[RU]

1. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.

2. Применение по п.1, где ангиогенез индуцируют в ишемизированной ткани или органе у указанного субъекта.

3. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.

4. Применение по п.3, где кровоток увеличивают в ишемизированной ткани или органе указанного субъекта.

5. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.

6. Применение по любому из пп.1-5, где указанная средняя молекулярная масса составляет от 4500 до 5500 Да.

7. Применение по любому из пп.1-6, где указанный декстрансульфат или указанная его фармацевтически приемлемая соль имеет среднее содержание серы от 15 до 20%.

8. Применение по п.7, где указанное среднее содержание серы составляет приблизительно 17%.

9. Применение по любому из пп.1-8, где среднечисленная молекулярная масса (M _n ) указанного декстрансульфата или указанной его фармацевтически приемлемой соли, измеренная с помощью ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, составляет от 1850 до 2000 Да.

10. Применение по п.9, где в указанном декстрансульфате или указанной его фармацевтически приемлемой соли количество единиц глюкозы составляет в среднем 5,1, а среднее количество сульфата на единицу глюкозы составляет от 2,6 до 2,7.

11. Применение по любому из пп.1-10, где указанный декстрансульфат или указанную его фармацевтически приемлемую соль получают в виде водного раствора для инъекций.

12. Применение по любому из пп.1-11, где указанный субъект представляет собой человека, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного человека.

13. Применение по п.12, где указанное заболевание, расстройство или медицинское состояние выбраны из группы, состоящей из заживления ран, периферической ишемии, предпочтительно ишемии после трансплантации органов, тканей или клеток, заболевания периферических артерий, ишемии конечностей, синдрома беспокойных ног, синдрома Рейно, серповидно-клеточной анемии или облитерирующего тромбангиита; коронарной ишемии, предпочтительно застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или коронарной болезни сердца; ишемического заболевания у детей, предпочтительно перинатального или неонатального заболевания, неонатального гипоксического или ишемического повреждения головного мозга, асфиксической энцефалопатии, церебрального паралича; ишемии центральной нервной системы, предпочтительно травматического повреждения головного мозга, височного артериита, гипоксии, вызванной рассеянным склерозом, инсультом, боковым амиотрофическим склерозом; заболевания мышечной дистрофии; ишемии, вызванной тромботическими, геморрагическими или травматическими повреждениями.

14. Применение по любому из пп.1-13, где указанная фармацевтически приемлемая соль декстрансульфата представляет собой натриевую соль декстрансульфата.

15. Способ индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да.

16. Способ по п.15, где указанный декстрансульфат или указанную его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозировке, составляющей от 0,05 до 50 мг/кг массы тела указанного субъекта, предпочтительно от 0,05 до 30 мг/кг массы тела указанного субъекта и более предпочтительно от 0,1 до 15 мг/кг или от 0,1 до 10 мг/кг массы тела указанного субъекта.

17. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.

18. Способ увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да.

19. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.

20. Способ васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да.

21. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.

22. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза в органе и/или васкуляризированной ткани, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.

23. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока в васкуляризированной ткани и/или органе, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.

24. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации васкуляризированной ткани и/или органа, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.

(57) Реферат / Формула:

1. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.

2. Применение по п.1, где ангиогенез индуцируют в ишемизированной ткани или органе у указанного субъекта.

3. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.

4. Применение по п.3, где кровоток увеличивают в ишемизированной ткани или органе указанного субъекта.

5. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.

6. Применение по любому из пп.1-5, где указанная средняя молекулярная масса составляет от 4500 до 5500 Да.

7. Применение по любому из пп.1-6, где указанный декстрансульфат или указанная его фармацевтически приемлемая соль имеет среднее содержание серы от 15 до 20%.

8. Применение по п.7, где указанное среднее содержание серы составляет приблизительно 17%.

9. Применение по любому из пп.1-8, где среднечисленная молекулярная масса (M _n ) указанного декстрансульфата или указанной его фармацевтически приемлемой соли, измеренная с помощью ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, составляет от 1850 до 2000 Да.

10. Применение по п.9, где в указанном декстрансульфате или указанной его фармацевтически приемлемой соли количество единиц глюкозы составляет в среднем 5,1, а среднее количество сульфата на единицу глюкозы составляет от 2,6 до 2,7.

11. Применение по любому из пп.1-10, где указанный декстрансульфат или указанную его фармацевтически приемлемую соль получают в виде водного раствора для инъекций.

12. Применение по любому из пп.1-11, где указанный субъект представляет собой человека, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного человека.

13. Применение по п.12, где указанное заболевание, расстройство или медицинское состояние выбраны из группы, состоящей из заживления ран, периферической ишемии, предпочтительно ишемии после трансплантации органов, тканей или клеток, заболевания периферических артерий, ишемии конечностей, синдрома беспокойных ног, синдрома Рейно, серповидно-клеточной анемии или облитерирующего тромбангиита; коронарной ишемии, предпочтительно застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или коронарной болезни сердца; ишемического заболевания у детей, предпочтительно перинатального или неонатального заболевания, неонатального гипоксического или ишемического повреждения головного мозга, асфиксической энцефалопатии, церебрального паралича; ишемии центральной нервной системы, предпочтительно травматического повреждения головного мозга, височного артериита, гипоксии, вызванной рассеянным склерозом, инсультом, боковым амиотрофическим склерозом; заболевания мышечной дистрофии; ишемии, вызванной тромботическими, геморрагическими или травматическими повреждениями.

14. Применение по любому из пп.1-13, где указанная фармацевтически приемлемая соль декстрансульфата представляет собой натриевую соль декстрансульфата.

15. Способ индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да.

16. Способ по п.15, где указанный декстрансульфат или указанную его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозировке, составляющей от 0,05 до 50 мг/кг массы тела указанного субъекта, предпочтительно от 0,05 до 30 мг/кг массы тела указанного субъекта и более предпочтительно от 0,1 до 15 мг/кг или от 0,1 до 10 мг/кг массы тела указанного субъекта.

17. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.

18. Способ увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да.

19. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.

20. Способ васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да.

21. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.

22. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза в органе и/или васкуляризированной ткани, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.

23. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока в васкуляризированной ткани и/или органе, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.

24. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу M _w от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации васкуляризированной ткани и/или органа, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.

