(57) Реферат / Формула:
1. Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 - продуцент бактериородопсина.
Евразийское ои 032524 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201700112
(22) Дата подачи заявки 2014.10.27
(51) Int. Cl. C12N1/20 (2006.01) C12P1/04 (2006.01) C12R 1/01 (2006.01) A01N 63/02 (2006.01)
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ HALOBACTERIUM SALINARUM - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОРОДОПСИНА
(31) 2014133704
(32) 2014.08.18
(33) RU
(43) 2017.07.31
(86) PCT/RU2014/000811
(87) WO 2016/028188 2016.02.25
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ТЮРИН СЕРГЕЙ АНАНЬЕВИЧ; ПОГОРЕЛОВ ОЛЕГ ВАДИМОВИЧ
(RU)
(72) Изобретатель:
Тюрин Сергей Ананьевич (RU)
(74) Представитель:
Апарина Т.В. (RU)
(56) RU-C1-2370957
WO-A2-2001023415
RU-C1-2321627
RU-C1-2416634
(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается штамма-продуцента бактериородопсина. Штамм Halobacterium salinarum ST 3 получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 без предварительной обработки химическими реагентами и депонирован в ВКПМ под номером В-11850. Штамм Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 превосходит по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) ВКПМ В-10425.
032524
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается штамма-продуцента бактериородопсина. Штамм Halobacterium salinarum ST 3 получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 без предварительной обработки химическими реагентами и депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-11850. Штамм Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 превосходит по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) прототип ВКПМ В-10425.
Предшествующий уровень техники
Из уровня техники известен штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 - продуцент бактериородопсина, раскрытый в патенте RU 2321627, опубликованном 10.04.2008.
Недостатками данного штамма являются низкие параметры микробиологической продуктивности, такие как количество биомассы и бактериородопсина.
Наиболее близким к заявленному изобретению является штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 - продуцент бактериородопсина, раскрытый в патенте RU 2416634, опубликованном 20.04.2011, значительно превосходящий по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) штаммы бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 и Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025.
Недостатками данного штамма являются низкие параметры микробиологического роста по основным показателям, таким как количество биомассы и бактериородопсина.
Раскрытие изобретения
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, - получение штамма Halobacterium salinarum с повышенным уровнем синтеза биомассы и бактериородопсина.
Задача решена путем получения штамма бактерий Halobacterium salinarum ST 3, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 и способного синтезировать бактериородопсин на 30% более, чем ВКПМ В-10425 при различных условиях культивирования. Заявляемый штамм получен путём многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425, без предварительной обработки химическими реагентами.
Штамм ВКПМ В-11850 имеет следующие характеристики:
Культурально-морфологические признаки
Величина клеток трехсуточной культуры 2-5x0,5-0,9 мкм, одиночные палочки, иногда объединены по 2-3 палочки.
Подвижен, максимум подвижности на 4 сутки роста. Спор не образует, газовых вакуолей не содержит.
Колонии полупрозрачные, гладкие с гладким краем, темно-красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлёй. Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 25% NaCl. При содержании хлористого натрия ниже 20% клетки теряют свою окраску, а при попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.
Хорошо растёт при 36-40°С, в солевой жидкой среде, имеющей состав (мас.%.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO4 - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, CaCl2 - 0,02, вода
- остальное, рН среды - 7,2-7,4, а также в солевой агаризованной среде, имеющей состав (мас.%.): пептон
- 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO4 - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, CaCl2 - 0,02, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4.
Отношение к температуре: хорошо растет при 36-40°С, оптимальная температура 38°С.
Отношение к рН среды: хорошо растет при 7,2-7,4, оптимум рН-7,3.
Физиолого-биохимические признаки
Факультативный аэроб, прототроф, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растёт на картофеле. Желатину не разжижает. Антагонистических свойств не обнаружено.
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16 S рРНК, штамм наиболее близок к видам Halobacterium salinarum (99,9%).
Как и все представители рода Halobacterium заявляемый штамм непатогенен и может быть отнесен к группе безопасности № 1 (на основании заключения Коллекции АТСС). Работа с ним не требует специальных мер предосторожности.
Не является генетически модифицированным штаммом.
Хранение штамма:
Хорошо хранится на агаризованной среде в бакпечатках и на косяках в условиях холодильника в течение года. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Продуктивность штамма Halobacterium salinurum ВКЛМ В-11850 при выращивании в колбах
Заявляемый штамм ВКПМ В-11850, а также используемый в качестве контроля штамм ВКПМ В-10425 (прототип) выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, "Osram", Germany) до стационарной ста- 1
032524
дии роста (6 суток) на круговой качалке при 37°С и встряхивании 100 об/мин.
Для выращивания использовали среду следующего состава (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт -0,5, NaCl - 25, MgSO4 - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, CaCl2 - 0,02, вода - остальное, рН среды -7,2-7.4.
Осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и взвешивали полученную биомассу.
Затем к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, и инкубировали при встряхивании в условиях комнатной температуры в течение 3 ч.
Осадок отделяли центрифугированием, супернатант использовали для определения количества бак-териородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:
С= D-Mr'Vp.pa'VKI0B;/ Ебр Упробы
где
D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм; Mr - молекулярная масса бактериородопсина (26700); Vp-pa - общий объем раствора бактериородопсина;
V кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете; Ебр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М-1см-1);
V пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете. Полученные данные представлены в табл. 1.
Из приведенных в табл. 1 результатов видно, что заявляемый щтамм В-11850 превосходит ВКПМ В-10425 как по количеству биомассы, так и по концентрации бактериородопсина после выращивания в колбах.
Пример 2. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 при выращивании в ферментере
Заявляемый штамм ВКПМ В-11850, а также испопьзуемый в качестве контроля штамм ВКПМ В-10425 (прототип) выращивали в ферментере BioFlo 110 (New Brunswick Scientific, USA), в объеме среды культивирования 10000 мл. В качестве среды культивирования использовали среду как в примере 1. В ферментере поддерживали постоянную температуру 37°С, перемешивание: первые 24 ч 400 об/мин, на вторые сутки 600 об/мин, на 3 сутки 800 об/мин, на 7 сутки 1000 об/мин. Аэрация во время ферментации - 0,5 л/мин. Исследуемые штаммы выращивали до стационарной стадии роста. Далее определяли вес биомассы и содержание бактериородопсина в среде выращивания как в примере 1.
Полученные данные представлены в табл. 2.
Как следует из результатов, приведенных в табл. 1 и 2, заявляемый штамм ВКПМ В-11850 превосходит прототип ВКПМ В-10425 по количеству синтезируемых при различных условиях культивирования биомассы и бактериородопсина.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 - продуцент бактериородопсина.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 2 -
