EA 32673B1 20190628

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032673b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Съедобная композиция, представленная в виде отдельной порции одной или более единичных доз, содержащая комбинацию от 2 до 200 мг по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и от 20 до 2000 мг по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида и его солей, где указанный гомоизофлавоноид выбран из группы, состоящей из 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-она (ЕА1), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-она (ЕА2), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-она (EA3), метилофиопогонанона А (МОА) и метилофиопогонанона В (MOB).

2. Съедобная композиция по п.1, где указанный по меньшей мере один моноглюкозид флавоноида и его соли выбраны из группы, состоящей из моноглюкозида флавона, моноглюкозида флавонола, моноглюкозида флаванона, моноглюкозида изофлавона и антоцианина и их солей.

3. Съедобная композиция по п.2, где указанный по меньшей мере один моноглюкозид флавоноида и его соли выбраны из группы, состоящей из лютеолин-7-глюкозида, текторидина, дельфинидин-3-О-глюкозида хлорида (миртиллина хлорида), кемпферол-3-глюкозида, нарингенин-7-О-глюкозида и апигенин-8-С-глюкозида.

4. Съедобная композиция по любому из пп.1-3, где молярное отношение моноглюкозида флавоноида и его солей к гомоизофлавоноиду составляет по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 5, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10.

5. Способ снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта, включающий стадии: (a) пероральное введение съедобной композиции по любому из пп.1-4 не страдающему диабетом субъекту и (b) пероральноое введение сахарида не страдающему диабетом субъекту; причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на период времени вплоть до 90 мин или следует за стадией (b) через период времени вплоть до 30 мин, и при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.

6. Способ лечения субъекта с диабетом II типа, включающий стадии: (a) пероральное введение съедобной композиции по любому из пп.1-4 нуждающемуся в этом субъекту и (b) пероральное введение сахарида нуждающемуся в этом субъекту; причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на период времени вплоть до 90 мин или следует за стадией (b) через период времени вплоть до 30 мин, и при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.

7. Способ по п.5 или 6, где стадия (а) опережает стадию (b) на период времени вплоть до 60 мин.

8. Способ по любому из пп.5-7, где указанный сахарид может быть выбран из группы, состоящей из полисахарида, олигосахарида, дисахарида, моносахарида и их смесей.

9. Применение съедобной композиции по любому из пп.1-4 для получения лекарственного средства для снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта.

10. Применение съедобной композиции по любому из пп.1-4 для получения лекарственного средства для лечения диабета II типа.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

7. Способ по п.5 или 6, где стадия (а) опережает стадию (b) на период времени вплоть до 60 мин.

Евразийское 032673 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201890213
(22) Дата подачи заявки 2016.08.25
(51) Int. Cl. A23L 33/105 (2016.01)
(54) СЪЕДОБНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
(31) 15183639.2
(32) 2015.09.03
(33) EP
(43) 2018.09.28
(86) PCT/EP2016/070118
(87) WO 2017/036926 2017.03.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЮНИЛЕВЕР Н.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Фаулер Марк Иан (GB), Ван Хуэйцзюнь (CN)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU) (56) LI-GEN LIN ET AL.: "Naturally Occurring Homoisoflavonoids and Their Pharmacological Activities", PLANTA MEDICA, vol. 80, no. 13, 8 September 2014 (2014-09-08), pages 1053-1066, XP055249523, DE ISSN: 0032-0943, DOI: 10.1055/ s-0034-1383026 cited in the application page 548, page 550, right-hand column - page 551, left-hand column
WO-A1-2014086632
KR-A-20110041808
(57) Пищевые продукты или блюда с высоким содержанием доступных углеводов, таких как сахароза или крахмал, повышают постпрандиальную концентрацию глюкозы в крови. Согласно Node et al. (Cardiovascular diabetology, 8, 23 (2009)), повторяющиеся высокие постпрандиальные "всплески" глюкозы в плазме связаны с повышенным риском развития диабета II типа. Неконтролируемые колебания гликемии являются нежелательными, и любое снижение или "сглаживание" постпрандиальной концентрации глюкозы в крови потенциально обеспечивает положительный эффект. Настоящее изобретение относится к съедобной композиции для замедления поглощения глюкозы в кишечнике путем синергического ингибирования активного натрий-глюкозного котранспортера 1 (SGLT1) и пассивного транспортера глюкозы 2 (GLUT2), которое приводит к выравниванию или сглаживанию постпрандиального пика глюкозы. Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция, представленная в виде отдельной порции одной или более единичных доз, содержащая комбинацию от 2 до 200 мг по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и от 20 до 2000 мг по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида и его солей.
Пищевые продукты или блюда с высоким содержанием доступных углеводов, таких как сахароза или крахмал, повышают постпрандиальную концентрацию глюкозы в крови. Согласно Node et al. (Cardiovascular diabetology, 8, 23 (2009)) повторяющиеся высокие постпрандиальные "всплески" глюкозы в плазме связаны с повышенным риском развития диабета II типа. Неконтролируемые колебания гликемии являются нежелательными, и любое снижение или "сглаживание" постпрандиальной концентрации глюкозы в крови потенциально обеспечивает положительный эффект. Настоящее изобретение относится к съедобной композиции для замедления поглощения глюкозы в кишечнике путем синергического инги-бирования активного натрий-глюкозного котранспортера 1 (SGLT1) и пассивного транспортера глюкозы 2 (GLUT2), которое приводит к выравниванию или сглаживанию постпрандиального пика глюкозы.
