|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ получения микросфер на основе сополимера D,L-лактида и гликолида с октреотида ацетатом, предусматривающий: a) растворение октреотида ацетата по меньшей мере в одном органическом растворителе, смешиваемом с водой и содержащем воду, с образованием водной фазы; b) образование эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле-воде в подходящей масляной фазе, содержащей органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида, при этом раствор является не смешиваемым с водной фазой, и при этом органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида охлаждают до 5°С или ниже; c) выпаривание по меньшей мере одного органического растворителя, используемого на стадии (а), из полученной эмульсии с образованием микросфер с помощью контролирования и повышения температуры в ходе стадии выпаривания; контролирование in vivo характеристик высвобождения октреотида ацетата, которые коррелируют с in vitro профилем растворения, путем повышения температуры в ходе стадии выпаривания. 2. Способ по п.1, где органическим растворителем является метанол и при этом добавляют воду. 3. Способ по п.1, где сополимер D,L-лактида и гликолида растворяют в дихлорметане. 4. Способ по п.1, где выпаривание на стадии (с) начинают при температуре выше 15°С и в ходе стадии выпаривания температуру эмульсии повышают до значения более 35°С. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где температуру повышают за период времени от 20 мин до 3 ч. 6. Способ по п.5, где дополнительно осуществляют высушивание в течение длительного периода после периода повышения температуры. 7. Совокупность микросфер, получаемая способом по любому из пп.1-6.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ получения микросфер на основе сополимера D,L-лактида и гликолида с октреотида ацетатом, предусматривающий: a) растворение октреотида ацетата по меньшей мере в одном органическом растворителе, смешиваемом с водой и содержащем воду, с образованием водной фазы; b) образование эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле-воде в подходящей масляной фазе, содержащей органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида, при этом раствор является не смешиваемым с водной фазой, и при этом органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида охлаждают до 5°С или ниже; c) выпаривание по меньшей мере одного органического растворителя, используемого на стадии (а), из полученной эмульсии с образованием микросфер с помощью контролирования и повышения температуры в ходе стадии выпаривания; контролирование in vivo характеристик высвобождения октреотида ацетата, которые коррелируют с in vitro профилем растворения, путем повышения температуры в ходе стадии выпаривания. 2. Способ по п.1, где органическим растворителем является метанол и при этом добавляют воду. 3. Способ по п.1, где сополимер D,L-лактида и гликолида растворяют в дихлорметане. 4. Способ по п.1, где выпаривание на стадии (с) начинают при температуре выше 15°С и в ходе стадии выпаривания температуру эмульсии повышают до значения более 35°С. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где температуру повышают за период времени от 20 мин до 3 ч. 6. Способ по п.5, где дополнительно осуществляют высушивание в течение длительного периода после периода повышения температуры. 7. Совокупность микросфер, получаемая способом по любому из пп.1-6.
Евразийское 032580 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201691884
(22) Дата подачи заявки 2014.03.31
(51) Int. Cl. A61K9/16 (2006.01) A61K31/00 (2006.01)
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАГРУЖЕННЫХ ОКТРЕОТИД АЦЕТАТОМ МИКРОСФЕР НА ОСНОВЕ PLGA С ХАРАКТЕРИСТИКАМИ КОНТРОЛИРОВАННОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ
(43) 2017.02.28
(86) PCT/EP2014/000858
(87) WO 2015/149820 2015.10.08
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ФАРМАТЕН С.А. (GR)
(72) Изобретатель:
Каравас Евангелос, Кутрис Эфтимиос, Миниоти Катерина, Хайтиду Сотириа, Папаниколау Йоргия, Мантурлиас Теофанис (GR)
(74) Представитель:
Носырева Е.Л. (RU)
(56) WO-A1-0110414
WO-A2-2005110369 US-A1-2010086597 US-B1-6902743 US-B1-6913767
JEYANTHI R. ET AL.: "Effect of solvent removal technique on the matrix characteristics of polylactide/glycolide microspheres for peptide delivery", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 38, no. 2, 1 February 1996 (1996-02-01), pages 235-244, XP004037409, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/0168-3659(95)00125-5, abstract, point 2.2
MEHTA R.C ET AL.: "BIODEGRADABLE
MICROSPHERES AS DEPOT SYSTEM FOR
PARENTERAL DELIVERY OF PEPTIDE DRUGS",
JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 29,
no. 3, 1 March 1994 (1994-03-01), pages
375-384, XP000442702, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/0168-3659(94)90082-5, page 377, left
column, figures 2-3
(57) Способ получения микросфер из биоразлагаемого сополимера D,L-лактида и гликолида, содержащих октреотид ацетат в качестве активных фармацевтических ингредиентов.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к получению биоразлагаемых микросфер из сополимера Б,Ь-лактида и гли-колида "PLGA", содержащих пептидные активные фармацевтические ингредиенты, и к достижению характеристик контролированного высвобождения. В частности, настоящее изобретение относится к способу экстракции/выпаривания эмульсионного растворителя, где высвобождение пептида из полимерной матрицы контролируется температурным профилем в ходе стадии выпаривания растворителя.
