EA 32560B1 20190628 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/032560 Полный текст описания EA201690355 20140806 Регистрационный номер и дата заявки US61/863,761 20130808 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2014/049923 Номер международной заявки (PCT) WO2015/021139 20150212 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21906 Номер бюллетеня [**] ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АКТИВНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа [8] A01H 5/00, [8] A01H 1/00, [8] C07H 21/02, [8] C07H 21/04, [8] C12N 15/00 Индексы МПК [US] Абад Андре Р., [US] Вулф Томас Чэд, [US] Чжоу Лань Сведения об авторах [US] ПАЙОНИР ХАЙ-БРЕД ИНТЕРНЭШНЛ, ИНК. Сведения о патентообладателях [US] ПАЙОНИР ХАЙ-БРЕД ИНТЕРНЭШНЛ, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000032560b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая инсектицидный полипептид, выбранная из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит синтетическую нуклеотидную последовательность, включающую кодоны, способные экспрессировать в растении.

3. ДНК-конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 и гетерологичный регуляторный элемент, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты.

4. Клетка-хозяин, содержащая ДНК-конструкцию по п.3.

5. Клетка-хозяин по п.4, где клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.

6. Клетка-хозяин по п.4, где клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.

7. Трансгенное растение, устойчивое к насекомым-вредителям, содержащее клетку-хозяина по п.6.

8. Трансгенное растение по п.7, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из маиса, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томата, крестоцветных, разновидностей перца, картофеля, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.

9. Семя растения, содержащее ДНК-конструкцию по п.3.

10. Выделенный инсектицидный полипептид, выбранный из группы, состоящей из: (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13; (c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

11. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид по п.10.

12. Композиция по п.11, содержащая от 1 до 99 вес.% указанного полипептида.

13. Способ контроля популяции чешуекрылого или жесткокрылого вредителя, предусматривающий контакт указанной популяции с эффективным количеством полипептида по п.10.

14. Способ уничтожения чешуекрылого вредителя, предусматривающий обеспечение указанному вредителю эффективного количества полипептида по п.10.

15. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.4 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, и получение указанного полипептида, который выбран из группы, состоящей из: (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13; (c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

16. Растение или растительная клетка со стабильно встроенной в их геном ДНК-конструкцией, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, обладающий инсектицидной активностью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который управляет экспрессией, кодирующей последовательности в растительной клетке.

17. Способ получения трансгенного растения или растительной клетки, устойчивых к вредителю, предусматривающий введение в указанные растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

18. Способ защиты растения от вредителя, предусматривающий введение в указанное растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

19. Способ по п.18, где полипептид обладает инсектицидной активностью в отношении чешуекрылого вредителя.

20. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, способная кодировать инсектицидный полипептид и выбранная из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 15 или комплементарную ей последовательность полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.

21. ДНК-конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.20 и гетерологичный регуляторный элемент, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты.

22. Трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию по п.21.

23. Семя растения, содержащее ДНК-конструкцию по п.21.

24. Выделенный инсектицидный полипептид, выбранный из группы, состоящей из: (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16; (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 15; (c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептиду с SEQ ID NO: 16; и (d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности с SEQ ID NO: 16.

25. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид по п.24.

26. Способ уничтожения или контроля популяции чешуекрылого или жесткокрылого вредителя, предусматривающий контакт указанной популяции с пестицидно эффективным количеством полипептида по п.23.

27. Способ получения трансгенного растения или растительной клетки, устойчивых к вредителю, предусматривающий введение в указанные растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 15; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.

28. Способ защиты растения от вредителя, предусматривающий обеспечение вредителю растения или растительной клетки, содержащих вектор экспрессии, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.20.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая инсектицидный полипептид, выбранная из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит синтетическую нуклеотидную последовательность, включающую кодоны, способные экспрессировать в растении.

3. ДНК-конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 и гетерологичный регуляторный элемент, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты.

4. Клетка-хозяин, содержащая ДНК-конструкцию по п.3.

5. Клетка-хозяин по п.4, где клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.

6. Клетка-хозяин по п.4, где клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.

7. Трансгенное растение, устойчивое к насекомым-вредителям, содержащее клетку-хозяина по п.6.

8. Трансгенное растение по п.7, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из маиса, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томата, крестоцветных, разновидностей перца, картофеля, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.

9. Семя растения, содержащее ДНК-конструкцию по п.3.

10. Выделенный инсектицидный полипептид, выбранный из группы, состоящей из: (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13; (c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

11. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид по п.10.

12. Композиция по п.11, содержащая от 1 до 99 вес.% указанного полипептида.

13. Способ контроля популяции чешуекрылого или жесткокрылого вредителя, предусматривающий контакт указанной популяции с эффективным количеством полипептида по п.10.

14. Способ уничтожения чешуекрылого вредителя, предусматривающий обеспечение указанному вредителю эффективного количества полипептида по п.10.

15. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.4 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, и получение указанного полипептида, который выбран из группы, состоящей из: (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13; (c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

16. Растение или растительная клетка со стабильно встроенной в их геном ДНК-конструкцией, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, обладающий инсектицидной активностью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который управляет экспрессией, кодирующей последовательности в растительной клетке.

17. Способ получения трансгенного растения или растительной клетки, устойчивых к вредителю, предусматривающий введение в указанные растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

18. Способ защиты растения от вредителя, предусматривающий введение в указанное растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; (c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и (d) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

19. Способ по п.18, где полипептид обладает инсектицидной активностью в отношении чешуекрылого вредителя.

20. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, способная кодировать инсектицидный полипептид и выбранная из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 15 или комплементарную ей последовательность полной длины; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.

21. ДНК-конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.20 и гетерологичный регуляторный элемент, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты.

22. Трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию по п.21.

23. Семя растения, содержащее ДНК-конструкцию по п.21.

24. Выделенный инсектицидный полипептид, выбранный из группы, состоящей из: (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16; (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 15; (c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептиду с SEQ ID NO: 16; и (d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности с SEQ ID NO: 16.

25. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид по п.24.

26. Способ уничтожения или контроля популяции чешуекрылого или жесткокрылого вредителя, предусматривающий контакт указанной популяции с пестицидно эффективным количеством полипептида по п.23.

27. Способ получения трансгенного растения или растительной клетки, устойчивых к вредителю, предусматривающий введение в указанные растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из: (a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 15; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16; (c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16; и (d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.

28. Способ защиты растения от вредителя, предусматривающий обеспечение вредителю растения или растительной клетки, содержащих вектор экспрессии, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.20.