В WO 2012/168108 (Unilever et al) раскрыта съедобная композиция для замедления поглощения глюкозы в кишечнике путем синергического ингибирования активного натрий-глюкозного котранспор-тера 1 (SGLT1) и пассивного транспортера глюкозы 2 (GLUT2), которое приводит к выравниванию или сглаживанию постпрандиального пика глюкозы. В частности, предложена съедобная композиция, содержащая по меньшей мере 5% в расчете на сухую массу по меньшей мере одного агликона флавоноида и по меньшей мере 5% в расчете на сухую массу по меньшей мере одного глюкозида флавоноида, причем указанный глюкозид флавоноида по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 60% устойчивее к гидролизу под действием лакта-зы-флоридзингидролазы, чем кверцетин-4-глюкозид, и при этом указанный агликон флавоноида является ингибитором GLUT 2, а указанный глюкозид флавоноида является ингибитором SGLT 1.
В WO 2014/086632 (Unilever et al) предложена съедобная композиция для замедления поглощения глюкозы в кишечнике путем синергического ингибирования активного натрий-глюкозного котранспор-тера 1 (SGLT1) и пассивного транспортера глюкозы 2 (GLUT2), которое приводит к выравниванию или сглаживанию постпрандиального пика глюкозы. В частности, предложена съедобная композиция в виде одной порции одной или более единичных доз, причем указанная съедобная композиция содержит 202000, предпочтительно 30-1000, наиболее предпочтительно 40-500 мг 3,5-дигидрокси-транс-стильбена и 10-2000, предпочтительно 20-1000, наиболее предпочтительно 40-500 мг моноглюкозида флавоноида или моноглюкозида дигидрохалкона.
Zhang et al (J. Nat. Prod., 73, 548-552 (2010)) сообщает, что растворимая в этилацетате фракция 90% метанольного экстракта мочковатых корней Polygonatum odoratum, как было обнаружено, усиливает стимулированное инсулином поглощение глюкозы дифференцированными адипоцитами 3T3-L1. Фракционирование на основе данных биоанализа привело к получению девяти гомоизофлавоноидов совместно с гликозидом изофлавона и гликозидом флаванона. Указанные гомоизофлавоноиды включают 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-он (ЕА2) и 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-он (EA3), и указанный гликозид изофлавона представляет собой текторидин. Результаты свидетельствуют о том, что гомоизофлавоноиды могут быть потенциальными сенсибилизаторами инсулина.
Краткое описание изобретения
В клеточной модели транспорта глюкозы на основе клеток Caco-2 (гетерогенных эпителиальных клеток колоректальной аденокарциномы человека) было обнаружено, что существовала статистически значимая синергическая понижающая регуляция транспорта глюкозы через клетки после обработки селективными смесями гомоизофлавоноидов (ингибиторов GLUT2) и моноглюкозидов флавоноидов (ингибиторов SGLT1) по сравнению с обработкой любым из указанных соединений в отдельности или по сравнению с их теоретическими суммарными характеристиками.
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция, представленная в виде отдельной порции одной или более единичных доз, где указанная съедобная композиция содержит комбинацию от 2 до 200 мг по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и от 20 до 2000 мг по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида и его солей. Указанные количества по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида и его солей являются такими, чтобы обеспечивать синергическое снижение постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции.
Согласно Lin et al (Planta Med, 80, 1053-1066 (2014)), гомоизофлавоноиды представляют собой подкласс флавоноидов, редко встречающийся в природе. Главным образом они могут быть обнаружены в растениях семейств Fabacae и Asparagacae. Их можно разделить на подклассы: типа саппанина (sappanin-type); типа сцилласциллина (scillascillin-type); типа бразилина (brazilin-type); типа цезальпина (caesalpin-type) и типа протосаппанина (protosappanin-type).
тип бразилина тип цезальпина тип протосаппанина Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта, где указанный способ включает стадии
(a) перорального введения съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения не страдающему диабетом субъекту и
(b) перорального введения сахарида не страдающему диабетом субъекту;
причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на 0-90 мин, предпочтительно 0-60 мин или следует за стадией (b) через 0-30 мин,
при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с диабетом II типа, где указанный способ включает стадии
(a) перорального введения съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения нуждающемуся в этом субъекту и
(b) перорального введения сахарида нуждающемуся в этом субъекту;
причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на 0-90 мин, предпочтительно 0-60 мин или следует за стадией (b) через 0-30 мин,
при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция согласно первому аспекту настоящего изобретения для применения для снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция согласно первому аспекту настоящего изобретения для применения для лечения диабета II типа.
В шестом аспекте настоящего изобретения предложено применение съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для снижения пост-прандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта.
