[RU]

1. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с молекулой-1 адгезии клеток мукозального адрессина (MAdCAM-1), содержащая по меньшей мере 140 мг/мл анти- α4 β7 антитела, цитрат или ЭДТА, аргинин, гистидин и поверхностно-активное вещество, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.

2. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.1, где молярное соотношение анти- α4 β7 антитела к цитрату составляет от 1:4 до 1:100.

3. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.1, где молярное соотношение цитрата к поверхностно-активному веществу составляет от 3:1 до 156:1.

4. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая по меньшей мере 140 мг/мл анти- α4 β7 антитела, цитрат, гистидин, аргинин и полисорбат 80, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.

5. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая смесь анти- α4 β7 антитела, цитрата, гистидина, аргинина и полисорбата 80, где молярное соотношение полисорбата 80 к анти- α4 β7 антителу составляет 0,7:1 до 2,0:1, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.

6. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация цитрата составляет от 20 до 30 мМ.

7. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация полисорбата 80 составляет от 0,1 до 0,3%.

8. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация аргинина составляет от 50 до 150 мМ.

9. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация гистидина составляет от 25 до 65 мм.

10. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, где анти- α4 β7 антитело представляет собой гуманизированное антитело.

11. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислоты 20-140 SEQ ID NO:2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или 21-132 SEQ ID NO: 5.

12. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция имеет pH от 6,1 до 7,0.

13. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция имеет pH от 6,5 до 6,8.

14. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая ≥ 95% анти- α4 β7 антитела в мономерной форме.

15. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая ≤ 5% агрегатов антитела.

16. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая от 150 до 180 мг/мл анти- α4 β7 антитела, от 5 до 50 мМ цитрата, от 10 до 75 мМ гистидина, от 0,01 до 0,5% полисорбата 80 и от 50 до 150 мМ аргинина, где анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, и где композиция имеет pH от 6,1 до 6,9.

17. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация гистидина составляет от 25 до 65 мМ.

18. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация аргинина составляет 125 мМ.

19. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация цитрата составляет от 20 до 30 мМ.

20. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где композиция имеет pH от 6,2 до 6,8.

21. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая от 150 до 180 мг/мл анти- α4 β7 антитела, 25 мМ цитрата, 50 мМ гистидина, 0,2% полисорбата 80 и 125 мМ аргинина, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, и где композиция имеет pH от 6,2 до 6,8.

22. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.21, содержащая 160 мг/мл антитела.

23. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по пп.16-22, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислоты 20-140 SEQ ID NO: 2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или 21-132 SEQ ID NO: 5.

24. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой анти- α4 β7 антитело представляет собой ведолизумаб.

25. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, которая содержит менее чем около 1,0% агрегатов антитела после 12 месяцев хранения при 25°С.

26. Способ ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, которое вызывает определенное заболевание или расстройство у пациента, включающий введение фармацевтической композиции по любому из предшествующих пунктов в эффективном количестве.

27. Способ по п.26, где указанное заболевание или расстройство представляет собой воспалительную болезнь кишечника, причем анти- α4 β7 антитело вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (a) индукционная фаза, включающая начальную дозу 300 мг антитела, которую вводят на неделе 0 пациенту с последующей дозой 300 мг антитела, которую вводят пациенту через две недели после начальной дозы; и (b) поддерживающая фаза, включающая введение 108 мг антитела пациенту каждые две недели после индукционной фазы; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента.

28. Способ по п.26 или 27, где у пациента отмечается недостаточный до адекватного ответ, потеря ответа на лечение или непереносимость лечения по меньшей мере одним препаратом, выбранным из иммуномодулятора, антагониста фактора некроза опухоли-альфа или их комбинации.

29. Способ по п.26 или 27, где режим дозирования приводит к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероидов пациентом.

30. Способ по п.26 или 27, где дозы вводят подкожно или внутримышечно.

(57) Реферат / Формула:

1. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с молекулой-1 адгезии клеток мукозального адрессина (MAdCAM-1), содержащая по меньшей мере 140 мг/мл анти- α4 β7 антитела, цитрат или ЭДТА, аргинин, гистидин и поверхностно-активное вещество, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.

2. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.1, где молярное соотношение анти- α4 β7 антитела к цитрату составляет от 1:4 до 1:100.

3. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.1, где молярное соотношение цитрата к поверхностно-активному веществу составляет от 3:1 до 156:1.

4. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая по меньшей мере 140 мг/мл анти- α4 β7 антитела, цитрат, гистидин, аргинин и полисорбат 80, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.

5. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая смесь анти- α4 β7 антитела, цитрата, гистидина, аргинина и полисорбата 80, где молярное соотношение полисорбата 80 к анти- α4 β7 антителу составляет 0,7:1 до 2,0:1, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.

6. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация цитрата составляет от 20 до 30 мМ.

7. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация полисорбата 80 составляет от 0,1 до 0,3%.

8. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация аргинина составляет от 50 до 150 мМ.

9. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация гистидина составляет от 25 до 65 мм.

10. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, где анти- α4 β7 антитело представляет собой гуманизированное антитело.

11. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислоты 20-140 SEQ ID NO:2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или 21-132 SEQ ID NO: 5.

12. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция имеет pH от 6,1 до 7,0.

13. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция имеет pH от 6,5 до 6,8.

14. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая ≥ 95% анти- α4 β7 антитела в мономерной форме.

15. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая ≤ 5% агрегатов антитела.

16. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая от 150 до 180 мг/мл анти- α4 β7 антитела, от 5 до 50 мМ цитрата, от 10 до 75 мМ гистидина, от 0,01 до 0,5% полисорбата 80 и от 50 до 150 мМ аргинина, где анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, и где композиция имеет pH от 6,1 до 6,9.

17. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация гистидина составляет от 25 до 65 мМ.

18. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация аргинина составляет 125 мМ.

19. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация цитрата составляет от 20 до 30 мМ.

20. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где композиция имеет pH от 6,2 до 6,8.

21. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, содержащая от 150 до 180 мг/мл анти- α4 β7 антитела, 25 мМ цитрата, 50 мМ гистидина, 0,2% полисорбата 80 и 125 мМ аргинина, причем анти- α4 β7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, и где композиция имеет pH от 6,2 до 6,8.

22. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.21, содержащая 160 мг/мл антитела.

23. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по пп.16-22, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислоты 20-140 SEQ ID NO: 2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или 21-132 SEQ ID NO: 5.

24. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой анти- α4 β7 антитело представляет собой ведолизумаб.

25. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, которая содержит менее чем около 1,0% агрегатов антитела после 12 месяцев хранения при 25°С.

26. Способ ингибирования связывания интегрина α4 β7 с MAdCAM-1, которое вызывает определенное заболевание или расстройство у пациента, включающий введение фармацевтической композиции по любому из предшествующих пунктов в эффективном количестве.

27. Способ по п.26, где указанное заболевание или расстройство представляет собой воспалительную болезнь кишечника, причем анти- α4 β7 антитело вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (a) индукционная фаза, включающая начальную дозу 300 мг антитела, которую вводят на неделе 0 пациенту с последующей дозой 300 мг антитела, которую вводят пациенту через две недели после начальной дозы; и (b) поддерживающая фаза, включающая введение 108 мг антитела пациенту каждые две недели после индукционной фазы; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента.

28. Способ по п.26 или 27, где у пациента отмечается недостаточный до адекватного ответ, потеря ответа на лечение или непереносимость лечения по меньшей мере одним препаратом, выбранным из иммуномодулятора, антагониста фактора некроза опухоли-альфа или их комбинации.

29. Способ по п.26 или 27, где режим дозирования приводит к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероидов пациентом.

30. Способ по п.26 или 27, где дозы вводят подкожно или внутримышечно.

