[RU]

1. Соединение формулы (I) его стереоизомерная форма или его фармацевтически приемлемая соль; при этом указанное соединение выбрано из группы, где R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, F или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F или СН ₃ , R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой СН ₃ ; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой Cl и R ₃ представляет собой Н или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, или R ₁ представляет собой СН ₃ , R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой F.

2. Соединение, стереоизомерная форма или фармацевтически приемлемая соль по п.1, где указанное соединение выбрано из группы

3. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге, содержащая соединение формулы (I), его стереоизомерную форму или фармацевтически приемлемую соль по п.1 или 2 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями.

4. Применение соединения формулы (I), его стереоизомерной формы или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 в качестве лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге.

5. Применение фармацевтической композиции по п.3 в качестве лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге.

6. Применение соединения, представленного следующей структурной формулой (I) его стереоизомерной формы или его фармацевтически приемлемой соли; при этом указанное соединение выбрано из группы, где R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, F или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F или СН ₃ , R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой СН ₃ ; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой Cl и R ₃ представляет собой Н или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, или R ₁ представляет собой СН ₃ , R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой F, для ингибирования репликации вируса (вирусов) денге у пациента.

(57) Реферат / Формула:

1. Соединение формулы (I) его стереоизомерная форма или его фармацевтически приемлемая соль; при этом указанное соединение выбрано из группы, где R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, F или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F или СН ₃ , R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой СН ₃ ; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой Cl и R ₃ представляет собой Н или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, или R ₁ представляет собой СН ₃ , R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой F.

2. Соединение, стереоизомерная форма или фармацевтически приемлемая соль по п.1, где указанное соединение выбрано из группы

3. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге, содержащая соединение формулы (I), его стереоизомерную форму или фармацевтически приемлемую соль по п.1 или 2 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями.

4. Применение соединения формулы (I), его стереоизомерной формы или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 в качестве лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге.

5. Применение фармацевтической композиции по п.3 в качестве лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге.

6. Применение соединения, представленного следующей структурной формулой (I) его стереоизомерной формы или его фармацевтически приемлемой соли; при этом указанное соединение выбрано из группы, где R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, F или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F или СН ₃ , R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой СН ₃ ; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой ОСН ₃ и R ₃ представляет собой Н; R ₁ представляет собой Н, R ₂ представляет собой Cl и R ₃ представляет собой Н или СН ₃ ; R ₁ представляет собой F, R ₂ представляет собой F и R ₃ представляет собой Н, или R ₁ представляет собой СН ₃ , R ₂ представляет собой Н и R ₃ представляет собой F, для ингибирования репликации вируса (вирусов) денге у пациента.