В седьмом аспекте настоящего изобретения предложено применение съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения диабета II типа.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение проиллюстрировано со ссылкой на чертеж, на которой представлена модель изменения концентрации глюкозы во времени в процессе приема пищи.
Подробное описание изобретения
В первом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция, представленная в виде отдельной порции одной или более единичных доз, причем указанная съедобная композиция содержит комбинацию от 2 до 200 мг по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и от 20 до 2000 мг по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида и его солей. Указанные количества указанного по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и указанного по меньшей мере одного моноглюкозида флаво-ноида и его солей являются такими, чтобы обеспечивать синергическое снижение постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции.
Предпочтительно указанная съедобная композиция содержит по меньшей мере 5 мг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг, еще более предпочтительно по меньшей мере 15 мг и предпочтительно не более 100 мг, более предпочтительно не более 50 мг, еще более предпочтительно не более 25 мг указанного по меньшей мере одного гомоизофлавоноида.
Предпочтительно указанная съедобная композиция содержит по меньшей мере 50 мг, более предпочтительно по меньшей мере 100 мг, еще более предпочтительно по меньшей мере 150 мг и предпочтительно не более 1000 мг, более предпочтительно не более 500 мг, еще более предпочтительно не более 250 мг указанного по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида. Предпочтительно указанный по
меньшей мере один гомоизофлавоноид представляет собой гомоизофлавоноид типа саппанина. Предпочтительно указанный гомоизофлавоноид типа саппанина представляет собой гомоизофлавоноид типа 3-бензилхроман-4-она. Предпочтительно указанный гомоизофлавоноид имеет структуру I:
1?1
где R1 представляет собой -Н или -Me и
где R2 представляет собой -ОН, -ОМе или -О-СТ^-О-^).
5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-он (ЕА1)
Предпочтительно указанный гомоизофлавоноид выбран из группы, состоящей из 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-она (ЕА1), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-она (ЕА2), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-она (EA3), ме-тилофиопогонанона А (МОА) и метилофиопогонанона В (MOB).
он о
5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-он (ЕАЗ)
5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-он (ЕА2)
метилофиопогонанон В (MOB)
Предпочтительно указанный по меньшей мере один моноглюкозид флавоноида и его соли выбраны из группы, состоящей из моноглюкозида флавона, моноглюкозида флавонола, моноглюкозида флавано-на, моноглюкозида изофлавона и антоцианина и их солей. Предпочтительно указанный по меньшей мере один моноглюкозид флавоноида и его соли выбраны из группы, состоящей из лютеолин-7-глюкозида, текторидина, дельфинидин-3-О-глюкозида хлорида (миртиллина хлорида), кемпферол-3-глюкозида, на-рингенин-7-О-глюкозида и апигенин-8-С-глюкозида.
Предпочтительно молярное отношение моноглюкозида флавоноида и его солей к гомоизофлаво-ноиду составляет по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 5, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта, где указанный способ включает стадии
(a) перорального введения съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения не страдающему диабетом субъекту и
(b) перорального введения сахарида не страдающему диабетом субъекту;
причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на 0-90 мин, предпочтительно 0-60 мин или следует за стадией (b) через 0-30 мин,
при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.
Предпочтительно указанный сахарид может быть выбран из группы, состоящей из полисахарида, олигосахарида, дисахарида, моносахарида и их смесей.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с диабетом II типа, где указанный способ включает стадии
(a) перорального введения съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения нуждающемуся в этом субъекту и
(b) перорального введения сахарида нуждающемуся в этом субъекту;
причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на 0-90 мин, предпочтительно 0-60 мин или следует за стадией (b) через 0-30 мин,
при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция согласно первому аспекту настоящего изобретения для применения для снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложена съедобная композиция согласно первому аспекту настоящего изобретения для применения для лечения диабета II типа.
В шестом аспекте настоящего изобретения предложено применение съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для снижения пост-прандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта.
В седьмом аспекте настоящего изобретения предложено применение съедобной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения диабета II типа.
Пример 1. Обнаружение ингибиторов SGLT1 и GLUT2.
Способ.
Стандартная культура клеток.
Эпителиальные клетки колоректальной аденокарциномы человека (Caco-2) получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и культивировали в питательной среде, состоявшей из модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (содержавшей Glutamax-1, 4,5 г/л D-глюкозы и 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (ГЭПЭС) (Invitrogen)), 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma), 1% заменимых аминокислот (Invitrogen) и 1 мМ пирувата натрия (Sigma). Указанные клетки пересевали по стандартной методике при примерно 80% степени смыкания монослоя с применением стабильного трипсиноподобного фермента TrypLE(tm) Express (Invitrogen) для снятия клеток и высевали в количестве примерно 114 клеток на мм2 в неиспользованные культуральные флаконы. Для экспериментов применяли только клетки, прошедшие от 45 до 49 пассажей.
Получение монослоев дифференцированных клеток Caco-2.
