[RU]

1. Полимерный конъюгат, представленный следующей формулой: где A представляет собой ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059 (2'-амино-3'-метоксифлавон), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол); X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида или их сополимеров; Y представляет собой остаток одного из следующих соединений: Z представляет собой гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник®); и o равно 1; p и q независимо равны 0 или 1; m равно целому числу от 1 до 20; n равно целому числу от 2 до 6 при условии, что A не является доксорубицином, когда m и n, оба, равны единице.

2. Полимерный конъюгат по п.1, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

3. Полимерный конъюгат по п.1 или 2, в котором Z представляет собой поли(алкиленгликоль).

4. Полимерный конъюгат по п.3, в котором Z представляет собой полиэтиленгликоль.

5. Полимерный конъюгат по любому из пп.1-4, в котором X является биоразлагаемым.

6. Полимерный конъюгат по п.5, в котором X выбирается из группы, состоящей из поликапролактона, полиангидридов, а также их сополимеров.

7. Полимерный конъюгат по п.6, в котором X представляет собой полиангидрид.

8. Полимерный конъюгат по п.7, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

9. Полимерный конъюгат по п.7, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание поли-CPH (PCPH) и полисебацинового ангидрида.

10. Полимерный конъюгат по п.1, в котором Y представляет собой лимонную кислоту.

11. Полимерный конъюгат по п.1, представленный следующей формулой: где A представляет собой ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059 (2'-амино-3'-метоксифлавон), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол); X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида; Y представляет собой одно из следующего: Z представляет собой гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник®); и n равно целому числу от 2 до 6.

12. Полимерный конъюгат по п.11, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

13. Полимерный конъюгат по п.11 или 12, в котором Z представляет собой поли(алкиленгликоль).

14. Полимерный конъюгат по п.13, в котором Z представляет собой полиэтиленгликоль.

15. Полимерный конъюгат по любому из пп.11-14, в котором X является биоразлагаемым.

16. Полимерный конъюгат по п.15, в котором X выбирается из группы, состоящей из поликапролактона, полиангидридов, а также их сополимеров.

17. Полимерный конъюгат по п.16, в котором X представляет собой полиангидрид.

18. Полимерный конъюгат по п.17, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

19. Полимерный конъюгат по п.16, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.

20. Полимерный конъюгат по любому из пп.11-19, в котором n равно 3.

21. Полимерный конъюгат по п.11, в котором Y представляет собой лимонную кислоту.

22. Полимерный конъюгат по п.11, представленный формулой IA где A представляет собой ингибитор HIF-1, выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059, 2-метоксиэстрадиола и YC-1; D представляет собой O; PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь; X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида.

23. Полимерный конъюгат по п.22, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

24. Полимерный конъюгат по п.22 или 23, в котором X является биоразлагаемым.

25. Полимерный конъюгат по п.24, в котором X представляет собой полиангидрид.

26. Полимерный конъюгат по п.25, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

27. Полимерный конъюгат по п.25, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.

28. Полимерный конъюгат по п.1, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.

29. Полимерный конъюгат по п.11, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.

30. Полимерный конъюгат по п.22, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.

31. Множество микро- и/или наночастиц, содержащих конъюгат по любому из пп.1-30.

32. Препарат, содержащий полимерный конъюгат по любому из пп.1-30 и/или частицы по п.31 в фармацевтически приемлемом носителе.

33. Препарат по п.32, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

34. Препарат по п.33, в котором X представляет собой полиангидрид.

35. Препарат по п.34, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

36. Полимерный конъюгат по п.35, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.

37. Способ лечения заболевания или нарушения, связанного с аберрантной васкуляризацией, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, препарата по п.32, в фармацевтически приемлемом эксципиенте, в форме микро- и/или наночастиц или импланта.

38. Способ лечения глазного заболевания или нарушения, связанного с аберрантной васкуляризацией, включающий введение в глаза пациента, который нуждается в этом, препарата по п.32, в фармацевтически приемлемом эксципиенте, в форме микро- и/или наночастиц или импланта или в фармацевтически приемлемой форме для введения в глаза.

39. Способ по п.38, в котором глазное заболевание или нарушение представляет собой интраокулярное неоваскулярное заболевание, нарушение или повреждение.

40. Способ по п.39, в котором интраокулярное неоваскулярное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из возрастной дегенерации макулы, связанной с хориоидальной неоваскуляризацией, пролиферативной диабетической ретинопатии, пролиферативной витреоретинопатии, ретинопатии недоношенных, патологической близорукости, болезни Гиппеля-Линдау, синдрома предполагаемого гистоплазмоза глаз (СПГГ), а также состояний, связанных с ишемией, таких как окклюзия ветки вены сетчатки, окклюзия центральной вены сетчатки, окклюзия ветки артерии сетчатки и окклюзия центральной артерии сетчатки, неоваскуляризации, связанной с опухолью, неоваскуляризации, связанной с раной глаза, ретинальной неоваскуляризации, отторжения трансплантата роговицы, осложнений после хирургической операции, которые вызывают неоваскуляризацию, осложнений после травмы, которые вызывают неоваскуляризацию, а также их сочетаний.

41. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение представляет собой мокрую возрастную дегенерацию макулы.

42. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение включает хориоидальную неоваскуляризацию.

43. Способ по п.42, в котором композиция обеспечивает эффективное количество одного или более активных средств для сокращения площади хориоидальной неоваскуляризации, измеряемой методом флуоресцентной ангиографии, по меньшей мере на 15%.

44. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение включает ретинальную неоваскуляризацию.

45. Способ по п.44, в котором композиция обеспечивает эффективное количество одного или более активных средств для сокращения площади ретинальной неоваскуляризации, измеряемой методом флуоресцентной ангиографии, по меньшей мере на 15%.

(57) Реферат / Формула:

1. Полимерный конъюгат, представленный следующей формулой: где A представляет собой ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059 (2'-амино-3'-метоксифлавон), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол); X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида или их сополимеров; Y представляет собой остаток одного из следующих соединений: Z представляет собой гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник®); и o равно 1; p и q независимо равны 0 или 1; m равно целому числу от 1 до 20; n равно целому числу от 2 до 6 при условии, что A не является доксорубицином, когда m и n, оба, равны единице.

2. Полимерный конъюгат по п.1, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

3. Полимерный конъюгат по п.1 или 2, в котором Z представляет собой поли(алкиленгликоль).

4. Полимерный конъюгат по п.3, в котором Z представляет собой полиэтиленгликоль.

5. Полимерный конъюгат по любому из пп.1-4, в котором X является биоразлагаемым.

6. Полимерный конъюгат по п.5, в котором X выбирается из группы, состоящей из поликапролактона, полиангидридов, а также их сополимеров.

7. Полимерный конъюгат по п.6, в котором X представляет собой полиангидрид.

8. Полимерный конъюгат по п.7, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

9. Полимерный конъюгат по п.7, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание поли-CPH (PCPH) и полисебацинового ангидрида.

10. Полимерный конъюгат по п.1, в котором Y представляет собой лимонную кислоту.

11. Полимерный конъюгат по п.1, представленный следующей формулой: где A представляет собой ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059 (2'-амино-3'-метоксифлавон), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол); X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида; Y представляет собой одно из следующего: Z представляет собой гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник®); и n равно целому числу от 2 до 6.

12. Полимерный конъюгат по п.11, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

13. Полимерный конъюгат по п.11 или 12, в котором Z представляет собой поли(алкиленгликоль).

14. Полимерный конъюгат по п.13, в котором Z представляет собой полиэтиленгликоль.

15. Полимерный конъюгат по любому из пп.11-14, в котором X является биоразлагаемым.

16. Полимерный конъюгат по п.15, в котором X выбирается из группы, состоящей из поликапролактона, полиангидридов, а также их сополимеров.

17. Полимерный конъюгат по п.16, в котором X представляет собой полиангидрид.

18. Полимерный конъюгат по п.17, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

19. Полимерный конъюгат по п.16, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.

20. Полимерный конъюгат по любому из пп.11-19, в котором n равно 3.

21. Полимерный конъюгат по п.11, в котором Y представляет собой лимонную кислоту.

22. Полимерный конъюгат по п.11, представленный формулой IA где A представляет собой ингибитор HIF-1, выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059, 2-метоксиэстрадиола и YC-1; D представляет собой O; PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь; X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида.

23. Полимерный конъюгат по п.22, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

24. Полимерный конъюгат по п.22 или 23, в котором X является биоразлагаемым.

25. Полимерный конъюгат по п.24, в котором X представляет собой полиангидрид.

26. Полимерный конъюгат по п.25, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

27. Полимерный конъюгат по п.25, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.

28. Полимерный конъюгат по п.1, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.

29. Полимерный конъюгат по п.11, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.

30. Полимерный конъюгат по п.22, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.

31. Множество микро- и/или наночастиц, содержащих конъюгат по любому из пп.1-30.

32. Препарат, содержащий полимерный конъюгат по любому из пп.1-30 и/или частицы по п.31 в фармацевтически приемлемом носителе.

33. Препарат по п.32, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.

34. Препарат по п.33, в котором X представляет собой полиангидрид.

35. Препарат по п.34, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.

36. Полимерный конъюгат по п.35, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.

37. Способ лечения заболевания или нарушения, связанного с аберрантной васкуляризацией, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, препарата по п.32, в фармацевтически приемлемом эксципиенте, в форме микро- и/или наночастиц или импланта.

38. Способ лечения глазного заболевания или нарушения, связанного с аберрантной васкуляризацией, включающий введение в глаза пациента, который нуждается в этом, препарата по п.32, в фармацевтически приемлемом эксципиенте, в форме микро- и/или наночастиц или импланта или в фармацевтически приемлемой форме для введения в глаза.

39. Способ по п.38, в котором глазное заболевание или нарушение представляет собой интраокулярное неоваскулярное заболевание, нарушение или повреждение.

40. Способ по п.39, в котором интраокулярное неоваскулярное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из возрастной дегенерации макулы, связанной с хориоидальной неоваскуляризацией, пролиферативной диабетической ретинопатии, пролиферативной витреоретинопатии, ретинопатии недоношенных, патологической близорукости, болезни Гиппеля-Линдау, синдрома предполагаемого гистоплазмоза глаз (СПГГ), а также состояний, связанных с ишемией, таких как окклюзия ветки вены сетчатки, окклюзия центральной вены сетчатки, окклюзия ветки артерии сетчатки и окклюзия центральной артерии сетчатки, неоваскуляризации, связанной с опухолью, неоваскуляризации, связанной с раной глаза, ретинальной неоваскуляризации, отторжения трансплантата роговицы, осложнений после хирургической операции, которые вызывают неоваскуляризацию, осложнений после травмы, которые вызывают неоваскуляризацию, а также их сочетаний.

41. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение представляет собой мокрую возрастную дегенерацию макулы.

42. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение включает хориоидальную неоваскуляризацию.

43. Способ по п.42, в котором композиция обеспечивает эффективное количество одного или более активных средств для сокращения площади хориоидальной неоваскуляризации, измеряемой методом флуоресцентной ангиографии, по меньшей мере на 15%.

44. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение включает ретинальную неоваскуляризацию.

