[RU]

1. Способ получения клеток яичника китайского хомячка CHO-S с нулевым уровнем фукозы, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантного белка, включающий: (a) обработку популяции клеток CHO-S метотрексатом (МТХ) в концентрации 100-200 нМ, который вызывает мутацию в гене GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD); (b) обеспечение контактирования полученной популяции клеток CHO-S, содержащих мутантные клетки, с нетоксичным лектином в течение не более 60 мин, что позволяет осуществить связывание лектина с фукозной группой на клеточной мембране указанных клеток, причем за указанное время не происходит уничтожение клеток; и (c) выделение субпопуляции клеток, которые связываются с лектином, таким образом отбирая клетки, применимые в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, где отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы в отсутствие экзогенной фукозы, причем в мутированной GMD отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзонами 3 и 4, или аминокислоты, кодируемые экзонами 8 и 9.

2. Способ по п.1, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc-белок.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный лектин присоединен к детектируемой группе или аффинной группе.

4. Способ по п.3, в котором при присоединении лектина к аффинной группе дополнительно осуществляют контактирование указанной популяции клеток, содержащей мутантные клетки, с дополнительным агентом, такое дополнительное вещество содержит родственную связывающую группу для указанной аффинной группы.

5. Способ по п.4, где указанная аффинная группа содержит биотин.

6. Способ по п.4, где указанная родственная связывающая группа присоединена к детектируемой группе.

7. Способ по п.6, где указанная детектируемая группа содержит флуоресцентную группу или магнитную частицу.

8. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством FACS сортинга.

9. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством магнитного разделения.

10. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют по меньшей мере тремя циклами последовательного выделения.

11. Способ по любому из пп.1-4, где указанный лектин представляет собой лектин алеврии оранжевой (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL).

12. Выделенная клетка CHO-S, полученная способом по любому из предшествующих пунктов, где клетка является генетически модифицированной для экспрессии мутантной GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD), имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23 или 24.

13. Выделенная клетка CHO-S по п.12, где величина фукозилирования белка, экспрессированного в ней, линейно зависит от концентрации внешней фукозы, где концентрация внешней фукозы находится между 1 и 10 мкг/мл.

14. Выделенная клетка CHO-S по п.12 или 13, экспрессирующая фукозилтрансферазу-8 (Fut8) дикого типа.

15. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-14, экспрессирующая GDP-кето-6-дезоксиманнозу 3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (FX) дикого типа.

16. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-15, экспрессирующая рекомбинантное антитело или Fc слитый белок.

17. Клеточная линия CHO-S, содержащая выделенную клетку, полученную способом по п.1.

18. Клеточная линия по п.17, которая образует популяцию клеток, у которой суммарная концентрация жизнеспособных клеток (IVCC) на 20% выше, чем у немутантных клеток CHO-S.

19. Клеточная линия по п.17 или 18, в которой время удвоения популяции не превышает 20 ч.

20. Клеточная линия по любому из пп.17-19, имеющая стабильный фукозный фенотип, по меньшей мере, на протяжении 370 удвоений популяции.

21. Клеточная линия CHO-S по п.20, депонированная в CNCM под номером I-4449.

22. Клеточная культура, которая содержит выделенную клетку CHO-S по п.12 и клеточную культуральную среду, лишенную животных примесей.

23. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда содержит фукозу.

24. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда не содержит фукозу.

25. Способ получения рекомбинантного белка, предусматривающий трансфекцию выделенной клетки CHO-S по п.12 полинуклеотидом, кодирующим рекомбинантный белок, культивирование трансфицированной клетки CHO-S в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, и выделение указанного белка.

26. Способ по п.25, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc слитый белок.

27. Способ по п.25, где указанную трансфекцию проводят в присутствии экзогенной фукозы.

28. Способ по п.25, предусматривающий культивирование выделенной клетки CHO-S по п.12 в культуральной среде, содержащей фукозу, после указанной трансфекции.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ получения клеток яичника китайского хомячка CHO-S с нулевым уровнем фукозы, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантного белка, включающий: (a) обработку популяции клеток CHO-S метотрексатом (МТХ) в концентрации 100-200 нМ, который вызывает мутацию в гене GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD); (b) обеспечение контактирования полученной популяции клеток CHO-S, содержащих мутантные клетки, с нетоксичным лектином в течение не более 60 мин, что позволяет осуществить связывание лектина с фукозной группой на клеточной мембране указанных клеток, причем за указанное время не происходит уничтожение клеток; и (c) выделение субпопуляции клеток, которые связываются с лектином, таким образом отбирая клетки, применимые в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, где отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы в отсутствие экзогенной фукозы, причем в мутированной GMD отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзонами 3 и 4, или аминокислоты, кодируемые экзонами 8 и 9.

2. Способ по п.1, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc-белок.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный лектин присоединен к детектируемой группе или аффинной группе.

4. Способ по п.3, в котором при присоединении лектина к аффинной группе дополнительно осуществляют контактирование указанной популяции клеток, содержащей мутантные клетки, с дополнительным агентом, такое дополнительное вещество содержит родственную связывающую группу для указанной аффинной группы.

5. Способ по п.4, где указанная аффинная группа содержит биотин.

6. Способ по п.4, где указанная родственная связывающая группа присоединена к детектируемой группе.

7. Способ по п.6, где указанная детектируемая группа содержит флуоресцентную группу или магнитную частицу.

8. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством FACS сортинга.

9. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством магнитного разделения.

10. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют по меньшей мере тремя циклами последовательного выделения.

11. Способ по любому из пп.1-4, где указанный лектин представляет собой лектин алеврии оранжевой (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL).

12. Выделенная клетка CHO-S, полученная способом по любому из предшествующих пунктов, где клетка является генетически модифицированной для экспрессии мутантной GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD), имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23 или 24.

13. Выделенная клетка CHO-S по п.12, где величина фукозилирования белка, экспрессированного в ней, линейно зависит от концентрации внешней фукозы, где концентрация внешней фукозы находится между 1 и 10 мкг/мл.

14. Выделенная клетка CHO-S по п.12 или 13, экспрессирующая фукозилтрансферазу-8 (Fut8) дикого типа.

15. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-14, экспрессирующая GDP-кето-6-дезоксиманнозу 3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (FX) дикого типа.

16. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-15, экспрессирующая рекомбинантное антитело или Fc слитый белок.

17. Клеточная линия CHO-S, содержащая выделенную клетку, полученную способом по п.1.

18. Клеточная линия по п.17, которая образует популяцию клеток, у которой суммарная концентрация жизнеспособных клеток (IVCC) на 20% выше, чем у немутантных клеток CHO-S.

19. Клеточная линия по п.17 или 18, в которой время удвоения популяции не превышает 20 ч.

20. Клеточная линия по любому из пп.17-19, имеющая стабильный фукозный фенотип, по меньшей мере, на протяжении 370 удвоений популяции.

21. Клеточная линия CHO-S по п.20, депонированная в CNCM под номером I-4449.

22. Клеточная культура, которая содержит выделенную клетку CHO-S по п.12 и клеточную культуральную среду, лишенную животных примесей.

23. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда содержит фукозу.

24. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда не содержит фукозу.

25. Способ получения рекомбинантного белка, предусматривающий трансфекцию выделенной клетки CHO-S по п.12 полинуклеотидом, кодирующим рекомбинантный белок, культивирование трансфицированной клетки CHO-S в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, и выделение указанного белка.

26. Способ по п.25, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc слитый белок.

27. Способ по п.25, где указанную трансфекцию проводят в присутствии экзогенной фукозы.

