|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Соединение структуры  4,4,4-трифтор-N-((2S)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, его диастереомер или фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение структуры  N-((2S)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или его диастереомер, или фармацевтически приемлемая соль. 3. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы, аденокистозной карциномы или сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток. 4. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы. 5. Применение по п.4 для производства лекарственного средства для лечения рака легких. 6. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток. 7. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для инициации образования слуховых волосковых клеток.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Соединение структуры 4,4,4-трифтор-N-((2S)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, его диастереомер или фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение структуры N-((2S)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или его диастереомер, или фармацевтически приемлемая соль. 3. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы, аденокистозной карциномы или сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток. 4. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы. 5. Применение по п.4 для производства лекарственного средства для лечения рака легких. 6. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток. 7. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для инициации образования слуховых волосковых клеток.
Евразийское ои 032634 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201792478
(22) Дата подачи заявки
2016.07.01
(51) Int. Cl. C07D 487/14 (2006.01) C07D 471/14 (2006.01) A61K31/55 (2006.01) A61P27/16 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)
(54) СОЕДИНЕНИЯ-ИНГИБИТОРЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ ПУТИ NOTCH
(31) 62/189,393
(32) 2015.07.07
(33) US
(43) 2018.06.29
(86) PCT/US2016/040612
(87) WO 2017/007702 2017.01.12
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US); АУДИОН ТЕРАПЕУТИКС (NL)
(72) Изобретатель:
Клэй Джулия Мари (US), Эдж Альберт (NL), Хипскинд Филип Артур (US), Джилл Джон С. (NL), Пател Бхарвин Кумар (US), Ван Эс Хельмут
(74)
Хендрикус Герардус (NL), Вроблески Аарон Д., Чжао Гайин (US)
Представитель:
Угрюмов В.М., Христофоров А.А., Строкова О.В., Гизатуллина Е.М., Карпенко О.Ю., Глухарёва А.О., Лыу Т.Н. (RU)
(56)
WO-A1-2014039781 US-A1-2013029972 CATERINA FATTORUSSO ET AL.: "Specific Targeting Highly Conserved Residues in the HIV-1 Reverse Transcriptase Primer Grip Region. Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel, Potent, and Broad Spectrum NNRTIs with Antiviral Activity", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 48, no. 23, 1 November 2005 (2005-11-01), pages 7153-7165, XP055064516, ISSN: 0022-2623, DOI: 10.1021/jm050257d compound 20a
(57)
Потеря с возрастом волосковых сенсорных клеток внутреннего уха, воздействие шума, влияние химических агентов, лекарственных препаратов, заболевания и генетические расстройства каждый год приводят к нарушениям слуха у многих людей. Независимо от этиологии гибель или дисфункция меха-носенсорных волосковых клеток, расположенных в кортиевом органе улиткового лабиринта, является основной причиной сенсоневральной тугоухости (SNHL). Профилактические меры замедления потери слуха, главным образом, ограничены периферической защитой, такой как беруши, или уменьшение уровня шума, или отмена использования наушников. Современные способы лечения SNHL основаны в основном на электронных технологиях, таких как усиление звука с помощью слухового аппарата или в обход волосковых клеток посредством электрической стимуляции выживших нейронов спирального ганглия с помощью кохлеарного имплантата. Для внезапной сенсоневральной тугоухости предложено также введение стероидов для обеспечения системной терапии или интратимпанальной терапии.
Кохлеарный сенсорный эпителий содержит волосковые клетки, приспособленные для обнаружения звуковой вибрации, которая преобразуется стереоцилией на апикальных поверхностях волосковых клеток в электрические импульсы и передается в головной мозг через VIII черепной нерв. Слуховые волос-ковые клетки, образующиеся во время развития, являются постмитотическими, и они не заменяются после утраты или в процессе нормального обновления клеток у млекопитающих. В результате SNHL вследствие потери слуховых волосковых клеток является необратимой. Развитие слуховых волосковых клеток во время эмбрионального периода включает дифференцировку, в которой просенсорные эпителиальные клетки приобретают различные направления развития - либо волосковых клеток, либо поддерживающих клеток в процессе латерального торможения, опосредованного передачей сигналов Notch. Активная передача сигналов Notch, стимулированная лигандами на соседних волосковых клетках, препятствует дифференцировке просенсорных эпителиальных клеток в волосковые клетки. Такие клетки становятся поддерживающими клетками.
Передача сигналов Notch представляет собой эволюционный консервативный путь, который играет ключевую роль в развитии и гомеостазе ткани у млекопитающих. Рецепторы и лиганды Notch содержат однопроходные трансмембранные домены, экспрессируются на клеточной поверхности, и поэтому передача сигналов Notch особенно важна для опосредования коммуникации между соседними клетками, экс-прессирующими такие рецепторы и лиганды. Существует четыре известных рецептора Notch, встречающихся у грызунов и людей, которые получили название от Notchl до Notch 4. Рецепторы Notch представляют собой гетеродимерные белки, состоящие из внеклеточного и внутриклеточного домена, которые первоначально синтезируются в виде одного полипептида. Взаимодействие рецептора и лиганда активирует серию протеолитических расщеплений полипептида рецептора Notch, в которой участвует активность у-секретазы. Активность у-секретазы отщепляет внутриклеточный домен Notch от внутренней стороны плазматической мембраны, который перемещается в ядро с образованием комплекса фактора транскрипции. Внутриклеточный домен Notch (NICD) является активной формой белка. Различные сигнальные функции Notch включают пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез, миграцию и самообновление. Такие разнообразные функции передачи сигналов Notch во время развития и сохранения нормальных тканей могут быть аберрантно активированы при различных формах рака. Онкогенные функции передачи сигналов Notch включают подавление апоптоза и ускорение клеточной пролиферации.
у-Секретаза играет определяющую роль в каскаде активации Notch. В результате ингибиторы у-секретазы активно исследуют на предмет их возможности блокирования активации рецептора Notch для лечения рака. Несмотря на продолжающиеся клинические испытания не существует ни одного промышленного химиотерапевтического лекарства, являющегося ингибитором Notch.
у-Секретаза через путь передачи сигналов Notch также играет важнейшую роль в дифференцировке просенсорных клеток. В результате ингибиторы у-секретазы активно исследуют на предмет их возможности блокирования активации рецептора Notch для лечения SNHL. Вместо введения агента, ингиби-рующего Notch, различными способами для доставки в системный кровоток и инициации экспрессии атонального гомолога 1 (Atohl или Mathl) в патологически повышенных количествах и в течение продолжительных периодов времени, целесообразно и желательно инициировать экспрессию Atoh1 в кохле-арном окружении с более конкретным уровнем экспрессии и в течение более конкретного периода времени. Невозможность модулирования Atohl остается главным препятствием для изучения слуховых во-лосковых клеток и разработки терапевтических средств для регенерации слуховых волосковых клеток. Несмотря на продолжающиеся исследования, такие как WO 2014/039781, не существует промышленных ингибиторов Notch для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток.
Существует потребность в обнаружении соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении передачи сигналов пути Notch. Кроме того, существует потребность в обнаружении соединений, который ингибируют передачу сигналов пути Notch посредством ингибирующей активности у-секретазы. Существует также потребность в обнаружении соединений, обладающих различными структурными особенностями, которые могут способствовать ингибирующей активности в отношении передачи сигналов пути Notch и у-секретазы. Дополнительная потребность заключается в обнаружении со
единений, которые инициируют экспрессию Atoh1 посредством ингибирования передачи сигналов пути Notch. Существует также дополнительная потребность в обнаружении соединений, демонстрирующих требуемые свойства абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено соединение структуры
П ; Н "
о о Соединение 1
4,4,4-трифтор-N-((2S)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[i]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, или его, по существу, диастереомерно чистый изомер, или фармацевтически приемлемая соль любого из указанных выше соединений.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение структуры
F3S н о У у
П : Н Я
О = О
Соединение 2
N-((2S)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или его, по существу, диастереомерно чистый изомер, или фармацевтически приемлемая соль любого из вышеуказанных соединений.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение 1 или его, по существу, чистый диастереомер; или соединение 2 или его, по существу, чистый диастереомер; или фармацевтически приемлемую соль любого из вышеуказанных соединений и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рака, который представляет собой Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лим-фобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, эритролейкоз, трижды негативный рак молочной железы, рак молочной железы, рак яичников, меланому, рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак толстой и прямой кишок, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак печени, плоскоклеточную карциному полости рта, рак кожи, медуллобластому, ангиосаркому, рабдомиосаркому, липосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, гепатоцеллюлярную карциному, внутрипеченочную и внепеченочную холангиокарциному и аденокистозную карциному, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу,чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рака легких у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток, у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ инициации образования слуховых волосковых клеток у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диа-стереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диа-стереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении Т-клеточного острого лимф областного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоб-ластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака лег
ких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосар-комы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении рака легких.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении сенсонев-ральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при инициации образования слуховых волосковых клеток.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения Т-клеточного острого лимф областного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдо-миосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рака легких.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для инициации образования слуховых волосковых клеток.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток, у домашней собаки, включающий введение указанной домашней собаке терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ инициации образования слуховых во-лосковых клеток у домашней собаки, включающий введение указанной домашней собаке терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
Выражение "соединение 1, его диастереомер" означает 4,4,4-трифтор-^(^)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо [Т]пирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)бутанамид; или диастереомер 4,4,4-трифтор^-(^)-1-((^)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо [f]пирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, или 4,4,4-трифтор-N-((S)-1-(((R)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1H-бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид. Аналогично, выражение "соединение 2, его диасте-реомер" означает N-((2S)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид; или диастереомер N-((S)-1-(((S)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или N-((S)-1-(((R)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид.
Термин "пациент" означает млекопитающее, а "млекопитающее" включает, но не ограничивается
им, человека после постнатального периода. Постнатальный период у человека представляет собой период, начинающийся сразу после рождения ребенка и продолжающийся в течение 30 дней.
"Терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" означает дозу соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомер 2, или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомера 2, или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей любое из указанных выше соединений, необходимую для инги-бирования передачи сигналов Notch у онкологического пациента и либо разрушения раковых клеток-мишеней, либо замедления или остановки прогрессирования рака у пациента. Аналогично, "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" означает дозу соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомер 2, или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомера 2, или его фармацевтически эффективной соли, или фармацевтической композиции, содержащей любое из указанных выше соединений, необходимую для ингибирования передачи сигналов Notch у пациента с сенсоневральной тугоухостью, вызванной потерей или повреждением слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток.
" По существу, чистый диастереомер соединения 1 или соединения 2" означает изомер 1 или изомер 2, по существу, не содержащий другого изомера. Соединение 1 или соединение 2 является "по существу, диастереомерно чистым", если изомерная чистота в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2 составляет более 90% энантиомерного избытка. В другом варианте реализации изомерная чистота составляет более 95% энантиомерного избытка в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2. В другом варианте реализации изомерная чистота составляет более 98% энантиомерного избытка в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2. В другом варианте реализации изомерная чистота составляет более 99% энантиомерного избытка в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2. Все стереоизомеры, включая диастереомерные смеси соединения 1 или соединения 2, входят в границы объема настоящего изобретения.
Предполагаемые дозы соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака составляют от 0,1 до 100 мг/пациент/сутки. Предпочтительные дозы предположительно составляют от 1,0 до 75 мг/пациент/сутки. Наиболее предпочтительные дозы предположительно составляют от 2,0 до 50 мг/пациент/сутки. Предполагаемые дозы соединения 1, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей или повреждением слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток составляют от 0,01 до 100 мг/пациент/сутки. Предпочтительные дозы предположительно составляют от 0,1 до 10 мг/пациент/сутки. Наиболее предпочтительные дозы предположительно составляют от 0,2 до 1,0 мг/пациент/сутки.
Для лечения рака, сенсоневральной тугоухости или для образования слуховых волосковых клеток точную дозу, необходимую для лечения пациента, и продолжительность курса лечения определяет врач с учетом стадии и тяжести заболевания, а также особых потребностей и реакции конкретного пациента. Несмотря на то, что доза указана в посуточном выражении, схема введения может быть изменена для обеспечения более оптимального терапевтического эффекта для пациента и для регулирования и облегчения токсичности, связанной с лекарством. Помимо ежедневного введения, может быть уместно введение один раз в два дня (Q2D), один раз в два дня в течение пятидневного периода с последующими двумя днями без введения дозы (T.I.W.), один раз в три дня (Q3D), или один раз в неделю (Q.I.W.) в течение 21-дневного цикла введения доз, или другие схемы введения.
