|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Набор для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, включающий: (a) раствор для разведения образца, включающий от 5 до 100% (м/о) коровьей сыворотки, от 0,05 до 0,2% (м/о) обезжиренного сухого молока, от 0,025 до 0,1% (м/о) неионного ПАВ и от 0,025 до 0,1% (м/о) консерванта; (b) раствор для разведения конъюгата, включающий 10% (м/о) козьей сыворотки; (c) раствор для промывки, включающий от 10 до 40 мМ натрия ацетата, от 75 до 300 мМ натрия хлорида и от 0,025 до 0,1% (м/о) неионного ПАВ. 2. Набор по п.1, где консервантом является Proclin 300. 3. Набор по п.1, где козья сыворотка включает козье антитело к IgG человека. 4. Набор по п.3, где козье антитело к IgG человека является специфичным к Fc человека. 5. Набор по п.1, где белок, содержащий человеческий Fc, является одним или более выбранными из группы, состоящей из человеческого антитела, гуманизированного антитела и слитого белка, содержащего человеческий Fc. 6. Набор по п.1, где рН раствора для промывки составляет 3-5. 7. Способ измерения титра белка, содержащего Fc человека, с использованием набора по п.1, включающий: (a) разведение образца, содержащего человеческий Fc, с использованием раствора для разведения образца; (b) проведение реакции со стандартными растворами, разведенными до различных концентраций, и раствором для разведения образца в ячейках планшета, на которых адсорбирован целевой антиген; (c) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки; (d) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора для разведения конъюгата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию; (e) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки; (f) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора субстрата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию; (g) остановку реакции путем добавления раствора для остановки реакции в каждую из ячеек; (h) измерение поглощения стандартных растворов и образца. 8. Способ по п.7, где образец, включающий белок, содержащий Fc человека, является одним или более выбранными из группы, состоящей из человеческой сыворотки, человеческой плазмы и человеческой крови.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Набор для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, включающий: (a) раствор для разведения образца, включающий от 5 до 100% (м/о) коровьей сыворотки, от 0,05 до 0,2% (м/о) обезжиренного сухого молока, от 0,025 до 0,1% (м/о) неионного ПАВ и от 0,025 до 0,1% (м/о) консерванта; (b) раствор для разведения конъюгата, включающий 10% (м/о) козьей сыворотки; (c) раствор для промывки, включающий от 10 до 40 мМ натрия ацетата, от 75 до 300 мМ натрия хлорида и от 0,025 до 0,1% (м/о) неионного ПАВ. 2. Набор по п.1, где консервантом является Proclin 300. 3. Набор по п.1, где козья сыворотка включает козье антитело к IgG человека. 4. Набор по п.3, где козье антитело к IgG человека является специфичным к Fc человека. 5. Набор по п.1, где белок, содержащий человеческий Fc, является одним или более выбранными из группы, состоящей из человеческого антитела, гуманизированного антитела и слитого белка, содержащего человеческий Fc. 6. Набор по п.1, где рН раствора для промывки составляет 3-5. 7. Способ измерения титра белка, содержащего Fc человека, с использованием набора по п.1, включающий: (a) разведение образца, содержащего человеческий Fc, с использованием раствора для разведения образца; (b) проведение реакции со стандартными растворами, разведенными до различных концентраций, и раствором для разведения образца в ячейках планшета, на которых адсорбирован целевой антиген; (c) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки; (d) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора для разведения конъюгата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию; (e) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки; (f) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора субстрата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию; (g) остановку реакции путем добавления раствора для остановки реакции в каждую из ячеек; (h) измерение поглощения стандартных растворов и образца. 8. Способ по п.7, где образец, включающий белок, содержащий Fc человека, является одним или более выбранными из группы, состоящей из человеческой сыворотки, человеческой плазмы и человеческой крови.
Евразийское
патентное
ведомство
032572
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201790748
(22) Дата подачи заявки 2015.09.30
(51) Int. Cl.
G01N 33/53 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
(54) НАБОР ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ТИТРА БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ Fc, С ПОМОЩЬЮ НЕПРЯМОГО ИФА И СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ТИТРА БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ Fc, С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
(31) 10-2014-0131456
(32) 2014.09.30
(33) KR
(43) 2017.08.31
(86) PCT/KR2015/010324
(87) WO 2016/053002 2016.04.07
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ГРИН КРОСС КОРПОРЕЙШН (KR)
(72) Изобретатель:
Син Ён Вон, Ли Чухо, Лим Чон-Аэ, Чан Ки Хван, Ким Мин-Со (KR)
(74) Представитель:
Саломатина И.С., Фелицына С.Б.
(RU)
(56) WO-A1-0073347 ЕР-А1-0806667 KR-A-1020130063229 KR-A-1020040021768 US-A1-20140193432
(57) В изобретении обеспечивается набор для измерения титра человеческого антитела, гуманизированного антитела или белка, слитого с человеческим Fc, в плазме или сыворотке человека, и способ измерения титра белка, содержащего Fc человека, в плазме или сыворотке человека с его использованием; и, в частности, набор для измерения титра белка, содержащего Fc человека, в плазме или сыворотке человека, включающий раствор для разведения образца, раствор для разведения конъюгата и раствор для промывки, которые используются в непрямом иммуноферментном анализе (непрямом ИФА); и способ измерения титра белка, содержащего Fc человека, в плазме или сыворотке человека, с его использованием.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к набору для измерения титра белка, включающего человеческий Fc, и к способу измерения титра белка, включающего человеческий Fc, с его использованием; и, в частности, к набору для измерения титра белка, включающего человеческий Fc, в плазме или сыворотке крови человека, где набор включает раствор для разведения образца, раствор для разведения конъюгата и раствор для промывки, и используется в определении с помощью непрямого твердофазного иммунофер-ментного анализа (далее обозначаемого как непрямой ИФА); и к способу измерения титра белка, включающего человеческий Fc, в плазме или сыворотке крови человека с его использованием.
Предшествующий уровень техники
Анититело к поверхностному антигену вируса гепатита В (анти-HBsAg антитело) вырабатывается после инфицирования вирусом гепатита В или иммунизации вакциной вируса гепатита В и применяется для контроля результатов вакцинирования против вируса гепатита В путем измерения концентрации вырабатываемого анти-HBsAg антитела с помощью анализа титра анти-HBsAg антитела (концентрация анти-HBsAg 10 мМЕ/мл или меньше считается неиммунной концентрацией анти-HBsAg). Кроме того, при трансплантации печени при наличии гепатита В, вызванного вирусом гепатита В, в качестве основного заболевания анти-HBsAg антитело применяют для контроля титра анти-HBsAg антитела ко времени использования иммуноглобулина против гепатита В (HBIG) для предотвращения повторного инфицирования вирусом гепатита В.
В качестве метода анализа титра анти-HBsAg антитела используют иммуноферментный анализ (EIA), хемилюминесцентный иммуноанализ на микрочастицах (CMIA), радиоиммуноанализ (РИА) и тому подобное (El-Madhun et al., Vaccine, 16:156-160, 1998; L. Haaheim et al., International Congress Series, 1219:283-289, 2001; Odd Odinsen et al., Clin. Vaccine Immunol, 14(10): 1623-1628, 2007; P. Kryger et al., J. Clin. Microbiol, 13:405-409, 1981).
Способ анализа титра анти-HBs антитела заключается в измерении титра антитела путем нанесения поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В в планшет для микротитрования или микрочастицы, проведении реакции поверхностного антигена с анализируемым образцом, а затем в измерении степени развития окраски, люминесценции или изотопов с использованием поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В, конъюгированного с ферментом или радиоактивным изотопом.
IgG, который является типичным антителом, имеет Y форму. Как показано на фиг. 1А, участки связывания антигена присутствуют на обоих концах Y формы, так что антиген связывается с каждым участком. Как показано на фиг. 1А, измерение титра, как правило, проводят, когда поверхностный антиген вируса гепатита В, нанесенный на подложку (далее обозначаемый как нанесенный HBsAg), связывается с одним из антигенсвязывающих участков анти-HBs антитела, а поверхностный антиген вируса гепатита В, меченный ферментом или радиоактивным изотопом (далее обозначаемым как меченный HBsAg), связывается с другим участком, т.е. где поверхностные антигены связываются с каждым участком.