---

Евразийское 032569 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201692555
(22) Дата подачи заявки
2015.06.11
(51) Int. Cl. A61K 31/721 (2006.01) A61P 9/10 (2006.01)
(54) ПРИМЕНЕНИЕ ДЕКСТРАНСУЛЬФАТА, ИМЕЮЩЕГО СРЕДНЮЮ МОЛЕКУЛЯРНУЮ МАССУ Mw ОТ 4500 ДО 7500 ДА, ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ АНГИОГЕНЕЗА У СУБЪЕКТА
(31) 1450729-7; 1451120-8; 1451540-7
(32) 2014.06.12; 2014.09.22; 2014.12.15
(33) SE
(43) 2017.04.28
(86) PCT/SE2015/050677
(87) WO 2015/190989 2015.12.17
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ТХ МЕДИК АБ (SE)
(72) Изобретатель:
Ваас Андерс, Брюс Ларс, Брюс Адам (SE)
(74) Представитель:
Харин А.В., Котов И.О., Буре Н.Н., Стойко Г.В. (RU) (56) WO-A1-2004047848
Strilic, Boris et al. "Electrostatic Cell-Surface repulsion initiates lumen formation in developing blood vessels", Current Biology, 2010, 20, 2003-2009; whole document
Gajanayake T. et al.," Dextran sulfate facilitates anti-CD4 mAb-induced long-term rat cardiac allograft survival after prolonged cold ischemia", American Journal of Transplantation, 2008, 8, 1151 -1162; whole document
US-A1-20100087393
(57) Варианты осуществления изобретения относятся к индуцированию ангиогенеза, в частности к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта, и для увеличения кровотока или васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта, страдающего от ишемии, а также к соответствующим способам. Применение декстрансульфата в указанном диапазоне средних молекулярных масс обеспечивает эффективное влияние на ангиогенез, не вызывая побочных эффектов.
Область изобретения
Варианты осуществления, в общем, относятся к ангиогенезу и, в частности, к применению декстрансульфата для индуцирования ангиогенеза у субъекта.
Предшествующий уровень техники
Ангиогенез представляет собой физиологический процесс, при котором новые кровеносные сосуды формируются из уже существующих сосудов. Он отличается от васкулогенеза, который представляет собой de novo образование эндотелиальных клеток из клеток-предшественников мезодермы. Первичные сосуды в развивающемся эмбрионе формируются посредством васкулогенеза, после чего ангиогенез является ответственным за большую часть роста, если не за весь рост, новых кровеносных сосудов в процессе развития и при болезни.
Ангиогенез представляет собой нормальный и жизненно важный процесс при росте и развитии, а также при заживлении ран и в формировании грануляционной ткани.
Ангиогенез традиционно классифицируют как ангиогенез, при котором происходит образование сосудистых отростков, или образование сосудов путем инвагинации, или ангиогенез, при котором происходит разделение сосудов. Ангиогенез, при котором происходит образование сосудистых отростков, формирует совершенно новые кровеносные сосуды, в то время как при разделении сосудов, существующий кровеносный сосуд разделяется на два.
Ангиогенез может стать мишенью для борьбы с заболеваниями, которые характеризуются либо плохой васкуляризацией, либо нарушениями сосудистой системы. Отсутствие кровеносных сосудов в восстанавливаемой или в другой метаболически активной ткани, может препятствовать восстановлению или другим важных функциям. Некоторые болезни, такие как ишемические хронические повреждения, являются результатом отсутствия или недостаточного образования кровеносных сосудов и могут быть вылечены локальным распространением кровеносных сосудов, в результате чего, поступление новых питательных веществ к месту ускорят восстановление.
Современное клиническое применение принципа ангиогенеза можно разделить на два основных направления: антиангиогенные терапии и проангиогенные терапии. В то время как антиангиогенные терапии в настоящее время используют для лечения или профилактики рака и злокачественных новообразований, которые требуют большое количество кислорода и питательных веществ для пролиферации, проангиогенные терапии в настоящее время изучают в качестве альтернативного варианта для лечения, например, сердечно-сосудистых заболеваний, коронарной болезни сердца, атеросклеротических заболеваний, ишемической болезни сердца, заболеваний периферических артерий, нарушений заживления ран
и т.д.
Традиционные подходы проангиогенного лечения включают, среди прочего, генную терапию, направленную на амплификацию и ингибирование генов интереса; протеинотерапию, которая в первую очередь управляет ангиогенными факторами роста; и клеточную терапию, которая включает введение специфических типов клеток.
Существуют серьезные нерешенные проблемы, связанные с генной терапией. Трудности включают эффективную интеграцию терапевтических генов в геном клеток-мишеней, снижающих риск нежелательного иммунного ответа, потенциальную токсичность, иммуногенность, воспалительные реакции и онкогенез, связанный с вирусными векторами, применяемыми при внедрении генов, и невероятную сложность генетической основы ангиогенеза.
В проангиогенной протеинотерапии применяют различные факторы роста, такие как фактор роста фибробластов (FGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), для стимулирования ангиогенеза. Препятствием для протеинотерапии является способ доставки. Пероральный, внутривенный, внутриартери-альный, или внутримышечный способы введения белка не всегда так же эффективны, как когда терапевтический белок может быть метаболизирован или очищен до попадания в ткани-мишени. Проангиоген-ные клеточные терапии находятся еще на ранних стадиях исследований, с большим количеством открытых вопросов относительно подходящих типов клеток и дозировки использования.
Ишемия представляет собой ограничение в кровоснабжении тканей, вызывающее дефицит кислорода и глюкозы, необходимых для клеточного метаболизма. Ишемия, как правило, вызвана проблемами с кровеносными сосудами, с возникающими повреждениями или дисфункцией ткани. Она также означает локальную анемию и гипоксию в той или иной части тела, иногда в результате заторов, таких как сосудистый спазм, тромбоз или эмболия.
Восстановление коронарного кровотока после периода длительной ишемии, часто включает так называемое реперфузионное повреждение, вызывающее повреждения эндотелия, и пораженный эндотелий, который проявляет прокоагулянтный и провоспалительный фенотип. Реперфузия значительно ускоряет вызванные ишемией активацию комплемента и депонирование.
Декстрансульфат представляет собой хорошо известный ингибитор комплемента, и поэтому был предложен для достижения цитопротекции эндотелия от реперфузионного повреждения после ишемии.
В Experimental Cell Research 215, 294-302 (1994) раскрыто, что сульфатированные полисахариды, такие как гепарин и декстрансульфат, могут быть использованы in vitro для индуцированного коллагеном формирования сосудистой трубки. Однако экспериментальные данные in vivo показали, что низкомоле
кулярный сульфатированный полисахарид гепарин (2,4 кДа) ингибирует ангиогенез, Glycobiology 3, 567573 (1993), Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23, 141 -149 (1993).
В патенте U.S. 5,135,920 раскрыто, что декстрансульфат со средней молекулярной массой 500000 Да является ангиостатическим, т.е. ингибирующим ангиогенез.
Существуют возможности для усовершенствования в области ангиогенеза в данной области.
Краткое описание изобретения
Основной целью является индуцировать ангиогенез у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.
Другой целью является увеличить кровоток у субъекта, страдающего от ишемии.
Данные и другие цели соответствуют вариантам осуществления, как описано в настоящем документе.
Один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.
Другой аспект вариантов осуществления относится к способу индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта. Способ включает введение субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющего среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к способу увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии. Способ включает введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до
7500 Да.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.
Следующий аспект вариантов осуществления относится к способу васкуляризации ишемизирован-ной ткани у субъекта. Способ включает введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
Другой аспект вариантов осуществления относится к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.
Следующий аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для применения для индуцирования ангиогенеза в органе и/или васкуляризированной ткани in vitro или ex vivo, для применения для увеличения кровотока в васкуляризированной ткани и/или органе in vitro или ex vivo и/или для васкуляризации васкуляризированной ткани и/или органа in vitro или ex vivo, а также к связанным с ними способами.
Краткое описание графических материалов
Варианты осуществления, вместе с их дополнительными целями и преимуществами, могут быть лучше поняты посредством ссылки на следующее описание вместе с сопровождающими графическими материалами.
На фиг. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая среднюю массу тела для всей модели критической ишемии конечностей у мышей. Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим апостериорным сравнением Бонферрони не выявил статистически значимых различий между группами.
На фиг. 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая средний кровоток исследуемой группы для всей модели критической ишемии конечностей у мышей. Для повторных измерений был выполнен двухфакторный ANOVA с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Сравнение групп 2M, 3M и 4M, получавших лечение декстрансульфатом, с контрольной группой 1M выявило статистически значимые различия с 14 и 21 суток по 35 сутки (p <0,001).
На фиг. 3 представлена диаграмма, иллюстрирующая плотность капилляров CD34 групп на основе
исследования критической ишемии конечностей, после двойного окрашивания FITC-меченным декстра-ном (DA). Столбцы DA представляют функциональные капилляры. Статистический анализ выполняли с применением двухфакторного ANOVA с последующим множественным сравнением Бонферрони.
На фиг. 4 представлена диаграмма сравнения плотности капилляров CD34 ишемизированных и не ишемизированных конечностей в группах на основе исследования критической ишемии конечностей, после двойного окрашивания FITC-меченным декстраном (DA). Столбцы DA представляют функциональные капилляры. Статистический анализ выполняли с применением двухфакторного ANOVA с последующим множественным сравнением Бонферрони.
На фиг. 5A-5C показана плотность капилляров CD34 групп в исследовании критической ишемии конечностей (фиг. 5A - мышь из контрольной группы 1M, получавшей носитель; фиг. 5B - мышь из группы 3M, получавшей декстрансульфат 30 мг/кг многократно; фиг. 5C - мышь из группы 4M, получавшей декстрансульфат 30 мг/кг однократно). Левые диаграммы показывают CD34 окрашивание, а правые диаграммы показывают окрашивание FITC-меченым декстраном.
На фиг. 6 представлена диаграмма, иллюстрирующая оценку функционирования HLI-поврежденной конечности у животных, получавших декстрансульфат. На сутки 0 HLI индуцировали путем лигирования и иссечения бедренной артерии. Лечение начинали на 8-е сутки введением носителя или 10 или 30 мг/кг декстрансульфата, один раз в неделю (1х/н) или 3 раза в неделю (3х/н). Конечность оценивали по шкале от 0 до 3, где 3 представляет собой худший показатель (волочение ноги). Декстран-сульфат индуцировал значительное улучшение с суток 21 и в последующий период (анализ на сутки 7, 14, 21, 28 и 35), рассчитывали двухфакторным ANOVA.
На фиг. 7 представлена диаграмма, иллюстрирующая плотность капилляров групп в исследовании критической ишемии конечностей эндотелиального маркера актина гладких мышц (SMA). Статистическая значимость в соответствии с двухфакторным ANOVA с последующим множественным сравнением Бонферрони.
На фиг. 8 сравнивается кровоток, измеренный у двух мышей с помощью бесконтактной лазерной доплеровской визуализации, через 35 дней после лигирования бедренной артерии левой задней конечности. На нижней панели представлено получение носителя (группа 1М), на верхней панели представлено лечение декстрансульфатом (группа 3M).
На фиг. 9 представлено распределение массы тела в группах, используемое для исследования инсульта tMCAO.
На фиг. 10 представлена система подсчета Neuroscore по группам лечения на протяжении всего исследования инсульта tMCAO.
На фиг. 11 представлен шаговый тест по группам лечения на протяжении всего исследования инсульта tMCAO.
На фиг. 12 представлен тест по оценке реакции передних конечностей на стимуляцию по группам лечения на протяжении всего исследования инсульта tMCAO.
На фиг. 13 представлен тест тела на качание дельта (левый поворот-правый поворот) по группам лечения на протяжении всего исследования инсульта tMCAO.
На фиг. 14 представлено соотношение церебрального кровотока и процентного изменения среднего диаметра сосудов в обеих группах, получавших лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, на сутки 29.
На фиг. 15 представлена плотность капилляров SMA у крыс, получавших лечение декстрансульфа-том 15 мг/кг ежедневно, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, на сутки 30.
На фиг. 16 представлена GFAP область (область положительных клеток в квадратных микронах в поле зрения при 10-кратном увеличении) в группе, получавшей лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, на сутки 30.
На фиг. 17A и 17B представлена эффективность лечения на плотность капилляров у крысы из контрольной группы, получавшей носитель (фиг. 17A), и из группы, получавшей декстрансульфат (15 мг/кг ежедневно) (фиг. 17B).
На фиг. 18 представлен размер инфаркта через 35 суток после индуцирования ИМ.
На фиг. 19 представлено сравнение SMA окрашивания через 35 суток после индуцирования ИМ для группы, получавшей лечение декстрансульфатом (15 мг/кг 3 раза в неделю в течение 3-х недель), и контрольной группы, получавшей носитель.
На фиг. 20A-20C представлено SMA окрашивание сосудистой плотности для двух крыс, получавших декстрансульфат (15 мг/кг 3 раза в неделю в течение 3-х недель) (фиг. 20A, 20B), и одной контрольной крысы, получавшей носитель (фиг. 20C).
На фиг. 21 представлено среднее значение кровотока в модели HLI у крыс.
На фиг. 22 представлены оценки конечности в модели HLI у крыс.
На фиг. 23 представлена плотность капилляров SMA и фактора 8 HLI-поврежденной ноги. На фиг. 24 представлена оценка ангиографии капилляров HLI-поврежденной ноги. На фиг. 25A-25D представлены изображения ангиографии капилляров контрольного животного, получавшего носитель (фиг. 25A), и животных, состоящих в группах лечения 2M, 3M и 4M (фиг. 25B