Термины "лечение", "лечить" или "лечащий" включают полный спектр вмешательств для лечения рака, сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей или повреждение слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток, например, введение активного соединения для облегчения, замедления или реверсирования одного или более симптомов и для отсрочки прогресси-рования рака или потери или повреждения слуховых волосковых клеток, от которого страдает пациент, или для инициации образования слуховых волосковых клеток у пациента.
" Домашняя собака" означает одомашненных собак и собак домашних пород, включая, но не ограничиваясь ими, домашних питомцев, собак-поводырей, собак-спасателей, пастушьих собак и собак, предназначенных для охраны скота.
"Слуховая тугоухость", "сенсоневральная тугоухость" или "потеря слуха" у человека означает, что слуховой порог (самый тихий воспринимаемый звук (интенсивность) при определенной частоте) у пациентов составляет от 21 до 40 дБ для легкой степени; от 41 до 55 дБ для умеренной степени; от 56 до 70 дБ для умеренно тяжелой степени; от 71 до 90 дБ для тяжелой степени и 91 дБ и более для абсолютной потери слуха. Интенсивность обычно тестируют в диапазоне от 0 до 120 дБ. Тестируемая частота обычно составляет 250, 500, 1000, 2000, 4000 и 8000 Гц. Диагностическую оценку слуха проводят стандартными способами тестирования, известными и используемыми специалистами в данной области техники, вклю
чая аудиометрию чистого тона, в том числе среднее значение чистого тона, речевую аудиометрию, в том числе порог восприятия речи, оценку акустических стволовых вызванных потенциалов (ABR или BAER), транстимпаническую электрокохлеографию (ECOG) и испытание отоакустической эмиссии (ОАЕ). Оценку у детей и младенцев также осуществляют стандартными способами тестирования, известными и используемыми специалистами в данной области техники, включая визуально подкрепленную аудиомет-рию, игровую аудиометрию, отоакустическую эмиссию (ОАЕ) и оценку акустических стволовых вызванных потенциалов.
Соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно составляют в виде фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемым носителем и вводят различными способами. Предпочтительно для лечения рака такие композиции предназначены для перорального введения.
Для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей или повреждением слуховых волос-ковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток может быть составлена и введена фармацевтическая композиция, подходящая для перорального или парентерального введения для обеспечения местной или системной терапии. Пероральные композиции включают таблетки, таблетки с покрытиями, твердые или мягкие желатиновые капсулы, растворы, эмульсии или суспензии. Парентеральные композиции могут быть составлены для обеспечения возможности введения, включая подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интраперитонеальные, интраплевральные, интра-стернальные, транстимпанические, внутрилабиринтные или интракохлеарные инъекции или инфузии. Фармацевтические композиции могут быть составлены для обеспечения биодоступности соединения согласно настоящему изобретению при введении композиции пациенту или могут быть составлены для обеспечения контролируемого или устойчивого высвобождения активного фармацевтического ингредиента. Предпочтительна фармацевтическая композиция, подходящая для транстимпанического введения в полость среднего уха и предпочтительно также введения в нишу круглого окна среднего уха. Предусмотрена также внутрилабиринтная инъекция и интракохлеарная инъекция. Предпочтительный способ введения для лечения тугоухости представляет собой транстимпаническую инъекцию, однако это не исключает фармацевтические композиции, подходящие для альтернативных способов введения для обеспечения системной доставки, и может включать композиции и схемы лечения, альтернативные или дополнительные для местного транстимпанического введения. Предпочтительна также система местной доставки с устойчивым высвобождением, в которой интервал высвобождения может варьироваться от 3 дней до 90 дней в зависимости от доставляющего носителя или смеси доставляющих агентов-носителей, в которые введено соединение 1, или его, по существу, чистый диастереомер, или его фармацевтически приемлемая соль.
Фармацевтические композиции, способы получения и системы доставки для направленной доставки лекарств хорошо известны в данной области техники (см., например, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., ред., 19-е изд., Mack Publishing Co., 1995); Salt and Plontke, "Principles of Local Drug Delivery to the Inner Ear", Audiol Neurotol, 2009, (14); 350-360; Rhee, et al., "Sustained-Release Injectable Drug Delivery," Pharmaceutical Technology, Special Issue Drug Delivery, 01 ноября 2010). Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, окрашивающие агенты, ароматизаторы, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты.
Соединение согласно настоящему изобретению может взаимодействовать со многими неорганическими и органическими кислотами с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Такие фармацевтически приемлемые соли и общие способы их получения общеизвестны в данной области техники (см., например, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, том 66, № 1, январь 1977).
Соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль могут быть получены многими способами, известными в данной области техники, а также способами, описанными ниже. Конкретные стадии синтеза могут быть объединены в различных вариантах для получения соединения 1, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.
Соединение 1 имеет название 4,4,4-трифтор^-(ДО)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1H-бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, и может также иметь название 4,4,4-трифтор-N-{(1S)-2-[(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1H-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-6-ил)амино]-1-метил-2-оксоэтил}бутанамид; и может также иметь название бутанамид, 4,4,4-трифтор-N-[(1S)-1-метил-2-оксо-2-[(2,3,5,6-тетрагидро-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-Ш-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-6-ил)амино]этил]-; и для однозначного описания соединения 1 могут быть использованы другие названия. Его диастереомеры имеют название 4,4,4-трифтор-№(^)-1-((^)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1H-бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксо-пропан-2-ил)бутанамид и 4,4,4-трифтор-N-((S)-1-(((R)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1H-бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид. Для однозначного описания
каждого из указанных диастереомеров могут быть использованы другие названия.
Соединение 2 имеет название №(^)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2^ f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, также может иметь название N-{(1S)-2-[(8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино]-1-метил-2-оксоэтил}-4,4,4-трифторбутанамид и также может иметь название бутанамид, 4,4,4-трифтор-N-[(1S)-1-метил-2-оксо-2-[(6,8,9,10-тетрагидро-8,8-диметил-6-оксо-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино]этил]-; и для однозначного описания соединения 2 могут быть использованы другие названия. Его диастереомеры имеют название N-((S)-1-(((S)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид и N-((S)-1-(((R)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид. Для однозначного описания каждого из указанных диастереомеров могут быть использованы другие названия.
Следует понимать, что соединение 1 и соединение 2 изображены с одним зафиксированным хи-ральным центром из двух хиральных центров. В данном контексте для описания конкретных изомеров использованы обозначения Кана-Ингольда-Прелога (R)- и (S)-. Конкретные стереоизомеры могут быть получены посредством стереоспецифического синтеза с применением энантиомерно чистых или обогащенных исходных материалов. Конкретные стереоизомеры исходных материалов, промежуточные соединения или рацемические смеси, содержащие соединение 1 или соединение 2, могут быть выделены способами, хорошо известными в данной области техники, такими как способы, представленные в публикациях Stereochemistry of Organic Compounds, E.I. Eliel and S.H. Wilen (Wiley 1994) и Enantiomers, Ra-cemates and Resolutions, J., Jacques, A. Collet, and S.H. Wilen (Wiley 1991), включая хроматографию на хиральных неподвижных фазах, ферментативное разделение или фракционную кристаллизацию или хроматографию диастереомеров, полученных специально для этого, таких как диастереомерные соли. Если хиральное соединение выделено или разделено на свои изомеры, но абсолютные конфигурации или оптическое вращение не установлены, то изомеры произвольно обозначают как изомер 1 и изомер 2 в соответствии с порядком их элюирования в хиральной хроматографии, а если хиральная хроматография проведена на ранних стадиях синтеза, то такое же обозначение применяют в отношении всех последующих промежуточных соединений и примеров. Хотя в настоящем изобретении предусмотрены все смеси, содержащие соединения согласно настоящему изобретению, предпочтительным вариантом реализации является соединение 1, изомер 2, или соединение 2, изомер 2.
Соединения, используемые в качестве первоначальных исходных материалов для синтеза соединений согласно настоящему изобретению, общеизвестны и в случае их отсутствия в продаже могут быть легко синтезированы с помощью представленных специальных ссылок посредством стандартных технологий, обычно используемых специалистами в данной области техники или представленных в общих литературных источниках.
Примеры известных методик и способов включают те, которые описаны в общих литературных источниках, таких как Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, т. 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5-е изд., Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4-е изд., ч. В, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, и т.д., а также в ссылках, цитированных в них.
В данном контексте следующие термины имеют указанное значение: "mAtoh1" относится к белку атонального гомолога 1 мышей; "hAtoh 1" относится к белку атонального гомолога 1 человека; "Atohl" относится к гену атонального гомолога 1 человека; "минимальная среда" относится к 500 мл среды DMEM/F12+5 мл N2 100Х маточного раствора и 10 мл В27 50Х маточного раствора плюс 500 мкл маточного раствора ампициллина (1000Х, 50 мг/мл) и 1667 мкл фунгизона (300Х); "BFGF" относится к основному фактору роста фибробластов; "DMEM" относится к среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко; "ДМСО" относится к диметилсульфоксиду; "ЭДТК" относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; "EGF" относится к эпидермальному фактору роста; "ЭГТК" относится к этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый эфир)-^^№,№-тетрауксусной кислоте; ЭР/МС относится к электрораспылительной масс-спектроскопии; "FBS" относится к эмбриональной бычьей сыворотке; "GFP" относится к зеленому флуоресцентному белку; "ч." относится к часу или часам; "HBSS" относится к сбалансированному солевому раствору Хэнкса; "HEK" относится к почке эмбриона человека; "IC50" относится к концентрации агента, которая вызывает 50% от максимального ингибирующего ответа, возможного для данного агента; "IgG" относится к иммуноглобулину G; "Mathl" относится к гену атонального гомолога 1 человека; "среда А" относится к 200 мл минимальной среды+EGF bFGF+IGF-1+гепарансульфат в концентрации 20, 10, 50 и 50 нг/мл соответственно; "MEM" относится к минимальной поддерживающей среде; "мин" относится к минутам; "МС" относится к масс-спектроскопии; "N1ICD" относится к внутриклеточному домену Notchl; "nGFP" относится к ядерному зеленому флуоресцентному белку; "ОС" относится к кортиеву органу; "PBS" относится к фосфатно-солевому буферному раствору; "PBST" относится к фосфатно-солевому буферному раствору+Tween(r); "кПЦР" относится к количественной полимеразной цепной реакции; "кОТ-ПЦР" относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипци
ей; "об/мин" относится к количеству оборотов в минуту; "буфер RLT" относится к лизисному буферу для выделения РНК, RNeasyLysis; "RT" относится к комнатной температуре; "Tbp" относится к ТАТА-связывающему белку.
Подготовительный синтез 1. 1-Бром-3-(2-бром-4-метоксифенил)пропан-2-он
н,с- [{
По каплям добавляли триметилсилилдиазометан (118,4 мл, 236,80 ммоль, 2 М в гексане) к перемешиваемому при 0°С раствору 2-(2-бром-4-метоксифенил)ацетилхлорида (52 г, 197,3 ммоль) в тетрагид-рофуране (197 мл) и ацетонитриле (197 мл) в атмосфере азота. Через 15 мин оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч в атмосфере азота. Концентрировали с получением густого красного маслянистого вещества (61 г). По каплям добавляли бромоводород (36 мл, 197 ммоль, 33% в уксусной кислоте) к перемешиваемому при 5°С раствору 2-(2-бром-4-метоксифе-нил)ацетилазида, полученного на предыдущей стадии, в уксусной кислоте (265 мл). После добавления оставляли нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота. Через 45 мин гасили смесью льда/воды (500 мл) с получением коричневого осадка. Отфильтровывали твердое вещество, промывали водой (100 мл) и гексанами (100 мл) и сушили под вакуумом при 45°С в течение 2 ч с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого маслянистого вещества (63,0 г, 99%). 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 7.17-7,12 (м, 2Н), 6,85 (дд, J=2,5, 8,5 Гц, 1H), 4,03 (с, 2Н), 3,97 (с, 2Н), 3,79 (с, 3Н).