Однако при анализе титра анти-HBs моноклонального антитела, разработанного Green Cross Corp., в соответствии со способом, показанным на фиг. 1(А), без плазмы или сыворотки человека, измеренный титр примерно в 20-100 раз ниже титра, измеренного способом, показанным на фиг. 1(D). Полагают, что причиной того, что титр анти-HBs моноклонального антитела, измеренный способом с фиг. 1(А), является низким, может быть ошибка, обусловленная такой комбинацией, как показана на фиг. 1(В) или 1(С). Таким образом, возможен случай, когда оба участка связывания определяемого антитела связываются с нанесенным HBsAg или меченным HBsAg (фиг. 1В), или случай, когда один участок связывания антитела не способен связываться с одним антигеном, а другой участок связывания связывается с антигеном (фиг. 1(С)), и соответственно количество антитела нельзя точно определить.
Кроме того, даже когда титр измеряют с помощью способа, показанного на фиг. 1(D), для преодоления вышеописанных проблем, когда применяют полностью человеческое антитело, такое как анти-HBs моноклональное антитело, разработанное Green Cross Corp., может происходить неспецифическое связывание полностью человеческого антитела с другими человеческими антителами, исходно присутствующими в человеческой плазме или сыворотке, как показано на фиг. 2; и второе антитело, распознающее белок, включающий человеческий Fc, не способно дифференцировать неспецифическое связывание и специфическое связывание анти-HBs моноклонального антитела, что вызывает высокий фоновый сигнал, и соответственно по-прежнему трудно нормально измерить титр.
Для решения вышеописанных проблем авторы настоящего изобретения установили, что ошибку измерения можно уменьшить путем точного определения только специфических реакций, таких как на фиг. 1(D), с помощью способа измерения титра на основе непрямого ИФА; однако точность измерения титра антитела среди субъектов, подвергаемых анализу, все еще остается низкой.
Соответственно в настоящем изобретении предпринята попытка исключения возможности ошибки при существующем измерении титра и повышения точности измерения титра белка, включающего человеческий Fc, в плазме или сыворотке человека; и в результате было установлено, что когда используемый набор для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, включает раствор для разведения образца, раствор для разведения конъюгата и раствор для промывки, каждый из которых имеет специфический состав, то возможность ошибки при измерении титра белка, содержащего человеческий Fc, в
плазме или сыворотке человека существенно снижается, а точность измерения титра антитела среди субъектов, подвергающихся анализу, повышается; и завершено настоящее изобретение.
Описание изобретения
Техническая проблема.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение набора для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, способного повысить точность измерения титра человеческого антитела, гуманизированного антитела, или человеческого Fc-слитого белка в плазме или сыворотке человека, и способа измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, в частности антитела, в плазме или сыворотке человека с его использованием.
Техническое решение.
Для решения вышеуказанных задач настоящее изобретение обеспечивает набор для измерения титра белка, включающего человеческий Fc, содержащий:
(a) раствор для разведения образца, включающий коровью сыворотку, обезжиренное сухое молоко и неионный ПАВ;
(b) раствор для разведения конъюгата, включающий сыворотку, полученную от животного; и
(c) раствор для промывки, включающий натрия ацетат, натрия хлорид и неионный ПАВ.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ измерения титра белка, содержащего человече-
ский Fc, включающий:
(a) разведение образца, включающего человеческий Fc, с использованием раствора для разведения образца;
(b) добавление и проведение реакции со стандартными растворами, разведенными до различных концентраций, и раствором для разведения образца в ячейках планшета, на которых адсорбирован целевой антиген;
(c) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки;
(d) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора для разведения конъюгата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию;
(e) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки;
(f) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора субстрата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию;
(g) остановку реакции путем добавления раствора для остановки реакции в каждой из ячеек;
(h) измерение поглощения стандартных растворов и образца.
Описание чертежей
Фиг. 1 является схематической диаграммой, показывающей способ измерения титра антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В (анти-HBs).
Фиг. 2 является схематической диаграммой, показывающей проблему существующего способа измерения титра анти-HBs в человеческой плазме или человеческой сыворотке.
Фиг. 3 является схематической диаграммой, показывающей способ измерения титра анти-HBs антитела в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 4 является графиком, показывающим результаты линейного регрессионного анализа итоговых результатов анализа из экспериментов по измерению титра антител с использованием Hepabig-Gene
ИФА и РИА (АМС).
Фиг. 5 является графиком, показывающим кривую результатов анализа Бланда и Альтмана для РИА (АМС) и Hepabig-Gene ИФА.
Фиг. 6 является графиком, показывающим сравнение ИФА способа измерения титра с использованием существующего 1% БСА/ФБР (BSA/PBS) в качестве раствора для разведения образца и результатов
РИА (ASM).
Фиг. 7 является графиком, показывающим сравнение результатов Hepabig-Gene ИФА и РИА (ASM).
Фиг. 8 является графиком, показывающим сравнение результатов Hepabig-Gene ИФА и результатов анализа GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 диагностического реагента.
Наилучший способ осуществления изобретения
Если это нельзя определить другим способом, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, как общепринято для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, терминология, используемая в настоящем описании, хорошо известна в данной области техники и обычно применяется.
Настоящее изобретение обеспечивает новый способ измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, позволяющий существенно снизить ошибки, возникающие при неспецифическом связывании с человеческими антителами, исходно присутствующими в человеческой плазме или сыворотке; и обеспечивающий более точные значения, по сравнению с существующим способом измерения антитела, обладающего высокой аффинностью к специфическому антигену; и набор для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc.
Белок, содержащий человеческий Fc, в настоящем изобретении означает все белки, включающие человеческую Fc область.
Белок, включающий человеческий Fc, может быть по меньшей мере одним белком, выбранным из группы, состоящей из человеческого антитела, гуманизированного антитела, химерного антитела, и Fc-слитого белка, такого как этанерцепт, в котором растворимый рецептор, цитокин, гормон и тому подобные слиты с Fc, но не ограничивается ими. Человеческое антитело и гуманизированное антитело являются особо предпочтительными в качестве примеров белка, включающего человеческий Fc.
"Hepabig-Gene ИФА" или "Н-Е" в настоящем описании означает набор для измерения титра белка, включающего человеческий Fc, из настоящего изобретения.
В приведенном в качестве примера варианте осуществления настоящего изобретения сходимость и точность измерения набора для определения титра белка, включающего человеческий Fc, из настоящего изобретения подтверждают путем сравнения результатов анализа с использованием набора для измерения титра белка, включающего человеческий Fc, и результатов анализа с использованием существующего определения анти-HBs антитела (далее РИА (АМС) определения).
Далее, набор для определения титра белка, включающего человеческий Fc, и способ измерения в соответствии с настоящим изобретением подробно описаны на примере набора для определения титра анти-HBs антитела, приведенного в качестве примера.
В обычном способе измерения титра анти-HBs антитела, как показано на фиг. 1(А), титр может быть измерен надлежащим образом, когда поверхностный антиген вируса гепатита В связан с одним из антигенсвязывающих участков анти-HBs антитела, нанесенного на подложку, а поверхностный антиген вируса гепатита В, меченный ферментом или радиоактивным изотопом, связан с другим из антигенсвя-зывающих участков соответственно.
Однако при анализе титра анти-HBs моноклонального антитела, разработанного Green Cross Corp., в соответствии со способом, показанным на фиг. 1(А), измеренный титр примерно в 20-100 раз ниже титра в способе, показанном на фиг. 1(D) (данные не показаны). Полагают, что причиной того, что титр анти-HBs моноклонального антитела, измеренный способом с фиг. 1(А), снижен, является возможность ошибки, такой как на фиг. 1(В) или фиг. 1(С). Соответственно авторы настоящего изобретения провели тест для измерения титра антитела с использованием способа, показанного на фиг. 1(D), для исключения возможности ошибки (фиг. 1(В) и 1(С)) существующего способа измерения титра, и установили, что титр антител можно точно измерить в способе, показанном на фиг. 1(D), по сравнению с существующими способами.