45. Способ по п.44, в котором композиция обеспечивает эффективное количество одного или более активных средств для сокращения площади ретинальной неоваскуляризации, измеряемой методом флуоресцентной ангиографии, по меньшей мере на 15%.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
032552 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2019.06.28
(51) Int. Cl. A61K47/48 (2006.01) A61P27/02 (2006.01)
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
201491710
2013.03.12
(54) ПРЕПАРАТЫ С КОНТРОЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ДЛЯ ДОСТАВКИ ИНГИБИТОРОВ HIF-1
(31) (32)
61/611,931
2012.03.16
(33) US
(43) 2015.04.30
(86) PCT/US2013/030533
(87) WO 2013/138343 2013.09.19
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ДЗЕ ДЖОНС ХОПКИНС ЮНИВЕРСИТИ (US)
(72) Изобретатель:
Хэйнс Джастин Скот, Кампочиаро Питер Энтони, Фу Цзе (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) Masayuki Yokoyama ET AL.: "CHARACTERIZATION
AND ANTICANCER ACTIVITY OF THE MICELLE-FORMING POLYMERIC ANTICANCER DRUG ADRIAMYCIN-CONJUGATED POLYETHYLENE GLYCOL POLYASPARTIC ACID BLOCK COPOLYMER", 15 March 1990 (1990-03-15), pages 1693-1700, XP055060134, Retrieved from the Internet: URL:http:// cancerres.aacrjournals.org/content/50/6/1693.full.pdf#p age=1 &view=FitH, [retrieved on 2013-04-18], abstract, figure 1
WO-A1-9207866
US-A-5710135
SUDHIR P. DEOSARKAR ET AL.: "Polymeric particles conjugated with a ligand to VCAM-1 exhibit selective, avid, and focal adhesion to sites of atherosclerosis", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 101, no. 2, 1 October 2008 (2008-10-01), pages 400-407, XP055060107, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/bit.21885, abstract
A. DONG ET AL.: "Vascular cell-adhesion molecule-1 plays a central role in the proangiogenic effects of oxidative stress", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 108, no. 35, 30 August 2011 (2011-08-30), pages 14614-14619, XP055060257, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas. 1012859108, page 14618, column 1, paragraph 2 -column 2, paragraph 2 US-A-4997652 US-A-5932462
TANG B.C. ET AL.: "Enhanced efficacy of local etoposide delivery by poly(ether-anhydride) particles against small cell lung cancer in vivo", BIOMATERIALS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV., BARKING, GB, vol. 31, no. 2, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 339-344, XP026746005, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/J.BIOMATERIALS. 2009.09.033, [retrieved on 2009-09-30]
FIEGEL J. ET AL.: "Poly(ether-anhydride) dry powder aerosols for sustained drug delivery in the lungs", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 96, no. 3, 18 May 2004 (2004-05-18), pages 411-423, XP004505675, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/JJCONREL.2004.02.018
Takeshi Iwase et al.: "Safe and Effective Polymeric-Doxorubicin Conjugate Nanoparticles for Prolonged Antiangiogenic Activity in the Eye", 8 May
2012 (2012-05-08), XP002695866, Retrieved from
the Internet: URL:http://www.abstractsonline.com/Plan/ ViewAbstract.aspx?mID=2866 &sKey=ebc9c74c-9d11-
43d0-9d5c-060396c9ca9a &cKey=33638dc5-1717-4e08-
8287-5344c389580c &mKey={F0FCE029-9BF8-4E7C-B48E-9FF7711D4A0E}, [retrieved on 2013-05-17], abstract
(57) Предложены лекарственные препараты с контролируемым высвобождением для доставки одного или более ингибиторов HIF-1. Препараты с контролируемым высвобождением содержат один или более ингибиторов HIF-1, конъюгированных с или диспергированных в полимерном носителе. В некоторых случаях один или более ингибиторов HIF-1 диспергированы или инкапсулированы в полимерной матрице. В предпочтительных вариантах осуществления один или более ингибиторов HIF-1 ковалентно связаны с полимером, образуя конъюгат полимер-лекарственное средство. Из полимерных носителей могут быть образованы имплантаты, микрочастицы, наночастицы или их сочетание для введения. Препараты с контролируемым высвобождением ингибиторов HIF-1 обеспечивают продолжительное благоприятное терапевтическое действие, при этом снижаются побочные эффекты за счет высвобождения низких уровней одного или более ингибиторов HIF-1 и/или конъюгатов ингибиторов HIF-1 в течение продолжительного периода времени. Лекарственные препараты с контролируемым высвобождением для доставки одного или более ингибиторов HIF-1 можно использовать для лечения или профилактики заболевания или нарушения у пациента, которое связано с васкуляризацией, включая рак, ожирение, а также глазные заболевания, такие как мокрая ВДМ.
Область техники изобретения
Изобретение относится к полимерным препаратам с контролируемым высвобождением для доставки эффективного количества одного или более ингибиторов HIF-1, в частности, в глаза, а также к способам их применения для лечения и профилактики заболеваний, в частности для лечения или профилактики глазных заболеваний.
Уровень техники изобретения
Индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1) представляет собой транскрипционный фактор, который контролирует экспрессию более 60 генов-мишеней, продукты которых играют ключевую роль во многих процессах, включая ангиогенез. Например, экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), наиболее важного известного регулятора ангиогенеза, стимулируется HIF-1. Активный HIF-1 состоит из альфа (HIF-1a, 2a) и бета (HIF-1P) субъединиц, которые димеризуются и связываются с консенсусными последовательностями (отвечающими на гипоксию элементами, HRE) в регуляторных областях генов-мишеней. В нормоксии HIF-1 гидроксилируется и взаимодействует с белком Гиппеля-Линдау (pVHL), субъединицей E3 убиквитин-лигазы, который делает HIF мишенью для деградации. В отсутствие кислорода гидроксилирование HIF ингибируется, что предотвращает связывание с pVHL и приводит к его накоплению внутри клетки. Повышенные уровни внутриклеточных HIF-la и HIF-2a связаны со многими процессами аберрантной васкуляризации.
Из-за его важной роли в ангиогенезе HIF-1 представляет собой перспективную мишень при лечении и профилактике заболеваний и нарушений, связанных с окулярной неоваскуляризацией. Попытки разработать клинически эффективные методы лечения были серьезно затруднены из-за сложности введения и поддержания терапевтически эффективного количества ингибиторов HIF-1 в течение продолжительного периода времени. Кроме того, многие ингибиторы HIF-1 являются цитотоксическими и проявляют серьезные побочные эффекты и/или токсичность, особенно при введении в ткани глаза.
Для лечения хронических заболеваний глаз существует потребность в способах длительного действия для доставки ингибиторов HIF-1 в глаза. Препараты, обеспечивающие продолжительную доставку HIF-1, позволят свести к минимуму возможную токсичность, связанную с введением многих ингибиторов HIF-1. Препараты, обеспечивающие продолжительную доставку HIF-1, будут также поддерживать подавление VEGF и других стимуляторов ангиогенеза, максимально повышать эффективность, способствовать регрессу неоваскуляризации и позволят свести к минимуму вероятность возникновения катастрофических осложнений, включая субретинальное кровоизлияние. Кроме того, уменьшение потребности в частых инъекциях снизит риск эндофтальмита и уменьшит бремя частых посещений клиники, основного затруднения для пациентов и их семей.
В документах Yokoyama et al., Cancer Research, 1990, 50, 1693-1700, WO 92/07866 (University of Texas System), US 5710135 (Leenders et al.) и Deosarkar et al., Biotechnology and Bioengineering, 2008, 101(2), 400-407 предлагают различные коньюгаты полимеров и лекарственных средств.
Таким образом, целью изобретения является предложение препаратов ингибиторов HIF-1 с повышенной стабильностью, безопасностью и эффективностью.
Целью изобретения также является предложение препаратов лекарственного средства, способных эффективно доставлять терапевтические уровни одного или более ингибиторов HIF-1 в течение продолжительного периода времени.
Еще одной целью изобретения является предложение усовершенствованных способов лечения или профилактики глазных заболеваний или нарушений.
Сущность изобретения
В документе описаны лекарственные формы препаратов с контролируемым высвобождением для доставки одного или более ингибиторов HIF-1, конъюгированных с, или диспергированных в полимерном носителе для контролируемой доставки. Полимерную матрицу можно создавать из не биоразлагае-мых или биоразлагаемых полимеров; однако предпочтительно полимерная матрица является биоразла-гаемой. Из полимерной матрицы можно формировать имплантаты (например, стержни, диски, пластины и так далее), микрочастицы, наночастицы или их сочетание для доставки. После введения один или более ингибиторов HIF-1 высвобождаются в течение продолжительного периода времени, либо при распаде полимерной матрицы, диффузии одного или более ингибиторов из полимерной матрицы, либо в результате и того и другого. При использовании конъюгата полимер-лекарственное средство можно получать частицы с более контролируемыми нагрузками лекарственного средства и профилями высвобождения лекарственного средства. Кроме того, растворимость конъюгата можно контролировать так, чтобы сводить к минимуму концентрацию растворимого лекарственного средства и, следовательно, токсичность.
В предпочтительных вариантах осуществления один или более ингибиторов HIF-1 ковалентно связаны с полимером, образуя конъюгат полимер-лекарственное средство. Из конъюгатов полимер-лекарственное средство затем можно формировать имплантаты (например, стержни, пластины, диски и так далее), микрочастицы, наночастицы или их сочетания для доставки в глаза. При использовании конъюгата полимер-лекарственное средство можно получать частицы с более контролируемыми нагрузками лекарственного средства и профилями высвобождения лекарственного средства. Кроме того, растворимость конъюгата можно контролировать, изменяя растворимость полимерной части и/или узла
ветвления ("Y" в химической структуре полимера) так, чтобы сводить к минимуму концентрацию растворимого лекарственного средства и, следовательно, токсичность.
В некоторых вариантах осуществления полимерный конъюгат, представленный следующей формулой
(A-X)m-Y- ( (Z)0- (Х)р- (A)q)n,
где A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стаурос-порина, PD98059(2-(2-амино-3-метоксифенил)-4H-1-бензопиран-4-он), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол);
X представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), поли(молочной кислоты-со-гликолевой кислоты), поликапролактона и полиангидрида или их сополимеров;
,соон
Y представляет собой одно из следующего:
он он о соон
нооа
о он он
он о
V-Лн
о он
соон
соон но-( У- соон соон
но соон
соон
соон
Z представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник(r)); и
o равно 1;
p и q независимо равны 0 или 1;
m равно целому числу от одного до двадцати; и
n равно целому числу от двух до шести, при условии, что A не является доксорубицином, когда m и n оба равны единице.
Иллюстративные конъюгаты полимер-лекарственное средство данного типа представлены общими формулами, приведенными ниже
где A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1;
X представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофобный полимерный сегмент;
Y отсутствует или представляет собой узел ветвления;
Z представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофильный полимерный сегмент;
m представляет собой количество ветвей A-X и равно целому числу от одного до двадцати; и
n представляет собой количество ветвей Z, Z-X и Z-X-A и равно целому числу от нуля до двадцати,
более предпочтительно от одного до двадцати, при условии, что A не является доксорубицином, когда m
и n оба равны единице.
A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1. В некоторых случаях ингибитор HIF-1 представляет собой антрациклин, такой как доксорубицин (DXR) или даунорубицин (DNR).
Один или более гидрофобных полимерных сегментов могут представлять собой любой биосовместимый гидрофобный полимер или сополимер. В некоторых случаях гидрофобный полимер или сополимер является биоразлагаемым. Примеры подходящих гидрофобных полимеров включают, но не ограничиваются ими, сложные полиэфиры, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота или по-ликапролактон, полиангидриды, такие как полисебациновый ангидрид, а также сополимеры любых вышеперечисленных. В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимер представляет собой полиангидрид, такой как полисебациновый ангидрид, или его сополимер.
Профиль распада одного или более гидрофобных полимерных сегментов можно выбирать для оказания влияния на скорость высвобождения активного средства in vivo. Например, гидрофобные полимерные сегменты можно выбирать так, чтобы они распадались в течение периода времени от семи дней до 2 лет, более предпочтительно от семи дней до 56 недель, более предпочтительно от четырех недель до
56 недель, наиболее предпочтительно от восьми недель до 28 недель.
Один или более гидрофильных полимерных сегментов могут представлять собой любой гидрофильный биосовместимый нетоксичный полимер или сополимер. В некоторых вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов содержат поли(алкиленгликоль), такой как поли-этиленгликоль (PEG). В конкретных вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов представляют собой линейные цепи PEG.
В некоторых вариантах осуществления, когда присутствуют и гидрофобные и гидрофильные полимерные сегменты, общая средневзвешенная молекулярная масса одного или более гидрофильных полимерных сегментов предпочтительно будет больше, чем средневзвешенная молекулярная масса гидрофобного полимерного сегмента. В некоторых случаях общая средневзвешенная молекулярная масса гидрофильных полимерных сегментов по меньшей мере в пять раз, более предпочтительно по меньшей мере в десять раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в пятнадцать раз больше, чем средневзвешенная молекулярная масса гидрофобного полимерного сегмента.
Узел ветвления в случае его наличия может представлять собой органическую молекулу, содержащую три или более функциональных групп. Предпочтительно, узел ветвления будет содержать функциональные группы по меньшей мере двух различных типов (например, один или более спиртов и одну или более карбоновых кислот, или один или более галогенидов и одну или более карбоновых кислот). В таких случаях различные функциональные группы, присутствующие на узле ветвления, могут быть независимо доступны для синтетической модификации, допуская ковалентное присоединение гидрофобных и гидрофильных сегментов к узлу ветвления в контролируемых стехиометрических соотношениях. В некоторых вариантах осуществления узел ветвления представляет собой поликарбоновую кислоту, такую как лимонная кислота, виннокаменная кислота, муциновая кислота, глюконовая кислота или 5-гидроксибензол-1,2,3-трикарбоновая кислота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство образован из одного гидрофобного полимерного сегмента и двух или более гидрофильных полимерных сегментов, кова-лентно связанных через мультивалентный узел ветвления. Иллюстративные конъюгаты полимер-лекарственное средство такого типа представлены общей формулой, приведенной ниже
A-X-Y- (Z)n,
где A представляет собой ингибитор HIF-1;
X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент;
Y представляет собой узел ветвления;
Z представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофильный полимерный сегмент; и n равно целому числу от двух до десяти.
A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1. В некоторых случаях ингибитор HIF-1 представляет собой антрациклин, такой как доксорубицин (DXR) или даунорубицин (DNR).
В некоторых вариантах осуществления гидрофильные полимерные сегменты содержат по-ли(алкиленгликоль), такой как полиэтиленгликоль (PEG), предпочтительно линейные цепи PEG. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты содержат от двух до шести гидрофильных полимерных сегментов.
В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимер представляет собой полиангидрид, такой как полисебациновый ангидрид, или его сополимер. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент представляет собой поли(1,6-бис-(п-карбоксифенокси)гексан-со-себациновую кислоту) (ram^CPH-SA) или поли(1,3-бис-(п-карбоксифенокси)пропан-со-себациновую кислоту) (ram^CPP-SA).
В некоторых вариантах осуществления узел ветвления связывает один гидрофобный полимерный сегмент с тремя гидрофильными полиэтиленгликолевыми полимерными сегментами. В некоторых случаях конъюгат полимер-лекарственное средство может быть представлен формулой I
.L-PEG
Формула
где A представляет собой ингибитор HIF-1;
L представляет собой, независимо для каждого случая, эфир (например, -O-), тиоэфир (например, -S-), вторичный амин (например, -NH-), третичный амин (например, -NR-), вторичный амид (например, -NHCO-; -CONH-), третичный амид (например, -NRCO-; -CONR-), вторичный карбамат (например, -OCONH-; -NHCOO-), третичный карбамат (например, -OCONR-; -NRCOO-), мочевину (например,
-NHCONH-; -NRCONH-; -NHCONR-, -NRCONR-), сульфинильную группу (например, -SO-) или сульфо
нильную группу (например, -SOO-);
R представляет собой, отдельно для каждого случая, алкильную, циклоалкильную, гетероциклоал-кильную, алкиларильную, алкенильную, алкинильную, арильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную одним-пятью заместителями, независимо выбранными из алкила, циклопропила, циклобутилового эфира, амина, галогена, гидроксила, эфира, нитрила, CF3, сложного эфира, амида, мочевины, карбамата, тиоэфира, карбоновой кислоты и арила;
PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь; и
X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент.
В некоторых вариантах осуществления узел ветвления представляет собой молекулу лимонной кислоты и гидрофильные полимерные сегменты представляют собой полиэтиленгликоль. В таких случаях
конъюгат полимер-лекарственное средство может быть представлен формулой IA
Формула IA,
где A представляет собой ингибитор HIF-1;
D представляет собой, независимо для каждого случая, O или NH; PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь; и X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент.
X может быть любым биосовместимым гидрофобным полимером или сополимером. В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимер или сополимер является биоразлагаемым. В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимер представляет собой полиангидрид, такой как полисебациновый ангидрид, или его сополимер.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство можно использовать для формирования имплантатов (например, стержней, дисков, пластин и так далее), наночастиц или микрочастиц с улучшенными свойствами для контролируемой доставки ингибиторов HIF-1.
Предложены также фармацевтические композиции, содержащие имплантаты (например, стержни, диски, пластины и так далее), наночастицы, микрочастицы или их сочетания для контролируемого высвобождения одного или более ингибиторов HIF-1 в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Наночастицы, микрочастицы или их сочетания могут быть образованы из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, или смесей конъюгатов полимер-лекарственное средство с одним или более полимерами. Имплантаты (например, стержни, диски, пластины и так далее), наночастицы, микрочастицы или их сочетания могут быть также образованы из полимерной матрицы, в которой один или более ингибиторов HIF-1 диспергированы или инкапсулированы.
Фармацевтические композиции можно вводить для лечения или профилактики заболевания или нарушения у пациента, которое связано с васкуляризацией, включая рак и ожирение. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции вводят для лечения или профилактики заболевания или нарушения у пациента, которое связано с окулярной неоваскуляризацией. После введения один или более ингибиторов HIF-1 высвобождаются в течение продолжительного периода времени в концентрациях, которые являются достаточно высокими, чтобы производить терапевтический эффект, однако достаточно низкими, чтобы не допускать неприемлемые уровни цитотоксичности, и при этом высвобождение продолжается гораздо дольше, чем в случае ингибитора без конъюгата.
Это продемонстрировано в случае препаратов с контролируемым высвобождением, содержащих антрациклины. Инъекция в стекловидное тело антрациклинов подавляет интраокулярную неоваскуляри-зацию, однако этот эффект недолговечен, поскольку антрациклины быстро выводятся из заднего сегмента глаза. Кроме того, антрациклины слишком токсичны для клинического применения, на что указывает резкое сокращение амплитуд b-волны скотопической ЭРГ и дегенерация сетчатки. Однако введение препарата с контролируемым высвобождением антрациклина (например, наночастиц, образованных из конъюгата полимер-лекарственное средство формулы I) обеспечивает более сильную и продолжительную антиангиогенную активность без признаков токсичности. Препарат с контролируемым высвобождением HIF-1 обеспечивает длительный терапевтический эффект без побочных эффектов за счет высвобождения низких уровней ингибитора HIF-1 в течение продолжительного периода времени.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1A-B приведены гистограммы, отображающие площадь хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) (CNV) (в мм2), наблюдаемую в глазах мышей C57BL/6 через 14 дней после разрыва у них мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией без введения ингибитора HIF-1 и после введения различных количеств доксорубицина или даунорубицина. В случае значений ХНВ, измеренных после введения HIF-1,
площадь XHB, наблюдаемая после введения HIF-1 (светлые столбики) представлена рядом с площадью ХНВ, наблюдаемой в парных глазах (ПГ) (FE), оставленных без лечения. Столбики представляют среднюю (±SEM) площадь хориоидальной HB. На фиг. 1A приведены графики площади ХНВ (в мм2), наблюдаемой в глазах мышей C57BL/6 через 14 дней после разрыва у них мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией без введения ингибитора HIF-1 (в оба глаза (ОГ) (BE) мыши инъецировали только растворитель, левый столбик) и после введения 10, 1,0 и 0,1 мкг даунорубицина (DNR). В глазах, в которые инъецировали 10 мкг DNR, наблюдали статистически значимое сокращение площади ХНВ (P <0,001, n=10) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель. В глазах, в которые инъецировали 1,0 мкг и 0,1 мкг DNR, не наблюдали статистически значимое сокращение площади ХНВ (для 1,0 мкг P <0,082, n=10; для 0,1 мкг P <0,399, n=10) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель. На фиг. 1B приведены графики площади ХНВ (в мм2), наблюдаемой в глазах мышей C57BL/6 через 14 дней после разрыва у них мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией без введения ингибитора HIF-1 (в оба глаза (ОГ) мыши инъецировали только растворитель, левый столбик) и после введения 10, 1,0 и 0,1 мкг доксорубицина (DXR, светлые столбики). В глазах, в которые инъецировали 10 мкг DXR, наблюдали статистически значимое сокращение площади ХНВ (P <0,001, n=10) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель. В глазах, в которые инъецировали 1,0 мкг и 0,1 мкг DXR, не наблюдали статистически значимое сокращение площади ХНВ (для 1,0 мкг P <0,071, n=10; для 0,1 мкг P <0,322, n=10) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель. На обеих фиг. 1A и 1B средняя площадь ХНВ была сходной в парных глазах (ПГ) и глазах мышей, которым в оба глаза (ОГ) инъецировали только растворитель, это свидетельствовало о том, что отсутствовал системный эффект от интраокулярных инъекций ингибитора HIF-1;
на фиг. 2A-B приведены гистограммы, отображающие площадь ретинальной неоваскуляризации (РНВ) (RNV) (в мм2), наблюдаемую в глазах мышей C57BL/6 с индуцированной кислородом ишемиче-ской ретинопатией через пять дней после введения контроля-растворителя (буфер PBS без ингибитора HIF-1) и после введения различных количеств доксорубицина или даунорубицина. Столбики представляют среднюю (±SEM) площадь РНВ. На фиг. 2A приведены графики площади РНВ (в мм2), наблюдаемой в глазах мышей C57BL/6 с индуцированной кислородом ишемической ретинопатией через пять дней после введения контроля-растворителя (буфер PBS без ингибитора HIF-1, левый столбик) и после введения 1,0, 0,1 и 0,01 мкг даунорубицина (DNR). В глазах, в которые инъецировали 1,0 мкг и 0,1 мкг DNR, наблюдали статистически значимое сокращение площади РНВ (для 1 мкг P <0,001, n=6; для 0,1 мкг P=0,013, n=8). В глазах, в которые инъецировали 0,01 мкг DNR, не наблюдали статистически значимое сокращение площади РНВ (P=0,930, n=6). На фиг. 2B приведены графики площади РНВ (в мм2), наблюдаемой в глазах мышей C57BL/6 с индуцированной кислородом ишемической ретинопатией через пять дней после введения контроля-растворителя (буфер PBS без ингибитора HIF-1, левый столбик) и после введения 1,0, 0,1 и 0,01 мкг доксорубицина (DXR). В глазах, в которые инъецировали 1,0 мкг DXR, наблюдали статистически значимое сокращение площади РНВ (P <0,001, n=8). В глазах, в которые инъецировали 0,1 мкг и 0,01 мкг DXR, не наблюдали статистически значимое сокращение площади РНВ (для 0,1 мкг P=0,199, n=7; для 0,01 мкг, P=0,096, n=8);