---

Евразийское 032625 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201391613
(22) Дата подачи заявки 2012.05.02
(51) Int. Cl.
A61K39/395 (2006.01) A61K 47/12 (2006.01) A61K 47/14 (2006.01) A61K 47/18 (2006.01)
A61K 47/26 (2006.01)
A61K 9/00 (2006.01)
(54) КОМПОЗИЦИЯ АНТИ-а4р7 АНТИТЕЛА
(31) 61/481,522; 61/544,054
(32) 2011.05.02; 2011.10.06
(33) US
(43) 2014.07.30
(86) PCT/US2012/036069
(87) WO 2012/151247 2012.11.08
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МИЛЛЕННИУМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Дилузио Уиллоу, Нгуйен Пхоунг М., Варга Ксанад М., Паланиаппан Ваитхианатхан, Браун Джейсон, Фокс Ирвинг Х., Сколз Кэтрин (US), Дженкинс Эрика Хелен (GB), Розарио Мария (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2008071394 WO-A1-2009009407
PARIKH A. ET AL.: "P130 - Gastrointestinal selectivity of vedolizumab (MLN0002), a humanized monoclonal antibody to alpha4beta7 integrin", JOURNAL OF CROHN'S AND COLITIS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 3, no.
1, 1 February 2009 (2009-02-01), page S62,
XP025961540, ISSN: 1873-9946, DOI: 10.1016/ S1873-9946(09)60157-4 [retrieved on 2009-02-01], the whole document
FEAGAN B. G. ET AL.: "Treatment of Active Crohn's Disease With MLN0002, a Humanized Antibody to the alpha4beta7 Integrin", CLINICAL
GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY,
AMERICAN GASTROENTEROLOGICAL ASSOCIATION, US, vol. 6, no. 12, 1 December
2008 (2008-12-01), pages 1370-1377, XP025872069, ISSN: 1542-3565, DOI: 10.1016/J.CGH.2008.06.007 [retrieved on 2008-10-01], the whole document
US-A1-2005095238
(57) Описаны композиции антител, включающие смесь анти-а4р7 антитела, антиоксиданта или хелатирующего агента и по меньшей мере одной свободной аминокислоты. Раскрытые композиции могут обладать улучшенной стабильностью, пониженным образованием агрегатов или обоими этими характеристиками. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает безопасный режим дозирования таких композиций антител, который может легко соблюдаться и который обеспечивает терапевтически эффективное количество анти-а4р7 антитела in vivo.
Родственные заявки
Данная заявка претендует на приоритет временной заявки США 61/544054, поданной 6 октября 2011 г. и временной заявки США 61/481522, поданной 2 мая 2011 г. Содержание вышеуказанных заявок целиком включено в настоящий документ в качестве ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка включает Перечень последовательностей, который был подан в ASCII-формате через систему EFS-Web и настоящим целиком включен в настоящий документ в качестве ссылки. Указанный ASCII-документ, созданный 30 апреля 2012 г., назван 92596603.txt и имеет размер 16986 байт.
Известный уровень техники
Прогресс в биотехнологии создал возможности получения различных белков, предназначенных для применения в фармацевтике, с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Поскольку белки имеют большие размеры и более сложны, чем традиционные органические и неорганические лекарственные препараты (т.е., содержат многочисленные функциональные группы в дополнение к сложным трехмерным структурам), составление композиций таких белков связано с особыми проблемами. Для того, чтобы белок оставался биологически активным, композиция должна сохранять конформационную целостность по меньшей мере коровой последовательности аминокислот белка, в то же самое время защищая многочисленные функциональные группы белка от деградации. Белки могут иметь недостаточную стабильность, и моноклональные и поликлональные антитела, в особенности, могут быть относительно нестабильными (см., напр., Wang, et al., J. Pharm Sci. 96:1-26 (2007)). Имеется большое число вариантов составления композиций, и ни один из подходов или систем не является пригодным для всех белков. Было описано несколько факторов, которые необходимо учитывать (см., напр., Wang et al.).
Стабильность белка может зависеть от многочисленных характеристик. Фактически, даже в случае очищенных антител, структуры антител могут быть гетерогенными, что дополнительно усложняет составление композиций таких систем. Кроме того, эксципиенты, включаемые в состав композиций антител, предпочтительно минимизируют любой потенциальный иммунный ответ.
В случае антител, сохранение конформационной целостности является еще более важным. Пути деградации белков могут быть связаны с химической нестабильностью (т.е., с любым процессом, включающим модификацию белка путем образования или разрыва связи, приводящего к новой химической сущности) или физической нестабильностью (т. е., изменениями структуры белка более высокого порядка). Химическая нестабильность проявляется, например, в деамидировании, изомеризации, гидролизе, окислении, фрагментации, бета-элиминировании гликана или дисульфидном обмене. Физическая нестабильность может быть вызвана, например, денатурацией, агрегированием, преципитацией или адсорбцией. Четырьмя наиболее распространенными путями деградации белка являются фрагментация, агрегирование, деамидирование и окисление белка. Последствия химической или физической нестабильности терапевтического белка включают уменьшение эффективной введенной дозы, снижение безопасности терапии вследствие, например, облучения или иммунологической реактивности, и большая частота производства из-за короткого срока хранения.
Несколько публикаций раскрывают в общем различные способы лечения воспалительных болезней кишечника, и предусматривают схемы дозирования для введения агентов, предназначенных для лечения воспалительной болезни кишечника. Например, WO 96/24673 раскрывает мукозальные сосудистые ад-рессины и лечение заболеваний, ассоциированных с рекрутментом лейкоцитов в желудочно-кишечный тракт в результате связывания лейкоцитов с клетками, экспрессирующими MAdCAM. US 2005/0095238 описывает способы лечения болезни, ассоциированной с инфильтрацией лейкоцитов в мукозальную ткань, и введение человеку эффективного количества человеческого или гуманизированного иммуноглобулина или антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с интегрином сс4|37. US 2005/0095238 дополнительно описывает различные дозы (например, 0,15, примерно 0,5, примерно 1,0, примерно 1,5 или примерно 2,0 мг иммуноглобулина или фрагмента на кг веса тела) и различные интервалы между дозами (7, 14, 21, 28, или 30 дней). Однако вышеуказанные патенты и публикации не раскрывают конкретные композиции анти-а4|37 антитела или конкретные дозы и режимы дозирования, описанные и заявляемые в данном документе. Важно отметить, что вышеуказанные патенты не раскрывают композиции, дозы и режимы дозирования, обеспечивающие способы лечения (подтвержденные данными клинических испытаний), описанные и заявляемые в данном документе.
Композиции антител по настоящему изобретению могут быть полезны для ингибирования связывания лейкоцитов с клетками, экспрессирующими MAdCAM, и тем самым способствовать лечению воспалительной болезни кишечника у пациентов. Соответственно, существует насущная потребность в определении пригодных дозировок и режимов дозирования таких соединений, и в разработке композиций, предпочтительно, подкожных композиций, позволяющих обеспечить стабильные, терапевтически эффективные уровни в крови композиций антител на протяжении длительного периода времени в стабильной и удобной форме.
Сущность изобретения
Изобретение относится к идентификации антиоксиданта или хелатирующего агента и по меньшей
мере одной аминокислоты, в качестве пригодных эксципиентов для составления композиций анти-сс4Р7 антител, нестабильность которых делает их восприимчивыми к деамидированию, окислению, изомеризации и/или агрегированию. Композиция улучшает стабильность, уменьшает образование агрегатов и замедляет деградацию антитела, входящего в ее состав.
Таким образом, в первом аспекте, изобретение относится к стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей смесь анти-сс4Р7 антитела, антиоксиданта или хелатирующего агента и по меньшей мере одной свободной аминокислоты.
В некоторых вариантах исполнения стабильная жидкая фармацевтическая композиция характеризуется образованием менее примерно 1,0% агрегатов через 12 месяцев при комнатной температуре. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция может демонстрировать образование менее примерно 0,2% агрегатов через 12 месяцев при комнатной температуре.
В некоторых вариантах исполнения антиоксидант или хелатирующий агент представляет собой цитрат. В некоторых вариантах исполнения хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
В некоторых вариантах исполнения свободная аминокислота композиции представляет собой гис-тидин, аланин, аргинин, глицин, глутаминовую кислоту или любую их комбинацию. Композиция может включать от примерно 50 до примерно 175 мМ свободной аминокислоты. Композиция может включать от примерно 100 до примерно 175 мМ свободной аминокислоты. Молярное соотношение свободной аминокислоты к антителу может составлять по меньшей мере 250:1.
Композиция может также содержать поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активное вещество может представлять собой полисорбат 20, полисорбат 80, полоксамер или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах исполнения молярное соотношение антиоксиданта к поверхностно-активному веществу составляет от примерно 3:1 до примерно 156:1.
Композиция может иметь pH от примерно 6,3 до примерно 7,0. Величина pH композиции может составлять от примерно 6,5 до примерно 6,8. Композиция может иметь pH от примерно 6,1 до примерно 7,0, или от примерно 6,2 до 6,8.
В некоторых вариантах исполнения стабильная жидкая фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере от примерно 60 до примерно 160 мг/мл анти-сс4Р7 антитела. Композиция может содержать по меньшей мере примерно 160 мг/мл анти-сс4Р7 антитела. Композиция может содержать от примерно 150 до примерно 180 мг/мл антитела или примерно 165 мг/мл антитела.
В другом аспекте изобретение относится к стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере от примерно 60 до примерно 160 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, буферный агент и по меньшей мере примерно 10 мМ цитрата. Буферный агент может быть гистидиновым буфером.
В другом аспекте изобретение относится к стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере от примерно 60 до примерно 180 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, буферный агент и по меньшей мере примерно 5 мМ цитрата. Буферный агент может быть гистидиновым буфером.
В другом аспекте изобретение относится к стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере примерно 160 мг/мл анти-сс4Р7 антитела и по меньшей мере примерно 10 мМ цитрата. Композиция может дополнительно содержать полисорбат 80.
В другом аспекте изобретение относится к стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей примерно 160 мг/мл анти-сс4Р7 антитела и по меньшей мере примерно 5 мМ цитрата. Композиция может дополнительно содержать полисорбат 80.
В другом аспекте изобретение относится к стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей смесь анти-сс4Р7 антитела, цитрата, гистидина, аргинина и полисорбата 80. Композиция может находиться в контейнере, таком как флакон, картридж, шприц или автоинжектор.
Анти-сс4Р7 антитело в стабильной жидкой фармацевтической композиции по изобретению может представлять собой ведолизумаб. Композиция по изобретению может быть предназначена для подкожного, внутривенного или внутримышечного введения.
В некоторых аспектах композиция может минимизировать иммуногенность анти-сс4Р7 антитела.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения воспалительной болезни кишечника, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту стабильной жидкой фармацевтической композиции, описанной в данном документе. Введение может быть подкожным введением. Введение может быть самовведение.
В еще одном аспекте, изобретение относится к изделию, включающему контейнер, стабильную жидкую фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, и инструкции по ее использованию.
В одном аспекте, изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительной болезни кишечника, включающему стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином сс4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим
режимом дозирования: (а) начальные дозы, например, в индукционной фазе схемы лечения, шесть доз по 165 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем подкожной инъекции через день; (b) после этого на неделе шесть, седьмая и последующие дозы, например, на поддерживающей фазе схемы лечения, по 165 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвя-зывающего фрагмента путем подкожной инъекции раз в две недели или раз в четыре недели, по необходимости; причем режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом сс4Р7, где антиген-связывающая область содержит три гипервариабельных участка (участка, определяюших комплементар-ность) (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельн область тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительной болезни кишечника, где способ включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином сс4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования, включающим индукционную фазу внутривенных доз и поддерживающую фазу подкожных доз: (а) начальная внутривенная доза 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем внутривенной инфузии; (b) затем последующая вторая внутривенная доза 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем внутривенной инфузии примерно через две недели после начальной дозы; (с) затем, начиная с недели шесть, третья и последующие дозы по 165 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем подкожной инъекции раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели или раз в четыре недели, по необходимости; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом сс4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте изобретение относится к режиму дозирования для терапевтического лечения воспалительной болезни кишечника, где режим дозирования включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антиген-связывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином сс4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязы-вающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии с подкожным или внутримышечным режимом дозирования, который поддерживает среднюю минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия в сыворотке иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 9 до примерно 13 мкг/мл; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом сс4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте изобретение относится к режиму дозирования для терапевтического лечения воспалительной болезни кишечника, где режим дозирования включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антиген-связывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином сс4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязы-вающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии с подкожным или внутримышечным режимом дозирования, который поддерживает среднюю минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия в сыворотке гумани
зированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 35 до примерно 40 мкг/мл; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антиген-связывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом сс4Р7, причем антигенсвя-зывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12,
CDR3 SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительной болезни кишечника, где способ включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином сс4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (а) множество доз индукционной фазы гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, достаточных для достижения средней минимальной остаточной концентрации от примерно 20 до примерно 30 мкг/мл гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента после примерно шести недель начального дозирования; (b) затем множество доз поддерживающей фазы гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, необходимое для поддержания средней минимальной остаточной концентрации в состоянии равновесия в сыворотке от примерно 9 до примерно 13 мкг/мл или примерно от 35 до 40 мкг/мл иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом сс4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID
NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В некоторых аспектах композиция, способ лечения, доза и/или режим дозирования обеспечивают минимальную вероятность того, что у пациента будут вырабатываться антитела, реактивные к анти-сс4Р7 антителу.
Пациент может демонстрировать отсутствие адекватного ответа, потерю ответа, или быть интоле-рантным к лечению по меньшей мере одним иммуномодулятором, антагонистом фактора некроза опухо-ли-альфа (TNF-cc) или их комбинациям.
Воспалительная болезнь кишечника может быть болезнью Крона или неспецифическим язвенным колитом. Воспалительная болезнь кишечника может быть от умеренного до тяжелого активным неспецифическим язвенным колитом.
Режим дозирования может приводить к заживление слизистой у пациентов, страдающих от умеренного до тяжелого активного неспецифического язвенного колита.
Пациент может ранее получать лечение по меньшей мере одним кортикостероидом от воспалительной болезни кишечника. Пациент может параллельно получать лечение по меньшей мере одним корти-костероидом от воспалительной болезни кишечника. Режим дозирования может приводить к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероида пациентом.
В некоторых аспектах гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде готовой лекарственной формы при концентрации от примерно 1,0 до примерно 1,4 мг/мл. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент может быть введен в виде готовой лекарственной формы с концентрацией примерно 1,2 мг/мл.
В некоторых аспектах гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде готовой лекарственной формы, содержащей анти-сс4Р7 антитело в количестве от примерно 70 до примерно 250 мг, от примерно 90 до примерно 200 мг, от примерно 150 до примерно 180 мг или по меньшей мере 160 мг.
В некоторых аспектах режим дозирования не изменяет соотношения CD4 к CD8 в спинномозговой жидкости пациентов, получающих указанное лечение.
Пациент может быть особой в возрасте 65 лет или старше и не требовать какой-либо коррекции режима дозирования.
В некоторых аспектах способ лечения композицией анти-сс4Р7 антитела, доза, или режим дозирования могут минимизировать иммуногенность анти-сс4Р7 антитела.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой изображение нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1), кодирующей тяжелую цепь гуманизированного анти-сс4Р7 иммуноглобулина и расшифрованной аминокислотной последовательности тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2). Нуклеотидная последовательность содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные буквы, нуклеотиды 18-23 SEQ ID NO:1) и лидерную последовательность (строчные буквы, нуклеотиды 24-86 SEQ ID NO:1) на 5'-конце тяжелой цепи. Открытая рамка считывания нуклеотидной последовательности включает нуклеотиды 24-1433 SEQ ID NO: 1.
Фиг. 2 представляет собой изображение нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO:3), кодирующей легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, называемого в данном документе ведолизу-маб, и расшифрованной аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 4) легкой цепи. Нуклеотидная последовательность содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные буквы, нуклеотиды 18-23 SEQ ID NO: 3) и лидерную последовательность (строчные буквы, нук-леотиды 24-80 SEQ ID NO: 3) на 5'-конце тяжелой цепи. Открытая рамка считывания нуклеотидной последовательности включает нуклеотиды 24-737 SEQ ID NO: 3.
Фиг. 3 изображает выравнивание аминокислотных последовательностей (А) зрелой гуманизированной легкой цепи (аминокислоты 20-238 SEQ ID NO:4) гуманизированного иммуноглобулина, называемого в данном документе ведолизумаб, и (В) зрелой гуманизированной легкой цепи гуманизированного иммуноглобулина, называемого в данном документе LDP-02 (SEQ ID NO: 5). (касательно LDP-02, см. WO 98/06248 и Feagan et al., N. Eng. J. Med. 352: 2499-2507 (2005)). Feagan et al. описывают клинические исследования LDP-02, но в их статье LDP-02 называется MLN02.) Выравнивание показывает, что аминокислотные последовательности легкых цепей ведолизумаба и LDP-02 различаются в положениях 114 и 115 зрелых легких цепей.
Фиг. 4 изображает выравнивание аминокислотных последовательностей (А) родовой человеческой константной области каппа-легкой цепи (SEQ ID NO: 6) и (В) родовой мышиной константной области каппа-легкой цепи (SEQ ID NO:7). Аминокислотные остатки Thr и Val (находящиеся в положениях 114 и 115 зрелой легкой цепи ведолизумаба (аминокислоты 133 и 134 SEQ ID NO: 4)) присутствуют в константной области человеческой каппа-легкой цепи, тогда как аминокислотные остатки Ala и Asp (находящиеся в положениях 114 и 115 зрелой легкой цепи LDP-02 (SEQ ID NO: 5)) присутствуют в константной области мышиной каппа-легкой цепи.
Фиг. 5 представляет собой карту вектора pLKTOK38D (также называемого pTOK38MLN02-TV), который кодирует гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь MLN02 и является пригодным для продуцирования ведолизумаба в клетках СНО (см. публикацию патентной заявки США № 2004/0033561 А1, которая раскрывает pLKTOK38. pLKTOK38D представляет собой вариант pLKTOK38, в котором сайты рестрикции, указанные на карте, фланкируют последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи).
Фиг. 6 показывает полученные методом эксклюзионной хроматографии (SEC) кривые образования агрегатов (% в день) в зависимости от изменений концентрации белка, pH и молярного соотношения поверхностно-активное вещество: белок. В диапазоне значений pH от 6,0 до 6,5, образование агрегатов было схожим с композицией с молярным соотношением полисорбат 80:белок в интервале значений от 0,7
до 1,5.
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий, что при молярных соотношениях полисорбат 80: белок более 1,5, скорость образования агрегатов возрастает с увеличением рН.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий влияние эксципиентов на образование агрегатов. К композициям прибавляли 25 мМ цитрата, 5 мМ цитрата, 5 мМ ЭДТА, 25 мМ цистеина или 5 мМ цис-теина. Все три эксципиента уменьшали образование агрегатов.
Фиг. 9 представляет собой ряд графиков, показывающих уменьшение образования агрегатов в присутствии 25 мМ цитрата в композиции и корреляцию между увеличением концентрации белка и возрастанием скорости образования агрегатов.
Фиг. 10 представляет собой график, показывающий результаты определения методом катионооб-менной хроматографии (СЕХ) деградации химического вещества при 40°C. Данные показывают влияние изменения pH на определенную методом катионообменной хроматографии (СЕХ) деградацию.
Фиг. 11 представляет собой график, показывающий влияние температуры на величину pH композиций. Величина pH композиций, содержащих гистидин, понижается с температурой, в то время как величина pH цитратных композиций не зависят от температуры.
Фиг. 12 представляет собой график, показывающий процентное содержание определенной методом катионообменной хроматографии (СЕХ) основной изоформы на протяжении периода двенадцати месяцев. Композиции, имеющие pH 6,0-6,2, демонстрируют примерно на 1-2% меньшее содержание основной изоформы, чем композиции, имеющие pH 6,3-6,4.
Фиг. 13 изображает ряд графиков, демонстрирующих, что вязкость зависит главным образом от концентрации белка и рН. Было продемонстрировано, что добавки сахарозы, гистидина и аргинина незначительно влияют на вязкость композиции.
Фиг. 14 показывает аминокислотные последовательности (А) зрелой человеческой вариабельной области каппа-легкой цепи антитела GM607'CL и (В) вариабельной области тяжелой цепи человеческого 21/28'CL.
Фиг. 15 изображает компоненты белкового продукта в предварительно наполненном шприце.
Фиг. 16А-В показывает влияние (А) концентрации белка и (В) вязкости на усилие инъекции различных испытанных шприцов.
Фиг. 17(А) показывает зависимость начального усилия преодоления трения скольжения как функции концентрации белка и размера иглы.
Фиг. 17(В) показывает начальное усилие преодоления трения скольжения для каждого производителя шприца и размера иглы.
Фиг. 18 показывает профиль абсорбции ведолизумаба. График показывает, что концентрации внутримышечных и подкожных доз обычно перекрываются. Не наблюдается очевидных значительных различий профилей абсорбции для таких путей введения.
Детальное описание изобретения
Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей анти-сс4Р7 антитела. Фармацевтическая композиция может быть смесью, содержащей антиоксидант или хелатирующий агент (например, цитрат), анти-сс4Р7 антитело и свободную аминокислоту. Фармацевтическая композиция может находиться в твердой или жидкой форме.
Определения
Термин "фармацевтическая композиция" относится к препарату, содержему анти-сс4Р7 антитело в такой форме, которая позволяет эффективно обеспечить биологическую активность антитела, и которая не содержит дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться композиция.
" Стабильной" является композиция, в которой содержащееся в ней антитело в значительной степени сохраняет свою физическую стабильность и/или свою химическую стабильность и/или свою биологическую активность при хранении. В одном аспекте, композиция в значительной степени сохраняет свою физическую и химическую стабильность, а также свою биологическую активность при хранении. Период хранения обычно выбирают на основании предполагаемого срока годности композиции. Различные аналитические методики измерения стабильности белка известны специалистам и рассмотрены, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Стабильность может быть измерена при выбранной температуре для выбранного периода времени. Например, жидкая композиция является стабильной при примерно 40°C в течение по меньшей мере примерно 3 дней, 5 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель или 6 недель. В другом аспекте лиофилизированная композиция является стабильной при примерно 40°C в течение по меньшей мере примерно 2-4 недель, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 12 месяцев, или по меньшей мере примерно 18 месяцев. Жидкая и/или лиофилизирован-ная композиция, в другом аспекте, является стабильной при примерно 5°C и/или 25°C в течение по меньшей мере примерно 1 месяца, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 12 месяцев, по меньшей мере примерно 18 месяцев, по меньшей мере примерно 24 месяцев, по меньшей мере примерно 30 месяцев, или по меньшей мере примерно 36 месяцев; и/или стабильной при примерно -20°C и/или -70°C в течение по меньшей мере примерно 1 месяца, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 12 месяцев, по меньшей мере примерно 18 месяцев, по меньшей мере примерно 24 месяцев, по меньшей мере примерно 30 месяцев, по меньшей мере примерно 36 месяцев, по меньшей мере примерно 42 месяцев, или по меньшей мере примерно 48 месяцев. Кроме того, жидкая композиция может, в некоторых вариантах исполнения, быть стабильной после замораживания (например, до -80°C) и оттаивания, например, после 1, 2 или 3 циклов замораживания и оттаивания.
Стабильность жидкой композиции можно оценить качественно и/или количественно множеством различных способов, включая оценку образования димера, мультимера и/или агрегатов (например, экс-клюзионная хроматография (SEC), времяпролётная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF MS), аналитическое ультрацентрифугирование, светорассеяние (фотонно-корреляционная спектроскопия, динамическое светорассеяние (DLS), статическое светорассеяние, многоугловое лазерное светорассеяние (MALLS)), проточная микроскопическая визуализация, подсчет с использованием электронного импеданса (культеровского), по затемнению света, или другие жидкостные системы подсчета частиц, путем измерения мутности и/или путем визуального контроля); путем оценки гетерогенности заряда с использованием катионообменной хроматографии (СЕХ), изо-электрического фокусирования (IEF), например, капиллярной методики (clEF), или электрофореза в капиллярной зоне; анализ аминоконцевых или карбоксиконцевых последовательностей; масс-спектрометрический анализ; сравнительный анализ методами SDS-PAGE или SEC фрагментированных,
интактных и мультимерных (т. е., димерных, тримерных и т. д.) антител; анализ пептидных карт (например, триптический или LYS-C); оценка биологической активности или антигенсвязывающей функции антител; и т. п. Стабильность твердофазной композиции может также быть оценена качественно и/или количественно множеством различных способов, включая прямые тесты, такие как определение кристаллической структуры методом рентгеновской порошковой дифракции (XRPD); оценка структуры антител в твердом состоянии с использованием инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR); и измерение термических переходов в лиофилизированном твердом веществе (плавление, стеклование и т.д.) с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), и непрямые тесты, такие как измерение влагосодержания с помощью теста Карла Фишера, например, для экстраполяции вероятности химической нестабильности вследствие гидролиза. Нестабильность может затрагивать любой один или несколько параметров из: агрегирования (например, нековалентное агрегирование растворимых веществ, ковалентное агрегирование растворимых веществ (например, перегруппировка/перемешивание дисульфидных связей), агрегирование нерастворимых веществ), деамидирование (например, деамидирование Asn), окисление (например, окисление Met), изомеризация (например, изомеризация Asp), отсечение/гидролиз/фрагментация (например, фрагментация шарнирной области), образование сукцинимида, N-концевое удлинение, С-концевой процессинг, различия в гликозилировании и т.п.
" Деамидированное" моноклональное антитело представляет собой антитело, в котором один или несколько аспарагиновых или глутаминовых остатков были дериватизированы, например, до аспараги-новой кислоты или изоаспарагиновой кислоты.
Антитело, "восприимчивое к деамидированию", представляет собой антитело, включающее один или несколько остатков, демонстрирующих склонность к деамидированию.
Антитело, "восприимчивое к окислению", представляет собой антитело, включающее один или несколько остатков, демонстрирующих склонность к окислению.
Антитело, "восприимчивое к агрегированию", представляет собой антитело, которое демонстрирует агрегирование с другой (другими) молекулами антитела, особенно, при замораживании, нагревании, высушивании, восстановлении и/или перемешивании.
Антитело, "восприимчивое к фрагментация", представляет собой антитело, которое демонстрирует расщепление на два или больше фрагментов, например, в своей шарнирной области.
" Восстановительное деамидирование, окисление, агрегирование или фрагментация" используются для обозначения предотвращения или снижения (например, до 80, 60, 50, 40, 30, 20 или 10%) величины деамидирования, агрегирования или фрагментации по сравнению с моноклональным антителом, приготовленным при отличном значении pH или в другом буфере.
"Агрегат", "агрегат SEC (агрегат, определяемый методом эексклюзионной хроматографии)" или " растворимый агрегат" представляют собой от более одного до не более десяти белков и/или фрагментов антител, ассоциированных друг с другом путем ковалентных, ионных или гидрофобных взаимодействий с образованием более крупного белкового тела.
"Нерастворимый агрегат" или "частица" представляет собой более десяти белков и/или фрагментов антител, ассоциированных друг с другом путем ковалентных, ионных или гидрофобных взаимодействий с образованием более крупного белкового тела.
В используемом тут значении, "биологическая активность" моноклонального антитела относится к способности антитела связываться с антигеном и приводить к измеримому биологическому ответу, который может быть измерен in vitro или in vivo. Такая активность может быть антагонистической или агони-стической.
Молекула клеточной поверхности, "интегрин сс4Р7", или "сс4Р7", представляет собой гетеродимер сс4 цепи (CD49D, ITGA4) и Р7 цепи (ITGB7). Каждая цепь может формировать гетеродимер с альтернативной цепью интегрина, с образованием, например, а4Р1 или ссЕР7. Человеческие гены сс4 и Р7 (GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) RefSeq номера доступа NM_000885 и NM_000889, соответственно) экспрессируются В и Т лимфоцитами, в частности лимфоцитами памяти CD4+. Типично для многих интегринов, сс4Р7 может существовать в состоянии покоя или в активированном состоянии. Лиганды сс4Р7 включают молекулу адгезии сосудистых клеток (VCAM), фибронектин и мукозальный адрессин (MAdCAM, например, MAdCAM-1).