25D).
На всех фигурах представлены среднее значение + стандартная ошибка среднего.
Подробное описание изобретения
Настоящие варианты осуществления, в общем, относятся к ангиогенезу и, в частности, к применению декстрансульфата для индуцирования ангиогенеза у субъекта.
Настоящие варианты осуществления основаны на раскрытии того факта, что декстрансульфат определенной средней молекулярной массы имеет эффект индуцирования ангиогенеза и увеличения кровотока при введении субъекту, предпочтительно субъекту, который является млекопитающим, и более предпочтительно субъекту, который является человеком.
Данный эффект декстрансульфата в соответствии с вариантами осуществления был весьма неожиданным в свете предшествующего уровня техники, раскрывающего, что сульфатированные полисахариды ингибируют ангиогенез in vivo и что декстрансульфат со средней молекулярной массой 500000 Да является ангиостатическим, т.е. ингибирующим ангиогенез.
Экспериментальные данные, представленные в настоящем документе, ясно показывают, что декст-рансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, влияет in vivo на индуцирование ангиогенеза, как показано, за счет значительного увеличения среднего кровотока, уменьшения тяжести ишемии, повышения плотности капилляров в модели ишемии и в модели инсульта и уменьшения размера инфаркта в модели инфаркта миокарда (ИМ). Декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, кроме того, способен к селективному формированию кровеносных сосудов в ишемизированной ткани, при этом не вызывая какого-либо значительного образования сосудов в неишемизированной ткани.
Соответственно, один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500, для применения в индуцировании ангиогенеза у субъекта.
В дальнейшем, упоминание (средней) молекулярной массы и содержания серы декстрансульфата применимо также к любой фармацевтически приемлемой соли декстрансульфата. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль декстрансульфата предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу и содержание серы, как описано в следующих вариантах осуществления.
Декстрансульфат вне объема вариантов осуществления, как полагают, имеет меньшее влияние или на самом деле не имеет влияния на ангиогенез вовсе. Например, гепарин, другой сульфированный полисахарид, со средней молекулярной массой 2,4 кДа, фактически ингибирует ангиогенез, также как крупные молекулы декстрансульфата (Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23, 141-149 (1993); патент U.S. 5,135,920).
Кроме того, декстрансульфат с молекулярной массой, превышающей 10000 Да как правило, имеет более низкий эффект против побочных эффектов в отличие от декстрансульфата, имеющего меньшую среднюю молекулярную массу. Это означает, что максимальная доза декстрансульфата, которую можно безопасно вводить субъекту, является меньшей для более крупных молекул декстрансульфата (более 10000 Да), в отличие от молекул декстрансульфата, имеющих среднюю молекулярную массу в пределах данного диапазона. Как следствие, такие крупные молекулы декстрансульфата менее целесообразны для клинического применения, когда декстрансульфат следует вводить субъектам in vivo. Кроме того, крупные молекулы декстрансульфата имеют фактически противоположный эффект в отличие от декстран-сульфата, в соответствии с вариантами осуществления, как это раскрыто в патенте U.S. 5,135,920.
Таким образом, по-видимому, есть очень узкий диапазон средней молекулярной массы декстран-сульфата, в котором декстрансульфат имеет влияние на ангиогенез при введении субъекту, и молекулы декстрансульфата за пределами объема вариантов осуществления не имеют или на самом деле имеют эффект ингибирования ангиогенеза.
Декстрансульфат представляет собой сульфатированный полисахарид и, в частности, сульфатиро-ванный глюкан, т.е. полисахарид состоящий из множества молекул глюкозы. Средняя молекулярная масса, как определено в данном описании, указывает на то, что отдельные сульфатированные полисахариды могут иметь молекулярную массу, отличную от этой средней молекулярной массы, но, что средняя молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу сульфатированных полисахаридов. Это также подразумевает, что существует естественное распределение молекулярных масс вокруг данной средней молекулярной массы для образца декстрансульфата.
Среднюю молекулярную массу (Mw) декстрансульфата обычно определяют с использованием косвенных способов, таких как гель-проникающая хроматография, рассеяние света или вязкость. Определение средней молекулярной массы с использованием таких косвенных способов будет зависеть от целого ряда факторов, в том числе выбора колонки и элюента, скорости потока, процедуры калибровки и т.д.
Средняя молекулярная масса (Mw): ^ M'Ni типична для способов, чувствительных к молекулярному размеру, а не числовым значениям, например рассеяние света и способам гель-проникающей хроматографии (SEC). Если предполагается нормальное распределение, то одна и та же масса будет с каждой стороны Mw, то есть общая масса молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу
ниже Mw, равна общей массе молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу выше
Mw.
В одном из вариантов осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль имеет среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
В необязательном, но предпочтительном варианте осуществления менее 40% молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу Mw менее 3000 Да, предпочтительно менее 35%, в том числе менее 30% или менее 25% молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу Mw менее 3000 Да. Кроме того или в качестве альтернативы, менее 20% молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу Mw более 10000 Да, предпочтительно менее 15%, в том числе менее 10% или менее 5% молекул декстран-сульфата имеют молекулярную массу Mw более 10000 Да. Таким образом, в конкретном варианте осуществления, декстрансульфат имеет, по существу, узкое молекулярно-массовое распределение вокруг средней молекулярной массы.
В одном конкретном варианте осуществления средняя молекулярная масса Mw декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 4500 до 5500 Да.
Таким образом, в данном предпочтительном варианте осуществления средняя молекулярная масса Mw декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли предпочтительно составляет приблизительно 5000 Да или по меньшей мере, по существу, близко к 5000 Да, в том числе 5000±500 Да, например, 5000±400 Да, предпочтительно 5000±300 Да или 5000±200 Да, в том числе 5000±100 Да. Следовательно, в одном варианте осуществления средняя молекулярная масса Mw декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли составляет 4,5 кДа, 4,6 кДа, 4,7 кДа, 4,8 кДа, 4,9 кДа, 5,0 кДа, 5,1 кДа, 5,2 кДа, 5,3 кДа, 5,4 кДа или 5,5 кДа.
В конкретном варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, как представлено выше, представляет собой среднюю Mw, и ее предпочтительно определяют с помощью гель-проникающей хроматографии, гель-фильтрационной хроматографии, рассеянием света или способами, основанными на вязкости.
В конкретном варианте осуществления, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль состоит, в среднем, из приблизительно или чуть более 5 единиц глюкозы и имеет среднее количество сульфата на единицу глюкозы по меньшей мере 2,0, такое как по меньшей мере 2,5.
Декстрансульфат представляет собой полианионное производное декстрана и содержит серу. Среднее содержание серы в декстрансульфате, в соответствии с вариантами осуществления, составляет предпочтительно от 15 до 20% и более предпочтительно приблизительно 17%, как правило, соответствуя приблизительно двум сульфатным группам на остаток глюкозила. В конкретном варианте осуществления, содержание серы в декстрансульфате предпочтительно равно или по меньшей мере близко к максимально возможной степени содержания серы в молекулах декстрана.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, имеет среднечисленную молекулярную массу (Mn), измеренную с помощью ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, составляющую от 1850 до 2000 Да.
В другом конкретном варианте осуществления декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, имеет в среднем 5,1 единицу глюкозы и среднее количество сульфата на единицу глюкозы от 2,6 до 2,7, что, как правило, приводит к тому, что среднечисленная молекулярная масса (Mn), измеренная с помощью ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, составляет от 1850 до 2000 Да.
Среднечисленную молекулярную массу (MJ: 2^; как правило, получают с помощью анализа концевых групп, например ЯМР-спектроскопии или хроматографии. Если предполагается нормальное распределение, то одно и то же количество молекул декстрансульфата может быть найдено с каждой стороны Mn, то есть количество молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу менее Mn, равно количеству молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу более Mn.
Декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, может быть представлен в качестве фармацевтически приемлемого производного декстрансульфата. Такие фармацевтически приемлемые производные включают соли декстрансульфата, например натриевую или калиевую соли.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемую соль, в соответствии с вариантами осуществления, предпочтительно вводят субъекту путем инъекции и в частности путем внутривенной (в.в.) инъекции, подкожной (п.к.) инъекции или внутрибрюшинной инъекции, предпочтительно в.в. или п.к. инъекции. Могут быть применены другие парентеральные пути введения, включая внутримышечную и внутрисуставную инъекции. Инъекция декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли может быть введена, в качестве альтернативы или в дополнение, непосредственно в место, например, ишемизированную ткань или орган, или другое место тела субъекта, в которых имеет место ангиогенез и увеличение кровотока.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль, в соответствии с вариантами осуществления, предпочтительно получают в виде водного раствора для инъекций с выбранным растворителем или наполнителем. Растворитель представляет собой преимущественно водный растворитель и в частности буферный раствор. Не ограничивающим примером такого буферного раствора является буфер ли
монной кислоты, такой как буфер моногидрат лимонной кислоты (CAM) или фосфатный буфер. Например, декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, может быть растворен в физиологическом растворе, таком как 0,9% NaCl физиологический раствор, а затем, необязательно, забуферен с помощью 75 мМ CAM, и pH доведен до приблизительно 5,9 с использованием гидроксида натрия. Также небуферизованные растворы возможны, в том числе водные растворы для инъекций, такие как физиологический раствор, т.е. NaCl (водный). Кроме того, могут быть использованы другие буферные системы, кроме CAM, если буферный раствор желателен.
Варианты осуществления не ограничиваются инъекциями и в качестве альтернативы могут быть применены другие способы введения, в том числе пероральное, интраназальное, буккальное, ректальное, дермальное, трахеальное, бронхиальное, или местное введение. Активное соединение, декстрансульфат, затем объединяют с подходящим наполнителем или носителем, который выбирают на основании конкретного способа введения.
Приемлемая доза декстрансульфата, в соответствии с вариантами осуществления, может изменяться в зависимости от размера и массы субъекта, состояния, от которого лечат субъекта, а также от других факторов. В частности для субъекта, который является человеком, возможный диапазон доз может составлять от 1 мкг/кг до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно от 10 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела.
В предпочтительных вариантах осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемую соль получают для введения в дозировке, составляющей от 0,05 до 50 мг/кг массы тела субъекта, предпочтительно от 0,05 или 0,1 до 40 мг/кг массы тела субъекта, а более предпочтительно от 0,05 или 0,1 до 30 мг/кг, или от 0,1 до 25 мг/кг, или от 0,1 до 15 мг/кг или от 0,1 до 10 мг/кг массы тела субъекта.
Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемую соль, в соответствии с вариантами осуществления, предпочтительно начинают как можно быстрее после повреждения или другого состояния вызывающего ишемию, инсульт или сердечно-сосудистое заболевание у субъекта, или вызывающего заболевание, которое можно лечить или по меньшей мере облегчить, индуцированием ангиоге-неза, вызванного введением декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой солью.
Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли необязательно должно быть ограничено лечением данного заболевания, но может, в качестве альтернативы или дополнительно, быть применено для профилактики. Другими словами, декстрансульфат, раскрытый в вариантах осуществления, может быть введен субъекту, который будет проходить медицинскую процедуру, такую как операция, которая может привести к локальной ишемии или другим лечебным эффектам, которые можно лечить, ингибировать или облегчать путем индуцирования ангиогенеза и/или увеличения кровотока.
Декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, можно вводить разово, например, в виде однократной болюсной инъекции. Такая болюсная доза может быть введена достаточно быстро пациенту, но предпочтительно вводить в течение некоторого времени, таким образом, чтобы раствор дек-странсульфата вводили пациенту в течение нескольких минут, например, в течение от 5 до 10 мин.
В качестве альтернативы декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, можно вводить многократно, т.е. по меньшей мере дважды в течение периода лечения. Длительность такого периода лечения, как правило, связана с эндогенным периодом времени заживления ран при различных типах и определенном типе инсульта. Для получения дополнительной информации о подходящих периодах лечения, можно сослаться на Chapter 1 Overview of Wound Healing in Different Tissue Types, pages 340 of Indwelling Neural Implants: Strategies for Contending with the In Vivo Environment, ed. William M. Rei-chert, 2008 by Taylor & Francis Group, LLC (ISBN: 978-0-8493-9362-4).
Таким образом, декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, может быть введен один раз или несколько раз в день, один раз или несколько раз в неделю, один раз или несколько раз в месяц, в виде иллюстрирующего примера.