В последнее время пациенты при трансплантации печени из-за гепатита В периодически применяли препараты иммуноглобулина против гепатита В, полученные при фракционировании плазмы, для предотвращения рецидива гепатита В. Время до повторного использования определяют с помощью периодического мониторинга сыворотки на основе 500 мМЕ/мл при определении существующим способом РИА (АМС). Однако, поскольку определение титра анти-HBs является таким же, как в способе, показанном на фиг. 1(А), невозможно измерить точный титр GC1102 (см. Корейский патент № 467706), который является человеческим моноклональным антителом.
Кроме того, когда препараты иммуноглобулина против гепатита В, полученные при фракционировании плазмы, периодически применяют у пациентов после трансплантации печени из-за гепатита В, титр повышается в плазме или сыворотке до тысяч мМЕ/мл. Существующий обычный способ измерения титра анти-HBs имеет диапазон определения от 10 до максимум 1,000 мМЕ/мл, и соответственно плазму или сыворотку необходимо дополнительно разбавлять для подтверждения точного титра, и точность и сходимость в соответствии с разведением могут меняться в зависимости от раствора для разведения образцов, и соответственно необходима отдельная проверка для разведения образца.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на поиск корреляции между результатами анализа с помощью РИА (АМС) и с помощью способа анализа, т.е. способа измерения титра антитела с использованием иммуноглобулина человека против гепатита В с помощью национальных стандартов, и возможности того, что титр анти-HBs антител в 500 мМЕ/мл в сыворотке пациента, который является основой для повторного использования препаратов иммуноглобулина против гепатита В, полученных при фракционировании плазмы, также равно применим к Hepabig-Gene ИФА, и возможности гарантии точности и сходимости даже в широком диапазоне во время использования раствора для разведения образца в соответствии с настоящим изобретением.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда титр антител измеряли с использованием национальных стандартов с помощью набора для измерения титра антител с использованием непрямого ИФА в соответствии с настоящим изобретением, полнота извлечения данных (%) составила примерно 93,3%, по сравнению с действительной величиной, и можно было точно измерить титр до 3,500 мМЕ/мл. Когда титр антител измеряли с использованием национальных стандартов иммуноглобулина против гепатита В с помощью существующего метода РИА (АМС), титр был в 1,4 раза выше действительной величины. Соответственно было подтверждено, что непрямой ИФА с использованием набора для измерения титра антитела в соответствии с настоящим изобретением позволяет определить титр более точно в широком диапазоне, по сравнению с существующим способом РИА (АМС).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения можно подтвердить, что измерение титра анти-HBs антитела в сыворотке крысы возможно путем использования набора для измерения титра
Fc-содержащего белка в соответствии с настоящим изобретением. Это означает, что титр можно измерить с высокой точностью даже при измерении титра антител или Fc-содержащего белка, полученного от специфических видов животных, подобно настоящему изобретению, в плазме или сыворотке тех же самых видов животных.
В одном аспекте набор для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, включает:
(a) раствор для разведения образца, включающий коровью сыворотку, обезжиренное сухое молоко, и неионный ПАВ;
(b) раствор для разведения конъюгата, включающий сыворотку, полученную от животного; и
(c) раствор для промывки, включающий натрия ацетат, натрия хлорид и неионный ПАВ.
В настоящем изобретении коровья сыворотка в растворе для разведения образца может иметь концентрацию от 5 до 100% (м/о). Кроме того, обезжиренное сухое молоко в растворе для разведения образца может иметь концентрацию от 0,05 до 0,2% (м/о). Когда концентрация обезжиренного сухого молока превышает вышеуказанный диапазон, первый раствор для разведения является крайне липким, что повышает ошибку измерения, а когда концентрация коровьей сыворотки и обезжиренного сухого молока ниже вышеописанного диапазона, может увеличиваться вероятность неспецифического связывания, при котором белок, содержащий человеческий Fc, антитело, которое определяют, связывается с нежелательным участком белка или антигеном. Предпочтительно концентрация коровьей сыворотки и обезжиренного сухого молока может составлять 10 и 0,1% (м/о) соответственно.
Неионный ПАВ в растворе для разведения образца может использоваться без ограничения с тем условием, что он соответствует задачам настоящего изобретения. Предпочтительно неионный ПАВ в растворе для разведения образца может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из Tween 20 (полисорбата 20), Tween 80 (полисорбата 80), Brij 30 (полиоксиэтилен(4)-лаурил-эфира), Brij 35 (полиоксиэтилен(23)-лаурил-эфира). Наиболее предпочтительно можно применять Tween 20. Неионный ПАВ может иметь концентрацию от 0,025 до 0,1% (м/о), предпочтительно 0,05% (м/о).
Раствор для разведения образца может дополнительно включать консервант, предпочтительно Pro-clin 300, но не ограничиваясь им. Когда добавляют консервант, то он может иметь концентрацию от 0,025 до 0,1% (м/о), предпочтительно 0,05% (м/о).
В настоящем изобретении сыворотка, полученная от животного, в растворе для разведения конъю-гата предпочтительно является козьей сывороткой, но не ограничивается ею. Таким образом, могут применяться все сыворотки, полученные от животных, если они соответствуют задачам настоящего изобретения.
Козья сыворотка может включать козье антитело против IgG человека, а козье антитело против IgG человека может быть специфичным к Fc, и может быть фрагментами цельного IgG антитела или Fab, или тому подобным. Предпочтительно козье антитело против IgG человека в растворе для разведения конъю-гата может быть специфичным к Fc.
Раствор для разведения конъюгата может включать сыворотку, полученную от животного, в концентрации 5-20% (м/о).
В настоящем изобретении натрия ацетат в растворе для промывки может иметь концентрацию 1040 мМ, натрия хлорид для раствора для промывки может иметь концентрацию 75-300 мМ, неионный ПАВ в растворе для промывки может иметь концентрацию 0,025-0,1% (м/о), а рН раствора для промывки может составлять 3-5. Предпочтительно натрия ацетат может иметь концентрацию 20 мМ, натрия хлорид может иметь концентрацию 150 мМ, неионный ПАВ может иметь концентрацию 0,05% (м/о), а рН раствора для промывки может быть равным 4.
Неионный ПАВ в растворе для промывки может применяться без ограничения, если он соответствует задачам настоящего изобретения. Предпочтительно неионный ПАВ в растворе для промывки может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из Tween 20 (полисорбата 20), Tween 80 (полисорбата 80), Brij 30 (полноксиэтилен(4)-лаурил-эфира), Brij 35 (полноксиэтилен(23)-лаурил-эфира), и тому подобного. Наиболее предпочтительно можно применять Tween 20.
В другом аспекте способ измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, включает:
(a) разведение образца, включающего белок, содержащий человеческий Fc, с использованием раствора для разведения образца;
(b) проведение реакции со стандартными растворами, разведенными до различных концентраций, и раствором для разведения образца в ячейках планшета, на которых адсорбирован целевой антиген;
(c) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки;
(d) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора для разведения конъюгата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию;
(e) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки;
(f) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора субстрата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию;
(g) остановку реакции путем добавления раствора для остановки реакции в каждую из ячеек; и
(h) измерение поглощения стандартных растворов и образца.
В настоящем изобретении раствор для разведения образца включает коровью сыворотку, обезжи
ренное сухое молоко и неионный ПАВ, где коровья сыворотка в растворе для разведения образца может иметь концентрацию 5-100% (м/о), обезжиренное сухое молоко в растворе для разведения образца может иметь концентрацию 0,05-0,2% (м/о), а неионный ПАВ в растворе для разведения образца может иметь концентрацию 0,025-0,1% (м/о).
Раствор для разведения образца может дополнительно включать консервант, предпочтительно Pro-clin 300, где консервант может иметь концентрацию 0,025-0,1% (м/о).
Разведение образца с использованием раствора для разведения образца на этапе (а) можно проводить с использованием раствора для разведения образца, имеющего объем, превышающий объем образца примерно в 2-20 раз, предпочтительно в 5-15 раз и наиболее предпочтительно в 10 раз. Кроме того, образец, включающий белок, содержащий человеческий Fc, может быть одним или более, выбранным из группы, состоящей из сыворотки человека, плазмы человека и крови человека, но не ограничивается ими.
В настоящем изобретении раствор для разведения конъюгата включает сыворотку, полученную от животного, предпочтительно козью сыворотку, но не ограничивается ими. Таким образом, можно применять сыворотки, полученные от всех животных, если они соответствуют задачам настоящего изобретения.