---

Евразийское 032546 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201790758
(22) Дата подачи заявки 2015.09.30
(51) Int. Cl.
C07D 209/42 (2006.01) A61K31/404 (2006.01) A61P 31/12 (2006.01)
(57) Изобретение относится к производным моно- или дизамещенных индолов формулы (I), которые пригодны для предупреждения или лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге, а также относится к указанным соединениям для применения в качестве лекарственного препарата, более предпочтительно для применения в качестве лекарственного препарата для лечения или предупреждения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге. Изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям или комбинированным препаратам на основе таких соединений, к таким композициям или препаратам для применения в качестве лекарственного препарата, более предпочтительно для предупреждения или лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких соединений.
Настоящее изобретение относится к моно- или дизамещенным индольным соединениям, способам предупреждения или лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге, с применением указанных соединений, а также относится к указанным соединениям для применения в качестве лекарственного препарата, более предпочтительно для применения в качестве лекарственного препарата для лечения или предупреждения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге. Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям или комбинированным препаратам на основе таких соединений, к таким композициям или препаратам для применения в качестве лекарственного препарата, более предпочтительно для предупреждения или лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких соединений.
Предпосылки к созданию изобретения
Флавивирусы, которые переносятся москитами или клещами, являются причиной угрожающих жизни инфекций у человека, таких как энцефалит и геморрагическая лихорадка. Известны четыре различных, но тесно связанных серотипа флавивируса, вызывающего денге, так называемые DENV-1, -2, -3 и -4. Денге является эндемическим заболеванием в большинстве тропических и субтропических зон по всему миру, преимущественно в городских и полугородских областях. Согласно Всемирной организации здравоохранения (WHO) 2,5 миллиарда людей, из которых 1 миллиард детей, подвержены риску заражения DENV (WHO, 2002 г.). По оценкам ежегодно во всем мире происходит от 50 до 100 миллионов случаев лихорадки денге [DF], полмиллиона случаев заболевания денге с тяжелым течением (т.е. геморрагической лихорадки денге [DHF] и шока при геморрагической лихорадке денге [DSS]) и более чем 20000 смертей. DHF стала основной причиной госпитализации и смерти среди детей в эндемических зонах. В целом, вирус денге является наиболее распространенной причиной арбовирусного заболевания. Вследствие недавних крупных вспышек в странах, расположенных в Латинской Америке, Юго-Восточной Азии и Западной части Тихого Океана (в том числе Бразилии, Пуэрто-Рико, Венесуэле, Камбодже, Индонезии, Вьетнаме, Таиланде), количество случаев денге сильно возросло за последние годы. Не только количество случаев денге увеличивается по мере распространения заболевания в новые области, но и вспышки становятся более тяжелыми.
Для предупреждения и/или контроля заболевания, ассоциированного с вирусной инфекцией, вызываемой вирусом денге, в настоящее время единственными доступными способами являются стратегии, направленные на уничтожение москитов, для контроля переносчика инфекции. Несмотря на прогресс в разработке вакцин против вируса денге, возникает много трудностей. Они включают наличие явления, называемого зависимым от антитела усилением (ADE). Выздоровление от инфекции, вызванной одним серотипом, обеспечивает пожизненный иммунитет против данного серотипа, однако, придает только частичную и временную защиту против последующей инфекции, вызываемой одним из трех других се-ротипов. После заражения другим серотипом уже существующие гетерологичные антитела образуют комплексы с вновь инфицирующим серотипом вируса денге, но не нейтрализуют патоген. Вместе с тем предполагают, что облегчается проникновение вируса в клетки, что приводит к неконтролируемой репликации вируса и повышенным пиковым титрам вируса. Как при первичном, так и при вторичном заражениях повышенные титры вируса ассоциированы с заболеванием денге с более тяжелым течением. Одной из причин того, что дети более подвержены заболеванию денге с тяжелым течением, чем взрослые, может быть тот факт, что материнские антитела могут легко передаваться младенцам при грудном вскармливании.
В регионах с двумя или более серотипами, которые циркулируют одновременно, также называемых сверхэндемическими зонами, риск заболевания денге в серьезной форме значительно выше из-за повышенного риска перенести вторичную инфекцию с более тяжелым течением. Более того, в условиях повышенной эндемичности вероятность появления более вирулентных штаммов является повышенной, что, в свою очередь, повышает вероятность геморрагической лихорадки денге (DHF) или шока при геморрагической лихорадке денге.
Москиты, которые переносят вирус денге, в том числе Aedes aegypti и Aedes albopictus (желтолихо-радочный комар), движутся на север земного шара. Согласно центрам по контролю и профилактике заболеваний (CDC) Соединенных Штатов (США) оба вида москитов в настоящее время являются повсеместными в южном Техасе. Распространение на север москитов, переносящих вирус денге, не ограничивается территорией США, а наблюдается также и в Европе.
Несмотря на большие усилия в течение последних 3 десятилетий, в настоящее время не существует вакцины, способной защитить людей от вирусного заболевания денге. Основной проблемой является разработка вакцины, которая предоставляла бы защиту от всех четырех серотипов (квадривалентной вакцины) в одинаковой степени. Более того, на сегодня отсутствуют специальные противовирусные лекарственные средства для лечения или предупреждения вирусной инфекции, представляющей собой лихорадку денге. Очевидно, что все еще существует большая нереализованная потребность медицины в терапевтических средствах для предупреждения или лечения вирусных инфекций у животных, более конкретно у людей, а особенно вирусных инфекций, вызванных флавивирусами, более конкретно вирусом денге. Чрезвычайно необходимыми являются соединения с хорошей противовирусной активностью, которые не имеют побочных эффектов или имеют низкие степени проявления побочных эффектов, с ши
роким спектром активности против множества серотипов вируса денге, низкой токсичностью и/или хорошими фармакокинетическими или динамическими свойствами.
В данный момент настоящее изобретение предусматривает соединения, производные моно- или ди-замещенных индолов, которые проявляют высокую эффективную активность против всех четырех (4) серотипов вируса денге. Также соединения согласно настоящему изобретению обладают хорошим фар-макокинетическим профилем и, неожиданно, эти конкретные соединения проявляют улучшенную хи-ральную устойчивость.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что по меньшей мере одна из вышеупомянутых проблем может быть решена с помощью имеющихся соединений по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение предусматривает соединения, которые, как было показано, обладают высокой противовирусной активностью против всех четырех (4) серотипов, известных на сегодняшний день. В настоящем изобретении, более того, продемонстрировано, что эти соединения эффективно ингибиру-ют пролиферацию вируса денге (DENV). Следовательно, эти соединения составляют подходящий класс сильнодействующих соединений, которые можно применять при лечении и/или предупреждении вирусных инфекций у животных, млекопитающих и людей, более конкретно для лечения и/или предупреждения инфекций, вызываемых вирусами денге.
Настоящее изобретение, более того, относится к применению таких соединений в качестве лекарственных препаратов и к их применению для изготовления лекарственных препаратов для лечения и/или предупреждения вирусных инфекций, в частности, вызываемых вирусами, принадлежащих к семейству вирусов денге, у животных или млекопитающих, более конкретно у людей. Настоящее изобретение также относится к способам получения всех таких соединений и к фармацевтическим композициям, включающим их в эффективном количестве.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предупреждения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге, у людей путем введения пациенту, который нуждается в этом, эффективного количества одного или нескольких таких соединений или их фармацевтически приемлемых солей необязательно в комбинации с одним или несколькими другими лекарственными препаратами, например с другим противовирусным средством.
Одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение соединений формулы (I)
их стереоизомерной формы, фармацевтически приемлемой соли, сольвата или полиморфа, содержащих моно- или дизамещенную индольную группу; при этом указанное соединение выбрано из группы, где
R1 представляет собой Н, R2 представляет собой F и R3 представляет собой Н, F или СН3; R1 представляет собой F или СН3, R2 представляет собой ОСН3 и R3 представляет собой Н; R1 представляет собой F, R2 представляет собой Н и R3 представляет собой СН3; R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОСН3 и R3 представляет собой Н; R1 представляет собой Н, R2 представляет собой Cl и R3 представляет собой Н или СН3; R1 представляет собой F, R2 представляет собой F и R3 представляет собой Н, или R1 представляет собой СН3, R2 представляет собой Н и R3 представляет собой F. В частности, соединения по настоящему изобретению или их стереоизомерная форма, фармацевтически приемлемая соль, сольват или полиморф выбраны из группы
Частью настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I) или его стереоизомерную форму, фармацевтически приемлемую соль, сольват или полиморф вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями.
Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I) включают их соли присоединения кислот и основные соли. Подходящие соли присоединения кислот образуются из кислот, которые образуют
нетоксичные соли. Подходящие основные соли образуются из оснований, которые образуют нетоксичные соли.
Соединения по настоящему изобретению также могут существовать в несольватированной и соль-ватированной формах. Термин "сольват" используется в данном документе для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение по настоящему изобретению и одну или несколько молекул фармацевтически приемлемого растворителя, например этанола.
Термин "полиморф" относится к способности соединения по настоящему изобретению существовать в более чем одной форме или кристаллической структуре.
Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде кристаллических или аморфных продуктов. Они могут быть получены, например, в виде твердой прессованной массы, порошков или пленок посредством таких способов, как осаждение, кристаллизация, лиофильная сушка, сушка распылением или сушка выпариванием. Их можно вводить отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими соединениями по настоящему изобретению или в комбинации с одним или несколькими другими лекарственными средствами. Как правило, их будут вводить в виде состава совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями. Термин "наполнитель" используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличного от соединения (соединений) по настоящему изобретению. Выбор наполнителя в большой степени зависит от таких факторов, как конкретный способ введения, влияние наполнителя на растворимость и устойчивость и природа лекарственной формы.
Соединения по настоящему изобретению или любая их подгруппа могут быть составлены в различные фармацевтические формы для целей введения. В качестве подходящих композиций могут быть упомянуты все композиции, обычно применяемые для системно вводимых лекарственных средств. Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению эффективное количество конкретного соединения, необязательно в форме соли присоединения, в качестве активного ингредиента объединяют в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, при этом носитель может принимать широкое разнообразие форм в зависимости от формы препарата, требуемого для введения. Такие фармацевтические композиции желательны в единичной лекарственной форме, подходящей, например, для перорального или ректального введения. Например, при получении композиций в пероральной лекарственной форме можно использовать любую из общепринятых фармацевтических сред, таких как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т. п., в случае жидких препаратов для перорального введения, таких как суспензии, сиропы, настойки, эмульсии и растворы; или твердых носителей, таких как крахмалы, сахара, каолин, разбавители, смазывающие средства, связующие, разрыхлители и т. п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Благодаря своей простоте введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее преимущественные единичные лекарственные формы для перорального введения, в случае которых безусловно используют твердые фармацевтические носители. Также включены препараты в твердой форме, которые могут быть преобразованы, непосредственно перед применением, в жидкие формы.
Особенно преимущественным является составление вышеупомянутых фармацевтических композиций в единичную лекарственную форму для простоты введения и однородности дозирования. Единичная лекарственная форма, используемая в данном документе, относится к физически отдельным единицам, подходящим в качестве единичных доз, при этом каждая единица содержит предварительно установленное количество активного ингредиента, рассчитанное для получения необходимого терапевтического эффекта совместно с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных лекарственных форм являются таблетки (в том числе делимые или покрытые оболочкой таблетки), капсулы, пилюли, пакетики с порошком, пластинки, суппозитории, растворы или суспензии для инъекций и т.п., а также их отдельные множества.
Специалисты в области лечения инфекционных заболеваний смогут определить эффективное количество, исходя из результатов тестов, представленных далее в данном документе. В целом, предполагается, что эффективное суточное количество будет составлять от 0,01 до 50 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 0,1 до 10 мг/кг массы тела. Может быть целесообразным введение требуемой дозы в виде двух, трех, четырех или более частей дозы через соответствующие интервалы на протяжении дня. Указанные части дозы можно составлять в виде единичных лекарственных форм, например, содержащих от 1 до 1000 мг и, в частности, от 5 до 200 мг активного ингредиента на единичную лекарственную форму.
Точная дозировка и частота введения зависят от конкретного используемого соединения формулы (I), конкретного состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, подлежащего лечению, возраста, массы и общего физического состояния конкретного пациента, а также другого медикаментозного лечения, которое может получать индивидуум, что хорошо известно специалистам в данной области. Более того, очевидно, что эффективное количество может быть снижено или увеличено в зависимости от реакции подвергаемого лечению субъекта и/или в зависимости от оценки врача, назначающего соединения по настоящему изобретению. Таким образом, вышеупомянутые диапазоны эффективного количества являются только рекомендациями и не предназначены для ограничения в той или иной мере объема или применения настоящего изобретения.
Подразумевается, что настоящее раскрытие также включает в себя любые изотопы атомов, присутствующих в соединениях по настоящему изобретению. Например, изотопы водорода включают тритий и дейтерий, а изотопы углерода включают С-13 и С-14.