Евразийское 032560 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201690355
(22) Дата подачи заявки 2014.08.06
(51) Int. Cl.
A01H 5/00 (2006.01) A01H1/00 (2006.01) C07H 21/02 (2006.01) C07H21/04 (2006.01) C12N15/00 (2006.01)
(54)
ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АКТИВНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 61/863,761; 61/863,763
(32) 2013.08.08
(33) US
(43) 2016.06.30
(86) PCT/US2014/049923
(87) WO 2015/021139 2015.02.12
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ПАЙОНИР ХАЙ-БРЕД ИНТЕРНЭШНЛ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Абад Андре Р., Вулф Томас Чэд, Чжоу Лань (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) GenBank: AF077326.1. Bacillus thuringiensis Cry1Be1 delta-endotoxin gene, complete cds. 26 August 1998. [Retrieved from the Internet 7 November 2014: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/3360518/]; in entirety
(57) Изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты и их варианты и фрагменты, полученные из штаммов Bacillus thuringiensis, кодирующие полипептиды с пестицидной активностью в отношении насекомых-вредителей, в том числе Lepidoptera и Coleoptera. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пестицидные белки, пестицидные композиции, ДНК-конструкции и трансформированные микроорганизмы и растения, содержащие нуклеиновую кислоту согласно вариантам осуществления. Эти композиции находят применение в способах контроля вредителей, в особенности вредителей растений.
Ссылка на перечень последовательностей, представленный в электронном виде
Перечень последовательностей с названием файла "5277PCT sequence listing.txt", созданный 18 июля 2014 г., и размером 74 кбайта подается в машиночитаемой форме одновременно с настоящим описанием. Перечень последовательностей является частью настоящего описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область изобретения
Настоящее раскрытие относится к встречающимся в естественных условиях и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, полученным из новых генов Bacillus thuringiensis, которые кодируют пестицидные полипептиды, характеризующиеся пестицидной активностью в отношении насекомых-вредителей. В композициях и способах согласно настоящему изобретению используются раскрытые нуклеиновые кислоты и кодируемые ими пестицидные полипептиды для контроля вредителей растений.
Предпосылки изобретения
Насекомые-вредители являются основным фактором, причиняющим ущерб сельскохозяйственным культурам в мире. Например, питание совок, повреждение совкой-ипсилон или повреждение кукурузным мотыльком могут быть опустошительными в экономическом плане для сельскохозяйственных производителей. Связанный с насекомым-вредителем ущерб от нападений кукурузного мотылька только на полевую и сладкую кукурузу достиг приблизительно 1 млрд долларов в год по издержкам от повреждения и затратам на контроль.
Традиционно, главным способом воздействия на популяции насекомых-вредителей является применение химических инсектицидов широкого спектра действия. Тем не менее, потребители, так же как и осуществляющие регулирование правительственные органы, становятся все более обеспокоенными риском неблагоприятного воздействия на окружающую среду, связанного с получением и применением синтетических химических пестицидов. Вследствие таких опасений регулирующие органы запретили или ограничили применение некоторых из более опасных пестицидов. Таким образом, разработка альтернативных пестицидов представляет значительный интерес.
Биологический контроль насекомых-вредителей, имеющих сельскохозяйственное значение, с применением микробного агента, такого как грибы, бактерии или другие виды насекомых, представляет собой не оказывающую негативного влияния на окружающую среду и коммерчески привлекательную альтернативу синтетическим химическим пестицидам. В целом можно сказать, что применение биопестицидов приводит к меньшему риску загрязнения и неблагоприятных воздействий на окружающую среду, и биопестициды обеспечивают большую специфичность по отношению к мишени, чем та, которая характерна для традиционных химических инсектицидов широкого спектра действия. Кроме того, зачастую производство биопестицидов стоит дешевле и, вследствие этого, улучшается экономически эффективный выход продукции для широкого спектра сельскохозяйственных культур.
Определенные виды микроорганизмов из рода Bacillus, как известно, обладают пестицидной активностью против широкого спектра насекомых-вредителей, в том числе Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera и др. Bacillus thuringiensis (Bf) и Bacillus papilliae входят в число наиболее успешных средств биологического контроля, обнаруженных к настоящему времени. Патогенность в отношении насекомых также приписывалась штаммам В. larvae, В, lentimorbus, В. sphaericus (Harwook, ed., ((1989), Bacillus (Plenum Press), 306) и В. cereus (WO 96/10083). Пестицидная активность, как оказывается, сконцентрирована в параспоральных кристаллических белковых включениях, хотя пестицидные белки также были выделены из Bacillus на вегетативной стадии роста. Несколько генов, кодирующих эти пестицидные белки, были выделены и охарактеризованы (см., например, патенты США № 5366892 и 5840868).
Микробные инсектициды, в частности, полученные от штаммов Bacillus, сыграли важную роль в сельском хозяйстве как альтернатива химическому контролю вредителей. Недавно ученые в области сельского хозяйства разработали культурные растения с улучшенной устойчивостью к насекомым при помощи генной инженерии культурных растений с тем, чтобы они продуцировали пестицидные белки, происходящие из Bacillus. Например, с помощью генной инженерии были разработаны растения кукурузы и хлопчатника для выработки пестицидных белков, выделенных из штаммов Bt (см., например, Aronson (2002), Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806). Эти сельскохозяйственные культуры, разработанные при помощи генной инженерии, в настоящее время широко применяются в американском сельском хозяйстве и предоставляют фермеру не оказывающую негативного влияния на окружающую среду альтернативу традиционным способам контроля насекомых. Кроме того, разновидности картофеля, измененные при помощи генной инженерии таким образом, чтобы они содержали пестицидные Cry токсины, реализовывались американским фермерам. В то время как они были признаны коммерчески успешными, эти разработанные при помощи генной инженерии устойчивые к насекомым культурные растения обеспечивают устойчивость только к узкому диапазону экономически важных насекомых-вредителей.
Соответственно, остается потребность в новых токсинах Bt с более широким спектром инсектицидной активности в отношении насекомых-вредителей, например токсинах, которые активны против большего ряда насекомых из отряда Lepidoptera. Кроме того, остается потребность в биопестицидах, обладающих активностью в отношении ряда насекомых-вредителей, и в биопестицидах, которые обладают
улучшенной инсектицидной активностью.
Краткое описание изобретения
Предусматриваются композиции и способы для оказания воздействия на насекомых-вредителей. Более конкретно, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам оказания воздействия на насекомых с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные пептиды, для получения трансформированных микроорганизмов и растений, которые экспресси-руют инсектицидный полипептид согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды, которые являются пестицидными по меньшей мере для одного насекомого, принадлежащего к отряду Lepidoptera.
Варианты осуществления предусматривают молекулы нуклеиновой кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют полипептиды, обладающие пестицидной активностью в отношении насекомых-вредителей (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15, кодирующие полипептид с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16 соответственно). Нуклеотидная последовательность дикого типа (например, встречающаяся в естественных условиях) согласно вариантам осуществления, которая была получена из Bt, кодирует инсектицидный пептид. Варианты осуществления дополнительно предусматривают фрагменты и варианты раскрытой нуклеотидной последовательности, которые кодируют биологически активные (например, инсектицидные) полипептиды.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают выделенные пестицидные (например, инсектицидные) полипептиды, кодируемые либо встречающейся в естественных условиях, либо модифицированной (например, подвергнутой мутагенезу или манипуляции) нуклеиновой кислотой согласно вариантам осуществления. В конкретных примерах пестицидные белки согласно вариантам осуществления включают фрагменты белков и полипептидов полной длины, которые получены из подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, сконструированных для введения конкретных аминокислотных последовательностей в полипептиды согласно вариантам осуществления. В конкретных вариантах осуществления полипептиды обладают усиленной пестицидной активностью по сравнению с активностью встречающегося в естественных условиях полипептида, из которого они получены.
Нуклеиновые кислоты согласно вариантам осуществления также можно применять для получения трансгенных (например, трансформированных) однодольных или двудольных растений, которые характеризуются геномами, содержащими по меньшей мере одну стабильно встроенную нуклеотидную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность согласно вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, который управляет экспрессией кодируемого пестицидного полипептида. Соответственно, также предусматриваются трансформированные растительные клетки, ткани растений, растения и их семена.
В конкретном варианте осуществления трансформированное растение можно получить с применением нуклеиновой кислоты, которая была оптимизирована для повышенной экспрессии в растении-хозяине. Например, один из пестицидных полипептидов согласно вариантам осуществления может быть восстановлен по полипептидной последовательности с получением нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в конкретном хозяине, например в культурном растении, таком как растение кукурузы (Zea mays). Экспрессия кодирующей последовательности таким трансформированным растением (например, двудольным или однодольным) будет приводить в результате к выработке пестицидного полипептида и придавать растению повышенную устойчивость к насекомым. Некоторые варианты осуществления предусматривают трансгенные растения, экспрессирующие пестицид-ные полипептиды, которые находят применение в способах оказания воздействия на различных насекомых-вредителей.
Варианты осуществления дополнительно включают пестицидные или инсектицидные композиции, содержащие инсектицидные полипептиды согласно вариантам осуществления, и они необязательно могут содержать дополнительные инсектицидные пептиды. Варианты осуществления охватывают применение таких композиций по отношению к среде обитания насекомых-вредителей с целью воздействия на насекомых-вредителей.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1-4 представлено выравнивание последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4. Различия по аминокислотам заштрихованы.
Подробное описание изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения направлены на композиции и способы для оказания воздействия на насекомых-вредителей, в особенности на вредителей растений. Более конкретно, выделенная нуклеиновая кислота согласно вариантам осуществления, а также ее фрагменты и варианты содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют пестицидные полипептиды (например, белки). Раскрытые пестицидные белки являются биологически активными (например, пестицидными) в отношении насекомых-вредителей, таких как, без ограничения, насекомые-вредители отряда Lepidoptera.
Композиции согласно вариантам осуществления предусматривают выделенные нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют пестицидные полипептиды, кассеты экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления, выделенные пестицидные белки и пестицидные композиции. Некоторые варианты осуществления предусматривают модифицированные пестицидные полипептиды, обладающие улучшенной инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых по сравнению с пестицидной активностью соответствующего белка дикого типа. Варианты осуществления дополнительно предусматривают растения и микроорганизмы, трансформированные этими новыми нуклеиновыми кислотами, и способы, предполагающие применение таких нуклеиновых кислот, пестицидных композиций, трансформированных организмов и продуктов из них при оказании воздействия на насекомых-вредителей.
Нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно применять для трансформации любого организма для выработки кодируемых пестицидных белков. Предусматриваются способы, которые предполагают применение таких трансформированных организмов для воздействия на вредителей растений или для их контроля. Нуклеиновые кислоты и нуклео-тидные последовательности согласно вариантам осуществления можно также применять для трансформации органелл, таких как хлоропласты (McBride et al. (1995), Biotechnology, 13:362-365 и Kota et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1840-1845).
Помимо этого, варианты осуществления относятся к идентификации фрагментов и вариантов встречающейся в естественных условиях кодирующей последовательности, которые кодируют биологически активные пестицидные белки. Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления находят непосредственное применение в способах оказания воздействия на вредителей, в особенности на насекомых-вредителей, таких как вредители из отряда Lepidoptera. Соответственно, варианты осуществления предусматривают новые подходы к оказанию воздействия на насекомых-вредителей, которые не зависят от применения традиционных синтетических химических инсектицидов. Варианты осуществления предполагают выявление встречающихся в естественных условиях биоразлагаемых пестицидов и генов, которые их кодируют.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают фрагменты и варианты встречающейся в естественных условиях кодирующей последовательности, которые также кодируют биологически активные (например, пестицидные) полипептиды. Нуклеиновые кислоты согласно вариантам осуществления охватывают последовательности нуклеиновой кислоты или нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии клетками конкретного организма, например, последовательности нуклеиновой кислоты, которые были восстановлены по полипептидной последовательности (т.е. подвергнуты "обратной трансляции") с использованием предпочтительных для растений кодонов на основе аминокислотной последовательности полипептида с усиленной пестицидной активностью. Варианты осуществления дополнительно предусматривают мутации, которые придают улучшенные или измененные свойства полипептидам согласно вариантам осуществления. См., например, патент США
№ 7462760.
В последующем описании широко применяется ряд выражений. Следующие определения представлены для облегчения понимания вариантов осуществления.
Единицы измерения, приставки и обозначения можно обозначить в форме, принятой в системе СИ. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записаны соответственно слева направо в направлении от аминогруппы к карбоксигруппе. Область числовых значений включает числа, определяющие диапазон. Аминокислоты в данном документе могут быть названы либо по их общеизвестным трехбуквенным обозначениям, либо по однобуквенным обозначениям, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре IU-PAC-IUB. Нуклеотиды, аналогичным образом, могут быть названы по их общепринятым однобуквенным кодам. Вышеупомянутые термины более полно определены со ссылкой на настоящее описание в целом.
Как используется в данном документе, "нуклеиновая кислота" включает ссылки на дезоксирибо-нуклеотидный или рибонуклеотидный полимер или в одно-, или в двунитевой форме и, если не ограничен иным образом, охватывает известные аналоги (например, пептидонуклеиновые кислоты), обладающие основными свойствами природных нуклеотидов, заключающимися в том, что они гибридизуются с однонитевыми нуклеиновыми кислотами подобно встречающимся в естественных условиях нуклеоти-дам.
Используемые в данном документе термины "кодирующий" или "кодируемый", когда они используются в контексте определенной нуклеиновой кислоты, означают, что нуклеиновая кислота содержит
необходимую информацию для управления трансляцией нуклеотидной последовательности в определенный белок. Информация, которой кодируется белок, определяется применением кодонов. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может содержать нетранслируемые последовательности (например, ин-троны) в границах транслируемых участков нуклеиновой кислоты или может не содержать такие промежуточные нетранслируемые последовательности (например, как в кДНК).
Используемая в данном документе фраза "последовательность полной длины" в отношении определенного полинуклеотида или кодируемого им белка означает наличие полной последовательности нуклеиновой кислоты или полной аминокислотной последовательности нативной (несинтетической) эндогенной последовательности. Полинуклеотид полной длины кодирует полноразмерную каталитически активную форму определенного белка.
Используемый в данном документе термин "антисмысловая" при использовании в контексте ориентации нуклеотидной последовательности, относится к дуплексной последовательности полинуклеотида, которая функционально связана с промотором в ориентации, при которой транскрибируется антисмысловая нить. Антисмысловая нить в значительной степени комплементарна эндогенному продукту транскрипции, так что трансляция эндогенного продукта транскрипции часто подавляется. Таким образом, в случаях, когда термин "антисмысловая" используется в контексте конкретной нуклеотидной последовательности, термин относится к комплементарной нити для эталонного продукта транскрипции.
Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины используют в отношении аминокислотных полимеров, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также в отношении встречающихся в естественных условиях аминокислотных полимеров.
Термины "остаток", или "аминокислотный остаток", или "аминокислота" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислоте, которая встроена в белок, полипептид или пептид (в собирательном значении "белок"). Аминокислота может представлять собой встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, и, если не ограничивается иным образом, она может охватывать известные аналоги природных аминокислот, которые могут функционировать подобно встречающимся в естественных условиях аминокислотам.
Полипептиды согласно вариантам осуществления можно получить либо из нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, либо посредством применения стандартных методик молекулярной биологии. Например, белок согласно вариантам осуществления можно получить путем экспрессии рекомби-нантной нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления в соответствующей клетке-хозяине или в качестве альтернативы при помощи комбинации ex vivo процедур.
Используемые в данном документе термины "выделенный" и "очищенный" используются взаимозаменяемо и относятся к нуклеиновым кислотам или полипептидам или их биологически активным частям, которые практически или по сути не содержат компонентов, которые в норме сопутствуют или взаимодействуют с нуклеиновой кислотой или полипептидом, когда те находятся в естественном окружении. Таким образом, выделенные или очищенные нуклеиновая кислота или полипептид практически не содержат другой клеточный материал или культуральную среду при получении с помощью рекомби-нантных методик или практически не содержат химических предшественников или других химических продуктов, если они синтезированы химическим способом.
" Выделенная" нуклеиновая кислота обычно не содержит последовательности (такие как, например, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Например, в различных вариантах осуществления выделенные нуклеиновые кислоты могут содержать менее приблизительно 5 т.о., 4 т.о., 3 т.о., 2 т.о., 1 т.о., 0,5 т.о. или 0,1 т.о. нуклеотидных последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновые кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота.
Используемые в данном документе термины "выделенный" или "очищенный" в случае, когда они используются в отношении полипептида согласно вариантам осуществления, означают, что выделенный белок практически не содержит клеточный материал и включает препараты белка, содержащие менее приблизительно 30, 20, 10 или 5% (по сухому весу) загрязняющего белка. Если белок согласно вариантам осуществления или его биологически активная часть являются полученными с помощью методик реком-бинантных ДНК, то культуральная среда представляет менее приблизительно 30, 20, 10 или 5% (по сухому весу) химических предшественников или химических продуктов, не являющихся белком, представляющим интерес.
" Рекомбинантная" молекула нуклеиновой кислоты (или ДНК) применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая находится в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления "выделенная" или "рекомбинантная" нуклеиновая кислота не содержит последовательности (предпочтительно последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кисло
ту (т. е. последовательности, расположенные на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. В контексте настоящего раскрытия термины "выделенные" или "рекомбинантные" при применении для обозначения молекул нуклеиновой кислоты исключают выделенные хромосомы.
Применяемые в данном документе "последовательность нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с нативной или геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изменение по отношению к нативной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает, без ограничения, изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, обусловленные вырожденностью генетического кода; оптимизацию кодонов последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в растениях; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения по меньшей мере одной аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления по сравнению с нативной или геномной последовательностью; удаление одного или нескольких интронов, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных регуляторных участков, расположенных выше или ниже; делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку гетерологичного 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка и модификацию сайта полиаде-нилирования. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой кДНК, В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты.
Будет понятно, что по всему описанию слово "содержащий" или варианты, такие как "содержит" или "содержат", подразумевает включение приведенного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий.
Используемый в данном документе термин "воздействие на насекомых-вредителей" относится к осуществлению изменений питания, роста и/или поведения насекомого на любой стадии развития, в том числе, без ограничения, к уничтожению насекомого; задержке роста; предотвращению возникновения способности к репродукции; антифидантной активности и т. п.
Используемые в данном документе термины "пестицидная активность" и "инсектицидная активность" используются как синонимы и относятся к активности организма или вещества (такого как, например, белок), которую можно измерить, но без ограничения, по смертности вредителя, потере веса вредителем, отпугиванию вредителя и другим изменениям поведения и физических характеристик вредителя после питания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Таким образом, организм или вещество с пестицидной активностью оказывает отрицательное воздействие по меньшей мере на один измеряемый параметр приспособляемости вредителя. Например, "пестицидные белки" представляют собой белки, которые проявляют пестицидную активность сами по себе или в комбинации с другими белками.
Используемый в данном документе термин "пестицидно эффективное количество" означает количество вещества или организма, который обладает пестицидной активностью, когда присутствует в среде обитания вредителя. Для каждого вещества или организма пестицидно эффективное количество определяют эмпирически в отношении каждого вредителя, подверженного влиянию в специфической среде. Аналогично, "инсектицидно эффективное количество" может быть использовано для обозначения "пес-тицидно эффективного количества", когда вредитель представляет собой вредителя-насекомого.
Используемые в данном документе термины "рекомбинантно сконструированный" или "сконструированный" означают использование технологии рекомбинантной ДНК для внесения (например, при конструировании) изменения в структуру белка, исходя из понимания механизма действия белка и анализа аминокислот, которые вводят, удаляют или заменяют.
Используемые в данном документе термины "мутантная нуклеотидная последовательность", или " мутация", или "подвергнутая мутагенезу нуклеотидная последовательность" означают нуклеотидную последовательность, которая была подвергнута мутагенезу или изменена таким образом, чтобы она содержала один или несколько нуклеотидных остатков (например, пару оснований), которые не присутствуют в соответствующей последовательности дикого типа. Такой мутагенез или изменение заключаются в одном или нескольких добавлениях, делециях, или заменах, или замещениях остатков нуклеиновой кислоты. Если мутации созданы путем добавления, удаления или замены аминокислоты в сайте протео-литического расщепления, такие добавление, удаление или замена могут присутствовать в пределах мотива протеолитического сайта или прилегать к нему при условии, что цель мутации достигается (т. е. при условии, что протеолиз по данному сайту изменен).
Мутантная нуклеотидная последовательность может кодировать мутантный инсектицидный токсин, проявляющий улучшенную или пониженную инсектицидную активность, или аминокислотную последовательность, которая придает улучшенную или пониженную инсектицидную активность полипептиду, содержащему ее. Используемые в данном документе термины "мутант" или "мутация" в контексте белка, полипептидной или аминокислотной последовательности относятся к последовательности, которая была подвергнута мутагенезу или изменена таким образом, чтобы она содержала один или несколько аминокислотных остатков, которые не присутствуют в соответствующей последовательности дикого типа. Такой мутагенез или изменение заключаются в одном или нескольких добавлениях, делециях, или заменах, или замещениях аминокислотных остатков. Мутантный полипептид проявляет улучшенную или пониженную инсектицидную активность или представляет собой аминокислотную последовательность, которая придает улучшенную инсектицидную активность полипептиду, содержащему ее. Таким образом, термины " мутант" или " мутация" относятся к любому из мутантной нуклеотидной последовательности и кодируемых аминокислот или к ним обоим. Мутантов можно использовать отдельно или в любой совместимой комбинации с другими мутантами согласно вариантам осуществления или с другими мутантами. " Мутантный полипептид" может, напротив, проявлять снижение инсектицидной активности. В случае, когда более чем одну мутацию добавляют к конкретной нуклеиновой кислоте или белку, мутации могут быть добавлены одновременно или последовательно; если последовательно, мутации могут быть добавлены в любом подходящем порядке.
Используемые в данном документе термины "улучшенная инсектицидная активность" или "улучшенная пестицидная активность" относятся к инсектицидному полипептиду согласно вариантам осуществления, который обладает усиленной инсектицидной активностью по сравнению с активностью соответствующего ему белка дикого типа, и/или к инсектицидному полипептиду, который является эффективным против более широкого спектра насекомых, и/или к инсектицидному полипептиду, характеризующемуся специфичностью по отношению к насекомому, которое не чувствительно к токсичности белка дикого типа. Заключение об улучшенной или усиленной пестицидной активности требует демонстрации повышения пестицидной активности по меньшей мере на 10% в отношении насекомого-мишени или повышения пестицидной активности по меньшей мере на 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 100, 150, 200 или 300% или более по сравнению с пестицидной активностью инсектицидного полипептида дикого типа, определенной в отношении такого же насекомого.
Например, улучшенная пестицидная или инсектицидная активность обеспечивается в тех случаях, когда полипептид оказывает воздействие на более широкий или более узкий спектр насекомых по сравнению со спектром насекомых, на которые воздействует Bt токсин дикого типа. Более широкий спектр воздействия может быть желательным в тех случаях, когда необходима универсальность, тогда как более узкий спектр воздействия может быть желателен в тех случаях, когда, например, в иных обстоятельствах полезные насекомые могут подвергнуться воздействию при применении или присутствии токсина. Хотя варианты осуществления не привязаны к какому-либо конкретному механизму действия, улучшенную пестицидную активность также можно обеспечить посредством изменений одной или нескольких характеристик полипептида; например стабильность или продолжительность существования полипептида в кишечнике насекомого могут быть увеличены по сравнению со стабильностью или продолжительностью существования соответствующего белка дикого типа.
Используемый в данном документе термин "токсин" относится к полипептиду, проявляющему пес-тицидную активность, или инсектицидную активность, или улучшенную пестицидную активность, или улучшенную инсектицидную активность. Токсин "Bt" или "Bacillus thuringiensis", как предполагается, включает более широкий класс Cry токсинов, обнаруживающихся в различных штаммах Bt, который включает такие токсины, как, например, Cry1s, Cry2s или Cry3s.
Термины "сайт протеолитического расщепления" или "сайт расщепления" относятся к аминокислотной последовательности, которая придает чувствительность к классу протеаз или конкретной протеа-зе таким образом, что полипептид, содержащий эту аминокислотную последовательность, расщепляется классом протеаз или конкретной протеазой. Сайт протеолитического расщепления считается "чувствительным" к протеазе(протеазам), которая распознает этот сайт. Из уровня техники известно, что эффективность расщепления будет варьировать, и что снижение эффективности расщепления может привести к увеличению стабильности или продолжительности существования полипептида в кишечнике насекомого. Таким образом, протеолитический сайт может придавать чувствительность более чем к одной про-теазе или классу протеаз, но эффективность расщепления по этому сайту может варьировать для различных протеаз. Сайты протеолитического расщепления включают, например, сайты для трипсина, сайты для химотрипсина и сайты для эластазы.
Исследование показало, что протеазы кишечника насекомого, относящегося к чешуекрылым, включают трипсины, химотрипсины и эластазы. См., например, Lenz et al. (1991), Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212 и Hedegus et al. (2003), Arch. Insect Biochem. Physiol. 53:30-47. Например, приблизительно 18 различных трипсинов было обнаружено в средней кишке личинки Helicoverpa armigera (см., Gatehouse et al. (1997), Insect Biochem. Mol. Biol. 27:929-944). Были выявлены предпочтительные сайты-субстраты протеолитического расщепления для этих протеаз. См., например, Peterson et al. (1995), insect
Biochem. Mol. Bioi. 25:765-774.
Предпринимались попытки понять механизм действия Bt токсинов и сконструировать токсины с улучшенными свойствами. Было показано, что протеазы кишечника насекомого могут оказывать влияние на воздействие Cry белков Bt на насекомое. Некоторые протеазы активируют Cry белки посредством их процессинга из формы "протоксина" в токсичную форму, или "токсин". См., Oppert (1999), Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12 и Carroll et al. (1997), J. Invertebrate Pathology, 70:41-49. Эта активация токсина может включать удаление N- и С-концевых пептидов из белка, а также может включать внутреннее расщепление белка. Другие протеазы могут разлагать Cry белки. См., Oppert, там же.
Сравнение аминокислотных последовательностей Cry токсинов с различной специфичностью выявило пять высококонсервативных блоков последовательностей. В плане структуры токсины содержат три отдельных домена, которые представляют собой, от N- к С-концу: кластер из семи альфа-спиралей, вовлеченный в образовании поры (называемый "доменом 1"), три антипараллельных бета-листа, вовлеченных в связывание с клеткой (называемые "доменом 2"), и бета-сендвич (называемый "доменом 3"). Расположение и свойства этих доменов известны специалисту в данной области техники. См., например, Li et al. (1991), Nature, 305:815-821 и Morse et al. (2001), Structure, 9:409-417. Если упоминается конкретный домен, такой как домен 1, следует понимать, что точные конечные характеристики домена применительно к конкретной последовательности не являются решающими при условии, что последовательность или ее часть включает последовательность, которая обеспечивает, по меньшей мере, какую-нибудь функцию, приписываемую конкретному домену. Таким образом, например, при упоминании "домена 1" предполагается, что конкретная последовательность включает кластер из семи альфа-спиралей, но точные конечные показатели последовательности, используемой или упоминаемой применительно к данному кластеру, не являются решающими. Специалисту в данной области техники знакомы определение таких конечных показателей и оценка таких функций.
В попытке лучше охарактеризовать и улучшить Bt токсины, изучали штаммы бактерии Bt. Были выявлено, что препараты кристаллов, полученные из культур штаммов Bt, обладают пестицидной активностью против многочисленных чешуекрылых вредителей (см., например, экспериментальный пример 1). Была предпринята попытка идентифицировать нуклеотидные последовательности, кодирующие белки кристаллов из выбранных штаммов, и нуклеиновые кислоты дикого типа (т.е. встречающиеся в естественных условиях) согласно вариантам осуществления выделяли из этих штаммов бактерий, клонировали в вектор экспрессии и трансформировали E. coli. В зависимости от характеристик данного препарата считается, что демонстрация пестицидной активности иногда требует предварительной обработки трипсином для активации пестицидных белков. Таким образом, понятно, что некоторые пестицидные белки требуют расщепления протеазой (например, трипсином, химотрипсином и т. п.) для активации, тогда как другие белки являются биологически активными (например, пестицидными) в отсутствие активации.
Такие молекулы можно изменять с помощью средств, описанных, например, в патенте США № 7462760. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты можно сконструировать таким образом, чтобы они кодировали полипептиды, которые содержат дополнительные мутации, придающие улучшенную или измененную пестицидную активность по сравнению с пестицидной активностью встречающегося в естественных условиях полипептида. Нуклеотидные последовательности таких сконструированных нуклеиновых кислот содержат мутации, не обнаруживающиеся в последовательностях дикого типа.
Мутантные полипептиды согласно вариантам осуществления обычно получают с помощью способа, который включает стадии получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид семейства Cry, анализа структуры полипептида для идентификации конкретных сайтов" мишеней" для мутагенеза лежащей в основе генной последовательности исходя из представлений о предполагаемой функции домена-мишени и механизма действия токсина; введения одной или нескольких мутаций в последовательность нуклеиновой кислоты с получением необходимого изменения в одном или нескольких аминокислотных остатках кодируемой полипептидной последовательности и анализа полученного полипептида в отношении пестицидной активности.
Многие из инсектицидных Bt токсинов являются родственными с различными степенями сходства их аминокислотных последовательностей и третичной структуры, и при этом средства для получения кристаллических структур Bt токсинов являются хорошо известными. Иллюстративные результаты расчета кристаллической структуры с высоким разрешением для полипептидов как Cry3A, так и Cry3B доступны в литературе. Рассчитанная структура гена Cry3A (Li et al. (1991), Nature, 353:815-821) обеспечивает понимание взаимосвязи между структурой и функцией токсина. Совместное рассмотрение опубликованных структурных анализов Bt токсинов и описанной функции, связанной с конкретными структурами, мотивами и т. п., указывает на то, что специфические участки токсина соотносятся с конкретными функциями и отдельными стадиями механизма действия белка. Например, многие токсины, выделенные из Bt, обычно описывают как содержащие три домена: пучок из семи спиралей, который вовлечен в образование поры, домен из трех листов, который вовлечен в связывание с рецептором, и бета-сендвич мотив (Li et al. (1991), Nature, 305: 815-821).
Как описано в патентах США № 7105332 и 7462760, токсичность Cry белков можно улучшить путем целенаправленного воздействия на участок, расположенный между альфа-спиралями 3 и 4 в домене 1 токсина. Эта теория основывается на совокупности знаний, имеющих отношение к инсектицидным токсинам, в том числе 1) о том, что альфа-спирали 4 и 5 в домене 1 Cry3A токсинов, как сообщалось, встраиваются в липидный бислой клеток, выстилающих среднюю кишку чувствительных насекомых (Gazit et al. (1998), Proc. Nail. Acad. Sci. USA 95:12289-12294); 2) на знаниях авторов настоящего изобретения о расположении сайтов расщепления трипсином и химотрипсином в аминокислотной последовательности белка дикого типа; 3) на наблюдении, что белок дикого типа был более активным в отношении определенных насекомых после активации in vitro при обработке трипсином или химотрипсином; и 4) на сообщениях о том, что расщепление токсинов с 3'-конца приводило в результате к пониженной токсичности в отношении насекомых.
Для создания новых полипептидов с усиленной или измененной пестицидной активностью можно создать ряд мутаций и поместить в различные фоновые последовательности. См., например, патент США № 7462760. Эти мутанты предусматривают, но без ограничения, добавление по меньшей мере одного дополнительного чувствительного к протеазе сайта (например, сайт расщепления для трипсина) в участок, расположенный между спиралями 3 и 4 в домене 1; замещение исходного чувствительного к про-теазе сайта в последовательности дикого типа отличающимся чувствительным к протеазе сайтом; добавление нескольких чувствительных к протеазе сайтов в конкретном положении; добавление аминокислотных остатков около чувствительного к протеазе сайта(ов) для изменения фолдинга полипептида и, таким образом, усиления расщепления полипептида в чувствительном к протеазе сайте(ах) и добавление мутаций для защиты полипептида от разрушающего расщепления, которое снижает токсичность (например, создание ряда мутаций, при которых аминокислота дикого типа заменяется валином для защиты полипептида от расщепления). Мутации можно использовать по отдельности или в любой комбинации для обеспечения полипептидов согласно вариантам осуществления.
Гомологичные последовательности идентифицировали с помощью поиска сходства в неизбыточной (nr) базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием BLAST и PSI-BLAST. Гомологичные белки состояли из Cry токсинов преимущественно из Bacillus thuringiensis.
Мутация, которая представляет собой дополнительный или альтернативный чувствительный к про-теазе сайт, может быть чувствительной к нескольким классам протеаз, таких как сериновые протеазы, которые включают трипсин и химотрипсин, или ферментов, таких как эластаза. Таким образом, мутацию, которая представляет собой дополнительный или альтернативный чувствительный к протеазе сайт, можно сконструировать для того, чтобы сайт легко распознавался и/или расщеплялся категорией проте-аз, таких как протеазы млекопитающих или протеазы насекомых. Чувствительный к протеазе сайт также можно сконструировать таким образом, чтобы он расщеплялся конкретным классом ферментов или конкретным ферментом, о котором известно, что он продуцируется в организме, таким как, например, хи-мотрипсином, продуцируемым хлопковой совкой Heliothis zea (Lenz et al. (1991), Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212). Мутации также могут придавать устойчивость к протеолитическому расщеплению, например, к расщеплению химотрипсином по С-концу пептида.
Наличие дополнительного и/или альтернативного чувствительного к протеазе сайта в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида может улучшить пестицидную активность и/или специфичность полипептида, кодируемого нуклеиновыми кислотами согласно вариантам осуществления. Соответственно, нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления могут быть ре-комбинантно сконструированными или с ними могут быть произведены манипуляции для получения полипептидов с улучшенной или измененной инсектицидной активностью и/или специфичностью по сравнению с таковыми у немодифицированного токсина дикого типа. Кроме того, мутации, раскрытые в данном документе, можно поместить в другие нуклеотидные последовательности или применять в сочетании с ними для обеспечения улучшенных свойств. Например, чувствительный к протеазе сайт, который легко расщепляется химотрипсином насекомого, например химотрипсином, обнаруживающимся у совки Берта или хлопковой совки (Hegedus et al. (2003), Arch. Insect Biochem. Physiol. 53:30-47 и Lenz et al. (1991), Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212), можно поместить в фоновую последовательность Cry для обеспечения улучшенной токсичности у этой последовательности. Таким образом, варианты осуществления предусматривают токсичные полипептиды с улучшенными свойствами.
