|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ сепарации спорадических циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) или распространяющихся опухолевых клеток (РОК), циркулирующих эндометриальных клеток и циркулирующих фетальных трофобластных клеток (ЦФТК), присутствующих в органической жидкости пациента, без химического или механического их изменения с обеспечением возможности их последующей эффективной культивации, включающий следующие шаги: предоставление фильтрационной мембраны, имеющей первую и вторую стороны, при этом отверстия мембраны меньше диаметра спорадических клеток, предоставление абсорбентного материала и размещение его в плотном контакте со второй стороной указанной фильтрационной мембраны, обеспечение прохождения органической жидкости со спорадическими клетками через первую сторону фильтрационной мембраны таким образом, что органическая жидкость, проходя через фильтрационную мембрану за счет капиллярной силы в абсорбентный материал, освобождается от спорадических клеток, получение указанных спорадических клеток, захваченных на мембране, при этом спорадические клетки остаются механически и химически неизменными и поэтому живыми, что позволяет проводить их последующую эффективную культивацию. 2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что органическую жидкость предварительно отбирают из периферической или центральной крови, костного мозга, асцитных жидкостей, плеврального выпота, перитонеальной жидкости лаважа, бронхоальвеолярного лаважа и околоплодной жидкости. 3. Способ по пп.1, 2, характеризующийся тем, что указанная органическая жидкость - это органическая жидкость пациентов с меланомой, раком груди, опухолью желудочно-кишечного тракта, такой как карцинома желудка, карцинома кишечника, карцинома поджелудочной железы и карцинома печени; урогенитальными опухолями и опухолями мягких тканей, такими как головные и шейные опухоли и другие плотные опухоли. 4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что периферическая кровь отбирается как антикоагулированная периферическая кровь. 5. Способ по пп.1-4, характеризующийся тем, что после сепарации осуществляют определение, и/или количественное определение, и/или культивирование спорадических клеток, выделенных на фильтрационной мембране, или клеток, смытых с фильтрационной мембраны в сосуд для культивирования. 6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что предварительно до сепарации органическую жидкость разбавляют питательной средой, в частности средой для культур клеток и тканей (RPMI), для повышения успешности последующей культивации. 7. Аппарат для реализации способа по п.1, характеризующийся тем, что он включает в себя открытый сверху и снизу полый резервуар (3) для приема смеси спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости, при этом нижняя часть резервуара (3) находится в плотном контакте по крайней мере с частью первой стороны фильтрационной мембраны (1), диаметр пор которой составляет 7-10 мкм, при этом она выполнена из биосовместимого материала, по крайней мере часть второй стороны мембраны (1) находится в плотном контакте с абсорбентным материалом (2), таким образом фильтрационная мембрана (1) отделяет внутреннее пространство резервуара (3) от указанного абсорбентного материала (2). 8. Аппарат по п.7, характеризующийся тем, что абсорбентный материал (2) размещен в накопительном базовом контейнере (4), снабженном верхней крышкой (5), причем к указанной крышке сверху с возможностью снятия закреплен периметрический держатель мембраны (6), который посредством прижимного кольца (7) плотно, с возможностью снятия удерживает мембрану (1) по ее окружности, при этом резервуар (3) плотно закреплен к держателю (6) по его периметру. 9. Аппарат по п.7 или 8, характеризующийся тем, что фильтрационная мембрана (1) имеет размер пор 8 мкм. 10. Аппарат по пп.7-9, характеризующийся тем, что фильтрационная мембрана (1) изготовлена из поликарбоната. 11. Аппарат по пп.7-10, характеризующийся тем, что абсорбентный материал (2) состоит из целлюлозы, тонкой бумаги, текстильного волокна или их комбинации.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ сепарации спорадических циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) или распространяющихся опухолевых клеток (РОК), циркулирующих эндометриальных клеток и циркулирующих фетальных трофобластных клеток (ЦФТК), присутствующих в органической жидкости пациента, без химического или механического их изменения с обеспечением возможности их последующей эффективной культивации, включающий следующие шаги: предоставление фильтрационной мембраны, имеющей первую и вторую стороны, при этом отверстия мембраны меньше диаметра спорадических клеток, предоставление абсорбентного материала и размещение его в плотном контакте со второй стороной указанной фильтрационной мембраны, обеспечение прохождения органической жидкости со спорадическими клетками через первую сторону фильтрационной мембраны таким образом, что органическая жидкость, проходя через фильтрационную мембрану за счет капиллярной силы в абсорбентный материал, освобождается от спорадических клеток, получение указанных спорадических клеток, захваченных на мембране, при этом спорадические клетки остаются механически и химически неизменными и поэтому живыми, что позволяет проводить их последующую эффективную культивацию. 2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что органическую жидкость предварительно отбирают из периферической или центральной крови, костного мозга, асцитных жидкостей, плеврального выпота, перитонеальной жидкости лаважа, бронхоальвеолярного лаважа и околоплодной жидкости. 3. Способ по пп.1, 2, характеризующийся тем, что указанная органическая жидкость - это органическая жидкость пациентов с меланомой, раком груди, опухолью желудочно-кишечного тракта, такой как карцинома желудка, карцинома кишечника, карцинома поджелудочной железы и карцинома печени; урогенитальными опухолями и опухолями мягких тканей, такими как головные и шейные опухоли и другие плотные опухоли. 4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что периферическая кровь отбирается как антикоагулированная периферическая кровь. 5. Способ по пп.1-4, характеризующийся тем, что после сепарации осуществляют определение, и/или количественное определение, и/или культивирование спорадических клеток, выделенных на фильтрационной мембране, или клеток, смытых с фильтрационной мембраны в сосуд для культивирования. 6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что предварительно до сепарации органическую жидкость разбавляют питательной средой, в частности средой для культур клеток и тканей (RPMI), для повышения успешности последующей культивации. 7. Аппарат для реализации способа по п.1, характеризующийся тем, что он включает в себя открытый сверху и снизу полый резервуар (3) для приема смеси спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости, при этом нижняя часть резервуара (3) находится в плотном контакте по крайней мере с частью первой стороны фильтрационной мембраны (1), диаметр пор которой составляет 7-10 мкм, при этом она выполнена из биосовместимого материала, по крайней мере часть второй стороны мембраны (1) находится в плотном контакте с абсорбентным материалом (2), таким образом фильтрационная мембрана (1) отделяет внутреннее пространство резервуара (3) от указанного абсорбентного материала (2). 8. Аппарат по п.7, характеризующийся тем, что абсорбентный материал (2) размещен в накопительном базовом контейнере (4), снабженном верхней крышкой (5), причем к указанной крышке сверху с возможностью снятия закреплен периметрический держатель мембраны (6), который посредством прижимного кольца (7) плотно, с возможностью снятия удерживает мембрану (1) по ее окружности, при этом резервуар (3) плотно закреплен к держателю (6) по его периметру. 9. Аппарат по п.7 или 8, характеризующийся тем, что фильтрационная мембрана (1) имеет размер пор 8 мкм. 10. Аппарат по пп.7-9, характеризующийся тем, что фильтрационная мембрана (1) изготовлена из поликарбоната. 11. Аппарат по пп.7-10, характеризующийся тем, что абсорбентный материал (2) состоит из целлюлозы, тонкой бумаги, текстильного волокна или их комбинации.