Подготовительный синтез 2. (32)-1-(2-Бром-4-метоксифенил)-3-(3,3-диметилпирролидин-2-илиден)пропан-2-он
Вг Н3С
Одной порцией добавляли 3,3-диметилпирролидин-2-тион (26,5 г, 205 ммоль) к суспензии промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 1, 1-бром-3-(2-бром-4-метоксифенил)пропан-2-она (60,00 г, 186 ммоль) и йодида калия (31 г, 86 ммоль) в тетрагидрофуране (600 мл) при комнатной температуре и перемешивали в течение 1 ч. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (200 мл), отфильтровывали твердое вещество, и промывали осадок на фильтре метил-трет-бутиловым эфиром (100 мл) с получением 1-(2-бром-4-метоксифенил)-3-[(4,4-диметил-2,3-дигидропиррол-1-ий-5-ил)сульфанил]пропан-2-она йодида в виде светло-желтого твердого вещества (100 г). К суспензии твердого вещества (100 г, 201 ммоль) в ацетонитриле (1 л) добавляли триэтиламин (56 мл, 401 ммоль) и трифенилфосфин (58 г, 221 ммоль) и перемешивали при 65°С в течение 2,5 ч. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (200 мл) и отфильтровывали твердое вещество. Выпаривали фильтрат, растирали остаток с метил-трет-бутиловым эфиром (20 мл) и отфильтровывали твердое вещество (два раза). Выпаривали объединенные фильтраты с получением 50 г неочищенного вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 20-50% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде грязновато-белого твердого вещества (41 г, 70%). МС (m/z): 338,0/340,0 (М+/М+2).
Подготовительный синтез 3. 9-Метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-А][1] бензазепин-5(6Н)-он
Н3С-о
Дегазировали/продували азотом (х3) смесь промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 2, (32)-1-(2-бром-4-метоксифенил)-3-(3,3-диметилпирролидин-2-илиден)пропан-2-она (40,0 г, 118 ммоль), ацетата палладия (2,7 г, 12 ммоль), карбоната цезия (77 г, 237 ммоль), 4,5-бис-(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (13,7 г, 24 ммоль) и №метил-2-пирролидона (1,2 л). Нагревали суспензию при 150°С в течение 4 ч. Охлаждали до комнатной температуры, отфильтровывали твердое вещество, промывали этилацетатом и отбрасывали твердое вещество. К фильтрату добавляли этилацетат (1 л) и воду (500 мл), отфильтровывали твердое вещество через диатомовую землю и отбрасывали. Разделяли слои фильтрата, экстрагировали из водной фазы этилацетатом (2х20 мл), затем дихлорметаном (3x100 мл). Дважды промывали объединенные органические слои 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 100 мл темно-коричневого маслянистого вещества. Фильтровали вещество через слой диоксида кремния, элюируя дихлорметаном, затем 1%-ной смесью метанола/дихлорметана, и концентрировали фильтрат. Разделяли остаток между этилацетатом и 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия, проводили обратную экстракцию из водной фазы этилацетатом, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде темно-коричневого пенистого вещества. Растворяли
полученное пенистое вещество в этилацетате (250 мл), добавляли SiliaBond Thiol(r) (80 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Отфильтровывали твердое вещество, промывали осадок на фильтре этилацетатом и дихлорметаном, концентрировали фильтрат с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-коричневого твердого вещества (19,6 г, 65%). МС (m/z): 258,0 (М+Н).
Подготовительный синтез 4. 6-Гидроксиимино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а] [1]бензазепин-5(6Н)-он
Н3С-о
Несколькими порциями добавляли трет-бутоксид калия (11 г, 98 ммоль) к перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 3, 9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-А][1]бензазепин-5(6Н)-она (16,8 г, 65 ммоль) в тетрагидрофуране (336 мл), и перемешивали в течение 15 мин. По каплям добавляли амилнитрит (12,2 мл, 91 ммоль), и перемешивали смесь в течение 30 мин при 0°С. Выливали реакционную смесь в смесь лед/вода (200 мл), и экстрагировали смесь этилацетатом (2х200 мл). Отфильтровывали кристаллизованное твердое вещество, экстрагировали из фильтрата дихлорметаном (2х100 мл). Промывали объединенные органические вещества насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением светло-коричневого твердого вещества. Растирали твердое вещество с 1:1 смесью ме-тил-трет-бутилового эфира/гексана, объединяли с собранным ранее твердым веществом с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-желтого твердого вещества (16,5 г, 88%). МС (m/z):
287,1 (М+Н).
Подготовительный синтез 5. 6-Амино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а] [1]бензазепин-5(6Н)-он
Н3С-о
По каплям в течение 10 мин добавляли трифторуксусную кислоту (17 мл, 231 ммоль) к перемешиваемой при 5-10°С суспензии промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 4, 6-гидроксиимино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-5(6Н)-она (16,5 г, 58 ммоль) и цинковой пыли (11,3 г, 173 ммоль) в дихлорметане (248 мл), затем оставляли нагреваться до комнатной температуры. Фильтровали смесь через слой диатомовой земли, выливали фильтрат в смесь льда и насыщенного водного раствора бикарбоната натрия (1:1, 500 мл). Фильтровали полученную суспензию через диатомовую землю, и промывали фильтровальную подложку дихлорметаном. Экстрагировали из водного слоя дихлорметаном (100 мл), сушили объединенные органические слои сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-коричневого пенистого вещества (14,7 г, 94%). МС (m/z): 273,1 (М+Н).
Подготовительный синтез 6. Бензил-(28)-2-(4,4,4-трифторбутаноиламино)пропаноат
F J Н О
о сн3 I^JI
Добавляли гидрохлорид бензилового эфира L-аланина (7 г, 32,5 ммоль), диизопропилэтиламин (28 мл, 162 ммоль), гидрат гидроксибензотриазола (7,5 г, 49 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (9,3 г, 49 ммоль) к перемешанному раствору 4,4,4-трифтормасляной кислоты (7,1 г, 49 ммоль) в дихлорметане (162 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере N2 в течение 20 ч. Гасили 20%-ным водным раствором лимонной кислоты (150 мл), перемешивали смесь в течение 5 мин, разделяли слои и экстрагировали из водного слоя дихлорметаном (100 мл). Промывали объединенные органические слои насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (150 мл), сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением 10,6 г бледно-желтого твердого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 25-50% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (9,2 г, 94%). МС (m/z): 304,2 (М+Н).
Подготовительный синтез 7. (28)-2-(4,4,4-Трифторбутаноиламино)пропановая кислота
Chiral
F н О
о =
Добавляли палладий (1,8 г, 0,8 ммоль, 5% на С) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 6, бензил-(2S)-2-(4,4,4-трифторбутаноилами
но)пропаноата (8,8 г, 29 ммоль) в метаноле (88 мл) при комнатной температуре. Дегазировали смесь и перемешивали в атмосфере водорода (из баллона) в течение 5 ч. Фильтровали смесь через диатомовую землю, промывали фильтровальную подушку метанолом и концентрировали фильтрат с получением белого твердого вещества. Растирали твердое вещество с дихлорметаном и сушили под вакуумом в течение ночи при комнатной температуре с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (6,11 г, выход 99%). МС (m/z): 214,1 (М+Н).
Подготовительный синтез 8. Метил-3-(3,3-диметил-2-тиоксопирролидин-1-ил)пропаноат
н3с-° Y сн3
Растворяли 3,3-диметилпирролидин-2-тион (15,7 г, 122 ммоль) и метилакрилат (12 мл, 134 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавляли гидроксид натрия (0,8 г, 20 ммоль) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере азота. Разбавляли насыщенным солевым раствором, экстрагировали этилацетатом, разделяли слои, промывали органический слой насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 27,5 г неочищенного твердого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 20-50% этилацетата в гекса-нах, с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (25,9 г, 99%). МС (m/z): 216,2 (М+Н).
Подготовительный синтез 9. Метил-3-[(22)-2-(2-этокси-2-оксоэтилиден)-3,3-диметилпирролидин-1-ил]пропаноат
Добавляли тетракис(ацетато)диродий (II) (3,74 г, 8,5 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 8, метил-3-(3,3-диметил-2-тиоксопир-ролидин-1-ил)пропаноата (41,4 г, 192 ммоль) в толуоле (156 мл) и нагревали до 110°С в атмосфере азота. По каплям добавляли этилдиазоацетат (89 мл, 844 ммоль) в течение примерно 18 ч, затем нагревали в течение ночи при 110°С. Концентрировали и очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 30% смесью этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого маслянистого вещества (34,5 г, 67%). МС (m/z): 270,2 (М+Н).
Подготовительный синтез 10. Этил-(22)-2-(3,3-диметилпирролидин-2-илиден)ацетат
HN~X-CH3 О^.СН3
По каплям в течение 45 мин добавляли гексаметилдисилазид калия (301 мл, 0,5 М в толуоле, 151 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 9, метил-3-[(22)-2-(2-этокси-2-оксоэтилиден)-3,3-диметилпирролидин-1-ил]пропаноата (33,8 г, 126 ммоль) в тетрагидрофуране (430 мл) в атмосфере азота, используя баню из смеси воды/льда для поддержания температуры <30°С. После завершения добавления перемешивали в течение 40 мин. Гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (250 мл), затем концентрировали. Разделяли между диэтиловым эфиром и насыщенным солевым раствором, экстрагировали из водного слоя этилацетатом (х4), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 37 г вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 10%-ной смесью этил-ацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (9,1 г, 40%). МС (m/z): 184,2 (М+Н).
Подготовительный синтез 11. Этил-(22)-2-[3,3-диметил-1-(3-метил-2-пиридил)пирролидин-2-илиден]ацетат
В реакционном сосуде смешивали 2-бром-3-метилпиридин (1,5 г, 8,7 ммоль), промежуточное соединение, полученное подготовительным синтезом 10, этил-(22)-2-(3,3-диметилпирролидин-2-илиден)ацетат (1,6 г, 8,7 ммоль) и сим-диметилэтилендиамин (0,77 мл, 8,7 ммоль) в 1,4-диоксане (15 мл). Через раствор пропускали азот при перемешивании в течение 10 мин. Одной порцией добавляли карбонат калия (3,6 г, 26 ммоль) и йодид меди (I) (0,83 г, 4,4 ммоль), закрывали и нагревали перемешанную
смесь при 120°С в течение 2 дней. Разбавляли дихлорметаном, фильтровали через диатомовую землю и концентрировали фильтрат. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 5-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого маслянистого вещества (1,58 г, 66%). МС (m/z): 275,0 (М+Н).
Подготовительный синтез 12. 8,8-Диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-1^пирроло[1,2-а]азепин-6(8Н)-он
В реакционный сосуд шприцом добавляли бис-(триметилсилил)амид натрия (22 мл, 1 M в тетрагид-рофуране, 22 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 11, этил-(22)-2-[3,3-диметил-1-(3-метил-2-пиридил)пирролидин-2-илиден]ацетата (2,88 г, 10,5 ммоль) и тетрагидрофурана (60 мл). Закрывали сосуд и нагревали при 70°С при перемешивании в течение 3 дней. Охлаждали до комнатной температуры, гасили насыщенным солевым раствором, экстрагировали этилацетатом, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением коричневого маслянистого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 50-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (1,70 г, 71%). МС (m/z): 229,2 (М+Н).
Подготовительный синтез 13. 6-Азидо-10-аза-3,3-диметил-2,6-дигидро-Ш-пирроло[1,2-а] [ 1 ]бензазепин-5 -он
В течение 10 мин добавляли диизопропиламид лития (7,0 мл, 10,5 ммоль, 1,5 М в гексанах) к перемешиваемому при -78°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 12, 8,8-диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-6(8Н)-она (1,85 г, 8,1 ммоль) в тетрагидрофуране (50 мл) в атмосфере азота. Через 30 мин через шприц добавляли уксусную кислоту (2,3 мл, 41 ммоль), затем оставляли нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота. Гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Разделяли смесь между насыщенным солевым раствором и этилацетатом, разделяли слои, промывали этилацетатный слой насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением коричневого твердого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 5-60% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (1,2 г, 55%). МС
(m/z): 270,2 (М+Н).
Подготовительный синтез 14. 5-Амино-3,3-диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-6(8Н)-он
Добавляли цинковую пыль (1,2 г, 18 ммоль), затем хлорид аммония (5 г, 66 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 13, 6-азидо-10-аза-3,3-диметил-2,6-дигидро-Ш-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-5-она (1,2 г, 4,5 ммоль) в этаноле (50 мл) и воде (15 мл) при комнатной температуре. Через 1 ч разбавляли этилацетатом, отфильтровывали твердое вещество и концентрировали фильтрат. Суспендировали остаток между этилацетатом и насыщенным солевым раствором, разделяли слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 5-40% [10% 2М раствора аммиака в метаноле/дихлорметане] в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (0,72 г, 67%). МС (m/z): 244,2 (М+Н).