Например, подвергнутая мутагенезу нуклеотидная последовательность Cry может предусматривать дополнительные мутанты, содержащие дополнительные кодоны, которые вводят вторую чувствительную к трипсину аминокислотную последовательность (дополнительно к встречающемуся в естественных условиях сайту для трипсина) в кодируемый полипептид. Альтернативный дополнительный мутант согласно вариантам осуществления предусматривает дополнительные кодоны, сконструированные для введения по меньшей мере одного дополнительного отличающегося чувствительного к протеазе сайта в полипептид, например чувствительного к химотрипсину сайта, расположенного непосредственно в направлении 5' или 3' от встречающегося в естественных условиях сайта для трипсина. В качестве альтернативы можно создать мутантов с заменой, у которых по меньшей мере один кодон нуклеиновой кисло
ты, который кодирует встречающийся в естественных условиях чувствительный к протеазе сайт, разрушен, а альтернативные кодоны введены в последовательность нуклеиновой кислоты с целью обеспечения отличающегося (например, замененного) чувствительного к протеазе сайта. Мутант с замещением также может быть добавлен к последовательности Cry, в которой встречающийся в естественных условиях сайт расщепления для трипсина, присутствующий в кодируемом полипептиде, разрушен, а сайт расщепления для химотрипсина или эластазы введен на его место.
Считается, что можно применять любую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности, которые представляют собой сайты протеолитического расщепления или предполагаемые сайты протеолитического расщепления (например, последовательности, такие как RR или LKM), и что точная идентичность кодонов, используемых для введения любого из этих сайтов расщепления в вариантный полипептид, может варьировать в зависимости от применения, т. е. экспрессии в конкретном виде растений. Также считается, что любую из раскрытых мутаций можно ввести в любую последовательность полинуклеотида согласно вариантам осуществления, которая содержит кодоны для аминокислотных остатков, обеспечивающих нативный сайт расщепления для трипсина, на который целенаправленно воздействует модификация. Соответственно, варианты либо токсинов полной длины, либо их фрагментов можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные или альтернативные сайты расщепления, и предполагается, что эти варианты осуществления охватываются объемом вариантов осуществления, раскрытых в данном документе.
Специалист в данной области техники поймет, что любую полезную мутацию можно добавить к последовательностям согласно вариантам осуществления при условии, что кодируемые полипептиды сохраняют пестицидную активность. Таким образом, последовательности также можно подвергнуть мутагенезу с тем, чтобы кодируемые полипептиды были устойчивы к протеолитическому расщеплению химотрипсином. Более одного сайта распознавания можно добавить в конкретном положении в любой комбинации, и при этом несколько сайтов распознавания можно добавить к токсину или удалить из него. Таким образом, дополнительные мутации могут содержать три, четыре или более сайтов распознавания. Следует понимать, что несколько мутаций можно сконструировать в любой подходящей последовательности полинуклеотида; соответственно, либо последовательности полной длины, либо их фрагменты можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные или альтернативные сайты расщепления, а также были устойчивы к протеолитическому расщеплению. Таким образом, варианты осуществления предусматривают Cry токсины, содержащие мутации, которые улучшают пестицидную активность, а также улучшенные композиции и способы оказания воздействия на вредителей с использованием других Bt токсинов.
Мутации могут защищать полипептид от разрушения протеазой, например, путем удаления предполагаемых сайтов протеолитического расщепления, таких как предполагаемые сайты для сериновой протеазы и сайты распознавания для эластазы, из различных областей. Некоторые или все такие предполагаемые сайты можно удалить или изменить с тем, чтобы снизить протеолиз в месте расположения исходного сайта. Изменения протеолиза можно оценить путем сравнения мутантного полипептида с токсинами дикого типа или путем сравнения мутантных токсинов, которые отличаются их аминокислотной последовательностью. Предполагаемые сайты протеолитического расщепления и сайты протеолитиче-ского расщепления включают, без ограничения, следующие последовательности: RR, сайт расщепления для трипсина; LKM, сайт для химотрипсина; и сайт для трипсина. Эти сайты можно изменить путем добавления или удаления любого числа и вида аминокислотных остатков при условии, что пестицидная активность полипептида повышается. Таким образом, полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями, содержащими мутации, будут содержать по меньшей мере одно изменение или добавление аминокислоты по сравнению с нативной или фоновой последовательностью или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 или 280 или более изменений или добавлений аминокислоты. Пестицидную активность полипептида также можно улучшить путем усечения нативной последовательности или последовательности полной длины, как известно из уровня техники.
Композиции согласно вариантам осуществления включают нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют пестицидные полипептиды. В частности, варианты осуществления предусматривают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, или нук-леотидные последовательности, кодирующие указанную аминокислотную последовательность, например нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13, а также их фрагменты и варианты.
В частности, варианты осуществления предусматривают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, или нуклеотид-ные последовательности, кодирующие указанную аминокислотную последовательность, например нук-леотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, а также их фрагменты и варианты.
Интерес также представляют оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления. Используемая в данном документе фраза "оптимизированные нуклеотидные последовательности" относится к нуклеиновым кислотам, которые являются оптимизированными для экспрессии в конкретном организме, например, в растении. Оптимизированные нуклеотидные последовательности можно получить для любого организма, представляющего интерес, с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, патент США № 7462760, в котором описывается оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая раскрытый пести-цидный белок. В данном примере нуклеотидную последовательность получали посредством "обратной трансляции" аминокислотной последовательности белка и изменения нуклеотидной последовательности с тем, чтобы она содержала предпочтительные для маиса кодоны, при этом все еще кодировала ту же аминокислотную последовательность. Эта процедура более подробно описана в Murray et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:477-498. Оптимизированные нуклеотидные последовательности находят применение при повышении экспрессии пестицидного белка в растении, например в однодольных растениях семейства Gramineae (Роасеае), таких как, например, растение маиса или кукурузы.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16, а также их фрагменты и варианты.
В конкретных вариантах осуществления пестицидные белки согласно вариантам осуществления предполагают инсектицидные полипептиды полной длины, фрагменты инсектицидных полипептидов полной длины и вариантные полипептиды, которые получены из подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, сконструированных для введения конкретных аминокислотных последовательностей в полипептиды согласно вариантам осуществления. В конкретных вариантах осуществления аминокислотные последовательности, которые вводят в полипептиды, содержат последовательность, которая обеспечивает сайт расщепления для фермента, такого как протеаза.
Из уровня техники известно, что пестицидная активность Bt токсинов, как правило, активируется при расщеплении пептида в кишечнике насекомого различными протеазами. Поскольку пептиды не всегда могут расщепляться в кишечнике насекомого с полной эффективностью, фрагменты токсина полной длины могут обладать усиленной пестицидной активностью по сравнению с самим токсином полной длины. Таким образом, некоторые из полипептидов согласно вариантам осуществления включают фрагменты инсектицидного полипептида полной длины, и некоторые из фрагментов, вариантов и мутаций полипептида будут характеризоваться усиленной пестицидной активностью по сравнению с активностью встречающегося в естественных условиях инсектицидного полипептида, из которого они получены, в особенности если встречающийся в естественных условиях инсектицидный полипептид не активируется in vitro протеазой перед скринингом в отношении активности. Таким образом, настоящим изобретением охватываются усеченные варианты или фрагменты последовательностей.
Мутации можно поместить в любую фоновую последовательность, в том числе в такие усеченные полипептиды при условии, что полипептид сохраняет пестицидную активность. Специалист в данной области техники может легко сравнить два или более белков в отношении пестицидной активности с помощью анализов, известных из уровня техники или описанных в других местах в данном документе. Следует понимать, что полипептиды согласно вариантам осуществления можно получить либо путем экспрессии нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, либо путем применения стандартных методик молекулярной биологии.
Считается, что пестицидные белки могут быть олигомерными и будут отличаться по молекулярному весу, числу остатков, составляющим пептидам, активности в отношении конкретных вредителей и другим характеристикам. Тем не менее, с помощью способов, изложенных в данном документе, можно выделить и охарактеризовать белки, активные в отношении ряда вредителей. Пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно применять в комбинации с другими Bt токсинами или другими инсектицидными белками для расширения спектра насекомых-мишеней. Более того, применение пести-цидных белков согласно вариантам осуществления в комбинации с другими Bt токсинами или другими инсектицидными активными компонентами отличной природы является особенно полезным для предотвращения и/или сдерживания развития устойчивости у насекомых. Другие инсектицидные средства включают ингибиторы протеаз (как серинового, так и цистеинового типов), сс-амилазы и пероксидазы.
Фрагменты и варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и полипептидов, кодируемых ими, также охватываются вариантами осуществления. Используемый в данном документе термин "фрагмент" относится к части нуклеотидной последовательности полинуклеотида или к части аминокислотной последовательности полипептида согласно вариантам осуществления. Фрагменты нук-леотидной последовательности могут кодировать фрагменты белка, которые сохраняют биологическую активность нативного белка или соответствующего белка полной длины и, следовательно, обладают пес
тицидной активностью. Таким образом, считается, что некоторые из последовательностей полинуклео-тидов и аминокислотных последовательностей согласно вариантам осуществления можно справедливо называть и фрагментами, и мутантами.
Следует понимать, что термин "фрагмент" в том значении, в котором он используется по отношению к последовательностям нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления, также охватывает последовательности, которые являются полезными в качестве гибридизационных зондов. Нуклеотидные последовательности из этого класса обычно не кодируют фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность. Таким образом, фрагменты нуклеотидной последовательности могут варьировать в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов, приблизительно 50 нуклеотидов, приблизительно 100 нуклеотидов и до нуклеотидной последовательности полной длины, кодирующей белки согласно вариантам осуществления.
Фрагмент нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, который кодирует биологически активную часть пестицидного белка согласно вариантам осуществления, будет кодировать по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 или 300 смежных аминокислот или до общего числа аминокислот, присутствующих в пестицидном полипептиде согласно вариантам осуществления (например, 739 аминокислот для SEQ ID NO: 2). Таким образом, следует понимать, что вариантами осуществления также охватываются полипептиды, которые представляют собой фрагменты иллюстративных пес-тицидных белклов согласно вариантам осуществления и имеют длину по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 или 300 смежных аминокислот или до общего числа аминокислот, присутствующих в пес-тицидном полипептиде согласно вариантам осуществления (например, 739 аминокислот для SEQ ID NO: 2). От фрагментов нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, которые являются полезными в качестве гибридизационных зондов или ПЦР-праймеров обычно не требуется, чтобы они кодировали биологически активную часть пестицидного белка. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления может кодировать биологически активную часть пести-цидного белка, или он может представлять собой фрагмент, который можно применять в качестве гибри-дизационного зонда или ПЦР-праймера с использованием способов, раскрытых в данном документе. Биологически активную часть пестицидного белка можно получить путем выделения части одной из нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления, экспрессии кодируемой части пестицидного белка (например, путем рекомбинантной экспрессии in vitro) и оценки активности кодируемой части пестицидного белка.
Нуклеиновые кислоты, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, содержат по меньшей мере 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 850, 900 или 950 нуклеотидов или до числа нуклеотидов, присутствующих в нуклеотидной последовательности, раскрытой в данном документе (например, 2220 нуклеотидов для SEQ ID NO: 1). Конкретные варианты осуществления предусматривают фрагменты, происходящие из (например, полученные из) первой нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления, где фрагмент кодирует усеченный токсин, обладающий пестицидной активностью. Усеченные полипептиды, кодируемые полинуклеотидными фрагментами согласно вариантам осуществления, обладают пестицидной активностью, которая является либо эквивалентной, либо улучшенной по сравнению с активностью соответствующего полипептида полной длины, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, из которой происходит фрагмент. Предусматривается, что такие фрагменты нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления могут быть усеченными по 3'-концу нативной кодирующей последовательности или соответствующей кодирующей последовательности полной длины. Фрагменты нуклеиновой кислоты также могут быть усеченными как по 5'-, так и по 3'-концу нативной кодирующей последовательности или соответствующей кодирующей последовательности полной длины.
Термин "варианты" используется в данном документе для обозначения практически сходных последовательностей. Для нуклеотидных последовательностей консервативные варианты включают те последовательности, которые из-за вырожденности генетического кода кодируют аминокислотную последовательность одного из пестицидных полипептидов согласно вариантам осуществления. Специалисты в данной области техники легко поймут, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих, белки согласно настоящему изобретению. Табл. 1 представляет собой таблицу кодонов, в которой представлены синонимичные кодоны для каждой аминокислоты. Например, все кодоны AGA, AGG, CGA, CGC, CGG и CGU кодируют аминокислоту аргинин. Таким образом, в каждом положении в нуклеиновых кислотах согласно настоящему изобретению, в котором аргинин обозначен кодоном, кодон может быть изменен на любой из соответствующих кодо-нов, описанных выше, без изменения кодируемого полипептида. Понятно, что U в последовательности РНК соответствует Т в последовательности ДНК.
При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для усиления экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин является растением, для улучшенной экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с использованием кодонов, предпочтительных для растений. См., например, Campbell and Gowri, (1990), Plant Physiol. 92:1-11; в отношении рассмотрения использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться как у видов однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:477-498). Таким образом, кодон, предпочтительный для маиса, для конкретной аминокислоты можно установить из известных генных последовательностей маиса. Использование кодонов маисом для 28 генов из растений маиса приведено в табл. 4 из Murray, et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США № 5380831 и 5436391, Murray, et al., (1989), Nucleic Acids Res. 17:477-498 и Liu H. et al. Mol. Bio. Rep. 37:677-684, 2010, включенные в данный документ посредством ссылки. Таблицу использования кодонов Zea maize также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, доступ к которому можно получить с применением префикса www. В табл. 2 показан анализ оптимальных кодонов маиса (адаптировано из Liu H. et al. Mol. Bio. Rep. 37:677-684, 2010).
Использование кодонов сравнивали с применением критерия сопряженности хи-квадрат для идентификации оптимальных кодонов. Кодоны, которые встречаются статистически более часто (Р\0,01), обозначены звездочкой.
Таблица использования кодонов Glycine max показана в виде табл. 3, и ее также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3847 &aa=1 &style=N, доступ к которому можно получить с применением префикса www.
К тому же, специалист в данной области техники поймет, что изменения можно вводить путем мутирования последовательностей нуклеиновой кислоты, что ведет к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные молекулы нуклеиновой кислоты можно создавать путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений и/или делеций в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации можно вводить при помощи стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные последовательности нуклеиновой кислоты также охватываются настоящим изобретением.
Встречающиеся в природе аллельные варианты, такие как эти, можно идентифицировать с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методики гибридизации, как изложено в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий полипептид с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий полипептид с SEQ ID NO: 16, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной.
Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклео-тидные последовательности, такие как полученные, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза, но которые все еще кодируют пестицидный белок согласно вариантам осуществления, такой как му-тантный токсин. В целом, варианты конкретной нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления будут иметь последовательность, по меньшей мере приблизительно на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную конкретной нуклеотидной последовательности при определении с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. Вариант нуклео-тидной последовательности согласно вариантам осуществления может отличаться от данной последова
тельности лишь 1-15 нуклеотидами, лишь 1-10, как, например, 6-10, лишь 5, лишь 4, 3, 2 или даже 1 нук-леотидом.
Варианты конкретной нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления (т.е. иллюстративной нуклеотидной последовательности) также можно оценивать путем сравнения процентной идентичности последовательности для полипептида, кодируемого вариантной нуклеотидной последовательностью, и полипептида, кодируемого эталонной нуклеотидной последовательностью. Таким образом, например, раскрыты выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид с данной процентной идентичностью последовательности по отношению к полипептиду с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14. Процентную идентичность последовательности для любых двух полипептидов можно рассчитать с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. При оценке любой заданной пары полинуклеотидов согласно вариантам осуществления путем сравнения процентной идентичности последовательности, общей для двух полипептидов, которые они кодируют, последовательности двух кодируемых полипептидов идентичны по меньшей мере приблизительно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70%, обычно по меньшей мере приблизительно на 75, 80, 85%, по меньшей мере приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97% или по меньшей мере приблизительно на 98, 99% или более.
Используемый в данном документе термин "вариантный белок" охватывает полипептиды, которые получены из нативного белка путем делеции (так называемого усечения) или добавления одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце нативного белка; делеции или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативном белке или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативном белке. Соответственно, термин "вариантный белок" охватывает биологически активные фрагменты нативного белка, которые содержат достаточное число смежных аминокислотных остатков для сохранения биологической активности нативного белка, т.е. для того, чтобы он обладал пестицидной активностью. Такая пестицидная активность может быть отличающейся или улучшенной по сравнению с нативным белком, или она может быть неизменной при условии, что пестицидная активность сохраняется.
Вариантные белки, охватываемые вариантами осуществления, являются биологически активными, т.е. они продолжают обладать необходимой биологической активностью нативного белка, т.е. пестицидной активностью, как описано в данном документе. Такие варианты могут быть результатом, например, генетического полиморфизма или манипуляции, осуществляемой человеком. Биологически активные варианты нативного пестицидного белка согласно вариантам осуществления будут иметь последовательность, по меньшей мере приблизительно на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности для нативного белка при определении с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. Биологически активный вариант белка согласно вариантам осуществления может отличаться от данного белка лишь 1-15 аминокислотными остатками, лишь 1-10, как, например, 6-10, лишь 5, лишь 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 6.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 8.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 10.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 12.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 14.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид имеет последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется модифицированным физическим свойством.
Применяемый в данном документе термин "физическое свойство" относится к какому-либо параметру, который подходит для описания физико-химических характеристик белка. Применяемые в данном документе термины "физическое свойство, представляющее интерес" и "свойство, представляющее интерес" применяются взаимозаменяемо для обозначения физических свойств белков, которые исследуются и/или модифицируются. Примеры физических свойств включают, без ограничения, суммарный поверхностный заряд и распределение зарядов на поверхности белка, суммарную гидрофобность и распределение гидрофобных остатков на поверхности белка, плотность поверхностного заряда, плотность гид-рофобности поверхности, общее число поверхностных ионизируемых групп, поверхностное натяжение, размер белка и его распределение в растворе, температуру плавления, теплоемкость и второй вириаль-ный коэффициент. Примеры физических свойств также включают, без ограничения, растворимость, фолдинг, стабильность и усвояемость. В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется повышенной перевариваемостью фрагментов, полученных в результате протеолитического расщепления, в кишечнике насекомого. Модели для переваривания при помощи искусственного желудочного сока известны специалисту в данной области техники (Fuchs, R.L. and J.D. Astwood. Food Technology, 50:83-88, 1996; Astwood, J.D., et al. Nature Biotechnology, 14:1269-1273, 1996; Fu T.J. et al. J. Agric Food Chem. 50:7154-7160, 2002).
Кроме того, вариантами осуществления охватывается микроорганизм, который трансформирован по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно вариантам осуществления, кассетой экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту, или вектором, содержащим кассету экспрессии. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой микроорганизм, размножающийся на растениях. Вариант осуществления настоящего изобретения относится к инкапсулированному пестицидному белку, который содержится в трансформированном микроорганизме, способном к экспрессии по меньшей мере одного пестицидного белка согласно вариантам осуществления.
Варианты осуществления предусматривают пестицидные композиции, содержащие трансформированный микроорганизм согласно вариантам осуществления. В таких вариантах осуществления трансформированный микроорганизм обычно присутствует в пестицидной композиции в пестицидно эффективном количестве вместе с подходящим носителем. Вариантами осуществления также охватываются пестицидные композиции, содержащие выделенный белок согласно вариантам осуществления, отдельно или в комбинации с трансформированным организмом согласно вариантам осуществления, и/или инкапсулированный пестицидный белок согласно вариантам осуществления в инсектицидно эффективном количестве вместе с подходящим носителем.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают способ расширения спектра насекомых-мишеней путем применения пестицидного белка согласно вариантам осуществления в комбинации по меньшей мере с одним другим или "вторым" пестицидным белком. В способах согласно вариантам осуществления можно использовать любой пестицидный белок, известный из уровня техники. Такие пести-цидные белки включают, без ограничения, Bt токсины, ингибиторы протеаз, сх-амилазы и пероксидазы.
Вариантами осуществления также охватываются трансформированные или трансгенные растения, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления растение является стабильно трансформированным нуклео-тидной конструкцией, содержащей по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность согласно вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке. Используемые в данном документе термины "трансформированное растение" и " трансгенное растение" относятся к растению, которое содержит в своем геноме гетерологичный поли-нуклеотид. В целом, гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрирован в геном трансгенного или трансформированного растения таким образом, что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетеролигичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном сам или как часть рекомбинант-ной кассеты экспрессии.
Следует понимать, что используемый в данном документе термин "трансгенный" включает любую клетку, клеточную линию, каллюс, ткань, часть растения или растение, генотип которого был изменен в результате присутствия гетерологичной нуклеиновой кислоты, в том числе такие трансгенные объекты, которые исходно изменены таким образом, а также такие трансгенные объекты, которые созданы путем половых скрещиваний или бесполого размножения из исходного трансгенного объекта. Используемый в данном документе термин "трансгенный" не охватывает изменение генома (хромосомного или внехро-мосомного) с помощью традиционных способов селекции растений или встречающихся в природе трансгенных объектов, например случайное перекрестное опыление, инфекция, вызванная нерекомбинантным вирусом, трансформация нерекомбинантными бактериями, нерекомбинационная транспозиция или спонтанная мутация.
Используемый в данном документе термин "растение" включает целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки и потомство таковых. Части трансгенных растений находятся в пределах объема вариантов осуществления и предусматривают, например,
растительные клетки, растительные протопласты, тканевые культуры растительных клеток, из которых можно регенерировать растения, растительные каллюсы, скопления растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растений, таких как зародыши, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветки, ветви, плоды, зерна, колоски, стержни початков, шелуха, стебли, корни, верхушки корней, пыльники и т.п., происходящих из трансгенных растений или их потомства, ранее трансформированных молекулой ДНК согласно вариантам осуществления и, таким образом, по меньшей мере частично состоящих из трансгенных клеток. Класс растений, которые можно применять в способах согласно вариантам осуществления обычно настолько же широк, как и класс высших растений, поддающихся методикам трансформации, включающий как однодольные, так и двудольные растения.
Хотя варианты осуществления не зависят от конкретного биологического механизма повышения устойчивости растения к вредителю растений, экспрессия нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления в растении может приводить в результате к выработке пестицидных белков согласно вариантам осуществления и к повышению устойчивости растения к вредителю растений. Растения согласно вариантам осуществления находят применение в сельском хозяйстве в способах оказания воздействия на насекомых-вредителей. Определенные варианты осуществления предусматривают трансформированные культурные растения, такие как, например, растения маиса, которые находят применение в способах оказания воздействия на насекомых-вредителей растения, таких как, например, чешуекрылые вредители.
" Исследуемое растение или растительная клетка" представляют собой растение или растительную клетку, в которых генетическое изменение, такое как трансформация, затронуло ген, представляющий интерес, или представляют собой растение или растительную клетку, которые происходят от растения или клетки, измененных таким образом, и которые содержат изменение. "Контроль", или "контрольное растение", или " контрольная растительная клетка" обеспечивают точку отсчета для измерения изменений фенотипа исследуемого растения или растительной клетки.
Контрольное растение или растительная клетка могут представлять собой, например, (а) растение или клетку дикого типа, т. е. с таким же генотипом, что и у исходного материала для генетического изменения, который дал в результате исследуемое растение или клетку; (b) растение или растительную клетку с таким же генотипом, что и у исходного материала, но которые были трансформированы нуль-конструкцией (т. е. конструкцией, которая не оказывает известного влияния на признак, представляющий интерес, такой как конструкция, содержащая маркерный ген); (с) растение или растительную клетку, которые являются нетрансформированным сегрегантом среди потомства исследуемых растения или растительной клетки; (d) растение или растительную клетку, генетически идентичные исследуемым растению или растительной клетке, но которые не были подвергнуты воздействию условий или стимулов, которые будут индуцировать экспрессию гена, представляющего интерес; или (е) исследуемое растение или растительную клетку, как таковые, в условиях, при которых ген, представляющий интерес, не экс-прессируется.
Специалист в данной области техники легко поймет, что достижения в области молекулярной биологии, такие как сайт-специфический и неспецифический мутагенез, методики полимеразной цепной реакции и методики белковой инженерии, обеспечивают богатый набор инструментов и протоколов, подходящих для применения с целью изменения или конструирования как аминокислотной последовательности, так и лежащих в основе генных последовательностей белков, представляющих интерес с точки зрения сельского хозяйства.
Таким образом, белки согласно вариантам осуществления можно изменять различными способами, включая аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки. Способы осуществления таких манипуляций, как правило, известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей пестицидных белков можно получить путем введения мутаций в синтетическую нуклеиновую кислоту (например, молекулу ДНК). Способы мутагенеза и внесения изменений в нуклеиновую кислоту хорошо известны из уровня техники. Например, сконструированные изменения можно вводить с использованием методики опосредованного олигонуклеотидами сайт-направленного мутагенеза. См., например, Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492; Kunkel et al. (1987), Methods in Enzymol. 154:367382; патент США № 4873192; Walker and Gaastra, eds. (1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), и источники, цитируемые в этих документах.
Подвергнутые мутагенезу нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно модифицировать с тем, чтобы изменить приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 или более из аминокислот, присутствующих в первичной последовательности кодируемого полипептида. В качестве альтернативы можно вводить даже еще большее количество изменений по отношению к нативной последовательности таким образом, чтобы у кодируемого белка по меньшей мере приблизительно 1 или 2%, или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12%, или даже приблизительно 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19%, или 20, 21, 22, 23, 24%, или 25, 30, 35%, или 40% или более кодонов могли быть измененными или иным образом модифицированными по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Таким же образом, у кодируемого белка может быть по меньшей мере приблизительно 1 или 2%, или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12%, или даже приблизительно 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19%, или 20, 21, 22, 23, 24%, или 25, 30,
35%, или 40% или более дополнительных кодонов по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Следует понимать, что подвергнутые мутагенезу нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления, как предполагается, охватывают биологически функциональные эквивалентные пептиды, которые обладают пестицидной активностью, такой как улучшенная пестицидная активность, которую определяют по антифидантным свойствам в отношении личинок кукурузного мотылька. Такие последовательности могут возникнуть как следствие избыточности кодонов и функциональной эквивалентности, которые, как известно, встречаются в естественных условиях в последовательностях нуклеиновой кислоты и кодируемых таким образом белках.
Специалист в данной области техники поймет, что добавления аминокислот и/или аминокислотные замены обычно основываются на относительном сходстве заместителей в боковой цепи аминокислот, например их гидрофобности, заряда, размера и т. п. Иллюстративные группы аминокислотных замен, в которых принимаются во внимание различные из вышеизложенных характеристик, хорошо известны специалисту в данной области техники и включают аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин и валин, лейцин и изолейцин.
Руководство по соответствующим аминокислотным заменам, которые не влияют на биологическую активность белка, представляющего интерес, можно найти в модели Dayhoff et al. (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включенной в данный документ посредством ссылки. Могут быть произведены консервативные замены, такие как замещение одной аминокислоты другой с аналогичными свойствами.
Таким образом, гены и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления включают как встречающиеся в естественных условиях последовательности, так и мутантные формы. Аналогично, белки согласно вариантам осуществления охватывают как встречающиеся в естественных условиях белки и варианты (например, усеченные полипептиды), так и их модифицированные (например, мутантные) формы. Такие варианты будут продолжать обладать необходимой пестицидной активностью. Очевидно, что мутации, которые будут произведены в нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и, в целом, не будут создавать комплементарные участки, которые могут образовать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на европейский патент № 75444.
Ожидается, что делеции, вставки и замены в белковых последовательностях, охватываемые данным документом, не произведут радикальных изменений в характеристиках белка. Тем не менее, если трудно предсказать точный эффект замены, делеции и вставки перед ее осуществлением, специалист в данной области техники поймет, что данный эффект будет оценен посредством обычных скрининговых анализов, таких как анализы с кормлением насекомых. См., например, Marrone et al. (1985), J. Econ. Entomol. 78:290-293; и Czapla and Lang (1990), J. Econ. Entomol. 83:2480-2485, включенные в данный документ посредством ссылки.
Вариантные нуклеотидные последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные в результате мутагенной и рекомбиногенной процедуры, такой как ДНК-шаффлинг. При такой процедуре можно производить манипуляции с одной или несколькими различными кодирующими последовательностями для создания нового пестицидного белка, обладающего необходимыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создают из популяции родственных по последовательностям полинуклеотидов, содержащих участки последовательностей, которые характеризуются значительной идентичностью последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с применением этого подхода кодирующие последовательности полной длины, мотивы в последовательностях, кодирующих домен, представляющий интерес, или любой фрагмент нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления можно перетасовать между нуклеотидными последовательностями согласно вариантам осуществления и соответствующими частями других известных нуклеотидных последовательностей Cry с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес.
Свойства, представляющие интерес, включают, без ограничения, пестицидную активность на единицу пестицидного белка, стабильность белка и токсичность в отношении видов, не являющихся мишенью, в особенности людей, домашнего скота, а также растений и микробов, которые экспрессируют пес-тицидные полипептиды согласно вариантам осуществления. Варианты осуществления не связываются конкретной стратегией шаффлинга, нужно только, чтобы по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность согласно вариантам осуществления или ее часть была задействована в такой стратегии шаф-флинга. В шаффлинге могут быль задействованы только нуклеотидные последовательности, раскрытые в данном документе, или он может дополнительно предусматривать шаффлинг других нуклеотидных последовательностей, известных из уровня техники. Стратегии ДНК-шаффлинга известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751; Stemmer (1994), Nature, 370:389-391; Crameri et al. (1997), Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997), J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4504-4509; Crameri et al. (1998), Nature, 391:288-291 и
патенты США № 5605793 и 5837458.
Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также можно применять для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности из других бактерий и, более конкретно, из других штаммов Bacillus. Таким образом, такие способы, как ПЦР, гибридизация и т. п., можно применять для идентификации таких последовательностей на основе гомологии их последовательности с последовательностями, изложенными в данном документе. Вариантами осуществления охватываются последовательности, выбранные на основе идентичности последовательности с полными последовательностями, изложенными в данном документе, или их фрагментами. Такие последовательности включают последовательности, которые являются ортологами раскрытых последовательностей. Термин "ортологи" относится к генам, происходящим от общего предкового гена и выявляемым у различных видов вследствие видообразования. Гены, обнаруживаемые у различных видов, считаются ортологами, если их нуклеотидные последовательности и/или кодируемые ими белковые последовательности имеют существенную степень идентичности, как определено в других разделах в данном документе. Функции ортологов часто являются высококонсервативными среди видов.
В случае подхода, основанного на ПЦР, олигонуклеотидные праймеры можно сконструировать для применения в ПЦР-реакциях для амплификации соответствующих последовательностей ДНК исходя из кДНК или геномной ДНК, извлеченных из какого-либо организма, представляющего интерес. Способы конструирования ПЦР-праймеров и ПЦР-клонирования в целом известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), в дальнейшем "Sambrook". См. также Innis et al., eds. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995), PCR Strategies (Academic Press, New York) и Innis and Gelfand, eds. (1999), PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Известные способы ПЦР включают, без ограничений, способы с применением парных праймеров, гнездовых праймеров, одиночных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, ген-специфических праймеров, вектор-специфических праймеров, частично несовпадающих праймеров и т.п.