28. Способ по п.25, предусматривающий культивирование выделенной клетки CHO-S по п.12 в культуральной среде, содержащей фукозу, после указанной трансфекции.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
032513
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201391282
(22) Дата подачи заявки 2012.03.05
(51) Int. Cl.
C12N15/10 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01)
C12N 15/01 (2006.01)
(54) КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ФУКОЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 211583; 217216
(32) 2011.03.06; 2011.12.27
(33) IL
(43) 2014.04.30
(86) PCT/IL2012/000109
(87) WO 2012/120500 2012.09.13 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
МЕРК СЕРОНО С.А. (CH)
(72)
Изобретатель:
Хельман Дэниел, Бар-Шимон Мейрав, Тойстер-Ачитув Мира (IL)
(74)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(56)
WO-A1-2010036443
CHOW MING ET AL.: "Random population-wide genetic damage induced in replicating cells treated with methotrexate", 30 March 1998 (1998-03-30), MUTATION RESEARCH, VOL. 413, NR. 3, PAGE(S) 251-264, XP002677215, ISSN: 0027-5107, page 262, column 1, last paragraph - page 262, column 2, paragraph 1 - page 252, column 1, paragraph 2 - page 252, column 2, paragraph 2
HOFFMANN S. ET AL.: "RAPID ISOLATION OF CHORIOCAPILLARY ENDOTHELIAL CELLS BY LYCOPERSICON ESCULENTUM-COATED DYNABEADS", GRAEFE'S ARCHIVE FOR CLINICAL
AND EXPERIMENTAL OPHTHALMOLOGY,
SPRINGER VERLAG, XX, vol. 236, no. 10, 1 October 1998 (1998-10-01), pages 779-784, XP001025139, ISSN: 0721-832X, DOI: 10.1007/S004170050158, page 780, column 1, paragraph 2 - page 780, column 2, paragraph 1
JACKSON CJ. ET AL.: "Binding of human endothelium to ulex europaeus I-coated dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium",
JOURNAL OF CELL SCIENCE, CAMBRIDGE
UNIVERSITY PRESS, LONDON, GB, vol. 96, 1 January 1990 (1990-01-01), pages 257-262, XP002263448, ISSN: 0021-9533, page 257, column 2, last paragraph - page 258, column 1, paragraph 3
RIPKA J. ET AL.: "Two chinese hamster ovary glycosylation mutants affected in the conversion
of GDP-mannose to GDP-fucose", ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, ACADEMIC
PRESS, US, vol. 249, no. 2, 1 September 1986 (1986-09-01),
pages 533-545, XP024759128, ISSN: 0003-9861, DOI:
10.1016/0003-9861(86)90031-7 [retrieved on 1986-09-01], page 534, column 1, paragraph 2; tab. 2, page 544, column 1, last paragraph - page 544, column 2, paragraph 1, Abstract KANDA ET AL.: "Establishment of a GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout host cell line: A new strategy for generating completely non-fucosylated recombinant therapeutics", JOURNAL
OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE
PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 130, no. 3, 19 June 2007 (2007-06-19), pages 300-310, XP022119693, ISSN: 0168-1656, DOI: 10.1016/J.JBIOTEC.2007.04.025, page 301, column 1, last paragraph - page 301, column 2, paragraph 1 - page 303, column 1, paragraph 2 - page 304, column 1, paragraph 1 - page 305, column 2, paragraph 1; fig. 4, 6; tab. 1, page 309, column 1, paragraph 1
OHYAMA С. ET AL.: "Molecular cloning and expression of GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, a key enzyme for fucose metabolism defective in Lec13 cells",
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR
BIOLOGY, US, vol. 273, no. 23, 5 June 1998 (1998-06-05), pages 14582-14587, XP002328593, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/JBC.273.23.14582, the whole document
MASUDA ET AL.: "Enhanced binding affinity for FcgammaRIIIa of fucose-negative antibody is sufficient to induce maximal antibody-dependent cellular cytotoxicity",
MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, GB,
vol. 44, no. 12, 17 April 2007 (2007-04-17), pages 3122-3131, XP022031617, ISSN: 0161-5890, DOI: 10.1016/J.MOLIMM.2007.02.005, the whole document
KANDA YUTAKA ET AL.: "Comparison of cell lines for stable production of fucose-negative
antibodies with enhanced ADCC", BIOTECHNOLOGY
AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US, vol. 94, no. 4, 1 July 2006 (2006-07-01), pages 680-688, XP002415543, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/ BIT.20880, the whole document
NATSUME A. ET AL.: "Fucose removal from complex-type oligosaccharide enhances the antibody-dependent cellular cytotoxicity of single-gene-encoded antibody comprising a single-chain antibody linked the antibody constant region", JOURNAL OF
IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE
PUBLISHERS B.V., AMSTERDAM, NL, vol. 306, no. 1-2, 30 November 2005 (2005-11-30), pages 93-103, XP027659257, ISSN: 0022-1759 [retrieved on 2005-11-30], the whole document
(57) Изобретение относится к способу получения клеток яичника китайского хомячка CHO-S с нулевым уровнем фукозы, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантного
белка, включающему обработку популяции клеток CHO-S метотрексатом (МТХ) в концентрации 100-200 нМ, который вызывает мутацию в гене GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD); обеспечение контактирования полученной популяции клеток CHO-S, содержащих мутантные клетки, с нетоксичным лектином в течение не более 60 мин, что позволяет осуществить связывание лектина с фукозной группой на клеточной мембране указанных клеток, причем за указанное время не происходит уничтожение клеток; выделение субпопуляции клеток, которые связываются с лектином, таким образом отбирая клетки, применимые в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, где отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы в отсутствие экзогенной фукозы, причем в мутированной GMD отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзонами 3 и 4, или аминокислоты, кодируемые экзонами 8 и 9, а также к вариантам этого способа. Также изобретение относится к выделенной клетке CHO-S, полученной таким способом, к клеточной линии, содержащей указанную клетку, к клеточной культуре, содержащей указанную выделенную клетку и культуральную среду, лишенную животных примесей, а также к способу получения рекомбинантного белка, предусматривающему трансфекцию указанной выделенной клетки СНО-S полинуклеотидом, кодирующим рекомбинантный белок, культивирование трансфицированной клетки CHO-S в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, и выделение указанного белка.
Область, к которой относится изобретение, и предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение в некоторых вариантах его осуществления относится к клеточным линиям CHO, способам их получения и к применению этих клеточных линий.
Рекомбинантные терапевтические антитела играют важную роль в лечении целого ряда заболеваний. По оценкам около 30% вновь появляющихся лекарственных средств в следующем десятилетии предположительно основано на антителах. Тридцать рекомбинантных антител и Fc-слияний одобрено для продажи с товарооборотом, который достиг в 2008 г. $35 млрд.
Антитела содержат целевую антиген-специфичную область, которая состоит из вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей. Эта часть антитела может связываться с растворимым антигеном или мембраносвязанной мишенью и нейтрализовать их.
Fc-часть ответственна за эффекторные функции посредством механизма антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), комплемент-зависимого комплекса (CDC) и неонатального рецептора FcRn. Эти эффекторные функции опосредуются через взаимодействие эффекторных молекул с шарнирной областью и областью СН2 Fc. Домен СН2 содержит олигосахарид, расположенный в участке N-гликозилирования в положении 297 антитела, который, как известно, играет важную роль в связывании с эффекторными клетками. Этот олигосахарид обычно состоит из комплекса двухразветвленного типа со множественной гетерогенностью, например, ядерного гептасахарида совместно с дополнительными вариабельными наружными сахаридными остатками.
ADCC представляет собой один из важнейших механизмов уничтожения для антител, которые связываются с лигандами на мембране клеток-мишеней. FcyR, экспрессирующийся на лейкоцитах, связывается с доменом СН2 антител и при связывании и образовании иммунных комплексов с антигенами на клетках-мишенях инициируется активация лейкоцитов. Активация может включать фагоцитоз и высвобождение клеточных медиаторов, что приводит к изменению проницаемости мембраны клетки и гибели. ADCC активность зависит от изотипа IgG с одной стороны и от специфичного FcyR с другой стороны. Тогда как IgG1 и IgG3 могут индуцировать эту активность, IgG4 не может. FcyR, который связывается с IgG и является важным для активации механизма ADCC, известен как FcyRIIIa и экспрессируется на NK-клетках и макрофагах. Во многих случаях активность ADCC, достигаемая при связывании NK-клетки с клеткой-мишенью, не является достаточно эффективной для уничтожения клетки-мишени. Причиной этого является то, что аффинность FcyRIIIa в отношении IgG1 является низкой.
Повышенная активность ADCC была обнаружена у пациентов, у которых экспрессируется высокоаффинный аллотип FcyRIIIa 158Val, обнаруживающийся у 10-15% населения, по сравнению с пациентами, у которых экспрессируется FcyRIIIa - 158Phe. Повышенная ADCC также была получена путем манипуляций, сделанных на Fc IgG. Алгоритмы компьютерного дизайна использовали для создания антител и отбора на высокую аффинность с помощью скрининга с высокой пропускной способностью. Эта работа в результате привела к получению антител, которые демонстрируют усиление эффекторной функции in vitro > 2 порядков величины (Lazar, Dang et al., 2006), хотя было обнаружено снижение термостабильности мутантного IgG1 (IgG1 с мутациями S239D, A330L и I332E). Другим подходом для получения антител с повышенной ADCC является получение их с низкими уровнями фукозы на олигосахариде в положении 297. Ранее было обнаружено, что остатки фукозы на олигосахариде препятствуют связыванию Fc с FcyRIIIa (Shinkawa, Nakamura et al., 2003). Одним путем получения антител с низкими уровнями фуко-зы является использование клеток с такими природными возможностями, например клетки гибридомы Rat YB2/0 (Shinkawa, Nakamura et al., 2003), хотя рекомбинантные белки, продуцируемые в этих клетках, имеют изменчивые уровни содержания фукозы. Некоторые другие возможные клетки немлекопитающих включают клетки птиц от Vivalis, сконструированное водяное растение Lemna от Biolex (Cox, Sterling et al., 2006) и вариант мхов Physocmirtella patens от Igeneon (Nechansky, Schuster et al., 2007). Кроме того, GlycoFi генерировали различные линии клеток Pichia Pastoris с возможностью нескольких технологий гликозилирования, включая повышенную ADCC (Hamilton, Davidson et al., 1999). Также некоторые клетки млекопитающих используют для получения антител с различными возможностями гликозилирования в целом и повышенной ADCC в частности. Гликотип вызывал в различных клеточных линиях человека, полученных путем гликоинжиниринга, гликооптимизированное биотерапевтическое гликозилирование. Компания Glycart, приобретенная Roche, сконструировала клеточную линию, продуцирующую рекомби-нантные антитела со сниженным уровнем фукозы, путем включения бета(1,4)-№ ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей образование разделенных пополам олигосахаридов, которые были вовлечены в антителозависимую клеточную цитоток-сичность (ADCC) (Umana, Jean-Mairet et al., 1999). Компания Biowa синтезировала нуль-мутацию в гене фукозилтрансферазы 8 (Fut8) CHO DG44 для сведения к минимуму уровней фукозы (Yamane-Ohnuki,
Kinoshita et al., 2004).
Недавнее исследование показало, что гетерологичная экспрессия прокариотического фермента GDP-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулозаредуктазы в цитозоле может блокировать превращение промежуточного соединения GDP-4-кето-6-дезоксиманнозы в конечный продукт, который обычно не встречается в клетках позвоночных. Следовательно, клетки CHO, которые были модифицированы этим путем, секре
тировали антитела, лишенные сердцевинной фукозы (von Horsten, Ogorek et al.). Другим подходом было создание мутантов, резистентных к лектину, которые выживают в присутствии токсичных лектинов, специфичных к фукозе. LEC13 представляет собой клеточную линию на основе CHO, которая была разработана путем инкубирования клеток CHO в присутствии токсичного лектина гороха, специфичного к фукозе (Ripka и Stanley 1986). LEC13 лишены GDP-манноза 4,6-дегидратазной активности, которая в результате приводит к экспрессии IgG1 человека, лишенных фукозы (Shields, Lai et al., 2002).
В патентной заявке США № 2010/0081150 представлены сведения о мутации клеток CHO путем обработки химическими соединениями и отбора клеток, которые демонстрируют вариант профиля глико-зилирования, включающий снижение фукозилирования путем уничтожения клеток высоким содержанием фукозы, для получения клеток, применимых для экспрессии антител.
В патентной заявке США № 2010/0304436 представлены сведения о клеточных линиях CHO с уменьшенным фукозилированием путем внесения мутаций в белок Fx и контролирования доступности внешнего источника фукозы для направления способности клеток к фукозилированию полипептидов.
Kanda et al. (Kanda, Imai-Nishiya et al., 2007) описывают линии клеток-хозяев с нокаутом GMD и FUT8. Клетки с нокаутом GMD имеют геномную делецию, соответствующую GMD экзону 5, областям 6
и 7.
Ripka et al. (Ripka и Stanley 1986) описывают четыре мутантных клетки CHO, резистентных к лек-тину. Эти мутации осуществлялись путем инкубирования с №метил^-нитрозогуанидином.
Shields et al. (Shields, Lai et al., 2002) описывают, что IgG1, продуцируемый клеточной линией LEC13 (СНО, лишенные фукозы), увеличивал связывание с FcyRIIIA вплоть до 50 раз, а также увеличивалась ADCC.
Kanda et al. (Kanda, Yamane-Ohnuki et al., 2006) описывают, что LEC13 продуцирует 50-70% фуко-зилированных антител; однако эта известная клеточная линия не могла стабильно продуцировать антитела. Таким образом, клеточная линия LEC13 не подходит в качестве продуцирующей клеточной линии.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения клеток яичника китайского хомячка CHO-S с нулевым уровнем фукозы, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантного белка, включающему:
(a) обработку популяции клеток CHO-S метотрексатом (МТХ) в концентрации 100-200 нМ, который вызывает мутацию в гене GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD),
(b) обеспечение контактирования полученной популяции клеток CHO-S, содержащих мутантные клетки, с нетоксичным лектином в течение не более 60 мин, что позволяет осуществить связывание лек-тина с фукозной группой на клеточной мембране указанных клеток, причем за указанное время не происходит уничтожение клеток; и
(c) выделение субпопуляции клеток, которые связываются с лектином, таким образом отбирая клетки, применимые в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, где отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы в отсутствии экзогенной фукозы, причем в мутированной GMD отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзонами 3 и 4, или аминокислоты, кодируемые экзонами
8 и 9.
В одном из вариантов осуществления в указанном способе рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc-белок. В другом варианте способа указанный лектин присоединен к детектируемой группе или аффинной группе. Еще в одном варианте осуществления в указанном способе при присоединении лектина к аффинной группе дополнительно осуществляют контактирование указанной популяции клеток, содержащей мутантные клетки, с дополнительным агентом, такое дополнительное вещество содержит родственную связывающую группу для указанной аффинной группы. Еще в одном варианте осуществления в указанном способе аффинная группа содержит биотин. В другом варианте способа родственная связывающая группа присоединена к детектируемой группе. В дополнительном варианте осуществления детектируемая группа содержит флуоресцентную группу или магнитную частицу. В еще одном варианте осуществления выделение в указанном способе осуществляют посредством FACS сор-тинга. В другом варианте такое выделение осуществляют посредством магнитного разделения или по меньшей мере тремя циклами последовательного выделения. Кроме того, в одном из вариантов осуществления указанный лектин представляет собой лектин алеврии оранжевой (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL).
Настоящее изобретение также относится к выделенной клетке CHO-S, полученной вышеописанным способом. Такая выделенная клетка является генетически модифицированной и экспрессирует мутант-ную GDP-маннозу 4,6-дегидратазу (GMD) с аминокислотной последовательность, представленной в SEQ
ID NO: 23 или 24.
В одном из вариантов осуществления величина фукозилирования белка, экспрессирующегося в клетке, линейно зависит от концентрации внешней фукозы, где концентрация внешней фукозы находится между 1 и 10 мкг/мл. В другом варианте осуществления выделенная клетка экспрессирует фукозил-трансферазу-8 (Fut8) дикого типа, GDP-кето-6-дезоксиманнозу 3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (FX) дикого типа, рекомбинантное антитело или Fc слитый белок.
Настоящее изобретение также относится к клеточной линии CHO-S, содержащей выделенную клетку, полученную вышеописанным способом.
Такая клеточная линия может образовывать популяцию клеток, у которой суммарная концентрация жизнеспособных клеток (IVCC) на 20% выше, чем у немутантных клеток CHO-S, а время удвоения популяции не превышает 20 ч. Кроме того, такая клеточная линия имеет стабильный фукозный фенотип, по меньшей мере, на протяжении 370 удвоений популяции. В одном из вариантов осуществления клеточная линия CHO-S депонирована в CNCM под номером I-4449.
Также настоящее изобретение относится к клеточной культуре, которая содержит описанную выше выделенную клетку и клеточную культуральную среду, лишенную животных примесей.
В одном варианте осуществления клеточная культуральная среда содержит фукозу, а в другом - не содержит фукозу.
Настоящее изобретение также относится к способу получения рекомбинантного белка, предусматривающий трансфекцию выделенной клетки CHO-S по п.12 полинуклеотидом, кодирующим рекомби-нантный белок, культивирование трансфицированной клетки CHO-S в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, и выделение указанного белка.
В этом способе рекомбинантный белок может представлять собой антитело или Fc слитый белок. Также в этом способе трансфекцию проводят в присутствии экзогенной фукозы. В одном из вариантов осуществления способ предусматривает культивирование выделенной клетки CHO-S, описанной выше, в культуральной среде, содержащей фукозу, после указанной трансфекции.
Краткое описание чертежей
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны только путем приведения примеров со ссылкой на сопровождающие чертежи и изображения. Конкретной ссылкой на чертежи в подробностях подчеркивается, что показанные подробные данные представлены как пример и для целей иллюстрирующего обсуждения вариантов осуществления изобретения. В связи с этим настоящее изобретение в сочетании с чертежами делает очевидным для специалистов в данной области возможность практического осуществления вариантов настоящего изобретения.
На чертежах изображено следующее.
На фиг. 1 представлена графическая схема экспериментального подхода, который был использован для получения клеток с экспрессией полипептидов, имеющих нулевой или низкий уровень фукозы.
На фиг. 2 представлена графическая схема процессов очистки интактного и мономерного анти-
EGFR mAb.
На фиг. 3 представлен приводимый в качестве примера профиль кинетического анализа с помощью системы Octet.
На фиг. 4 представлена диаграмма, иллюстрирующая приводимую в качестве примера стратегию выделения клеток ITL-LF1 с низким уровнем фукозы (нулевая фукоза в отсутствии внешней фукозы). Клетки CHO-S инкубировали с мутагеном метотрексатом (МТХ) с последующими двумя циклами отбора клеток с низким содержанием фукозы путем мечения этих клеток биотинилированным лектином, специфичным к фукозе (биотинилированным AAL) и выделением клеток, которые не связываются с магнитными бусами, покрытыми стрептавидином. После этой стадии следовал другой цикл отбора, в котором эти клетки метили биотинилированным лектином, специфичным к фукозе (биотинилированным AAL), и флуоресцентным стрептавидином, и отбор клеток с низкой флуоресценцией проводили посредством
FACS.
На фиг. 5 представлена диаграмма, иллюстрирующая приводимую в качестве примера стратегию выделения клеток ITL-LF1 с низким содержанием фукозы. Клетки CHO-S инкубировали с мутагеном МТХ с последующими четырьмя циклами мечения клеток биотинилированным лектином, специфичным к фукозе (биотинилированным AAL) и флуоресцентным стрептавидином, и сортингом клеток с низкой флуоресценцией посредством FACS.
На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на клетках CHO-S, обработанных и необработанных МТХ после разделения на магнитных бусах. Клетки CHO-S, инкубированные с МТХ или нет, метили биотинилированным AAL и смешивали с магнитными бусами, покрытыми стрептавидином. Эти клетки, разделенные магнитными бусами, и клетки, которые не прикрепились к магниту, в дальнейшем были репродуцированы. FACS анализ проводили путем мечения клеток биоти-нилированным AAL с последующим окрашиванием флуоресцентным стрептавидином. Клетки CHO-S, обработанные МТХ, немеченые (CHO-S, инкубированные с МТХ и меченые AAL <°), клетки CHO-S с низким содержанием фукозы, инкубированные в МТХ и отобранные с помощью бус (Л> , CHO-S, отобранные с помощью бус (°).
На фиг. 7А представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на клетках ITL-LF1, выделенных с помощью магнитных бус и FACS. Клетки CHO-S, инкубированные с МТХ, метили биотинилированным AAL и смешивали с магнитными бусами, покрытыми стрептавидином. Эти клетки, разделенные на магните, и клетки, которые не прикрепились к магниту, в дальнейшем репродуцировали. Эту стадию повторяли два раза. Затем клетки метили биотинилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином, и клетки с низкой флуоресценцией подвергали сортингу посредством FACS и дополни
тельно репродуцировали. FACS анализ проводили путем мечения клеток биотинилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином. Клетки CHO-S, обработанные МТХ, немеченые <п> , клетки CHO-S, обработанные МТХ (°), клетки CHO-S, обработанные МТХ после однократного разделения на бусах (д), клетки CHO-S, обработанные МТХ после двух циклов разделения на бусах (Ф), клетки CHO-S, обработанные МТХ, после двух циклов разделения на бусах и однократного цикла FACS сортинга (т> .
На фиг. 7В представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на клетках, отобранных с использованием 1-фукоза-специфичного лектина аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL). Клетки CHO-S, немеченые (п), клетки CHO-S (0), клетки CHO-S, обработанные МТХ после однократного разделения на бусах (А), клетки CHO-S, обработанные МТХ после двух циклов разделения на бусах (^), клетки CHO-S, обработанные МТХ после двух циклов разделения на бусах и однократного цикла FACS сортинга
На фиг. 8А представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на ITL-LF1 в различной среде. Клетки ITL-LF1 репродуцировали в ProCHO5 и С6614 и анализировали посредством FACS после мечения этих клеток биотинилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином. CHO-S, обработанные МТХ, немеченые (?), CHO-S в ProCH05 (°), ITL-LF1 в ProCH05 (A), ITL-LF1 в С6614 (0).
На фиг. 8В представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на обработанных МТХ клетках CHO-S, выделенных с помощью магнитных бус и FACS. Клетки CHO-S, инкубированные с МТХ, метили биотинилированным AOL и смешивали с магнитными бусами, покрытыми стрептавиди-ном. Эти клетки, разделенные на магните, и клетки, которые не прикрепились к магниту, в дальнейшем репродуцировали. Эту стадию повторяли два раза. Затем эти клетки метили биотинилированным AOL и флуоресцентным стрептавидином и клетки с низкой флуоресценцией подвергали сортингу посредством FACS и дополнительно репродуцировали. FACS анализ проводили путем мечения клеток биотинилированным AOL и флуоресцентным стрептавидином. Клетки CHO-S, немеченые (П), клетки CHO-S (°), клетки CHO-S, обработанные МТХ после однократного разделения на бусах (Д), клетки CHO-S, обработанные МТХ после двух циклов разделения на бусах (Ф), клетки CHO-S, обработанные МТХ после двух циклов разделения на бусах и однократного цикла FACS сортинга (т> .
На фиг. 9 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней сиаловых кислот на клетках ITL-LF1 в различной среде. Клетки ITL-LF1 анализировали на уровни сиаловых кислот в среде ProCHO5 и С6614. Эти клетки метили конъюгированным с FITC специфичным лектином, связывающим сиаловые кислоты (MAA) и анализировали посредством FACS. Клетки CHO-S, немеченые (п), клетки CHO-S, меченые MAA-FITC (°), клетки ITL-LF1 в ProCHO5 меченые MAA-FITC (Д> , клетки ITL-LF1 в С6614 меченые MAA-FITC (0).
На фиг. 10 представлен график, иллюстрирующий оценку стабильности фукозы клеток ITL-LF1. Клетки ITL-LF1 анализировали посредством FACS на уровень фукозы на клеточной поверхности в различные моменты времени после завершения процесса разделения для оценки стабильности низкой экспрессии фукозы. Для анализа эти клетки метили биотинилированным AAL и флуоресцентным стрепта-видином.
На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий оценку скорости роста клеток ITL-LF1. Клетки ITL-LF1 репродуцировали на протяжении 363 удвоений популяции (PDL) и скорость роста определяли после каждого пассажа.
На фиг. 12 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ клеток ITL-LF2, выделенных путем последовательного FACS сортинга. Клетки CHO-S, инкубированные с МТХ, метили биотинилирован-ным AAL и флуоресцентным стрептавидином. Клетки с низкой флуоресценцией подвергали сортингу посредством FACS и в дальнейшем репродуцировали. Эту процедуру повторяли четыре раза. FACS анализ проводили путем мечения клеток биотинилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином. Клетки CHO-S, обработанные МТХ, немеченые (О), клетки CHO-S, обработанные МТХ (°), клетки CHO-S, обработанные МТХ, после первого сортинга (Д), клетки CHO-S, обработанные МТХ, после второго сортинга (Ф), клетки CHO-S, обработанные МТХ, после третьего сортинга СЎ), клетки CHO-S, обработанные МТХ, после четвертого сортинга (¦).
На фиг. 13 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на клетках ITL-LF2 в различной среде. Клетки ITL-LF2, репродуцировали в ProCHO5 и С6614, анализировали посредством FACS после мечения этих клеток биотинилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином. CHO-S, немеченые (?), CHO-S в ProCHO5 (°), ITL-LF2 в ProCHO5 \ , ITL-LF2 в С6614 (0).
На фиг. 14 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней сиаловых кислот на клетках ITL-LF2. Клетки ITL-LF анализировали на уровни сиаловых кислот в среде ProCHO5. Эти клетки метили конъюгированным с FITC лектином, связывающим сиаловые кислоты (МАА), и анализировали посредством FACS. Клетки CHO-S, немеченые (клетки CHO-S меченые MAA-FITC (°), клетки ITL-LF2 в среде РгоСН05, меченые MAA-FITC (Д).
На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ на клетках ITL-LF2 для анализа уровня фукозы на клеточной поверхности в различные моменты времени после завершения процесса разделения для оценки стабильности низкой экспрессии фукозы. Для анализа эти клетки метили биоти
нилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином.
На фиг. 16 представлен график, иллюстрирующий скорость роста клеток ITL-LF2. Клетки ITL-LF2 репродуцировали на протяжении 370 PDL и скорость роста определяли после каждого пассажа.
На фиг. 17 представлен график, иллюстрирующий оценку максимальной клеточной концентрации клеток ILA-LF2 в РгоСН05. Клетки высевали с концентрацией 0,2х106 в периодическом процессе, и количество клеток определяли каждые два дня. Клетки CHO-S (°) и клетки ITL-LF2 (Д).
На фиг. 18 представлен график, иллюстрирующий действие экзогенной фукозы на уровень фукози-лирования клеток ITL-LF2. Клетки ITL-LF2 высевали в среде ProCHO5 с концентрацией 0,2х106 клеток/мл с различными концентрациями L-фукозы и инкубировали при 37°С в термостате на шейкере при
320 об/мин с CO2.
На фиг. 19А представлен график, иллюстрирующий жизнеспособность ITL-LF2 и CHO-S в периодическом процессе. Клетки высевали с концентрацией 0,2х106 клеток/мл в ProCHO5 с добавками в периодическом процессе, и жизнеспособность клеток анализировали на протяжении этого процесса. Клетки CHO-S (°) и клетки ITL-LF2 (Д).
На фиг. 19В представлен график, иллюстрирующий концентрацию жизнеспособных клеток ITL-LF2 и CHO-S в периодическом процессе. Клетки высевали с концентрацией 0,2х106 клеток/мл в ProCHO5 с добавками в периодическом процессе, и количество клеток анализировали на протяжении этого процесса. Клетки CHO-S (°) и клетки ITL-LF2 (Д).
На фиг. 19С представлен график, иллюстрирующий суммарную концентрацию жизнеспособных клеток (IVCC) ITL-LF2 и CHO-S в периодическом процессе. Клетки высевали с концентрацией 0,2х106 клеток/мл в ProCHO5 с добавками в периодическом процессе. Концентрацию жизнеспособных клеток измеряли на протяжении этого процесса. IVCC рассчитывали исходя из измерения клеточной концентрации. Клетки CHO-S (°) и клетки ITL-LF2 (Д). Следует отметить, что обе клеточные линии CHO-S и ITL-LF2 являются сравнимыми, но клетки CHO-S жизнеспособны только до 9 дня, тогда как клетки ITL-LF2 -до 12 дня.
На фиг. 19D представлен график, иллюстрирующий концентрацию лактата линии ITL-LF2 и CHO-S в периодическом процессе.
На фиг. 20 представлена диаграмма, иллюстрирующая путь фукозилирования белка и предполагаемые ферменты для анализа мРНК (отмечены в прямоугольниках).
На фиг. 21 представлена фотография, иллюстрирующая ОТ-ПЦР анализ генов пути фукозилирова-ния. Тотальную РНК выделяли из клеток CHO-S (С) и ITL-LF2 (LF) и подвергали ОТ-ПЦР, используя polydT, с последующим использованием ген-специфичных праймеров. Полученные в результате продукты пропускали через агарозный гель и детектировали под УФ светом с помощью окрашивания Syber-Safe(tm) Ожидаемые размеры: Fut8 - 1,7 Kb; GMD - 1,1 Kb; FX - 1,2 Kb; GFPP - 1,7 Kb; M - маркер размера
ДНК.
Фиг. 22А-В представляют собой сравнение белковых последовательностей между полноразмерной GMD и вариантами сплайсинга. кДНК, полученные с помощью ОТ-ПЦР из РНК, экстрагированной из клеток CHO-S и ITL-LF2, пропускали через гели, выделяли и секвенировали. Последовательность ДНК затем транслировали в белок с использованием программного обеспечения CloneManager(tm). Белковую последовательность варианта сплайсинга 1 (SV1; фиг. 22А; SEQ ID NO: 23) и варианта сплайсинга 2 (SV2; фиг. 22В, SEQ ID NO: 24) сравнивали с белком (SEQ ID NO: 25), кодируемым полноразмерным геном GMD. Пунктирные линии обозначают области делеции. Текст указывает, какие экзоны делетиро-ваны в каждом варианте сплайсинга.