Добавляли (2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)пропановую кислоту (0,69 г, 3,6 ммоль), гидрат 1-гидроксибензотриазола (0,55 г, 3,6 ммоль) и диизопропилэтиламин (0,67 мл, 3,9 ммоль) к перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 14, 5-амино-3,3-диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-6(8Н)-она (0,72 г, 3,0 ммоль) в
Подготовительный синтез 15. трет-бутил-N-[(1S)-2-[(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигидро-1H-пирроло [ 1,2-а] [ 1]бензазепин-6-ил)амино]-1 -метил-2-оксоэтил]карбамат
тетрагидрофуране (10 мл) в атмосфере азота. Добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (0,68 г, 3,6 ммоль), и оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота. Через 2 ч разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Промывали органическое вещество насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 50-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (1,04 г, 84%). МС (m/z): 415,0 (М+Н).
Подготовительный синтез 16. (2S)-2-Амино-N-(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигидро-1Н-пирроло [ 1,2-а] [ 1 ]бензазепин-6-ил)пропанамида гидрохлорид
Добавляли хлороводород (12,5 мл, 50 ммоль, 4 M в диоксане) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 15, трет-бутил^-[(^)-2-[(10-аза-3,3-диметил-5 -оксо-2,6-дигидро-1 Н-пирроло [1,2-а][1] бензазепин-6-ил)амино]- 1-метил-2-оксоэтил] карбамата (1,04 г, 2,5 ммоль) в 1,4-диоксане (40 мл) и нагревали до 45°С при перемешивании. По завершении реакции по данным ЖХ-МС концентрировали смесь с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого желтого вещества (0,93 г, неочищенное). МС (m/z): 315,2 (М+1).
Пример 1. 4,4,4-Трифтор-N-((2S)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1H-бензо [Лпирроло [ 1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бу танамид
н3с-о
Часть 1. Диастереомерный 4,4,4-трифтор-N-((2S)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1 H-бензо [Лпирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)бутанамид.
Добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (12,4 г, 65 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 5,6-амино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1H-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-5(6Н)-она, и промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 7, (2S)-2-(4,4,4-трифторбутаноиламино)пропановой кислоты (10,9 г, 51 ммоль) в дихлорметане (294 мл) при комнатной температуре. Охлаждали смесь до 5°С, добавляли 1-гидроксибензотриазол (8,75 г, 65 ммоль) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение 10 мин. Промывали смесь водой (3x100 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением темного твердого вещества. Растирали с метил-трет-бутиловым эфиром с получением указанного в заголовке соединения (смесь диастереомеров) в виде грязновато-белого твердого вещества (22,0 г, 87%). МС (m/z): 468,1 (М+Н).
Часть 2. 4,4,4-трифтор-N-((2S)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-
бензо[f]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид изомеры 1 и 2.
Разделяли смесь диастереомеров, полученных в примере 1, части 1, на колонке Chiralpak AD, элюи-руя 10% смесью ацетонитрила/этанола (0,2% диметилэтиламина), с получением соединения изомера 1 (Rt=3,20 мин.) в виде белого твердого вещества (9,8 г, 38%) и соединения изомера 2 (Rt=7,37 мин) в виде белого твердого вещества (9,0 г, 36%). МС (m/z): 468,2 (М+Н) для обоих изомеров.
Пример 2. N-((2S)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид
Часть 1. Диастереомерный №{(^)-2-[(8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-:г]пирроло [1,2-а] азепин-5-ил)амино]-1 -метил-2-оксоэтил}-4,4,4-трифторбутанамид.
Добавляли 4,4,4-трифтормасляную кислоту (0,45 г, 3,2 ммоль), гидрат 1-гидроксибензотриазола (0,49 г, 3,2 ммоль) и диизопропилэтиламин (2,3 мл, 13,2 ммоль) к перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 16, (2S)-2-амино-N-(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигидро-1H-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-6-ил)пропанамида гидрохлорида (0,93 г, 2,6 ммоль) в тетрагидрофуране (50 мл) в атмосфере азота. Добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (0,61 г, 3,2 ммоль), и оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота в течение 16 ч. Разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Промывали
органический слой насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 75-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (смесь диа-стереомеров) в виде грязновато-белого твердого вещества (0,82 г, 71%). МС (m/z): 439,2 (М+1).
Часть 2. N-((2S)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-f]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид изомеры 1 и 2.
Разделяли смесь диастереомеров, полученных в примере 2, части 1, на колонке Chiralpak AD-H, элюируя 15% МеОН/СО2(газ), с получением изомера 1 (Rt=1,60 мин) в виде белого твердого вещества (194 мг, 24%, эпимеризуется до д.и. (диастереомерного избытка) 32%)) и изомера 2 (Rt=2,31 мин) в виде белого твердого вещества (469 мг, 57%). МС (m/z): 439,0 (М+Н) для обоих изомеров.
Рак все чаще рассматривают как гетерогенную совокупность заболеваний, возникновение и развитие которых вызвано аберрантной функцией одного или более генов, регулирующих репарацию ДНК, геномную стабильность, клеточную пролиферацию, гибель клеток, адгезию, ангиогенез, инвазию и метастаз в клеточном и тканевом микроокружении. Вариантная или аберрантная функция "раковых" генов может возникать в результате природного полиморфизма ДНК, изменений количестве геномных копий (посредством амплификации, делеции, утраты хромосом или дупликации), изменений в структуре генов и хромосом (посредством хромосомной транслокации, инверсии или другой перегруппировки, которая приводит к разрегулированной генной экспрессии) и точечных мутаций. Раковые неоплазмы могут быть вызваны одной аберрантной функцией гена, и они поддерживаются той же аберрантной функцией гена, или их сохранение и прогрессирование усилены дополнительными аберрантными функциями генов.
Помимо генетических хромосомных отклонений, упомянутых выше, каждый вид рака также может включать эпигенетические модификации генома, включая метилирование ДНК, геномный импринтинг и модификацию гистона ацетилированием, метилированием или фосфорилированием. Эпигенетическая модификация может играть роль в инициации и/или сохранении злокачественного заболевания.
Составлены обширные каталоги цитогенетических отклонений при раковых заболеваниях человека, и они поддерживаются и регулярно обновляются в режиме онлайн (см. базу данных хромосомных аберраций злокачественных новообразований, составленную Мительманом (The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer), на странице проекта по анатомии ракового генома (Cancer Genome Anatomy Project (CGAP)) Национального онкологического института США (NCI). Указанная база данных включает хромосомные отклонения, характерные, по меньшей мере, для некоторых злокачественных заболеваний согласно настоящему изобретению. Проект "Раковый геном" (Cancer Genome) института Сенгера научного фонда Wellcome Trust (Wellcome Trust Sanger Institute) поддерживает подробный онлайн " Реестр раковых генов" (Cancer Gene Census) всех человеческих генов, которые каузально связаны с опухолеобразованием, а также базу данных COSMIC (каталог соматических мутаций при раке) соматических мутаций при раке человека. Дополнительный источник, содержащий богатую информацию о ци-тогенетических изменениях, каузально связанных с различными раковыми заболеваниями, представляет собой "Атлас генетики и цитогенетики в онкологии и гематологии" (Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology).
Для диагностики раковых злокачественных заболеваний известны и широко используются методы биопсии, иммунофенотипирования и другие тесты. Помимо дифференциального окрашивания хромосом с высоким разрешением и технологии усовершенствованной хромосомной визуализации, хромосомные аберрации при подозрении на рак можно определить с помощью цитогенетического анализа, такого как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), кариотипирование, спектральное кариотипирование (SKY), мультиплексная FISH (M-FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH), наборы для анализа од-нонуклеотидного полиморфизма (чипы SNP) и другие диагностические и аналитические тесты, известные и используемые специалистами в данной области техники.
Онкогенная роль Notch впервые описана при Т-клеточном лейкозе человека, затрагивающем транслокацию внутриклеточного домена Notch1 в область промотора Т-клеточного рецептора Р, что приводит к сверхэкспрессии внутриклеточного домена Notch1 (Grabber et al. Nature Review Cancer, 2006(6): 347359; Weng et al. Science, 2004(306):269-271). Сверхэкспрессия внутриклеточного домена Notch1 в гемато-поэтических клетках-предшественниках мышей приводит к проявлению у мышей Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, как у человека. Помимо Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, появляется все больше данных о том, что сигналы Notch являются онкогенными при других раковых заболеваниях, действуя через многие механизмы, включая рецепторную амплификацию и сверхэкспрессию лигандов и/или рецепторов, включая острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз (Rosati et al., Blood, 2009(113): 856-865), острый миелогенный лейкоз (Sliwa et al. Int J Clin Exp Pathol. 2014(7(3)): 882-889), хронический миелогеный лейкоз (Nakahara et al., Blood, 2010(115(14)): 2872-2881) и эритролейкоз (Robert-Moreno et al., Leukemia. 2007(21): 1496-1503). Аберрантная конститутивная передача сигналов Notch вследствие мутации или сверхэкспрессии лигандов и/или рецепторов также участвует в ряде солидных опухолевых злокачественных заболеваний, включая трижды негативный рак молочной железы (Stoeck et al., Cancer Discovery, 2014(4): 1154-1167), рак молочной железы, рак яичников (Park et al. Cancer Research, 2006(66):6312-6318), меланому (Gast et al. Genes, Chromosomes & Cancer,
2010(49):733-745), рак легких, немелкоклеточный рак легких (Westhoff et al. PNAS, 2009(106):22293-
22298), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак толстой и прямой кишок, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак печени, плоскоклеточную карциному (полости рта), рак кожи и медуллобластому (Rangathan et al., Nature Review Cancer, 2011(11):338-351 и дополнительная информация S1 (таблица)). Аберрантная конститутивная передача сигналов Notch вследствие мутации или сверхэкспрессии лигандов и/или рецепторов также участвует в ангиосаркоме (Ravi et al., J Clin Oncol. 2007, (25(18S, 20 июня, Дополнение)): реферат 10030), рабдомиосаркоме (Belyea et al., Clin Cancer Res, 2011(17(23)): 7324-7336; Roma et al, Clin Cancer Res. 2011(17(3)): 505-513), липосаркоме (J Clin Oncol. 2009, (27(15S, Дополнение)): реферат 10526), злокачественной фиброзной гистиоцитоме (Wang et al., Cancer Res. 2012, (72): 1013-1022), гепатоцеллюлярной карциноме (Villanueva et al., Gastroenterology. 2012, (143): 1660-1669), внутрипеченочной и внепеченочной холангиокарциноме (Wu et al., Int J Exp Pathol. 2014, (7(6)): 3272-3279; Sekiya et al., J Clin Invest. 2012, (122(11)): 3914-3918; Yoon et al., World J Gastroenterol. 2011, (17(35)): 4023-4030) и аденокистозной карциноме (Bell et al., Annals of Diagnostic Pathology, 2014, (18): 10-13; Stoeck et al, Cancer Discov. 2014, (4): 1154-1167). Ингибирование передачи сигналов Notch представляет собой привлекательную мишень для обеспечения терапевтической пользы для онкологических пациентов, заболевание которых вызвано аберрантной активацией конститутивного пути передачи сигналов Notch. Shih et al. Cancer Research. 2007(67)1879-1882.
Одним из определяющих генов для развития волосковых клеток внутреннего уха является гомолог гена млекопитающих основного фактора транскрипции типа спираль-петля-спираль Atonal-1 (Atohl). Экспрессия Atohl в кохлеарных клетках необходима для генеза слуховых волосковых клеток. Просен-сорные эпителиальные клетки в развивающемся кортиевом органе, экспрессирующие Atohl, в дальнейшем подвергаются дифференцировке в слуховые волосковые клетки (Helms et al., Development 2000, (127(6)): 1185-1196), и Atohl является одним из наиболее ранних маркеров дифференцировки слуховых волосковых клеток. Поддерживающие клетки кортиева органа поддерживают способность развития характеристик волосковых клеток, включая формирование ресничек (Zheng et al., Nature Neuroscience, 2000,(3(6)): 580-586; Kawamoto et al., J Neurosci. 2003, (23(11)): 4395-4400; Izumikawa et al., Nat Med, 2005, (11(3)):271-276; и надлежащую функцию волосковых клеток (Kawamoto et al., 2003).
Каждая волосковая клетка в улитке окружена нечувствительными поддерживающими клетками, которые обеспечивают трофическую и структурную поддержку волосковых клеток и ганглий и являются необходимыми для сохранения надлежащей ионной концентрации в кортиевом органе посредством межклеточной коммуникации через щелевой контакт. Существует два типа волосковых клеток: внутренние и внешние волосковые клетки. Кохлеарные волосковые клетки у млекопитающих, включая людей, состоят из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов внешних волосковых клеток. Внутренние волосковые клетки являются фактическими сенсорными рецепторами, и 95% волокон слухового нерва, направленного в головной мозг, происходят из этой субпопуляции. Почти все окончания на внешних волосковых клетках находятся на эфферентных аксонах, которые образуются из клеток головного мозга, и эти клетки действуют как предварительные усилители звука. Поддерживающие клетки играют ключевую роль в образовании слуховых волосковых клеток после утраты или повреждения слуховых волоско-вых клеток. Во время развития волосковые и поддерживающие клетки развиваются из общего предшественника, и при появлении волосковой клетки в окружающие клетки поступает сигнал, приводящий к их развитию, в поддерживающие клетки посредством контактного ингибирования, опосредованного сигнальным каскадом Notch (Kelley, Nat Rev Neurosci. 2006, (11): 837-849).