При гибридизационных методиках всю известную нуклеотидную последовательность или ее часть применяют в качестве зонда, который избирательно гибридизируется с другими соответствующими нук-леотидными последовательностями, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК (т.е. геномные библиотеки или библиотеки кДНК) из выбранного организма. Гибридизационные зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и их можно пометить выявляемой группой, такой как 32Р, или любым другим выявляемым маркером. Таким образом, например, зонды для гибридизации можно получить с помощью мечения синтетических олигонуклеотидов на основе последовательностей согласно вариантам осуществления. Способы получения зондов для гибридизации и для построения библиотек кДНК и геномных библиотек, как правило, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook.
Например, полную последовательность, раскрытую в данном документе, или одну или несколько ее частей можно применять в качестве зонда, способного специфично гибридизироваться с соответствующими последовательностями и матричными РНК. Для обеспечения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными по отношению к последовательностям согласно вариантам осуществления и обычно имеют длину по меньшей мере приблизительно 10 или 20 нуклеотидов. Такие зонды можно применять для амплификации соответствующих последовательностей Cry из выбранного организма с помощью ПЦР. Эту методику можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают гибридизационный скрининг высеянных на чашку Петри библиотек ДНК (бляшек или колоний; см., например, Sambrook).
Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в жестких условиях. Используемые в данном документе термины "жесткие условия" или "жесткие условия гибридизации" относятся к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в явно большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз или в 10 раз больше по сравнению с фоном). Жесткие условия являются зависимыми от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Путем контроля жесткости условий гибридизации и/или отмывки можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). В качестве альтернативы условия жесткости можно отрегулировать так, чтобы они допускали некоторое несовпадение в последовательностях с тем, чтобы выявлять более низкие степени сходства (гетерологичное зондирование). Обычно зонд имеет длину менее приблизительно 1000 или 500 нуклеотидов.
Как правило, жесткие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,5 М ионов Na, как правило, концентрация ионов Na (или других солей) составляет приблизительно 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Иллюстративные условия низ
кой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором 30-35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия) при 37°C и отмывкой 1Х-2Х SSC (20X SSC = 3,0 М NaCl/0,3 M тринатрия цитрат) при 50-55°C. Иллюстративные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°C и отмывку в 0,5Х-1Х SSC при 55-60°C. Иллюстративные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°C и окончательную отмывку в 0,1 Х SSC при 60-65°C в течение по меньшей мере приблизительно 20 мин. Необязательно, отмывочные буферы могут содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 1% SDS. Длительность гибридизации, в целом, составляет менее приблизительно 24 ч, обычно от приблизительно 4 до приблизительно 12 ч.
Специфичность, как правило, зависит от отмывок после гибридизации, причем ключевыми факторами являются ионная сила и температура конечного отмывочного раствора. Для гибридов ДНК-ДНК Tm (температуру плавления) можно аппроксимировать из уравнения в Meinkoth and Wahl (1984), Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% форм.) - 500/л; где М представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процент гуанозиновых и ци-тозиновых нуклеотидов в ДНК, "% форм." представляет собой процентное содержание формамида в гиб-ридизационном растворе и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизируется с идеально соответствующим зондом. Процедуры отмывки, как правило, осуществляют, по меньшей мере, до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие и пока не будет достигнут низкий фоновый уровень гибридизации, как, например, в течение 2 ч, 1 ч или 30 мин.
Tm снижают приблизительно на 1°C для каждого 1% несовпадения; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или отмывки можно скорректировать для гибридизации с последовательностями с необходимой идентичностью. Например, если осуществляют поиск последовательностей с идентичностью > 90%, Tm можно снизить на 10°C. Обычно жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°C ниже, чем Tm для конкретной последовательности и комплементарной ей последовательности при определенной ионной силе и рН. Тем не менее, при условиях высокой жесткости можно проводить гибридизацию и/или отмывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°C ниже, чем Tm; при условиях умеренной жесткости можно проводить гибридизацию и/или отмывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°C ниже, чем Tm; в условиях низкой жесткости можно проводить гибридизацию и/или отмывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°C ниже, чем Tm.
При использовании уравнения, композиций для гибридизации и отмывки и необходимой Tm специалистам в данной области техники будет понятно, что изменения жесткости растворов для гибридизации и/или отмывки, по существу, описаны. Если необходимая степень несовпадения приводит в результате к Tm ниже 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор формамида), то концентрацию SSC можно повысить для того, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Исчерпывающее пособие по гибридизации нуклеиновых кислот находится в Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al., eds. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). См. также Sambrook. Таким образом, выделенные последовательности, которые кодируют белок Cry согласно вариантам осуществления и гибридизируются в жестких условиях с последовательностями Cry, раскрытыми в данном документе, или с их фрагментами, охватываются вариантами осуществления.
Следующие термины применяют для описания родства последовательностей между двумя или более нуклеиновыми кислотами или полинуклеотидами: (а) "эталонная последовательность", (b) "окно сравнения", (с) "идентичность последовательностей", (d) "процентная идентичность последовательностей" и (е) "существенная идентичность".
(a) Как применяется в данном документе, "эталонная последовательность" является заданной последовательностью, применяемой в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой сокращенную версию или полную форму определенной последовательности; например, в виде сегмента кДНК полной длины или последовательности гена, или полной кДНК или последовательности гена.
(b) Используемое в данном документе "окно сравнения" относится к непрерывному и точно определенному сегменту в последовательности полинуклеотида, причем последовательность полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Как правило, длина окна сравнения составляет по меньшей мере 20 смежных нуклео-тидов и необязательно может составлять 30, 40, 50, 100 или больше. Специалисты в данной области техники понимают, что во избежание высокого сходства с эталонной последовательностью, вследствие включения гэпов в последовательность полинуклеотида, как правило, вводится штраф за гэп и его вычитают из количества совпадений.
Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны из уровня техники. Таким образом, определение процентной идентичности последовательностей между любыми двумя по
следовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. Неограничивающими примерами таких математических алгоритмов являются алгоритм по Myers and Miller (1988), CABIOS 4:11-17; алгоритм локального выравнивания по Smith et al. (1981), Adv. Appl. Math. 2:482; алгоритм глобального выравнивания по Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453; способ поиска локального выравнивания по Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; алгоритм из Karlin and Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, который модифицирован в Karlin and Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
Для сравнения последовательностей можно использовать компьютерные реализации данных математических алгоритмов для того, чтобы определить идентичность последовательностей. Такие реализации включают, без ограничений, CLUSTAL в программе PC/Gene (доступна от Intelligenetics, Маунтин-Вью, Калифорния); программу ALIGN (версия 2.0) и GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в GCG Wisconsin Genetics Software Package, версия 10 (доступны от Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, Сан-Диего, Калифорния, США). Выравнивания при помощи этих программ могут быть выполнены с использованием параметров по умолчанию. Программа CLUSTAL хорошо описана в Higgins et al. (1988), Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989), CABIOS, 5:151-153; Corpet et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992), CABIOS, 8:155-65 и Pearson et al. (1994), Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Программа ALIGN основана на алгоритме из Myers and Miller (1988), упоминаемом выше. При сравнении аминокислотных последовательностей в программе ALIGN можно применять таблицу весов замен остатков РАМ120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за открытие гэпа 4. Программы BLAST из Altschul, et al., (1990), J. Mol. Biol. 215:403, основаны на алгоритме из Karlin and Altschul, (1990), упоминаемом выше. Поиски нуклеотидных последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTN при параметрах вес выравнивания = 100, длина слова = 12 с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидной последовательности, кодирующей белок согласно вариантам осуществления. Поиски белковых последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTX при параметрах вес выравнивания = 50, длина слова = 3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белку или полипептиду согласно вариантам осуществления. Для получения выравнивания с гэпами с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389. В качестве альтернативы можно использовать PSI-BLAST (в BLAST 2.0) для выполнения итерированного поиска, который обнаруживает отдаленные взаимосвязи между молекулами. См. Altschul et al. (1997), упоминаемый выше. При использовании BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST можно использовать параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей, BLASTX для белков). См. веб-сайт Национальной центра биотехнологической информации в сети Интернет по адресу ncbi.hlm.nih.gov. Выравнивание можно проводить вручную с помощью просмотра.
Если не указано иное, значения идентичности/сходства последовательностей, приведенные в данном документе, относятся к значению, полученному с помощью GAP версии 10 с применением следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с применением штрафа за открытие гэпа 50, и штрафа за продолжение гэпа 3, и матрицы замен nwsgapdna.cmp; % идентичности и % сходства для аминокислотной последовательности с применением штрафа за открытие гэпа 8, и штрафа за продолжение гэпа 2, и матрицы замен BLOSUM62; или любой эквивалентной ей программы. Используемый в данном документе термин "эквивалентная программа" относится к любой программе для сравнения последовательностей, в которой для любых двух рассматриваемых последовательностей осуществляют выравнивание с идентичными совпадениями нуклеотидных или аминокислотных остатков и идентичной процентной идентичностью последовательности по сравнению с соответствующим выравниванием, осуществляемым с помощью GAP версии 10.
В GAP используется алгоритм по Needleman and Wunsch (1970), выше, для обнаружения выравнивания двух полных последовательностей, который максимально увеличивает число совпадений и сводит к минимуму количество гэпов. GAP рассматривает все возможные варианты выравнивания и положения гэпов и создает выравнивание с наибольшим количеством совпавших оснований и наименьшим числом гэпов. Она позволяет назначить штраф за открытие гэпа и штраф за продолжение гэпа в единицах совпавших оснований. В GAP необходимо прибавлять число штрафов за открытие гэпа к совпадениям для каждого гэпа, который вводится. Если выбран штраф за продолжение гэпа больше нуля, в GAP необходимо, кроме этого, прибавлять для каждого введенного гэпа длину гэпа, умноженную на штраф за продолжение гэпа. Значения по умолчанию для штрафа за открытие гэпа и значения по умолчанию для штрафа за продолжение гэпа в GCG Wisconsin Genetics Software Package версии 10 для белковых последовательностей составляют 8 и 2 соответственно. Для нуклеотидных последовательностей штраф за открытие гэпа по умолчанию составляет 50, в то время как штраф за продолжение гэпа по умолчанию составляет 3. Штрафы за открытие гэпа и за продолжение гэпа могут быть выражены в виде целого числа, выбранного из группы, состоящей из целых чисел от 0 до 200. Таким образом, например, штрафы за открытие гэпа и за продолжение гэпа могут составлять 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или более.
GAP является одним представителем семейства лучших средств выравнивания. Существует множество представителей этого семейства, но ни один другой представитель не характеризуется лучшим качеством. GAP отображает четыре численных показателя для выравниваний: качество, отношение, идентичность и сходство. Качество является увеличенным до максимума показателем для выравнивания последовательностей. Отношение представляет собой качество, деленное на количество оснований в более коротком сегменте. Процентная идентичность представляет собой процент символов, которые собственно совпадают. Процентное сходство представляет собой процент символов, которые являются сходными. Символы, которые лежат напротив гэпов, игнорируют. Сходство засчитывают, если значение матрицы замен для пары символов больше или равно 0,50, что является порогом сходства. Матрицей замен, применяемой в версии 10 пакета программного обеспечения GCG Wisconsin Genetics Software Package является BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915).
(c) Как используется в данном документе, "идентичность последовательностей" или "идентичность" в контексте двух последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие в пределах определенного окна сравнения. Если процентную идентичность последовательностей используют применительно к белкам, подразумевается, что положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, при этом аминокислотные остатки заменены другими аминокислотными остатками с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не изменяют функциональные свойства молекулы. Если последовательности отличаются консервативными заменами, то процентную идентичность последовательностей можно повысить с тем, чтобы внести поправку на консервативную природу замены. Говорят, что последовательности, которые отличаются такими консервативными заменами, характеризуются "сходством последовательностей" или "сходством". Средства для осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. Как правило, она предусматривает оценку в баллах консервативной замены как частичного, а не полного несовпадения, что, таким образом, увеличивает процентную идентичность последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается балл 1, а неконсервативной замене присваивается балл ноль, то консервативной замене присваивается балл от 0 до 1. Оценку консервативных замен в баллах рассчитывают, например, как реализовано в программе PC/GENE (Intelligenetics, Маун-тин-Вью, Калифорния).
(d) Как используется в данном документе, "процентная идентичность последовательностей" означает значение, определяемое с помощью сравнения двух последовательностей с оптимальным выравниванием в пределах окна сравнения, где часть последовательности полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процентной идентичности последовательности.
(e) (i) Термин "существенная идентичность" последовательностей полинуклеотидов означает, что полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% или более идентична при сравнении с эталонной последовательностью с помощью одной из описанных программ для выравнивания с использованием стандартных параметров. Специалист в данной области техники поймет, что данные значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями с учетом вырожденности кодона, аминокислотного сходства, расположения рамки считывания и т. п. Существенная идентичность аминокислотных последовательностей для данных целей обычно означает, что последовательности идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90 или 95% или более.
Другим показателем того, что нуклеотидные последовательности являются существенно идентичными, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях. Обычно жесткие условия выбирают так, чтобы температура была приблизительно на 5°C ниже Tm для конкретной последовательности при определенной ионной силе и рН. Тем не менее, жесткие условия охватывают температуры в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 20°C ниже Tm в зависимости от необходимой степени жесткости, что в ином случае оговорено в данном документе. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще являются существенно идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, являются существенно идентичными. Это может иметь место, например, если копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодона, допускаемой генетическим кодом. Одним показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты существенно идентичны, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно-реагирующим с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой.
(е)(и) Термин "существенная идентичность" в контексте пептида указывает на то, что пептид содержит последовательность, по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 95% или более идентичную эталонной последовательности в пределах определенного окна сравнения. Оптимальное выравнивание для этих целей можно провести с использованием алгоритма глобального выравнивания по Needleman and Wunsch (1970), выше. Признаком того, что две пептидные последовательности являются существенно идентичными, является то, что один пептид иммунологически реагирует с антителами против второго пептида. Таким образом, пептид является существенно идентичным второму пептиду, например, где два пептида отличаются только по консервативному замещению. Пептиды, которые являются "существенно сходными", имеют общие последовательности, как отмечалось выше, за исключением того, что положения остатков, которые не идентичны, могут отличаться по консервативным аминокислотным изменениям.
Применение термина "нуклеотидные конструкции" в данном документе не предназначено ограничивать варианты осуществления нуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалисты в данной области техники поймут, что нуклеотидные конструкции, в частности полинуклеотиды и олиго-нуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и комбинаций рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, также можно применять в способах, раскрытых в данном документе. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления дополнительно охватывают все комплементарные формы таких конструкций, молекул и последовательностей. Кроме того, нуклеотидные конструкции, нуклеотидные молекулы и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления охватывают все нуклеотидные конструкции, молекулы и последовательности, которые можно использовать в способах согласно вариантам осуществления для трансформации растений, в том числе, без ограничения, состоящие из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их комбинаций. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды имеют в составе как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также охватывают все формы нуклеотидных конструкций, в том числе, без ограничения, однонитевые формы, двунитевые формы, шпильки, структуры "стебель-и-петля" и т.п.
Дополнительный вариант осуществления относится к трансформированному организму, такому как организм, выбранный из группы, состоящей из растительных клеток или клеток насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловирусов, простейших, нематод и водорослей. Трансформированный организм содержит молекулу ДНК согласно вариантам осуществления, кассету экспрессии, содержащую указанную молекулу ДНК, или вектор, содержащий указанную кассету экспрессии, которые могут быть стабильно встроенными в геном трансформированного организма.
Последовательности согласно вариантам осуществления предусмотрены в составе конструкций ДНК для экспрессии в организме, представляющем интерес. Конструкции будут включать 5' и 3' регуля-торные последовательности, функционально связанные с последовательностью согласно вариантам осуществления. Применяемый в данном документе термин "функционально связанные" относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанный означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот являются смежными и, где необходимо для соединения двух кодирующих белок областей, смежными и в той же рамке считывания. Конструкция может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, подлежащий введению в организм путем котрансформации. В качестве альтернативы, дополнительный(е) ген(ы) может(гут) предусматриваться в нескольких конструкциях ДНК.
Такая ДНК-конструкция снабжена несколькими сайтами рестрикции для вставки последовательности Cry токсина, транскрипция которой будет регулироваться регуляторными участками. ДНК-конструкция может дополнительно содержать гены селектируемых маркеров.
В направлении транскрипции 5'-3' ДНК-конструкция будет включать участок инициации транскрипции и трансляции (т. е. промотор), последовательность ДНК согласно вариантам осуществления и участок терминации транскрипции и трансляции (т. е. участок терминации), функционирующие в организме, служащем хозяином. Участок инициации транскрипции (т.е. промотор) может быть нативным, аналогичным, чужеродным или гетерологичным относительно организма-хозяина и/или последовательности согласно вариантам осуществления. Кроме того, промотор может быть природной последовательностью или, в качестве альтернативы, синтетической последовательностью. Применяемый в данном документе термин "чужеродный" указывает на то, что промотор не найден в нативном организме, в который введен промотор. Если промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" относительно последовательности согласно вариантам осуществления, предполагается, что промотор не является натив-ным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности согласно вариантам осуществления. Используемый в данном документе химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициации транскрипции, который является гетерологичным для кодирующей последовательности. Если промотор является нативной или природной последовательностью, экспрессия функционально связанной последовательности изменена по
сравнению с экспрессией дикого типа, что приводит к изменению фенотипа.
Участок терминации может быть нативным относительно участка инициации транскрипции, может быть нативным относительно функционально связанной последовательности ДНК, представляющей интерес, может быть нативным относительно растения-хозяина или может быть получен из другого источника (т. е. чужеродный или гетерологичный для промотора, последовательности, представляющей интерес, растения-хозяина или какой-либо их комбинации).
Подходящие участки терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как участки тер-минации генов октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также, Guerineau et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991), Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991), Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al.
(1990) , Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990), Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 и Joshi et al. (1987), Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для усиления экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин является растением, для усиления экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с применением кодонов, предпочтительных для растений. См., например, Campbell and Gowri (1990), Plant Physiol. 92:1-11; в отношении рассмотрения использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться как у видов однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:477-498). Таким образом, кодон, предпочтительный для маиса, для конкретной аминокислоты можно установить из известных генных последовательностей маиса. Данные о частоте использования кодонов у маиса для 28 генов из растений маиса приведены в табл. 4 в Murray et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Murray et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные в данный документ посредством ссылки.
Известны дополнительные модификации последовательности для усиления экспрессии гена у клеточного хозяина. Они включают устранение последовательностей, кодирующих ложные сигналы поли-аденилирования, сигналы сайта сплайсинга экзонов и интронов, транспозон-подобные повторы и другие хорошо изученные последовательности, которые могут быть вредны для экспрессии гена. Содержание GC в последовательности можно скорректировать до уровней, средних для данного клеточного хозяина, рассчитываемых с учетом известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Применяемый в данном документе термин "клетка-хозяин" относится к клетке, которая содержит вектор и которая поддерживает репликацию и/или экспрессию предполагаемых векторов экспрессии. Клетки-хозяева могут быть прока-риотическими клетками, такими как Е. coli, или эукариотическими клетками, такими как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих, или клетками однодольных или двудольных растений. Примером клетки-хозяина, относящейся к однодольному растению, является клетка-хозяин маиса. Если возможно, последовательность модифицируют для того, чтобы избежать образования прогнозируемых шпилечных вторичных структур мРНК.
Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5'-лидерные последовательности. Такие ли-дерные последовательности могут способствовать усилению трансляции. Трансляционные лидерные последовательности известны из уровня техники и включают лидерные последовательности пикорнави-русов, например, лидерную последовательность EMCV (5'-некодирующий участок генома вируса энце-фаломиокардита) (Elroy-Stein et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); лидерные последовательности потивирусов, например лидерную последовательность TEV (вируса гравировки табака) (Gallie et al. (1995), Gene 165(2):233-238), лидерную последовательность MDMV (вируса карликовой мозаики кукурузы), мРНК белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP) (Macejak et al.
(1991) , Nature 353:90-94); нетранслируемую лидерную последовательность мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (РНК-4 AMV) (Jobling et al. (1987), Nature 325:622-625); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (TMV) (Gallie et al. (1989), в Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), p. 237-256) и лидерную последовательность вируса хлоротической пятнистости маиса (MCMV) (Lommel et al. (1991), Virology 81:382-385). См. также, Della-Cioppa et al. (1987), Plant Physiol. 84:965-968.
При получении кассеты экспрессии с различными фрагментами ДНК можно проводить манипуляции так, чтобы получить последовательности ДНК в надлежащей ориентации и, при необходимости, в надлежащей рамке считывания. С этой целью для соединения фрагментов ДНК можно использовать адаптеры или линкеры, или можно задействовать другие манипуляции для обеспечения подходящих сайтов рестрикции, удаления избыточной ДНК, удаления сайтов рестрикции и т. п. С этой целью можно задействовать мутагенез in vitro, репарацию с помощью праймеров, рестрикцию, гибридизацию, повторные замены, например транзиции и трансверсии.
При практическом осуществлении вариантов осуществления можно применять ряд промоторов. Промоторы можно выбирать исходя из необходимого результата. Нуклеиновые кислоты можно объединять с конститутивными, тканепредпочтительными, индуцируемыми или другими промоторами для экспрессии в организме-хозяине. Подходящие конститутивные промоторы для применения в растительной
клетке-хозяине включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, раскрытые в документе WO 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор 35S CaMVp (Odell et al. (1985), Nature 313:810-812); промотор гена актина риса (McElroy et al. (1990), Plant Cell 2:163-171); убиквитиновый промотор (Christensen et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:619-632; и Christen-sen et al. (1992), Plant Mol. Biol. 18:675-689); промотор pEMU (Last et al. (1991), Theor. Appl. Genet. 81:581-588); промотор гена MAS (Velten et al. (1984), EMBO J. 3:2723-2730); промотор гена ALS (патент США № 5659026) и т.п. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США № 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611.
В зависимости от требуемого результата, может быть полезно экспрессировать ген при помощи индуцируемого промотора. Особый интерес для регуляции экспрессии нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления у растений представляют собой индуцируемые ранением промоторы. Такие индуцируемые ранением промоторы могут реагировать на повреждение, вызванное питанием насекомого, и они включают промотор гена ингибитора протеиназы картофеля (pin II) (Ryan (1990), Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996), Nature Biotechnology 14:494-498); промоторы генов wun1 и wun2, патент США № 5428148; промоторы генов win1 и win2 (Stanford et al. (1989), Mol. Gen. Genet. 215:200-208); промотор гена системина (McGurl et al. (1992), Science 225:1570-1573); промотор гена WIP1 (Rohmeier et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993), FEBS Letters 323:73-76); промотор гена MPI (Corderok et al. (1994), Plant J. 6(2):141-150) и т.п., включенные в данный документ посредством ссылки.
Кроме того, в способах и нуклеотидных конструкциях согласно вариантам осуществления можно использовать индуцируемые патогеном промоторы. Такие индуцируемые патогеном промоторы включают промоторы из генов, связанных с патогенезом белков (PR белков), которые индуцируются после инфицирования патогеном; например, PR белков, SAR белков, бета-1,3-глюканазы, хитиназы и т.д. См., например, Redolfi, et al., (1983), Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992), Plant Cell 4:645-656; и Van Loon (1985), Plant Mol. Virol. 4:111-116. См. также WO 99/43819, включенную в данный документ посредством ссылки.
Представляют интерес промоторы, которые экспрессируются локально в месте заражения патогеном или рядом с ним. См., например, Marineau et al. (1987), Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989), Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:24272430; Somsisch et al. (1988), Mol. Gen. Genet. 2:93-98; и Yang (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1497214977. См. также, Chen et al. (1996), Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993), Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989), Plant Cell 1:961-968; патент США № 5750386 (индуцируемый нематодами); а также источники, цитируемые в этих документах. Особый интерес представляет индуцируемый промотор для гена маиса PRms, экспрессия которого индуцируется патогеном Fusarium moniliforme (см., например, Cordero et al. (1992), Physiol. Mol. Plant Path.
41:189-200).
Регулируемые химическими веществами промоторы можно применять для модуляции экспрессии гена в растении посредством внесения экзогенного химического регулятора. В зависимости от цели, промотор может быть индуцируемым химическим веществом промотором, в этом случае применение химического вещества индуцирует экспрессию гена, или репрессируемым химическим веществом промотором, в этом случае применение химического вещества подавляет экспрессию гена. Индуцируемые химическими веществами промоторы известны из уровня техники, и они включают, без ограничения, промотор ln2-2 маиса, который активируется антидотами к бензолсульфонамидным гербицидам, промотор GST маиса, который активируется гидрофобными электрофильными соединениями, которые применяются в качестве предвсходовых гербицидов, и промотор PR-1 а табака, который активируется салициловой кислотой. Другие регулируемые химическими веществами промоторы, представляющие интерес, включают чувствительные к стероидам промоторы (см., например, индуцируемый глюкокортикоидами промотор в Schena et al. (1991), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-10425; и McNellis et al. (1998), Plant J. 14(2):247-257) и индуцируемые тетрациклином и репрессируемые тетрациклином промоторы (см., например, Gatz et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 227:229-237, и патенты США № 5814618 и 5789156), включенные в данный документ посредством ссылки.
Тканепредпочтительные промоторы можно использовать для целенаправленного усиления экспрессии пестицидного белка в пределах конкретной ткани растения. Тканепредпочтительные промоторы включают промоторы, обсуждаемые в Yamamoto et al. (1997), Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997), Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997), Moi. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997), Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996), Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996), Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996), Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994), Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994), Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993), Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993), Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; и Guevara-Garcia et al. (1993), Plant J. 4(3):495-505. В случае необходимости, такие промоторы можно модифицировать с получением слабой экспрессии.
Промоторы, активные преимущественно в листьях, известны из уровня техники. См., например, Yamamoto et al. (1997), Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994), Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994), Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993), Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993), Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; и Matsuoka et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
Известны промоторы, активные преимущественно в корнях, или промоторы, специфичные по отношению к корню, и их можно выбирать из многих доступных из литературы или выделенных de novo из различных совместимых видов. См., например, Hire et al. (1992), Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (специфичный по отношению к корню ген глутаминсинтетазы сои); Keller and Baumgartner (1991), Plant Cell 3(10):1051-1061 (специфичный по отношению к корню регуляторный элемент в гене GRP 1.8 фасоли обыкновенной); Sanger et al. (1990), Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (специфичный по отношению к корню промотор гена маннопинсинтазы (MAS) из Agrobacterium tumefaciens); и Miao et al. (1991), Plant Cell 3(1):11-22 (кДНК-клон полной длины, кодирующий цитозольную глутаминсинтетазу (GS), которая экс-прессируется в корнях и корневых клубеньках сои). См. также Bogusz et al. (1990), Plant Cell 2(7):633-641, где описаны два специфичных по отношению к корню промотора, выделенные из генов гемоглобина азотфиксирующего, не относящегося к бобовым растения Parasponia andersonii и родственного, не относящегося к азотфиксирующим и не относящегося к бобовым растения Trema tomentosa. Промоторы этих генов были связаны с репортерным геном Р-глюкуронидазы и введены как в Nicotiana tabacum, не относящийся к бобовым, так и в бобовое Lotus corniculatus, и при этом в обоих случаях активность промотора, специфичная по отношению к корню, сохранялась. Leach и Aoyagi (1991), описывают свой анализ промоторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии генов ro1C и ro1D Agrobacterium rhizogenes, индуцирующих разрастание корней (см. Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Они пришли к выводу, что в этих промоторах энхансер и тканепредпочтительные ДНК-детерминанты разделены. Teeri et al. (1989) применяли слияние гена с lacZ для того, чтобы показать, что ген из Т-ДНК Agrobacterium, кодирующий октопинсинтазу, является особенно активным в эпидермисе кончика корня, и что ген TR2' является специфичным по отношению к корню в интактном растении и стимулируется при ранении ткани листа, что является особенно желательной комбинацией характеристик для применения с инсектицидным или ларвицидным геном (см. EMBO J. 8(2):343-350). Ген TR1', слитый с nptII (неомицинфос-фотрансфераза II), продемонстрировал аналогичные характеристики. Дополнительные предпочтительные для корня промоторы включают промотор гена VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995), Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); и промотор rolB (Capana et al. (1994), Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. См. также патенты США № 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 и 5023179.
Промоторы, "активные преимущественно в семени", включают как промоторы, "специфичные по отношению к семени" (промоторы, которые активны во время развития семени, такие как промоторы запасных белков семени), так и промоторы "прорастания семени" (промоторы, которые активны во время прорастания семени). См., Thompson et al. (1989), BioEssays 10:108, включенную в данный документ посредством ссылки. Такие промоторы, активные преимущественно в семени, включают, без ограничения, промоторы генов Cim1 (индуцируемый цитокинином транскрипт); CZ19B1 (19 кДа зеин маиса) и milps (мио-инозитол-1-фосфатсинтаза); (см. патент США № 6225529, включенный в данный документ посредством ссылки). Промоторы генов гамма-зеина и Glob-1 представляют собой промоторы, специфичные по отношению к эндосперму. У двудольных растений промоторы, специфичные по отношению к семени, включают, без ограничения, промоторы генов Р-фазеолина фасоли, напина, Р-конглицинина, лектина сои, круциферина и т.п. У однодольных растений промоторы, специфичные по отношению к семени, включают, без ограничения, промоторы генов 15 кДа зеина, 22 кДа зеина, 27 кДа зеина, g-зеина, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулина 1 маиса и т.д. См. также включенный в данный документ посредством ссылки документ WO 00/12733, где раскрыты промоторы, активные преимущественно в семени, из генов end1 и end2. Промотор, который имеет "преимущественную" экспрессию в конкретной ткани, экспресси-руется в такой ткани в большей степени, чем по меньшей мере в одной другой растительной ткани. Для некоторых промоторов, активных преимущественно в определенной ткани, показана экспрессия почти исключительно в конкретной ткани.
Если требуется низкий уровень экспрессии, будут применяться слабые промоторы Как правило, применяемый в данном документе термин "слабый промотор" относится к промотору, который управляет экспрессией кодирующей последовательности на низком уровне. Под низким уровнем экспрессии подразумевают уровни от приблизительно 1/1000 до приблизительно 1/100000 транскриптов, до приблизительно 1/500000 транскриптов. В качестве альтернативы понятно, что термин "слабые промоторы" также охватывает промоторы, которые управляют экспрессией только в небольшом количестве клеток и не управляют в других, при этом обеспечивается общий низкий уровень экспрессии. Если промотор управляет экспрессией с неприемлемо высокими уровнями, части промоторной последовательности можно удалить или модифицировать для снижения уровней экспрессии.
Такие слабые конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 (документ WO 99/43838 и патент США № 6072050), коровый промотор 35S CaMV и т.п. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США № 5608149; 5608144;
5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611, включенных в данный документ посредством ссылки.
Как правило, кассета экспрессии будет содержать ген селектируемого маркера для отбора трансформированных клеток. Гены селектируемых маркеров используют для отбора трансформированных клеток или тканей. Гены маркеров включают в себя гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу II (NEO) и гигромицин-фосфотрансферазу (НРТ), а также гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глуфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Дополнительные примеры подходящих генов селектируемых маркеров включают, без ограничения, гены, кодирующие признак устойчивости к хлорамфениколу (Herrera Estrella et al. (1983), EMBO J. 2:987-992); метотрексату (Herrera Estrella et al. (1983), Nature 303:209-213; и Meyer et al. (1991), Plant Mol. Biol. 16:807-820); стрептомицину (Jones et al. (1987), Mol. Gen. Genet. 270:86-91); спектиномицину (Bretagne-Sagnard et al. (1996), Transgenic Res. 5:131-137); блеомицину (Hille et al. (1990), Plant Mol. Biol. 7:171-176); сульфонамиду (Guerineau et al. (1990), Plant Mol. Biol. 75:127-136); бромоксинилу (Stalker et al. (1988), Science 242:419423); глифосату (Shaw et al. (1986), Science 233:478-481; и патенты США № 7709702 и 7462481); фосфи-нотрицину (DeBlock et al. (1987), EMBO J. 6:2513-2518). См., в общем, Yarranton (1992), Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992), Cell 71. 63-72; Reznikoff (1992), Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) в The Operon, p. 177-220; Hu et al. (1987), Cell 48:555-566; Brown et al. (1987), Cell 49:603-612; Figge et al. (1988), Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990), Science 248:480-483; Gossen (1993), Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990), Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989), Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991), Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988), Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993), Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992), Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985), Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); и Gill et al. (1988), Nature 334:721-724. Такие раскрытия включены в данный документ посредством ссылки.