В используемом тут значении человеческий иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий "специфичностью связывания с комплексом сс4Р7", связывается с сс4Р7, но не с сс4Р1 или aEР7.
В используемом тут значении "изотоническая" композиция имеет по существу такое же осмотическое давление, как и человеческая кровь. Изотонические композиции будут обычно иметь осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм. Изотоничность может быть измерена, например, по давлению пара или с помощью осмометра замораживающего типа.
В используемом тут значении "буферный агент" относится к буферу, который противодействует изменениям pH в результате воздействия конъюгированных компонентов кислота-основание. Буферный агент может присутствовать в жидкой или твердой композиции по изобретению. В некоторых вариантах
исполнения, буферный агент по настоящему изобретению устанавливает величину pH композиции в интервале от примерно 5,0 до примерно 7,5, от примерно pH 5,5 до примерно 7,5, от примерно pH 6,0 до примерно 7,0, или в интервале pH от примерно 6,3 до примерно 6,5. В одном аспекте, примеры буферных агентов, которые, сами или в комбинации, будут регулировать величину pH в диапазоне значений от 5,0 до 7,5, включают ацетат, сукцинат, глюконат, гистидин, цитрат, фосфат, малеат, какодилат, 2-[N-морфолино]этансульфоновую кислоту (MES), бис(2-гидроксиэтил)иминотрис[гидроксиметил]метан (Bis-Tris), №[2-ацетамидо]-2-иминодиуксусную кислоту (ADA), глицилглицин и другие буферы на основе органических кислот. В другом аспекте, буферный агент по настоящему изобретению представляет собой гистидин или цитрат.
" Гистидиновый буфер" представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры гисти-диновых буферов включают растворы гистидина хлорида, гистидина ацетата, гистидина фосфата, гисти-дина сульфата. Гистидиновый буфер или буфер гистидин-HCl имеет pH от примерно 5,5 до примерно 7,0, имеет pH от примерно 6,1 до примерно 6,9, или примерно pH 6,5.
"Цитратный буфер" представляет собой буфер, содержащий ионы цитрата. Примеры цитратных буферов включают растворы цитрата натрия, цитрата аммония, цитрата кальция и цитрата калия. Цит-ратный буфер имеет pH от примерно 3,0 до 6,2, от примерно 5,5 до 6,5, от примерно 6,1 до примерно 6,5, примерно pH 6,1, примерно pH 6,2 или примерно pH 6,5.
"Сахарид" в данном документе означает соединение, имеющее общую формулу (СН2О)П, и его производные, включая моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахароспирты, восстанавливающие сахара, невосстанавливающие сахара и т.п. Примеры сахаридов по настоящему изобретению включают глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, декстран, эритрит, глицерин, ара-бит, силит, сорбит, маннит, мелибиозу, мелицитозу, рафинозу, маннотриозу, стахиозу, мальтозу, лакту-лозу, мальтулозу, глюцит, мальтит, лактит, изомальтулозу и т.п. Сахарид может быть лиопротектантом. В одном аспекте, сахарид в данном документе означает невосстанавливающий дисахарид, такой как сахароза.
В данном документе, "поверхностно-активное вещество" относится к агенту, который понижает поверхностное натяжение жидкости. В одном аспекте, поверхностно-активное вещество представляет собой неионное поверхностно-активное вещество. Примеры поверхностно-активных веществ в данном документе включают полисорбат (полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, например, полисорбат 20 и по-лисорбат 80); TRITON (т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол, неионный детергент, Union Carbide, дочерняя компания Dow Chemical Co., Midland Ml); додецилсульфат натрия (ДСН); лаурилсульфат натрия; натрия октилгликозид; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил-или стеарилсаркозин; линолеил-, миристил- или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеамидопропил-, миристамидопропил-, палмамидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например, лауроамидопропил); миристамидопропил-, палмамидопропил- или изостеарамидопропилдиме-тиламин; натрия метилкокоил- или динатрия метилолеилтаурат; сорбитанмонопальмитат; и серия продуктов MONAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); полиэтилгликоль (PEG), полипропипенгликоль (PPG) и сополимеры полоксиэтилен- и полоксипропипенгликоля (например, плюроник (Pluronics)/полоксамер (Poloxamer), PF68 и т.д.) и т.д. В другом аспекте, поверхностно-активное вещество в данном документе означает полисорбат 80.
Термин "хелатирующий агент" относится к агенту, который связывается с атомом более чем одной связью. В одном аспекте, примеры хелатирующих агентов по настоящему изобретению включают цитрат, этилендиаминтетрауксусную кислоту, этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), димеркапрол, диэтилентриаминпентауксусную кислоту и ^^бис(карбоксиметил)глицин. В другом аспекте хелати-рующий агент представляет собой цитрат или ЭДТА.
Термин "антиоксидант" относится к агенту, который ингибирует окисление других молекул. Примеры антиоксидантов по настоящему изобретению включают цитрат, липоевую кислоту, мочевую кислоту, глутатион, токоферол, каротин, ликопен, цистеин, фосфонатные соединения, например этидроно-вую кислоту, десфероксамин и малат.
Термин " антитело" в данном документе используется в самом широком смысле и, более конкретно, охватывает полноразмерные моноклональные антитела, иммуноглобулины, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные из по меньшей мере двух полноразмерных антител, например, каждое к отличному антигену или эпитопу, и индивидуальные антигенсвязывающие фрагменты, включая dAbs, scFv, Fab, F(ab)'2, Fab', включая человеческие, гуманизированные и антитела от видов, не являющихся человеком, и рекомбинантные антигенсвязы-вающие формы, такие как монотела и диатела.
Молярные количества и соотношения анти-сс4Р7 антитела к другим эксципиентам, описанным в данном документе, рассчитывают на основе предположения о приблизительном молекулярном весе антитела примерно 150000 Да. Фактический молекулярный вес антитела может отличаться от 150000 Да, в зависимости от аминокислотного состава или посттрансляционной модификации, например, в зависимости от клеточной линии, используемой для экспрессии антитела. Фактический молекулярный вес антите
ла может находиться в пределах ±5% от 150000 Да.
Термин " человеческое антитело" включает антитело, содержащее последовательность, выделенную из последовательности человеческого зародышевого иммуноглобулина, такое как антитело, полученное от трансгенных мышей, содержащих гены человеческого иммуноглобулина (например, XENOMOUSE генно-инженерных мышей (Abgenix, Fremont, CA), HUMAB-MOUSE (r), KIRIN ТС MOUSE(tm) трансхромосомных мышей, KMMOUSE(r) (MEDAREX, Princeton, NJ)), их человеческих библиотек фагового дисплея, клеток человеческой миеломы или человеческих В-клеток.
Термин "моноклональное антитело", в используемом тут значении, относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени гомогенных антител, т.е., индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов, которые могут возникать при продуцировании моноклональных антител, причем такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминантов (эпитопов), где каждое моноклональное антитело направлено против отдельного детерминанта антигена. Определение "моноклональный" указывает на характер антитела как полученного от в значительной степени гомогенной популяции антител и не должно истолковываться как требующее продуцирования антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомби-нантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из библиотеки фаговых антител с использованием методик, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Моноклональные антитела по настоящему изобретению, в частности, включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична с или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична с или гомологична соответствующей последовательности антител, полученной от другого вида или принадлежащей к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желательную биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес по настоящему изобретению, включают "приматизированные" антитела, содержащие вариабельный домен антигенсвязывающих последовательностей, полученный от не являющегося человеком примата (например, мартышки, человекообразной обезьяны и т. д.) и последовательности человеческой константной области.
" Антигенсвязывающие фрагменты" гуманизированного иммуноглобулина, приготовленные в композиции по изобретению, содержат по меньшей мере вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей анти-сс4Р7 антитела. Например, антигенсвязывающий фрагмент ведолизумаба содержит аминокислотные остатки 20-131 последовательность гуманизированной легкой цепи SEQ ID NO:4. Примеры таких анти-генсвязывающих фрагментов включают фрагменты Fab, фрагменты Fab', scFv и фрагменты F(ab')2 гуманизированного иммуноглобулина, известные специалистам. Антигенсвязывающие фрагменты гуманизированного иммуноглобулина по изобретению могут быть получены путем ферментативного расщепления или рекомбинантными методами. Например, гидролиз папаином или пепсином может быть использован для получения фрагментов Fab или F(ab')2, соответственно. Антитела могут также быть получены в различных укороченных формах с использованием генов антитела, в которые были введены один или несколько терминирующих кодонов левее природного сайта терминации. Например, рекомбинантный конструкт, кодирующий тяжелую цепь фрагмента F(ab')2, может быть сконструирован таким образом, чтобы он включал ДНК-последовательности, кодирующие СН1 домен и шарнирную область тяжелой цепи. В одном аспекте, антигенсвязывающие фрагменты ингибируют связывание интегрина сс4Р7 с одним или несколькими из его лигандов (например, мукозальным адрессином MAdCAM (например, MAd-CAM-1), фибронектином).
Гидролиз антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт и остаточный фрагмент "Fc", название которого отображает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих сайта и сохраняет способность к перекрестному связыванию с антигеном.
"Fv" представляет собой фрагмент антитела, состоящий из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи с нековалентной ассоциацией.
Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на кар-бокси-конце СН1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в данном документе обозначает Fab', в котором цистеиновый остаток (остатки) константных доменов несет по меньшей мере одну свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антител
первоначально получали в виде пар Fab'-фрагментов с шарнирными цистеинами между ними. Также известны другие химические связи фрагментов антител.
"Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антител содержат VH и VL домены антител, в которых такие домены присутствуют в отдельной полипептидной цепи. В одном аспекте, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который обеспечивает возможность образования желательной для связывания антигена структуры scFv. Обзор scFv приведен Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New
York, pp. 269-315(1994).
Термин " диатела" относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащим вариабельный тяжелый домен (VH), соединенный с вариабельным легким доменом (VL) в той же полипептидной цепи (VH-VL). Благодаря использованию линкера, слишком короткого для того, чтобы обеспечить возможность спаривания двух доменой одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описан-ны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993).
" Полноразмерное антитело" представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут быть константными доменами нативной последовательности (например, константными доменами нативной последовательности человека) или вариантами их аминокислотной последовательности. В одном аспекте, полноразмерное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями.
" Вариант аминокислотной последовательности" антитела по настоящему изобретению означает антитело с аминокислотной последовательностью, которая отличается от основного типа антител. Обычно, варианты аминокислотных последовательностей будут обладать по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% гомологии с основным типом антител. Варианты аминокислотных последовательностей имеют замещения, делеции и/или аддиции в определенных положениях в или рядом с аминокислотной последовательностью основного типа антител, но сохраняют антигенсвязывающую активность. Варианты в последовательностях константных областей антитела будут обладать меньшим эффектом на антигенсвязывающую активность, чем варианты в вариабельных областях. В вариабельных областях варианты аминокислотных последовательностей будут по меньшей мере на примерно 90% гомологичны, по меньшей мере на примерно 95% гомологичны, по меньшей мере на примерно 97% гомологичны, по меньшей мере на примерно 98% гомологичны или по меньшей мере на примерно 99% гомологичны основному типу антител.
" Гомология" определяется как процентное содержание в варианте аминокислотной последовательности идентичных остатков после выравнивания последовательности и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимального процента гомологии. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны специалистам.
" Терапевтическое моноклональное антитело" представляет собой антитело, используемок для терапии человека. Терапевтические моноклональные антитела, раскрытые в данном документе, включают анти-сс4Р7 антитела.
" Вариант гликозилирования" антитела по настоящему изобретению означает антитело с присоединенными к нему одним или несколькими углеводными фрагментами, которые отличаются от одного или нескольких углеводных фрагментов, присоединенных к основному типу антител. Примеры вариантов гликозилирования по настоящему изобретению включают антитело с G1 или G2 олигосахаридной структурой, вместо G0 олигосахаридной структуры, присоединенной к его Fc-области, антитело с одним или двумя углеводными фрагментами, присоединенными к одной или двум его легким цепям, антитело, не имеющее углеводов, присоединенных к одной или двум тяжелым цепям антитела и т. д., и комбинации изменений гликозилирования.
" Эффекторные функции" антитела относятся к тем биологическим активностям, которые приписываются Fc-области (Fc-области нативной последовательности или Fc-области варианта аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплемент-зависимая цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.п.
В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей, полноразмерные антитела могут быть отнесены к разным "классам". Существует пять основных классов полноразмерных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на "подклассы" (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам антител, называются а, 8, е, у и |Л соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.
" Легкие цепи" антител любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (к) и лямбда (А), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.
"Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" относятся к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксичные клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcRs) (например, природные клетки-убийцы (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, ме-диирующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в табл. 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки ADCC активности молекулы, представляющей интерес, может быть проведен in vitro анализ ADCC, такой как описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают моно-нуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-убийцы (NK). Альтернативно или дополнительно, ADCC активность молекулы, представляющей интерес, может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как раскрытая в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656(1998).
Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. В одном аспекте, FcR представляет собой последовательность нативного человеческого FcR. В другом аспекте, FcR представляет собой рецептор, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы таких рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRIIA ("активирующий рецептор") и FcyRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют схожие аминокислотные последовательности, различающиеся преимущественно в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит иммунорецепторный тирозин-активируемый мотив (ITAM) в своем ци-топлазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит иммунорецепторный тирозино-вый ингибирующий мотив (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см. обзор в M.Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcRs приведен Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92
(1991) ; Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 726:33-41 (1995). Другие FcRs, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охвачены в данном документе термином "FcR". Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, отвечающий за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
Термин "гипервариабельная область" при использовании в данном документе относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из "участок, определяющий комплементарность" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Остатки "каркасного участка" или "FR" представляют собой остатки вариабельного домена кроме остатков гипервариабельной области, как они определены в данном документе. Гипервариабельная область или ее CDR могут быть перенесены из одной цепи антитела в другую или в другой белок для придания специфичности связывания антигена полученному (комплексному) антителу или связывающему белку.
" Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, принадлежащих грызунам) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, выделенную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области не являющегося человеком вида (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, обладающего желательной специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие нечеловеческие остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, отсутствующие в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антитела. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, типично, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину и все или по существу все FR принадлежат последовательностям человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, необязательно, будет также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), типично, человеческого иммуноглобулина. Дополнительные подробности приведены в Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596
(1992) .
(1992)
Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких его гипервариабельных областях, которые приводят к улучшению аффинности антитела к антигену, по сравнению с родительским антителом, не имеющим такого изменения (изменений). В одном аспекте, подвергнутые аффинному созреванию антитела будут иметь наномолярны или даже пикомолярные аффинности к антигену-мишени. Подвергнутые аффинному созреванию антитела получают с помощью процедур, известных специалистам. Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описывает аффинное созревание путем перемешивания доменов VH и VL. Случайный мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992).
" Изолированное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его природного окружения. В определенных вариантах исполнения, антитело будет очищено (1) до более 95 мас.% белка, при определении по методу Лоури, альтернативно, более 99 мас.% (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности при определении методом ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавли-вающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или серебром. Изолированное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Обычно, однако, изолированное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки.
" Лечение" относится как к терапевтическому, так и профилактическому лечению или предохранительным мерам. Особы, нуждающиеся в лечении, включают тех, кто уже болен, а также тех, кому нужно предотвратить болезнь или ее рецидив. Таким образом, пациент, подлежащий лечению по настоящему изобретению, может иметь установленный диагноз болезни или может быть предрасположен или восприимчив к болезни. Термины "пациент" и "субъект" в настоящем изобретении используются взаимозаменяемо.
Антитело, используемое для приготовления композиции, является, по существу, чистым и желательно в значительной степени гомогенным (т.е. не содержащим белковых загрязнений и т.д.). "По существу чистое" антитело означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 90 мас.% антитела, в пересчете на общий вес белка, альтернативно, по меньшей мере примерно 95 или 97 мас.% "В значительной степени гомогенное" антитело означает композицию, содержащую белок, в которой по меньшей мере примерно 99 мас.% белка представляет собой специфическое антитело, например, анти-а4Р7 антитело, в пересчете на общий вес белка.
" Клиническая ремиссия" в используемом тут значении по отношению к субъектам с неспецифическим язвенным колитом относится к оценке по полной шкале Мейо 2 или меньше баллов и отсутствию оценок по индивидуальным подшкалам более 1 балла. " Клиническая ремиссия" болезни Крона относится к оценке по шкале CDAI, равной 150 баллам или меньше.
" Клинический ответ", в используемом тут значении, по отношению к субъектам с неспецифическим язвенным колитом, относится к снижению по полной шкале Мейо на 3 или больше балла и на 30% от базовой линии (или по частичной шкале Мейо на 2 или больше балла и на 25% или больше от базовой линии, если оценка по полной шкале Мейо не проводилась при посещении врача) с сопровождающим снижением по подшкале ректального кровотечения на 1 или больше баллов или по абсолютной шкале ректального кровотечения на 1 или меньше баллов. "Клинический ответ" в используемом тут значении по отношению к субъектам с болезнью Крона относится к снижению на 70 баллов или больше оценки по шкале CDAI от базовой линии (неделя 0).
"Заживление слизистой" в используемом тут значении по отношению к субъектам с неспецифическим язвенным колитом относится к оценке по эндоскопической подшкале 1 балл или меньше.
В используемом тут значении, "терапевтическая неудача" относится к ухудшению болезни, необходимости в применении препаратов неотложной терапии или хирургическом вмешательстве для лечения неспецифического язвенного колита или болезни Крона. Препараты неотложной терапии представляют собой любой новый лекарственный препарат или любое увеличение дозы препарата базовой линии, необходимые для лечения новых или некупированных симптомов неспецифического язвенного колита или болезни Крона (за исключением противодиарейных средств для борьбы с хронической диареей).
Композиции
Как описано в настоящем изобретении, было обнаружено, что анти-а4Р7 антитела являются более стабильными в составе композиций с антиоксидантом или хелатирующим агентом. Кроме того, как описано в настоящем изобретении, композиции анти-а4Р7 антител могут быть составлены таким образом, чтобы уменьшать образование агрегатов (например, количество полисорбата 80 в композиции может быть уменьшено). Например, композиции, которые содержат цитрат или ЭДТА и анти-а4Р7 антитела, снижают скорость образования агрегатов антител при хранении. Композиции также могут храниться без кислорода для уменьшения образования агрегатов. В одном варианте исполнения, композиция имеет
показатель образования агрегатов антител менее примерно 2,5% при 25°C через 12 месяцев. В одном варианте исполнения, композиция имеет показатель образования агрегатов антител менее примерно 2,0% при 25°C через 12 месяцев. В одном варианте исполнения, композиция имеет показатель образования агрегатов антител менее примерно 1,6% при 25°C через 12 месяцев. В одном варианте исполнения, композиция имеет показатель образования агрегатов антител менее примерно 1,3% при 25°C через 12 месяцев. В одном варианте исполнения, композиция имеет показатель образования агрегатов антител менее примерно 1,0% при 25°C через 12 месяцев. В другом варианте исполнения, композиция имеет показатель агрегации антител в композиции менее примерно 0,5% при 5°C через 12 месяцев. В другом варианте исполнения, композиция имеет показатель агрегации антител в композиции менее примерно 0,3% при 5°C через 12 месяцев.
Настоящее изобретение предусматривает, в первом аспекте, стабильную композицию анти-а4Р7 антитела. Композиция содержит анти-а4Р7 антитело и антиоксидант или хелатирующий агент. Композиция также содержит буферный агент, который может быть одной или несколькими свободными аминокислотами. Композиция может необязательно дополнительно содержать поверхностно-активное вещество. Антитело в композиции может быть полноразмерным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, таким как фрагмент Fab, Fv, scFv, Fab' или F(ab')2.
Образование агрегатов может быть уменьшено путем удаления кислорода из композиции. Альтернативно, композиция может содержать антиоксидант или хелатирующий агент. В одном аспекте, Типичные примеры антиоксидантов и хелатирующих агентов, которые могут быть введены в состав композиции, включают липоевую кислоту, мочевую кислоту, глутатион, токоферол, каротин, ликопен, цистеин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), димерка-прол, диэтилентриаминпентауксусную кислоту и ^№бис(карбоксиметил)глицин, фосфонатные соединения, например, этидроновую кислоту, десфероксамин, малат и цитрат. Некоторые антиоксиданты и хелатирующие агенты могут снижать скорость образования агрегатов при хранении композиции. В другом аспекте, хелатирующий агент и/или антиоксидант представляет собой цитрат или ЭДТА. Типичные примеры концентраций хелатирующего агента для жидких композиций находятся в диапазоне значений от примерно более 0 до примерно 60 мМ, от примерно 5 до примерно 50 мМ, от примерно 5 до примерно 15 мМ, примерно 10 до примерно 25 мМ, до примерно 20 до примерно 30 мМ. В другом аспекте концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 0 до примерно 30 мМ. В одном варианте исполнения хелатирующий агент и/или антиоксидант представляет собой цитрат и концентрация цитрата составляет от примерно 0 до примерно 15 мМ, от примерно 0 до примерно 10 мМ или от примерно 0 до примерно 5 мМ.
Композиция может содержать любую одну желательную свободную аминокислоту, которая может находиться в L-форме, D-форме или любой желательной смеси таких форм. В одном аспекте, свободные аминокислоты, которые могут быть включены в композиции, включают, например, гистидин, аланин, аргинин, глицин, глутаминовую кислоту, серин, лизин, триптофан, валин, цистеин и их комбинации. Некоторые аминокислоты могут стабилизировать белки от деградации в процессе производства при высушивании, лиофилизации и/или хранении, например, благодаря образованию водородных связей, солевых мостиков, антиоксидантным свойствам или гидрофобным взаимодействиям или путем исключения из белковой поверхности. Аминокислоты могут действовать как модификаторы тоничности или могут вызывать снижение вязкости композиции. В другом аспекте свободные аминокислоты, такие как гистидин и аргинин, могут действовать как лиопротектанты и не кристаллизуются при лиофилизации в качестве компонентов композиции. Свободные аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и гистидин, сами или в комбинации, могут действовать как буферные агенты в водном растворе в диапазоне значений pH от 5 до 7,5. В еще одном аспекте композиция содержит гистидин, аргинин или комбинацию гистидина и аргинина. В еще одном аспекте концентрации свободной аминокислоты для жидких композиций находятся в диапазоне значений от примерно 9 мМ до примерно 0,5 М, например, от примерно 10 до примерно 90 мМ, от примерно 10 до примерно 75 мМ, от примерно 10 до примерно 40 мМ, от примерно 25 до примерно 50 мМ, от примерно 15 до примерно 300 мМ, от примерно 20 до примерно 200 мМ, от примерно 25 до примерно 150 мМ, от примерно 50 до примерно 75 мМ, от примерно 50 до примерно 120 мМ, от примерно 50 до примерно 150 мМ, или от примерно 50 до примерно 125 мМ.
Композиция может необязательно дополнительно содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, например, для предотвращения образования растворимых и нерастворимых агрегатов. В одном аспекте, поверхностно-активное вещество представляет собой неионное поверхностно-активное вещество. В другом аспекте, поверхностно-активное вещество представляет собой ионное поверхностно-активное вещество. Типичные примеры поверхностно-активных веществ, которые могут быть введены в композиции, включают, например, полисорбат 20, полисорбат 80, полоксамер (Pluronic(r)) и их комбинации. В случае его присутствия, поверхностно-активное вещество обычно используется в количестве, которое уменьшает образование нерастворимых агрегатов антитела, например, при розливе во флаконы, замораживании, высушивании, лиофилизации и/или восстановлении, в присутствии силикона, флаконов для наполнения, предварительно заполненных шприцов и/или картриджей.
Концентрация поверхностно-активного вещества обычно составляет от примерно 0,0001 до примерно 1,0%, от примерно 0,01 до примерно 0,5%, например, примерно 0,05, 0,1, 0,15, 0,20, 0,3, 0,4 или 0,5% (мас./об.). Более высокие концентрации поверхностно-активного вещества, например полисорбата 80, могут приводить к увеличению образования агрегатов при определении методом SEC (эксклюзионной хроматографии). Снижение концентрации полисорбата 80 может уменьшать образование агрегатов при определении методом SEC при хранении. В одном аспекте величина молярного соотношения поверхностно-активное вещество: антитело составляет от примерно 0,7:1 до примерно 2,0:1. В другом аспекте молярное соотношение поверхностно-активное вещество :антитело равно 1,5:1.
Вариант исполнения композиция анти-а4Р7 антитела содержит высокую концентрацию анти-а4Р7 антитела. Например, в одном варианте исполнения жидкие композиции могут содержать по меньшей мере примерно 60 мг/мл, по меньшей мере примерно 70 мг/мл, по меньшей мере примерно 80 мг/мл, по меньшей мере примерно 90 мг/мл, по меньшей мере примерно 100 мг/мл, по меньшей мере примерно 110 мг/мл, по меньшей мере примерно 120 мг/мл, по меньшей мере примерно 130 мг/мл, по меньшей мере примерно 140 мг/мл, по меньшей мере примерно 150 мг/мл, по меньшей мере примерно 160 мг/мл, по меньшей мере примерно 170 мг/мл, по меньшей мере примерно 180 мг/мл, по меньшей мере примерно 190 мг/мл, по меньшей мере примерно 200 мг/мл, по меньшей мере примерно 250 мг/мл, по меньшей мере примерно 300 мг/мл, от примерно 60 до примерно 190 мг/мл, от примерно 60 до примерно 170 мг/мл анти-а4Р7 антитела, от примерно 150 до примерно 180 мг/мл или от примерно 160 до примерно 165 мг/мл анти-а4Р7 антитела. Альтернативно, в другом аспекте, жидкие композиции могут содержать по меньшей мере примерно 154 мг/мл, по меньшей мере примерно 176 мг/мл.
Композиция может быть жидкостью или твердым веществом. Жидкие композиции представляют собой водные растворы или суспензии, приготовленные в пригодном водном растворителе, таком как вода или водно-органическая смесь, такая как водно-спиртовые смеси. Жидкие композиции имеют значение pH от примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6,0 и 7,3, от примерно 6,0 до примерно 7,0, от примерно 6,0 и 6,5, от примерно 6,0 и 6,3, от примерно 6,3 до 7,1, или от примерно 6,4 до 7,0, или от 6,3 до 6,8, такое как примерно 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9. Жидкие композиции могут храниться при комнатной температуре охлажденными (например, при 2-8°C) или замороженными (например, -20 или -70°C) для хранения.
Твердая композиция может быть приготовлена любым пригодным способом и может иметь форму брикета или порошка, например, с добавкой лиопротектанта. В одном аспекте твердую композицию готовят путем высушивания жидкой композиции, как описано в настоящем изобретении, например путем лиофилизации или распылительной сушки. В тех случаях, когда композиция представляет собой твердую композицию, она может иметь влагосодержание не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4,5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3,5%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2,5%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1,5%, не более чем примерно 1%, или быть, по существу, безводной. Твердая композиция может быть растворена, т. е. восстановлена, в пригодной среде или растворителе для получения жидкости, пригодной для введения.