На 96-луночные подложки с проницаемыми вставками Corning(r) HTS Transwell(r) 96 (Sigma) нано
сили коллагеновое покрытие с применением 40 мкл 50 мкг/мл коллагена I типа из крысиных хвостов (BD Biosciences) в 0,02 М уксусной кислоте в течение 1 ч при комнатной температуре в стерильных условиях. Вставки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ (Invitrogen)), и клетки Caco-2 высевали во вставки в количестве 1,0х106 клеток/мл (75 мкл на вставку) в питательной среде и 30 мл питательной среды добавляли в расположенный ниже планшет для питающего слоя. Указанные клетки оставляли для прикрепления к коллагеновой матрице и образования монослоев на 48 ч при 37°C, 5% CO2. Вставки и планшет для питающего слоя промывали посредством ФСБ и клетки инкубировали с применением среды для дифференцировки энтероцитов BD Entero-STIM(tm), содержавшей раствор-заменитель сыворотки MITO+(tm) (оба BD Biosciences), в количестве 75 мкл на вставку и 30 мл в планшете для питающего слоя в течение еще 48 ч при 37°C, 5% CO2.
Скрининговый анализ клеток на ингибитор транспорта глюкозы.
Монослои дифференцированных клеток осторожно промывали фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко, содержавшим CaCl2 и MgCl2 (ФСБ(+) (Invitrogen)), и вставки перемещали в новый 96-луночный планшет-приемник Corning(r) HTS Transwell(r)-96 (Sigma). Клетки инкубировали с применением свежего ФСБ(+) (75 мкл на вставку и 225 мкл на лунку) в течение 60 мин при 37°C, 5% CO2. ФСБ(+) осторожно отсасывали и заменяли на 75 мкл на вставку 5 мМ D-глюкозы (Sigma) ± испытываемое соединение или 25 мМ D-глюкозы ± испытываемое соединение в трех повторностях и в каждую лунку быстро добавляли 225 мкл на лунку ФСБ(+).
Лунки с 5 мМ глюкозой и лунки с 25 мМ глюкозой инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 15 и 30 мин соответственно. Подробная информация обо всех испытываемых соединениях содержится в табл. 1. Вставки с клетками перемещали в новый планшет-приемник, надосадочную жидкость осторожно отделяли от клеток посредством отсасывания и заменяли на 100 мкл 100 мкМ раствора красителя люцифера желтого (Lucifer Yellow, Sigma) для подтверждения целостности монослоев. В каждую лунку добавляли 225 мкл ФСБ(+) и указанные лунки инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 1 ч. Затем вставки с клетками отбрасывали и проницаемость мембран для люцифера желтого проверяли посредством измерения флуоресценции образцов при 485 нм (возбуждение) и 530 нм (эмиссия) с помощью микропланшетного ридера для измерения флуоресценции Spectramax Gemini EM.
Анализ на содержание глюкозы.
Количество глюкозы, транспортируемой через монослои клеток, измеряли с применением анализа на содержание глюкозы на основе набора Amplex Red Glucose/Glucose oxidase Assay Kit от Invitrogen. Вкратце, 50 мкл каждого испытываемого образца перемещали в 96-луночный планшет с черными стенками/прозрачным дном (Greiner Bio-One), в который добавляли 100 мкл рабочего буферного раствора (0,5 мкл 10 мМ Ampliflu Red, 1 мкл 10 ед/мл пероксидазы хрена, 1 мкл 100 ед/мл глюкозооксидазы и 97,5 мкл ФСБ, все Sigma). После 10 мин инкубирования при комнатной температуре измеряли флуоресценцию указанных образцов при 530 нм (возбуждение) и 590 нм (эмиссия) с помощью микропланшетного ридера для измерения флуоресценции Spectramax Gemini EM и концентрацию глюкозы определяли на основе экстраполяции стандартной кривой.
Результаты.
В табл. 1 представлен процент ингибирования транспорта глюкозы через монослой дифференцированных клеток Caco-2 для каждого испытываемого соединения. При более низкой 5 мМ концентрации D-глюкозы ранний транспорт глюкозы через монослой клеток происходит преимущественно с помощью апикально экспрессируемого высокоаффинного транспортера глюкозы с низкой емкостью SGLT1. При более высоких концентрациях D-глюкозы транспортер SGLT1 приходит в состояние насыщения, и, следовательно, большая часть транспорта глюкозы через указанный монослой осуществляется низкоаффинным транспортером с высокой емкостью GLUT2, который нацеливается на апикальную мембрану только после первичного SGLT1-зависимого транспорта глюкозы. Клеточная модель для скрининга, подробно описанная в вышеуказанных способах, предназначена для использования преимуществ указанных различий в оптимальных условиях для каждого транспортера для обнаружения специфичных ингибиторов как SGLT1, так и GLUT2. Несмотря на то, что и SGLT1, и GLUT2 на апикальной мембране переносят глюкозу в энтероцит, GLUT2 также экспрессируется в базолатеральной мембране, где он необходим для транспорта глюкозы за пределы клетки. Следовательно, специфичные ингибиторы GLUT2 будут не только блокировать апикально нацеленные транспортеры при высоких концентрациях D-глюкозы (25 мМ), они также будут проникать в клетку и блокировать выход глюкозы из энтероцита при низких концентрациях D-глюкозы (5 мМ). Таким образом, для разграничения ингибирования апикальных и ба-золатеральных транспортеров каждое соединение испытывали при 5 мМ D-глюкозе в течение 15 мин и 25 мМ D-глюкозе в течение 30 мин. Соединения причисляли к ингибиторам SGLT1, если они демонстрировали по меньшей мере 20% ингибирование транспорта глюкозы при 5 мМ D-глюкозе и не более чем 20% соответствующее ингибирование при 25 мМ D-глюкозе. Соединения, которые были способны инги-бировать транспорт глюкозы по меньшей мере на 20% при обоих условиях, причисляли к специфичным ингибиторам GLUT2. Указанный подход был проверен на соответствие требованиям путем применения общепризнанных специфичных ингибиторов SGLT1 и GLUT2, а именно флоридзина и флоретина соот
ветственно.