Сведения о предшествующем уровне техники
Пептидные лекарственные средства обычно вводят системно, например парентерально, из-за их плохой пероральной абсорбции и высокой нестабильности в желудочном соке. Однако парентеральное введение может быть болезненным и вызывать дискомфорт, особенно при многократных ежесуточных введениях. Для сведения к минимуму числа инъекций пациенту лекарственное вещество предпочтительно вводить в виде состава депо. Было предложено парентеральное введение пептидных лекарственных средств в виде состава депо в биоразлагаемом полимере, например в виде микросфер или имплантатов, обеспечивающее их длительное высвобождение после времени удерживания в полимере, который защищает пептид от ферментативных и гидролитических влияний биологической среды. Общим недостатком инъекционных составов депо является колебание уровней в плазме крови, таких как высокие пиковые уровни, которые вызывают нежелательные фармакологические побочные реакции, наряду с уровнями в плазме крови, близкими к нулю, в течение периода полного высвобождения. Трудно достигать терапевтически релевантный уровень в крови в течение продолжительного периода времени, и редко обеспечиваются удовлетворительные профили высвобождения пептидов.
Установленные факторы, которые контролируют характеристики высвобождения пептидов из парентерального депо в форме микросфер из PLGA, включают в себя форму пептида (т.е. свободный пептид, форму соли), тип полимера (т.е. молекулярную массу, отношение лактида к гликолиду, линейную или разветвленную структуру, концевые группы), загрузку лекарственным средством, размер частиц и пористость частиц, а также распределение лекарственного средства в полимерной матрице (патент США № 5538739).
На рынке имеются несколько коммерческих лекарственных составов длительного высвобождения из микросфер. Sandostatin LAR(r) является коммерческим доступным парентеральным составом депо, содержащим активный пептид октреотида ацетат. Он назначается, в частности, для длительной поддерживающей терапии пациентов с акромегалией, а также для лечения тяжелой диареи и гиперемии, ассоциированной со злокачественными карциноидными опухолями и опухолями, связанными с вазоактив-ным интестинальным пептидом (ВИПомами). Утвержденный в дозах 10, 20 и 30 мг (и до 40 мг для пациентов с акромегалией в некоторых странах, таких как Япония) Sandostatin LAR(r) предусматривает внут-риягодичную инъекцию один раз в месяц. Фармакокинетический профиль октреотида после инъекции Sandostatin LAR(r) отражает профиль высвобождения из полимерной матрицы и ее биоразложение. После однократной внутримышечной инъекции людям концентрация октреотида достигает временного начального пика через 1 ч после введения, а затем за 24 ч непрерывно снижается до низкого невыявляемого уровня. После такого начального высвобождения в день 1 октреотид сохраняется на субтерапевтических уровнях у большинства пациентов в течение следующих 7 дней. После этого концентрация октреотида снова повышается и на приблизительно день 14 (через приблизительно 2-3 недели после инъекции) достигает уровней плато, которые сохраняются на протяжении следующих 3-4 недель, затем следует период снижения в течение 6 недель (Summary of product characteristics for Sandostatin LAR(r) 10 mg, 20 mg or 30 mg powder and solvent for suspension for intramuscular injection, 2013). Согласно указанному выше и в соответствии с доступными литературными данными ожидаемый профиль высвобождения для Sandostatin LAR у крыс соответствует тому же паттерну (AAPS PharmSciTech, Vol. 12, No 4 (2011)).
Существует ряд методик для микроинкапсулирования пептидов в микросферах из PLGA. Наиболее широко используемые методики как лабораторного, так и коммерческого получения включают в себя методику фазового разделения/коацервации, высушивание распылением и методику выпаривания одинарной или двойной эмульсии/растворителя (PDA J. Pharm. Sci. and Tech. 2008, 62 125-154; Microencapsulation Methods and Industrial Applications Second Edition).
1. Согласно методике фазового разделения или коацервации водный раствор пептида/белка эмульгируют или, в качестве альтернативы, пептид/белок диспергируют в твердой форме в раствор, содержащий дихлорметан и PLGA. Добавляют кремнийорганическое масло в данную дисперсию при определенной скорости, снижая растворимость полимера в его растворителе. Богатая полимером жидкая фаза (коа-церват) инкапсулирует диспергированные молекулы пептида/белка, и незрелые микросферы подвергают затвердеванию и промывке с использованием гептана. Процесс весьма чувствителен к свойствам полимера, и остаточный растворитель также является важным вопросом.
2. Согласно методике высушивания распылением полимер растворяют в летучем органическом растворителе, таком как дихлорметан или ацетон. Белок суспендируют как твердое вещество или эмульгируют как водный раствор в этом органическом раствор путем гомогенизации. После этого полученную дисперсию распыляют через (нагретую) форсунку в потоке нагретого воздуха. Органический раствори
1.
тель испаряется, тем самым образуя микросферы с размерами, как правило, 1-100 мкм. Микросферы собирают циклонным сепаратором. Для полного удаления органического растворителя далее может следовать стадия вакуумной сушки или лиофилизации. Внутренняя структура полученных полимерных микросфер зависит от растворимости пептида/белка в полимере перед его высушиванием распылением, что приводит к образованию продуктов пористого или матричного типа. Если исходная дисперсия находится в растворе, то конечный продукт, получаемый после высушивания распылением, относится к матричному или монолитному типу, т.е. представляет собой полимерные частицы активного ингредиента с растворимой или диспергируемой природой (определяемый как микросферы). Наоборот, если исходная дисперсия находится в суспензии, то полученный продукт относится к пористому типу, т.е. четкая полимерная пленка/оболочка инкапсулирует жидкое ядро из растворенного активного ингредиента (определяемый как микрокапсулы).