Данные соединения, применяемые в настоящем изобретении, могут также существовать в их сте-реохимически изомерной форме, охватывая все возможные соединения, составленные из одних и тех же атомов, связанных с помощью такой же последовательности связей, однако имеющие разные пространственные структуры, не являющиеся взаимозаменяемыми. Если не упомянуто или не указано иное, химическое обозначение соединений охватывает смесь всех возможных стереохимически изомерных форм, которыми могут обладать указанные соединения.
Указанная смесь может содержать все диастереомеры и/или энантиомеры с основной молекулярной структурой указанного соединения. Все стереохимически изомерные формы соединений, используемые в настоящем изобретении либо в чистом виде, либо в смеси друг с другом, предназначены для включения в объем настоящего изобретения, в том числе любые рацемические смеси или рацематы.
Чистые стереоизомерные формы упомянутых в настоящем документе соединений и промежуточных продуктов определяют как изомеры, по сути не содержащие других энантиомерных или диастерео-мерных форм одной и той же основной молекулярной структуры указанных соединений или промежуточных продуктов. В частности, термин "стереоизомерно чистый" относится к соединениям или промежуточным продуктам, характеризующимся стереоизомерным избытком, составляющим по меньшей мере от 80% (т.е. минимум 90% одного изомера и максимум 10% других возможных изомеров) до стереоизо-мерного избытка, составляющего 100% (т.е. 100% одного изомера и отсутствие другого), более конкретно, к соединениям или промежуточным продуктам, характеризующимся стереоизомерным избытком, составляющим от 90 до 100%, еще более конкретно характеризующимся стереоизомерным избытком, составляющим от 94 до 100%, и наиболее конкретно характеризующимся стереоизомерным избытком, составляющим от 97% до 100%. Термины "энантиомерно чистый" и "диастереомерно чистый" следует понимать подобным образом, но в таком случае в отношении соответственно энантиомерного избытка и диастереомерного избытка смеси, представляющей интерес.
Чистые стереоизомерные формы соединений и промежуточных соединений, используемые в настоящем изобретении, можно получать при применении процедур, известных в уровне техники. Например, энантиомеры можно отделять друг от друга с помощью селективной кристаллизации их диастерео-мерных солей с оптически активными кислотами или основаниями. Их примерами являются винная кислота, дибензоилвинная кислота, дитолуоилвинная кислота и камфорсульфоновая кислота. В качестве альтернативы энантиомеры можно разделять с помощью хроматографических методик с использованием хиральных неподвижных фаз. Указанные чистые стереохимически изомерные формы можно также получать из соответствующих чистых стереохимически изомерных форм соответствующих исходных материалов при условии, что реакция протекает стереоспецифически. Предпочтительно, если необходим определенный стереоизомер, то указанное соединение будет синтезировано с помощью стереоспецифи-ческих способов получения. В таких способах преимущественно применяют энантиомерно чистые исходные материалы.
Общие подходы синтеза
Синтез соединений общей формулы I можно осуществлять, как изложено на схеме 1. 2-(4-Хлор-2-метоксифенил)уксусная кислота (II) может быть превращена в соответствующий 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорид (III) с использованием реактива для хлорирования, такого как, например, тионилхлорид. Реакцию Фриделя-Крафтса ацетилхлорида III с замещенным индолом общей формулы IV можно осуществлять с использованием реактива, представляющего собой кислоту Льюиса, такого как, например, Et2AlCl, в подходящем растворителе, таком как, например, CH2Cl2, и при подходящих условиях реакции, которые, как правило, включают охлаждение, с получением 3-ацилированного индола общей формулы V. Введение анилинового фрагмента в альфа положение по отношению к карбонильному фрагменту соединения общей формулы V можно осуществлять при помощи последовательности реакций, которая включает, например, бромирование V реактивом, таким как, например, трибромид фенил-триметиламмония, в подходящем растворителе, таком как, например, THF, с получением соединений общей формулы VI, и последующее приведение в реакцию соединений общей формулы VI и 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола (VII) в подходящем растворителе, таком как, например, CH3CN, и, как правило, с использованием основания, такого как, например, TEA или DIPEA, с получением соединений общей формулы I в виде рацемических смесей. Хиральное разделение соединений общей формулы I можно осуществлять с помощью, например, хиральной хроматографии с получением энантиомеров А и В общей формулы I.
Энантиомеры 1(A) и 1(B)
В качестве альтернативного подхода промежуточное соединение общей формулы V также можно получить, как изложено на схеме 2. N-Boc-защищенный замещенный индол-3-карбальдегид общей формулы VIII можно превращать в соответствующее промежуточное соединение по типу соединения из реакции Штрекера общей формулы IX посредством проведения реакции с морфолином в присутствии реагентов, таких как, например, цианид натрия и бисульфит натрия, и в подходящем растворителе, таком как, например, смесь воды и смешиваемого с водой органического растворителя, такого как, например, диоксан. Алкилирование соединения общей формулы IX 4-хлор-2-метоксибензилхлоридом можно осуществлять в присутствии основания, такого как, например, гексаметилдисилазан калия, и в подходящем растворителе, таком как, например, DMF, с получением соединения общей формулы X. Воздействие на соединение общей формулы X подходящего водного гидролитического кислого условия, такого как, например, обработка водным раствором хлористоводородной кислоты, при повышенной температуре, дает промежуточное соединение общей формулы V.
Схема 2
Примеры Способы LC/MS
Измерения в ходе высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) проводили с помощью насоса для LC, детектора на диодной матрице (DAD) или УФ-детектора и колонки, которая описана в соответствующих способах. При необходимости включали дополнительные детекторы (см. приведенную ниже табл. способов).
Поток из колонки направляли в масс-спектрометр (MS), который был оснащен источником ионизации при атмосферном давлении. В компетенции специалиста в данной области находится установка настраиваемых параметров (например, диапазона сканирования, минимального времени измерения и т.п.) с целью получения ионов, обеспечивающих определение номинальной моноизотопной молекулярной массы (MW) соединения. Сбор данных проводили с помощью соответствующего программного обеспечения.
Соединения описаны по их экспериментальному времени удерживания (Rt) и ионам. Если в таблице данных не указано иное, то указанный молекулярный ион соответствует [М+Н]+ (протонированной молекуле) и/или [М-Н]- (депротонированной молекуле). В случае, если соединение не было непосредственно способно к ионизации, указывают тип аддукта (т. е. [M+NH4]+, [М+НСОО]- и т.д.). Для молекул со сложными изотопными распределениями (Br, Cl) указанное значение является таким значением, которое получено для наименьшей массы изотопа. Все результаты получали с экспериментальными погрешностями, которые обычно связаны с применяемым способом.
Далее в данном документе "SQD" означает одиночный квадрупольный детектор, "MSD" означает масс-селективный детектор, "RT" означает комнатную температуру, "ВЕН" означает мостиковый гибрид этилсилоксана/диоксида кремния, "DAD" означает детектор на диодной матрице, "HSS" означает диоксид кремния повышенной прочности.
Коды способов LC/MS (скорость потока, выраженная в мл/мин; температура колонки (T) в °C; время анализа в минутах).
Код способа
Прибор
Колонка
Подвижная фаза
Градиент
Поток T колонки
Время анализа (мин.)
LC-A
Waters: Acquity(r) UPLC(r)-DAD-SQD
Waters: BEH C18(l,7 мкм, 2,1x50 MM)
A: 10 мМ
CH3COONH4 в
95% H20+5% CH3CN B: CH3CN
От 95% А до 5% А за 1,3 мин., у держивание в течение 0,7 мин.
0,8 мл/минуты
55°С
От 100% А до
LC-B
Waters: Acquity(r) UPLC(r)-DAD-SQD
Waters: HSS T3 (1,8 мкм, 2,1x100 MM)
A: 10 мМ CH3COONH4 в 95% H20+5% CH3CN B: CH3CN
5% А за 2,10
мин., до 0% А за 0,90
мин., до 5% А за 0,5
мин.
0,7 мл/минуты
55°С
3,5
84,2% А в
течение 0,49
Waters:
мин., до 10,5% А
LC-C
Acquity(r) UPLC(r)-DAD-Quattro Micro(tm)
Waters: BEH C18(l,7 мкм, 2,1x100 MM)
A: 95% CH3COONH4 7 MM/5% CH3CN, B: CH3CN
за 2,18 мин., удерживание в
течение 1,94 мин., обратно до 84,2% А за 0,73
мин., удерживание в
0,343 мл/минуты
40°С
6,2
течение 0,73
мин.
LC-D
Waters: Acquity(r) UPLC(r)-DAD-TQD
Waters: HSS C18(l,8 мкм, 2,1x50 мм
A: 0,1% муравьиная
кислота вН20 В: CH3CN
От 50% А до 10% за 3,5 мин., удерживание в течение 1,5 мин.
0,5 мл/минуты
40°С
Измерения в ходе SFC проводили с применением аналитической системы хроматографии со сверхкритической подвижной фазой, укомплектованной насосом для двухкомпонентных смесей для доставки диоксида углерода (CO2) и модификатором, автоматическим дозатором, термостатом для колонок, детектором на диодной матрице, оснащенным проточной кюветой для работы под высоким давлением, выдерживающей значения до 400 бар. При оснащении масс-спектрометром (MS) поток из колонки направляли в (MS). В компетенции специалиста в данной области находится установка настраиваемых параметров (например, диапазона сканирования, минимального времени измерения и т. п.) с целью получения ионов, обеспечивающих определение номинальной моноизотопной молекулярной массы (MW) соединения. Сбор данных проводили с помощью соответствующего программного обеспечения.
Аналитические способы SFC-MS (скорость потока, выраженная в мл/мин.; температура колонки (Т) в °С; время анализа в минутах, противодавление (BPR) в барах).
Код способа
Колонка
Подвижная фаза
Градиент
Поток T колонки
Время анализа
BPR
Колонка Daicel
30% В с
А:С02
SFC-A
Chiralpak(r) AD-H (5 мкм,
В: МеОН
удержанием 7
150x4,6 мм)
мин.
100
SFC-B
Колонка Daicel Chiralpak(r) AD-H (5 мкм, 150x4,6 мм)
А: С02 В: МеОН
40% В с удержанием 7 мин.
100
SFC-C
Колонка Daicel Chiralpak(r) OJ-H (5 мкм, 250x4,6 мм)
A: C02 В: MeOH
40% В с удержанием 7 мин.
100
SFC-D
Колонка Daicel Chiralpak(r) OD-H (5 мкм, 150x4,6 мм)
A:C02
40% В с удержанием 7 мин.
B: MeOH
100
SFC-E
WHELK-Ol (S,S) 250*4,6 мм 5 мкм Regis
A:C02 B: MeOH
60% В с удержанием 7 мин.
100
25% В с
SFC-F
Колонка Daicel Chiralpak(r) AS3 (3,0 мкм, 150x4,6 мм)
A:C02 B: EtOH +0,2% iPrNH2 +3%H20
удержанием 6 мин., до 50% за
1 мин. с удержанием 2,5 мин.
2,5 40
9,5 ПО
30% В с
SFC-G
Колонка Daicel Chiralpak(r) AS3 (3,0 мкм, 150x4,6 мм)
A: C02 B: EtOH +0,2% iPrNH2 +3%H20
удержанием 6 мин., до 50% за
1 мин. с удержанием 2,5 мин.
2,5 40
9,5 ПО
Точки плавления
Значения представляют собой либо максимальные значения, либо диапазоны температур плавления, и их получают с экспериментальными погрешностями, которые обычно связаны с таким аналитическим способом.
DSC823e (обозначен как DSC)
Для ряда соединений точки плавления определяли с помощью DSC823e (Mettler-Toledo). Точки плавления измеряли с градиентом температур 10°С/мин. Максимальная температура составляла 300°C.
Углы вращения плоскости поляризации света
Углы вращения плоскости поляризации света измеряли на поляриметре Perkin-Elmer 341 с натриевой лампой и обозначали следующим образом: [а]° (Л, с г/100 мл, растворитель, Т°0).
[a]xT= (100ОС)/(1ХС), где l означает длину пробега в дм, а c означает концентрацию в г/100 мл для образца при температуре Т (°C) и длине волны X (в нм). Если используемая длина волны света составляет 589 нм (D-линия натрия), то вместо этого можно использовать символ D. Всегда следует приводить знак направления вращения (+ или -). В случае использования данного уравнения концентрацию и растворитель всегда приводят в круглых скобках после угла вращения. Угол вращения указывают в градусах, а единицы концентрации не приводят (принято, что они представлены в г/100 мл).
Пример 1. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 1) и хиральное разделение на энантиомеры 1А и 1В.
O^^^CI SOCI2
60°C, 16 ч.
F^^N THF
1b 0°C, 1 4., к. т.
2,5 ч.
H2N О
Et3N
CH3CN, MM, 100°C, 30 мин.
Синтез промежуточного соединения 1а
2-(4-Хлор-2-метоксифенил )уксусную кислоту [CAS 170737-95-8] (5,8 г, 28,9 ммоль) добавляли небольшими порциями к тионилхлориду (50 мл) и полученный раствор перемешивали в течение ночи при 60°C. Растворитель концентрировали при пониженном давлении и выпаривали совместно с толуолом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (6,5 г) в виде маслянистого остатка, который использовали без дополнительной очистки на следующей стадии.
Синтез промежуточного соединения 1b
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (37,1 мл, 37,14 ммоль) к раствору 6-фтор-Ш-индола [CAS 399-51-9] (3,34 г, 24,76 ммоль) в CH2Cl2 (100 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (6,3 г, 28,76 ммоль) в CH2Cl2 (100 мл) медленно добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли ледяную воду и осадок отфильтровывали, промывали водой и небольшим количеством CH2Cl2. Твердые вещества высушивали под вакуумом при 70°C в течение ночи с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-Ш-индол-3-ил)этанона 1b (4,9 г).
Синтез промежуточного соединения 1с
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-5 6-1] (5,8 г, 15,4 ммоль) в THF (65 мл) к смеси 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-Ш-индол-3-ил)этанона 1b (4,9 г, 15,4 ммоль) в THF (60 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью EtOAc и промывали водой. В органическом слое возникал осадок и его отфильтровывали и высушивали с получением первой партии 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-Ш-индол-3-ил)этанона 1с (4,6 г). Органический слой отделяли, высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток кристаллизовали из EtOAc, осадок отфильтровывали, промывали с помощью Et2O и высушивали под вакуумом с получением второй фракции 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-Ш-индол-3-ил)этанона 1с (1,6 г).
Синтез соединения 1 и хиральное разделение на энантиомеры 1А и 1В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-Ш-индол-3-ил)этанона 1с (2,1 г, 5,3 ммоль), 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (924 мг, 5,05 ммоль) и триэтиламина (1,47 мл, 10,6 ммоль) в CH3CN (16 мл) в запечатанной пробирке нагревали при 100°C в течение 30 мин с использованием микроволнового устройства Biotage(r) Initiator EXP 60 с выходной мощностью, варьирующейся от 0 до 400 Вт (фиксированное время удерживания). Реакционную смесь разбавляли с помощью CH2Cl2 и органический слой промывали водой, высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (15-40 мкм, 80 г) с использованием гептана/EtOAc, градиент от 50/50 до 0/100. Чистые фракции собирали и концентрировали с получением 1,1 г соединения 1. Эту фракцию объединяли с другой партией, составляющей 0,93 г соединения 1, и затем очищали посредством ахиральной SFC (неподвижная фаза: CYANO 6 мкм 150x21,2 мм, подвижная фаза: 75% СО2, 25% МеОН) с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединение 1, 1,36 г) в виде рацемической смеси.
Энантиомеры соединения 1 (1,36 г) разделяли посредством хиральной SFC (неподвижная фаза: Chi-racel(r) OJ 20x250 мм, подвижная фаза: 60% СО2, 40% МеОН) с получением 611 мг первого элюирован-ного энантиомера и 586 мг второго элюированного энантиомера. Первый элюированный энантиомер поглощали с помощью CH3CN/диизопропилового эфира/гептана. Осадок отфильтровывали и высушивали с получением энантиомера 1А (496 мг) в виде аморфного порошка. Второй элюированный энантиомер поглощали с помощью CH3CN/диизопропилового эфира/гептана. Осадок отфильтровывали и высушивали с получением энантиомера 1В (458 мг) в виде аморфного порошка.