фиг. 3A представляет собой график, демонстрирующий эффективность препарата с контролируемым высвобождением ингибитора HIF-1 (в частности, наночастиц DXR-PSA-PEG3) в лечении ХНВ в модели ХНВ на мышах. Фиг. 3A представляет собой гистограмму, отображающую площадь ХНВ (в мм2), наблюдаемую в глазах мышей C57BL/6 через 14 дней после разрыва у них мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией без введения ингибитора HIF-1 (только растворитель инъецировали в оба глаза (ОГ) мышей, левый столбик) и после введения 10, 1,0 и 0,1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3. В случае значений ХНВ, измеренных после введения различных количеств наночастиц DXR-PSA-PEG3, площадь ХНВ, наблюдаемая после введения наночастиц, графически изображена рядом с площадью ХНВ, наблюдаемой в парных газах (ПГ), оставленных без лечения. Столбики представляют среднюю (±SEM) площадь ХНВ. Во всех глазах, в которые инъецировали 10 мкг, 1,0 мкг и 0,1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3, наблюдали статистически значимое сокращение площади ХНВ (для 10 мкг P <0,001, n=10; для 1,0 мкг P=0,009, n=10; для 0,1 мкг P=0,007, n=10) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель;
фиг. 3B представляет собой график, демонстрирующий эффективность препарата с контролируемым высвобождением ингибитора HIF-1 (в частности, наночастиц DXR-PSA-PEG3) в лечении сформировавшейся ХНВ в модели ХНВ на мышах. В этом случае, мембрану Бруха у мышей C57BL/6 разрывали лазерной фотокоагуляцией и давали возможность ХНВ разрастаться в течение семи дней. Затем в одной группе измеряли базовую площадь ХНВ и остальных мышей лечили инъекцией 1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 в один глаз и инъекцией только растворителя в парный глаз. Еще через семь дней измеряли площадь ХНВ в глазах, которые лечили DXR-PSA-PEG3 и растворителем. На фиг. 3B приведена гистограмма, отображающая площадь ХНВ (в мм2), наблюдаемую через семь дней после введения 1 мкг нано-частиц DXR-PSA-PEG3 (левый столбик) и 14 дней после разрыва мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией. Площадь ХНВ (в мм2), наблюдаемую через семь дней после введения 1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 и 14 дней после разрыва мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией, сравнивали с площадью
ХНВ, измеренной в парных глазах, в которые инъецировали только растворитель (центральный столбик), через 14 дней после разрыва мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией и семь дней после инъекции растворителя и не подвергавшихся лечению глазах через семь дней после разрыва мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией (базовая линия; правый столбик). Наблюдали статистически значимое сокращение площади ХНВ (P <0,001, n=10), как относительно парных глаз, в которые инъецировали только растворитель (центральный столбик), так и относительно базовой ХНВ, наблюдаемой через семь дней после разрыва мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией в не подвергавшихся лечению глазах (правый столбик), это свидетельствовало о том, что лечение DXR-PSA-PEG3 не только значительно уменьшало ХНВ (сравните левый и средний столбики), но также способствовало регрессу существующей ХНВ (сравните левый и правый столбики);
фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий эффективность препарата с контролируемым высвобождением ингибитора HIF-1 (в частности, наночастиц DXR-PSA-PEG3) в лечении РНВ у мышей с индуцированной кислородом ишемической ретинопатией. Фиг. 4 представляет собой гистограмму, отображающую площадь РНВ (в мм2), наблюдаемую в глазах мышей C57BL/6 с индуцированной кислородом ишемической ретинопатией через пять дней после введения контроля-растворителя (буфер PBS без ингибитора HIF-1, правый столбик) и после введения 1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 (левый столбик). Столбики представляют среднюю (±SEM) площадь РНВ. Наблюдали статистически значимое сокращение площади РНВ (P <0,001, n=8) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель;
на фиг. 5A-B приведены графики, демонстрирующие способность препарата с контролируемым высвобождением ингибитора HIF-1 (в частности, наночастиц DXR-PSA-PEG3) подавлять субретинальную неоваскуляризацию (НВ) у трансгенных мышей, у которых промотор родопсина направляет экспрессию VEGF в фоторецепторах (rho/VEGF мыши), в течение по меньшей мере 35 дней. В постнатальный день (P) 14, гемизиготным по rho/VEGF мышам делали интраокулярную инъекцию 10 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 в один глаз и только растворителя (буфера PBS) в парный глаз. Фиг. 5A представляет собой гистограмму, отображающую площадь НВ (в мм2) на сетчатку, наблюдаемую через четыре недели после интраокулярной инъекции 10 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 (левый столбик). Наблюдали статистически значимое сокращение площади НВ на сетчатку (P=0,042, n=5) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель. Фиг. 5B представляет собой гистограмму, отображающую площадь НВ (в мм2) на сетчатку, наблюдаемую через пять недель после интраокулярной инъекции 10 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 (левый столбик). Наблюдали статистически значимое сокращение площади НВ на сетчатку (P=0,007, n=5) по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали только растворитель;
на фиг. 6A приведен график, демонстрирующий распределение объема микрочастиц по размерам, определенное с использованием Coulter Multisizer. На фиг. 6B приведен график, демонстрирующий распределение объема наночастиц по размерам, определенное с использованием Coulter Multisizer;
на фиг. 7A приведен график, демонстрирующий количество высвобожденного конъюгата лекарственного средства (нМ) во внутриглазную жидкость (ВЖ) (АН) в зависимости от времени (дни) из микрочастиц и наночастиц, инъецированных в глаза кроликов. Фиг. 7В представляет собой гистограмму для сравнения количеств высвобожденного конъюгата лекарственного средства DXR (нМ) во внутриглазной жидкости (ВЖ) и стекловидном теле в глазах кроликов, в которые инъецировали частицы. Время (дни) составляло 105 для животных, которым вводили наночастицы, и 115 для животных, которым вводили микрочастицы;
на фиг. 8 приведен график, демонстрирующий высвобождение конъюгата доксорубицина (DXR) in vitro (мкг) в зависимости от времени (дни) для полимерных стержней, содержащих 10% DXR (•), 30% DXR (¦) и 50% DXR (А);
на фиг. 9A приведен график, демонстрирующий in vitro профиль высвобождения конъюгата доксо-рубицина (DXR) из микрочастиц, полученных из DXR-SA-PEG3 (¦) и DXR-SA-CPH-PEG (А). На фиг. 9B приведен график, демонстрирующий in vitro профиль высвобождения конъюгата доксорубицина (DXR) из микрочастиц, полученных из DXR-SA-CPH-PEG3 (А).
Подробное описание изобретения
I. Определения.
Используемый в настоящем документе термин "активное средство" относится к физиологически или фармакологически активному веществу, которое действует на местном и/или на системном уровне в организме. Активное средство представляет собой вещество, которое вводят пациенту для лечения (например, лекарственное средство), профилактики (например, профилактическое средство) или диагностики (например, диагностическое средство) заболевания или нарушения. Используемый в настоящем документе термин "офтальмическое лекарственное средство" или "офтальмическое активное средство" относится к средству, которое вводят пациенту для облегчения, отсрочки начала или предотвращения одного или более симптомов глазного заболевания или нарушения, или диагностическому средству, полезному для визуализации или иной оценки состояния глаза.
Используемый в настоящем документе термин "эффективное количество" или "терапевтически эф
фективное количество" означает количество конъюгата полимер-лекарственное средство, эффективное для облегчения, отсрочки начала или предотвращения одного или более симптомов, в частности, глазного заболевания или нарушения. В случае возрастной дегенерации макулы, эффективное количество конъюгата полимер-лекарственное средство отсрочивает начало, уменьшает или предотвращает потерю зрения у пациента. Используемый в настоящем документе термин "биосовместимый" и "биологически совместимый", как правило, относится к материалам, которые, вместе с любыми их метаболитами или продуктами распада, в целом, нетоксичны для реципиента и не вызывают никаких существенных неблагоприятных эффектов в организме реципиента. Вообще говоря, биосовместимые материалы представляют собой материалы, которые не вызывают существенный воспалительный или иммунный ответ при введении пациенту.
Используемый в настоящем документе термин "биоразлагаемый полимер", в целом, относится к полимеру, который будет распадаться или эродировать в результате действия ферментов и/или гидролиза в физиологических условиях на меньшие по размеру единицы или химические вещества, которые могут быть метаболизированы, элиминированы или выведены из организма субъекта. Время распада зависит от состава, морфологии, например пористости, размеров частиц полимера, а также от окружающей среды.
Используемый в настоящем документе термин "гидрофильный" означает свойство наличия сродства к воде. Например, гидрофильные полимеры (или гидрофильные полимерные сегменты) представляют собой полимеры (или полимерные сегменты), которые преимущественно растворимы в водных растворах и/или имеют тенденцию поглощать воду. Как правило, чем более гидрофильным является полимер, тем более этот полимер имеет тенденцию растворяться, смешиваться или смачиваться водой.
Используемый в настоящем документе термин "гидрофобный" означает свойство отсутствия сродства, или даже отталкивание воды. Например, чем более гидрофобным является полимер (или полимерный сегмент), тем более этот полимер (или полимерный сегмент) имеет тенденцию не растворяться, не смешиваться или не смачиваться водой.
О гидрофильности и гидрофобности можно говорить как об относительных понятиях, например, но без ограничения, о спектре гидрофильности/гидрофобности в группе полимеров или полимерных сегментов. В некоторых вариантах осуществления, в которых описаны два или более полимеров, термин "гидрофобный полимер" может быть использован на основании относительной гидрофобности полимера в сравнении с другим, более гидрофильным полимером.
Используемый в настоящем документе термин "наночастица", в целом, относится к частице, имеющей диаметр, такой как средний диаметр, от примерно 10 нм вплоть до, но не включительно, примерно 1 микрон, предпочтительно от 100 нм до примерно 1 мкм. Частицы могут иметь любую форму. Наноча-стицы, имеющие сферическую форму, как правило, называют "наносферы".
Используемый в настоящем документе термин "микрочастица", в целом, относится к частице, имеющей диаметр, такой как средний диаметр, от примерно 1 мкм до примерно 100 мкм, предпочтительно от примерно 1 мкм до примерно 50 мкм, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 30 мкм. Микрочастицы могут иметь любую форму. Микрочастицы, имеющие сферическую форму, как правило, называют "микросферы".
Используемый в настоящем документе термин "молекулярная масса", в целом, относится к относительной средней длине цепи блочного полимера, если не указано иное. На практике, молекулярную массу можно оценивать или характеризовать с использованием различных методов, включая гельпрони-кающую хроматографию (ГПХ) (GPC) или капиллярную вискозиметрию. Определенную методом ГПХ молекулярную массу называют средневзвешенной молекулярной массой (Mw), в отличие от среднечи-словой молекулярной массы (Mn). Метод капиллярной вискозиметрии позволяет оценивать молекулярную массу как характеристическую вязкость, определяемую в разбавленном растворе полимера с использованием определенного набора условий концентрации, температуры и растворителя.
Используемый в настоящем документе термин "средний размер частиц", в целом, относится к статистическому среднему размеру частиц (диаметру) в популяции частиц. Диаметр практически сферической частицы можно называть физическим или гидродинамическим диаметром. Диаметр несферической частицы можно предпочтительно называть гидродинамическим диаметром. При использовании в настоящем документе, диаметр несферической частицы может означать наибольшее линейное расстояние между двумя точками на поверхности частицы. Средний размер частиц можно измерять с помощью методов, известных в данной области, таких как метод динамического рассеяния света.
Термины "монодисперсное" и "однородное распределение по размеру" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и описывают популяцию наночастиц или микрочастиц, в которой все частицы имеют одинаковый или почти одинаковый размер. При использовании в настоящем документе, монодисперсное распределение означает распределение частиц, при котором 90% или более распределения находится в пределах 15% от среднего размера частиц, более предпочтительно в пределах 10% от среднего размера частиц, наиболее предпочтительно в пределах 5% от среднего размера частиц.
Используемый в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемый" относится к соединениям, носителям, эксципиентам, композициям и/или лекарственным формам, которые с медицинской точки зрения подходят для использования в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной
токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, с разумным соотношением польза/риск.
Используемый в настоящем документе термин "узел ветвления" относится к части конъюгата полимер-лекарственное средство, которая служит для присоединения нескольких гидрофильных полимерных сегментов к одному концу гидрофобного полимерного сегмента или нескольких гидрофобных полимерных сегментов к одному концу гидрофильного сегмента.
Используемый в настоящем документе термин "ингибитор HIF-1" относится к лекарственному средству, которое снижает уровень HIF-1 и/или его способность стимулировать транскрипцию генов, содержащих отвечающий на гипоксию элемент в их области промотора.
Используемый в настоящем документе термин "имплантат", в целом, относится к полимерному устройству или элементу, имеющему определенную структуру, размер, или иным образом сконфигурированному для имплантации, предпочтительно путем инъекции или хирургической имплантации, в определенный участок тела так, чтобы оказывать терапевтическое полезное действие за счет высвобождения одного или более ингибиторов HIF-1 в течение продолжительного периода времени в участке имплантации. Например, интраокулярные имплантаты представляют собой полимерные устройства или элементы, которые имеют определенную структуру, размер, или иным образом сконфигурированы для размещения в глазу, предпочтительно путем инъекции или хирургической имплантации, и лечения одного или более глазных заболеваний или нарушений за счет высвобождения одного или более ингибиторов HIF-1 в течение длительного периода времени. Интраокулярные имплантаты, как правило, биосовместимы с физиологическими условиями в глазу и не вызывают неблагоприятные побочные эффекты. Как правило, интраокулярные имплантаты могут быть помещены в глаз без нарушения зрения.
Диапазоны значений, определенных в настоящем документе, включают все значения в пределах диапазона, а также все поддиапазоны в пределах диапазона. Например, если диапазон определен как целое число от 0 до 10, диапазон охватывает все целые числа в пределах диапазона, а также любые и все поддиапазоны в пределах диапазона, например, 1-10, 1-6, 2-8, 3-7, 3-9 и так далее.
II. Конъюгаты полимер-лекарственное средство.
Предложены конъюгаты с контролируемым высвобождением, содержащие один или более ингибиторов HIF-1, конъюгированных с, или диспергированных в полимерном носителе для контролируемого высвобождения одного или более ингибиторов HIF-1. При введении конъюгатов с контролируемым высвобождением ингибиторов HIF-1 активность повышается и продлевается, тогда как токсичность снижается или исключается.
В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов HIF-1 диспергированы или инкапсулированы в полимерной матрице для доставки в глаза. Полимерную матрицу можно создавать из не биоразлагаемых или биоразлагаемых полимеров; однако предпочтительно полимерная матрица является биоразлагаемой. Из полимерной матрицы можно формировать имплантаты, микрочастицы, наночастицы или их сочетания для доставки в глаза. После введения один или более ингибиторов HIF-1 высвобождаются в течение продолжительного периода времени, либо при распаде полимерной матрицы, диффузии одного или более ингибиторов из полимерной матрицы, либо в результате и того, и другого. При использовании конъюгата полимер-лекарственное средство можно получать частицы с более контролируемыми нагрузками лекарственного средства и профилями высвобождения лекарственного средства.
В некоторых вариантах осуществления препарат с контролируемым высвобождением содержит частицы, образованные из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство. Конъюгаты полимер-лекарственное средство представляют собой блок-сополимеры, содержащие один или более ингибиторов HIF-1, ковалентно связанных с блок-сополимером. Как правило, конъюгаты полимер-лекарственное средство содержат ингибитор HIF-1, один или более гидрофобных полимерных сегментов и один или более гидрофильных полимерных сегментов. В некоторых случаях один или более гидрофильных полимерных сегментов присоединены к одному или более гидрофобным полимерным сегментам с помощью узла ветвления. При использовании конъюгата полимер-лекарственное средство можно получать частицы с более контролируемыми нагрузками лекарственного средства и профилями высвобождения лекарственного средства. Кроме того, растворимость конъюгата можно контролировать так, чтобы сводить к минимуму концентрацию растворимого лекарственного средства и, следовательно, токсичность.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит один или более ингибиторов HIF-1, ковалентно присоединенных к биоэродируемому полимерному сегменту. Предпочтительно, биоэродируемый сегмент, к которому присоединен ингибитор HIF-1, состоит из одного или более мономеров, которые имеют низкую растворимость в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления один или более мономеров имеют растворимость в воде менее чем 2 г/л, более предпочтительно менее чем 1 г/л, более предпочтительно менее чем 0,5 г/л, наиболее предпочтительно менее чем 0,3 г/л.
А. Структура конъюгатов полимер-лекарственное средство.
Предложены конъюгаты полимер-лекарственное средство, которые содержат ингибитор HIF-1, ко-валентно присоединенный к блок-сополимеру.
В одном варианте осуществления конъюгат имеет формулу
(A-X)m-Y- ( (Z)0-(Х)р-(A)q)n, где A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1; X представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофобный полимерный сегмент; Y отсутствует или представляет собой узел ветвления;
Z представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофильный полимерный сегмент; o, p и q независимо равны 0 или 1;
m представляет собой количество ветвей A-X и равно целому числу от одного до двадцати; и
n представляет собой количество ветвей Z, Z-X и Z-X-A и равно целому числу от нуля до двадцати,
более предпочтительно от одного до двадцати, при условии, что A не является доксорубицином, когда m
и n оба равны единице.
Иллюстративные конъюгаты полимер-лекарственное средство представлены общими формулами, приведенными ниже
где A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1;
X представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофобный полимерный сегмент;
Y отсутствует или представляет собой узел ветвления;
Z представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофильный полимерный сегмент; и
m представляет собой количество ветвей A-X и равно целому числу от одного до двадцати; и
n представляет собой количество ветвей Z, Z-X и Z-X-A и равно целому числу от нуля до двадцати,
более предпочтительно от одного до 20, при условии, что A не является доксорубицином, когда m и n
оба равны единице.
A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1. В некоторых случаях активное средство представляет собой антрациклин, такой как доксорубицин (DXR) или даунорубицин (DNR).
Один или более гидрофобных полимерных сегментов могут представлять собой любой биосовместимый гидрофобный полимер или сополимер. В некоторых случаях гидрофобный полимер или сополимер является биоразлагаемым. Примеры подходящих гидрофобных полимеров включают, но не ограничиваются ими, сложные полиэфиры, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота или по-ликапролактон, полиангидриды, такие как полисебациновый ангидрид, а также их сополимеры. В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимер представляет собой полиангидрид, такой как полисебациновый ангидрид, или его сополимер.
Профиль распада одного или более гидрофобных полимерных сегментов можно выбирать для оказания влияния на скорость высвобождения активного средства in vivo. Например, гидрофобные полимерные сегменты можно выбирать так, чтобы они распадались в течение периода времени от семи дней до 2 лет, более предпочтительно от семи дней до 56 недель, более предпочтительно от четырех недель до 56 недель, наиболее предпочтительно от восьми недель до 28 недель.
Один или более гидрофильных полимерных сегментов могут представлять собой любой гидрофильный биосовместимый нетоксичный полимер или сополимер. В некоторых вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов содержат поли(алкиленгликоль), такой как поли-этиленгликоль (PEG). В конкретных вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов представляют собой линейные цепи PEG.
В некоторых случаях конъюгат полимер-лекарственное средство содержит только один гидрофильный полимерный сегмент (т.е. n равно единице). В предпочтительных вариантах осуществления конъю-гат полимер-лекарственное средство содержит более чем одну гидрофильную полимерную цепь (т.е. n больше единицы). В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит от двух до шести, более предпочтительно от трех до пяти гидрофильных полимерных цепей. В одном варианте осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит три гидрофильных полимерных сегмента.
В тех случаях, когда присутствуют и гидрофобные и гидрофильные полимерные сегменты, общая молекулярная масса одного или более гидрофильных полимерных сегментов предпочтительно будет больше, чем молекулярная масса гидрофобного полимерного сегмента. В некоторых случаях общая молекулярная масса гидрофильных полимерных сегментов по меньшей мере в пять раз, более предпочтительно по меньшей мере в десять раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в пятнадцать раз больше, чем молекулярная масса гидрофобного полимерного сегмента.
Узел ветвления, в случае его наличия, может представлять собой органическую молекулу, содержащую три или более функциональных групп. Предпочтительно, узел ветвления будет содержать функциональные группы по меньшей мере двух различных типов (например, один или более спиртов и одну или более карбоновых кислот, или один или более галогенидов и одну или более карбоновых кислот или
один или более аминов). В таких случаях различные функциональные группы, присутствующие на узле ветвления, могут быть независимо доступны для синтетической модификации, допуская ковалентное присоединение гидрофобных и гидрофильных сегментов к узлу ветвления в контролируемых стехиомет-рических соотношениях. В некоторых вариантах осуществления узел ветвления представляет собой по-ликарбоновую кислоту, такую как лимонная кислота, виннокаменная кислота, муциновая кислота, глю-коновая кислота или 5-гидроксибензол-1,2,3-трикарбоновая кислота.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство образован из одного гидрофобного полимерного сегмента и двух или более гидрофильных полимерных сегментов, кова-лентно связанных через мультивалентный узел ветвления. Иллюстративные конъюгаты полимер-лекарственное средство такого типа представлены общей формулой, приведенной ниже
A-X-Y- (Z)n,