3. Масло-в-воде (o/w) и вода-в-масле-воде (w/o/w) являются двумя водными методиками, предусматривающими образование, соответственно, одинарной и двойной эмульсии при получении микросфер. В данных способах пептиды/белки растворяют в органическом растворителе (например, в спирте) или в водном растворе, а затем смешивают или эмульгируют с органическим раствором (несмешивае-мым с водой) полимера с образованием раствора или эмульсии вода-в-масле (w/o) соответственно. Ди-хлорметан служит органическим растворителем для PLGA, и первичную эмульсию o/w формируют с использованием либо гомогенизации с высоким усилием сдвига, либо обработки ультразвуком. Затем эту первичную эмульсию быстро переносят в избыток водной среды, содержащей стабилизатор, обычно поливиниловый спирт (PVA). Снова требуются гомогенизация или интенсивное взбалтывание для начального образования двойной эмульсии w/o/w. Затем удаление (путем выпаривания) органического растворителя с помощью нагревания, вакуума или и того и другого обеспечивает разделение фаз полимера и ядра с получением микросфер. Вместо выпаривания растворителя также можно предпринять экстракцию растворителя большим количеством воды со стабилизатором или без такового для получения микросфер, содержащих пептид/белок. Хотя методика w/o/w микроинкапсулирования кажется концептуально простой для выполнения, способ образования частиц является достаточно сложным, и множество параметров способа влияют или воздействуют на свойства загруженных пептидом/белком микросфер из PLGA.
До сих пор температурный профиль, используемый в ходе стадии выпаривания в методике выпаривания эмульсии/растворителя, не был определен в качестве критического параметра способа, влияющего на характеристики высвобождения пептида из полимерной матрицы. Наоборот, обычно используется обработка при постоянной температуре, слегка превышающей температуру кипения органического растворителя (или слегка превышающее давление паров растворителя при применении пониженного давления/вакуума для ускорения выпаривания растворителя).
Типичный механизм высвобождения для таких типов составов включает в себя три фазы, которые, как правило, могут быть представлены как фаза начального высвобождения (фаза 1), фаза гидратации (фаза 2) и фаза первичного высвобождения (фаза 3), которая контролируется диффузией, но облегчается разрушением полимерной матрицы. Высвобождение лекарственного средства начинается после времени задержки, когда молекулярная масса полимера падает ниже критического значения, и, таким образом, может происходить потеря массы (Faisant N., Siepmann J., Benoit J.P. PLGA-based microspheres: elucidation of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. Eur. J. Pharm. Sci., 2002 May; 15(4):355-66; Korber M. PLGA erosion: solubility-or diffusion-controlled? Pharm. Res., 2010 Nov; 27(11):2414-20). В данной области существует потребность в улучшенном способе получения с контролем профиля высвобождения пептидного лекарственного средства из полимерной матрицы микросфер.
Краткое описание изобретения
Изобретение относится к методике выпаривания одинарной или двойной эмульсии/растворителя для получения микросфер из PLGA длительного высвобождения, содержащих пептидные лекарственные средства, в частности октреотид, где высвобождение пептида из полимерной матрицы контролируется применяемым температурным профилем в ходе стадии выпаривания растворителя. Другие пептиды включают в себя эксенатид, леупорелин, гозерелин, лираглютид и тедуглютид.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, при котором стадию выпаривания растворителя выполняют при контролируемой температуре, которая повышается в ходе стадии выпаривания для достижения отвердевания микросфер. Полученные микросферы собирают просеиванием, промывают и, наконец, сушат в вакууме на фильтре-осушителе с получением свободно текучего порошка.
Авторы настоящего изобретения в качестве признака настоящего изобретения представляют способ получения микросфер из сополимера D^^ra^^ и гликолида с пептидом, при этом пептид также может находиться в форме фармацевтически приемлемой соли, предусматривающий:
a. растворение пептида или его соли по меньшей мере в одном органическом растворителе, смешиваемом с водой и необязательно содержащем также воду, с образованием водной фазы;
b. образование эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле-воде в подходящей масляной фазе, содержащей органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида, при этом раствор является не смешиваемым с водной фазой;
c. выпаривание по меньшей мере одного органического растворителя, используемого в a., из эмуль-
сии с образованием микросфер с помощью контролирования температуры в ходе стадии выпаривания и повышения температуры в ходе стадии выпаривания.
В следующем аспекте характеристики высвобождения микросфер, что обеспечивается in vitro и in vivo данными, контролируются степенью повышения температуры в ходе стадии выпаривания растворителя. Более конкретно, температуру в ходе выпаривания растворителя повышают с исходной температуры от 15 до 25°С, предпочтительно приблизительно 20°С. Предпочтительно максимальная температура достигает значения не более 38°С или составляет 38°С. Температуру повышают за период времени от 20 мин до 3 ч. Высушивание может продолжаться в течение длительного периода после периода повышения температуры. Предпочтительно скорость повышения температуры составляет 0,1-1°С/мин. Повышение температуры может быть постоянным в течение периода или постадийным. Под "постадийным" подразумевается, что каждое изменение является ступенчатым изменением температуры, а также что температура сохраняется в течение определенного периода до следующего изменения. Также может происходить смешивание постадийных и постоянных изменений температуры в ходе стадии выпаривания.
Термин "характеристики высвобождения" означает профиль растворения составов в способе, который коррелирует с in vivo PK профилем составов у крыс после однократной внутримышечной инъекции. В одном аспекте был установлен тип A in vitro in vivo корреляции между in vitro профилем растворения и in vivo профилем высвобождения, как вычислено по деконволюции кривых концентрации в плазме крови у крыс с использованием однокамерной модели.