Вышеупомянутая клеточная модель транспорта глюкозы была описана Kellett et al. (Diabetes, 54, 10, 3056-62 (2005)) и со ссылкой на фиг. 1 предназначена для воспроизведения локальных изменений концентрации глюкозы в тонком кишечнике в процессе употребления богатой углеводами пищи. Перед приемом пищи концентрация свободной глюкозы в просвете кишечника является низкой ( <5 мМ) и апи-кально экспрессируемый транспортер SGLT1 активно переносит любую доступную глюкозу в энтероцит. Транспортеры GLUT2 также функционируют на базолатеральной мембране энтероцита, при необходимости перенося глюкозу из крови в клетку для поддержания клеточного метаболизма. В процессе приема пищи локальная концентрация глюкозы начинает повышаться (5-10 мМ) и глюкоза переносится из просвета кишечника посредством SGLT1, а затем в системный кровоток с помощью GLUT2. Вследствие указанного первичного транспорта глюкозы через энтероцит внутриклеточные запасы GLUT2 активируются и нацеливаются на апикальную мембрану. Вскоре после приема пищи происходит образование очень высоких локальных концентраций глюкозы (25-100 мМ), так как углеводы, содержащиеся в пище, расщепляются на моносахариды под действием ферментов альфа-глюкозидаз, расположенных на апикальной мембране энтероцита. При указанном высоком уровне глюкозы высокоаффинный транспортер с низкой емкостью SGLT1 приходит в состояние насыщения и большая часть транспорта глюкозы через энтероцит происходит с помощью низкоаффинных транспортеров с высокой емкостью GLUT2, в тот момент присутствующих в апикальной мембране.
Табл. 1 демонстрирует, что для ингибирования SGLT1 требуется моноглюкозид флавоноида или моноглюкозид дигидрохалкона, что подтверждают флоридзин, текторидин и дельфинидин-3-О-глюкозида хлорид (миртиллина хлорид).
В табл. 1 WO 2014/086632 (Unilever et al.) раскрыты дополнительные примеры ингибиторов SGLT1, все из которых являются моноглюкозидами флавоноидов, такие как лютеолин-7-глюкозид, апигенин-7-глюкозид, апигенин-8-с-глюкозид, кемпферол-3-глюкозид, кемпферол-7-глюкозид, кверцетин-3-глюкозид, кверцетин-4-глюкозид, нарингенин-7-глюкозид, эриодиктиол-7-глюкозид, даидзеин-8-С-глюкозид, даидзеин-7-глюкозид, цианидин-3-глюкозид, мальвидин-3-О-глюкозид, дельфинидин-3-глюкозид и пеларгонидин-3-глюкозид. Наоборот, присутствие в химической структуре дополнительного глюкозного фрагмента нейтрализует указанное ингибирующее действие, что демонстрирует кверцетин-3,4'-диглюкозид. Специфичность глюкозида подтверждается отсутствием ингибирующей активности по отношению к SGLT1 других испытываемых гликозидов флавоноидов, включая цианидин-3-рутинозид и мальвидин-3-О-галактозид. Кроме того, отсутствие ингибирующей активности по отношению к SGLT1, продемонстрированное моноглюкозидом гидрохинона, арбутином, подчеркивает важность структур флавоноида и дигидрохалкона в молекуле глюкозида.
Табл. 1 также демонстрирует, что все пять гомоизофлавоноидов, ЕА1, ЕА2, EA3, МОА и MOB, являются ингибиторами GLUT2.
В табл. 1: соединения испытывали на ингибирующую активность в отношении SGLT1 и GLUT2 в клетках Caco-2 с применением 5 мМ D-глюкозы в течение 15 мин и 25 мМ D-глюкозы в течение 30 мин соответственно. Присвоенный класс транспортера, ингибированного каждым соединением, основан на ингибиторах SGLT1, осуществляющих > 20% ингибирование транспорта глюкозы при 5 мМ D-глюкозе и <20% ингибирование при 25 мМ D-глюкозе, и ингибиторах GLUT2, осуществляющих > 20% ингибирование при уровнях D-глюкозы 5 мМ и 25 мМ. Значения % ингибирования транспорта глюкозы для трех повторностей.
* Все соединения испытывали при 300 мкМ; флоридзин представляет собой положительный контроль для ингибиторов SGLT1.