Козья сыворотка может включать козье антитело к IgG человека, а козье антитело к IgG человека может быть специфичным к Fab или Fc. Предпочтительно козье антитело к IgG человека в растворе для разведения конъюгата может быть специфичным к Fc.
Значения титра стандартного раствора, разведенного до различных концентраций, может составлять 1000, 500, 150, 100, 50, 10 и 0 мМЕ/мл.
Раствор для разведения конъюгата может быть козьей сывороткой, а козья сыворотка может иметь концентрацию 5-20% (м/о).
Раствор для промывки может включать натрия ацетат, натрия хлорид и неионный ПАВ.
Натрия ацетат в растворе для промывки может иметь концентрацию 10-40 мМ, натрия хлорид в растворе для промывки может иметь концентрацию 75-300 мМ, неионный ПАВ в растворе для промывки может иметь концентрацию 0,025-0,1% (м/о), а рН раствора для промывки может быть равным 4.
Этап (b) можно проводить при комнатной температуре в течение 10-120 мин, предпочтительно 3090 мин и наиболее предпочтительно 60 мин. Этапы (d) и (f) можно проводить при комнатной температуре в течение 10-60 мин, предпочтительно 20-40 мин и наиболее предпочтительно 30 мин.
Поглощение на этапе (h) предпочтительно измеряют при длине волны измерения 450 нм и контрольной длине волны 620 нм в течение 30 мин после добавления раствора для остановки реакции, но не ограничиваясь этим.
Раствор субстрата с этапа (f) является ТМБ субстратом пероксидазы, предпочтительно по меньшей мере одним, выбранным из ТМБ А и ТМБ В, и, в частности, наиболее предпочтительно смесью ТМБ А и ТМБ В, но не ограничиваясь ими. Для специалиста в данной области техники понятно, что пригодны обычные растворы субстрата.
Раствор для остановки реакции с этапа (g) применяют без ограничения, с тем условием, что он останавливает развитие окраски субстрата, предпочтительно раствор серной кислоты, но не ограничиваясь ей.
Примеры
Далее настоящее изобретение описано подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако следующие примеры приведены только с целью иллюстрации настоящего изобретения, и для специалиста в данной области техники понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.
Пример 1. Измерение титра в человеческой сыворотке с помощью Hepabig-Gene ИФА.
Задачей данного примера является подтверждение фонового сигнала и проверка того, можно ли нормально измерить титр анти-HBs антитела в сыворотке человека путем анализа титра анти-HBs антитела в сыворотке человека с использованием Hepabig-Gene ИФА и сравнения полученного титра с титром, измеренным обычным ИФА с использованием БСА/ФБР.
В данном примере использовали следующие реагенты.
(1) Анти-HBs антитело:
GC1102 стандарт для титрования (GCC, серия N787R8003, 10,500 мМЕ/мл, Корейский патент
№467706);
НВ48-33 (Корейский патент № 1072895); НВ48-35 (Корейский патент № 1072895);
НВ48-59 (Корейский патент № 1072895).
(2) Коровья сыворотка (Gibco, 16170-078).
(3) Козья сыворотка (Gibco, 16170-072).
(4) Обезжиренное сухое молоко (Difco, 232100).
(5) Планшет из набора для анализа GENEDIA, покрытый HBsAg (GENEDIA анти-HBs ИФА 3.0,
GCMS, F1103).
(6) Tween 20 (Sigma, P1379).
(7) Козье антитело к IgG человека (Fc специфичное, конъюгированное с пероксидазой, Sigma, А0170).
(8) ТМБ субстрат пероксидазы для микропланшетов (KPL, 50-76-03).
(9) Серная кислота (H2SO4, Riedel, 30743).
(10) Натрия хлорид (Sigma, S3014).
(11) Уксусная кислота (Riedel, 27225).
(12) Натрия ацетат тригидрат (Riedel, 25022).
(13) ФБР (фосфатно-солевой буферный раствор) (Lonza, 17-516Q).
(14) БСА (бычий сывороточный альбумин) (Bovogen, BSA100).
(15) GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 (GREEN CROSS CORP. MS, F1103). Реагенты, используемые в анализе, готовили с помощью следующих методик.
(1) Tween 20, имеющий концентрацию 10% (м/о).
10 г исходного Tween 20 добавляли к 90 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивали.
(2) Инактивированная нагреванием коровья сыворотка и козья сыворотка.
Коровью сыворотку и козью сыворотку, растворенную при комнатной температуре или 2-8°С, нагревали при 56°С в течение 30 мин.
(3) Буфер для растворения (0,1% обезжиренного сухого молока/0,05% Tween 20/10% коровьей сыворотки/90% ФБР).
100 мл нагретой и инактивированной коровьей сыворотки, 1 г обезжиренного сухого молока и 5 мл 10% Tween 20 смешивали и добавляли ФБР для получения 1 л раствора. Смесь тщательно перемешивали для полного растворения, фильтровали с использованием фильтра 0,45 мкм и применяли.
(4) Раствор конъюгата комплекса второго антитела (1:20,000).
5 мкг козьего антитела против IgG человека (специфичного к Fc и конъюгированного с пероксида-зой) добавляли к 5 мл нагретой и инактивированной козьей сыворотки и тщательно перемешивали для приготовления раствора. 1 мл приготовленного раствора тщательно смешивали с 19 мл нагретой и инак-тивированной козьей сыворотки.
(5) Раствор субстрата.
Субстрат пероксидазы ТМБ А и субстрат пероксидазы ТМБ В тщательно смешивали в отношении
1:1.
(6) Раствор для остановки реакции.
28 мл серной кислоты медленно смешивали с 972 мл дистиллированной воды.
(7) Раствор для промывки.
2,722 г натрия ацетата тригидрата, 8,766 г натрия хлорида, 5 г 10% Tween 20 добавляли к 900 мл дистиллированной воды и контролировали рН 4,0 с уксусной кислотой, а затем доводили итоговый объем до 1 л дистиллированной водой и тщательно перемешивали.
(8) 1% (м/о) БСА/ФБР.
10 г БСА растворяли в 1 л ФБР и применяли.
(9) PBST.
5 г Tween 20 добавляли к 1 л ФБР и медленно перемешивали до полного растворения без образования пузырьков.
Раствор для разведения образцов, вторые антитела, растворы для разведения второго антитела и растворы для промывки для ИФА с использованием БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца, реактивы из Hepabig-Gene ИФА показаны в табл. 1 ниже.
Методики анализа титра антител с использованием GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0, который является диагностическим реагентом для определения титра анти-HBs антитела, были следующими. Отрицательный стандартный раствор, стандартный раствор и образец, разведенный в 10-25 раз отрицательным стандартным раствором, добавляли в микропланшет в диагностический реагент. Затем концентрированный конъюгат разбавляли в 26 раз раствором для разведения конъюгата, и разведенный концентрированный конъюгат добавляли в микропланшет, на который были внесены стандартный раствор, отрицательный стандартный раствор и образец, а затем перемешивали с помощью перемешивающего устройства, и проводили реакцию при 37°С в течение 1-60 мин. После завершения реакции полученную смесь промывали с использованием концентрированного раствора для промывки в диагностическом реагенте, кото
рый разбавляли в 10 раз дистиллированной водой. Раствор субстрата в диагностическом реагенте разбавляли в 101 раз буфером для субстрата, и разведенный раствор субстрата добавляли в промытые ячейки планшета, затем проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию останавливали путем добавления раствора для остановки реакции в диагностическом реагенте.
Методики анализа титра антител с использованием ИФА с БСА/ФБР в качестве растворителя образца были следующими. Рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В, не обработанный формалином, наносили в планшет для микротитрования, затем блокировали с использованием 1% БСА/ФБР. Затем стандартный раствор и образец сыворотки человека, разведенный в 25 раз раствором для разведения образца (1% БСА/ФБР) добавляли в планшет для инициации реакции. После завершения реакции полученную смесь промывали PBST, и подвергали второй реакции с козьим антителом против IgG человека (Fab-специфичным), конъюгированным с пероксидазой хрена, и вновь промывали PBST. После завершения второй реакции добавляли раствор ТМБ субстрата для развития окраски, и реакцию останавливали путем добавления раствора серной кислоты.