На основании способности поддерживающих клеток к трансдифференцировке в слуховые волоско-вые клетки, а также на основании их общего пути развития постулировано, что поддерживающие клетки могут выполнять функцию предшественников волосковых клеток (Parker et al., Audiology and Neurootol-ogy. 2004, (9(2)): 72-80). В нескольких исследованиях показано, что параллельное подавление клеточного цикла поддерживающих клеток может приводить к образованию слуховых волосковых клеток у млекопитающих (Lowenheim et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999, (96): 4084-4088; Torchinsky et al., J Neurocvtol, 1999, (28(10-11)): 913-924; Minoda et al., Hear Res. 2007, (232): 44-51). Таким образом, поддерживающие клетки взрослого млекопитающего сохраняют способность к трансдифференцировке в слуховые волос-ковые клетки, если они могут свободно вступить в клеточный цикл.
Медикаментозная терапия для восстановления слуховых волосковых клеток является новым подходом, и интратимпаническое введение жидкости в среднее ухо, предпочтительно в нишу круглого окна, без фактической инъекции в улитку в терапевтической дозе и в течение подходящего времени может эффективно активировать экспрессию Atoh1 для трансдифференцировки поддерживающих клеток улитки в слуховые волосковые клетки. В публикации Mizutari et al., Neuron. 2013, (77(1)): 58-69 показано, что доставка в среднее ухо ингибитора гамма-секретазы (LY411575) может быть использована для регенерации слуховых волосковых клеток, утраченных вследствие акустической травмы, у мышей, и что новое поколение волосковых клеток, образованных из поддерживающих клеток, приводит к значительному поддающемуся измерению восстановлению слуха. В указанной работе представлены концептуальные данные о терапевтическом эффекте ингибирования сигнального пути Notch на образование слуховых волосковых клеток и восстановление слуха в модели на мышах, а также представлено механистическое
объяснение данного физиологического эффекта (дифференцировка поддерживающих клеток в слуховые волосковые клетки). Показана дозолимитирующая токсичность при системном введении LY411575.
Следующие in vitro и in vivo исследования демонстрируют ингибирующее действие на сигнальный путь Notch и эффективность соединений 1 и 2 или их, по существу, чистых диастереомеров в отношении конкретной линии раковых клеток. Представленные анализы общепризнаны специалистами в данной области техники как свидетельствующие о клинической химиотерапевтической активности при применении у людей. Ингибирование расщепления внутриклеточного домена Notch под действием у-секретазы предположительно является эффективным в отношении каждого из рецепторов Notch 1, Notch 2, Notch 3 и Notch 4. Анализы, свидетельствующие об ингибирующей активности в отношении сигнального пути Notch, могут быть проведены, по существу, так, как описано ниже, или подобными способами, приводящими к получению аналогичных данных.
Анализ клеточной визуализации накопления N1ICD Notch 1 в ядре.
Клетки HEK293AB12 (клетки HEK293 конструировали для устойчивой экспрессии мышиной кДНК Notch1, кодирующей аминокислоты 1703-2183, NP 032740.3 (полноразмерный мышиный белок-предшественник Notch 1: SEQ ID N0:1), с сигнальной пептидной последовательностью из 23 аминокислот, MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR (SEQ ID N0:2) на N-конце) помещали на 96-луночные планшеты в концентрации 5000 клеток на лунку, инкубировали в среде Игла, модифицированной по способу Дуль-бекко (DMEM), с высоким содержанием глюкозы и 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) при 37° С, 5% СО2 в течение 24 ч. Клетки обрабатывали исследуемым соединением, вводя дозы в 10 точках с разбавлениями 1:3 в диапазоне от 1000 до 0,05 нМ, и с конечной концентрацией диметилсульфоксида (ДМСО) 0,2%. Через 24 ч обработки клеточные планшеты процессировали, применяя последовательно следующие стадии: фиксировали клетки с помощью 100 мкл на лунку фиксатора PREFER(tm) в течение 30 мин при комнатной температуре (RT); пермеабилизировали клетки с помощью 100 мкл на лунку 0,1% TRITON(r) X100 в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре; промывали 3 раза, каждый раз используя 100 мкл на лунку PBS; добавляли 50 мкл на лунку кроличьего анти-NHCD (внутриклеточный домен Notch1) антитела в разбавлении 1:2000 в PBS с 1% альбумина бычьей сыворотки и инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С; промывали 3 раза, каждый раз используя 100 мкл на лунку PBS; инкубировали с 50 мкл на лунку козьего антикроличьего IgG (иммуноглобулин G) Alexa 488 в разбавлении 1:1000 в PBS с 1% альбумина бычьей сыворотки, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С; промывали 3 раза, каждый раз используя 100 мкл на лунку PBS, и добавляли 100 мкл на лунку 15 мкМ раствора йодида пропидия с 50 мкг/мл РНКазы в течение 30 мин для окрашивания ядер. Планшеты сканировали с помощью флуоресцентного цитометра с лазерным сканированием для микропланшетов ACUMEN EXPLORER(tm) (TTP LABTECH LTD) для измерения общего количества клеточных ядер на лунку и общей площади ядер на лунку при флуоресценции при 655-705 нм (эмиссия ДНК, связанной с йодидом пропидия) и при флуоресценции антитела, связанного с N1ICD в области ядра, при 505-530 нм. Главным результатом анализа является отношение общей флуоресценции ядерного N1ICD к общей площади ядра, нормализованный сигнал ядерного N1ICD. Относительный профиль цитотоксич-ности определяли как % количества клеток к количеству контрольных клеток с 0,2% ДМСО. Образуется антитело, которое распознает расщепленный Notch1 или N1ICD, к человеческому пептиду, соответствующему аминоконцевому сайту расщепления человеческого Notch1 в положении Vai1744. В необработанных контрольных клетках N1ICD, образованный из Notch1, транслоцируется и накапливается в ядре. При обработке клеток соединением-ингибитором расщепления Notch 1 сигнал ядерного N1ICD снижается. Зависимость от концентрации и IC50 определяли аппроксимацией кривой к четырехпараметрической логистической функции для сигнала ядерного N1ICD, а % количества клеток наносили на тот же график для определения профиля цитотоксичности. Выполняя анализ, по существу, так, как описано выше, определяли среднюю IC50 для соединения 1, изомера 2, которая составила 0,37 нМ (+/-0,16; n=2), и для соединения 2, изомера 2, которая составила 1,55 нМ (+/-1,12; n=2). Ни одно из соединений не влияло на количество клеток при их использовании в концентрации до 1000 нМ. Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение 1, изомер 2, и соединение 2, изомер 2, обладают аффинностью к Notch 1 и ингибируют внутриклеточное накопление внутриклеточного домена Notch 1 клеточного сигнального пептида.
In vivo испытания ингибирования мишени исследования на животных.
Для оценки in vivo влияния соединения 1, изомера 2, и соединения 2, изомера 2, на подавления фармакодинамики (ФД) процессинга Notch проводили исследования на животных, используя мышей Balb/C, не являющихся опухоленосителем (Charles River). Для каждой группы использовали по 5 мышей. Мышам обеспечивали доступ к нормальному корму ad libitum. Лечение начинали с перорального введения (через зонд) соединения или носителя (1% Na-КМЦ в 0,25% Tween-80) в объеме 0,2 мл. В заданные моменты времени (через 4 или 8 ч после введения доз) после лечения животных усыпляли посредством асфиксии с CO2 и цервикальной дислокации. Извлекали ткани (легкие) и использовали для анализа ФД ответа, измеряемого по расщепленному N1ICD.
Анализ N1ICD.
Для оценки уровня N1ICD в легких из замороженной ткани вырезали примерно 75 мг и мелко нарезали перед гомогенизацией (записывали фактическую массу). Замороженные образцы опухоли переносили в пробирки для лизиса Matrix-D(tm) и ресуспендировали в ледяном лизисном буфере XY (25 мМ Tris, pH 7,5, 10 мкг/мл ингибитора трипсина/химотрипсина, 10 мкг/мл апротинина, 60 мМ бета-глицерофосфата , 1% Triton(r) Х-100, 10 мМ NaF, 2,5 мМ пирофосфата, 150 мМ NaCl, 15 мМ этилендиа-минтетрауксусной кислоты (ЭДТК), рН 8,0, 5 мМ этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N'N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТК), рН 8,0, 1 мМ ванадата Na, 10 мкг/мл лейпептина, 1 мМ дитиотреитола, 1 мкМ микроцистина LR, 10 мкг/мл N-п-тозил-L-фенилаланин-хлорметил-кетона (TPCK), 2 мМ гидрохлорида метилового эфира Na-п-тозил-L-аргинина (TAME), 15 мМ ди(трис) соли 4-нитрофенилфосфата (PNPP), 0,1 мМ гидрохлорида 4-(2-аминоэтил)бензлсульфонилфторида (AEBSF), 5 мМ бензамидина, 1 мкМ окадаиковой кислоты, содержащем 1X таблетку Complete (Roche Complete(tm) № 11697498001) и 1X коктейль ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich P8340) в соотношении массы:объема 75 мг/мл буфера. Ткани гомогенизировали в гомогенизаторе Fast Prep FP120 (Thermo Scientific, Рокфорд, штат Иллинойс) при скорости 6,0 в течение 30 с при 4°С, затем инкубировали на льду в течение 15 мин. Процедуру повторяли, в целом, 2-3 цикла до полной гомогенизации. Лизаты вращали в центрифуге Eppendorf при 4°С при 30000 об/мин в течение 15 мин для удаления дебриса. Извлекали 400 мкл надосадочной жидкости, переносили в новую пробирку Eppendorf и подвергали циклу замораживания/оттаивания. Образцы снова вращали в центрифуге Eppendorf при 4°С при 30000 об/мин в течение 30 мин и собирали для анализа 120 мкл надосадочной жидкости. Общую концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Pierce BCA(tm) (Thermo Scientific, Рокфорд, штат Иллинойс), используя планшет-ридер Thermo-max(tm) (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния). Концентрацию N1ICD определяли с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного анализа N1ICD. Аналит фиксировали расщепленным Notch1(Val1744)-специфическим обычным кроличьим моноклональным антителом и обнаруживали с помощью С-концевого Notch1 SULFO-TAG(tm) (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, штат Мэриленд) поли-клонального козьего антитела (R &D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота). Лизаты разбавляли до 2 мкг/мкл в ледяном лизисном буфере Tris для иммуноферментного твердофазного анализа (R6OTX) (Me-so Scale Discovery, Гейтерсберг, штат Мэриленд), содержащем 1X таблетку Complete (Roche Complete(tm) мини, № 11836153001) и 1X коктейль ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich P8340), и помещали 25 мкл на планшет для иммуноферментного твердофазного анализа. Инкубацию 50 мкг лизата белка проводили при комнатной температуре в течение одного часа для фиксации аналита и с детекторным антителом. Планшеты считывали на приборе Sector Imager 6000(tm) (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, штат Мэриленд). Фоновый вычитаемый N1ICD нормировали к общему содержанию белка и выражали как % инги-бирования относительно группы, обработанной носителем. % Ингибирования N1ICD и статистическую значимость (значение р), измеренную методом Дуннета на опухолях, собранных через 4 ч после введения последней дозы соединения 1, изомера 2, или соединения 2, изомера 2, анализировали, по существу, так, как описано выше, и обобщали данные в табл. 1.
Таблица 1
Соединение
Доза (мг/кг)
Время (ч.) после лечения
Ингибирования
N1ICD (Ср ±СОС; п=1)
Значение р
Изомер 2
70±12
< 0,0001
Изомер 2
65±11
< 0,0001
Изомер 2
100
92±3
< 0,0001
Изомер 2
87±3
< 0,0001
Изомер 2
52±31
0,0054
Изомер 2
11±13
Незначимое
Изомер 2
6±15
Незначимое
Изомер 2
0,3
-7±26
Незначимое
Изомер 2
65±11
< 0 0001
Изомер 2
15±14
Незначимое
Данные в табл. 1 свидетельствуют об ингибировании расщепления N1ICD соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, в легочной ткани мышей. Данные в табл. 1 дополнительно демонстрируют in vivo корреляцию с данными функциональной активности, описанными выше.