Соединение 1.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3,61 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,3 Hz, 2H) 3,77-3,88 (m, 2H) 3,96 (s, 3H) 4,78 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (t, J=1,9 Hz, 1H) 5,93 (d, J=1,9 Hz, 2H) 6,15 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,40 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,02-7,08 (m, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,27 (dd, J=9,6, 2,4 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,5 Hz, 1H) 8,13 (dd, J=8,8, 5,7 Hz, 1H) 8,43 (s, 1H) 11,96-12,17 (m, 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 2,95 минуты, МН+ 499
Энантиомер 1А.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3,57-3,68 (m, 5 H) 3,77-3,89 (m, 2H) 3,96 (s, 3H) 4,73-4,87 (m, 1H) 5,71 (t, J=1,9 Hz, 1H) 5,91-5,96 (m, 2H) 6,15 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,39 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,01-7,11 (m, 2H) 7,27 (dd, J=9,6, 2,4 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,2 Hz, 1H) 8,13 (dd, J=9,6, 5,7 Hz, 1H) 8,43 (s, 1H) 11,45-12,31 (m, 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 2,95, MH+ 499
[o]D20: +112,1° (c 0,281, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-C): Rt 3,17 мин., МН+ 499, хиральная чистота 100%. Энантиомер 1B.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3,57-3,67 (m, 5H) 3,74-3,90 (m, 2H) 3,96 (s, 3H) 4,78 (br. s., 1H) 5,70-5,74 (m, 1H) 5,93 (s, 2H) 6,15 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,40 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,027,08 (m, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,27 (dd, J=9,6, 2,4 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,2 Hz, 1H) 8,13 (dd, J=9,6, 5,5 Hz, 1H) 8,43 (s, 1H) 11,63-12,47 (m, 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 2,95, MH+ 499
[o]D20: -113,9° (c 0,28, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-C): Rt 4,12 мин., МН+ 499, хиральная чистота 100%. Пример 1.1. Хиральная устойчивость энантиомера 1А при рН 7,4
Хиральную устойчивость энантиомера 1А (R=OMe) оценивали посредством определения энантио-мерного избытка (ее%) после инкубирования в течение 24 и 48 ч. в буферном растворе при рН 7,4 при 40 и 60°C. Для оценки влияния метокси-заместителя энантиомера 1А (R=OMe) на устойчивость к рацемизации хиральную устойчивость энантиомера 1'A (R=H) тестировали при тех же условиях.
С этой целью получали 5 мкМ забуференные (рН=7,4) растворы 1А и 1'А посредством смешивания 25 мкл 100 мкМ раствора 1А или 1'А в DMSO с 475 мкл водного буфера, рН 7,4. Образцы отбирали через 24 и 48 ч после инкубирования при 40 и 60°C.
Аналитические образцы анализировали с помощью хиральной SFC (определение MS) и хиральную чистоту выражали в виде энантиомерного избытка (ее%=%энантиомера А - %энантиомера В). Оба энан-
тиомера 1А и ГА характеризовались хиральной чистотой 100% перед началом их инкубирования.
ее%
Соединение
Температура
Моменты 24
времени (ч.)
отбора проб 48
40°С
100
100
60°С
40°С
1 'А
60°С
Пример 2. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 2) и хиральное разделение на энантиомеры 2А и 2В.
oW1
Et2AICI
I н
CH2CI2, 0°С, 1 ч.
DIPEA CH3CN, к. т., 3 дня
Синтез промежуточного соединения 2а
Раствор 6-фтор-7-метил-Ш-индола [CAS 57817-10-4] (1,10 г, 7,37 ммоль) в CH2Cl2 (40 мл) охлаждали на ледяной бане в потоке N2. В течение 15 мин добавляли по каплям 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (10 мл, 10 ммоль). После дополнительного перемешивания в течение 15 мин при 0°C добавляли раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1 а (2,06 г, 9,42 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (35 мл) в течение 75 мин при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч и затем гасили посредством медленного добавления раствора тетрагидрата тартрата калия-натрия (сегнетовой соли) [CAS 6100-16-9] (4,24 г, 15 ммоль) в воде (10 мл) при поддержании внутренней температуры смеси ниже 10°C. Ледяную баню удаляли, добавляли 2-метил-THF (160 мл) и Na2SO4 (60 г) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь фильтровали через Dicalite(r) и осадок на фильтре промывали несколькими порциями THF. Объединенные фильтраты выпаривали при пониженном давлении и остаток растирали с небольшим количеством CH2Cl2. Твердые вещества выделяли посредством фильтрации и высушивали под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-7-метил-Ш-индол-3-ил)этанона 2а (1,9 г) в виде белого порошка.
Синтез соединения 2 и хиральное разделение на энантиомеры 2А и 2В Раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)этанона 2а (1,9 г, 5,73 ммоль) в сухом THF (60 мл) охлаждали на ледяной бане в потоке N2. Добавляли по каплям при 0°C раствор три
бромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (2,3 г, 5,91 ммоль) в THF (50 мл) в течение 1 ч и смесь перемешивали при 0°C в течение дополнительных 1,5 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток, содержащий неочищенное бромированное промежуточное соединение 2b, растворяли в CH3CN (100 мл). Добавляли 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанол [CAS 725237-16-1] (2,11 г, 11,5 ммоль) и диизопропилэтиламин (2 мл, 11,6 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Добавляли воду (350 мл) и продукты реакции экстрагировали с помощью 2-метил-THF (3x 100 мл). Объединенные органические слои промывали с помощью 0,5 М HCl (200 мл) и воды (3Х 300 мл), высушивали над MgSO4 и выпаривали при пониженном давлении. Остаток (2,48 г) очищали посредством колоночной хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния 40 г, HP-Spher(r) 40 мкм; подвижная фаза: гептан/EtOAc, градиент от 100/0 до 0/100). Фракции, содержащие продукт реакции, объединяли и выпаривали при пониженном давлении. Остаток растирали с небольшим количеством смеси EtOAc/гептана (1/1), твердые вещества отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидрокси-этокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединение 2, 1,38 г) в виде рацемической смеси.
Энантиомеры соединения 2 (1,38 г) разделяли посредством препаративной SFC (неподвижная фаза: Chiralpak(r) Diacel AS 20x250 мм, подвижная фаза: СО2, EtOH с 0,4% iPrNH2). Первый элюированный энантиомер растворяли в смеси МеОН (50 мл) и воды (20 мл) и смесь выпаривали при пониженном давлении (200 мбар, водяная баня 40°C) до остаточного объема 20 мл. Полученную суспензию разбавляли с помощью 20 мл воды и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Белое твердое вещество отфильтровывали, промывали водой и высушивали под вакуумом при комнатной температуре с получением энантиомера 2А (631 мг) в виде аморфного белого порошка. Второй элюированный энантиомер растворяли в смеси МеОН (50 мл) и воды (20 мл) и смесь выпаривали при пониженном давлении (200 мбар, водяная баня 40°C) до остаточного объема 20 мл. Полученную суспензию разбавляли с помощью 20 мл воды и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Белое твердое вещество отфильтровывали, промывали водой и высушивали под вакуумом при комнатной температуре с получением энантиомера 2В (625 мг) в виде аморфного белого порошка.
Соединение 2.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2,37 (br s, 3H) 3,60 (s, 3H) 3,63 (q, J=5,2 Hz, 2H) 3,76-3,89 (m, 2H) 3,96 (s, 3H) 4,76 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,94 (d, J=2,2 Hz, 2H) 6,16 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,36 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,95 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1H) 7,00 (dd, J=10,1, 8,8 Hz, 1H) 7,08 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1H) 7,95 (dd, J=8,7, 5,2 Hz, 1H) 8,41 (s, 1H) 12,17 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,19 мин, МН+ 513
Энантиомер 2А.
1H ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2,38 (s, 3H) 3,61 (s, 3H) 3,62-3,67 (m, 2H) 3,82 (ddt, J=15,4, 10,2, 5,1, 5,1 Hz, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,81 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (br t, J=1,8 Hz, 1H) 5,95 (d, J=1,5 Hz, 2H) 6,17 (br d, J=8,4 Hz, 1H) 6,40 (br d, J=8,1 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,4, 1,8 Hz, 1H) 7,02 (br dd, J=10,1, 9,0 Hz, 1H) 7,10 (d, J=1,8 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,1 Hz, 1H) 7,96 (dd, J=8,6, 5,3 Hz, 1H) 8,44 (s, 1H) 12,22 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,20, MH+ 513
[OC]D20: +83,3° (c 0,36, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-F): Rt 2,05 мин, МН+ 513, хиральная чистота 100%. Энантиомер 2В.
1H ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2,38 (s, 3H) 3,61 (s, 3H) 3,62-3,67 (m, 2H) 3,83 (qt, J=10,2, 5,1 Hz, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,80 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (br t, J=2,2 Hz, 1H) 5,95 (d, J=1,8 Hz, 2H) 6,17 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,40 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,4, 1,8 Hz, 1H) 7,02 (dd, J=10,2, 8,8 Hz, 1H) 7,10 (d, J=1,8 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,1 Hz, 1H) 7,96 (dd, J=8,6, 5,3 Hz, 1H) 8,44 (s, 1H) 12,21 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,20, MH+ 513 [O]D20: -81,9° (c 0,515, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-F): Rt 3,28 мин, МН+ 513, хиральная чистота 100%.
Пример 3. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-хлор-7-метил-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидрокси-этокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединение 3) и хиральное разделение на энантиомеры ЗА и ЗВ.
Синтез промежуточного соединения 3a
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (18,1 мл, 18,1 ммоль) к раствору 6-хлор-7-метил-Ш-индола [CAS 57817-09-1] (2 г, 12,08 ммоль) в CH2Cl2 (60 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,21 г, 14,66 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (60 мл) медленно добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли ледяную воду, осадок отфильтровывали и промывали водой. Твердое вещество высушивали под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-хлор-7-метил-Ш-индол-3-ил)этанона 3a (3,2 г).
Синтез промежуточного соединения 3b
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (3,63 г, 9,65 ммоль) в THF (85 мл) к раствору 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-хлор-7-метил-Ш-индол-3-ил)этанона 3a (3,2 г, 9,2 ммоль) в THF (85 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч и при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества CH^N/диизопропилового эфира. Осадок отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-хлор-7-метил-Ш-индол-3-ил)этанона 3b (4,1 г).
Синтез соединения 3 и хиральное разделение на энантиомеры 3A и 3B
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-хлор-7-метил-Ш-индол-3-ил)этанона 3b (3,1 г, 7,26 ммоль), 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (1,33 г, 7,26 ммоль) и диизопропилэ-тиламина (1,9 мл, 10,9 ммоль) в CH3CN/THF (1/1) (120 мл) перемешивали при 70°C в течение 24 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли с помощью CH2Cl2 и промывали с помощью 1 н. HCl. Органический слой отделяли, высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на си-ликагеле (15-40 мкм, 80 г в CH2Cl2/MeOH (99,5/0,5)). Чистые фракции собирали и выпаривали при пониженном давлении (2,3 г). Небольшое количество кристаллизовали из Et2O/CH3CN с получением аналитического образца 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-хлор-7-метил-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 3) в виде рацемата.
Энантиомеры соединения 3 (2,2 г) разделяли посредством препаративной хиральной SFC (неподвижная фаза: (S,S) Whelk-O 1 5 мкм 250x21,1 мм, подвижная фаза: 45% СО2, 55% EtOH (+ 2% CH2Cl2)) с получением 1,11 г первого элюированного энантиомера и 1,07 г второго элюированного энантиомера. Первый элюированный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O/гептана с получением энантиомера 3A (461 мг) в виде аморфного белого порошка. Второй элюированный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O/ гептана с получением энантиомера 3B (872 мг) в виде аморфного белого порошка.
Соединение 3.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 12,26 (d, J=2,8 Hz, 1H) 8,46 (d, J=3,2 Hz, 1H) 7,97 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,22 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 6,40 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,18 (d, J=8,2 Hz, 1H) 5,95 (d, J=2,2 Hz, 2H) 5,71 (t, J=2,2 Hz, 1H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 3,96
(s, 3H) 3,77-3,89 (m, 2H) 3,58-3,67 (m, 5H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,28 минуты, МН+ 529 Температура плавления: 220°C Энантиомер 3A.
1Н ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 12,26 (br. s., 1H) 8,46 (s, 1H) 7,97 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,21 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,10 (d, J=1,9 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 6,40 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,18 (d, J=8,2 Hz, 1H) 5,95 (d, J=2,2 Hz, 2H) 5,71 (t, J=2,0 Hz, 1H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 3,97 (s, 3H) 3,77-3,89 (m,
2H) 3,59-3,67 (m, 5H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,27 минуты, МН+ 529 [O]d20: +88,8° (c 0,2691, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-E): Rt 3,40 мин., МН+ 529, хиральная чистота 100%. Энантиомер 3B.
1Н ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 12,26 (br. s., 1H) 8,45 (s, 1H) 7,97 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,21 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1Н) 6,40 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,18 (d, J=8,2 Hz, 1H) 5,95 (d, J=2,2 Hz, 2H) 5,71 (t, J=2,0 Hz, 1H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 3,97 (s, 3H) 3,76-3,90 (m,
2H) 3,60-3,66 (m, 5H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,27 минуты, МН+ 529 [O]d20: -87,4° (c 0,2564, DMF) Хиральная SFC (способ SFC-E): Rt 4,19 мин., МН+ 529, хиральная чистота 100%. Пример 4. Синтез 1-(6-хлор-1H-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 4) и хиральное разделение на энантиомеры 4А и 4В.
Синтез промежуточного соединения 4а
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (19,8 мл, 19,8 ммоль) к раствору 6-хлор-1Н-индола [CAS 17422-33-2] (2 г, 13,2 ммоль) в CH2Cl2 (45 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,36 г, 15,3 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (45 мл) медленно добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли ледяную воду и осадок отфильтровывали, промывали водой и минимальным количеством CH2Cl2. Твердое вещество высушивали под вакуумом с получением 1-(6-хлор-Ш-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил)этанона 4а (2,68 г).
Синтез промежуточного соединения 4b
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (3,165 г, 8,4 ммоль) в THF (50 мл) к раствору 1-(6-хлор-Ш-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил) этанона 4а (2,68 г, 8 ммоль) в THF (50 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч и при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в EtOAc и промывали водой. Появлялся осадок и твердые вещества отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-1-(6-хлор-Ш-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил)этанона 4b (2,75 г).
Синтез соединения 4 и хиральное разделение на энантиомеры 4А и 4В