Методики анализа титра антител с использованием Hepabig-Gene ИФА были следующими. Реком-бинантный поверхностный антиген вируса гепатита В, не обработанный формалином, наносили в планшет для микротитрования, затем блокировали с использованием 1% БСА/ФБР. Затем стандартный раствор и образец сыворотки человека, разведенный в 10 раз раствором для разведения образца (10% (м/о) коровьей сыворотки, включающей 0,1% (м/о) обезжиренного сухого молока, 0,05% (м/о) Tween 20, и 0,05 % (м/о) Proclin 300) добавляли в планшет для инициации реакции. После завершения реакции полученную смесь промывали раствором для промывки и подвергали второй реакции с козьим антителом против IgG человека (Fc-специфичным), конъюгированным с пероксидазой хрена, и проявляли окраску путем добавления ТМБ субстрата.
В первом анализе фоновый сигнал Hepabig-Gene ИФА в человеческой сыворотке проверяли с использованием сыворотки от 19 пациентов, страдающих гепатитом В (HBsAg (+)), у которых, как известно, сыворотка не содержала анти-HBs антитела. Вначале подтверждали, что анти-HBs антитело не присутствует в сыворотке пациентов, страдающих гепатитом В, с использованием диагностического реагента GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 (табл. 2). При разведении образца с использованием 15 БСА/ФБР во всех 19 образцах отмечался высокий фоновый сигнал более 900 мМЕ/мл. Однако в Hepabig-Gene во всех образцах фоновый сигнал составил не более 100 мМЕ/мл.
Таблица 2
Результаты первого анализа с использованием сыворотки, взятой у 19 пациентов, страдающих гепатитом В
Во втором анализе было проверено, способен ли Hepabig-Gene ИФА к нормальному измерению титра без фонового сигнала даже в человеческой сыворотке, с использованием 21 сыворотки, взятой у здоровых людей, среди которых не было пациентов, страдающих гепатитом В. Для проверки генерации фонового сигнала использовали диагностический реагент GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 для сравнения. В Hepabig-Gene ИФА все из 21 образцов не генерировали высокий фоновый сигнал, как сыворотки с использованием 1% БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образцов в первом анализе. Кроме того, даже хотя результат Hepabig-Gene ИФА был сопоставим с результатом GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 диагностическим реагентом, не отмечалось разницы фонового сигнала (табл. 3). Во втором анализе определение титра в ИФА с использованием БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца, где уже был подтвержден высокий фоновый сигнал, не применяли.
Результатами первого и второго анализа было подтверждено, что в существующем ИФА с использованием 1 % БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца в первом и втором анализе генерировался значительный фоновый сигнал более 900 мМЕ/мл, даже при отсутствии титра анти-HBs антитела. Однако в Hepabig-Gene ИФА генерировался фоновый сигнал на схожем уровне с GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 коммерческим диагностическим реагентом. Это означает, что высокий фоновый сигнал, генерируемый при использовании существующего антитела против IgG человека в качестве второго антитела можно эффективно контролировать в Hepabig-Gene ИФА.
Пример 2. Анализ для сравнения титров, измеренных с помощью Hepabig-Gene ИФА и АМС.
Задачей примера 2 является проверка корреляции между результатами измерения титра с использованием Hepabig-Gene ИФА в соответствии с настоящим изобретением, и результатами измерения титра анти-HBs антитела (РИА (АМС) в сыворотке, с использованием национального стандарта иммуноглобулина против гепатита В (KFDA Эталон 08/026) Министерства безопасности продуктов питания и лекарственных средств (MFDS). В данном примере использовали национальный стандарт иммуноглобулина человека против гепатита В (95,45 ME на флакон, MFDS).
Реагенты, используемые в данном примере, и методики приготовления реагентов были такими же, как в примере 1, за исключением диагностического реагента GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0.
Методики анализа титра антител с использованием Hepabig-Gene ИФА были такими же, как в примере 1.
При измерении с помощью РИА (АМС) титр определяли с использованием иммуноферментного анализа (EIA), в котором поверхностный антиген вируса гепатита В наносили в планшет и проводили реакцию с образцом, подвергаемым анализу, а затем фермент, такой как пероксидаза или щелочная фос-фатаза, конъюгировали с поверхностным антигеном вируса гепатита В, как при существующем измерении титра анти-HBs, как показано на фиг. 1(А); или с помощью радиоиммунного анализа (РИА), в кото-
125т ~ тэ
ром радиоактивным изотопом, таким как I, маркирован поверхностный антиген вируса гепатита В.
Методики анализа с использованием РИА (АМС) были следующими. Отрицательный контроль, положительный контроль и образец добавляли в пробирки для анализа, и частицы, покрытые HBs антигеном, добавляли в каждую пробирку для анализа, затем проводили реакцию при перемешивании при комнатной температуре, или реакцию при 45°С в течение 90 мин. После завершения реакции частицы промывали дистиллированной водой 3-5 раз, добавляли 125I и проводили реакцию при перемешивании при комнатной температуре или реакцию при 45°С в течение 90 мин. После завершения реакции частицы промывали дистиллированной водой 3-5 раз. Затем, в пределах 24 ч после промывания измеряли радиоактивность в каждой пробирке для анализа в течение 1 мин с помощью прибора для анализа гамма-излучения.
Методики подготовки анализируемых образцов были следующими.
Отрицательный контроль, положительный контроль и образец добавляли в пробирки для анализа, и частицы, покрытые HBs антигеном, добавляли в каждую пробирку для анализа, затем проводили реакцию при перемешивании при комнатной температуре, или реакцию при 45°С в течение 90 мин. После завершения реакции частицы промывали дистиллированной водой 3-5 раз, добавляли 125I и проводили реакцию при перемешивании при комнатной температуре или реакцию при 45°С в течение 90 мин. По
сле завершения реакции частицы промывали дистиллированной водой 3-5 раз. Затем, в пределах 24 ч после промывания измеряли радиоактивность в каждой пробирке для анализа в течение 1 мин с помощью прибора для анализа гамма-излучения.
При первом анализе 30 образцов негативного контроля анализировали с помощью Hepabig-Gene ИФА; среди полученных результатов анализа два результата, в которых предел обнаружения Hepabig-Gene ИФА был меньше 10 мМЕ/мл ( <10 мМЕ/мл), не были включены в итоговые результаты. 30 контрольных образцов анализировали с помощью РИА (АМС); среди полученных результатов анализа два результата, в которых предел обнаружения АМС был меньше 10 мМЕ/мл, не были включены в итоговые результаты. При определении среднего процентного выхода (% выхода: %Вых.) каждого измерения, %Вых. Hepabig-Gene ИФА составил 956,0%, а %Вых. РИА (АМС) составил 14712,9%; результаты анализа показаны в табл. 4 ниже.
Таблица 4
Результаты первого анализа с использованием национальных стандартов иммуноглобулина против гепатита В (Эталон KFDA 08/026)
И-^лер енный ппр (мМЕ мл)
Измеренный ппр (мМЕ мл)
ГыМЕ мл]
с-сс ¦
уровня выхода)
АМС 1Ч-, уровня выхода)
Теоретический татр
No. (мМЕ мл)
уровня выхода)
АМС
уровня выхода)
46 mi
36 (172)
1750
IbZb .95
2530 (145)
47 (94/
96 (191!
1750
1603 (92)
2540 (145!
250
:-i 96
314 (1261
2000
2039 (102!
2940 .147:
250
250 '100;
331 "132"
2000
1809 "0!
266J 133:
S0O
452 <90;
735(153)
2250
2214 :9Е.
J230 .144.
500
518 (104)
758 (151)
2250
2077 <92)
SS30.157.
7S0
713 (951
1160 I1S5I
2500
25" 1103)
3520(1415
750
842 > 112>
1120 a"j
2500
2330 > Ж)
3490 (140!
1000
839 . 841
1530 ,153!
2750
2494 (91)
3790 Ц3$)
1000
957 (981
1520 -152,
2750
2529(92)
зазо (139)
12 50
Ш6 |9В)
1710 11371
3000
2750 "92?
4280 (143)
12 50
Ш! 193Э
1770 ;142i
3000
2395 .9Ti
42J0 (141!
1S00
14S6 (87)
2250 11501
3500
3391 <"7)
4W0 (143!