Евразийское 032557 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201592174
(22) Дата подачи заявки
2014.05.06 (51) Int. Cl. CI2M1/00 (2006.01) CI2N1/02 (2006.01)
(54) СПОСОБ СЕПАРАЦИИ СПОРАДИЧЕСКИХ КЛЕТОК ИЗ ОРГАНИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЕЙ И АППАРАТ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА
(31) 2013-456
(32) 2013.06.14
(33) CZ
(43) 2016.04.29
(86) PCT/CZ2014/000052
(87) WO 2014/198242 2014.12.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МЕТАСЕЛЛ, С.Р.О. (CZ)
(72) Изобретатель:
Бобек Владимир (CZ), Колостова Катарина (SK)
(74) Представитель:
Явкина Е.В. (RU)
(56) US-A1-2010324449 WO-A1-2006116327 WO-A2-2012057498 EP-A2-2634245 US-A-5114350
(57) Способ осторожного выделения живых спорадических клеток (редких клеток) из таких органических жидкостей, как кровь, злокачественные излияния (асциты, плевральный выпот), жидкости бронхоальвеолярного лаважа, жидкость перитонеального лаважа и околоплодная жидкость, в котором используется фильтрационная мембрана, установленная в плотном контакте с абсорбентным материалом. С помощью настоящего способа можно изолировать, например, циркулирующие опухолевые клетки и распространяющиеся опухолевые клетки, эндометриальные клетки и циркулирующие трофобластные клетки, тем самым позволяя осуществить дальнейшее выявление, количественное определение, исследование характеристик и в особенности культивирование клеток. Также раскрыт аппарат для реализации данного способа.
Область изобретения
Настоящим изобретением предлагается способ осторожного выделения живых спорадических клеток (редких клеток) из таких органических жидкостей, как кровь, злокачественные излияния (асциты, плевральный выпот), жидкости бронхоальвеолярного лаважа, жидкость перитонеального лаважа и околоплодная жидкость. С помощью настоящего способа можно изолировать, например, циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) и распространяющиеся опухолевые клетки (РОК), эндометриальные клетки и циркулирующие трофобластные клетки (ЦФТК, циркулирующие фетальные трофобластные клетки), тем самым позволяя осуществить дальнейшее выявление, количественное определение, исследование характеристик и в особенности культивирование клеток.
Справочная информация об изобретении
Метастатические поражения - самая частая причина смерти пациентов с карциномами (Бирхмайер, 1996 г.). Во время метастазирования опухолевые клетки отделяются от первичной опухоли и поступают в кровоток напрямую или через лимфатическую систему, мигрируя во вторичные органы и образуя метастатическое отложение. Выявление ЦОК у пациентов с метастатической карциномой указывает на неблагоприятный прогноз (Чжажо, 2011 г., Чжан, 2012 г., Ван, 2011 г.).
Несмотря на высокую клиническую важность, молекулярное исследование характеристик ЦОК до сих пор не проводилось. Это объясняется чрезвычайно низким содержанием ЦОК в клетках крови. ЦОК образуются в процессе эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), который характеризуется пониженной экспрессией эпителиальных маркеров и повышенной экспрессией мезенхимальных маркеров. Эти изменения способствуют повышению моторики, инвазии и не поддаются лечению (Тьери, 2002 г., Шук, 2003 г., Кристофори, 2006 г., Ехлингер, 2003 г.). ЦОК/РОК представляют собой популяцию опухолевых клеток, распространяющихся на отдаленные органы, создавая потенциал возникновения микро- и макро-метастатических очагов. Некоторые опухолевые клетки из первичных опухолей и/или ЦОК и РОК имеют свойства стволовых клеток (РСК, раковые стволовые клетки). Популяция раковых стволовых клеток имеет способность саморегенерироваться и не поддается лечению, что обусловливает неблагоприятный прогноз.
ЦОК/РСК имеют огромный потенциал при постановке диагноза, определении прогноза, мониторинге терапевтического воздействия на болезнь и риски (Мани, 2008 г.).
Раннее распространение опухоли в лимфатические узлы и кровь осуществляется циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), и распространяющимися раковыми клетками (РОК). ЦОК, согласно описаниям, также выявляются у пациентов после резекции первичной опухоли, просто из-за обработки первичной опухоли.
Выявление ЦОК является неоспоримым фактором прогнозирования рака. Выявление ЦОК может потенциально использоваться для диагностики или в качестве альтернативы инвазивных биопсий для раннего выявления метастатического распространения опухоли и для определения и мониторинга эффективности терапии у отдельных пациентов. Количество и характеристики ЦОК могут быть прогнозным фактором выживания или прогнозным фактором ответа на терапию. Длительное изучение характеристик ЦОК позволяет сделать более качественную оценку динамики физиологического ответа. Также изменения количества ЦОК относительно ранее зафиксированных количеств, установленные с помощью визуализации, указывают на то, что анализ ЦОК может быть более важным при оценке выживания, чем методы визуализации.
В общем случае имеются действительные сведения о негативном прогнозном значении ЦОК, выявляемых при метастатическом раке толстой и прямой кишки, раке простаты, раке яичников, раке груди. Также проводились исследования значения ЦОК при формировании венозной тромбоэмболии. У пациентов с метастатическим раком груди и с выявленными ЦОК (п> 1) в периферической крови наблюдалось до четырех раз выше число случаев тромбоза по сравнению с пациентами без ЦОК (Мего, 2009 г.). ЦОК, возможно, вовлечены в активацию коагуляции через экспрессию и выделение факторов ткани (Давила, 2008 г.). ЦОК присутствуют в крови в очень малом количестве, приблизительно одна клетка на десять миллиардов клеток крови (Пантель, 2001 г., Цигельшмидт, 2005 г.).