Как правило, при острых заболеваниях, например, вызванных острой ишемией при, например, инсульте, инфаркте миокарда (ИМ), трансплантации клеток и органов, длительность периода лечения может составлять однократное введение, но предпочтительно в виде нескольких введений за период лечения, например, через неделю, через несколько недель или через месяц. Более длительные периоды лечения до трех месяцев или даже до года могут обеспечить дополнительное улучшение заживления и восстановления.
Для ишемических состояний прерывистого типа, может существовать вариант применения лечение в виде профилактики (предотвращения) или лечения непосредственно после обострения заболевания. Такой тип введения может быть подходящим для таких заболеваний, как рассеянный склероз (MS), боковой амиотрофический склероз (ALS) и серповидно-клеточная анемия. Периоды лечения могут доходить до 1-3 месяцев для лечения после обострения. Для профилактики заболевания, возможно, могут быть использованы более длительные периоды лечения.
Индуцирование ангиогенеза у субъекта путем введения декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, предпочтительно происходит в организме человека, страдающего от заболевания, расстройства или медицинского состояния, вызывающего ишемию в организме субъекта, который является человеком.
Ишемия представляет собой ограничение в кровоснабжении тканей, вызывающее дефицит кисло
рода и глюкозы, необходимых для клеточного метаболизма. Ишемия, как правило, вызвана проблемами с кровеносными сосудами, с возникающими повреждениями или дисфункцией ткани или органа. Это также означает локальную анемию и гипоксию в той или иной части тела, иногда в результате заторов, таких как сосудистый спазм, тромбоз или эмболия.
Эффективное лечение ишемии или эффективный подход в предотвращении или по меньшей мере уменьшении риска страдания от ишемии, представляет собой индуцирование ангиогенеза. Ангиогенез вызывает увеличение кровотока в соответствующей ткани и тем самым может противодействовать любому ограничению кровоснабжения ткани, вызванного заболеванием, расстройством или медицинским состоянием.
Неограничивающие, но наглядные примеры заболеваний, расстройств или медицинских состояний, которые могут вызвать ишемию включают заживление ран; периферическую ишемию, такую как ишемия после трансплантации органов, тканей или клеток, заболевание периферических артерий, ишемия конечностей, синдром беспокойных ног, синдром Рейно, серповидно-клеточная анемия или облитери-рующий тромбангиит; коронарную ишемию, например, вызванную застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда или коронарной болезнью сердца; ишемические заболевания у детей, такие как перинатальные или неонатальные заболевания, детские болезни, например неонатальное гипоксиче-ское или ишемическое повреждение головного мозга, асфиксическая энцефалопатия, церебральный паралич; ишемию центральной нервной системы, например, вызванную травматическим повреждением головного мозга, височным артериитом, гипоксию, вызванную рассеянным склерозом, инсультом, боковым амиотрофическим склерозом; или заболевание мышечной дистрофии; ишемию, вызванную тромбо-тическими, геморрагическими или травматическими повреждениями.
Заживление ран обычно включает четыре фазы, которые, как правило, называют ранняя фаза, фаза воспаления, пролиферативная фаза и фаза созревания и ремоделирования. Ангиогенез является одним из процессов, происходящих во время пролиферативной фазы. Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли может способствовать эффекту ангиогенеза, возникающего в качестве одного из вспомогательных процессов заживления ран. Процесс ангиогенеза происходит одновременно с пролиферацией фибробластов в процессе заживления ран, когда эндотелиальные клетки мигрируют в область раны. Поскольку активность фибробластов и эпителиальных клеток требует кислорода и питательных веществ, ангиогенез является обязательным для других стадий процесса заживления ран, таких как эпидермальная и миграция фибробластов.
Периферическая ишемия, как правило, означает ишемические состояния, происходящие в органах и тканях, отличных от сердца (коронарная ишемия) и центральной нервной системы (ишемия ЦНС). Могут существовать различные причины периферической ишемии. Типичным примером является трансплантация органов или тканей субъекту. Трансплантированный орган или ткани обычно подвергаются ишемии в ходе первоначального процесса приживления происходящего в точке пересадки, пока новые кровеносные сосуды не будут сформированы вокруг пересаженного органа или ткани. Существует высокий риск повреждения или дисфункции органа или ткани вследствие ишемии и гипоксии, если достаточное кровоснабжение не будет установлено вскоре после трансплантации. Следовательно, индуцирование ангиоге-неза посредством декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, согласно вариантам осуществления, при трансплантации может значительно снизить риск повреждений или дисфункции пересаженного органа или ткани вследствие ишемии и/или гипоксии. Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, согласно вариантам осуществления, может быть осуществлено до трансплантации, с целью индуцирования ангиогенеза и обеспечения увеличения кровотока в месте пересадки до фактического начала трансплантации. В таком случае, увеличение кровотока, индуцированное декстрансульфатом, в соответствии с вариантами осуществления, может быть достаточно, чтобы предотвратить или, по меньшей мере, уменьшить ишемические повреждения трансплантированного органа или ткани.
Заболевание периферических сосудов (PVD), которое обычно называют заболеванием периферических артерий (PAD) или окклюзионным заболеванием периферических артерий (PAOD) или периферическим заболеванием кровеносных сосудов, относится к закупорке крупных артерий, не имеющих отношения к венечному кровообращению, сосудистой системе дуги аорты или головному мозгу. PVD может возникнуть в результате атеросклероза, воспалительных процессов, приводящих к стенозу, эмболии или образованию тромбов. Это приводит к острой или хронической ишемии. Эффективным лечением PVD является восстановление кровотока путем введения декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, раскрытых в вариантах осуществления изобретения.
Ишемия конечностей, часто называемая острой ишемией конечности, имеет место, когда происходит внезапное прекращение кровотока к конечности. Острая ишемия конечности, как правило, возникает либо из-за эмболии или тромбоза. Тромбоз обычно является следствием заболевания периферических сосудов (атеросклеротического заболевания, которое приводит к закупорке кровеносных сосудов), в то время как причиной эмболии воздух, травмы, жир, амниотическая жидкость или опухоли. Субъекты, страдающие от ишемии конечности, получили бы пользу от введения декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, раскрытых в вариантах осуществления изобретения.
В медицине, феномен Рейно представляет собой чрезмерное уменьшение притока крови на холоде или при эмоциональном стрессе, вызывая изменение цвета пальцев, ног, а иногда и в других областях. Феномен Рейно сам по себе лишь признак (гипоперфузия), сопровождающийся симптомом. В патогенезе он может быть частью болезни Рейно (также известной как первичный феномен Рейно), где причина неизвестна, или частью синдрома Рейно (вторичный феномен Рейно), который представляет собой синдром, вызванный известным первичным заболеванием, наиболее часто заболеваниями соединительной ткани, такими как системная красная волчанка. Это гиперактивация симпатической нервной системы вызывает чрезмерный спазм периферических кровеносных сосудов, что приводит к гипоксии тканей. Хронические, рецидивирующие случаи феномена Рейно могут привести к атрофии кожи, подкожной ткани и мышцы, возможно, вызывая образование язв и ишемической гангрены. Введение декстрансуль-фата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, может быть эффективным средством снижения риска поражения, лечения или по меньшей мере облегчения симптомов синдрома или болезни Рейно.
Серповидно-клеточная болезнь (SCD), или серповидно-клеточная анемия (SCA) или дрепаноцитоз, это наследственное заболевание крови, характеризующееся тем, что красные кровяные клетки принимают аномальную неизменную, серповидную форму. Образование серповидных форм снижает пластичность красных кровяных клеток и приводит к риску недостаточного притока крови к части тела. Индуцирование ангиогенеза с применением декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, может быть использовано для снижения риска развития периферической ишемии у пациентов, страдающих от SCD.
Облитерирующий тромбангиит, также известный как болезнь Бюргера или пресенильная гангрена, представляет собой повторяющееся прогрессирующее воспаление и тромбоз (свертывание) малых и средних артерий и вен рук и ног. Поэтому облитерирующий тромбангиит может вызвать ишемию в руках и ногах из-за ограничения кровотока эти конечностей. Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, может быть эффективным средством для увеличения кровотока к рукам и ногам.
Коронарная ишемия представляет собой медицинский термин, обозначающий недостаточное количество крови в коронарных артериях. Коронарная ишемия связана с заболеваниями сердца, а также сердечными приступами. Она также известна как ишемия сердца. Коронарная болезнь сердца (CAD) возникает, когда жировые вещества прилипают к стенкам коронарных артерий, что сужает артерии и снижает кровоток. Это вызывает недостаток поступления кислорода и крови к сердцу, что может привести к инфаркту миокарда (сердечному приступу). CAD вызывает спазм артерий, что приводит к отсутствию крови, протекающей через артерии, а также кислорода, такой процесс называется атеросклероз. Атеросклероз является наиболее частой причиной коронарной ишемии. Увеличение кровотока в сердечной мышце посредством индуцирования ангиогенеза, вызванного путем введения декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, раскрытого в вариантах осуществления, может иметь большое значение для снижения риска или уменьшения нарушений, вызванных коронарной ишемией. Тромбоз также может стать причиной коронарной ишемии.
Инфаркт миокарда (ИМ) или острый инфаркт миокарда (ОИМ), широко известный как сердечный приступ, происходит, когда остановка потока крови в части сердца вызывает повреждение сердечной мышцы. Большинство ИМ происходит из-за коронарной болезни сердца. Механизм ИМ часто включает в себя отрыв атеросклеротической бляшки, что приводит к полному блокированию коронарной артерии. Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, уменьшает размер инфаркта. Соответственно, серьезные повреждения сердечной мышцы, вызванные инфарктом миокарда, могут быть значительно уменьшены в соответствии с вариантами осуществления.
Ишемия в ЦНС может быть вызвана различными причинами. Например, черепно-мозговая травма может привести к блокированию или ограничению кровотока части мозга. Такое ограничение кровотока может иметь серьезные последствия, если гипоксия происходит в головном мозге. Увеличение кровотока, вызванное введением декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, может быть использовано для снижения риска серьезных повреждений головного мозга, вызванных ишемией после травматического повреждения головного мозга.
Височный артериит, также известный как гигантоклеточный артериит (GCA), краниальный артериит или болезнь Хортона, представляет собой воспалительное заболевание кровеносных сосудов наиболее чаще с участием крупных и средних артерий головы, в основном ветвей наружной сонной артерии. Является одной из форм васкулита. Индуцирование ангиогенеза и увеличение кровотока, вызванные введением декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, могут быть полезными для субъектов, страдающих от височного артериита.
Инсульт, иногда упоминающийся как нарушение мозгового кровообращения (CVA), цереброваску-лярный инсульт (CVI) или, в разговорной речи, инсульт, представляет собой потерю функции головного мозга из-за нарушения его кровоснабжения. Такое нарушение является следствием либо ишемии, либо кровоизлияния. Ишемия происходит вследствие либо закупорки кровеносного сосуда по причине тром
боза или артериальной эмболии, либо системной гипоперфузии. Кровоизлияние в мозг происходит вследствие кровотечения кровеносных сосудов головного мозга, либо непосредственно в паренхиме головного мозга или в субарахноидальном пространстве окружающих тканей мозга. Субъект, страдающий от инсульта получил бы пользу от лечения, которое увеличивает приток крови к мозгу для уменьшения риска повреждений, вызванных недостаточным кровоснабжением. Как следствие этого, введение декст-рансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, в соответствии с вариантами осуществления, преимущественно подходит субъектам, страдающим от инсульта.
Различные неврологические расстройства могут привести к ограничению кровоснабжения ЦНС, например, части головного мозга. Например, в Multiple Sclerosis International 2013, 1-6 (2013) раскрыто, что поражения при раннем рассеянном склерозе (MS) связаны с гипоксией. Следовательно, субъекты, страдающие от MS могут получить пользу от увеличения кровотока для того, чтобы вылечить или по меньшей мере уменьшить или ингибировать гипоксию, связанную с MS.
Боковой амиотрофический склероз (ALS), также известный как болезнь моторных нейронов (MND) и болезнь Лу Герига, является нейродегенеративным заболеванием с различными причинами. Характеризуется быстро прогрессирующей слабостью вследствие атрофии мышц и мышечной спастичности, проблемами с речью (дизартрия), глотанием (дисфагия) и дыханием (одышка). Эксперименты показали, что ALS связан с уменьшением кровотока в, например, премоторных областях лобной доли головного мозга, Acta Neurologica Scandinavia 116, 340-344 (2007). Предположили, что увеличение кровотока посредством индуцирования ангиогенеза может быть полезным для субъектов, страдающих от ALS.
Индуцирование ангиогенеза в соответствии с вариантами осуществления, может дополнительно быть применено при имплантации различных медицинских приборов, датчиков и т.д., где может быть полезным индуцировать микроциркуляцию в направлении или на фоне имплантата.
Декстрансульфат, раскрытый в вариантах осуществления, таким образом, может быть применен для лечения, ингибирования или профилактики различных ишемических заболеваний, расстройств и состояний, а также ишемических составляющих в различных заболеваниях, расстройствах и состояниях.