1S00
1435 (96?
2270 11511
3500
2S23 (81!
4750 (136)
Число образцов
¦ о Уровня выхода* (?о. среднее = СКО}
GCC
95±6.0
о У ровня выхода* = Измеренный тигр Теоретический титр х 100
АМС
147*12 9
Во втором анализе 28 образцов негативного контроля анализировали с помощью Hepabig-Gene ИФА; среди полученных результатов анализа четыре результата, в которых предел обнаружения Hepa-big-Gene ИФА был меньше 10 мМЕ/мл, не были включены в итоговые результаты. 28 контрольных образцов анализировали с помощью РИА (АМС); среди полученных результатов анализа четыре результата, в которых предел обнаружения АМС был меньше 10 мМЕ/мл, не были включены в итоговые результаты. При определении среднего процентного выхода (% выхода: %Вых.) каждого измерения, %Вых. Hepabig-Gene ИФА составил 967,1%, а %Вых. РИА (АМС) составил 14016,4%; результаты анализа показаны в табл. 5 ниже.
Таблица 5
GCC
9в±7.1
АМС
140±1б 4
Двухвыборочный t-тест в отношении результатов первого и второго анализа (которые различаются с точки зрения создания препарата) проводили с использованием %Вых. для каждого измерения (95% доверительный уровень). Значение вероятности (значение Р) результатов первого анализа и результатов
Результаты первого анализа с использованием национальных стандартов иммуноглобулина против гепатита В (Эталон KFDA 08/026)
второго анализа Hepabig-Gene ИФА составило 0,565, а значение вероятности (значение Р) результатов первого анализа и результатов второго анализа АМС составило 0,112. Два значения вероятности (значения Р) результатов первого и второго анализа составили 0,05 или больше, и соответственно признано, что нет разницы между результатами первого анализа и результатами второго анализа, и следующий анализ результатов проводили с использованием итоговых результатов анализа, включающих общие результаты первого и второго анализа (табл. 6).
Таблица 6
Итоговые результаты анализа с использованием национальных стандартов иммуноглобулина против гепатита В (Эталон KFDA 08/026)
Теоре-
Измеренный штр (мМЕ мл;
Теоре-
1Ьмеренньштитр [кМ ма)
ТНЧвС-
пиес-
оси
б" V
iv. .
кий
АМС Л
ппр
уровня
уровня
ппр
уровня
уровня
;мМЕ
выхода)
вьиода)
Bill
выхода)
выхода)
_ мл)
мл!
1 [вторичный;
28 (103;
43 <Ш.
27 (первичный)
1000
139 Ш1.
1535 153;
}. Iвторичный;
21 (первичный;
"000
S57 (К,
!Ш .152.
1 : вторичный;
11 -891
-.¦:¦>
2" (первичный;
1250
122S 91-
1710 ..137,
4- (вторичный)
31 89]
И > 1S"'>
33 (первичньпт)
U€J В
ига !М2,
5 (первичный;
46 921
;t .;:
31 (вторичный;
1400
1354 , 37,
2130 IX54i
6 (первичный)
"7 .841
;с :я
32 (вторичный)
14"
1139 if)
U7S 134.
Т < [вторичный;
54 КК
33 (первичньш;
1SO0
2259 ;l"0i
* ; вторичный;
55 1101.
:? l;i
34 (первичньш
1500
1435 "31,
2273 :Ш>
* (вторичный;
105
105 196;
133
3S (первичньш)
17S0
isai 9f,
2530 (145i
10 [вторичный)
109
105 14.
171 US81
•№ (первичньпт;
1МН Ч>
.4*0 I4S"
11 (вторичный;
11"
12й .101i
17; (вторичньш;
isei §6,
z:m 130
12 [вторичный!
251 100(
11- (вторичный;
:w ее
2410 ;Шг
13 'первичный'
250
J4i т.
99 (первичный;
гшж
Л9 11021
14(первичньш)
25й
250 1 ОС ¦
40 (первичный;
1ЖШ
180* 98!
леи ;m> .
151 (вторичный)
т &F
4??
41 (первичный)
г"е
2214 Ш
5I5S 144,
Ш (вторичный;
350
321 IM,
4:'
"¦(первичный;
2077 "2;
Ш0 1157,
17 (вторичный;
43В
45.' "1031
-ц-
43 [первичный;
;ss4 поз,
3520 141.
18 (вторичный)
w т:
5*il25 <
44 {первичньш;
КОЗ
23" ")
3"tM 145,
1§{перБ1Гчный:
SCO
452 1"
7§5(I59i
41 (первичный;
27"
24S4 *Ji
37*0 138-
20|'первичньш)
Sif(104.
7з:
** (первичньп!)
2 756
25.4 92.
3133 139-
211 (вторичный;
Ю №s
¦-;
47 (первичньпт;
J0OO
г?" ,52
mo ;i43>
22 (вторичный;
700
70S -101.
•15,131,
*J (первичный;
з"с
2S95 97,
4233 il41i
23(первичньш)
Т5"
713 195'
-.55
"{первичный;
35"
ИМ "7i
4ИЮ :143|
• * [первичный;
7 so
М.> 1121
U20 <"i
SO', (первичньш1;
2823 ,и;.
25 (вторичный;
"75
907 -1М.
.;-с- .33
51 (вторичньш:
3500
332" ,55s
SCW ,145,
26 (вторичный;
8Т5
ает т;
11" 1133.
52 (вторичный;
3S0C
3327 .JSi
4830 138,
Число
" с Уровня выхода*
образцов
(V среднее =
СКО;
"КС
" о > ровня выхода* = Измеренный пггр
АМС
144±14 5
Теоретический титр х ISO
При анализе среднего процентного выхода (% выхода: %Вых.) каждого измерения в итоговых результатах анализа %Вых. Hepabig-Gene ИФА составил 966,5%, а %Вых. РИА (АМС) составил 14414,8%. В результате анализа линейного регрессионного анализа с использованием Excel, %Вых. Hepabig-Gene ИФА составил 93,3%, по сравнению с теоретическим титром национального стандарта, а %Вых. РИА (АМС) составил 141,5%, по сравнению с теоретическим титром национального стандарта (табл. 6). Кроме того, значение R2 составило также 0,99 или больше, что может подтвердить, что Hepabig-Gene ИФА имеет значительно более высокую разрешающую способность на модели линейного регрессионного анализа (фиг. 4).
Эквивалентность двух измерений оценивали с помощью графиков Бланда-Альтмана. Эти кривые были распределены в 95% доверительном интервале (1.96SD); однако, было подтверждено, что среднее значение "у" кривых было 39,9% (фиг. 5), а взаимоотношение было таким же самым, как в следующем уравнении.
Результаты измерений с помощью РИА (АМС) - результаты Hepabig-Gene ИФА = 0,399 х среднее значение (среднее) результатов измерений.
Таким образом, разница результатов измерений составила 39,9% от среднего значения по результатам двух измерений. Эти результаты подтвердили, что два измерения и результат анализа не являются эквивалентными друг другу.
В качестве коэффициента корреляции для оценки использовали коэффициент корреляции Пирсона (95% доверительный интервал, JMP v8.0). Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,996 (значение вероятности (значение Р) составило 0,000), и можно признать, что результаты анализа при двух измерениях имеют сильную положительную корреляцию.
Регрессионный анализ проводили путем построения значений титра при анализе Hepabig-Gene ИФА по Х-оси, а значений титра при анализе РИА (АМС), полученных в Отделении ядерной медицины Медицинского центра Asan, по Y-оси. В результате регрессионного анализа было получено следующее уравнение линейной регрессии, а значение вероятности (значение Р) по отношению к коэффициенту составило 0,000 и было высоко достоверным на уровне значимости 0,05.
РИА (АМС) =1,51 Hepabig-Gene ИФА [уравнение линейной регрессии].
Из этих результатов можно видеть, что 500 мМЕ/мл, что является результатом анализа с помощью
РИА (АМС), при разведении национальных стандартов с использованием существующего раствора для разведения образцов составило 331 мМЕ/мл, что было средним значением результатов анализа с использованием Hepabig-Gene ИФА.