В современных технологиях используются различные способы выявления ЦОК: сепарация с помощью градиентной колонки, иммуно-магнитная сепарация, градиентная иммуно-магнитная сепарация. Эти способы специфические для клеток и более мягкие, чем способы фильтрации под давлением, но при связывании антитело взаимодействует с рецепторами и антигенами на клеточной мембране, и, таким образом, настоящие и живые ЦОК/РОК отобрать сложно.
Присутствие спорадических клеток может также выявляться косвенно с помощью ПЦР-ОТ, но этот подход часто ограничен в связи с низкой экспрессией опухолевых специфичных маркеров и неспецифичностью антигенов, типичных для ЦОК и РОК (Андреопулу, 2012 г.). Кроме того, была доказана высокая степень несоответствия экспрессии поверхностных антигенов между первичной опухолью и ЦОК/РОК, что предполагает высокую неточность при использовании этих маркеров при сепарации
ЦОК/РОК.
Учитывая, что выделенные спорадические клетки ЦОК в большинстве эпителиальных опухолей гораздо более крупные по размеру, чем клетки крови, один из эффективных способов сепарации ЦОК ос
нован на процессе фильтрации через фильтрационную мембрану, при котором выделенные клетки остаются на мембране и другие клетки проходят сквозь мембрану (Патерлини-Брешо и др., 2007 г., Вона, 2000 г.). Применение способа сепарации на основе размера ЦОК/РОК позволяет осуществить выявление и сепарацию ЦОК/РОК независимо от поверхностных антигенов и рецепторов, экспрессия которых варьирует с течением раковой болезни.
Способы фильтрации, которые использовались недавно, включают процесс фильтрации, ускоряемый с помощью давления или вакуума (Микулова, 2011 г.). Градиентная фильтрация, проводимая таким образом, осуществляется посредством изменения давления. Общий недостаток способов фильтрации заключается в том, что возникает скопление осадка и преципитации на фильтрационной мембране, что приводит к засорению фильтра, тем самым приводя к застреванию клеток крови в осадке. В результате осадок и клетки крови значительно ухудшают возможность оценить присутствие спорадических клеток на фильтре под микроскопом. Захваченные клетки крови могут быть частично удалены вымыванием, однако на фильтре остается осадок. По этой причине в фильтрующий аппарат приходится добавлять дополнительные антикоагулянтные агенты (не только в пробирку во время отбора крови). Главный недостаток, как и в большинстве других способов, заключается в повреждении живых клеток, из-за чего клетки обычно перестают делиться и их последующая культивация становится невозможной.
Все в настоящее время используемые способы также обладают другими недостатками, например в них требуется проводить анализ больших объемов крови, посвящать большую часть времени работе в лаборатории, длительной оценке (обработка проб занимает несколько часов) или использовать дорогое оборудование и реагенты и/или же таким способам не достает надежности, чувствительности, эффективности, специфичности и стандартности, которые необходимы в рутинных способах выявления ЦОК и
РОК.
Поэтому желательный способ сепарации клеток, в особенности спорадических клеток из органических жидкостей, должен быть воспроизводимым, позволяющим сделать хорошую оценку наличия спорадических клеток на фильтре под микроскопом, причем процесс не должен быть затратным по времени, оборудованию и рабочему персоналу, причем он должен быть недорогим даже при небольших количествах тестируемых проб и причем для него не требуются использование дорогих реагентов с ограниченным сроком годности. В процессе сепарации не должно возникать какого-либо взаимодействия с рецепторами и антигенами. Процесс должен быть осторожным в отношении клеток, позволяющим осуществить отбор живых клеток и настоящих ЦОК/РОК и использовать указанные клетки в последующих экспериментах ин витро и ин виво.
Кроме того, желательно получить легко изготавливаемое устройство для осуществления процесса изоляции воспроизводимым способом, которое будет доступно для большинства лабораторий, подходящее для стерильного обращения с потенциально патологическим материалом. Указанное устройство должно обеспечивать возможность последующего выявления, и/или количественного определения, и/или культивирования отделенных клеток на фильтрационной мембране и может быть исполнено в виде одноразового или многоразового варианта.
Сущность изобретения
Были устранены недостатки более ранних способов и был выполнен ряд требований с помощью способа сепарации спорадических клеток из органических жидкостей человека и животных в соответствии с настоящим изобретением, в котором используется фильтрационная мембрана, установленная в плотном контакте с абсорбентным материалом.
Было установлено, что в отличие от фильтрации с помощью давления/вакуума, во время фильтрации за счет капиллярной силы (капиллярности) сгущение протеинов из органических жидкостей, таких как кровь или плазма крови, возникает в минимальной степени, поэтому нет необходимости добавлять антикоагулянты к антикоагулянту (EDTA) в пробирку с пробой крови для нормального сбора крови. Если в органической жидкости уже присутствует сгусток, разведение малыми количествами буфера, например ФБР, является достаточным для предотвращения сгущения. Кроме того, фильтрующая мембрана не засоряется (в частности в начале фильтрации, что обычно происходит при фильтрации с помощью давления/вакуума), и сепарация становится более гладкой, быстрой и полной.
Меньшее количество осадка приводит к меньшему количеству клеток крови, таких как красные клетки крови, остающихся в указанном осадке, учитывая, что в основном сам осадок как таковой и клетки крови мешают выявлению спорадических клеток на фильтре. Очевидно, корректная оценка присутствия спорадических клеток критически важна. Время фильтрации можно довольно легко регулировать используемой площадью фильтрации, т.е. площадью мембранного фильтра и абсорбентного материала.
Кроме того, было установлено, что спорадические клетки, застрявшие на мембране, остаются механически и химически неизмененными и поэтому живыми, что позволяет проводить их последующую эффективную культивацию, которую невозможно реализовать с помощью других способов, с учетом перспективы текущих результатов.
Кроме того, было установлено, что для разведения органической жидкости или для ополаскивания спорадических клеток на фильтре соответственно можно напрямую использовать такую питательную среду как RPMI для повышения уровня успешности сепарации (и также культивации, если также постав
лена задача дальнейшего культивирования спорадических клеток), при том, что скорость сепарации на фильтрационной мембране, а также жизнеспособность клеток остаются неизменными.
Фильтруемая органическая жидкость без спорадических клеток проходит сквозь отверстия в фильтрационной мембране, а элементы, имеющие больший размер, чем отверстия в фильтрационной мембране, застревают (типичный размер клеток крови ниже 6 мкм, а спорадических клеток выше 10 мкм). Выделенные спорадические клетки откладываются из-за их размера на фильтрационной мембране, и затем мембрана может быть отделена от абсорбентного материала, оставаясь при этом зафиксированной в держателе. В другом исполнении мембрана может быть позже полностью изъята из держателя.