# На основе ингибиторов SGLT1, осуществляющих > 20% ингибирование при 5 мМ глюкозе и <20% ингибирование при 25 мМ глюкозе, и ингибиторов GLUT2, осуществляющих > 20 % ингибирование при 5 мМ и 25 мМ глюкозе.
Вывод.
С применением анализа клеток Caco-2 текторидин и дельфинидин-3-О-глюкозида хлорид (миртиллина хлорид) идентифицировали в качестве ингибиторов SGLT1. С применением анализа клеток Caco-2 гомоизофлавоноиды ЕА1, ЕА2, EA3, МОА и MOB идентифицировали в качестве ингибиторов GLUT2.
Пример 2. Экстракция и выделение соединений из Polygonatum odoratum (купены душистой).
Способ.
Сушеную корневую часть Polygonatum odoratum (купены душистой), 1,0 кг, подвергали экстракции водным раствором 95% этанола в течение 2 ч при массовом отношении твердого вещества к жидкости 1:4. Затем оставшийся корень растения подвергали экстракции водным раствором 70% этанола в течение 2 ч при массовом отношении твердого вещества к жидкости 1:3. Затем два водно-этанольных экстракта объединяли, концентрировали и сушили под вакуумом с получением 333,1 г (доля выхода 33,3%) водно-этанольного экстракта Polygonatum odoratum.
Высушенный экстракт растворяли в воде и последовательно распределяли между петролейным эфиром, этилацетатом и 1-бутанолом с получением 21,0 г петролейноэфирного экстракта (доля выхода 6,3%), 4,33 г этилацетатного экстракта (доля выхода 1,3%), 29,3 г 1-бутанольного экстракта (доля выхода 8,8%) и 216,5 г водного экстракта (доля выхода 65,0%).
Этилацетатный экстракт дополнительно очищали с применением системы полупрепаративной ВЭЖХ LC3000, снабженной колонкой YMC-Pack-C18 (250 ммх10 мм, 5 мкм), которую элюировали изо
кратической системой растворителей, содержавшей примерно 60% ацетонитрила и примерно 40% воды с 0,18% муравьиной кислоты, с мониторингом при 280 нм при скорости потока 6 мл/минута, с получением 38,3 мг 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-она (ЕА1) (доля выхода 0,885%), 59,0 мг 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-она (ЕА2) (доля выхода 1,362 %), 93,8 мг 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-она (EA3) (доля выхода 2,167%). Вывод.
Было обнаружено, что этилацетатный экстракт водно-этанольного экстракта сушеной корневой части Polygonatum odoratum содержит 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-он (ЕА1), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-он (ЕА2), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-он (EA3). Текторидин не был идентифицирован в качестве продукта экстракции.
Пример 3. Синергический эффект ингибиторов SGLT1 и гомоизофлавоноидов. Вещества.
5,7-Дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-он (ЕА1) (из примера 2). 5,7-Дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-он (ЕА2) (из примера 2). 5,7-Дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-он (EA3) (из примера 2). Метилофиопогонанон А (МОА) (Shanghai PureOne, Biotechnology Co. Ltd.) Метилофиопогонанон В (MOB) (Shanghai PureOne, Biotechnology Co. Ltd.) Способ.
Получение монослоев дифференцированных клеток Caco-2.
Клетки Caco-2 культивировали и пересевали по стандартной методике, как описано в примере 1. Клетки Caco-2 высевали в многолуночные вставки с фибриллярным коллагеном BioCoat HTS Fibrillar Collagen Multiwell Inserts (BD Biosciences) в количестве 2,5 х105 клеток/мл (500 мкл на вставку) в питательной среде и 30 мл питательной среды добавляли в расположенный ниже планшет для питающего слоя. Указанные клетки оставляли для прикрепления к коллагеновой матрице и образования монослоев на 24 ч при 37°C, 5% CO2. Вставки и планшет для питающего слоя промывали посредством ФСБ и клетки инкубировали с применением среды для дифференцировки энтероцитов BD Entero-STIM(tm), содержавшей раствор-заменитель сыворотки MITO+(tm) (оба BD Biosciences), в количестве 500 мкл на вставку и 30 мл в планшете для питающего слоя в течение еще 48 ч при 37°C, 5% СО2.
Клеточная модель транспорта глюкозы.