Смесь 2-бром-1-(6-хлор-1H-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил)этанона 4b (2,3 г, 5,6 ммоль), 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (1,53 г, 8,4 ммоль) и диизопропилэтиламина (2,4 мл, 13,9 ммоль) в CH3CN/THF (1/1) (140 мл) перемешивали при 50°C в течение 12 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли с помощью EtOAc, промывали с помощью 1 н. HCl и затем водой. Органический слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Неочищенное соединение очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (15-40 мкм, 80 г в CH2Cl2/MeOH (99,5/0,5)). Чистые фракции собирали и выпаривали при пониженном давлении. Небольшое количество кристаллизовали из Et2O/CH3CN с получением аналитического образца 1-(6-хлор-1H-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метокси-фенил)амино)этанона (соединения 4) в виде рацемической смеси. Оставшееся количество соединения 4 (2,1 г) дополнительно очищали посредством препаративной LC (неподвижная фаза: диоксид кремния без покрытия с частицами неправильной формы 150 г, подвижная фаза: толуол/iPrOH 95/5).
Энантиомеры соединения 4 (1,9 г) разделяли посредством препаративной хиральной SFC (неподвижная фаза: Chiralpak(r) IC 5 мкм, 250x30 мм, подвижная фаза: 60% СО2, 40% МеОН) с получением 870 мг первого элюированного энантиомера и 870 мг второго элюированного энантиомера. Два энантиомера снова очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (15-40 мкм, 24 г в CH2Cl2/MeOH (99,5/0,5)). Первый элюированный энантиомер (800 мг) отверждали из CH3CN/Et2O с получением энан-тиомера 4А (693 мг) в виде аморфного белого порошка. Второй элюированный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O с получением энантиомера 4В (619 мг) в виде аморфного белого порошка.
Соединение 4.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,60 (s, 3H) 3,64 (t, J=5,0 Hz, 2H) 3,75-3,88 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,38-5,09 (m, 1H) 5,71 (t, J=1,9 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,2 Hz, 2H) 6,13-6,18 (m, 1H) 6,35-6,46 (m, 1H) 6,97 (dd, J=8,4, 1,9 Hz, 1H) 7,09 (d, J=2,2 Hz, 1H) 7,21 (dd, J=8,5, 1,9 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1H) 7,53 (d, J=1,9 Hz, 1H) 8,13 (d, J=8,5 Hz, 1H) 8,46 (d, J=2,8 Hz, 1H) 12,13 (d, J=2,8 Hz, 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,11 мин, МН+ 515
Температура плавления: 154°C
Энантиомер 4А.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,60 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,0 Hz, 2H) 3,74-3,88 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,79 (t, J=5,0 Hz, 1H) 5,71 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,15 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,41 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,21 (dd, J=8,5, 1,9 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,53 (d, J=1,9 Hz, 1H) 8,13 (d, J=8,5 Hz, 1H) 8,46 (s, 1H) 12,12 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,13 мин, МН+ 515
[осЬ20: +111,6° (c 0,284, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-A): Rt 3,68 мин, МН+ 515, хиральная чистота 100%.
Энантиомер 4В.
1Н ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,62-3,68 (m, 2H) 3,76-3,89 (m, 2H) 3,95 (s, 3 H) 4,74-4,83 (m, 1H) 5,72 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,15 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,42 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,21 (dd, J=8,5, 1,9 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,53 (d, J=1,9 Hz, 1H) 8,13 (d, J=8,5 Hz, 1H) 8,46 (s, 1H) 12,13 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,14 мин, МН+ 515 [O]D20: -113,9° (c 0,288, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-A): Rt 5,04 мин, МН+ 515, хиральная чистота 100%.
Пример 5. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)-1-(б-метокси-Ш-индол-З-ил)этанона (соединения 5) и хиральное разделение на энантиомеры 5А и 5В.
Раствор NaHSO3 (5,7 г, 54,5 ммоль) в воде (45 мл) добавляли к перемешиваемому раствору трет-бутил-3-формил-6-метокси-Ш-индол-1-карбоксилата [CAS 847448-73-1] (10 г, 36,3 ммоль) в диоксане (45 мл). Через 15 мин добавляли морфолин (4,8 мл, 54,5 ммоль) и спустя 35 мин добавляли цианид натрия (NaCN) (1,96 г, 40 ммоль). Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней до завершения реакции. Продукт отфильтровывали и промывали смесью 1/1 диокса-на/воды (3x 35 мл) и затем водой (3x 45 мл) и высушивали под вакуумом при 60°C. Твердые вещества взбалтывали в Et2O (125 мл), отфильтровывали, промывали с помощью Et2O (3x) и высушивали под вакуумом при 50°C с получением трет-бутил 3-(циано(морфолино)метил)-6-метокси-Ш-индол-1-карбоксилата 5а (12,3 г).
Синтез промежуточного соединения 5b
Смесь трет-бутил-3-(циано(морфолино)метил)-6-метокси-1H-индол-1-карбоксилата 5 а (6,0 г, 16,2 ммоль) в сухом DMF (80 мл) перемешивали в атмосфере N2 при охлаждении на ледяной бане. Добавляли по каплям раствор 0,5 М KHMDS в толуоле (35,5 мл, 17,8 ммоль) в течение 10 мин. После перемешивания в течение дополнительных 10 мин добавляли 4-хлор-1-(хлорметил)-2-метоксибензол [CAS 10107984-9] (3,09 г, 16,2 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Реакционную смесь выливали в холодную воду (400 мл) и продукт экстрагировали с помощью Et2O (2x). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали, выпаривали при пониженном давлении и выпаривали совместно с ксилолом. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 120 г, подвижная фаза: гептан/EtOAc, градиент от 100/0 до 20/80). Необходимые фракции объединяли, выпаривали при пониженном давлении и выпаривали совместно с диоксаном с получением трет-бутил-3-(2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-циано-1-морфолиноэтил)-6-метокси-1H-индол-1-карбоксилата 5b (7,75 г).
Синтез промежуточного соединения 5с
К перемешиваемой суспензии трет-бутил-3-(2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-циано-1-морфолино-этил)-6-метокси-Ш-индол-1-карбоксилата 5b (7,75 г, 14,7 ммоль) в диоксане (40 мл) и воде (20 мл) добавляли раствор 6 М HCl в изопропаноле (36,8 мл, 220 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 60°C в течение 4 ч и затем при 80°C в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь оставляли на 20 ч для обеспечения кристаллизации продукта реакции. Продукт отфильтровывали, промывали смесью 1/1/1 iProH/H^O/диоксана (2x 15 мл) и высушивали под вакуумом при 50°C с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-метокси-1H-индол-3-ил)этанона 5с (3,67 г).
Синтез соединения 5 и хиральное разделение на энантиомеры 5А и 5В
Перемешиваемую смесь 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-метокси-1H-индол-3-ил)этанона 5 с (2,35 г, 7,13 ммоль) в THF (100 мл) охлаждали на ледяной бане в атм. N2. Добавляли трибромид фенилтриметил
аммония [CAS 4207-56-1] (2,81 г, 7,48 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч, затем при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Добавляли 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанол [CAS 725237-16-1] (2,61 г, 14,3 ммоль), диизопропилэтиламин (2,46 мл, 14,3 ммоль) и CH3CN (100 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч и при 55°C в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении до 50% исходного объема. Добавляли 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанол [CAS 725237-16-1] (1 г) и диизопропилэтиламин (1,5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 65 ч. Реакционную смесь выливали в воду (400 мл) и продукт экстрагировали с помощью 2-MeTHF (2x). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток (7 г) очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 120 г, подвижная фаза: гептан/EtOAc/EtOH, градиент от 100/0/0 до 50/37/13). Необходимые фракции объединяли и выпаривали при пониженном давлении. Остаток (5,8 г) дополнительно очищали посредством препаративной HPLC (неподвижная фаза: Uptisphere(r) C18 ODB -10 мкм, 200 г, 5 см, подвижная фаза: 0,25% раствор NH4HCO3 в воде, CH3CN). Фракции, содержащие продукт, объединяли и выпаривали при пониженном давлении. Остаток растворяли в МеОН (20 мл) и оставляли для кристаллизации на 4 ч. Твердые вещества отфильтровывали, промывали МеОН (3x 5 мл) и высушивали под вакуумом при 50°C с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)-1-(6-метокси-Ш-индол-3-ил)этанона (соединения 5, 2,06 г) в виде рацемической смеси.
Хиральное разделение соединения 5 (2 г) осуществляли посредством хирального разделения с использованием нормальной фазы (неподвижная фаза: AD-H, подвижная фаза: 50% метанола, 50% этанола). Фракции, содержащие продукт, объединяли и выпаривали при пониженном давлении. Первый элюи-рованный энантиомер кристаллизовали из перемешиваемого раствора МеОН (13 мл) посредством добавления воды (3 мл). После перемешивания в течение ночи твердые вещества отфильтровывали, промывали смесью 3/1 МеОН/Н2О (4x 3 мл) и высушивали под вакуумом при 50°C с получением энантиомера 5А (476 мг). Второй элюированный энантиомер кристаллизовали из исходного раствора МеОН (13 мл) посредством добавления воды (3 мл). После перемешивания в течение ночи твердые вещества отфильтровывали, промывали смесью 3/1 МеОН/Н2О (4x 3 мл) и высушивали под вакуумом при 50°C для получения энантиомера 5В (362 мг).
Соединение 5.
1Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,65 (q, J=5,3 Hz, 2H) 3,77 (s, 3H) 3,78-3,90 (m, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,6 Hz, 1H) 5,71 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,2 Hz, 2H) 6,13 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,36 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,83 (dd, J=8,7, 2,3 Hz, 1H) 6,92-7,00 (m, 2H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1H) 8,01 (d, J=8,6 Hz, 1H) 8,29 (d, J=2,9 Hz, 1H) 11,81 (br d, J=2,2 Hz, 1H).
LC/MS (способ LC-B): Rt 1,93, MH+ 511
Энантиомер 5А.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,4 Hz, 2H) 3,77 (s, 3H) 3,78-3,90 (m, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,13 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,36 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,83 (dd, J=8,7, 2,3 Hz, 1H) 6,92-6,99 (m, 2H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1H) 8,01 (d, J=8,8 Hz, 1H) 8,29 (d, J=3,1 Hz, 1H) 11, 81 (br d, J=2,4 Hz, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,08, MH+ 511
[o]D20: +109,3° (с 0, 61, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-G): Rt 1,78 мин, МН+ 511, хиральная чистота 100%. Энантиомер 5В
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,2 Hz, 2H) 3,77 (s, 3H) 3,78-3,89 (m, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,6 Hz, 1H) 5,71 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,12 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,35 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,82 (dd, J=8,7, 2,3 Hz, 1H) 6,91-7,01 (m, 2H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,1 Hz, 1H) 8,01 (d, J=8,6 Hz, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,08, MH+ 511
[o]D20: -108,9° (c 0,52, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-G): Rt 2,19 мин, МН+ 511, хиральная чистота 100%. Пример 6. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)-1-(6-метокси-5-метил-Ш-индол-3-ил)этанона (соединения 6) и хиральное разделение на энантиомеры 6А и
6В.
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (13,5 мл, 13,5 ммоль) к раствору 6-метокси-5-метил-Ш-индола [CAS 1071973-95-9] (1,45 г, 9 ммоль) в CH2Cl2 (45 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (2,4 г, 10,9 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (45 мл) медленно добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли ледяную воду, осадок отфильтровывали и промывали водой. Твердое вещество высушивали под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-метокси-5-метил-1H-индол-3-ил)этанона 6а
(2,1 г).
Синтез промежуточного соединения 6b
При 0°C добавляли по каплям раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (2,4 г, 6,4 ммоль) в THF (65 мл) к смеси 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-метокси-5-метил-Ш-индол-3-ил)этанона 6а (2,1 г, 6,1 ммоль) в THF (60 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч и при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества диизопропилового эфира. Осадок отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-метокси-5-метил-1H-индол-3-ил)этанона 6b (2,36 г).
Синтез соединения 6 и хиральное разделение на энантиомеры 6А и 6В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6-метокси-5-метил-1H-индол-3-ил)этанона 6b (1,35 г, 3,2 ммоль), 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (0,585 г, 3,2 ммоль) и диизопропил-этиламина (0,83 мл, 4,8 ммоль) в CH3CN/THF (1/1) (80 мл) перемешивали при 70°C в течение 24 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли с помощью CH2Cl2, промывали с помощью 1 н. HCl и воды. Органический слой отделяли, высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Неочищенное соединение очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (15-40 мкм, 80 г в CH2Cl2/MeOH (99,5/0,5)). Небольшое количество кристаллизовали из Et2O/CH3CN с получением аналитического образца 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)-1-(6-метокси-5-метил-1H-индол-3-ил)этанона (соединения 6) в виде рацемической смеси. Оставшееся количество неочищенного соединения 6 смешивали с другой партией (общее количество 1,19 г) и дополнительно очищали дважды посредством препаративной LC (неподвижная фаза: диоксид кремния без покрытия с частицами неправильной формы 150 г, подвижная фаза: C^C^/MeOH (98/2), и затем толуол/iPrOH (95/5).
Энантиомеры соединения 6 (950 мг) разделяли посредством препаративной хиральной SFC (неподвижная фаза: Chiralpak(r) IC 5 мкм, 250x30 мм, подвижная фаза: 50% СО2, 50% МеОН) с получением 485 мг первого элюированного энантиомера и 480 мг второго элюированного энантиомера. Первый элюиро-ванный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O с получением энантиомера 6А (406 мг) в виде аморфного белого порошка. Второй элюированный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O с получением энантиомера 6В (436 мг) в виде аморфного белого порошка.
Соединение 6.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,21 (s, 3H) 3,61 (s, 3H) 3,62-3,68 (m, 2 H) 3,74-3,90 (m, 5H) 3,97 (s, 3H) 4,76 (t, J=4,8 Hz, 1H) 5,68-5,74 (m, 1H) 5,93 (d, J=1,5 Hz, 2H) 6,11 (d, J=7,6 Hz, 1H) 6,31 (d, J=7,6 Hz, 1H) 6,92 (s, 1H) 6,95 (dd, J=8,3, 1,8 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,8 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,3 Hz, 1H) 7,89 (s, 1H) 8,22 (s, 1H) 11,73 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,02 минуты, МН+ 525
Энантиомер 6А.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,20 (s, 3H) 3,60 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,3 Hz, 2H) 3,75-3,88 (m, 5 H) 3,97 (s, 3H) 4,78 (t, J=5,3 Hz, 1H) 5,70 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,92 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,11 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,33 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,92 (s, 1H) 6,95 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,88 (s, 1H) 8,23 (s, 1H) 11,75 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,04 мин, МН+ 525
[O]D20: +116,8° (c 0,4536, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-B): Rt 2,40 мин, МН+ 525, хиральная чистота 100%.
Энантиомер 6В.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,20 (s, 3H) 3,60 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,4 Hz, 2H) 3,77-3,88 (m, 5 H) 3,97 (s, 3H) 4,78 (t, J=5,4 Hz, 1H) 5,70 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,92 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,11 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,33 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,92 (s, 1H) 6,95 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,88 (s, 1H) 8,23 (s, 1H) 11,75 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,04 мин, МН+ 525