Течение органической жидкости без спорадических клеток сквозь мембрану постоянно ускоряется в связи с тем, что капиллярная сила засасывает жидкость в абсорбентный материал. Никакого дополнительного давления перед фильтром и никакого втягивающего давления (вакуума) после фильтра не применятся к фильтруемой органической жидкости во время фильтрации. Жидкость только засасывается за счет капиллярной силы без необходимости какого-либо регулирования на надлежащей скорости через фильтр в абсорбентный материал. (В этом контексте гидростатическое давление, оказываемое на фильтр высотою колонки с органической жидкостью, становится неважным.) Объем капиллярной силы приводит к постоянной фильтрации жидкости без какого-либо сгущения перед или на фильтрационной мембране, что часто наблюдается, например, в способах с использованием вакуума после фильтра или дополнительного давления перед фильтром.
Преимущество решения в соответствии с изобретением заключается в высокой эффективности застревания спорадических клеток даже с низкой концентрацией и ускорении процесса сепарации, таким образом, также ускорения выявления и повышения эффективности культивации. При использовании способа в соответствии с изобретением никакого взаимодействия спорадических клеток с рецепторами и антигенами не наблюдается, и, таким образом, возможно отобрать настоящие и живые ЦОК/РОК, которые могут затем использоваться в экспериментах ин витро, затем ин виво. Способ позволяет сохранять фильтруемые клетки в очень хорошем живом состоянии для последующего анализа. Не нужно никакого специального лабораторного оборудования. Способ позволяет обрабатывать относительно большие объемы крови или других органических жидкостей (например, 50 мл).
Соответственно настоящее изобретение обеспечивает способ сепарации спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости пациента, за счет их застревания на фильтрационной мембране, в которой отверстия меньше, чем диаметр клеток, причем из спорадических клеток, присутствующих в указанной органической жидкости, оказывающихся на первой стороне мембранного фильтра, органическая жидкость без спорадических клеток проходит через фильтрационную мембрану за счет капиллярной силы в абсорбентный материал, установленный в плотном контакте со второй стороной указанного мембранного фильтра.
Спорадическими клетками, которые присутствуют в органической жидкости, являются, например, циркулирующие опухолевые клетки, распространяющиеся опухолевые клетки, эндометриальные клетки и циркулирующие фетальные трофобластические клетки.
Органической жидкостью является любая жидкость, полученная напрямую (посредством сбора) или косвенно (с последующими обработками любого вида) из организма человека или животного. Она предпочтительно отбирается из группы центральной или периферической крови, костного мозга, асцит-ной жидкости, плеврального выпота, перитонеальной жидкости лаважа и околоплодной жидкости.
Объектом теста предпочтительно может быть пациент с первичным раком или метастатической болезнью.
Проба для теста может также быть успешно взята у животного, которое было одобрено в качестве экспериментальной метастатической модели.
В ином исполнении периферической кровью является антикоагулированная периферическая кровь, такая как кровь, отбираемая в обычную пробирку для сбора крови, включая антикоагулянты, такие как
EDTA.
Если органическая жидкость содержит осадок до сепарации, фильтруемая органическая жидкость предпочтительно разбавляется соответствующим буфером, например ФБР (физиологический солевой раствор с фосфатным буфером) и/или TrypLE(tm), чтобы растворить осадок и упростить фильтрацию/сепарацию.
Однако изобретение не исключает применение любых известных способов для предотвращения образования сгустков крови во время сбора крови. Примером является поэтапная загрузка и как вариант энзиматическое растворение (например, с помощью TrypLE(tm), Инвитроген), однако предпочтительно не применять растворение.
Чтобы улучшить фильтрацию в случае присутствия кровяных осадков, периферическая кровь может быть дополнительно разбавлена раствором ФБР или культивационной средой. Чтобы удалить кровяные осадки и прочие грубые примеси, кровь или другое, органические жидкости можно также отфильтровать через сито с размером пор, например, 0,1 мм, которые затем промываются несколько раз с использованием ФБР. После этого загружается остаточный объем крови. В конце пробирка для сбора крови
ополаскивается с использованием ФБР, объем которого отфильтровывается через сито.
Выделенные спорадические клетки могут затем быть промыты на фильтре для улучшения оценки на микроскопе, например таким буфером как ФБР или такой средой как RPMI. По сравнению с вакуумной фильтрацией способ в соответствии с изобретением обеспечивает значительные преимущества во всех отношениях.
Затем выделенные клетки могут быть дополнительно проанализированы, например на микроскопе, предпочтительно после иммуногистохимического или другого окрашивания, подсчитаны (например, на микроскопе, вручную или автоматически), или культивированы, или иным образом обработаны. В других исполнениях выявление, и/или количественное определение, и/или культивация отделенных клеток осуществляется после сепарации напрямую на фильтрационной мембране или в посуде с культурой.
Фильтры со спорадическими клетками могут храниться более длительный период замороженными, высушенными или зафиксированными применяемыми стандартными способами для дальнейшего анализа.
Как уже было указано, в особенности в случае когда планируется последующее культивирование спорадических клеток, органическая жидкость может быть разбавлена напрямую средой для культивирования, используемой в последующей культивации выделенных клеток, до сепарации, например средой RPMI, тем самым дополнительно повышая уровень успешности фильтрации и последующей культивации.
Последующая культивация спорадических клеток может осуществляться стандартным способом в инкубаторе при 37°С и 5% CO2 в стандартной посуде для выращивания или же в пластмассовой или стеклянной бутылке со смыванием клеток с фильтра. Для этой цели, например, фильтр ополаскивается с 2x1 мл среды RPMI, и среда с клетками переносится в 24-луночную тарелку, где клетки могут культивироваться напрямую на поверхности пластмассовой тарелки или на вставленном покровном стекле микроскопа. Культура на покровном стекле является предпочтительной, если требуется провести иммуноги-стохимический и иммунофлуоресцентный анализ клеток.
Культивация предпочтительно осуществляется вставкой фильтра, содержащего захваченные клетки, в питательную среду в посуде для выращивания или наливанием питательной среды в фильтр с захваченными клетками, вставленный в посуду для выращивания.
В другом предпочтительном исполнении культивация осуществляется переносом мембранного фильтра, установленного в держатель, описанный ниже, сразу после сепарации, например в 6-луночную тарелку с культурой с питательной средой, добавленной в каждую лунку. Затем клетки можно культивировать как стандартную тканевую культуру.
В одном исполнении изобретения органическая жидкость - это органическая жидкость пациентов с меланомой, раком груди, раковыми заболеваниями желудочно-кишечного тракта, такими как рак желудка, рак кишечника, рак поджелудочной железы и рак печени; урогенитальными опухолями, опухолями мягких тканей, такими как головные и шейные опухоли и другие плотные опухоли.