Пригодные растворители для восстановления твердой композиции включают воду, изотонический солевой раствор, буфер, например, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера (с лактозой или декстрозой), минимальной поддерживающей средой, спиртово-водные растворы, раствор декстрозы и т. д. Количество растворителя может обеспечивать терапевтическую концентрацию белка выше, равную или ниже концентрации до высушивания. В другом аспекте концентрация восстановленного анти-а4Р7 антитела представляет собой ту же концентрацию, что и в жидкой композиции перед высушиванием.
Композиция может быть стерильной, и это может быть достигнуто в соответствии с известными квалифицированному специалисту процедурами получения стерильных фармацевтических композиций, пригодных для введения людям, до или после приготовления композиции. Композиция может быть стерилизована в виде жидкости, например, перед высушиванием и/или после восстановления путем фильтрации через мелкие поры, путем асептической обработки или путем воздействия ультрафиолетового излучения. Размеры пор фильтра могут составлять 0,1 или 0,2 мкм для фильтрации микроорганизмов или от 10 до 20 нм для фильтрации вирусных частиц. Альтернативно или дополнительно высушенная композиция может быть стерилизована, например, путем облучения гамма-излучением. В одном аспекте жидкую композицию анти-а4Р7 антитела стерилизуют путем фильтрации перед высушиванием.
В одном аспекте композиция является стабильной при хранении. Различные анализы стабильности являются доступными квалифицированному специалисту-практику для подтверждения стабильности композиции. Например, антитело в жидкой композиции может быть стабильным при хранении при примерно 25°C в течение по меньшей мере примерно 4 недель, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев или по меньшей мере примерно 6 месяцев или по меньшей мере примерно 9 месяцев или по меньшей мере примерно 12 месяцев; при примерно 2-8°C - по меньшей мере примерно 3 месяца, по меньшей мере примерно 1 год, по меньшей мере примерно 2 года, по меньшей мере примерно 3 года или дольше. Альтернативно или дополнительно, антитело в композиции могут быть стабильным при хранении при примерно 15°C в течение по меньшей мере примерно 4 недель, по
меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 1 года или дольше. Альтернативно или дополнительно, антитело в композиции может быть стабильным при хранении при примерно -20 или -70°C в течение по меньшей мере примерно 4 недель; по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 1 года, по меньшей мере примерно 2 лет, по меньшей мере примерно 3 лет, по меньшей мере примерно 4 лет или дольше.
Стабильность может быть протестирована путем оценки физической стабильности, химической стабильности и/или биологической активности антитела в композиции во время приготовления композиции, а также после хранения при указанных температурах. Физическая и/или химическая стабильность жидкой композиции или восстановленого сухого порошка может быть оценена качественно и/или количественно множеством различных способов (см., например, Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development, Rodriguez-Diaz et al. eds. Informa Healthcare (2005)), включая оценку образования растворимых и нерастворимых агрегатов (например, с использованием эксклюзионной хроматографии, аналитического ультрацентрифугирования, MALDI-TOF MS, светорассеяния (динамического (DLS) или MALLS), микроскопической визуализации в потоке или с помощью других систем подсчета частиц в жидкости, путем измерения мутности, центрифугированием в градиенте плотности и/или путем визуального контроля); путем оценки гетерогенности заряда с использованием катионообменной хроматографии (см. также Vlasak and lonescu, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468-481 (2008) и Harris et al. J. Chromatogr. В Bi-omed. Sci. Appl. 752:233-245 (2001)), изоэлектрического фокусирования или электрофореза в капиллярной зоне; анализа аминоконцевых или карбоксиконцевых последовательностей; масс-спектрометрического анализа; анализа методом ДСН-ПААГ для сравнения фрагментированных, интакт-ных и мультимерных (т.е., димерных, тримерных и т.д.) антител; пептидных карт (например, триптиче-ских или LYS-, и т.п.). Нестабильность может приводить к агрегированию, деамидированию (например, деамидированию Asn), окислению (например, окислению Met), изомеризации (например, изомеризации Asp), денатурации, отсечению/гидролизу/фрагментации (например, фрагментации шарнирной области), образованию сукцинимида, неспаренному цистеину (цистеинам), N-концевому удлинению, С-концевому процессингу, различиям в гликозилировании, и т. д. Биологическая активность или антигенсвязывающие функции, например, связывание анти-а4Р7 антитела с MAdCAM (например, MAdCAM-1) или ингибиро-вание связывания клетки, экспрессирующей интегрин а4Р7, с MAdCAM (например, MAdCAM-1), например, иммобилизированным MAdCAM (например, MAdCAM-1), может быть оценена с использованием различных методик, доступных квалифицированному специалисту-практику (см., напр., Soler et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 330:864-875 (2009)). Измерение влагосодержания сухой композиции может указывать вероятность протекания химической или физической деградации композиции, причем большая влажность вызывает более сильную деградацию.
Стабильная композиция может способствовать низкой иммуногенности анти-а4Р7 антитела. Имму-ногенное анти-а4Р7 антитело может приводить к ответу с образованием человеческих антител против иммуноглобулина человека (НАНА) у людей или пациентов. У пациентов с возникающим НАНА-ответом на анти-а4Р7 антитело могут наблюдаться нежелательные эффекты (например, реакция места инфузии) при лечении или анти-а4Р7 антитело может быстро элиминироваться, приводя к более низкой дозе, чем запланированная для лечения. В отчете (Feagen et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:2499-2507) о ранних исследованиях лечения анти-а4Р7 антителами указывалось, что человеческие антитела против иммуноглобулина человека образовывались к неделе 8 у 44% получавших лечение пациентов. Антитело в данных исследованиях хранилось в виде жидкости не содержало полисорбата.
В некоторых вариантах исполнения, композиция увеличивать долю НАНА-негативных пациентов до по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% пациентов по сравнению с результатами НАНА для менее стабильной композиции.
В некоторых вариантах исполнения, композиция анти-а4Р7 антитела содержит > 50% главной заряженной изоформы, > 55% главной заряженной изоформы или от 65 до 70% главной заряженной изофор-мы. В других аспектах, стабильная композиция анти-а4Р7 антитела содержит <45% кислотных заряженных изоформ, <40% кислотных заряженных изоформ, <30% кислотных заряженных изоформ или от 22 до 28% кислотных изоформ. В других аспектах стабильная композиция анти-а4Р7 антитела содержит <25% основных изоформ, <20% основных изоформ, <15% основных изоформ, примерно 5% основных изоформ или примерно 10% основных изоформ. В одном аспекте, стабильная композиция анти-а4Р7 антитела содержит > 55% главной изоформы, <30% кислотных изоформ и/или <20% основных изоформ, например, при определении по методу СЕХ. В другом аспекте стабильная композиция анти-а4Р7 антитела содержит > 50% главной изоформы, <45 % кислотных изоформ и/или <10% основных изоформ, например, при определении по методу clEF.
В некоторых аспектах сухая твердая композиция анти-а4Р7 антитела имеет <10% влагосодержания, <5% влагосодержания или <2,5% влагосодержания. Время, необходимое для восстановления, составляет
<60 мин, <50 мин или <40 мин или <30 мин или <20 мин.
Содержание мономеров и/или содержание агрегатов (например, в виде димеров, тримеров, тетраме-ров, пентамеров, олигомеров и агрегатов более высокого порядка), например, в жидкой композиции или в восстановленой композиции, может быть измерено методами SEC, аналитического ультрацентрифугирования, светорассеяния (DLS или MALLS), MALDI-TOF MS или наномасштабных измерений, таких как анализ траекторий наночастиц (NTA) (NanoSight Ltd., Wiltshire, UK). Разрешение, характеризация и количественное определение агрегатов могут быть осуществлены рядом способов, включая увеличение длины разделения на колонке для эксклюзионной хроматографии, например, путем использования более длинной колонки или путем последовательного присоединения второй или большего часла SEC-колонок к исходной аналитической SEC-колонке, дополнение количественного определения мономеров методом SEC светорассеянием, или путем использования NTA.
В одном варианте исполнения, композиция анти-сс4Р7 антитела содержит > 90% мономерного антитела, > 95% мономерного антитела или от 97 до 99% мономерного антитела. В другом варианте исполнения, большая часть материала в композиции анти-сс4Р7 антитела имеет средний радиус <20 нм, <15 нм, <10 нм или от примерно 5 до примерно 7 нм. В одном аспекте, композиция анти-сс4Р7 антитела содержит > 80% по количеству тяжелой плюс легкой цепей по результатам белкового анализа. В одном аспекте, присутствует > 90% тяжелой плюс легкой цепей. В другом аспекте, композиция анти-сс4Р7 антитела содержит <10% агрегатов, <5% агрегатов, <2,5% агрегатов, <1,5% агрегатов, <1,0% агрегатов или <0,5% агрегатов. В другом аспекте, стабильная композиция анти-сс4Р7 антитела содержит > 96% мономеров и/или <2,5% агрегатов. В еще одном аспекте, стабильная композиция анти-сс4Р7 антитела содержит примерно 99% мономеров и/или примерно <1% агрегатов.
Размеры частиц более 1-2 мкм, например, агрегатов или нерастворенного эксципиента, например, в жидкой композиции или в восстановленной композиции, могут быть измерены методом затемнения света (например, система для подсчета частиц в жидкости (HIAC) фирмы Hach Ultra Analytics (Grants Pass, OR)), микроскопии, культеровским счетчиком или системой на основе цифровой (например, поточной) микроскопической визуализации, такой как микрофлюидная визуализация (MFI) фирмы Brightwell (Ottawa, CA) или анализатор частиц FLOWCAM(r) Image фирмы Fluid Imaging Technologies (Yarmouth, ME). В одном аспекте, размер частиц в препарате анти-сс4Р7 антитела составляет примерно 30 мкм, примерно 25 мкм, примерно 10 мкм, примерно 5 мкм, примерно 2 или 1 мкм или меньше. Количество частиц в композиции антител должно быть минимальным. В одном аспекте количество частиц в композиции ан-ти-сс4Р7 антитела составляет <6000 частиц с диаметром > 10 мкм и/или <600 частиц с диаметром > 25 мкм в одной дозе (US Pharmacopoeia Chp. 788, способ подсчета методом затемнения света; составляет половину от количества, измеренного микроскопическими способами количественного определения). В другом аспекте, количество частиц в дозе композиции анти-сс4Р7 антитела составляет от примерно 1000 частиц > 10 мкм до примерно 0-100 частиц > 25 мкм (способ MFI). В еще одном аспекте, количество частиц на миллилитр, например, определенное путем измерения методом MFI, в дозе композиции анти-сс4Р7 антитела составляет от примерно 500 до примерно 2000 частиц размером 2-10 мкм на мл, от примерно 50 до примерно 350 частиц размером > 10 мкм на мл, от примерно 0 до примерно 50 частиц размером > 25 мкм на мл. В еще одном аспекте, количество частиц в дозе композиции анти-сс4Р7 антитела составляет от примерно 500 до примерно 100000, от примерно 1000 до примерно 5000, или от примерно 1500 до примерно 3000 частиц размером 2-10 мкм на мл.
Вязкость композиции анти-сс4Р7 антитела может контролироваться для подкожного или внутримышечного введения. Вязкость может зависеть от концентрации белка и рН. Например, с увеличением концентрации белка вязкость может возрастать. Увеличение pH может снижать вязкость композиции анти-сс4Р7 антитела. В некоторых белковых композициях добавляют хлорид натрия для снижения вязкости композиции. Дополнительными компонентами, которые могут влиять на вязкость композиции анти-сс4Р7 антитела, являются аминокислоты, такие как гистидин и аргинин.
Композиция анти-сс4Р7 антитела может быть изотонической (например, 250-350 мОсм) или гипертонической (например, более 350 мОсм, более 450 мОсм, более 550 мОсм или более 650 мОсм), например, для подкожного или внутримышечного введения. В одном аспекте, композиция анти-сс4Р7 антитела не является гипотонической, например, менее 250 мОсм. В другом аспекте, композиция анти-сс4Р7 антитела имеет показатель от примерно 350 до примерно 400 мОсм, от примерно 400 до примерно 450 мОсм, или от примерно 350 до примерно 450 мОсм.
Нестабильность, приводящая к денатурации, может быть оценена методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Антитела имеют две температуры плавления (Tm) на ДСК, например Tm1 и Tm2. Определенные эксципиенты могут влиять на стабильность нативного анти-сс4Р7 антитела. Обнаружение более высокой температуры плавления при сравнении композиций методом ДСК может указывать на более стабильную композицию анти-сс4Р7 антитела с более высоким значением Tm. Например, при pH 5,7 значение Tm композиции анти-сс4Р7 антитела ниже и, таким образом, она менее стабильна, чем при pH 6,5. В одном аспекте, Tm1 композиции анти-сс4Р7 антитела имеет значение > 60°C. В
другом аспекте, Tm1 композиции анти-сс4Р7 антитела имеет значение от примерно 65 до примерно 70°C или примерно 69°C. В одном аспекте, Tm2 композиции анти-сс4Р7 антитела имеет значение > 80°C. В другом аспекте, Tm2 композиции анти-сс4Р7 антитела имеет значение от примерно 82 до примерно 88°C или примерно 86°C.
В одном варианте исполнения композиция анти-сс4Р7 антитела имеет аффинность связывания или значение ЕС50 от примерно 60 до примерно 140% от значения для эталонного стандарта анти-сс4Р7 антитела. В одном аспекте анти-сс4Р7 антитело в композиции, описанной в настоящем изобретении, связывается с сс4Р7, например, на клетке (WO 98/06248 или патент США № 7147851), со значением, составляющим от примерно 80 до примерно 120% от значения для эталонного стандарта. В другом варианте исполнения композиция анти-сс4Р7 антитела обладает способностью ингибировать по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% связывания клетки, экспрессирующей интегрин сс4Р7, с MAdCAM (например, MAdCAM-1), например, химерой MAdCAM-Ig (см. публикацию патентной заявки США № 20070122404, где также приведены примеры эталонных стандартов).
Как было отмечено выше, замораживание композиции специально предусматривается настоящим изобретением. Таким образом, композиция может быть подвергнута испытаниям на стабильность при замораживании и оттаивании. Соответственно, антитело в жидкой композиции может быть стабильным при замораживании и оттаивании композиции, например, антитело может быть стабильным после одного, двух, трех, четырех, пяти или больше циклов замораживание/оттаивание.
В некоторых вариантах исполнения, фармацевтическая композиция представляет собой жидкую композицию, содержащую по меньшей мере от примерно 60 до примерно 170 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, буферный агент (например, гистидин) и по меньшей мере примерно 5 мМ цитрата. В других вариантах исполнения, композиция представляет собой жидкую композицию, содержащую по меньшей мере от примерно 60 до примерно 170 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, буферный агент (например, цитрат), аминокислоту (например, аргинин) и поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80).
В другом варианте исполнения композиция содержит по меньшей мере от примерно 140 или примерно 150 до примерно 170 мг/мл, например, примерно 160 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, буферный агент (например, гистидин), по меньшей мере примерно 5 мМ цитрата и свободную аминокислоту (например, аргинин).
В еще одном варианте исполнения композиция содержит по меньшей мере примерно 160 мг/мл ан-ти-сс4Р7 антитела, буферный агент (например, гистидин), по меньшей мере примерно 5 мМ цитрата, 0,2% полисорбата 80 и свободную аминокислоту (например, аргинин). В варианте исполнения концентрация буфера в композиции составляет от примерно 15 до примерно 75 мМ, от примерно 25 до примерно 65 мМ или примерно 50 мМ. Концентрация свободной аминокислоты в композиции составляет от примерно 50 до примерно 250 мМ, от примерно 75 до примерно 200 мМ, от примерно 100 до примерно 150 мМ или примерно 125 мМ; концентрация полисорбата 80 в композиции составляет от примерно 0,05 до 0,4%, от примерно 0,1 до 0,4%, от примерно 0,1 до 0,3%, от примерно 0,1 до 0,25%, от примерно 0,1 до 0,2% или примерно 0,2%.
В некоторых вариантах исполнения композиция представляет собой твердую композицию (например, лиофилизированную композицию), включающую смесь анти-сс4Р7 антитела, цитрата, гистидина, аргинина, полисорбата 80 и лиопротектанта или сахарида, такого как невосстанавливающий сахар. Саха-рид может быть включен в жидкую композицию до достижения концентрации от 0 до 20% или от примерно 6 до примерно 10%.
В одном варианте исполнения композиция лиофилизируется и хранится в виде разовой дозы в одном контейнере, например флаконе, шприце, картридже и/или автоинжекторе. Контейнер может храниться при примерно 2-8°C или 25°C до ее введения нуждающемуся в этом субъекту. Флакон может быть, например, флаконом на 5, 10 или 20 куб.см (сс) (например, для дозы 160 мг/мл). Флакон может содержать по меньшей мере примерно 20 мг, по меньшей мере примерно 50 мг, по меньшей мере примерно 70 мг, по меньшей мере примерно 80 мг, по меньшей мере примерно 100 мг, по меньшей мере примерно 120 мг, по меньшей мере примерно 155 мг, по меньшей мере примерно 180 мг, по меньшей мере примерно 200 мг, по меньшей мере примерно 240 мг, по меньшей мере примерно 300 мг, по меньшей мере примерно 360 мг, по меньшей мере примерно 400 мг, по меньшей мере примерно 540 мг или по меньшей мере примерно 900 мг анти-сс4Р7 антитела. В одном аспекте контейнер содержит примерно 165 мг анти-сс4Р7 антитела.
В другом варианте исполнения композиция является жидкой и хранится в виде разовой дозы в одном или двух флаконах, картриджах, шприцах или автоинжекторах. Флакон, картридж, шприц или автоинжектор могут храниться при примерно 2-8°C до введения их содержимого, например, анти-сс4Р7 антитела, нуждающемуся в этом субъекту. Флакон может быть, например, флаконом на 5, 10 или 20 куб.см (например, для дозы 160 мг/мл). Флакон может содержать по меньшей мере примерно 20 мг, по меньшей мере примерно 50 мг, по меньшей мере примерно 70 мг, по меньшей мере примерно 80 мг, по меньшей мере примерно 100 мг, по меньшей мере примерно 120 мг, по меньшей мере примерно 155 мг, по меньшей мере примерно 180 мг, по меньшей мере примерно 200 мг, по меньшей мере примерно 240 мг, по
меньшей мере примерно 300 мг, по меньшей мере примерно 360 мг, по меньшей мере примерно 400 мг, по меньшей мере примерно 540 мг или по меньшей мере примерно 900 мг анти- <о4Р7 антитела. В одном аспекте флакон содержит примерно 165 мг анти- <о4Р7 антитела. Шприц или картридж могут быть контейнером емкостью 1 или 2 мл (например, для дозы 160 мг/мл) или больше 2 мл, например, для более высокой дозы (по меньшей мере 320 или 400 мг или выше). Шприц или картридж может содержать по меньшей мере примерно 20 мг, по меньшей мере примерно 50 мг, по меньшей мере примерно 70 мг, по меньшей мере примерно 80 мг, по меньшей мере примерно 100 мг, по меньшей мере примерно 120 мг, по меньшей мере примерно 155 мг, по меньшей мере примерно 180 мг, по меньшей мере примерно 200 мг, по меньшей мере примерно 240 мг, по меньшей мере примерно 300 мг, по меньшей мере примерно 360 мг, по меньшей мере примерно 400 мг или по меньшей мере примерно 500 мг анти- <о4Р7 антитела.
Один или несколько других фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или стабилизаторов, таких как описанные в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Hendrickson, R. Ed. (2005), могут быть включены в композиции при условии, что они не будут оказывать нежелательного эффекта на требуемые характеристики композиции. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают дополнительные буферные агенты; сорастворители; антиоксиданты, включая цитрат и цистеин; хела-тирующие агенты, такие как ЭДТА; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); биодегради-руемые полимеры, такие как полиэфиры; консерванты; смазывающие вещества стенки контейнера, например, силикон, минеральное масло, глицерин или производное перфторполиэфира TRIBOGLIDE(r) (Tribo Film Research, Inc.), для облегчения инъекции, и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.
Антитела ос4Р7
Анти- <о4Р7 антитела, пригодные для использования в композициях, включают антитела из любого желательного источника, такого как полностью человеческие антитела, мышиные антитела, кроличьи антитела и т. п., и любые желательные сконструированные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и т. п. Антигенсвязывающие фрагменты любых таких типов антител, такие как фрагменты Fab, Fv, scFv, Fab' и F(ab')2, также являются пригодными для использования в композициях.
Анти- <о4Р7 антитело может связываться с эпитопом на <о4 цепи (например, гуманизированного MAb 21,6 (Bendig et al., патент США № 5840299)), на Р7 цепи (например, FIB504 или гуманизированного производного (например, Fong et al., патент США № 7528236)) или с комбинационным эпитопом, образующимся в результате ассоциации цепи о 4 с цепью Р7. В одном аспекте антитело связывает комбинационный эпитоп на комплексе о 4Р7, но не связывает эпитоп на о 4 цепи или Р7 цепи, если цепи не ассоциированы друг с другом. Ассоциация о 4 интегрина с Р7 интегрином может создавать комбинационный эпитоп, например, в результате сближения вследствие образования мостиковых связей остатков, расположенных в обоих цепях, которые вместе образуют эпитоп, или в результате конформационного обнажения на одной цепи, например, о 4 цепи интегрина или Р7 цепи интегрина, эпитопного связывающего сайта, который является недоступным для связывания антителом в отсутствие соответствующего партнера интегрина или без активации интегрина. В другом аспекте анти-о 4Р7 антитело связывает как о 4 цепь интегрина, так и Р7 цепь интегрина и, таким образом, является специфическим по отношению к интегри-новому комплексу о 4Р7. Такие антитела могут связывать о 4Р7, но не связывают, например, о 4Р1 и/или не связывают о ЕР7. В другом аспекте, анти-о 4Р7 антитело связывается с таким же или по существу с таким же эпитопом, как и Act-1 антитело (Lazarovits, A. I. et al., J. Immunol., 133(4): 1857-1862 (1984), Schweighoffer et al., J. Immunol., 151(2): 717-729, 1993; Bednarczyk et al., J. Biol. Chem., 269(11): 83488354, 1994). Клеточная линия мышиной гибридомы АСТ-1, которая продуцирует мышиное монокло-нальное антитело Act-1, была депонирована согласно Будапештскому договору 22 августа 2001 г., от имени фирмы Millennium Pharmaceuticals, Inc., 40 Landsdowne Street, Cambridge, Mass. 02139, U.S.A., в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., под номером доступа РТА-3663. В другом аспекте, анти-о 4Р7 антитело представляет собой человеческое антитело или о 4Р7 связывающий белок, в котором используются CDR, предусмотренные в публикации патентной заявки США № 2010/0254975.
В одном аспекте анти-о 4Р7 антитело ингибирует связывание о 4Р7 с одним или несколькими из его лигандов (например, мукозальным адрессином, например, MAdCAM (например, MAdCAM-1), фибро-нектином и/или сосудистым адрессином (VCAM)). MAdCAM приматов (например, MAdCAM-1) описаны в публикации РСТ WO 96/24673, полное описание которой настоящим включено в данное описание в качестве ссылки. В другом аспекте анти-о 4Р7 антитело ингибирует связывание о 4Р7 с MAdCAM (например, MAdCAM-1) и/или фибронектином без ингибирования связывания VCAM.
В одном аспекте, анти-о 4Р7 антитела для использования в композициях представляют собой гуманизированные варианты мышиного Act-1 антитела. Пригодные способы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам. Обычно гуманизированное анти-о 4Р7 антитело может содержать тяжелую цепь, которая включает 3 гипервариабельных участка тяжелой цепи (CDR - CDR1, SEQ ID
NO: 8, CDR2, SEQ ID NO: 9 и CDR3, SEQ ID NO: 10) мышиного Act-1 антитела и пригодные каркасные участки человеческой тяжелой цепи; а также содержит легкую цепь, которая включает 3 CDR легкой цепи (CDR1, SEQ ID NO: 11, CDR2, SEQ ID NO: 12 и CDR3, SEQ ID NO: 13) мышиного Act-1 антитела и пригодные каркасные участки человеческой легкой цепи. Гуманизированное Act-1 антитело может содержать любые пригодные человеческие каркасные участки, включая консенсусные каркасные участки, с аминокислотными замещениями или без них. Например, одна или несколько каркасных аминокислот может быть заменена на другую аминокислоту, такую как аминокислота в соответствующем положении мышиного Act-1 антитела. Человеческая константная область или ее часть, в случае присутствия, может быть выделена из к- или А-легких цепей и/или из у- (например, у1, у2, у3, у4), о- (например, <о1, <о2), 8-или е-тяжелых цепей человеческих антител, включая аллельные варианты. Конкретный вариант константной области или ее частей (например, IgG1), может быть выбран с целью регулирования эффектор-ной функции. Например, мутированная константная область (вариант) может быть включена в слитый белок для минимизации связывания с Fc-рецепторами и/или способности фиксировать комплемент (см., напр., Winter et al., GB 2209757 В; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, Dec. 22, 1994). Гуманизированные варианты Act-1 антитела были описаны в публикациях РСТ №№ WO 98/06248 и WO 07/61679, содержание которых настоящим целиком включено в данное описание в качестве ссылки.
В другом аспекте анти-о 4Р7 гуманизированные антитела для использования в композиции содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты 20-140 SEQ ID NO: 2 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или аминокислоты 21132 SEQ ID NO: 5. При необходимости, может присутствовать пригодная человеческая константная область (области). Например, гуманизированное анти-о 4Р7 антитело может включать тяжелую цепь, содержащую аминокислоты 20-470 SEQ ID NO: 2 и легкую цепь, содержащую аминокислоты 21-239 SEQ ID NO: 5. В другом примере гуманизированное анти-о4Р7 антитело может включать тяжелую цепь, содержащую аминокислоты 20-470 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую аминокислоты 20-238 SEQ ID NO: 4. Фиг. 4 изображает выравнивание, сравнивающее типичные легкие цепи человеческих антител с мышиными антителами. Выравнивание показывает, что гуманизированная легкая цепь ведолизумаба (например, Chemical Abstract Service (CAS, American Chemical Society) № регистрации 943609-66-3), с двумя мышиными остатками, замененными на человеческие остатки, является более человеческой, чем легкая цепь LDP-02 (фиг. 3). Кроме того, LDP-02 содержит слабо гидрофобный, гибкий аланин 114 и гидрофильный сайт (аспартат 115), которые заменены в ведолизумабе на слабо гидрофильный гидро-ксил-содержащий треонин 114 и гидрофобный, потенциально направленный вовнутрь остаток валина
115.
Дополнительные замещения в последовательности антитела могут быть, например, мутациями каркасных участков тяжелой и легкой цепей, такими как мутация изолейцина на валин в положении остатка 2 SEQ ID NO: 14; мутация метионина на валин в положении остатка 4 SEQ ID NO: 14; мутация аланина на глицин в положении остатка 24 SEQ ID NO: 15; мутация аргинина на лизин в положении остатка 38 SEQ ID NO: 15; мутация аланина на аргинин в положении остатка 40 SEQ ID NO: 15; мутация метионина на изолейцин в положении остатка 48 SEQ ID NO: 15; мутация изолейцина на лейцин в положении остатка 69 SEQ ID NO: 15; мутация аргинина на валин в положении остатка 71 SEQ ID NO: 15; мутация треонина на изолейцин в положении остатка 73 SEQ ID NO: 15; или любую их комбинацию; и замещение CDR тяжелой цепи на CDR (CDR1, SEQ ID NO: 8, CDR2, SEQ ID NO: 9 и CDR3, SEQ ID NO: 10) мышиного Act-1 антитела; и замещение CDR легкой цепи на CDR легкой цепи (CDR1, SEQ ID NO: 11, CDR2, SEQ ID NO: 12 и CDR3, SEQ ID NO: 13) мышиного Act-1 антитела.
В некоторых вариантах исполнения анти-о 4Р7 гуманизированные антитела для использования в композиции содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую примерно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотами 20-140 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, имеющую примерно 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности с аминокислотами 20-131 SEQ ID NO: 4 или аминокислотами 21-132 SEQ ID NO: 5. Идентичность аминокислотной последовательности может быть определена с использованием пригодного алгоритм выравнивания последовательностей, такого как система Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), с использованием параметров по умолчанию. В варианте исполнения, анти-о 4Р7 антитело для использования в композиции представляет собой ведолизумаб (CAS, American Chemical Society, № регистрации 94360966-3).
Другие о 4Р7 антитела также могут быть использованы в композициях и режимах дозирования, описанных в настоящем изобретении. Например, о 4Р7 антитела, описанные в US 2010/0254975 (Amgen, Inc.), целиком включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки, являются пригодными для использования в композициях и способах лечения воспалительной болезни кишечника у людей.
Анти-о 4Р7 антитело может быть получено путем экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих каждую цепь в живых клетках, например, клетках в культуре. Различные системы хозяин-экспрессионный вектор могут быть использованы для экспрессии молекул антител по изобрете
нию. Такие системы экспрессии в хозяине предусматривают носители, с помощью которых кодирующие последовательности, представляющие интерес, могут быть получены, а затем очищены, но также предусматривают клетки, которые могут, при трансформации или трансфекции пригодными кодирующими нуклеотидными последовательностями, экспрессировать анти-о 4Р7 антитело in situ. Они включают, без ограничений, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, экспрессионными векторами плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие последовательности антитела; дрожжи (например, Saccharomyces, Pich-ia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными векторами, содержащими кодирующие последовательности антитела; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинант-ными вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирусными), содержащими кодирующие последовательности антитела; системы растительных клеток, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV), или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессионными векторами (например, Ti-плазмиды), содержащими кодирующие последовательности антитела; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, СНО, BHK, 293, 3Т3, NS0), содержащие рекомби-нантные экспрессионные конструкты, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, аденовирусный поздний промотор; промотор вирус коровьей оспы 7,5K). Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, таким как промоторный элемент главного предраннего гена человеческого цитомегаловируса, являются эффективной системой экспрессии антител (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
В бактериальных системах, ряд экспрессионных векторов может быть предпочтительно выбран в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемой молекулы антитела. Например, если нужно продуцировать большое количество такого белка для получения фармацевтических композиций молекулы антитела, могут быть желательными векторы, направляющие экспрессию высоких уровней продуктов слитых белков, которые могут быть легко очищены. Такие векторы включают, без ограничений, экспрессионный вектор Е. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), в котором кодирующая последовательность антитела может быть лигирована индивидуально в вектор в рамке с кодирующей областью lac Z для получения слитого белка; векторы pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:31013109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); и т.п. Векторы pGEX также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST). В общем, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матрицей глутатион-агарозных бусин с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX конструируют таким образом, чтобы они включали сайты расщепления протеазы тромбина или фактора Ха, чтобы клонированный целевой генный продукт мог быть отделен от GST-фрагмента.