Фиг. 23А-В иллюстрируют рестриктазный анализ двух вариантов сплайсинга GMD. Фиг. 23А - расположение уникальных сайтов рестрикции в вариантах сплайсинга GMD; фиг. 23В - агарозный гель, показывающий полосы после рестрикции. Размеры и их объяснения подробно представлены в табл. 7 в разделе "Примеры", приведенном ниже.
На фиг. 24 представлен график, иллюстрирующий анализ уровня экспрессии генов каскада фукози-лирования в клетках ITL-LF2 по сравнению с клетками CHO-S посредством Q-ПЦР. кДНК получали из РНК ITL-LF2 и CHO-S (контроль) и подвергали анализу Q-ПЦР, используя ген-специфичные праймеры и зонды, которые расположены на экзонах 5-6 (которые находятся в мРНК полноразмерной GMD и обоих вариантах сплайсинга). Результаты для каждого гена были получены из четырех отдельных экстрактов РНК, из клеток, высеянных в четыре различные даты. В каждую дату экстракции получали кДНК и использовали для детекции всех генов посредством Q-ПЦР. Все образцы анализировали в трех повторах и стандартизировали относительно эндогенного контроля бета-актин. Числа над столбцами указывают Р-величины для каждого гена, вычисленные с использованием статистического анализа двухстороннего критерия Стьюдента. Значимость указана Р-величинами <0,05.
RQ - кратность изменения экспрессии по сравнению с контролем.
На фиг. 25 представлено схематичное изображение вектора МВ-129 (pCMV-P-GMD). кДНК полноразмерной GMD из CHO-S дикого типа клонировали в вектор pCMV-P. pCMVpr - промотор CMV человека. IVS - интрон А гена hCMV IE. РАС - ген устойчивости к пуромицину.
На фиг. 26 представлен график, иллюстрирующий, что ITL-LF2 восстанавливают фукозилирование после трансфекции кДНК GMD дикого типа. Клетки ITL-LF2 были трасфицированы вектором, содержащим кДНК GMD (pCMV-P-GMD) в среде С6614 в присутствии фукозы. Трансфицированные клетки переносили в среду РгоСН05 в отсутствии фукозы. Эти клетки анализировали посредством FACS после мечения биотинилированным AAL и флуоресцентным стрептавидином. CHO-S, немеченые CHO-S (о), ITL-LF2 (А), клетки ITL-LF2, трансфицированные GMD (0).
На фиг. 27 представлена диаграмма, иллюстрирующая плазмиду PGL3, содержащую тандем анти-EGFR mAb анти-EGFR mAb-EMCV-РАС1-DHFR. Линейную плазмиду, содержащую LC и НС анти-EGFR mAb, использовали для трансфекции CHO-S и ITL-LF2. mCMV - мышиный цитомегаловирусный промотор, EMCV - вирус энцефаломиокардита, IRES - внутренний сайт связывания рибосомы, РАС -пуромицин N-ацетилтрансфераза, DHFR - дигидрофолатредуктаза, НС - тяжелая цепь, LC - легкая цепь, SV40 - обезьяний вирус 40, рА - полиаденилирование.
На фиг. 28 представлена диаграмма, иллюстрирующая стабильную экспрессию анти-EGFR mAb в пулах ITL-LF2 и CHO-S. ITL-LF2 и CHO-S были трансфицированы вектором, содержащим анти-EGFR mAb (тандем PGL3 анти EGFR mAb EMCV-РАС1-DHFR). После восстановления продуктивность оценивали в пулах.
На фиг. 29 представлен график, иллюстрирующий анализ FACS уровней фукозы на клетках ITL-LF2, трансфицированных анти-EGFR mAb. Анализ уровней фукозы на мембране клеток, трансфициро-ванных анти-EGFR mAb, репродуцированных в среде С6614 до и после удаления фукозы. CHO-S, немеченые (?), CHO-S в РгоСН05 (°), ITL-LF2 в С6614 (0), ITL-LF2, трансфицированные анти-EGFR mAb, в С6614 в присутствии фукозы (Ў), ITL-LF2, трансфицированные анти-EGFR mAb, в С6614 в отсутствии фукозы.
На фиг. 30 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней сиаловых кислот на клетках ITL-LF2, трансфицированных анти-EGFR mAb. Анализ уровней сиаловых кислот на мембране клеток, трансфицированных анти-EGFR mAb, репродуцированных в среде ProCHO5. Эти клетки метили конъюгированным с FITC лектином, связывающим сиаловые кислоты (MAA), и анализировали посредством FACS. CHO-S, немеченые (?), CHO-S (°), ITL-LF2 (0), CHO-S, трансфицированные анти-EGFR mAb (т), ITL-LF2, трансфицированные анти-EGFR mAb (Д).
На фиг. 31 А, В представлены иллюстрации векторов, сконструированных для транзиторной транс-фекции клеток ITL-LF2. Векторы МВ-127 и МВ-128 были сконструированы на основе вектора рТТ5. Ан-ти-EGFR mAb-LC - легкая цепь EGFR mAb; анти-EGFR mAbANTI EGFR MAB-HC - тяжелая цепь EGFR mAb.
На фиг. 32 представлена столбчатая диаграмма, иллюстрирующая транзиторную экспрессию анти-EGFR mAb в клетках ITL-LF2 и в клетках CHO-S. Клетки ITL-LF2 и клетки CHO-S были транзиторно трансфицированы анти-EGFR mAb, содержащим вектором РТТ5 в среде ProCHO5. Условия трансфекции были специфичны для этого типа клеток. Клетки ITL-LF2 дополняли VPA и переносили в 31°С и CHO-S дополняли VPA и CellBoost через 24 ч после трансфекции.
На фиг. 33 представлена иллюстрация, изображающая анализ уровней остатков Сахаров на антителах посредством FACS. Образцы неочищенного продукта или очищенного антитела перемешивали с магнитными бусами, покрытыми белком G, с последующим связыванием с флуоресцентно меченым лек-тином. Уровни фукозы определяли посредством FACS в соответствии с флуоресценцией.
На фиг. 34 представлен график, иллюстрирующий анализ посредством FACS уровней фукозы на анти-EGFR mAb, транзиторно экспрессированном в ITL-LF2 и CHO-S. Образцы неочищенного продукта перемешивали с магнитными бусами, покрытыми белком G с последующим связыванием со смесью био-тинилированного AAL и флуоресцентного стрептавидина. Уровни фукозы определяли посредством FACS соответственно уровням флуоресценции. Магнитные бусы (?), анти-EGFR из трансфицированных клеток CHO-S (°), анти-EGFR из трансфицированных клеток ITL-LF2 (Д).
На фиг. 35 представлен график, иллюстрирующий анализ посредством FACS уровней фукозы на неочищенном продукте из анти-EGFR mAb, стабильно экспрессированного в культурах ITL-LF2 и CHO-S. Образцы неочищенного продукта перемешивали с магнитными бусами с белком G с последующим связыванием со смесью биотинилированного AAL и флуоресцентного стрептавидина. Уровни фукозы определяли посредством FACS соответственно уровням флуоресценции. Магнитные бусы (?), анти-EGFR mAb из трансфицированных клеток CHO-S (°), анти-EGFR mAb из трансфицированных клеток ITL-LF2 (Д).
На фиг. 36 представлен график, иллюстрирующий анализ посредством FACS уровней сиаловых кислот на неочищенном продукте из анти-EGFR mAb, стабильно экспрессированного в культурах ITL-LF2 и CHO-S. Образцы неочищенного продукта перемешивали с магнитными бусами с белком G с последующим связыванием с FITC-конъюгированным МАА. Уровни сиаловых кислот определяли посредством FACS соответственно уровням флуоресценции. Магнитные бусы О, неочищенный продукт из трансфицированных клеток CHO-S (°), неочищенный продукт из трансфицированных клеток ITL-LF2.
На фиг. 37 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней фукозы на анти-EGFR mAb, стабильно экспрессируемом в ITL-LF2 и CHO-S. Образцы очищенного антитела перемешивали с
магнитными бусами с белком G с последующим связыванием со смесью биотинилированного AAL и флуоресцентного стрептавидина. Уровни фукозы определяли посредством FACS в соответствии с уровнями флуоресценции. Магнитные бусы (?), анти-EGFR mAb из трансфицированных клеток CHO-S (°), анти-EGFR mAb из трансфицированных клеток ITL-LF2 (Д).
На фиг. 38 представлен график, иллюстрирующий FACS анализ уровней сиаловых кислот на анти-EGFR mAb, стабильно экспрессируемом в ITL-LF2 и CHO-S. Образцы очищенного антитела перемешивали с магнитными бусами с белком G с последующим связыванием с MAA, конъюгированным с FITC. Уровни сиаловых кислот определяли посредством FACS соответственно уровням флуоресценции. Магнитные бусы (?), анти-EGFR из трансфицированных клеток CHO-S (°), анти-EGFR из трансфицированных клеток ITL-LF2 (Д).
На фиг. 39 представлено считывание показаний Octet анализа уровней фукозы на очищенном ин-тактном анти-EGFR mAb. Очищенные продукты анти-EGFR mAb из CHO-S и ITL-LF2 - 225 мкг/мл при O.D 280 связывались с биотинилированным AAL (2 мкг/мл), который заранее был присоединен к биосенсорам, предварительно покрытым стрептавидином. График представляет стадию связи кинетического анализа с использованием системы Octet QK. Каждая кривая представляет конкретный образец, отмеченный стрелкой.
На фиг. 40 представлено считывание данных Octet анализа уровней сиаловых кислот на очищенном интактном анти-EGFR mAb. Очищенные продукты анти-EGFR mAb из клеток CHO-S и ITL-LF2 -115 мкг/мл при O.D 280 связывались с биотинилированным-MAA (10 мкг/мл), который заранее был присоединен к биосенсорам, предварительно покрытым стрептавидином. График представляет стадию связи кинетического анализа с использованием системы Octet QK. Каждая кривая представляет конкретный образец, отмеченный стрелкой.
На фиг. 41 представлен график анализа уровней фукозы на очищенном Fc-мономере анти-EGFR с использованием Octet. Fc-фракции анти-EGFR mAb из клеток CHO-S и из клеток ITL-LF2 40 мкг/мл при O.D. 280 связывались с биотинилированным AAL (1 мкг/мл), который заранее был присоединен к биосенсорам, предварительно покрытым стрептавидином. График представляет стадию связи кинетического анализа с использованием системы Octet QK. Каждая кривая представляет конкретный образец, отмеченный стрелкой.
На фиг. 42 представлен график анализа уровней сиаловых кислот на очищенном Fc-мономере анти-EGFR с использованием Octet. Fc-фракции анти-EGFR mAb из клеток CHO-S и из клеток ITL-LF2 - 250 мкг/мл при O.D 280 связывались с биотинилированным MAA (10 мкг/мл), который заранее был присоединен к биосенсорам, предварительно покрытым стрептавидином. График представляет стадию связи кинетического анализа с использованием системы Octet QK. Каждая кривая представляет конкретный образец, отмеченный стрелкой.
На фиг. 43 представлен график, показывающий результаты анализа профиля заряда очищенного продукта анти-EGFR mAb с использованием iCE280. Очищенные продукты анти-EGFR mAb из клеток CHO-S (¦) и из клеток ITL-LF2 (А) 0,4 мг/мл при O.D 280 анализировали с использованием iCE280. Точки представляют % площади пика изоформ в iCE280 профиле (следует отметить, что линии на этом чертеже не представляют непрерывные функции и были добавлены только для того, чтобы было легче следить за изоформами одного и того же продукта).
На фиг. 44 представлена таблица, которая демонстрирует профили гликана для Fc-фракций анти-
EGFR.
На фиг. 45 представлен график, иллюстрирующий действие экзогенной фукозы на уровень фукози-лирования клеток ITL-LF2, трансфицированных EGFR mAb. Клетки ITL-LF2, трансфицированные анти-EGFR mAb, высевали в среде ProCHO5 в концентрации 0,2х106 клеток/мл с различными концентрациями L-фукозы, и инкубировали при 37°С в термостате на шейкере при 320 об/мин с СО2.
На фиг. 46 представлен график, иллюстрирующий действие экзогенной фукозы на уровень фукози-лирования EGFR mAb.
На фиг. 47 представлена калибровочная кривая уровня фукозилирования на анти-EGFR mAb соответственно добавлению фукозы извне.
На фиг. 48А, В представлены калибровочные кривые уровней фукозы на очищенном Fc-мономере анти-EGFR с использованием Octet. Образцы получали путем смешивания продукта из фракции Fc-мономера анти-EGFR mAb из клеток CHO-S и из клеток ITL-LF2 40 мкг/мл при O.D. 280. Образцы связывались с биотинилированным AAL (1 мкг/мл), который заранее был присоединен к биосенсорам, предварительно покрытым стрептавидином. График представляет стадию связи кинетического анализа с использованием системы Octet QK. Каждая кривая соответствует конкретному % фукозы в образце (А). Представление линейной кривой (В).
На фиг. 49 представлен анализ частично фукозилированных фракций Fc-мономера анти-EGFR с использованием Octet. Фракции Fc-мономера анти-EGFR mAb из клеток CHO-S и из клеток ITL-LF2 40 мкг/мл при O.D. 280 связывались с биотинилированным AAL (1 мкг/мл), который заранее был присоединен к биосенсорам, предварительно покрытым стрептавидином. График представляет стадию связи кинетического анализа с использованием системы Octet QK. Каждая кривая соответствует конкретному
образцу.
Описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение в некоторых вариантах его осуществления относится к клеткам CHO и клеточным линиям с нулевым содержанием фукозы, способам их получения и к их применению.
Перед рассмотрением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения подробно, должно быть понятно, что это изобретение необязательно ограничено в заявке подробным изложением в последующем описании или проиллюстрировано Примерами. Это изобретение имеет другие варианты осуществления или может быть осуществлено на практике или выполнено различными способами.
Для снижения уровней фукозилирования рекомбинантных белков, например антител, для получения повышенной ADCC, авторы настоящего изобретения создали клеточные линии из клеток CHO-S, которые были модифицированы для экспрессии варианта профилей гликозилирования на их клеточной поверхности. Это осуществлялось путем инкубирования клеток в присутствии МТХ с последующей эффективной селекцией клеток с наименьшими уровнями фукозы на клеточных мембранах.
Селекцию проводили либо путем выделения на магнитных бусах и FACS сортингом (фиг. 7А, В), либо только путем FACS сортинга (фиг. 12), используя специфичные к фукозе лектины, которые обладают высокой аффинностью в отношении ccFuc1-6GlcNA остатка, находящегося в сайте гликозилирова-ния Fc-области антитела (например, лектин алеврии оранжевой (aleuria aurantia) (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL)).
Хотя отбор клеток с нулевой экспрессией фукозы проводили в соответствии с уровнями фукозы на клеточных мембранах, те же уровни фукозы были обнаружены на рекомбинантном антителе (анти-EGFR mAb), экспрессируемом в этих клетках, по данным анализов, проведенных целым рядом способов (фиг.
33-41).
Инкубируя клетки в среде, содержащей фукозу, авторы настоящего изобретения показали, что уровень фукозилирования на рекомбинантном белке, экспрессируемом в них, является регулируемым. Было показано, что этот результат является воспроизводимым (фиг. 49).
Кроме того, было обнаружено, что фенотип клеток по настоящему изобретению является стабильным на протяжении 370 протестированных удвоений популяций (PDL) (фиг. 15). Таким образом, допускается использование таких клеток в качестве продуцирующих клеток для рекомбинантных белков в случае, если требуется более 100 удвоений популяции.
Скорость роста клеток с нулевой экспрессией фукозы (обозначенных ITL-LF2 клетками) определяли во время теста стабильности фукозы, и было обнаружено, что результатом является время удвоения популяции (PDT) примерно 15-20 ч (фиг. 11), аналогичное клеткам CHO-S, из которых были получены клетки ITL-LF2.
Анализ ключевых белков, которые, как известно, вовлечены в фукозилирование, показал, что размер мРНК GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD) в отобранных клетках по настоящему изобретению был короче, чем в их эквивалентах дикого типа (фиг. 20) и секвенирование показало два варианта сплайсинга. Молекулы мРНК экстрагировали из клеток, лишенных либо третьего и четвертого, либо восьмого и девятого экзонов (фиг. 21 А-В и 22А-В).
Авторы настоящего изобретения предположили, что способ, описанный в настоящем изобретении для получения и идентификации клеточных типов с конкретными свойствами, может быть использован для отбора дополнительных подходящих типов клеток.
Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложен способ отбора клеток CHO, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, указанный способ предусматривает:
(a) введение генетических мутаций в популяцию клеток CHO, путем контактирования этих клеток с
МТХ;
(b) контактирование указанной популяции клеток CHO, содержащей мутировавшие клетки, с веществом, связывающим фукозу, в течение такого количества времени, которое дает возможность веществу, связывающему фукозу, связаться с фукозной группой на клеточной мембране популяции клеток, где указанное количество времени не дает возможности уничтожить эти клетки; и
(c) извлечение из этой популяции клеток субпопуляции клеток, которые связываются с веществом, связывающим фукозу, тем самым осуществляя отбор клеток, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы.
Клетка CHO, происходящая из ткани яичника китайского хомячка, или клеточная линия, подходящая в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой любую клетку, которая является клеточной линией, полученной из ткани яичника китайского хомячка (Cricetulus griseus). Примеры включают клетки CHO, описанные в таких документах, как Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Nat Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Nat Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Nat Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883900); и подобных. Кроме того, CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUXB11 (ATCC CCL-9096) и Pro-5 (ATCCCCL
1781) зарегистрированы в ATCC(Американская коллекция типовых культур), а также CHO-S (Life Technologies, Cat #11619) или субклеточные линии, полученные путем адаптации этих клеточных линий с использованием различных сред, также могут быть использованы в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клон CHO-1E5, CHO-S, CHO/DG44, CHO-3F или CHO-2.6.
Мутаген МТХ вызывает мутацию в гене или полипептиде, вовлеченном в путь синтеза фукозы.
Как указывалось, способ одного из аспектов настоящего изобретения осуществляют путем контактирования мутировавшей популяции клеток CHO с веществом, связывающим фукозу, таким образом, чтобы дать ему возможность связаться с клеточными мембранами мутантных клеток.
В контексте настоящего изобретения выражение "вещество, связывающее фукозу" относится к любому веществу (например, лектину), которое обладает способностью связываться с фукозными группами на клеточной поверхности с Kd по меньшей мере 1х10-5. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения вещество, связывающее фукозу, связывается с остатками ccFuc1-6GlcNA с Kd по меньшей мере 1х10-3 (Matsumura, Higashida et al., 2009), например Kd по меньшей мере 1х10-4, Kd по меньшей мере 1 х10-5, Kd по меньшей мере 1 х10-6 или Kd по меньшей мере 1 х10-7.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения вещество, связывающее фукозу, представляет собой полипептид, например лектин.
Лектины, приводимые в качестве примера, рассматриваемые настоящим изобретением, включают, но не только, лектин алеврии оранжевой aleuria aurantia (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспер-гилл риса Aspergillus oryzae (AOL) и агглютинин улекса европейского (Ulex europaeus) (UEA) и те, которые описаны в документе (Oda, Senaha et al., 2003, Tateno, Nakamura-Tsuruta et al., 2009), содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Как указано, контактирование осуществляют в условиях, которые позволяют осуществлять связывание веществ, связывающих фукозу, с фукозой на клеточных мембранах. В соответствии с одним из вариантов осуществления, связывание происходит в таких условиях, которые не дают возможности лек-тину вызывать гибель клеток (т. е. истощение клеток) с которыми он связывается.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывание происходит в условиях, которые не дают возможности лектину вызывать гибель более 50% клеток, с которыми он связывается.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывание происходит в условиях, которые не дают возможности лектину вызывать гибель более 40% клеток, с которыми он связывается.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывание происходит в условиях, которые не дают возможности лектину вызывать гибель более 30% клеток, с которыми он связывается.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывание происходит в условиях, которые не дают возможности лектину вызывать гибель более 20% клеток, с которыми он связывается.
В соответствии с одним из вариантов осуществления связывание осуществляется в течение не более 3 ч, предпочтительно не более 2 ч и еще более предпочтительно не более 1 ч.
В соответствии с одним из вариантов осуществления вещество, связывающее фукозу, в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения присоединяют к функциональной группе, которое позволяет осуществлять истощение (либо непосредственно, либо опосредованно) клеточной популяции, которая связывается с этим веществом.
Таким образом, вещество, которое связывает фукозу, может быть присоединено к детектируемой группе, в том числе, но не только, к флуоресцентной группе или магнитной частице.
Приводимые в качестве примера флуоресцентные группы могут включать флуоресцеин или его производные, такие как флуоресцеинизотиоцианат (FITC), орегоновый зеленый (Oregon Green), токийский зеленый (Tokyo Green), SNAFL, карбоксинафтофлуоресцеин (CFSE), диацетат сложного сукцини-мидильного эфира карбоксифлуоресцеина (CFDA-SE), DyLight 488, AlexaFluor 488, зеленый флуоресцентный белок (GFP), фитоэритрин (РЕ), перидинин-хлорофил протеин (PerCP), РЕ-Alexa Fluor 700, РЕ-Су5 (TRI-COLOR), PE-Cy5.5, PE-Alexa Fluor 750, РЕ-Су7, аллофикоцианин (АРС), АРС-Су7 и их производные.
Альтернативно, вещество, которое связывает фукозу, может быть присоединено к аффинной группе.
Используемый в контексте настоящего изобретения термин "аффинная группа" относится к молекуле, способной к селективному взаимодействию с родственной связывающей группой, например, такой как биотин/авидин, лиганд/рецептор и подобные.
Подробные протоколы присоединения веществ, связывающих фукозу, к аффинным или детектируемым группам можно найти в разделе "Примеры", приведенном ниже в этом описании.
Будет понятно, что в том случае, если вещество, связывающее фукозу, присоединено к флуоресцентной группе (либо напрямую, либо опосредовано через родственную связывающую молекулу), из мутировавшей клеточной популяции могут быть элиминированы нежелательные клетки с использованием известных способов клеточного сортинга, например, используя клеточный сортер с активацией флуоресценции (FACS).
Большое разнообразие проточных цитометров является коммерчески доступным, в том числе, например, Becton Dickinson FACScan и FACScaliber (BD Biosciences, Mountain View, CA). Сведения об антителах, которые могут быть использованы для FACS анализа, представлены у Schlossman S., Boumell L., et al. [Leucocyte Typing V. New York: Oxford University Press; 1995] и являются коммерчески доступными повсеместно.
В тех случаях, когда вещество, связывающее фукозу, присоединено к магнитной частице (либо напрямую, либо опосредовано через родственную связывающую молекулу), из мутировавшей клеточной популяции могут быть элиминированы нежелательные клетки путем фракционирования клеток в магнитном поле.
В тех случаях, когда вещество, связывающее фукозу, присоединено к аффинной группе, из мутировавшей клеточной популяции могут быть элиминированы нежелательные клетки путем аффинной очистки с родственной связывающей молекулой. Таким образом, например, если вещество, связывающее фукозу, присоединено к биотину, из мутировавшей клеточной популяции могут быть элиминированы нежелательные клетки путем очистки стрептавидиновыми бусами или колонкой. Если, например, вещество, связывающее фукозу, присоединено к антителу или Fc-домену антитела, из мутировавшей клеточной популяции могут быть элиминированы нежелательные клетки путем очистки бусами с белком А или колонкой.
Как указывалось выше в настоящем описании, родственная связывающая молекула сама может быть присоединена к детектируемой группе, и элиминацию можно осуществлять после добавления родственной связывающей молекулы посредством FACS или MACS.
Будет понятно, что истощение нежелательных клеточных популяций можно осуществить за несколько циклов (например, за два, три или более циклов) последовательной элиминации. Далее, стадии истощения могут включать несколько циклов последовательной элиминации с использованием одного и того же способа (например, только фракционирования на основе FACS), или могут объединять несколько различных способов (например, фракционирование в магнитном поле с последующим флуоресцентным фракционированием).
В соответствии с одним из вариантов осуществления число циклов элиминации и конкретный способ выбирают таким образом, чтобы клетки, которые связываются с веществом, связывающим фукозу, были удалены в значительной степени.
Термин "удалены в значительной степени" означает удаление по меньшей мере 50% или более конкретного типа клеток, например по меньшей мере примерно 75, примерно 80, примерно 90, примерно 95 или примерно 97%, в том числе по меньшей мере 99, 99,5, 99,9% или более конкретного типа клеток.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения клетки, которые связываются с веществом, связывающим фукозу, удаются в значительной степени и остаются только клетки, которые имеют нулевое содержание фукозы на клеточной мембране.
При добавлении фукозы извне к клеткам после указанного выше удаления могут быть получены различные клетки, которые имеют определенное количество содержания фукозы, в зависимости от добавленного количества.
Таким образом, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, получают клетки CHO, которые имеют менее 50% фукозы на их клеточной мембране по сравнению с клетками дикого типа (то есть до обработки метотрексатом).
В соответствии с другим вариантом осуществления получают клетки CHO, которые имеют менее 40% фукозы на их клеточной мембране, по сравнению с клетками дикого типа (то есть до обработки ме-тотрексатом).
В соответствии с другим вариантом осуществления, получают клетки CHO, которые имеют менее 30% фукозы на их клеточной мембране по сравнению с клетками дикого типа (то есть до обработки ме-тотрексатом).
В соответствии с другим вариантом осуществления, получают клетки CHO, которые имеют менее 20% фукозы на их клеточной мембране по сравнению с клетками дикого типа (то есть до обработки ме-тотрексатом).
В соответствии с другим вариантом осуществления, получают клетки CHO, которые имеют менее 10% фукозы на их клеточной мембране по сравнению с клетками дикого типа (то есть до обработки ме-тотрексатом).
После выделения клеточных популяций по настоящему изобретению, их можно выращивать в культурах, и в любом устройстве, которое может быть использовано для выращивания культур, в том числе в ферментаторах или биореакторах. Культуры можно выращивать в виде монослоев или прикрепленными к поверхности. Альтернативно, выделенные клеточные популяции можно выращивать в суспензии.
Клетки можно выращивать в культуральной среде, которая представляет собой бессывороточную среду. Среда может быть коммерчески доступной, например, но не только, ProCHO5 (Lonza, Catalogue #BE12-766Q), CHO DHFR" Medium powder (SAFC Bioscinces, Catalogue #C6614) или Opti-CHO (Invitro-gen, Catalogue #12681), дополненная глутамином, например 8 мМ L-глутамина.
В соответствии с одним из вариантов осуществления среда лишена чужеродных загрязняющих примесей, то есть свободна от компонентов животного происхождения.
В соответствии с другим вариантом осуществления, клетки выращивают в клеточной культуре в условиях (например, среде и месте), которые дают возможность для бесконечной пролиферации, то есть клеточной линии.
Выделенные клетки CHO могут поддерживать свой вариант профиля гликозилирования (то есть экспрессии фукозы) в течение большого числа пассажей в культуре, то есть обладают высокой стабильностью. В соответствии с одним из вариантов осуществления было обнаружено, что модифицированная клетка-хозяин CHO может поддерживать свой вариант профиля гликозилирования даже после 370 пассажей.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что клетки CHO, отобранные в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, имеют конкретный фенотип, например экспрессию мутантной GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD), которая ответственна за низкое фукозилирование их клеточных мембран.
Клетки после мутагенеза могут содержать по меньшей мере одну аллель GMD с мутацией потери функции.
Термин " аллель", используемый в контексте настоящего изобретения, относится к любой одной или нескольким альтернативным формам локуса гена, все аллели которого относятся к свойству или характеристике. В диплоидной клетке или организме две аллели заданного гена занимают соответствующие ло-кусы на паре гомологичных хромосом.
" Мутация с потерей функции" представляет собой мутацию в последовательности гена, которая вызывает либо снижение, либо полное отсутствие функции продукта гена, обычно белка. Мутация с потерей функции, например, может быть вызвана путем усечения продукта гена вследствие сдвига рамки считывания или нонсенс мутации. Фенотип, связанный с аллелью с мутацией потери функции, обычно является рецессивным, но также может быть доминантным.
Будет понятно, что в настоящем изобретении также рассматриваются клетки, в которых обе аллели GMD несут мутацию с потерей функции. В некоторых случаях GMD может быть в гомозиготной форме или в гетерозиготной форме. В соответствии с этим вариантом осуществления гомозиготность представляет собой состояние, при котором обе аллели в локусе GMD характеризуются одной и той же нуклео-тидной последовательностью.
Гетерозиготность относится к различным состояниям гена в локусе GMD.
В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что клетки CHO после мутагенеза и процедуры селекции в соответствии с настоящим изобретением могут экспрессировать два варианта форм GMD, как представлено в последовательностях SEQ ID NO: 23 и 24, которые соответствуют деле-циям экзонов 3 и 4 и 8 и 9 гена GMD соответственно.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена выделенная клетка CHO, которая является генетически модифицированной для экспрессии мутантной GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD), имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 и/или 24.
Было обнаружено, что клетки в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения экспресси-руют функционирующую фукозилтрансферазу-8 (Fut8). Функционирующая Fut8 может представлять собой Fut8 дикого типа, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 29.
Кроме того, клетки по настоящему изобретению экспрессируют функционирующую GDP-кето-6-дезоксиманнозу 3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (FX). Функционирующая FX может представлять собой FX дикого типа, имеющую полипептидную последовательность, представленную в последовательности SEQ
ID NO: 30.