Приведенный выше перечень генов селектируемых маркеров не предназначен для ограничения. Любой ген селектируемого маркера можно применять в вариантах осуществления.
Способы согласно вариантам осуществления включают введение полипептида или полинуклеотида в растение. Как подразумевается, "введение" означает представление растению полинуклеотида или полипептида таким образом, что последовательность попадает внутрь клетки растения. Способы согласно вариантам осуществления не зависят от конкретного способа введения полинуклеотида или полипептида в растение, нужно только, чтобы полинуклеотид или полипептиды проникали внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Из уровня техники известны способы введения полинуклеотида и/или полипептидов в растения, в том числе, без ограничений, способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и способы трансформации, опосредованной вирусами.
Подразумевается, что "стабильная трансформация" означает, что нуклеотидный конструкция, вводимая в растение, интегрируется в геном растения и может быть унаследована его потомками. Подразумевается, что "временная трансформация" означает, что полинуклеотид вводится в растение и не интегрируется в геном растения, или в растение вводится полипептид.
Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольных или двудольных, на которые нацелена трансформация. Подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в растительные клетки и последующей вставки в геном растения включают микроинъекцию (Crossway et al. (1986), Biotechniques 4:320-334), электропорацию (Riggs et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), Agrobacterium-опосредованную трансформацию (патенты США № 5563055 и 5981840), прямой перенос генов (Paszkowski et al. (1984), EMBO J. 3:2717-2722) и баллистическое ускорение частиц (см., например, патенты США № 4945050; 5879918; 5886244 и 5932782; Tomes et al. (1995), в Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Spring-er-Verlag, Berlin); и McCabe et al. (1988), Biotechnology 6:923-926); а также трансформацию при помощи Led (WO 00/28058). Что касается трансформации картофеля, см., Tu et al. (1998), Plant Molecular Biology 37:829-838; и Chong et al. (2000) Transgenic Research 9:71-78. Дополнительные методики трансформации можно найти в Weissinger et al. (1988), Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987), Particulate Science and Technology 5:27-37 (лук); Christou et al. (1988), Plant Physiol. 87:671-674 (соя); McCabe et al. (1988), Bio/Technology 6:923-926 (соя); Finer and McMullen (1991), In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (соя); Singh et al. (1998), Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (соя); Datta et al. (1990), Biotechnology 8:736-740 (рис); Klein et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (маис); Klein et al. (1988), Biotechnology 6:559-563 (маис); в патентах США № 5240855; 5322783 и 5324646; Klein et al.
(1988), Plant Physiol. 91:440-444 (маис); Fromm et al. (1990), Biotechnology 8:833-839 (маис);
Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984), Nature (London) 311:763-764; в патенте США № 5736369 (зерновые); Bytebier et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985), в The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), p. 197-209 (пыльца); Kaeppler et al. (1990), Plant Cell Reports 9:415-418; и Kaeppler et al. (1992), Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (опосредованная нитевидными кристаллами трансформация); D'Halluin et al. (1992), Plant Cell 4:14951505 (электропорация); Li et al. (1993), Plant Cell Reports 12:250-255; и Christou and Ford (1995), Annals of Botany 75:407-413 (рис); Osjoda et al. (1996), Nature Biotechnology 14:745-750 (маиса с помощью Agrobacterium tumefaciens); все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
В конкретных вариантах осуществления последовательности согласно вариантам осуществления можно предоставлять растению с применением ряда способов временной трансформации. Такие способы временной трансформации включают, без ограничения, введение белка Cry токсина или его вариантов и фрагментов непосредственно в растение или введение транскрипта Cry токсина в растение. Такие способы включают, например, микроинъекцию или бомбардировку частицами. См., например, Crossway et al. (1986), Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura et al. (1986), Plant Sci. 44:53-58; Hepler et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176-2180; и Hush et al. (1994), The Journal of Cell Science 107:775-784, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. В качестве альтернативы, растение можно временно трансформировать полинуклеотидом Cry токсина с использованием методик, известных из уровня техники. Такие методики включают применение вирусной векторной системы и осаждение полинуклеотида таким способом, который исключает последующее высвобождение ДНК. Таким образом, может происходить транскрипция ДНК, связанной с частицами, но частота, с которой она высвобождается для интеграции в геном, в значительной степени снижена. Такие способы включают применение частиц, покрытых полиэтиленимином (PEI; № по кат. Sigma P3143).
Из уровня техники известны способы нацеленной вставки полинуклеотида в специфическое местоположение в геноме растения. В одном варианте осуществления вставку полинуклеотида в требуемое местоположение в геноме выполняют с использованием системы сайт-специфичной рекомбинации. См., например, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 и WO 99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Вкратце, полинуклеотид согласно вариантам осуществления может содержаться в кассете для переноса, фланкированной двумя неидентичными сайтами рекомбинации. Кассету для переноса вводят в растение, имеющее в своем геноме стабильно встроенный целевой сайт, фланкированный двумя неидентичными сайтами рекомбинации, которые соответствуют сайтам кассеты для переноса. Обеспечивают подходящую рекомбиназу, и кассета для переноса интегрируется в целевой сайт. Полинуклеотид, представляющий интерес, таким образом, интегрируется в конкретное хромосомное положение в геноме растения.
Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения в соответствии с традиционными способами. См., например, McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5:81-84. Эти растения затем можно выращивать и опылять с использованием либо такой же трансформированной линией, либо другой линии и идентифицировать полученный гибрид с конститутивной или индуцируемой экспрессией требуемой фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколения для того, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, а затем собрать семена, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипиче-ской характеристики была достигнута.
Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно обеспечить в растении при помощи контакта растения с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. Как правило, такие способы включают встраивание нуклеотидной конструкции, представляющей интерес, в вирусную молекулу ДНК или РНК. Понятно, что рекомбинантные белки согласно вариантам осуществления могут первоначально синтезироваться как часть вирусного полипротеина, который позже может процессиро-ваться путем протеолиза in vivo или in vitro с образованием необходимого пестицидного белка. Также понятно, что такой вирусный полипротеин, содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности пестицидного белка согласно вариантам осуществления, может обладать необходимой пестицидной активностью. Такие вирусные полипротеины и нуклеотидные последовательности, которые их кодируют, охвачены вариантами осуществления. Способы получения растений с нуклеотидными конструкциями и продукции кодируемых белков в растениях, которые включают вирусные молекулы ДНК или РНК, известны из уровня техники. См., например, патенты США № 5889191; 5889190; 5866785; 5589367 и 5316931; включенные в данный документ посредством ссылки.
Варианты осуществления дополнительно относятся к материалу для размножения трансформированного растения согласно вариантам осуществления, в том числе, без ограничения, семенам, клубням, клубнелуковицам, луковицам, листьям и черенкам корней и побегов.
Варианты осуществления можно применять для трансформации любых видов растений, в том числе, без ограничения, однодольных и двудольных. Примеры растений, представляющих интерес, включают, без ограничений, кукурузу (Zea mays), Brassica sp. (например, В, napus, В. rapa, B. juncea), в частности те виды Brassica, которые являются пригодными в качестве источников растительного масла, люцер
ну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicoior, Sorghum vulgare), просо (например, пеннисетум рогозовидный (Pennisetum glaucum), просо культурное (Panicum miliaceum), щетинник итальянский (Setaria italica), просо пальчатое (Eieusine coracana)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solanum tuberosum), разновидности арахиса (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), сладкий картофель (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофейное дерево (Coffea spp.), кокосовую пальму (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые деревья (Citrus spp.), шоколадное дерево (Theobroma cacao), чайный куст (Cameilia sinensis), банан (Musa spp.), авокадо (Persea americana), инжир (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), маслину (Oiea europaea), папайю (Carica papaya), кешью (Anacardium occidentaie), ма-кадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdaius), разновидности сахарной свеклы (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharum spp.), разновидности овса, ячмень, овощи, декоративные растения и хвойные растения.
Овощи включают разновидности томата (Lycopersicon esculentum), латук (например, Lactuca sativa), разновидности зеленой фасоли (Phaseolus vulgaris), разновидности лимской фасоли (Phaseolus limensis), разновидности гороха (Lathyrus spp.) и представителей рода Cucumis, таких как огурец (С. sativus), канталупа (С. cantalupensis) и дыня мускусная (С. melo). Декоративные растения включают азалию (Rhododendron spp.), гортензию (Macrophylla hydrangea), гибискус (Hibiscus rosasanensis), розы (Rosa spp.), тюльпаны (Tulipa spp.), нарциссы (Narcissus spp.), петунии (Petunia hybrida), гвоздику (Dianthus caryophyllus), пуансеттию (Euphorbia pulcherrima) и хризантему. Хвойные, которые могут быть использованы при осуществлении на практике вариантов осуществления, включают, например, виды сосны, такие как сосна ладанная (Pinus taeda), сосна Эллиота (Pinus elliotii), сосна желтая (Pinus ponderosa), скрученная широкохвойная сосна (Pinus contorta) и сосна лучистая (Pinus radiata); лжетсугу тиссолистую (Pseudotsuga menziesii); тсугу западную (Tsuga canadensis); ель ситхинскую (Picea glauca); калифорнийское мамонтово дерево (Sequoia sempervirens); истинные ели, такие как пихта белая (Abies amabilis) и пихта бальзамическая (Abies balsamea); и кедры, такие как туя (Thuja plicata) и аляскинский желтый кедр (Chamaecyparis nootkatensis). Растения согласно вариантам осуществления включают культурные растения, в том числе, без ограничения, кукурузу, люцерну, подсолнечник, Brassica spp., сою, хлопчатник, сафлор, арахис, сою, пшеницу, просо, табак, сахарный тростник и т.д.
Разновидности газонной травы включают, без ограничения, мятлик однолетний (Роа аппиа); плевел многоцветковый (Lolium multiflorum); мятлик сплюснутый (Роа compressa); овсяницу красную Чуинга (Festuca rubra); полевицу тонкую (Agrostis tenuis); полевицу болотную (Agrostis palustris); житняк пустынный (Agropyron desertorum); житняк гребенчатый (Agropyron cristatum); овсяницу длиннолистную (Festuca longifolia); мятлик луговой (Роа pratensis); ежу сборную (Dactylis glomerata); плевел многолетний (Lolium perenne); овсяницу красную (Festuca rubra); полевицу белую (Agrostis alba); мятлик обыкновенный (Роа trivialis); овсяницу овечью (Festuca ovina); костер безостый (Bromus inermis); овсяницу тростниковую (Festuca arundinacea); тимофеевку луговую (Phleum pratense); полевицу собачью (Agrostis canina); бескильницу расставленную (Puccinellia distans); пырей Смита (Agropyron smithii); свинорой пальчатый (Cynodon spp.); узкобороздник однобокий (Stenotaphrum secundatum); зойсию (Zoysia spp.); гречку заметную (Paspalum notatum); аксонопус афинский (Axonopus affinis); эремохлою змеехвостую (Eremochloa ophiuroides); кикуйю (Pennisetum clandesinum); паспалум влагалищный (Paspaium vaginatum); москитную траву (Bouteloua gracilis); бизонову траву (Buchloe dactyloids); боковой овес (Bouteloua curtipendula).
Растения, представляющие интерес, включают зерновые растения, которые дают семена, представляющие интерес, масличные растения и бобовые растения. Семена, представляющие интерес, включают семена зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, рожь, просо и т.д. Масличные растения включают хлопчатник, сою, сафлор, подсолнечник, Brassica, маис, люцерну, пальму, кокосовую пальму, лен, клещевину, маслину и т.д. Бобовые растения включают разновидности бобов и разновидности гороха. Бобы включают гуар, рожковое дерево, пажитник, сою, разновидности обыкновенной фасоли, вигну китайскую, золотистую фасоль, лимскую фасоль, стручковую фасоль, разновидности чечевицы, турецкий горох и т. д.
В определенных вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления можно пакетировать с любой комбинацией представляющих интерес последовательностей полинуклеотидов для создания растений с необходимым фенотипом. Например, полинуклео-тиды согласно вариантам осуществления можно пакетировать с любыми другими полинуклеотидами, кодирующими полипептиды с пестицидной и/или инсектицидной активностью, такими как другие токсичные белки Bt (описанные в патентах США № 5366892; 5747450; 5736514; 5723756; 5593881; и Geiser et al. (1986), Gene 48:109), пентин (описан в патенте США № 5981722) и т.п. Полученные комбинации также могут включать несколько копий любого представляющего интерес полинуклеотида. Полинуклео-тиды согласно вариантам осуществления можно также пакетировать с любым другим геном или комбинацией генов для получения растений с разнообразными комбинациями необходимых признаков, в том числе, без ограничений, с признаками, желательными для использования для питания животных, такими как гены, обуславливающие высокое содержание масла (например, патент США № 6232529); сбаланси
рованное содержание аминокислот (например, хордотионины (патенты США № 5990389; 5885801; 5885802 и 5703409); ячмень с высоким содержанием лизина (Williamson et al. (1987), Eur. J. Biochem. 165:99-106; и документ WO 98/20122) и белки с высоким содержанием метионина (Pedersen et al. (1986), J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988), Gene 71:359; и Musumura et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:123)); повышенную усвояемость (например, модифицированные запасные белки (патент США № 6858778); и гены тиоредоксинов (патент США № 7009087), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки.
Полинуклеотиды согласно вариантам осуществления также можно пакетировать с признаками, желательными для устойчивости к заболеваниям или гербицидам (например, гены детоксикации фумони-зина (патент США № 5792931); гены авирулентности или устойчивости к заболеваниям (Jones et al. (1994), Science 266:789; Martin et al. (1993), Science 262:1432; и Mindrinos et al. (1994), Cell 78:1089); мутанты по ацетолактат-синтазе (ALS), которые приводят к устойчивости к гербицидам, как, например, мутации S4 и/или Hra; устойчивости к ингибиторам глутаминсинтазы, таким как фосфинотрицин или basta (например, ген bar); и обуславливающие устойчивость к глифосату (ген EPSPS и ген GAT, которые раскрыты в патентах США № 7709702 и 7462481; и с признаками, желательными для обработки или переработки продуктов, как, например, высокое содержание масла (например, патент США № 6232529); модифицированные масла (например, гены десатуразы жирных кислот (патент США №5 952544; WO 94/11516)); модифицированные крахмалы (например, ADPG-пирофосфорилазы (AGP-аза), крахмал-синтазы (SS), крахмал-ветвящие ферменты (SBE) и крахмал-деветвящие ферменты (SDBE)); и с полимерами или биопластмассами (например, патент США № 5602321; бета-кетотиолаза, полигидроксибути-ратсинтаза и ацетоацетил-СоА-редуктаза (Schubert et al. (1988), J. Bacteriol. 170:5837-5847), с признаками, облегчающими экспрессию полигидроксиалканоатов (РНА)), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки. Также можно комбинировать полинуклеотиды согласно вариантам осуществления с полинуклеотидами, обеспечивающими агрономические признаки, такие как мужская стерильность (например, см. патент США № 5583210), прочность стебля, время цветения, или признаки, связанные с технологией трансформации, такие как регуляция клеточного цикла или целенаправленное воздействие на гены (например, документы WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления пакетированный признак может представлять собой признак или трансгенный объект, который получил разрешение контролирующих органов, в том числе, без ограничения, является трансгенным объектом из табл. 4А-4F.
MON89788
Monsanto Company
Соя с переносимостью глифосата, полученная посредством вставки гена агоА (epsps), кодирующего модифицированную 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), из Agrobacterium tumefaciens СР4.
ОТ96-15
Agriculture & Agri-Food Canada
Соя с низким содержанием линоленовой кислоты, полученная благодаря традиционному кроссбридингу для введения нового признака, обусловленного встречающимся в природе мутантом гена fan1, который отбирали в отношении низкого содержания линоленовой кислоты.
W62, W98
Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo))
Соя с переносимостью гербицида глуфосината аммония, полученная посредством вставки гена, кодирующего модифицированную фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (PAT), из почвенной бактериMStreptomyces hygroscopicus.
Таблица 4В
Пшеница Triticum aestivum
Объект
Компания
Описание
AP205CL
BASF Inc.
Отбор в отношении подвергнутой мутагенезу версии фермента ацетогидроксикислота-синтазы (АНAS), также известной как ацетолактатсинтаза (ALS) или ацетолактат-пируват-лиаза.
AP602CL
BASF Inc.
Отбор в отношении подвергнутой мутагенезу версии фермента ацетогидроксикислота-синтазы (АНAS), также известной как ацетолактатсинтаза (ALS) или ацетолактат-пируват-лиаза.
BW255-2, BW238-3
BASF Inc.
Отбор в отношении подвергнутой мутагенезу версии фермента ацетогидроксикислота-синтазы (АНAS), также известной как ацетолактатсинтаза (ALS) или ацетолактат-пируват-лиаза.
BW7
BASF Inc.
Переносимость имидазолиноновых гербицидов, индуцированная посредством химического мутагенеза гена ацетогидроксикислота-синтазы (АНAS) с применением азида натрия.
MON71800
Monsanto Company
Сорт пшеницы с переносимостью глифосата, полученный посредством вставки гена, кодирующего модифицированную 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), из почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, штамм СР4.
SWP965001
Cyanamid Crop
Protection
Отбор в отношении подвергнутой мутагенезу версии фермента ацетогидроксикислота-синтазы (АНAS), также известной как ацетолактатсинтаза (ALS) или ацетолактат-пируват-лиаза.
Teal 11А
BASF Inc.
Отбор в отношении подвергнутой мутагенезу версии фермента ацетогидроксикислота-синтазы (АНAS), также известной как ацетолактатсинтаза (ALS) или ацетолактат-пируват-лиаза.
ВТ11 х GA21
Syngenta Seeds, Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий ВТ11 (уникальный идентификатор OECD: SYN-BT011-1) и GA21 (уникальный идентификатор OECD: MON-00021-9).
ВТ11 х MIR162
Syngenta Seeds, Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий ВТ11 (уникальный идентификатор OECD: SYN-BT011-1) и MIR162 (уникальный идентификатор OECD: SYN-IR162-4). Устойчивость к огневке кукурузной и переносимость гербицида глуфосината аммония (Liberty) получают от ВТ11, которая содержит ген CrylAb из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki и ген, кодирующий фосфинотрицин-Ы-ацетилтрансферазу (PAT), из S. viridochromogenes. Устойчивость к другим чешуекрылым вредителям, в том числе Н. zea, S. frugiperda, A. ipsilon и S. albicosta, получают от MIR162, которая содержит ген vip3Aa из штамма АВ88 Bacillus thuringiensis.
ВТ11 х
MIR162X MIR604х GA21
Syngenta Seeds, Inc.
Устойчивость к жесткокрылым вредителям, в частности к вредителям кукурузным жукам (Diabrotica spp.) и к нескольким чешуекрылым вредителям кукурузы, в том числе к огневке кукурузной (ЕСВ, Ostrinia nubilalis), хлопковой совке (CEW, Helicoverpa zea), кукурузной листовой совке (FAW, Spodoptera frugiperda) и совке-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon); переносимость гербицидов, содержащих глифосат и глуфосинат-аммония.
ВТ11 х MIR604
Syngenta Seeds, Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий ВТ11 (уникальный идентификатор OECD: SYN-BT011-1) и MIR604 (уникальный идентификатор OECD: SYN-IR605-5). Устойчивость к огневке кукурузной и переносимость гербицида глуфосината аммония (Liberty) получают от ВТ11, которая содержит ген CrylAb из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki и ген, кодирующий фосфинотрицин-1М-ацетилтрансферазу (PAT), из S. viridochromogenes. Устойчивость к кукурузному жуку получают от MIR604, которая содержит ген тСгуЗА из Bacillus thuringiensis.
ВТ11 х MIR604х GA21
Syngenta Seeds, Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий ВТ11 (уникальный идентификатор OECD: SYN-BT011-1), MIR604 (уникальный идентификатор OECD: SYN-IR605-5) и GA21 (уникальный идентификатор OECD: MON-00021-9). Устойчивость к огневке кукурузной и переносимость гербицида глуфосината аммония (Liberty) получают от ВТ11, которая содержит ген CrylAb из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki и ген, кодирующий фосфинотрицин-Ы-ацетилтрансферазу (PAT), из S. viridochromogenes. Устойчивость к кукурузному жуку получают от MIR604, которая содержит ген тСгуЗА из Bacillus thuringiensis. Переносимость гербицида глифосата получают от GA21, которая содержит ген модифицированной EPSPS из маиса.
СВН-351
Aventis CropScience
Маис с устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицида глуфосината аммония, разработанный посредством вставки генов, кодирующих белок СгуЭС из Bacillus thuhngiensis subsp tolworthi и фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (PAT) из Streptomyces hygroscopicus.
DAS-06275-8
DOW
AgroSciences LLC
Маис с устойчивостью к чешуекрылым насекомым и переносимостью гербицида глуфосината аммония, полученный вставкой гена CrylF из Bacillus thuringiensis var aizawai и фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (PAT) из Streptomyces hygroscopicus.
DAS-59122-7
DOW
AgroSciences LLC и Pioneer Hi-В red International Inc.
Маис с устойчивостью к кукурузному жуку, полученный посредством вставки генов Сгу34АЫ и Сгу35АЫ из штамма PS149B1 Bacillus thuringiensis. Ген, кодирующий PAT, из Streptomyces viridochromogenes вводили в качестве селектируемого маркера.
DAS-59122-7X NK603
DOW
AgroSciences LLC и Pioneer Hi-В red International Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий DAS-59122-7 (уникальный идентификатор OECD: DAS-59122-7) с NK603 (уникальный идентификатор OECD: MON-ООбОЗ-б). Устойчивость к кукурузному жуку получают от DAS-59122-7, которая содержит гены Сгу34АЬ 1 и СгуЗБАЫ из штамма PS149B1 Bacillus thuringiensis. Переносимость гербицида глифосата получают от NK603.
DAS-59122-7 x TC1507X
NK603
DOW
AgroSciences LLC и Pioneer Hi-Bred International Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий DAS-59122-7 (уникальный идентификатор OECD: DAS-59122-7) и ТС1507 (уникальный идентификатор OECD: DAS-01507-1) с NK603 (уникальный идентификатор OECD: MON-00603-6). Устойчивость к кукурузному жуку получают от DAS-59122-7, которая содержит гены Cry34АЫ и СгуЗБАЫ из штамма PS149B1 Bacillus thuringiensis. Устойчивость к чешуекрылым и переносимость гербицида глуфосината аммония получают от ТС1507. Переносимость гербицида глифосата получают от NK603.
DBT418
Dekalb Genetics Corporation
Маис с устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицида глуфосината аммония, разработанный посредством вставки генов, кодирующих белок Сгу1 АС из Bacillus thuringiensis subsp kurstaki и фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (PAT) из Streptomyces hygroscopicus.
DK404SR
BASF Inc.
Сомаклональные варианты с модифицированной ацетил-СоА-карбоксилазой (АССазой) отбирали при помощи культивирования зародыша на среде, обогащенной сетоксидимом.
Трансгенный объект 3272
Syngenta Seeds, Inc.
Линия маиса, экспрессирующая ген термостабильной альфа-амилазы ату797Е для применения в способе получения этанола с применением сухого помола. Ген фосфоманноза-изомеразы от E.coli использовали в качестве селектируемого маркера.
Трансгенный объект 98140
Pioneer Hi-Bred International Inc.
Трансгенный объект маиса, экспрессирующий переносимость гербицида глифосата, с помощью экспрессии модифицированной бактериальной глифосат-N-ацетилтрансферазы и ALS-ингибирующих гербицидов, с помощью экспрессии модифицированной формы фермента ацетолактатсинтазы маиса.
EXP1910IT
Syngenta Seeds, Inc. (в прошлом Zeneca Seeds)
Переносимость имидазолинонового гербицида, имазетапира, индуцированная химическим мутагенезом фермента ацетолактатсинтазы (ALS) с применением этилметансульфоната (EMS).
GA21
Syngenta Seeds, Inc. (в прошлом Zeneca Seeds)
Введение посредством бомбардировки частицами модифицированной 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPS), фермента, вовлеченного в биохимический метаболический путь шикимата, для выработки ароматических аминокислот.
GA21 х MON810
Monsanto Company
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий GA21 (идентификатор OECD: MON-00021-9) и MON810 (идентификатор OECD: MON-00810-6).
Pioneer Hi-Bred International Inc.
Переносимость имидазолинонового гербицида, имазетапира, получали посредством in vitro отбора сомаклональных вариантов.
LY038
Monsanto Company
Измененный аминокислотный состав, специфически повышенные уровни лизина благодаря введению гена cordapA, полученного от Corynebacterium glutamicum, кодирующего фермент дигидродипиколинат-синтазу (cDHDPS).
MIR162
Syngenta Seeds, Inc.
Трансгенный объект маиса с устойчивостью к насекомым, экспрессирующий белок Vip3A из Bacillus thuringiensis и селектируемый маркер PMI из Escherichia coli.
MIR604
Syngenta Seeds, Inc.
Маис с устойчивостью к кукурузному жуку, полученный путем трансформации модифицированным геном СгуЗА. Ген фосфоманноза-изомеразы от E.coli использовали в качестве селектируемого маркера.
MIR604x GA21
Syngenta Seeds, Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий MIR604 (уникальный идентификатор OECD: SYN-IR605-5) и GA21 (уникальный идентификатор OECD: MON-00021-9). Устойчивость к кукурузному жуку получают от MIR604, которая содержит ген тСгуЗА из Bacillus thuringiensis. Переносимость гербицида глифосата получают от GA21.
MON80100
Monsanto Company
Маис с устойчивостью к насекомым, полученный посредством вставки гена CrylAb из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Генетическая модификация придает устойчивость к нападению огневки кукурузной (ЕСВ).
MON802
Monsanto Company
Маис с устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицида глифосата, полученный посредством вставки генов, кодирующих белок CrylAb из Bacillus thuringiensis и 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (EPSPS) из штамма СР4 A. tumefaciens.
MON809
Pioneer Hi-Bred International Inc.
Устойчивость к огневке кукурузной (Ostrinia nubilalis) при помощи введения синтетического гена CrylAb. Устойчивость к глифосату с помощью введения бактериальной версии растительного фермента, 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS).
MON810
Monsanto Company
Маис с устойчивостью к насекомым, полученный посредством вставки усеченной формы гена CrylAb из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. Генетическая модификация придает устойчивость к нападению огневки кукурузной (ЕСВ).
MON810X LY038
Monsanto Company
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и увеличенным содержанием лизина, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий MON810 (идентификатор OECD: MON-00810-6) и LY038 (идентификатор OECD: REN-00038-3).
MON810X MON88017
Monsanto Company
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью глифосата, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий MON810 (идентификатор OECD: MON-00810-6) и MON88017 (идентификатор OECD: MON-88017-3). Устойчивость к огневке кукурузной (ЕСВ) получена благодаря усеченной форме гена CrylAb из Bacillus thuhngiensis subsp. kurstaki HD-1, присутствующего в MON810. Устойчивость к кукурузному жуку получают благодаря гену СгуЗВЫ из штамма EG4691 Bacillus thuhngiensis subspecies kumamotoensis, присутствующему в MON88017. Переносимость глифосата получают благодаря гену, кодирующему 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (EPSPS), из штамма СР4 Agrobacterium tumefaciens, присутствующему в MON88017.
MON832
Monsanto Company
Введение посредством бомбардировки частицами глифосатоксидазы (GOX) и модифицированной 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS), фермента, вовлеченного в биохимический метаболический путь шикимата, для выработки ароматических аминокислот.
MON863
Monsanto Company
Маис с устойчивостью к кукурузному жуку, полученный посредством вставки гена СгуЗВЫ из Bacillus thuringiensis subsp, kumamotoensis.
MON863 х MON810
Monsanto Company
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий MON863 (идентификатор OECD: MON-00863-5) и MON810 (идентификатор OECD: MON-00810-6)
MON863 х MON810X
NK603
Monsanto Company
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный в результате традиционного кроссбридинга гибрида с пакетированными генами MON-00863-5 х MON-00810-6 и NK603 (идентификатор OECD:
MON863 х NK603
Monsanto Company
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий MON863 (идентификатор OECD:MON-00863-5) и NK603 (идентификатор OECD: MON-00603-6).
MON87460
Monsanto Company
MON 87460 разрабатывали для обеспечения сниженной потери урожая в условиях ограниченного количества воды относительно традиционного маиса. Эффективность по отношению к MON 87460 получают при помощи экспрессии вставленного белка холодового шока В (CspB) Bacillus subtilis.
MON88017
Monsanto Company
Маис с устойчивостью к кукурузному жуку, полученный посредством вставки гена СгуЗВЫ из штамма EG4691 из Bacillus thuringiensis подвида kumamotoensis. Переносимость глифосата получают посредством вставки гена, кодирующего 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (EPSPS), из штамма СР4 Agrobacterium tumefaciens.
MON89034
Monsanto Company
Трансгенный объект маиса, экспрессирующий два различных инсектицидных белка из Bacillus thuringiensis, обеспечивающий устойчивость к ряду чешуекрылых вредителей.
MON89034 MON88017
Monsanto Company
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью глифосата, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий MON89034 (идентификатор OECD: MON-89034-3) и MON88017 (идентификатор OECD:MON-88017-3). Устойчивость к чешуекрылым насекомым получают благодаря двум генам Cry, присутствующим в MON89043. Устойчивость к кукурузному жуку получают благодаря одному гену Cry, и переносимость глифосата получают благодаря гену, кодирующему 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (EPSPS) из Agrobacterium tumefaciens, присутствующему в MON88017.
MON89034 x NK603
Monsanto Company
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий MON89034 (идентификатор OECD: MON-89034-3) с NK603 (уникальный идентификатор OECD: MON-ООбОЗ-б). Устойчивость к чешуекрылым насекомым получают благодаря двум генам Cry. присутствующим в MON89043. Переносимость гербицида глифосата получают от NK603.
MON89034 хТС1507х MON88017
х DAS-59122-7
Monsanto Company и Mycogen Seeds c/o Dow AgroSciences LLC
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий: MON89034, ТС1507, MON88017 и DAS-59122. Устойчивость к наземным и подземным насекомым-вредителям и переносимость гербицидов глифосата и глуфосината аммония.
MS3
Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo))
Мужская стерильность, вызванная экспрессией гена рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens; устойчивость к РРТ присутствовала благодаря РРТ-ацетилтрансферазе (PAT).
MS6
Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo))
Мужская стерильность, вызванная экспрессией гена рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens; устойчивость к РРТ присутствовала благодаря РРТ-ацетилтрансферазе (PAT).
NK603
Monsanto Company
Введение посредством бомбардировки частицами модифицированной 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPS), фермента, вовлеченного в биохимический метаболический путь шикимата, для выработки ароматических аминокислот.
NK603 х MON810
Monsanto Company
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий NK603 (идентификатор OECD: MON-ООбОЗ-б) и MON810 (идентификатор OECD: MON-00810-6).
NK603 х Т25
Monsanto Company
Гибрид маиса с пакетированной переносимостью гербицида глуфосината аммония и глифосата, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий NK603 (идентификатор OECD: MON-00603-6) и Т25 (идентификатор OECD: ACS-ZM003-2).
Т14, Т25
Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo))
Маис с переносимостью гербицида глуфосината, полученный посредством вставки гена, кодирующего фосфинотрицин-М-ацетилтрансферазу (PAT) из аэробной актиномицеты Streptomyces viridochromogenes.
Т25х MON810
Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo))
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий Т25 (идентификатор OECD: ACS-ZM003-2) и MON810 (идентификатор OECD:MON-00810-6).
ТС1507
Mycogen (c/o Dow AgroSciences); Pioneer (c/o DuPont)
Маис с устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицида глуфосината аммония, полученный посредством вставки гена CrylF из Bacillus thuringiensis var. aizawai и гена, кодирующего фосфинотрицин-Ы-ацетилтрансферазу, из Streptomyces viridochromogenes.
ТС1507Х DAS-59122-7
DOW AgroSciences LLC и Pioneer Hi-Bred International Inc.
Маис с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный при помощи традиционного кроссбридинга родительских линий ТС1507 (уникальный идентификатор OECD: DAS-01507-1) с DAS-59122-7 (уникальный идентификатор OECD: DAS-59122-7). Устойчивость к чешуекрылым насекомым получают от ТС1507 вследствие присутствия гена CrylF из Bacillus thuringiensis var. aizawai. Устойчивость к кукурузному жуку получают от DAS-59122-7, которая содержит гены Сгу34АЫ и СгуЗБАЫ из штамма PS149B1 Bacillus thuringiensis. Переносимость гербицида глуфосината аммония получают от ТС1507 благодаря гену, кодирующему фосфинотрицин-М-ацетилтрансферазу из Streptomyces viridochromogenes.
ТС1507Х
NK603
DOW AgroSciences LLC
Гибрид кукурузы с пакетированной устойчивостью к насекомым и переносимостью гербицидов, полученный в результате традиционного кроссбридинга родительских линий 1507 (идентификатор OECD: DAS-01507-1) и NK603 (идентификатор OECD: MON-ООбОЗ-б).
Другие трансгенные объекты, разрешенные контролирующими органами, хорошо известны специалисту в данной области техники и их можно найти на сайте Центра оценки риска для окружающей среды (cera-gmc.org/?action=grn_crop_database, доступ к которому можно получить с применением префикса www) и на сайте Международной службы по приобретению агробиотехнологических приложений (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, доступ к которому можно получить с применением префикса www).
Эти пакетированные комбинации можно создавать любым способом, в том числе, без ограничений, перекрестным скрещиванием растений с помощью любой традиционной методики, или методики TOP-CROSS(r), или генетической трансформации. Если признаки пакетированы с помощью генетической трансформации растений, то представляющие интерес последовательности полинуклеотидов можно комбинировать в любое время и в любом порядке. Например, трансгенное растение, содержащее один или несколько требуемых признаков, можно применять в качестве мишени для введения дополнительных признаков с помощью последовательной трансформации. Признаки можно вводить одновременно в протоколе котрансформации с представляющими интерес полинуклеотидами, представленными любой комбинацией кассет трансформации. Например, если будут вводиться две последовательности, то эти две последовательности могут содержаться в отдельных кассетах для трансформации (транс) или содержаться в одной кассете для трансформации (цис). Экспрессия этих последовательностей может управляться одним и тем же промотором или различными промоторами. В определенных случаях может потребоваться введение кассеты для трансформации, которая будет подавлять экспрессию представляющего интерес полинуклеотида. Ее можно комбинировать с любой комбинацией других кассет супрессии или кассет сверхэкспрессии для получения требуемой комбинации признаков в растении. Кроме того, считается, что полинуклеотидные последовательности можно пакетировать в требуемом местоположении в геноме с применением системы для сайт-специфичной рекомбинации. См., например, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 и WO 99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
Композиции согласно вариантам осуществления находят разнообразные применения в защите растений, семян и растительных продуктов. Например, композиции можно использовать в способе, который предполагает помещение эффективного количества пестицидной композиции в среду обитания вредителя с помощью процедуры, выбранной из группы, состоящей из опрыскивания, опыливания, разбрасывания или нанесения покрытия на семена.
Перед продажей материала для размножения растений (плода, клубня, луковицы, клубнелуковиц, зерен, семени), в особенности семени, в качестве коммерческого продукта, его в обычном порядке обрабатывают с использованием защитного покрытия, содержащего гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды или смеси некоторых из этих препаратов, при необходимости, вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению вспомогательными веществами, обычно применяемыми в области получения составов для обеспечения защиты от повреждения, вызванного бактериальными, грибковыми вредителями или животными-вредителями. Для того чтобы обработать семя, защитное покрытие можно применять по отношению к семенам либо путем пропитки клубней или зерен жидким составом, либо путем нанесения на них покрытия из комбинированного влажного или сухого состава. Кроме того, в особых случаях возможны другие способы применения по отношению к растениям, например, обработка, направленная на почки или плоды.
Семя растения согласно вариантам осуществления, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидный белок согласно вариантам осуществления, можно обрабатывать защитным покрытием для семян, содержащим соединение для обработки семян, такое как, например, каптан, кар-боксин, тирам, металаксил, пиримифос-метил и другие, которые обычно применяются в обработке семян. В одном варианте осуществления защитное покрытие для семян, содержащих пестицидную композицию согласно вариантам осуществления, используют отдельно или в комбинации с одним из защитных покрытий для семян, обычно применяемых в обработке семян.
Считается, что гены, кодирующие пестицидные белки, можно использовать для трансформации организмов, патогенных для насекомых. Такие организмы включают бакуловирусы, грибы, простейших, бактерий и нематод.
Ген, кодирующий пестицидный белок согласно вариантам осуществления, можно вводить с помощью подходящего вектора в микроорганизм-хозяин, а указанного хозяина применять по отношению к окружающей среде, или растениям, или животным. Термин "введенный" в контексте вставки нуклеиновой кислоты в клетку означает "трансфекцию", или "трансформацию", или "трансдукцию" и включает ссылку на встраивание нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может встраиваться в геном клетки (например, хромосому, плазмиду, пластидную или митохондриальную ДНК), превращаться в автономный репликон или временно экспрессироваться (например, трансфицированная мРНК).