[a]D20: -121,9° (c 0,3855, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-B): Rt 3,75 мин, МН+ 525, хиральная чистота 99,86%. Пример 7. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-6-метокси-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидро-ксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 7) и хиральное разделение на энантиомеры 7 А и
7В.
DIPEA
CH3CN/THF, 50°С, 12 ч. МеО
Синтез промежуточного соединения 7а
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (15,7 мл, 15,7 ммоль) к раствору 5-фтор-6-метокси-Ш-индола [CAS 1211595-72-0] (2 г, 12,1 ммоль) в CH2Cl2 (50 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,2 г, 14,6 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (50 мл) медленно добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли ледяную воду и осадок отфильтровывали, промывали водой и минимальным количеством CH2Cl2. Твердое вещество высушивали под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-6-метокси-Ш-индол-3-ил)этанона 7а (2,82 г).
Синтез промежуточного соединения 7b
При 0°C добавляли по каплям раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (3,5 г, 8,1 ммоль) в THF (20 мл) к раствору 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-6-метокси-1H-индол-3-ил) этанона 7а (2,82 г, 8,1 ммоль) в THF (46 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1ч. и при комнатной температуре в течение 4 ч. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в EtOAc, промывали водой. Органическую фазу высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества EtOAc. Осадок отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-6-метокси-1H-индол-3-ил)этанона 7b (2,5 г).
Синтез соединения 7 и хиральное разделение на энантиомеры 7А и 7В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-6-метокси-1H-индол-3-ил)этанона 7b (2,4 г, 5,6 ммоль), 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (1,5 г, 8,2 ммоль) и диизопропилэти-ламина (1,45 мл, 8,4 ммоль) в CH3CN/THF (1/1) (48 мл) перемешивали при 50°C в течение 12 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли с помощью EtOAc, промывали с помощью 1 н. HCl и воды. Органический слой отделяли, высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (15-40 мкм, 80 г в CH2Cl2/MeOH (99,5/0,5)). Чистые фракции собирали и выпаривали при пониженном давлении. Небольшое количество отверждали из Et2O/CH3CN с получением аналитического образца 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-6-метокси-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединение 7) в виде рацемической смеси.
Энантиомеры соединения 7 (1,6 г) разделяли посредством препаративной хиральной SFC (неподвижная фаза: Chiralpak(r) IC 5 мкм, 250x30 мм, подвижная фаза: 55% СО2, 45% МеОН) с получением 680 мг первого элюированного энантиомера и 720 мг второго элюированного энантиомера. Первый элюиро-ванный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O с получением энантиомера 7А (603 мг) в виде аморфного белого порошка. Второй элюированный энантиомер отверждали из CH3CN/Et2O с получением энантио-мера 7В (505 мг) в виде аморфного белого порошка.
Соединение 7.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,60 (s, 3H) 3,62-3,67 (m, 2H) 3,74-3,88 (m, 5H) 3,96 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,3 Hz, 1H) 5,66-5,75 (m, 1H) 5,92 (d, J=1,8 Hz, 2H) 6,12 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,37 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,96
(dd, J=8,1, 1,8 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,8 Hz, 1H) 7,14 (d, J=7,6 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1H) 7,81 (d, J=11,6 Hz, 1H) 8,33 (s, 1H) 11,94 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 2,90 минуты, МН+ 529
Энантиомер 7А.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,60 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,5 Hz, 2H) 3,76-3,88 (m, 5 H) 3,96 (s, 3H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (t, J=1,9 Hz, 1H) 5,92 (d, J=1,9 Hz, 2H) 6,12 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,39 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 2,0 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,14 (d, J=7,6 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,81 (d, J=11,7 Hz, 1H) 8,34 (s, 1H) 11,95 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 2,90 минуты, МН+ 529
[CC]D20: +86,2° (c 0,232, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-B): Rt 2,28 мин., МН+ 529, хиральная чистота 100%. Энантиомер 7В.
1Н ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,60 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,5 Hz, 2H) 3,76-3,88 (m, 5H) 3,96 (s, 3H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,71 (t, J=1,9 Hz, 1H) 5,92 (d, J=1,9 Hz, 2H) 6,12 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,39 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 7,09 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,14 (d, J=7,6 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,81 (d, J=12,0 Hz, 1H) 8,34 (s, 1H) 11,95 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-C): Rt 2,90 минуты, МН+ 529
[C]D20: -88,7° (c 0,3, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-B): Rt 4,04 мин., МН+ 529, хиральная чистота 100%. Пример 8. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 8) и хиральное разделение на энантиомеры
8А и 8В.
Синтез промежуточного соединения 8а
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (15,0 мл, 15,0 ммоль) к раствору 5-фтор-7-метил-Ш-индола [CAS 1082041-52-8] (1,49 г, 10,0 ммоль) в CH2Cl2 (20 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,28 г, 15,0 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (10 мл) добавляли медленно при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли 1 М раствора сегнетовой соли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Образовавшиеся твердые вещества отфильтровывали и распределяли между EtOAc и 1 н. HCl. Фазы разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические фазы объединяли, промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)этанона 8а (2,03 г).
Синтез промежуточного соединения 8b
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (2,53 г, 6,72 ммоль) в THF (10 мл) к раствору 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил) эта-нона 8а (2,03 г, 6,11 ммоль) в THF (50 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества ацетонитрила. Осадок отфильтровывали, промывали ацетонитрилом и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)этанона 8b (2,00 г).
Синтез соединения 8 и хиральное разделение на энантиомеры 8А и 8В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-7-метил-1H-индол-3-ил)этанона 8b (1,70 г, 4,14 ммоль) и 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (2,28 г, 12,4 ммоль) в THF (10 мл) и CH3CN (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток распределяли между EtOAc и 1 н. HCl. Фазы разделяли. Органическую фазу промывали дважды с помощью 1 н. HCl, водным насыщенным раствором NaHCO3 и солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества ацетонитрила. Осадок отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5-фтор-7-метил-Ш-индол-3
ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 8, 1,23 г) в виде рацемической смеси.
Энантиомеры соединения 8 (1,17 г) разделяли посредством хирального разделения с использованием нормальной фазы (неподвижная фаза: Daicel Chiralpak(r) OD-H, подвижная фаза: 80% гептана, 20% этанола). Первый элюированный продукт дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 12 г, подвижная фаза: геп-тан/EtOAc/EtOH, градиент от 100/0/0 до 40/45/15). Чистые фракции объединяли и выпаривали. Продукт кристаллизовали в течение ночи из смеси МеОН (4 мл) и воды (1 мл), отфильтровывали, промывали МеОН (3х) и высушивали под вакуумом при 50°C для получения энантиомера 8А (37 мг). Второй элюиро-ванный продукт дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 12 г, подвижная фаза: гептан/EtOAc/EtOH, градиент от 100/0/0 до 40/45/15). Чистые фракции объединяли и выпаривали. Продукт кристаллизовали из смеси МеОН и Н2О, отфильтровывали, промывали МеОН и высушивали под вакуумом при 50°C для получения энантиомера 8В (177 мг).
Соединение 8.
1H ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,48 (s, 3H) 3,56-3,71 (m, 5H) 3,74-3,92 (m, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,72 (s, 1H) 5,95 (d, J=1,9 Hz, 2H) 6,17 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,40 (d, J=8,3 Hz, 1H) 6,87-7,01 (m, 2H) 7,10 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,3 Hz, 1H) 7,65 (dd, J=9,8, 2,3 Hz, 1H) 8,46 (s, 1H) 12,22 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-D): Rt 1,52 мин, МН+ 513
Энантиомер 8А.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,2 Hz, 2H) 3,77 (s, 3H) 3,78-3,89 (m, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,6 Hz, 1H) 5,71 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,12 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,35 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,82 (dd, J=8,7, 2,3 Hz, 1H) 6,91-7,01 (m, 2H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,1 Hz, 1H) 8,01 (d, J=8,6 Hz, 1H) 8,29 (d, J=2,9 Hz, 1H) 11,81 (br d, J=2,4 Hz, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,12 мин, МН+ 513
[CC]D20: -83,8° (c 0,4725, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-G): Rt 2,32 мин, МН+ 513, хиральная чистота 100%. Энантиомер 8В.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,47 (s, 3H) 3,61 (s, 3H) 3,65 (q, J=5,2 Hz, 2H) 3,77-3,90 (m, 2H) 3,97 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,6 Hz, 1H) 5,72 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,95 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,16 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,37 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,92 (dd, J=10,1, 2,0 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,3, 1,9 Hz, 1H) 7,10 (d, J=1,8 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1H) 7,65 (dd, J=9,7, 2,4 Hz, 1H) 8,45 (d, J=3,5 Hz, 1H) 12,20 (br d, J=2,9 Hz, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,14 мин, МН+ 513
[a]D20: +86,6° (c 0,4805, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-G): R 1,44 мин, МН+ 513, хиральная чистота 100%. Пример 9. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5,6-дифтор-1Н-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидрокси-этокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 9) и хиральное разделение на энантиомеры 9А и 9В.
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (14,9 мл, 14,9 ммоль) к раствору 5,6-дифтор-1Н-индола [CAS 169674-01-5] (1,50 г, 9,8 ммоль) в CH2Cl2 (20 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,22 г, 14,7 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (20 мл) добавляли медленно при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 2 ч. Добавляли 1 М раствора сегнетовой соли и реакционную смесь энергично перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Осадок отфильтровывали и распределяли между EtOAc и 1 н. HCl. Фазы разделяли. Водный слой экстрагировали дважды с помощью EtOAc. Органические фазы объединяли, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества ацетонитрила. Осадок отфильтровывали и высушивали под вакуу
мом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5,6-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 9а (2,73 г).
Синтез промежуточного соединения 9b
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (3,36 г, 8,94 ммоль) в THF (50 мл) к раствору 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5,6-дифтор-Ш-индол-3-ил)-2-(4-хлор-2-метоксифенил)этанона 9а (2,73 г, 8,13 ммоль) в THF (80 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 15 мин и при комнатной температуре в течение 2 ч.
Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества ацетонитрила. Осадок отфильтровывали и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5,6-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 9b (3,00 г).
Синтез соединения 9 и хиральное разделение на энантиомеры 9 А и 9В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5,6-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 9b (1,80 г, 4,34 ммоль) и 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (2,39 г, 13,0 ммоль) в THF (9 мл) и CH3CN (9 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 65 ч. Добавляли 1 н. HCl и реакционную смесь экстрагировали с помощью EtOAc. Фазы разделяли. Органическую фазу промывали 1 н. HCl, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Осадок очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле с использованием градиента EtOAc (15-70%) в дихлор-метане. Чистые фракции объединяли и концентрировали при пониженном давлении с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(5,6-дифтор-1Н-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)ами-но)этанона (соединения 9, 1,20 г) в виде рацемической смеси. Фракции с примесями объединяли и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле с использованием градиента этилацетата (15% -70%) в дихлорметане с получением второй партии соединения 9 (0,290 г) в виде рацемической смеси.
Энантиомеры соединения 9 (1,4 г) разделяли посредством хирального разделения с использованием нормальной фазы (неподвижная фаза: Daicel Chiralpak(r) OD-H, подвижная фаза: 80% гептана, 20% этанола). Первый элюированный продукт дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 12 г, подвижная фаза: CH2Cl2/MeOH, градиент от 100/0 до 90/10). Чистые фракции объединяли, выпаривали и выпаривали совместно с МеОН. Остаток лиофилизировали из смеси растворителей CH3CN (4,5 мл) и воды (2,5 мл) и высушивали под вакуумом при 45°C для получения энантиомера 9А (409 мг). Второй элюированный продукт дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Revel-eris 12 г, подвижная фаза: CH2Cl2/MeOH, градиент от 100/0 до 90/10). Чистые фракции объединяли, выпаривали и выпаривали совместно с МеОН. Остаток лиофилизировали из смеси растворителей CH3CN (5 мл) и воды (3 мл) и высушивали под вакуумом при 45°C для получения энантиомера 9В (388 мг).
Соединение 9.
1Н ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,62-3,70 (m, 2H) 3,75-3,90 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,79 (t, J=5,6 Hz, 1H) 5,72 (t, J= 2,1 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 1H) 6,15 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,42 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,2, 2,2 Hz, 1H) 7,10 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,3 Hz, 1H) 7,54 (dd, J=10,8, 7,0 Hz, 1H) 7,99 (dd, J=11,2, 8,2 Hz, 1H) 8,48 (s, 1H) 12,19 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-D): Rt 1,44 мин, МН+ 517
Энантиомер 9А.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,2 Hz, 2H) 3,77-3,89 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,72 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,14 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,39 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1H) 7,53 (dd, J=10,8, 7,0 Hz, 1H) 7,99 (dd, J=11,2, 8,1 Hz, 1H) 8,47 (s, 1H) 12,16 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,15 мин, МН+ 517
[cc]D20: -98,9° (c 0,445, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-G): Rt 1,92 мин, МН+ 517, хиральная чистота 100%. Энантиомер 9В
1Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,61 (s, 3H) 3,64 (q, J=5,2 Hz, 2H) 3,75-3,91 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,6 Hz, 1H) 5,72 (t, J=2,1 Hz, 1H) 5,93 (d, J=2,2 Hz, 2H) 6,14 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,39 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,1, 2,0 Hz, 1H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1H) 7,53 (dd, J=10,8, 7,0 Hz, 1H) 7,99 (dd, J=11,1, 8,3 Hz, 1H) 8,47 (s, 1H) 12,16 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,15 мин, МН+ 517