Более конкретно, "профиль растворения" относится к количественному значению или количеству октреотида, которое высвобождается из микросфер, как функция времени, в 1 мМ ацетатного буфера, рН 4,0, при 37°С.
Характеристики высвобождения выражают с помощью начального "взрывного" высвобождения (фаза 1), времени задержки (фаза 2) и продолжительности и наклона фазы первичного высвобождения (фаза 3). Более конкретно, профиль растворения описывается следующим уравнением, где постоянная y0 отражает начальное "взрывное" высвобождение, постоянная x0 отражает время задержки, и постоянные a и b описывают фазу первичного высвобождения
% Высвобождения = у0 Н -z т~
1 +эксп.( ^ b Х°> )
Изобретение относится к способу выпаривания эмульсии (одинарной или двойной)/растворителя для получения микросфер из PLGA, содержащих фармацевтический активный пептид, где скорость повышения температуры в ходе стадии выпаривания растворителя используют для контролирования характеристики высвобождения заключенного пептида. Более конкретно, скорость повышения температуры в ходе фазы выпаривания растворителя фаза используют для контролирования времени задержки профиля высвобождения пептида, которое выражается вычисленной постоянной x0 профиля растворения микросфер. Время задержки профиля высвобождения полученных микросфер тестируют в 1 мМ ацетатного буфера, рН 4,0, при 37°С.
Более конкретно, методика выпаривания одинарной эмульсии/растворителя предусматривает следующие стадии (фиг. 1).
i. Октреотид растворяют в соответствующем количестве подходящего растворителя, предпочтительно метанола.
ii. Сополимер D,L-лактида и гликолида, растворяют в дихлорметане и раствор охлаждают до 10°С или ниже, предпочтительно до 5°С или ниже.
iii. Два раствора смешивают вместе при интенсивном взбалтывании с образованием диспергированной указанной масляной фазы.
iv. Водную указанную непрерывную фазу получают путем растворения динатрия гидрофосфата и калия дигидрофосфата в растворе PVA и охлаждения до 10°С или ниже, предпочтительно до 5°С или ниже.
v. Диспергированную и непрерывную фазы смешивают вместе, предпочтительно с использованием встроенного в систему диспергатора с высоким усилием сдвига, с образованием полутвердых микросфер с требуемым распределением размера частиц. Поток непрерывной фазы получают с помощью перистальтического насоса, тогда как отношение непрерывной фазы в потоке получают с помощью шприцевого насоса.
vi. Образовавшиеся микросферы переносят из выпускного отверстия в подходящий сосуд с контролируемой температурой от 15 до 25°С, предпочтительно приблизительно 20°С, при взбалтывании.
vii. Отвердевания микросфер достигают постепенным повышением, как описывается в данном документе.
viii. После нескольких часов общего высушивания, приблизительно 4 ч, высушенные микросферы переносят на фильтр-осушитель.
ix. Частицы промывают на фильтре-осушителе водой, предпочтительно при комнатной температуре, а после осушения микросферы оставляют сохнуть в течение по меньшей мере 12 ч, предпочтительно
vii.
24 ч, предпочтительно при давлении 10 мбар и осторожном взбалтывании.
Соответственно, методика выпаривания двойной эмульсии/растворителя предусматривает следующие стадии (фиг. 2).
i. Октреотид растворяют в соответствующем количестве воды.
ii. Сополимер D,L-лактида и гликолида растворяют в дихлорметане и раствор охлаждают до 10°С или ниже, предпочтительно до 5°С или ниже.
iii. Два раствора эмульгируют, предпочтительно при 20000 rpm в течение 1 мин, с использованием цифрового диспергатора Т25 ULTRA-TURRAX с верхним расположением, образуя диспергированную указанную масляную фазу, и охлаждают до 10°С или ниже, предпочтительно до 5°С или ниже.
iv. Водную непрерывную фазу получают путем растворения динатрия гидрофосфата и калия дигид-рофосфата в растворе PVA и охлаждения до 10°С или ниже, предпочтительно до 5°С или ниже.
v. Диспергированную и непрерывную фазы смешивают вместе, предпочтительно с использованием встроенного в систему диспергатора с высоким усилием сдвига, с образованием полутвердых микросфер с требуемым распределением размера частиц. Поток непрерывной фазы получают с помощью перистальтического насоса, тогда как отношение непрерывной фазы в потоке получают с помощью шприцевого насоса.
vi. Образованные микросферы переносят из выпускного отверстия в сосуд реактора с контролированной температурой от 15 до 25°С, предпочтительно приблизительно 20°С, при взбалтывании.
vii. Отвердевания микросфер достигают постепенным повышением, как описывается в данном документе.
viii. После нескольких часов общего высушивания, приблизительно 4, высушенные микросферы переносят на фильтр-осушитель.