Таким образом, из результатов эксперимента в представленном примере видно, что Hepabig-Gene ИФА надлежащим образом оценивает национальный стандарт (93,3% RE в результатах линейного регрессионного анализа); однако при анализе с помощью РИА (АМС) значения для национального стандарта повысились в 1,4 раза (141,5% RE в результатах линейного регрессионного анализа). Было установлено, что результаты анализа при двух измерениях имели коэффициент сильной положительной корреляции (оцениваемый по коэффициенту корреляции Пирсона), а результаты измерения с помощью РИА (АМС) были выше в 1,51 раз, по сравнению с результатами Hepabig-Gene ИФА. Кроме того, было показано, что измерение титра антител с помощью Hepabig-Gene ИФА имело такую же точность измерения, как у существующего способа анализа, и обеспечивало более точное измерение количества антител по сравнению с существующим анализом.
Пример 3. Анализ для сравнения титров при измерении с помощью Hepabig-Gene ИФА и АМС.
Задачей настоящего примера является сравнение и анализ значений, полученных при измерении титра анти-HBs антител, таком как с помощью Hepabig-Gene ИФА, ИФА с использованием 1% БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца, РИА (АМС), и диагностического реагента GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0, в 156 образцах сыворотки от 156 пациентов, у которых применяли иммуноглобулин против гепатита В (HBIG) для предотвращения рецидива гепатита В после трансплантации печени из-за гепатита В.
Реагенты, используемые для Hepabig-Gene ИФА, ИФА с использованием 1% БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца, РИА (АМС), и диагностического реагента GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0, и методики приготовления реагентов были такими же, как в примерах 1 и 2. Кроме того, способы анализа Hepabig-Gene ИФА, ИФА с использованием 1% БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца и диагностического реагента GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0 были такими же, как в примере 1, а способ анализа РИА (АМС) был таким же, как в примере 2.
При сравнении результатов, полученных при ИФА с использованием 1% БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образца, с РИА (АМС), образцы, имеющие низкий титр, близкий к 0 в РИА (АМС), создавали высокий фоновый сигнал до максимум 2,000 мМЕ/мл при измерении титра в ИФА с использованием 1% БСА/ФБР в качестве раствора для разведения образцов, как показано на фиг. 6. Это подобно результатам из примера 1. Кроме того, корреляция между двумя способами составила всего R2=0,4582, а тангенс угла наклона кривой регрессии составил 0,4857, и соответственно можно признать, что одни и те же образцы давали более высокие значения в РИА (АМС), чем при измерении титра с помощью ИФА с использованием 1% БСА/ФБР.
При этом, когда сравнивали Hepabig-Gene ИФА с РИА (АМС), было показано, что фоновый сигнал эффективно удалялся Hepabig-Gene ИФА, a R2 составил 0,7181, что подтвердило, что корреляция с РИА (АМС) улучшалась по сравнению со способом с использованием 1% БСА/ФБР, как показано на фиг. 7. Однако тангенс угла наклона регрессионной кривой между двумя способами составил 0,5015, что подтверждало, что образцы давали более высокие значения в способе РИА (АМС) по сравнению с Hepabig-Gene ИФА, подобно сравнению РИА (АМС) со способом с использованием 1% БСА/ФБР. Можно признать, что эти результаты существенно схожи с результатами из примера 2.
При сравнении Hepabig-Gene ИФА с диагностическим реагентом GENEDIA(r) анти- HBs ИФА 3.0 R2 составил 0,8627, что указывало на высокую корреляцию между двумя способами, а тангенс угла наклона регрессионной кривой между двумя способами составил 1,0068. Таким образом, было подтверждено, что измеренные значения для двух способов были почти одними и теми же, как показано на фиг. 8.
Как показано на фиг. 6-8, Hepabig-Gene ИФА эффективно снижает высокий фоновый сигнал в сыворотке человека в соответствии с существующим способом с использованием 1% БСА/ФБР и имеет высокую корреляцию с коммерческим РИА и диагностическим реагентом GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0. В частности, было показано, что результаты измерения в Hepabig-Gene ИФА были почти одними и теми же, как для диагностического реагента GENEDIA(r) анти-HBs ИФА 3.0.
Пример 4. Измерение титра анти-HBs антитела в сыворотке крысы с использованием GC1102.
В представленном примере проверяли, позволяет ли измерение титра антител к поверхностному антигену гепатита В (анти-HBs) с использованием Hepabig-Gene ИФА в соответствии с настоящим изобретением в сыворотке человека определить титр антитела (титр анти-HBs антитела из GC1102, GC1102 в смеси с IV-Hepabig для инъекций, и GC1102 в смеси с IV-Globulin S для инъекций) в сыворотке крысы.
Стандарты и образцы, используемые в настоящем примере, были следующими.
(1) Стандарты: стандарты для Hepabig-Gene ИФА, титр анти-HBs 10,500 МЕ/мл.
(2) GC1102: анти-HBs моноклональное антитело, титр анти-HBs 10,500 МЕ/мл.
(3) IV-Hepabig для инъекций: Hepabig для внутривенного введения, 10 мл, титр анти-HBs 270,5 МЕ/мл.
(4) IV-Globulin S для инъекций: IV-Globulin S для инъекций, 10 мл, титр анти-HBs 2,2 МЕ/мл.
(1)
Реагенты, используемые в данном примере, были такими, как в примерах выше, а реагенты, включая раствор для разведения образца, раствор для разведения конъюгата, раствор для промывки и тому подобное, также готовили тем же способом, как в примерах выше. Стандартные растворы готовили путем разведения GC1102 стандартов с буфером для разведения, и получали концентрацию 0, 10, 50, 100, 150, 500 или 1000 МЕ/мл, и получали стандартную кривую.
КК образцы GC1102 (10,500 МЕ/мл) и IV-Hepabig для инъекций (270,5 МЕ/мл, GREEN CROSS CORP.) готовили путем разведения GC1102 с сывороткой крысы, получая концентрации 200, 1000, 4000, 8000 мМЕ/мл соответственно.
КК образцы GC1102 и IV-globulin S для инъекций (Green Cross Corp.) готовили в качестве смесей, чтобы концентрация белка (мг/мл) IV-globulin S для инъекции была такой же, как у IV-Hepabig для инъекций, с использованием буфера, и смешивали так, чтобы получить тот же самый титр анти-HBs антитела, как в IV-Hepabig для инъекций.
Приготовленные смеси разбавляли сывороткой крысы и получали концентрации 200, 1000, 4000, 8000 мМЕ/мл соответственно.
Анализа титра анти-HBs антител IV-Hepabig для инъекций с использованием Hepabig-Gene ИФА проводили, чтобы проверить, можно ли примерно 270,5 МЕ/мл, что является титром анти-HBs антитела, определенным в образце серии № 150Н8028 IV-Hepabig для инъекций, измерить в анализе с использованием Hepabig-Gene ИФА. В качестве образца использовали IV-Hepabig для инъекций, разведенный в 800, 1,600, 3,200 и 6,400 раз раствором для разведения образца из Hepabig-Gene ИФА.
Оценку точности проводили путем повторения теста шесть раз на концентрацию, и добавляя 4 концентрации в диапазоне анализа. При оценке точности образцы оценивали по % выхода (%Вых.) и проверяли, находится ли измеренный %Вых. в диапазоне 80-120%.
Оценку сходимости проводили путем проведения теста шесть раз на концентрацию, и с добавлением 4 концентраций в диапазоне анализа. При оценке сходимости образцы оценивали по % относительного среднеквадратического отклонения (%ОСКО), и проверяли, находится ли %ОСКО в пределах 15%. Затем оценивали внутрианалитическую и межаналитическую сходимость, где внутрианалитическую сходимость оценивали, проверяя, находится ли %ОСКО среди результатов, полученных при повторении анализа дважды по отношению к одному стандарту, в пределах 15%; а межаналитическую сходимость оценивали, проверяя, находится ли %ОСКО среди результатов, полученных при повторении анализа три раза в день, в пределах 15%.
При оценке избирательности было подтверждено, что не отмечается эффекта интерференции биологической среды с использованием 8 образцов сыворотки крыс. %Вых. подтверждали путем добавления GC1102 (50 мМЕ/мл) в 8 сывороток крысы, и также было подтверждено отсутствие эффекта интерференции.
Другие методы анализа, использованные в настоящем примере, были такими же, как способы Hepabig-Gene ИФА из примера 1.