Монослои дифференцированных клеток осторожно промывали ФСБ(+) и вставки перемещали в новый стандартный 24-луночный планшет для культур тканей. Клетки инкубировали с применением свежего ФСБ(+) (500 мкл на вставку и 1 мл на лунку) в течение 30 мин при 37°C, 5% СО2. ФСБ(+) осторожно отсасывали и заменяли на 250 мкл на вставку 5 мМ D-глюкозы ± испытываемое соединение, и перед тем как клетки помещали обратно в инкубатор при 37°C, 5% СО2, в каждую лунку, расположенную ниже, быстро добавляли 1 мл ФСБ(+). Через 15 мин вставки с клетками перемещали в новый 24-луночный планшет, в каждую вставку добавляли еще 250 мкл 45 мМ D-глюкозы ± испытываемое соединение (с получением конечной концентрации глюкозы 25 мМ) и снова добавляли в лунки 1 мл ФСБ(+). Еще через 15 мин вставки снова перемещали в новый 24-луночный планшет и на этот раз добавляли только свежий ФСБ(+) в лунки, расположенные ниже. Еще через 15 мин указанную стадию повторяли. Вставки с клетками перемещали в новый 24-луночный планшет, надосадочную жидкость осторожно отделяли от клеток посредством отсасывания и заменяли на 500 мкл 100 мкМ раствора красителя люцифера желтого (Lucifer Yellow) (Sigma) для подтверждения целостности монослоев. В каждую лунку добавляли 1 мл ФСБ(+) и указанные лунки инкубировали при 37°C, 5% СО2 в течение 1 ч. Затем вставки с клетками отбрасывали и проницаемость мембран для люцифера желтого проверяли посредством измерения флуоресценции образцов при 485 нм (возбуждение) и 530 нм (эмиссия) с помощью микропланшетного ридера для измерения флуоресценции Spectramax Gemini EM.
Анализ на содержание глюкозы.
После последнего инкубирования весь оставшийся ФСБ(+) с каждой стадии (т.е. после 15, 30, 45 и 60 мин) анализировали на содержание глюкозы, как описано в примере 1, и вычисляли общий кумулятивный транспорт глюкозы. Локальные изменения внутрипросветной концентрации глюкозы, описанные и проиллюстрированные в примере 1, воспроизводили in vitro путем первичного кратковременного инкубирования дифференцированных клеток Caco-2 с D-глюкозой в низкой концентрации (5 мМ в течение 15 минут) с последующим немедленным продолжительным инкубированием с D-глюкозой в высокой концентрации (25 мМ конечной концентрации в течение 45 мин).
Результаты.
В табл. 2 приведены результаты, полученные с помощью упомянутого выше анализа Caco-2 с применением комбинаций выбранных гомоизофлавоноидов и ингибиторов SGLT1 (различных моноглюко-зидов флавоноидов), и указанные результаты ясно свидетельствуют о том, что в комбинации ингибиторы SGLT1 и гомоизофлавоноиды могут синергически ингибировать локальное поглощение глюкозы из просвета кишечника и, следовательно, снижать высокие "всплески" постпрандиальной глюкозы в крови,
связанные с возникновением диабета II типа.
В табл. 2: кумулятивный транспорт глюкозы и среднеквадратическое отклонение (для двух повтор-ностей) для комбинации известных ингибиторов SGLT1 и выбранных гомоизофлавоноидов. 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-он (ЕА1); 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-он (ЕА2); 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-он (EA3); метилофиопогонанон А (МОА); метилофиопогонанон В (MOB).
Моноглюкозид флавона & гомоизофлавоноид
Лютеолин-7-глюкозид (L7G, 300 мкМ) & ЕА-1 (2,5 мкМ)
365,0
6,71
L7G
281,9
8,72
ЕА-1
339,2
11,91
L7G
301,4
10,39
L7G
ЕА-1
260,7
14,53
Антоцианин & гомоизофлавоноид
Миртиллина хлорид (МС, 300 мкМ) & MOB (5 мкМ)
257,15
13,00
227,60
11,38
MOB
200,59
18,33
220,62
9,05
MOB
141,10
7,54
Моноглюкозид флаванона & гомоизофлавоноид
Нарингенин-7-О-глюкозид (N7G, 300 мкМ) & MOB (5 мкМ)
257,15
13,00
N7G
236,65
8,24
MOB
200,59
18,33
N7G
215,32
7,67
N7G
MOB
144,25
8,24
Моноглюкозид флавонола & гомоизофлавоноид
Кемпферол-З-глюкозид (K3G, 150 мкМ) & ЕА2 (10 мкМ)
385,96
9,44
K3G
290,49
10,04
ЕА2
283,98
13,36
K3G
297,72
9,35
K3G
ЕА2
182,41
12,11
Моноглюкозид изофлавона & гомоизофлавоноид
Текторидин (Т, 300 мкМ) & МОА (5 мкМ)
327,43
5,73
298,98
16,55
МОА
231,69
17,90
298,40
2,65
МОА
186,11
2,62
Моноглюкозид флавона & гомоизофлавоноид
Апигенин-8-С-глюкозид (A8G, 300 мкМ) & ЕАЗ (2,5 мкМ)
304,99
4,00
A8G
287,58
11,08
ЕАЗ
291,33
16,24
A8G
291,89
12,53
A8G
ЕАЗ
237,69
5,14
В указанной выше таблице каждому испытываемому объединению в пару гомоизофлавоноида (ГИФ) и моноглюкозида флавоноида (МФ) соответствуют 5 следующих значений.
1. Отсутствие соединения (ОС) + ОС.
2. ОС + ГИФ (данные, не использованные для вычисления синергии).
3. ОС+ГИФ.
4. МФ+ОС.
5. МФ+ГИФ.
Пара 1 обеспечивает исходный уровень.
Пара 3 демонстрирует ингибирование, вызванное только ГИФ.
Пара 4 демонстрирует ингибирование, вызванное только МФ.