ix. Частицы промывают на фильтре-осушителе водой, предпочтительно при комнатной температуре, а после осушения микросферы оставляют сохнуть в течение по меньшей мере 12 ч, предпочтительно 24 ч, предпочтительно при давлении 10 мбар и осторожном взбалтывании.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1a - схематическая диаграмма способа двойного эмульгирования;
фиг. 1b - схематическая диаграмма способа одинарного эмульгирования;
фиг. 2a - график распределения размера частиц для составов 1а-1с;
фиг. 2b - график распределения размера частиц для составов 2а-2с;
фиг. 3 a - изображения SEM и поперечного сечения SEM составов 1а-1с;
фиг. 3b - изображения SEM и поперечного сечения SEM составов 2а-2с;
фиг. 4a - сравнение профилей растворения Sandostatin EAR и составов 1а-1с;
фиг. 4b - сравнение профилей растворения Sandostatin LAR и составов 2а-2с;
фиг. 5 - профили концентрации в плазме крови крыс Sandostatin LAR и составов 1а и 2с;
фиг. 6a - сравнение in vivo наблюдаемой и рассчитанной по результатам измерений концентрации в плазме крови Sandostatin LAR;
фиг. 6b - сравнение in vivo наблюдаемой и рассчитанной по результатам измерений концентрации в плазме крови состава 1а;
фиг. 6с - сравнение между наблюдаемой и прогнозируемой концентрацией в плазме крови состава
2с.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к составу длительного высвобождения октреотида ацетата с характеристиками высвобождения, контролируемыми путем контролирования и повышения температуры в ходе стадии выпаривания растворителя способа получения.
Октреотид (также известный как (4R,7S,10S,13R,16S,19R)-19-[(2R)-2-амино-3-фенилпропанамидо]-10-(4-аминобутил)-16-бензил-N-[(2R,3R)-1,3-дигидроксибутан-2-ил] -7-( 1 -гидроксиэтил)-13 -(1Н-индол-3 -илметил)-6,9,12,15,18-пентаоксо-1,2-дитиа-5,8,11,14,17-пентаазациклоайкозан-4-карбоксамид, предпочтительно в форме ацетатной соли (или любой другой фармацевтически приемлемой соли) или также известный как 4D-фенилаланил-L-цистеинил-L-фенилаланил-D-триптофил-L-лизил-L-треонил-N-((1R,2R)-2-гидрокси-1-(гидроксиметил)пропил)-L-пистеинамид циклический (2-7)дисульфидацетат (соль) или L-цистеинамид-D-фенилаланил-L-цистеинил-L-фенилаланил-D-триптофил-L-лизил-L-треонил-N-(2-гидрокси-1-(гидроксиметил)пропил)циклический (2-7)дисульфид Д-Д*Д*))ацетат (соль)) представляет собой синтетический октапептидный (DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ол) аналог встречающегося в природе гормона соматостатина и утвержден для применения в контроле опухолей при нейроэндокрин-ных нарушениях, таких как акромегалия, и нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта или поджелудочной железы. Химическая структура октреотида ацетата представлена ниже
Подходящие получаемые коммерческим путем полимеры для использования в получении микросфер из PLGA согласно настоящему изобретению включают в себя без ограничения RESOMER(r) и LAKESHORE BIOMATERIALS от Evonik Industries AG, Expansort(r) от PCAS., PURASORB(r) от PURAC Biochem BV. Полимеры PLGA, используемые в настоящем изобретении, могут иметь отношение молочной кислоты к гликолевой кислоте в диапазоне от приблизительно 50:50 до приблизительно 65:35 и среднюю молекулярную массу (Mw) в диапазоне от 10000 до 70000. Предпочтительно в настоящем изобретении используют PLGA с соотношением мономеров 50:50 и средней молекулярной массой в диапазоне от 30000 до 50000.
Органические растворители для PLGA, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают в себя без ограничения этилацетат, тетрагидрофуран, ацетонитрил, дихлорметан, гексаф-торизопропанол, хлороформ и ацетон. Более предпочтительно, в настоящем изобретении используют дихлорметан. Концентрация полимера в органическом растворителе составляет 10-40 вес.%, наиболее предпочтительно 20-30 вес.%.
Согласно настоящему изобретению октреотида ацетат растворяют в воде для инъекций с получением концентрации 10-40 вес.% и более предпочтительно 25-35 вес.%, в качестве альтернативы, октреотида ацетат растворяют в подходящем органическом растворителе, смешиваемом с водой, предпочтительно в метаноле, с получением концентрации 5-20 вес.%, более предпочтительно 10 вес.%. Необязательно используют органический растворитель, смешиваемый с водой.
Для получения диспергированной фазы раствор октреотида ацетата диспергируют в растворе полимера путем использования диспергатора с высоким усилием сдвига в периодическом режиме, эксплуатируемого при скорости сдвига 15000-30000 с-1. Более предпочтительно используют скорость сдвига 2000025000 с-1. В качестве альтернативы, раствор октреотида ацетата в метаноле добавляют в раствор полимера при взбалтывании. Диспергированную фазу контролируют при температуре ниже 20°С, более предпочтительно 5-10°С.