Инициация экспрессии mAtoh1 в слуховых сферах.
В общем, выделение клеток Корти осуществляли на 0 день в основном способом, описанным в публикации Oshima et al., Methods Mol Biol., 2009; 493: 141-162. Выращивание и размножение клеток проводили в течение 3-4 дней. На 3 или 4 день клетки помещали на планшет и обрабатывали исследуемым соединением. В течение следующих 7 дней клетки оставляли для прикрепления и дифференцировки. На 10 или 11 день проводили лизис клеток и выделение РНК. кОТ-ПЦР TaqMan проводили на 12 день, а результаты экспрессии Atoh1 и Tbp1 анализировали на 13-15 день.
Выделение клеток.
Окружающую ткань из каменистой части височной кости извлекали из постнатальных мышей в возрасте от 1 до 4 дней (трансгенная линия: mAtoh1-управляемый nGFP; Lumpkin EA, et al., Gene Expr Patterns, 2003; (36): 389-95 обоих полов). Полукруглые улитки уха отделяли от вестибулярной системы с помощью кусачек. На этой стадии развития костный лабиринт не полностью кальцифицирован и легко разрезается кусачками. Осторожно открывали костный лабиринт улитки уха и извлекали спиральную связку и прикрепленный кортиев орган, свернутые вместе по спирали стержня улитки, апикально раскручивая со стержня улитки. Начиная с основания отделяли спиральную связку от кортиева органа с помощью тонких кусачек.
Переносили иссеченный кортиев орган (ОС) в отдельные пробирки объемом 1,5 мл, наполненные 850 мкл ледяного HBSS. В одну пробирку помещали до 12 тканей ОС. Быстро осаждали ткани ОС центрифугированием и удаляли HBSS. Разделяли клетки, добавляя 100 мкл предварительно нагретого раствора TrypLE(tm) Select (Life Technologies), и инкубировали при 37°С в течение 13 мин. Быстро осаждали разделенные ткани ОС центрифугированием. Удаляли раствор TrypLE(tm) Select. Добавляли 100 мкл среды A (DMEM/F12 с добавлением N2 (LifeTechnologies) с добавлением В27 (LifeTechnologies), ампициллина (50 мкг/мл) и фунгизона (LifeTechnologies), EGF (20 нг/мл), bFGF (10 нг/мл), IGF-1 (50 нг/мл) и ге-парансульфата (50 нг/мл)). Затем иссеченную и переработанную ткань измельчали с помощью кончика пипетки Р200. Удаляли клеточные агрегаты и дебрис; переносили клеточную суспензию и промывали через предварительно смоченный сетчатый фильтр для клеток с размером отверстий 70 мкм, сливая суспензию в одну чистую культуральную пробирку. Промывали пробирки, использованные для разделения, и сетчатый фильтр для клеток достаточным количеством среды А и объединяли с клеточной суспензией. Подсчитывали плотность клеток с помощью гемоцитометра или Countess(r) (Life Technologies). В клеточную суспензию добавляли свежую среду А до достижения конечной плотности до нанесения на планшет 1,0Е5 клеток на мл и наносили на культуральный планшет с ультранизким связыванием, Т-75 (Greiner).
Выращивание в суспензии для размножения ОС сфер.
Диссоциированные одиночные клетки выращивали на культуральном планшете с ультранизким связыванием (Greiner) в среде А в течение 3-4 дней в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 при 37°С с получением клонально выращенных сфер, называемых сферами первого поколения, из плавающих клеток. В случае налипания клеток на чашки с низким связыванием в процессе их выращивания их можно отделить посредством осторожного перемешивания.
Связывание и обработка культуры.
После выращивания сфер в течение 3-4 дней визуально подсчитывали количество сфер с помощью микроскопа для стандартизации плотности посева слуховых сфер на один мл для данной стадии. Собирали клетки центрифугированием и ресуспендировали сферы в минимальной среде в концентрации примерно 2000 сфер на мл. Высевали сферы в объеме 150 мкл на лунку 96-луночного обработанного планшета для клеточных культур с получением примерно 300 сфер на лунку. Обрабатывали сферы экспериментальными агентами в четырех экземплярах в конечном объеме 200 мкл в минимальной среде (DMEM/F12, с добавлением N2 (LifeTechnologies), с добавлением В27 (LifeTechnologies), ампициллина (50 мкг/мл) и фунгизона (LifeTechnologies)). Выращивали обработанные сферы в течение 7 дней в увлажненном инкубаторе с регулируемой температурой при 5% CO2, 37°С. Удаляли среду и проводили экстракцию РНК.
Экстракция РНК.
Добавляли буфер RLT Plus (Qiagen) с добавлением 1% бета-меркаптоэтанола, 175 мкл на лунку. В каждую лунку добавляли 2,5 мкл 4 нг/мкл раствора носителя РНК (микро-набор RNeasy(r) Plus; Qiagen), разбавленного в буфере RLT Plus, затем проводили экстракцию РНК. Общую РНК экстрагировали с помощью микро-набора RNeasy(r) Plus (Qiagen) по инструкциям производителя.
Синтез кДНК.
Синтез кДНК проводили с помощью системы синтеза первой цепи Superscript(r) III (LifeTechnolo-gies, № по каталогу 18080-051) по протоколу производителя, используя случайные гексамеры для синтеза кДНК. Разбавляли кДНК до 50%, добавляя 21 мкл ультрачистой воды, не содержащей нуклеазы. 5 мкл разбавленной кДНК использовали для кПЦР.
кПЦР.
Для количественного измерения экспрессии маркеров волосковых клеток из культур обработанных сфер проводили кПЦР с зондами для обнаружения рассматриваемого гена mAtoh1 и эндогенного кон
трольного гена в одной, двухцветной мультиплексной реакции. Использовали мастер-микс экспрессии гена TaqMan (LifeTechnologies, 4369016) и рассматриваемый зонд (Atohl; Mm00476035_s1 и эндогенный контрольный зонд (Tbp1; Mm00446971_m1, LifeTechnologies) по инструкциям производителя. Для каждого зонда поддерживали постоянные условия. Относительную генную экспрессию между экспериментальными группами анализировали методом ААСТ и усредняли данные повторных измерений. Эксперименты проводили как минимум в трех экземплярах и записывали как истинное среднее значение.
Таблица 2
Соединение
RQ при 10 нМ
RQ при 100 нМ
RQ при 1 мкМ
1, Изомер 2
1,43±0,17"
1,76±0,17*
1,64±0,13*
2, Изомер 2
1,14±0,07
1,21±0,13
1,57±0,11"
Данные в табл. 2 демонстрируют относительные количественные значения (RQ) экспрессии Atoh1, маркера образования волосковых клеток, в слуховых сферах, обработанных каждым из соединения 1, изомера 2, и соединения 2, изомера 2, в трех концентрациях (10, 100 нМ и 1 мкМ). Данные (± стандартная ошибка среднего, СОС) представляют кратность инициации генной экспрессии относительно отрицательных контрольных образцов, обработанных носителем (ДМСО). (* - значимая разность относительно отрицательного контроля, р <0,05).
Инициация экспрессии hAtoh1 в клеточных линиях опухолей человека.
Для оценки эффективности соединения 1, изомера 2, и соединения 2, изомера 2, в отношении их способности инициировать экспрессию hAtoh1 использовали клеточную линию опухоли человека. Эндогенная регуляция передачи сигналов Notch для данной клеточной линии аналогична регуляции во внутреннем ухе. В общем, представленный анализ проводили в соответствии с принципами, описанными в публикации Kazanjian et al., Gastroenterology, 2010, 139(3): 918-928 and Supplementary Materials and Methods.
В общем, использовали стандартные технологии выращивания клеток. Клеточную линию адено-карциномы толстой и прямой кишок человека с низким числом пересевов LS174T (АТСС CL-188), поддерживаемую в питательной среде (MEM с 10% FBS), помещали в 96-луночные обработанные планшеты для тканевых культур в концентрации 10000 клеток на лунку в 100 мкл аналитической среды (MEM с 1% FBS).
На следующий день проводили полулогарифмические серийные разбавления 10 мМ исходных растворов исследуемых соединений (разбавленных в 100% ДМСО) с получением одиннадцати понижающихся доз лекарственного соединения. Конечные концентрации составляли от 10 мкМ до 0,127 нМ. Использовали 3,16-кратное серийное разбавление с концентрациями ДМСО в каждой лунке 100%. Следующее разбавление 1:10 исходного разбавления ДМСО проводили в аналитической среде. Другое разбавление 1:100 также проводили в аналитической среде.
100 мкл растворов исследуемых соединений добавляли в каждую лунку, содержащую клетки и питательную среду, и выращивали в течение 72 ч при 37 °С в 5% СО2.
Клетки собирали с планшетов на 4 день и экстрагировали и очищали РНК, используя набор для РНК RNeasy(r) Plus 96 (Qiagen) по протоколу производителя.
Синтез кДНК проводили с помощью системы синтеза первой цепи Superscript(r) III (LifeTechnolo-gies, 18080-051) по протоколу производителя, используя случайные гексамеры для синтеза кДНК. кДНК разбавляли до 50%, добавляя 21 мкл ультрачистой воды, не содержащей нуклеазы. 5 мкл разбавленной кДНК использовали для кПЦР.
кПЦР.
Для количественного определения экспрессии маркеров волосковых клеток из культур обработанных сфер проводили кПЦР с зондами для обнаружения экспрессии hAtoh1 или ТВР в одной двухцветной мультиплексной реакции. Для измерения относительной генной экспрессии для каждого образца использовали мастер-микс экспрессии генов TaqMan (LifeTechnologies, 4369016) и рассматриваемый зонд (человеческий Atoh1; LifeTechnologies, ID для анализа Hs00944192_s1) и эндогенный контроль (человеческий ТВР; LifeTechnologies, ID для анализа Hs00427620_m1) по инструкциям производителя. Для каждого зонда поддерживали постоянные условия. Относительную генную экспрессию между экспериментальными группами анализировали методом ААСТ, и усредняли данные повторных измерений.
Проводили четыре отдельных анализа для получения значений IC50 для каждого исследуемого соединения. Значение IC50 определяли аппроксимацией данных, полученных в зависимости от концентрации, к модели зависимости "log(антагониста) от ответа (три параметра", используя программное обеспечение GraphPad Prism(r), для 12 доз в диапазоне концентраций от 4,0Е-11 до 1,0Е-6 М, анализируя, в целом, 108 точек для каждого соединения. Значения IC50 для соединения 1, изомера 2, и для соединения 2, изомера 2, представлены в табл. 3.
Данные в табл. 3 демонстрируют значения IC50 для соединения 1, изомера 2, и для соединения 2, изомера 2, рассчитанные в данном анализе по относительной экспрессии hAtoh1, маркера образования слуховых волосковых клеток.
Реакция на соединения в анализе эксплантата кортиева органа.
В общем, выращивание органотипического эксплантата кортиева органа осуществляли на 0 день в соответствии со способом, описанным в публикации Parker et al., Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), el685. Выращивание эксплантата проводили в течение 4-7 дней, после чего культуру либо готовили для клеточного лизиса для кОТ-ПЦР, либо для тканевой фиксации для иммуногистохимии.
Выделение и выращивание эксплантатов кортиева органа.
Слуховой пузырь и окружающую ткань из каменистой части височной кости извлекали из постна-тальных мышей в возрасте от 1 до 4 дней (трансгенная линия: Atoh1 - управляемый nGFP; Lumpkin E.A. et al., Gene Expr Patterns, 2003, (36):389-95) обоих полов. Кортиевы органы иссекали в растворе Хэнкса, удаляли спиральную связку и помещали эксплантаты на покровные стекла, покрытые полиТ^-орнитином (0,01%, Sigma) и ламинином (50 мг/мл, Becton Dickinson) с получением препарата с плоской кохлеарной поверхностью. Затем каждый кохлеарный эксплантат помещали в одну лунку 24-луночного планшета (Falcon) и выращивали в среде DMEM (Invitrogen) с 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки и пенициллином-стрептомицином (LifeTechnologies). Экспериментальные соединения добавляли вместе со средой на 0 день и заменяли каждые 2-3 дня. Все культуры выдерживали в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 при 37°С.
Анализ генной экспрессии с помощью кОТ-ПЦР.