Могут быть выбраны микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, заселяют "фитосферу" (фил-лоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одной или нескольких сельскохозяйственных культур, представляющих интерес. Эти микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они могли успешно конкурировать в конкретной среде с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать стабильное поддержание и экспрессию гена, экспрессирующего пестицидный белок, и, желательно, обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разрушения и инактивации в окружающей среде.
Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes, грибы, в частности дрожжи, например, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий фитосферы, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli и Azotobacter vinelandii, а также виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Доступен ряд способов для введения гена, экспрессирующего пестицидный белок, в микроорганизм-хозяин в условиях, которые создают возможность для стабильного сохранения и экспрессии данного гена. Например, можно конструировать кассеты экспрессии, которые содержат нуклеотидные конструкции, представляющие интерес, функционально связанные с сигналами регуляции транскрипции и трансляции для экспрессии нуклеотидных конструкций, и нуклеотидную последовательность, гомологичную последовательности в организме-хозяине, при помощи которой будет происходить внедрение, и/или систему репликации, функционирующую в хозяине, при помощи которой будет происходить внедрение или стабильное поддержание.
Сигналы регуляции транскрипции и трансляции включают в себя без исключения промоторы, старт-сайты инициации транскрипции, операторы, активаторы, энхансеры, другие регуляторные элементы, сайты связывания рибосом, кодон инициации, сигналы терминации и т. п. См., например, патенты США № 5039523 и 4853331; ЕР 0480762 А2; Sambrook; Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Davis et al., eds. (1980), Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), и источники, цитируемые в этих документах.
Подходящие клетки-хозяева, где клетки, содержащие пестицидный белок, будут обрабатывать для продления активности пестицидных белков в клетке в случае, когда обработанную клетку вносят в среду обитания вредителя-мишени (вредителей-мишеней), могут включать либо прокариотов, либо эукариотов, при этом они обычно ограничены теми клетками, которые не вырабатывают веществ, токсичных для высших организмов, таких как млекопитающие. Тем не менее, организмы, которые вырабатывают вещества, токсичные для высших организмов, можно применять в том случае, когда токсин является нестабильным или уровень применения является весьма низким, чтобы избежать любой возможности токсичности в отношении млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес будут представлять прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы. Иллюстративные прокариоты, как грамотрицатель-ные, так и грамположительные, включают Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella и Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, такие как Rhizobium; Spirillaceae, такие как Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, такие как Pseudomonas и Acetobacter, Azotobacteraceae и Nitrobacteraceae. Среди эука-риот представлены грибы, такие как Phycomycetes и Ascomycetes, которые включают дрожжи, такие как Saccharomyces и Schizosaccharomyces; и дрожжи из отдела Basidiomycetes, такие как Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces и т.п.
Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина с целью выработки пестицидного белка, включают простоту введения гена пестицидного белка в хозяина, доступность систем экспрессии, эффективность экспрессии, стабильность белка в хозяине и наличие сопутствующих генетических возможностей. Характеристики, представляющие интерес для применения в виде пести-цидной микрокапсулы, включают защитные свойства для пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включений; сродство к листьям; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для поглощения вредителями; простота уничтожения и усвоение без повреждения токсина и т. п. Другие соображения включают легкость составления и обращения, экономичность, стабильность при хранении и т.п.
Организмы-хозяева, представляющие особый интерес, включают дрожжи, такие как Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (такие как S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., организмы филлоплана, такие как Pseudomonas spp. (такие как Р. aeruginosa, P. fluorescens), Erwinia spp. и Flavobacte-rium spp., а также другие такие организмы, в том числе Bt, E. coli, Bacillus subtilis и т.п.
Гены, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления, можно вводить в микроорганизмы, которые размножаются на растениях (эпифиты) для доставки пестицидных белков к потенциальным вредителям-мишеням. Эпифиты, например, могут представлять собой грамположительные или грамотрицательные бактерии.
Бактерии, колонизирующие корни, например, можно выделять из растений, представляющих интерес, при помощи способов, известных из уровня техники. А именно, штамм Bacillus cereus, который колонизирует корни, можно выделять из корней растения (см., например, Handelsman et al. (1991), Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Гены, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления, можно вводить в Bacillus cereus, колонизирующую корни, при помощи стандартных способов, известных из уровня техники.
Гены, кодирующие пестицидные белки, можно вводить, например, в Bacillus, колонизирующую корни, посредством электротрансформации. В частности, гены, кодирующие пестицидные белки, можно клонировать в челночный вектор, например, рНТ3101 (Lerecius et al. (1989), FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218. Челночный вектор pHT3101, содержащий кодирующую последовательность конкретного гена пестицидного белка, можно, например, трансформировать в Bacillus, колонизирующую корни, посредством электропорации (Lerecius et al. (1989), FEMS Microbioi. Letts. 60:211-218).
Системы экспрессии можно разрабатывать таким образом, чтобы пестицидные белки секретирова-лись за пределы цитоплазмы грамотрицательных бактерий, таких как, например, E. coli. Преимущества секреции пестицидных белков являются следующими: (1) возможность избежать потенциальных цито-токсических эффектов экспрессируемого белка и (2) улучшение эффективности очистки пестицидного белка, в том числе, без ограничения, повышение эффективности выделения и очистки белка в расчете на объем клеточного бульона и снижение времени и/или затрат на извлечение и очистку в пересчете на единицу белка.
Пестицидные белки можно создать таким образом, чтобы они секретировались в E. coli, например, путем слияния подходящего сигнального пептида Е. coli с аминоконцом пестицидного белка. Сигнальные пептиды, распознаваемые Е. coli, можно найти в белках, которые, как уже известно, секретируются Е. coli, например, белок OmpA (Ghrayeb et al. (1984), EMBO J, 3:2437-2442). OmpA представляет собой
главный белок внешней мембраны Е. coli, и, таким образом, полагают, что его сигнальный пептид является эффективным в процессе транслокации. Кроме того, сигнальный пептид OmpA не нужно модифицировать перед процессингом, что может иметь место в случае других сигнальных пептидов, например сигнального пептида липопротеинов (Duffaud, et al., (1987), Meth. Enzymol. 153:492).
Пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно ферментировать в бактерии-хозяине, а полученные бактерии обрабатывать и использовать в виде микробных распыляемых растворов тем же способом, что и штаммы Bt, которые применялись в виде инсектицидных распыляемых растворов. В случае пестицидного белка(ов), которые секретируются из Bacillus, сигнал секреции удаляют или подвергают мутации с применением методик, известных из уровня техники. Такие мутации и/или деле-ции предотвращают секрецию пестицидного белка(ов) в ростовую среду во время процесса ферментации. Пестицидные белки остаются в пределах клетки, и клетки затем обрабатывают для получения инкапсулированных пестицидных белков. Для этой цели можно применять любой подходящий микроорганизм. Pseudomonas применяли для экспрессии Bt токсинов в виде инкапсулированных белков, а полученные клетки подвергали обработке и распылению в качестве инсектицида (Gaertner et al. (1993), в Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).
В качестве альтернативы пестицидные белки вырабатываются при введении гетерологичного гена в клеточный хозяин. Экспрессия гетерологичного гена приводит, прямо или опосредованно, к выработке и сохранению пестицида внутри клетки. Эти клетки затем обрабатывают при условиях, которые продлевают активность токсина, вырабатываемого в клетке, когда осуществляют применение клетки по отношению к среде целевого вредителя(вредителей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти инкапсулированные естественным образом пестицидные белки можно затем составлять в соответствии с традиционными методиками для применения по отношению к среде пребывания вредителя-мишени, например почва, вода и листва растений. См., например, документ ЕР 0192319 и источники, цитируемые в этом документе.
В вариантах осуществления трансформированный микроорганизм (который включает целые организмы, клетки, спору(ы), пестицидный белок(и), пестицидный компонент(ы), оказывающий воздействие на вредителя компонент(ы), мутант(ы), живые или мертвые клетки и клеточные компоненты, в том числе смеси живых и мертвых клеток и клеточных компонентов и в том числе разрушенные клетки и клеточные компоненты) или выделенный пестицидный белок можно составить с приемлемым носителем в пес-тицидную композицию(и), которая представляет собой, например, суспензию, раствор, эмульсию, распыляемый порошок, диспергируемые гранулы или пеллеты, смачиваемый порошок и эмульгируемый концентрат, аэрозоль или распыляемый раствор, пропитанные гранулы, вспомогательное вещество, наносимую в качестве покрытия пасту, коллоид, а также инкапсулированные формы, например, в полимерных веществах. Такие составленные композиции можно получать с помощью таких общепринятых способов, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрование, центрифугирование, седиментация или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид.
Такие композиции, раскрытые выше, можно получать с помощью добавления поверхностно-активного средства, инертного носителя, консерванта, увлажнителя, стимулятора поедания, аттрактанта, средства для инкапсуляции, связующего, эмульгатора, красителя, защитного средства от УФ, буфера, средства, повышающего текучесть, или удобрения, донора питательных микроэлементов или других препаратов, которые влияют на рост растения. Один или несколько агрохимикатов, в том числе, без ограничения, гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды, акарици-ды, регуляторы роста растений, вспомогательные средства для сбора урожая и удобрения, можно комбинировать с носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, традиционно используемыми в области составления, или другими компонентами для облегчения обращения с продуктом и его применения по отношению к конкретным целевым вредителям. Подходящие носители и вспомогательные средства могут быть твердыми или жидкими и соответствуют веществам, обычно используемым в технологии составления, например природным или регенерированным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, смачивающим средствам, веществам, придающим клейкость, связующим или удобрениям. Активные ингредиенты согласно вариантам осуществления обычно применяют в виде композиций и их можно применять по отношению к возделываемой площади, растению или семени, подлежащим обработке. Например, композиции согласно вариантам осуществления можно применять по отношению к зерну при подготовке к хранению или во время хранения в зерновом бункере или элеваторе и т.д. Композиции можно применять одновременно или последовательно с другими соединениями. Способы применения активного ингредиента согласно вариантам осуществления или агрохимической композиции согласно вариантам осуществления, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, вырабатываемых штаммами бактерий согласно вариантам осуществления, включают, без ограничения, внекорневое применение, нанесение покрытия на семена и применение по отношению к почве. Количество применений и норма применения зависят от интенсивности поражения соответствующим вредителем.
Подходящие поверхностно-активные средства включают, без ограничений, анионные соединения, такие как карбоксилат, например, металла; карбоксилат длинноцепочечной жирной кислоты;
N-ацилсаркозинат; сложные моно- или диэфиры фосфорной кислоты с этоксилатами жирных спиртов или соли таких сложных эфиров; сульфаты жирных спиртов, такие как додецилсульфат натрия, октаде-цилсульфат натрия или цетилсульфат натрия; сульфаты этоксилированных жирных спиртов; этоксили-рованные алкилфенолсульфаты; лигнинсульфонаты; нефтяные сульфонаты; алкиларилсульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты или низшие алкилнафталинсульфонаты, например бутилнафталинсульфо-нат; соли сульфированных нафталин-формальдегидных конденсатов; соли сульфированных фенол-формальдегидных конденсатов; более сложные сульфонаты, такие как сульфонаты амидов, например сульфированный продукт конденсации олеиновой кислоты и N-метилтаурина; или диалкилсульфосукци-наты, например сульфонат натрия или диоктилсукцинат. Неионогенные средства включают продукты конденсации сложных эфиров жирных кислот, жирных спиртов, амидов жирных кислот или жирных ал-кил- или алкенилзамещенных фенолов с этиленоксидом, сложные эфиры жирной кислоты и эфиров многоатомных спиртов, например сложные эфиры сорбита и жирных кислот, продукты конденсации таких сложных эфиров с этиленоксидом, например сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, ацетиленовые гликоли, такие как 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4,7-диол, или этоксилированные ацетиленовые гликоли. Примеры катионного поверхностно-активного средства включают алифатический моно-, ди- или полиамин, такой как ацетат, нафтенат или олеат; или кислородсодержащий амин, такой как аминоксид полиоксиэтиленалкиламина; амины с амидными связями, полученные путем конденсации карбоновой кислоты с ди- или полиамином; или соль четвертичного аммония.
Примеры инертных материалов включают, без ограничений, неорганические минеральные вещества, такие как каолин, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты, или растительные материалы, такие как пробка, измельченные в порошок стержни кукурузных початков, шелуха арахиса, шелуха риса и скорлупа грецких орехов.
Композиции согласно вариантам осуществления могут находиться в форме, подходящей для непосредственного применения, или в виде концентрата первичной композиции, для которого требуется разведение подходящим количеством воды или другого разбавителя перед применением. Концентрация пестицида будет варьировать в зависимости от природы конкретного состава, в частности от того, является ли он концентратом или должен применяться непосредственно. Композиция содержит 1-98% твердого или жидкого инертного носителя и 0-50% или 0,1-50% поверхностно-активного вещества. Эти композиции будут вводить в обозначенной норме для коммерческого продукта, например от приблизительно 0,01 до 5,0 фунтов/а при применении в сухой форме и от приблизительно 0,01 до 10 пинт/а при применении в жидкой форме.
В дополнительном варианте осуществления композиции, а также трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно обрабатывать перед составлением для продления пестицидной активности при применении по отношению к среде обитания вредителя-мишени при условии, что предварительная обработка не оказывает вредное воздействие на пестицидную активность. Такие обработки можно осуществлять с помощью химических и/или физических средств при условии, что обработка не влияет отрицательно на свойства композиции(композиций). Примеры химических реактивов включают, без ограничения, галогенирующие средства; альдегиды, такие как формальдегид и глутаровый альдегид; противоинфекционные средства, такие как зефиран хлорид; спирты, такие как изопропанол и этанол; и фиксирующие смеси для гистологических препаратов, такие как фиксирующая смесь Буэна и фиксирующая смесь Хелли (см., например, Humason (1967), Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).
В других вариантах осуществления преимущество будет иметь обработка полипептидов Cry токсинов протеазой, например трипсином, для активации белка перед применением композиции с пестицид-ным белком согласно вариантам осуществления по отношению к среде обитания вредителя-мишени. Способы активации протоксина сериновой протеазой хорошо известны из уровня техники. См., например, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454; и Carroll and Ellar (1989), Biochem. J. 261:99-105, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. Например, подходящий протокол активации включает без ограничения объединение полипептида, который нужно активировать, например очищенного нового Cry полипептида (например, с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12), и трипсина в весовом соотношении белок/трипсин 1/100 в 20 нМ NaHCO3, рН 8, и расщепление образца при 36°C в течение 3 ч.
Композиции (в том числе трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки согласно вариантам осуществления) можно применять по отношению к среде обитания насекомого-вредителя, например, при помощи опрыскивания, мелкодисперсного распыления, опыливания, разбрасывания, нанесения покрытия или поливания, введения в почву или на нее, введения в поливную воду, при помощи обработки семян или общего применения или опыливания во время, когда вредитель начал появляться, или перед появлением вредителей в качестве меры защиты. Например, пестицидный белок и/или трансформированные микроорганизмы согласно вариантам осуществления можно смешивать с зерном для защиты зерна во время хранения. В целом, важно обеспечивать хороший контроль вредителей на ранних
стадиях роста растений, поскольку как раз в это время растение может повреждаться наиболее сильно. В целях удобства композиции согласно вариантам осуществления могут содержать другой инсектицид, если это считается необходимым. В одном варианте осуществления композицию применяют непосредственно по отношению к почве, во время высаживания, в гранулярной форме композиции носителя и мертвых клеток штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма согласно вариантам осуществления. Другим вариантом осуществления является гранулярная форма композиции, содержащей агрохими-кат, такой как, например, гербицид, инсектицид, удобрение, инертный носитель и мертвые клетки штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма согласно вариантам осуществления.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что не все соединения в равной степени эффективны против всех вредителей. Соединения согласно вариантам осуществления проявляют активность против насекомых-вредителей, которые могут включать экономически важных агрономических, лесных, тепличных вредителей, вредителей питомников, декоративных растений, пищи и тканей, здоровья людей и животных, домашней и коммерческой инфраструктуры, домашнего хозяйства и подвергающихся хранению продуктов. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д., в частности, Coleoptera и Lepidoptera.
Насекомые из отряда Lepidoptera включают, без ограничения, совок, подгрызающих совок, пядениц и гелиотин семейства Noctuidae: Agrotis ipsilon Hufnagel (совка-ипсилон); A. orthogonia Morrison (совка прямоугольная); A. segetum Denis & Schiffermuiler (совка озимая); A. subterranea Fabricius (совка зернистая); Alabama argillacea Hubner (совка хлопковая американская); Anticarsia gemmatalis Hubner (гусеница вельветовых бобов); Athetis mindara Barnes and McDunnough (шершавая совка); Earias insulana Boisduval (совка хлопковая египетская); E. vittella Fabricius (совка пятнистая); Egira (Xylomyges) curialis Grote (цитрусовая совка); Euxoa messoria Harris (чернобокая гусеница совки); Helicoverpa armigera Hubner (совка щетинконогая резедовая); Н. zea Boddie (совка кукурузная или хлопковая совка); Heliothis virescens Fab-ricius (табачная листовертка); Hypena scabra Fabricius (совка клеверная); Mamestra configurata Walker (совка Берта); М. brassicae Linnaeus (совка капустная); Melanchra picta Harris (совка); Pseudaletia unipuncta Haworth (совка луговая); Pseudoplusia includens Walker (соевая совка); Richia albicosta Smith (личинка западной бобовой совки); Spodoptera frugiperda JE Smith (совка травяная); S. exigua Hubner (совка малая); S. litura Fabricius (табачная совка, гусеница, пожирающая соцветия); Trichoplusia ni Hubner (совка ни); огневки, чехлоноски, бабочки, строящие паутинные гнезда, конусные бабочки и вредители, скелетирую-щие листья, из семейств Pyralidae и Crambidae, такие как Achroia grisella Fabricius (малая восковая моль); Amyelois transitella Walker (гусеница, повреждающая рубчики цитрусовых); Anagasta kuehniella Zeller (огневка мельничная); Cadra cautelia Walker (огневка сухофруктовая); Chilo partellus Swinhoe (огневка кукурузная стеблевая); С. suppressalis Walker (желтая рисовая огневка); С. terrenellus Pagenstecher (огневка тростниковая стеблевая); Corcyra cephalonica Stainton (огневка рисовая); Crambus caliginosellus Clemens (огневка кукурузная); С. teterrellus Zincken (огневка мятликовая); Cnaphalocrocis medinalis Guenee (листовертка рисовая); Desmia funeralis Hubner (виноградная листовертка); Diaphania hyalinata Linnaeus (дынная огневка); D. nitidalis Stoll (огневка огурцов-пикули); Diatraea grandiosella Dyar (огневка кукурузная юго-западная), D. saccharalis Fabricius (тростниковая огневка); Eiasmopalpus lignosellus Zeller (мальм кукурузный мотылек); Eoreuma loftini Dyar (мексиканская рисовая огневка); Ephestia elutella Hubner (огневка табачная (шоколадная)); Galleria mellonelia Linnaeus (большая восковая моль); Hedylepta accepta Butler (тростниковая листовертка); Herpetogramma licarsisalis Walker (луговой мотылек); Homoeosoma electellum Hulst (огневка-травянка); Loxostege sticticalis Linnaeus (луговой мотылек); Maruca testuialis Geyer (огневка акациевая); Orthaga thyrisalis Walker (чайная моль); Ostrinia nubilalis Hubner (кукурузный мотылек); Plodia interpunctelia Hubner (моль индийская мучная); Scirpophaga incertulas Walker (огневка рисовая стеблевая); Udea rubigalis Guenee (огневка ржаво-коричневая); и листовертки, листовертки-почкоеды, плодожорки и гусеницы-вредители плодов в семействе Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (западная черноголовая листовертка); A. variana Fernald (восточная черноголовая листовертка); Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (листовертка сетчатая); Archips spp., в том числе А. argyrospila Walker (листовертка плодовых деревьев) и A. rosana Linnaeus (европейская листовертка); Argyrotaenia spp.; Bonagota salubricola Meyrick (листовертка бразильская яблочная); Choristoneura spp.; Cochylis hospes Walsingham (полосатая подсолнечниковая моль); Cydia latiferreana Walsingham (лещинная плодожорка); С. pomonella Linnaeus (яблонная плодожорка); Endopiza viteana Clemens (листовертка виноградная); Eupoecilia ambiguella Hubner (листовертка гроздевая); Grapholita molesta Busck (плодожорка восточная персиковая); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller (листовертка европейская виноградная); Platynota flavedana Clemens (листовертка изменчивая); P. stultana Walsingham (листовертка всеядная); Spilonoia ocellana Denis & Schiffermuller (листовертка почковая) и Suleima helianthana Riley (листовертка подсолнечниковая).
Другие выбранные сельскохозяйственные вредители из отряда Lepidoptera включают, без ограничения, Alsophila pometaria Harris (осенний плодовый червь); Anarsia lineatella Zeller (моль фруктовая полосатая); Anisota senatoria J.E. Smith (сатурния оранжевая дубовая); Antheraea pernyi Guerin-Meneville (китайский дубовый шелкопряд); Bombyx топ Linnaeus (тутовый шелкопряд); Bucculatrix thurberiella Busck
(кривоусая хлопковая моль); Colias eurytheme Boisduval (люцерновая желтушка); Datana integerrima Grote & Robinson (хохлатка ореховая); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (сибирский шелкопряд), Ennomos subsignaria Hubner (пяденица вязовая); Erannis tiliaria Harris (пяденица липовая); Erechthias flavistriata Walsingham (листовертка почковая тростниковая); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (шелкопряд золотистый); Harrisina americana Guerin-Meneville (пироморфида американская); Heiiothis subflexa Guenee; Hemileuca oliviae Cockrell (гусеница бабочки-сатурнии); Hyphantria cunea Drury (американская белая бабочка); Keiferia lycopersicella Walsingham (томатная моль); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (пяденица гемлоковая восточная); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (пяденица гемлоковая западная); Leucoma salicis Linnaeus (волнянка ивовая); Lymantria dispar Linnaeus (непарный шелкопряд); Malacosoma spp.; Manduca quinquemaculata Haworth (бражник пятиточечный, томатный бражник); М. sexta Haworth (томатный бражник, табачный бражник); Operophtera brumata Linnaeus (пяденица зимняя); Orgyia spp.; Paleacrita vernata Peck (пяденица весенняя); Papilio cresphontes Cramer (парусник кресфонтес, "апельсиновая собака"); Phryganidia californica Packard (коконопряд кольчатый калифорнийский); Phyllocnistis citrella Stain-ton (цитрусовая мушка-минер); Phyllonorycter blancardella Fabricius (моль-пестрянка плодовая нижнесторонняя); Pieris brassicae Linnaeus (белянка капустная большая); Р. rapae Linnaeus (белянка капустная малая); P. napi Linnaeus (белянка брюквенная); Piatyptilia carduidactyla Riley (пальцекрылка артишоковая); Plutella xylosteila Linnaeus (моль капустная); Pectinophora gossypiella Saunders (розовый коробочный червь); Pontia protodice Boisduval & Leconte (клетчатая белянка); Sabulodes aegrotata Guenee (всеядная пяденица); Schizura concinna J.E. Smith (хохлатка); Sitotroga cerealella Olivier (моль ячменная ангумуаз-ская); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (походный шелкопряд сосновый); Tineola bisselliella Hummel (моль комнатная); Tuta absoluta Meyrick (томатная моль) и Yponomeuta padella Linnaeus (горностаевая моль плодовая).
Представляют интерес личинки и имаго из отряда Coleoptera, в том числе долгоносики из семейств Anihribidae, Bruchidae и Curculionidae, в том числе без ограничения: Anthonomus grandis Boheman (долгоносик хлопковый); Cylindrocopturus adspersus LeConte (долгоносик подсолнечниковый стеблевой); Diaprepes abbreviatus Linnaeus (Diaprepes root weevil); Hypera punctata Fabricius (долгоносик точечный); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (долгоносик рисовый водяной); Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus (долгоносик западно-индийский тростниковый); М. hemipterus sericeus Olivier (долгоносик тростниковый); Sitophilus granarius Linnaeus (долгоносик амбарный); S. oryzae Linnaeus (долгоносик рисовый); Smicronyx fulvus LeConte (красный долгоносик подсолнечниковый); S. sordidus LeConte (серый долгоносик подсолнечниковый); Sphenophorus maidis Chittenden (долгоносик маисовый); Rhabdoscelus obscurus Boisduval (долгоносик новогвинейский тростниковый); земляные блошки, блошки, корневые черви, листоеды, картофельные жуки и листовые минеры из семейства Chrysomelidae, в том числе без ограничения: Chaetocnema ectypa Horn (блошка стеблевая хлебная); С. pulicaria Melsheimer (земляная кукурузная блошка); Coiaspis brunnea Fabricius (листоед виноградный); Diabrotica barberi Smith & Lawrence (северный кукурузный жук); D. undecimpunctata howardi Barber (блошка 11-точечная Говарда); D. virgifera virgifera LeConte (западный кукурузный жук); Leptinotarsa decemlineata Say (колорадский жук); Oulema melanopus Linnaeus (пьявица красногрудая); Phyllotreta cruciferae Goeze (блошка крестоцветная); Zygogramma exclamationis Fabricius (подсолнечниковый листоед); жуки из семейства Coccinellidae, в том числе без ограничения, Epilachna varivestis Mulsant (мексиканская фасолевая коровка); хрущи и другие жуки из семейства Scarabaeidae, в том числе без ограничения: Antitrogus parvulus Britton (личинка жука, поедающая сахарный тростник); Cyclocephala borealis Arrow (дупляк северный, хрущ); С. immaculata Olivier (дупляк южный, хрущ); Dermolepida albohirtum Waterhouse (сероспинный жук, поедающий сахарный тростник); Euetheola humilis rugiceps LeConte (тростниковый жук); Lepidiota frenchi Blackburn (личинка Lepidiota, поедающая сахарный тростник); Tomarus gibbosus De Geer (жук морковный); Т. subtropicus Blatchley (личинка жука, поедающая сахарный тростник); Phyllophaga crinita Burmeister (хрущ); P. latifrons LeConte (июньский хрущ); Popillia japonica Newman (хрущик японский); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (нехрущ майский); кожееды из семейства Dermestidae; проволочники из семейства Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp., в том числе М. communis Gyllenhal (проволочник); Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; короеды из семейства Scolytidae и жуки из семейства Tenebrionidae; жуки из семейства Cerambycidae, такие как, но без ограничения, Migdolus fryanus Westwood (усач); и жуки из семейства Buprestidae, в том числе, но без ограничения, Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger (минирующая листья узкозлатка).
Представляют интерес имаго и незрелые особи отряда Diptera, в том числе минирующие мушки Agromyza parvicornis Loew (кукурузная минирующая мушка); галлицы, в том числе без ограничения: Contarinia sorghicola Coquillett (галлица сорговая); Mayetiola destructor Say (гессенская муха); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (подсолнечниковая галлица); Sitodiplosis mosellana Gehin (оранжевая зерновая галлица); плодовые мушки (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (плодовые мушки); личинки, в том числе, без ограничения, Delia spp., в том числе Delia platura Meigen (муха ростковая); D. coarctata Fallen (муха озимая); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (малые комнатные мухи); Meromyza americana Fitch (американская меромиза); Musca domestica Linnaeus (комнатная муха); Stomoxys calcitrans Linnaeus (жигалка осенняя)); мухи полевые, жигалки, мухи мясные, Chrysomya spp.; Phormia spp.; и дру
гие мухи-вредители надсемейства Muscoidea, слепни Tabanus spp.; носоглоточные оводы Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; бычьи оводы Hypoderma spp.; пестряки Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (рунец овечий); и другие Brachycera, комары Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; мошки Prosimulium spp.; Simulium spp.; мокрецы, москиты, сциариды и другие Nematocera.
В качестве насекомых, представляющих интерес, включены насекомые из отряда Hemiptera, такие как, но без ограничения, следующие семейства: Adelgidae, Aleyrodidae, Aphididae, Asterolecaniidae, Cercopidae, Cicadellidae, Cicadidae, Cixiidae, Coccidae, Coreidae, Dactylopiidae, Delphacidae, Diaspididae, Eriococcidae, Flatidae, Fulgoridae, Issidae, Lygaeidae, Margarodidae, Membracidae, Miridae, Ortheziidae, Pentatomidae, Phoenicococcidae, Phylloxeridae, Pseudococcidae, Psyllidae, Pyrrhocoridae и Tingidae.
Важные с точки зрения сельского хозяйства представители отряда Hemiptera включают без ограничения: Acrostemum hilare Say (клоп-щитник зеленый); Acyrthisiphon pisum Harris (тля гороховая); Adelges spp. (хермесы); Adelphocoris rapidus Say (клоп люцерновый); Anasa tristis De Geer (клоп-ромбовик печальный); Aphis craccivora Koch (тля люцерновая); A, fabae Scopoli (тля свекловичная); А. gossypii Glover (тля хлопковая, тля бахчевая); A. maidiradicis Forbes (тля кукурузная корневая); A. pomi De Geer (тля яблонная); A. spiraecola Patch (тля зеленая цитрусовая); Aulacaspis tegalensis Zehntner (щитовка тростниковая); Aulacorthum solani Kaltenbach (тля картофельная обыкновенная); Bemisia tabaci Gennadius (бело-крылка табачная, белокрылка хлопковая); В. argentifolii Bellows & Perring (белокрылка магнолиевая); Blissus leucopterus leucopterus Say (клоп-черепашка пшеничный североамериканский); Blostomatidae spp.; Brevicoryne brassicae Linnaeus (тля капустная); Cacopsylla pyricola Foerster (медяница грушевая); Calocoris norvegicus Gmelin (клопик картофельный); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (тля земляничная американская); Cimicidae spp.; Coreidae spp.; Corythuca gossypii Fabricius (клоп хлопковый); Cyrtopeitis modesta Distant (клоп томатный); С. notatus Distant (слепняк); Deois flavopicta Stal (слюнявица); Dialeurodes citri Ashmead (белокрылка цитрусовая); Diaphnocoris chlohonis Say (клоп-вредитель гледичии); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (тля ячменная); Duplachionaspis divergens Green (щитовка); Dysaphis piantaginea Paaserini (тля яблонно-подорожниковая); Dysdercus sutureilus Herrich-Schaffer (красноклоп хлопковый); Dysmicoccus boninsis Kuwana (серый тростниковый мучнистый червец); Empoasca fabae Harris (цикадка картофельная); Eriosoma lanigerum Hausmann (тля кровяная); Erythroneoura spp. (цикадки виноградные); Eumetopina flavipes Muir (цикадка островная тростниковая); Eurygaster spp.; Euschistus servus Say (щит-ник коричневый); Е. varioiarius Palisot de Beauvois (клоп однопятнистый); Graptostethus spp. (комплекс клопов-наземников); и Hyalopterus pruni Geoffroy (тля мучнистая сливовая); Icerya purchasi Maskell (чер-вец желобчатый австралийский); Labopidicoia allii Knight (жук-вредитель растений лука); Laodelphax stri-atellus Fallen (темная цикадка); Leptogiossus corculus Say (сосновый семенной клоп); Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer (клоп тростниковый); Lipaphis erysimi Kaltenbach (тля горчичная листовая); Lygocoris pabulinus Linnaeus (зеленый слепняк); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (клоп луговой); L. Hesperus Knight (клоп луговой западный); L. pratensis Linnaeus (клоп травяной); L. rugulipennis Poppius (клоп полевой); Macrosiphum euphorbiae Thomas (тля картофельная большая); Macrosteles quadriiineatus Forbes (ци-кадка астровая); Magicicada septendecim Linnaeus (цикада семнадцатилетняя); Mahanarva fimbrioiata Stal (слюнявица тростниковая); Melanaphis sacchari Zehntner (тля тростниковая); Melanaspis glomerata Green (червец черный); Metopolophium dirhodum Walker (тля розанно-злаковая); Myzus persicae Sulzer (тля оранжерейная, тля персиковая зеленая); Nasonovia ribisnigri Mosley (тля цикориево-смородиновая); Ne-photettix cinticeps Uhler (цикадка зеленая); N. nigropictus Stal (цикадка рисовая); Nezara viridula Linnaeus (зеленый овощной клоп); Nilaparvata lugens Stal (бурая цикадка); Nysius ericae Schilling (низиус вересковый); Nysius raphanus Howard (низиус); Oebalus pugnax Fabricius (клоп-щитник рисовый); Oncopeltus fas-ciatus Dallas (ластовневый клоп); Orthops campestris Linnaeus; Pemphigus spp. (тли корневые и тли галловые); Peregrinus maidis Ashmead (цикадка кукурузная); Perkinsiella saccharicida Kirkaldy (дельфацида тростниковая); Phylloxera devastatrix Pergande (филлоксера гикори); Planococcus citri Risso (мучнистый чер-вец цитрусовый); Plesiocoris rugicollis Fallen (клоп яблонный); Poecilocapsus lineatus Fabricius (клоп четырёхполосный травяной); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (хлопковый слепняк); Pseudococcus spp. (другие мучнистые червецы); Pulvinaria elongata Newstead (червец пушицевый); Pyrilla perpusilla Walker (цикадка тростниковая); Pyrrhocoridae spp.; Quadraspidiotus pemiciosus Comstock (щитовка калифорнийская); Redu-viidae spp.; Rhopalosiphum maidis Fitch (тля сорговая); R. padi Linnaeus (тля черемуховая обыкновенная); Saccharicoccus sacchari Cockerell (тростниковый мучнистый червец); Schizaphis graminum Rondani (тля злаковая обыкновенная); Sipha flava Forbes (тля сахарного тростника желтая); Sitobion avenae Fabricius (тля злаковая); Sogatella furcifera Horvath (цикадка белоспинная); Sogatodes oryzicola Muir (дельфацида рисовая); Spanagonicus albofasciatus Reuter (слепняк белокрапчатый); Therioaphis maculata Buckton (пятнистая люцерновая тля); Tinidae spp.; Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (тля померанцевая); и T. citricida Kirkaldy (тля цитрусовая); Trialeurodes abutiloneus (белокрылка полосатокрылая) и Т. vaporari-orum Westwood (белокрылка тепличная); Trioza diospyri Ashmead (листоблошка хурмовая); и Typhlocyba pomaria McAtee (цикадка яблонная).
Также включены имаго и личинки из отряда Acari (клещи), такие как Aceria tosichella Keifer (галловый клещ пшеничный); Panonychus ulmi Koch (красный плодовый клещ); Petrobia latens Muller (петробия многоядная); Steneotarsonemus bancrofti Michael (клещ, повреждающий стебель сахарного тростника);
клещики паутинные и клещики красные семейства Tetranychidae, Oligonychus grypus Baker & Pritchard, О. indicus Hirst (клещ листовой тростниковый), О. pratensis Banks (травяной клещ Бэнкса), О. stickneyi McGregor (клещ паутинный тростниковый); Tetranychus urticae Koch (клещ паутинный двупятнистый); Т. mcdanieli McGregor (клещик МакДэниела); Т. cinnabarinus Boisduval (красный паутинный клещик); Т. Turkestani Ugarov & Nikolski (туркестанский паутинный клещик); плоские клещи семейства Tenuipal-pidae, Brevipalpus lewisi McGregor (оранжевый клещ); ржавчинные и почковые клещи семейства Eriophy-idae и другие клещи, питающиеся листьями, и клещи, важные для здоровья человека и животных, т.е. пылевые клещи семейства Epidermoptidae, железницы семейства Demodicidae, зерновые клещи семейства Glycyphagidae, иксодовые клещи отряда Ixodidae. Ixodes scapularis Say (черноногий клещ); I. holocyclus Neumann (австралийский паралитический клещ); Dermacentor variabilis Say (клещ иксодовый собачий); Amblyomma americanum Linnaeus (иксодовый клещ Amblyomma) и конские и чесоточные клещи семейств Psoroptidae, Pyemotidae и Sarcoptidae.
Представляющими интерес насекомыми-вредителями из отряда Thysanura являются, например, Lepisma saccharina Linnaeus (чешуйница); Thermobia domestica Packard (термобия).
Дополнительные охваченные вредители-артроподы включают пауков из отряда Araneae, таких как Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (бурый паук-отшельник) и Latrodectus mactans Fabricius (черная вдова) и многоножек из отряда Scutigeromorpha, таких как Scutigera coleoptrata Linnaeus (обыкновенная мухоловка). Кроме того, интерес представляют насекомые-вредители из отряда Isoptera, в том числе из семейства Termitidae, такие как, но без ограничения, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren и Pseudacan-thotermes militaris Hagen (тростниковый термит). Интерес также представляют насекомые из отряда Thy-sanoptera, в том числе, без ограничения, трипсы, такие как Stenchaetothrips minutus van Deventer (тростниковый трипе).
Пестицидную активность композиций согласно вариантам осуществления можно тестировать на насекомых-вредителях на ранних стадиях развития, например, в виде личинок или других незрелых форм. Насекомых можно разводить в полной темноте при температуре от приблизительно 20 до приблизительно 30°C и при относительной влажности от приблизительно 30 до приблизительно 70%. Биологические анализы можно осуществлять, как описано в Czapla and Lang (1990), J. Econ. Entomol. 83(6):2480-2485. Способы разведения личинок насекомых и проведения биологических анализов хорошо известны специалисту в данной области техники.
Специалисту в данной области техники известен широкий спектр методик биологических анализов. Общие процедуры включают добавление экспериментального соединения или организма к источнику пищи в закрытом контейнере. Пестицидную активность можно измерить, но без ограничения, по изменениям смертности, потери веса, привлечения, отпугивания, а также другим изменениям поведения и физическим изменениям после поедания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Биологические анализы, описанные в данном документе можно использовать с любым питающимся насекомым-вредителем на стадии личинки или имаго.
Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения.
Экспериментальная часть
Пример 1. Идентификация гена и экспрессия в Е. coli.
Гены, кодирующие инсектицидные белки с SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 16, получали в результате скрининга изолятов Bacillus thuringiensis из штаммов, обозначенных DP2179, DP1886, JAPH0844, UZ70, DP371, DP597 и DP371 соответственно. На фиг. 1-4 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4. В табл. 5 представлена процентная идентичность для аминокислотных
последовательностей с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14. В табл. 6 представлены штамм и идентификаторы последовательности для последовательностей полинуклеотидов и полипептидных последовательностей инсектицидных полипептидов.
Кодирующие последовательности SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15 для инсектицидных полипептидов с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16 соответственно синтезировали и клонировали в вектор рЕТ28а (Novagen(r)) и трансформировали в клетки Е. coli BL21 (Invitrogen). Культуры в укрупненном масштабе 1,0 л выращивали при 600 нм до O.D.~0,8, а затем культуры индуцировали 1 мМ изопропил-(3^-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) и обеспечивали возможность их роста в течение 16 ч при 16°C. Клеточные осадки лизировали в 50 мл 500 мМ NaCl/20 мМ Tris/5 мМ имидазола/рН 7,9 с использованием 0,02% лизоцима (вес./об.) и 0,1% Tween-20 и добавляли 1 таблетку полного ингибитора протеаз (Roche). После лизиса растворы подвергали ультразвуковой обработке и лизат центрифугировали при 25000 об/мин в течение 30 мин. Су-пернатант, содержащий фракцию растворимых белков, фильтровали через 0,45 мкм вакуумный фильтр, а затем добавляли 1 мл взвеси Talon (Clontech) и после этого инкубировали для связывания на вращающем устройстве при 100 об/мин в течение 1 ч. Лизат затем добавляли в колонку и связанный белок выделяли и промывали 20 мл 50 мМ NaCl/ 20 мМ Tris/ 5 мМ имидазола/ рН 7,9, а затем элюировали 1,5 мл 50 мМ NaCl/ 20 мМ Tris/500 мМ имидазола/рН 7,9. Очищенный белок затем подвергали диализу в 50 мМ буфере на основе карбоната натрия с рН 10. Очищенный белок передавали для исследования инсектицидной активности в наборе in vitro анализов с кормлением Lepidoptera.