Согласно настоящему изобретению непрерывная фаза состоит из водного раствора с поверхностно-активным веществом, предпочтительно поливиниловым спиртом (PVA). Примеры других поверхностно-активных веществ, которые необязательно могут быть использованы, включают в себя один или несколько из анионных поверхностно-активных веществ (таких как натрия олеат, натрия стеарат или натрия лаурилсульфат), неионогенных поверхностно-активных веществ (таких как Poloxarners, Tweens), поливинилпирролидона, карбоксиметилцеллюлозы натрия и желатина, используемых независимо или в комбинации. PVA предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу от приблизительно 10000 до приблизительно 150000 Да, что соответствует диапазону вязкости 3-9 сП при измерении в виде 4% водного раствора при 20°С, 85-89% степени гидролиза и эфирном числе 130-150. Выбранные марки PVA, которые используют согласно настоящему изобретению, включают в себя Emprove PVA 4-88 (молекулярная масса 25000-30000; вязкость 4% в воде: 3,4-4,6 сП), PVA 8-88 (Mw приблизительно 65000; вязкость 4% раствора в воде 6,8-9,2 сП) и PVA 18-88 (Mw приблизительно 130000; вязкость 4% раствора в воде), доступный от Merck KGaA. Количество поверхностно-активного вещества, добавляемого в водную фазу, предпочтительно составляет до 5,0% (мас./мас.) относительно массы водного раствора. Более предпочтительно количество поверхностно-активного вещества (оптимально количество PVA) составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5% мас./мас. Непрерывную фазу термостатируют при температуре ниже 20°С, более предпочтительно 5-10°С.
Согласно настоящему изобретению эмульгирование водной фазы в непрерывной масляной фазе выполняют с помощью одного из следующих средств: i) механическое взбалтывание, ii) диспергатор периодического действия, iii) встроенный в систему диспергатор. Предпочтительно способ эмульгирования осуществляют с помощью встроенного в систему диспергатора МТ-3000, доступного от Kinematica, эксплуатируемого при скорости сдвига 5000-20000 м-1, наиболее предпочтительно в диапазоне 1000015000 с-1, с образованием в результате микросфер 10-250 мкм, наиболее предпочтительно 20-100 мкм. Массовое отношение диспергированной и непрерывной фазы составляет 1:20 - 1:150, более предпочтительно 1:75 - 1:100.
Суспензию образованных микросфер переносят (из выпускного отверстия, находящегося в составе
системы диспергатора) в подходящий сосуд (предпочтительно теплоизолированный для обеспечения контроля температуры), который сначала контролируют при значении выше 15°С, предпочтительно при приблизительно 20°С. Температуру в ходе выпаривания растворителя повышают от исходной температуры от 15 до 25°С, предпочтительно до значения приблизительно 20°С. Предпочтительно максимальная достигаемая температура составляет достигает значения не более 35°С или составляет 38°С. Температуру повышают за период времени от 20 мин до 3 ч. Высушивание может продолжаться в течение длительного периода после периода повышения температуры. Предпочтительно скорость повышения температуры составляет 0,1-1°С/мин. Повышение температуры может быть постоянным за определенный период или постадийным. Под "постадийным" подразумевается, что каждое изменение является ступенчатым изменением температуры, а также, что температура сохраняется в течение определенного периода до следующего изменения. Также может происходить смешивание постадийных и постоянных изменений температуры в ходе стадии выпаривания.
Выпаривание растворителя из микросферы происходит согласно используемому температурному профилю при взбалтывании и частичном вакууме, предпочтительно частичный вакуум немного ниже давления паров дихлорметана.
После выпаривания растворителя затвердевшие частицы собирают из суспензии на фильтре-осушителе при слабом взбалтывании. Предпочтительно используют фильтр-осушитель от PSL (Powder System Limited). Собранные частицы промывают водой, а затем сушат на фильтре-осушителе путем использования вакуума в приблизительно 10 мбар.
Конечные микросферы анализируют на предмет размера частиц, загрузки лекарственным средством, молекулярной массы полимера, остаточного растворителя и in vitro высвобождения, как описывается ниже. Результаты представлены в табл. 1 и 2, а также на фиг. 3-4. Выбранные составы (т.е. 1а и 2с) вместе с эталонным продуктом Sandostatin LAR тестировали на крысах с целью создания in vitro in vivo корреляционной модели. Ниже представлены подробное описание PK исследования и применяемой методики для разработки и осуществления. Результаты in vivo представлены на фиг. 5-6.
Анализ распределения размера частиц (PSD).
Распределение размера частиц измеряли с помощью лазерной дифракции с использованием Malvern Master Sizer 2000 Hydro2000S. Средний размер частиц выражали как среднеобъемный диаметр в микронах.
Определение загрузки лекарственным средством.
Приблизительно 50 мг микросфер полностью растворяли в 10 мл метиленхлорида (30-минутная обработка ультразвуком). Добавляли 20 мл 0,1М ацетатного буфера (рН 4,0) в раствор для экстракции ок-треотида в водную фазу. Две фазы тщательно смешивали с помощью вортекса в течение 5 мин, затем разделяли центрифугированием при 4000 rpm в течение 5 мин. Отбирали образец водной фазы для анализа HPLC с целью измерения содержания октреотида. Образец фильтровали через 0,45-мкм шприцевой фильтр перед анализом. Условия HPLC были следующими: градиент разделения обеспечивали с помощью колонки Inertsil ODS3 (4,6 х 250 мм, размер частиц 5 мкм); подвижная фаза состояла из 0,1% триф-торуксусной кислоты (TFA) в дистиллированной воде (элюент А) и 0,1% TFA в ацетонитриле (элюент В) и прогоняли с линейным градиентом от 20 до 35% элюента В с течение 18 мин. Скорость потока составляла 1,0 мл/мин, объем введенной пробы составлял 10 мкл, и рабочая длина волны детектора составляла
210 нм.
Измерение средней молекулярной массы.