Существенным преимуществом настоящих вариантов осуществления является то, что декстран-сульфат, раскрытый в вариантах осуществления, способен селективно индуцировать ангиогенез у субъекта, т.е. индуцировать ангиогенез локально, например, в ткани или органе, где это необходимо. Например, ангиогенез индуцируется и происходит в ишемизированной ткани, но отсутствует в неишемизиро-ванной ткани, как показано на фиг. 4, где видно наличие образования мелких капилляров (как показано с помощью CD-34) и подтверждение функционирования и активности капилляров (как показано с помощью DA) в ишемизированной правой конечности, но не в неишемизированной левой конечности.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к способу индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта. Способ включает введение субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
Следующий аспект вариантов осуществления относится к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да для получения лекарственного средства для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да для применения в увеличении кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.
Аспект, относящийся к вариантам осуществления, определяет способ увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии. Способ включает введение субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да. Другой аспект, относящийся к вариантам осуществления, определяет применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да для получения лекарственного средства для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.
В конкретном варианте осуществления, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль способны увеличивать кровоток в ишемизированной ткани или органе у субъекта.
Ткани или орган могут быть периферическим органом, сердцем или тканями ЦНС, такими как головной мозг, как описано выше.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли, имеющим среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.
Следующий аспект вариантов осуществления определяет способ васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта. Способ включает введение субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да. Другой аспект, относящийся к вариантам осуществления, определяет применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекар
ственного средства для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.
Ишемизированной тканью может быть периферический орган, сердце или ткани ЦНС, такие как головной мозг, как описано выше.
Васкуляризация, то есть формирование мелких капилляров, индуцированное или вызванное декст-рансульфатом, раскрытым в вариантах осуществления, происходит избирательно в ишемизированной ткани субъекта, но отсутствует в неишемизированной, то есть здоровой ткани субъекта. Таким образом, васкуляризация, индуцированная в соответствии с вариантами осуществления, происходит только в мес-те(ах), где она необходима, при этом не затрагивая здоровые ткани (незначительные васкуляризацион-ные образования).
Субъект представляет собой предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно примата и в частности человека. Настоящий вариант осуществления, однако, может быть применен также в ветеринарии. Неограниченные примеры субъектов животного происхождения включают приматов, кошек, собак, свиней, лошадей, мышей, крыс.
Варианты осуществления также могут быть применены для in vitro и/или ex vivo лечения васкуля-ризированной ткани и/или органов с тем, чтобы индуцировать ангиогенез в васкуляризированной ткани и/или органе, увеличить кровоток в васкуляризированной ткани и/или органе и/или васкуляризировать васкуляризированную ткань и/или орган.
В таком случае, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль могут быть добавлены к васкуляризированной ткани и/или органу при различных in vitro или ex vivo применениях. Например, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль могут быть добавлены в культуральную среду, в которую погружены или контактируют in vitro васкуляризированная ткань и/или орган. В качестве альтернативы, или в дополнение, васкуляризованная ткань и/или орган могут быть опрысканы раствором, содержащим декстрансульфат или его фармацевтически приемлемую соль. Кроме того, если васкуляризованная ткань и/или орган соединен с насосом искусственного кровообращения или устройством экстракорпоральной мембранной оксигенации (ECMO), то декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль могут быть добавлены в кровь, которую прокачивают через васкуляризованную ткань и/или орган.
Примеры
Пример 1. Оценивание ангиогенеза в модели критической ишемии задних конечностей у мышей.
Заболевание периферических артерий (PAD) является формой заболевания периферических сосудов (PVD), при которой обнаруживается частичная или полная блокировка кровоснабжения конечности, обычно ноги, что приводит к нарушению кровотока и гипоксии в ткани. Когда PAD развивается, оно достигает стадии критической ишемии конечностей (CLI) с изъязвлениями кожи, гангреной и неизбежными ампутациями. Терапевтический ангиогенез возник как неинвазивное средство стимулирования неова-скуляризации в ишемизированных тканях. Как раскрыто в настоящем исследовании, системные подкожные введения декстрансульфата стимулируют ангиогенез, вызывающий образование мелких кровеносных сосудов и пролиферацию эндотелиальных клеток. В настоящем исследовании модель стабильной тяжелой ишемии (Journal of Experimental and Clinical Medicine 31, 128-132 (2006)) была применена для оценки безопасности и эффективности декстрансульфата в отношении ангиогенеза и функционального исхода заболевания.
Материалы
Декстрансульфат со средней молекулярной массой от 5 до 7 кДа приобретали у pK Chemicals A/S, Дания. На фиг. с 1 по 4, 6, 7 декстрансульфат обозначен как ТМ-700.
Инъекционный раствор декстрансульфата получали за сутки до начала исследования. В качестве носителя использовали 0,9% NaCl (физиологический раствор) (Teva Pharmaceutical Industries Ltd). Раствор для инъекций получали путем добавления соответствующего объема NaCl к взвешенным соединениям, чтобы получить требуемую концентрацию для введения (10 или 30 мг/кг массы тела). Декстран-сульфат растворяли встряхиванием на вортексе или просто путем поворота колбы несколько раз. Раствор хранили при температуре от 2 до 8°C в течение ночи, чтобы стабилизировать агрегаты. На следующий день, колбу встряхивали на вортексе и раствор фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм, чтобы получить стерильный раствор. Растворы получали на 7-е сутки, чтобы использовать на 8-21 сутки, а на 21-е сутки было выполнено второе получение, для использования на 22-35 сутки. Раствор хранили при температуре от 2 до 8°C между датами применения.
60 самцов мышей Balb/c, возраст которых составлял 9 недель, со средней массой тела 24,7 г на начало исследования (сутки 0), приобретали у Harlan Laboratories, Израиль. Минимальная и максимальная масса, отмеченная в каждой группе, составляла ±20% от среднего группового значения. Животных содержали в соответствии с Национальным институтом здоровья (NIH) и Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC). Животных размещали в полисульфоновых (PSU) клетках (5/клетка) размером 42,5*265,6*18,5 см, с верхней решеткой из нержавеющей стали, оснащенных оборудованием для гранулированного питания и питьевой водой в прозрачной бутылке из поликарбоната; подстилка: использовали стерилизованную паром чистую рисовую шелуху (Harlan, Sani-chip, Cat#: 106S8216) и материал подстилки меняли вместе с клеткой, по меньшей мере два раза в неде
лю. Животных кормили ad libitum имеющейся в продаже пищей для грызунов (Teklad Certified Global 18% Protein Diet Cat#: 106S8216). Животные имели свободный доступ к автоклавированной и подкисленной питьевой воде (pH от 2,5 до 3,5), полученной из городского источника. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях, с кондиционером и фильтрами (HEPA F6/6) с достаточным запасом свежего воздуха (минимум 15 замен воздуха/час). Животных содержали в климатически контролируемой среде. Диапазон температур составлял от 20 до 24°C и диапазон относительной влажности (ОВ) составлял от 30 до 70% с циклом 12 часов света и 12 часов темноты.
Хирургическая операция
В день операции анестезию вызывали 1,5-3,0% изофлураном, 1,5% N2O и 0,5% O2. Мышей, находящихся под наркозом помещали вентральной поверхностью вверх. Делали надрез 0,5-1,0 см на коже в паховой области. Бедренную артерию лигировали проксимально только после дистальной части подвздошной артерии, и в дистальном направлении после ее бифуркации глубокой бедренной артерией с помощью 6-0 шелковой нити, рассечённой и иссечённой между двумя лигатурами. Рану закрывали 4-0 шелковой нитью, и мышь оставляли для восстановления.
Лечение декстрансульфатом
На 8-е сутки, 2-я неделя после операции, каждому животному в группах 2M и 3M вводили раствор декстрансульфата подкожно три раза в неделю. Животным в группе 4M вводили подкожно один раз в неделю, а группа 1M получала лечение носителем (NaCl), см. табл. 1.
Измерения массы тела
Массу тела измеряли на сутки -1 исследования до операции и один раз в неделю после этого. Между 0-ми сутками и 7-ми сутками наблюдали небольшое снижение средней массы тела во всех группах животных 1M, 2M, 3M и 4M в пределах от 1,1 г до 1,6 г, см. фиг. 1. С 14-х суток наблюдалось постепенное увеличение массы. Соответственно, между 0-ми сутками и 35-ми сутками среднее увеличение массы тела составило от 0,4 г до 1,7 г, см. табл. 2.
Таблица 2. Среднее изменение массы тела от базового уровня по исследуемой группе
Группа
Лечение
Среднее изменение массы от 0 до 35 суток (г)
носитель 3 раза в неделю
0,4
декстрансульфат 10 мг/кг 3 раза в неделю
1,0
декстрансульфат 30 мг/кг 3 раза в неделю
1,7
декстрансульфат 30 мг/кг 1 раз в неделю
1,0
Измерения кровотока
Кровотоки в ногах с обеих сторон были измерены с помощью бесконтактных лазерных доплеров-ских измерений перед операцией на сутки -1 и на 1, 7, 14, 21, 28 и 35 сутки после операции. Измерение кровотока выражали как отношение потока в ишемизированной конечности к потоку в нормальной конечности.
У всех животных групп 1M, 2M, 3M и 4M наблюдали увеличение среднего кровотока в оперируемой конечности между 1-ми и 35-ми сутками, см. фиг. 2. Средний кровоток увеличивался от базового уровня после операции в группе 2M, получавшей лечение декстрансульфатом (10 мг/кг 3 раза в неделю), на 46,7 единиц; в группе 3M, получавшей лечение декстрансульфатом (30 мг/кг 3 раза в неделю), на 59,3 единиц и в группе 4M, получавшей лечение декстрансульфатом (30 мг/кг 1 раз в неделю), на 51,1 единиц, по сравнению с увеличением на 19,5 единиц в группе 1M, получавшей контрольный носитель. Это составляет 2,2, 3,0 и 2,8-кратное увеличение, соответственно, в среднем значении кровотока вследствие лечения декстрансульфатом, см. табл. 3 и фиг. 2.
На фиг. 8 сравнивается кровоток, измеренный у мыши контрольной группы (группа 1M) и мыши, получавшей лечение декстрансульфатом, в соответствии с группой 3M. На фиг. показана бесконтактная лазерная доплеровская визуализация через 35 суток после лигирования бедренной артерии левой задней конечности.
Макроскопические оценки степени тяжести ишемии Макроскопические оценки ишемизированной конечности проводили на 7-е сутки и один раз в неделю после этого, с помощью морфологических степеней для некротической области, см. табл. 4. Таблица 4. Морфологические степени для некротической области
Степень
Характеристика
отсутствие некроза
некроз, ограниченный пальцем ноги (потеря пальца ноги)
некроз, распространяющийся на предплюсну (потеря стопы)
некроз, распространяющийся на голень (потеря коленного сустава)
некроз, распространяющийся на бедро (полная потеря задних конечностей)
Ишемизированную конечность оценивали макроскопически еженедельно с 7-х суток до 35-х суток с помощью оценочных морфологических шкал для некротической области, см. табл. 4. Во всех группах животных, получавших носитель и декстрансульфат, обнаружили некроз пальца ноги или ампутацию стопы (степени от 1 до 2, см. табл. 6). Процентные доли ампутаций стоп в каждой группе, получавшей лечение, представлены в табл. 5 и табл. 6. Ампутация стоп обнаружена в контрольной группе 1M, получавшей носитель (15,4%), и в группе 4M, получавшей лечение декстрансульфатом (30 мг/кг 1 раз в неделю) (7,1%). Доля некроза пальца ноги в контрольной группе 1M, получавшей носитель, составила 23,1% животных. В группах животных 2M и 3M, получавших лечение декстрансульфатом, через 35 суток после HLI индуцирования, доля некроза пальца ноги составила 21,4 и 14,3% соответственно. В группе животных 4M, получавшей лечение декстрансульфатом, некроза пальцев ног не наблюдалось (табл. 6).
Оценка функционирования конечности и ишемического повреждения in vivo Полуколичественную оценку ухудшения функционирования ишемизированной конечности выполняли раз в неделю после операции, используя следующую шкалу, см. табл. 7.
Таблица 7. Оценка функционирования конечности
Степень
Характеристика
сгибание пальца ноги для устойчивого ослабления напряжения мышц хвоста
сгибание подошвы
нет волочения и нет сгибания подошвы
волочение стопы
Функционирование конечности оценивали, как "Не установлено" в случае частичной или полной ампутации конечности. В таком случае измерения кровотока не были включены в статистический анализ.
Параллельно с измерениями кровотока и по сравнению с контрольной группой 1M, получавшей носитель, все группы 2M, 3M и 4M, получавшие лечение декстрансульфатом, показали лучшие результаты в улучшении функционирования конечностей, см. табл. 8 и табл. 9 ниже и фиг. 6.
Таблица 8. Число случаев функционирования конечности с оценкой 0, 1, 2 и 3 на сутки 7 у мышей
Группа
Число случаев функционирования конечности с оценкой 0 (%) у мышей
Число случаев функционирования конечности с оценкой 1 (%) у мышей
Число случаев функционирования конечности с оценкой 2 (%) у мышей
Число случаев функционирования конечности с оценкой 3 (%) у мышей
0,0
0,0
0,0
100,0
0,0
0,0
21,4
79,6
0,0
0,0
21,4
79,6
0,0
0,0
7,1
92,9
Иммуногистохимия и анализ плотности капилляров