Авторы настоящего изобретения показали, что клетки CHO, которые были получены в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, могут быть использованы для получения гликопро-теинов, например антител или Fc слитых белков, которые могут быть взяты на исследование или собраны. Гликопротеины могут быть секретированными, демонстрировать вариант профиля гликозилирова-ния и/или иметь терапевтическое применение, как описано в настоящей заявке далее. Такие гликопро-теины, например, могут представлять собой антитело с повышенной ADCC активностью по сравнению с соответствующим антителом, продуцируемым в немодифицированной родительской клетке-хозяине, как описано далее в настоящей заявке.
" Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" (ADCC) в контексте настоящего изобретения относится к клеточно-опосредованной реакции, при которой эффекторные клетки, которые экспрессируют FcR (например, клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связавшееся антитело на клетке-мишени и в последствии вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC включают NK-клетки, моноциты и макрофаги. NK-клетки обычно экспрессируют преимущественно Fc.гамма.RШ, тогда как моноциты экспрессируют Fc.гамма.RI, Fc.гамма.RII и Fc.гамма.RШ. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена у Ravetch и Kinet, Annu. Rev.
Immunol, 9:457-92 (1991).
" Эффекторными клетками" являются лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и вы
полняют эффекторную функцию (функции). Предпочтительно эти клетки экспрессируют, по меньшей мере, Fc.гамма.RШ и выполняют ADCC эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), клетки естественные киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительными являются РВМС и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например из крови или РВМС, как описано в настоящей заявке, или могут быть репродуцированы in vitro с использованием способов, известных из уровня техники.
В одном из вариантов осуществления антитело, полученное из клеточной линии CHO по настоящему изобретению, опосредует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно, чем соответствующее антитело, продуцированное родительскими клетками-хозяевами, когда рассматриваемые антитела примеряют в сравнимых количествах. В основном ADCC активность можно оценить с помощью исследований, описанных в настоящей заявке, но рассматриваются другие исследования и способы определения ADCC активности, например, в модели на животных и так далее. Антитело, полученное из клеточной линии CHO по настоящему изобретению, является более эффективным при опосредовании ADCC, чем родительское антитело, например, в аналитических системах in vivo или in vitro, как дополнительно описано в патентной публикации США № 2010/0081150, включенной в настоящую заявку в качестве ссылки.
Соответственно выделенные популяции клеток или клеточные линии по настоящему изобретению, предварительно модифицированные с получением в результате варианта профилей фукозилирования, могут быть дополнительно модифицированы таким образом, чтобы содержать гетерологичную полинук-леотидную последовательность. Такие последовательности могут содержать кодирующую или некоди-рующую область гена или фрагмента гена, матричной РНК (мРНК), транспортной РНК, рибосомальной РНК, рибозимов и так далее. Гетерологичные последовательности могут кодировать белковоподобную группу, которая относится к белкам, полипептидам, пептидам, аминокислотным последовательностям, которая охватывает полимеры аминокислот любой длины.
Гетерологичные полинуклеотидные последовательности обычно функционально связаны с промоторами (то есть в векторы экспрессии) для обеспечения экспрессии рекомбинантного полипептида.
В соответствии с одним из вариантов осуществления, трансфекцию клеток CHO по настоящему изобретению осуществляют в присутствии экзогенной фукозы. Рассматриваемые концентрации фукозы включают 1-20 мкг/мл, например 10 мкг/мл.
Как показано на фиг. 45 и 48 величина фукозилирования рекомбинантного полипептида может контролироваться путем инкубирования трансфицированных клеток в фукозе.
Рассматриваемые концентрации фукозы включают 1-10 мкг/мл, например 2,5-5 мкг/мл, например 3,5 мкг/мл.
Таким образом, предлагается популяция клеток CHO, клеточная мембрана которых является нефу-козилированной и которые способны экспрессировать белки различной степени фукозилирования, величина фукозилирования зависит от количества фукозы в культуральной среде во время трансфекции и после трансфекции. Величина фукозилирования рекомбинантного полипептида может находиться в интервале от 0 до 100%.
Помимо содержания необходимых элементов для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности, используемая экспрессионная конструкция также может включать последовательности, сконструированные для повышения стабильности, увеличения продукции, улучшения очистки, повышения выхода или токсичности экспрессированного пептида. Например, можно осуществлять экспрессию слитого белка или расщепляемого слитого белка, содержащего белок в соответствии с некоторыми вариантами настоящего изобретения, и гетерологичного белка. Такой слитый белок может быть сконструирован таким образом, чтобы этот слитый белок легко мог быть выделен с помощью аффинной хроматографии; например, путем иммобилизации на колонке, специфичной в отношении гетеро-логичного белка. В тех случаях, когда сайт расщепления сконструирован между белком и расщепляемым слитым белком, расщепляемый слитый белок может быть отделен от хроматографической колонки путем обработки соответствующим ферментом или средством, которое разрушает сайт расщепления [например, см. Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70 и Gardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:1585415859].
В соответствии с одним из вариантов осуществления очистку проводят в отсутствии экзогенной фукозы.
Получение нуклеиновых кислот можно проводить с помощью целого ряда различных рутинных ре-комбинантных технологий и способов синтеза. Стандартные методики рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования хорошо известны из уровня техники и описаны Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Mani-atis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) и ТЛ. Silhavy, M.L. Bennan и L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) и Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, опубликовано Greene Publishing Assoc. и Wiley-Interscience (1987). Вкратце, рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут представлять собой полученные фрагменты геномной ДНК, кДНК и РНК, каж
дая из которых может быть экстрагирована непосредственно из клетки или рекомбинантно получена с помощью различных способов амплификации, в том числе, ПЦР и ОТ-ПЦР, но не только.
Как указывалось, клетки CHO по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве клеток-хозяев для получения антител. Антитела могут быть моноклональными или поликлональными.
В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой ингибирующее антитело. Ин-гибирующее антитело может ингибировать одну или несколько биологических функций антигена, с которым связывается это антитело. Например, ингибирующее антитело может отрицательно регулировать сигнальную трансдукцию соответствующего антигена путем ингибирования активности антигена или путем ингибирования экспрессии этого антигена. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой нейтрализующее антитело. Нейтрализующее антитело снижает или аннулирует некоторую биологическую активность растворимого антигена или живого микроорганизма, например инфекционного агента. Нейтрализующие антитела могут конкурировать с природным лигандом или рецептором за антиген. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой стимулирующее или активирующее антитело. Стимулирующее или активирующее антитело может представлять собой агони-стическое антитело, которое активирует сигнальную трансдукцию соответствующего антигена при связывании с этим антигеном, тем самым, активируя или положительно регулируя активность антигена, или положительно регулируя экспрессию антигена, с которым связывается указанное антитело.
Термин " антитело" в контексте настоящего изобретения включает интактные молекулы, а также их функциональные фрагменты, такие как Fc слитые белки, определенные следующим образом: генетически сконструированные молекулы, содержащие константную область тяжелой цепи, которая непосредственно связана, или связана через подходящий полипептидный линкер, с другим полипептидом или белком.
Гуманизированные формы антител, не являющихся антителами человека (например, мышиных) представляют собой химерные молекулы иммуноглобулинов, цепи или фрагменты иммуноглобулинов, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR) реципиента заменены остатками из CDR видов, не являющихся человеком (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих желаемую специфичность, аффинность и функциональную активность. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не находятся ни в реципиентном антителе, ни в привнесенных CDR или каркасных последовательностях. В основном гуманизированное антитело будет содержать по существу все, по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена, в которых все или по существу все области CDR соответствуют таковым иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, и все или по существу все FR области представляют собой области консенсус-ной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
В одном из вариантов осуществления легкая и тяжелая цепи могут быть трансформированы в отдельные модифицированные культуры клеток-хозяев, либо одного и того же, либо различных видов. В альтернативном варианте осуществления отдельные плазмиды для легкой и тяжелой цепи могут быть использованы для совместной трансформации одной модифицированной культуры клеток-хозяев. В другом варианте осуществления одна экспрессионная плазмида, содержащая оба гена и способная экспрес-сировать гены как для легкой, так и для тяжелой цепи, может быть трансформирована в одну модифицированную культуру клеток-хозяев.
В тех случаях, когда тяжелая и легкая цепи экспрессируются совместно в одном и том же хозяине, способ выделения разрабатывают таким образом, чтобы выделить реконструированное антитело. Это можно осуществить с помощью обычных способов очистки антител, например, таких как белок А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Рекомбинантные антитела, которые могут быть получены в клетках по настоящему изобретению, имеют вариант профиля фукозилирования так, чтобы повысить эффекторную функцию антитела. Предпочтительно рекомбинантные антитела по настоящему изобретению имеют низкие уровни фукозы на Fc-мономере, который представляет собой ADCC релевантный остаток фукозы, тем самым повышая активность антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) антитела.
В соответствии с одним из вариантов осуществления продуцируемые антитела представляют собой IgG1 или IgG3 тип антител.
Антитело с различными профилями фукозилирования и/или продуцированное модифицированными клетками-хозяевами CHO по настоящему изобретению могут связываться с антигеном, таким как опухолевый антиген. Опухолевый антиген может быть выбран из группы, состоящей из HER2, Fc-рецептора II иммуноглобулина эпсилон, Alk-1, CD20, EGF-рецептора, VEGF-рецептора, FGF-рецептора,
NGF-рецептора, PDGF-рецептора, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA-4, муцина 1, муцина 16, эндоглина, рецептора мезотелина, рецептора Nogo, фолатного рецептора, CXCR4, рецептора инсулиноподобного фактора роста, ганглиозида GD3, и альфа и бета интегринов.
Приводимые в качестве примера антитела, продуцируемые в клетках по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются, адалимумаб (HumiraRTM), алемтузумаб (CampathRTM), базиликсимаб (SimulectRTM), бевацизумаб (AvastinRTM), цетуксимаб (ErbituxRTM), даклизумаб (ZenapaxRTM), дацетузумаб, эфализумаб (RaptivaRTM), эпратузумаб, ибритумомаб (ZevalinRTM), тиуксетан, инфликсимаб (RemicadeRTM), муромонаб-CD3 (ОКТ3), омализумаб (XolairRTM), паливизумаб (SynagisRTM), ореговомаб (OvaRexRTM), ритуксимаб (RituxanRTM), трастузумаб (HerceptinRTM), окрелизумаб, пертузумаб, huM195Mab, анти-Абета, анти-CD4, анти-oxLDL, трастузумаб-DM1, апомаб, rhuMAb GA101, анти-OX40L, ипилимумаб, устекинумаб, голимумаб, офатумумаб, залутумумаб, мотавизумаб, экромексимаб, MDX010, 4В5, TNX-901, IDEC-114 и любые Fc-фрагменты антител, специфичных в отношении антигенов и способных индуцировать ADCC.
В контексте настоящего изобретения термин "примерно" относится к ±10%. Термины "содержит", "содержащий", "включает", "включающий", "имеющий" и родственные им слова по корню и значению означают "включая, но не ограничиваясь".
По всему тексту заявки различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате интервалов величин. Должно быть понятно, что описание в формате интервалов величин осуществляется только для удобства и краткости и не должно рассматриваться как строгое ограничение объема изобретения. Соответственно описание интервала не должно рассматриваться имеющим конкретно описанные все возможные поддиапазоны, а также как отдельные числовые величины в пределах этого интервала. Например, описание такого интервала как 1-6 должно рассматриваться имеющим конкретно описанные поддиапазоны, например 1-3, 1-4, 1-5, 2-4, 2-6, 3-6 и так далее, а также отдельные числа в пределах этого интервала.
Во всех случаях, когда числовой интервал указан в настоящей заявке, это означает включение любого указанного числа (дробного или целого) в указанный интервал. Выражения "находится в интервале/в интервале между" первое указывает число, а второе указывает число и "находится в интервале/в интервале от" первое означает число "до" второго указанного числа, в контексте настоящего изобретения используются взаимозаменяемо и означают включение первого и второго указанных чисел и все дробные и целые числа между ними.
Используемый в контексте настоящего изобретения термин "способ" относится к методам, средствам, методикам и процедурам для осуществления поставленной задачи, включающим, но не ограничивающимся, те методы, средства, методики и процедуры либо известные, либо легко получаемые из известных методов, средств, методик и процедур практикующими специалистами в области химии, фармакологии, биологии, биохимии и медицины.
Должно быть понятно, что некоторые особенности настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предоставлены в сочетании в одном варианте осуществления. В свою очередь, различные особенности настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены отдельно или в любом подходящем сочетании, представляющим собой часть другого, более широкого сочетания, или как подходящие в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Некоторые особенности, описанные в контексте различных вариантов осуществления не должны рассматриваться как существенные признаки этих вариантов осуществления, если этот вариант осуществления не является неработоспособным без этих элементов.
Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения как описано выше и как заявлено в формуле изобретения, приведенной ниже, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.
Примеры
Ссылка теперь сделана на следующие примеры, которые вместе с приведенными выше описаниями иллюстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения неограничивающим образом.
В основном номенклатура, используемая в контексте настоящего изобретения, и лабораторные методы, используемые в настоящем изобретении, включают молекулярные, биохимические, микробиологические методики и технологии рекомбинатных ДНК. Такие методики подробно описаны в литературе; см., например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al. (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Том I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методологии, изложенные в патентах США №№ 4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Culture of
Animal Cells - A Manual of Basic Technique" авторы Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), 3-е изд.; "Current Protocols in Immunology", том I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммуноанализы подробно описаны в патентной и научной литературе, см., например, патенты США №№ 3791932; 3839153; 3850752;
3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219;
5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D. и Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D. и Higgins S.J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) и "Methods in Enzymology", Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из них включены в качестве ссылки как полностью изложенные в настоящем описании. Другие общие ссылки представлены по всему тексту этого документа. Считается, что описанные в них способы хорошо известны в данной области и представлены для удобства прочтения. Вся информация, содержащаяся в них, включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Общие данные.
Клетки.
Стабилизированные CHO-S (GibcoBRL, Cat. # 11619) клетки, адаптированные к культуральной среде Sigma C6614.
CHO-S в С6614, культивированные в 200 нМ МТХ. CHO-Dukx в С6614. CHO-S1 в ProCHO-5.
Плазмиды: PGL3 anti EGFR mAb EMCV-PAC1 -DHFR Tandem -872; pTT5 вектор; pCMV-P. Реактивы.
AccuPrime Pfx Invitrogen ДНК полимераза Cat No. 12344-024;
агароза, сертифицированная для молекулярной биологии, IBI Agarose, Cat # IB70042; раствор фракции бычьего альбумина (BSA), 7,5%, Sigma, Cat. # А8412; лектин алеврии оранжевой (Aleuria Aurantia) AAL: 1 мг/мл, cat: L-1390, Vector; лектин аспергиллы риса (Aspergillus Oryzae) AOL, 5 мг/мл Cat. L0169, EY; ампициллин- Sigma Cat. # A9518;
Антитела для ELISA: захват: козьи антитела против IgG человека (H+L), Jackson Immuno Research Cat. #109-005-088 (USA). Обнаружение: козьи антитела против Fc IgG человека (Fab2), Jackson Immuno Research Cat. #109-036-098 (USA);
анализ бета-актина по требованию (зонд и праймеры для Q-ПЦР) - ABI Cat. #RN00667869_m1;
биотин (EZ-Link(r) NHS-PEG4-Biotin, No-Weigh(tm) Format, cat: 21329, Thermo Cat. # 21329;
биотинилированный AAL 1 мг активный конъюгат, Vector, Cat. # В-1395;
биотинилированный MAL 1 мг, EY, Cat. # BA-7801-2;
бычий сывороточный альбумин (BSA), Bovostar. Bovogen Cat. # BSAS.01;
Cell Boost, HyClone, Cat. # SH30866.01;
CHO CD Efficient Feed(tm) A, Invitrogen, Cat. # A10234-01;
CHO CD Efficient Feed(tm) B, Invitrogen, Cat. # A10240-01;
лимонная кислота, Sigma Cat. # C-1909;
декстран-сульфат натриевая соль, Sigma, Cat. # D4911;
DH5a компетентные бактерии - Life-Technologies Cat. # 18263-012;
DMSO, Merck, Cat. # 1.02931.1000;
ДНК-лестница: 1 тыс. пар лестница для ДНК - Biolabs Cat No. #3232L; ДНК-лестница: 100 тыс. пар лестница для ДНК - Biolabs Cat No. #3231L;
DTT, Cat: D9779, Sigma; EDTA, Sigma, Cat. # E7889; этанол Merck Cat. # 00983.1000;
EZ-Link(r) NHS-PEG4-Biotin, No-Weigh(tm) Format, cat: 21329, Thermo Fisher Scientific Inc USA; FACS бусы Accudrop, Becton Dickinson, Cat. # MAB345249;
фукоза, Sigma, Cat. # F2252;
глюкоза, Sigma, Cat. # G7021;
глютамин, Biological Industries, Cat. # 03-020-1A;
глутамин, Sigma, Cat. # G5972;
глицин, Merck, Cat. # 4201;
гуанидин-HCl, cat: G3272, Sigma;
Hepes 1M, Invitrogen, Cat. # 15630-056;
набор "High Capacity cDNA Reverse Transcription", Applied Biosystems Cat. #4368814;
HTX50, Biological Industries, Cat. # 03-085-1C; соляная кислота, Merck, Cat. # UN-1789 1.00317.2500;
iCE 280 метилцеллюлоза 1%, Cat.#102220 и 101876, Convergent Biosciences, (Canada); iCE 280 фармалит 3-10, Cat.#10-0456-01, GE Healthcare (Germany);
iCE 280 pI маркеры 6.14 и 9.5, Cat.#102220 и 101996 соответственно, Convergent Biosciences, (Canada);
iCE 280 набор для проверки пригодности системы, Cat.#102093-j, Convergent Biosciences, (Canada);
набор iCE280 IEF Convergent Biosciences;
IMag буфер, Becton Dickinson, Cat. # 552362;
IMag SA Particles Plus - DM, Becton Dickinson, Cat. # 557812;
йодацетамид, cat: 11149, Sigma;
ITSX100, Invitrogen, Cat. #51500-056;
LB+ампициллиновые чашки- Hy-Labs Cat. #PD178;
L-Цистеин, Cat: C7352, Sigma;
LipofectAmine, Invitrogen, Cat # 50470;
аглютинин маакии амурской Maackia amurensis 1 мг/мл, cat: L8025, Lot: 036k4075 Sigma;
MAA-FITC, 2 мг в 2 мл буфера, EY, Cat. # F-7801-2; малеимид, cat: 129585, Lot: S56783-278 Sigma; Na2PO4. 2H2O, Merck, Cat. # 6580;
NaH2PO4.H2O, Merck, Cat. # 6346;
система Octet QK, кинетический буфер x10 cat # 18-5032 Fortebio.Fortebio Inc, USA; папаин, Cat: P3125, Sigma, поставляемый в 0,05 M ацетате натрия, pH 4,5, содержащий 0,05% тимола;
феноловый красный, Sigma, Cat. # P0290; плуроник F-68, Sigma Cat. # Р5556;
полиэтиленимин порошкообразный, линейный ММ 25000, Polysciences, Cat. # 23966; смесь ингибиторов протеаз, SigmaCat. # P8340; ингибитор протеазы, Sigma, Cat. # P8340;
белок А Сефароза - Mab Select Xtra, Cat.#17-5269-07, Lot# 10011545; магнитные бусы белок G, Biolabs, Cat. # S1430; пуромицин, Invivogen, Cat. # Ant-pr 5; пуромицин, Sigma Cat. # P8 8 33;
контрольный образец: ERBITUX(r) 5 мг/мл раствор для инфузии от MERCK SERONO lot #7820907; ферменты рестрикции приобретали у New England Biolabs;
стрептавидин, конъюгированный с R-фикоэритрином (SA-PE) 0,2 мг/мл, Biolegend, Cat. # 405203;
стрептавидин, конъюгированный с R-фикоэритрином (SA-PE), Jackson, Cat.# 016-110-084;
порошкообразное обезжиренное молоко, Fluka. Cat. # 70166;
бикарбонат натрия, Merck, Cat. # 6329;
карбонат натрия, Merck, Cat. # 6392;
хлорид натрия, Merck, Cat. # 6404;
гранулы гидроксида натрия, Merck Cat. #1.06498.5000;
набор для синтеза кДНК Superscript(r) III CellsDirect, Invitrogen Cat. #18080-051; краситель для геля SYBR Safe DNA, 10000x в DMSO, Invitrogen, Cat # S33102; раствор ТМВ, Cat: 1928, Savyon Diagnostics; набор реагентов Trans IT-PRO Reagent kit, Mirus, Cat. # Mir5700;
Tris-HCl, cat: T3038, Lot: 037K8402, Sigma;
Tween 20, cat: 8.17072, Merck;
натриевая соль вальпроевой кислоты, Sigma, Cat. # P4543. Растворы.
Биотинилированная смесь AAL-SA-PE: биотинилированный AAL 20 мкг/мл и SA-PE 2 мкг/мл в PBS+0,1 плюрониловая кислота;
осветлитель 1% - FACS Clean, Becton Dickinson, Cat. # 340345;
ELISA аналитический буфер - 1% порошкообразное обезжиренное молоко в PBS;
ELISA блокирующий раствор- 1% BSA/0,05% Tween-20 в PBS;
ELISA захватывающий раствор (покрытие) - козьи антитела против IgG человека (H+L), разбавленный 1:900 до конечной концентрации 2 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере pH 9,6;
образцы для калибровочной кривой ELISA: контрольный образец Erbitux (EMDLot-7820907, 5,0 мг/мл) разбавляли аналитическим буфером до 100 нг/мл, с последующим двухкратным серийным разведением до 1,56 нг/мл. Каждую стандартную точечную концентрацию получали в конечном объеме по меньшей мере 1 мл;
ELISA промывочный буфер- 0,05% Tween-20 в PBS;
буферная смесь: хлорид натрия 11,7 г (100 мМ); лимонная кислота 4,2 г (10 мМ); глицин 15 г (100 мМ); гидроксид натрия до pH 5,8 и дополняли объем до 2 л с использованием воды для инъекций;
iCE 280 подвижный маточный раствор: 70 мкл 1% метилцеллюлоза, 1 мкл 6.14 и 9.5 pI маркер, 8 мкл фармалитов (pH 3-10) добавить 100 мл воды для инъекций;
папаиновый расщепляющий буфер: 0,1М Tris-HCl, 4 мМ EDTA, 5 мМ цистеин pH 7,6. Цистеин должен быть приготовлен свежим каждый раз. Разведение папаина до 1 мг/мл с буфером в соответствии с инструкциями производителя;
PBS (забуференный фосфатно-солевой раствор) - 10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,2, полученный путем 1:10 разведением 10Х PBS;
PBS с 0,1% плюроником;
PBS, (ITL preparation, BR R0450V01);
PBS-0,05% Tween 20: 0,5 мл Tween 20 перемешивали с 1 л PBSx1; фосфатный буфер 20 мМ: pH 7,5: 1,8 г Na2PO4-2H2O и 1,38 г NaH2PO4-H2O в 1 л воды; белок А - элюирующий буфер: 20 мМ уксусная кислота pH 3,2; белок А - уравновешивание/промывание 2 буфер: 50 мМ ацетат натрия, pH 6,8; белок А - промывание 1 буфер: 50 мМ ацетат натрия+1,5 М хлорид натрия, pH 6,8; Восстанавливающий буфер x2: 8 М гуанидин-HCl, 100 мМ Tris-HCl, 10 мМ DTT, pH 8,8 (готовят свежим каждый раз).
Культуральные среды.
3,5% Cell boost 6 маточный раствор;
среда для клонирования CHO, Cat. # C6366, Sigma;
СНО DHFFT Medium powder, SAFC Bioscinces, Cat. # C6614 (ITL preparation R0461V01); DMEM-F/12 1:1 X1, Invitrogen, Cat. # 21331-020;
среда FEME ((DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen Cat. #32 500 043), дополненная 8 мл/л ITS-X (Invitrogen,
Cat. # 51500-056);
минимальная эссенциальная среда Игла, Sigma, Cat. # M2279;
ProCHO5, Lonza, Cat. # BE12-766Q;
Select CD1000, Becton Dickinson, Cat. # 215204; маточный раствор натриевой соли VPA, 100 мМ. Изделия одноразового использования.
14- мл центрифужные пробирки, Greiner, Cat. # 187261;
15- мл центрифужные пробирки, Corning, Cat. # 430052; 24-луночные планшеты, Nunc, Cat. #
142475;
5-мл полистирольная круглодонная пробирка, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352054; 5-мл круглодонная пробирка, полистирол, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352054; 96-луночные планшеты, Costar, Cat. # 3595; 96-луночные планшеты, Falcon, Cat. # 353072;
ABI PRISM TM оптические адгезивные крышки 100/упаковка, Applied Biosystems, Cat# 4311971; пробирки Cryo tube 2 мл, Grenier, cat.# 126-263; фильтр акродиск 0,2 мкм, Gelman, Cat. # 4192; амикон ультра 15 мл 10 кДа, Cat: UFC901024, Millipore; амикон ультра 3 кДа, Cat: UFC900324, Millipore;
амикон ультра, центрифужный фильтровальный блок, Millipore, Cat. # UFC801024; контейнер Cryo Freezing 1°C, Nalgene, Cat. # 5100-0001;
одноразовый фильтр 0,22 мк для PBS или водной стерилизации, Nalgene, Cat. 1270020;
Одноразовый фильтр 0,2 мк для ACFM стерилизации (GP express plus membrane), Millipore, Cat. # SCGPU05RE или SCGPU11RE;
одноразовый фильтр 0,45 мк для FACS осветляющей стерилизации, Nalgene, Cat. # 4500045;
одноразовый 40 мк стерильный клеточный фильтр, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352340;
одноразовая 5 мл полистирольная пробирка с крышкой для клеточного фильтра 35 мк, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352235;
одноразовый стерильный фильтр 70 мк (или 35 мк) cup Filcon, Becton Dickinson, Falcon, Cat. #
340634;
одноразовый фильтр 10 мк Cup filcon, Becton Dickinson, Cat. # 340732; одноразовый фильтр 30 мк Cup filcon, Becton Dickinson, Cat. # 340625; DynaMag, Dynal, Invitrogen, Cat. #123.01D; DynaMag, Dynal, Invitrogen, Cat. #123.21D;
ELISA, микротитровальные планшеты MaxiSorp F96, cat:, NUNC;
Erlenmeyer 1000 мл, Triforest, Cat. # TF FPC1000S;
Erlenmeyer колбы: 125 мл, Corning, Cat. # WI-431143, 250 мл, Corning, Cat.# WI-431144, 500мл, Corning, Cat.# WI-431145, 2 л, Corning, Cat. # WI-431255;
FACS пробирки, Falcon Cat. # 352235 с синей крышкой фильтра;
FACS пробирки, BD Falcon, Cat. # 352235;
фильтр 10" 0,1 мкм, Durapore, Millipore, Cat. # MILLIPAK200;
фильтровальные пробирки 50, TPP, Cat# 87050;
iCE 280 капиллярный картридж, Cat: FC Coating (PN:101700), Convergent Biosciences; iCE 280 трансферный капилляр микроинъектора; Cat:PN:102019, Convergent Biosciences; IMagnet, Becton Dickinson, Cat. # 552311;
Kova Glasstic предметное стекло 10 с гридами, Hycor, Cat. 87144; микроцентрифужные пробирки (1,7 мл), Costar, Cat. # 3207;
Octet QK System, микропланшет, черный 96-луночный cat: 655209, Greiner bio-one, Германия; оптический 96-луночный планшет для ПЦР в быстром режиме с штрих-кодом 20/упаковка, Applied
Biosystems, Cat# 4346906;
наконечники для пипеток, Sorenson, Cat. # 14200 и 14220; наконечники для пипеток 0-200 мкл, Costar, Cat. # 4864;
кассета для диализа Slide -A Lyzer Dialysis cassette G2 2 кДа: cat: 87718, Thermo;
диализная трубка SnakeSkin 10 кДа, cat: 68100, Lot: JJ127549, Thermo HiTrap MabSelect Xtra 1 мл,
Cat: 28-4082-58, GE;
Stericup 1 л фильтрующий элемент 0,1 мкм, Millipore, Cat. # SCGPU05RE; Stericup 1 л фильтрующий элемент 0,2 мкм, Millipore, Cat. # SCGPU11RE; Steriflip фильтрующий элемент 50мл, 0,22 мкм, Millipore, Cat. # SCGP00525; стерильные 24-луночные планшеты, Nunc, Cat. # 143982; стерильные 6-луночные планшеты, Costar, Cat. # 3506;
стерильные центрифужные пробирки: 15 мл, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 2097 и Corning, Cat. # 430055, 50 мл Corning, Cat. # 430290, 250 мл Corning, Cat. # 430776, 500 мл Corning, Cat. # 431123; стерильные FACS пробирки, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352054;
стерильные пипетки: 10 мл Sterillin Cat. # 47110, 1 мл Sterillin, Cat. # 40105, 2 мл Sterilin, Cat. # 40102, 5 мл Corning, Cat. # 4011, 50 мл Corning, Cat. # 4501, 25 мл Falcon, Cat. # 35-7525; стерильные флаконы для тканевых культур: 25 см2, (Т-25), Nunc, Cat. # 163371; стрептавидин биосенсорные насадки cat: 18-5019, Fortebio Inc, USA; шприц 2,5 мл стерильный, Medi-Plus, Cat.; TCF 175 см2, Nunc, Cat#156502;
TCF 25 см2, Nunc, Cat#136196; TCF 80 см2, Nunc, Cat#153732.
Оборудование.
Анализатор АКТА explorer 100, cat: 18-1112-41, GE (Germany);
автоматическая платформа Cellavista - Innovatis, Roche;
центрифуга - Cat. # 5417R- Eppendorf;
центрифуга - Cat. # 5417R- Eppendorf;
центрифуга - Тип RC 3C Plus - Sorvall (США);
водяная баня с циркуляцией, Модель F3/K, Haake (Финляндия);
кондуктометр ORION, Модель 150, ORION Research Inc.;
счетчик Культера - Модель Z1, Coulter Electronics (Англия);
крио-контейнер Cryo Freezing 1°C, Nalgene, Cat. # No.5100-0 0 01;
ELISA планшетный ридер Sunrise basic, Cat. # 16039400, TECAN;
промыватель планшетов ELISA Plate Washer Columbus, Cat. # 6040834, TECAN;
ELISA Robot Genesis RSP 150/8, Cat. # 611408, TECAN;
ELISA, iEMS термостат, Cat. # 5112200, Thermo;
Eppendorf центрифуга, серии 5417R, Eppendorf (Германия);
FACSAria проточный цитометр, Beckton Dickinson;
дозатор Finnpipette, Cat. # 4540000 Labsystems (Finland);
GE Fanuc серии 90-70 программируемый контроллер - General Electric Ltd. (USA);
автоматический прибор GeneAmp(r) PCR System 9700, PE Applied Biosystems (USA);
система для электрофореза Horizen Gel electrophoresis System, GIBCO-BRL Horizon 58, Cat. # 41060;
анализатор для капиллярного электрофореза iCE 280 Imaged Capillary Electrophoresis Analyzer, Cat. # 1241, Convergent Biosciences;
микроинжектор iCE 280 PrinCE Microlnjector, Cat. #5418074067, Convergent Biosciences;
программное обеспечение iCE 280 Software iCE280 CFR software v.2.3.6 Convergent Biosciences;
программное обеспечение Image master VDS, Cat. # 80-6254-80 Pharmacia (Швеция);
встряхивающий аппарат Incubation Shaker Box, CERTOMAT(r) BS-T, B. Braun Biotech International (Германия);
термостат 37°С 5% CO2, температура и СО2 контролируются, Tuttnauer (Израиль); термостат - Shake "n" stack, Hybaid, Cat # HBMOVC5T220 (гибридизационная печь); вытяжной шкаф с ламинарным потоком воздуха (LFH) класс 100 - Israflow (Израиль); световой микроскоп - Модель TMSNo. 301070 - Nikon (Япония); термостат/шейкер для микропланшетов, iEMS, ThermoLabsystem (Финляндия); промыватель для микропланшетов, Cat. # WW015, Applied Quality Services LTD (UK); микроволновая печь- Crystal 17L;