Способ и аппарат настоящего изобретения могут использоваться, например, для сепарации циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из периферической или центральной крови, опухолевых клеток желудочно-кишечного тракта (пищевод, желудок, толстые и тонкие кишки, печень, поджелудочная железа, желчный пузырь и желчный проток), опухолей урогенитальной системы (яичник, эндометрий, простата, мочевой пузырь, семенник), опухолей респираторной системы (легкое, средостение, верхние дыхательные пути), опухолей нейроэндокринной системы, костных опухолей, головных и шейных опухолей, опухолей в груди, метастатических опухолей без первичной локализации и других менее частых твердых опухолей.
Способ и аппарат в соответствии с настоящим изобретением может также использоваться для отдельных гематопоэтических болезней, нейроэндокринных опухолей, распространяющихся опухолевых клеток из асцитов, из плеврального выпота, из слюны, из лаважей (бронхоальвеолярные лаважи, лаважи брюшины и грудной полости, лаважи забрюшинного пространства и т. д.), для циркулирующих и распространяющихся эндометриальных клеток (из крови и из лаважей).
Важное применение также относится к сепарации циркулирующих фетальных трофобластных клеток (ЦФТК) из крови или амниоцентической жидкости, потому что ЦФТК присутствуют в периферической материнской крови с пятой недели беременности, и они не остаются в кровотоке после окончания беременности (Бианки и др., 1996 г.). Поэтому ЦФТК - это очень привлекательный источник ДНК/РНК, исследуемых с помощью неинвазивной пренатальной диагностики (ПНД-НИ). При сравнении тестов на основе ЦФТК и хориоцентеза 100% диагностическая чувствительность и специфичность были подтверждены в отношении тестирования на основе ЦФТК. Базовый признак, по которому клетки ЦФТК отличаются от клеток крови - это их размер (клетки ЦФТК достигают стандартного размера 10 мкм и более). В современных отчетах говорится, что у беременной женщины имеется 99% вероятность, что каждая клетка размером больше 15 мкм является клеткой эмбрионного происхождения, таким образом является ЦФТК (Муавия, 2012 г.). Благодаря новой методологии теперь стало возможным отделять воспроизводимым способом неповрежденные ЦФТК и использовать их для последующего анализа.
Выявление ЦОК и РОК может осуществляться на животных моделях опухоли, и ЦОК/ РОК можно
выявлять у лиц, которые имеют более одного типа опухоли.
После сепарации клетки могут быть обработаны иммуногистохимическими способами, а также одноклеточными способами для определения генной экспрессии.
В изобретении также предлагается аппарат для осуществления сепарации смеси спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости пациента с помощью способов, описанных выше, причем этот аппарат включает в себя фильтрационную мембрану, установленную в плотном контакте с абсор-бентным материалом.
Геометрия мембраны, как правило, определяет размер, форму и плотность пор мембраны. Эффективность мембранного фильтра может, таким образом, быть оптимизирована регулировкой размера, формы и плотности пор мембраны. Выбирается такая конструкция мембраны, которая позволяет задержать опухолевые и спорадические клетки, пропуская клетки крови. Фильтрующая мембрана - это предпочтительно такая мембрана, которая задерживает спорадические клетки с размерами выше 10 мкм и пропускает элементы крови размером до 6 мкм, т. е. мембрана с размером пор 7-10 мкм, например 8 мкм или с близким значением, например в пределах ± 1 мкм, по заявлению производителя.
Фильтрующая мембрана предпочтительно изготовляется из такого биосовместимого материала, как поликарбонат, который обладает преимуществами гибкости и биосовместимости.
Минимизация эффектов сгущения и повышение скорости фильтрации могут быть дополнительно достигнуты с помощью более крупного фильтра с большей фильтрующей поверхностью. Например, можно использовать поликарбонатные мембраны с порами размером 8 мкм с диаметром мембраны 25 мм.
Термин "плотный контакт" означает такой плотный контакт мембранного фильтра и абсорбентного материала, который не влияет на капиллярное прохождение сквозь мембрану в абсорбентный материал, а именно во время операции предотвращается доступ воздуха в зону соприкосновения между мембраной и абсорбентным материалом, который прямо контактирует с фильтруемой жидкостью только через поры в мембране. Это может быть достигнуто, например, прижимом краев мембраны, или креплением мембраны в подходящем аппарате к поверхности абсорбентного материала, или прижимом краев мембраны, установленной в подходящий держатель под легким давлением к гибкой поверхности абсорбентного материала.
Абсорбентный материал имеет достаточную абсорбентную способность и способен беспрепятственно поглотить все элементы крови и другие элементы, которые присутствуют в органической жидкости различной вязкости, и абсорбент в основном состоит из волокнистого материала, тонкой бумаги, текстильного волокна или их комбинации, в частности.
Объем фильтруемой органической жидкости ограничен всасывающей способностью абсорбентного материала и его объемом. Следовательно, размер и/или объем аппарата и характеристики абсорбентного материала могут адаптироваться в зависимости от применения. Преимущественно с помощью одного аппарата можно отфильтровать объем 50 мл и более. Этот способ и аппарат работают даже при таком минимальном объеме крови, как менее 1 мл, однако с повышением объема фильтруемой органической жидкости вероятность застревания спорадических клеток повышается.
Аппарат в соответствии с изобретением предпочтительно также включает в себя верхний и нижний открытый полый контейнер для приема смеси спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости, причем нижняя периферия контейнера находится в плотном контакте по крайней мере с частью верхней первой стороны мембраны, и по крайней мере часть нижней второй стороны мембраны находится в плотном контакте с абсорбентным материалом, таким образом мембрана отделяет внутреннее пространство контейнера от указанного абсорбентного материала. Верхний край контейнера предпочтительно может быть расширен, чтобы образовать воронку и/или указанный край может быть снабжен ситом для удаления сгустков, которые уже присутствуют в крови, и т.д.
По вышеописанной причине для достижения максимальной площади фильтрации по крайней мере часть первой стороны мембраны и по крайней мере часть второй стороны мембраны располагаются друг против друга с наибольшей площадью, тем самым максимизируя контактную площадь между абсор-бентным материалом и спорадическими клетками, присутствующими в органической жидкости, отделенных с помощью мембраны.