1) Анализ титра анти-HBs антитела IV-Hepabig для инъекций с использованием Hepabig-Gene ИФА.
Титр анти-HBs антитела IV-Hepabig для инъекций, разведенного в 800, 1600, 3200 и 6400 раз раствором для разведения образцов из Hepabig-Gene ИФА, определяли с использованием Hepabig-Gene ИФА. Результат анализа составил 276,0 МЕ/мл (%ОСКО 4,7%), что совпало с типичным показателем для IV-Hepabig для инъекций, 270,5 МЕ/мл, в пределах среднеквадратического отклонения, и соответственно было показано, что Hepabig-Gene ИФА пригоден для определения титра in vitro, такого как анализ при выпуске препарата иммуноглобулина против гепатита В, полученного из плазмы крови, на содержание анти-HBs антител, например IV-Hepabig для инъекций (табл. 7).
2) Измерение титра антител GC1102 в сыворотке крыс с использованием Hepabig-Gene ИФА.
Для измерения титра антител GC1102 в сыворотке крыс с использованием Hepabig-Gene ИФ, КК образцы, полученные путем добавления GC1102 (8000, 4000, 1000 и 200 мМЕ/мл) в сыворотку крыс, анализировали с использованием Hepabig-Gene ИФА 1.1, а затем проверяли точность, внутрианалитическую сходимость и межаналитическую сходимость. Анализ повторяли шесть раз при включении добавок GC1102 (200, 1,000, 4,000 и 8,000 мМЕ/мл) в сыворотку крысы. %Вых. составил 88,8-107,5%, внутриана-литическая сходимость (%ОСКО) была в пределах 13,7%, а межаналитическая сходимость (%ОСКО) была в пределах 11,0%, что подтвердило, что титр анти-HBs GC1102 можно измерить с использованием Hepabig-Gene ИФА даже в сыворотке крысы, а также в сыворотке человека (табл. 8).
3) Измерение титра антитела IV-Hepabig для инъекций в сыворотке крысы с использованием Hepabig-Gene ИФА.
КК образцы, полученные путем добавления IV-Hepabig для инъекций (8000, 4000, 1000 и 200 мМЕ/мл) в сыворотку крыс, анализировали с использованием Hepabig-Gene ИФА, а затем проверяли точность, внутрианалитическую сходимость и межаналитическую сходимость. Анализ повторяли шесть раз при включении добавок IV-Hepabig для инъекций (200, 1,000, 4,000 и 8,000 мМЕ/мл) в сыворотку крысы. %Вых. составил 92,2-111,8%, внутрианалитическая сходимость (%ОСКО) была в пределах 11,4%, а межаналитическая сходимость (%ОСКО) была в пределах 6,8%, что подтвердило, что титр анти-HBs в таких препаратах, как полученный из плазмы крови иммуноглобулин против гепатита В, можно измерить с использованием Hepabig-Gene ИФА даже в сыворотке крысы (табл. 9).
Таблица 9
Результаты эксперимента по определению титра антител IV-Hepabig для инъекций в сыворотке крысы с использованием Hepabig-Gene ИФА
5) Оценка избирательности.
Для проверки избирательности 8 образцов сыворотки крысы и образцов с добавками, полученных путем добавления GC1102 (500 мМЕ/мл) в сыворотку крысы, анализировали с использованием Hepabig-Gene ИФА. При анализе всех 8 образцов сыворотки крыс с использованием Hepabig-Gene ИФА титр анти-HBs антител не был выявлен во всех 8 образцах сыворотки крыс, а при анализе образцов с добавками, полученных путем добавления GC1102 (500 мМЕ/мл) в сыворотку крыс, %Вых. составил 96,0-106,2%, что подтвердило отсутствие эффекта интерференции по отношению к другим компонентам в сыворотке крысы (табл. 11).
Таблица 11
Результаты оценки избирательности с использованием Hepabig-Gene ИФА
Образец
Негативный образец
Образец с добавлением
AR%
< 100
492
98,4
< 100
481
96,0
< 100
491
97,9
< 100
517
103,4
< 100
483
96,6
< 100
491
98,3
< 100
510
102,0
< 100
531
106,2
Даже в случаях использования НВ48-33, НВ48-35 и НВ48-59 (Корейский патент № 1072895), которые являются иными анти-HBs антителами, чем GC1102, можно подтвердить, что титр всех антител может быть точно измерен с помощью Hepabig-Gene ИФА, подобного GC1102, по сравнению с существующим способом.
Настоящее изобретение подробно описано на основе его частных характеристик, и для специалиста в данной области техники понятно, что эти специфические технологии являются просто предпочтительными вариантами осуществления и соответственно объем настоящего изобретения не ограничивается этими вариантами осуществления. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения и ее эквивалентом.
Промышленная применимость
Набор для измерения титра Fc-содержащего белка в соответствии с настоящим изобретением позволяет преодолеть то ограничение, что титр специфического Fc-содержащего белка, такого как человеческое антитело, гуманизированное антитело или белок, слитый с человеческим Fc, нельзя точно определить из-за ряда неспецифических антител, присутствующих в человеческой плазме или сыворотке, в существующем наборе для измерения титра с использованием иммуноферментного анализа (ФИА) с нанесением специфических антигенов или функциональных групп; и позволяет измерить титр белка, содержащего человеческий Fc, в человеческой плазме или сыворотке при сохранении высокой сходимости среди тестируемых субъектов.
В частности, существующий анализ титра белка, содержащего человеческий Fc, в частности человеческого антитела или гуманизированного антитела, имеет измеряемый диапазон от 10 до максимум 1000 мМЕ/мл. Однако анализ титра с использованием набора для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, в соответствии с настоящим изобретением имеет гораздо более широкий диапазон измерения от 100 до максимум 10000 мМЕ/мл.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением титр можно измерить с высокой сходимостью даже при анализе титра антител или Fc-содержащего белка, полученного от специфических видов животных, подобно настоящему изобретению, в плазме или сыворотке этих видов животных.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Набор для измерения титра белка, содержащего человеческий Fc, включающий: (a) раствор для разведения образца, включающий от 5 до 100% (м/о) коровьей сыворотки, от 0,05 до 0,2% (м/о) обезжиренного сухого молока, от 0,025 до 0,1% (м/о) неионного ПАВ и от 0,025 до 0,1% (м/о)
консерванта;
(b) раствор для разведения конъюгата, включающий 10% (м/о) козьей сыворотки;
(c) раствор для промывки, включающий от 10 до 40 мМ натрия ацетата, от 75 до 300 мМ натрия хлорида и от 0,025 до 0,1% (м/о) неионного ПАВ.
2. Набор по п.1, где консервантом является Proclin 300.
3. Набор по п.1, где козья сыворотка включает козье антитело к IgG человека.
4. Набор по п.3, где козье антитело к IgG человека является специфичным к Fc человека.
5. Набор по п.1, где белок, содержащий человеческий Fc, является одним или более выбранными из
группы, состоящей из человеческого антитела, гуманизированного антитела и слитого белка, содержаще-
го человеческий Fc.
6. Набор по п.1, где рН раствора для промывки составляет 3-5.
7. Способ измерения титра белка, содержащего Fc человека, с использованием набора по п.1, включающий:
(a) разведение образца, содержащего человеческий Fc, с использованием раствора для разведения
образца;
(b) проведение реакции со стандартными растворами, разведенными до различных концентраций, и раствором для разведения образца в ячейках планшета, на которых адсорбирован целевой антиген;
(c) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки;
(d) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора для разведения конъюгата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию;
(e) удаление содержимого каждой ячейки и промывание каждой ячейки раствором для промывки;
(f) полное удаление раствора для промывки, оставшегося в каждой из ячеек, и добавление раствора субстрата в каждую из ячеек, в которых проводят реакцию;
(g) остановку реакции путем добавления раствора для остановки реакции в каждую из ячеек;
(h) измерение поглощения стандартных растворов и образца.
8. Способ по п.7, где образец, включающий белок, содержащий Fc человека, является одним или более выбранными из группы, состоящей из человеческой сыворотки, человеческой плазмы и человеческой крови.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032572
- 1 -
032572
- 1 -
032572
- 1 -
032572
- 1 -
032572
- 1 -
032572
- 1 -
032572
- 9 -
032572
- 16 -
|