Пример 2. Анализы на Lepidoptera с частично очищенными белками.
Биологические скрининг-анализы инсектицидной активности проводили для оценки эффектов инсектицидных белков в отношении ряда видов Lepidoptera: кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), хлопковой совки (Helicoverpa zea), совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), соевой совки (Pseudoplusia includens) и гусеницы вельветовых бобов (Anticarsia gemmatalis).
Анализы с кормлением Lepidoptera проводили на искусственном рационе, содержащем очищенный белок, в системе с использованием 96-луночного планшета. Очищенный белок (25 мкл) затем добавляли в искусственный рацион. Две из пяти новорожденных личинок помещали в каждую лунку для питания ad libitum в течение 5 дней. Результаты выражали как положительные реакции в отношении личинок, такие как остановка развития и/или смерть. Результаты выражали как отрицательные, если личинки были подобны отрицательному контролю, который питается рационом, в который вносили только вышеуказанный буфер. Первичный скрининг с помощью биологического анализа осуществляли для каждого очищенного белка при одной концентрации с использованием кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), хлопковой совки (Helicoverpa zea), совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), соевой совки (Pseudoplusia includens) и гусеницы вельветовых бобов (Anticarsia gemmatalis). Анализы с использованием насекомых оценивали следующим образом: 3 = 100% смертность; 2 = сильное замедление роста; 1 = замедление роста и 0 = отсутствие активности.
Результаты первичного анализа инсектицидной активности для инсектицидных полипептидов с SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 4 представлены в табл. 7-9 соответственно.
Таблица 7
Местное/ка пельное применение с
использова нием
планшета
4 наблюдения на насекомое
Концентрация (мкг/см2)
ЕСВ
FAW
BCW
CEW
SBL
VBC
Первичный скрининг
Для инсектицидных полипептидов с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 после первичного биологического анализа ряд концентраций соответствующих образцов очищенного белка также исследовали в отношении набора насекомых. Результаты анализа инсектицидной активности для инсектицидных полипептидов с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 представлены в табл. 10-13 соответственно.
Для инсектицидного полипептида с SEQ ID NO: 2 рассчитывали ряд концентраций белка с SEQ ID NO: 2 и концентраций для 50% смертности (LC50) или подавления роста 50% особей (IC50). Результаты LC50/IC50 для инсектицидного полипептида с SEQ ID NO: 2 представлены в табл. 14.
Таблица 14
Насеком ое
LC/IC50
ррт
ниже 95%СL
выше 95%CL
SBL
LC50
9,119
4,380
20,13
IC50
7,181
2,302
22,40
VBC
LC50
60,68
35,72
111,7
IC50
7,621
4,561
10,61
ЕСВ
LC50
4,453
3,118
6,157
IC50
1,921
1,389
2,527
CEW
LC50
> 316 (смертность 29,2%)
IC50
73,49
47,20
119,2
FAW
LC50
> 316 (смертность 8,3%)
IC50
> 316 (37,5% соотв.)
Результаты анализа инсектицидной активности для инсектицидного полипептида с SEQ ID NO: 2 представлены в табл. 15.
Таблица 15
Разведение
мкг/см2
112,5
56,3
28,1
14,1
3,5
1,8
0,9
0,5
0,2
0,1
ЕСВ
CEW
FAW
BCW
Пример 3. Перекрестная устойчивость в отношении инсектицидных полипептидов у устойчивой к Cry1 А или Оу2А линии совки ни (CBL).
Для определения того, имели ли устойчивые к Cry белкам насекомые перекрестную устойчивость к инсектицидному полипептиду с SEQ ID NO: 2, личинок совки ни (Trichoplusia ni), чувствительных или устойчивых к Сгу1 А или Cry2А, обрабатывали инсектицидным полипептидом с SEQ ID NO: 2.
В Корнелльском университете (кафедра энтомологии, Женева, Нью-Йорк) разрабатывали и поддерживали линии Т. ni, а также проводили анализы. Линии Т. ni, которые отличаются (количественно)
своей чувствительностью к инсектицидным белкам CrylAc и Cry2Ab: одна линия является чувствительной (SS) как к Cryl Ас, так и к Cry2Ab, тогда как две другие линии имеют пониженную чувствительность к CrylAc или Cry2Ab. Обе устойчивые к Bt линии происходили из устойчивой к Bt популяции T. ni, собранной из коммерческого тепличного хозяйства в Британской Колумбии, Канада. Устойчивую к CrylAc (GLEN-Cry1Ac-BCS8) и устойчивую к Cry2Ab линию, изогенные по отношению к лабораторной SS линии, получали путем возвратного скрещивания с лабораторной SS линией 6 или более раз (с последующими процедурами отбора по устойчивости). Развившаяся в теплице устойчивость к Cry1Ac (RR> 900) у линии Т. ni (GLEN-Cry1Ac-BCS4) характеризовалась высоким уровнем перекрестной устойчивости к CrylAb (RR> 800), однако она не имела перекрестной устойчивости к CrylBb, CrylC, CrylD, CrylE, Cry1J, Cry2Ab или Cry9C (RR-2.1-6:7) при низком уровне перекрестной устойчивости к Cry1F (RR=7,8-кратный). Механизм устойчивости к Оу1Ас был обнаружен в виде изменения, воздействующего на связывание Cry1Ab и Оу1Ас с сайтом связывания для СГУ^Ь/С^АС в средней кишке (Wang et al. 2007).
Чувствительность личинок у чувствительных и устойчивых к Bt линий Т. ni в отношении инсектицидных белков определяли с использованием способа биологического анализа с нанесением проб на рацион в виде покрытия (Kain, Zhao et ai. 2004. J. Econ. Entomol. 97:2073-2978; Wang, Zhao et al. 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:1199-1207). Вкратце, для биологических анализов новорожденных особей аликвоту 0,2 мл образца при определенной концентрации наносили на поверхность (-7 см2) 5 мл искусственного рациона в 30 мл чашке для разведения насекомых. Каждый биологический анализ предусматривал от восьми до десяти концентраций образца, помимо отрицательного контроля, и пять повторностей для каждой концентрации. Растворы белков получали путем смешивания белков с соответствующими количествами буферных растворов. Десять новорожденных личинок ( <24 ч после вылупления) помещали в каждую чашку для анализа. Смертность и подавление роста личинок (определяемое как подавление, если личинки не переходят во вторую личиночную стадию за 4 дня) при помощи каждого образца оценивали через 4 дня кормления на обработанном рационе при 27°C с 50% RH (относительная влажность) и фотопериодом 16:8 ч (свет: темнота). Концентрации для 50% смертности (LC50) или подавления роста 50% особей (IC50) рассчитывали на основании пробит-анализа, и статистические анализы осуществляли с использованием программного обеспечения для статистического анализа Polo. Результаты перекрестной устойчивости для инсектицидного полипептида с SEQ ID NO: 2 представлены в табл. 16.
SS = чувствительная линия;
R = устойчивая линия;
RR = показатель устойчивости.
Пример 4. Временная экспрессия и биологический анализ с использованием насекомого на временно трансформированных тканях листьев.
Полинуклеотиды с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 15 клонировали в векторы для временной экспрессии под управлением убиквитинового промотора маиса (Christensen and Quail, (1996), Transgenic Research 5:213-218) и дуплицированного варианта промотора из вируса мозаики мирабилис (DMMV PRO; Dey and Maiti, (1999), Plant Mol. Biol., 40:771-82). Из уровня техники хорошо известен агроинфильтрационный способ введения клеточной суспензии Agrobacterium в растительные клетки интактных тканей для того, чтобы можно было измерить или изучить воспроизводимые инфицирование и дальнейшую экспрессию трансгена, полученного из растения (Kapila, et. al., (1997), Plant Science 122:101-108). Вкратце, проводили инфильтрацию агробактериями молодых проростков маиса с использованием нормализованных культур бактериальных клеток тестируемых и контрольных штаммов. Листовые диски получали из каждого проростка и заражали WCRW (Diabrotica virgifera) вместе с соответствующими контролями. Степень потребления зеленых тканей листа оценивали через 2 дня после заражения.
Через 2 дня питания количество тканей листа, потребленных личинками ЕСВ, CEW, FAW, BCW SBL и VBC оценивали с использованием всего 24 дисков на обработку. По сравнению с отрицательным контролем (DsRed) ткани, накапливающие инсектицидный полипептид c SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 16, были повреждены значительно меньше на всех 24 дисках.
Пример 5. Опосредованная Agrobacterium трансформация маиса и регенерация трансгенных растений.
Для опосредованной Agrobacterium трансформации маиса при помощи полинуклеотидной последовательности токсина (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15) можно применять способ Zhao (патент США № 5981840 и РРТ публикация патентной заявки WO 98/32326; содержание которых включено в данный документ посредством ссылки). Вкратце, незрелые зародыши выделяли из маиса и зародыши
приводили в контакт с суспензией Agrobacterium в условиях, при которых бактерии были способны переносить нуклеотидную последовательность токсина (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15) по меньшей мере в одну клетку по меньшей мере одного из незрелых зародышей (стадия 1: стадия инфицирования). На этой стадии незрелые зародыши можно погружать в суспензию Agrobacterium для инициации инокуляции. Зародыши в течение определенного времени культивировали совместно с Agrobacterium (стадия 2: стадия совместного культивирования). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде после стадии инфицирования. После периода совместного культивирования предполагалась необязательная стадия "покоя". На этой стадии покоя зародыши инкубировали в присутствии по меньшей мере одного антибиотика, который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium, без добавления средства для отбора к растительным трансформантам (стадия 3: стадия покоя). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде с антибиотиком, но без средства для отбора, для исключения Agrobacterium и в течение фазы покоя для инфицированных клеток. Затем инокулированные зародыши культивировали на среде, содержащей средство для отбора, и выделяли растущий трансформированный каллюс (стадия 4: стадия отбора). Незрелые зародыши культивировали на твердой среде со средством для отбора, что приводило к выборочному росту трансформированных клеток. Затем каллюс регенерировали с получением растений (стадия 5: стадия регенерации), и каллюсы, выращенные на селективной среде, культивировали на твердой среде для регенерации растений.
Пример 6. Трансформация зародышей сои.
Зародыши сои подвергали бомбардировке плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность токсина с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15, функционально связанную с подходящим промотором, как указано ниже. Для индукции соматических зародышей семядоли длиной 3-5 мм, вырезанные из поверхностно-стерилизованных, незрелых семян соответствующего сорта сои, культивировали на свету или в темноте при 26°C на соответствующей агаровой среде в течение 6-10 недель. Соматические зародыши, дающие вторичные зародыши, затем вырезали и помещали в подходящую жидкую среду. После повторного отбора в отношении кластеров соматических зародышей, деление клеток в которых уже привело к зародышам на стадии глобулы, суспензии поддерживали, как описано ниже.
Соевые зародышевые суспензионные культуры можно поддерживать в 35 мл жидкой среды на ротационном шейкере при 150 об/мин при 26°C с флюоресцентными источниками света согласно схеме день/ночь 16:8 ч. Культуры пересевали каждые две недели путем инокуляции примерно 35 мг ткани в 35 мл жидкой среды
Соевые зародышевые суспензионные культуры затем можно трансформировать при помощи способа бомбардировки генной пушкой (Klein, et al., (1987), Nature (London) 327:70-73, патент США № 4945050). Для этих трансформаций можно применять устройство Biolistic PDS1000/HE от Du Pont (гелиевая модификация).
Селектируемый маркерный ген, который можно применять для облегчения трансформации сои, без ограничения предусматривал следующее: промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты (Odell, et al., (1985), Nature 313:810-812), ген гигромицин-фосфотрансферазы из плазмиды pJR225 (из Е. coli; Gritz, et al., (1983), Gene 25:179-188) и 3'-участок из гена нопалин-синтазы из Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность токсина (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15), функционально связанную с подходящим промотором, можно выделять в виде рестрикционного фрагмента. Этот фрагмент затем можно вставить в уникальный рестрикци-онный сайт вектора, несущего маркерный ген.
К 50 мкл суспензии 1 мкм золотых частиц при концентрации 60 мг/мл добавляли (по порядку): 5 мкл ДНК (1 мкг/мкл), 20 мкл спермидина (0,1 М) и 50 мкл CaCl2 (2,5 М). Препарат частиц затем перемешивали в течение 3 мин, центрифугировали с использованием микроцентрифуги в течение 10 с и удаляли супернатант. Покрытые ДНК частицы затем однократно промывали в 400 мкл 70% этанола и ресус-пендировали в 40 мкл безводного этанола. Суспензию ДНК/частицы можно обрабатывать ультразвуком три раза в течение 1 с. 5 мкл золотых частиц, покрытых ДНК, затем загружали на каждый диск-макроноситель.
Примерно 300-400 мг двухнедельной суспензионной культуры помещали в пустую 60x15 мм чашку Петри и остаточную жидкость удаляли из ткани при помощи пипетки. Для каждого трансформационного эксперимента обычно подвергали бомбардировке приблизительно 5-10 плашек с тканью. Устанавливали давление разрыва мембраны 1100 psi и в камере создавали вакуум с понижением давления до 28 дюймов ртутного столба. Ткань располагали на расстоянии приблизительно 3,5 дюйма от задерживающего экрана и бомбардировали три раза. После бомбардировки ткань можно разделить пополам, поместить обратно в жидкость и культивировать, как описано выше.
Через 5-7 дней после бомбардировки жидкую среду можно заменить свежей средой, а через 11-12 дней после бомбардировки заменить свежей средой, содержащей 50 мг/мл гигромицина. Эту селективную среду можно обновлять еженедельно. Через 7-8 недель после бомбардировки можно наблюдать зе
леную трансформированную ткань, растущую из нетрансформированных, некрозных зародышевых кластеров. Выделенную зеленую ткань отбирали и инокулировали в отдельные колбы для получения новых, клонально размноженных, трансформированных зародышевых суспензионных культур. Каждую новую линию можно рассматривать как независимый объект трансформации. Эти суспензии затем можно пересевать и поддерживать в виде кластеров незрелых зародышей или регенерировать в целые растения путем созревания и проращивания отдельных соматических зародышей.
Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, ориентированы на уровень специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации, патенты и заявки на патент включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент специально и отдельно была включена посредством ссылки.
Хотя в целях ясности понимания вышеприведенное изобретение было довольно подробно описано посредством иллюстрации и примеров, очевидно, что на практике можно осуществлять определенные изменения и модификации в пределах объема вариантов осуществления.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Пионер ХайБред Интернешенл Абад, Андрэ Вольф, Томас Чжоу, Лань
<120> ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АКТИВНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 5277PCT <150> 61/863761 <151> 2013-08-08
<150> 61/863763
<151> 2013-08-08
<160> 16
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 2220
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 1
atgacttcaa
tcgaatcatt
atagccgagg
aacattgctg
ttttatagtt
ctagaacatg
cttgctcgat
tggctagaaa
ttagagcttg
ttattgatgg
ctttttggta
gcggaaaaaa
aatttgagag
acgctaggag
ataaatacca
gcaccttcag
atagaggctg
ttcagcgtat
cttgaatcgc
tctattaatc
gcagggataa
tggagaaatc
gtggggacac
aattatgaat
ataggaaaaa ccgcacaaat ggaataatat gtagaatact ttattgtcgg ttgaacaact tacaaggttt accgtgatga attttcttaa tatatgctca gtgaatttgg cgagagaata ggacaaatgc tattagatct gtgctcaatt gatttgcaag ccgttattag taagtcgatg gaacaataag ctgtaacatt atatacttct ccctgaattc aactatttga cttacagtca tgagaatgaa ggatctatca caatccactt aggcgtatta tgaattatgg tgtaagacaa aggagcttcc tgcaagaacg tgcgatgccg agctgcaaat gcttacatcg ttctgattat tgaaagttgg agtggcacta aacaagagaa tacgaattgg gcctccgcat gagtaatact ggggtcatta acagttcaca aactactcct tcttagaggt ttcagaaact tagattatct attataaatg ccagatgctc gttagcgcat ggcgtaccgt cctagcggca caaataacag tttagagcct agaagtgttc cttttcgcaa ttacatctat caggaaattc tgcgcaagat ttgcgatata ttcccaagct atttatacag tttaataata ctacttgatt caatatatga agtacctcga tctcgtgacg gtgaatggag agccttctct gaattaccac aatataagac ctttatcgat gtattgagga caacagtcca ttgctggaca gagatccgtg aaaatgctag atcaacaatc tttataccca taaacaatca tattattgag aacgttatta ggtataatac atcaattccg atgacacgcg atccaattgg atgcaccatc ttccagaaca attactgggt cacacggaaa tttatagaac taccttgggc atactatagg cagaaacaac taatatcagg tccagctgta ttctttgtgt aacgggtatt actagctagt ggaaatcttt gaatacggca acttgaagac atatatagcc acaggttcca agatgcctct tgagcgccaa gggtttaaat tagagactta tatttatcca gagaacaaat gttttctgcc gcttacaatt gggacataga taccaatact agaatcatat tagatttaat gtatactgga agaacgacca aaacactttg
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840
900 960
1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440
agagcaccag aatattatta tcaggaccag caaaatagag gttcgtgtac aacatttttt gattttggtt gttagaaatt actgcaacct tttactaata gtatccaatt cttgagaaag aacttcacat tatattcttg ctcaaattcc gatttactgg gctaccttga gttatgcttc ccagcatagt attttgaaag ttagtgagaa tcgaagcaga cgaatccaag tagtggcgtg tgaaatatgc ccatcaataa gacgcaccgt tgcagtgaag tggggactta ggttccgatt tgtaaccccg accagctaca taccaatgca tgcaggagtg atatgattta aagattaaaa tttatcggat gaaacgactc gcaaccagac
agtgcagatc gtacgaatac ggaaactttc tttttaatgg gttagattaa ataatagtgg caattcatct ccacatctac attcaactca gtgttaattg gctacgtcat tagataatct tttacatctg caacaggtaa ataatagaca gatttgaatt gaaagagcgc aagaggcggt acagatgtga cagattatca gaattctgct tggatgaaaa agtgatgaaa gaaacttact ttcatatcta ctaatgagca
gattgctaca ttctgtaatt aaataatatt cagatatcga gggtaattca acaatcaagg tgtagtaggt tatcccagtt gaatgctctg tattgatcaa gagagaatta ccaagatcca atcgaattga
1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220
<210> 2
<211> 739
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 2
Met Thr Ser Asn Arg Lys Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Ala Val Ser Asn His Ser Ala Gln Met Asp Leu Ser Pro Asp
20 25 30
Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Ile Ala Glu Gly Asn Asn Ile Asn
35 40 45
Pro Leu Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ala Gly
50 55 60
Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Ala Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Phe Ile Val Gly Glu Leu Trp Pro Ser Gly Arg Asp Pro
85 90 95
Trp Glu Ile Phe Leu Glu His Val Glu Gln Leu Val Arg Gln Gln Ile
100 105 110
Thr Glu Asn Ala Arg Asn Thr Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly
115 120 125
Ala Ser Phe Arg Ala Tyr Gln Gln Ser Leu Glu Asp Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Arg Asp Asp Ala Arg Thr Arg Ser Val Leu Tyr Thr Gln Tyr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Glu Leu Asp Phe Leu Asn Ala Met Pro Leu Phe Ala Ile Asn Asn
165 170 175
Gln Gln Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe Gly Ser Glu Phe Gly Leu
195 200 205
Thr Ser Gln Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Glu Arg Gln Ala Glu Lys Thr
210 215 220
Arg Glu Tyr Ser Asp Tyr Cys Ala Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Leu Arg Tyr Asn Gln Phe
245 250 255
Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro
260 265 270
Ser Tyr Asp Thr Arg Ile Tyr Pro Ile Asn Thr Ser Ala Gln Leu Thr
275 280 285
Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Arg Thr Asn Ala Pro Ser Gly
290 295 300
Phe Ala Ser Thr Asn Trp Phe Asn Asn Asn Ala Pro Ser Phe Ser Ala
305 310 315 320
Ile Glu Ala Ala Val Ile Arg Pro Pro His Leu Leu Asp Phe Pro Glu
325 330 335
Gln Leu Thr Ile Phe Ser Val Leu Ser Arg Trp Ser Asn Thr Gln Tyr
340 345 350
Met Asn Tyr Trp Val Gly His Arg Leu Glu Ser Arg Thr Ile Arg Gly
355 360 365
Ser Leu Ser Thr Ser Thr His Gly Asn Thr Asn Thr Ser Ile Asn Pro
370 375 380
Val Thr Leu Gln Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg Thr Glu Ser Tyr
385 390 395 400
Ala Gly Ile Asn Ile Leu Leu Thr Thr Pro Val Asn Gly Val Pro Trp
405 410 415
Ala Arg Phe Asn Trp Arg Asn Pro Leu Asn Ser Leu Arg Gly Ser Leu
420 425 430
Leu Tyr Thr Ile Gly Tyr Thr Gly Val Gly Thr Gln Leu Phe Asp Ser
435 440 445
Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Glu Arg Pro Asn Tyr Glu Ser
450 455 460
Tyr Ser His Arg Leu Ser Asn Ile Arg Leu Ile Ser Gly Asn Thr Leu
465 470 475 480
Arg Ala Pro Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Asp Arg Thr Asn
485 490 495
Thr Ile Ala Thr Asn Ile Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn
500 505 510
Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly
515 520 525
Asp Leu Val Arg Leu Asn Asn Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly
530 535 540
Tyr Leu Glu Val Pro Ile Gln Phe Ile Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg
545 550 555 560
Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile Gln Leu Ser Val Asn
565 570 575
Trp Gly Asn Ser Asn Ile Phe Ser Ser Ile Val Pro Ala Thr Ala Thr
580 585 590
Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Arg Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Thr
595 600 605
Asn Ala Phe Thr Ser Ala Thr Gly Asn Val Val Gly Val Arg Asn Phe
610 615 620
Ser Glu Asn Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val
625 630 635 640
Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Glu Ala
645 650 655
Val Asn Ala Leu Phe Thr Asn Thr Asn Pro Arg Arg Leu Lys Thr Asp
660 665 670
Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu
675 680 685
Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Leu Glu Lys Val
690 695 700
Lys Tyr Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro
705 710 715 720
Asn Phe Thr Ser Ile Asn Lys Gln Pro Asp Phe Ile Ser Thr Asn Glu
725 730 735
Gln Ser Asn
<210> 3
<211> 1890
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 3
atgagtgaat tgaaggggaa ttttaagaaa agtactaatc gaacttgttg tttgctaaaa 60
ataataaata taggaggaag aggtatgaat tcaaaggaac atgattatct aaaagtttgt 120
aatgatttaa gtgacgccaa tattaatatg gagcggtttg ataagaatga tgcactggaa 180
attggtatgt ccattgtatc tgaacttatt ggtatgattc caggcggaac agctttgcaa 240
tttgtgttta atcaattgtg gtctcgttta ggtgattctg gatggaatgc gttcatggaa 300
catgtggagg aattaattga tactaaaata gaagggtatg caaaaaataa agccttatct 360
gaattagcag gtatacaaag aaaccttgaa acatatatac aattacgtaa tgaatgggaa 420
aatgatattg aaaactcaaa ggctcaaggt aaggtagcta attactatga aagtcttgag 480
caggcggttg aaaggagtat gcctcaattt gcagtgggga attttgaagt accactttta 540
actgtctatg tgcaagctgc taatcttcat ttattattat taagagatgt ttcagtttat 600
ggaaagcgtt ggggatggtc ggagcagaaa attaaaattt attatgataa acagattaag 660
tatacccatg aatacacaaa tcattgtgta aattggtata ataaaggact tgagagatta 720
aaaaataaag gttcttctta tcaagattgg tacaattata atcgtttccg tagagaaatg 780
actcttactg ttttagatat cgttgcttta ttcccgcact atgatgtaca aacttatcca 840
ataacaaccg ttgctcagct aacaagggaa gtttataccg atcctttact taattttaat 900
cctaaattac attctgtgtc tcaattacct agttttagtg acatggaaaa tgcaacaatt 960
agaactccac atctgatgga atttttaaga atgctaacaa tttatacaga ttggtatagt 1020
gtgggaagaa actattattg gggaggacat cgcgtgacgt cttaccatgt aggaggagag 1080
aatataagat cacctctata tggtagagag gcaaatcaag aggttcctag agatttttat 1140
ttttatggac ccgtttttaa gacgttatca aagccgactc taagaccatt acagcagcct 1200
gcaccagctc ctccttttaa tttacgtagc ttagagggag tagaattcca cactcctaca 1260
ggtagtttta tgtatcgtga aagaggatcg gtagattctt ttaatgagtt accgcctttt 1320
aatccagttg ggttacctca taaggtatac agtcaccgtt tatgtcatgc aacgtttgtt 1380
cgtaaatctg ggacccctta tttaacaaca ggtgccatct tttcttggac acatcgtagt 1440
gctgaagaaa ccaatacaat tgaatcaaat attattacgc aaatcccgtt agtaaaagca 1500
tatcaaattg ggtcaggcac tactgtaagg aaaggaccag gattcacagg aggggatata 1560
cttcgaagaa caggtcctgg aacatttgga gatatgagaa taaatattaa tgcaccatta 1620
tctcaaagat atcgtgtaag gattcgttat gcttctacga cagatttaca atttgtcacg 1680
agtattaatg ggaccaccat taatattggt aacttcccaa aaactattaa taatctaaat 1740
actttaggtt ctgagggcta tagaacagta tcgtttagta ctccatttag tttctcaaat 1800
gcacaaagca tatttagatt aggtatacaa gcattttctg gagttcaaga agtttatgtg 1860
gataaaattg aatttattcc tgttgaatag 1890
<210> 4
<211> 629
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 4
Met Ser Glu Leu Lys Gly Asn Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys
1 5 10 15
Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly Met Asn Ser Lys
20 25 30
Glu His Asp Tyr Leu Lys Val Cys Asn Asp Leu Ser Asp Ala Asn Ile
35 40 45
Asn Met Glu Arg Phe Asp Lys Asn Asp Ala Leu Glu Ile Gly Met Ser
50 55 60
Ile Val Ser Glu Leu Ile Gly Met Ile Pro Gly Gly Thr Ala Leu Gln
65 70 75 80
Phe Val Phe Asn Gln Leu Trp Ser Arg Leu Gly Asp Ser Gly Trp Asn
85 90 95
Ala Phe Met Glu His Val Glu Glu Leu Ile Asp Thr Lys Ile Glu Gly
100 105 110
Tyr Ala Lys Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Ala Gly Ile Gln Arg Asn
115 120 125
Leu Glu Thr Tyr Ile Gln Leu Arg Asn Glu Trp Glu Asn Asp Ile Glu
130 135 140
Asn Ser Lys Ala Gln Gly Lys Val Ala Asn Tyr Tyr Glu Ser Leu Glu
145 150 155 160
Gln Ala Val Glu Arg Ser Met Pro Gln Phe Ala Val Gly Asn Phe Glu
165 170 175
Val Pro Leu Leu Thr Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu
180 185 190
Leu Leu Arg Asp Val Ser Val Tyr Gly Lys Arg Trp Gly Trp Ser Glu
195 200 205
Gln Lys Ile Lys Ile Tyr Tyr Asp Lys Gln Ile Lys Tyr Thr His Glu
210 215 220
Tyr Thr Asn His Cys Val Asn Trp Tyr Asn Lys Gly Leu Glu Arg Leu
225 230 235 240
Lys Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Gln Asp Trp Tyr Asn Tyr Asn Arg Phe
245 250 255
Arg Arg Glu Met Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro
260 265 270
His Tyr Asp Val Gln Thr Tyr Pro Ile Thr Thr Val Ala Gln Leu Thr
275 280 285
Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Leu Asn Phe Asn Pro Lys Leu His
290 295 300
Ser Val Ser Gln Leu Pro Ser Phe Ser Asp Met Glu Asn Ala Thr Ile
305 310 315 320
Arg Thr Pro His Leu Met Glu Phe Leu Arg Met Leu Thr Ile Tyr Thr
325 330 335
Asp Trp Tyr Ser Val Gly Arg Asn Tyr Tyr Trp Gly Gly His Arg Val
340 345 350
Thr Ser Tyr His Val Gly Gly Glu Asn Ile Arg Ser Pro Leu Tyr Gly
355 360 365
Arg Glu Ala Asn Gln Glu Val Pro Arg Asp Phe Tyr Phe Tyr Gly Pro
370 375 380
Val Phe Lys Thr Leu Ser Lys Pro Thr Leu Arg Pro Leu Gln Gln Pro
385 390 395 400
Ala Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg Ser Leu Glu Gly Val Glu Phe
405 410 415
His Thr Pro Thr Gly Ser Phe Met Tyr Arg Glu Arg Gly Ser Val Asp
420 425 430
Ser Phe Asn Glu Leu Pro Pro Phe Asn Pro Val Gly Leu Pro His Lys
435 440 445
Val Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Val Arg Lys Ser Gly
450 455 460
Thr Pro Tyr Leu Thr Thr Gly Ala Ile Phe Ser Trp Thr His Arg Ser
465 470 475 480
Ala Glu Glu Thr Asn Thr Ile Glu Ser Asn Ile Ile Thr Gln Ile Pro
485 490 495
Leu Val Lys Ala Tyr Gln Ile Gly Ser Gly Thr Thr Val Arg Lys Gly
500 505 510
Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Gly Pro Gly Thr
515 520 525
Phe Gly Asp Met Arg Ile Asn Ile Asn Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr
530 535 540
Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe Val Thr
545 550 555 560
Ser Ile Asn Gly Thr Thr Ile Asn Ile Gly Asn Phe Pro Lys Thr Ile
565 570 575
Asn Asn Leu Asn Thr Leu Gly Ser Glu Gly Tyr Arg Thr Val Ser Phe
580 585 590
Ser Thr Pro Phe Ser Phe Ser Asn Ala Gln Ser Ile Phe Arg Leu Gly
595 600 605
Ile Gln Ala Phe Ser Gly Val Gln Glu Val Tyr Val Asp Lys Ile Glu
610 615 620
Phe Ile Pro Val Glu 625
<210> 5 <211> 2070 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 5
atgaaactaa agaatcaaga taagcatcaa agtttttcta gcaatgcgaa agtagataaa 60
atctctacgg attcactaaa aaatgaaaca gatatagaat tacaaaacat taatcatgaa 120
gattgtttga aaatgtctga gtatgaaaat gtagagccgt ttgttagtgc atcaacaatt 180
caaacaggta ttggtattgc gggtaaaata cttggtaccc taggcgttcc ttttgcagga 240
caagtagcta gtctttatag ttttatctta ggtgagctat ggcctaaggg gaaaaatcaa 300
tgggaaatct ttatggaaca tgtagaagag attattaatc aaaaaatatc aacttatgca 360
agaaataaag cacttacaga cttgaaagga ttaggagatg ccttagctgt ctaccatgat 420
tcgcttgaaa gttgggttgg aaatcgtaat aacacaaggg ctaggagtgt tgtcaagagc 480
caatatatcg cattagaatt gatgttcgtt cagaaactac cttcttttgc agtgtctgga 540
gaggaggtac cattattacc gatatatgcc caagctgcaa atttacattt gttgctatta 600
agagatgcat ctatttttgg aaaagagtgg ggattatcat cttcagaaat ttcaacattt 660
tataaccgtc aagtcgaacg agcaggagat tattccgacc attgtgtgaa atggtatagc 720
acaggtctaa ataacttgag gggtacaaat gccgaaagtt gggtacgata taatcaattc 780
cgtagagaca tgactttaat ggtactagat ttagtggcac tatttccaag ctatgataca 840
caaatgtatc caattaaaac tacagcccaa cttacaagag aagtatatac agacgcaatt 900
gggacagtac atccgcatcc aagttttaca agtacgactt ggtataataa taatgcacct 960
tcgttctctg ccatagaggc tgcggctatc cgaagcccgc atctacttga ttttctagaa 1020
caacttacaa tttttagcgc ttcatcacga tggagtaata ctaggcacat gacttattgg 1080
cgggggcaca cgattcaatc tcggccaata ggaggcggat taaatacctc aacgcatggg 1140
gctaccaata cttctattaa tcctgtaaca ttacggttcg catcacgaga cgtttatagg 1200
actgaatctt atgcaggagt gcttctatgg ggaatttacc ttgaacctat tcatggtgtc 1260
cctactgtta ggtttaattt tacgaaccct cagaatattt ctgatagagg taccgctaac 1320
tatagtcaac cttatgagtc acctgggctt caattaaaag attcagaaac tgaattacca 1380
ccagaaacaa cagaacgacc aaattatgaa tcttacagtc acaggttatc tcatataggt 1440
ataattttac aatccagggt gaatgtaccg gtatattctt ggacgcatcg tagtgcagat 1500
cgtacgaata cgattggacc aaatagaatc acccaaatcc caatggtaaa agcatccgaa 1560
cttcctcaag gtaccactgt tgttagagga ccaggattta ctggtgggga tattcttcga 1620
agaacgaata ctggtggatt tggaccgata agagtaactg ttaacggacc attaacacaa 1680
agatatcgta taggattccg ctatgcttca actgtagatt ttgatttctt tgtatcacgt 1740
ggaggtacta ctgtaaataa ttttagattc ctacgtacaa tgaacagtgg agacgaacta 1800
aaatacggaa attttgtgag acgtgctttt actacacctt ttacttttac acaaattcaa 1860
gatataattc gaacgtctat tcaaggcctt agtggaaatg gggaagtgta tatagataaa 1920
attgaaatta ttccagttac tgcaaccttc gaagcagaat atgatttaga aagagcgcaa 1980
gaggcggtga atgctctgtt tactaatacg aatccaagaa gattgaaaac agatgtgaca 2040
gattatcata ttgatcaagt atccaattaa 2070
<210> 6
<211> 689
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 6
Met Lys Leu Lys Asn Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Ser Ser Asn Ala
1 5 10 15
Lys Val Asp Lys Ile Ser Thr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp Ile
20 25 30
Glu Leu Gln Asn Ile Asn His Glu Asp Cys Leu Lys Met Ser Glu Tyr
35 40 45
Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr Ile Gln Thr Gly Ile
50 55 60
Gly Ile Ala Gly Lys Ile Leu Gly Thr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly
65 70 75 80
Gln Val Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Ile Leu Gly Glu Leu Trp Pro Lys
85 90 95
Gly Lys Asn Gln Trp Glu Ile Phe Met Glu His Val Glu Glu Ile Ile
100 105 110
Asn Gln Lys Ile Ser Thr Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Thr Asp Leu
115 120 125
Lys Gly Leu Gly Asp Ala Leu Ala Val Tyr His Asp Ser Leu Glu Ser
130 135 140
Trp Val Gly Asn Arg Asn Asn Thr Arg Ala Arg Ser Val Val Lys Ser
145 150 155 160
Gln Tyr Ile Ala Leu Glu Leu Met Phe Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe
165 170 175
Ala Val Ser Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro Ile Tyr Ala Gln Ala
180 185 190
Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Ile Phe Gly Lys
195 200 205
Glu Trp Gly Leu Ser Ser Ser Glu Ile Ser Thr Phe Tyr Asn Arg Gln
210 215 220
Val Glu Arg Ala Gly Asp Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg
245 250 255
Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Asp Met Thr Leu Met Val Leu Asp Leu Val
260 265 270
Ala Leu Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Gln Met Tyr Pro Ile Lys Thr Thr
275 280 285
Ala Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Ala Ile Gly Thr Val His
290 295 300
Pro His Pro Ser Phe Thr Ser Thr Thr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro
305 310 315 320
Ser Phe Ser Ala Ile Glu Ala Ala Ala Ile Arg Ser Pro His Leu Leu
325 330 335
Asp Phe Leu Glu Gln Leu Thr Ile Phe Ser Ala Ser Ser Arg Trp Ser
340 345 350
Asn Thr Arg His Met Thr Tyr Trp Arg Gly His Thr Ile Gln Ser Arg
355 360 365
Pro Ile Gly Gly Gly Leu Asn Thr Ser Thr His Gly Ala Thr Asn Thr
370 375 380
Ser Ile Asn Pro Val Thr Leu Arg Phe Ala Ser Arg Asp Val Tyr Arg
385 390 395 400
Thr Glu Ser Tyr Ala Gly Val Leu Leu Trp Gly Ile Tyr Leu Glu Pro
405 410 415
Ile His Gly Val Pro Thr Val Arg Phe Asn Phe Thr Asn Pro Gln Asn
420 425 430
Ile Ser Asp Arg Gly Thr Ala Asn Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Ser Pro
435 440 445
Gly Leu Gln Leu Lys Asp Ser Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr
450 455 460
Glu Arg Pro Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Gly
465 470 475 480
Ile Ile Leu Gln Ser Arg Val Asn Val Pro Val Tyr Ser Trp Thr His
485 490 495
Arg Ser Ala Asp Arg Thr Asn Thr Ile Gly Pro Asn Arg Ile Thr Gln
500 505 510
Ile Pro Met Val Lys Ala Ser Glu Leu Pro Gln Gly Thr Thr Val Val
515 520 525
Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr
530 535 540
Gly Gly Phe Gly Pro Ile Arg Val Thr Val Asn Gly Pro Leu Thr Gln
545 550 555 560
Arg Tyr Arg Ile Gly Phe Arg Tyr Ala Ser Thr Val Asp Phe Asp Phe
565 570 575
Phe Val Ser Arg Gly Gly Thr Thr Val Asn Asn Phe Arg Phe Leu Arg
580 585 590
Thr Met Asn Ser Gly Asp Glu Leu Lys Tyr Gly Asn Phe Val Arg Arg
595 600 605
Ala Phe Thr Thr Pro Phe Thr Phe Thr Gln Ile Gln Asp Ile Ile Arg
610 615 620
Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu Val Tyr Ile Asp Lys
625 630 635 640
Ile Glu Ile Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu
645 650 655
Glu Arg Ala Gln Glu Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Asn Thr Asn Pro
660 665 670
Arg Arg Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser
675 680 685
Asn
<210> 7 <211> 2493 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 7
atgaatctat caccagatgc tcgtattgaa gatagcttgt gtgtagccga ggtgaacaat 60
attgatccat ttgttagcgc atcaacagtc caaacgggta taaacatagc tggtagaata 120
ttgggcgtat taggtgtgcc gtttgctgga caactagcta gtttttatag ttttcttgtt 180
ggggaattat ggcctagtgg cagagatcct tgggaaattt tcctggaaca tgtagaacaa 240
cttataagac aacaagtaac agaaaatact aggaatacgg ctattgctcg attagaaggt 300
ctaggaagag gctatagatc ttaccagcag gctcttgaaa cttggttaga taaccgaaat 360
gatgcaagat caagaagcat tattcttgag cgctatgttg ctttagaact tgacattact 420
actgctatac cgcttttcag aatacgaaat gaagaagttc cattattaat ggtatatgct 480
caagctgcaa atttacacct attattattg agagacgcat ccctttttgg tagtgaatgg 540
gggatggcat cttccgatgt taaccaatat taccaagaac aaatcagata tacagaggaa 600
tattctaacc attgcgtaca atggtataat acagggctaa ataacttaag agggacaaat 660
gctgaaagtt ggttgcggta taatcaattc cgtagagacc taacgttagg ggtattagat 720
ttagtagccc tattcccaag ctatgatact cgcacttatc caatcaatac gagtgctcag 780
ttaacaagag aaatttatac agatccaatt gggagaacaa atgcaccttc aggatttgca 840
agtacgaatt ggtttaataa taatgcacca tcgttttctg ccatagaggc tgccattttc 900
aggcctccgc atctacttga ttttccagaa caacttacaa tttacagtgc atcaagccgt 960
tggagtagca ctcaacacat gaattattgg gtgggacata ggcttaactt ccgcccaata 1020
ggagggacat taaatacctc aacacaagga cttactaata atacttcaat taatcctgta 1080
acattacagt ttacgtctcg tgacgtttat agaacagaat caaatgcagg gacaaatata 1140
ctatttacta ctcctgtgaa tggagtacct tgggctagat ttaattttat aaaccctcag 1200
aatatttatg aaagaggcgc cactacctac agtcaaccgt atcagggagt tgggattcaa 1260
ttatttgatt cagaaactga attaccacca gaaacaacag aacgaccaaa ttatgaatct 1320
tatagtcata gattatctca tataggacta atcataggaa acactttgag agcaccagtc 1380
tattcttgga cgcatcgtag tgcagatcgt acgaatacga ttggaccaaa tagaatcacc 1440
caaatcccaa tggtaaaagc atccgaactt cctcaaggta ccactgttgt tagaggacca 1500
ggatttactg gtggggatat tcttcgaaga acgaatactg gtggatttgg accgataaga 1560
gtaactgtta acggaccatt aacacaaaga tatcgtatag gattccgcta tgcttcaact 1620
gtagattttg atttctttgt atcacgtgga ggtactactg taaataattt tagattccta 1680
cgtacaatga acagtggaga cgaactaaaa tacggaaatt ttgtgagacg tgcttttact 1740
acacctttta cttttacaca aattcaagat ataattcgaa cgtctattca aggccttagt 1800
ggaaatgggg aagtgtatat agataaaatt gaaattattc cagttactgc aaccttcgaa 1860
gcagaatatg atttagaaag agcgcaagag gcggtgaatg ctctgtttac taatacgaat 1920
ccaagaagat tgaaaacaga tgtgacagat tatcatattg atcaagtatc caatttagtg 1980
gcgtgtttat cggatgaatt ctgcttggat gaaaagagag aattacttga gaaagtgaaa 2040
tatgcgaaac gactcagtga tgaaagaaac ttactccaag atccaaactt cacatccatc 2100
aataagcaac cagacttcat atctactaat gagcaatcga atttcacatc tatccatgaa 2160
caatctgaac atggatggtg gggaagtgag aacattacca tccaggaagg aaatgacgta 2220
tttaaagaga attacgtcac actaccgggt acttttaatg agtgttatcc gacgtattta 2280
tatcaaaaaa taggggagtc ggaattaaaa gcatatactc gctaccaatt aagaggttat 2340
attgaagata gtcaagattt agagatatat ttgattcgtt ataatgcgaa acatgaaaca 2400
ttggatgttc caggtaccga gtccctatgg ccgctttcag ttgaaagccc aatcggaagg 2460
tgcggagaac cgaatcgatg cgcaccacat tga 2493
<210> 8 <211> 830
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 8
Met Asn Leu Ser Pro Asp Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Val Ala
1 5 10 15
Glu Val Asn Asn Ile Asp Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr
20 25 30
Gly Ile Asn Ile Ala Gly Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe
35 40 45
Ala Gly Gln Leu Ala Ser Phe Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Leu Trp
50 55 60
Pro Ser Gly Arg Asp Pro Trp Glu Ile Phe Leu Glu His Val Glu Gln
65 70 75 80
Leu Ile Arg Gln Gln Val Thr Glu Asn Thr Arg Asn Thr Ala Ile Ala
85 90 95
Arg Leu Glu Gly Leu Gly Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Gln Gln Ala Leu
100 105 110
Glu Thr Trp Leu Asp Asn Arg Asn Asp Ala Arg Ser Arg Ser Ile Ile
115 120 125
Leu Glu Arg Tyr Val Ala Leu Glu Leu Asp Ile Thr Thr Ala Ile Pro
130 135 140
Leu Phe Arg Ile Arg Asn Glu Glu Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala
145 150 155 160
Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Glu Trp Gly Met Ala Ser Ser Asp Val Asn Gln Tyr Tyr Gln
180 185 190
Glu Gln Ile Arg Tyr Thr Glu Glu Tyr Ser Asn His Cys Val Gln Trp
195 200 205
Tyr Asn Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp
210 215 220
Leu Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp
225 230 235 240
Leu Val Ala Leu Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Ile Asn
245 250 255
Thr Ser Ala Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Arg
260 265 270
Thr Asn Ala Pro Ser Gly Phe Ala Ser Thr Asn Trp Phe Asn Asn Asn
275 280 285
Ala Pro Ser Phe Ser Ala Ile Glu Ala Ala Ile Phe Arg Pro Pro His
290 295 300
Leu Leu Asp Phe Pro Glu Gln Leu Thr Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg
305 310 315 320
Trp Ser Ser Thr Gln His Met Asn Tyr Trp Val Gly His Arg Leu Asn
325 330 335
Phe Arg Pro Ile Gly Gly Thr Leu Asn Thr Ser Thr Gln Gly Leu Thr
340 345 350
Asn Asn Thr Ser Ile Asn Pro Val Thr Leu Gln Phe Thr Ser Arg Asp
355 360 365
Val Tyr Arg Thr Glu Ser Asn Ala Gly Thr Asn Ile Leu Phe Thr Thr
370 375 380
Pro Val Asn Gly Val Pro Trp Ala Arg Phe Asn Phe Ile Asn Pro Gln
385 390 395 400
Asn Ile Tyr Glu Arg Gly Ala Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Gln Gly
405 410 415
Val Gly Ile Gln Leu Phe Asp Ser Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr
420 425 430
Thr Glu Arg Pro Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile
435 440 445
Gly Leu Ile Ile Gly Asn Thr Leu Arg Ala Pro Val Tyr Ser Trp Thr
450 455 460
His Arg Ser Ala Asp Arg Thr Asn Thr Ile Gly Pro Asn Arg Ile Thr
465 470 475 480
Gln Ile Pro Met Val Lys Ala Ser Glu Leu Pro Gln Gly Thr Thr Val
485 490 495
Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn
500 505 510
Thr Gly Gly Phe Gly Pro Ile Arg Val Thr Val Asn Gly Pro Leu Thr
515 520 525
Gln Arg Tyr Arg Ile Gly Phe Arg Tyr Ala Ser Thr Val Asp Phe Asp
530 535 540
Phe Phe Val Ser Arg Gly Gly Thr Thr Val Asn Asn Phe Arg Phe Leu
545 550 555 560
Arg Thr Met Asn Ser Gly Asp Glu Leu Lys Tyr Gly Asn Phe Val Arg
565 570 575
Arg Ala Phe Thr Thr Pro Phe Thr Phe Thr Gln Ile Gln Asp Ile Ile
580 585 590
Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu Val Tyr Ile Asp
595 600 605
Lys Ile Glu Ile Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp
610 615 620
Leu Glu Arg Ala Gln Glu Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Asn Thr Asn
625 630 635 640
Pro Arg Arg Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val
645 650 655
Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys
660 665 670
Arg Glu Leu Leu Glu Lys Val Lys Tyr Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu
675 680 685
Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Thr Ser Ile Asn Lys Gln Pro
690 695 700
Asp Phe Ile Ser Thr Asn Glu Gln Ser Asn Phe Thr Ser Ile His Glu
705 710 715 720
Gln Ser Glu His Gly Trp Trp Gly Ser Glu Asn Ile Thr Ile Gln Glu
725 730 735
Gly Asn Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Phe
740 745 750
Asn Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Gly Glu Ser Glu
755 760 765
Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser
770 775 780
Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr
785 790 795 800
Leu Asp Val Pro Gly Thr Glu Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser
805 810 815
Pro Ile Gly Arg Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His
820 825 830
<210> 9
<211> 1923
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 9