Экстракцию РНК проводили посредством лизиса ткани эксплантата с применением 35 мкл буфера RLT Plus (Qiagen) на лунку, и общую РНК очищали с помощью мини-набора RNeasy(r) Plus (Qiagen). Синтез кДНК осуществляли с помощью системы синтеза первой цепи Superscript(r) III (LifeTechnologies), используя случайные гексамеры. Для количественного измерения индукции экспрессии маркеров волос-ковых клеток проводили кПЦР с мастер-миксом экспрессии генов TaqMan (LifeTechnologies, 4369016) и зондами для обнаружения рассматриваемых генов (например, hAtoh1; ID для анализа Mm00476035_s1, Pou4f3; ID для анализа Mm04213795_s1 и Муо7а; ID для анализа Mm01274015_m1, LifeTechnologies) и эндогенным контрольным геном, Tbp (ID для анализа Mm00446971_m1, LifeTechnologies). Относительную генную экспрессию между экспериментальными группами анализировали методом ААСТ и усредняли данные повторных измерений. Эксперименты проводили как минимум в трех экземплярах и записывали как истинное среднее значение.
Таблица 4
Соединение
Atohl
Pou4f3
Муо7а
1, Изомер 2
3,72±0,S4
2,04±0,35
1,73±0,33
2, Шомер 2
3,10±0,69
1,65±0,25
1,49±0,22
Данные в табл. 4 демонстрируют относительные количественные значения (RQ) экспрессии маркеров образования волосковых клеток, Atoh1, Pou4f3 и Муо7а, в эксплантатах кортиева органа, обработанных соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, в концентрации 1 мкМ. Данные (±СОС) представляют кратность инициации генной экспрессии относительно образцов, обработанных отрицательным контролем.
Иммуноокрашивание новых волосковых клеток, экспрессирующих Atoh1.
После выращивания эксплантата ткани фиксировали в 24-луночном планшете с помощью 200 мкл смеси Cytofix/Cytoperm (BD) в течение 30 мин, промывали PBS, содержащим TritonXl00 (PBST), и окрашивали с помощью 200 мкл раствора первичного антитела, состоящего из 4% нормальной ослиной сыворотки в PBST с козьим анти-GFP (1:2500; AbCAM, ab5450) и кроличьим антимиозином VIIa (1:1000; Proteus Bioscience № 25-6790) в течение 1 ч. Затем ткани тщательно промывали PBST и окрашивали раствором вторичного антитела, состоящим из Alexa Fluor 488 ослиного антикозьего IgG (1:1000; Invitrogen, A-11055) и Alexa Fluor 568 ослиного антикроличьего IgG (1:1000; Invitrogen, A10042), в течение 1 ч. Затем их тщательно промывали PBST и устанавливали на предметные стекла для микроскопа. Отдельные волосковые клетки идентифицировали по экспрессии Atoh1-суррогатного маркера GFP (зеленый) и миозина VIIa (красный), визуализировали, а затем считывали в интервале 100 мкМ в среднеапикальной области для изучения образования зарождающихся волосковых клеток в экспериментальных обработанных соединением образцах по сравнению с количеством волосковых клеток в необработанных образцах или в образцах, обработанных отрицательным контролем (биологически неактивным соединением). Количество клеток подсчитывали в слепом режиме в пяти отдельных экспериментах.
Данные в табл. 5 демонстрируют количество внешних волосковых клеток в эксплантатах кортиева органа, выращенных в течение четырех дней в присутствии соединения 1, изомера 2 (n=13), или соединения 2, изомера 2 (n=15), при 1 мкМ, и иммунноокрашенных для GFP (суррогатного маркера Atoh1) и миозина VIIa. Процентное увеличение волосковых клеток выражено относительно образцов, обработанных отрицательным контролем.
Анализ генной экспрессии после ототоксичного повреждения.
Для моделирования регенерации волосковых клеток в ответ на лечение исследуемым соединением после ототоксичного повреждения использовали вариант культуры органотипического эксплантата кор-тиева органа. Данную модель повреждения осуществляли в соответствии со способом, описанным в публикации Korrapati et al., PLOSOne, 2013, 8(8), e73276, в которой описано 95%-ное сокращение средне-апикальных волосковых клеток. На 0 день для повреждения и выборочного уничтожения волосковых клеток в эксплантате кортиевая органа осуществляли обработку аминогликозидом (гентамицин (100 мкМ)) в течение 18-24 ч. На 1 день гентамицин удаляли и начинали обработку соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2 в концентрации 5 мкМ. Выращивание эксплантатов продолжали, в целом, 4 дня, после чего культуру готовили к проведению протокола кОТ-ПЦР, описанного выше. Можно наблюдать очевидное подтверждение вызванного гентамицином повреждения в культурах, обработанных соединениями отрицательного контроля. Однако количественное измерение для определения реакции на обработку соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, после ототоксичного повреждения, полученное с помощью кОТ-ПЦР, демонстрирует увеличение генной экспрессии для маркеров просенсорных волосковых клеток Atoh1 и Pou4f3 и для маркера волосковых клеток Муо7А.
Данные в табл. 6 демонстрируют, по данным кОТ-ПЦР, относительное увеличение генной экспрессии маркеров образования волосковых клеток, Atoh1, Pou4f3 и Муо7а, в эксплантатах кортиева органа, обработанных соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, в концентрации 5 мкМ после повреждения гентамицином (100 мкМ). Данные демонстрируют процентное увеличение генной экспрессии относительно образцов, обработанных отрицательных контролем, с повреждением волосковых клеток, вызванным гентамицином (* - значимая разность относительно отрицательного контроля, р <0,05). Индукция маркера волосковых клеток в культуре целой слуховой капсулы.
Слуховую капсулу (эксплантат слуховой капсулы), состоящую из кохлеарного костного лабиринта и вестибулярной системы, вырезали из постнатальных мышей в возрасте от 1 до 4 дней (трансгенная линия: Atoh 1-управляемый nGFP; Lumpkin E.A., et al., Gene Expr. Patterns, 2003, 3(4): 389-95) обоих полов, в целом, в соответствии со способом, описанным в публикации Parker et al., Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), el685. Целую слуховую капсулу извлекали из теменной кости и выдерживали ex-vivo в системе для выращивания культур с вращающимися пробирками в течение до 3 дней, в среде, содержащей DMEM, высокую концентрацию глюкозы, 5% FBS, 5% лошадиной сыворотки, 1 мкг/мл ампициллина.
Эксплантат слуховой капсулы использовали для оценки проникновения во внутреннее ухо исследуемого соединения в различных носителях для его доставки. Испытания проводили с композициями соединения 1, изомера 2 (7,2 мМ) в различных носителях для его доставки. Небольшие объемы (100-200 нм) напрямую наносили на нишу круглого окна улитки уха. Улитку иссекали, обрабатывали, инкубировали в течение 1-2 ч, затем вносили в культуру роллерного типа. Через 48 ч эксплантат слуховой капсулы открывали для извлечения кортиева органа из костного лабиринта улитки уха, и проводили анализ ОТ-
ПЦР.
Композицию оставляли на 1-2 ч, затем смывали культуральной средой. Затем эксплантат слуховой капсулы выращивали в течение 48 ч в необработанной среде. Улитку разламывали, и затем вырезали це
лый кортиев орган и готовили для количественной ОТ-ПЦР для измерения уровня экспрессии маркера волосковых клеток Atoh1 (как описано выше в анализе эксплантата кортиева органа). В табл. 7 представлены данные индукции Atoh1 в конкретных носителях для доставки. Повышающую регуляцию Atoh1 под действием соединения 1, изомера 2, во всех исследуемых композициях (кратность 2-3 раза, n от 12 до 17) измеряли в сравнении с эксплантатами слуховой капсулы, обработанными только контрольным носителем, через 48 ч выращивания.
Усвоение исследуемого соединения в перилимфе внутреннего уха in vivo.
AUC
(мкмоль.ч.л"
1451
7002
8634
2711
Самок альбиносов морских свинок линии Хартли (Charles River, Франция) анестезировали смесью кетамина/ксилазина, затем вводили инъекцию 70 мкл соединения 1, изомера 2, в виде композиций, описанных выше для анализа культуры целой слуховой капсулы, транстимпаническим путем для полного заполнения среднего уха. Образцы перилимфы (жидкого содержимого лабиринта внутреннего уха) извлекали через 0,5, 1, 6, 24 и 48 ч после инъекции и проводили анализ ЖХМС (n=5) для определения концентрации исследуемого соединения. В табл. 8 представлены данные об усвоении исследуемого соединения во внутреннем ухе после транстимпанического введения в среднее ухо с применением указанных носителей для его доставки.
Аминокислотные последовательности
SEQ Ш N0:1
(Белок-предшественник Notch 1 мышей, полная длина)
MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLRCSQPSGTCLNGGRCEVANGTEACVCSGAFVG
QRCQDSNPCLSTPCKNAGTCHVVDHGGTVDYACSCPLGFSGPLCLTPLDNACLA
NPCRNGGTCDLLTLTEYKCRCPPGWSGKSCQQADPCASNPCANGGQCLPFESSYI
CRCPPGFHGPTCRQDVNECSQNPGLCRHGGTCHNEIGSYRCACRATHTGPHCELP
YVPCSPSPCQNGGTCRPTGDTTHECACLPGFAGQNCEENVDDCPGNNCKNGGAC
VDGVNTYNCRCPPEWTGQYCTEDVDECQLMPNACQNGGTCHNTHGGYNCVCV
NGWTGEDCSENITJDCASAACFQGATCHDRVASFYCECPHGRTGLLCHLNDACIS
NPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVDECALGANPCEHAGKCLNT
LGSFECQCLQGYTGPRCEmVNECISNPCQNDATCLDQIGEFQCICMPGYEGVYCE
INTDECASSPCLHNGHCMDKINEFQCQCPKGFNGHLCQYDVDECASTPCKNGAK
CLDGPNTYTCVCTEGYTGTHCEVDroECDPDPCHYGSCKDGVArFTCLCQPGYT
GHHCETNINECHSQPCRHGGTCQDRDNSYLCLCLKGTTGPNCEINLDDCASNPCD
SGTCLDKroGYECACEPGYTGSMCNVNroECAGSPCHNGGTCEDGIAGFTCRCPE
GYETOPTCLSEVNECNSNPCfflGACRDGLNGYKCDCAPGWSGTNCDINNNECESN
PCVNGGTCKDMTSGYVCTCREGFSGPNCQTNINECASNPCLNQGTCroDVAGYK
CNCPLPYTGATCEVVLAPCATSPCKNSGVCKESEDYESFSCVCPTGWQGQTCEV
DENlECVKSPCRHGASCQNTNGSYRCLCQAGYTGRNCESDroDCRPNPCHNGGSC
TDGINTAFCDCLPGFQGAFCEEDINECASNPCQNGANCTDCVDSYTCTCPVGFNG
rHCENNTPDCTESSCFNGGTCVDGmSFTCLCPPGFTGSYCQYDVNECDSRPCLHG
GTCQDSYGTYKCTCPQGYTGLNCQNLVRWCDSAPCKNGGRCWQTNTQYHCEC
RSGWTGVNCDVLSVSCEVAAQKRGIDVTLLCQHGGLCVDEGDKHYCHCQAGY
TGSYCEDEVDECSPNPCQNGATCTDYLGGFSCKCVAGYHGSNCSEEINECLSQPC
QNGGTCroLTNSYKCSCPRGTQGVHCEINVDDCHPPLDPASRSPKCFNNGTCVDQ
VGGYTCTCPPGFVGERCEGDVNECLSNPCDPRGTQNCVQRVNDFHCECRAGHT
GRRCESVINGCRGKPCKNGGVCAVASNTARGFICRCPAGFEGATCENDARTCGS
LRCLNGGTCISGPRSPTCLCLGSFTGPECQFPASSPCVGSNPCYNQGTCEPTSENPF
YRCLCPAKFNGLLCHILDYSFTGGAGRDIPPPQrEEACELPECQVDAGNKVCNLQ
CNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDG
FDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEbiVPERLAA
GTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVWKRDAQGQQMrFPYYGHEEE
LRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDniGSIVYLEmNRQCVQSSSQ
CFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKffiAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVL
LFFVGCGVLLSRKRRRQHGQLWFPEGFKVSEASKKKRREPLGEDSVGLKPLKNA
SDGALMDDNQNEWGDEDLETKKFRFEEPVVLPDLSDQTDHRQWTQQHLDAAD
LRMSAMAPTPPQGEVDADCMDVNVRGPDGFTPLMIASCSGGGLETGNSEEEEDA
PAVISDFIYQGASLHNQTDRTGETALHLAARYSRSDAAKRLLEASADANIQDNM
GRTPLHAAVSADAQGVFQILLRNRATDLDARMHDGTTPLILAARLAVEGMLEDL
INSHADVNAVDDLGKSALFTWAAAVNNVDAAVVLLKNGANKDMQNNKEETPLF
LAAl^GSYETAKVLLDFIFANRDITDrMDFiPRDIAQEP^MHrlDIVRLLDEYNLVR
SPQLHGTALGGTPTLSPTLCSPNGYLGNLKSATQGKKARKPSTKGLACGSKEAK
DLKARRKKSQDGKGCLLDSSSMLSPVDSLESPHGYLSDVASPPLLPSPFQQSPSM
PLSHLPGMPDTHLGISHLNVAAKPEMAALAGGSRLAFEPPPPRLSHLPVASSASTV
LSTNGTGAMNFTVGAPASLNGQCEWLPRLQNGMVPSQYNPLRPGVTPGTLSTQA
AGLQHSMMGPLHSSLSTNTLSPIIYQGLPNTRLATQPHLVQTQQVQPQNLQLQPQ NLQPPSQPHLSVSSAANGHLGRSFLSGEPSQADVQPLGPSSLPVHTILPQESQALPT SLPSSMVPPMTTTQFLTPPSQHSYSSSPVDNTPSHQLQVPEHPFLTPSPESPDQWSS SSPHSNISDWSEGISSPPTTMPSQITHIPEAFK
SEQ Ю NQ:2 (сигнальный пептид)
MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Эли Лилли энд Компани Аудион Терапеутикс
<120> СОЕДИНЕНИЯ-ИНГИБИТОРЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ ПУТИ NOTCH
<130>
X20729
<150> 62/189,393 <151> 2015-07-07
<160>
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 2531
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 1
Met Pro Arg Leu Leu Thr Pro Leu Leu Cys Leu Thr Leu Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Gly Leu Arg Cys Ser Gln Pro Ser Gly Thr Cys Leu
20 25 30
Asn Gly Gly Arg Cys Glu Val Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys
35 40 45
Ser Gly Ala Phe Val Gly Gln Arg Cys Gln Asp Ser Asn Pro Cys Leu
50 55 60
Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp His Gly
65 70 75 80
Gly Thr Val Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Pro Leu Gly Phe Ser Gly Pro
85 90 95
Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Ala Asn Pro Cys Arg
100 105 110
Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys
130 135 140
Ala Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe His Gly Pro Thr Cys Arg
165 170 175
Gln Asp Val Asn Glu Cys Ser Gln Asn Pro Gly Leu Cys Arg His Gly
180 185 190
Gly Thr Cys His Asn Glu Ile Gly Ser Tyr Arg Cys Ala Cys Arg Ala
195 200 205
Thr His Thr Gly Pro His Cys Glu Leu Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro
210 215 220
Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Thr Thr
225 230 235 240
His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Gln Asn Cys Glu Glu
245 250 255
Asn Val Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly Ala Cys
260 265 270
Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Glu Trp Thr
275 280 285
Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Met Pro Asn
290 295 300
Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn
305 310 315 320
Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Asn Ile
325 330 335
Asp Asp Cys Ala Ser Ala Ala Cys Phe Gln Gly Ala Thr Cys His Asp
340 345 350
Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu
355 360 365
Leu Cys His Leu Asn Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly
370 375 380