программное обеспечение Octet QK System, Data Acquisition Software 6.3 version, Fortebio Inc, США; программное обеспечение Octet QK System, Data Analysis software 6.3 version, Fortebio Inc, США;
Octet QK System, Fortebio Inc, CA, США;
шейкер с орбитальным вращением платформы с амплитудой (орбитой) 25 мм New Brunswick Scientific (США);
перистальтические насосы - Watson Marlow 503S или 505U (Объединенное Королевство); pH-метр, серии РНМ210, Radiometer (Дания); устройство для отмывки планшетов (SLT 96PW) TECAN;
шейкер с качающейся платформой - Hoefer "Red-Rocker" PR50-250V (Pharmacia biotech.); блок питания, Cat. # PS500XT, Hoefer scientific instruments (США); центрифуга с охлаждением, Multifuge 3 S-R, Heraeus;
шейкер-инкубатор с охлаждением, Innova 4230, New Brunswick Scientific (США); автоматизированное устройство для обработки образцов, Модель RSP 150/8 Genesis, TECAN, (Швейцария);
шейкер, Rotamax, серия# 120 Heidolph (Германия);
программное обеспечение - WIZCON-PC Soft International Ltd. (Израиль);
система ПЦР в реальном времени StepOnePlus(tm), Applied Biosystems, Cat# 4376600;
сушильное УФ-устройство UV table, BTS 20.MS, Uvitec, Cat. # M023641;
водяная баня с терморегулятором, Polyscience, Модель 9106.
Общие способы.
Сокращения:
AAL - лектин алеврии оранжевой (Aleuria aurantia),
ACF - без компонентов животного происхождения,
ACFM - среда, не содержащая компонентов животного происхождения,
ADCC - антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность Анти EGFR mAb,
СНО - яичник китайского хомячка,
DHFR - дигидрофолатредуктаза,
DMEM - модифицированная по Дульбекко среда Игла,
DMSO - диметилсульфоксид,
DTT - дитиотреитол,
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота,
EGFR - рецептор эпидермального фактора роста,
ELISA - иммуноферментный анализ,
EMCV - вирус энцефаломиокардита,
Fab - CH1 и VH часть тяжелой цепи и легкой цепи IgG1,
FACS - клеточный сортер с активацией флуоресценции,
Fc - СН3 и СН2 части тяжелой цепи IgG1,
F-SA - флуоресцент стрептавидин,
Fut8 - фукозилтрансфераза 8,
FX - GDP кето-6-дезоксиманноза 3,5-эпимераза, 4-редуктаза,
GFT - переносчик GDP-фукозы GMD - GDP-манноза4,6-дегидратаза GOI - ген, представляющий интерес НС - тяжелая цепь,
hCMV-IE - немедленно ранний промотор цитомегаловируса человека, HRP - пероксидаза хрена,
ICE - капиллярный электрофорез с визуализацией, IgG1 - иммуноглобулин G1 типа, IRES - внутренний сайт связывания рибосомы, LC - легкая цепь,
MAA - лектин маакии амурской (Maackia amurensis),
МСВ - главный банк клеток,
mCMV - промотор цитомегаловируса мышей,
MFI - средняя интенсивность флуоресценции,
MS - масс-спектрометрия,
МТХ - метотрексат,
NK - естественные клетки-киллеры,
рА - полиаденилирование,
РАС - пуромицин N-ацетилтрансфераза,
PBS - забуференный фосфатом физиологический раствор,
PCD - пикограмм на клетку в день,
PCR - полимеразная цепная реакция,
PDL - уровень удвоения популяции,
PDT - время удвоения популяции,
POI - белок, представляющий интерес,
PreMCB - предварительный главный клеточный банк,
RE - фермент(ы) рестрикции,
RT - комнатная температура,
SA - стрептавидин,
SA-PE - стрептавидин, конъюгированный с R-фикоэритрином,
SP - сигнальный пептид,
SV40 - обезьяний вирус 40,
ТМ - трансмембранный пептид,
ТМВ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин,
VPA - вальпроевая кислота.
Инкубирование клеток CHO-S в присутствии МТХ.
Клетки CHO-S в С6614 высевали с плотностью 0,2x106 клеток/мл в 100 нМ МТХ и репродуцировали в течение десяти дней, пока жизнеспособность превышает 90%. Затем клетки переносили в 200 нМ МТХ на 27 дней и впоследствии эти клетки замораживали в присутствии 200 нМ МТХ. Для выделения клеток с нулевой экспрессией фукозы эти клетки размораживали в среде, которая не содержала МТХ.
Отбор клеток с низким содержанием фукозы с использованием магнитных стрептавидиновых бус.
Клетки CHO-S, обработанные МТХ, метили биотинилированным AAL или AOL и перемешивали со стрептавидином, связанным с магнитными бусами. Клетки отделяли с помощью магнита, и клетки в суспензии, которые не прикрепились к магниту (то есть имели низкий уровень фукозы на своей поверхности), в дальнейшем репродуцировали. Эту процедуру проводили дважды, а затем клетки сортировали с помощью FACS.
50x106 клеток CHO-S, обработанных МТХ, собирали и промывали в PBS+0,1% плюрониловая кислота (Pluronic F-68, Sigma Cat. # Р5556). Затем клетки ресуспендировали в 5 мл биотинилированного AAL (Vector, cat. B-1395, Lot # U0922) с концентрацией 20 мкг/мл или с AOL (Cat. L0169, EY) с концентрацией 5 мкг/мл в PBS+0,1% плюрониловая кислота в течение 30 мин при комнатной температуре. Окрашенные клетки промывали с использованием PBS+0,1% плюрониловая кислота перед добавлением 250 мкл BD IMag SA Particles Plus - DM (BD, Cat. # 557812) и инкубированием в течение еще 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 2,25 мл PBS+0,1% плюрониловую кислоту+0,5% BSA. Бусы делили на три 5-мл пробирки. Эти пробирки помещали в BD IMagmet (BD, Cat. # 552311) и оставляли на 8 мин. Супернатант аспирировали и переносили в новую 15-мл пробирку. Эту стадию проводили дважды и аспирированный супернатант объединяли. Супернатант снова делили на 5-мл пробирки и помещали в BD IMagmet (BD, Cat. # 552311) на 8 мин. Супернатант собирали, центрифугировали и высевали в среду С6614 (СНО DHFR- Medium powder, SAFC Bioscinces Cat. # C6614) (ITL preparation R0461V01). Эти клетки репродуцировали, а затем проводили второй цикл разделения с использованием бус.
После инкубирования с лектином жизнеспособность клеток составляла 83% при инкубировании с AAL и 89% при инкубировании с AOL. Обычная жизнеспособность клеток после инкубирования с PBS составляет 85-95%.
Сортинг клеток с низким содержанием фукозы с помощью FACS.
A. Сортинг после разделения магнитными бусами.
Клетки после двух циклов разделения магнитными бусами подвергали FACS сортингу клеток, имеющих низкие уровни фукозы на их клеточной поверхности. 40x106 клеток промывали в холодном PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугировали, ресуспендировали в 10 мл биотинилированного AAL или в смеси AOL+SA-PE 20 мкг/мл и переносили в флакон Т80 для инкубирования 30 мин со встряхиванием при 45 об/мин при 37°С. Эти клетки центрифугировали, промывали в холодном PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугировали дважды и ресуспендировали в PBS+0,1% плюро-ниловая кислота до конечной концентрации 10x106 клеток/мл. Самую нижнюю флуоресцентную фракцию популяции (1,5%) сортировали с помощью FACS в 2 мл Sigma C6614 SFM+HT (Biological Industries Cat. # 03-085-1C)/пробирку, центрифугировали, ресуспендировали в 1,5 мл Sigma C6614 SFM+HT/пробирку, высевалив лунку в 6 луночный планшет и репродуцировали.
B. Сортинг клеток с низким содержание фукозы - четыре цикла.
100x106 клеток промывали в холодном PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугировали, ресуспендировали в 10 мл биотинилированного AAL (20 мкг/мл)+SA-РЕ (1:100) смесь в PBS+0,1% плюро-ниловая кислота и переносили во флакон Т80 для инкубирования 30 мин со встряхиванием при 45
об/мин 37°С. Эти клетки центрифугировали, промывали в холодном PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугировали дважды и ресуспендировали в PBS+0,1% плюрониловая кислота до получения концентрации клеток, составляющей 10x10%m, и фильтровали в пробирки FACS. После инкубирования с AAL жизнеспособность клеток составила 81%. Обычная жизнеспособность клеток после инкубирования с PBS составляет 85-95%. Самую низкую флуоресцентную фракцию (0,2% в первом сортинге, 0,07% во втором, 1% в третьем и 2% в четвертом) популяции сортировали с помощью FACS в 2 мл Sigma ProCHO5 SFM+HT/пробирку, центрифугировали, ресуспендировали в 1 мл (в первом и втором сортин-гах), 3 мл (в третьем и четвертом сортингах) ProCHO5+НТ/пробирку, высевали в лунку в 24-луночный планшет (в первом и во втором сортингах), флакон Т25 (в третьем и четвертом сортингах) и репродуцировали.
Анализ уровня фукозы на клеточной мембране с помощью FACS.
2x106 клеток промывали в PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугировали, ресуспендировали в 500 мкл биотинилированного AAL (Cat. B1395, Vector) (разбавленного до 20 мкг/мл) или AOL (Cat. L0169, EY) (разбавленного до 5 мкг/мл)+SA-РЕ (Cat. 40250, Biolegend) (разбавленного до 2 мкг/мл) смесь в PBS+0,1% плюрониловая кислота и переносили в 24-луночные планшеты для инкубирования 30 мин со встряхиванием при 37°С. Клетки тщательно ресуспендировали и переносили в 15-мл пробирки. Добавляли 10 мл PBS+0,1% плюрониловую кислоту и клетки перемешивали, центрифугировали и снова промывали. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота/пробирка и фильтровали в FACS пробирки для анализа в соответствии с флуоресценцией клеток.
Анализ содержания сиаловой кислоты на клеточных мембранах с помощью FACS: 2x106 клеток промывали дважды в PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугировали, ресуспендировали в 500 мкл MAA-FITC (разбавленного до 50 мкг/мл) в PBS+0,1% плюрониловая кислота и переносили в 24-луночные планшеты для инкубирования 30 мин со встряхиванием при 25°С. Эти клетки тщательно ре-суспендировали и переносили в 15-мл пробирки. Добавляли 10 мл PBS+0,1% плюрониловой кислоты, и клетки перемешивали, центрифугировали и промывали снова. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота на пробирку и фильтровали в FACS пробирку для анализа в соответствии с флуоресценцией клеток.
Добавление экзогенной фукозы к культуре клеток ITL-lf2.
Клетки ITL-LF2, либо до, либо после трансфекции анти-EGFR mAb, высевали в среду ProCHO5 с концентрацией 0,2x106 клеток/мл с различными концентрациями L-фукозы (Sigma Cat. #F2252) и инкубировали при 37°С на шейкере при 320 об/мин с СО2. Через 4 дня образцы клеток брали для FACS анализа в соответствии с флуоресценцией клеток (как описано далее в настоящей заявке). Кроме того, неочищенные образцы из клеток, трансфицированных анти-EGFR mAb, анализировали с помощью FACS.
Получение предварительных главных клеточных банков.
Клеточные культуры для замораживания клеток размножали в Erlenmeyers. Требуемое количество клеток центрифугировали и ресуспендировали в среде для криоконсервации, состоящей из 92,5% смеси 1:1 свежей среды ProCHO5+НТ и кондиционированной среды (от экспоненциально растущих клеток-хозяев ITL-LF2) и 7,5% DMSO. 60 флаконов замораживали от каждого клона в каждом предварительном главном банке клеток (пре-МСВ), 10x106 клеток на флакон в 1,5 мл на флакон. Клетки замораживали при -80°С в контейнере Cryo Freezing 1°C, (NALGENE, Cat. # No. 5100-0001) и 24 ч спустя переносили для хранения в пары жидкого азота.
Тестирование банка клеток.
Жизнеспособность клеток в замороженной ампуле в пре-МСВ клеток ITL-LF2 тестировали через 11 дней после получения пре-МСВ. Одну ампулу размораживали,,и жизнеспособность определяли сразу же после размораживания. Клетки репродуцировали на протяжении трех циклов роста, и жизнеспособность определяли после третьего цикла.
Тестирование стерильности проводили путем прямого переноса или иммерсионного метода. Клетки также тестировали на микоплазму.
Клонирование с помощью FACS ACDU.
Клонирование с помощью автоматизированного устройства Automated Cell Deposition Unit (ACDU) клеточного сортера FACSAria, клеток, растущих в ProCHO5+НТ, проводили с помощью ACDU, в режиме точности "Одна клетка", в 96-луночных планшетах, содержащих 200 мкл/лунку смеси 80% C6366+20% ProCHO5 ACFM. Концентрация клеток составила 0,4x106 клеток/мл. Планшеты фотографировали с помощью Cellavista в день клонирования (день 0), а затем восемь дней спустя. Отбирали несколько клонов, репродуцировали, а затем переносили во флаконы Т25, содержащие 4 мл смеси 50% Sigma C6366 и 50% ProCHO5. Во время размножения клеток постепенно добавляли ProCHO5. Эти клетки анализировали для характеристики мРНК.
Экстракция РНК из клеток.
Тотальную РНК выделяли из клеток с помощью набора Rneasy kit (Qiagen Cat. #74104) в соответствии с инструкциями производителя.
ОТ-ПЦР для обнаружения генов выработки фукозы.
кДНК получали из тотальной РНК, экстрагированной из клеток CHO-S или ITL-LF2, используя набор Invitrogen Superscript III (Cat. #18080-051) и Oligo dT праймеры, предоставленные в этом наборе. Затем проводили ПЦР, используя ген-специфичные праймеры. Праймеры были синтезированы в Sigma Aldrich. Последовательности праймеров подробно описаны в табл. 1, приведенной ниже. Полученные в результате полосы анализировали на агарозных гелях и сравнивали с маркерами размера ДНК.
Таблица 1
Конструкция
В-127 (рТТ5-.nti EGFR mAb anti EGFR mAb-HC)
Используемая матрица
PGL3 anti EGFR mAb EMCV-РАС1-DHFR Tandem -
Полученный
Hindlll -a EGFR mAbH NotI
SEQ ID N0:1
Последовательность *
691-38 SEQ ID N0:2
i-128 (pTT5-
anti EGFR mAb-LC)
PGL3 anti EGFR mAb EMCV-РАС 1-DHFR Tandem -
Hindlll -анти EGFR mAbLC-Notl
Q-ПЦР (ПЦР в реальном времени) для оценки уровней экспрессии мРНК пути фукозы.
кДНК получали, используя высокоэффективный набор для синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы Applied Biosystems и случайные праймеры, поставляемые в этом наборе (Applied Biosys-tems Cat. #4368814).
Ген-специфичные праймеры и зонды TaqMan(r) MGB синтезировали в Applied Biosystems. Последовательности праймеров и зондов подробно изложены в табл. 2, приведенной ниже.
Таблица 2
Ген
Зонд
5'-пример
3' -праймер
Альфа 1,6
фукозилтрансфераза (Fut8)
SEQ ID N0:5
SEQ ID N0:6
SEQ ID N0:7
GDP-4-кето-б-дезокси-О-манноза эпимераза-редуктаза (Fx)
SEQ ID N0:8
SEQ ID N0:9
SEQ ID N0:10
GDP-манноза 4,6-дегидратаза (GMD) -5-6 экзон праймеры
SEQ ID N0:11
SEQ ID N0:12
SEQ ID N0:13
GDP бета L-фукозапирофосфорилаз a (GFPP)
SEQ ID N0:14
SEQ ID N0:15
SEQ ID N0:16
Переносчик GDP-фукозы (GFT)
SEQ ID N0:17
SEQ ID N0:18
SEQ ID N0:19
VEZT
SEQ ID N0:20
SEQ ID N0:21
SEQ ID N0:22
Q-ПЦР проводили следующим образом.
Для каждой реакции 5 мкл полученной кДНК добавляли к смеси, содержащей TaqMan(tm) мастер-микс для экспрессии гена, прямой и обратный праймеры & TaqMan(tm) MGB зонд в конечном объеме 13 мкл.
Q-ПЦР проводили на аппарате StepOnePlus(tm) Real Time PCR в режиме "быстро" и результаты анализировали, используя программное обеспечение StepOnePlus(tm) и DataAssist v2^. ДНК секвенирование фрагментов к ДНК и плазмид.
Секвенирование ДНК проводили с помощью полностью автоматизированного анализатора 16 Capillary ABI Prism 3100 Genetic Analyzer. Последовательности анализировали в лаборатории, используя программное обеспечение Sci-Ed General (Clone manager software, version 7.01 и Align plus 5, version 5.01).
Конструирование ДНК векторов экспрессии.
Все векторы конструировали, используя стандартные способы молекулярной биологии. Получение плазмидной ДНК.
Плазмидную ДНК выделяли, используя набор "QIAGEN Hispeed plasmid Maxi Kit" в соответствии со способом, описанным производителем. Для стабильных трансфекций ДНК линеаризовали специфичными рестриктазами и стерилизовали путем осаждения ДНК этанолом. Транзиторные трансфекции проводили с использованием кольцевой ДНК.
Стабильные трансфекции клеток ITL-LF2 и CHO-S.
Клетки ITL-LF2 адаптировали к бессывороточной среде С6614 (СНО DHFFT Medium powder, SAFC Bioscinces Cat. # C6614). Клетки выращивали в суспензии в 50-мл пробирках (фильтровальные пробирки 50, ТРР, Cat# 87050), 37°С, увлажняли и встряхивали при 320 об/мин. За два дня до трансфекций 100 мл клеток высевали с концентрацией 0,5x106 клеток/мл в 500-мл колбу Эрленмейера Corning, Cat. WI-431145). Эти клетки трансфектировали с использованием вектора PGL3 anti EGFR mAb EMCV-PAC1 DHFR Tandem-872, содержащего последовательность, кодирующую анти-EGFR mAb от LipofectAmine
(GibcoBRL Cat. # 18324-020). В день трансфекций клетки в повторах промывали; ресуспендировали и
10x106 клеток высевали в 4 мл MEM (Sigma, Cat. # М2279) на флакон Т-25 (Nunc Cat. # 163371). Для каждой трансфекций одной плазмидой использовали 20 мкг линеаризованного вектора PGL3 anti EGFR
mAb EMCV-PAC1 DHFR Tandem-872. Конечный объем ДНК доводили до 100 мкл в MEM. В дальнейшем добавляли 100 мкл LipofectAmine и инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем к клеткам добавляли смесь ДНК-LipofectAmine и инкубировали в течение 4 ч при 37°С, 5% СО2 в шейкер-инкубаторе при 50 об/мин. В конце этого периода инкубации клетки осаждали центрифугированием и среду заменяли 8 мл свежей среды 50% С6614 (Sigma) и 50% C6366 (Sigma), дополненной 13,6 мг/л гипоксантина/3,9 мг/л тимидина (НТ, Biological Industries Cat. # 03-085-1С) и 10 мкг/мл фукозы
(Sigma, Cat. #F2252).
Эти флаконы инкубировали при 37°С в шейкер-инкубаторе при 50 об/мин в течение 72 ч. Затем клетки собирали, центрифугировали и ресуспендировали в 10 мл среды 50% С6614 +50% C6366, дополненной 10 мг/мл фукозы и 5-10 мкг/мл пуромицина (для различных репликатов) и возвращали в исходные флаконы Т-25. В указанных селективных условиях могли выжить только клетки, экспрессирующие ген РАС. После восстановления репликативного пула постепенно добавляли среду С6614 +10 мкг/мл фукозы. Когда пулы были полностью восстановлены, клетки высевали в свежую среду С6614 без фуко-зы. Затем клетки переносили в среду ProCHO5 и определяли уровни фукозилирования на клеточной мембране, как описано ниже в настоящей заявке.
Клетки CHO-S культивировали в бессывороточной среде ProCHO5 (Lonza, Cat. #BE12-766Q), дополненной гипоксантином 13,61 мг/л и тимидином 3,88 мг/л (HTx1, Biological Industries Cat. #03-085-1B). Клетки выращивали в суспензии в фильтровальных пробирках 50 мл Bioreactor (TPP, Cat# 87050), 37°С, увлажняли и встряхивали при 320 об/мин. За два дня до трансфекции клетки высевали в концентрации 0,2x106 клеток/мл в 500-мл встряхиваемые колбы Эрленмейер, с фильтровальными крышками (Corning, Cat. #431145). В день трансфекции клетки центрифугировали и 10x106 клеток высевали в 4 мл MEM (Sigma, Cat.# M2279) во флаконы Т25 (Nunc, Cat. # 163371). Для каждой трансфекции одной плазмидой использовали 20 мкг линеаризованного вектора (PGL3 anti EGFR mAb EMCV-PAC1 DHFR Tandem-872). Конечный объем ДНК доводили до 100 мкл в MEM. В дальнейшем добавляли 100 мкл LipofectAmine (GibcoBRLCat. # 18324-020) и инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Смесь ДНК-LipofectAmine затем добавляли к клеткам и инкубировали в течение 4 ч при 37°С, 5% СО2 в шейкер-инкубаторе при 50 об/мин. В конце этого периода инкубации клетки осаждали центрифугированием и среду заменяли 8 мл свежей среды ProCHO5 (Lonza, Cat #BE12-766Q), дополненной декстрансульфатом 0,1 мг/мл, гипоксантином 27,22 мг/л и тимидином 7,76 мг/л (HTx2, Biological Industries Cat. # 03-085-1В) в колбе Эрленмейера 125 мл с фильтровальной крышкой (Corning, Cat. # 431143). Эту колбу инкубировали при 37°С в шейкер-инкубаторе при 125 об/мин в течение 72 ч. Затем клетки собирали, центрифугировали и ресуспендировали в 20 мл среды ProCHO5, дополненной 25 мкг/мл пуромицина (Invivogen, Cat. # ant-pr-1), в этих селективных условиях могли выживать только клетки, экспрессирующие ген РАС.
Транзиторная трансфекция клеток ITL-LF2.
За два дня до трансфекции клетки репродуцировали в ProCHO5, высевали с концентрацией 0,5x106 клеток/мл в 250 мл в 1000 мл колбы Эрленмейера (TRIFOREST, Cat. # TF FPC1000S) для достижения приблизительной плотности 2,5-3,0x106 клеток/мл через 2 дня.
Использовали два протокола трансфекции.
1. Трансфекция в среде, содержащей ProCHO5 (Lonza).
В день трансфекции 37,5 мкг ДНК (18,75 мкг каждой из плазмид HC+LC) разбавляли в 2,5 мл среды FEME ((DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen Cat. #32 500 043), 29 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 5 г/л D-глюкозы и 7,5 мМ L-глутамина) в 15-мл пробирке (Corning, Cat. # 430052). Er125 колбу заполняли 10 мл исходного объема среды FEME (DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen Cat. #32 500 043), дополненной 8 мл/л ITS-X (Invitrogen, Cat. # 51500-056); 187,5 мкг рабочего раствора PEI (Polysciences inc., Cat. #23966) добавляли в среду ДНК+FEME (^iRPEI 1:5), реактивы перемешивали на вихревой мешалке в течение 10 с и инкубировали в течение 10 с при комнатной температуре. 60x106 живых клеток центрифугировали в 50-мл пробирках. Осадок осторожно ресуспендировали со смесью для трансфекции и переносили в 125-мл колбы Эрленмейера с последующим инкубированием в течение 180 мин в СО2 шейкер-инкубаторе при 37°С в 160 атм. 12,5 мл среды ProCHO5 добавляли для достижения конечной концентрации 2,4x106 клеток/мл в 25 мл культуры.
Через 24 ч после трансфекции трансфицированные клетки CHO-S дополняли 100 мкл (конечная концентрация 0,5 мМ) рабочего раствора натриевой соли вальпроевой кислоты (VPA) 100 нМ (Sigma, Cat. #P4543) и 2 мл 3,5% Cell boost (HyClone Cat# SH30866.01). Клетки ITL-LF2 дополняли 100 мкл (конечная концентрация 0,5 мМ) рабочего раствора натриевой соли вальпроевой кислоты (VPA) 100 нМ (Sigma, Cat. # P4543) и температуру инкубирования снижали до 31°С.
После 6 дней инкубирования образец клеточной суспензии брали для подсчета клеток и определения их жизнеспособности. После центрифугирования супернатант брали для оценки транзиторной экспрессии в тесте ELISA.
2. Трансфекция во второй среде.
Получение анти-EGFR mAb с использованием клеток ITL-LF2 и CHO-S.
Клетки с концентрацией 0,5-2x106 высевали в 200-600 мл ProCHO5, содержащей декстрансульфат, в 1- или 2-л колбах Эрленмейера, и культивировали в течение 4 дней при 37°С на шейкер-инкубаторе при 320 об/мин. Собранные клетки центрифугировали и фильтровали через 0,22-мкм фильтр. В последствии добавляли смесь ингибиторов протеаз (Sigma, Cat. # Р8340) (1 мл для 1 л культуры). Собранные клетки держали замороженными при -80°С до начала процесса очистки.
Анализ уровня фукозы неочищенного собранного образца или очищенного рекомбинантного белка с помощью FACS.
Магнитные бусы с белком G (Cat.S1430S, Biolabs) тщательно ресуспендировали и 25 мкл переносили в 2-мл пробирки при комнатной температуре. Пробирки располагали на магните в течение 1 мин и супернатант аспирировали. Добавляли 0,5 мл 20 мМ фосфатного буфера для ресуспендированя бус с белком G. Эту стадию промывания повторяли еще раз.
100 мкл образца антитела (25-37 мкг/мл либо неочищенного продукта, либо очищенного белка) добавляли в пробирки, содержащие магнитные бусы. Эту смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С и помещали на магнит для отделения супернатанта. Бусы промывали два раза 0,5 мл 20 мМ фосфатного буфера, и буфер аспирировали на магните. Бусы, связавшиеся с образцом антител, ресуспендировали в 0,5 мл биотинилированной смеси AAL-SA-PE (биотинилированный AAL Vector, Cat. B1395, 20 мкг/мл и SA-PE, BioLegend, Cat. 40520, 0,2 мг/мл, разбавленный до 2 мкг/мл в PBS+0,1% плюрониловая кислота) и переносили в 24-луночные планшеты (Nunc, Cat. 142475), покрытые алюминиевой фольгой, и инкубировали 30 мин, встряхивая при 80 об/мин 37°С. Эту смесь тщательно ресуспендировали и переносили в 15мл пробирки (Corning, Cat. 430052) с 10 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота. Затем проводили два цикла промывания путем добавления 10 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугирования и удаления супернатанта. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота, фильтровали через пробирку FACS (Falcon, Cat. 352235) и анализировали с помощью FACS.
Анализ уровня сиаловых кислот неочищенного образца или очищенного рекомбинантного белка с помощью FACS.
Магнитные бусы с белком G (Cat. S1430S, Biolabs) тщательно ресуспендировали и 25 мкл переносили в 2-мл пробирки при комнатной температуре. Пробирки располагали на магните в течение 1 мин и супернатант аспирировали. Добавляли 0,5 мл 20 мМ фосфатного буфера для ресуспендирования бус с белком G. Эту стадию промывания повторяли еще раз.
100 мкл образца антитела (25 мкг/мл либо неочищенного продукта, либо очищенного белка) добавляли в пробирки, содержащие магнитные бусы. Эту смесь инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и помещали на магнит для отделения супернатанта. Бусы промывали два раза 0,5 мл 20 мМ фосфатного буфера и этот буфер аспирировали на магните. Бусы, связавшиеся с образцом антител, ресуспендировали в 0,5 мл MAA-FITC (2 мг в 2 мл, EY, Cat. F-7801-1, разбавленный до 25 мкг/мл в PBS+0,1 плюрониловая кислота) и переносили в 24-луночные планшеты (Nunc, Cat. 142475), покрытые алюминиевой фольгой, и инкубировали 30 мин при встряхивании при 80 об/мин при комнатной температуре. Эту смесь тщательно ресуспендировали и переносили в 15-мл пробирки (Corning, Cat. 430052) с 10 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота. Затем проводили два цикла промывания путем добавления 10 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота, центрифугирования и удаления супернатанта. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл PBS+0,1% плюрониловая кислота, фильтровали через пробирку FACS (Falcon, Cat. 352235) и анализировали с помощью FACS.
ELISA антител против EGFR.
ELISA использовали для определения концентрации антитела человека в тестируемых образцах. Этот анализ проводили, как описано ниже.
Микротитровальные планшеты покрывали 2 мкг/мл козьими антителами против IgG человека (H+L) в 0,1 М карбонатном буфере pH 9,6 и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали четыре раза промывочным буфером (0,05% Tween-20 в PBS). Затем планшеты блокировали блокирующим буфером (1% BSA в PBS-T 0,05%), 200 мкл/лунку, в течение 1 ч при комнатной температуре. После блокировки планшеты промывали четыре раза промывочным буфером (0,05% Tween-20 в PBS). Покрытые планшеты использовали сразу же после получения или хранили при -20°С до использования (в течение 6 недель). В планшеты добавляли образцы, образцы для калибровочной кривой и контрольные образцы (100 мкл/лунку) и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. Планшеты промывали снова четыре раза промывочным буфером и добавляли 100 мкл аликвоты конъюгированного с HRP козьего Fab против IgG человека, разбавленного до 8 нг/мл в аналитическом буфере (1% порошкообразное обезжиренное молоко в PBS), и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Планшеты промывали снова четыре раза промывочным буфером, добавляли 100 мкл раствора субстрата (ТМВ) и инкубировали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления в каждую лунку 100 мкл 1 н. HCl. Поглощение измеряли при А450 нм в ELISA анализаторе. Стандартные растворы готовили серийными разведениями эталонного образца анти-EGFR (ERBITUX от MerckSerono) для получения калибровочной кривой в интервале от 100 до 1,56 нг/мл в аналитическом буфере. Образец неочищенного
продукта из пула 2390 (полученного в ITL) использовали в качестве контрольного образца. Программное обеспечение Magelan 5 вычисляло результаты оптических данных. Использовали четырех-параметрическое логистическое уравнение, и результаты неизвестных образцов автоматически интерполировали из калибровочной кривой, выраженные в нг/мл. Разведение образцов, получение калибровочной кривой, нанесение образцов на планшеты проводили с помощью автоматизированного устройства для обработки образцов.
Очистка интактного анти-EGFR и FC-мономера.
Анти-EGFR продукты, полученные из пулов (2390 и 2622UN), очищали на колонке с белком А. Очищенные продукты анализировали либо как интактный IgG, либо как Fc мономер (полученный как описано ниже). Процесс очистки проводили, как описано на фиг. 2, и выполняли, используя системы
АКТА Explorer.
Очистка анти-EGFR на белке А.
Колонку, заполненную белок А сефароза-МАЬ SelectXtra (объемом 5 мл), уравновешивали с использованием 5-6 CV 50 мМ ацетата натрия pH 6,8 со скоростью потока 2,0 мл/мин. Осветленный неочищенный продукт (~500 мл), содержащий продукт из пула, загружали на колонку при скорости потока 2,0 мл/мин. Колонку промывали в две стадии (7-9 CV): первое промывание с использованием 1,5 М NaCl в 50 мМ ацетате натрия pH 6,8 с последующим вторым промыванием с использованием 50 мМ ацетата натрия pH 6,8, со скоростью потока 2,0 мл/мин до получения исходного уровня. Продукт элюировали в одной фракции с использованием 20 мМ уксусной кислоты pH 3,2 при скорости потока 2,0 мл/мин. Прохождение через колонку проводили при комнатной температуре и контролировали посредством УФ при 280 и 215 нм. pH доводили до 6,0 с использованием 1 М Tris. Колонку промывали 0,1 М уксусной кислотой, pH 2,9, а затем очищали на месте с использованием 8 CV 4 M гуанидин HCl. Колонку повторно уравновешивали с использованием 50 мМ ацетата натрия pH 6,8 и хранили в 20% этаноле.
Диализ и концентрирование интактного анти-EGFR mAb.
Фракцию, элюированную с колонки белок А сефароза - MAb Select Xtra, диализировали в диализной трубке SnakeSkin (MM размера пор границы пропускания 10 кДа) дважды против "Буферной смеси" (100 мМ NaCl, 100 мМ глицина, 10 мМ цитрат, pH 5,8) в течение ночи в объемном соотношении примерно 1:100. После диализа образец концентрировали ультрафильтрацией (ММ мембраны границы пропускания 10 кДа) в концентраторе Amicon. Эти стадии проводили при 2-8°С. Концентрацию концентрированного продукта измеряли с помощью ELISA или при O.D. 280 нм.
Расщепление антитела папаином.
Фракцию, элюированную с колонки с белком А, подвергали диализу в диализной трубке SnakeSkin (MM размера пор границы пропускания 10 кДа) дважды против буфера (0,1 М Tris-HCl, 4 мМ EDTA, pH 7,6) в течение ночи при 4°С в объемном соотношении примерно 1:100 (белок:буфер). После диализа образец концентрировали до 1 мг/мл ультрафильтрацией (ММ мембраны границы пропускания 10 кДа) в концентраторе Amicon. Анти-EGFR расщепляли на Fab и Fc фракции папаином. Расщепление проводили путем инкубирования антитела в конечной концетрации 1 мг/мл в 0,1 М Tris-HCl pH 7,6, 4 мМ EDTA, 5 мМ цистеина. Расщепление инициировали путем добавления папаина (разбавленного до 1 мг/мл водой) с получением конечного соотношения белок:фермент 100:1 (мас./мас.). Расщепление проводили в течение 2 ч при 37°С, расщепление останавливали путем добавления малеимида (33 мМ) и охлаждали на льду. Фракцию Fc-димера очищали из смеси расщепления аффинной хроматографией с белком А, как описано выше в настоящей заявке. Очищенный Fc димер диализировали в диализной трубке SnakeSkin (MM размера пор границы пропускания 10 кДа) дважды против PBSx1, pH 7,2 и концентрировали до 2 мг/мл ультрафильтрацией (ММ мембраны границы пропускания 10 кДа) в концентраторе Amicon.
Восстановление и алкилирование.