Мышей умерщвляли после окончания исследования на сутки 36. Всем животным за 5 мин до умерщвления вводили внутривенно конъюгат флуоресцеинизотиоцианат (FITC) - декстран 500000 Да 10 мг/мл в дозировке 200 мкл на мышь. Четырехглавую мышцу рассекали в коронарной части. Мышцу фиксировали в свежем 2,5% параформальдегиде (pH 7,4) в течение 24 ч, а затем погружали в парафин для иммуноокрашивания актином гладких мышц (SMA) с мышиными моноклональными антителами (анти-SMA Ab-1, клон 1A4, 1:800, Thermo scientific) и CD34 с анти CD34 (1:200, Cedralene). Заливку в парафин выполняли в соответствии со стандартным способом заливки.
Пятна на участках оценивали и фотографировали с помощью флуоресцентной микроскопии (E600; Nikon, Токио, Япония), оборудованного с этой целью объективом планфлуоритом, связанным с CCD-камерой (DMX1200F; Nikon). В этих условиях Cy3 показывает ярко-красную флуоресценцию: Ex (макс): 543 нм; Em (макс) 570 нм, в то время как флуоресцеин декстран показывает интенсивную зеленую флуоресценцию (Ex (макс): 488 нм; Em (макс): 530 нм). Цифровые изображения собирали и анализировали с помощью программного обеспечения Image Pro+. Четыре среза образцов мышц были взяты из тех же
областей восьми животных из групп 1M, 3M и 4M. Измерили области кровеносных сосудов. Плотность выражали как среднее число капилляров в поле зрения. Общее количество сосудов представляет собой все кровеносные сосуды в измеряемой области.
Количество CD34 положительных капилляров было больше в группах 3M и 4M, получавших лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой 1M на 35-е сутки исследования, см. фиг. 3, 4 и 5A-5C. CD34 положительное окрашивание рассматривают как показатель формирования мелких капилляров, и таким образом полученные результаты подтверждают улучшение кровотока, наблюдаемое в группах животных, получавших декстрансульфат. Декстран окрашивание подтвердило, что эти капилляры функционируют и активны. SMA окрашивание показало такое же увеличение формирования капилляров, как при CD34 окрашивании, см. фиг. 7.
На фиг. 4 ясно показано, что декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, индуцирует ангиогенез только в ишемизированной ткани, то есть в правой конечности, и отсутствует в не-ишемизированной ткани, то есть в левой конечности. Таким образом, декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, вызывает избирательное индуцирование ангиогенеза только там, где это необходимо.
Замедление ангиогенеза является одной из особенностей ишемических заболеваний. Наиболее общепризнанной мишенью для терапевтического ангиогенеза является VEGF и его рецепторы. Тем не менее, клинические испытания, направленные на устранение ишемии были неутешительными, что указывает на необходимость разработки новых терапевтических мишеней для лечения ишемических заболеваний.
В настоящем исследовании улучшение кровотока в модели ишемии задних конечностей у мышей изучили с целью оценки эффективности декстрансульфата. Повторное (три раза в неделю) или (один раз в неделю) подкожное введение декстрансульфата в дозировке 30 мг/кг, значительно восстанавливает перфузию крови по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. На 35-е сутки, наблюдали от двух с половиной до трех кратное увеличение значений перфузии кровотока в группах, получавших лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой, со статистически значимым эффектом, начиная с четырнадцатых суток после обработки.
Объединенные данные исследования подтвердили терапевтическую эффективность использования введенного подкожно декстрансульфата для лечения окклюзионной болезни периферических артерий на мышиной модели Balb/c. Спонтанные ампутации или скорость некроза пальца ноги также уменьшились у животных, получавших лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой. Лечение декстрансульфатом улучшило функциональное выздоровление конечностей во всех группах животных, получавших лечение препаратом, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Лечение декстрансульфатом не вызывало побочных эффектов у подопытных животных.
Иммуногистохимические выводы подтвердили результаты in vivo. В совокупности данные этого исследования подтвердили терапевтическую эффективность декстрансульфата для лечения окклюзион-ного заболевания периферических артерий на мышиной модели.
Лечение декстрансульфатом мышей с ишемией задних конечностей приводило к значительному и быстрому восстановлению кровотока, что измеряли с помощью лазерного доплеровского способа, и демонстрировало также уменьшение тяжести ишемизированной конечности и скорейшее улучшение функционирования конечности.
Неблагоприятного воздействия на общее состояние здоровья не было отмечено ни в одной из групп. Эти данные были подтверждены иммуногистохимическим оцениванием. Полученные данные отражают изменения в морфологии кровеносных сосудов, то есть увеличение плотности капилляров и ангиогенез кровеносных сосудов.
Пример 2. Оценивание эффективности ангиогенеза в модели инсульта у крыс.
Для оценки эффективности лечения декстрансульфатом была использована модель инсульта tMCAO у крыс. Крысы получали лечение декстрансульфатом в течение 28 суток с помощью подкожных инъекций, через два часа после хирургической процедуры, либо по 30 мг/кг три раза в неделю или ежедневную дозу 15 мг/кг. В ходе исследования были проверены неврологические, двигательные и сомато-сенсорные функции в серии поведенческих тестов.
Четкие различия были продемонстрированы между группами, получавшими лечение декстрансуль-фатом, и контрольной группой, получавшей носитель. Улучшение двигательных функций, в соответствии с оценками Neuroscore, шаговым тестированием и тестом тела на качание, было продемонстрировано в обеих группах, получавших препарат. Сенсомоторные функции также восстановились после лечения декстрансульфатом. Вполне вероятно, что ангиогенную активность следует отнести к эффекту от лечения декстрансульфатом. Этот вывод был поддержан увеличением перфузии крови головного мозга и увеличением плотности капилляров актина гладких мышц (SMA) в пораженном полушарии. Лечение декстрансульфатом также снижает воспалительную реакцию по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель.
С учетом этих результатов можно сделать вывод о том, что лечение декстрансульфатом очевидно улучшает двигательные и соматосенсорные нарушения, а также перфузию крови головного мозга и ан
гиогенную активность в модели инсульта у крыс.
Инсульт является основной причиной серьезной, длительной нетрудоспособности и третьей ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах. Суммарные затраты здравоохранения по инвалидности в результате инсульта оценивают в 53,6 миллиардов долларов в год. Ишемические инсульты составляют более 88% всех инсультов, что делает их наиболее распространенным типом травмы сосудов головного мозга. Ишемические состояния в мозге вызывают гибель нейронов, что приводит к постоянному сенсо-моторному дефициту. Теперь ясно, что экстренное лечение пациентов, перенесших инсульт часто невозможно в клинических условиях. Врачам нужны новые стратегии безотлагательного лечения инсульта.
Были использованы несколько моделей животных для изучения ишемии головного мозга в попытке понять ее патофизиологию и определить терапевтические стратегии для минимизации тяжести ишемиче-ских повреждений. Фокальная ишемия приводит к локальному инфаркту головного мозга и индуцируется окклюзией средней мозговой артерии (MCAO) у крыс. Она получила большое признание в качестве модели полушарного инфаркта у людей. После MCAO корковый и стриарный инфаркт с временным и пространственным развитием происходит в сосудистой области средней мозговой артерии.
В последнее десятилетие объединили растущее число фактов исследований поведенческой оценки при инсульте у животных. Установили, что функциональное улучшение является высоконадежным в качестве меры для терапевтической эффективности.
Одним из наиболее перспективных инновационных методов лечения сосудистых осложнений при инсульте, является терапевтический ангиогенез, который возник как неинвазивное средство для стимуляции неоваскуляризации в ишемизированных тканях.
В настоящем исследовании изучены нейропротективные и реабилитационные возможности декст-рансульфата на модели инсульта временной MCAO у крыс.
Материалы
Декстрансульфат со средней молекулярной массой от 5 до 7 кДа приобретали у pK Chemicals A/S, Дания. На фиг. 9-16 декстрансульфат обозначен как ТМ-700.
Декстрансульфат растворяли в 0,9% NaCl (физиологический раствор) (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) до концентрации 60 мг/мл для инъекции три раза в неделю и 30 мг/мл для ежедневной инъекции. Препарат стабилен в течение одной недели. Животные получали 0,5 мл/кг, что равно 30 и 15 мг/кг массы тела.
46 самцов крыс SD со средней массой тела 342 г до начала исследования (сутки 0) приобретали у Harlan Laboratories, Израиль. Минимальная и максимальная масса, отмеченная в каждой группе, составляла ±20% от среднего группового значения массы тела. Животных содержали в соответствии с рекомендациями Национального института здоровья (NIH) и Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC). Животных содержали в полиэтиленовых клетках (5/клетка) размером 35*30*15 см, с верхней решеткой из нержавеющей стали, оснащенных оборудованием для гранулированного питания и питьевой водой в пластиковой бутылке; подстилка: использовали стерилизованную паром чистую рисовую шелуху (Harlan, Sani-chip cat#:2018SC+F) и материал подстилки меняли вместе с клеткой, по меньшей мере два раза в неделю. Животных кормили ad libitum, имеющейся в продаже пищей для грызунов (Teklad Certified Global 18% Protein Diet cat #: 106S8216). Животные имели свободный доступ к автоклавированной и подкисленной питьевой воде (Ph от 2,5 до 3,5), полученной из городского источника. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях, с кондиционером и фильтрами (HEPA F6/6) с достаточным запасом свежего воздуха (минимум 15 замен воздуха/ч). Животных содержали в климатически контролируемой среде. Диапазон температур составлял от 20 до 24°C и диапазон относительной влажности (ОВ) составлял от 30 до 70% с циклом 12 ч света и 12 ч темноты.
Хирургическая операция
В день операции анестезию вызывали 4% изофлураном в смеси 70% N2O и 30% O2 и поддерживали с помощью 1,5-2% изофлурана.
Временную окклюзию средней мозговой артерии осуществляли в соответствии с методом, описанным ранее в Stroke 29, 2162-2170 (1998). Через разрез по срединной линии шеи обнажали правую общую сонную артерию (ОСА) и осторожно отделяли от окружающих нервов и фасции - от ее бифуркации к основанию черепа. Затем изолировали ветви затылочной артерии наружной сонной артерии (НСА) и эти ветви рассекали и коагулировали. НСА дополнительно рассекали дистально и коагулировали вместе с концевой язычной и верхнечелюстной ветвями артерии, которые затем разделяли. Внутреннюю сонную артерию (ВСА) изолировали и тщательно отделяли от соседнего блуждающего нерва, и крылонебную артерию лигировали близко к ее началу 5-0 нейлоновой нитью (SMI, Бельгия). Затем 4-0 шелковую нитью обвязывали свободно вокруг мобилизованного остатка НСА, и 4-0 одноволоконную нейлоновую хирургическую нить длиной 4 см (кончик нити затупляли с использованием пламени, и нить покрывали полилизином перед введением) вводили через проксимальную НСА в ВСА, а оттуда в круг Виллиса, по существу окклюдируя среднюю мозговую артерию. Хирургическую рану закрывали и животных возвращали в клетки для восстановления после наркоза. Через два часа после окклюзии крысам вновь проводили анестезию, вытягивали одноволоконную нить, чтобы создать реперфузию, а хирургическую рану закрывали и крыс возвращали в клетки.
В первый час после окклюзии, животных подвергали неврологической оценке с применением "Критериев исключения Neuroscore". Только животные с итоговой оценкой более и равной 10 были включены в исследование.
Лечение декстрансульфатом Через 2 ч после окклюзии (сразу после реперфузии), животным в группах 2M и 3M (декстрансульфат в дозировке 30 мг/кг три раза в неделю или 15 мг/кг в сутки) и животным в группе 1M (контрольный носитель) делали инъекции подкожно, см. табл. 10.
Таблица 10. Распределение по группам
Группа
Лечение
Дозировка
Способ введения
Длительность
лечения
(сутки)
1М (п=13)
носитель
Подкожно 3 раза в неделю
2М (п=15)
декстрансульфат
30 мг/кг
ЗМ (п=15)
декстрансульфат
15 мг/кг
Подкожно ежедневно
Анализ данных
Если не указано иное, все статистические анализы проведены с использованием двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA для повторных измерений с последующим апостериорным тестом Бонферрони.
Масса тела
На протяжении всего исследования не было обнаружено статистически значимых различий в массе тела между различными группами леченя, см. фиг. 9.
Оценки неврологического теста (Neuroscore)
Оценивание: предоперационное, через один час после окклюзии и на 7, 14, 21 и 28 сутки.
Выполняли модифицированную оценку неврологического статуса (mNRS). Человек, который делал поведенческие оценки, не знал дозировку введенного препарата (слепое тестирование). Neuroscore с общей оценкой 18 выполняли в соответствии с Stroke 32, 1005-1011 (2001).
Neuroscore включает серию клинико-неврологических тестов (комплекс из двигательного, сенсорного теста, тестов на реагирование и равновесие), которые использовали для оценки эффективности проведенного лечения. Neuroscore градуировали по шкале от 0 до 18 (где нормальная оценка равна 0, а максимальное нарушение представлено оценкой 18). Как ожидалось, во всех группах крыс наблюдали резкое снижение неврологических функций через два часа после индуцирования tMCAO, со спонтанным улучшением в течение долгого времени после этого. Статистически значимые различия наблюдали в группе 2M, получавшей лечение декстрансульфатом 30 мг/кг три раза в неделю, и 3M, получавшей лечение дек-странсульфатом 15 мг/кг ежедневно, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, от первого теста на 7 сутки и в течение исследования до 28-х суток, см. фиг. 10. Статистически значимых различий между двумя схемами дозирования 2M и 3M обнаружено не было.
Шаговый тест
Оценивание: предоперационное и на 7, 14, 21 и 28 сутки.
Животных тестировали на акинезию передних конечностей с помощью шагового теста. Животное удерживали за задние конечности и одну переднюю конечность фиксировали с одной стороны, и незафиксированную переднюю лапу волочили по столу. Число регулировочных шагов подсчитывали, пока животное перемещалось вбок по поверхности стола (85 см приблизительно за пять секунд), в переднем и заднем направлении для обеих передних конечностей.