Ser Asn Cys Asp Thr Asn Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys
385 390 395 400
Pro Ser Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys
405 410 415
Ala Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Leu Asn Thr
420 425 430
Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg
435 440 445
Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Ile Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp
450 455 460
Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Ile Cys Met Pro
465 470 475 480
Gly Tyr Glu Gly Val Tyr Cys Glu Ile Asn Thr Asp Glu Cys Ala Ser
485 490 495
Ser Pro Cys Leu His Asn Gly His Cys Met Asp Lys Ile Asn Glu Phe
500 505 510
Gln Cys Gln Cys Pro Lys Gly Phe Asn Gly His Leu Cys Gln Tyr Asp
515 520 525
Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly Ala Lys Cys Leu
530 535 540
Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr Glu Gly Tyr Thr Gly
545 550 555 560
Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Asp Pro Asp Pro Cys His
565 570 575
Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala Thr Phe Thr Cys Leu Cys Gln
580 585 590
Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys His
595 600 605
Ser Gln Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Arg Asp Asn Ser
610 615 620
Tyr Leu Cys Leu Cys Leu Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cys Glu Ile
625 630 635 640
Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu
645 650 655
Asp Lys Ile Asp Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly
660 665 670
Ser Met Cys Asn Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Ser Pro Cys His
675 680 685
Asn Gly Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Ala Gly Phe Thr Cys Arg Cys
690 695 700
Pro Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys
705 710 715 720
Asn Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Ala Cys Arg Asp Gly Leu Asn Gly
725 730 735
Tyr Lys Cys Asp Cys Ala Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys Asp Ile
740 745 750
Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys
755 760 765
Lys Asp Met Thr Ser Gly Tyr Val Cys Thr Cys Arg Glu Gly Phe Ser
770 775 780
Gly Pro Asn Cys Gln Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys
785 790 795 800
Leu Asn Gln Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val Ala Gly Tyr Lys Cys Asn
805 810 815
Cys Pro Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Val Val Leu Ala Pro
820 825 830
Cys Ala Thr Ser Pro Cys Lys Asn Ser Gly Val Cys Lys Glu Ser Glu
835 840 845
Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Cys Val Cys Pro Thr Gly Trp Gln Gly Gln
850 855 860
Thr Cys Glu Val Asp Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Pro Cys Arg His
865 870 875 880
Gly Ala Ser Cys Gln Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Leu Cys Gln
885 890 895
Ala Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Glu Ser Asp Ile Asp Asp Cys Arg
900 905 910
Pro Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Gly Ile Asn Thr
915 920 925
Ala Phe Cys Asp Cys Leu Pro Gly Phe Gln Gly Ala Phe Cys Glu Glu
930 935 940
Asp Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gln Asn Gly Ala Asn Cys
945 950 955 960
Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Val Gly Phe Asn
965 970 975
Gly Ile His Cys Glu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Glu Ser Ser Cys
980 985 990
Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys Leu
995 1000 1005
Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln Tyr Asp Val Asn
1010 1015 1020
Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu His Gly Gly Thr Cys Gln Asp
1025 1030 1035
Ser Tyr Gly Thr Tyr Lys Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Gly
1040 1045 1050
Leu Asn Cys Gln Asn Leu Val Arg Trp Cys Asp Ser Ala Pro Cys
1055 1060 1065
Lys Asn Gly Gly Arg Cys Trp Gln Thr Asn Thr Gln Tyr His Cys
1070 1075 1080
Glu Cys Arg Ser Gly Trp Thr Gly Val Asn Cys Asp Val Leu Ser
1085 1090 1095
Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Lys Arg Gly Ile Asp Val Thr
1100 1105 1110
Leu Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp Glu Gly Asp Lys
1115 1120 1125
His Tyr Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys Glu
1130 1135 1140
Asp Glu Val Asp Glu Cys Ser Pro Asn Pro Cys Gln Asn Gly Ala
1145 1150 1155
Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Phe Ser Cys Lys Cys Val Ala
1160 1165 1170
Gly Tyr His Gly Ser Asn Cys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Cys Leu
1175 1180 1185
Ser Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile Asp Leu Thr Asn
1190 1195 1200
Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly Val His Cys
1205 1210 1215
Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys His Pro Pro Leu Asp Pro Ala Ser
1220 1225 1230
Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln Val
1235 1240 1245
Gly Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Arg
1250 1255 1260
Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp Pro
1265 1270 1275
Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn Asp Phe His Cys
1280 1285 1290
Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys Glu Ser Val Ile
1295 1300 1305
Asn Gly Cys Arg Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly Gly Val Cys Ala
1310 1315 1320
Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Ala
1325 1330 1335
Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys Gly
1340 1345 1350
Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly Pro Arg
1355 1360 1365
Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Ser Phe Thr Gly Pro Glu Cys
1370 1375 1380
Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Val Gly Ser Asn Pro Cys Tyr
1385 1390 1395
Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Asn Pro Phe Tyr Arg
1400 1405 1410
Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile Leu
1415 1420 1425
Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro Pro
1430 1435 1440
Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Val Asp Ala
1445 1450 1455
Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly
1460 1465 1470
Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys
1475 1480 1485
Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly
1490 1495 1500
His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly
1505 1510 1515
Phe Asp Cys Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp
1520 1525 1530
Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly
1535 1540 1545
Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu
1550 1555 1560
His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val
1565 1570 1575
Leu Leu Pro Pro Asp Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu
1580 1585 1590
Arg Glu Leu Ser His Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg
1595 1600 1605
Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly His Glu
1610 1615 1620
Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ser Thr Val Gly Trp
1625 1630 1635
Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gly Arg Gln Arg
1640 1645 1650
Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu
1655 1660 1665
Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser Ser Gln Cys Phe
1670 1675 1680
Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser
1685 1690 1695
Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser
1700 1705 1710
Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr
1715 1720 1725
Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly
1730 1735 1740
Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp
1745 1750 1755
Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg
1760 1765 1770
Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys
1775 1780 1785
Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp
1790 1795 1800
Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro
1805 1810 1815
Val Val Leu Pro Asp Leu Ser Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp
1820 1825 1830
Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met
1835 1840 1845
Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp
1850 1855 1860
Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala
1865 1870 1875
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu
1880 1885 1890
Glu Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala
1895 1900 1905
Ser Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His
1910 1915 1920
Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu
1925 1930 1935
Glu Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr
1940 1945 1950
Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln
1955 1960 1965
Ile Leu Leu Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His
1970 1975 1980
Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu
1985 1990 1995
Gly Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala
2000 2005 2010
Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val
2015 2020 2025
Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn
2030 2035 2040
Lys Asp Met Gln Asn Asn Lys Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala
2045 2050 2055
Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His
2060 2065 2070
Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg
2075 2080 2085
Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu
2090 2095 2100
Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Thr Ala
2105 2110 2115
Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Thr Leu Cys Ser Pro Asn
2120 2125 2130
Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Lys Ser Ala Thr Gln Gly Lys Lys Ala
2135 2140 2145
Arg Lys Pro Ser Thr Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala
2150 2155 2160
Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly
2165 2170 2175
Cys Leu Leu Asp Ser Ser Ser Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu
2180 2185 2190
Glu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu
2195 2200 2205
Leu Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Met Pro Leu Ser His
2210 2215 2220
Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Ser His Leu Asn
2225 2230 2235
Val Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Ala Gly Gly Ser Arg
2240 2245 2250
Leu Ala Phe Glu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val
2255 2260 2265
Ala Ser Ser Ala Ser Thr Val Leu Ser Thr Asn Gly Thr Gly Ala
2270 2275 2280
Met Asn Phe Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser Leu Asn Gly Gln Cys
2285 2290 2295
Glu Trp Leu Pro Arg Leu Gln Asn Gly Met Val Pro Ser Gln Tyr
2300 2305 2310
Asn Pro Leu Arg Pro Gly Val Thr Pro Gly Thr Leu Ser Thr Gln
2315 2320 2325
Ala Ala Gly Leu Gln His Ser Met Met Gly Pro Leu His Ser Ser
2330 2335 2340
Leu Ser Thr Asn Thr Leu Ser Pro Ile Ile Tyr Gln Gly Leu Pro
2345 2350 2355
Asn Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln
2360 2365 2370
Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Leu Gln Pro Gln Asn Leu Gln Pro
2375 2380 2385
Pro Ser Gln Pro His Leu Ser Val Ser Ser Ala Ala Asn Gly His
2390 2395 2400
Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val
2405 2410 2415
Gln Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Pro Val His Thr Ile Leu Pro
2420 2425 2430
Gln Glu Ser Gln Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Met Val
2435 2440 2445
Pro Pro Met Thr Thr Thr Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His
2450 2455 2460
Ser Tyr Ser Ser Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu
2465 2470 2475
Gln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro
2480 2485 2490
Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn Ile Ser Asp Trp
2495 2500 2505
Ser Glu Gly Ile Ser Ser Pro Pro Thr Thr Met Pro Ser Gln Ile
2510 2515 2520
Thr His Ile Pro Glu Ala Phe Lys 2525 2530
<210> 2
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
Met Pro Arg Leu Leu Thr Pro Leu Leu Cys Leu Thr Leu Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Gly Leu Arg 20
МеО
1. Соединение структуры
о - о
4,4,4-трифтор-М-((28)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[1]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, его диастереомер или фармацевтически приемлемая
соль.
2. Соединение структуры
М-((28)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-1]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или его диастереомер, или фармацевтически приемлемая соль.
3. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобласт-ного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического мие-логенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосар-комы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы, аденокистозной карциномы или сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток.
4. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистио-цитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы.
5. Применение по п.4 для производства лекарственного средства для лечения рака легких.
6. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток.
7. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для инициации образования слуховых волосковых клеток.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032634
- 9 -
032634
- 21 -
032634
- 21 -
032634
- 21 -
032634
- 21 -
032634
- 21 -
032634
- 21 -
032634
- 21 -
032634
- 25 -
032634
- 33 -
|