Восстановление и алкилирование проводили, используя фракцию Fc димера в денатурирующих условиях для получения Fc мономера для характеристики уровня фукозы в сайте N-гликозилирования в положении 297, расположенного в домене СН2 тяжелой цепи (см. предпосылки). Фракцию Fc димера разбавляли до 1 мг/мл буфером (4 М гуанидин-HCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,8), затем добавляли дитиотреи-тол (DTT, 5 мМ) и реакционную смесь размещали при 75°С в течение 5 мин. Раствор белка затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли 0,5 М рабочий раствор йодацетамида до достижения конечной концентрации 15 мМ. Алкилирование проводили при комнатной температуре в течение 40 мин в темноте. Затем добавляли рабочий раствор 0,5 М DTT до получения 15 мМ концентрации для остановки алкилирования.
Диализ и концентрирование Fc мономера анти-EGFR.
Фракцию, элюированную с колонки белок А сефароза - MAb Select Xtra, диализировали в диализной трубке SnakeSkin (MM размера пор границы пропускания 10 кДа) дважды против "буферной смеси" (100 мМ NaCl, 100 мМ глицин, 10 мМ цитрат, pH 5,8) в течение ночи в объемном соотношении примерно 1:100 (белок: буфер). После диализа образец концентрировали ультрафильтрацией (ММ мембраны границы пропускания 10 кДа) в концентраторе Amicon. Эти стадии проводили при 2-8°С. Концентрацию концентрированного продукта измеряли с помощью ELISA или при O.D. 280 нм.
Анализ уровня фукозы и сиаловых кислот на очищенном белке с использованием системы Octet.
Этот анализ проводили для определения либо уровня фукозы либо сиаловых кислот на очищенных продуктах (интактный IgG1 или мономер Fc) посредством кинетического анализа Octet. Этот анализ проводили, как описано ниже.
Реактив NHS-PEG4-биотин использовали для биотинилирования либо AAL, либо MAA в соответствии с инструкциями производителя. Раствор биотинилированного реактива (1 мМ в PBSx1, pH 7,2) добавляли в 1 мл лектина (1 мг/мл) (соотношение лектин:биотин 1:5). Реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч на льду. Диализ образца проводили против PBS pH 7,2 в кассете Slide-A-Lyzer (MM размера пор границы пропускания 10 кДа).
Стрептавидиновые биосенсоры (SA) предварительно инкубировали в кинетическом буфере в течение 20 мин при 30°С без встяхивания перед началом эксперимента. Буферы, биотинилированный лектин и очищенный продукт получали в соответствии с требуемой концентрацией и переносили в 96-луночный планшет (250 мкл/лунку), все стадии проводили при 30°С, скорость встряхивания (1000 об/мин). Движение инициировали путем расположения биосенсоров в соответствующих лунках и измерения изменения толщины слоя (в нанометрах, нм) в зависимости от времени, все под контролем компьютера. Сначала 1 мкг/мл биотинилированного AAL (AAL-B) или 10 мкг/мл биотинилированного MAA (MAA-В) иммоби-лизировали на поверхности концов стрептавидиновых биосенсоров в течение 40 мин (стадия нагрузки). Затем эти концы промывали в разбавленном кинетическом буфере (KBx1) в течение 10 мин (исходная стадия). На стадии соединения очищенный белок связывался с биотинилированным лектином в течение 40 мин с последующим промыванием в буфере KBx1 в течение стадии диссоциации. На фиг. 3 показан характерный профиль кинетического анализа с помощью системы Octet. Данные были обработаны автоматически с использованием программного обеспечения Octet User Software version 6.3.
Анализ профиля заряда очищенного антитела с помощью ICE 280.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование с визуализацией проводили, используя анализатор iCE280 (Convergent Biosciences). Разделение изоформ осуществляли на капиллярных картриджах (50 мм длина, 100 мкм I.D. колонка), разделительный капилляр, который имеет внутреннюю поверхность, предварительно покрытую фторзамещенным углеводородным соединением.
Очищенные и подвергнутые диализу образцы анти-EGFR концентрировали до 4 мг/мл ультрафильтрацией (ММ границы пропускания целлюлозной мембраны 10 кДа) в ультрацентрифужном фильтре Amicon. Образец для анализа получали путем смешивания 20 мкл 4 мг/мл анти-EGFR, 80 мкл подвижного рабочего раствора. Разделение проводили, используя 100 мМ NaOH в качестве катодного раствора и 80 мМ Н3РО4 в качестве анодного раствора. Электрофореграммы получали УФ-поглощением при 280 нм. Краткое изложение конечных условий и концентраций приведено в табл. 3, представленной ниже.
Анализ профиля гликозилирования на Fc мономере с помощью MS.
Fc мономер антитела к EGFR выделяли, как описано выше, дополнительно охарактеризовывали в отношении анализа гликана, посредством MS.
Размножение и продуктивность клеток в ACFM. Подращивание клеточной культуры и вычисления PDT.
Клеточные культуры подращивали в ACFM следующим образом: клетки высевали в 50-мл пробирки с концентрацией 0,2x106 клеток/мл и инкубировали при 37°С на орбитальном шейкере при 320 об/мин. Дважды в неделю измеряли количество и жизнеспособность клеток. Культуру перевивали
центрифугированием при 100 g в течение 5 мин при 4°С и клеточную массу затем ресуспендировали в свежей предварительно нагретой ACFM.
Уровень удвоения популяции (PDL) и время удвоения популяции (PDT) определяли в соответствии со следующими уравнениями:
PDL - log(rg) ~ 1оё(Г/) log(2)
РРТ-24Чдт)
PDL
где Ti - общее количество живых клеток при высевании; Те - общее количество живых клеток в конце. Определение максимальной клеточной концентрации.
Клетки высевали в 50-мл пробирки (ТРР, Cat# 87050) с концентрацией 0,2x106 клеток/мл и инкубировали при 37°С на орбитальном шейкере при 320 об/мин. В различные моменты времени измеряли количество и жизнеспособность клеток.
Специфичная продуктивность в ACFM.
Для специфичной продуктивности (PCD) в ACFM клетки высевали в специализированную ACFM с концентрацией 0,5x10 клеток/мл, в 50-мл пробирку и инкубировали при 37°С в шейкер-инкубаторе (320 об/мин) в течение 24 ч. Затем среду удаляли, и концентрацию продукта определяли с помощью ELISA. Вычисление проводили путем деления 24 ч титров на среднюю концентрацию клеток при высевании и через 24 ч эксперимента.
Сг + Се 2
где PCD - пг/клетки/день; Т - титр (пг/мл);
Ci - концентрация клеток при высевании (клеток/мл); Се - концентрация клеток после 24 ч (клеток/мл). Рост и продуктивность в периодическом процессе.
Рост и продуктивность клеточной суспензии в периодическом процессе осуществляли при концентрации высевания 0,2x106 клеток/лунку в 40 мл среды ProCHO5 и 12 мл CHO CD EfficientFeed(tm) A, (Invitrogen, Cat.# A10234-01)+CHO CD EfficientFeed(tm) В Invitrogen, Cat.# A10240-01) (1:1) в 125-мл колбах Эрленмейера: 125 мл (Corning, Cat.# WI-431143) встряхивая при 125 об/мин, при 37°С с 5% СО2 до тех пор, пока уровень жизнеспособности не опустится ниже 70%. Образцы брали для анализа титра продукта (посредством ELISA), концентрации метаболитов, концентрации клеток и жизнеспособности каждые 1-2 дня начиная с третьего дня.
Пример 1. Стратегия выделения клеток с низким содержанием фукозы.
Стратегия, используемая для выделения клеток, экспрессирующих низкий уровень фукозы, была основана на создании случайных мутаций и отборе клеток с требуемым фенотипом с низким содержанием фукозы.
Этот способ включал несколько стадий (как описано на фиг. 4 и 5) и начинался инкубированием клеток CHO-S с мутагеном МТХ таким образом, чтобы генерировать мутации. Затем МТХ удаляли и клетки выделяли в соответствии с одной из следующих стадий:
1) два цикла мечения клеток биотинилированным лектином, специфичным к фукозе (биотинилиро-ванным AAL или AOL), и выделение клеток, которые не связываются с магнитными бусами, покрытыми стрептавидином. После этой стадии следовало мечение клеток биотинилированным лектином, специфичным к фукозе (биотинилированным AAL или AOL), и флуоресцентным стрептавидином, и однократный сортинг низкофлуоресцентных клеток с помощью FACS (фиг. 4);
2) четыре цикла мечения клеток биотинилированным лектином, специфичным к фукозе (биотини-лированным AAL), и флуоресцентным стрептавидином, и сортинг низкофлуоресцентных клеток с помощью FACS (фиг. 5).
Инкубирование клеток CHO-S в МТХ.
Клетки CHO-S в С6614 высевали с плотностью 0,2x106 клеток/мл в 100 нМ МТХ и репродуцировали в течение 10 дней, пока жизнеспособность не превысит 90%. Затем клетки переносили в той же исходной концентрации в С6614 с 200 нМ МТХ, пока жизнеспособность не превысит 90%. Эти клетки замораживали и использовали для выделения клеток, с низким содержанием фукозы.
Пример 2. Отбор клеток с низким содержанием фукозы с помощью двух циклов выделения стреп-тавидиновыми магнитными бусами и одного цикла FACS сортинга (клетки ITL-LF1).
50 млн клеток CHO-S инкубировали в 200 нМ МТХ, клетки CHO-S дикого типа и клетки CHO DUKX отделяли однократно на магнитных бусах, высевали в 96-луночные планшеты, репродуцировали
и переносили во флаконы Т80. Количество и жизнеспособность отделенных несвязавшихся клеток было выше в случае клеток CHO-S, обработанных МТХ, и значительно ниже в клетках, не обработанных МТХ. Кроме того, клетки CHO-S, инкубированные в МТХ, достигали флаконов Т80 за 14 дней, тогда как CHO-S и CHO-DUKX достигали флаконов Т80 только после 22 дней. Дальнейшее выделение клеток с низким содержанием фукозы проводили только с клетками CHO-S, обработанными МТХ. Второе выделение с использованием магнитных бус, покрытых стрептавидином, начинали с 5x107 клеток, и отобранные несвязавшиеся клетки высевали в 96-луночные планшеты. FACS сортинг 1,5% популяции с наименьшим содержанием фукозы проводили с 4x107 клеток после восстановления и размножения клеток. Анализ уровня фукозы на клеточной мембране.
Анализ уровня фукозы на клеточной поверхности показал, что после мечения клеток биотинилиро-ванным AAL и SA-PE только клетки CHO-S, отобранные МТХ продемонстрировали субпопуляцию с низкими уровнями фукозы на клеточной мембране. Отделенные клетки CHO-S (фиг. 6) и CHO DUKX (данные не показаны) представляли нормальный уровень фукозы на клеточной мембране. Дальнейший анализ клеток CHO-S, обработанных МТХ, после двух циклов селекции с использованием магнитных бус, покрытых стрептавидином, и одной селекции с использованием FACS сортинга, изображен на фиг. 7А и показывает низкофукозный профиль отобранных клеток. Было обнаружено, что низкофукозный профиль является сходным как в среде ProCHO5, так и С6614 (фиг. 8А).
Аналогичный подход проводили с биотинилированным AOL. Анализ клеток CHO-S, обработанных МТХ, меченных биотинилированным AOL, после двух циклов селекции с использованием магнитных бус, покрытых стрептавидином, и однократная селекция с использованием FACS сортинга изображены на фиг. 8В и демонстрируют низкофукозный профиль отобранных клеток.
Применение 1-фукоза-специфичного лектина, аспергиллы риса Aspergillus oryzae (AOL) для отбора клеток с низким содержанием фукозы.
Клетки CHO-S, инкубированные с МТХ, метили биотинилированным AOL и смешивали с магнитными бусами, покрытыми стрептавидином. Эти клетки отделяли на магните, и клетки, которые не присоединились к магниту, дополнительно репродуцировали. Эту стадию повторяли дважды. Затем клетки метили биотинилированным AOL и флуоресцентным стрептавидином, и низкофлуоресцентные клетки отбирали с помощью FACS и дополнительно репродуцировали. FACS анализ проводили путем мечения клеток биотинилированным AOL и флуоресцентным стрептавидином. Результаты, представленные на фиг. 7В, показывают, что AOL также может быть использован для отбора клеток с низкой экспрессией фукозы.
Анализ уровня сиаловых кислот на клеточной мембране.
Анализ уровня сиаловых кислот может указывать не только на присутствие сиаловой кислоты на олигосахаридах, а также гарантирует, что во время отбора клеток с низким содержанием фукозы не был потерян целый олигосахарид. Анализ уровня сиаловых кислот на клеточной мембране проводили путем инкубирования клеток с лектином, специфичным в отношении сиаловой кислоты (MAA), конъюгиро-ванным с FITC, с последующим анализом FACS. Этот анализ показал, что после мечения клеток биоти-нилированным AAL и SA-PE как клетки CHO-S, так и клетки ITL-LF1 демонстрировали сходные уровни сиаловой кислоты на клеточной мембране в среде ProCHO5 и в среде С6614 (фиг. 9).
Стабильность низкофукозного фенотипа.
Анализ уровня фукозы на клеточной поверхности проводили в различные моменты времени после отбора клеток ITL-LF1 в течение 358 удвоений популяции (PDL), и было показано, что после мечения клеток биотинилированным AAL и SA-PE низкофукозный фенотип оставался низким и стабильным
(фиг. 10).
Скорость роста.
Скорость роста клеток ITL-LF1 определяли во время теста стабильности фукозы, и было обнаружено, что результат PDT 15-20 ч (фиг. 11) аналогичен CHO-S.
Пример 3. Отбор клеток с нулевым содержанием фукозы путем отбора с помощью FACS (клетки
ITL-LF2).
Клетки CHO-S, инкубированные в 200 нМ МТХ, отбирали с помощью FACS для выбора популяции с низким содержанием фукозы. Исходное количество клеток, взятых для сортинга, фракция отобранных клеток с низким содержанием фукозы, а также число отобранных клеток в каждом цикле сортинга представлены в табл. 4, приведенной ниже.
Анализ уровня фукозы на клеточной мембране.
Анализ уровня фукозы на клеточной поверхности показал, что после мечения клеток биотинилированным AAL и SA-PE отобранная фракция CHO-S МТХ с нулевым содержанием фукозы увеличивалась с количеством проводимых сортингов. Три цикла сортинга в результате привели к получению гомогенной популяции с низкими уровнями фукозилирования. Четвертый сортинг применяли для дополнительного подтверждения отбора гомогенной популяции с низкими уровнями фукозы (фиг. 12). Другой анализ показал, что уровни фукозилирования клеток ITL-LF2 были нулевыми как в среде ProCHO5, так и в среде С6614 (фиг. 13).
Анализ уровня сиаловых кислот на клеточной мембране.
Анализ уровня сиаловых кислот может показывать не только присутствие сиаловой кислоты на олигосахаридах, а также гарантировать, что во время селекции на низкое содержание фукозы целый оли-госахарид не был потерян. Этот анализ показал, что после мечения клеток MAA лектином, специфичным сиаловой кислоте, конъюгированным с FITC, как клетки CHO-S, так и клетки ITL-LF2 демонстрировали сходные уровни сиаловых кислот на клеточной мембране (фиг. 14).
Стабильность низкофукозного фенотипа.
Анализ уровня фукозы на клеточной поверхности проводили в различные моменты времени после отбора клеток ITL-LF2 с низким содержанием фукозы в течение 370 PDL, и было показано, что после мечения клеток биотинилированным AAL и SA-PE низкофукозный фенотип оставался низким и стабильным (фиг. 15).
Скорость роста.
Скорость роста клеток ITL-LF2 определяли во время теста стабильности фукозы, и был получен результат PDT 15-20 ч (фиг. 16), аналогичный CHO-S. Максимальная клеточная концентрация.
Для определения максимальной клеточной концентрации в условиях чистой периодической культуры (без подпидки) клетки ITL-LF2 высевали с концентрацией 0,2х106 клеток/мл в 50-мл пробирки и культивировали в течение семи дней. Максимально достигаемая концентрация жизнеспособных клеток составляла 8,4х106 клеток/мл, которая является немного выше, чем у родительских CHO-S, которые достигали максимально 7,5х106 жизнеспособных клеток/мл (фиг. 17).
Действие экзогенной фукозы на уровень фукозилирования клеток ITL-LF2.
Клетки ITL-LF2 высевали в среде ProCHO5 в присутствии повышающихся концентраций L-фукозы в культуральной среде. Результаты FACS анализа показывают корреляцию между экзогенно добавленной концентрацией фукозы и уровнем фукозилирования на клеточной мембране (фиг. 18).
Выращивание клеток ITL-LF2 в периодическом процессе.
Для оценки продуктивности клеток ITL-LF2 и сравнения их с клетками CHO-S в периодическом процессе клетки высевали в ProCHO5+CHO CD EfficientFeed(tm) и репродуцировали на протяжении времени, пока жизнеспособность оставалась выше 60%. Образцы брали из культуры для измерения клеточной концентрации, жизнеспособности клеток, концентрации метаболитов и титров продукта. Результаты показывают, что ITL-LF2 растут в течение более длительного времени с более высокой жизнеспособностью (фиг. 19В и 19С) и на ~20% более высокой суммарной концентрацией жизнеспособных клеток (IVCC) (фиг. 19D) по сравнению с клетками CHO-S. Клетки ITL-LF2 также демонстрируют значительно более низкую концентрацию лактата на протяжении этого процесса (фиг. 19D), что указывает на то, что эти клетки используют лактат в качестве источника углерода более эффективно, чем родительские клетки CHO-S.
Клонирование с помощью FACS ACDU.
Клонирование клеток ITL-LF2 проводили с помощью автоматизированного устройства Automated Cell Deposition Unit (ACDU) клеточного сортера FACSAria. 103 и 124 клона, появившиеся из 192 лунок, высевали в 80% C6366+20% ProCHO5 в двух экспериментах (которые отражают 54 и 65% восстановление) через восемь дней после клонирования. Аналогичный диапазон восстановления обычно получают после клонирования клеток CHO-S (данные не показаны). Несколько клонов репродуцировали в среде ProCHO5 и использовали для характеристики мРНК.
Генетический анализ клеток ITL-LF2.
Каскад фукозилирования состоит из двух путей, которые начинаются по отдельности и сходятся. Эти два пути состоят из самого начального каскада реакций от D-глюкозы и пути утилизации продуктов метаболизма от L-фукозы. Для изучения причины низкофукозного фенотипа клеток ITL-LF2 проводили анализ экспрессии генов, которые вовлечены в этот каскад реакций. Этот анализ проводят для того, чтобы увидеть, могут ли быть какие-либо из этих генов разрушены либо в последовательности, либо в уровнях экспрессии. Гены, которые были проанализированы на профиль экспрессии (посредством ОТ-ПЦР и секвенирования) и уровень экспрессии (посредством Q-ПЦР), продемонстрированы на фиг. 20.
Последовательности праймеров подробно описаны в табл. 5, приведенной ниже.
Для анализа генов каскада фукозилирования, экспрессируемых в ITL-LF2, по сравнению с родительскими клетками CHO-S тотальную РНК экстрагировали из обеих клеточных линий и подвергали обратной транскрипции (ОТ) с последующей ПЦР с ген-специфичными праймерами, которые захватывают всю кодирующую область. Полученные в результате кДНК затем прогоняли на агарозных гелях для анализа наличия различий в размерах, полученных от родительских клеток CHO-S и клеток ITL-LF2. Полосы, которые были получены, дополнительно анализировали путем секвенирования. На фиг. 21 показаны результаты, полученные после ОТ-ПЦР для всех четырех тестируемых генов.
кДНК сходных размеров были получены для генов GDP-4-кето-б-дезокси-D-маноза эпимеразы-редуктазы (Fx) и альфа 1,6 фукозилтрансферазы (Fut8). Секвенирование подтвердило, что обе кДНК генов являются идентичными в двух клеточных линиях. GDP бета L фукозапирофосфорилаза (GFPP) не определялась в клетках CHO-S (проверено в нескольких анализах ОТ-ПЦР), но полоса очень слабой интенсивности в ожидаемом размере могла быть определена в клетках ITL-LF2 (стрелка на фиг. 21). Секве-нирование в этом случае не проводили.
Для гена GMD полоса в ожидаемом размере была определена в клетках CHO-S, и секвенирование показало, что это является полноразмерной мРНК GMD. Однако в клетках ITL-LF2 было обнаружено две полосы (эти две полосы иногда выглядят как "жирная" полоса на геле, показывающая дублет), обе меньше, чем полноразмерная ORF. Секвенирование подтвердило присутствие двух вариантов сплайсинга: один (обозначенный вариантом сплайсинга 1 - SV1), содержащий делецию экзонов 8 и 9 (фиг. 22 А), и второй (вариант сплайсинга 2 - SV2) с делецией в экзонах 3 и 4 (фиг. 22В). Последовательности белка полноразмерной GMD и обоих вариантов сплайсинга представлены в последовательностях SEQ ID NO: 23-25. Последовательности ДНК полноразмерной GMD и обоих вариантов сплайсинга представлены в последовательностях SEQ ID NO: 26-28. Кроме того, небольшая полоса ~250 пар нуклеотидов была обнаружена как в клетках CHO-S, так и в клетках ITL-LF2. В связи с тем, что эта небольшая полоса была обнаружена в обоих клеточных типах, эта полоса, по-видимому, не является причиной различий, наблюдаемых в гликозилировании в обоих типах этих клеток. Следовательно, эта полоса была названа "небольшой" полосой, но в дальнейшем не была проанализирована.
Анализ последовательности вариантов сплайсинга GMD (SV) показал присутствие уникального сайта рестриктазы для каждого варианта сплайсинга (BglII на экзоне 4 и XmnI на экзоне 8 (смотри фиг. 23А). Для дальнейшей верификации профилей РНК в клетках CHO-S и ITL-LF2 проводили дополнительную ОТ-ПЦР для каждого типа клеток. Затем кДНК расщепляли на три равные части, одну необработанную, другую расщепленную BglII и третью расщепленную XmnI. Затем все реакции проводили на агарозном геле, и полосы выявляли и сравнивали с маркером размера ДНК (фиг. 23В). Обоснованием, лежащим в основе этого эксперимента, было то, что если клетки ITL-LF2 содержат смесь двух SV, расщепление одной рестриктазой будет оставлять более высокую полосу SV, которая не содержит специфический сайт рестрикции, и дополнительные новые полосы будут появляться у ожидаемых размеров для других SV, которые содержат специфический сайт рестрикции. Ожидаемые размеры полос были получены во всех расщеплениях, указывая на то, что действительно в ITL-LF2 два варианта сплайсинга существуют в виде смеси. Кроме того, самая большая (высокая) полоса после рестрикции (SV, который не был расщеплен) была вырезана из геля и секвенирована. Результаты показали присутствие SV, ожидаемого в следующем случае: SV2 оставался в виде более высокой полосы во фракции, расщепленной BglII, a SV1 оставался во фрагменте, расщепленном XmnI (для пояснения полученных размеров фрагментов смотри табл. 6, приведенную ниже).
Уровни экспрессии генов, вовлеченных в синтез фукозы.
Уровень экспрессии генов, вовлеченных в каскад фукозилирования, определяли с помощью количественной ПЦР (Q-PCR) с ген-специфичными праймерами и зондами. Значительных изменений в уровнях экспрессии любого из тестируемых генов обнаружено не было (фиг. 24). Эти результаты указывают на то, что изменения уровней фукозилирования клеток ITL-LF2 происходили не за счет уровня экспрессии мРНК GMD.
Получение пре-МСВ (подготовка, размораживание, тестирование стерильности и присутствия ми-коплавм): клетки ITL-LF2, полученные после четырех циклов селекции на низкое содержание фукозы с помощью FACS, репродуцировали и замораживали. Эти клетки размораживали для размножения их и получения пре-МСВ. Был получен предварительный главный банк клеток (пре-МСВ), содержащий 60 ампул с 10х106 клеток на флакон.
Тестирование на жизнеспособность, стерильность и присутствие микоплазм предварительных главных банков клеток.
Одну ампулу из пре-МСВ клеток ITL-LF2 размораживали через 11 дней после замораживания. Жизнеспособность, измеренная сразу же после размораживания, составляла 98,3%. Эти клетки репродуцировали в течение трех циклов роста, и было обнаружено, что их жизнеспособность составляет 99,0% соответственно.
Пре-МСВ тестировали на стерильность и загрязнение микоплазмой. Было обнаружено, что этот банк является стерильным и свободным от микоплазмы.
Пример 4. У клеток ITL-LF2 восстанавливается фукозилирование при трансфекции геном GMD дикого типа.
Было обнаружено, что в клетках ITL-LF2 ген GMD (который вовлечен в de-novo метаболический путь синтеза фукозы) демонстрировал два варианта сплайсинга и не демонстрировал полноразмерную мРНК, что отличается от профиля, который можно увидеть в клетках CHO-S дикого типа. Для оценки того, приводит ли утрата полноразмерного белка GMD к фенотипу с низким содержанием фукозы, наблюдаемому в клетках ITL-LF2, клетки трансфицировали с использованием кДНК полноразмерной GMD с последующим анализом уровней фукозилирования с использованием FACS.
Конструирование плазмиды МВ-129 (PCMV-P-GMD).
кДНК полноразмерной GMD получали с помощью ОТ-ПЦР на тотальной РНК, экстрагированной из клеток CHO-S дикого типа, используя праймеры 586-26 и 587-22, описанные в табл. 5, приведенной выше. Для клонирования этого гена в требуемый вектор дополнительную стадию ПЦР проводили с праймерами 700-45 и 701-30 (подробности смотри в табл. 7, приведенной ниже), которые обеспечивали добавление сайтов распознавания рестриктазами (RE) (5'SwaI и 3'XhoI), необходимых для стадии клонирования.
Конструк-
Исполь-
Полученный
5'-
¦праймер
' -праймер
ция век-
зуемая
фрагмент
Последова-
Последо-
тора.
матрица
тельность*
вательность *
МВ-127
PGL3
Hindlll
690-
GTCTGAAT
691
GGATCCGC
(рТТ5-
APERA
APERAHC-
TCAAGCTT
-38
GGCCGCTA
APERA-HC)
EMCV-
Notl
GTAGCGAT
CGCCGCCC
РАС1-
CGCCGCCA
TCAGATCT
DHFR
CCAT
TTATCA
Tandem -
SEQ ID
SEQ ID NO:
872
NO: 41
МВ-128
PGL3
Hindlll
692-
GCTTGAAT
693
GCGGCCGC
(рТТ5-
APERA
APERALC-
TCAAGCTT
-32
TGTCCGCG
APERA-LC)
EMCV-
Notl
CTAGTACG
CCTTACTA
РАС1-
CGTGTTTA
ACACTCTC
DHFR
AACC
SEQ ID NO:
Tandem -
SEQ ID
872
NO: 4 3
МВ-129
кДНК GMD
Swal-GMD-
700-
GTCCGATA
701
ATCCCTCG
(pCMV-P-
Xhol
TCATTTAA
-30
AG TTATCA
GMD)
клеток
ATCGCCAC
GGCGTTGG
CHO wt
CATGGCTC
GGTTGGTTC
ACGCTCCC
SEQ ID NO:
GCTAG
SEQ ID
NO: 4 5
ПЦР фрагмент был расщеплен Swal и XhoI и лигирован в векторе pCMV-P, который был расщеплен теми же рестриктазами.
Полученный в результате вектор (МВ-129) содержит ген GMD под контролем промотора hCMV с геном устойчивости к пуромицину в качестве селективного маркера в отдельной кассете, как показано на фиг. 25.
Экспрессия фукозы трансфицированньгх клеток.
Клетки ITL-LF2 и CHO-S трансфицировали с использованием линейной плазмиды, содержащей последовательность, кодирующую GMD (pCMV-P-GMD) в трех повторах, используя реактив липофекта-мин. Клетки ITL-LF2 восстанавливали в течение трех дней в 50% С6614 (Sigma) и 50% C6366 (Sigma), дополненной 13,6 мг/л гипоксантина/3,9 мг/л тимидина (НТ) и 10 мкг/мл фукозы. Затем трансфицированные клетки подвергали селекции в 50% С6614 (Sigma) и 50% C6366 (Sigma), дополненной 10 мкг/мл фукозы и 10 мкг/мл пуромицина. После полного восстановления трансфицированные пулы ITL-LF2 переносили в среду ProCHO5, содержащую 10 мкг/мл пуромицина без фукозы.
Уровень фукозилирования анализировали с помощью FACS на клетках ITL-LF2, трансфицирован-ных GMD, и сравнивали с уровнями фукозилирования клеток CHO-S (положительный контроль) и ITL-LF2 (отрицательный контроль) (фиг. 26). Результаты показывают, что приблизительно 45% популяции экспрессирует белки с уровнями фукозилирования, сходными с таковыми клеток CHO-S. Остальная популяция (~55%) демонстрирует более низкие уровни фукозилирования. Тем не менее, популяция с низким уровнем фукозилирования имела более высокие уровни фукозилирования, чем нетрансфицирован-ные клетки ITL-LF2. Представленные выше результаты указывают на то, что фукозилирование было восстановлено в клетках ITL-LF2 после трансфекции плазмидой, содержащей GMD, и подтверждают, что дефект в мРНК GMD был причиной низкого уровня фукозилирования на клетках ITL-LF2. Причина существования двух субпопуляций клеток ITL-LF2, трансфицированных GMD, которые имеют различные уровни фукозилирования, может вытекать из жесткости селекции пуромицином. Предполагается, что как низко фукозилированные, так и высоко фукозилированные субпопуляции экспрессируют пуро-мицин N-ацетилтрансферазу (РАС) в достаточном количестве для выживания в условиях селекции пуро-мицином, но может не быть прямой корреляции между экспрессией РАС и GMD. Следовательно, две субпопуляции экспрессируют различные уровни белка GMD, что в результате приводит к различным уровням фукозилирования.
Пример 5. Анализ клеток ITL-LF2 после стабильной и транзиторной трансфекции.
Стабильная трансфекция клеток ITL-LF и CHO-S.
Клетки ITL-LF2 и CHO-S трансфицировали с использованием линейной плазмиды, содержащей последовательность, кодирующую анти-EGFR mAb (PGL3 anti EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR Tandem) в трех повторах (фиг. 27), используя реактив липофектамин.
Клетки ITL-LF2 восстанавливали в течение трех дней в 50% С6614 (Sigma) и 50% C6366 (Sigma),
дополненной 13,6 мг/л гипоксантина/3,9 мг/л тимидина (НТ) и 10 мкг/мл фукозы. Затем трансфицированные клетки подвергали селекции в 50% С6614 (Sigma) и 50% C6366 (Sigma), дополненной 10 мкг/мл фукозы и 5-10 мкг/мл пуромицина. Через восемь дней клетки переносили в среду С6614 с 10 мкг/мл фукозы и 25 мкг/мл пуромицина. После полного восстановления трансфицированные пулы ITL-LF2 объединяли для получения объединенного пула трансфицированных клеток с низким содержанием фукозы. Фукозу удаляли из среды и в дальнейшем клетки переносили в среду ProCHO5, содержащую 10 мкг/мл пуромицина.
Клетки CHO-S восстанавливали в течение трех дней в среде ProCHO5 (Sigma), дополненной 27,2 мг/л гипоксантина/7,8 мг/л тимидина (НТ) и 10 мкг/мл фукозы. Затем трансфицированные клетки подвергали селекции в среде ProCHO5, дополненной 10 мкг/мл фукозы и 25 мкг/мл пуромицина. Через 12 дней клетки CHO-S были полностью восстановлены.
Было обнаружено, что экспрессия рекомбинантного антитела, проанализированная с помощью ELISA, только слегка ниже в клетках ITL-LF2 по сравнению с трансфицированными клетками CHO-S
(фиг. 28).
FACS анализ уровня фукозы на мембране клеток, трансфицированных анти-EGFR mAb.
Анализ уровней фукозы на клеточной мембране клеток, трансфицированных анти-EGFR mAb, репродуцированных в среде С6614, до и после удаления фукозы показал, что при удалении фукозы фуко-зилирование снижается до исходного низкого уровня, полученного в отсутствии фукозы (фиг. 29).
FACS анализ уровня сиаловых кислот на мембране клеток, трансфицированных анти-EGFR mAb.
Этот анализ показал, что после трансфекции и после мечения клеток лектином, специфичным в отношении сиаловых кислот: MAA, конъюгированным с FITC, и клетки CHO-S, и клетки ITL-LF2, трансфицированные анти-EGFR, представляют сходные уровни сиаловых кислот на своей клеточной мембране. Эти уровни также являются сходными с уровнями нетрансфицированных клеток CHO-S и ITL-LF2
(фиг. 30).
Конструирование pTT5-anti EGFR mAb векторов для транвиторной трансфекции.
Для транзиторных трансфектантов анти-EFGR mAb в клетках ITL-LF2 было сконструировано два вектора на основе вектора рТТ5. Один вектор содержал легкую ^rn> (LC), а другой - тяжелую цепь (НС) антитела EFGR mAb.
Для получения вектора MB-127 был получен фрагмент ПЦР из 1476 пар нуклеотидов, содержащий НС EFGR mAb, с использованием праймеров 690-36 & 691-38 на векторе PGL3 с тандемом анти EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR- 872. Этот фрагмент расщепляли HindIII и NotI и лигировали в векторе рТТ5, который был расщеплен теми же рестриктазами. Полученный в результате вектор можно увидеть на фиг.
31А.
Для получения вектора MB-128 был получен ПЦР фрагмент 762 пары нуклеотидов, содержащий EFGR mAb LC, с использованием праймеров 692-36 и 693-32 на векторе PGL3 anti EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR Tandem - 872. Этот фрагмент расщепляли HindIII и NotI и лигировали в векторе рТТ5, который был расщеплен теми же рестриктазами. Полученный в результате вектор можно увидеть на фиг. 31В.
Транзиторные трансфектанты клеток ITL-LF и CHO-S.
Клетки ITL-LF2 и CHO-S трансфицировали с использованием вектора РТТ5, содержащего анти-EGFR mAb (фиг. 30В), используя реактив PEI, в трех повторах. Затем выполняли два протокола транс-фекции.