Молекулярную массу микросфер определяли с помощью гель-проникающей хроматографии (GPC) с использованием системы Agilent Model GPC 50Plus, оснащенной 2 колонками PLgel 5 мкм Mixed-D 300 X 7,5 мм, соединенных рядами, и детектором показателя преломления (RI). Подвижная фаза представляет собой THF со скоростью потока 1 мл/мин, а температура колонки составляет 30°С. Для анализа образцов 10-15 мг микросфер растворяют в 5 мл THF и раствор оставляют на ночь при взбалтывании. Извлекают 2 мл, фильтруют через 40-мкм PTFE фильтры и анализируют. Объем вводимой пробы составляет 100 мкл. Данные собирают и анализ выполняют с использованием программного обеспечения Cirrus. Для калибровки используют полистироловые стандарты с диапазоном MW от 162 до 371100.
In vitro способ высвобождения.
Приблизительно 150 мг составленных микросфер помещали в 100-мл бутыль и инкубировали в 30 мл ацетатного буфера (1 мМ, рН 4,0) при 37°С на качалке с водяным термостатом (85 rpm). Отбирали образец среды высвобождения в разные моменты времени, фильтровали через 0,45-мкм шприцевой фильтр и анализировали путем HPLC. Условия HPLC были следующими: градиент разделения обеспечивали с использованием колонки Inertsil ODS3 (4,6 х 250 мм, размер частиц 5 мкм); подвижная фаза состояла из 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в дистиллированной воде (элюент А) и 0,1% TFA в аце-тонитриле (элюент В), и прогоняли с линейным градиентом от 25 до 35% элюента В в течение 25 мин. Скорость потока составляла 0,1 мл/мин, объем введенной пробы составлял 10 мкл, и рабочая длина волны детектора составляла 210 нм.
Остаточные растворители (дихлорметан).
Исследовали удаление этанола и/или метиленхлорида из микрочастиц октреотида. Микрочастицы полностью растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Затем количественно определяли концентрации этанола и метиленхлорида в органическом растворе с помощью газовой хроматографии (GC). Свежие микрочастицы в количестве 90 мг растворяли в 5 мл диметилсульфоксида в сосуде для GC перед паро-фазным анализом с помощью GC. Выпаривания остаточных растворителей достигали путем 30-минутной инкубации образца при 100°С в печи GC. Анализ GC проводили с GC-2010 plus (Shimadzu, Япония). Использовали аналитическую колонку RTX-5 (RESTEK, США) с использованием Crossbond 5% дифенила/95% диметилполисилоксана в качестве стационарной фазы. Количество растворителей измеряли с использованием стандартов калибровочной кривой. Время удерживания дихлорметана составляет 5,75 мин.
Исследования на животных.
Составы микросфер после смешивания с кристаллическим маннитом (т.е. 17% маннита по отношению к общей массе) подвергали стерилизации с помощью УФ-облучения при 365 нм в течение 180 мин с использованием источника УФ-света 6 Вт для использования в фармакокинетических исследованиях на самцах крыс Sprague-Dawley. Крысам (по шесть на группу) весом приблизительно 240-250 г и возрастом 8-12 недель путем инъекции вводили тестируемые составы. Перед инъекцией образцы сухого порошка суспендировали в стерильном растворителе (среде), состоящем из воды для инъекции, натрия карбоки-метилцеллюлозы 0,5 вес.% и маннита 0,6 вес.%. Животным осуществляли одну однократную внутримышечную инъекцию с фиксированной дозой в приблизительно 60 мг состава октреотида (микросфе-ры)/крыса, что соответствовало 3 мг активного вещества октреотида/крыса в объеме 0,25 мл/крыса среды, в одно место. Суспензию вводили посредством иглы для подкожных инъекция 26G внутримышечно в квадрицепс крыс, расположенный на краниальной части бедренной кости. Образцы крови крыс отбирали перед введением дозы лекарственного средства и после него в определенные моменты времени, в том числе через 0,5, 1, 2, 6, 24 ч, в день 3, 7, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56 и день 70 после введения дозы. В каждый момент времени отбирали приблизительно 0,5 мл крови из ретробульбарного сплетения под легкой изофлурановой анестезией и переносили в подписанные пробирки, содержащие 200 мМ K2EDTA в качестве антикоагулянта, и смешивали вручную путем переворачивания 4-5 раз. Образцы крови всегда держали на водном льду и плазму крови отделяли центрифугированием собранных образцов в течение 1 ч. Образцы плазмы хранили при ниже -60°С до биоанализа с использованием одобренного способа LC-
MS/MS.
In vitro in vivo корреляция.
Для разработки модели IVIVC осуществляли следующую процедуру: (1) отбор составов для разных скоростей высвобождения, в том числе Sandostatin LAR, состава 1а и состава 2с, (2) измерение in vitro профилей растворения различными способами растворения, (3) измерение PK in vivo профилей концентрации в плазме для составов (т.е. Sandostatin LA, состава 1a и состава 2с) после однократного внутримышечного введения у крыс, (4) оценивание in vivo профиля высвобождения с помощью измеренных профилей концентрации в плазме крови с использованием методики деконволюции Wagner-Nelson (однокамерная модель), (5) вычисление корреляции между деконволюцией in vivo профиля высвобождения и in vitro профилей растворения с использованием объединенных данных для Sandostatin LAR и состава 1а, (6) выбор подходящего способа растворения с более высокой корреляцией с in vivo данными и установление IVIVC с помощью анализа линейной регрессии (6) внутренняя валидация установленной модели путем сравнения рассчитанных по результатам измерений профилей концентрации в плазме крови с использованием модели конволюции Wagner-Nelson для состава Sandostatin LAR и состава 1а и (7) внешняя валидация установленной модели путем сравнения прогнозируемой концентрации в плазме крови, вычисленной по in vitro профилю растворения состава 2с и установленной модели, и наблюдаемого in vivo профиля концентрации в плазме крови состава 2с.