В ином исполнении абсорбентный материал устанавливается в накопительный базовый контейнер, снабженный верхней крышкой, причем к этой крышке сверху крепится периферийный держатель мембраны с возможностью снятия и причем указанный держатель посредством прижимного кольца плотно, с возможностью снятия удерживает мембрану по ее окружности, и причем к резервуару сверху плотно крепится держатель по периметру указанного держателя. Аппарат предпочтительно предназначен для однократного использования, но ни исполнение аппарата, ни прочие элементы, за исключением мембраны и абсорбентного материала, не исключаются из повторного использования.
Описание иллюстраций
На фиг. 1 показано одно исполнение фильтрующего аппарата в двух ракурсах.
На фиг. 2 показано исполнение фильтрующего аппарата в разобранном виде (абсорбентный материал не показан).
На фиг. 3 показано одно исполнение прикрепления мембраны к держателю.
На фиг. 4 показана клеточная культура ЦОК ин витро, выделенная из периферической крови пациента с раком простаты, с ЦОК, выращенными на фильтрационной мембране.
На фиг. 5 показана культура ЦОК ин витро на фильтрационной мембране, для гематологического анализа был использован способ окрашивания Мэй-Грюнвальда.
На фиг. 6 показана обработка отделенных клеток с помощью иммуногистохимии, (ЦОК изолированы из крови пациента с метастатическим раком простаты и окрашены антителом по панцитокератину).
Ha фиг. 7 показана пара выделенных ЦОК, которые во ходе культивации прошли через фильтр на дне лунок с культурой (для анализа был использован способ окрашивания Мэй-Грюнвальда).
Примеры.
Аббревиатуры.
ЦОК - циркулирующая опухолевая клетка.
РОК - распространяющиаяся опухолевая клетка.
ЦФТК - циркулирующие фетальные трофобластные клетки.
ПНД-НИ - неинвазивная пренатальная диагностика.
ФБР - фосфатный буферный раствор с 0,15 М NaCl в основном с соляным буфером. ФБС - фетальная бычья сыворотка.
EDTA - хелатон 2, этилендиаминететраацетическая кислота. Пример 1.
Определение циркулирующих опухолевых клеток при раке простаты по периферической крови пациентов, которые прошли хирургическое удаление первичной опухоли.
5-10 мл периферической крови отбирается во время хирургической операции в собирательную пробирку с EDTA (например, Vacuette K3E (REF 456 036), S-monovette K3E (REF 02,1066,001 ). Кровь обрабатывается сразу или хранится при 4°С максимум 24 ч.
Периферическая кровь поэтапно вливается пипеткой в контейнер 3 аппарата для осуществления фильтрации. Кровь, присутствующая на первой стороне мембраны 1, фильтруется через фильтрационную мембрану 1 с диаметром 25 мм, состоящую из поликарбонатной мембраны (РСТЕ), с размером пор 8 мкм (GE, поликарбонат, 8,0 мкм, 25 мм), причем фильтрующая мембрана 1 находится в плотном контакте с абсорбентным материалом 2, волокнистым материалом (Pur-Zellin Hartmann). Процесс фильтрации занимает приблизительно 5 мин в зависимости от объема фильтруемой крови и вязкости крови.
Кроме того, процесс можно осуществить несколькими способами.
1. После фильтрации фильтрующая мембрана 1, зафиксированная в держателе 6 и содержащая изолированные ЦОК, переносится в одну лунку 6-луночной тарелки для выращивания, в которой находится питательная среда RPMI (4 мл), RPMI (Sigma R8758), обогащенная ФБС (F2442, Sigma) и добавляются антибиотики (пенициллин-стрептомицин (Р4458, Sigma), амфотерицин (А2942, Sigma)). Захваченные клетки затем культивируются как нормальные тканевые культуры по крайней мере в течение 14 дней при 37°С, 5% CO2 со сменой среды каждые 3 дня.
Выращенная клеточная культура была окрашена в соответствии с стандартным протоколом Мэй-Грюнвальда по иммуногистохимическому окрашиванию, и фотография, сделанная на микроскопе с отраженным светом, показана на фиг. 4.
На фиг. 5 показаны похожие варианты иммунофлуоресцентного окрашивания ЦОК при раке простаты (панцитокератин-FITC, Sigma), покрытого Prolong Gold(tm) с DAPI).
2. После фильтрации фильтрующая мембрана 1, содержащая изолированные ЦОК, ополаскивается
1 мл среды, и указанная среда с клетками, вымытая из фильтра, затем переносится в 24-луночную тарелку, где она накладывается на предметное стекло микроскопа, расположенного на дне лунки (Assistent, N. 1001, диаметр 12 мм). Затем клетки выращиваются напрямую на предметном стекле микроскопа, что дополнительно упрощает обработку во время иммуногистохимического окрашивания и последующего иммуногистохимического анализа по крайней мере в течение 14 дней при 37°С в атмосфере 5% CO2 со сменой среды каждые 3 дня.
3. После фильтрации фильтрующая мембрана 1, содержащая изолированные ЦОК, ополаскивается 1
мл среды; затем, среда с клетками переносится пипеткой из мембраны в культурные камеры (Nunc(r) Lab-
Tek(r) ChamberSlide(tm) (4 камеры) для конфокальной микроскопии (система для заснятия видео в режиме
реального времени и замедленной съемки, Leica) и затем культивируется как нормальная тканевая куль-
тура по крайней мере в течение 14 дней при 37°С с атмосферой 5% CO2 со сменой среды каждые 3 дня.
Во всех вышеописанных случаях культивация спорадических клеток на мембране и спорадических клеток смыванием с мембраны осуществлялась без каких-либо проблем. Аналогично культивация клеток из опухолей другого типа, изолированных с помощью способа настоящего изобретения, осуществлялась без каких-либо проблем. Напротив, успешное культивирование спорадических клеток, выделенных из органических жидкостей пациентов с помощью способов, известных в этой области, как на мембране, так и без мембраны, еще не было продемонстрировано.
4. После фильтрации и ополаскивания спорадических клеток, захваченных на фильтре, с помощью
2 мл RPMI фильтрующая мембрана 1, установленная в держателе, с содержанием изолированных ЦОК
окрашивается напрямую по стандартному протоколу окрашивания Мэй-Грюнвальда, и присутствие спорадических клеток оценивается под микроскопом. Пример 2.
Определение распространяющихся опухолевых клеток при метастатическом раке яичников плеврального выпота.