В системах насекомых, вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность антитела может быть клонирована индивидуально в несущественные области (например, ген полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, полиэд-ринового промотора).
В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использован ряд экспрессионных систем на основе вирусов. В тех случаях, когда в качестве экспрессионного вектора используется аденовирус, кодирующая последовательность антитела, представляющая интерес, может быть лигирована с аденовирусным комплексом контроля транскрипции/трансляции, например, поздним промотором и трехкомпонентной ли-дерной последовательностью. Этот химерный ген может быть затем вставлен в геном аденовируса путем in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или E3) будет давать рекомбинантный вирус, который является жизнеспособным и способен экспрессировать молекулу антитела в инфицированных хозяевах (например, см. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Специфические инициирующие сигналы также могут быть необходимы для эффективной трансляции вставленных кодирующих последовательностей антитела. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG и прилегающие к нему последовательности. Кроме того, инициирующий кодон должен быть согласован с рамкой считывания желательной кодирующей последовательности для обеспечения трансляции полной вставки. Такие экзогенные сигналы контроля трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть усилена путем включения пригодных энхансерных элементов транскрипции, терминаторов транскрипции и т.д. (см. Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-
544(1987)).
Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию вставленной последовательности или модифицирует и процессирует генный продукт конкретным желательным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функционирования белка. Разные клетки-хозяева имеют харак
терные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Пригодные клеточные линии или системы хозяев могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессированного чужеродного белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточными механизмами для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают, без ограничений, клетки яичника китайского хомячка (СНО),
NSO, HeLa, VERY, почки новорожденного хомяка (BHK), почки обезьяны (COS), MDCK, 293, 3T3,
WI38, человеческой почечноклеточной карциномы (например, Hep G2), клеточные линии рака молочной железы, такие как, например, ВТ483, Hs578T, HTB2, ВТ20 и T47D, и клеточная линия нормальной молочной железы, такая как, например, CRL7030 и Hs578Bst.
Механизмы гликозилирования разных типов клеток могут продуцировать антитела с составами гликозилирования, отличными от других типов клеток, или без гликозилирования, как в случае бактериальных клеток. В одном аспекте типами клеток, пригодными для продуцирования анти-о 4Р7 антител, являются клетки млекопитающих, такие как NS0 или клетки СНО. В одном аспекте, клетки млекопитающих могут включать делецию фермента, участвующего в клеточном метаболизме, и экзогенный ген, представляющий интерес, может быть функционально связан с замещающим ферментом, например, в конструкте или векторе для введения в клетки, например, путем трансформации или трансфекции. Конструкт или вектор с экзогенным геном создает для клеток-хозяев конструкта или вектора селекционное преимущество, способствующее продуцированию полипептида, кодируемрнр экзогенным геном. В одном варианте исполнения, клетки СНО представляют собой клетки DG44 (Chasin and Urlaub (1980) PNAS USA 77: 4216), включающие делецию или инактивацию гена дигидрофолатредуктазы. В другом варианте исполнения, клетки СНО представляют собой клетки CHO K1, включающие делецию или инактивацию гена глутаминсинтазы (см., например, патенты США №№ 5122464 или 5827739).
Твердые композиции
Твердые композиции по изобретению обычно получают высушиванием жидкой композиции. Может быть использован любой пригодный способ высушивания, такой как лиофилизация или распылительная сушка. В одном аспекте, лиопротектант прибавляют к композиции перед лиофилизацией. Лио-филизация предусматривает замораживание жидкой композиции, обычно в контейнере, который будет использоваться для хранения, транспортировки и распространения композиции (например, флакон, шприц (например, одно- или двухкамерный шприц) или картридж (например, одно- или двухкамерный картридж) (см., например, Gatlin and Nail в Protein Purification Process Engineering, ed. Roger G. Harrison, Marcel Dekker Inc., 317-367 (1994)). После замораживания композиции, атмосферное давление снижают и температуру регулируют таким образом, чтобы обеспечить удаление замороженного растворителя, например, путем сублимации. Эта стадия процесса лиофилизация иногда называется первичным высушиванием. При необходимости, температура может быть затем поднята для удаления какого-либо растворителя, остающегося связанным с сухой композицией, путем испарения. Эта стадия процесса лиофили-зации иногда называется вторичным высушиванием. В тех случаях, когда композиция достигла желательной степени сухости, процесс высушивания завершается и контейнеры герметизуют. Готовую твердую композицию иногда называют "лиофилизированной композицией" или "сухарем" (cake). Процесс лиофилизации может быть проведен с использованием любого пригодного оборудования. Пригодное оборудование для лиофилизации является доступным из ряда коммерческих источников (например, SP
Scientific, Stone Ridge, NY).
Различные пригодны аппараты могут быть использованы для высушивания жидких композиций для получения твердой (например, лиофилизированной) композиции. Обычно, квалифицированные специалисты в данной области техники получают лиофилизированные композиции путем использования герметичной камеры, имеющей полки, на которых размещают флаконы с жидкой композицией для высушивания. Температура полок, а также скорость охлаждения и нагревания, могут контролироваться, так же как и давление внутри камеры. Следует понимать, что различные параметры процесса, описанные в настоящем изобретении, относятся к процессам, осуществляемым с использованием этого типа аппаратов. Рядовые специалисты при необходимости могут легко адаптировать параметры, описанные в настоящем изобретении, к другим типам аппаратов для высушивания.
Пригодные температуры и величина вакуума для первичного и вторичного высушивания могут быть легко определены рядовым специалистом. В общем, композицию замораживают при температуре примерно -30°C или ниже, такой как -40 или -50°C. Скорость охлаждения может влиять на количество и размеры кристаллов льда в матрице. Первичное высушивание обычно проводят при температуре на примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40 или примерно 50°C выше температуры замораживания. В одном аспекте условия первичного высушивания могут быть установлены для поддержания анти-о 4Р7 антитела ниже температуры стеклования или температуры коллапса композиции. Выше температуры коллапса аморфная замороженная матрица можеть течь (коллапсировать), в результате чего молекулы белка могут не быть окружены жесткой твердой матрицей и молекулы белка могут не быть стабильными в коллапсированной матрице. Также, композицию может быть трудно полностью высушить в случае
коллапса. Получаемые при этом более высокие количества влаги в композиции могут приводить к более высоким скоростям деградации белка и уменьшении продолжительности времени, в течение которого лиофилизированный продукт может храниться до снижения его качества до неприемлемого уровня. В одном аспекте, температуру полок и давление в камере выбирают для поддержания температуры продукт ниже температуры коллапса при первичном высушивании. Температура стеклования замороженной композиции может быть измерена способами, известными специалистам, например, дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК). Температура коллапса может быть измерена способами, известными специалистам, например, микроскопии с вымораживанием жидкой фазы, оптической когерентной томографии. Стадия высушивания может удалять по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или больше растворителя. В одном аспекте, первичная стадия высушивания удаляет более 80% растворителя из композиции анти-о 4Р7 антитела.
Размер флакона может быть выбран на основании площади поверхности, которая будет контактировать с полкой и вакуума во время лиофилизации. Время высушивания прямо пропорционально высоте слоя, поэтому размер флакона может быть выбран на основании высоты слоя осадка, которая будет определена как разумная. Флакон с большей величиной отношения диаметра к объему может обеспечивать больший контакт с полкой для эффективной теплопередачи на протяжении цикла лиофилизации. Разбавленный раствор антитела в большом объеме жидкости потребует большего времени для высушивания. Необходимо обеспечить баланс между размером флакона и объемом композиции, потому что флаконы большего размера могут требовать больших затрат при хранении и транспортировке и имеют большее соотношение пустого пространства к композиции и могут увеличивать долю композиции, подверженную разрушительным эффектам влаги при долгосрочном хранении. Для дозы 165 мг, размер флакона композиции анти-оо4Р7 антитела может составлять 3, 5 или 10 мл. В одном аспекте размер флакона составляет 5 мл для раствора 160 мг/мл.
Принципы выбора размера картриджа или шприца для лиофилизации схожи с принципами выбора флаконов. Увеличение толщины слоя осадка будет также увеличивать время высушивания. Диаметр и размер шприца или картриджа должен быть сбалансирован с конечным объемом композиции. Большие диаметры могут увеличивать скорость поглощения влаги лиофилизированным осадком, тем самым усиливая разрушительные эффекты влаги при хранении. Для дозы 165 мг, объем композиции анти-о 4Р7 антитела может быть равен 1 или 2 мл. В одном аспекте размер шприца или картриджа имеет значение более 1 мл для раствора 160 мг/мл.
После лиофилизации флакон, шприц или картридж могут быть герметизированы, например закрыты пробкой, под вакуумом. Альтернативно, газ, например, сухой воздух или азот, может быть впущен в контейнер перед герметизацией. В тех случаях, когда существует проблема окисления, газ, запускаемый в камеру лиофилизации, может включать газ, который замедляет или предотвращает окисление лиофи-лизированного продукта. В одном аспекте газы представляют собой бескислородные газы, например, азот или инертный газ, например гелий, неон, аргон, криптон или ксенон. В другом аспекте газ представляет собой азот или аргон.
Лечение композицией антитела
В одном аспекте изобретение предусматривает способ лечения болезни или расстройства у субъекта, включающий введение субъекту композиции анти-о 4Р7 антитела, описанной в настоящем изобретении, в количестве, эффективном для лечения болезни или расстройства, например, у людей. Человек может быть взрослым (например, 18 лет или старше), подростком или ребенком. Человек может быть особой в возрасте 65 лет или старше. В отличие от альтернативных терапевтических режимов дозирования, человек в возрасте 65 лет или старше не требует какой-либо модификации режима дозирования, описанного в настоящем изобретении, и ему может быть введена обычная композиция анти-о 4Р7 антитела, описанная в настоящем изобретении.
Субъект может демонстрировать отсутствие адекватного ответа, потерю ответа или непереносимость лечения иммуномодулятором, антагонистом TNF-оо или их комбинациями. Пациент может ранее получать лечение воспалительной болезни кишечника по меньшей мере одним кортикостероидом (например, преднизоном). Неадекватный ответ на кортикостероиды относится к признакам и симптомам персистентно активной формы болезни вопреки анамнезу по меньшей мере одной 4-недельной схемы индукции, которая включает эквивалент дозы преднизона 30 мг в день перорально в течение 2 недель или внутривенно в течение 1 недели. Потеря ответа на кортикостероиды относится к двум неудачным попыткам снизить кортикостероиды до уровня ниже соответствующего эквиваленту дозы преднизона 10 мг в день перорально. Непереносимость кортикостероидов включает анамнез синдрома Кушинга, омтео-пении/омтеопороза, гипергликемии, бессонницы и/или инфекции.
Иммуномодулятор может быть, например, азатиоприном перорально, 6-меркаптопурином или ме-тотрексатом. Неадекватный ответ на иммуномодулятор относится к признакам и симптомам персистент-но активной болезни вопреки анамнезу по меньшей мере одной 8-недельной схемы или азатиоприна пе-рорально (> 1,5 мг/кг), 6-меркаптопурина (> 0,75 мг/кг) или метотрексата (> 12,5 мг/неделю). Непереносимость иммуномодулятора включает, без ограничений, тошноту/рвоту, боль в животе, панкреатит, анома
лии функциональной пробы печени (LFT), лимфопению, генетическую мутацию тиопуринметилтранс-феразы (ТРМТ) и/или инфекцию.
Антагонист ФНО-оо (фактор некроза опухоли-оо), например, представляет собой агент, который ин-гибирует биологическую активность ФНО-оо и предпочтительно связывает ФНО-оо, такой как монокло-нальное антитело, например, Ремикейд (инфликсимаб), ХУМИРА (адалимумаб), Симзия (цертолизумаб пегол), Симпони (голимумаб) или циркулирующий рецепторный слитый белок, такой как Энбрел (эта-нерцепт). Неадекватный ответ на антагонист ФНО-о относится к признакам и симптомам персистентно активной формы болезни вопреки анамнезу по меньшей мере одной 4-недельной схемы индукции ин-фликсимаблм 5 мг/кг внутривенно (IV), 2 дозы с промежутком по меньшей мере 2 недели; одна 80 мг подкожная доза адалимумаба, с последующей одной 40 мг дозой с промежутком по меньшей мере в две недели; или 400 мг подкожно цертолизумаба пегола, 2 дозы с промежутком в по меньшей мере 2 недели. Потеря ответа на антагонист ФНО-о относится к рецидиву симптомов на стадии поддерживающего дозирования после ранее достигнутого клинического эффекта. Непереносимость антагониста ФНО-о включает, без ограничений, реакции, ассоциированные с инфузией, демиелинизацию, застойную сердечную недостаточность и/или инфекцию.
Потеря поддержания ремиссии в используемом тут значении для субъектов с неспецифическим язвенным колитом, относится к увеличению оценки по шкале Мейо на по меньшей мере 3 балла и оценке по модифицированной шкале Baron, равной по меньшей мере 2.
В другом аспекте, настоящее изобретение предусматривает композиции анти-о 4Р7 антител, которые (1) могут связывать интегрин о 4Р7 in vitro и/или in vivo; и (2) могут модулировать активность или функцию интегрина о 4Р7, такую как (а) функция связывания (например, способность интегрина о 4Р7 связываться с MAdCAM (например, MAdCAM-1), фибронектином и/или VCAM-1) и/или (b) функция инфильтрации лейкоцитов, включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях (например, способность ингибировать миграцию лейкоцитов к кишечной мукозальной ткани). В одном варианте исполнения антитело в композиции может связывать интегрин о 4Р7 и может ингибировать связывание интег-рина о 4Р7 с одним или несколькими из его лигандов (например, MAdCAM (например, MAdCAM-1), VCAM-1, фибронектин), тем самым ингибируя инфильтрацию тканей лейкоцитами (включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях). В другом варианте исполнения антитело в композиции может связывать интегрин о 4Р7 и может селективно ингибировать связывание интегрина о 4Р7 с одним или несколькими из его лигандов (например, MAdCAM (например, MAdCAM-1), VCAM-1, фибронектин), тем самым ингибируя инфильтрацию тканей лейкоцитами (включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях). Такие композиции анти-о 4Р7 антител могут ингибировать клеточную адгезию клеток, несущих интегрин о 4Р7, с клетками сосудистого эндотелия в мукозальных тканях, включая кишечник-ассоциированные ткани, лимфоидные органы или лейкоциты (особенно лимфоциты, такие как Т- или В-клетки) in vitro и/или in vivo. В еще одном варианте исполнения композиция анти-о 4Р7 антитела по настоящему изобретению может ингибировать взаимодействие о 4Р7 с MAdCAM (например, MAdCAM-1) и/или фибронектином. В еще одном варианте исполнения композиция анти-о 4Р7 антитела по настоящему изобретению может селективно ингибировать взаимодействие о 4Р7 с MAdCAM (например, MAd-CAM-1) и/или фибронектином, например, без ингибирования взаимодействия о 4Р7 с VCAM.
Композиции анти-о 4Р7 антител по настоящему изобретению могут быть использованы для модулирования (например, ингибирования (уменьшения или предотвращения)) функции связывания и/или функции инфильтрации лейкоцитов (например, лимфоцитов, моноцитов) интегрина о 4Р7. Например, гуманизированные иммуноглобулины, ингибирующие связывание интегрина оо4Р7 с лигандом (т.е., одним или несколькими лигандами), могут вводиться в соответствии со способом лечения заболеваний, ассоциированных с инфильтрацией лейкоцитов (например, лимфоцитов, моноцитов) в ткани (включая рекрутмент и/или накопление лейкоцитов в тканях), в частности, в ткани, экспрессирующие молекулу
MAdCAM (например, MAdCAM-1).
Эффективное количество композиции анти-оо4Р7 антитела по настоящему изобретению (т.е., одного или нескольких) вводят индивидууму (например, млекопитающему, такому как человек или другой примат) с целью лечения такой болезни. Например, воспалительные болезни, включая болезни, ассоциированные с инфильтрацией лейкоцитами желудочно-кишечного тракта (включая кишечник-ассоциированный эндотелий), другие мукозальные ткани или ткани, экспрессирующие молекулу MAd-CAM (например, MAdCAM-1) (например, кишечник-ассоциированные ткани, такие как венулы собственной пластинки тонкой и толстой кишки; и молочной железы (например, молочной железы в период лактации)), можно лечить в соответствии со способом по настоящему изобретению. Аналогично, индивидуум, имеющий болезнь, ассоциированную с инфильтрацией лейкоцитов в ткани в результате связывания лейкоцитов с клетками (например, эндотелиальными клетками), экспрессирующими MAdCAM (например, MAdCAM-1), может получать лечение в соответствии с настоящим изобретением.
В одном варианте исполнения болезни, которые можно лечить, соответственно включают воспалительную болезнь кишечника (IBD), такую как неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, илеит,
глютеновую болезнь, нетропическую спру, энтеропатию, ассоциированную с серонегативными артропа-тиями, микроскопический или коллагеновый колит, эозинофильный гастроэнтерит или резервуарный илеит, возникающий после проктоколэктомии и илеоанального анастомоза. В некоторых вариантах исполнения воспалительная болезнь кишечника представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. Неспецифический язвенный колит может быть от умеренной до тяжелой активной формы неспецифического язвенного колита. Лечение может приводить к заживлению слизистой у пациентов, страдающих от умеренной до тяжелой активной формы неспецифического язвенного колита. Лечение может также приводить к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероида пациентом.
Другими болезнями, которые можно лечить с использованием композиции по изобретению, являются панкреатит и инсулинзависимый сахарный диабет. Сообщалось, что MAdCAM (например, MAd-CAM-1) экспрессируется некоторыми сосудами в экзокринной поджелудочной железе NOD (не страдающих ожирением диабетических) мышей, а также from BALB/c и SJL мышей. Сообщалось, что экспрессия MAdCAM (например, MAdCAM-1) индуцируется на эндотелии воспаленных островков поджелудочной железы NOD-мыши и MAdCAM (например, MAdCAM-1) был преимущественным адрессином, экспрессируемым эндотелием островков NOD на ранних стадиях инсулита (Hanninen A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)). Лечение NOD-мышей с использованием анти-MAdCAM или анти-Р7 антител предотвращало развитие диабета (Yang et al., Diabetes, 46:1542-1547 (1997)). Кроме того, наблюдалось накопление лимфоцитов, экспрессирующих о 4Р7 в островках, и MAdCAM-1 был задействован в связывании клеток лимфомы через о 4Р7 с сосудами воспаленных островков (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)) или с желудочно-кишечным трактом в лимфоме из клеток мантии (Geiss-mann et al., Am. J. Pathol., 153:1701-1705 (1998)).
Примеры воспалительных болезней, ассоциированных с мукозальными тканями, которые можно лечить с использованием композиции по изобретению, включают холецистит, холангит (Adams and Ek-steen Nature Reviews 6:244-251 (2006) Grant et al., Hepatology 33:1065-1072 (2001)), например, первичный склерозирующий холангит, болезнь Бехчета, например, кишечника или перихолангит (желчный проток и окружающая ткань печени) и болезнь "трансплантат против хозяина" (например, в желудочно-кишечном тракте (например, после трансплантации костного мозга) (Petrovic et al. Blood 103: 1542-1547 (2004)). Как видно при болезни Крона, воспаление часто выходит за пределы мукозальной поверхности, соответственно, восприимчивыми к лечению могут быть хронические воспалительные болезни, такие как саркои-доз, хронический гастрит, например аутоиммунный гастрит (Katakai et al., Int. Immunol., 14:167-175 (2002)) и другие идиопатические состояния.
Изобретение также относится к способу ингибирования инфильтрации лейкоцитами мукозальной ткани. Изобретение также относится к способу лечения рака (например, о 4Р7-положительная опухоль, такая как лимфома). Другие примеры воспалительных болезней, ассоциированных с мукозальными тканями, которые можно лечить с использованием композиции по изобретению, включают мастит (молочной железы) и синдром раздраженного кишечника.
Болезни или патогены, этиологии которых задействуют взаимодействие MAdCAM (например, MAdCAM-1) с о 4Р7, можно лечить анти-о 4Р7 антителом в композициях, описанных в настоящем изобретении. Примеры таких болезней включают иммунодефицитные расстройства, такие как вызванные вирус иммунодефицита человека (см., например, WO 2008140602).
Композицию по изобретению вводят в эффективном количестве, ингибирующим связывание интег-рина о 4Р7 с его лигандом. Для терапии, эффективное количество будет достаточным для достижения желательного терапевтического (включая профилактический) эффекта (таким как количество, достаточное для уменьшения или предотвращения интегрин о 4Р7-медиируемого связывания и/или передачи сигналов, тем самым ингибируя адгезию и инфильтрацию лейкоцитов и/или ассоциированные клеточные ответы). Эффективное количество анти-о 4Р7 антитела, например эффективный титр, достаточный для поддержания насыщения, например нейтрализации, интегрина о 4Р7, может индуцировать клинический ответ или ремиссию воспалительной болезни кишечника. Эффективное количество анти-о 4Р7 антитела может приводить к заживлению слизистой при неспецифическом язвенном колите или болезни Крона. Композиция по изобретению может быть введена в виде разовой дозы или кратных доз. Дозировка может быть определена способами, известными специалистам, и может зависеть, например, от возраста индивидуума, восприимчивости, толерантности и общего самочувствия. Примеры схем введения включают местные пути, такие как назальное или ингаляционное или трансдермальное введение, энтеральные пути, такие как через питательную трубку или суппозиторий, и парентеральные пути, такие как внутривенное, внутримышечное, подкожное, интраартериальное, интраперитонеальное или интравитреальное введение. Пригодные дозы антитела могут составлять от примерно 0,1 до примерно 10,0 мг/кг веса тела за одно введение, например от примерно 2 до примерно 7 мг/кг, от примерно 3 до примерно 6 мг/кг или от примерно 3,5 до примерно 5 мг/кг. В конкретных вариантах исполнения вводимая доза составляет примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9 или примерно 10 мг/кг. Общая доза может составлять примерно 22,
примерно 50, примерно 72, примерно 125, примерно 165 или примерно 432 мг. Общая доза может составлять по меньшей мере 77, по меньшей мере 125 или по меньшей мере 356 мг. В одном варианте исполнения общая доза составляет 165 мг. В другом варианте исполнения общая доза равна 108 мг. В другом варианте исполнения общая доза равна 216 мг.
Моделирование и симуляции (программа BERKELEY MADONNA(tm), University of California) с использованием фармакокинетических (PK) данных исследований доступности анти-о 4Р7 антитела в зависимости от времени после введения позволяют оценить потенциальный режим дозирования для подкожного или внутримышечного введения. PK-данные могут оцениваться для режимов индукции и поддержания. Другим подходом в моделировании является популяционный фармакокинетиче-ский/фармакодинамический анализ (NONMEM(r), инструмент для моделирования нелинейных смешанных эффектов, ICON plc, Dublin, Ireland). Могут быть проанализированы как уровни экспозиции, так и остаточные уровни.
Типично, после достижения насыщения мишени, например, интегрина оо4Р7, концентрация антитела в крови демонстрирует линейную зависимость от введенной дозы. Анти-о 4Р7 антитело, введенное подкожным или внутримышечным путем, имеет биодоступность анти-о 4Р7 антитела, составляющую от примерно 60% до примерно 90% от введения внутривенным путем. В качестве примера такого соотношения, если принять биодоступность внутривенной (IV) дозы за 100%, а биодоступность подкожной дозы будет определена равной 69,5%, то внутривенная доза 300 мг может соответствовать подкожному введению дозы 432 мг. Соответственно внутривенная доза 150 мг при относительной биодоступности 69,5% может соответствовать подкожной дозе 216 мг. Аналогично, если было определено, что подкожная доза имеет доступность 75%, и определено, что внутримышечная доза имеет биодоступность 80%, то внутривенной дозе 300 мг могут соответствовать подкожная доза 400 мг и внутримышечная доза 375 мг. Табл. 40-43 в примерах иллюстрируют эти соотношения и содержат пригодные дозы и режимы дозирования анти-о 4Р7 антитела.
В некоторых аспектах режим дозирования имеет две фазы, индукционную фазу и поддерживающую фазу. В индукционной фазе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят способом, быстро обеспечивающим эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, пригодное для определенных целей, таких как индуцирование иммунной толерантности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту или для индуцирования клинического ответа и облегчения симптомов воспалительной болезни кишечника. Пациенту может быть проведена индукционная фаза лечения при его начальном лечении анти-о 4Р7 антителом при лечении после длительного перерыва в терапии, например более трех месяцев, более четырех месяцев, более шести месяцев, более девяти месяцев, более одного года, более восемнадцати месяцев или более двух лет после терапии анти-о 4Р7 антителом, или во время поддерживающей фазы терапии анти-о 4Р7 антителом, если наблюдается возврат симптомов воспалительной болезни кишечника, например рецидив из ремиссии болезни. В некоторых вариантах исполнения режим индукционной фазы приводит к более высокому значению средней минимальной остаточной концентрации, например, концентрации непосредственно перед введением следующей дозы, чем средняя минимальная остаточная концентрация в состоянии равновесия в сыворотке, поддерживаемая на протяжении поддеживающего режима.
В поддерживающей фазе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят способом, обеспечивающим продолжение ответа, достигнутого при индукционной терапии, со стабильным уровнем антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Поддерживающий режим может предотвращать возврат симптомов или рецидив воспалительной болезни кишечника. Поддерживающий режим может обеспечивать удобство для пациента, например, представлять собой простой режим дозирования или требовать нечастых поездок для лечения. В некоторых вариантах исполнения поддерживающий режим может включать введение анти-о 4Р7 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, в композиции, описанной в настоящем изобретении, в соответствии со стратегией, выбранной из группы, состоящей из низких доз, нечастого введения, самовведения и комбинации любых вышеперечисленных элементов.
В одном варианте исполнения, например, во время индукционной фазы терапии, режим дозирования предусматривает эффективное количество анти-о 4Р7 антитела или антигенсвязывающего фрагмента в композиции, описанной в настоящем изобретении, для индуцирования ремиссии воспалительной болезни кишечника у пациента. В некоторых вариантах исполнения, эффективное количество анти-о 4Р7 антитела является достаточным для достижения средней минимальной остаточной концентрации анти-о 4Р7 антитела от примерно 5 до примерно 60 мкг/мл, от примерно 15 до примерно 45 мкг/мл, от примерно 20 до примерно 30 мкг/мл, или от примерно 25 до примерно 35 мкг/мл к концу индукционной фазы. Продолжительность индукционной фазы может составлять примерно четыре недели, примерно пять недель, примерно шесть недель, примерно семь недель или примерно восемь недель лечения. В некоторых вариантах исполнения схема индукции может использовать стратегию, выбранную из группы, состоящей из высокой дозы, частого введения и комбинации высокой дозы и частого введения анти-о 4Р7 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, в композиции, описанной в настоящем изобретении.
Индукционная доза может быть введена один раз или множество раз, составляющее несколько доз, например, по меньшей мере две дозы. На протяжении индукционной фазы, доза может вводиться раз в день, через день, два раза в неделю, раз в неделю, раз в десять дней, раз в две недели или раз в три недели. В некоторых вариантах исполнения, индукционная доза вводится в первые две недели терапии анти-о 4Р7 антителом. В одном варианте исполнения, индукционная доза может быть введена один раз при начале лечения (день 0) и один раз примерно через две недели после начала лечения. В другом варианте исполнения, продолжительность индукционной фазы составляет шесть недель. В другом варианте исполнения продолжительность индукционной фазы составляет шесть недель, и множество индукционных доз вводится в течение первых двух недель.
В некоторых вариантах исполнения, например, при начале лечения пациента с тяжелой воспалительной болезнью кишечника (например, пациентов с неудачной анти-ФНОо терапией), индукционная фаза должна иметь большую продолжительность, чем у пациентов со слабой или умеренной формой болезни. В некоторых вариантах исполнения, индукционная фаза для пациента с тяжелой болезнью может иметь продолжительность, составляющую по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 12 недель или по меньшей мере 14 недель. В одном варианте исполнения, индукционный режим дозирования для пациента с тяжелой болезнью может включать дозу в неделю 0 (начало лечения), дозу в неделю 2 и дозу в неделю 6. В другом варианте исполнения, индукционный режим дозирования для пациента с тяжелой болезнью может включать дозу в неделю 0 (начало лечения), дозу в неделю 2, дозу в неделю 6 и дозу в неделю 10.
В одном варианте исполнения, например, на протяжении поддерживающей фазы терапии режим дозирования поддерживает среднюю минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия в сыворотке, например, концентрацию плато непосредственно перед введением следующей дозы, от примерно 5 до примерно 25 мкг/мл, от примерно 7 до примерно 20 мкг/мл, от примерно 5 до примерно 10 мкг/мл, от примерно 10 до примерно 20 мкг/мл, от примерно 15 до примерно 25 мкг/мл или от примерно 9 до примерно 13 мкг/мл анти-о 4Р7 антитела. В другом варианте исполнения режим дозирования например, на протяжении поддерживающей фазы терапии, поддерживает среднюю минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия в сыворотке от примерно 20 до примерно 30 мкг/мл, от примерно 20 до примерно 55 мкг/мл, от примерно 30 до примерно 45 мкг/мл, от примерно 45 до примерно 55 мкг/мл или от примерно 35 до примерно 40 мкг/мл анти-оо4Р7 антитела. В другом варианте исполнения режим дозирования например, на протяжении поддерживающей фазы терапии, поддерживает долгосрочную среднюю концентрацию в сыворотке, например, экспозицию (например, площадь под кривой концентрация-время), равную от примерно 15 до примерно 40 мкг/мл, от примерно 10 до примерно 50 мкг/мл, от примерно 18 до примерно 26 мкг/мл или от примерно 22 до примерно 33 мкг/мл анти-оо4Р7 антитела. В еще одном варианте исполнения, режим дозирования например, на протяжении поддерживающей терапии, поддерживает долгосрочную среднюю концентрация в сыворотке, например, экспозицию (например, площадь под кривой концентрация-время) от примерно 35 до примерно 90 мкг/мл, от примерно 45 до примерно 75 мкг/мл, от примерно 52 до примерно 60 мкг/мл или от примерно 50 до примерно 65 мкг/мл анти-о 4Р7 антитела.