Пример 1а-с (одинарная эмульсия).
4 г сополимера D,L-лактида и гликолида с молярным соотношением 50:50 (Mw = 41000 и полидисперсностью приблизительно 1,65), коммерчески доступного от PURAC под названием PURASORB 5004А, растворяли в 30 г дихлорметана при взбалтывании магнитной мешалкой. Раствор полимера охлаждали до 5°С. Растворяли 0,2941 г октреотида ацетата в 0,5882 г воды для инъекции при перемешивании. Раствор октреотида ацетата добавляли в раствор полимера и эмульгировали с помощью Ultra Turrax(r) в течение 1 мин при 20000 rpm для образования первой эмульсии (DP - дисперсной фазы), 11,5 г поливинилового спирта EMROVE(r) 18-88 от Merck растворяли в 2307 г воды для инъекций при 80°С, а затем добавляли 17,46 г динатрия гидрофосфата и 4,18 г калия дигидрофосфата. Раствор охлаждали до 5°С с образованием непрерывной фазы (СР). Микросферы с требуемым распределением размера частиц получали путем подачи СР при 2,3 л/мин и DP при 15,6 мл/мин во встроенный в систему диспергатор Kine-matica MT 3000. Суспензию микросфер получали в сосуде стеклянного реактора с двумя оболочками, контролируемом при 20°С, и при интенсивном взбалтывании для удаления растворителя. Температуру в сосуде повышали до 38°С согласно предварительно определенным интервалам времени, как показано в следующей таблице (табл. 1). Через 4 ч микросферы переносили на стеклянный фильтр-осушитель, про
мывали избытком воды комнатной температуры и оставляли в вакууме 10 мбар и при осторожном взбалтывании на 24 ч для сушки.
Таблица 1. Свойства составов 1а-1с
Пример 2а-с (двойная эмульсия).
4 г сополимера D,L-лактида и гликолида с молярным соотношением 50:50 (Mw = 41000 и полидисперсностью приблизительно 1,65), коммерчески доступного от PURAC под названием PURASORB 5004А, растворяли в 30 г дихлорметана при взбалтывании магнитной мешалкой. Раствор полимера охлаждали до 5°С. Раствор полимера стерилизовали фильтрацией через шприцевой фильтр и охлаждали до 5°С. 0,2941 г октреотида ацетат растворяли в 2,941 г метанола при перемешивании. Добавляли раствор октреотида ацетата в раствор полимера и смешивали при взбалтывании с образованием масляной фазы (DP - диспергированная фаза). Растворяли 11,5 г поливинилового спирта EMROVE(r) 18-88 от Merck в 2307 г воды для инъекции при 80°С, а затем добавляли 17,46 г динатрия гидрофосфата и 4,18 г калия ди-гидрофосфата. Раствор охлаждали до 5°С с формированием непрерывной фазы (СР). Микросферы с требуемым распределением размера частиц получали путем подачи СР при 2,3 л/мин и DP при 18,7 мл/мин во встроенный в систему диспергатор Kinematica MT 3000. Суспензию микросфер получали в сосуде стеклянного реактора с двумя оболочками, контролируемом при 20°С, и при интенсивном взбалтывании для удаления растворителя. Температуру в сосуде повышали до 38°С согласно предварительно опреде
ленным интервалам времени, как показано в следующей таблице (табл. 2). Через 4 ч микросферы переносили на стеклянный фильтр-осушитель, промывали избытком воды комнатной температуры и оставляли в вакууме 10 мбар и при осторожном взбалтывании на 24 ч для сушки.
Таблица 2. Свойства составов 2а-2с
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения микросфер на основе сополимера D,L-лактида и гликолида с октреотида ацетатом, предусматривающий:
a) растворение октреотида ацетата по меньшей мере в одном органическом растворителе, смешиваемом с водой и содержащем воду, с образованием водной фазы;
b) образование эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле-воде в подходящей масляной фазе, содержащей органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида, при этом раствор является не смешиваемым с водной фазой, и при этом органический раствор сополимера D,L-лактида и гликолида охлаждают до 5°С или ниже;
c) выпаривание по меньшей мере одного органического растворителя, используемого на стадии (а), из полученной эмульсии с образованием микросфер с помощью контролирования и повышения темпера
a)
туры в ходе стадии выпаривания;
контролирование in vivo характеристик высвобождения октреотида ацетата, которые коррелируют с in vitro профилем растворения, путем повышения температуры в ходе стадии выпаривания.
2. Способ по п.1, где органическим растворителем является метанол и при этом добавляют воду.
3. Способ по п.1, где сополимер D,L-лактида и гликолида растворяют в дихлорметане.
4. Способ по п.1, где выпаривание на стадии (с) начинают при температуре выше 15°С и в ходе стадии выпаривания температуру эмульсии повышают до значения более 35°С.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где температуру повышают за период времени от 20 мин до 3 ч.
6. Способ по п.5, где дополнительно осуществляют высушивание в течение длительного периода после периода повышения температуры.
7. Совокупность микросфер, получаемая способом по любому из пп.1-6.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032580
- 1 -
(19)
032580
- 1 -
(19)
032580
- 9 -
(19)
032580
- 11 -
|