Распространяющиеся опухолевые клетки из плеврального выпота, удаленного у пациента с метастатическим раком яичников, были выделены следующим образом: эффузия была осуществлена с помощью пипетки в контейнер 3 фильтрационного аппарата. Эффузия на первой стороне мембраны 1 фильтруется через фильтрационную мембрану 1 с диаметром 25 мм, сделанную из поликарбонатной мембраны (РСТЕ), с диаметром пор 8 мкм, как описано в примере 1, где абсорбентный материал 2, волокнистый материал (Pur-Zellin, Hartmann) непосредственно примыкает к фильтрующей мембране 1. Клетки были зафиксированы в фильтре и проанализированы в виде гематологических кровяных пятен, окрашенных по стандартному протоколу окрашивания Мэй-Грюнвальда, и изучены под микроскопом.
Пример 3.
Аппарат для осуществления фильтрации.
Одно исполнение аппарата для осуществления фильтрации, показанное на фиг. 1-3, включает в себя поликарбонатную фильтрационную мембрану 1 с размером пор 8 мкм, причем абсорбентный материал 2, состоящий из волокнистого материала, находится в плотном контакте с ней на нижней стороне указанной мембраны. Аппарат дополнительно включает в себя верхний и нижний открытый полый контейнер 3 для приема смеси спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости. Для упрощения наливания жидкостей верхний край контейнера 3 расширен, формируя воронку. Нижняя периферия контейнера 3 находится в тесном контакте с верхней первой стороной мембраны 1 и нижняя вторая сторона мембраны 1 находится в плотном контакте с абсорбентным материалом 2, так что мембрана 1 отделяет внутреннее пространство контейнера 3 от указанного абсорбентного материала 2.
Абсорбентный материал 2 устанавливается в накопительный базовый контейнер 4, снабженный верхней крышкой 5, причем к этой крышке сверху крепится периметрический держатель мембраны 6 с возможностью снятия. Держатель 6 можно вертикально двигать относительно крышки 5 и, следовательно, также относительно абсорбентного материала 2, что позволяет создать плотный контакт мембранного фильтра 1 с абсорбентным материалом 2 или прижать прижимное кольцо 7 к абсорбентному материалу 2 соответственно для наилучшего контакта мембраны 1 с абсорбентным материалом 2. Держатель 6 плотно удерживает мембрану 1 по ее окружности с помощью прижимного кольца 7 с возможностью снятия с помощью нити, так что набор, состоящий из держателя 6, фильтрующей мембраны 1 и прижимного кольца 7 может быть удален из аппарата целиком и захваченные клетки могут быть окрашены или культивированы напрямую на мембране 1. Контейнер 3 с возможностью снятия крепится с помощью штыкового соединения к держателю 6 по его окружности.
Пример 4.
Сравнение двух видов технологии фильтрации относительно присутствия осадка.
Цель эксперимента состояла в сравнении фильтрации клеток крови, содержащих спорадические клетки, ускоренной вакуумом, с фильтрацией при помощи капиллярных сил в соответствии с изобретением относительно оценки присутствия спорадических клеток, выделяемых на фильтрационной мембране, которое в основном зависит от присутствия осадка и остаточных клеточных элементов крови на фильтрационной мембране.
В обоих процессах используется мембрана с заявленным размером пор 7-8 мкм и абсорбентный материал, как описано в примере 1. Чтобы достичь приблизительно одинакового времени фильтрации, использовались фильтры с различным размером, фильтр с диаметром 7 мм использовался для вакуумной фильтрации и фильтр с диаметром 25 мм для фильтрации при помощи капиллярных сил.
Один и тот же объем 2 мл крови, полученный, как описано в примере 1, от пациента с раком простаты, прошел фильтрацию через две мембранные системы при комнатной температуре с временем фильтрации 87 с при фильтрации при помощи вакуумной системы и 97 с при фильтрации при помощи капиллярных сил в соответствии с изобретением.
Частое появление осадка крови на фильтры наблюдалось в случае вакуумной фильтрации, что сделало невозможным оценку присутствия спорадических клеток на фильтре во время микроскопии. При использовании фильтрационного способа за счет капиллярных сил в соответствии с изобретением осадка на фильтре не было.
Пример 5.
Сравнение двух видов технологии фильтрации с перспективой ополаскивания.
Использовалась такая же конфигурация, как описано в примере 4, за исключением того, что пробы крови брались у пациента с раком груди. Поскольку мы часто наблюдали образование сгустка во время вакуумной фильтрации этого типа проб, что вело к усложнению оценки, в основном в связи с тем, что красные клетки крови оставались в осадке, фильтры дополнительно промывались 2 мл питательной среды (RPMI) после фильтрации крови.
Как ожидалось, осадок остался на фильтре после вакуумной фильтрации, но ополаскивание помог
ло удалить остаток красных клеток крови, и, таким образом, общая оценка присутствия спорадических клеток на фильтре после ополаскивания с RPMI оказалась лучше, чем в случае без ополаскивания. Общее время фильтрации и ополаскивания для фильтра со средой RPMI составило 4 мин 37 с.
После использования капиллярных сил для фильтрации фильтр позволил сделать более качественную оценку даже без ополаскивания, чем фильтр после применения вакуума. Оценка присутствия спорадических клеток на фильтре после ополаскивания с RPMI дополнительно улучшилась и была лучше оценки фильтрации при помощи вакуума с ополаскиванием. Общее время фильтрации и ополаскивания при фильтрации с средой RPMI составило лишь 39 с в этом случае.
Соответственно преимущество применения капиллярных сил для фильтрационной сепарации спорадических клеток, как относительно появления сгустков, так и относительно оценки присутствия спорадических клеток, было подтверждено. Кроме того, с этапом ополаскивания средой RPMI наблюдалось уменьшение времени фильтрации.
Ссылки.
Андреопулу и др. Сравнение способов проведения анализа для выявления циркулирующих опухолевых клеток при метастатическом раке груди: сравнение систем AdnaGen AdnaTest BreastCancer Select/Detect(tm) с Veridex CellSearch(tm). Int J Рак, 2012 г., 130(7):1590-7
Бианки и др. Мужские фетальные прогениторные клетки выявляющиеся в материнской крови в течение 27 лет после родов
Proc. Natl. Acad. Sci. США, 93 (1996 г.), pp. 705-708
Бирхмайер С. Эпителиально-мезенхимальные переходы при прогрессии рака. Acta Anat (Basel), 1996 г., 156:217-26
Кристофори Г. Новый сигнал инвазивного фронта. Nature, 2006 г., 441:440-50
Давила и др. Микрочастицы, несущие тканевый фактор, полученные из опухолевых клеток: влияние на активность коагуляции. J Thromb Haemost, 2008 г., 6(9):1517-24
Ехлингер и др. Описание экспрессии эпителиальной пластичности при прогрессии опухоли. Oncogene, 2003 г., 22:7155-69
Микулова В. и др. Способы выявления циркулирующих опухолевых клеток и их клиническое значение у раковых пациентов. Folia Biol (Praha). 2011 г.;57(4):151-61.