где A представляет собой, независимо для каждого случая, ингибитор HIF-1; X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент; Y представляет собой узел ветвления;
Z представляет собой, независимо для каждого случая, гидрофильный полимерный сегмент; и n равно целому числу от нуля до 300, более предпочтительно от нуля до пятидесяти, более предпочтительно от нуля до тридцати, наиболее предпочтительно от нуля до десяти.
A, независимо для каждого случая, представляет собой ингибитор HIF-1. В некоторых случаях ингибитор HIF-1 представляет собой антрациклин, такой как доксорубицин (DXR) или даунорубицин (DNR).
Гидрофобный полимерный сегмент может представлять собой любой биосовместимый гидрофобный полимер или сополимер. В некоторых случаях гидрофобный полимерный сегмент также является биоразлагаемым. Примеры подходящих гидрофобных полимеров включают, но не ограничиваются ими, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиангидриды, поликапролактон, а также их сополимеры. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимер представляет собой полиангидрид, такой как полисебациновый ангидрид.
Один или более гидрофильных полимерных сегментов могут представлять собой любой гидрофильный биосовместимый нетоксичный полимер или сополимер. Гидрофильный полимерный сегмент может представлять собой, например, поли(алкиленгликоль), полисахарид, поли(виниловый спирт), по-липирролидон или их сополимеры. В предпочтительных вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов представляют собой или состоят из полиэтиленгликоля (PEG).
В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит от трех до шести, более предпочтительно от трех до пяти гидрофильных полимерных цепей. В одном варианте осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит три гидрофильных полимерных сегмента.
Узел ветвления может представлять собой, например, органическую молекулу, содержащую несколько функциональных групп. Предпочтительно, узел ветвления будет содержать функциональные группы по меньшей мере двух различных типов (например, спирт и несколько карбоновых кислот или карбоновую кислоту и несколько спиртов). В некоторых вариантах осуществления узел ветвления представляет собой поликарбоновую кислоту, такую как молекула лимонной кислоты.
В некоторых вариантах осуществления узел ветвления связывает один гидрофобный полимерный сегмент с тремя гидрофильными полиэтиленгликолевыми полимерными сегментами. В некоторых случаях конъюгат полимер-лекарственное средство может быть представлен формулой I
X-PEG
Формула I,
где A представляет собой ингибитор HIF-1;
L представляет собой, независимо для каждого случая, эфир (например, -O-), тиоэфир (например, -S-), вторичный амин (например, -NH-), третичный амин (например, -NR-), вторичный амид (например, -NHCO-; -CONH-), третичный амид (например, -NRCO-; -CONR-), вторичный карбамат (например, -OCONH-; -NHCOO-), третичный карбамат (например, -OCONR-; -NRCOO-), мочевину (например,
-NHCONH-; -NRCONH-; -NHCONR-, -NRCONR-), сульфинильную группу (например, -SO-) или сульфо-
нильную группу (например, -SOO-);
R представляет собой, отдельно для каждого случая, алкильную, циклоалкильную, гетероциклоал-кильную, алкиларильную, алкенильную, алкинильную, арильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную одним-пятью заместителями, независимо выбранными из алкила, циклопропила, циклобутилового эфира, амина, галогена, гидроксила, эфира, нитрила, CF3, сложного эфира, амида, мочевины, карбамата, тиоэфира, карбоновой кислоты и арила;
PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь; и X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент.
В некоторых вариантах осуществления узел ветвления представляет собой молекулу лимонной кислоты и гидрофильные полимерные сегменты представляют собой полиэтиленгликоль. В таких случаях конъюгат полимер-лекарственное средство может быть представлен формулой IA
Формула IA, где A представляет собой ингибитор HIF-1;
D представляет собой, независимо для каждого случая, O или NH; PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь; и X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент.
В некоторых вариантах осуществления D представляет собой, в каждом отдельном случае, O. В других вариантах осуществления D представляет собой, в каждом отдельном случае, NH. В других вариантах осуществления D представляет собой, независимо для каждого случая, O или NH.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство представлен следующей формулой
А-Х,
где A представляет собой ингибитор HIF-1; и
X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, предпочтительно полиангидрид. B. Ингибиторы HIF-1.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство содержат один или более ингибиторов HIF-1. Любой подходящий ингибитор HIF-1 можно включать в конъюгаты полимер-лекарственное средство. Предпочтительно, один или более ингибиторов HIF-1 представляют собой ингибиторы HIF-1a. Ингибиторы могут быть малыми молекулами и/или биомолекулами или макромолекулами (например, белками, ферментами, нуклеиновыми кислотами, факторами роста, полисахаридами, липидами и так далее). В некоторых случаях низкомолекулярное активное средство имеет молекулярную массу менее чем примерно 2000 г/моль, предпочтительно менее чем примерно 1500 г/моль, более предпочтительно менее чем примерно 1200 г/моль, наиболее предпочтительно менее чем примерно 1000 г/моль. В других вариантах осуществления низкомолекулярное активное средство имеет молекулярную массу менее чем примерно 500 г/моль. Биомолекулы, как правило, имеют молекулярную массу более чем примерно 2000 г/моль и могут состоять из повторяющихся единиц, таких как аминокислоты (пептиды, белки, ферменты и так далее) или азотистые основания (нуклеиновые кислоты).
В предпочтительном варианте осуществления один или более ингибиторов HIF-1 представляют собой антрациклины. Антрациклины, такие как доксорубицин (DXR) и даунорубицин (DNR), представляют собой противораковые химиотерапевтические средства, которые связываются с ДНК и подавляют пролиферацию раковых клеток. Независимо от их активности в отношении клеточной пролиферации DXR и DNR подавляют транскрипционную активность HIF-1.
Антрациклины представляют собой гликозиды, агликон которых является тетрациклическим производным антрахинона. Термин антрациклин охватывает соединения класса природных антрациклинов, а также их синтетические или полусинтетические аналоги и производные, их пролекарства и их фармацевтически приемлемые соли. Используемые в настоящем документе термины "аналоги" и "производные", как правило, относятся к соединениям, в которых сохранено антрациклиновое ядро, т.е. тетрацик-лическое ядро, но существует различие по одной или более функциональным группам, присоединенным к ядру. В некоторых вариантах осуществления производные и аналоги отличаются по фрагменту аглико-на и/или сахарному остатку, присоединенному к молекуле.
Любой антрациклин, который обеспечивает терапевтический эффект, может быть включен в конъ-югаты полимер-лекарственное средство. Предпочтительно, антрациклин представляет собой соединение, которое используется или подходит для клинического применения в качестве антинеопластического средства при химиотерапии рака. Примеры природных соединений в классе антрациклинов включают даунорубицин и доксорубицин, которые продуцируются микроорганизмами, принадлежащими к роду Streptomyces.
Примеры предпочтительных антрациклинов включают доксорубицин, даунорубицин, 13-дезоксидоксорубицин (также известный как GPX-100), иодоксорубицин, эпирубицин, ТНР-адриамицин, идарубицин, меногарил, аклациномицин A (также известный как акларубицин), зорубицин, пираруби
цин, валрубицин, амрубицин, иодоксорубицин, неморубицин, (4R)-1-(4-карбокси-1-оксобутил)-4-гидрокси-L-пролил-L-аланил-L-серил(2R)-2-циклогексилглицил-L-глютаминил-L-серил-L-лейцин (также известный как L 377202), 4'-дезокси-4'-иодоксорубицин. Дополнительные антрациклины, которые можно включать в конъюгаты полимер-лекарственное средство, известны в данной области. См., например, Suarato et al. Chimicaoggi, 9-19 (April 1990); J.W. Lown: Pharmac. Ther. 60: 185-214 (1993); F.M. Arcamone: Biochimie, 80, 201-206 (1998); C. Monneret: Eur. J. Med. Chem. 36: 483-493 (2001) и патенты США № 4438015, 4672057, 5646177, 5801257 и 6284737.
Конъюгат полимер-лекарственное средство может также содержать фармацевтически приемлемую соль антрациклина. В некоторых случаях может быть желательным включать соль антрациклина в конъ-югат полимер-лекарственное средство из-за одного или более полезных физических свойств солей, например повышенной стабильности или желательной растворимости, или профиля растворения. Соли соединений антрациклина можно получать с использованием стандартных методов, известных в данной области. Список подходящих солей можно найти, например, в книге Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, p. 704.
Конъюгат полимер-лекарственное средство может также содержать пролекарство антрациклина. Пролекарства антрациклина представляют собой соединения, которые могут превращаться в биологически активный антрациклин, либо in vivo после введения, либо in vitro до введения соединения. Примеры подходящих пролекарств антрациклина известны в данной области. См, например, патент США № 5710135 Leenders et al., патент США № 6268488, вьщанный Barbas III et al., WO 92/19639, выданный J. Iacquesy et al., K. Bosslet et al. Cancer Res. 54: 2151-2159 (1994), S. Andrianomenjanahary et al. Bioorg. Med. Chem Lett. 2: 1093-1096 (1992) и J.-P. Gesson et al. Anti-Cancer Drug Des. 9: 409-423 (1994).
Другие подходящие ингибиторы HIF-1 включают, без ограничения, полиамиды, такие как эхино-мицин (NSC-13502) (Kong et al., Cancer Research, 65(19): 9047-9055 (2005) и Olenyuk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 16768-16773 (2004)), который ингибирует взаимодействие между HIF и ДНК; эпиди-тиодикетопиперазины, такие как хетомин (Kung et al., Cancer Cell. 6(3): 33-43 (2004)), который ингибиру-ет взаимодействие между HIF и p300; бензоазагетероциклы, такие как YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол) (Yeo et al., Journal of the National Cancer Institute. 95(7): 516-525 (2003)); ради-цикол и его аналоги, такие как KF58333 (Kurebayashi et al., Cancer Research 92: 1342-1351 (2001)); рапа-мицины, включая рапамицин и его аналоги, такие как темсиролимус (CCI779) и эверолимус (RAD001) (Majumder et al. Nature Medicine 10: 594-601 (2004)); гелданамицины, включая гелданамицин и его аналоги, такие как 17-аллиламино-17-деметоксигелданамицин (17-AAG) и 17-диметиламиноэтиламино-17-деметоксигелданамицин (17-DMAG); квинокармицина моноцитрат (KW2152) и продукт его гидроциана-ции DX-52-1 (NSC-607097) (Rapisarda et al. Cancer Research. 62(15): 4316-4324 (2002)); аналоги камптоте-цина (ингибиторы топоизомеразы I) (Rapisarda et al., Cancer Research 62(15): 4316-4324 (2002)), такие как топотекан (NSC609699), камптотецин, сложный 20-эфир^) (NSC-606985), и 9-глицинамидо-20^)-камптотецин HCl (NSC-639174); средства, нарушающие структуру микротрубочек (Escuin et al. Cancer Research 65(19): 9021-9028 (2005)), такие как паклитаксел, доцетаксел, 2-метоксиэстрадиол, винкристин, дискодермолид и эпотилон B; ингибиторы тиоредоксина (Welsh et al. Molecular Cancer Therapeutics, 2: 235-243 (2003)), такие как РХ-12 (1-метилпропил-2-имидазолил дисульфид) и плейротин; ингибиторы P13-киназы (Jiang et al. Cell Growth and Differentiation 12: 363-369 (2001)), такие как вортманнин и LY294002; ингибиторы протеинкиназы-1 (МЕК-1), такие как PD98059 (2'-амино-3'метоксифлавон); РХ-12 (1-метилпропил-2-имидазолил дисульфид); плейротин РХ-478; хиноксалин 1,4-диоксиды; натрия бу-тират (NaB); натрия нитропуррузид (SNP); 103D5R (Tan et al., Cancer Research 65:605-612 (2005)); PX-478 (S-2-амино-3-[4V-N,N-бис-(2-хлорэтил)амино]фенилпропионовой кислоты N-оксид дигидрохлорид) (Welsh et al., Molecular Cancer Therapeutics 3: 233-244 (2004) ); ингибиторы деацетилазы гистонов, такие как [(E)-(1S,4S,10S,21R)-7-[(Z)этилиден]-4,21-диизопропил-2-окса-12,13-дитиа-5,8,20,23-тетраазабицик-ло[8,7,6]трикос-16-ен-3,6,9,19,22-пентанон (FR901228, депсипептид) и FK228 (FR901228) (NSC 630176) (Mie-Lee et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 300(1): 241-246 (2003)); генистеин; инданон; стауроспорин; кумарины; аналоги барбитуровой и тиобарбитуровой кислоты; аналоги (арилок-сиацетиламино)бензойной кислоты, 2-метоксиэстрадиол и его аналоги, дигоксин и другие сердечные гликозиды (Zhang et al. PNAS 105: 19579), акрифлавин (Lee et al. PNAS 106: 17910) и соединения гидро-ксамовой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор HIF-1 представляет собой рапамицин, темсиро-лимус, эверолимус, гелданамицин, эхиномицин, доксорубицин, даунорубицин, камптотецин, топотекан, иринотекан или бортезомиб.
C. Гидрофобный полимерный сегмент.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство могут содержать один или более гидрофобных полимерных сегментов. Гидрофобные полимерные сегменты могут представлять собой гомополимеры или сополимеры.
В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент представляет собой биоразлагаемый полимер. В тех случаях, когда гидрофобный полимер является биоразлагаемым, профиль распада полимера можно выбирать для оказания влияния на скорость высвобождения активного
средства in vivo. Например, можно выбирать гидрофобный полимерный сегмент, чтобы он распадался в течение периода времени от семи дней до 2 лет, более предпочтительно от семи дней до 56 недель, более предпочтительно от четырех недель до 56 недель, наиболее предпочтительно от восьми недель до 28 недель.
Примеры подходящих гидрофобных полимеров включают полигидроксикислоты, такие как по-ли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) и поли(молочная кислота-со-гликолевая кислота); поли-гидроксиалканоаты, такие как поли-3-гидроксибутират или поли-4-гидроксибутират; поликапролактоны; поли(ортоэфиры); полиангидриды; поли(фосфазены); поли(гидроксиалканоаты); поли(лактид-со-капро-лактоны); поликарбонаты, такие как поликарбонаты на основе тирозина; полиамиды (включая синтетические и природные полиамиды), полипептиды и поли(аминокислоты); полиэфирамиды; сложные полиэфиры; поли(диоксаноны); поли(алкиленалкилаты); гидрофобные полиэфиры; полиуретаны; полиэфиры, содержащие сложноэфирные группы; полиацетали; полицианоакрилаты; полиакрилаты; полиметилме-такрилаты; полисилоксаны; сополимеры поли(оксиэтилена)/поли(оксипропилена); поликетали; полифосфаты; полигидроксивалераты; полиалкиленоксалаты; полиалкиленсукцинаты; поли(малеиновые кислоты), а также их сополимеры.
В предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент представляет собой полиангидрид. Полиангидрид может представлять собой алифатический полиангидрид, ненасыщенный полиангидрид или ароматический полиангидрид. Репрезентативные полиангидриды включают полиадипиновый ангидрид, полифумаровый ангидрид, полисебациновый ангидрид, полималеиновый ангидрид, полияблочный ангидрид, полифталевый ангидрид, полиизофталевый ангидрид, полиаспараги-новый ангидрид, политерефталевый ангидрид, полиизофталевый ангидрид, поликарбоксифеноксипропа-новый ангидрид, поликарбоксифеноксигексановый ангидрид, а также сополимеры этих полиангидридов с другими полиангидридами в различных мольных соотношениях. Другие подходящие полиангидриды раскрыты в патентах США № 4757128, 4857311, 4888176 и 4789724. Полиангидрид также может быть сополимером, содержащим полиангидридные блоки.
В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент представляет собой по-лисебациновый ангидрид. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент представляет собой поли(1,6-бис-(п-карбоксифенокси)гексан-со-себациновую кислоту) (mw^CPH-SA). В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент представляет собой поли(1,3-бис-(п-карбоксифенокси)пропан-со-себациновую кислоту) (rnw^CPP-SA).
Молекулярную массу гидрофобного полимера можно варьировать для получения конъюгатов полимер-лекарственное средство, которые образуют частицы, имеющие свойства, например, скорость высвобождения лекарственного средства, оптимальные для конкретных вариантов применения. Гидрофобный полимерный сегмент может иметь молекулярную массу от примерно 150 Да до 1 МДа. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный полимерный сегмент имеет молекулярную массу от примерно 1 кДа до примерно 100 кДа, более предпочтительно от примерно 1 кДа до примерно 50 кДа, наиболее предпочтительно от примерно 1 кДа до примерно 25 кДа.
В некоторых случаях гидрофобный полимерный сегмент имеет молекулярную массу, которая меньше чем средняя молекулярная масса одного или более гидрофильных полимерных сегментов конъ-югата полимер-лекарственное средство. В предпочтительном варианте осуществления гидрофобный полимерный сегмент имеет молекулярную массу менее чем примерно 5 кДа.
D. Гидрофильные полимеры.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство могут также содержать один или более гидрофильных полимерных сегментов. Предпочтительно, конъюгаты полимер-лекарственное средство содержат более одного гидрофильного полимерного сегмента. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит от двух до шести, более предпочтительно от трех до пяти гидрофильных полимерных сегментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство содержит три гидрофильных полимерных сегмента.
Каждый гидрофильный полимерный сегмент может независимо представлять собой любой гидрофильный биосовместимый (т.е. не вызывающий существенный воспалительный или иммунный ответ) нетоксичный полимер или сополимер. Примеры подходящих полимеров включают, но не ограничиваются ими, поли(алкиленгликоли), такие как полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), a также сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(оле-финовый спирт), поливинилпирролидон, поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилмет-акрилат), поли(сахариды), поли(аминокислоты), поли(гидроксикислоты), поли(виниловый спирт), а также их сополимеры, терполимеры и смеси.
В предпочтительных вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов содержат поли(алкиленгликолевую) цепь. Поли(алкиленгликолевые) цепи могут содержать от 8 до 500 повторяющихся единиц, более предпочтительно от 40 до 500 повторяющихся единиц. Подходящие поли(алкиленгликоли) включают полиэтиленгликоль, полипропилен-1,2-гликоль, поли(пропиленоксид), полипропилен-1,3-гликоль, а также их сополимеры. В некоторых вариантах осуществления один или более гидрофильных полимерных сегментов представляют собой цепи PEG. В таких случаях цепи PEG
могут быть линейными или разветвленными, как те, которые описаны в патенте США № 5932462. В некоторых вариантах осуществления цепи PEG являются линейными.
Каждый из одного или более гидрофильных полимерных сегментов может независимо иметь молекулярную массу от примерно 300 Да до 1 МДа. Гидрофильный полимерный сегмент может иметь молекулярную массу в диапазоне из любых молекулярных масс, перечисленных выше. В некоторых вариантах осуществления каждый из одного или более гидрофильных полимерных сегментов имеет молекулярную массу от примерно 1 кДа до примерно 20 кДа, более предпочтительно от примерно 1 кДа до примерно 15 кДа, наиболее предпочтительно от примерно 1 кДа до примерно 10 кДа. В предпочтительном варианте осуществления каждый из одного или более гидрофильных полимерных сегментов имеет молекулярную массу примерно 5 кДа.
E. Узлы ветвления.
Конъюгаты, необязательно, содержат узел ветвления, который служит для связывания нескольких гидрофильных полимерных сегментов с одним концом гидрофобного полимерного сегмента. Узел ветвления может представлять собой любой органический, неорганический или металлоорганический фрагмент, который является поливалентным, так, чтобы обеспечивать более двух точек присоединения. В предпочтительных вариантах осуществления узел ветвления представляет собой органическую молекулу, содержащую несколько функциональных групп.
Функциональные группы могут представлять собой любой атом или группу атомов, которая содержит по меньшей мере один атом, не являющийся ни углеродом, ни водородом, при условии, что эти группы должны быть способны вступать в реакцию с гидрофобными и гидрофильными полимерными сегментами. Подходящие функциональные группы включают галогены (бром, хлор и йод); кислородсодержащие функциональные группы, такие как гидроксилы, эпоксиды, карбонилы, альдегиды, сложный эфир, карбоксилы и кислые хлориды; азотсодержащие функциональные группы, такие как амины и азиды; а также серосодержащие группы, такие как тиолы. Функциональная группа может также представлять собой углеводородный фрагмент, содержащий одну или более неароматических пи-связей, например, алкин, алкен или диен. Предпочтительно, узел ветвления будет содержать функциональные группы по меньшей мере двух различных типов (например, один или более спиртов и одну или более карбоно-вых кислот или один или более галогенидов и один или более спиртов). В таких случаях различные функциональные группы, присутствующие на узле ветвления, могут быть независимо доступны для синтетической модификации, допуская ковалентное присоединение гидрофобных и гидрофильных сегментов к узлу ветвления в контролируемых стехиометрических соотношениях.
После реакции гидрофобных и гидрофильных полимерных сегментов с функциональными группами на узле ветвления один или более гидрофобных полимерных сегментов и один или более гидрофильных полимерных сегментов будут ковалентно присоединены к узлу ветвления через связывающие фрагменты. Особенности связывающих фрагментов будут определяться особенностями функциональной группы и реакционноспособным локусом гидрофобных и гидрофильных полимерных сегментов (поскольку эти элементы вступают в реакцию с образованием связывающего фрагмента или предшественника связывающего фрагмента). Примеры подходящих связывающих фрагментов, которые связывают полимерные сегменты с узлом ветвления, включают вторичные амиды (-CONH-), третичные амиды
(-CONR-), вторичные карбаматы (-OCONH-; -NHCOO-), третичные карбаматы (-OCONR-; -NRCOO-), мочевины (-NHCONH-; -NRCONH-; -NHCONR-, -NRCONR-), карбинолы (-CHOH-, -CROH-), эфиры
(-O-) и сложные эфиры (-COO-, -CH2O2C-, CHRO2C-), где R представляет собой алкильную группу, арильную группу или гетероциклическую группу. В некоторых вариантах осуществления полимерные сегменты связаны с узлом ветвления через сложный эфир (-COO-, -CH2O2C-, CHRO2C-), вторичный амид (-CONH-) или третичный амид (-CONR-), где R представляет собой алкильную группу, арильную группу или гетероциклическую группу.
В некоторых вариантах осуществления узел ветвления представляет собой поликарбоновую кислоту, такую как лимонная кислота, виннокаменная кислота, муциновая кислота, глюконовая кислота или 5-гидроксибензол-1,2,3-трикарбоновая кислота. Иллюстративные узлы ветвления включают следующие органические соединения:
он он
F. Синтез конъюгатов полимер-лекарственное средство.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство можно получать с использованием методов синтеза, известных в данной области. Репрезентативные методологии для получения конъюгатов полимер-лекарственное средство описаны ниже. Подходящий метод синтеза конкретного конъюгата полимер-лекарственное средство можно определять с учетом ряда факторов, таких как структура конъюгата полимер-лекарственное средство, особенности полимеров, которые составляют конъюгат, особенности активного средства, а также структура соединения в целом в том, что касается совместимости функциональных групп, стратегий использования защитных групп и наличия лабильных связей.
В дополнение к методологиям синтеза, описанным ниже, в данной области известны реакции и стратегии, полезные для получения конъюгатов полимер-лекарственное средство, альтернативные тем, которые описаны в настоящем документе. См., например, March, "Advanced Organic Chemistry" 5th Edition, 2001, Wiley-Interscience Publication, New York.
Как правило, конъюгаты полимер-лекарственное средство получают, создавая сначала полимерный компонент конъюгата полимер-лекарственное средство, а затем ковалентно присоединяя активное средство. Например, схемы 1 и 2 иллюстрируют синтез конъюгата полимер-доксорубицин, содержащего док-сорубицин, связанный с полимерным сегментом из поли(себацинового ангидрида), к которому присоединена одна полиэтиленгликольная цепь (DXR-PSA-PEG).
Схема 1
о о
П Т 0 СН3 + HO-PEG-ОСНз
Схема 2
О о
де, получая ацилированный предшественник полисебациновой кислоты (PreSA). Избыток PreSA затем объединяют с метиловым эфиром полиэтиленгликоля и полимеризуют в безводных условиях полимеризации горячего расплава. Как показано на схеме 2, полученный полимер (PEG-PSA) затем может вступать в реакцию с доксорубицином, с образованием конъюгата полимер-лекарственное средство (DXR-