atgacttcaa ataggaaaaa tgagaatgaa attataaatg ccttatcgat tccagctgta 60
tcgaatcatt ccgcacaaat ggatctatcg ctagatgctc gtattgagga ttctttgtgt 120
atagccgagg ggaataatat caatccactt gttagcgcat caacagtcca aacgggtata 180
aacatagctg gtagaatatt gggcgtatta ggtgtgccgt ttgctggaca actagctagt 240
ttttatagtt ttcttgttgg ggaattatgg cctagtggca gagatccttg ggaaattttc 300
ctggaacatg tagaacaact tataagacaa caagtaacag aaaatactag gaatacggct 360
attgctcgat tagaaggtct aggaagaggc tatagatctt accagcaggc tcttgaaact 420
tggttagata accgaaatga tgcaagatca agaagcatta ttcttgagcg ctatgttgct 480
ttagaacttg acattactac tgctataccg cttttcagaa tacgaaatga agaagttcca 540
ttattaatgg tatatgctca agctgcaaat ttacacctat tattattgag agacgcatcc 600
ctttttggta gtgaatgggg gatggcatct tccgatgtta accaatatta ccaagaacaa 660
atcaggtata cagaggaata ttctaaccat tgcgtacaat ggtataatac agggctaaat 720
aacttaagag ggacaaatgc tgaaagttgg ctgcggtata atcaattccg tagagaccta 780
acgttagggg tattagattt agtagcccta ttcccaagct atgatactcg cacttatcca 840
atcaatacga gtgctcagtt aacaagagaa atttatacag atccaattgg gagaacaaat 900
gcaccttcag gatttgcaag tacgaattgg tttaataata atgcaccatc gttttctgcc 960
atagaggctg ccattttcag gcctccgcat ctacttgatt ttccagaaca acttacaatt 1020
tacagtgcat caagccgttg gagtagcact caacatatga attattgggt gggacatagg 1080
cttaacttcc gcccaatagg agggacatta aatacctcaa cacaaggact tactaataat 1140
acttcaatta atcctgtaac attacagttt acgtctcgtg acgtttatag aacagaatca 1200
aatgcaggga caaatatact atttactact cctgtgaatg gagtaccttg ggctagattt 1260
aattttataa accctcagaa tatttatgaa agaggcgcca ctacctacag tcaaccgtat 1320
cagggagttg ggattcaatt atttgattca gaaactgaat taccaccaga aacaacagaa 1380
cgaccaaatt atgaatcata tagtcataga ttatctcata taggactaat cataggaaac 1440
actttgagag caccagtcta ttcttggacg catcgtagtg caactaatac aaatacaatt 1500
aatccagata ttattacaca aataccttta gtgaaaggat ttagacttgg tggtggcacc 1560
tctgtcatta aaggaccagg atttacagga ggggatatcc ttcgaagaaa taccattggt 1620
gagtttgtgt ctttacaagt caatattaac tcaccaatta cccaaagata ccgtttaaga 1680
tttcgttatg cttccagtag ggatgcacga attactgtag cgataggagg acaaattaga 1740
gtagatatga cccttgaaaa aacgatggaa attggggaga gcttaacatc tagaacattt 1800
agctatacca attttagtaa tcctttttca tttagggcta atccagatat aattagaata 1860
gctgaagaac ttcctattcg tggtggtgag ctttatatag ataaaattga acttattcta 1920
tga 1923
<210> 10
<211> 640
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 10
Met Thr Ser Asn Arg Lys Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Ala Val Ser Asn His Ser Ala Gln Met Asp Leu Ser Leu Asp
20 25 30
Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Ile Ala Glu Gly Asn Asn Ile Asn
35 40 45
Pro Leu Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ala Gly
50 55 60
Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Ala Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Leu Trp Pro Ser Gly Arg Asp Pro
85 90 95
Trp Glu Ile Phe Leu Glu His Val Glu Gln Leu Ile Arg Gln Gln Val
100 105 110
Thr Glu Asn Thr Arg Asn Thr Ala Ile Ala Arg Leu Glu Gly Leu Gly
115 120 125
Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Gln Gln Ala Leu Glu Thr Trp Leu Asp Asn
130 135 140
Arg Asn Asp Ala Arg Ser Arg Ser Ile Ile Leu Glu Arg Tyr Val Ala
145 150 155 160
Leu Glu Leu Asp Ile Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Arg Ile Arg Asn
165 170 175
Glu Glu Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe Gly Ser Glu Trp Gly Met
195 200 205
Ala Ser Ser Asp Val Asn Gln Tyr Tyr Gln Glu Gln Ile Arg Tyr Thr
210 215 220
Glu Glu Tyr Ser Asn His Cys Val Gln Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Leu Arg Tyr Asn Gln Phe
245 250 255
Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro
260 265 270
Ser Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Ile Asn Thr Ser Ala Gln Leu Thr
275 280 285
Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Arg Thr Asn Ala Pro Ser Gly
290 295 300
Phe Ala Ser Thr Asn Trp Phe Asn Asn Asn Ala Pro Ser Phe Ser Ala
305 310 315 320
Ile Glu Ala Ala Ile Phe Arg Pro Pro His Leu Leu Asp Phe Pro Glu
325 330 335
Gln Leu Thr Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Trp Ser Ser Thr Gln His
340 345 350
Met Asn Tyr Trp Val Gly His Arg Leu Asn Phe Arg Pro Ile Gly Gly
355 360 365
Thr Leu Asn Thr Ser Thr Gln Gly Leu Thr Asn Asn Thr Ser Ile Asn
370 375 380
Pro Val Thr Leu Gln Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg Thr Glu Ser
385 390 395 400
Asn Ala Gly Thr Asn Ile Leu Phe Thr Thr Pro Val Asn Gly Val Pro
405 410 415
Trp Ala Arg Phe Asn Phe Ile Asn Pro Gln Asn Ile Tyr Glu Arg Gly
420 425 430
Ala Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Gln Gly Val Gly Ile Gln Leu Phe
435 440 445
Asp Ser Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Glu Arg Pro Asn Tyr
450 455 460
Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Gly Leu Ile Ile Gly Asn
465 470 475 480
Thr Leu Arg Ala Pro Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Asn
485 490 495
Thr Asn Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys
500 505 510
Gly Phe Arg Leu Gly Gly Gly Thr Ser Val Ile Lys Gly Pro Gly Phe
515 520 525
Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Ile Gly Glu Phe Val Ser
530 535 540
Leu Gln Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg
545 550 555 560
Phe Arg Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Ile Thr Val Ala Ile Gly
565 570 575
Gly Gln Ile Arg Val Asp Met Thr Leu Glu Lys Thr Met Glu Ile Gly
580 585 590
Glu Ser Leu Thr Ser Arg Thr Phe Ser Tyr Thr Asn Phe Ser Asn Pro
595 600 605
Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Arg Ile Ala Glu Glu Leu
610 615 620
Pro Ile Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Leu Ile Leu
625 630 635 640
<210> 11
<211> 1989
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 11
atgacttcaa ataggaaaaa tgagaatgaa attataaatg ccttatcgat tccagctgta 60
tcgaatcatt ccgcacaaat ggatctatcg ctagatgctc gtattgagga ttctttgtgt 120
atagccgagg ggaataatat caatccactt gttagcgcct caacagtcca aacgggtatt 180
aacatagctg gtagaatact aggtgtatta ggcgtaccgt ttgctggaca actagctagt 240
ttttatagtt ttcttgtcgg tgaattatgg ccccgcggca gagatcagtg ggaaattttc 300
ttagaacatg tcgaacaact tataaatcaa caaataacag aaaatgctag gaatacggca 360
cttgctcgat tacaaggttt aggagattcc tttagagcct atcaacagtc acttgaagat 420
tggctagaaa accgtgatga tgcaagaacg agaagtgttc tttatatcca atatatagct 480
ttagaacttg attttcttaa tgcaatgccg cttttcgcaa ttagaaacca agaagttcca 540
ttattgatgg tatatgctca agctgcaaat ttacacctat tattattgag agatgcctct 600
ctttttggta gtgaatttgg gcttacatcg caggaaattc aacgctatta tgagcgccaa 660
gtggaacgaa cgagagatta ttccgactat tgcgtagaat ggtataatac aggtctaaat 720
agcttgagag ggacaaatgc cgcaagttgg gtacggtata atcaattccg tagagatcta 780
acgttaggag tattagatct agtggcgcta ttcccaagct atgacactcg cacttatcca 840
ataaatacga gtgctcagtt aacaagggaa gtttatacag acgcaattgg gactgtacat 900
ccgcatcaag catttgcaag tacgacttgg tataataata atgcaccttc gctctctgcc 960
atagaggctg cggttatccg aagcccgcat ctacttgatt ttccagaaca acttacaatt 1020
tacagcacat taagtcgatg gagtaacact cagtatatga atatatgggt aggtcataga 1080
cttgaatctc gaacaatagg agggtcatta aatacctcga cacaaggatc taccaatact 1140
tctattaatc ctgtaagatt acagtttacg gcacgagacg tttataggac tgaatcattg 1200
gcagggctaa atatattttt aactcaacct gttaatgggg taccttgggt tagatttaat 1260
tggagaaatc ccctgaattc tcttagaggt agccttctct atactatagg gtatactgga 1320
gttgggacgc aattacaaga ttcagaaact gaattaccac cagaaacaac agaacgacca 1380
aattatgaat cttacagtca tagattatct catataggac tcatttcatc atctcatgtg 1440
agagcattgg tatattcttg gacgcaccgt agtgcagatc gtacaaatac aattggacca 1500
aatagaatta cacaaatacc attggtaaaa gcacttaacc ttcattcagg tgctactgtt 1560
gttagagggc caggatttac aggtggggat atccttcgta gaacgaatac tggtacattt 1620
ggagatatac gtttaaatat taatgtgcca ttatcccaaa gatatcgcgt aaggattcgt 1680
tatgcttcta ctacagattt acaatttttc acgagaatta atggaaccac tgttaatatt 1740
gctaatttct caagaactat gaataggggg gataatttag aatctagaag ttttagaact 1800
gcaggattta gtactccttt taatttttca aatgcccaaa gcacattcac attgggtgct 1860
cagagttttt caaatcagga agtttatata gatagagtcg aatttgttcc ggcagaggta 1920
accttcgaag cagaatatga tttagaaaga gcgcaagagg cggtgaatgc tctgtttact 1980
aatacgtaa 1989
<210> 12
<211> 662
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 12
Met Thr Ser Asn Arg Lys Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Ala Val Ser Asn His Ser Ala Gln Met Asp Leu Ser Leu Asp
20 25 30
Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Ile Ala Glu Gly Asn Asn Ile Asn
35 40 45
Pro Leu Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ala Gly
50 55 60
Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Ala Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Leu Trp Pro Arg Gly Arg Asp Gln
85 90 95
Trp Glu Ile Phe Leu Glu His Val Glu Gln Leu Ile Asn Gln Gln Ile
100 105 110
Thr Glu Asn Ala Arg Asn Thr Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly
115 120 125
Asp Ser Phe Arg Ala Tyr Gln Gln Ser Leu Glu Asp Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Arg Asp Asp Ala Arg Thr Arg Ser Val Leu Tyr Ile Gln Tyr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Glu Leu Asp Phe Leu Asn Ala Met Pro Leu Phe Ala Ile Arg Asn
165 170 175
Gln Glu Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe Gly Ser Glu Phe Gly Leu
195 200 205
Thr Ser Gln Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Glu Arg Gln Val Glu Arg Thr
210 215 220
Arg Asp Tyr Ser Asp Tyr Cys Val Glu Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Ser Leu Arg Gly Thr Asn Ala Ala Ser Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe
245 250 255
Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro
260 265 270
Ser Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Ile Asn Thr Ser Ala Gln Leu Thr
275 280 285
Arg Glu Val Tyr Thr Asp Ala Ile Gly Thr Val His Pro His Gln Ala
290 295 300
Phe Ala Ser Thr Thr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro Ser Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ile Glu Ala Ala Val Ile Arg Ser Pro His Leu Leu Asp Phe Pro Glu
325 330 335
Gln Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Leu Ser Arg Trp Ser Asn Thr Gln Tyr
340 345 350
Met Asn Ile Trp Val Gly His Arg Leu Glu Ser Arg Thr Ile Gly Gly
355 360 365
Ser Leu Asn Thr Ser Thr Gln Gly Ser Thr Asn Thr Ser Ile Asn Pro
370 375 380
Val Arg Leu Gln Phe Thr Ala Arg Asp Val Tyr Arg Thr Glu Ser Leu
385 390 395 400
Ala Gly Leu Asn Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Asn Gly Val Pro Trp
405 410 415
Val Arg Phe Asn Trp Arg Asn Pro Leu Asn Ser Leu Arg Gly Ser Leu
420 425 430
Leu Tyr Thr Ile Gly Tyr Thr Gly Val Gly Thr Gln Leu Gln Asp Ser
435 440 445
Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Glu Arg Pro Asn Tyr Glu Ser
450 455 460
Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Gly Leu Ile Ser Ser Ser His Val
465 470 475 480
Arg Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Asp Arg Thr Asn
485 490 495
Thr Ile Gly Pro Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala Leu
500 505 510
Asn Leu His Ser Gly Ala Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly
515 520 525
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe Gly Asp Ile Arg
530 535 540
Leu Asn Ile Asn Val Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg
545 550 555 560
Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe Phe Thr Arg Ile Asn Gly Thr
565 570 575
Thr Val Asn Ile Ala Asn Phe Ser Arg Thr Met Asn Arg Gly Asp Asn
580 585 590
Leu Glu Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Gly Phe Ser Thr Pro Phe Asn
595 600 605
Phe Ser Asn Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu Gly Ala Gln Ser Phe Ser
610 615 620
Asn Gln Glu Val Tyr Ile Asp Arg Val Glu Phe Val Pro Ala Glu Val
625 630 635 640
Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Glu Ala Val Asn
645 650 655
Ala Leu Phe Thr Asn Thr 660
<210> 13 <211> 1974 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 13
atgacttcaa ataggaaaaa tgagaatgaa attataaatg ctttatcgat tccagctgta 60
tcgaatcatt ccgcacaaat ggatctatca ccagatgctc gtattgagga tagcttgtgt 120
atagccgagg ggaacaatat cgatccattt gttagcgcat caacagtcca aacgggtatt 180
aacatagctg gtagaatact aggcgtattg ggcgtaccgt ttgctggaca actagctagt 240
ttttatagtt ttcttgttgg tgaattatgg cctagcggca gagatccatg ggaaattttt 300
atggaacatg tcgaacaact tgtaagacaa caaataacgg acagtgttag ggataccgct 360
attgctcgtt tagaaggtct aggaagaggg tatagatctt accagcaggc tcttgaaact 420
tggttagata accgaaatga tgcaagatca agaagcatta ttcttgagag atatattgct 480
ttagaacttg acattactac tgctataccg cttttcagca tacgaaatca agaggttcca 540
ttattaatgg tatatgctca agctgcaaat ttacacctat tattattgag agacgcatcc 600
ctttttggta gtgaatgggg gatgtcatct gccgatgtta accaatatta ccaagaacaa 660
atcagatata cagaggaata ttctaaccat tgcgtgcaat ggtataatac gggtctaaat 720
aacctaagag ggacaaatgc tgaaagctgg gtacggtata atcaattccg cagagaccta 780
acattaggag tattagatct agtggcccta ttcccaagct atgatactcg cacttatcca 840
ataaatacga gtgctcagtt aacaagagaa gtttatacag acgcaattgg agcaacaggg 900
gtaaatatgg caaatatgaa ttggtacaat aataatgcac cttcgttctc cgctatagag 960
gctgcggtta gcttcatcac tctcggccaa aatcctgtaa gtgcttctat tttacgaacc tcacctgggc ccaaattatg gtgaatgtac ccaaatagaa gttgttagag tttggaccga cgctatgctt aattttagat agacgtgctt attcaaggcc actgcaacct tcagaagccc gatggagtaa taggaggcgg cattacggtt ggggaattta ctcagaatat ttcaattaaa aatcttacag cggtatattc tcacccaaat gaccaggatt taagagtaac caactgtaga tcctacgtac ttactacacc ttagtggaaa tcgaagcaga gcatctactt tactaggcat attaaacacc cacgtctcga ccttgaacct ttatgataga agattcagaa tcataggtta ttggacgcat cccaatggta tactggtggg tgttaacgga ttttgatttc aatgaacagt ttttactttt tggggaagtg atatgattta
gattttctag aacaacttac atgacttact ggagggggca tcaacgtatg ggtctaccaa gacgtctata ggacagaatc attcatggtg tccctactgt ggtactgcta actatagtca acggaattac cgccagaaac tctcatatag gtataatttt cgtagtgcag atcgtacgaa aaagcatccg aacttcctca gatattcttc gaagaacgaa ccattaacac aaagatatcg tttgtatcac gtggaggtac ggagacgaac taaaatacgg acacaaattc aagatataat tatatagata aaattgaaat gaaagagcgc aagaggcggt
aatttttagc cacgattcaa tacttctatt atgggcagga taggtttaat accgtacgag aacagaacga acaatccagg tacgattgga aggtaccact tactggtgga tataggattc tactgtaaat aaattttgtg tcgaacgtct tattccagtt gtaa
1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380
1440
1500 1560
1620 1680
1740
1800 1860
1920 1974
<210> 14 <211> 657
<212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 14
Met Thr Ser Asn Arg Lys Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Ala Val Ser Asn His Ser Ala Gln Met Asp Leu Ser Pro Asp
20 25 30
Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Ile Ala Glu Gly Asn Asn Ile Asp
35 40 45
Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ala Gly
50 55 60
Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Ala Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Leu Trp Pro Ser Gly Arg Asp Pro
85 90 95
Trp Glu Ile Phe Met Glu His Val Glu Gln Leu Val Arg Gln Gln Ile
100 105 110
Thr Asp Ser Val Arg Asp Thr Ala Ile Ala Arg Leu Glu Gly Leu Gly
115 120 125
Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Gln Gln Ala Leu Glu Thr Trp Leu Asp Asn
130 135 140
Arg Asn Asp Ala Arg Ser Arg Ser Ile Ile Leu Glu Arg Tyr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Glu Leu Asp Ile Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ser Ile Arg Asn
165 170 175
Gln Glu Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe Gly Ser Glu Trp Gly Met
195 200 205
Ser Ser Ala Asp Val Asn Gln Tyr Tyr Gln Glu Gln Ile Arg Tyr Thr
210 215 220
Glu Glu Tyr Ser Asn His Cys Val Gln Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe
245 250 255
Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro
260 265 270
Ser Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Ile Asn Thr Ser Ala Gln Leu Thr
275 280 285
Arg Glu Val Tyr Thr Asp Ala Ile Gly Ala Thr Gly Val Asn Met Ala
290 295 300
Asn Met Asn Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro Ser Phe Ser Ala Ile Glu
305 310 315 320
Ala Ala Val Ile Arg Ser Pro His Leu Leu Asp Phe Leu Glu Gln Leu
325 330 335
Thr Ile Phe Ser Ala Ser Ser Arg Trp Ser Asn Thr Arg His Met Thr
340 345 350
Tyr Trp Arg Gly His Thr Ile Gln Ser Arg Pro Ile Gly Gly Gly Leu
355 360 365
Asn Thr Ser Thr Tyr Gly Ser Thr Asn Thr Ser Ile Asn Pro Val Thr
370 375 380
Leu Arg Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg Thr Glu Ser Trp Ala Gly
385 390 395 400
Val Leu Leu Trp Gly Ile Tyr Leu Glu Pro Ile His Gly Val Pro Thr
405 410 415
Val Arg Phe Asn Phe Thr Asn Pro Gln Asn Ile Tyr Asp Arg Gly Thr
420 425 430
Ala Asn Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Ser Pro Gly Leu Gln Leu Lys Asp
435 440 445
Ser Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Glu Arg Pro Asn Tyr Glu
450 455 460
Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Gly Ile Ile Leu Gln Ser Arg
465 470 475 480
Val Asn Val Pro Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Asp Arg Thr
485 490 495
Asn Thr Ile Gly Pro Asn Arg Ile Thr Gln Ile Pro Met Val Lys Ala
500 505 510
Ser Glu Leu Pro Gln Gly Thr Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr
515 520 525
Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Gly Phe Gly Pro Ile
530 535 540
Arg Val Thr Val Asn Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile Gly Phe
545 550 555 560
Arg Tyr Ala Ser Thr Val Asp Phe Asp Phe Phe Val Ser Arg Gly Gly
565 570 575
Thr Thr Val Asn Asn Phe Arg Phe Leu Arg Thr Met Asn Ser Gly Asp
580 585 590
Glu Leu Lys Tyr Gly Asn Phe Val Arg Arg Ala Phe Thr Thr Pro Phe
595 600 605
Thr Phe Thr Gln Ile Gln Asp Ile Ile Arg Thr Ser Ile Gln Gly Leu
610 615 620
Ser Gly Asn Gly Glu Val Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Pro Val
625 630 635 640
Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Glu Ala
645 650 655
Val
<210> 15 <211> 3702
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 15
atgacttcaa ataggaaaaa tgagaatgaa attataaatg ctttatcgat tccagctgta 60
tcgaatcatt ccgcacaaat ggatctatca ccagatgctc gtattgagga ttctttgtgt 120
atagccgagg ggaataatat caatccactt gttagcgcat caacagtcca aacgggtatt 180
aacattgctg gtagaatact aggcgtatta ggcgtaccgt ttgctggaca actagctagt 240
ttttatagtt ttattgtcgg tgaattatgg cctagcggca gagatccgtg ggaaatcttt 300
ctagaacatg ttgaacaact tgtaagacaa caaataacag aaaatgctag gaatacggca 360
cttgctcgat tacaaggttt aggagcttcc tttagagcct atcaacaatc acttgaagac 420
tggctagaaa accgtgatga tgcaagaacg agaagtgttc tttataccca atatatagcc 480
ttagagcttg attttcttaa tgcgatgccg cttttcgcaa taaacaatca acaggttcca 540
ttattgatgg tatatgctca agctgcaaat ttacatctat tattattgag agatgcctct 600
ctttttggta gtgaatttgg gcttacatcg caggaaattc aacgttatta tgagcgccaa 660
gcggaaaaaa cgagagaata ttctgattat tgcgcaagat ggtataatac gggtttaaat 720
aatttgagag ggacaaatgc tgaaagttgg ttgcgatata atcaattccg tagagactta 780
acgctaggag tattagatct agtggcacta ttcccaagct atgacacgcg tatttatcca 840
ataaatacca gtgctcaatt aacaagagaa atttatacag atccaattgg gagaacaaat 900
gcaccttcag gatttgcaag tacgaattgg tttaataata atgcaccatc gttttctgcc 960
atagaggctg ccgttattag gcctccgcat ctacttgatt ttccagaaca gcttacaatt 1020
ttcagcgtat taagtcgatg gagtaatact caatatatga attactgggt gggacataga 1080
cttgaatcgc gaacaataag ggggtcatta agtacctcga cacacggaaa taccaatact 1140
tctattaatc ctgtaacatt acagttcaca tcacgagacg tttatagaac agaatcttat 1200
gcagggataa atatacttct aactactcct gtgaatggag taccttgggc tagatttaat 1260
tggagaaatc ccctcaattc tcttagaggt agccttctct atactatagg gtatactgga 1320
gtggggacac aactatttga ttcagaaact gaattaccac cagaaacaac agaacgacca 1380
aattatgaat cttacagtca tagattatct aatataagac taatatcagg aaacactttg 1440
agagcaccag tatattcttg gacgcaccgt agtgcagatc gtacgaatac gattgctaca 1500
aatattatta ctcaaattcc tgcagtgaag ggaaactttc tttttaatgg ttctgtaatt 1560
tcaggaccag gatttactgg tggggactta gttagattaa ataatagtgg aaataatatt 1620
caaaatagag gctaccttga ggttccgatt caattcatct ccacatctac cagatatcga 1680
gttcgtgtac gttatgcttc tgtaaccccg attcaactca gtgttaattg gggtaattca 1740
aacatttttt ccagcatagt accagctaca gctacgtcat tagataatct acaatcaagg 1800
gattttggtt attttgaaag taccaatgca tttacatctg caacaggtaa tgtagtaggt 1860
gttagaaatt ttagtgagaa tgcaggagtg ataatagaca gatttgaatt tatcccagtt 1920
actgcaacct tcgaagcaga atatgattta gaaagagcgc aagaggcggt gaatgctctg 1980
tttactaata cgaatccaag aagattaaaa acagatgtga cagattatca tattgatcaa 2040
gtatccaatt tagtggcgtg tttatcggat gagttctgct tggatgaaaa gagagaatta 2100
cttgagaaag tgaaatatgc gaaacgactc agtgatgaaa gaaacttact ccaagatcca 2160
aacttcacat ccatcaataa gcaaccagac ttcatatcta ctaatgagca atcgaatttc 2220
acatctatcc atgaacaatc tgaacatgga tggtggggaa gtgagaacat tacaatccag 2280
gaaggaaatg aagtatttaa agagaatttt ttcacactac cgggtactct taatgagtgt 2340
tatccaacat atttatatca aaaaataggg gagtcggaat taaaagcata tactcgctac 2400
caattaagag gctatattga agatagtcaa gatttagaga tatatttgat tcgttacaat 2460
gcgaaacatg aaacattgga tgttccaggt accgagtccg tatggccgct ttcagttgaa 2520
agcccaatcg gaaggtgcgg agaaccgaat cgatgcgtgc cgcatattga atggaatcct 2580
aatttagact gttcctgcag agatggagaa aaatgtgcgc atcattccca tcatttctct 2640
ttggatattg atgttggatg catagacttg caagagaacc taggcgtgtg ggtggtattc 2700
aagattaaga cgcaggaagg tcatgcaaga ctagggaatc tggaatttat tgaagagaaa 2760
ccattattag gagaagcact gtctcgtgtg aagagagcag agaaaaaatg gagagacaaa 2820
cgtgaaaaac tacaattgga aacaaaacga gtatatacag aggcaaaaga agctgtgggt 2880
gctttatttg tagattctca atatgataga ttacaagcgg atacaaacat tggcatgatt 2940
catgcggcag ataaacttgt tcatcgaata cgagaggcgt atctttcaga attatctgtt 3000
atcccaggtg taaatgcgga aatttttgaa gaattagaag gtcgcattat cactgcaatc 3060
tccctatacg atgcgagaaa tgtcgttaaa aatggtgatt ttaataatgg attagcttgc 3120
tggaatgtaa aagggcatgt agatgtacaa cagagccatc accgttctgt ccttgttatc 3180
ccagaatggg aagcagaagt gtcacaagca gttcgcgtct gtccggggcg tggctatatc 3240
ctccgtgtca cagcttacaa agagggatat ggagagggtt gtgtaactat ccatgaaatc 3300
gataacaata cagacgaact aaaatttaaa aactgtgaag aagaggaagt gtatccaacg 3360
gatacaggaa cgtgtaatga ttatactgca caccaaggta cagcaggatg cgcagatgca 3420
tgtaattccc gtaatgttgg atatgaggat gtatatgaaa tgaatactac agcatctgtt 3480
aattacaaac cgacttatga agaagaaatg tatacagatg tacgaagaga taatcattgt 3540
gaatatgaca gagggtatgt gaattatcca ccagtaccag ctggttatgt gacaaaagaa 3600
ttagaatact tccctgaaac agatacagta tggattgaga ttggagaaac agaagggaag 3660
tttattgtag acagcgtgga attactcctc atggaagaat ag 3702
<210> 16 <211> 1233 <212> БЕЛОК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 16
Met Thr Ser Asn Arg Lys Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Ala Val Ser Asn His Ser Ala Gln Met Asp Leu Ser Pro Asp
20 25 30
Ala Arg Ile Glu Asp Ser Leu Cys Ile Ala Glu Gly Asn Asn Ile Asn
35 40 45
Pro Leu Val Ser Ala Ser Thr Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ala Gly
50 55 60
Arg Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Ala Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Phe Ile Val Gly Glu Leu Trp Pro Ser Gly Arg Asp Pro
85 90 95
Trp Glu Ile Phe Leu Glu His Val Glu Gln Leu Val Arg Gln Gln Ile
100 105 110
Thr Glu Asn Ala Arg Asn Thr Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly
115 120 125
Ala Ser Phe Arg Ala Tyr Gln Gln Ser Leu Glu Asp Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Arg Asp Asp Ala Arg Thr Arg Ser Val Leu Tyr Thr Gln Tyr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Glu Leu Asp Phe Leu Asn Ala Met Pro Leu Phe Ala Ile Asn Asn
165 170 175
Gln Gln Val Pro Leu Leu Met Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Leu Phe Gly Ser Glu Phe Gly Leu
195 200 205
Thr Ser Gln Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Glu Arg Gln Ala Glu Lys Thr
210 215 220
Arg Glu Tyr Ser Asp Tyr Cys Ala Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Leu Arg Tyr Asn Gln Phe
245 250 255
Arg Arg Asp Leu Thr Leu Gly Val Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro
260 265 270
Ser Tyr Asp Thr Arg Ile Tyr Pro Ile Asn Thr Ser Ala Gln Leu Thr
275 280 285
Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Arg Thr Asn Ala Pro Ser Gly
290 295 300
Phe Ala Ser Thr Asn Trp Phe Asn Asn Asn Ala Pro Ser Phe Ser Ala
305 310 315 320
Ile Glu Ala Ala Val Ile Arg Pro Pro His Leu Leu Asp Phe Pro Glu
325 330 335
Gln Leu Thr Ile Phe Ser Val Leu Ser Arg Trp Ser Asn Thr Gln Tyr
340 345 350
Met Asn Tyr Trp Val Gly His Arg Leu Glu Ser Arg Thr Ile Arg Gly
355 360 365
Ser Leu Ser Thr Ser Thr His Gly Asn Thr Asn Thr Ser Ile Asn Pro
370 375 380
Val Thr Leu Gln Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg Thr Glu Ser Tyr
385 390 395 400
Ala Gly Ile Asn Ile Leu Leu Thr Thr Pro Val Asn Gly Val Pro Trp
405 410 415
Ala Arg Phe Asn Trp Arg Asn Pro Leu Asn Ser Leu Arg Gly Ser Leu
420 425 430
Leu Tyr Thr Ile Gly Tyr Thr Gly Val Gly Thr Gln Leu Phe Asp Ser
435 440 445
Glu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Glu Arg Pro Asn Tyr Glu Ser
450 455 460
Tyr Ser His Arg Leu Ser Asn Ile Arg Leu Ile Ser Gly Asn Thr Leu
465 470 475 480
Arg Ala Pro Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Asp Arg Thr Asn
485 490 495
Thr Ile Ala Thr Asn Ile Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn
500 505 510
Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly
515 520 525
Asp Leu Val Arg Leu Asn Asn Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly
530 535 540
Tyr Leu Glu Val Pro Ile Gln Phe Ile Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg
545 550 555 560
Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile Gln Leu Ser Val Asn
565 570 575
Trp Gly Asn Ser Asn Ile Phe Ser Ser Ile Val Pro Ala Thr Ala Thr
580 585 590
Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Arg Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Thr
595 600 605
Asn Ala Phe Thr Ser Ala Thr Gly Asn Val Val Gly Val Arg Asn Phe
610 615 620
Ser Glu Asn Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val
625 630 635 640
Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Glu Ala
645 650 655
Val Asn Ala Leu Phe Thr Asn Thr Asn Pro Arg Arg Leu Lys Thr Asp
660 665 670
Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu
675 680 685
Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Leu Glu Lys Val
690 695 700
Lys Tyr Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro
705 710 715 720
Asn Phe Thr Ser Ile Asn Lys Gln Pro Asp Phe Ile Ser Thr Asn Glu
725 730 735
Gln Ser Asn Phe Thr Ser Ile His Glu Gln Ser Glu His Gly Trp Trp
740 745 750
Gly Ser Glu Asn Ile Thr Ile Gln Glu Gly Asn Glu Val Phe Lys Glu
755 760 765
Asn Phe Phe Thr Leu Pro Gly Thr Leu Asn Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr
770 775 780
Leu Tyr Gln Lys Ile Gly Glu Ser Glu Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr
785 790 795 800
Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu
805 810 815
Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Leu Asp Val Pro Gly Thr Glu
820 825 830
Ser Val Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro Ile Gly Arg Cys Gly Glu
835 840 845
Pro Asn Arg Cys Val Pro His Ile Glu Trp Asn Pro Asn Leu Asp Cys
850 855 860
Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser
865 870 875 880
Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Ile Asp Leu Gln Glu Asn Leu Gly Val
885 890 895
Trp Val Val Phe Lys Ile Lys Thr Gln Glu Gly His Ala Arg Leu Gly
900 905 910
Asn Leu Glu Phe Ile Glu Glu Lys Pro Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ser
915 920 925
Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu
930 935 940
Gln Leu Glu Thr Lys Arg Val Tyr Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Gly
945 950 955 960
Ala Leu Phe Val Asp Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn
965 970 975
Ile Gly Met Ile His Ala Ala Asp Lys Leu Val His Arg Ile Arg Glu
980 985 990
Ala Tyr Leu Ser Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Glu Ile
995 1000 1005
Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ile Thr Ala Ile Ser Leu Tyr
1010 1015 1020
Asp Ala Arg Asn Val Val Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu
1025 1030 1035
Ala Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Gln Gln Ser His
1040
1045
1050
His
Arg 1055
Ser
Val
Leu
Val
Ile 1060
Pro
Glu
Trp
Glu
Ala 1065
Glu
Val
Ser
Gln
Ala 1070
Val
Arg
Val
Cys
Pro 1075
Gly
Arg
Gly
Tyr
Ile 1080
Leu
Arg
Val
Thr
Ala 1085
Tyr
Lys
Glu
Gly
Tyr 1090
Gly
Glu
Gly
Cys
Val 1095
Thr
Ile
His
Glu
Ile 1100
Asp
Asn
Asn
Thr
Asp
1105
Glu
Leu
Lys
Phe
Lys
1110
Asn
Cys
Glu
Glu
Glu 1115
Glu
Val
Tyr
Pro
Thr 1120
Asp
Thr
Gly
Thr
Cys 1125
Asn
Asp
Tyr
Thr
Ala 1130
His
Gln
Gly
Thr
Ala 1135
Gly
Cys
Ala
Asp
Ala 1140
Cys
Asn
Ser
Arg
Asn 1145
Val
Gly
Tyr
Glu
Asp
1150
Val
Tyr
Glu
Met
Asn 1155
Thr
Thr
Ala
Ser
Val 1160
Asn
Tyr
Lys
Pro
Thr 1165
Tyr
Glu
Glu
Glu
Met 1170
Tyr
Thr
Asp
Val
Arg 1175
Arg
Asp
Asn
His
Cys 1180
Glu
Tyr
Asp
Arg
Gly 1185
Tyr
Val
Asn
Tyr
Pro 1190
Pro
Val
Pro
Ala
Gly 1195
Tyr
Val
Thr
Lys
Glu 1200
Leu
Glu
Tyr
Phe
Pro 1205
Glu
Thr
Asp
Thr
Val 1210
Trp
Ile
Glu
Ile
Gly 1215
Glu
Thr
Glu
Gly
Lys
1220
Phe
Ile
Val
Asp
Ser 1225
Val
Glu
Leu
Leu
Leu
1230
Met
Glu
Glu
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая инсектицидный полипептид, выбранная из группы, состоящей из:
(a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины;
(b) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14;
(c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и
(d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит синтетическую нуклеотидную последовательность, включающую кодоны, способные экс-прессировать в растении.
3. ДНК-конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 и гетерологичный регуля-торный элемент, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты.
4. Клетка-хозяин, содержащая ДНК-конструкцию по п.3.
5. Клетка-хозяин по п.4, где клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.
6. Клетка-хозяин по п.4, где клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.
7. Трансгенное растение, устойчивое к насекомым-вредителям, содержащее клетку-хозяина по п.6.
8. Трансгенное растение по п.7, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из маиса, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томата, крестоцветных, разновидностей перца, картофеля, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.
9. Семя растения, содержащее ДНК-конструкцию по п.3.
10. Выделенный инсектицидный полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, со-
стоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и
SEQ ID NO: 14;
(b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоя-
щей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ
ID NO: 13;
(c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и
(d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.
11. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид по п.10.
12. Композиция по п.11, содержащая от 1 до 99 вес.% указанного полипептида.
13. Способ контроля популяции чешуекрылого или жесткокрылого вредителя, предусматривающий контакт указанной популяции с эффективным количеством полипептида по п.10.
14. Способ уничтожения чешуекрылого вредителя, предусматривающий обеспечение указанному вредителю эффективного количества полипептида по п.10.
15. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.4 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, и получение указанного полипептида, который выбран из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и
SEQ ID NO: 14;
(b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ
ID NO: 13;
(c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и
(d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.
16. Растение или растительная клетка со стабильно встроенной в их геном ДНК-конструкцией, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, обладающий инсектицидной активностью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:
(a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины;
(b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14;
(c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и
(d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14,
где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который управляет экспрессией, кодирующей последовательности в растительной клетке.
17. Способ получения трансгенного растения или растительной клетки, устойчивых к вредителю, предусматривающий введение в указанные растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:
(a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины;
(b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14;
(c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и
(d) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.
18. Способ защиты растения от вредителя, предусматривающий введение в указанное растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) молекулы нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 или комплементарной ей последовательности полной длины;
(b) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14;
(c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14; и
(d) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.
19. Способ по п.18, где полипептид обладает инсектицидной активностью в отношении чешуекрылого вредителя.
20. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, способная кодировать инсектицидный полипептид и выбранная из группы, состоящей из:
(a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 15 или комплементарную ей последовательность полной длины;
(b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16;
(c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16; и
(d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.
21. ДНК-конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.20 и гетерологичный регу-ляторный элемент, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты.
22. Трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию по п.21.
23. Семя растения, содержащее ДНК-конструкцию по п.21.
24. Выделенный инсектицидный полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16;
(b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 15;
(c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной полипептиду с SEQ
ID NO: 16; и
(d) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной полипептидной последовательности с SEQ ID NO: 16.
25. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид по п.24.
26. Способ уничтожения или контроля популяции чешуекрылого или жесткокрылого вредителя, предусматривающий контакт указанной популяции с пестицидно эффективным количеством полипептида по п.23.
27. Способ получения трансгенного растения или растительной клетки, устойчивых к вредителю, предусматривающий введение в указанные растение или растительную клетку вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:
15;
(b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16;
(c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16; и
(d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 16.
28. Способ защиты растения от вредителя, предусматривающий обеспечение вредителю растения
28.
или растительной клетки, содержащих вектор экспрессии, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.20.
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(47)
SEQ
(51)
SEQ
(47)
SEQ
(21)
SEQ
(47)
SEQ
(47)
SEQ
(50)
SEQ
(97)
SEQ
(101)
SEQ
(97)
SEQ
(71)
SEQ
(97)
SEQ
(97)
SEQ
(94)
SEQ
(146)
SEQ
(150)
SEQ
(146)
SEQ
(120)
SEQ
(146)
SEQ
(146)
SEQ
(144)
SEQ
(196)
SEQ
(200)
SEQ
(196)
SEQ
(170)
SEQ
(196)
SEQ
(196)
SEQ
(194)
1 50
-MTSNRKNENEIINALSIPAVSNHSAQMDLSPDAR IEDSLCIAEGNN
MKLKNQDKHQSFSSHAKVDKISTDSLKNE7DIELQNINHEDCLKMSEYEN
~MTSNRKNENEIINALSIPAVSNHSAQMDLStDAR IEDSLCIAEGNN
MNL S PDAR IEDSLCVAEVNN
-MTSNRKNENEIINALSIPAVSNHSAQMDLStDAR IEDSLCIAEGNN
-MTSNRKNENEIINALSIPAVSNHSAQMDLSPDAR IEDSLCIAEGNN
M3ELKGNPKKSTNRTCCLLKIINIGGRGMNSKEHDYLKVCNDLSDAN-IN
51 100
IDPFVSASTVQTGINIAGRILGVLGVPFAGQLASFYSFLVGELWPSGRDP
VEPFVSASTIQTGIGIAGKILGTLGVPFAGQVASLYSFILGELWPKGKNQ
INPLVSASTVQTGINIAGRILGVLGVPFAGQLASFYSFLVGELWPSGRDP
IDPFVSASTVQ.TGINIAGRILGVLGVPFAGQLASFYSFLVGELWPSGRDP
INFLVSASTVQTGINIAGRILGVLGVFFAGQLASFYSFLVGELWFRGRDO.
INPLVSASTVQTGINIAGRILGVLGVPFAGQLASFYSFIVGELWPSGRDP
MERFDKNDALEIGMSIVSELIGMI PG~GTAI, <3FVFNQLWSRI.GD:S
101 150 -WEIFMEHVEQLVRQQITDSVRDTAIARLEGLGRGYRSYQQALETWLDNR -WEIFMEHVEEIINQKISTYARNKALTDLKGLGDALAVYHDSLESWVGNR -WEIFLEHVEQLIRQQ^TEN$RNTA?ARLEGLGRGYRSYQQALETWI.DNR -WEIFLEHVEQLIRQQVTENTRNTAIARLEGLGRGYRSYQQALETWLDNR -WEIFLEHVEQLINQQITENARNTALARLQGLGDSFRAYQQSLEDWLENR -WEIFLEHVEQLVRQQITENARNTALARLQGLGASFRAYQQSLEDWLENR GWWAFMEHVEELIDTKIEGYAKNKALSELAGIQRNLETYIQLRNEWENDI
151 200 NDARSRSIILERYIALELDITTAIPLF$IRNQEVPLLMVYAQAANLHLLL NNTRARSWKSQYIALELMFVQKLP SFAVSGEEVPLLPIYAQAANLHLLL NDARSRSIILERYVALELDITTAIPLFRIRNEEVPLLMVYAQAANLHLLL NDARSRSIILERYVALELDITTAIPLFRIRNEEVPLLMVYAQAANLHLLL DDARTRSVLYIQYIALELDFLNAMPLFAIRNQEVPLLI4VYAQAANLHLLL DDARTRSVLYTQYIALELDFLNAMPLFAINNQQVPLLMVYAQAANLHLLL ENSKAQGKVANYYESLEQAVERSMPQFAVGNFEVPLLTVYVQAANLHLLL
201 250 LRDASLFGSEWGMSSADVNQYYQEQIRYTEEYSNHCVQWYNTGLNNLR- LRDASIFGKEWGLS3SEISTFYNRQVERAGDYSDHCVKWYSTGLNNLR- LRDASLFGSEWGMASSDVNQYYQEQIRYTEEYSNHCVQWYNTGLNNLR- LRDASLFGSEWGMASSDVNQYYQEQIRYTEEYSNHCVQHYNTGLNNLR- LRDASLFGSEFGLTSQEIQRYYERQVERTRDYSDYCVEWYNTGLNSLR- LRDASLFGSEFGLTSQEIQRYYERQAEKTREYSDYCARWYNTGLNNLR- LRDVSVYGKRWGWSEQKIKIYYDKQIKYTHEYTNHCVNWYNKGLERLKNK
Фиг. 1
SEQ
(244)
SEQ
(248)
SEQ
(244)
SEQ
(218)
SEQ
(244)
SEQ
(244)
SEQ
(244)
SEQ
(294)
SEQ
(298)
SEQ
(294)
SEQ
(268)
SEQ
(294)
SEQ
(294)
SEQ
(294)
SEQ
(342)
SEQ
(348)
SEQ
(344)
SEQ
(318)
SEQ
(344)
SEQ
(344)
SEQ
(336)
SEQ
(391)
SEQ
(397)
SEQ
(394)
SEQ
(368)
SEQ
(393)
SEQ
(393)
SEQ
(384)
SEQ
(441)
SEQ
(447)
SEQ
(442)
SEQ
(416)
SEQ
(440)
SEQ
(440)
SEQ
(431)
251 300 GTNAESWVRYNQFRRDLTLGVLDLVALFP SYDTRTYPINTSAQLTREVYT GTNAE S WVR YNQFRRDMTLMVLD LVALFP SYDTQMYPIKTTAQLTREVYT GTNAESWLRYNQFRRDLTLGVLDLVALFP SYDTRTYP INTSAQLTREIYT GTNAESWLRYNQFRRDLTLGVLDLVALFP SYDTRTYP INTSAQLTREIYT GTNAASWVRYNQFRRDLTLGVLDLVALFP SYDTRTYP INTSAQLTREVYT GTNAESWLRYNQFRRDLTLGVLDLVALFP SYDTRIYP INTSAQLTREIYT GSSYQDWYNYNRFRREMTLTVLDIVALFPHYDVQTYPITTVAQLTREVYT
301 350
DAIGATGVN-MANMNWYNNNAPSFSAIEAAVIRSPHLLDFLEQLTIFSA
DAIGTVHPHPSFTSTTWYNNNAPSFSAIEAAAIRSPHLLDFLEQLTIFSA
DPIGRTNAPSGFASTNWFNNNAPSFSAIEAAIFRPPHLLDFPEQLTIYSA
DPIGRTNAPSGFASTNHFNNNAPSFSAIEAAIFRPPHLLDFPEQLTIYSA
DAIGTVHPHQAFASTTWYNNNAPSLSAIEAAVIRSPHLLDFPEQLTIYST
DPIGRTNAPSGFASTNWFNNNAPSFSAIEAAVIRPPHLLDFPEQLTIFSV
DPLLNFNPK LHSVS-QLPSFSDMENATIRTPHLMEFLRMLTIY-
351 400 SSRWSNTRHMTYWRGHriQSRPIGGGLNTSTYGSTN-TSINPVTLRFTSR SSRWSNTRiJMTYWRGHTliQSRPIGGGLNTSTHGATN-TSINPVTLRFftSR
SSRWSSTQH(tm)YWVGHRLNFRPIGGTLNTSTC^3LTNNTSINPVTLQFTSR SSRWSSTQHMNYWVGHRLNFRPIGGTLNTSTQGLTTNFTSINPVTLQFTSR LSRWSNTQYMNIWVGHRLESRTIGGSLNTSTQGSTN-TSINPVRLQFTAR LSRWSNTQYMNYWVGHRLESRTIRGSLSTSTHGNTN-TSINPVTLQFTSR -TDWYSVGRNYYWGGHRVTSYHVGGENIRSPLYGREANQEVPRDFYFYG-
401 450 DVYRTESWAGVLLWGIYLEPIHGVPTVRFNFTNPQNIYDRGTANYSQPYE DVYRTESYAGVLL^GIYLEPIHGVPTArRFNFTNPQNISDRGTANYSQPYE DVYRTESNAGTNIL-FTTPVNGVP WARFNFINPQNIYERGATTYSQP YQ DVYRTESNAGTNIL-FTTPVNGVP WARFNF INPQNI YERGATTYSQP YQ DVYRTESLAGLNIF-LTQPVNGVPWVRFNWRNPLNSLR-GSLLYTIGYT DVYRTESYAGINIL-LTTPVNGVPWARFNWRNPLNSLR-GSLLYTIGYT PVFKTLSKPTLRP L-Q-QPAPAPPFNLRSLEGVEFHTP TGSFMYRERGS
451 500
SPGLQLKDSETELPPETTERPNYESYSHRLSHIGIILQS RVNVPVY
SPGLQLKDSETELPPETTERPNYESYSHRLSHIGIILQS RVNyPVY
GVGiQLFDSETELPPETTERPNYESYSHRLSHIGLIIGN TLRAPVY
GVGiQLFJJSETELPPETTERPNYESYSHRLSHIGLIIGN TLRAPVY
GVGTQLQDSETELPPETTERPNYESYSHRLSHIGLISSS HVRALVY
GVGTQLFDSETELPPETTERPNYESYSHRLSNIRLISGN: TLRAPVY
. VDSFNELPPFNPVGLPHKVYSHRLCHATFVRKSGTPYLTTGAIF
Фиг. 2
SEQ
(487)
SEQ
(493)
SEQ
(488)
SEQ
(462)
SEQ
(486)
SEQ
(486)
SEQ
(475)
SEQ
(537)
SEQ
(543)
SEQ
(538)
SEQ
(512)
SEQ
(536)
SEQ
(535)
SEQ
(525)
SEQ
(582)
SEQ
(588)
SEQ
(583)
SEQ
(557)
SEQ
(581)
SEQ
(585)
SEQ
(570)
SEQ
(632)
SEQ
(638)
SEQ
N0:10
(633)
SEQ
(607)
SEQ
(630)
SEQ
(632)
SEQ
(620)
SEQ
(658)
SEQ
(688)
SEQ
(641)
SEQ
(657)
SEQ
(663)
SEQ
(682)
SEQ
(630)
501 550 SWTHRSADRTNTIGPNRITQIPMVKASELPQGTTVVRGPGFTGGDILRRT SWTHRSADRTNTIGPNRITQIPMVKASELPQGTTVVRGPGFTGGDILRRT SWTHRSATNTNTINPDIITQIPLVKGFRLGGGTSVIKGPGFTGGDILRRN SWTHRSADRTNTIGPNRITQIPMVKASELPQGTTVVRGPGFTGGDILRRT SWTHRSADRTNTIGPNRITQIPbVKALNLHSGATVVRGPGFTGGDILRRT SWTHRSADRTNTIATNIITQIPAVKGNFLFNGSVIS-GPGFTGGDLVRLN SWTHRSAEETNTIESNIITQIPLVKAYQIGSGTTVRKGPGFTGGDILRRT
551 600
NTGGFGPIRVTVNGPLT QRYRIGFRYASTVDFDFFVSRGGTTVNN
NTGGFGPIRVTVNGPLT QRYRIGFRYASTVDFDFFVSRGGTTVNN
TIGEFVSLQVNINSPIT QRYRLRFRYAS SRDARITVAIGGQIRVD
NTGGFGPIRVTVNGPLT QRYRIGFRYASTVDFDFFVSRGGTTVNN
NTGTFGDIRLNINVPLS QRYRVRIRYASTTDLQFFTRINGTTVNI
NSGNNIQjqRGYLEVPIQF.IST.STRYRVRVRYASVTP.IQLSVNWGNSNIFS
GPGTFGDMRININAPLS QRYRVRIRYASTTDLQFVTSINGTTINI
601 650 FRFLRTMNSGDELKYGNFVRRAFTTPFTFTQIQDIIRTSIQGLSGNGEVY FRFLRTMNSGDELKYGNFVRRAFTTPFTFTQIQDIIRTSIQGLSGNGEVY MTLEKTMEIGESLTSRTFSYTNFSNPFSFRANPDIIRIAEELPIRGGELY FRFLRTMNSGDELKYGNFVRRAFTTPFTFTQIQD I IRTS IQGLSGNGEVY ANFSRTMNRGDNLESRSFRTAGFSTPFNFSNAQSTFTLGAQSFSNQE-VY SIVPATATSLDNLQS R--DFGYFE S TNAFTSATGNWGVRNF SENAGVI GNFPKTINNLNTLGSEGYRTVSFSTPFSFSNAQSIFRLGIQAFSGVQEVY
651 700
IDKIEIIPVTATFEAEYDLERAQEAV
IDKIEIIPVTATFEAEYDLERAQEAVNALFTNTNP RRLKTDVTDYHIDQV
IDKIELIL
I DKIE 11 PVTATFEAE YDLERAQE AVNALFTNTNP RRLKTDVTD YH I DQV
IDRVEFVPAEVTFEAEYDLERAQEAVNALFTNT
IDRFEFI PVTATFEAE YDLERAQE AVNALFTNTNP RRLKTDVTD YH I DQV
VDKIEFIPVE
701 750
SN
SNLVACLSDEFCLDEKRELLEKVKYAKRLSDERNLLQDPNFTSINKQPDF
SNLVACLSDEFCLDEKRELLEKVKYAKRLSDERNLLQDPNFTSINKQPDF
Фиг. 3
751 800
SEQ ID N0:14 (658)
SEQ ID N0:6 (690)
SEQ ID NO:10 (641)
SEQ ID N0:3 (707) ISTNEQSNFTSIHEQSEHGWWGSENITIQEGNDVFKENYVTLPGTFNECY
SEQ ID NO:12 (663)
SEQ ID N0:2 (732) ISTNEQSN
SEQ ID N0:4 (630)
801 850
SEQ ID N0:14 (658)
SEQ ID N0:6 (690)
SEQ ID N0:10 (641)
SEQ ID N0:8 (757) PTYLYQKIGESELKAYTRYQLRGYIEDSQDLEIYLIRYNAKHETLDVPGT
SEQ ID N0:12 (663)
SEQ ID N0:2 (740)
SEQ ID N0:4 (630)
851 874
SEQ ID N0:14 (658)
SEQ ID N0:6 (690)
SEQ ID N0:10 (641)
SEQ ID N0:8 (807) ESLWPLSVESPIGRCGEPNRCAPH
SEQ ID N0:12 (663)
SEQ ID N0:2 (740)
SEQ ID N0:4 (630)
Фиг. 4
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032560
- 1 -
(19)
032560
- 1 -
(19)
032560
- 1 -
(19)
032560
- 1 -
(19)
032560
- 1 -
(19)
032560
- 1 -
(19)
032560
- 9 -
032560
- 31 -
032560
- 38 -
032560
- 58 -
032560
- 59 -
032560
- 60 -
032560
- 61 -
032560
- 69 -
032560
- 71 -
032560
- 74 -