Трансфекция в ProCHO5.
Клетки CHO-S и ITL-LF2 трансфицировали в среде, содержащей ProCHO5, при 37°С и через 24 ч после трансфекции клетки CHO-S дополняли вальпроевой кислотой и инкубировали при 31°С. Концентрация белка в клетках ITL-LF2 и CHO-S в указанных выше условиях составляла 12,5 и 25 мкг/мл соответственно (фиг. 32).
Пример 6. Анализ рекомбинантных антител.
Анализ уровней фукозы и сиаловых кислот на неочищенном продукте или антителах, очищенных с помощью FACS.
Неочищенный или очищенный продукт, содержащий антитела, связывали с магнитными бусами с белком G с последующим окрашиванием флуоресцентно меченным специфичным лектином (как показано на фиг. 33). Образцы антител анализировали с помощью FACS для определения уровней остатков сахаров.
Анализ уровня фукозы на неочищенном продукте из транзиторно трансфицированных клеток с помощью FACS.
Образцы неочищенного продукта в результате транзиторной трансфекции концентрировали с помощью центробежного фильтра (Amicon ultra cat# UFC801024) для достижения концентрации свыше 25 мкг/мл. Анализы проводили, как указано в разделе "Методы", при концентрации белкового продукта 3237 мкг/мл. Результаты четко показывают, что трансфицированные клетки ITL-LF2 экспрессируют белок анти-EGFR mAb с низкими уровнями фукозы (фиг. 33) аналогичными таковым из стабильно трансфици-рованных клеток (фиг. 37) и в корреляции с уровнями, обнаруженными на клеточной мембране (фиг. 29).
Анализ уровня фукозы на неочищенном продукте из стабильных пулов с помощью FACS.
Собирали образцы неочищенного продукта, полученного из периодической клеточной культуры. Анализы проводили с помощью FACS, как описано в разделе "Методы", при концентрации белка 25 мкг/мл. Результаты четко показывают, что трансфицированные клетки ITL-LF2 экспрессируют белок анти-EGRF mAb с низкими уровнями фукозы (фиг. 35), аналогичными таковым, из транзиторно транс-фицированных клеток (фиг. 34) и в корреляции с уровнями, определяемыми на клеточной мембране
(фиг. 29).
Анализ уровня сиаловых кислот на неочищенном продукте стабильных пулов с помощью FACS.
Собирали образцы неочищенного продукта, полученного из периодической клеточной культуры. Анализы проводили с помощью FACS, как описано в разделе "Методы", при концентрации белка 25 мкг/мл. Результаты четко показывают, что трансфицированные клетки ITL-LF2 и CHO-S экспрессируют белок анти-EGFR mAb с аналогичными уровнями сиаловых кислот (фиг. 36) в корреляции с уровнями, обнаруженными на клеточной мембране (фиг. 30).
Анализ уровня фукозы на очищенном продукте с помощью FACS.
FACS анализ очищенного продукта анти-EGFR mAb из стабильно трансфицированных клеток ITL-LF2 показал низкие уровни фукозы, тогда как очищенный продукт из родительских клеток CHO-S содержал нормальные уровни фукозы (фиг. 37). Уровни фукозы находятся в корреляции с уровнями, определяемыми на клеточной мембране (фиг. 29) и в неочищенном продукте (фиг. 34).
FACS анализ уровня сиаловых кислот на очищенном продукте.
FACS анализ очищенного продукта анти-EGFR mAb из стабильно трансфицированных клеток показал аналогичные уровни сиаловых кислот на продукте как из клеток ITL-LF2, так и клеток CHO-S (фиг. 38). Уровни сиаловых кислот находятся в корреляции с уровнями, определенными на клеточной мембране (фиг. 30) и в неочищенном продукте (фиг. 36).
Определение уровней фукозы на интактном анти-EGFR mAb с помощью Octet.
Очищенную фракцию интактного анти-EGFR mAb, элюированную с колонки с белком А, диализи-ровали против буферной смеси и концентрировали. Уровень фукозы на интактном очищенном анти-EGFR mAb, продуцированном либо клетками CHO-S дикого типа, либо клетками ITL-LF2, определяли путем связывания анти-EGFR mAb с биотинилированным лектином алеврии оранжевой (aleuria aurantia) (AAL). Этот анализ проводили на системе Octet QK, используя модуль кинетического анализа. Сначала биотинилированный-AAL был связан с биосенсером, покрытым стрептавидином, а затем фукоза на антителе против EGFR связывалась с лектином AAL. Анализ интактного анти-EGFR mAb дает возможноть определить только остатки фукозилирования Fab, поскольку сайт фукозилирования (ASN 297), расположенный в Fc-области, не доступен для AAL (данные не показаны). Для определения сайта фукозилирования в Fc-области должен быть получен Fc-мономер.
Эти результаты демонстрируют низкие уровни фукозы на интактном анти-EGFR mAb, продуцируемом клетками ITL-LF2, по сравнению с продуктом, продуцируемым трансфицированными клетками
CHO-S (фиг. 39).
Определение уровней сиаловых кислот на интактном анти-EGFR mAb с помощью Octet.
Анти-EGFR mAb, продуцированное либо клетками CHO-S дикого типа (WT), либо клетками ITL-LF2, оценивали на уровни сиалирования. Очищенную фракцию интактного анти-EGFR mAb, элюиро-ванную с колонки с белком А, диализировали против буферной смеси и концентрировали. Уровни сиа-ловой кислоты на интактном очищенном анти-EGFR mAb определяли путем связывания этого продукта с биотинилированным лектином маакии амурской (Maackia amurensis) (MAA). Этот анализ проводили на системе Octet QK, используя модуль кинетического анализа. Сначала биотинилированный-MAA связывался с биосенсером, покрытым стрептавидином, а затем сиаловые кислоты на анти-EGFR mAb связывались с лектином MAA. Результаты (фиг. 40) показали, что уровни сиаловых кислот являются сходными на обоих продуктах, продуцированных клетками ITL-LF2 и CHO-S. Эти результаты означают, что единственным различием в продукте, продуцированном клетками ITL-LF2 и CHO-S, является уровень фуко-зы, тогда как весь профиль гликозилирования возможно не изменился.
Определение уровней фукозы на Fc мономере анти-EGFR с помощью Octet.
Fc-фракции анти-EGFR получали путем расщепления папаином интактного антитела, затем восстановлением и алкилированием с последующими стадиями диализа и концентрирования. Фракции Fc-мономера получали из продукта, продуцированного клетками CHO-S дикого типа, клетками ITL-LF2. Уровни фукозы на Fc-мономере определяли путем связывания этих фракций с биотинилированным-AAL, который предварительно был присоединен к биосенсорам системы Octet QK, покрытым стрептави-дином. Результаты демонстрируют низкий уровень фукозы на Fc-мономере анти-EGFR из клеток ITL-LF2 по сравнению с продуктом, продуцированным клетками CHO-S (фиг. 41).
Определение уровней сиаловых кислот на Fc-мономере анти-EGFR с помощью Octet.
Fc-фракции анти-EGFR mAb получали путем расщепления папаином интактного антитела, затем восстановления и алкилирования с последующим диализом и концентрированием. Диализованные и концентрированные фракции Fc-мономера получали из продукта, продуцированного клетками CHO-S дикого типа, клетками ITL-LF2. Уровень фукозы на Fc-мономере определяли путем связывания этих
фракций с биотинилированным-MAA, который предварительно был присоединен к биосенсорам системы Octet QK, покрытых стрептавидином. Результаты показывают сходные уровни сиалилирования на Fc-фракции, очищенной как из клеток CHO-S, так и клеток ITL-LF2 (фиг. 42).
Капиллярное изоэлектрофокусирование очищенного продукта из анти-EGFR пулов.
Продукт анти-EGFR mAb, продуцированный клетками CHO-S дикого типа или клетками ITL-LF2, очищали на колонке с белком А, диализировали против буферной смеси и концентрировали. Профиль заряда интактных продуктов анализировали с помощью капиллярного электрофореза на iCE 280. На фиг. 43 показано сравнение между величинами pI очищенных продуктов из клеток CHO-S, клеток ITL-LF2. Эти результаты демонстрируют, что профили заряда продукта, продуцированного клетками CHO-S и ITL-LF2, являются сходными, в то время как эталонный образец, по-видимому, является несколько более щелочным по сравнению с ними, вероятно, вследствие различия в клеточных линиях и условиях культивирования.
Масс-спектрометрический анализ Fc-фракций анти-EGFR.
Очищенное интактное анти-EGFR mAb расщепляли папаином для получения фракций Fc и Fab, затем Fc-фракцию очищали с последующим диализом и концентрированием. Образцы Fc анти-EGFR из клеток CHO-S дикого типа и клеток ITL-LF2 анализировали в EMD Serono Research Center (Billerica, USA) с помощью масс-спектрометрии для оценки уровня фукозилирования в сайте гликозилирования в консервативной Fc-области. Полученные структуры гликана главным образом были биантенарными с 0, 1 и 2 галактозами G0-F, G1-F и G2-F соответственно, как описано на фиг. 44. Уровень галактозы является более высоким в продукте, полученном из клеток CHO-S, как показано более высокой фракцией с одним и, большей частью, двумя остатками галактозы. Результаты показывают, что Fc-область IgG продукта, продуцированного клетками CHO-S дикого типа, была полностью фукозилирована, тогда как Fc-область продукта, продуцированного клетками ITL-LF2, была нефукозилирована.
Пример 7. Влияние добавления экзогенной фукозы на уровень фукозилирования клеток ITL-LF2, трансфицированных анти-EGFR mAb.
Клетки ITL-LF2, трансфицированные анти-EGFR mAb, высевали в среду ProCHO5 в присутствии повышающихся концентраций L-фукозы в культуральной среде. Эти клетки так же, как и неочищенный продукт, анализировали через 4 дня после высевания клеток. Результаты FACS анализа показывают корреляцию между концентрацией экзогенно добавленной фукозы и уровнем фукозилирования на клеточной мембране (фиг. 45), а также на рекомбинантном анти-EGFR mAb (фиг. 46). Максимальное фукози-лирование получали при концентрации 10 мкг/мл фукозы как на клетках, так и на рекомбинантном анти-EGFR mAb. Наиболее низкие уровни фукозилирования были определены на клетках при концентрации 1 мкг/мл внешней фукозы, тогда как на рекомбинантном анти-EGFR mAb наиболее низкий уровень фуко-зилирования определяли при более высокой концентрации 2,5 мкг/мл внешней фукозы.
На основе представленных выше результатов была построена калибровочная кривая, где максимум флуоресценции интерпретировали как 100% фукозилирование, и образец, полученный без фукозы, определяли как 0% фукозилирование. Уровень флуоресценции при 0% внешней фукозы вычитали из уровня флуоресценции, полученного при каждой концентрации внешней фукозы, а затем процент фукозилиро-вания вычисляли как уровень флуоресценции при каждой концентрации фукозы, разделенный на уровень флуоресценции при 100% фукозилировании (насыщение фукозой). Кривая была получена из этих цифр (фиг. 47).
Калибровочная кривая фукозилированного и нефукозилированного Fc-мономера анти-EGFR mAb на основании результатов Octet QK.
Fc фракции анти-EGFR получали путем расщепления папаином интактного антитела с последующим восстановлением, алкилированием, диализом и концентрированием. Фракции Fc-мономера получали из продукта, продуцированного клетками CHO-S дикого типа и клетками ITL-LF2. Образцы для калибровки получали путем перемешивания различных соотношений продукта из клеток CHO-S (пул 100% фукоза) и продукта из клеток ITL-LF2 (0% фукоза). Уровни фукозы на каждом образце определяли путем связывания смешанного образца с биотинилированным-AAL, который предварительно был присоединен к биосенсорам системы Octet QK, покрытых стрептавидином. Ассоциативную стадию кинетического анализа проводили с помощью системы Octet QK. Каждая кривая соответствует конкретному % фукозы в образце (фиг. 48А). Линейная корреляция между уровнем связывания и % фукозилированного продукта на калибровочной кривой (фиг. 48В) может служить для вычисления уровня фукозилирования требуемых образцов. Результаты показывают, что этот анализ является чувствительным и может разграничивать с высоким разрешением близкие уровни фукозы. Линейная корреляция между уровнем связывания и % фукозилированного продукта означает, что требуемый процент фукозилирования может быть получен путем добавления определенной концентрации экзогенной фукозы.
Анализ частично фукозилированных фракций Fc-мономера анти-EGFR с помощью Octet.
Вслед за результатами FACS анализа, который показывает корреляцию между экзогенно добавленной концентрацией фукозы и уровнем фукозилирования на клеточной мембране, уровни фукозы на очищенном анти-EGFR mAb определяли с помощью системы Octet. Клетки ITL-LF2, экспрессирующие анти-EGFR х mAb, культивировали в 5 парраллельны партиях в течение 4 дней в присутствии 3,5 мкг/мл
фукозы, и среду собирали. Анти-EGFR mAb очищали и расщепляли папаином с последующим восстановлением и алкилированием для выделения фракции Fc-мономера. Уровень фукозы анализировали, как описано выше. Результаты демонстрируют, что добавление 3,5 мкг/мл фукозы к среде дает ~ 15% уровень фукозилирования с вариабельностью +/-0,5% в белке, очищенном из пяти различных групп (фиг. 49). Это указывает на то, что желаемый уровень фукозы является воспроизводимым.
Анализ частично фукозилированных фракций Fc-мономера анти-EGFR путем масс-спектрометрии.
Уровень фукозилирования на фракциях мономера анти-EGFR mAb анализировали путем масс-спектрометрии. Клетки ITL-LF2, экспрессирующие анти-EGFR mAb, культивировали параллельно в 5 партиях в течение 4 дней в присутствии 3,5 мкг/мл фукозы, и среду собирали. Анти-EGFR mAb очищали и расщепляли папаином с последующим восстановлением и алкилированием для выделения фракции Fc-мономера, как описано выше.
Наблюдаемые структуры гликана главным образом были биантенарными с 0, 1 и 2 остатками галактозы G0-F, G1-F и G2-F соответственно, как описано в табл. 8, представленной ниже. Уровень галактозы выше в продукте, полученном из CHO-S, на что указывает более высокая фракция одного и преимущественно двух остатков галактозы. Эти результаты демонстрируют, что добавление к среде 3,5 мкг/мл фуко-зы индуцирует 15,6% уровень фукозилирования с вариабельностью +/- 1,7% в белке из пяти различных групп. Эти результаты коррелируют с результатами, полученными с помощью системы Octet (фиг. 49). Эти результаты показывают, что Fc-область IgG продукта, продуцированного клетками CHO-S дикого типа, была полностью фукозилирована, тогда как Fc-область продукта, продуцированного клетками ITL-LF2, была нефукозилирована. Очень хорошая корреляция была обнаружена между результатами Octet и результатами масс-спектрометрии в отношении уровней фукозилирования.
Возможная масса
гликана
Предполагаемая структура
S3-
Неизвестно
Уровень фукозилирования
CHO-S (WT)
ITL-LF2 (3.5F/1)
ITL-LF2 (3.5F/2)
ITL-LF2 (3.5F/3)
ITL-LF2 (3.5F/5)
GluNac
; Фукоза- ^ ; Галактоза- Q
Выводы и обсуждение
В последнее время было разработано несколько подходов для уменьшения уровней фукозилирования рекомбинантных антител для получения усиленной ADCC. В этой работе было успешно выполнено создание клеточной линии ITL-LF2 из клеток CHO-S путем инкубирования клеток в присутствии метот-рексата с последующим эффективным отбором клеток с наиболее низкими уровнями фукозы, то есть нулевым уровнем фукозы на клеточной мембране. Мутации и амплификация гена, образованные посредством инкубирования клеток в присутствии метотрексата (МТХ), ранее были описаны в литературе (Schimke 1988: Coquelle, Pipiras et al., 1997: Singer, Mesner et al., 2000).
После обработки МТХ мутаген удаляли для следующих стадий отбора. Этот отбор проводили либо путем выделения на магнитных бусах (фиг. 7) и/или с помощью FACS сортинга (фиг. 12), используя специфичный к фукозе лектин алеврии оранжевой (AAL), который имеет высокую аффинность в отношении остатка aFuc1-6GlcNA в сайте гликозилироания Fc. Хотя отбор клеток, экспрессирующих нулевое содержание фукозы, проводили в соответствии с уровнями фукозы на клеточной мембране, нулевые уровни фукозы были обнаружены на рекомбинантном антителе (анти-EGFR mAb), экспрессированном в этих клетках, с помощью целого ряда аналитических способов (фиг. 34-43). Анти-EGFR mAb, которое служило в качестве модельного антитела, представляет два сайта N-гликозилирования, один на Fab-фрагменте, а другой, который является важным для ADCC активности, на СН2 Fc. Анализы Octet и MS проводили не только на интактном mAb, а также на Fc-мономере с остатками фукозы, имеющими отношение к ADCC. Эти результаты показывают нулевые уровни фукозы на релевантном ADCC остатке фукозы из продукта, продуцированного клетками ITL-LF2. Было обнаружено, что фенотип клеток ITL-LF2 с нулевой фукозой является стабильным на протяжении 370 протестированных PDL (фиг. 15). Развитие клеток, экспрессирующих рекомбинантные белки, и продукция в биореакторах обычно завершается в пределах ~200 PDL клеток. Продолжительность эксперимента по стабильности нулевого уровня фукозы (370 PDL) дольше этого, поэтому ожидается, что ITL-LF2 будут оставаться стабильными на протяжении всего развития клона и процесса продуцирования. Было обнаружено, что большинство характеристик клеточной линии ITL-LF2 сходны с CHO-S, как можно сделать вывод из приведенной ниже табл. 8. Скорость роста, максимальная клеточная концентрация, уровень сиаловых кислот клеточных белков и рекомбинантного антитела, экспрессированного в этих клетках, и уровень экспрессии анти-EGFR mAb, были очень похожи. Кроме того, клетки ITL-LF2 превосходили клетки CHO-S по жизнеспособности и, как результат, в
суммарной концентрации жизнеспособных клеток (IVCC), определенной в периодическом процессе. Этот феномен мог быть результатом процесса строгого отбора, что клетки подвергались циклам отбора на низкое содержание фукозы на клеточной мембране.
Стабильную трансфекцию проводили с высокой эффективностью в отношении клеток ITL-LF2 в присутствии экзогенной фукозы. Кроме того, восстановление клеток ITL-LF2 после трансфекции было быстрее, чем клеток CHO-S, хотя в отсутствии экзогенной фукозы трансфицированные клетки вряд ли могли быть восстановлены (данные не показаны). Эти сведения означают, что фукоза играет важную роль в восстановлении после трансфекции и на стадиях отбора. Транзиторная трансфекция с использованием анти-EGFR mAb также была успешной примерно с 65-75% продуктивностью, полученной в CHO-S.
В приведенной ниже табл. 9 представлено краткое описание характеристик клеток ITL-LF2.
Помимо того, что было обнаружено, что уровень фукозы в клетках ITL-LF2 явлется нулевым и стабильным, было обнаружено, что уровень фукозилирования на клетках (фиг. 18 и 45) и рекомбинантном белке (фиг. 46-47 и 49) зависит от добавления экзогенной фукозы дозозависимым образом. Кроме того, при экзогенном добавлении определенной концентрации фукозы полученный в результате уровень фуко-зилирования рекомбинантного антитела в различных образцах был воспроизводимым (фиг. 49 и табл. 8). Каскад реакций фукозилирования (фиг. 20) показывает, что ветви как de novo, так и реутилизационного пути могу приводить к образованию GDP-фукозы. Поскольку клетки ITL-LF2 были отобраны в соответствии с фенотипом нулевой фукозы, было интересным раскрыть генетический источник для такой характеристики. Добавление экзогенной фукозы в результате приводило к восстановлению уровня фукозили-рования белков на клеточной мембране (фиг. 18). Эти сведения означают, что реутилизационный путь является активным (фиг. 20). ОТ-ПЦР и секвенирование некоторых важных фекрментов для de novo и реутилизационного пути показали, что мРНК фукозилтрансферазы 8 (Fut8) в клетках ITL-LF2 и CHO-S были идентичными как по размеру (фиг. 21), так и по последовательности (данные не показаны). Эти данные отличают клетки ITL-LF2 от Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd, разрушавших обе аллели FUT8 в клеточной линии CHO DG44 яичников китайского хомячка путем последовательной гомологичной рекомбинации (Yamane-Ohnuki, Kinoshita et al., 2004; Kanda, Satoh et al., 2005).
Аналогично с Fut8 размер мРНК и последовательность GDP-кето-6-дезоксиманноза 3,5-эпимеразы, 4-редуктазы (FX) (фиг. 21), вовлеченных в каскад реакций de novo, не были изменены в клетках ITL-LF2. С другой стороны, размер мРНК GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD) в клетках ITL-LF2 был короче, чем в клетках CHO-S (фиг. 20), и последовательность показала два варианта сплайсинга. Молекулы мРНК, экстрагированные из клеток, лишены либо третьего и четвертого, либо восьмого и девятого экзо-нов (фиг. 21 А, В и 22А, В). Установление различий между делециями не может быть определено на геле, поскольку размеры делеций являются сходными (фиг. 21 и 23В). Однако только короткие варианты GMD (а не полноразмерный) могли быть определены на геле (фиг. 21). Механизм, посредством которого субпопуляция, которую инкубировали с мутагеном, экспрессирует различные варианты сплайсинга, а не
полноразмерную мРНК, является неясным, но, возможно, что изменения не существуют в первоначальной популяции CHO-S, поскольку клетки с низким содержанием фукозы не были отобраны без МТХ. Эти результаты являются очень интересными, принимая во внимание, что отбор проводили фенотипиче-ски.
Анализ Q-ПЦР показал, что все протестированные гены вовлечены в каскад фукозилирования и экспрессируют сходные уровни мРНК (фиг. 24). Эти результаты дают возможность предположить, что нулевые уровни фукозы, полученные в клетках ITL-LF2, получены в результате либо инактивации белка GMD, экспрессированного из различных вариантов сплайсинга, либо в результате низких уровней или полного отсутствия белка GMD.
Подход, заключающийся в отборе различных фенотипов, был использован другой исследовательской группой для получения мутантов, резистентных к лектину, в клетках CHO (LEC 13) (Ripka и Stanley 1986). В этом подходе клетки инкубировали с токсичным лектином гороха, специфичным к фукозе, и было обнаружено, что резистентные клетки экспрессируют IgG1 человека, которые были лишены фуко-зы, присоединенной к Asn (297)-связанному углеводу (Shields, Lai et al., 2002). Дальнейшая исследовательская работа показала, что уровни фукозы в этих клетках повышались после сравнительно короткого промежутка времени, указывая на то, что фенотип с низким содержанием фукозы не был стабильным, и в некоторой степени активный белок GDP-фукоза был синтезирован в каскаде метаболических реакций de novo (Kanda, Yamane-Ohnuki et al., 2006). В другом недавнем документе Kanda с коллегами (Kanda, Imai-Nishiya et al., 2007) показали с помощью ОТ-ПЦР анализа, что LEC13 экспрессирует мРНК того же размера, что и мРНК, экспрессированная в CHO DG44. Клетки ITL-LF2, как было указано ранее, представляют стабильный фенотип нулевой фукозы, возможно, благодаря полному отсутствию активной формы GMD (фиг. 21). Генотипический анализ CHO-SM (Kanda, Imai-Nishiya et al., 2007), представляющий собой другую клеточную линию, резистентную к лектину (агглютинин-LCA чечевицы обыкновенной (Lens culinaris)), с помощью ОТ-ПЦР секвенирования и саузерн-блоттинга показал, что эта клеточная линия экспрессирует мутантную мРНК GMD, которая лишена экзонов 5, 6 и 7, кодирующих домены ключевой активности (Somoza, Menon et al., 2000; Webb, Mulichak et al., 2004). Экзоны 3 и 4, а также эк-зоны 8 и 9 являются ключевыми для активности GMD, как было показано в клетках ITL-LF2. Следовательно, можно сделать вывод о том, что GMD профиль клеток ITL-LF2 отличается как от LEC13, так и от
CHO SM.
Клетки ITL-LF2 были получены в результате четырех последовательных циклов сортинга путем FACS селекции в каждом отборе фракции клеток, содержащей наименьшее количество фукозы (или отсутствие фукозы) (табл. 4). Первый отбор даже почти не приводил в результате к получению клеток с фенотипом с низким уровнем фукозы. Тем не менее, после второго отбора большинство клеток экспрес-сировало низкие уровни фукозы на клеточной мембране. Дополнительный (третий) отбор завершался получением гомогенной популяции, которая представляет только нулевые уровни фукозы. Четвертый отбор проводили только для того, чтобы подтвердить, что присутствуют только клетки, экспрессирую-щие только нулевой уровень фукозы (фиг. 12).
Клеточная линия ITL-LF2 была депонирована в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microoganisms) в институте Пастера в Париже под номером CNCM I-4449 28 февраля 2011 г.
Ссылки
ANOLIK, J. H., D. CAMPBELL, ET AL. (2003). "THE
RELATIONSHIP OF FCGAMMARIIIA GENOTYPE TO DEGREE OF В CELL DEPLETION BY RITUXIMAB IN THE TREATMENT OF SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS." ARTHRITIS RHEUM 48(2): 455-9.
CARTER, P. J. (2006). "POTENT ANTIBODY THERAPEUTICS BY DESIGN." NAT REV IMMUNOL 6(5): 343-57.
CARTRON, G., L. DACHEUX, ET AL. (2002). "THERAPEUTIC ACTIVITY OF HUMANIZED ANTI-CD20 MONOCLONAL ANTIBODY AND POLYMORPHISM IN IGG FC RECEPTOR FCGAMMARIIIA GENE." BLOOD 99(3): 754-8.
CLARK, M. R. (1997). "IGG EFFECTOR MECHANISMS." CHEM IMMUNOL 65: 88-110.
COQUELLE, A., E. PIPIRAS, ET AL. (1997). "EXPRESSION OF FRAGILE SITES TRIGGERS INTRACHROMOSOMAL MAMMALIAN GENE AMPLIFICATION AND SETS BOUNDARIES TO EARLY AMPLICONS." CELL 89(2): 215-25.
СОХ, К. M., J. D. STERLING, ET AL. (2006) ."GLYCAN OPTIMIZATION OF A HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY IN THE AQUATIC PLANT LEMNA MINOR." NAT BIOTECHNOL 24(12): 1591-7.
CROWE, J. S., V. S. HALL, ET AL. (1992). "HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY CAMPATH-1H: MYELOMA CELL EXPRESSION OF GENOMIC CONSTRUCTS, NUCLEOTIDE SEQUENCE OF CDNA CONSTRUCTS AND COMPARISON OF EFFECTOR MECHANISMS OF MYELOMA AND CHINESE HAMSTER OVARY CELL-DERIVED MATERIAL." CLIN EXP IMMUNOL 87(1): 105-10.
DALL'OZZO, S., S. TARTAS, ET AL. (2004) ."RITUXIMAB-DEPENDENT CYTOTOXICITY BY NATURAL KILLER CELLS: INFLUENCE OF FCGR3A POLYMORPHISM ON THE CONCENTRATION-EFFECT RELATIONSHIP." CANCER RES 64(13): 4664-9.
GENNARI, R., S. MENARD, ET AL. (2004). "PILOT STUDY OF THE MECHANISM OF ACTION OF PREOPERATIVE TRAS TUZUMAB IN PATIENTS WITH PRIMARY OPERABLE BREAST TUMORS OVEREXPRESSING HER2." CLIN CANCER RES 10(17): 5650-5.
HAMILTON, S. R., R. C. DAVIDSON, ET AL. (2006). "HUMANIZATION OF YEAST TO PRODUCE COMPLEX TERMINALLY SIALYLATED
GLYCOPROTEINS." SCIENCE 313(5792): 1441-3.
IDUSOGIE, E. E., L. G. PRESTA, ET AL. (2000). "MAPPING OF THE C1Q BINDING SITE ON RITUXAN, A CHIMERIC ANTIBODY WITH A HUMAN IGG1 FC." J IMMUNOL 164(8): 4178-84.
IDUSOGIE, E. E., P. Y. WONG, ET AL. (2001). "ENGINEERED ANTIBODIES WITH INCREASED ACTIVITY TO RECRUIT COMPLEMENT." J IMMUNOL 166(4): 2571-5.
IIDA, S., R. KUNI-KAMOCHI, ET AL. (2009)."TWO MECHANISMS OF THE ENHANCED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY (ADCC) EFFICACY OF NON-FUCOSYLATED THERAPEUTIC ANTIBODIES IN HUMAN BLOOD." BMC CANCER 9: 58.
IMAI-NISHIYA, H., K. MORI, ET AL. (2007). "DOUBLE KNOCKDOWN OF ALPHA1,6-FUCOSYLTRANSFERASE (FUT8) AND GDP-MANNOSE 4,6-DEHYDRATASE (GMD) IN ANTIBODY-PRODUCING CELLS: A NEW STRATEGY FOR GENERATING FULLY NON-FUCOSYLATED THERAPEUTIC ANTIBODIES WITH ENHANCED ADCC." BMC BIOTECHNOL 7: 84.
JEFFERIS, R. (2005). "GLYCOSYLATION OF RECOMBINANT ANTIBODY THERAPEUTICS." BIOTECHNOL PROG 21(1): 11-6.
JEFFERIS, R. (2007). "ANTIBODY THERAPEUTICS: ISOTYPE AND GLYCOFORM SELECTION." EXPERT OPIN BIOL THER 7(9): 1401-13.
JEFFERIS, R. (2009). "RECOMBINANT ANTIBODY THERAPEUTICS: THE IMPACT OF GLYCOSYLATION ON MECHANISMS OF ACTION." TRENDS PHARMACOL SCI 30(7): 356-62.
KANDA, Y., H. IMAI-NISHIYA, ET AL. (2007). "ESTABLISHMENT OF A GDP-MANNOSE 4,6-DEHYDRATASE (GMD) KNOCKOUT HOST CELL LINE: A NEW STRATEGY FOR GENERATING COMPLETELY NON-FUCOSYLATED RECOMBINANT THERAPEUTICS." J BIOTECHNOL 130(3): 300-10.
KANDA, Y., M. SATOH, ET AL. (2005). CELLS PRODUCING ANTIBODY COMPOSITIONS WITH INCREASED ANTIBODY DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXIC ACTIVITY. TOKYO, KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
KANDA, Y., N. YAMANE-OHNUKI, ET AL. (2006). "COMPARISON OF CELL LINES FOR STABLE PRODUCTION OF FUCOSE-NEGATIVE ANTIBODIES WITH ENHANCED ADCC." BIOTECHNOL BIOENG 94(4): 680-8.
LAZAR, G. A., W. DANG, ET AL. (2006). "ENGINEERED ANTIBODY FC VARIANTS WITH ENHANCED EFFECTOR FUNCTION." PROC NATL ACAD SCI USA 103(11): 4005-10.
LOUIS, E., Z. EL GHOUL, ET AL. (2004). "ASSOCIATION BETWEEN POLYMORPHISM IN IGG FC RECEPTOR IIIA CODING GENE AND BIOLOGICAL RESPONSE TO INFLIXIMAB IN CROHN'S DISEASE." ALIMENT PHARMACOL THER 19(5): 511-9.
MIESCHER, S., M. 0. SPYCHER, ET AL. (2004). "A SINGLE RECOMBINANT ANTI-RHD IGG PREVENTS RHD IMMUNIZATION: ASSOCIATION OF RHD-POSITIVE RED BLOOD CELL CLEARANCE RATE WITH POLYMORPHISMS IN THE FCGAMMARI IA AND FCGAMMAII IA GENES." BLOOD 103 (11) : 4028-35.
MORGAN, A., N. D. JONES, ET AL. (1995). "THE N-TERMINAL END OF THE CH2 DOMAIN OF CHIMERIC HUMAN IGG1 ANTI-HLA-DR IS NECESSARY FOR C1Q, FC GAMMA RI AND FC GAMMA RIII BINDING." IMMUNOLOGY 86(2): 319-24.
MOUTEL, S. AND F. PEREZ (2008). ""ANTIBODIES--EUROPE. ENGINEERING THE NEXT GENERATION OF ANTIBODIES"." BIOTECHNOL J 3(3): 298-300.
NECHANSKY, A., M. SCHUSTER, ET AL. (2007). "COMPENSATION OF ENDOGENOUS IGG MEDIATED INHIBITION OF ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY BY GLYCO-ENGINEERING OF THERAPEUTIC ANTIBODIES." MOL IMMUNOL 44(7): 1815-7.
NEZLIN, R. AND V. GHETIE (2004)."INTERACTIONS OF IMMUNOGLOBULINS OUTSIDE THE ANTIGEN-COMBINING SITE." ADV IMMUNOL 82: 155-215.
OGANESYAN, V., M. M. DAMSCHRODER, ET AL.
(2 008)."STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF A MUTATED, ADCC-ENHANCED HUMAN FC FRAGMENT." MOL IMMUNOL 45(7): 1872-82.
OHYAMA, C, P. L. SMITH, ET AL. (1998). "MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION OF GDP-D-MANNOSE-4,6-DEHYDRATASE, A KEY ENZYME FOR FUCOSE METABOLISM DEFECTIVE IN LEC13 CELLS." J BIOL CHEM 273 (23) : 14582-7 .
PRESTA, L. G. (2 008). "MOLECULAR ENGINEERING AND DESIGN OF THERAPEUTIC ANTIBODIES." CURR OPIN IMMUNOL 20(4): 460-70.
RAJU, T. S. (2008). "TERMINAL SUGARS OF FC GLYCANS INFLUENCE ANTIBODY EFFECTOR FUNCTIONS OF IGGS." CURR OPIN IMMUNOL 20(4): 471-8.
REICHERT, J. M. AND V. E. VALGE-ARCHER (2 007)."DEVELOPMENT
TRENDS FOR MONOCLONAL ANTIBODY CANCER THERAPEUTICS." NAT REV DRUG DISCOV 6(5): 349-56.
RIPKA, J. AND P. STANLEY (1986) . "LECTIN-RESISTANT CHO CELLS: SELECTION OF FOUR NEW PEA LECTIN-RESISTANT PHENOTYPES." SOMAT CELL MOL GENET 12(1): 51-62.
ROOPENIAN, D. C. AND S. AKILESH (2007). "FCRN: THE NEONATAL FC RECEPTOR COMES OF AGE." NAT REV IMMUNOL 7(9): 71525.
SALFELD, J. G. (2007) . "ISOTYPE SELECTION IN ANTIBODY ENGINEERING." NAT BIOTECHNOL 25(12): 1369-72.
SCHIMKE, R. T. (1988). "GENE AMPLIFICATION IN CULTURED CELLS." J BIOL CHEM 263(13): 5989-92.
SHIELDS, R. L., J. LAI, ET AL. (2002). "LACK OF FUCOSE ON HUMAN IGG1 N-LINKED OLIGOSACCHARIDE IMPROVES BINDING TO HUMAN FCGAMMA RIII AND ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR TOXICITY." J BIOL CHEM 277 (30) : 26733-40.
SHINKAWA, Т., К. NAKAMURA, ET AL. (2003)."THE ABSENCE OF FUCOSE BUT NOT THE PRESENCE OF GALACTOSE OR BISECTING N-ACETYLGLUCOSAMINE OF HUMAN IGG1 COMPLEX-TYPE OLIGOSACCHARIDES SHOWS THE CRITICAL ROLE OF ENHANCING ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY." J BIOL CHEM 278(5): 3466-73.
SINGER, M. J., L. D. MESNER, ET AL. (2000). "AMPLIFICATION OF THE HUMAN DIHYDROFOLATE REDUCTASE GENE VIA DOUBLE MINUTES IS INITIATED BY CHROMOSOME BREAKS." PROC NATL ACAD SCI USA 97 (14) : 7921-6.