Пара 5 демонстрирует ингибирование, вызванное комбинацией ГИФ и МФ.
Эффект синергии достигается, когда ингибирование, вызванное комбинацией ГИФ и МФ, является большим, чем сумма ингибирования, вызванного только ГИФ, добавленного к ингибированию, вызванному только МФ.
Следует отметить, что для объединения в пару текторидина (Т, 300 мкМ) и ЕА1 (10 мкМ) синерги-ческий эффект не наблюдался. Это было вызвано насыщением ингибирования в результате высокого количества ЕА1 (10 мкМ). Таким образом, объединение указанных соединений в пару повторяли с применением более низкого количества ЕА1 (5 мкМ) и, следовательно, без насыщения ингибирования посредством ЕА1, и наблюдался синергический эффект.
Аналогично следует отметить, что для объединения в пару лютеолин-7-глюкозида (L7G, 300 мкМ) и ЕА1 (10 мкМ) синергический эффект не наблюдался. Это опять-таки было вызвано насыщением ингибирования в результате высокого количества ЕА1 (10 мкМ). Таким образом, объединение указанных соединений в пару повторяли с применением более низкого количества ЕА1 (2,5 мкМ) и, следовательно, без насыщения ингибирования посредством ЕА1, и наблюдался синергический эффект.
Выводы.
Ингибиторы SGLT1 и гомоизофлавоноиды синергически ингибируют локальное поглощение глюкозы из просвета кишечника и, следовательно, снижают высокие "всплески" постпрандиальной глюкозы в крови, связанные с возникновением диабета II типа.
Ингибиторы SGLT1 представляли собой моноглюкозиды флавоноидов на основе пяти подклассов флавоноидов, а именно изофлавон, два флавона, антоцианидин, флаванон и флавонол. Выбранные го-моизофлавоноиды представляли собой 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-он (ЕА1); 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-он (ЕА2); 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-он (ЕА3); метилофиопогонанон А (МОА); метилофиопогонанон В (MOB).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Съедобная композиция, представленная в виде отдельной порции одной или более единичных доз, содержащая комбинацию от 2 до 200 мг по меньшей мере одного гомоизофлавоноида и от 20 до 2000 мг по меньшей мере одного моноглюкозида флавоноида и его солей, где указанный гомоизофлаво-ноид выбран из группы, состоящей из 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метилхроман-4-она (ЕА1), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6-метил-8-метоксихроман-4-она (ЕА2), 5,7-дигидрокси-3-(4'-гидроксибензил)-6,8-диметилхроман-4-она (EA3), метилофиопогонанона А (МОА) и метилофиопогона-нона В (MOB).
2. Съедобная композиция по п.1, где указанный по меньшей мере один моноглюкозид флавоноида и его соли выбраны из группы, состоящей из моноглюкозида флавона, моноглюкозида флавонола, моно-глюкозида флаванона, моноглюкозида изофлавона и антоцианина и их солей.
3. Съедобная композиция по п.2, где указанный по меньшей мере один моноглюкозид флавоноида и его соли выбраны из группы, состоящей из лютеолин-7-глюкозида, текторидина, дельфинидин-3-О-глюкозида хлорида (миртиллина хлорида), кемпферол-3-глюкозида, нарингенин-7-О-глюкозида и апиге-нин-8-С-глюкозида.
4. Съедобная композиция по любому из пп.1-3, где молярное отношение моноглюкозида флавонои-да и его солей к гомоизофлавоноиду составляет по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 5, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10.
5. Способ снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта, включающий стадии:
(a) пероральное введение съедобной композиции по любому из пп.1-4 не страдающему диабетом субъекту и
(b) пероральноое введение сахарида не страдающему диабетом субъекту;
причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на период времени вплоть до 90 мин или следует за стадией (b) через период времени вплоть до 30 мин, и при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.
6. Способ лечения субъекта с диабетом II типа, включающий стадии:
(a) пероральное введение съедобной композиции по любому из пп. 1 -4 нуждающемуся в этом субъекту и
(b) пероральное введение сахарида нуждающемуся в этом субъекту;
причем стадия (а) совпадает по времени со стадией (b), опережает стадию (b) на период времени вплоть до 90 мин или следует за стадией (b) через период времени вплоть до 30 мин, и при этом указанный сахарид содержит или представляет собой глюкозу.
7. Способ по п.5 или 6, где стадия (а) опережает стадию (b) на период времени вплоть до 60 мин.
8. Способ по любому из пп.5-7, где указанный сахарид может быть выбран из группы, состоящей из полисахарида, олигосахарида, дисахарида, моносахарида и их смесей.
9. Применение съедобной композиции по любому из пп.1-4 для получения лекарственного средства для снижения постпрандиальной пиковой амплитуды уровня глюкозы в крови или гликемической реакции у не страдающего диабетом субъекта.
10. Применение съедобной композиции по любому из пп.1-4 для получения лекарственного средст-
ва для лечения диабета II типа.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032673
- 1 -
(19)
032673
- 1 -
(19)
032673
- 1 -
(19)
032673
- 9 -
(19)
032673
- 12 -