[cc]D20: +98,9° (c 0,555, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-G): Rt 1,36 мин., МН+ 517, хиральная чистота 100%.
Пример 10. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(7-фтор-5-метил-1Н-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 10) и хиральное разделение на энантиоме-ры 10А и 10В.
Синтез промежуточного соединения 10а
Добавляли по каплям при -15°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (16 мл, 16 ммоль) к раствору 7-фтор-5-метил-1Н-индола [CAS 442910-91-0] (1,59 г, 10,7 ммоль) в CH2Cl2 (150 мл) в потоке N2. Через 15 мин. при -15°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,27 г, 14,9 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (50 мл) медленно добавляли при -15°C. Реакционную смесь перемешивали при -15°C в течение 1 ч и при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь выливали в перемешиваемую смесь ледяной воды/сегнетовой соли. Твердые вещества удаляли из реакционной смеси путем фильтрации через тонкую подушку из Dicalite(r) и осадок на фильтре промывали несколько раз с помощью THF. Слои разделяли и водный слой экстрагировали с помощью THF. Объединенные органические слои промывали солевым раствором, водой, высушивали над MgSO4, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Твердый остаток суспендировали в CH2Cl2 (10 мл). Твердые вещества отфильтровывали, промывали небольшим количеством CH2Cl2 и высушивали под вакуумом при 50°C с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(7-фтор-5-метил-1Н-индол-3-ил)этанона 10а (2,22 г).
Синтез промежуточного соединения 10b
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (2,77 г, 7,36 ммоль) в THF (50 мл) к раствору 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(7-фтор-5-метил-1Я-индол-3-ил) эта-нона 10а (2,22 г, 6,7 ммоль) в THF (150 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью THF. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества CH2Cl2. Осадок отфильтровывали, промывали с помощью CH2Cl2 (2х) и высушивали под вакуумом при 50°C с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(7-фтор-5-метил-1Н-индол-3-ил)этанона 10b (2,55 г).
Синтез соединения 10 и хиральное разделение на энантиомеры 10А и 10В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(7-фтор-5-метил-1Н-индол-3-ил)этанона 10b (2 г, 4,87 ммоль), 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (1,6 г, 7,3 ммоль) и диизопропилэти-ламина (1,26 мл, 7,3 ммоль) в CH3CN (100 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч., при 60°C в течение 8 ч. и снова при комнатной температуре в течение 16 ч. Растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток растворяли в CH2Cl2 (50 мл), промывали с помощью 0,5 М HCl (50 мл) и воды (50 мл), высушивали над MgSO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 120 г, подвижная фаза: EtOAc/гептан, градиент от 0/100 до 60/40). Фракции, содержащие продукт, объединяли, выпаривали и высушивали при 50°C под вакуумом с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(7-фтор-5-метил-1Н-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 10, 1,3 г) в виде белого твердого вещества.
Энантиомеры соединения 10 (1,3 г) разделяли посредством хирального разделения с использованием нормальной фазы (неподвижная фаза: AD-H, подвижная фаза: 70% этанола, 30% метанола) с получением 637 мг первого элюированного энантиомера и 628 мг второго элюированного энантиомера. Первый элюированный продукт кристаллизовали из смеси МеОН/воды. Твердые вещества отфильтровывали и промывали смесью МеОН/воды (1/1) с получением энантиомера 10А (302 мг) в виде белого аморфного порошка. Второй элюированный продукт дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (неподвижная фаза: диоксид кремния Biotage(r) Grace Reveleris 40 г, подвижная фаза: MeOH/CH2Cl2, градиент от 0/100 до 2/98). Фракции, содержащие продукт, объединяли и выпаривали с получением энан-тиомера 10В (335 мг) в виде белого аморфного порошка.
Соединение 10.
1Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,38 (s, 3H) 3,61 (s, 3H) 3,62-3,67 (m, 2H) 3,77-3,89 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,77 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,72 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,94 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,15 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,34 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,90 (d, J=12,1 Hz, 1H) 6,96 (dd, J=8,1, 2,0 Hz, 1H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H) 8,38 (s, 1H) 12,46 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,16 мин, МН+ 513
Энантиомер 10A.
1Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,38 (s, 3H) 3,62 (s, 3H) 3,66 (br t, J=4,8 Hz, 2H) 3,77-3,92 (m, 2H) 3,96 (s, 3H) 4,78 (br s, 1H) 5,73 (s, 1H) 5,96 (s, 2H) 6,17 (br d, J=7,9 Hz, 1H) 6,35 (br d, J=8,1 Hz, 1H) 6,91 (d, J=12,1 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,3, 1,4 Hz, 1H) 7,10 (d, J=1,5 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1H) 7,79 (s, 1H) 8,39 (s, 1H) 12,47 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,15 мин, МН+ 513
[OC]D20: +132,3° (c 0,505, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-F): Rt 2,13 мин, МН+ 513, хиральная чистота 100%. Энантиомер 10В.
1H ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 2,38 (s, 3H) 3,61 (s, 3H) 3,63-3,68 (m, 2H) 3,77-3,92 (m, 2H) 3,96
(s, 3Н) 4,77 (br t, J=5,7 Hz, 1H) 5,72 (t, J=2,0 Hz, 1H) 5,95 (d, J=2,0 Hz, 2H) 6,16 (d, J=7,9 Hz, 1H) 6,35 (d, J=8,1 Hz, 1H) 6,91 (d, J=12,1 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1H) 7,09 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,78 (s, 1H) 8,39 (s, 1H) 12,46 (br s, 1H).
LC/MS (способ LC-A): Rt 1,15 мин, МН+ 513
[O]D20: -144,1° (c 0,4975, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-F): Rt 3,13 мин., МН+ 513, хиральная чистота 100%. Пример 11. Синтез 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6,7-дифтор-1Н-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидрокси-этокси)-5-метоксифенил)амино)этанона (соединения 11) и хиральное разделение на энантиомеры 11А и
11 В.
Синтез промежуточного соединения 11а
Добавляли по каплям при 0°C 1 М диэтилалюминийхлорид в гексане (15,0 мл, 15,0 ммоль) к раствору 6,7-дифтор-1Н-индола [CAS 271780-84-8] (1,53 г, 10,0 ммоль) в CH2Cl2 (20 мл). Через 30 мин при 0°C раствор 2-(4-хлор-2-метоксифенил)ацетилхлорида 1а (3,28 г, 15,0 ммоль, синтез: см. пример 1) в CH2Cl2 (10 мл) добавляли медленно при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 ч. Добавляли 1 М раствора сегнетовой соли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Твердые вещества отфильтровывали и распределяли между EtOAc и 1 н. HCl. Фазы разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические фазы объединяли, промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6,7-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 11а (2,36 г).
Синтез промежуточного соединения 11b
Добавляли по каплям при 0°C раствор трибромида фенилтриметиламмония [CAS 4207-56-1] (2,90 г, 7,02 ммоль) в THF (10 мл) к раствору 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6,7-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 11а (2,36 г, 7,02 ммоль) в THF (50 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Осадок отфильтровывали и промывали с помощью EtOAc. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток поглощали с помощью минимального количества ацетонитрила. Осадок отфильтровывали, промывали ацетонитрилом и высушивали под вакуумом с получением 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6,7-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 11b (2,34 г).
Синтез соединения 11 и хиральное разделение на энантиомеры 11А и 11В
Смесь 2-бром-2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6,7-дифтор-1Н-индол-3-ил)этанона 11b (1,70 г, 4,14 ммоль) и 2-(3-амино-5-метоксифенокси)этанола [CAS 725237-16-1] (2,25 г, 12,3 ммоль) в THF (10 мл) и CH3CN (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток распределяли между EtOAc и 1 н. HCl. Фазы разделяли. Органическую фазу промывали дважды с помощью 1 н. HCl, водным насыщенным раствором NaHCO3 и солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле с использованием градиента EtOAc (20% - 100%) в гептане. Фракции, содержащие ожидаемое соединение, объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток кристаллизовали из смеси Et2O, ацетонитрила и гептана с получением 2-(4-хлор-2-метоксифенил)-1-(6,7-дифтор-1Н-индол-3-ил)-2-((3-(2-гидроксиэтокси)-5-мето
ксифенил)амино)этанона (соединения 11, 1,54 г) в виде рацемической смеси.
Энантиомеры соединения 11 (1,22 г) разделяли посредством препаративной хиральной SFC (неподвижная фаза: Chiralcel(r) OD-H 5 мкм 250x30 мм, подвижная фаза: 55% СО2, 45% МеОН) с получением 550 мг первого элюированного энантиомера и 570 мг второго элюированного энантиомера. Первый элю-ированный энантиомер отверждали из CH3CN/диизопропилового эфира с получением энантиомера 11А (487 мг). Второй элюированный энантиомер отверждали из CH3CN/диизопропилового эфира с получением энантиомера 11 В (460 мг). Оба энантиомера представлены в виде аморфных порошков.
Соединение 11.
1Н ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3,56-3,69 (m, 5H) 3,75-3,90 (m, 2H) 3,95 (s, 3H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 5,73 (s, 1H) 5,95 (d, J=1,9 Hz, 2H) 6,18 (d, J=8,3 Hz, 1H) 6,41 (d, J=8,3 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,1, 1,7 Hz, 1H) 7,10 (d, J=1,9 Hz, 1H) 7,16-7,30 (m, 1H) 7,36 (d, J=8,3 Hz, 1H) 7,92 (dd, J=8,7, 4,5 Hz, 1H) 8,50 (s, 1H) 12,78 (br. s., 1H).
LC/MS (способ LC-D): Rt 1,52 мин, МН+ 517
Энантиомер 11A.
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 12,79 (br. s., 1H) 8,50 (s, 1H) 7,92 (dd, J=8,7, 4,3 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,5 Hz, 1H) 7,20-7,27 (m, 1H) 7,10 (d, J=1,6 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,4, 1,7 Hz, 1H) 6,42 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,18 (d, J=8,2 Hz, 1H) 5,95 (d, J=1,6 Hz, 2H) 5,72 (s, 1H) 4,79 (t, J=5,4 Hz, 1H) 3,94 (s, 3H) 3,78-3,89 (m, 2H) 3,593,68 (m, 5H)
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,07 мин, МН+ 517 [O]d20: -99,6° (c 0,2218, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-D): Rt 1,80 мин, МН+ 517, хиральная чистота 100%. Энантиомер 11 В
1H ЯМР (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 12,79 (br. s., 1H) 8,50 (s, 1H) 7,91 (dd, J=8,7, 4,3 Hz, 1H) 7,36 (d, J=8,2 Hz, 1H) 7,17-7,28 (m, 1H) 7,10 (d, J=1,9 Hz, 1H) 6,97 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H) 6,41 (d, J=8,2 Hz, 1H) 6,18 (d, J=8,2 Hz, 1H) 5,95 (d, J=1,9 Hz, 2H) 5,72 (t, J=1,9 Hz, 1H) 4,79 (t, J=5,5 Hz, 1H) 3,94 (s, 3H) 3,77-3,88 (m,
2H) 3,55-3,70 (m, 5H)
LC/MS (способ LC-C): Rt 3,07 мин, МН+ 517 [O]d20: +99,2° (c 0,2127, DMF)
Хиральная SFC (способ SFC-D): Rt 3,38 мин, МН+ 517, хиральная чистота 100%.
Противовирусная активность соединений по настоящему изобретению Анализ противовирусной активности в отношении DENV-2
Тестировали противовирусную активность всех соединений по настоящему изобретению против штамма 16681 DENV-2, который метили усиленным зеленым флуоресцентным белком (eGFP). Среда для культивирования состоит из минимальной поддерживающей среды, дополненной 2% термически инак-тивированной фетальной телячьей сыворотки, 0,04% гентамицина (50 мг/мл) и 2 мМ L-глутамина. Клетки Vero, полученные из ЕСАСС, суспендировали в среде для культивирования и добавляли по 25 мкл в 384-луночные планшеты (2500 клеток/лунка), которые уже содержали противовирусные соединения. Как правило, эти планшеты содержали 4-кратное серийное разведение, состоящее из 9 стадий разведения, тестируемого соединения в 200-кратной конечной концентрации в 100% DMSO (200 нл). Кроме того, тестировали каждую концентрацию соединения в четырех параллельных анализах (диапазон конечной концентрации: 25-0,00038 мкМ). В результате каждый планшет содержал лунки, которые принимали в качестве контролей с вирусом (содержащих клетки и вирус без соединения), контролей с клетками (содержащих клетки без вируса и соединения) и контролей со средой (содержащих среду без клеток, вируса и соединений). В лунки, которые принимали в качестве контролей со средой, добавляли 25 мкл среды для культивирования вместо клеток Vero. После того, как клетки добавляли в планшеты, планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре для обеспечения равномерного распределения клеток в лунках. Далее планшеты инкубировали в полностью увлажненном инкубаторе (37°C, 5% СО2) до следующего дня. Затем штамм 16681 DENV-2, меченый eGFP, добавляли при множественности заражения (MOI), равной 0,5. Следовательно, 15 мкл вирусной суспензии добавляли во все лунки, содержащие тестируемое соединение, и во все лунки, которые принимали в качестве контролей с вирусом. Параллельно добавляли 15 мкл среды для культивирования к контролям со средой и клетками. Далее планшеты инкубировали в течение 3 дней в полностью увлажненном инкубаторе (37°C, 5% СО2). В день проведения считывания измеряли флуоресценцию eGFP с использованием автоматизированного флуоресцентного микроскопа при 488 нм (голубой лазер). Применяя служебную систему LIMS, рассчитывали кривые зависимости ингибирования от дозы для каждого соединения и определяли полумаксимальную эффективную концентрацию (ЕС50). Следовательно, рассчитывали процент ингибирования (I) для каждой тестируемой концентрации с использованием следующей формулы: I=100*(ST-SCC)/(SVC-SCC); при этом ST, SCC и SVC представляют собой уровень сигнала eGFP в лунках с тестируемыми соединениями, контролями с клетками и контролями с вирусом соответственно. ЕС50 представляет собой концентрацию соединения, при которой репликация вируса ингибируется на 50%, что измерено с помощью 50% восстановления интенсивности флуоресценции eGFP по сравнению с контролем с вирусом. Рассчитывали
ЕС5о с применением линейной интерполяции (табл. 1).
Параллельно оценивали токсичность соединений в тех же планшетах. После того, как проводили считывание сигнала eGFP, во все лунки 384-луночных планшетов добавляли 10 мкл резазурина, красителя, показывающего жизнеспособность клеток. Анализ с резазурином основан на восстановлении голубого резазурина с помощью NADH, продуцирующегося клетками, в сильнофлюоресцирующий продукт, резоруфин. Образование розового флуоресцентного резоруфина непосредственно связано с количеством жизнеспособных клеток в лунке. Планшеты инкубировали в течение дополнительных 5 ч в полностью увлажненном инкубаторе (37°C, 5% СО2). Далее планшеты измеряли на сверхчувствительном считывающем устройстве (Tecan) с использованием длины волны возбуждения, составляющей 530 нм. Также определяли полумаксимальную цитотоксическую концентрацию (СС5о), определенную как концентрация, необходимая для уменьшения превращения резазурина на 50% по сравнению с лунками с контроля-ми с клетками (табл. 1). В результате определяли индекс селективности (SI) для соединений, который рассчитывали как указано ниже: SI=CC50/EC50.
Таблица 1. EC50, CC50 и SI для соединений по настоящему изобретению в анализе противовирусной
активности в отношении DENV-2
№ соединения
ЕС50
СС50
(мкм)
(мкм)
0,0030
2053
0,00081
5395
0, 14
0,00081
5166
0, 081
0,00072
7587
0,00034
20070
0, 045
158
0,0014
4398
0,00070
6965
0, 045
164
0,0023
2860
0,00084
7057
0,40
0,0012
4639
0,00082
6520
0, 076
0,0026
2860
0, ООН
5569
0, 069
112
0,0024
3270
0,0012
3457
0,26
0,0022
3329
0,0044
899
0, 076
0,0075
767
10А
0,0032
1416
10В
0, 19
0,0031
1879
0, 090
11В
0,0012
3526
N= количество независимых экспериментов, в которых тестировали соединения. Анализ с количественной PCR с обратной транскриптазой (RT-qPCR) в отношении
квадривалентной вакцины
Протокол А.