PSA-PEG).
Синтез иллюстративного конъюгата полимер-лекарственное средство, содержащего несколько гидрофильных полимерных сегментов (три цепи PEG), присоединенных к гидрофобному полимерному сегменту (поли(себациновому ангидриду)) через узел ветвления (лимонная кислота), описан на схемах 3 и 4.
В случае конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих узел ветвления, синтез конъю-гата полимер-лекарственное средство будет, как правило, начинаться с последовательного присоединения гидрофобного полимерного сегмента и гидрофильных полимерных сегментов к узлу ветвления, с получением полимерной части конъюгата полимер-лекарственное средство. Как показано на схеме 3, сначала лимонная кислота вступает в реакцию с CH3O-PEG-NH2 в присутствии ^№-дицикло-гексилкарбодиимида (DCC) и каталитического количества 4-диметиламинопиридина (DMAP), с образованием амидных связей между цепями PEG и тремя остатками карбоновой кислоты узла ветвления из лимонной кислоты. Полученное соединение затем вступает в реакцию с ацилированным предшественником полисебациновой кислоты (PreSA) и полимеризуется в безводных условиях полимеризации горячего расплава. Как показано на схеме 4, полученный полимер (PEG3-PSA) затем вступает в реакцию с доксо-рубицином, с образованием конъюгата полимер-лекарственное средство (DXR-PSA-PEG3).
Схема 3
III. Частицы и имплантаты для контролируемой доставки ингибиторов HIF-1.
Предложены полимерные имплантаты (например, стержни, диски, пластины и так далее), микро- 16
частицы и наночастицы для контролируемой доставки одного или более ингибиторов HIF-1, либо образованные из конъюгатов, либо содержащие конъюгаты, диспергированные или инкапсулированные в матрице. В некоторых вариантах осуществления частицы или имплантаты содержат один или более ингибиторов HIF-1, диспергированных или инкапсулированных в полимерной матрице. В предпочтительных вариантах осуществления частицы или имплантаты образованы из конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих один или более ингибиторов HIF-1, которые ковалентно связаны с полимером.
A. Частицы, образованные из конъюгатов полимер-лекарственное средство.
Микрочастицы и наночастицы можно формировать из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство. В некоторых случаях частицы образованы из одного конъюгата полимер-лекарственное средство (т.е. частицы образованы из конъюгата полимер-лекарственное средство, который содержит одно и то же активное средство, гидрофобный полимерный сегмент, узел ветвления (при наличии) и гидрофильный полимерный сегмент или сегменты).
В других вариантах осуществления частицы образованы из смеси двух или более различных конъ-югатов полимер-лекарственное средство. Например, частицы могут быть образованы из двух или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих разные ингибиторы HIF-1 и один и тот же гидрофобный полимерный сегмент, узел ветвления (при наличии) и гидрофильный полимерный сегмент или сегменты. Такие частицы можно использовать, например, для совместного введения двух или более ингибиторов HIF-1. В других случаях частицы образованы из двух или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих один и тот же ингибитор HIF-1 и разные гидрофобные полимерные сегменты, узлы ветвления (при наличии) и/или гидрофильные полимерные сегменты. Такие частицы можно использовать, например, для варьирования скорости высвобождения ингибиторов HIF-1. Частицы также могут быть образованы из двух или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих разные ингибиторы HIF-1 и разные гидрофобные полимерные сегменты, узлы ветвления (при наличии) и/или гидрофильные полимерные сегменты.
Частицы также могут быть образованы из смесей конъюгатов полимер-лекарственное средство с одним или более дополнительными полимерами. В этих случаях один или более дополнительных полимеров могут представлять собой любой из не биоразлагаемых или биоразлагаемых полимеров, описанных в разделе В ниже, хотя биоразлагаемые полимеры являются предпочтительными. В данных вариантах осуществления можно выбирать характерные особенности и количество одного или более дополнительных полимеров, например, для оказания влияния на стабильность частиц, т.е. время, необходимое для распространения до участка, где желательна доставка, и время, желательное для доставки.
В композициях, описанных в настоящем документе, полезны частицы, имеющие средний размер частиц от 10 нм до 1000 мкм. В предпочтительных вариантах осуществления частицы имеют средний размер частиц от 10 нм до 100 мкм, более предпочтительно от примерно 100 нм до примерно 50 мкм, более предпочтительно от примерно 200 нм до примерно 50 мкм. В некоторых вариантах осуществления частицы представляют собой наночастицы, имеющие диаметр от 500 до 700 нм. Частицы могут иметь любую форму, но, как правило, имеют сферическую форму.
В некоторых вариантах осуществления популяция частиц, образованных из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, представляет собой монодисперсную популяцию частиц. В других вариантах осуществления популяция частиц, образованных из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, представляет собой полидисперсную популяцию частиц. В некоторых случаях, когда популяция частиц, образованных из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, представляет собой полидисперсную популяцию частиц, более 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% распределения частиц по размерам находится в пределах 10% от среднего размера частиц.
Предпочтительно, частицы, образованные из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержат значительные количества гидрофильного полимера, такого как PEG, на своей поверхности.
B. Частицы, содержащие один или более ингибиторов HIF-1, диспергированных в полимерной матрице.
Можно также получать частицы, содержащие один или более ингибиторов HIF-1, диспергированных или инкапсулированных в полимерной матрице. Матрица может быть образована из не биоразла-гаемых или биоразлагаемых матриц, хотя биоразлагаемые матрицы являются предпочтительными. Полимер выбирают на основании времени, необходимого для стабильности in vivo, т.е. времени, необходимого для распространения до участка, где желательна доставка, и времени, желательного для достаРвкепир. езентативными синтетическими полимерами являются поли(гидроксикислоты), такие как по-ли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) и поли(молочная кислота-со-гликолевая кислота), по-ли(лактид), поли(гликолид), поли(лактид-со-гликолид), полиангидриды, полиортоэфиры, полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, такие как полиэтилен и полипропилен, полиалкиленгликоли, такие как поли(этиленгликоль), полиалкиленоксиды, такие как поли(этиленоксид), полиалкилентерефталаты, такие как поли(этилентерефталат), поливиниловые спирты, поливиниловые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливиниловые галогениды, такие как поли(винилхлорид), поливинилпирролидон, полисилокса
ны, поли(виниловые спирты), поли(винилацетат), полистирол, полиуретаны и их сополимеры, деривати-зированные целлюлозы, такие как алкилцеллюлоза, гидроксиалкилцеллюлозы, эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, нитроцеллюлозы, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксибутилметилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетат бутират целлюлозы, ацетат фталат целлюлозы, карбоксилэтилцеллюлоза, триацетат целлюлозы и натриевая соль сульфата целлюлозы (совместно называемые в настоящем документе "синтетические целлюлозы"), полимеры акриловой кислоты, метакриловой кислоты или их сополимеры или производные, включая сложные эфиры, поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакри-лат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилмет-акрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат) (совместно называемые в настоящем документе "полиакриловые кислоты"), поли(масляная кислота), поли(валериановая кислота) и поли(лактид-со-капролактон), их сополимеры и смеси. Используемый в настоящем документе термин "производные" включает полимеры, имеющие замены, добавления химических групп, например, алкила, алкилена, гидроксилирования, окисления и другие модификации, обычно используемые специалистами в данной области.
Примеры предпочтительных биоразлагаемых полимеров включают полимеры гидроксикислот, таких как молочная кислота и гликолевая кислота, а также сополимеры с PEG, полиангидриды, по-ли(орто)эфиры, полиуретаны, поли(масляную кислоту), поли(валериановую кислоту), поли(лактид-со-капролактон), их смеси и сополимеры.
Примеры предпочтительных природных полимеров включают белки, такие как альбумин и прола-мины, например зеин, а также полисахариды, такие как альгинат, целлюлоза и полигидроксиалканоаты, например, полигидроксибутират.
Стабильность матрицы in vivo можно регулировать в процессе производства за счет использования таких полимеров, как полилактид-со-гликолид, сополимеризованный с полиэтиленгликолем (PEG). PEG в случае экспонирования на внешней поверхности может продлевать время циркуляции этих материалов, поскольку он является гидрофильным.
Примеры предпочтительных не биоразлагаемых полимеров включают этиленвинилацетат, по-ли(мет)акриловую кислоту, полиамиды, их сополимеры и смеси.
В композициях, описанных в настоящем документе, полезны частицы, имеющие средний размер частиц от 10 нм до 1000 мкм. В предпочтительных вариантах осуществления частицы имеют средний размер частиц от 10 нм до 100 мкм, более предпочтительно от примерно 100 нм до примерно 50 мкм, более предпочтительно от примерно 200 нм до примерно 50 мкм. В некоторых вариантах осуществления частицы представляют собой наночастицы, имеющие диаметр от 500 до 700 нм. Частицы могут иметь любую форму, но, как правило, имеют сферическую форму.
C. Методы получения микрочастиц и наночастиц.
Микрочастицы и наночастицы можно получать с использованием любого подходящего метода формирования полимерных микро- или наночастиц, известного в данной области. Метод, используемый для получения частиц, будет зависеть от множества факторов, включая характеристики полимеров, присутствующих в конъюгате полимер-лекарственное средство или полимерной матрице, а также желаемый размер частиц и распределение по размерам. Тип ингибитора(ов) HIF-1, включаемых в состав частиц, также может являться одним из факторов, поскольку некоторые ингибиторы HIF-1 являются нестабильными в присутствии некоторых растворителей, в определенных диапазонах температур и/или в определенных диапазонах pH.
В ситуациях, когда желательно получать монодисперсную популяцию частиц, частицы могут быть образованы с помощью метода, которым получают монодисперсную популяцию наночастиц. Альтернативно, можно использовать методы получения наночастиц с полидисперсным распределением, и частицы можно разделять методами, известными в данной области, такими как просеивание, после образования частиц для получения популяции частиц, имеющих желаемый средний размер частиц и распределение частиц по размерам.
Обычные методы получения микрочастиц и наночастиц включают, но не ограничиваются ими, выпаривание растворителя, формирование частиц горячим расплавом, удаление растворителя, сушку распылением, обращение фаз, коацервацию и низкотемпературное литье. Подходящие методы образования частиц кратко описаны ниже. Фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая изменяющие pH средства, дезинтегрирующие средства, консерванты и антиоксиданты, необязательно, можно включать в частицы в процессе образования частиц.
1. Выпаривание растворителя.
В данном методе конъюгат полимер-лекарственное средство (или полимерную матрицу и один или более ингибиторов HIF-1) растворяют в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Затем органический раствор, содержащий конъюгат полимер-лекарственное средство, суспендируют в водном растворе, содержащем поверхностно-активное вещество, такое как поли(виниловый спирт). Полученную эмульсию перемешивают до испарения большей части органического растворителя, при этом остаются твердые наночастицы. Полученные в результате наночастицы промывают водой и сушат в те
чение ночи в лиофилизаторе. Таким методом можно получать наночастицы с разными размерами и морфологией.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство, содержащие лабильные полимеры, такие как некоторые полиангидриды, могут разрушаться в процессе изготовления из-за присутствия воды. Для этих полимеров можно использовать следующие два метода, которые осуществляют в полностью безводных органических растворителях.
2. Формирование частиц горячим расплавом.
В данном методе конъюгат полимер-лекарственное средство (или полимерную матрицу и один или более ингибиторов HIF-1) сначала расплавляют, а затем суспендируют в несмешиваемом растворителе (таком как силиконовое масло) и при непрерывном перемешивании нагревают до 5°C выше температуры плавления конъюгата полимер-лекарственное средство. После стабилизации эмульсии ее охлаждают до отверждения частиц конъюгата полимер-лекарственное средство. Полученные в результате наночастицы промывают декантацией с подходящим растворителем, таким как петролейный эфир, получая сыпучий порошок. Внешние поверхности частиц, полученных таким методом, как правило, гладкие и плотные. Формирование частиц горячим расплавом можно использовать для получения частиц, содержащих конъюгаты полимер-лекарственное средство, которые гидролитически нестабильны, например, в случае некоторых полиангидридов. Предпочтительно, конъюгат полимер-лекарственное средство, используемый для получения микрочастиц данным методом, будет иметь общую молекулярную массу менее 7
5000 Да.
3. Удаление растворителя.
Для получения частиц из конъюгатов полимер-лекарственное средство, которые гидролитически нестабильны, также можно использовать удаление растворителя. В данном методе конъюгат полимер-лекарственное средство (или полимерную матрицу и один или более ингибиторов HIF-1) диспергируют или растворяют в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Эту смесь затем суспендируют путем перемешивания в органическом масле (таком как силиконовое масло) для получения эмульсии. Из эмульсии образуются твердые частицы, которые затем можно выделять из супернатанта. Морфология внешних поверхностей сфер, полученных данным методом, в значительной степени зависит от особенностей конъюгата полимер-лекарственное средство.
4. Сушка распылением.
В данном методе конъюгат полимер-лекарственное средство (или полимерную матрицу и один или более ингибиторов HIF-1) растворяют в органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Раствор прокачивают через сопло микронизации с приводом от потока сжатого газа, и полученный аэрозоль суспендируют в циклоне нагретого воздуха, давая возможность растворителю испаряться из микрокапель, с образованием частиц. Данным методом можно получать частицы с размерами в диапазоне 0,1-10 мкм.
5. Обращение фаз.
Частицы из конъюгатов полимер-лекарственное средство можно формировать с использованием метода обращения фаз. В данном методе конъюгат полимер-лекарственное средство (или полимерную матрицу и один или более ингибиторов HIF-1) растворяют в "хорошем" растворителе, и раствор выливают в сильный осадитель для конъюгата полимер-лекарственное средство для спонтанного образования, при благоприятных условиях, микрочастиц или наночастиц. Метод можно использовать для получения наночастиц с широким диапазоном размеров, включая, например, от примерно 100 нм до примерно 10 мкм, как правило, имеющих узкое распределение частиц по размерам.
6. Коацервация.
Методы получения частиц с использованием коацервации известны в данной области, например, описаны в GB B-929406; GB B-929 401 и патентах США № 3266987, 4794000 и 4460563. Коацервация заключается в разделении раствора конъюгата полимер-лекарственное средство (или полимерной матрицы и одного или более ингибиторов HIF-1) в две несмешивающиеся жидкие фазы. Одна фаза является плотной фазой коацервата, содержащей конъюгат полимер-лекарственное средство в высокой концентрации, тогда как вторая фаза содержит конъюгат полимер-лекарственное средство в низкой концентрации. В плотной фазе коацервата конъюгат полимер-лекарственное средство образует капли с размерами в нанометровом или микрометровом диапазоне, которые затвердевают в частицы. Коацервацию можно вызывать изменением температуры, добавлением осадителя или добавлением микросоли (простая коа-цервация), либо добавлением другого полимера, в результате чего образуется межполимерный комплекс (сложная коацервация).
7. Низкотемпературное литье.
Методы для литья при очень низких температурах микросфер с контролируемым высвобождением описаны в патенте США № 5019400, выданном Gombotz et al. В данном методе конъюгат полимер-лекарственное средство (или полимерную матрицу и один или более ингибиторов HIF-1) растворяют в растворителе. Смесь затем распыляют в сосуд, содержащий жидкий осадитель при температуре ниже точки замерзания раствора конъюгата полимер-лекарственное средство, который замораживает капли конъюгата полимер-лекарственное средство. По мере того как капли и осадитель для конъюгата полимер-лекарственное средство нагреваются, растворитель в каплях оттаивает и экстрагируется в осадитель,
что делает микросферы твердыми.
D. Имплантаты, образованные из конъюгатов полимер-лекарственное средство.
Из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство можно формировать импланта-ты. В предпочтительных вариантах осуществления имплантаты представляют собой интраокулярные имплантаты. Подходящие имплантаты включают, но не ограничиваются ими, стержни, диски, пластины и тому подобное.
В некоторых случаях имплантаты получают из одного конъюгата полимер-лекарственное средство (т.е. имплантаты образованы из конъюгата полимер-лекарственное средство, который содержит одно и то же активное средство, гидрофобный полимерный сегмент, узел ветвления (при наличии) и гидрофильный полимерный сегмент или сегменты).
В других вариантах осуществления имплантаты образованы из смеси двух или более различных конъюгатов полимер-лекарственное средство. Например, имплантаты могут быть образованы из двух или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих разные ингибиторы HIF-1 и один и тот же гидрофобный полимерный сегмент, узел ветвления (при наличии) и гидрофильный полимерный сегмент или сегменты. Такие имплантаты можно использовать, например, для совместного введения двух или более ингибиторов HIF-1. В других случаях имплантаты образованы из двух или более конъю-гатов полимер-лекарственное средство, содержащих один и тот же ингибитор HIF-1 и разные гидрофобные полимерные сегменты, узлы ветвления (при наличии) и/или гидрофильные полимерные сегменты. Такие имплантаты можно использовать, например, для варьирования скорости высвобождения ингибиторов HIF-1. Имплантаты также могут быть образованы из двух или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, содержащих разные ингибиторы HIF-1 и разные гидрофобные полимерные сегменты, узлы ветвления (при наличии) и/или гидрофильные полимерные сегменты.
Имплантаты также могут быть образованы из полимерной матрицы, в которой диспергированы или инкапсулированы один или более ингибиторов HIF-1. Матрица может быть образована из любых не био-разлагаемых или биоразлагаемых полимеров, описанных в разделе В выше, хотя биоразлагаемые полимеры являются предпочтительными. Состав полимерной матрицы выбирают на основании времени, необходимого для стабильности in vivo, т.е. времени, необходимого для распространения до участка, где желательна доставка, и времени, желательного для доставки.
Имплантаты также могут быть образованы из смесей конъюгатов полимер-лекарственное средство с одним или более полимерами, описанными в разделе B выше.
1. Размер и форма имплантата.
Имплантаты могут быть любой геометрической формы, например в виде волокон, листов, пленок, микросфер, шариков, круглых дисков, стержней или пластин. Размер имплантата определяется такими факторами, как переносимость имплантата, расположение имплантата, ограничения по размерам ввиду предложенного способа введения имплантата, легкость обработки и так далее.
При использовании листов или пленок размеры листов или пленок будут находиться в диапазоне по меньшей мере примерно 0,5 мм х 0,5 мм, как правило, примерно 3-10 мм х 5-10 мм с толщиной примерно 0,1-1,0 мм для простоты обработки. При использовании волокон диаметр волокна, как правило, будет находиться в диапазоне от примерно 0,05 до 3 мм и длина волокна будет, как правило, находиться в диапазоне от примерно 0,5 до 10 мм.
Размер и форму имплантата также можно использовать для контроля скорости высвобождения, периода лечения и концентрации лекарственного средства в зоне имплантации. Более крупные имплантаты будут доставлять пропорционально большую дозу, но в зависимости от отношения площади поверхности к массе могут иметь более низкую скорость высвобождения. Конкретный размер и геометрическую форму имплантата выбирают в соответствии с участком имплантации.
Интраокулярные имплантаты могут быть сферическими и не сферическими по форме. В случае им-плантатов сферической формы имплантат может иметь наибольший размер (например, диаметр) от примерно 5 мкм до примерно 2 мм или от примерно 10 мкм до примерно 1 мм для введения с помощью иглы, более 1 мм или более 2 мм, например 3 мм или до 10 мм, для введения путем хирургической имплантации. Если имплантат имеет не сферическую форму, имплантат может иметь наибольший размер или наименьший размер от примерно 5 мкм до примерно 2 мм или от примерно 10 мкм до примерно 1 мм для введения с помощью иглы, более 1 мм или более 2 мм, например 3 мм или до 10 мм, для введения путем хирургической имплантации.
Стекловидная камера глаза человека способна вмещать относительно крупные имплантаты различной геометрической формы, имеющие длину, например, 1-10 мм. Имплантат может представлять собой цилиндрическую гранулу (например, стержень) с размерами примерно 2 мм х 0,75 мм (диаметр). Им-плантат может представлять собой цилиндрическую гранулу с длиной от примерно 7 мм до примерно 10 мм и диаметром от примерно 0,75 мм до примерно 1,5 мм. В некоторых вариантах осуществления им-плантат имеет форму экструдированного волокна с диаметром примерно 0,5 мм, длиной примерно 6 мм и массой примерно 1 мг. В некоторых вариантах осуществления размер соответствует или близок к таковому у имплантатов, уже одобренных для интраокулярной инъекции при помощи иглы: диаметр 460 мкм и длина 6 мм, а также диаметр 370 мкм и длина 3,5 мм.
Также могут быть разработаны интраокулярные имплантаты, обладающие по меньшей мере некоторой гибкостью, как для облегчения введения имплантата в глаз, например в стекловидную камеру, так и для последующего размещения имплантата. Общая масса имплантата, как правило, составляет примерно 250-5000 мкг, более предпочтительно примерно 500-1000 мкг. В некоторых вариантах осуществления интраокулярный имплантат имеет массу примерно 500 мкг, 750 мкг или 1000 мкг.
2. Методы изготовления.
Имплантаты можно изготавливать любыми подходящими методами, известными в данной области. Примеры подходящих методов для изготовления имплантатов включают методы выпаривания растворителя, методы разделения фаз, методы с использованием границы раздела фаз, методы литья, методы литьевого прессования, методы экструзии, методы коэкструзии, метод вырезания прессованием, методы вырубной штамповки, компрессионный нагрев, а также их сочетания. Подходящие методы изготовления имплантатов можно выбирать с учетом многих факторов, включая свойства полимер/полимерных сегментов, присутствующих в имплантате, свойства одного или более ингибиторов HIF-1, присутствующих в имплантате, а также желаемую форму и размер имплантата. Подходящие методы изготовления им-плантатов описаны, например, в патенте США № 4997652 и публикации патентной заявки США № US 2010/0124565.
В некоторых случаях можно использовать методы экструзии, чтобы избежать необходимости в растворителях в процессе изготовления имплантата. При использовании методов экструзии полимер/полимерные сегменты и ингибитор HIF-1 выбирают так, чтобы они были стабильны при температурах, необходимых для производства, как правило, по меньшей мере примерно 85°С. Однако в зависимости от природы полимерных компонентов и одного или более ингибиторов HIF-1 в методах экструзии можно использовать температуры от примерно 25°С до примерно 150°С, более предпочтительно от примерно 65°С до примерно 130°С.