Ma и др. Мета-анализ циркулирующих опухолевых клеток как прогнозный маркер при раке легких. Asian Рас J Рак Prev, 2012 г., 13(4): 1137-44
Мани и др. Эпителиально-мезенхимальный переход генерирует клетки с свойствами стволовых клеток. Cell, 2008 г., 133:704-15
Мего и др. Циркулирующие опухолевые клетки связаны с повышенным риском венозной тромбоэмболии при метастатическом раке груди пациента. Br J Cancer, 2009b, 101(11):1813-6
Мувайя Н и др. Циркулирующие трофобластические клетки обеспечивают общий диагноз для 63 фетусов с риском кистозного фиброза или спинальной мышечной атрофии. Reprod Biomed Online. 2012 г. Nov;25(5):508-20.
Пантель К, Отте М. Скрытый микрометастаз: обогащение, идентификация и исследование характеристик единичных распространяющихся опухолевых клеток. Semin Рак Biol, 2001 г., 11:327-37
Патерлини-Брешо П., Бенали Н.Л. Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) выявление: Клиническое влияние и будущие направления. Cancer Lett, 2007 г., 253:180-204
Шук и др. Механизм, механика и функция эпителиально-мезенхимальных переходов при раннем развитии. Mech Dev, 2003 г., 120(11): 1351-83
Тьери Ж.П. Эпителиально-мезенхимальные переходы при прогрессии опухоли. Nat Rev Рак, 2002 г., 2:442-54
Бона и др. Изоляция по размеру эпителиальных опухолевых клеток: Новой способ для иммуноморфологической и молекулярной характеристики циркуляции опухолевых клеток. Am J Pathol, 2000 г., 156:57-63
Ван и др. Более высокое количество циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в периферической крови указывает на плохой прогноз для пациентов с раком простаты -- мета-анализ. Asian Рас J Рак Prev, 2011 г., 12(10):2629-35
Чжао и др. Прогнозная роль циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) выявляемых с помощью ПЦР-ОТ при раке груди: мета-анализ опубликованной литературы. Breast Cancer Res Treat, 2011 г., 130(3):809-16
Чжан и др. Мета-анализ прогнозной оценки циркулирующих опухолевых клеток при раке груди. Clin Cancer Res, 2012 г., 18(20):5701-10
Цигельшмидт и др. Выявление распространяющихся опухолевых клеток в периферической крови. Crit Rev Clin Lab Sci, 2005 г., 42:155-96.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ сепарации спорадических циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) или распространяющихся опухолевых клеток (РОК), циркулирующих эндометриальных клеток и циркулирующих фетальных трофобластных клеток (ЦФТК), присутствующих в органической жидкости пациента, без химического или механического их изменения с обеспечением возможности их последующей эффективной культивации, включающий следующие шаги:
предоставление фильтрационной мембраны, имеющей первую и вторую стороны, при этом отверстия мембраны меньше диаметра спорадических клеток,
предоставление абсорбентного материала и размещение его в плотном контакте со второй стороной указанной фильтрационной мембраны,
обеспечение прохождения органической жидкости со спорадическими клетками через первую сторону фильтрационной мембраны таким образом, что органическая жидкость, проходя через фильтрационную мембрану за счет капиллярной силы в абсорбентный материал, освобождается от спорадических клеток,
получение указанных спорадических клеток, захваченных на мембране, при этом спорадические клетки остаются механически и химически неизменными и поэтому живыми, что позволяет проводить их последующую эффективную культивацию.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что органическую жидкость предварительно отбирают из периферической или центральной крови, костного мозга, асцитных жидкостей, плеврального выпота, перитонеальной жидкости лаважа, бронхоальвеолярного лаважа и околоплодной жидкости.
3. Способ по пп.1, 2, характеризующийся тем, что указанная органическая жидкость - это органическая жидкость пациентов с меланомой, раком груди, опухолью желудочно-кишечного тракта, такой как карцинома желудка, карцинома кишечника, карцинома поджелудочной железы и карцинома печени; урогенитальными опухолями и опухолями мягких тканей, такими как головные и шейные опухоли и другие плотные опухоли.
4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что периферическая кровь отбирается как антикоагули-рованная периферическая кровь.
5. Способ по пп.1-4, характеризующийся тем, что после сепарации осуществляют определение, и/или количественное определение, и/или культивирование спорадических клеток, выделенных на фильтрационной мембране, или клеток, смытых с фильтрационной мембраны в сосуд для культивирования.
6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что предварительно до сепарации органическую жидкость разбавляют питательной средой, в частности средой для культур клеток и тканей (RPMI), для повышения успешности последующей культивации.
7. Аппарат для реализации способа по п.1, характеризующийся тем, что он включает в себя открытый сверху и снизу полый резервуар (3) для приема смеси спорадических клеток, присутствующих в органической жидкости, при этом нижняя часть резервуара (3) находится в плотном контакте по крайней мере с частью первой стороны фильтрационной мембраны (1), диаметр пор которой составляет 7-10 мкм, при этом она выполнена из биосовместимого материала, по крайней мере часть второй стороны мембраны (1) находится в плотном контакте с абсорбентным материалом (2), таким образом фильтрационная мембрана (1) отделяет внутреннее пространство резервуара (3) от указанного абсорбентного материала (2).
8. Аппарат по п.7, характеризующийся тем, что абсорбентный материал (2) размещен в накопительном базовом контейнере (4), снабженном верхней крышкой (5), причем к указанной крышке сверху с возможностью снятия закреплен периметрический держатель мембраны (6), который посредством прижимного кольца (7) плотно, с возможностью снятия удерживает мембрану (1) по ее окружности, при
2.
этом резервуар (3) плотно закреплен к держателю (6) по его периметру.
9. Аппарат по п.7 или 8, характеризующийся тем, что фильтрационная мембрана (1) имеет размер
пор 8 мкм.
10. Аппарат по пп.7-9, характеризующийся тем, что фильтрационная мембрана (1) изготовлена из поликарбоната.
11. Аппарат по пп.7-10, характеризующийся тем, что абсорбентный материал (2) состоит из целлюлозы, тонкой бумаги, текстильного волокна или их комбинации.
Направление течения
5 . _
/¦ ¦
::А
Фиг. 2
Фиг. 7
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032557
- 1 -
(19)
032557
- 1 -
(19)
032557
- 1 -
(19)
032557
- 1 -
(19)
032557
- 9 -
(19)
032557
- 10 -
032557
- 10 -
032557
- 11 -
|