Животных тестировали на акинезию передних конечностей в шаговом тесте, обычно используемом для измерения нервно-мышечных функций, как показатель двигательных функций животного. Некоторое улучшение двигательной функции с течением времени наблюдали у всех животных, которые были подвергнуты tMCAO, в основном в результате спонтанного функционального восстановления. Тем не менее, функциональное улучшение у крыс, получавших декстрансульфат, было более выраженным по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. В обеих группах животных 2M и 3M, получавших лечение, такое улучшение достигало статистической значимости по сравнению с контролем, начиная с первого теста на 7-е сутки, и продолжало улучшаться вплоть до окончания исследования на 28-е сутки, см. фиг. 11. Статистически значимых различий между двумя схемами дозирования 2M и 3M обнаружено не было.
Оценка передних конечностей Оценивание: предоперационное и на 7, 14, 21 и 28 сутки.
Для теста по оценке реакции передних конечностей на стимуляцию, исследователь держит крысу близко к столешнице и оценивает способность крысы ставить переднюю конечность на столешницу в
ответ на точечную зрительную, тактильную или проприоцептивную стимуляцию. Отдельные дополнительные оценки присваивали по каждому виду сенсорного отклика и добавляли, чтобы дать общую оценку (0 = норма, 12 = максимальное нарушение).
Тест по оценке реакции передних конечностей на стимуляцию (0-12):
Расположение при точечной стимуляции (0-2).
Расположение при визуальной стимуляции (вперед(0-2), в сторону (0-2)). Расположение при тактильной стимуляции (тыльная (0-2), боковая (0-2)). Расположение при проприоцептивной стимуляции (0-2).
Для каждого дополнительного теста, животных оценивали следующим образом:
0,0 = немедленный ответ;
0,5 = ответ в течение 2 с;
1,0 = ответ через 2-3 с;
1,5 = ответ более чем через 3 с;
2,0 = нет ответа.
В тесте передних конечностей оценивали соматосенсорные и сенсомоторные нарушения. Подобно другим тестам, наблюдали, некоторое спонтанное улучшение сенсомоторного нарушения с течением времени у всех животных, подвергнутых tMCAO. Тем не менее, у всех крыс, получавших декстрансуль-фат, наблюдали статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, начиная с 14-х суток и до окончания исследования на 28-е сутки, см. фиг. 12. В группе 3M улучшения сенсомоторного нарушения достигли статистической значимости уже при первом тестировании на 7-е сутки.
Тест тела на качание Оценивание: предоперационное и на 7, 14, 21 и 28 сутки.
Крысу держали приблизительно на расстоянии одного дюйма от основания хвоста. Затем поднимали на дюйм над поверхностью стола. Крысу держали в вертикальном положении, покачивая не более чем на 10° в левую или правую сторону. Запись качания проводили каждый раз, когда крыса смещала голову из вертикального положения в одну из сторон. Перед попыткой качания, крысу возвращали в вертикальное положение для подсчета следующего качания. Всего делали двадцать качаний. Нормальная крыса обычно имеет одинаковое число качаний в обе стороны. После фокальной ишемии, крыса имеет тенденцию качаться в контралатеральную сторону (левая сторона в этом случае). Оценки качания тела выражали в процентах качаний направо от общего числа качаний.
Наблюдали спонтанное частичное восстановление по оценкам тела на качание (к 50%) в течение первого месяца после инсульта.
Животных тестировали на акинезию передних конечностей в тесте тела на качание, обычно используемом для измерения нервно-мышечных функций. Некоторые спонтанные улучшения двигательной функции с течением времени наблюдали у всех животных, подвергнутых tMCAO. Тем не менее, все крысы, получавшие лечение декстрансульфатом, показали статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, начиная с первого теста на 7-е сутки и до окончания исследования на 28-е сутки, см. фиг. 13. Статистически значимых различий между двумя схемами дозирования групп 2M и 3M обнаружено не было.
Оценка церебрального кровотока
Оценивание: день 29.
Оценивание кровотока в коре головного мозга и спазма сосудов проводили с использованием лазерной доплеровской системы Flow-R, в которой отслеживали внутричерепной кровоток и диаметр сосудов (спазм/дилатация). Это осуществляли на 29 сутки после инициирования инсульта. Доплеровские измерения выполняли, пока животные находились под анестезией изофлураном.
Животных также обследовали на восстановление церебрального кровотока в поврежденном полушарии на 29 сутки. Статистически значимое улучшение скорости перфузии крови наблюдали у всех животных, которые были подвергнуты tMCAO и получили лечение декстрансульфатом (группы 2M и 3M) по сравнению с контрольной группой 1M, получавшей носитель. Отношение диаметра сосудов также увеличилось у животных, получивших лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой, см. фиг. 14 и 15.
Забор образцов и умерщвление
На 30-е сутки после MCAO крыс анестезировали кетамином/ксилазином и транскардиально перфу-зировали забуференным параформальдегидом (PFA) 4%. Головной мозг фиксировали в 4% забуферен-ном PFA для иммунологического окрашивания и гистологического оценивания.
Две секции образцов головного мозга брали из одинаковых областей у шести животных из групп 1M и 3M. Капилляры подсчитывали под микроскопом в общей сложности в трех случайных областях из каждой секции. Плотность выражали как среднее число капилляров в поле зрения. Лечение декстран-сульфатом 15 мг/кг ежедневно увеличило количество капилляров через 30 суток после инсульта, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель.
Увеличение количества капилляров SMA с диаметром менее 30 мкм наблюдали у животных, кото
рых подвергли tMCAO и которые получали лечение декстрансульфатом 15 мг/кг ежедневно, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, как результат ангиогенного эффекта, см. фиг. 16.
На фиг. 17A и 17B представлен эффект лечения на плотность капилляров у крыс из контрольной группы (фиг. 17A) и из группы декстрансульфата (15 мг/кг ежедневно) (фиг. 17B).
Смертность и клинические признаки
Восемнадцать крыс умерли во время исследования. Одна крыса умерла сразу после реперфузии перед введением дозы и семнадцать крыс в течение 10 ч после введения дозы (6 в группе 1M, 6 в группе 2M и 5 в группе 3M). Никаких неблагоприятных клинических признаков, не имеющих отношение к модели, не было обнаружено ни в одной группе животных.
Модель инсульта tMCAO у крыс традиционно представляет собой общепринятую модель для оценки нейропротекторной и реабилитационной эффективности лечения препаратом. Данная модель была использована в настоящем исследовании для оценки эффективности лечения декстрансульфатом при двух схемах дозирования. Крысы получали декстрансульфат в течение 28 суток посредством подкожных инъекций, начиная с двух часов после хирургической операции, либо 30 мг/кг три раза в неделю либо ежедневную дозу 15 мг/кг. В ходе исследования были проверены неврологические, двигательные и сома-тосенсорные функции в серии поведенческих тестов.
Как и ожидалось, наблюдали некоторое спонтанное восстановление неврологических функций в течение 28 суток наблюдения после индуцирования инсульта. Тем не менее, между группами, получавшими лечение декстрансульфатом и контрольной группой, получавшей носитель, были продемонстрированы четкие различия. Однако статистически значимых различий между двумя схемами дозирования отмечено не было. Улучшение двигательных функций, в соответствии с оценками Neuroscore, шагового теста и теста тела на качание, было продемонстрировано в обеих группах, получавших препарат (фиг. 10, 11 и 13). Сенсомоторные функции также восстановились после лечения декстрансульфатом (фиг. 12). Благоприятные эффекты наблюдали, начиная с первого тестирования, на 7-е сутки лечения и продолжали улучшаться до окончания исследования на 28 сутки. Наблюдаемые эффекты не могут быть отнесены к различиям в общем здоровье крыс, так как все группы набрали вес с одной скоростью, и нет существенных различий между ними (фиг. 9). Кроме того, не было отмечено видимых различий в общих клинических признаках. Вполне вероятно, что эффект лечения декстрансульфатом следует отнести к его ангио-генной активности. Этот вывод был поддержан увеличением церебрального кровотока и увеличением плотности капилляров SMA в пораженном полушарии. Лечение декстрансульфатом также снижает воспалительную реакцию по сравнению с получением контрольного носителя.
С учетом этих результатов можно сделать вывод о том, что лечение декстрансульфатом значительно улучшает двигательные и соматосенсорные нарушения, а также церебральную перфузию крови и ан-гиогенную активность в модели инсульта у крыс.
Таким образом, декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, как было показано, селективно индуцирует ангиогенез в моделях CLI (пример 1) и инсульта (пример 2). Результаты эксперимента показывают, что даже отсроченное лечение (начало на 15-е сутки после перевязки) является эффективным. Дозировки в интервале от 3 до 30 мг/кг (подкожно) являются эффективными, и эффективным является введение однократной дозы, один раз в неделю и 3 раза в неделю. Гистология подтверждает формирование вновь образованных функциональных сосудов. Декстрансульфат, в соответствии с вариантами осуществления, таким образом, обеспечивает селективное действие в ишемизированных областях.
Пример 3. Оценивание декстрансульфата в модели инфаркта миокарда.
В настоящем исследовании оценивали ангиогенную эффективность лечения декстрансульфатом на модели инфаркта миокарда у крыс.
Сердце имеет ограниченную регенеративную способность, поэтому мышцы, потерянные при остром инфаркте миокарда (ИМ), как правило, заменяются несокращающейся рубцовой тканью с ограниченной васкуляризацией. Стимуляция ангиогенеза и увеличение перфузии ткани является перспективной стратегией для восстановления сердца после ИМ.
Материалы и методы
В модели инфаркта миокарда участвует крыса с постоянно лигированной левой коронарной артерией с внутренним стежком. Операция вызывала обструкцию кровотока, а впоследствии серьезные ишеми-ческие повреждения и инфаркт сердечной стенки.
В общей сложности 150 самок крыс SD, имеющих среднюю массу тела 178 г на начало исследования (0 сутки), приобретали у Harlan Laboratories, Израиль. Животных кормили ad libitum имеющейся в продаже пищей для грызунов (Teklad Certified Global 18% Protein Diet). Животные имели свободный доступ к подкисленной питьевой воде (pH от 2,5 до 3,5), полученной из городского источника. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях. Диапазон температур составлял от 20 до 24°C и диапазон относительной влажности (ОВ) составлял от 30 до 70% с циклом 12 ч света и 12 ч темноты.
Декстрансульфат со средней молекулярной массой от 5 до 7 кДа приобретали у pK Chemicals A/S, Дания. Декстрансульфат растворяли в 0,9% NaCl (физиологический раствор) (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) для подкожного введения в дозировках 15 мг/кг или 3 мг/кг.
В день операции животных анестезировали комбинацией кетамина 90 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг. Для того чтобы вызвать ИМ, под анестезией и анальгезией, грудь крысы открывали левосторонней тора-котомией, удаляли перикард и проксимальную левую коронарную артерию окончательно окклюдировали внутренним стежком (Circulation 117, 1388-1396 (2008)). Через два часа после операции, каждому животному во всех группах лечения вводили подкожно декстрансульфат или раствора носителя в соответствии с табл. 11.
На 36-е сутки после индуцирования ИМ, крыс умерщвляли ингаляцией CO2, собирали сердца и фиксировали в 4% забуференном растворе формалина. Рутинную заливку парафином выполняли с использованием стандартных гистологических процедур.
Для идентификации размера ИМ использовали трихромное окрашивание по Массону. Девять сердец группы (2M), получившей лечение, и восемь из контрольной группы (1M), рассекали в поперечном направлении на пять срезов, которые погружали в парафин. Пять парафиновых срезов по 5 мкм были выполнены на микротоме Лейка. Все срезы окрашивали в соответствии с протоколом стандартного три-хрома по Массону. Срезы визуализировали в системе компьютерной обработки изображений, и размер инфаркта отмечали и рассчитывали с помощью программы ImageJ. Размер инфаркта выражали в процентах площади инфаркта (неокрашенная область) в отношении к общей площади левого желудочка. Для каждого животного анализировали пять последовательных срезов, один из которых содержал лигатуру, и рассчитывали средние значения всех срезов для каждого сердца. Иммуногистохимический маркер (актин гладких мышц - SMA) использовали для количественной оценки плотности сосудов.
Подсчет плотности сосудов выполняли на 1 квадратном миллиметре на краю очага инфаркта пораженной миокардиальной области. Снимки делали при помощи микроскопа Olympus BX43, используя 40-кратное увеличение объектива. Подсчет плотности SMA положительных судов осуществляли с использованием программного обеспечения для анализа изображений - Image Pro Plus 5.1 от Media Cybernetics.
Результаты
На фиг. 18 представлен размер инфаркта через 35 суток после индуцирования ИМ. Все группы, получавшие лечение, имели меньший средний размер инфаркта по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечение. Обнаружили существенное различие между группой 2M, получавшей лечение, и контрольной группой 1M.
На фиг. 19 представлено сравнение SMA окрашивания через 35 суток после индуцирования ИМ группы 2M, получавшей лечение и контрольной группы 1M. Лечение декстрансульфатом привело к более высокой плотности капилляров SMA по сравнению с контрольным носителем.
На фиг. 20A-20C представлены снимки SMA окрашивания плотности сосудов двух крыс из группы 2M, получавшей лечение (фиг. 20A и 20B), и одной крысы из контрольной группы 1M (фиг. 20C). Лечение декстрансульфатом привело к более высокой плотности сосудов SMA, по сравнению с контрольным носителем.
Декстрансульфат значительно уменьшал объем инфаркта у крыс в группе 2M, получавшей лечение, после инфаркта миокарда по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. В той же группе, получавшей декстрансульфат, выявили тенденцию увеличения плотности капилляров в инфарктной области сердца по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Декстрансульфат, таким образом, способствует восстановлению миокарда и кровеносных сосудов и усилению ангиогенеза в области инфаркта после инфаркта миокарда. Такой эффект может улучшить долгосрочное ремоделирование левого желудочка и усилить восстановление функции левого желудочка.
Пример 4. Оценивание эффективности ангиогенеза в модели ишемии задних конечностей у крыс.