Имплантаты можно получать коэкструзией для создания покрытия, охватывающего всю или часть поверхности имплантата. Такие покрытия могут быть эродируемыми или не эродируемыми и могут быть непроницаемыми, полупроницаемыми или проницаемыми для ингибитора HIF-1, воды или их сочетаний. Такие покрытия можно использовать для дополнительного контроля высвобождения ингибитора HIF-1 из имплантата.
Для получения имплантатов можно использовать компрессионные методы. При использовании компрессионных методов часто получают имплантаты с более высокими скоростями высвобождения, чем при использовании методов экструзии. В компрессионных методах можно использовать давление примерно 50-150 фунтов на квадратный дюйм, более предпочтительно примерно 70-80 фунтов на квадратный дюйм, даже более предпочтительно примерно 76 фунтов на квадратный дюйм и использовать температуру от примерно 0°С до примерно 115°С, более предпочтительно примерно 25°С.
IV. Фармацевтические препараты.
Фармацевтические препараты содержат один или более конъюгатов полимер-лекарственное средство в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Репрезентативные эксципиенты включают растворители, разбавители, изменяющие pH средства, консерванты, антиокси-данты, суспендирующие средства, увлажняющие средства, модификаторы вязкости, тонизирующие средства, стабилизаторы, а также их сочетания. Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты предпочтительно выбирают из материалов, которые, в целом, признаны безопасными (GRAS) и могут быть введены индивидууму, не вызывая нежелательные биологические побочные эффекты или нежелательные взаимодействия.
В некоторых случаях фармацевтический препарат содержит только один тип конъюгата или полимерных частиц для контролируемого высвобождения ингибиторов HIF-1 (например, препарат, содержащий частицы конъюгата полимер-лекарственное средство, при этом частицы конъюгата полимер-лекарственное средство, включенные в фармацевтический препарат, имеют один и тот же состав). В других вариантах осуществления фармацевтический препарат содержит два или более различных типов конъюгатов или полимерных частиц для контролируемого высвобождения ингибиторов HIF-1 (например, фармацевтический препарат содержит две или более популяций частиц конъюгата полимер-лекарственное средство, при этом популяции частиц конъюгата полимер-лекарственное средство имеют разные химические составы, разные средние размеры частиц и/или разные распределения частиц по размерам).
A. Дополнительные активные средства.
В дополнение к одному или более ингибиторам HIF-1, присутствующим в полимерных частицах, препарат может содержать одно или более дополнительных диагностических и/или профилактических средств. Активные средства могут представлять собой низкомолекулярное активное средство или биомолекулу, такую как фермент или белок, полипептид или нуклеиновая кислота. Подходящие низкомолекулярные активные средства включают органические и металлоорганические соединения. В некоторых случаях низкомолекулярное активное средство имеет молекулярную массу менее чем примерно 2000 г/моль, более предпочтительно менее чем примерно 1500 г/моль, наиболее предпочтительно менее чем
примерно 1200 г/моль. Низкомолекулярное активное средство может быть гидрофильным, гидрофобным или амфифильным соединением.
В некоторых случаях одно или более дополнительных активных средств могут быть инкапсулированы в, диспергированы в, или иным способом связаны с частицами, образованными из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных активных средств также могут быть растворены или суспендированы в фармацевтически приемлемом носителе.
В случае фармацевтических композиций для лечения глазных заболеваний препарат может содержать одно или более офтальмических лекарственных средств. В конкретных вариантах осуществления офтальмическое лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, используемое для лечения, профилактики или диагностики заболевания или нарушения заднего сегмента глаза. Неограничивающие примеры офтальмических лекарственных средств включают средства против глаукомы, средства против ангиогенеза, противоинфекционные средства, противовоспалительные средства, факторы роста, иммунодепрессанты, противоаллергические средства, а также их сочетания.
Репрезентативные средства против глаукомы включают аналоги простагландина (такие как траво-прост, биматопрост и латанопрост), антагонисты бета-андренергических рецепторов (такие как тимолол, бетаксолол, левобетаксолол и картеолол), агонисты адренергического рецептора альфа-2 (такие как бри-монидин и апраклонидин), ингибиторы карбоангидразы (такие как бринзоламид, ацетазоламин и дорзо-ламид), миотики (т.е. парасимпатомиметики, такие как пилокарпин и экотиопат), агонисты серотонинер-гических, мускариновых, дофаминергических рецепторов и агонисты адренергических рецепторов (такие как апраклонидин и бримонидин).
Репрезентативные средства против ангиогенеза включают, но не ограничиваются ими, антитела к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), такие как бевацизумаб (авастин(r)) и rhuFAb V2 (ранибизумаб, луцентис(r)), и другие анти-VEGF соединения, включая афлиберцепт (эйлеа(r)); макуген(r) (пегаптаниб натрия, анти-VEGF аптамер или EYE001) (Eyetech Pharmaceuticals); фактор(ы) пигментного эпителия (PEDF); ингибиторы COX-2, такие как целекоксиб (целебрекс(r)) и рофекоксиб (виокс(r)); интерферон альфа; интерлейкин-12 (IL-12); талидомид (таломид(r)) и его производные, такие как леналидомид (рев-лимид(r)); свкаламин; эндостатин; ангиостатин; ингибиторы рибозимов, такие как ангиозим(r) (Sirna Therapeutics); многофункциональные антиангиогенные средства, такие как неовастат(r) (AE-941) (Aeterna Laboratories, Quebec City, Canada); ингибиторы рецепторов тирозинкиназы (RTK), такие как сунитиниб (су-тент(r)); ингибиторы тирозинкиназы, такие как сорафениб (нексавар(r)) и эрлотиниб (тарцева(r)); антитела к рецептору эпидермального фактора роста, такие как панитумумаб (вектибикс(r)) и цетуксимаб (эрби-тукс(r)), а также другие средства против ангиогенеза, известные в данной области.
Противоинфекционные средства включают противовирусные средства, антибактериальные средства, противопаразитарные средства и противогрибковые средства. Репрезентативные противовирусные средства включают ганцикловир и ацикловир. Репрезентативные антибиотики включают аминогликози-ды, такие как стрептомицин, амикацин, гентамицин и тобрамицин, ансамицины, такие как гелданамицин и гербимицин, карбацефемы, карбапенемы, цефалоспорины, гликопептиды, такие как ванкомицин, тей-копланин и телаванцин, линкозамиды, липопептиды, такие как даптомицин, макролиды, такие как азит-ромицин, кларитромицин, диритромицин и эритромицин, монобактамы, нитрофураны, пенициллины, полипептиды, такие как бацитрацин, колистин и полимиксин B, хинолоны, сульфонамиды и тетрацикли-ны.
В некоторых случаях активное средство представляет собой противоаллергическое средство, такое как олопатадин и эпинастин.
Противовоспалительные средства включают как нестероидные, так и стероидные противовоспалительные средства. Подходящие стероидные активные средства включают глюкокортикоиды, прогестины, минералокортикоиды и кортикостероиды.
Офтальмическое лекарственное средство может находиться в своей нейтральной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли. В некоторых случаях может быть желательным получение препарата, содержащего соль активного средства, из-за одного или более полезных физических свойств солей, например, повышенной стабильности или желательной растворимости или профиля растворения.
Как правило, фармацевтически приемлемые соли можно получать реакцией форм свободной кислоты или основания активного средства со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в их смеси; как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Фармацевтически приемлемые соли включают соли активного средства, полученные из неорганических кислот, органических кислот, соли щелочных металлов и соли щелочно-земельных металлов, а также соли, образованные в результате реакции лекарственного средства с подходящим органическим лигандом (например, четвертичные соли аммония). Списки подходящих солей можно найти, например, в книге Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, p. 704. Примеры офтальмических лекарственных средств, иногда вводимых в форме фармацевтически приемлемой соли, включают тимолол малеат, бримонидин тартрат и диклофенак натрий.
В некоторых случаях активное средство представляет собой диагностическое средство визуализации или иной оценки состояния глаза. Иллюстративные диагностические средства включают парамагнитные молекулы, флуоресцентные соединения, магнитные молекулы и радиоактивные изотопы, средства для рентгенографии и контрастные вещества.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит один или более местных анестетиков. Репрезентативные местные анестетики включают тетракаин, лидокаин, аметокаин, пропаракаин, лигнокаин и бупивакаин. В некоторых случаях одно или более дополнительных средств, таких как фермент гиалуронидаза, также добавляют в препарат для ускорения и улучшения распределения местного анестетика.
В. Препараты для введения в глаза.
Частицы, образованные из конъюгатов полимер-лекарственное средство, предпочтительно будут сформулированы в виде раствора или суспензии для инъекций в глаза.
Фармацевтические препараты для введения в глаза предпочтительно находятся в виде стерильного водного раствора или суспензии частиц, образованных из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство. Приемлемые растворители включают, например, воду, раствор Рингера, фос-фатно-солевой буфер (PBS) и изотонический раствор хлорида натрия. Препарат может также представлять собой стерильный раствор, суспензию или эмульсию в нетоксичном, парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, таком как 1,3-бутандиол.
В некоторых случаях препарат распространяют или упаковывают в жидкой форме. Альтернативно, препараты для введения в глаза можно упаковывать в твердой форме, получаемой, например, путем лио-филизации соответствующего жидкого препарата. Перед введением твердое вещество можно восстанавливать с помощью соответствующего носителя или разбавителя.
Растворы, суспензии или эмульсии для введения в глаза могут быть забуферены с помощью эффективного количества буфера, необходимого для поддержания pH, подходящего для введения в глаза. Подходящие буферы хорошо известны специалистам в данной области и некоторыми примерами полезных буферов являются ацетатный, боратный, карбонатный, цитратный и фосфатный буферы.
Растворы, суспензии или эмульсии для введения в глаза могут также содержать одно или более тонизирующих средств для регулирования изотонического диапазона препарата. Подходящие тонизирующие средства хорошо известны в данной области и некоторые примеры включают глицерин, маннит, сорбит, хлорид натрия и другие электролиты.
Растворы, суспензии или эмульсии для введения в глаза могут также содержать один или более консервантов для предотвращения бактериального загрязнения офтальмических препаратов. Подходящие консерванты известны в данной области и включают полигексаметиленбигуанидин (PHMB), бен-залкония хлорид (BAK), стабилизированные оксихлор-комплексы (также известные как Purite(r)), фенил-ртути ацетат, хлорбутанол, сорбиновую кислоту, хлоргексидин, бензиловый спирт, парабены, тимеросал, а также их смеси.
Растворы, суспензии или эмульсии для введения в глаза могут также содержать один или более эксципиентов, известных в данной области, таких как диспергирующие средства, увлажняющие средства и суспендирующие средства.
V. Способы применения.
Лекарственные препараты с контролируемым высвобождением для доставки одного или более ингибиторов HIF-1 можно использовать для лечения или профилактики заболевания или нарушения у пациента, которое связано с васкуляризацией, включая рак и ожирение. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции вводят для лечения или профилактики заболевания или нарушения у пациента, которое связано с окулярной неоваскуляризацией. После введения один или более ингибиторов HIF-1 высвобождаются в течение продолжительного периода времени в концентрациях, которые являются достаточно высокими, чтобы производить терапевтический эффект, однако достаточно низкими, чтобы не допускать цитотоксичности.
При введении в глаза частицы высвобождают низкую дозу одного или более активных средств в течение продолжительного периода времени, предпочтительно более чем 3, 7, 10, 15, 21, 25, 30 или 45 дней. Структуру конъюгата полимер-лекарственное средство или состав полимерной матрицы, морфологию частиц и дозировку вводимых частиц можно специально приспосабливать для введения терапевтически эффективного количества одного или более активных средств в глаза в течение продолжительного периода времени, при этом сводя к минимуму побочные эффекты, такие как сокращение амплитуд b-волны скотопической ЭРГ и дегенерация сетчатки.
A. Глазные заболевания и нарушения.
Фармацевтические композиции, содержащие частицы для контролируемого высвобождения одного или более ингибиторов HIF-1, можно вводить в глаза пациента, который нуждается в этом, для лечения или профилактики одного или более глазных заболеваний или нарушений. В некоторых случаях глазное заболевание или нарушение затрагивает задний сегмент глаза. Используемый в настоящем документе термин "задний сегмент глаза" означает задние две трети глаза, включая переднюю гиалоидную мембрану и все оптические структуры позади нее, такие как стекловидное тело, сетчатка, сосудистая оболочка и
зрительный нерв.
В предпочтительных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую частицы, образованные из одного или более конъюгатов полимер-лекарственное средство, предложенных в настоящем документе, вводят для лечения или профилактики интраокулярного неоваскулярного заболевания. В некоторых вариантах осуществления частицы образованы из конъюгата полимер-лекарственное средство, содержащего антрациклин, такой как даунорубицин или доксорубицин.
Глазные заболевания, особенно те, которые характеризуются окулярной неоваскуляризацией, представляют собой значительную проблему общественного здравоохранения. Интраокулярные неоваску-лярные заболевания характеризуются неконтролируемым ростом сосудов в одной или более областях глаза. Неконтролируемая васкуляризация повреждает и/или затемняет одну или более структур в глазах, приводя к потере зрения. Интраокулярные неоваскулярные заболевания включают пролиферативные ретинопатии, хориоидальную неоваскуляризацию (ХНВ), возрастную дегенерацию макулы (ВДМ), диабетическую и другие связанные с ишемией ретинопатии, диабетический отек макулы, патологическую близорукость, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзию центральной вены сетчатки (ОЦВС), неоваскуляризацию роговицы и ретинальную неоваскуляризацию (РНВ). Интраокулярные не-оваскулярные заболевания поражают миллионы людей во всем мире, во многих случаях приводя к серьезной потере зрения и снижению качества жизни и производительности труда.
Возрастная дегенерация макулы (ВДМ) является одной из ведущих причин тяжелой, невосполнимой потери зрения у пожилых людей, Bressler et al. JAMA, 291: 1900-1901 (2004). ВДМ характеризуется широким спектром клинических и патологических признаков, таких как бледно-желтые пятна, известные как друзы, разрушение пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) и дисковидная дегенерация макулы. Различают сухую (т.е. не экссудативную) или мокрую (т.е. экссуда-тивную) ВДМ. Сухая ВДМ характеризуется наличием очагов повреждения, называемых друзами. Мокрая ВДМ характеризуется неоваскуляризацией в центре поля зрения.
Хотя мокрая ВДМ встречается реже, она является причиной 80-90% случаев тяжелой потери зрения, связанной с ВДМ (Ferris et al. Arch. Ophthamol. 102: 1640-2 (1984)). Причина возникновения ВДМ неизвестна. Тем не менее, очевидно, что риск развития ВДМ увеличивается с возрастом. ВДМ также связана с факторами риска, включая заболевание в семейном анамнезе, курение, окислительный стресс, диабет, употребление алкоголя и воздействие солнечного света.
Мокрая ВДМ, как правило, характеризуется ХНВ области макулы. Хориоидальные капилляры разрастаются и проникают через мембрану Бруха, достигая пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). В некоторых случаях капилляры могут прорастать в субретинальное пространство. Повышенная проницаемость новообразованных капилляров приводит к накоплению серозной жидкости или крови под ПЭС и/или ниже, или внутри нейросенсорной сетчатки. Снижение зрения происходит, когда центральная ямка набухает или отделяется. Может развиваться фиброзная метаплазия и организация, приводя к увеличению количества субретинальной массы, называемой дисковидным шрамом, что является последней стадией ВДМ и связано с постоянной потерей зрения (D'Amico D.J. N. Engl. J. Med. 331: 95-106 (1994)).
Другие глазные заболевания и нарушения, такие как увеит, также трудно поддаются лечению существующими методами лечения. Увеит является общим термином для обозначения воспаления любых компонентов увеального тракта, таких как радужка, цилиарное тело или сосудистая оболочка. Воспаление вышележащих слоев сетчатки, называемое ретинитом, или зрительного нерва, называемое невритом зрительного нерва, может происходить с сопутствующим увеитом или без него.
Осложнения увеита в глазах могут приводить к глубокой и необратимой потере зрения, особенно если он вовремя не диагностирован или лечение было неправильным. Наиболее частые осложнения уве-ита включают отслоение сетчатки, неоваскуляризацию сетчатки, зрительного нерва или радужки, а также цистоидный отек макулы. Отек макулы (ОМ) может происходить, если набухание, утечка и фоновая диабетическая ретинопатия (ФДР) имеет место в макуле, центральной 5% области сетчатки, наиболее важной для зрения. ОМ является распространенной причиной тяжелых нарушений зрения.
Было предпринято множество попыток лечения интраокулярных неоваскулярных заболеваний, а также заболеваний, связанных с хроническим воспалением глаз, фармацевтическими препаратами. Попытки разработать клинически эффективные методы лечения были серьезно затруднены из-за сложности введения и поддержания терапевтически эффективного количества фармацевтических препаратов в тканях глаза в течение продолжительного периода времени. Кроме того, многие фармацевтические препараты вызывают значительные побочные эффекты и/или токсичность при введении в ткани глаза.
Интраокулярные неоваскулярные заболевания являются глазными заболеваниями или нарушениями, которые характеризуются окулярной неоваскуляризацией. Неоваскуляризация может происходить в одной или более областях глаза, включая роговицу, сетчатку, слой сосудистой оболочки или радужку. В некоторых случаях глазное заболевание или нарушение характеризуется образованием новых кровеносных сосудов в слое сосудистой оболочки глаза (т.е. хориоидальной неоваскуляризацией, ХНВ). В некоторых случаях глазное заболевание или нарушение характеризуется образованием кровеносных сосудов, происходящих из вен сетчатки и продолжающихся вдоль внутренней (стекловидной) поверхности сетчатки (т.е. ретинальной неоваскуляризацией, РНВ).
Иллюстративные неоваскулярные заболевания глаз включают возрастную дегенерацию макулы, связанную с хориоидальной неоваскуляризацией, пролиферативную диабетическую ретинопатию (диабетическую ретинопатию, связанную с неоваскуляризацией сетчатки, преретинальной области или радужки), пролиферативную витреоретинопатию, ретинопатию недоношенных, патологическую близорукость, болезнь Гиппеля-Линдау, синдром предполагаемого гистоплазмоза глаз (СПГГ), а также состояния, связанные с ишемией, такие как окклюзия ветки вены сетчатки, окклюзия центральной вены сетчатки, окклюзия ветки артерии сетчатки и окклюзия центральной артерии сетчатки.
Неоваскуляризация может быть вызвана опухолью. Опухоль может быть либо доброкачественной, либо злокачественной опухолью. Иллюстративные доброкачественные опухоли включают гамартомы и нейрофибромы. Иллюстративные злокачественные опухоли включают хориоидальную меланому, уве-альную меланому радужки, увеальную меланому цилиарного тела, ретинобластому или метастатическое заболевание (например, метастазы в сосудистой оболочке).
Неоваскуляризация может быть связана с ранением глаза. Например, рана может возникать в результате травматического повреждения глазного яблока, например, рваная рана роговицы. Альтернативно, рана может возникать в результате офтальмологических хирургических операций.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство можно вводить для профилактики или снижения риска пролиферативной витреоретинопатии после витреоретинальной хирургической операции, профилактики помутнения роговицы после операции на роговице (такой как трансплантация роговицы и эксимер-лазерная хирургия), профилактики закрытия угла передней камеры после трабекулоэктомии или для профилактики или значительного замедления рецидива птеригиума.
Конъюгаты полимер-лекарственное средство можно вводить для лечения или профилактики глазного заболевания, вызванного воспалением. В таких случаях конъюгат полимер-лекарственное средство предпочтительно содержит противовоспалительное средство. Иллюстративные воспалительные глазные заболевания включают, но не ограничиваются ими, увеит, эндофтальмит, а также офтальмологическую травму или хирургическую операцию.
Глазное заболевание может также быть инфекционным глазным заболеванием, таким как ретинопатия ВИЧ, токсокароз, токсоплазмоз и эндофтальмит.
Фармацевтические композиции, содержащие частицы, образованные из одного или более конъюга-тов полимер-лекарственное средство, можно также использовать для лечения или профилактики одного или более заболеваний, затрагивающих другие части глаза, таких как сухой кератит, мейбомит, глаукома, конъюнктивит (например, аллергический конъюнктивит, весенний конъюнктивит, гигантский папиллярный конъюнктивит, атопический кератоконъюнктивит), неоваскулярная глаукома с неоваскуляризацией радужки и воспаление радужки.
1. Способы введения.
a. Маршрут введения.
Препараты, описанные в настоящем документе, можно вводить местной инъекцией в стекловидное тело (например, инъекцией в переднюю, среднюю и заднюю область стекловидного тела), подконъюнк-тивальной инъекцией, внутрикамерной инъекцией, инъекцией в переднюю камеру через височную сторону лимба, интрастромальной инъекцией, инъекцией в субхороидальное пространство, инъекцией в роговицу, субретинальной инъекцией и интраокулярной инъекцией. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят инъекцией в стекловидное тело.
Имплантаты, описанные в настоящем документе, можно вводить в глаз с использованием подходящих методов имплантации, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления имплан-таты вводят инъекцией в стекловидное тело с помощью иглы, например иглы 22 калибра. Помещение имплантата в стекловидное тело можно варьировать с точки зрения размера имплантата, формы имплан-тата, а также заболевания или нарушения, которое предстоит лечить.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции и/или имплантаты, описанные в настоящем документе, вводят совместно с одним или более дополнительными активными средствами. Используемый в настоящем документе термин "совместное введение" означает введение препарата с контролируемым высвобождением одного или более ингибиторов HIF-1 совместно с одним или более дополнительными активными средствами в составе одной и той же лекарственной формы, а также введение с использованием разных лекарственных форм одновременно или практически одновременно. Используемый в настоящем документе термин "практически одновременно", как правило, означает в пределах десяти минут, предпочтительно в пределах пяти минут, более предпочтительно в пределах двух минут, наиболее предпочтительно в пределах одной минуты.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции и/или имплантаты, описанные в настоящем документе, вводят совместно с одним или более дополнительными средствами лечения глазного неоваскулярного заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции и/или имплантаты, описанные в настоящем документе, вводят совместно с одним или более средствами против ангиогенеза, такими как бевацизумаб (авастин(r)), луцентис(r) или аф-либерцепт (эйлеа(r)).
b. Дозировка.