Готовая лекарственная форма может содержать полную дозу в примерно 0,5 мл, в примерно 1 мл, в примерно 1,5 мл в примерно 2 мл, в примерно 2,5 мл, в примерно 3 мл композиции антитела.
Готовая лекарственная форма для внутривенного введения может иметь концентрацию от примерно 1,0 до примерно 1,4 мг/мл, от примерно 1,0 до примерно 1,3 мг/мл, от примерно 1,0 до примерно 1,2 мг/мл, от примерно 1,0 до примерно 1,1 мг/мл, от примерно 1,1 до примерно 1,4 мг/мл, от примерно 1,1 до примерно 1,3 мг/мл, от примерно 1,1 до примерно 1,2 мг/мл, от примерно 1,2 до примерно 1,4 мг/мл, от примерно 1,2 до примерно 1,3 мг/мл или от примерно 1,3 до примерно 1,4 мг/мл. Готовая лекарственная форма может иметь концентрацию, равную примерно 0,6, 0,8, 1,0, 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,8 или примерно 2,0 мг/мл.
Доза может быть введена раз в неделю, раз в 2 недели, раз в 3 недели, раз в 4 недель, раз в 6 недель, раз в 8 недель или раз в 10 недель. Более высокая или более частое введение дозы, например, через день, раз в неделю, раз в 2 недели, раз в 3 недели или раз в 4 недели, может быть полезным для индуцирования ремиссии активной формы болезни или для лечения нового пациента, например, для индуцирования толерантности к анти-о 4Р7 антителу. Доза раз в 2 недели, раз в 3 недели, раз в 4 недели, раз в 5 недель, раз в 6 недель, раз в 8 недель или раз в 10 недель может быть полезной для профилактической терапии, например, для поддержания ремиссии у пациента с хронической болезнью. В одном аспекте схема лечения предусматривает проведение лечения в день 0, примерно в неделю 2, примерно в неделю 6 и через каждые 1 или 2 недели после этого. В другом аспекте, схема индукционного лечения предусматривает проведение сеансов лечения через день до в общей сложности 6 сеансов лечения.
Режим дозирования может быть оптимизирован для индукции клинического ответа и клинической ремиссии воспалительной болезни кишечника у пациента. В некоторых вариантах исполнения режим дозирования не изменяет соотношение CD4 к CD8 в спинномозговой жидкости пациентов, получающих лечение.
В некоторых аспектах стойкая клиническая ремиссия, например клиническая ремиссия, которая сохраняется на протяжении по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех посещений лечащего врача на протяжении периода времени шесть месяцев или один год после начала лечения, может быть достигнута при оптимизированном режиме дозирования.
В некоторых аспектах стойкий клинический ответ, например клинический ответ, сохраняющийся на протяжении по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере года после начала лечения, может быть достигнут при оптимизированном режиме дозирования.
Композиция может быть введена подкожно разовой или кратными инъекциями. Например, объем разовой инъекции может меняться в пределах от примерно 0,5 до примерно 3 мл. В варианте исполнения объем разовой инъекции может составлять от примерно 0,6 до примерно 1,1 мл или от примерно 1 до примерно 3 мл. В одном аспекте, объем разовой инъекции составляет примерно 1 мл. Калибр иглы, используемой для введения композиции подкожно, может быть равен примерно 25, примерно 26, примерно 27, примерно 28, примерно 29 или примерно 30G.
Композиция может быть введена внутримышечно разовой или кратными инъекциями. Например, объем разовой инъекции может меняться в пределах от примерно 0,5 до примерно 5 мл. В варианте исполнения объем разовой инъекции может составлять от примерно 2 до примерно 5 мл, от примерно 0,6 до примерно 1,1 мл или от примерно 1 до примерно 3 мл. В одном аспекте объем разовой инъекции составляет примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5 мл. Для введения композиции внутримышечно может быть использована игла калибром примерно 5/8", примерно 7/8", примерно 1", примерно 1,25", примерно 1,5", примерно 2" или примерно 3". Калибр иглы для внутримышечного введения может находиться в пределах 20-22G.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительной болезни кишечника, где способ включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином о 4Р7, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (а) начальные дозы 165 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем подкожной инъекции через день в количестве шести доз; (b) с последующей седьмой и последующими дозами по 165 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем подкожной инъекции раз в две недели или раз в четыре недели, по необходимости; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом о 4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO:8, CDR2 SEQ ID NO:9, CDR3 SEQ ID NO:10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO:11, CDR2 SEQ ID NO:12, CDR3 SEQ ID NO:13.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительной болезни кишечника, где способ включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином о 4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования: (а) начальная внутривенная доза 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем внутривенной инфузии; (b) затем последующая вторая внутривенная доза 300 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязы-вающего фрагмента путем внутривенной инфузии примерно через две недели после начальной дозы; (с) затем, начиная с недели шесть, третья и последующие дозы по 165 мг гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента путем подкожной инъекции раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели, по необходимости; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом о 4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте изобретение относится к режиму дозирования для терапевтического лечения воспалительной болезни кишечника, где режим дозирования включает стадию введения пациенту, стра
дающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антиген-связывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином о 4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязы-вающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии с подкожным или внутримышечным режимом дозирования, поддерживающим среднюю минимальную остаточную концентрацию в сыворотке в состоянии равновесия от примерно 9 до примерно 13 мкг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом о 4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже:
легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10;
тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте изобретение относится к режиму дозирования для терапевтического лечения воспалительной болезни кишечника, где режим дозирования включает стадию введения пациенту, страдающему от воспалительной болезни кишечника, гуманизированного иммуноглобулина или его антиген-связывающего фрагмента, обладающего специфичностью связывания с человеческим интегрином о 4Р7, где гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязы-вающую область нечеловеческого происхождения и по меньшей мере часть антитела человеческого происхождения, причем гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в соответствии с подкожным или внутримышечным режимом дозирования, поддерживающим среднюю минимальную остаточную концентрацию в сыворотке в состоянии равновесия от примерно 35 до примерно 40 мкг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента; и где дополнительно гуманизированный иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью связывания с комплексом о 4Р7, причем антигенсвязывающая область содержит три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области легкой цепи и три гипервариабельных участка (CDR1, CDR2 и CDR3) вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей, указанных ниже: легкая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID
NO: 10; тяжелая цепь: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах исполнения, способ лечения, доза или режим дозирования уменьшают вероятность развития у пациента НАНА-ответа на анти-о 4Р7 антитело. Развитие НАНА, например, измеряемое по антителам, реактивным к анти-о 4Р7 антителу, может увеличить клиренс анти-о 4Р7 антитела, например снизить концентрацию в сыворотке анти-о 4Р7 антитела, например уменьшить число анти-о 4Р7 антител, связанных с интегрином о 4Р7, тем самым снижая эффективность лечения. В некоторых вариантах исполнения для предотвращения НАНА пациента можно лечить по схеме индукции с последующим поддерживающим режимом. В некоторых вариантах исполнения между схемой индукции и поддерживающим режимом отсутствует перерыв. В некоторых вариантах исполнения схема индукции включает введение пациенту множества доз анти-о 4Р7 антитела. Для предотвращения НАНА пациента можно лечить с высокой начальной дозой, например по меньшей мере 1,5 мг/кг, по меньшей мере 2 мг/кг, по меньшей мере 2,5 мг/кг, по меньшей мере 3 мг/кг, по меньшей мере 5 мг/кг, по меньшей мере 8 мг/кг, по меньшей мере 10 мг/кг или от примерно 2 до примерно 6 мг/кг, или с частыми начальными введениями, например, примерно раз в неделю, примерно раз в две недели или примерно раз в три недели, стандартной дозы при начале терапии анти-о 4Р7 антителом. В некоторых вариантах исполнения способ лечения поддерживает по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% пациентов в НАНА-отрицательном состоянии. В других вариантах исполнения способ лечения поддерживает пациенты в НАНА-отрицательном состоянии в течение по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 15 недель, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет или на протяжении периода проведения терапии. В некоторых вариантах исполнения, пациенты или по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% пациентов, у которых развивается НАНА, сохраняют низкий титр, например <125, анти-о 4Р7 антитела. В варианте исполнения способ лечения поддерживает по меньшей мере 70% пациентов в НАНА-отрицательном состоянии в течение по меньшей мере 12 недель после начала терапии анти-о 4Р7 антителом.
Композиция может быть введена индивидууму (например, человеку) сама по себе или в сочетании с другим агентом. Композиция по изобретению может быть введена до одновременно с, или после введения дополнительного агента. В одном варианте исполнения вводят несколько композиций, ингибирую
щих связывание интегрина о 4Р7 с его лигандами. В таком вариане исполнения может быть введен агент, например моноклональное антитело, такое как анти-MAdCAM или анти-VCAM-! моноклональное антитело. В другом варианте исполнения дополнительный агент ингибирует связывание лейкоцитов с эндо-телиальным лигандом в пути, отличном от пути о 4Р7. Такой агент может ингибировать связывание, например, хемокинового (С-С мотив) рецептора 9 (CCR9)-экспрессирующих лимфоцитов экспрессирован-ным тимусом хемокином (TECK или CCL25) или агентом, который препятствует связыванию LFA-1 с молекулой межклеточной адгезии (ICAM). Например, в дополнение к композиции по настоящему изобретению вводят анти-TECK или анти-CCR9 антитело или ингибитор малой молекулы CCR9, такой как ингибиторы, раскрытые в публикациях РСТ WO 03/099773 или WO 04/046092, или анти-ICAM-! антитело или олигонуклеотид, предотвращающий экспрессию ICAM. В еще одном варианте исполнения, дополнительный активный ингредиент (например, противовоспалительное соединение, такое как сульфа-салазин, азатиоприн, 6-меркаптопурин, противовоспалительные средства, содержащие 5-аминосалициловую кислоту, другое нестероидное противовоспалительное соединение, стероидное про-тивовоспалительнон соединение или антибиотики, которые обычно вводят для борьбы с IBD (например, ципрофлоксацин, метронидазол) или другой биологический агент (например, антагонисты ФНО-альфа) может быть введен в сочетании с композицией по настоящему изобретению.
В варианте исполнения, доза совместно вводимого лекарственного препарата может снижаться со временем на протяжении периода лечения с помощью композиции, содержащей анти-о 4Р7 антитело. Например, пациент, которого лечат стероидом (например, преднизоном, преднизолоном) в начале или перед лечением композицией анти-о 4Р7 антитела, будет следовать схеме со снижением дозы стероида начиная с 6 недель лечения композицией анти-оо4Р7 антитела. Доза стероида будет уменьшена на примерно 25% на протяжении 4-8 недель после начала снижения до 50% через примерно 8-12 недель и 75% через примерно 12-16 недель уменьшения дозы во время лечения композицией анти-о 4Р7 антитела. В одном аспекте через примерно 16-24 недель лечения композицией анти-о 4Р7 антитела доза стероида может быть отменена. В другом примере, пациент, которого лечат противовоспалительным соединением, таким как 6-меркаптопурин, в начале или перед лечением композицией анти-о 4Р7 антитела, будет следовать схеме с уменьшением доз противовоспалительного соединения, аналогичной схеме уменьшения дозы стероида, описанной выше.
В одном варианте исполнения, способ включает подкожное введение или внутримышечное введение пациенту эффективного количества композиции по изобретению. В другом варианте исполнения композиция может быть подготовлена для самовведения.
Если композиция находится в твердой форме, например, в сухом состоянии, процесс введения может включать стадию превращения композиции в жидкое состояние. В одном аспекте, сухая композиция может быть восстановлена, например, жидкостью, как описано выше, для использования в инъекции, например, внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции. В другом аспекте твердая или сухая композиция может быть введена местно, например, в виде пластыря, крема, аэрозоля или суппозитория.
Изобретение также относится к способу лечения болезни, ассоциированной с инфильтрацией лейкоцитами тканей, экспрессирующих молекулу MAdCAM (например, MAdCAM-1). Способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества композиции анти-о 4Р7 антитела по изобретению. В варианте исполнения болезнь представляет собой болезнь "трансплантат против хозяина". В некоторых вариантах исполнения болезнь представляет собой болезнь, ассоциированную с инфильтрацией лейкоцитами тканей в результате связывания лейкоцитов, экспрессирующих интегрин о 4Р7, с кишечник-ассоциированным эндотелием, экспрессирующим молекулу MAdCAM (например, MAdCAM-1). В других вариантах исполнения, болезнь представляет собой гастрит (например, эозино-фильный гастрит или аутоиммунный гастрит), панкреатит или инсулинзависимый сахарный диабет. В других вариантах исполнения, болезнь представляет собой холецистит, холангит или перихолангит.
Изобретение также относится к способу лечения воспалительной болезнь кишечника у пациента. В одном варианте исполнения способ включает подкожное введение пациенту эффективного количества композиции анти-о 4Р7 антитела по изобретению. В некоторых вариантах исполнения, воспалительная болезнь кишечника представляет собой неспецифически язвенный колит или болезнь Крона. В других вариантах исполнения воспалительная болезнь кишечника представляет собой глютеновую болезнь, эн-теропатию, ассоциированную с серонегативными артропатиями, микроскопический или коллагеновый колит, гастроэнтерит (например, эозинофильный гастроэнтерит) или резервуарный илеит.
В некоторых вариантах исполнения лечение анти-о 4Р7 антителом не изменяет соотношения CD4:CD8 лимфоцитов. Соотношения CD4:CD8 могут быть измерены в крови, аспирате лимфатических узлов и спинномозговой жидкости (СМЖ). Соотношения CD4+:CD8+ лимфоцитов в СМЖ здоровых особ типично имеют значения больше или равные примерно 1 (Svenningsson et al., J. Neuroimmunol. 1995; 63: 39-46; Svenningsson et al., Ann Neurol. 1993; 34: 155-161). Иммуномодулятор может изменять соотношение CD4:CD8 до значений менее 1.
Промышленные изделия
В другом аспекте, изобретение представляет собой изделие, содержащее фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и предусматривает инструкции по его использованию. Изделие содержит контейнер. Пригодные контейнеры включают, например, бутылки, флаконы (например, двухкамерные флаконы, флакон жидкой композиции с иглой или без нее, флакон твердой композиции с флаконом жидкости для восстановления или без него и с иглой или без нее), шприцы (такие как двухкамерные шприцы, предварительно наполненные шприцы, автоинжектор), картриджи и пробирки. Контейнер может быть сформован из различных материалов, таких как стекло, металл или пластик. Контейнер содержит композицию, а ярлык на контейнере или ассоциированный с ним может содержать указания по использованию. В другом варианте исполнения композиция может быть подготовлена для самовведения и/или содержать инструкции для самовведения. В одном аспекте контейнер, содержащий композицию, может быть флаконом для одноразового использования. В другом аспекте контейнер, содержащий композицию, может быть флаконом для многоразового использования, позволяющим осуществлять повторное введение (например, 2-6 введений) композиции, например, с использованием нескольких порций восстановленой композиции. Изделие может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковки с инструкциями по применению, как указано в предыдущем разделе.
В одном варианте исполнения, изделие представляет собой шприц с иглой. Игла может иметь калибр 25 G, 26 G, 27 G, 29 G, 30 G. Тонкостенная игла, например 19 G или 23 G или больше, может облегчать инъекцию высоковязкой композиции. В одном аспекте, калибр иглы составляет 27 G или больше. Длина иглы может быть пригодной для подкожного введения и может быть равной примерно 1/2 дюйма (12,7 мм), примерно 5/8 дюйма (15,9 мм) или 1 дюйму (25,4 мм). В некоторых вариантах исполнения шприц представляет собой предварительно наполненный шприц.
Разработка продукта в виде предварительно наполненного шприца
В некоторых аспектах, существует несколько характеристик продукта, являющихся желательными для белкового продукта (например, анти-о 4Р7 антитела) в предварительно наполненном шприце (PFS) (например, для использования при введении композиции для подкожной или внутримышечной доставки). Полезно сбалансировать некоторые характеристики для уменьшения конкурирующих эффектов. Например, если желателен малый объем инъекции, то может быть предпочтительной высокая концентрация белка в композиции. Однако в случае высокой концентрации белка могут наблюдаться более высокие скорости образования примемей (например, агрегированных примесей, которые выщелачиваются в композицию из шприца) и для использования шприца необходимо прикладывать большие усилия. Малый размер иглы, используемый для обеспечения комфортного ощущения пациента в иесте инъекции, может потребовать больших усилий при использовании шприца. Понимание того, как стабильность и свойства продукта зависят как от композиции, так и от параметров шприца, таких как концентрация белка, pH и внутренний диаметр иглы, помогает в разработке белкового продукта (например, анти-о 4Р7 антитело в предварительно наполненном шприце).
В одном аспекте, способ разработки белкового продукта (например, анти-о 4Р7 антитела) для использования в предварительно наполненном шприце включает совместное изменение параметров шприца и параметров композиции, например, согласованно или одновременно. Это может приводить к лучшему пониманию диапазона стабильности белка и свойств продукта, которые можно ожидать для белкового продукта в предварительно наполненном шприце, чем в случае изменения каждого аспекта по отдельности или сериями.
Разработка продукта (например, анти-о 4Р7 антитела) в предварительно наполненном шприце связана с пониманием того, что в какой-то момент жидкая композиция входит в контакт с несколькими компонентами предварительно наполненного шприца (фиг. 15). Например, композиция может находиться в контакте с цилиндром шприца, который может быть изготовлен из стекла (например, боросиликат-ного стекла типа I) или пластика (например, полимера циклического олефина (СОР), сополимера циклического олефина (СОС), полипропипена или политетрафторэтилена). Композиция может находиться в контакте со шприцом, поршнем и/или наконечником, который может быть эластомерным (например, из одного и того же или разных материалов (например, пластика, такого как полиэтилен, полистирол или полипропипен, или эластичным, таким как каучук (природный, синтетический, бутильный) или силикон)). Композиция может находиться в контакте со смазывающим веществом, которое наносят на внутреннюю поверхность цилиндра для улучшения скольжения поршеня. Смазывающее вещество может быть, например, силиконовым маслом, минеральным маслом или глицерином. В варианте исполнения шприца с несъемной иглой, может использоваться игла из металлического сплава (например, игла из нержавеющей стали и адгезив, используемый для приклеивания иглы). Для белкового продукта в предварительно наполненном шприце необходимо учитывать, что жидкий белковый раствор находится в прямом контакте с одним или несколькими такими компонентами шприца на протяжении периода хранения продукта. Как композиция, так и компоненты шприца могут влиять на стабильность продукта.
Параметры композиции, которые могут влиять на стабильность продукта в виде предварительно наполненного шприца, включают концентрацию белка, рН, тип буфера, концентрацию буфера, ионную
силу, тип стабилизатора и концентрацию стабилизатора. Примеры стабилизаторов для белковых композиций включают, например, ионные соли, полисахариды, аминокислоты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества, как описано в предыдущих разделах.
Компоненты шприца, которые могут повлиять на стабильность продукта в виде предварительно наполненного шприца включают, например, смазывающее вещество, состав поршня и наконечника и примеси. Количество смазывающего вещества (например, силиконового масла на цилиндре шприца) может влиять на стабильность продукта. Состав поршня и наконечника, который может влиять на проницаемость для кислорода таких компонентов и вносить выщелачиваемые материалы из таких компонентов в белковый продукт (например, композицию анти-ос4Р7 антитела), также может влиять на стабильность продукта. Другие параметры шприца, которые могут повлиять на стабильность продукта, включают тип и/или количество примесей (например, тяжелых металлов (например, вольфрама)), которые могут выщелачиваться в композицию продукта (например, из цилиндра (например, стеклянного цилиндра) и/или иглы (например, из иглы из нержавеющей стали)), (см. также Ludwig et al. J.Pharm. Sci. 99: 1721-1733 (2010); Nashed-Samuel et al., American Pharmaceutical Review Jan/Feb: 74-80 (2011); Badkar et al. AAPS Pharm Sci Tech 12: 564-572)
Предварительно наполненный шприц может быть использован для инъекции вручную или использован с автоинжекторным устройством. Функциональные испытания предварительно наполненного шприца включают измерение усилия страгивания - усилия, необходимого для начала движения поршня, и силы трения скольжения - усилия, необходимого для инъецирования содержимого шприца с постоянной скоростью. Механические характеристики предварительно наполненного шприца могут зависеть от нескольких параметров композиции и шприца, таких как вязкость композиции и количество смазывающего вещества (например, силиконового масла) в шприце.
Несколько характеристик белковых продуктов в предварительно наполненных шприцах и факторы композиции или шприца, которые могут повлиять на такие свойства продукта, приведены в табл. 1. Многие характеристики продукта могут быть сложной функцией нескольких параметров композиции и шприца. Например, сила трения скольжения шприца является функцией вязкости композиции, хотя вязкость может зависеть от нескольких факторов композиции, таких как концентрация белка, концентрация стабилизатора и рН.
Скорость окисления белка
Концентрации
стабилизатора/антиоксиданта, рН, концентрация белка, концентрация поверхностно-активного вещества, растворенный кислород
Состав поршня и наконечник(кислородо-проницаемость), уровни содержания примесей тяжелых металлов, размер воздушного пузырька
Скорость образования растворимых агрегатов
Концентрация стабилизатора, рН, концентрация белка, концентрация поверхностно-активного вещества, растворенный кислород в растворе
Количество силиконового масла, уровни содержания примесей тяжелых металлов, размер воздушного пузырька
Скорость
образования
невидимых
невооруженным
взглядом и
видимых белковых
частиц
Концентрация стабилизатора, рН, концентрация белка, концентрация поверхностно-активного вещества
Количество силиконового масла, уровни содержания примесей тяжелых металлов, размер воздушного пузырька, площадь внутренней поверхности шприца
В одном аспекте поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 20 или полисорбат 80, может быть добавлено к белковым композициям в предварительно наполненных шприцах (например, для предотвращения адсорбции и денатурации белковых молекул на границах раздела жидкость/воздух и/или жидкость/смазывающее вещество (например, силиконовое масло)). Поверхностная адсорбция и денатурация молекул белка может быть одним из механизмов нуклеации невидимых невооруженным взглядом и видимых белковых частиц. Прибавление поверхностно-активного вещества в предварительно наполненный шприц, таким образом, может уменьшать образование невидимых невооруженным взглядом и видимых частиц в продуктах типа предварительно наполненных шприцов. В одном варианте исполнения, небольшое количество поверхностно-активного вещества может эмульгировать смазывающее вещество (например, капли силиконового масла в растворе и, тем самым, уменьшать образование невидимых невооруженных взглядом и видимых частиц смазывающего вещества (например, капелек силиконового масла)) (Ludwig et al., supra). В другом варианте исполнения, количество поверхностно-активного вещества в композиции минимизируют из-за потенциально вредных эффектов высоких количеств поверхностно-активных веществ на белковые композиции. Пероксидные примеси, присутствующие в по-лисорбатах, могут приводить к повышенному окислению белка (Wang and Wang J. Pharm. Sci. 91:22522264 (2002)). Высокие количества поверхностно-активного вещества могут эмульгировать значительное количество силиконового масла со стенок шприца и приводить к увеличению функциональной силы трения скольжения в течение периода хранения. При разработке продукта исследования должны быть направлены на изучение эффекта переменных уровней содержания поверхностно-активного вещества как на стабильность продукта, так и на эксплуатационные характеристики шприца.
Сложные взаимосвязи между параметрами композиции и шприца в системах белок/предварительно наполненный шприц (PFS) могут быть изучены с использованием подхода "качество на этапе разработки" (Quality by Design, QbD) или "планирование экспериментов" (Design of Experiments, DOE). Могут быть спланированы исследования, в которых одновременно изменяются параметры композиции и шприца для достижения лучшего понимания таких сложных систем. Это обеспечивает комплексный подход к разработке продуктов в предварительно наполненных шприцах. В табл. 2 приведен пример входных параметров и уровней содержания, которые могут быть использованы при планировании эксперимента для продукта в предварительно наполненном шприце и пример аналитических испытаний, которые могут быть использованы. В зависимости от типа планирования эксперимента, используемого для QbD-исследований, число экспериментов может меняться от 9 для плана отсеивающего эксперимента до 81 для полнофакторного плана (все возможные комбинации). Чем больше число экспериментов, тем больше число взаимосвязей между параметрами продукта, которые могут быть определены. Программное обеспечение, предназначенное для проведения такого анализа, например, прикладная программа для интерактивного статистического анализа JMP(r) (Cary, NC), может быть полезной для QbD-исследований. Этот анализ обеспечивает количественное понимание того, каким образом взаимодействуют параметры композиции и шприца, влияя на характеристики продукта.
Пример прогнозирующей модели, которая может быть получена на основании примера эксперимента, описанного в табл. 2, приведен ниже, где Cn обозначают числовые константы.
Образование растворимых агрегатов со временем=С0+ С1 [Концентрация белка]+С2 [Концентрация белка]2+С3[рН]+С4[Концентрация поверхностно-активного вещества]+С5 [Количество смазывающего вещества]
Многочисленные параметры шприца могут влиять на стабильность продукта и его свойства, поэтому вариант исполнения включает характеризацию того, каким образом допустимые допуски параметров шприца влияют на стабильность и свойства продукта. Количество смазывающего вещества (например, силиконового масла) на цилиндре шприца может меняться в пределах 50-100% для разных шприцов. Такие вариации количества могут влиять на несколько характеристик продукта, как указано в табл. 1.
Внутренний диаметр цилиндра шприца может меняться для разных шприцов, что влияет на усилие, прикладываемое при инъекции. Для шприцов с несъемными иглами, внутренний диаметр иглы может меняться для разных партий или для разных производителей, что будет влиять на усилие, прикладываемое при инъекции. Благодаря использованию QbD-подхода к исследованиям того, каким образом параметры шприца влияют на его характеристики, могут быть получены прогнозирующие модели, которые могут быть использованы для оценки того, каким образом допустимые допуски параметров шприца могут влиять на характеристики продукта. Прогнозирующ модели, полученные с использованием QbD-подхода, могут быть использованы для выбора параметров композиции и шприца, позволяющих обеспечить желательные характеристики продукта и прогнозировать стабильность продукта и его поведение.
Предварительно наполненный шприц может содержать примесь силиконовой эмульсии или вольфрама в белковой композиции. Типичные примеры количества силикона, который может присутствовать в предварительно наполненном шприце, меняются в пределах от примерно 0,3 до примерно 0,8 мг. В одном аспекте количество силикона, который может присутствовать в предварительно наполненном шприце, составляет примерно 0,3, примерно 0,4, примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7 или примерно 0,8 мг. В другом аспекте вязкость композиции будет находиться в пределах от 2 до 60 сП, что приводит к величине усилия инъекции от 5 до 80 Н при скорости 200 мм/мин. В еще одном аспекте вязкость композиции будет находиться в пределах от 4 до 27 сП, что дает величину усилия инъекции от 10 до 40 Н при скорости 200 мм/мин.
Изобретение можно более полно понять со ссылкой на приведенные далее примеры. Однако, они не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения. Все литературные и патентные источники целиком включены в настоящий документ в качестве ссылок.
Протокол приготовления композиции
Раствор анти-о4Р7 антитела подвергают диафильтрации в системе фильтрации с тангенциальным потоком до достижения определенной концентрации цитратного, гистидинового, аргининового буфера, затем объединяют и смешивают с раствором полисорбата 80 в цитратном, гистидиновом, аргининовом буфере. Раствор хранят при -70°C в бутылках емкостью 2 или 5 л. Раствор затем оттаивают и фильтруют дважды через фильтр 0,2 мкм. Приблизительно 1,0 мл помещают в стерилизованный шприц и закрывают стерилизованным поршнем (пробкой). Композицию хранят и готовый лекарственный продукт провозят в шприцах при 2-8°C.
Примеры
Пример 1.
Производство композиции
Факторы Концентрации эксципиентов
Проводят испытания образования агрегатов в композициях антитела. Была разработана модель определяемых методом эксклюзионной хроматографии (SEC) агрегатов на основании экспериментальных данных, описывающих концентрацию белка, pH и молярное соотношение поверхностно-активное веще-ство:белок. В диапазоне значений pH от 6,0 до 6,5, образование агрегатов было схожим в интервале значений молярного соотношения полисорбата 80 к белку от 0,7 до 1,5 (фиг. 6). Обычно при соотношении PS80:белок более 1,5, скорость образования агрегатов возрастает с увеличением pH (фиг. 7).
Был проведен эксперимент по исследованию образования SEC-агрегатов в присутствии воздуха. Одиннадцать разных композиций разного состава помещали во флаконы из боросиликатного стекла и закупоривали эластомерными пробками, оставляя воздух в пустом пространстве над раствором. Готовили идентичный набор композиций и воздух в пустом пространстве замещали аргоном. Эти образцы испытывали на стабильность при 40°C в течение двух недель. Все образцы с воздухом в пустом пространстве давали большое количество агрегатов в конце эксперимент в отличие от той же композиции с аргоном в пустом пространстве.