В исследовании, описанном выше в примере 1, ангиогенная эффективность декстрансульфат была доказана на модели стабильной тяжелой ишемии у мышей. В этом исследовании модель стабильной тя
желой ишемии у крыс (Toakai J Exp Clin Med 31(3), 128-13 (2006)) применяли для оценки эффективности декстрансульфата на ангиогенез и функциональный результат с использованием различных видов животных.
Материалы
Раствор декстрансульфата получали за сутки до начала исследования. В качестве носителя использовали 0,9% NaCl (физиологический раствор). Соответствующий объем NaCl добавляли к взвешенным соединениям, чтобы получить концентрацию 6 и 60 мг/мл, что соответствует введению 0,5 мл/кг с получением доы 3 и 30 мг/кг соответственно. Декстрансульфат (средняя молекулярная масса от 5 до 7 кДа, приобретали у pK Chemicals A/S, Дания) растворяли встряхиванием на вортексе или просто путем поворота колбы несколько раз. Раствор хранили при температуре 4°C в течение ночи, чтобы стабилизировать агрегаты. На следующий день, колбу встряхивали на вортексе и раствор фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм, чтобы получить стерильный раствор. Получение раствора считают безопасным до 15 суток при хранении при температуре 4°C. Растворы получали на 7-е сутки, чтобы использовать на 821 сутки, а на 21-е сутки было выполнено второе получение, для использования на 22-28 сутки.
90 самцов крыс SD со средней массой тела 277 г на начало исследования (сутки 0) приобретали у Harlan Laboratories, Израиль. Животных кормили ad libitum имеющейся в продаже пищей для грызунов (Teklad Certified Global 18% Protein Diet). Животные имели свободный доступ к подкисленной питьевой воде (pH от 2,5 до 3,5).
Животных содержали в соответствии с Национальным институтом здоровья (NIH) и Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC). Животных содержали в полиэтиленовых клетках (3/клетка) размером 35*30*15 см, с верхней решеткой из нержавеющей стали, оснащенных оборудованием для гранулированного питания и питьевой водой в пластиковой бутылке; подстилка: использовали стерилизованную паром чистую рисовую шелуху (Harlan, Sani-chip cat#: 7090A) и материал подстилки меняли вместе с клеткой, по меньшей мере два раза в неделю. Животных кормили ad libitum имеющейся в продаже пищей для грызунов (Teklad Certified Global 18% Protein Diet cat #: 106S8216). Животные имели свободный доступ к автоклавированной и подкисленной питьевой воде (pH от 2,5 до 3,5), полученной из городского источника. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях, с кондиционером и фильтрами (HEPA F6/6) с достаточным запасом свежего воздуха (минимум 15 замен воздуха/час). Животных содержали в климатически контролируемой среде. Диапазон температур составлял от 20 до 24°C и диапазон относительной влажности (ОВ) составлял от 30 до 70% с циклом 12 часов света и 12 часов темноты.
Все хирургические процедуры выполняли под анестезией и анальгезии (от 1,5 до 3,0% изофлурана, 1,5% N2O и 0,5% O2). Делали надрез 0,5-1,0 см на коже в паховой области. Бедренную артерию и вену лигировали дважды с помощью 4-0 шелковой нити и рассекали между лигатурами. Рану закрывали шелковой нитью 3-0 и крыс оставляли для восстановления.
На 8-е сутки, 2-я неделя после операции, каждому животному в группах 1M, 2M, 3M делали инъекции подкожно три раза в неделю. Животным в группах 4M и 5M делали инъекции подкожно однократно на 8-е сутки, см. табл. 12.
Измерение кровотока
Кровоток в ногах с обеих сторон измерили с помощью бесконтактных лазерных доплеровских измерений перед операцией на 1 сутки и на 1, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Измерение кровотока выражали как отношение потока в ишемизированной конечности к потоку в нормальной конечности.
У всех, получающих лечение, групп животных, отмечено заметное увеличение кровотока в прооперированной конечности, по сравнению с группой, получавшей контрольный носитель, между 1-ми сутками и 28-ми сутками, см. табл. 13 и фиг. 21. Обнаружены статистически значимые различия между всеми группами, получавшими декстрансульфат, и группой, получавшей контрольный носитель.
На фиг. 21 представлено соотношение кровотока в HLI-поврежденной ноге к неповрежденной ноге, измеренное с помощью бесконтактного лазерного доплеровского способа. Различные группы сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA для повторных измерений с последующим апостериорным тестом Бонферрони. При сравнении групп 2M, 3M, 4M и 5M, получавших лечение декстрансульфатом, и контрольной группы 1M, выявлены статистически значимые различия с 14-х суток по 28-е сутки (*P <0,05;**P <0,01;***P <0,001).
Степень тяжести ишемии
Макроскопические оценки ишемизированной конечности проводили еженедельно с 7-х суток до 28-х суток с использованием морфологических степеней для некротической области (см. табл. 4). Во всех группах животных, получавших декстрансульфат и носитель, не выявили некроза ни одного пальца ноги или ампутации ноги.
Оценка функционирования конечности и ишемического повреждения in vivo
Полуколичественную оценку ухудшения функционирования ишемизированной конечности выполняли раз в неделю после операции, используя шкалу, представленную в табл. 7. Подсчет выполнялся персоналом, который не знал о проводимом лечении, вслепую.
Во всех группах животных, получавших декстрансульфат, наблюдали улучшение функционирования конечности по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, между 1-ми сутками и 28-ми сутками, см. табл. 14 и фиг. 22.
Таблица 14. Число случаев функционирования конечности с оценкой 0-3 на сутки 28 у крыс
Группа
Число случаев функционирования конечности с оценкой 0 (%)
Число случаев функционирования конечности с оценкой 1 (%)
Число случаев функционирования конечности с оценкой 2 (%)
Число случаев функционирования конечности с оценкой 3 (%)
100
100
Различные группы сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA для повторных измерений с последующим апостериорным тестом Бонферрони. При сравнении групп 2M, 3M, 4M и 5M, получающих декстрансульфат, и контрольной группы 1M, выявлены статистически значимые различия с 14-х суток по 28-е сутки (*P <0,05;**P <0,01;***P <0,001).
Иммуногистохимия и анализ плотности капилляров
Четыре среза образцов мышц брали из одних и тех же областей у шести животных из групп 1M, 2M, 3M, 4M, 5M и окрашивали кровеносные сосуды с использованием антител к SMA и фактору 8. Площадь кровеносных сосудов оценивали визуально. Плотность выражали как среднее число капилляров в поле зрения. В общем количестве сосудов представлены все кровеносные сосуды в измеряемой области. Количество SMA и фактор 8 положительных капилляров в правой ишемизированной конечности было больше во всех группах 2M-5M, получавших лечение декстрансульфатом, по сравнению с контрольной группой 1M на 28-е сутки исследования, см. фиг. 23. SMA и фактор 8 положительное окрашивание рассматривают как показатель формирования мелких капилляров, и таким образом полученные результаты подтверждают улучшение кровотока, наблюдаемое в группах животных, получавших декстрансульфат. Статистический анализ выполняли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением Бонферрони, */** показывает p <0,05/0,01.
Ангиография
Число пересечений между контрастно заполненными сосудами определяли визуально через 28 суток после индуцирования ишемии задних конечностей. Ангиография выявила значительно большее ко
личество коллатералей в пораженной конечности у крыс, получавших декстрансульфат, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (p <0,01 и p <0,001 согласно однофакторному дисперсионному анализу ANOVA с последующим апостериорным тестом Бонферрони), см. фиг. 24 и 25A-25D.
Замедление ангиогенеза является одним из признаков ишемических заболеваний. Наиболее общепризнанной мишенью для терапевтического ангиогенеза является VEGF и его рецепторы. Тем не менее, клинические испытания, направленные на устранение ишемии были неутешительными, что указывает на необходимость разработки новых терапевтических мишеней для лечения ишемических заболеваний.
В настоящем исследовании улучшение кровотока в модели ишемии задних конечностей у крыс изучали с целью оценки эффективности декстрансульфата в двух разных дозировках и режимах лечения. Введение декстрансульфата в дозировках 30 и 3 мг/кг подкожно три раза в неделю или однократно на 8-е сутки значительно восстанавливало перфузию крови и улучшало функциональную оценку конечностей по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, начиная с 14 суток после операции. Дозировки и способы введения были эффективными. Ни одной спонтанной ампутации или некроза пальцев ног не наблюдали ни в одной из групп, получавших лечение, или в контрольной группе животных. Лечение декстрансульфатом не вызывало побочных эффектов у подопытных животных. Оценка ангиографии (измерение расширения коллатеральной артерии) была значительно выше во всех группах животных, получавших лечение декстрансульфатом, по сравнению с группой, получавшей носитель, без статистической разницы между этими группами. SMA и фактор 8 плотность капилляров также увеличилась после лечения декстрансульфатом. Объединенные данные настоящего исследования подтвердили терапевтическую эффективность декстрансульфата для лечения окклюзионного заболевания периферических артерий на модели ишемии задних конечностей у крыс.
Варианты осуществления, описанные выше, следует понимать, как иллюстративные примеры настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные модификации, комбинации и изменения могут быть сделаны в вариантах осуществления, без выхода за пределы объема настоящего изобретения. В частности, различные части решений в различных вариантах осуществления могут быть объединены в другие конфигурации, где это технически возможно. Объем настоящего изобретения, однако, определен прилагаемой формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.
2. Применение по п.1, где ангиогенез индуцируют в ишемизированной ткани или органе у указанного субъекта.
3. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.
4. Применение по п.3, где кровоток увеличивают в ишемизированной ткани или органе указанного субъекта.
5. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.
6. Применение по любому из пп.1-5, где указанная средняя молекулярная масса составляет от 4500
до 5500 Да.
7. Применение по любому из пп.1-6, где указанный декстрансульфат или указанная его фармацевтически приемлемая соль имеет среднее содержание серы от 15 до 20%.
8. Применение по п.7, где указанное среднее содержание серы составляет приблизительно 17%.
9. Применение по любому из пп.1-8, где среднечисленная молекулярная масса (Mn) указанного дек-странсульфата или указанной его фармацевтически приемлемой соли, измеренная с помощью ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, составляет от 1850 до 2000 Да.
10. Применение по п.9, где в указанном декстрансульфате или указанной его фармацевтически приемлемой соли количество единиц глюкозы составляет в среднем 5,1, а среднее количество сульфата на единицу глюкозы составляет от 2,6 до 2,7.
11. Применение по любому из пп.1-10, где указанный декстрансульфат или указанную его фармацевтически приемлемую соль получают в виде водного раствора для инъекций.
12. Применение по любому из пп.1-11, где указанный субъект представляет собой человека, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного человека.
13. Применение по п.12, где указанное заболевание, расстройство или медицинское состояние выбраны из группы, состоящей из заживления ран, периферической ишемии, предпочтительно ишемии после трансплантации органов, тканей или клеток, заболевания периферических артерий, ишемии конечно
10.
стей, синдрома беспокойных ног, синдрома Рейно, серповидно-клеточной анемии или облитерирующего тромбангиита; коронарной ишемии, предпочтительно застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или коронарной болезни сердца; ишемического заболевания у детей, предпочтительно перинатального или неонатального заболевания, неонатального гипоксического или ишемического повреждения головного мозга, асфиксической энцефалопатии, церебрального паралича; ишемии центральной нервной системы, предпочтительно травматического повреждения головного мозга, височного артериита, гипоксии, вызванной рассеянным склерозом, инсультом, боковым амиотрофическим склерозом; заболевания мышечной дистрофии; ишемии, вызванной тромботическими, геморрагическими или травматическими повреждениями.
14. Применение по любому из пп.1-13, где указанная фармацевтически приемлемая соль декстран-сульфата представляет собой натриевую соль декстрансульфата.
15. Способ индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
16. Способ по п.15, где указанный декстрансульфат или указанную его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозировке, составляющей от 0,05 до 50 мг/кг массы тела указанного субъекта, предпочтительно от 0,05 до 30 мг/кг массы тела указанного субъекта и более предпочтительно от 0,1 до 15 мг/кг или от 0,1 до 10 мг/кг массы тела указанного субъекта.
17. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для индуцирования ангиогенеза у субъекта, страдающего заболеванием, расстройством или медицинским состоянием, вызывающим ишемию в организме указанного субъекта.
18. Способ увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
19. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для увеличения кровотока у субъекта, страдающего от ишемии.
20. Способ васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта, включающий введение указанному субъекту декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да.
21. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для получения лекарственного средства для васкуляризации ишемизированной ткани у субъекта.
22. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для индуцирования ангиогенеза в органе и/или васкуляри-зированной ткани, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.
23. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для увеличения кровотока в васкуляризированной ткани и/или органе, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.
24. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли, имеющих среднюю молекулярную массу Mw от 4500 до 7500 Да, для васкуляризации васкуляризированной ткани и/или органа, где применение осуществляют in vitro или ex vivo.
20 30 Время (сутки)
Увеличение массы тела (г)
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032569
- 1 -
(19)
032569
- 1 -
(19)
032569
- 1 -
(19)
032569
- 9 -
032569
- 24 -