Тестировали противовирусную активность соединений по настоящему изобретению против штамма ТС974#666 DENV-1 (NCPV), штамма 16681 DENV-2, штамма Н87 DENV-3 (NCPV) и штаммов Н241 (NCPV) и EDEN DENV-4 (SG/06K2270DK1/2005; номер доступа в GenBank QG398256) в анализе с RT-qPCR. В связи с чем, клетки Vero заражали или с помощью штамма DENV-1, или -2, или -3, или -4 в присутствии или отсутствии тестируемых соединений. На 3 день после инфицирования клетки лизировали и клеточные лизаты использовали для получения кДНК как для вируса-мишени (3'UTR DENV; табл. 2), так и эталонного гена клетки (Р-актин, табл. 2). Впоследствии, осуществляли дуплексную PCR в режиме реального времени на приборе Lightcycler480. Полученное значение Ср является обратно пропорциональным по отношению к уровню экспрессии РНК этих мишеней. Ингибирование репликации DENV с помощью тестируемого соединения привело к сдвигу Ср для гена 3'UTR. С другой стороны, если тестируемое соединение является токсичным по отношению к клеткам, то будет наблюдаться похожий эффект и в отношении экспрессии Р-актина. Сравнительный способ ААСр применяют для вычисления ЕС50, который основан на относительной генной экспрессии гена-мишени (3'UTR), нормализованного конститутивным геном клетки (Р-актином). Кроме того, определяли значения СС50 на основе значений Ср, полученных для конститутивного гена Р-актина.
а Элементы указанных красителей (FAM, HEX) и гасителей люминесценции (BHQ1) выделены жирным и курсивом.
b Выбирали нуклеотидную последовательность праймеров и зондов из консервативной области в 3'UTR области генома вируса денге на основании выравнивания 300 нуклеотидных последовательностей четырех серотипов вируса денге, депонированных в Genbank (Gong et al., 2013, Methods Mol Biol, Chapter 16).
Среда для культивирования состояла из минимальной поддерживающей среды, дополненной 2% термически инактивированной фетальной телячьей сыворотки, 0,04% гентамицина (50 мг/мл) и 2 мМ L-глутамина. Клетки Vero, полученные из ЕСАСС, суспендировали в среде для культивирования и добавляли по 75 мкл/лунка в 96-луночные планшеты (10000 клеток/лунка), которые уже содержали противовирусные соединения. Как правило, эти планшеты содержали 4-кратное серийное разведение, состоящее из 9 стадий разведения, тестируемого соединения в 200-кратной конечной концентрации в 100% DMSO (500 нл; диапазон конечной концентрации: 25-0,00038 мкМ). Кроме того, каждый планшет содержал лунки, которые принимали в качестве контролей с вирусом (содержащих клетки и вирус без соединения), контролей с клетками (содержащих клетки без вируса и соединения). После добавления клеток в планшеты, планшеты инкубировали в полностью увлажненном инкубаторе (37°C, 5% СО2) до следующего дня. Затем, добавляли штамм ТС974#666 DENV-1, штамм 16681 DENV-2, штамм Н87 DENV-3 или штаммы Н241 или EDEN DENV-4. Следовательно, 25 мкл вирусной суспензии, где Ср ~22 получали в RT-qPCR, добавляли во все лунки, содержащие тестируемое соединение, и во все лунки, которые принимали в качестве контролей с вирусом. Параллельно добавляли 25 мкл среды для культивирования к контролям с клетками. Далее планшеты инкубировали в течение 3 дней в полностью увлажненном инкубаторе (37°C, 5% СО2). Через 3 дня удаляли надосадочную жидкость из лунок и дважды промывали клетки ледяным PBS (-100 мкл). Сгустки клеток в 96-луночных планшетах хранили при -80°C в течение по меньшей мере 1 дня. Далее экстрагировали РНК с применением набора для лизирования Cells-to-CT(tm) согласно инструкциям изготовителя (Applied Biosystems). Клеточные лизаты можно было хранить при -80°C или сразу же использовать на стадии с обратной транскрипцией.
При подготовке к стадии с обратной транскрипцией, получали смесь А (табл. 3A) и распределяли по 7,57 мкл/лунка в 96-луночном планшете. После добавления 5 мкл клеточных лизатов осуществляли пятиминутную стадию денатурации при 75°C (табл. 3B). Позже добавляли 7,43 мкл смеси В (табл. 3С) и инициировали стадию с обратной транскрипцией (табл. 3D) для получения кДНК.
В конечном итоге получали смесь для RT-qPCR, смесь С (табл. 4А), распределенную в 9б-луночных планшетах LightCycler для qPCR, к которым добавляли 3 мкл кДНК и осуществляли qPCR согласно условиям в табл. 4В на LightCycler 480.
Используя программное обеспечение LightCycler и служебную систему LIMS, рассчитали кривые зависимости от дозы для каждого соединения и определяли полумаксимальную эффективную концентрацию (ЕС50) и полумаксимальную цитотоксическую концентрацию (СС50) (табл. 6-9).
Образцы
864
Элемент смеси
Концентрация
Объем (мкл)
Единица измерен ия
Исход Конеч ная ная
образе Ц
образ цов
Буфер 2
Expand
HIFI
10, 00
1, 00
2,00
1728,
MgCl2
25, 00
3, 50
2, 80
2419,
dNTP
10, 00
1, 00
2, 00
1728,
Ингибито р РНК-
U/u.1
40, 00
1, 00
0, 50
432, 0
азы
Expand RT
и/ц1
50, 00
0, 33
0, 13
112, 3
Общий объем смеси (мкл)
7,43
Протокол В.
Клетки Vero (4 х 104) высевали в 96-луночные планшеты. Через один день среду для культивирования клеток заменяли 100 мкл среды для количественного определения, содержащей 2х, 3х или 5х серийное разведение соединения (диапазон концентрации: 50 мкг/мл 0,00038 мкг/мл, 50 мкг/мл - 0,0076 мкг/мл и 50 мкг/мл 0,00013 мкг/мл, соответственно) и 100 мкл разведения вируса денге, где Ct ~20 получали в RT-qPCR. После 2-часового инкубационного периода 3 раза промывали клеточный монослой средой для количественного определения для удаления остаточного не адсорбированного вируса и дополнительно инкубировали в течение либо 4 дней (DENV-2 NGC-Tongalike), либо 7 дней (штамм D1/H/IMTSSA/98/606 Djibouti DENV-1, прототип, представляющий собой штамм Н87 DENV-3, штамм Н241 DENV-4) в присутствии ингибитора. Собирали надосадочную жидкость и определяли РНК нагрузку с помощью количественной RT-PCR в режиме реального времени. 50% эффективную концентрацию (ЕС50), которую определяют как концентрацию соединения, которая необходима для ингибирования репликации вирусной РНК на 50%, определяли с применением логарифмической интерполяции (табл. 7 и 8).
РНК выделяли из 100 мкл надосадочной жидкости с помощью набора NucleoSpin 96 Virus (Filter Service, Дюрен, Германия), как описано производителем. Последовательности праймеров TaqMan (прямой праймер для DENV, обратный праймер для DENV; табл. 5) и зондов TaqMan (зонд для DENV, табл.
5) выбирали из неструктурного гена 3 (NS3) или NS5 соответствующих флавивирусов с использованием программного обеспечения Primer Express (версия 2.0; Applied Biosystems, Ленник, Бельгия). Зонд Taq-Man флюоресцентно метили с помощью 6-карбоксифлюоресцеина (FAM) на 5'-конце в качестве указанного красителя и с малой бороздой связующего вещества (MGB) на 3'-конце в качестве гасителя люминесценции (табл. 5). Проводили одностадийную количественную RT-PCR в общем объеме 25 мкл, с содержанием 13,9375 мкл Н2О, 6,25 мкл мастер-микса (Eurogentec, Серен, Бельгия), 0,375 мкл прямого праймера, 0,375 мкл обратного праймера, 1 мкл зонда, 0,0625 мкл обратной транскриптазы (Eurogentec) и 3 мкл образца. Проводили RT-PCR с применением системы ABI 7500 для быстрой PCR в режиме реального времени (Applied Biosystems, Бренчбург, Нью-Джерси, США) и с применением следующих условий: 30 мин при 48°C и 10 мин при 95°C, за чем следовало 40 циклов 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Данные анализировали с использованием программного обеспечения ABI PRISM 7500 SDS (версия 1.3.1; Applied Biosystems). Для полного количественного анализа составляли стандартные кривые с использованием 10-кратного разведения полученной матрицы с известными концентрациями.
а Элементы указанного красителя (FAM) и гасителя люминесценции (MGB/TAMRA) выделены жирным и курсивом.
b Нуклеотидную последовательность и положение праймеров и зондов в геноме выводили из нук-леотидной последовательности NGC DENV 2 (номер доступа в GenBank M29095; Irie et al., 1989), штамма D1/H/IMTSSA/98/606 Djibouti серотипа 1 вируса денге (номер доступа в Genbank AF298808), прототипа, представляющего собой штамм Н87 серотипа 3 вируса денге (с93130), штамма Н241 серотипа 4 вируса денге (нет доступных последовательностей).
Цитотоксический анализ (протокол В).
Оценивали потенциальные цитотоксические эффекты соединений в неинфицированных клетках Vero. Клетки высевали при 4 х 104 клеток/лунка в 96-луночный планшет при двух-, трех- или пятикратных серийных разведениях (в диапазоне 50 мкг/мл - 0,0038 мкг/мл, 50 мкг/мл - 0,0076 мкг/мл и 50 мкг/мл - 0,00013 мкг/мл, соответственно) соединения и инкубировали в течение от 4 до 7 дней. Отбирали среду для культивирования и 100 мкл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2И-тетразолий/феназинметосульфата (MTS/PMS; Promega, Лейден, Нидерланды) в PBS добавляли в каждую лунку.
После 2-часового инкубационного периода при 37°C определяли плотность клеток при 498 нм. Рассчитывали цитотоксическую активность с применением следующей формулы: % жизнеспособных кле-ток=100х(СЮ соединения/СЮсс), где OD соединения и ODCC соответствует оптической плотности при 498 нм соответственно неинфицированных культур клеток, обработанных соединением, и неинфицированных, необработанных культур клеток. 50% цитотоксическую концентрацию (т.е. концентрацию, которая уменьшает общее количество клеток на 50%; СС50) рассчитывали с использованием линейной интерполяции (табл. 7 и 8).
N= количество независимых экспериментов, в которых тестировали соединения Таблица 7. ЕС50, СС50 и SI для соединений против серотипа 2 в анализах с RT-qPCR
Протокол
RT-qPCR 16681
серотипа 2
№ соединения
ЕС50 (мкм)
СС50 (мкм)
0, ООН
4,7
4457
0,00085
5,7
6744
0,00024
4,3
25632
0,00044
5,2
12915
0,00050
4,5
10575
0,00054
3,7
8391
0,00091
4,7
5763
0,0012
5,2
4406
0,00079
3, 8
4833
10А
0,0032
4,2
1312
11В
0,0010
4,7
4562
Протокол В
RT-
qPCR
NGC-Tongalike серотипа 2
№ соединения
ЕС50 (мкм)
СС50 (мкм)
0,00038
36900
0,00040
31100
<0,00033
> 37200
<0,00034
> 37300
<0,00040
> 28 000
0,00040
29300
0,00027
18900
0,0014
8050
<0,00031
> 37300
10А
0,0014
8910
11В
0,00027
37900
N= количество независимых экспериментов, в которых тестировали соединения.
N= количество независимых экспериментов, в которых тестировали соединения.
Протокол А
RT-qPCR EDEN
серотипа 4
№ соединения
ЕС50 (мкм)
СС50 (мкм)
0,0062
3,7
583
0,0043
4,4
1007
0,0029
4,1
1579
0,0052
4,4
981
0,0046
4,2
630
0,0029
3,6
1241
0,0066
3,7
536
0,0065
4,5
690
0,0047
2,6
717
10А
0,0086
4,4
436
11В
0,0098
4,0
374
N= количество независимых экспериментов, в которых тестировали соединения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Janssen Pharmaceuticals, Inc
Katholieke Universiteit Leuven <120> ПРОИЗВОДНЫЕ МОНО- ИЛИ ДИЗАМЕЩЕННЫХ ИНДОЛОВ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСОВ ДЕНГЕ <130> TIP 326 PCT <150> EP14187374.5 <151> 2014-10-01 <150> EP15159164.1
<151> 2015-03-16 <160> 14
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1 <211> 20 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник <222> (1)..(20)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 1
tcggagccgg agtttacaaa 20
<210> 2 <211> 20 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(20)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 2
tcttaacgtc cgcccatgat 20
<210> 3 <211> 19 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(19)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 3
attccacaca atgtggcat 19
<210> 4 <211> 23 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(23)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 4
ggatagacca gagatcctgc tgt 23
<210> 5 <211> 20 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(20)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 5
cattccattt tctggcgttc 20
<210> 6 <211> 20 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(20)
<223> / организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 6
caatccatct tgcggcgctc 20
<210> 7 <211> 20 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(20)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 7
cagcatcatt ccaggcacag 20
<210> 8 <211> 20 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(20)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 8
caacatcaat ccaggcacag 20
<210> 9 <211> 19 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(19)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 9
cggttagagg agacccctc 19
<210> 10 <211> 21 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(21)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 10
gagacagcag gatctctggt c 21
<210> 11 <211> 28 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник
<222> (1)..(28)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 11
aaggactaga ggttagagga gacccccc 28
<210> 12 <211> 18 <212> ДНК
<213> Вирус денге <220>
<221> источник <222> (1)..(18)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК" <400> 12
ggccaggtca tcaccatt 18
<210> 13 <211> 21 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник <222> (1)..(21)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 13
atgtccacgt cacacttcat g 21
<210> 14 <211> 21 <212> ДНК
<213> Вирус денге
<220>
<221> источник <222> (1)..(21)
<223> /организм="вирус денге" тип_молекулы="неопределенная ДНК"
<400> 14
ttccgctgcc ctgaggctct c 21
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение формулы (I)
(|),
его стереоизомерная форма или его фармацевтически приемлемая соль; при этом указанное соединение выбрано из группы, где
R1 представляет собой Н, R2 представляет собой F и R3 представляет собой Н, F или СН3;
Ri представляет собой F или СН3, R2 представляет собой ОСН3 и R3 представляет собой Н;
Ri представляет собой F, R2 представляет собой Н и R3 представляет собой СН3;
Ri представляет собой Н, R2 представляет собой ОСН3 и R3 представляет собой Н;
R1 представляет собой Н, R2 представляет собой Cl и R3 представляет собой Н или СН3;
Ri представляет собой F, R2 представляет собой F и R3 представляет собой Н, или
R1 представляет собой СН3, R2 представляет собой Н и R3 представляет собой F.
2. Соединение, стереоизомерная форма или фармацевтически приемлемая соль по п.1, где указанное соединение выбрано из группы
3. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге, содержащая соединение формулы (I), его стереоизомерную форму или фармацевтически приемлемую соль по п .1 или 2 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями или носителями.
4. Применение соединения формулы (I), его стереоизомерной формы или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 в качестве лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге.
5. Применение фармацевтической композиции по п.3 в качестве лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусом денге.
6. Применение соединения, представленного следующей структурной формулой (I)
его стереоизомерной формы или его фармацевтически приемлемой соли; при этом указанное соединение выбрано из группы, где
R1 представляет собой Н, R2 представляет собой F и R3 представляет собой Н, F или СН3;
Ri представляет собой F или СН3, R2 представляет собой ОСН3 и R3 представляет собой Н;
Ri представляет собой F, R2 представляет собой Н и R3 представляет собой СН3;
Ri представляет собой Н, R2 представляет собой ОСН3 и R3 представляет собой Н;
R1 представляет собой Н, R2 представляет собой Cl и R3 представляет собой Н или СН3;
Ri представляет собой F, R2 представляет собой F и R3 представляет собой Н, или
Ri представляет собой СН3, R2 представляет собой Н и R3 представляет собой F,
для ингибирования репликации вируса (вирусов) денге у пациента.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032546
032546
- 1 -
- 1 -
(19)
032546
032546
- 1 -
- 1 -
(19)
032546
032546
- 4 -
- 5 -
(19)
032546
032546
- 8 -
- 9 -
032546
032546
- 8 -
- 8 -
032546
032546
- 8 -
- 8 -
032546
032546
- 8 -
- 8 -
032546
032546
- 10 -
- 10 -
032546
032546
- 10 -
- 10 -
032546
032546
- 26 -
- 26 -
032546
032546
- 27 -
- 27 -
032546
032546
- 29 -
- 29 -
032546
032546
- 31 -
- 31 -
032546
032546
- 33 -
- 34 -
032546
032546
- 35 -
- 34 -