На основании этих экспериментов была выдвинута гипотеза, что SEC-агрегаты образуются в результате окисления или в результате образования дисульфидной связи. Было исследовано добавление антиоксидантов и/или хелатирующих агентов. Была приготовлена композиция, содержащая 40 мМ гис-тидина, 90 мМ аргинина и 160 мг/мл белка с полисорбатом 80 до молярного соотношения с белком, равного 1,5, при pH 6,6. К композиции добавили 25 мМ цитрата, 5 мМ цитрата, 5 мМ ЭДТА, 25 мМ цистеи-на или 5 мМ цистеина. Все 3 дополнительных эксципиента уменьшали образование агрегатов (фиг. 8). Добавление антиоксидантов и/или хелатирующих агентов ранжировали по степени их действия в ряд цитрат> ЭДТА> цистеин. 5 или 25 мМ цитрата снижали образование SEC-агрегатов по сравнению с контрольной композицией.
Был проведен эксперимент с целью определения эффектов рН, концентрации белка, концентрации цитрата, концентрации гистидина и молярного соотношения полисорбата 80 к белку. Величина pH менялась от 6,0 до 6,3, концентрация белка менялась от 60 до 160 мг/мл, концентрация цитрата менялась от 0 до 25 мМ, концентрация гистидина менялась от 25 до 50 мМ, и молярное соотношение полисорбата 80 к белку менялось от 0,7 до 1,5. Композициями наполняли длинные шприцы на 1 мл, 27G1/2" (0,55±0,2 мг силикона). Все композиции содержали приблизительно 125 мМ аргинина.
Стабильность испытывали при 40°C в течение двух недель, с использованием СЕХ и SEC. Результаты (фиг. 9 и табл. 4) демонстрируют уменьшение образования агрегатов в присутствии 25 мМ цитрата в композиции, в то время как увеличение концентрации белка увеличивало скорость образования агрегатов. Количество мономера демонстрирует тенденцию, противоположную образованию агрегатов при 25 и 40°C, в то время как при 5°C количество мономера остается по существу неизменным на протяжении до 24 месяцев (табл. 5).
Другой набор композиций был исследован на скорость образования SEC-агрегатов в присутствии 40-63 мМ цитрата, но в отсутствие гистидина, при 40, 25, 5°C. Скорость образования агрегатов в этих композициях была немного выше, чем в композициях с гистидином при 40°C. Однако при 5°C скорость образования агрегатов в композициях с цитратом и без гистидина была сравнимой с композициями, со
держащими цитрат и гистидин (табл. 6). Также при 5°C, количество мономера остается, по существу, неизменным на протяжении до 24 месяцев (табл. 7).
Таблица 4
Композиция №
Конц. белка (мг/мл)
Конц. гистидина (мМ)
Конц. цитрата (мМ)
Конц. аргинина (мМ)
Молярное соотношение РЭ80:белок
Исходное количество агрегатов (%)
Изменение кол-ва
агрегатов через 12 месяцев при 5 °С
Изменение
кол-ва агрегатов через 24 месяца при 5°С
Изменение
кол-ва агрегатов через 12 месяцев при 25 °С
Изменение кол-ва
агрегатов через 1
месяц при 40 °С
6,4
125
0,7
0,4
0,1
0,1
0,7
0,2
6,4
125
1,5
0,4
0,5
1,1
1,5
0,4
157
6,4
125
1,5
0,4
0,2
0,3
1,3
0,5
161
6,3
125
0,7
0,4
0,6
0,7
2,5
0,8
6,2
125
1,5
0,4
0,2
0,2
0,5
0,2
110
6,0
125
0,7
0,4
0,4
0,6
1,7
0,7
162
6,2
125
0,7
0,4
0,3
0,3
1,1
0,5
160
6,0
125
1,5
0,4
0,4
0,6
2,2
0,9
169
6,3
125
0,7
0,5
0,3
0,6
158
6,3
123
1,0
0,5
0,6
Несколько экспериментов с pH было проведено с целью определения эффектов pH на определенную методом катионообменной хроматографии (СЕХ) деградацию при 5°C. Композиция антитела ведолизумаба содержала 160 мг/мл анти-о4Р7 антитела, 125 мМ аргинина, 50 мМ гистидина и 25 мМ цитрата. Было испытано несколько разных уровней pH - 6,3, 6,5, 6,7 и 6,9 - на стабильность при 40, 25 и 5°C.
СЕХ-модели при 40°C показывают (фиг. 10), что на определенную методом катионообменной хроматографии (СЕХ) деградацию сильнее всего влияет рН. Величина pH композиций, содержащих гисти-дин, уменьшается с повышением температуры, однако было продемонстрировано, что величина pH цит-ратных композиций не зависит от температуры (фиг. 11). Было определено, что композиция с гистиди-ном/цитратом имеет хорошую стабильность при pH 6,8 при 40°C через 1 неделю, при 6,3-6,5 при 25°C через 6 месяцев и при 6,3-6,5 при 5°C через 6 месяцев. На основании дополнительных исследований показатели стабильности композиций были схожими при 25 и 5°C для величины pH в диапазоне значений от 6,2 до 6,9 (табл. 8 и 9).
Четыре разные композиции анти-о4Р7 антител были испытаны на стабильность на протяжении двенадцати месяцев. Композиции, имеющие pH 6,0-6,2, демонстрировали приблизительно на 1-2% меньше главной изоформы, чем композиции, имеющие pH 6,3-6,4 (фиг. 12). Композиции, имеющие pH 6,3-6,4, демонстрировали менее 1% изменений основной или главной изоформы при 5°C.
Десять разных композиций анти-о4Р7 антител были испытаны на стабильность методом эксклюзи-онной хроматографии (SEC) на протяжении двенадцати месяцев (табл. 10). Композиции с концентрацией белка 60 мг/мл и содержащие 25 мМ цитрата, демонстрировали изменение количества агрегатов на 0,10,2% через 1 год, в то время как композиции, содержащие 160 мг/мл белка и 25 мМ цитрата, демонстрировали увеличение количества агрегатов от 0,2-0,3% на протяжении 1 года. Наблюдалось увеличение на 0,4-0,6% агрегатов в композициях, содержащих 60, 110 или 160 мг/мл белка без цитрата.
Пример 3. Вязкость
Усилие, необходимое для введения фармацевтической композиции путем инъекции, связано с вязкостью композиции. Были приготовлены композиции с различными значениями pH и различными концентрациями белка, аргинина, гистидина, цитрата, сахарозы и полисорбата 80. Провели испытания вязкости таких композиций. Была разработана статистическая модель In (вязкость). Модель продемонстрировала, что вязкость зависит главным образом от концентрации белка и pH (фиг. 13). Сахароза, гистидин и аргинин также могут оказывать незначительное влияние на вязкость. В некоторых композициях белков, хлорид натрия добавляют для уменьшения вязкости композиций. Известно, однако, что эффект хлорида натрия на вязкость зависит от белка и состава композиции.
Хлорид натрия добавляли к композиции, содержащей 140 мг/мл ведолизумаба, 125 мМ аргинина, 25 мМ гистидина, 25 мМ цитрата и полисорбат 80 при молярном соотношении полисорбата 80 к белку,
равном 1,5, и pH 6,4. NaCl не оказывал какого-либо влияния на вязкость композиции.
Эффекты вязкости на усилие инъекции для различных испытанных шприцов приведены на фиг.
16А и 16В.
Пример 4. Способы
Катионообменная хроматография (СЕХ)
Градиент фосфата/хлорида натрия на колонке со слабым катионообменником использовали в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии для выделения заряженных материалов в композиции анти-сс4Р7 антител и определения заряда материалов композиции антитела. Кислотные изоформы элюируются раньше главной изоформы, а основные изоформы элюируются после главной изоформы.
Данные по стабильности для композиции ведолизумаба, полученные методом СЕХ-анализа, показывают, что % главной изоформы был выше 55,0%.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (clEF)
Проводят clEF с использованием системы iCE280 с детектированием на полной колонке clEF (Convergent Biosciences, Toronto, Ontario). Амфолит может быть выбран в соответствии с рекомендациями производителя или может быть комбинацией коммерчески доступных амфолитов. Пригодной комбинацией является смесь 3-10 и 5-8 PHARMALYTE(tm) (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Данные по стабильности для композиций ведолизумаба, полученные методом clEF-анализа, показали, что % главной изоформы составлял примерно 53%, % кислотных материалов составлял примерно 42% и % основных материалов составлял примерно 5%.
Эксклюзионная хроматография (SEC)
SEC проводят с использованием колонки для аналитической SEC (Tosoh Bioscience, LLC, King of Prussia, PA). Подвижная фаза представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор, и оптическое поглощение контролируют при 280 нм.
Данные по стабильности для композиции ведолизумаба, полученные методом SEC-анализа, показали, что % мономера составлял 99,0%, % агрегатов составлял <0,5% и % низкомолекулярных веществ составлял <1,0%.
Анализ ДСН-ПААГ
ДСН-ПААГ проводят с использованием Трис-глицинового геля фирмы Invitrogen (Carlsbad, CA), 420% для восстанавливающих условий и 4-12% для невосстанавливающих условий. Восстановленный образец композиции антитела разбавляют в буфере жидкой композиции, затем разбавляют один к двум буфером Трис-глицин ДСН для образца (2Х, Invitrogen) с 10% 2-меркаптоэтанола (восстанавливающий буфер образца) или без 2-меркаптоэтанола (невосстанавливающий буфер образца). Образцы кратковременно нагревают и загружают для анализа в сравнении с маркером молекулярного веса (Invitrogen). Гели окрашивают коллоидным кумасси синим (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Полосы белка анализируют методом денситометрии для определения % тяжелой и легкой цепей для восстановленных гелей и % IgG для невосстановленных гелей.
Эффективность связывания
Клетки HuT78 (клетки Т-клеточной лимфомы человека, American Type Culture Collection, Manassas, VA), суспендированные в 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в PBS (фосфатно-солевой буфер), вводят в контакт с 0,01% азидом натрия с серийными разведениями первичного испытуемого антитела. После инкубации на льду, клетки промывают и обрабатывают флуоресцентно меченым вторичным антителом. После дополнительного промывания, клетки фиксируют и суспендируют в реагенте FACS для анализа методом проточной цитометрии (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ); см. также патент США №
7147851.
Влажность по методу Карла Фишера
Композицию титруют метанолом для кулонометрического определения влажности по Карлу Фишер.
Пример 5. Эффекты силикона в продуктах в виде шприца предварительно наполненного композицией анти-сс4Р7 антитела
Подкожную композицию, содержащую 60-160 мг/мл анти-сс4Р7 белка в буфере, содержащем L-гистидин, L-аргинина гидрохлорид, цитрат и полисорбат 80, используют для изучения эффектов силикона на стабильность композиций белка и характеристики контейнера/упаковки. Исследования проводят на образцах продукта с объемом раствора 0,5 мл.
Исследовали параметры, включающие концентрацию белка, молярное соотношение полисорбата 80 к белку и количество силикона, впрыскиваемого в цилиндры шприцов. Диапазон значений каждого из входных параметров приведен в табл. 11.
Используют планирование эксперимента для определения набора композиций для исследований. Разумное количество композиций составляет от 6 до 8 композиций. Примеры композиций, подвергаемых испытаниям, приведены в табл. 12.
К набору композиций могут быть добавлены некоторые контроли, которые испытавают в нескольких выбранных моментах времени.
Такие композиции помещают для испытаний стабильности при нескольких разных температурах (например, 5°C, 25°C/60% RH (относительной влажности), 40°C/75% RH) и извлекают в различные моменты времени (например, 0 недель, 1 неделя, 2 недель, 4 недели, 8 недель, 12 недель, 6 месяцев и 12 месяцев) для испытаний. Контроли испытывают в моменты времени 0 недель, 12 недель, 6 месяцев и 12 месяцев.
Испытания, проводимые при извлечении в каждый момент определения стабильности, включают SEC, CEX, Instron, MFI и количественное определение силикона. 1 шприц испытывают для определения Instron, а выдавленный из шприца материал используют для испытаний SEC, CEX, измерения усилия инъекции и микропоточной визуализации (MFI) и количественного определения силикона.
Пример 6. Анализ компонентой шприца, предварительно наполненного композицией анти-а4Р7 антитела
В данных исследованиях определяли, как шприцы различных производителей, эластомерные материалы поршня (пробки) и количество PS80 в композиции влияли на механические свойства системы и стабильность композиции.
Проводили планирование эксперимента по исследованию шприцов 3 разных производителей, 2 разных типов материала поршня (пробки) и 2 разных молярных соотношений PS80 к белку. В остальном состав композиций был постоянным с 170 мг/мл белка, 125 мМ аргинина, 50 мМ гистидина, 25 мМ цитрата и pH 6,5. В этих предварительно наполненных шприцах использовались тонкостенные иглы размером 27G1/2' или 29GV2M. Эксперименты проводились, как указано в табл. 15.
Входные параметры плана эксперимента для активной части эксперимента приведены ниже в табл. 13, а константы приведены в табл. 14. План эксперимента был разработан на основе входных параметров, приведенных в табл. 13.
Перечень экспериментов приведен в табл. 10.
Таблица 13. Переменные РОЕ (плана эксперимента) и уровни для активной композиции
Переменная
Значения
Молярное соотношение РЭ80:белок
1,0
1,5
Производитель шприца
Тип поршня (пробки)
4432
4023 с покрытием
В концентрированную композицию анти-а4Р7 вводят полисорбат 80 и разбавляют до 170 мг/мл. Состав исходной композиции приведен ниже в табл. 16.
Таблица 16. Сведения о буфере исходной композиции
Белок (мг/мл)
Общий His (мМ)
Общий цитрат (мМ)
Агд (мМ)
183
125
6,48
Для разбавления материала до желательного состава композиции готовят маточные растворы PS80 в 25 мМ цитрата, 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, pH 6,48.
Таблица 17. Сведения о маточных растворах
Эксципиент
Концентрация
PS 80 (%)
Смешивание осуществляют на основе схемы разбавления, и исходная композиция должна быть взвешена, в то время как другие маточные растворы могут дозироваться объемно пипетками. Композиции фильтруют. Аликвоты 0,5 мл композиции помещают в максимально возможное количество длинных шприцов на 1 мл. Шприцы укупоривают с помощью укупорочной машины с пузырьком 2-4 мм. Для каждого момента времени используется один шприц, хранившийся иглой книзу, и один шприц, хранившийся на боку. Избыток шприцов хранится иглой книзу.
Шприцы испытывают при 5, 25 и 40°C в неделю 2 и через месяц. Аналитические испытания (внешний вид, Instron, pH, осмоляльность, плотность, вязкость, SEC, CEX и Brightwell) проводят в начальный момент времени и затем снова через 2 недели при 25 и 40°C и через 4 недели при 25°C.
Пример 7. Анализ укупорочных материалов контейнера для подкожного введения, используемых в шприцах с тонкостенной иглой 27G, предварительно наполненных композицией анти-а4Р7 антитела
В данных исследованиях изучали влияние различных моделей шприцов с тонкостенной иглой 27G и поршнями (пробками) различных производителей и моделей на механические свойства системы и стабильность композиции со временем.
В данных исследованиях изучали, как стабильность жидкой композиции анти-а4Р7 для подкожного введения в предварительно наполненном шприце и механические свойства шприца зависят от производителя шприца и модели поршня (пробки) для шприцов с иглой 27GTW. Данные, полученные в этих исследованиях, могут позволить выбрать компоненты контейнера/упаковки для жидкой композиции анти-а4Р7 для подкожного введения.
Входные параметры плана эксперимента приведены ниже в табл. 19, а константы приведены в табл. 20. План эксперимента был разработан с использованием входных параметоров, приведенных в табл. 19.
Перечень проводимых экспериментов приведен в табл. 21.
В концентрированную композицию анти-ос4Р7 вводят с помощью шприца полисорбат 80 и разбавляют до 160 мг/мл. Состав исходной композиции приведен ниже в табл. 22.
Таблица 22. Сведения о буфере исходной композиции
Белок (мг/мл)
Общий His (мМ)
Общий цитрат (мМ)
Агд (мМ)
180
125
6,3
Для разбавления материала до желательного состава композиции готовят маточные растворы PS80 в 25 мМ цитрата, 50 мМ гистидина и 125 мМ аргинина, pH 6,3.
Таблица 23. Сведения о маточных растворах
Эксципиент
Концентрация
PS 80 (%) в His/Arg/цитратном буфере, рН 6,3
1,68
Смешивание осуществляют на основании схемы разбавления, и исходная композиция должна быть взвешена, в то время как другие маточные растворы могут быть дозироваться пипетками объемно. Композиции фильтруют. Аликвоты 0,5 мл композиций помещают в как можно большее число длинных шприцов на 1 мл. Шприцы укупоривают с помощью укупорочной машины с пузырьком 2-4 мм. Для каждого момента времени используют один шприц, хранящийся иглой книзу (needle down) (горизонтальное положение).
Шприцы испытывают при 5, 25°C/60% RH и 40°C/75% RH через 1, 3, 6, 9 месяцев (необязательно), 12, 18 и 24 месяца.
Жидкие композиции подвергают аналитическим испытаниям (концентрация, осмоляльность, рН, Instron, MFI, SEC и/или СЕХ) через 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 месяца (5°C); 1, 3, 6, 9, 12, 18 месяцев (25°C); 1, 3, 6, 9, 12 месяцев (40°C) и 1, 3 месяца (40°C).
Пример 8. Анализ композиции анти-ос4Р7 антитела для подкожного введения в предварительно наполненных пластиковых шприцах
Данные исследования были инициированы с целью изучения использования пластиковых шприцов в качестве системы контейнер/упаковка для композиции анти-ос4Р7 антитела для подкожного введения. Исследуют стабильность типичной композиции анти-ос4Р7 антитела для подкожного введения в предварительно наполненных пластиковых шприцах-кандидатах. Данные этих исследований помогают оценить применимость пластикового шприца для жидкой подкожной композиции анти-ос4Р7 антитела.
Образцы для испытаний на стабильность готовят, как указано ниже. Испытания на стабильность
проводят в условиях хранения 40°C/75% RH, 25°C/60% RH и 5°C.
Два типа пластиковых шприцов и один стеклянный шприц (контроль) в табл. 25 испытывают с жидкой композицией анти-сс4Р7 антитела для подкожного введения, приведенной в табл. 26. В табл. 27 приведены данные для каждого набора образцов, исследованных в эксперименте.
Таблица 25. Пластиковые шприцы
Образец
Поставщик
Белок (MB: 150000)
Arg (MB: 174,20) (мМ)
His (MB: 155,15) (мМ)
Цитрат (MB:
210,14) (мМ)
PS 80
(МВ:1309,68)
пластикового шприца
(мг/мл)
(мМ)
(мас/об %)
Молярное отношени е к белку
160
1,067
125
0,21
1,5
6,5
160
1,067
125
0,21
1,5
6,5
3 (прод.)
160
1,067
125
0,21
1,5
6,5
Для данных исследований используются ранее приготовленные жидкие анти-сс4Р7 композиции для подкожного введения. Композиции фильтруют. Отбор образцов фильтрованного раствора осуществляют, как при испытаниях качества образца "перед наполнением" (внешний вид, MFI, DLS). Аликвоты 0,5 мл композиции помещают в пластиковые шприцы на 1 мл. Шприцы укупоривают с помощью вакуумной укупорочной машины. Шприцы хранятся иглой книзу.
Проводят начальный контроль для измерения рН, осмоляльности, плотности, вязкости и концентрации белка. Аналитические испытания (внешний вид, SEC (агрегаты, мономер, LMW), СЕХ (кислотные материалы, главный компонент, основные материалы), сила трания скольжения, MFI, DLS и/или вес) проводят через 1 неделю, при 40°C, 2 недели, 40°C, 1 месяц, 5, 25 и 40°C, 3 месяца, 5 и 25°C, 6 месяцев при 5 и 25°C, 9 месяцев при 5 и 25°C и 12 месяцев при 5 и 25°C.
Образцы отбирают через 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев при 5 и 25°C. Образцы отбирают через 1, 2 недели и 1 месяц при 40°C.
Пример 9.
Образцы анализируют на внешний вид, усилие инъекции, SEC, СЕХ и микропоточную визуализацию при 5°C и 25°C в различные моменты времени, которые могут включать 0, 1, 3, 6 и 12 месяцев. Стабильность композиции, измеренная методами SEC и СЕХ, была схожей с описанной в примерах 1 и 2. Для испытаний на усилие инъекции измеряют силу трения скольжения (табл. 28). Статистическая модель показала, что единственным значащим фактором, влияющим на силу трения скольжения, был производитель шприца, где А имеет более высокую силу трения скольжения, чем В, который имеет более высокое значение, чем С (фиг. 17). Изменения силы трения скольжения шприцов на протяжении 12 месяцев при 5°C и 6 месяцев при 25°C были меньше 10 Н, преимущественно менее 5 Н.
Пример 10. Анализ компонентов предварительно наполненного шприца, используемых в шприцах с тонкостенной иглой 27G, наполненной композицией анти-а4Р7 антитела
Данные исследования изучали, как различные производители шприцов с тонкостенной иглой 27G и различные производители поршней (пробок) и эластомерных материалов влияют на механические свойства системы предварительно наполненного шприца и стабильность композиции со временем.
Проводили испытания шприцов трех разных производителей и 4 разных моделей поршня (пробки) с тонкостенными иглами 27G 72" и композиции, содержащей 160 мг/мл белка, 125 мМ аргинина, 50 мМ гистидина, 25 мМ цитрата, 0,2% PS80 при pH 6,5. Все приготовленные и испытанные образцы приведены в табл. 29.
Образцы анализируют на внешний вид, усилие инъекции, SEC, CEX и микропоточную визуализацию при 5, 25 и 40°C в различные моменты времени, которые могут включать 0, 1, 3, 6 и 12 месяцев. Стабильность композиции, измеренная методами SEC и СЕХ, была близка к описанной в примерах 1 и 2. Для испытаний на усилие инъекции проводили измерения усилия, необходимого для приведение поршня в движение, и силу трения скольжения. Результаты в начальный момент времени приведены в табл. 30.
7,9
7,6
4,3
10,4
6,1
6,3
4,2
4,1
15,0
33,3
5,9
4,8
3,9
4,4
10,0
7,2
4,6
6,1
9,8
13,0
Статистическая модель показала, что шприцы производителей А и С имели близкие характеристики и меньшую силу трения скольжения, чем у производителя В, в то время как поршень (пробка) Е имел немного большую силу трения скольжения, чем другие поршни (пробки).
В общем, начальные усилия приведения поршня в движение были близки для всех испытанных образцов.
На протяжении 12 месяцев при 5, 25 и 40°C сила трения скольжения значительно не изменялась. Однако усилие приведения поршня в движение для шприцов с поршнем (пробкой) F увеличивалось через 12 месяцев при 25 и 40°C.
Пример 11. Анализ композиции анти-ос4Р7 антитела в предварительно наполненных шприцах Данные исследования определяли, как разные уровни концентрации белка, концентрации полисор-бата 80, концентрации цитрата и pH влияли на композиции анти-о4Р7 антител в формате предварительно наполненных шприцов.
Часть плана эксперимента была создана в JMP с дробным факториалом двух уровней концентрации белка (от 60 до 160 мг/мл), pH (от 6,0 до 6,3), молярного соотношения полисорбат 80:белок (от 0,723 до 1,5) и концентрации цитрата (от 0 до 25 мМ). Эти композиции имели постоянные значения концентрации гистидина (50 мМ) и аргинина (125 мМ) (Композиции 1-8). Добавляют варианты таких композиций с 25 мМ гистидина (Композиции 9-10).
Был разработан дополнительный набор композиций для исследрвания композиций, не содержащих гистидина и использующих в качестве буфера только цитрат (Композиции 11-16). Уровни входных параметров всех исследуемых композиций приведены в табл. 31. Константы, используемые для всех композиций, приведены в табл. 32.
использованный для получения приемлемых объемов разбавления, приведен в табл. 34. Для получения композиций TFF 1 и 2 выполняют две разные операции TFF (фильтрация с тангенциальным потоком). Часть TFF 1 используется при проведении диализа для получения композиции, обозначенной "Диализ".
Для разбавления материала до желательного состава композиции, готовят маточные растворы каждого эксципиента в воде с концентрациями, указанными в табл. 35.
Таблица 35. Сведения о маточных растворах
Эксципиент
Концентрация
Гистидин (мМ)
220
Аргинина гидрохлорид (мМ)
625
PS 80 (%)
2,5
Гистидина гидрохлорид (мМ)
600
Лимонная кислота (мМ) (рН 6,3)
1500
Лимонная кислота (мМ) (рН 6,0)
1500
Цитрат (мМ)
600
Цитрат натрия (мМ)
800
Смешивание осуществляют на основании схемы разбавления и исходную композицию взвешивают, в то время другие маточные растворы дозируют объемно пипетками. Композиции фильтруют. Аликвоты 0,5 мл композиции помещают в как можно большее число длинных шприцов на 1 мл. Шприцы закрывают с помощью укупорочной машины. Шприцы хранят иглой книзу.
Жидкие композиции подвергают аналитическим испытаниям (внешний вид, рН, осмоляльность, плотность, DLS, SEC, CEX и/или Brightwell) в начальный момент времени и через 1 неделю, 40°C, 2 недели, 40°C, 1 месяц, 25 и 40°C, 2 месяца, 5 и 25°C, 3 месяца, 5 и 25°C, 6 месяцев, 5 и 25°C, 9 месяцев, 5 и 25°C, и 12 месяцев, 5 и 25°C.
Также проводят особые отборы проб композиций в соответствии с табл. 38.
Пример 12.
Композицию, содержащую 160 мг/мл белка, 50 мМ гистидина, 25 мМ цитрата, 125 мМ аргинина при pH 6,5 испытывали на стабильность в стеклянном шприце или в двух разных СОР пластиковых
шприцов. При 5 и 25°C через 12 месяцев количество агрегатов и мономера было сопоставимым между пластиковыми и стеклянными шприц.
Таблица 39
Компо зиция №
Молярное соотношение PS80: белок
Материал шприца
Изменение кол-ва SEC-агрегатов через 12 месяцев при 5 °С (%)
Изменение кол-ва SEC-агрегатов через 12 месяцев при 25 °С (%)
Количество мономера через 12
месяцев при
5 °С (%)
Количество мономера через 12
месяцев при
25 °С (%)
1,5
СОР Производитель 1
0,2
1,0
98,3
96,8
1,5
СОР Производитель 2
0,2
1,6
98,3
96,9
1,5
Стекло
0,2
1,4
98,4
96,8
Стекло
0,2
1,6
98,3
96,8
Пример 13. Биодоступность ведолизумаба при введении подкожной и внутримышечной инъекции
Были проведены исследования фазы I биодоступности ведолизумаба при введении подкожной и внутримышечной инъекции здоровым особам мужского пола. К участию в исследованиях было привлечено 42 здоровых особы мужского пола. Субъектов разделили на три группы (подкожное, внутримышечное и внутривенное введение) по 14 особ в каждой. Субъектам вводили 180 мг ведолизумаба в один день. Дозу восстанавливали из лиофилизированной композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при pH 6,3. Для субъектов внутримышечной и подкожной групп доза была разделена на две инъекции по 1,5 мл каждая. Брали пробы крови с целью определения концентрации ведолизумаба в плазме и была определена биодоступность ведолизумаба в каждой группе субъектов.
Не поступило сообщений о серьезных нежелательных эффектах или значительных инфекциях, клинически значимых аномалиях, положительных результатов субъективных/объективных контрольных опросников RAMP, или клинически значимых результатах ЭКГ.
Было проведено PK/PD (фармакокинетичкое-фармакодинамическое) моделирование и имитация с целью определения дозы и режимов внесосудистого введения, обеспечивающих экспозицию, близкую к достигаемой при внутривенном введении дозы, для поддержания такой желательной концентрации в сыворотке для остаточных уровней.
Профиль абсорбции (фиг. 18) показывает, что концентрации внутримышечных и подкожных доз обычно перекрываются. Не наблюдалось очевидных значительных различий в профилях абсорбции для таких путей введения. Абсолютная биодоступность ведолизумаба после подкожной (SC) инъекции составляла приблизительно 75%, а после внутримышечной (IM) инъекции - приблизительно 80%.
Пример 14. Моделирование режимов подкожного дозирования
Было проведено моделирование PK/PD и имитация с целью определения дозы и режимов внесосу-дистого введения, обеспечивающих экспозицию, близкую к достигаемой при внутривенном введении дозы, для поддержания такой желательной концентрации в сыворотке для остаточных уровней.
Конечный комбинированный набор данных (IV, SC и IM-данные) продемонстрировал двухкомпар-тментные линейные модели, параметризованные по клиренск (CL) и центральному объему распределения (V2), периферическому объему распределения (V3), внесосудистый путь-зависимой константы скорости абсорбции (KA) и относительной биодоступности (по сравнению с внутривенным введением) вне-сосудистых доз (F). IIV-члены были включены для CL, V2 и V3 с весом тела в качестве единственной присоединенной переменной, влияющей на CL и V3 посредством аллометрического эффекта.
Приемлемость и прогнозируемость модели были продемонстрированы с помощью бутстреп-процедуры оценки параметров, визуального контроля прогнозных параметров и графика критерия согласия. Анализ модели идентифицировал вес тела в качестве прогностического фактора фармакокинетики (PK) ведолизумаба, с отнесением вариабельности РК на счет межсубъектных и внутрисубъектных компонентов.
После того, как была продемонстрирована пригодность модели для имитации, модельные расчеты проводились для оценки эффекта пути введения (IV, IM или SC) и оценки эффекта частоты введения доз (еженедельно, через 2 недели, через 4 недели и через 8 недель) на минимальную остаточную концентрацию в состоянии равновесия. На основании этих значений и относительной биодоступности ведолизума-ба после IM и SC введения (F=69,5%), были выбраны дозы для достижения минимальных остаточных концентраций, схожих с полученными при IV введении доз.
Имитационные расчеты моделировали дозы и режимы для обеспечения сочетания индукционного и поддерживающего режимов при внутривенном введении. Целевыми параметрами были как экспозиция (площадь под кривой концентрация препарата в сыворотке-время (AUC)), так и минимальная остаточная концентрация препарата. Табл. 40-43 содержат результаты модельных расчетов.
Пример 15. Исследования фазы 2а с многократными дозами
Исследования фазы 2а с многократными дозами позволяют оценить безопасность, переносимость и фармакокинетику (PK) в состоянии равновесия для ведолизумаба после введения многократных доз ведолизумаба подкожным путем, и оценить относительную биодоступность подкожного режима введения по сравнению с внутривенным. Разработка НАНА и нейтрализация НАНА, и может быть оценен эффект на фармакодинамику (PD) многократных доз ведолизумаба после подкожного введения.
В данное исследование могли быть включены пациенты с неспецифическим язвенным колитом, имеющие показатели по частичной шкале Мейо, равные 1-12 баллов, и пациенты с болезнью Крона, имеющие показатели CDAI более 150. Когорты могли получать схему индукции ведолизумаба (300 мг) при внутривенном (IV) введении в недели 0 и 2, с последующим поддерживающим режимом по одной из следующих схем: Ведолизумаб (300 мг), IV введение, раз в 4 недели на протяжении недель 6-22 Ведоли-зумаб (300 мг), IV введение, раз в 8 недель на протяжении недель 6-22 Ведолизумаб (108 мг), SC введение, раз в неделю на протяжении недель 6-22 Ведолизумаб (108 мг), SC введение, раз в 2 недели на протяжении недель 6-22 Ведолизумаб (165 мг), SC введение, раз в 3 недели на протяжении недель 6-22.
Образцы для оценки PK и PD могут быть взяты перед введением дозы в день 1 и затем снова в день 1 (12 часов), 2, 3, 5, 8, 15, 29, 43, 127, 127 (12 часов), 128, 129, 131, 134, 141 и 155.
Пример 16. Долгосрочная клиническая практика применения ведолизумаба для лечения воспалительной болезни кишечника (IBD)
Открытое продолженное исследование безопасности фазы 2 было проведено с целью оценки долгосрочных фармакокинетических параметров (PK), фармакодинамических параметров (PD), безопасности и эффективности ведолизумаба. Пациенты имели возраст от 18 до 75 лет и или ранее участвовали в предшествующем исследовании PK/PD/безопасности для пациентов с неспецифическим язвенным колитом или имели симптомы IBD на протяжении по меньшей мере 2 месяцев, подтвержденные эндоскопич-но и/или гистопатологично и/или радиологично на протяжении 36 месяцев после скрининга.
Все пациенты получали внутривенный режим дозирования или 2 мг/кг или 6 мг/кг ведолизумаба (5 мг/мл антитела, 20 мМ цитрата/лимонной кислоты, 125 мМ хлорида натрия, 0,05% полисорбата 80, pH 6,0 (долгосрочное хранение при -70°C и до 3 месяцев (mo) при -20°C)) в дни 1, 15 и 43, с последующим введением доз раз в 8 недель на протяжении до в общей сложности 78 недель. Пациенты или не получали ранее лечения неспецифического язвенного колита или были пациентами с болезнью Крона или пациентами с неспецифическим язвенным колитом, которые участвовали в проводившихся ранее клинических испытаниях.
Для оценки результатов данного исследования использовали показатели эффективности/качества жизни (QoL); частичную шкалу Мейо (PMS), индекс активности болезни Крона (CDAI) и опросник для воспалительной болезни кишечника (IBDQ).
Фармакокинетические (PK) результаты
Средние концентрации ведолизумаба перед инфузией были доза-пропорциональными и оставались стабильными и детектируемыми на протяжении исследований.
Фармакодинамические (PD) результаты
Рецепторы (%АСТ-1+[CD4+CD45RO HIGH] и %MADCAM+[CD4+CD45RO HIGH] были почти полностью ингибированы на протяжении периода исследований при всех уровнях доз.
Частичная шкала Мейо (PMS)
Средний показатель PMS для базовой линии был выше у не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом (5,4), чем у продолжающих лечение пациентов с неспецифическим язвенным колитом (2,3). К дню 43, средний показатель PMS демонстрировал значительное снижение как для продолжающих лечение, так и для не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом. К дню 155 средние показатели двух групп сблизились. Средние показатели PMS продолжали снижаться до дня 267 и впоследствии выходили на плато.
Индекс активности болезни Крона (CDAI)
Среднее значение индекса активности болезни Крона (CDAI) у пациентов с болезнью Крона (CD) снижалось с 294,6 на базовой линии до 237,7 в день 43 и продолжало снижаться до дня 155 (156,1).
IBDQ (Опросник для больных ВЗК)
Продолжающие лечение пациенты с неспецифическим язвенным колитом имели наибольшие средние показатели IBDQ на базовой линии. К дню 43, средние показатели IBDQ увеличивались во всех трех группах больных. Средние показатели IBDQ продолжали возрастать со временем во всех 3 группах больных, достигая максимума в день 155 for пациенты с болезнью Крона и в день 491 для не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом и продолжающих лечение пациентов с неспецифическим язвенным колитом.