Предпочтительно, частицы будут высвобождать эффективное количество одного или более ингибиторов HIF-1 в течение продолжительного периода времени. В предпочтительных вариантах осуществления частицы высвобождают эффективное количество одного или более ингибиторов HIF-1 в течение по меньшей мере двух недель, более предпочтительно в течение по меньшей мере четырех недель, более предпочтительно в течение по меньшей мере шести недель, наиболее предпочтительно в течение по меньшей мере восьми недель. В некоторых вариантах осуществления частицы высвобождают эффективное количество одного или более ингибиторов HIF-1 в течение трех месяцев или более.
В некоторых случаях фармацевтический препарат вводят пациенту, который нуждается в этом, в терапевтически эффективном количестве для уменьшения хориоидальной неоваскуляризации. В некоторых случаях фармацевтический препарат вводят пациенту, который нуждается в этом, в терапевтически эффективном количестве для уменьшения ретинальной неоваскуляризации.
c. Терапевтическая эффективность.
В случае возрастной дегенерации макулы терапевтическую эффективность для пациента можно измерять путем одного или более из перечисленного: оценка среднего изменения наилучшей корригированной остроты зрения (BCVA) от исходного уровня до уровня в желаемый момент времени, оценка доли пациентов, острота зрения которых снизилась менее чем на 15 знаков (три строчки) в желаемый момент времени по сравнению с исходным уровнем, оценка доли пациентов, острота зрения которых повысилась более чем или ровно на 15 знаков (три строчки) в желаемый момент времени по сравнению с исходным уровнем, оценка доли пациентов с остротой зрения по таблице Снеллена, эквивалентной 20/2000 или хуже, в желаемый момент времени, оценка с помощью анкеты зрительных функций Национального офтальмологического института США, а также оценка размера ХНВ и степени утечки при ХНВ в желаемый момент времени с использованием флуоресцентной ангиографии.
В некоторых вариантах осуществления у по меньшей мере 25%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 35%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 40% пациентов с недавно возникшей ХНВ, которых лечили препаратами, описанными в настоящем документе, наступило улучшение остроты зрения на три или более строчек.
B. Другие заболевания и нарушения.
Лекарственные препараты с контролируемым высвобождением для доставки одного или более ингибиторов HIF-1 можно использовать для лечения заболевания или нарушения у пациента, которое связано с васкуляризацией, включая рак и ожирение.
Изобретение будет дополнительно разъяснено со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Примеры
Пример 1. Получение частиц конъюгата полиангидрид-лекарственное средство. Синтез полимера.
(Полиэтиленгликоль)3-со-поли(себациновую кислоту) (PEG3-PSA) получали поликонденсацией в расплаве. Вкратце, себациновую кислоту нагревали с обратным холодильником в уксусном ангидриде, получая предшественник полимера себациновой кислоты (ацил-SA). Соединение лимонная кислота-полиэтиленгликоль (PEG3) получали методами, известными в данной области (Ben-Shabat S. et al. Mac-romol. Biosci. 6: 1019-1025 (2006)). 2,0 г CH3O-PEG-NH2, 26 мг лимонной кислоты, 83 мг дициклогексил-карбодиимида (DCC) и 4,0 мг 4-(диметиламино)пиридина (DMAP) добавляли к 10 мл метиленхлорида. Эту смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, затем осаждали, промывали эфиром и высушивали в вакууме, выделяя PEG3. Затем ацил-SA (90% по массе) и PEG3 (10 мас.%) полимери-зовали при 180°C в течение 30 мин. Газообразный азот подавали в колбу на 30 с каждые 15 мин. Реакцию проводили в течение 30 мин. Полимеры охлаждали до температуры окружающей среды, растворяли в хлороформе и осаждали избытком петролейного эфира. Осадок собирали фильтрованием и высушивали в вакууме до постоянного веса.
Получение наночастиц DXR-PSA-PEG3.
Наночастицы DXR-PSA-PEG3 получали, растворяя PEG3-PSA и DXR в определенных соотношениях в 3 мл дихлорметана и 1 мл ДМСО и проводя реакцию в течение 2 ч при 50° перед гомогенизацией (L4RT, Silverson Machines, East Longmeadow, MA) в 100 мл водного раствора, содержащего 1% поливинилового спирта (25 кДа, Sigma). Затем частицы отверждали, давая возможность хлороформу испаряться при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. Частицы собирали центрифугированием (20000xg в течение 20 мин при 4°C) и дважды промывали дважды дистиллированной водой. Размер частиц определяли методом динамического рассеяния света на приборе ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Southborough, MA). Измерение размеров проводили при 25°C при угле рассеяния света 90°.
Высвобождение DXR из наночастиц DXR-PSA-PEG3 in vitro.
Наночастицы DXR-PSA-PEG3 суспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) в концентрации 2 мг/мл и инкубировали при 37°C на вращающейся платформе (140 об/мин). В выбранные моменты времени супернатант собирали центрифугированием (13500xg в течение 5 мин) и частицы ресуспен-дировали в свежем PBS. Содержание DXR определяли по поглощению при 480 нм.
Результаты.
Наночастицы DXR-PSA-PEG3, полученные выше, содержали 23,6% DXR (по массе) и имели средний размер частиц 647 нм. Исследования in vitro показали, что DXR постоянно высвобождался из нано-частиц в виде конъюгата с себациновой кислотой в течение срока вплоть до двух недель в условиях погружения в PBS при 37°C без начальной фазы быстрого высвобождения лекарственного средства (т.е. без "взрывного эффекта").
Пример 2. Лечение хориоидальной неоваскуляризации в мышиной модели ХНВ.
Материалы и методы.
Беспатогенных мышей C57BL/6 (Charles River, Wilmington, MA) использовали в экспериментах в соответствии с положением об использовании животных в офтальмологических исследованиях Ассоциации по исследованиям зрения и офтальмологии и руководящими принципами комитета по содержанию и использованию лабораторных животных Университета Джона Хопкинса.
Хориоидальную НВ индуцировали путем разрыва мембраны Бруха лазерной фотокоагуляцией, как описано ранее (Tobe T. et al., Am. J. Pathol. 135(5): 1641-1646 (1998)). Вкратце, 5-6-недельных самок мышей C57BL/6 анестезировали кетамина гидрохлоридом (100 мг/кг массы тела) и расширяли им зрачки. Лазерную фотокоагуляцию (размер пятна 75 мкм, продолжительность 0,1 с, 120 мВт) проводили в положениях на 9, 12 и 3 ч на заднем полюсе каждого глаза с использованием щелевой лампы диодного лазера OcuLight GL (Iridex, Mountain View, CA) в качестве системы доставки и ручного покровного стекла в качестве контактной линзы для осмотра сетчатки. Образование при воздействии лазера волдыря, который указывает на разрыв мембраны Бруха, является важным фактором в создании ХНВ; таким образом, только ожоги, при которых образовывался волдырь, включали в исследование.
Сразу после индуцированного лазером разрыва мембраны Бруха мыши были рандомизированы в различные группы лечения для интраокулярных инъекций. Инъекции в стекловидное тело выполняли под препаровальной лупой с использованием системы Harvard Pump Microinjection System и стеклянных микропипеток с оттянутым концом.
Через 1, 4, 7 и 14 дней после инъекции были сделаны фотографии глазного дна при помощи камеры Micron III(r) (Phoenix Research Laboratories Inc., Pleasanton, CA). Через 14 дней мышам проводили перфузию 1 мл PBS, содержащего флуоресцеин-меченый декстран в концентрации 25 мг/мл (средняя молекулярная масса 2х106 Да; Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) и плоские препараты хориоида изучали под флуоресцентным микроскопом. Изображения получали с помощью цифровой камеры Nikon Digital Still Camera DXM1200 (Nikon Instruments Inc., New York, NY). Программное обеспечение для анализа изображений (Image-Pro(r) Plus; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) использовали для измерения общей площади ХНВ в каждом участке разрыва, при этом исследователь не был осведомлен о группах лечения.
Лечение индуцированной кислородом ишемической ретинопатии.
Мышей C57BL/6 помещали в условия с 75% содержанием кислорода в постнатальный день (P) 7, в P12 возвращали в условия комнатной атмосферы и проводили интраокулярную инъекцию PBS или PBS с содержанием даунорубицина, доксорубицина или наночастиц DXR-PSA-PEG3. В день P17 измеряли площадь ретинальной НВ на поверхности сетчатки. Вкратце, мышам в возрасте P17 проводили интрао-кулярную инъекцию 1 мкл антитела крысы против мышиной молекулы клеточной адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток 1 (PECAM-1) (Pharmingen, San Jose, CA), через 12 ч их подвергали эвтаназии и глаза фиксировали в PBS-забуференном формалине в течение 5 ч при комнатной температуре. Сетчатки иссекали, промывали и инкубировали с поликлональным антителом козы против иммуноглобулинов крысы, конъюгированным с Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), в разведении 1:500 при комнатной температуре в течение 45 мин и монтировали плоские препараты для исследования. Наблюдатель, не осведомленный о группах лечения, измерял площадь НВ на сетчатку путем анализа изображения.
Лечение индуцированной VEGF ретиналвной неоваскуляризации.
Гемизиготным трансгенным по родопсину/VEGF мышам, экспрессирующим VEGF в фоторецепторах, проводили интраокулярную инъекцию 1 мкл PBS или PBS, содержащего 10 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3, в день P14. В день P21, P28, P35, P42 или P49 мышей анестезировали, проводили перфузию флуоресцеин-меченым декстраном (средняя молекулярная масса 2х106; Sigma-Aldrich), и плоские препараты сетчатки изучали под флуоресцентным микроскопом (Axioskop2 plus; Zeiss, Thornwood, NY) при увеличении 400х, что создавало узкую глубину резкости, так что, когда неоваскуляризация вдоль внешнего края сетчатки попадала в фокус, остальная часть сосудов сетчатки находилась вне фокуса, что позволяло легко разграничивать и количественно оценивать неоваскуляризацию. Изображения были оцифрованы при помощи видеокамеры с прибором с зарядовой связью в трехцветной палитре (Cool SNAPTM-Pro; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) и устройства ввода и регистрации кадров изображений. Программное обеспечение для анализа изображений (Image-Pro Plus 5,0; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) использовали для распознавания флуоресцентно окрашенных областей неоваскуляризации и для расчета общей площади неоваскуляризации на сетчатку. Исследователь, проводящий анализ изображений, не был осведомлен о группах лечения.
Запись электроретинограмм (ЭРГ).
Взрослым мышам C57BL/6 проводили интраокулярную инъекцию 1 мкл PBS или PBS, содержащего 0,1, 1,0 или 10 мкг даунорубицина или доксорубицина, либо 1,0 или 10 мкг наночастиц DXR-PSA-
PEG3. Скотопическую и фотопическую ЭРГ записывали через один, семь и 14 дней после инъекции с использованием прибора Espion ERG Diagnosys. Для скотопических записей мышей адаптировали к темноте в течение ночи, а для фотопических записей мышей адаптировали в течение 10 мин к фоновому белому свету с интенсивностью 30 кд/м2. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина гидрохлорида (100 мг/кг массы тела) и ксилазина (5 мг/кг массы тела). Зрачки расширяли мидрином P с содержанием 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина гидрохлорида (Santen Pharmaceuticals Co., Osaka, Japan). Мышей помещали на подложку, нагретую до 39°C, и платиновые петлевые электроды помещали на каждую роговицу после нанесения раствора для гониоскопической линзы (Alcon Labs, Fort Worth, TX). Электрод сравнения помещали подкожно в передней части скальпа между глазами и заземляющий электрод вводили в хвост. Голову мыши удерживали в стандартном положении в чашеобразном осветителе, создающем безориентирное зрительное пространство, что обеспечивало одинаковое освещение глаз. Записи для обоих глаз проводили одновременно со сбалансированным электрическим сопротивлением. Запись скотопических ЭРГ проводили при 11 уровнях интенсивности белого света в диапазоне от -3,00 до 1,40 log кд-с/м2. Для каждой интенсивности вспышки рассчитывали средние значения из шести измерений. Запись фотопических ЭРГ проводили при трех уровнях интенсивности белого света в диапазоне от 0,60 до 1,40 log кд-с/м2 при уровне фона 30 кд/м2. Для каждой интенсивности вспышки рассчитывали средние значения из пяти измерений.
Измерение толщины наружного ядерного слоя (НЯС).
Измеряли толщину НЯС. Взрослым мышам C57BL/6 проводили интраокулярную инъекцию 1 мкл PBS или PBS, содержащего 0,1, 1,0 или 10 мкг даунорубицина или доксорубицина, либо 1,0 или 10 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3. Мышей подвергали эвтаназии и маркировали положение на 12:00 на лимбе роговицы, глаза удаляли и погружали в соединение с оптимальной температурой для нарезания. Замороженные срезы толщиной десять микрометров нарезали параллельно 12:00 или 9:00 меридиану через зрительный нерв и фиксировали в 4% параформальдегиде. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, изучали под микроскопом Axioskop (Zeiss, Thornwood, NY) и изображения отцифровывали при помощи видеокамеры с прибором с зарядовой связью (CCD) в трехцветной палитре (IK-TU40A; Toshiba, Tokyo, Japan) и устройством ввода и регистрации кадров изображений. Программное обеспечение Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) использовали для определения контуров НЯС. Исследователь, не осведомленный о группах лечения, измерял толщину НЯС в шести точках, соответствующих 25% (S1), 50% (S2) и 75% (S3) расстояния между верхним полюсом и зрительным нервом и 25% 50% (I2) и 75% (I3) расстояния между нижним полюсом и зрительным нервом.
Статистический анализ.
Данные выражали в виде среднего значения ±SEM. Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента и P <0,05 считали значимым. Результаты.
Антрациклины подавляют хориоидальную и ретинальную НВ.
В мышиной модели хориоидальной НВ (Tobe Т. et al. Am. J. Pathol. 153: 1641-1646 (1998)), которая позволяет прогнозировать эффекты лекарственного средства у пациентов с неовакуляризацией при ВДМ (Saishin Y. et al. J. Cell Physiol. 195: 241-248 (2003)), интраокулярная инъекция 10 мкг DNR приводила к подавлению хориоидальной НВ, тогда как инъекция 1 или 0,1 мкг не оказывала существенного влияния (фиг. 1A). Аналогично, интраокулярная инъекция 10 мкг DXR приводила к подавлению хориоидальной НВ и инъекции 1 или 0,1 мкг не оказывали существенного влияния (фиг. 1В).
У новорожденных мышей с индуцированной кислородом ишемической ретинопатией моделью для прогнозирования эффектов лечения при пролиферативной диабетической ретинопатии, интраокулярная инъекция 1 мкг DNR приводила к значительному сокращению площади ретинальной НВ, доза 0,1 мкг вызывала небольшое сокращение и доза 0,01 мкг не оказывала существенного влияния (фиг. 2A). НВ визуализировали на плоских препаратах сетчатки после in vivo иммунофлуоресцентного окрашивания анти-PECAM1, методики, позволяющей избирательно окрашивать НВ и сосуды стекловидного тела. Ин-траокулярная инъекция 1 мкг DXR, но не 0,1 или 0,01 мкг, приводила к значительному сокращению площади ретинальной НВ (фиг. 2B). Через пять дней после инъекции 1 мкг DNR или DXR осажденное лекарственное средство визуализировали на поверхности сетчатки. Средняя площадь хориоидальной или ретинальной НВ в парных глазах существенно не отличалась от таковой в глазах мышей, которым в оба глаза инъецировали растворитель, что свидетельствовало об отсутствии системного эффекта от интрао-кулярных инъекций DNR или DXR.
Эффект интраокулярных инъекций DNR или DXR на функцию сетчатки.
Поскольку DNR и DXR являются антиметаболитами, а также ингибиторами HIF-1, авторы изобретения изучили их влияние на функцию сетчатки, оцениваемую при помощи ЭРГ. Через четырнадцать дней после интраокулярных инъекций 1 мкг, но не 0,1 мкг, DNR или DXR наблюдали значительное сокращение средних амплитуд скотопической и фотопической b-волн. Эти данные свидетельствуют о том, что хотя DNR и DXR сильно подавляют НВ глаз, болюсные инъекции свободных лекарственных средств могут вызывать токсичность для сетчатки.
Токсичность для сетчатки после интраокулярной инъекции дигоксина.
Ранее было показано, что интраокулярные инъекции 0,01-0,25 мкг дигоксина приводят к подавлению транскрипционной активности HIF-1 и НВ глаз (Yoshida T. et al. FASEB J. 24: 1759-1767 (2010)). Для изучения возможности того, что пагубные эффекты DXR и DNR на функцию сетчатки связаны с подавлением ими активности HIF-1, определяли влияние интраокулярной инъекции 0,25 и 0,05 мкг дигоксина на функцию сетчатки. Через неделю после интраокулярной инъекции 0,25 мкг дигоксина наблюдали значительное сокращение средней амплитуды скотопической а-волны, средней амплитуды скотопической b-волны и средней амплитуды фотопической b-волны. Также наблюдали уменьшение толщины наружного ядерного слоя в 3 из 6 точках сетчатки, в которых проводили измерения, что свидетельствовало о гибели фоторецепторных клеток. Эти результаты согласуются с наличием значительной токсичности после ин-траокулярной инъекции 0,25 мкг дигоксина. Интраокулярная инъекция 0,05 мкг дигоксина была менее токсичной, но все еще вызывала значительное сокращение средних амплитуд скотопической и фотопи-ческой b-волн. Таким образом, в случае как антрациклинов, так и дигоксина, инъекция свободного лекарственного средства в глаза несет риск токсичности для сетчатки.
Эффект DXR-полимерных наночастиц на НВ глаз.
Эффект интраокулярной инъекции наночастиц с DXR сначала был протестирован на мышах с индуцированной лазером хориоидальной НВ. После индуцированного лазером разрыва мембраны Бруха мыши C57BL/6 получали интраокулярную инъекцию 10, 1 или 0,1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3. Фотографии глазного дна животных, получавших 1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3, показали большую оранжевую массу наночастиц, расположенных на задней поверхности сетчатки через 1 день после инъекции, которая медленно уменьшалась с течением времени и все еще была хорошо видна в день 14. Частицы оставались видимыми на протяжении периодов времени вплоть до пяти недель.
У мышей, перфузированных флуоресцеин-меченым декстраном для визуализации хориоидальной НВ методом флуоресцентной микроскопии в день 14, площадь хориоидальной НВ выглядела меньшей по размеру в глазах, получавших интраокулярную инъекцию наночастиц DXR-PSA-PEG3, по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали PBS. Анализ изображений подтвердил, что по сравнению с глазами, в которые инъецировали PBS, средняя площадь хориоидальной НВ была значительно меньше в глазах, в которые инъецировали 10, 1 или 0,1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 (фиг. 3A).
Эффект наночастиц DXR-PSA-PEG3 на уже сформировавшуюся хориоидальную НВ исследовали, давая возможность НВ разрастаться в течение 7 дней, а затем инъецируя 1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3. Через семь дней после инъекции в глазах, в которые инъецировали наночастицы DXR-PSA-PEG3, наблюдаемая средняя площадь хориоидальной НВ была значительно меньше, чем та, которую наблюдали в контрольных глазах, в которые инъецировали PBS, и кроме того, значительно меньше, чем исходная величина хориоидальной НВ, имеющей место через 7 дней (фиг. 3B). Это свидетельствовало о том, что наночастицы DXR-PSA-PEG3 вызывали регресс сформировавшейся хориоидальной НВ.
Препарат наночастиц DXR-PSA-PEG3 также изучали с использованием модели индуцированной ишемией ретинальной неоваскуляризации (Smith L.E.H. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 101-111 (1994)). Интраокулярные инъекции 1 мкг наночастиц DXR-PSA-PEG3 приводили к значительному сокращению средней площади ретинальной НВ по сравнению с парными глазами, в которые инъецировали
PBS (фиг. 4).
Длительное подавление НВ после интраокулярной инъекции DXR-полимерных наночастиц трансгенным по rho/VEGF мышам.
Трансгенные по rho/VEGF мыши, у которых промотор родопсина направляет экспрессию VEGF в фоторецепторах, характеризуются постоянной экспрессией VEGF, начиная с постнатального дня (P) 7, и являются прекрасной моделью для тестирования продолжительности действия лекарственного средства
(Okamoto N. et. al. Am. J. Pathol. 151: 281-291 (1997)).
В день P14 гемизиготные по rho/VEGF мыши получали интраокулярную инъекцию 10 мкг наноча-стиц DXR-PSA-PEG3 в один глаз и PBS в парный глаз. Через 4 (фиг. 5A) или 5 недель (фиг. 5B) средняя площадь субретинальной НВ была значительно меньше в глазах, в которые инъецировали наночастицы с DXR, чем в парных глазах, в которые инъецировали растворитель.
Интраокулярная инъекция 1 или 10 мкг наночастиц с DXR не вызывала токсичноств, определяемую путем измерения ЭРГ или толщины НЯС.
Через 14 дней после интраокулярной инъекции 10 мкг DXR-PSA-PEG3 не наблюдали значительных различий в амплитудах скотопической или фотопической b-волны по сравнению с глазами, в которые инъецировали PBS. Также не было различий в толщине наружного ядерного слоя, что свидетельствовало о том, что наночастицы с DXR не вызывали гибель фоторецепторных клеток.
Пример 3. Фармакокинетические исследования на кроликах.
Материалы и методы.
Получения полимера PEG3-PSA.
(Полиэтиленгликоль)3-со-поли(себациновую кислоту) (PEG3-PSA) синтезировали конденсацией в расплаве. Вкратце, себациновую кислоту нагревали с обратным холодильником в уксусном ангидриде, получая предшественник полимера себациновой кислоты (ацил-SA). Полиэтиленгликоль (PEG3) получали смешиванием CH3O-PEG-NH2 (2,0 г), лимонной кислоты (26 г), дициклогексилкарбодиимида (DCC;
83 мг) и 4-(диметиламино)пиридина (DMAP, 4,0 мг), которые добавляли к 10 мл метиленхлорида, перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, затем осаждали, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Затем ацил-SA (90 мас.%) и PEG3 (10 мас.%) полимеризовали при 180°C в течение 30 мин. Газообразный азот подавали в колбу на 30 с каждые 15 мин. Полимеры охлаждали до температуры окружающей среды, растворяли в хлороформе и осаждали избытком петролейного эфира. Осадок собирали фильтрованием и высушивали в вакууме до постоянного веса, получая полимер PEG3-PSA. Получение наночастиц и микрочастиц DXR-PSA-PEG3.
Для получения наночастиц DXR-PSA-PEG3 80 мг PEG3-PSA растворяли в 6 мл дихлорметана (ДХМ) и 20 мг доксорубицина гидрохлорида (DXR) (NetQem LLC, Durham, NC) растворяли в 2 мл диме-тилсульфоксида (ДМСО). Растворы полимера и лекарственного средства смешивали и оставляли при 50°C на 30 мин. Полученную смесь гомогенизировали в 50 мл 1% раствора поливинилового спирта (ПВС) (25 кДа, Polyscience, Niles, IL) при 10000 об/мин в течение 3 мин с использованием гомогенизатора L4RT (Silverson Machines, East Longmeadow, MA). Суспензию частиц перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч для удаления дихлорметана. Частицы собирали центрифугированием (20000xg в течение 20 мин при 4°C) и промывали трижды сверхчистой водой перед лиофилизацией.
Микрочастицы DXR-PSA-PEG3 получали аналогичным образом. Вкратце, 200 мг PEG3-PSA растворяли в 3 мл ДХМ и смешивали с 40 мг DXR, растворенного в 1,5 мл ДМСО. После инкубации при 50°C в течение 30 мин смесь гомогенизировали в 100 мл ПВС при 3000 об/мин в течение 1 мин. После перемешивания в течение 2 ч частицы собирали центрифугированием (9000xg в течение 25 мин) и промывали трижды перед лиофилизацией.
Характеристика частиц.
Размер частиц определяли на приборе Coulter Multisizer IV (Beckman-Coulter Inc., Fullerton, CA). Определяли размеры более 100000 частиц для каждой партии микрочастиц, чтобы определить средний диаметр частиц. Морфологию частиц характеризовали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с холодным катодом в режиме полевой эмиссии (JEOL JSM-6700F, Peabody, MA). Нагрузку лекарственного средства определяли, растворяя сухой порошок частиц в ДХМ и ДМСО и измеряя поглощение на УФ спектрофотометре при длине волны 490 нм.
Эксперименты на животных.
Для данных исследований использовали пигментированных кроликов Dutch-Belted (n=10). С животными обращались в соответствии с положением об использовании животных в офтальмологических исследованиях Ассоциации по исследованиям зрения и офтальмологии и руководящими принципами комитета по содержанию и использованию лабораторных животных Университета Джона Хопкинса. Для интраокулярных инъекций и сбора внутриглазной жидкости животных анестезировали внутримышечной инъекцией кетамина (25 мг/кг) и ксилазина (2,5 мг/кг). Когда животные находились под воздействием седативных средств, их зрачки расширяли 2,5% раствором фенилэфрин гидрохлорида и 10% раствором тропикамида. Поверхность глаз анестезировали, закапывая 0,5% раствор пропаракаина гидрохлорида.
Для инъекции иглу 26 калибра осторожно вводили в полость стекловидного тела на 1,5 мм позади надвисочной стороны лимба, при этом конец иглы был направлен в середину стекловидного тела. Суспензию микро- или наночастиц GB-AMD-101 в объеме 0,1 мл вводили в правые глаза и 0,1 мл растворителя (PBS) вводили в левые глаза. Иглу выдерживали на месте в течение 10 секунд до извлечения, чтобы предотвратить рефлюкс из входного отверстия. Животных возвращали в клетки и контролировали до окончания действия анестезии.