SOMOZA, J. R., S. MENON, ET AL. (2000). "STRUCTURAL AND KINETIC ANALYSIS OF ESCHERICHIA COLI GDP-MANNOSE 4,6 DEHYDRATASE PROVIDES INSIGHTS INTO THE ENZYME'S CATALYTIC MECHANISM AND REGULATION BY GDP-FUCOSE." STRUCTURE 8(2): 12335.
STROHL, W. R. (2009). "OPTIMIZATION OF FC-MEDIATED EFFECTOR FUNCTIONS OF MONOCLONAL ANTIBODIES." CURR OPIN BIOTECHNOL 20(6): 685-91.
STROHL, W. R. (2009). THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES -PAST, PRESENT AND FUTURE. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES: FROM BENCH TO CLINIC. A. Z. N. Y. J. W. SONS: 4-50.
SULLIVAN, F. X., R. KUMAR, ET AL. (1998). "MOLECULAR CLONING OF HUMAN GDP-MANNOSE 4,б-DEHYDRATASE AND RECONSTITUTION OF GDP-FUCOSE BIOSYNTHESIS IN VITRO." J BIOL CHEM 273(14): 8193-202 .
TREON, S. P., M. HANSEN, ET AL. (2005). "POLYMORPHISMS IN
FCGAMMARIIIA (CD16) RECEPTOR EXPRESSION ARE ASSOCIATED WITH
CLINICAL RESPONSE TO RITUXIMAB IN WALDENSTROM'S
MACROGLOBULINEMIA." J CLIN ONCOL 23(3): 474-81.
UMANA, P., J. JEAN-MAI RE T, ET AL. (1999). "ENGINEERED GLYCOFORMS OF AN ANTINEUROBLASТОМА IGG1 WITH OPTIMIZED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXIC ACTIVITY." NAT BIOTECHNOL 17 (2) : 176-80.
VON HORSTEN, H. H., C. OGOREK, ET AL. "PRODUCTION OF NON-FUCOSYLATED ANTIBODIES BY CO-EXPRESSION OF HETEROLOGOUS GDP-6-DEOXY-D-LYXO-4-HEXULOSE REDUCTASE." GLYCOBIOLOGY 20(12): 160718 .
WEBB, N. A., A. M. MULICHAK, ET AL. (2004). "CRYSTAL STRUCTURE OF A TETRAMERIC GDP-D-MANNOSE 4,6-DEHYDRATASE FROM A BACTERIAL GDP-D-RHAMNOSE BIOSYNTHETIC PATHWAY." PROTEIN SCI 13(2): 529-39.
WENG, W. K. AND R. LEVY (2 003) . "TWO IMMUNOGLOBULIN G FRAGMENT С RECEPTOR POLYMORPHISMS INDEPENDENTLY PREDICT RESPONSE TO RITUXIMAB IN PATIENTS WITH FOLLICULAR LYMPHOMA." J CLIN ONCOL 21(21): 3940-7.
YAMANE-OHNUKI, N., S. KINOSHITA, ET AL. (2004). "ESTABLISHMENT OF FUT8 KNOCKOUT CHINESE HAMSTER OVARY CELLS: AN IDEAL HOST CELL LINE FOR PRODUCING COMPLETELY DEFUCOSYLATED ANTIBODIES WITH ENHANCED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY." BIOTECHNOL BIOENG 87(5): 614-22.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> MERCK SERONO S.A. HELMAN, DANIEL BAR-SHIMON, MEIRAV TOISTER-ACHITUV, MIRA
<12 0> КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ФУКОЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> P 11/028PCT
<150> 211583 <151> 2011-03-06
<150> 217216 <151> 2011-12-27
<160> 46
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<2 23> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 1
gtctgaattc aagcttgtag cgatcgccgc caccat
<210> <211>
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 2
ggatccgcgg ccgctacgcc gccctcagat ctttatca
36 ДНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 3
gcttgaattc aagcttctag tacgcgtgtt taaacc
<210> <211>
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 4
gcggccgctg tccgcgcctt actaacactc tc
18 ДНК
7 Л S~l TS1 -
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 5' FAM конъюгированный олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 3' BQ конъюгированный олигонуклеотид
<400> 5
atggctgagt ctctccga
<210> 6 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 6
ctggagcgct taaaacaaca aa 22
<210> <211> <212> <213>
23 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 7
ctgatcaata gggccttctg gta
<210> 8
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 5' FAM конъюгированный олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 3' BQ конъюгированный олигонуклеотид
<400> 8
caaagatgca gatctgac 18
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 9
gcttacccgg agaggaatgg 20
<210> <211> <212> <213>
10 20 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 10
gaacagggct tgggtttgtg 20
<210> 11
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 5' FAM конъюгированный олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 3' BQ конъюгированный олигонуклеотид
<400> 11
ctttgactta gcagagtaca
<210> <211> <212> <213>
12 19 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 12
gccctatgga gcagccaaa
<210> 13
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 13
aatgccgttc accgcaaa 18
<210> 14
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 5' FAM конъюгированный олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 3' BQ конъюгированный олигонуклеотид
<400> 14
cctgaatgtt gttgtcctt 19
<210> 15
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 15
tccacctcct caagggaaca c 21
<210> 16
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 16
ctcctccgtt gttccaatgt g 21
<210> <211> <212> <213>
17 18 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 5' FAM конъюгированный олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 3' BQ конъюгированный олигонуклеотид
<400> 17
ttctatgccc tgctcaca
<210> 18
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 18
ctgctgctca aacagaccac tt 22
<210> <211> <212> <213>
19 19 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 19
gtgccctcag ctccctctt 19
<210> 20
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 5' FAM конъюгированный олигонуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<223> 3' BQ конъюгированный олигонуклеотид
<400> 20
ttgggacgtc tcactgc 17
<210> 21
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 21
ctgctccctg gcaactccta 20
<210> <211> <212> <213>
22 23 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 22
aagtgggaag cataatgagc aaa 23
<210> 23
<211> 300
<212> БЕЛОК
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<223> Манноза 4,6-дегидратаза (GMD) - вариант сплайсинга 1
<400> 23
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
1 5 10 15
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
20 25 30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
35 40 45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
50 55 60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
65 70 75 80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
85 90 95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
100 105 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
115 120 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
130 135 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145 150 155 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
165 170 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
180 185 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
195 200 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
210 215 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225 230 235 240
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
245 250 255
Glu Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn
260 265 270
Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln
275 280 285
Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr Asn Pro Asn Ala
290 295 300
<210> 24 <211> 306 <212>
БЕЛОК
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<223> Манноза 4,6-дегидратаза (GMD) - вариант сплайсинга 2
<400> 24
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
1 5 10 15
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
20 25 30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
35 40 45
Glu Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Gly Val
50 55 60
Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu Ile Asn
65 70 75 80
Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val
85 90 95
Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro
100 105 110
Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn Phe Arg
115 120 125
Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu
130 135 140
Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser Arg Ser
145 150 155 160
Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu Gly Asn
165 170 175
Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Glu Ala
180 185 190
Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala
195 200 205
Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser Phe Met
210 215 220
His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn Glu Val
225 230 235 240
Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp Leu Lys
245 250 255
Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys Ser Lys
260 265 270
Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp Glu Leu
275 280 285
Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr Asn Pro
290 295 300
Asn Ala 305
<210> 25
<211> 372
<212> БЕЛОК
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<223> GDP-манноза 4,6-дегидратаза (полноразмерная GMD)
<400> 25
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
1 5 10 15
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
20 25 30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
35 40 45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
50 55 60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
65 70 75 80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
85 90 95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
100 105 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
115 120 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
130 135 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145 150 155 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
165 170 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
180 185 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
195 200 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
210 215 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225 230 235 240
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
245 250 255
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
260 265 270
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
275 280 285
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
290 295 300
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp
305 310 315 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
325 330 335
Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
340 345 350
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
355 360 365
Asn Pro Asn Ala
370
<210> 26 <211> 903
<212> ДНК
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<223> Манноза 4,6-дегидратаза (GMD) - вариант сплайсинга 1
<400> 26
atggctcacg ctcccgctag ctgcccgagc tccaggaact ctggggacgg cgataagggc 60
aagcccagga aggtggcgct catcacgggc atcaccggcc aggatggctc atacttggca 120
gaattcctgc tggagaaagg atacgaggtt catggaattg tacggcgatc cagttcattt 180
aatacaggtc gaattgaaca tttatataag aatccacagg ctcatattga aggaaacatg 240
aagttgcact atggtgacct caccgacagc acctgcctag taaaaatcat caatgaagtc 300
aaacctacag agatctacaa tcttggtgcc cagagccatg tcaagatttc ctttgactta 360
gcagagtaca ctgcagatgt tgatggagtt ggcaccttgc ggcttctgga tgcaattaag 420
acttgtggcc ttataaattc tgtgaagttc taccaggcct caactagtga actgtatgga 480
aaagtgcaag aaatacccca gaaagagacc acccctttct atccaaggtc gccctatgga 540
gcagccaaac tttatgccta ttggattgta gtgaactttc gagaggctta taatctcttt 600
gcggtgaacg gcattctctt caatcatgag agtcctagaa gaggagctaa ttttgttact 660
cgaaaaatta gccggtcagt agctaagatt taccttggac aactggaatg tttcagtttg
720
ggaaatctgg acgccaaacg agactggggc catgccaagg actatgtcga ggacttcctg
780
cagggagact gctccaaggc gcagcagaaa ctgaactgga agccccgcgt tgcctttgac
840
gagctggtga gggagatggt gcaagccgat gtggagctca tgagaaccaa ccccaacgcc
900
tga
903
<210> 27
<211> 921
<212> ДНК
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<223> Манноза 4,6-дегидратаза (GMD) - вариант сплайсинга 2
<400> 27
atggctcacg ctcccgctag ctgcccgagc tccaggaact ctggggacgg cgataagggc 60
aagcccagga aggtggcgct catcacgggc atcaccggcc aggatggctc atacttggca 120
gaattcctgc tggagaaagg atacgagatt tcctttgact tagcagagta cactgcagat 180
gttgatggag ttggcacctt gcggcttctg gatgcaatta agacttgtgg ccttataaat 240
tctgtgaagt tctaccaggc ctcaactagt gaactgtatg gaaaagtgca agaaataccc 300
cagaaagaga ccaccccttt ctatccaagg tcgccctatg gagcagccaa actttatgcc 360
tattggattg tagtgaactt tcgagaggct tataatctct ttgcggtgaa cggcattctc 420
ttcaatcatg agagtcctag aagaggagct aattttgtta ctcgaaaaat tagccggtca 480
gtagctaaga tttaccttgg acaactggaa tgtttcagtt tgggaaatct ggacgccaaa 540
cgagactggg gccatgccaa ggactatgtc gaggctatgt ggctgatgtt acaaaatgat 600
gaaccagagg actttgtcat agctactggg gaagttcata gtgtccgtga atttgttgag 660
aaatcattca tgcacattgg aaagaccatt gtgtgggaag gaaagaatga aaatgaagtg 720
ggcagatgta aagagaccgg caaaattcat gtgactgtgg atctgaaata ctaccgacca 780
actgaagtgg acttcctgca gggagactgc tccaaggcgc agcagaaact gaactggaag 840
ccccgcgttg cctttgacga gctggtgagg gagatggtgc aagccgatgt ggagctcatg 900
agaaccaacc ccaacgcctg a 921
<210> 28
<211> 1120
<212> ДНК
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> misc_feature
<223> GDP-манноза 4,6-дегидратаза (полноразмерная GMD)
<400> 28
atggctcacg ctcccgctag ctgcccgagc tccaggaact ctggggacgg cgataagggc 60
aagcccagga aggtggcgct catcacgggc atcaccggcc aggatggctc atacttggca 120
gaattcctgc tggagaaagg atacgaggtt catggaattg tacggcgatc cagttcattt 180
aatacaggtc gaattgaaca tttatataag aatccacagg ctcatattga aggaaacatg 240
aagttgcact atggtgacct caccgacagc acctgcctag taaaaatcat caatgaagtc 300
aaacctacag agatctacaa tcttggtgcc cagagccatg tcaagatttc ctttgactta 360
gcagagtaca ctgcagatgt tgatggagtt ggcaccttgc ggcttctgga tgcaattaag 420
acttgtggcc ttataaattc tgtgaagttc taccaggcct caactagtga actgtatgga 480
aaagtgcaag aaatacccca gaaagagacc acccctttct atccaaggtc gccctatgga 540
gcagccaaac tttatgccta ttggattgta gtgaactttc gagaggctta taatctcttt 600
gcggtgaacg gcattctctt caatcatgag agtcctagaa gaggagctaa ttttgttact 660
cgaaaaatta gccggtcagt agctaagatt taccttggac aactggaatg tttcagtttg 720
ggaaatctgg acgccaaacg agactggggc catgccaagg actatgtcga ggctatgtgg 780
ctgatgttac aaaatgatga accagaggac tttgtcatag ctactgggga agttcatagt 840
gtccgtgaat ttgttgagaa atcattcatg cacattggaa agaccattgt gtgggaagga 900
aagaatgaaa atgaagtggg cagatgtaaa gagaccggca aaattcatgt gactgtggat 960
ctgaaatact accgaccaac tgaagtggac ttcctgcagg gagactgctc caaggcgcag 1020
cagaaactga actggaagcc ccgcgttgcc tttgacgagc tggtgaggga gatggtgcaa 1080
gccgatgtgg agctcatgag aaccaacccc aacgcctgag 1120
<210> 29 <211> 575
<212> БЕЛОК
<213> Cricetulus griseus
<400> 29
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
20 25 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
50 55 60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
65 70 75 80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
85 90 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His
100 105 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
115 120 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145 150 155 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
165 170 175
Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
180 185 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
195 200 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
210 215 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225 230 235 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
245 250 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
260 265 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
275 280 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
290 295 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305 310 315 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
325 330 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Arg Glu Ile Glu Glu Thr Thr Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
355 360 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
370 375 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Glu Arg Arg Met Lys Val Asp
385 390 395 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
435 440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
450 455 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465 470 475 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
500 505 510
His Gln Pro Arg Thr Lys Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
515 520 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
530 535 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545 550 555 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
565 570 575
<210> 30
<211> 321
<212> БЕЛОК
<213> Cricetulus griseus
<400> 30
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
35 40 45
Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr
50 55 60
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn
85 90 95
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys
100 105 110
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
115 120 125
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
130 135 140
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
145 150 155 160
His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
165 170 175
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
180 185 190
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
195 200 205
Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
210 215 220
Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
225 230 235 240
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp
260 265 270
Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys
275 280 285
Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
290 295 300
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg
305 310 315 320
Lys
<210> 31 <211> 1728 <212> ДНК
<213> Cricetulus griseus
<400> 31
atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60
ttattgtttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga ccattctagc 120
agagaactct ccaagattct tgcaaagctg gagcgcttaa aacaacaaaa tgaagacttg 180
aggagaatgg ctgagtctct ccgaatacca gaaggcccta ttgatcaggg gacagctaca 240
ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300
aagaaacaag ctaggaatga tctgggaaag gatcatgaaa tcttaaggag gaggattgaa 360
aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagtgaat tgaagaaatt aaagaaatta 420
gaaggaaacg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acatcatgaa 480
aggtctatca tgacagatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg tgagtggcgg 540
gaaaaagaag ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataacata tctgcagaat 600
cccaaggact gcagcaaagc cagaaagctg gtatgtaata tcaacaaagg ctgtggctat 660
ggatgtcaac tccatcatgt ggtttactgc ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca 720
ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggag gatgggagac tgtgtttaga 780
cctgtaagtg agacatgcac agacaggtct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa 840
gtgaaggaca aaaatgttca agtggtcgag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgt 900
cctccttact tacccttggc tgtaccagaa gaccttgcag atcgactcct gagagtccat 960
ggtgatcctg cagtgtggtg ggtatcccag tttgtcaaat acttgatccg tccacaacct 1020
tggctggaaa gggaaataga agaaaccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt 1080
ggagtccatg tcagacgcac tgacaaagtg ggaacagaag cagccttcca tcccattgag 1140
gaatacatgg tacacgttga agaacatttt cagcttctcg aacgcagaat gaaagtggat 1200
aaaaaaagag tgtatctggc cactgatgac ccttctttgt taaaggaggc aaagacaaag 1260
tactccaatt atgaatttat tagtgataac tctatttctt ggtcagctgg actacacaac 1320
cgatacacag aaaattcact tcggggcgtg atcctggata tacactttct ctcccaggct 1380
gacttccttg tgtgtacttt ttcatcccag gtctgtaggg ttgcttatga aatcatgcaa 1440
acactgcatc ctgatgcctc tgcaaacttc cattctttag atgacatcta ctattttgga 1500
ggccaaaatg cccacaacca gattgcagtt tatcctcacc aacctcgaac taaagaggaa 1560
atccccatgg aacctggaga tatcattggt gtggctggaa accattggaa tggttactct 1620
aaaggtgtca acagaaaact aggaaaaaca ggcctgtacc cttcctacaa agtccgagag 1680
aagatagaaa cagtcaaata ccctacatat cctgaagctg aaaaatag 1728
<210> 32 <211> 966
<212> ДНК
<213> Cricetulus griseus
<400> 32
atgggtgagc cccagggatc caggaggatc ctagtgacag ggggctctgg actggtgggc 60
agagctatcc agaaggtggt cgcagatggc gctggcttac ccggagagga atgggtgttt 120
gtctcctcca aagatgcaga tctgacggat gcagcacaaa cccaagccct gttccagaag 180
gtacagccca cccatgtcat ccatcttgct gcaatggtag gaggcctttt ccggaatatc 240
aaatacaact tggatttctg gaggaagaat gtgcacatca atgacaacgt cctgcactca 300
gctttcgagg tgggcactcg caaggtggtc tcctgcctgt ccacctgtat cttccctgac 360
aagaccacct atcctattga tgaaacaatg atccacaatg gtccacccca cagcagcaat 420
tttgggtact cgtatgccaa gaggatgatt gacgtgcaga acagggccta cttccagcag 480
catggctgca ccttcactgc tgtcatccct accaatgtct ttggacctca tgacaacttc 540
aacattgaag atggccatgt gctgcctggc ctcatccata aggtgcatct ggccaagagt 600
aatggttcag ccttgactgt ttggggtaca gggaaaccac ggaggcagtt catctactca 660
ctggacctag cccggctctt catctgggtc ctgcgggagt acaatgaagt tgagcccatc 720
atcctctcag tgggcgagga agatgaagtc tccattaagg aggcagctga ggctgtagtg 780
gaggccatgg acttctgtgg ggaagtcact tttgattcaa caaagtcaga tgggcagtat 840
aagaagacag ccagcaatgg caagcttcgg gcctacttgc ctgatttccg tttcacaccc 900
ttcaagcagg ctgtgaagga gacctgtgcc tggttcaccg acaactatga gcaggcccgg 960
aagtga 966
<210> <211>
33 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 33
ataatgcggg catggactgg ttc
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
34 26 ДНК
Искусственная последовательность
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 34
atactatttt tcagcttcag gatatg
<210> <211>
35 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 35
ataatgggtg agccccaggg atc
<210> <211>
36 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 36
atatctagac aagggacagc agg
<210> 37 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид <400> 37
ataatggctc acgctcccgc tagctg 2 6
<210> <211> <212> <213>
38 22 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 38
atatcaggcg ttggggttgg tt
<210> 39
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 39
ataatggcgt ctctgcgcga agc 23
<210> 40
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 40
atattaagat ttctccgaat cag 23
<210> <211> <212> <213>
41 36 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 41
gtctgaattc aagcttgtag cgatcgccgc caccat
<210> 42
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 42
ggatccgcgg ccgctacgcc gccctcagat ctttatca 38
<210> 43
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 43
gcttgaattc aagcttctag tacgcgtgtt taaacc 36
<210> 44
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 44
gcggccgctg tccgcgcctt actaacactc tc 32
<210> <211> <212> <213>
45 45
ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 45
gtccgatatc atttaaatcg ccaccatggc tcacgctccc gctag
<210> 46
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Одноцепочечный ДНК олигонуклеотид
<400> 46
atccctcgag ttatcaggcg ttggggttgg ttc
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения клеток яичника китайского хомячка CHO-S с нулевым уровнем фукозы, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантного белка, включающий:
(a) обработку популяции клеток CHO-S метотрексатом (МТХ) в концентрации 100-200 нМ, который вызывает мутацию в гене GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD);
(b) обеспечение контактирования полученной популяции клеток CHO-S, содержащих мутантные клетки, с нетоксичным лектином в течение не более 60 мин, что позволяет осуществить связывание лек-тина с фукозной группой на клеточной мембране указанных клеток, причем за указанное время не про
(a)
исходит уничтожение клеток; и
(c) выделение субпопуляции клеток, которые связываются с лектином, таким образом отбирая клетки, применимые в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, где отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы в отсутствие экзогенной фукозы, причем в мутированной GMD отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзонами 3 и 4, или аминокислоты, кодируемые экзонами 8 и 9.
2. Способ по п.1, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc-белок.
3. Способ по п.1 или 2, где указанный лектин присоединен к детектируемой группе или аффинной группе.
4. Способ по п.3, в котором при присоединении лектина к аффинной группе дополнительно осуществляют контактирование указанной популяции клеток, содержащей мутантные клетки, с дополнительным агентом, такое дополнительное вещество содержит родственную связывающую группу для указанной аффинной группы.
5. Способ по п.4, где указанная аффинная группа содержит биотин.
6. Способ по п.4, где указанная родственная связывающая группа присоединена к детектируемой группе.
7. Способ по п.6, где указанная детектируемая группа содержит флуоресцентную группу или магнитную частицу.
8. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством FACS сортин-
га.
9. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством магнитного разделения.
10. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют по меньшей мере тремя циклами последовательного выделения.
11. Способ по любому из пп.1-4, где указанный лектин представляет собой лектин алеврии оранжевой (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL).
12. Выделенная клетка CHO-S, полученная способом по любому из предшествующих пунктов, где клетка является генетически модифицированной для экспрессии мутантной GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD), имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23 или 24.
13. Выделенная клетка CHO-S по п.12, где величина фукозилирования белка, экспрессированного в ней, линейно зависит от концентрации внешней фукозы, где концентрация внешней фукозы находится между 1 и 10 мкг/мл.
14. Выделенная клетка CHO-S по п.12 или 13, экспрессирующая фукозилтрансферазу-8 (Fut8) дикого типа.
15. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-14, экспрессирующая GDP-кето-6-
дезоксиманнозу 3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (FX) дикого типа.
16. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-15, экспрессирующая рекомбинантное антитело или Fc слитый белок.
17. Клеточная линия CHO-S, содержащая выделенную клетку, полученную способом по п.1.
18. Клеточная линия по п.17, которая образует популяцию клеток, у которой суммарная концентрация жизнеспособных клеток (IVCC) на 20% выше, чем у немутантных клеток CHO-S.
19. Клеточная линия по п.17 или 18, в которой время удвоения популяции не превышает 20 ч.
20. Клеточная линия по любому из пп.17-19, имеющая стабильный фукозный фенотип, по меньшей мере, на протяжении 370 удвоений популяции.
21. Клеточная линия CHO-S по п.20, депонированная в CNCM под номером I-4449.
22. Клеточная культура, которая содержит выделенную клетку CHO-S по п.12 и клеточную культу-ральную среду, лишенную животных примесей.
23. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда содержит фукозу.
24. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда не содержит фукозу.
25. Способ получения рекомбинантного белка, предусматривающий трансфекцию выделенной клетки CHO-S по п.12 полинуклеотидом, кодирующим рекомбинантный белок, культивирование транс-фицированной клетки CHO-S в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, и выделение указанного белка.
26. Способ по п.25, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc слитый белок.
27. Способ по п.25, где указанную трансфекцию проводят в присутствии экзогенной фукозы.
28. Способ по п.25, предусматривающий культивирование выделенной клетки CHO-S по п.12 в культуральной среде, содержащей фукозу, после указанной трансфекции.
16.
Мечение клеток биотинилированным AAL и отбор несвязанных на SA магнитных бусах - д цикла
Мечение клеток биотинилированным AAL и SA-PE и отбор клеток с наименьшей флуоресценцией посредством FACS
Мечение клеток биотинилированным AAL и SA-PE и отбор клеток с наименьшей флуоресценцией посредством FACS - четыре цикла
Анализ клеток
Трансфекция клеток модельными белками
Анализ клеток и рекомбинантных белков
Расщепление lgG1 на Fab и Fc папаином
Диализ и концентрирование интактного антитела (lgG1)
Очистка Fc-димера на колонке с Белком А
Восстановление и алкилирование для получения Fc-мономеров
Диализ и концентрирование Fc-мономеров
Фиг. 2
Инкубирование клеток CHO-S в МТХ М"мбра""ий к т ^юза
_ Олигосахарид дает незначительное число клеток с белок Олигосахарид
низкими уровнями фукозы
Стадия I: Обогащение клеточной
Мембранный А популяции "низкофукозилированными" Мембраннь
белок Щ- AAL/AOL
Олигосахарид
Магнитная бусинг Стрептавидин Биотин
Стадия II: Второе обогащение с
Фиг. 4
Фиг. 7А
"Нормально-фукозные" клетки
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Уровни удвоения популяции
Фиг. 10
Концентрация фукозы (мкг/мл)
100 ¦
80 ¦
$60 ¦
1 j40'
20 ¦
0 йГ
Дни
Фиг. 19В
Дни
Фиг. 19С
Дни Фиг. 19D
FutS
Fx GFPP
GMD
10.80.6-
evhgivrrsssfntgriehlyknpqahlegnm
Делеция экзона 8 и экзона 9 в SV1
1 lkyyrptevdflqgdcskaqqJclnwkprvafdelvreravqadvelmrtnpna
2 dnqgdcskaqqklnwkprvafdeivremvqadvelmrtnpna
valitgitgqdgsylaefllekgyevhgiv
mahapascpssrnsgdgdkgkprkvalitgitgqdgsylaefllekgye-
sfntgriehlyknpqahiegnm
Фиг. 22А, В
Фиг. 23А
4 О
Исходный уровень
анти-EGFR mAb из ITL-LF2
Время (сек)
Фиг. 39
анти-EGFR Fc-мономер из CHO-S
/ анти-EGFR Fc-мономер из ITL-LF2
/ Исходный уровень /
4,800
Время (сек)
Фиг. 41
Фиг. 43
Образец
Структура гликана
Относительная распространенность
Процент фукозилирования
CH0-S
дикого типа с нормальным содержанием фукозы
G0-F
25.5 %
100 %
•Vм1* G1-F
56.8 %
С*(r)^" G2-F
17.8 %
ITL-LF2 с низким содержанием фукозы
м*"" G0-F
45.9 %
\> - G1-F
49.0 %
cW*** G2-F
5.1 %
Фиг. 44
g- 10000
Концентрация фукозы ( мкг/мл)
Фиг. 46
Концентрация фукозы ( мкг/мл)
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032513
032513
- 8 -
- 9 -
032513
032513
- 22 -
- 22 -
032513
032513
- 22 -
- 22 -
032513
032513
- 22 -
- 22 -
032513
032513
Таблица 4
- 28 -
- 29 -
032513
Таблица 6
032513
Таблица 6
- 31 -
- 31 -
032513
Таблица 7
032513
Таблица 7
- 32 -
- 32 -
032513
032513
- 33 -
- 33 -
032513
032513
- 36 -
- 36 -
032513
032513
- 36 -
- 36 -
032513
032513
- 36 -
- 36 -
032513
032513
- 36 -
- 36 -
032513
032513
- 39 -
- 39 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 43 -
032513
032513
- 44 -
- 45 -
032513
032513
- 44 -
- 45 -
032513
032513
- 44 -
- 45 -
032513
032513
- 44 -
- 45 -
032513
032513
- 46 -
- 46 -
032513
032513
- 46 -
- 46 -
032513
032513
- 46 -
- 46 -
032513
032513
- 47 -
- 47 -
032513
032513
- 47 -
- 47 -
032513
032513
- 48 -
- 48 -
032513
032513
- 48 -
- 48 -
032513
032513
- 48 -
- 48 -
032513
032513
- 48 -
- 48 -
032513
032513
- 49 -
- 49 -
032513
032513
- 53 -
- 53 -
032513
032513
- 56 -
- 56 -
032513
032513
- 59 -
- 59 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 61 -
- 61 -
032513
032513
- 62 -
<220>
- 62 -
<220>
032513
032513
- 62 -
<220>
- 62 -
<220>
032513
032513
- 62 -
<220>
- 62 -
<220>
032513
032513
- 62 -
<220>
- 62 -
<220>
032513
032513
- 62 -
<220>
- 62 -
<220>
032513
032513
- 63 -
- 63 -
032513
032513
- 63 -
- 63 -
032513
032513
- 63 -
- 63 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 65 -
- 65 -
032513
032513
- 66 -
- 66 -
032513
- 68 -
- 67 -
032513
- 68 -
- 69 -
032513
- 68 -
- 69 -
032513
- 68 -
- 69 -
032513
032513
- 70 -
- 70 -
032513
032513
- 70 -
- 70 -
032513
032513
- 70 -
- 70 -
032513
032513
- 70 -
- 70 -
032513
032513
- 72 -
- 72 -
032513
032513
- 73 -
- 73 -
032513
032513
- 73 -
- 73 -