С-реактивный белок (CRP)
Как продолжающие лечение пациенты с неспецифическим язвенным колитом, так и пациенты с болезнью Крона продемонстрировали снижение средних уровней CRP до дня 155 с последующим выходом на плато. Не получавшие ранее лечения пациенты с неспецифическим язвенным колитом имели более низкий средний уровень CRP на базовой линии, чем продолжающие лечение пациенты с неспецифическим язвенным колитом (2,28 v. 7,09). Средние уровни CRP у не получавших ранее лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом оставались относительно постоянными для всех проанализированных моментов времени.
Другие результаты, касающиеся безопасности
Не было сообщений о других системных оппортунистических инфекциях (включая PML) на протяжении исследований. Для одного пациента был получен положительный результат теста на JC-виремию в один из моментов времени, при отрицательных результатах на JCV во все три другие момента времени. У трех из 72 пациентов (4%) были получены положительные результаты на НАНА (два из них были транзиентно положительными). Исследование не выявило свидетельств почечной токсичности, лимфо-цитоза или лимфопении или любых других ассоциированных с препаратом изменений лабораторных параметров.
Выводы
Ведолизумаб при введении в дозах 2,0 или 6,0 мг/кг раз в 8 недель на протяжении до 78 недель обеспечивал достижение насыщения рецептора-мишени, был ассоциирован с продолжительным сниже
нием средней активности болезни и улучшение показателей IBDQ, был обычно безопасным и хорошо переносился и продемонстрировал приемлемую иммуногенность.
Пример 17. Индукция и поддержание ответа и ремиссии у пациентов с неспецифическим язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности
Единичное исследование, включающее два рандомизированных двойных слепых многоцентровых исследования, было спроектировано для оценки индукции и поддержания ответа и ремиссии у пациентов с неспецифическим язвенным колитом от умеренной до тяжелой степени активности. Демографические показатели и характеристики болезни базовой линии были сопоставимыми для всех групп лечения.
Исследования индукции, при использовании внутривенного введения, сравнивали плацебо с ведо-лизумабом, в дозе 300 мг, восстановленной из лиофилизированной композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при pH 6,3, с конечной точкой в неделю 6 после 2 доз ведолизумаба.
Исследования поддержания, с использованием той же композиции и пути введения, что и при исследовании индукции, сравнивали плацебо с ведолизумабом при введении доз раз в четыре недели, и плацебо с ведолизумабом при введении доз раз в восемь недель. Конечной точкой этих исследований была неделя 52, когда проводился анализ индукции в популяции, вырабатывающей ответ.
Образцы крови брали для измерения концентрации ведолизумаба на протяжении исследований. Средняя концентрация ведолизумаба в сыворотке в конце индукционной фазы составляла от 20 до 30 мкг/мл. Средние остаточные концентрации ведолизумаба в сыворотке в состоянии равновесия после вве-денния дозы 300 мг 30 мин. внутривенной (IV) инфузией составляли от 9 до 13 мкг/мл для схемы q8wks (раз в 8 недель) и от 35 до 40 мкг/мл для схемы q4wks (раз в 4 недели). В конце инфузии, медианные концентрации ведолизумаба в плазме составляли от 98 до 101 мкг/мл для схемы q8wks и примерно от 129 до 137 мкг/мл для схемы q4wks.
Краткие сведения о реакции на исследования индукции и поддержания приведены в табл. 44-47. Клинический ответ, ремиссия и заживление слизистой к неделе 6 были достигнуты у значительно большей части пациентов, получавших лечение ведолизумабом, по сравнению с плацебо (табл. 44). В фазе индукции 39% ITT-популяции (intent-to-treat - все включённые в исследование пациенты, принявшие хотя бы одну дозу того или иного препарата) имели предшествовавшую неудачу анти-ФНОа терапии. Показатели клинического ответа и ремиссии были более высокими у пациентов, получавших ведолизу-маб, по сравнению с плацебо, как для пациентов с предшествовавшей неудачей анти-ФНО терапии, так и для пациентов без предшествовавшей экспозиции анти-ФНО. В предварительных анализах до недели 6, показатели частоты нежелательных эффектов (АЕ), серьезных АЕ и нежелательных эффектов, приводящих к прекращению участия в исследованиях, были более высокими в группе плацебо, чем в группе ве-долизумаба. У значительно большей части пациентов, получавших ведолизумаб, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо, были достигнуты клиническая ремиссия, заживление слизистой и ремиссия без использования кортикостероидов к неделе 52, и длительный ответ и ремиссия (табл. 45). У 32% популяции исследований поддержания наблюдалась предшествующая неудача анти-ФНОа терапии. Показатели клинической ремиссии и длительного клинического ответа для ведолизумаба были выше, чем для плацебо, как у пациентов с неудачей ФНО-терапии, так и у пациентов, не получавших ФНО. В популяции исследований безопасности (N=895) для недель 0-52, показатели нежелательных эффектов (АЕ), серьезных АЕ и серьезных инфекций были близкими для групп ведолизумаба и плацебо. Не наблюдалось увеличения частоты оппортунистических или кишечных инфекций в группе ведолизумаба.
Длительный
15,8
46,5
42,5
30,7
11,8,
клинический ответ
26,7
49,6
(%)
7,5,
45,9
Пациенты без экспозиции анти-ФНО-а антагонистом (60%)
Плацебо
VDZ
VDZ
Разница
95% СI
N=79
Q8wks
Q4wks
Q8wks vs. плацебо
N=72
N=73
Q4wks vs. плацебо
Клиническая
19,0
45,8
47,9
26,8
12,4,
ремиссия(%)
29,0
41,2
14,6,
43,3
Длительный
26,6
65,3
56,2
38,7
24,0,
клинический ответ
29,6
53,4
(%)
14,6,
44,6
Пример 18. Индукция и поддержание ответа и ремиссия у пациентов с болезнью Крона с от умеренной до тяжелой степенью активности
Единые исследования, включающие два рандомизированных двойных слепых многоцентровых исследования, предназначенные для оценки индукции и поддержания ответа и ремиссии у пациентов с болезнью Крона с от умеренной до тяжелой степенью активности. Демографические показатели и характеристики болезни базовой линии были сопоставимыми для всех групп лечения.
Исследования индукции, с использованием внутривенного введения, сравнивали плацебо с ведоли-зумабом, для 300 мг дозы, восстановленной из лиофилизированной композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при pH 6,3, с конечной точкой в неделю 6 после 2 доз ведолизумаба.
Исследования поддержания, с использованием той же композиции и пути введения, что и при исследовании индукции, сравнивали плацебо с ведолизумабом при введении доз раз в четыре недели, и плацебо с ведолизумабом при введении доз раз в восемь недель. Конечной точкой этих исследований была неделя 52, когда проводился анализ индукции в популяции, вырабатывающей ответ.
Неожиданно, данные исследования показали, что группы Q4 и Q8 недель дали очень схожие результаты. Сведения об ответах, наблюдавшихся в исследованиях индукции и поддержания, приведены в табл. 48-51. Значительно большая часть пациентов, получавших лечение ведолизумабом, достигала клинической ремиссии и повышенного ответа, по сравнению с плацебо (табл. 48). Показатели клинической ремиссии и повышенного ответа были более высокими у пациентов, получавших ведолизумаб, по сравнению с плацебо, как для популяции с предшествующей неудачей анти-ФНО терапии, так и для пациентов без предшествующей экспозиции анти-ФНО. Частота нежелательных эффектов (АЕ), серьезных АЕ и серьезных инфекций была схожей для групп ведолизумаба и плацебо. Не наблюдалось увеличения частоты случаев оппортунистических или кишечных инфекций в группе ведолизумаба.
Таблица 48. Результаты исследования индукции - Первичные и вторичные конечные точки
Конечные точки
Плацебо N=148
Ведолизумаб N=220
Скорректированная разница/RR
Клиническая ремиссия (%)
6,8%
14,5%
7,8%/2,1
0,0206
Повышенный ответ
(%)
25,7%
31,4%
5,7%/1,2
0,2322
Среднее изменение CRP (мкг/мл)
-3,6 N=147
-2,9 N=220 0,9288
популяция
Пациенты с предшествующей неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом (51%)
Конечная точка
Плацебо N=78
VDZ Q8Wks N=82
VDZ Q4Wks N=77
Разница Q8wks vs. плацебо Q4 wks vs. плацебо
95% СI
Клиническая ремиссия (%)
12,8
28,0
27,3
15,2 14,5
(3,0, 27,5) (2,0, 26,9)
Повышенный ответ
(%)
20,5
29,3
37,7
8,8 17,1
(-4,6, 22,1) (3,1, 31,2)
Пациенты без экспозиции анти-ФНО-а антагонистом (45%)
Плацебо N=71
VDZ Q8wks N=66
VDZ Q4wks N=71
Разница Q8wks vs. плацебо Q4wks vs. плацебо
95% СI
Клиническая ремиссия (%)
26,8
51,1
46,5
24,8 19,7
(8,9, 40,6) (4,2, 35,2)
Повышенный ответ
(%)
38,0
60,6
53,5
22,6 15,5
(6,3, 38,9) (-0,7, 31,7)
Пример 19. Индукция ответа и ремиссии у пациентов с болезнью Крона от умеренной до тяжелой степени активности
Были проведены рандомизированные двойные слепые многоцентровые исследования с контролем по плацебо для оценки эффекта индукции ведолизумаба при дозе 300 мг (восстановлена из композиции 60 мг/мл антитела в 50 мМ гистидина, 125 мМ аргинина, 0,06% полисорбата 80, 10% сахарозы, при рН 6,3, лиофилизированной), у пациентов с неудачей терапии ФНОа антагонистом в неделю 6 (после 2 доз -недели 0 и 2) и в неделю 10 (после 3 доз). Исследование состояло из 416 пациентов, 75% которых имели неудачи терапии ФНОа антагонистом и 25% которых не получали ранее ФНОа. Демографические показатели и сопутствующие лекарственные препараты для лечения IBD были сбалансированы по группам
лечения. Характеристики болезни базовой линии также были сбалансированы по группам лечения, за исключением активности болезни базовой линии.
Первичной конечной точкой, запланированной в данных исследованиях, была ремиссия через 6 недель (%) в популяции с неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом. Ключевыми вторичными конечными точками, подлежащими оценке (последовательная процедура проверки) были: ремиссия на неделе 6 (%) для общей популяции, ремиссия на неделе 10 (%) для популяции с неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом и общей популяции (с использованием процедуры Хохберга), устойчивая ремиссия в недели 6 и 10 (%) для популяции с неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом и общей популяции (с использованием процедуры Хохберга) и повышенный ответ в неделю 6 (%) для популяции с неудачей терапии анти-ФНО-а антагонистом.
Исследования показали, что пациентам с неудачей терапии антагонистами ФНО-а требовалось 3 дозы для индуцицирования ремиссии.
Показатели ремиссии у пациентов с неудачей терапии антагонистами ФНО-а возрастали в период между неделей 6 и неделей 10, но только для группы ведолизумаба (не плацебо). Показатели ремиссии для пациентов, не получавших ранее антагонисты ФНО-а, существенно не возрастали в период между неделями 6 и 10. В популяции с неудачей терапии антагонистами ФНО-а с высокой степенью тяжести болезни, у 43% ответ на антагонист ФНО-а не вырабатывался вообще, и у 45% ответ был утерян.
Пример 20. Стабильность
Различны композиции анти-ос4(37 антител были испытаны на стабильность на протяжении от 6 до 24 месяцев при 5°C (табл. 6 и 7). Композиции, имеющие pH 6,0-6,2, продемонстрировали приблизительно менее 4% деградации главной изоформы через 6 и через 24 месяца.
Различные композиции анти-ос4(37 антител были испытаны на стабильность при проведении измерений методом эксклюзионной хроматографии (SEC) на протяжении до 24 месяцев (табл. 4 и 5). Композиции с концентрацией белка 60 мг/мл, содержащие 25 мМ цитрата, демонстрировали изменение содержания агрегатов на 0,1-0,2% через 2 года, в то время как композиции, содержащие 160 мг/мл белка и 25 мМ цитрата, продемонстрировали увеличение содержания агрегатов приблизительно на 0,3% за 2 года. В композициях, содержащих 60, 110 или 160 мг/мл белка без цитрата, наблюдалось увеличение содержания агрегатов на 0,6-1,1%. В испытанных композициях, содержащих цитрат, но не содержащих гистидин, через 12 и 24 месяцев, наблюдалось увеличение содержания агрегатов приблизительно на 0,3-0,4%.
Пример 21. Определение эффекта ведолизумаба на соотношение CD4:CD8
Здоровые субъекты в возрасте 18-45 лет получали разовую дозу 450 мг ведолизумаба, восстановленного из лиофилизированной композиции в 10% сахарозе и разбавленного в системе для инфузии 0,9% солевым раствором. Спинномозговую жидкость (СМЖ) брали люмбальной пункцией до (базовая линия) и через 5 недель после разовой дозы 450 мг ведолизумаба. Каждый субъект служил своим собственным контролем.
Момент времени 5 недель был выбран на основании предыдущих исследований, продемонстрировавших, что пациенты с рассеянным склерозом (MS), получавшие лечение натализумабом, продемонстрировали эффекты на соотношение CD4+:CD8+ лимфоцитов в спинномозговой жидкости (СМЖ) и уменьшение числа поражений мозга после всего лишь одной дозы (Stove et al. Arch Neurol, 2006; 63:1383-1387; Stuve et al. Ann Neurol. 2006;59:743-747. Miller et al. N Engl J Med. 2003;348(1): 15-23); а также потому, что через 5 недель доза 450 мг ведолизумаба была достаточной для насыщения мишени и обеспечения концентрации в сыворотке, превышающей расчетные остаточные уровни в состоянии равновесия, ассоциированные с режимом дозирования фазы 3 300 мг раз в 4 недели.
Приблизительно 15 мл СМЖ было получено от каждого субъекта для проведения иммунофеноти-пирования. Образцы СМЖ включались в анализы, если они удовлетворяли следующим критериям: <10 красных кровяных клеток (КТ^)/мкл образца (для минимизации загрязнения периферической кровью); отрицательный результат культивации СМЖ; достаточное число Т-лимфоцитов в каждом образце для проточной цитометрии; и отсутствие детектируемых сывороточных антител к ведолизумабу.
Медианное значение для недели 5 (34,80 мкг/мл) и концентрации ведолизумаба в сыворотке для индивидуальных субъектов (диапазон значений 24,9-47,9 мкг/мл) были более высокими, чем прогнозируемые остаточные концентрации в состоянии равновесия (-24 мкг/мл) для режима дозирования фазы 3. Высокие степени насыщения (> 90%) ос4(37 рецепторов наблюдались в неделю 5, по результатам измерений MAdCAM-1-Fc, что указывает на насыщение ведолизумабом его мишени в момент проведения оценки конечной точки.
Ведолизумаб не детектировался ни в одном образце СМЖ (предел обнаружения = 0,125 мкг/мл). Эффект на число и соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов
Ведолизумаб не снижал значительно соотношение CD4+:CD8+ (табл. 56). Ни у одного из субъектов не наблюдалось после введения дозы величины соотношения CD4+:CD8+ <1 (р <0,0001 (1-сторонний t-критерий)). Ведолизумаб не снижал значительно число CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов в СМЖ. Кроме того, не наблюдалось значительных изменений в % CD4+ и % CD8+ Т-лимфоцитов в СМЖ (табл. 57). Также не наблюдалось значительных изменений лейкоцитов (WBC), CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов памяти в периферической крови (табл. 58).
Таблица 56. Эффект терапии на соотношение CD4+:CD8+ в СМЖ (оцениваемая популяция, п=13)
Базовая линия
Неделя 5
Разница соотношения CD4+:CD8+t
Среднее соотношение CD4+:CD8+ (SE, ст.ошибка) Диапазон значений
3,59 (0,273) 1,53-5,67
3,60 (0,265)* 1,42-5,15
0,01 (0,197)
90% 2-сторонний CI для соотношения
3,00-4,19
3,132, 4,077
90% 2-сторонний CI для разницы
-0,337, 0,363
CI = доверительный интервал
*р <0,0001 (односторонний t-критерий для одного образца для Н0:и <1 vs. Н1:ц> 1).
1" Разница определяется как разность значений соотношения для недели 5 и для базовой линии
Ведолизумаб не влияет на результаты подсчета клеток CD4+ и CD8+ в СМЖ или соотношение CD4+:CD8+ у здоровых добровольцев после разовой дозы 450 мг. Ни у кого из субъектов не наблюдалось снижения соотношения CD4+:CD8+ в СМЖ после введения дозы до значения менее 1. Ведолизумаб не детектировался в СМЖ. Кроме того, не наблюдалось изменений общего числа лейкоцитов (WBC) или подмножеств CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов памяти в периферической крови. Насыщение мишени (а4|37) в крови было определено для всех субъектов на момент оценки конечной точки. Уровни и соотношение CD4+ и CD8+ лимфоцитов в СМЖ были близки к значениям, ранее описанным в литературе.
Эти результаты согласуются с отсутствием влияния ведолизумаба как на физиологический противоопухолевый иммунитет ЦНС, так и на патологическое воспаление ЦНС обезьян.
Хотя настоящее изобретение было конкретно проиллюстрировано и описано со ссылками на предпочтительные варианты его исполнения, квалифицированным специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные изменения по форме и в деталях могут быть выполнены в настоящем изобретении без выхода за пределы объема изобретения, ограниченные приложенной формулой изобретения.
Фиг. 3
Легкая цепь зрелого гуманизированного LDP-02
Фиг. 4
Константная область родовой человеческой каппа-легкой цепи
Фиг. 4
Константная область родовой мышиной каппа-легкой цепи
Упоминается на странице 31 SYWMH
CDR1 тяжелой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 31 EIDPSESNTNYNQKFKG
CDR2 тяжелой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 31 GGYDGWDYAIDY
CDR3 тяжелой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 31 RSSQSLAKSYGNTYLS
CDR1 легкой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 31 GISNRFS
CDR2 легкой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Упоминается на странице 31 LQGTHQPYT
CDR3 легкой цепи мышиного АСТ-1 антитела
Фиг. 7
Вариабельная область каппа-легкой цепи человеческого GM607 CL антитела
Фиг. 7
Вариабельная область тяжелой цепи человеческого 21/28 СL антитела
Список последовательностей
<110> МИЛЛЕННИУМ ФАРМАЦЕВТИКАЛС, ИНК
<120> КОМПОЗИЦИЯ АНТИ-АЛЬФА-4-БЕТА-7 АНТИТЕЛА
<130> 079259-0603
<140> <141>
<150> 61/544,054 <151> 2011-10-06
<150> 61/481,522 <151> 2011-05-02
<160> 15
<170> Patentln version 3.5
<2Ю> 1 <211> 1445 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание: "Описание искусственной последовательности: синтетически: полинуклеотид"
agccgcggga
ggagcagtac
aacagcacgt
accgtgtggt
cagcgtcctc
accgtcctgc
1020
accaggactg
gctgaatggc
aaggagtaca
agtgcaaggt
ctccaacaaa
gccctcccag
1080
cccccatcga
gaaaaccatc
tccaaagcca
aagggcagcc
ccgagaacca
caggtgtaca.
1140
ccctgccccc
atcccgggat
gagctgacca
agaaccaggt
cagcctgacc
tgcctggtca
1200
aaggcttcta
tcccagcgac
atcgccgtgg
agtgggagag
caatgggcag
ccggagaaca
1260
actacaagac
cacgcctccc
gtgctggact
ccgacggctc
cttcttcctc
tacagcaagc
1320
tcaccgtgga
caagagcagg
tggcagcagg
ggaacgtctt
ctcatgctcc
gtgatgcatg
1380
aggctctgca
caaccactac
acgcagaaga
gcctctccct
gtctccgggt
aaataatcta
1440
gag с a
1445
<21Q> 2 <211> 470 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание: "Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид"
<400> 2
Met Gly Trp Ser Cys lie He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
15 10 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu
50 55 60
Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
<210> 3 <211> 751 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание: "Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид"
<400> 3 gaattctcga
gatcgatctc
accatgggat
ggagctgtat
catcctcttc
ttggtagcaa
cagctacagg
tgtccactcc
gatgtagtga
tgactcaaag
tccactctcc
ctgcctgtca
120
cccctggaga
accagcttct
atctcttgca
ggtctagtca
gagtcttgca
aagagttatg
180
ggaacaccta
tttgtcttgg
tacctgcaga
agcctggcca
gtctccacag
ctcctcatct
240
atgggatttc
caacagattt
tctggggtgc
cagacaggtt
cagtggcagt
ggttcaggga
300
cagatttcac
actcaagatc
tcgcgagtag
aggctgagga
cgtgggagtg
tattactgct
360
tacaaggtac
acatcagccg
tacacgttcg
gacaggggac
caaggtggag
atcaagcgta
420
cggtggctgc
accatctgtc
ttcatcttcc
cgccatctga
tgagcagttg
aaatctggaa
480
ctgcctctgt
tgtgtgcctg
ctgaataact
tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga
540
aggtggataa
cgccctccaa
tcgggtaact
cccaggagag
tgtcacagag
caggacagca
600
aggacagcac
ctacagcctc
agcagcaccc
tgaccctgag
caaagcagac
tacgagaaac
660
acaaagtcta
cgcctgcgaa
gtcacccatc
agggcctgag
ctcgcccgtc
acaaagagct
720
tcaacagggg
agagtgttag
tctagagcag
751
<210> 4 <211> 238 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание: "Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 4
Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
IS 10 15
Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu
35 40 45
Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gin Lys Pro
50 55 60
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Leu Gin Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly
210 215 220
1. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина а4(37 с молекулой-1 адгезии клеток мукозального адрессина (MAdCAM-1), содержащая по меньшей мере 140 мг/мл анти-а4В7 антитела, цитрат или ЭДТА, аргинин, гистидин и поверхностно-активное вещество,
причем анти-сс4Р7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.
2. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.1, где молярное соотношение анти-сс4Р7 антитела к цитрату составляет от 1:4 до 1:100.
3. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.1, где молярное соотношение цитрата к поверхностно-активному веществу составляет от 3:1 до 156:1.
4. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина сс4Р7 с MAdCAM-1, содержащая по меньшей мере 140 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, цитрат, гистидин, аргинин и полисорбат 80, причем анти-сс4Р7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.
5. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина сс4Р7 с MAdCAM-1, содержащая смесь анти-сс4Р7 антитела, цитрата, гистидина, аргинина и полисорбата 80, где молярное соотношение полисорбата 80 к анти-сс4Р7 антителу составляет 0,7:1 до 2,0:1, причем анти-сс4Р7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10.
6. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация цитрата составляет от 20 до 30 мМ.
7. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация полисорбата 80 составляет от 0,1 до 0,3%.
8. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация аргинина составляет от 50 до 150 мМ.
9. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация гистидина составляет от 25 до 65 мм.
10. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, где анти-сс4Р7 антитело представляет собой гуманизированное антитело.
11. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислоты 20-140 SEQ ID NO:2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или 21-132 SEQ ID NO: 5.
12. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция имеет pH от 6,1 до 7,0.
13. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция имеет pH от 6,5 до 6,8.
14. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая > 95% анти-сс4Р7 антитела в мономерной форме.
15. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая < 5% агрегатов антитела.
16. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина сс4Р7 с MAdCAM-1, содержащая от 150 до 180 мг/мл анти-сс4Р7 антитела, от 5 до 50 мМ цитрата, от 10 до 75 мМ гистидина, от 0,01 до 0,5% полисорбата 80 и от 50 до 150 мМ аргинина, где анти-сс4Р7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, и где композиция имеет pH от 6,1 до 6,9.
17. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация гистидина составляет от 25 до 65 мМ.
18. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация аргинина составляет 125 мМ.
19. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация цитрата составляет от 20 до 30 мМ.
20. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.16, где композиция имеет pH от 6,2 до
6,8.
21. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция для ингибирования связывания интегрина ос4Р7 с MAdCAM-1, содержащая от 150 до 180 мг/мл анти-ос4Р7 антитела, 25 мМ цитрата, 50 мМ гистидина, 0,2% полисорбата 80 и 125 мМ аргинина, причем анти-ос4Р7 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, и где композиция имеет pH от 6,2 до 6,8.
22. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по п.21, содержащая 160 мг/мл антитела.
23. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по пп.16-22, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислоты 20-140 SEQ ID NO: 2 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислоты 20-131 SEQ ID NO: 4 или 21-132 SEQ ID NO: 5.
24. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой анти-ос4Р7 антитело представляет собой ведолизумаб.
25. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, которая содержит менее чем около 1,0% агрегатов антитела после 12 месяцев хранения при 25°С.
26. Способ ингибирования связывания интегрина ос4Р7 с MAdCAM-1, которое вызывает определенное заболевание или расстройство у пациента, включающий введение фармацевтической композиции по любому из предшествующих пунктов в эффективном количестве.
27. Способ по п.26, где указанное заболевание или расстройство представляет собой воспалительную болезнь кишечника, причем анти-ос4Р7 антитело вводят пациенту в соответствии со следующим режимом дозирования:
(a) индукционная фаза, включающая начальную дозу 300 мг антитела, которую вводят на неделе 0 пациенту с последующей дозой 300 мг антитела, которую вводят пациенту через две недели после начальной дозы; и
(b) поддерживающая фаза, включающая введение 108 мг антитела пациенту каждые две недели после индукционной фазы;
где режим дозирования вызывает клинический ответ и клиническую ремиссию воспалительной болезни кишечника у пациента.
28. Способ по п.26 или 27, где у пациента отмечается недостаточный до адекватного ответ, потеря ответа на лечение или непереносимость лечения по меньшей мере одним препаратом, выбранным из им-муномодулятора, антагониста фактора некроза опухоли-альфа или их комбинации.
29. Способ по п.26 или 27, где режим дозирования приводит к уменьшению, прекращению или уменьшению и прекращению применения кортикостероидов пациентом.
30. Способ по п.26 или 27, где дозы вводят подкожно или внутримышечно.
Новая ДНА LDP02 тяжелая цепь - содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные буквы) и лидерную последовательность (строчные)
gaattctcgagatcgatCTCACCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccag
gtgCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA
GGTGTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCATTGGG
TGAGGCAGGCGCCTGGCCAACGTCTAGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTC
TGAGAGTAATACTAACTACAATCAAAAATTCAAGGGACGCGTCACATTGACT
GTAGACATTTCCGCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCTG
AGGACACTGCGGTCTACTATTGTGCAAGAGGGGGTTACGACGGATGGGACTA
TGCTATTGACTACTGGGGTCAAGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCA
CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG
GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA
CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC
TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCT
CCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG
CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC
ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCC
TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT
GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGC
Фиг. 1А
AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAtaatctagagca
Новый белок LDP02 тяжелая цепь (промежуток между VHL, VH и человеческий lgG1-FcRmut) MG WS CIILF LVATATG VH S
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDP SESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDY AIDYWGQGTLVT VS S
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQ S S GLYSL S SWT VP S S S LGTQT YICN VNHKP SNTKVDKKVEPKS CDKTHTCP
PCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPP VLD SDGSFFLY SICLT VDKS RWQQ GN VF S С S VMHE ALHNH YTQKSL SL S
PGK
Фиг. 1В
Новая ДНК LDP02 легкая цепь - содержит сайты клонирования (строчные буквы), последовательность Козака (прописные) и лидерную последовательность (строчные)
gaattctcgagatcgatCTCACCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgat
GTAGTGATGACTCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCCTGGAGAACCAGC
TTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGCAAAGAGTTATGGGAACACCT
ATTTGTCTTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCTAT
GGGATTTCCAACAGATTTTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTT
CAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCTCGCGAGTAGAGGCTGAGGACGTGGG
AGTGTATTACTGCTTACAAGGTACACATCAGCCGTACACGTTCGGACAGGGG
ACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC
GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGA
ATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT
CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG
CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAA
CACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA
CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTtagtctagagcagc
Новый белок LDP02 легкая цепь (промежуток между VKL, VK и человеческой С-каппа) MGWSCIILFLVATATGVHS
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYGI SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEI К
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Фиг. 2
попарно newMLN02-no sig LDP-02-no sig.txt
А 1 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQ 50
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I В 1 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQ 50
51 LLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQP 100
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 51 LLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQP 100
101 YTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK 150
101 YTFGQGTKVEIKRADAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK 150
151 VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE 200
151 VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE 200
201 VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 219
201 VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 219
Фиг. 3
попарно Hum kappa-const
MI:Mur kappa-const.txt
A 1 rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsg 50
I I I I • I I I I I I I II II II I II МММ:: МММ • • В 1 radaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqn 50
51 nsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtk 100
I I : I I I I I I I I I : I МММ I : I I : I МММ MM I 51 gvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivk 100
101 sfnrgec 107
I I I I II 101 sfnrnec 107
Фиг. 4
1111(1/12226)
Pvul(11626)v | Hind III (266)
/ EcoR I
BamHI (5892) Hpa I (6055)
pl_KTOK38D
(1590)v
Фиг. 6
-40H-90Arg-1.5PS80-25Cit -@-40H-90Arg-1.5PS80-5Cit
У m
- 40H-90Arg-1.5PS80-5EDTA -н- 40H-90Arg-1.5PS80-25Cys
. 40H-90Arg-1.5PS80-5Cys -А - Контроль: 40H-90Arg-1.5PS80
- 50 Cit-90Arg-1.5PS80
' ^^^^^
0 5 10 15
Время (дней)
Фиг. 8
Прогноз тенденции
Г 0.035-
[ о.оз-
LS5 0.025-
?jo 0.02-
о о
do 0.015-
+1 0.01-
0.005-
I I I I I I I о о о о о о о
СО 00 О СМ CD
I I I I I I г
LOOLOOLOOLOO T- T- CM CN oo
125.9
Концентрация белка (мг/мл)
Фиг. 9 15
Концентрация цитрата (мМ)
4 3.5
3 2.5
2 1.5
0.5 0
-0.5
? кислотные в основные
5.6
5.8
6.2 6.4 6.6 рН при комн.темп.
Фиг. 10
6.8
"#- 160P-50H-25C-1.5PS80-6.44pH -е- 160P-50H-0C-0.7PS80-6.3pH 160P-50H-25C-0.7PS80-6.19pH 160P-50H-0C-1.5PS80-6.0pH
100
200 Дни
Фиг. 12
300
400
Прогноз тенденции
Концентрация белка (мг/мл)
Концентрация аргинина (мМ)
Фиг. 13
Вариабельный участок каппа-легкой цепи антитела GM697'CI
SEQ ID NO: 14
Asp He
Glu Pro Asn Gly
Pro Gin
Asp Arg 65
Ser Arg Leu Gin
Val Met
Ala Ser 20
Tyr Asn 35
Leu Leu
Phe Ser
Val Glu
Thr Pro 100
Thr Gin
Gly Ser 70
Ala Glu
He Ser Tyr Leu He Tyr
Ser Pro Cys Arg
Asp Trp 40
Leu Gly 55
Leu Ser Leu 10
Ser Ser Gin 25
Tyr Leu Gin
Ser Asn Arg
Gly Thr Asp 75
Gly Val Tyr
Gin Gly Thr
105
14А
Pro Val Ser Leu Lys Pro
Ala Ser
Phe Thr Tyr Cys Lys Val
Thr Pro Gly 15
Leu His Ser
Gly Gin Ser Gly Val Pro
Leu Lys He
Met Gin Ala
Glu He Lys
110
Вариабельный участок тяжелой цепи антитела 21/28'CL
SEQ ID NO: 15
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr He Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
Фиг. 14В
Ф Производитель A27G
ф Производитель B27G
- Производитель C27G
О Производитель A27G тонкостенная
Н Производитель B27G тонкостенная
А Производитель C27G тонкостенная у
-А-'-"
• А" О
15 20 25 Вязкость (сП)
Фиг. 16
Прогноз тенденции: Начальное усилие сдвига поршня
Производитель шприца Фиг. 17А
1000 2000 3000
Время (ч) после последней дозы
Фиг. 18
4000
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032625
- 1 -
(19)
032625
- 1 -
(19)
032625
- 2 -
(19)
032625
- 9 -
032625
- 52 -
032625
- 52 -
032625
- 57 -
032625
- 58 -
032625
- 66 -
032625
- 69 -
032625
- 70 -
032625
- 70 -
032625
- 70 -
032625
- 70 -
032625
- 71 -
032625
- 71 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 72 -
032625
- 74 -
032625
- 75 -
032625
- 75 -
032625
- 75 -
032625
- 75 -
032625
- 75 -