В указанные моменты времени внутриглазную жидкость отбирали (~0,1 мл), вводя иглу 30 калибра через лимб и извлекая внутриглазную жидкость. Образцы хранили при ~80°C до использования. В конце исследования (день 105 для животных, получавших наночастицы, и день 115 для животных, получавших микрочастицы) животных подвергали эвтаназии с использованием пентобарбитала (> 150 мг/кг). У животных извлекали глазные яблоки, стекловидное тело выделяли и хранили при -80°C до использования.
Количественное определение методом ВЭЖХ высвобожденного конъюгата лекарственного средства в образцах внутриглазной жидкости и стекловидного тела кроликов.
Перед количественным определением содержания лекарственного средства методом ВЭЖХ 100 мкл образца внутриглазной жидкости или образца стекловидного тела смешивали с 200 мкл метанола и инкубировали при 4°C в течение 3 ч. После центрифугирования (15000xg, 10 мин) и фильтрования через 0,2-мкм PTFE фильтр 150 мкл фильтрата вводили инжектором в систему ВЭЖХ Waters, снабженную колонкой c18 с обращенно-фазовой смолой (5 мкм, 4,6x250 мм; Grace, Deerfield, IL). Высвобожденный конъюгат лекарственного средства элюировали изократической подвижной фазой, содержащей воду и ацетонитрил (60:40 об.%), со скоростью 1 мл/мин и проводили детекцию с использованием детектора флуоресценции (длина волны возбуждения: 500 нм, длина волны излучения: 551 нм). По оценкам, предел обнаружения составлял 10 нг/мл. Серию водных растворов DXR в различных концентрациях использовали в качестве калибровочных стандартов. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Empower 3 для анализа данных хроматографии (Waters Corporation, Milford, MA).
Результаты.
Микрочастицы и наночастицы DXR-PSA-PEG3.
Микрочастицы и наночастицы, состоящие из конъюгата DXR-SA-PEG3, синтезировали и характеризовали, как описано. Размер частиц определяли до лиофилизации и после восстановления в растворителе (PBS). До лиофилизации средний размер микрочастиц составлял 27,2+1,0 мкм, а наночастиц 0,98+0,02 мкм (табл. 1; фиг. 6). Средняя нагрузка лекарственного средства в случае микрочастиц составляла 13% и в случае наночастиц составляла 20% (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика микро- и наночастиц DXR-PSA-PEG3
Тип
Название образца
Объем частиц по диаметру
Средняя нагрузка лекарственного средства (по массе)
лиофилизации
После восстановления в PBS
Микрочастицы
2 7,2+10,4 мкм
2 4,3+8,3 мкм
13%
Наночастицы
0,98+0,74 мкм
3,7+2,0 мкм
20%
Анализ методом СЭМ показал наличие дискретных частиц ожидаемого размера. На фиг. 6A и 6B показано распределение объема частиц по размерам для микрочастиц и наночастиц соответственно.
Длительность высвобождения лекарственного средства после введения в СТ кроликам.
Кролики получали инъекцию в стекловидное тело (0,1 мл) микрочастиц или наночастиц DXR-PSA-PEG3 в правый глаз и инъекцию только растворителя (PBS) в левый глаз. В указанные моменты времени внутриглазную жидкость (~0,1 мл) собирали и анализировали на присутствие высвобожденного конъюгата лекарственного средства количественным анализом на основе ВЭЖХ. В день 115 (группа микрочастиц) или день 105 (группа наночастиц) животных подвергали эвтаназии и собирали внутриглазную жидкость и стекловидное тело. Уровни высвобожденного лекарственного средства в ВЖ сравнивали с уровнями в стекловидном теле для каждого животного.
У всех кроликов наблюдали стабильное высвобождение лекарственного средства после введения частиц в стекловидное тело (фиг. 7A, табл. 2).
Таблица 2. Фармакокинетика доставки частиц DXR-PSA-PEG3 в стекловидное тело кроликов
DXR-P5A-PEG3 Микрочастицы
: DXR-PSA-P?Q3 Наночастицы
День
Концентрация DXR
во,внулшгшжой.жищостит
4.74 ± 2.23мкг/мл
] День
-+(tm)
Концентрация DXR 6.91 ± 2.40 мкг/мл
3.45 +. 1.76 мкг/мл
j В
2.61 + 3 "11 мкг/мл
1,63 ± 0,65 м кг/мл
S 18
1,51 ± 0.77 мкг/мл
0.78 ± 0.52 мкг/мл
: 33
0.75 + 0.41 мкг/мл
0.16 ±0.21 мкг/мл
j 57
0.37 ± 0.27мкг/мл
0.21 ± G,45-мкг/мл
: 97
0.22 + 0,26 мкг/мл
11S
0.05 + CLGSM КГ/МЛ
j 105
0.13 ± 0.18 мкг/мл
Данные представлены в виде среднего значения ±SD.
Уровни, значительно превышающие предел количественного определения ВЭЖХ анализа (10 нг/мл или 20 нМ), наблюдали в ВЖ животных, получавших как микрочастицы, так и наночастицы, на протяжении всего исследования, 115 и 105 дней соответственно (фиг. 7A). Прямое сравнение уровней высвобожденного лекарственного средства в ВЖ с уровнями в стекловидном теле выявило, что уровни в стекловидном теле были значительно выше, чем уровни, измеренные в ВЖ, вплоть до 188 раз выше в стекловидном теле, чем в ВЖ (табл. 3, фиг. 7B). Средние уровни высвобожденного лекарственного средства в случае животных, получавших микрочастицы, в день 115 составляли 0,09+0,13 мкМ в ВЖ и 7,12+12,92 мкМ в стекловидном теле. В случае животных, получавших наночастицы, в день 105 средние уровни высвобожденного лекарственного средства составляли 0,23+0,31 мкМ в ВЖ и 11,91+10,45 мкМ в стекловидном теле (табл. 3). Уровни лекарственного средства в стекловидном теле были в 77-90 раз выше, чем уровни лекарственного средства, измеренные в ВЖ.
На фиг. 7A приведен график, демонстрирующий количество высвобожденного конъюгата лекарственного средства DXR (нМ) в зависимости от времени (дни) во внутриглазной жидкости (ВЖ) кроликов, получавших инъекцию в стекловидное тело микрочастиц и наночастиц. На фиг. 7B приведена гистограмма для сравнения количеств высвобожденного лекарственного средства во внутриглазной жидкости (ВЖ) и стекловидном теле кроликов, получавших наночастицы и микрочастицы, в дни 105 и 115 соответственно.
Данные представлены в виде среднего значения ±SD.
Доставка микро- или наночастиц DXR-PSA-PEG3 в стекловидное тело глаз кролика приводила к долгосрочному высвобождению лекарственного средства, продолжающемуся в течение по меньшей мере 115 или 105 дней, соответственно, на протяжении исследования. Уровни высвобожденного лекарственного средства, измеренные в стекловидном теле, были намного выше, чем уровни, измеренные во внутриглазной жидкости, в среднем в 77-90 раз выше.
Эти данные указывают на замедленное высвобождение из DXR-PSA-PEG3 при доставке в глаза и свидетельствуют о том, что DXR-PSA-PEG3 будет многообещающим способом лечения НВ глазных заболеваний, включая ВДМ с НВ.
Пример 4. Синтез и in vitro оценка полностью биоразлагаемых стержней из DXR-PSA-PEG3.
Были успешно получены конъюгаты DXR-PSA-PEG3 в форме стержней с диаметром 0,5 мм, длиной 0,5 см и массой 1 мг с тремя уровнями нагрузки лекарственного средства доксорубицина (DXR), 10%, 30 и 50%. Конъюгат DXR высвобождался in vitro стабильно в течение по меньшей мере 25 дней в случае всех трех типов стержней.
Материалы и методы.
Получение полимера PEG3-PSA.
(Полиэтиленгликоль)3-со-поли(себациновую кислоту) (PEG3-PSA) синтезировали конденсацией в расплаве. Вкратце, себациновую кислоту нагревали с обратным холодильником в уксусном ангидриде, получая предшественник полимера себациновой кислоты (ацил-SA). Полиэтиленгликоль (PEG3) получали смешиванием CH3O-PEG-NH2 (2,0 г), лимонной кислоты (26 г), дициклогексилкарбодиимида (DCC; 83 мг) и 4-(диметиламино)пиридина (DMAP, 4,0 мг), которые добавляли к 10 мл метиленхлорида, перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, затем осаждали, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Затем ацил-SA (90 мас.%) и PEG3 (10 мас.%) полимеризовали при 180°C в течение 30 мин. Газообразный азот подавали в колбу на 30 с каждые 15 мин. Полимеры охлаждали до температуры окружающей среды, растворяли в хлороформе и осаждали избытком петролейного эфира. Осадок собирали фильтрованием и высушивали в вакууме до постоянного веса, получая полимер PEG3-PSA.
Получение стержней из DXR-PSA-PEG3.
При получении стержней DXR-PSA-PEG3 использовали три различные концентрации DXR для получения стержней с уровнями нагрузки лекарственного средства 10, 30 и 50 мас.%. Для стержней с нагрузкой лекарственного средства 10, 30 и 50% PEG3-PSA и доксорубицина гидрохлорид (DXR) (NetQem LLC, Durham, NC) добавляли к CHCl3 в соотношениях 9:1, 7:3 и 1:1 (по массе). PEG3-PSA и DXR инкубировали при 50°C в течение одного часа, после чего CHCl3 удаляли в вакууме. Продукт реакции растирали в тонкий порошок и затем прессовали в стеклянную трубку с диаметром 0,5 мм, которую использовали в качестве формы. Стержни выдавливали из пресс-формы и нарезали длиной 0,5 см. Каждый стержень весил примерно 1 мг (0,9-1,2 мг).
Высвобождение лекарственного средства in vitro.
Один стержень (~1 мг) помещали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4) и инкубировали при 37°C на вращающейся платформе (140 об/мин). В выбранные моменты времени супернатант собирали и добавляли свежий PBS. Концентрацию конъюгата DXR определяли по поглощению при 480 нм.
Результаты.
Получали конъюгаты DXR-PSA-PEG3 в форме стержней с тремя различными уровнями нагрузки
лекарственного средства, 10, 30 и 50%. Конъюгаты DXR-PSA-PEG3 формовали в стержни с диаметром 0,5 мм, длиной 0,5 см и массой 1 мг.
Продолжительность высвобождения лекарственного средства in vitro оценивали с использованием стержней из DXR-PSA-PEG3 с уровнями нагрузки лекарственного средства 10, 30 и 50% (фиг. 8). Высвобождение лекарственного средства из стержней всех трех типов было стабильным в течение по меньшей мере 25 дней.
Эти данные демонстрируют, что возможен синтез конъюгатов DXR-PSA-PEG3 в форме стержней. Стержни, состоящие из конъюгатов DXR-PSA-PEG3 с различными концентрациями лекарственного средства, были успешно синтезированы, и все стержни демонстрировали стабильное высвобождение лекарственного средства in vitro. Эти данные также свидетельствуют о том, что можно получать стержни с различными размерами, массой и содержанием лекарственного средства и оптимизировать скорости высвобождения лекарственного средства для достижения наиболее эффективного профиля доставки лекарственного средства для каждого доставляемого лекарственного средства и для каждого терапевтического показания.
Пример 5. Получение полимерных конъюгатов DXR-PCPH-PSA-PEG3.
Микрочастицы, состоящие из полностью биоразлагаемого конъюгата полимер-лекарственное средство DXR-PSA-PCPH-PEG3, были синтезированы и демонстрировали более низкую скорость высвобождения лекарственного средства и более стабильную продолжительность высвобождения лекарственного средства по сравнению с микрочастицами DXR-PSA-PEG3. Добавление CPH к полимеру повышало гид-рофобность конъюгата полимер-лекарственное средство, что приводило к увеличению продолжительности высвобождения лекарственного средства, предположительно, вследствие уменьшения растворимости
DXR.
Материалы и методы
Синтез 1,6-бис (п-карбоксифенокси)гексана (CPH) 1,6-бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) синтезировали, как описано Conix (1966). Вкратце, п-гидроксибензойную кислоту (27,6 г) и гидроксид натрия (16,0 г) в воде (80 мл) перемешивали и нагревали до температуры флегмы. 1,6-дибромгексан (96%, 15,7 мл) добавляли в течение 30 мин, поддерживая смесь при температуре флегмы, и нагревали с обратным холодильником в течение дополнительных 3,5 ч. Гидроксид натрия (4,0 г), растворенный в воде (10 мл), добавляли к смеси и нагревали с обратным холодильником еще в течение 2 ч перед тем, как оставить реакционную смесь на ночь при комнатной температуре. Динатриевую соль выделяли фильтрованием, промывали 40 мл метанола и растворяли в дистиллированной воде. Раствор нагревали до 60-70°C и подкисляли 6H серной кислотой. Двухосновную кислоту выделяли фильтрованием и высушивали до постоянного веса в вакууме.
Синтез PreCPH.
1,6-бис-(п-Карбоксифенокси)гексан (CPH) (10,0 г) нагревали с обратным холодильником в 200 мл уксусного ангидрида в течение 30 мин в атмосфере азота с последующим удалением непрореагировав-шей дикислоты фильтрованием и растворителя испарением. Осадок перекристаллизовывали из диметил-формамида и этилового эфира, промывали сухим этиловым эфиром и высушивали до постоянного веса в вакууме.
Синтез предшественника полимера PEG3-PSA-PCPH.
(Полиэтиленгликоль)3-со-поли(себациновая кислота)-со-поли(CPH) (PEG3-SA-CPH) синтезировали конденсацией в расплаве. Вкратце, себациновую кислоту нагревали с обратным холодильником в уксусном ангидриде, получая предшественник полимера себациновой кислоты (ацил-SA). Полиэтиленгликоль (PEG3) получали смешиванием CH3O-PEG-NH2 (2,0 г), лимонной кислоты (26 г), дициклогексилкарбо-диимида (DCC; 83 мг) и 4-(диметиламино)пиридина (DMAP, 4,0 мг), которые добавляли к 10 мл мети-ленхлорида, перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, затем осаждали, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Затем PEG3 (10% мас./об.), ацил-SA (60% мас./об.) и PreCPH (30% мас./об.) полимеризовали при 180°C в течение 30 мин. Газообразный азот подавали в колбу на 30 с каждые 15 мин. Полимеры охлаждали до температуры окружающей среды, растворяли в хлороформе и осаждали избытком петролейного эфира. Осадок собирали фильтрованием и высушивали в вакууме до постоянного веса, получая предшественник полимера PEG3-PSA-PCPH.
Получение микрочастиц DXR-PSA-PCPH-PEG3.
Для получения микрочастиц DXR-PSA-PCPH-PEG3 200 мг PEG3-PSA-PCPH растворяли в 3 мл ди-
хлорметана (ДХМ) и смешивали с 40 мг доксорубицина гидрохлорида (DXR) (NetQem LLC, Durham, NC), растворенного в 1,5 мл ДМСО. После инкубации при 50°C в течение 30 мин смесь гомогенизировали в 100 мл ПВС при 3000 об/мин в течение 1 мин. После перемешивания в течение 2 ч частицы собирали центрифугированием (9000xg в течение 25 мин) и промывали трижды перед лиофилизацией. Характеристика частиц.
Размер частиц определяли на приборе Coulter Multisizer IV (Beckman-Coulter Inc., Fullerton, CA). Определяли размеры более 100000 частиц для каждой партии микрочастиц, чтобы определить средний диаметр частиц.
Высвобождение лекарственного средства in vitro.
Микрочастицы DXR-PSA-PCPH-PEG3 (2 мг) суспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) и инкубировали при 37°C на вращающейся платформе (140 об/мин). В выбранные моменты времени супернатант собирали центрифугированием (13500xg в течение 5 мин) и частицы ресуспендировали в свежем PBS. Содержание конъюгата DXR определяли по поглощению при 480 нм.
Результаты.
Микрочастицы DXR-PSA-PCPH-PEG3 были синтезированы и имели средний размер 24,3±8,7 мкм с уровнем нагрузки лекарственного средства 13,9%.
Продолжительность высвобождения in vitro лекарственного средства сравнивали для микрочастиц DXR-PSA-PCPH-PEG3 и микрочастиц DXR-PSA-PEG3 (средний размер 22,5±8,3 мкм). Микрочастицы DXR-PSA-PEG3 демонстрировали стабильное высвобождение лекарственного средства в течение 45 дней, в то время как микрочастицы DXR-PSA-PCPH-PEG3 демонстрировали меньшую скорость высвобождения лекарственного средства, и высвобождение лекарственного средства было стабильным в течение более 75 дней (фиг. 9).
Были синтезированы микрочастицы, состоящие из полностью биоразлагаемого конъюгата полимер-лекарственное средство DXR-PSA-PCPH-PEG3. Микрочастицы DXR-PSA-PCPH-PEG3 демонстрировали более низкую скорость высвобождения лекарственного средства и более стабильную продолжительность высвобождения лекарственного средства по сравнению с микрочастицами DXR-PSA-PEG3, частицами, в которые не был добавлен полимер PCPH. Добавление PCPH к полимеру повышало гидрофобность высвобождаемого конъюгата лекарственного средства, что, как ожидалось, должно снижать растворимость DXR, и приводило к большей продолжительности высвобождения лекарственного средства.
Полученные данные демонстрируют, что путем изменения химических свойств полимера для повышения гидрофобности высвобождаемого конъюгата лекарственного средства можно изменять уровень и продолжительность высвобождения лекарственного средства, свидетельствуя о том, что параметры можно оптимизировать для получения более эффективного профиля доставки лекарственного средства для каждого доставляемого лекарственного средства и для каждого терапевтического показания.
Схема 2
Схема 1
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полимерный конъюгат, представленный следующей формулой:
(A-X)m-Y- ( (Z)0- (Х)р- (A)q)n,
где A представляет собой ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, кампто-тецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059 (2'-амино-3'-метоксифлавон), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол);
X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида или их сополимеров;
Y представляет собой остаток одного из следующих соединений:
он он о соон
но. AQH ноос^4^соон
о он он
соон
Z представляет собой гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник(r)); и o равно 1;
p и q независимо равны 0 или 1; m равно целому числу от 1 до 20;
n равно целому числу от 2 до 6 при условии, что A не является доксорубицином, когда m и n, оба, равны единице.
2. Полимерный конъюгат по п.1, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эвероли-муса и стауроспорина.
3. Полимерный конъюгат по п.1 или 2, в котором Z представляет собой поли(алкиленгликоль).
4. Полимерный конъюгат по п.3, в котором Z представляет собой полиэтиленгликоль.
5. Полимерный конъюгат по любому из пп.1-4, в котором X является биоразлагаемым.
6. Полимерный конъюгат по п.5, в котором X выбирается из группы, состоящей из поликапролактона, полиангидридов, а также их сополимеров.
7. Полимерный конъюгат по п.6, в котором X представляет собой полиангидрид.
8. Полимерный конъюгат по п.7, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.
9. Полимерный конъюгат по п.7, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание поли-CPH (PCPH) и полисебацинового ангидрида.
10. Полимерный конъюгат по п.1, в котором Y представляет собой лимонную кислоту.
11. Полимерный конъюгат по п.1, представленный следующей формулой:
A-X-Y- (Z)n,
где A представляет собой ингибитор фактора, индуцируемого гипоксией 1-альфа (HIF-1), выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, кампто-тецина, гелданамицина, генистеина, иринотекана, сорафениба, стауроспорина, PD98059 (2'-амино-3'-метоксифлавон), 2-метоксиэстрадиола и YC-1 (3-(5'-гидроксиметил-2'-фурил)-1-бензилиндазол);
X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида;
Y представляет собой одно из следующего:
Z представляет собой гидрофильный полимерный сегмент, выбранный из поли(алкиленгликоля), полисахарида, поли(винилового спирта), поливинилпирролидона и блок-сополимера полиоксиэтилена (плюроник(r)); и
n равно целому числу от 2 до 6.
12. Полимерный конъюгат по п.11, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверо-лимуса и стауроспорина.
13. Полимерный конъюгат по п.11 или 12, в котором Z представляет собой поли(алкиленгликоль).
14. Полимерный конъюгат по п.13, в котором Z представляет собой полиэтиленгликоль.
15. Полимерный конъюгат по любому из пп. 11-14, в котором X является биоразлагаемым.
16. Полимерный конъюгат по п.15, в котором X выбирается из группы, состоящей из поликапро-лактона, полиангидридов, а также их сополимеров.
17. Полимерный конъюгат по п.16, в котором X представляет собой полиангидрид.
18. Полимерный конъюгат по п.17, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.
19. Полимерный конъюгат по п.16, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-
карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.
20. Полимерный конъюгат по любому из пп.11-19, в котором n равно 3.
21. Полимерный конъюгат по п.11, в котором Y представляет собой лимонную кислоту.
22. Полимерный конъюгат по п. 11, представленный формулой IA
Формула
где A представляет собой ингибитор HIF-1, выбранный из доксорубицина, даунорубицина, темси-ролимуса, рапамицина, эверолимуса, топотекана, камптотецина, гелданамицина, генистеина, иринотека-на, сорафениба, стауроспорина, PD98059, 2-метоксиэстрадиола и YC-1;
D представляет собой O;
PEG представляет собой полиэтиленгликолевую цепь;
X представляет собой гидрофобный полимерный сегмент, выбранный из поли(молочной кислоты), поли(гликолевой кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот, поликапролактона и полиангидрида.
23. Полимерный конъюгат по п.22, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверо-лимуса и стауроспорина.
24. Полимерный конъюгат по п.22 или 23, в котором X является биоразлагаемым.
25. Полимерный конъюгат по п.24, в котором X представляет собой полиангидрид.
26. Полимерный конъюгат по п.25, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.
27. Полимерный конъюгат по п.25, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-
карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.
из поли(молочной кислоты), по-
поли(молочной кислоты),
по-
28. Полимерный конъюгат по п.1, в котором X выбирается из поли(молочной кислоты), по-ли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.
29. Полимерный конъюгат по п.11, в котором X выбирается ли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.
30. Полимерный конъюгат по п.22, в котором X выбирается ли(гликолевой кислоты) и сополимера молочной и гликолевой кислот.
31. Множество микро- и/или наночастиц, содержащих конъюгат по любому из пп.1-30.
32. Препарат, содержащий полимерный конъюгат по любому из пп.1-30 и/или частицы по п.31 в
28.
фармацевтически приемлемом носителе.
33. Препарат по п.32, в котором A выбирается из темсиролимуса, рапамицина, эверолимуса и стауроспорина.
34. Препарат по п.33, в котором X представляет собой полиангидрид.
35. Препарат по п.34, в котором X представляет собой полисебациновый ангидрид.
36. Полимерный конъюгат по п.35, в котором X представляет собой 1,6 бис-(п-
карбоксифенокси)гексан (CPH) или сочетание CPH и полисебацинового ангидрида.
37. Способ лечения заболевания или нарушения, связанного с аберрантной васкуляризацией, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, препарата по п.32, в фармацевтически приемлемом эксципиенте, в форме микро- и/или наночастиц или импланта.
38. Способ лечения глазного заболевания или нарушения, связанного с аберрантной васкуляризацией, включающий введение в глаза пациента, который нуждается в этом, препарата по п.32, в фармацевтически приемлемом эксципиенте, в форме микро- и/или наночастиц или импланта или в фармацевтически приемлемой форме для введения в глаза.
39. Способ по п.38, в котором глазное заболевание или нарушение представляет собой интраоку-лярное неоваскулярное заболевание, нарушение или повреждение.
40. Способ по п.39, в котором интраокулярное неоваскулярное заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из возрастной дегенерации макулы, связанной с хориоидальной неоваскуля-ризацией, пролиферативной диабетической ретинопатии, пролиферативной витреоретинопатии, ретинопатии недоношенных, патологической близорукости, болезни Гиппеля-Линдау, синдрома предполагаемого гистоплазмоза глаз (СПГГ), а также состояний, связанных с ишемией, таких как окклюзия ветки вены сетчатки, окклюзия центральной вены сетчатки, окклюзия ветки артерии сетчатки и окклюзия центральной артерии сетчатки, неоваскуляризации, связанной с опухолью, неоваскуляризации, связанной с раной глаза, ретинальной неоваскуляризации, отторжения трансплантата роговицы, осложнений после хирургической операции, которые вызывают неоваскуляризацию, осложнений после травмы, которые вызывают неоваскуляризацию, а также их сочетаний.
41. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение представляет собой мокрую возрастную дегенерацию макулы.
42. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение включает хориоидальную неоваскуляризацию.
43. Способ по п.42, в котором композиция обеспечивает эффективное количество одного или более активных средств для сокращения площади хориоидальной неоваскуляризации, измеряемой методом флуоресцентной ангиографии, по меньшей мере на 15%.
44. Способ по п.40, в котором заболевание или нарушение включает ретинальную неоваскуляризацию.
45. Способ по п.44, в котором композиция обеспечивает эффективное количество одного или более активных средств для сокращения площади ретинальной неоваскуляризации, измеряемой методом флуоресцентной ангиографии, по меньшей мере на 15%.
37.
37.
37.
37.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032552
032552
- 1 -
- 1 -
032552
032552
- 1 -
- 1 -
032552
032552
- 1 -
- 1 -
032552
032552
- 1 -
- 1 -
032552
032552
- 1 -
- 1 -
032552
032552
- 4 -
- 3 -
032552
032552
- 2 -
- 2 -
032552
032552
- 8 -
- 9 -
032552
032552
- 15 -
032552
032552
- 18 -
- 18 -
032552
032552
- 35 -
032552
032552
- 38 -
- 38 -
032552
032552
- 40 -
- 40 -
032552
032552
- 41 -
- 41 -