EA 32498B1 20190628

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032498b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ индукции CD8 Т-клеточного ответа на неоантиген у человека, включающий одно или более введений рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), где рекомбинантный MVA содержит промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, причем промотор Pr13.5 содержит 1 или 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая на 100% идентична SEQ ID NO:1.

2. Способ по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 нуклеотидов, которая на 100% идентична SEQ ID NO:1.

3. Способ по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит SEQ ID NO:2.

4. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) для индукции CD8 Т-клеточного ответа на неоантиген у человека, содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, в котором промотор Pr13.5 содержит 1 или 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая на 100% идентична SEQ ID NO:1.

5. Рекомбинантный MVA по п.4, в котором промотор Pr13.5 содержит 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 нуклеотидов, которая на 100% идентична SEQ ID NO:1.

6. Рекомбинантный MVA по п.4, в котором промотор Pr13.5 содержит SEQ ID NO:2.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

3. Способ по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит SEQ ID NO:2.

6. Рекомбинантный MVA по п.4, в котором промотор Pr13.5 содержит SEQ ID NO:2.

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
032498
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201590831
(22) Дата подачи заявки
2013.10.28
(51) Int. Cl.
C12N15/863 (2006.01) A61K39/00 (2006.01)
(54) ПРОМОТОР Pr13.5 ДЛЯ УСТОЙЧИВЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ И ГУМОРАЛЬНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ
(31) 61/719,429
(32) 2012.10.28
(33) US
(43) 2015.08.31
(86) PCT/EP2013/003239
(87) WO 2014/063832 2014.05.01
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАВАРИАН НОРДИК А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Штайгервальд Робин, Бринкманн Кай
(DE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) M. Wachsman ET AL.: "Antigen-presenting capacity of epidermal cells infected with vaccinia virus recombinants containing the herpes simplex virus glycoprotein D, and protective immunity", The Journal of general virology, 1 September 1989 (1989-09-01), pages 2513-2520, XP055095225, ENGLAND DOI: 10.1099/0022-1317-70-9-2513 Retrieved from the Internet: URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/255 0579 page 2514, lines 2-7
PERKUS M.E. ET AL.: "CLONING AND EXPRESSION OF FOREIGN GENES IN VACCINIA VIRUS, USING A HOST RANGE SELECTION SYSTEM", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 63, no. 9, 1 September 1989 (1989-09-01), pages 3829-3836, ХР000351647, ISSN: 0022-538X, page 3829, last paragraph - page 3830, paragraph 1
J.A. TINE ET AL.: "NYVAC-Pf7: a poxvirus-vectored, mutliantigen, multistage vaccine candidate for Plasmodium falciparum malaaia.", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 64, no. 9, 1 September 1996 (1996-09-01), pages 3833-3844, XP055095101, figure 1, page 3836, last 1ine
WO-A2-2006073431
KAREN BAUR ET AL.: "Immediate-early expression of a recombinant antigen by modified vaccinia virus Ankara breaks the immunodominance of strong vector-specific B8R antigen in acute and memory CD8 T-cell responses", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 84, no. 17, 10
June 2010 (2010-06-10), pages 8743-8752, XP055057695,
DOI: 10.1128/jvi.00604-10, figures 1A, 3-5, page 8743, last line - page 8744, paragraph 1
DAVISON A.J. ET AL.: "Structure of vaccinia virus early promoters", JOURNAL OF MOLECULAR
BIOLOGY, ACADEMIC PRESS, UNITED KINGDOM,
vol. 210, no. 4, 20 December 1989 (1989-12-20),
pages 749-769, XP024010295, ISSN: 0022-2836, DOI:
10.1016/0022-2836(89)90107-1 [retrieved on 1989-12-20] abstract
Anonymous: "Vaccinia virus WR, complete genome - Nucleotide - NCBI", GenBank Accession
Number AY243312, 14 June 2006 [2006-06-14], XP055095213, Retrieved from the Internet: URL:http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/29 692106 [retrieved on 2014-01-08] cited in the application *VACWR018 nucleotide and amino acid sequence*
MAGDALINI MOUTAFTSI ET AL.: "Uncovering the interplay between CD8, CD4 and antibody responses to complex pathogens", FUTURE MICROBIOLOGY, vol. 5, no. 2, 1 February 2010 (2010-02-01), pages 221-239, XP055095338, ISSN: 1746-0913, DOI: 10.2217/fmb.09.110
MAGDALINI ET AL.: "Vaccinia Virus-Specific CD4+ T Cell Responses Target a Set of Antigens Largely Distinct from Those Targeted by CD8 T Cell Responses", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 178, no. 11, 1 June 2007 (2007-06-01), pages 6814-6820, XP055095361
KOTWAL G.J. ET AL.: "Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus
terminal transposition mutant", VIROLOGY, ELSEVIER,
AMSTERDAM, NL, vol. 167, no. 2, 1 December
1988 (1988-12-01), pages 524-537, XP023051144, ISSN:
0042-6822 [retrieved on 1988-12-01], page 534, lines 18-20, last paragraph, table 1
SONIA T. WENNIER ET AL.: "A Novel Naturally Occurring Tandem Promoter in Modified Vaccinia Virus Ankara Drives Very Early Gene Expression and Potent Immune Responses", PLOS ONE, vol. 8, no. 8, 12 August 2013 (2013-08-12), page e73511, XP055075403, DOI: 10.1371/journal.pone.0073511, the whole document
(57) Изобретение включает рекомбинантные поксвирусы, предпочтительно модифицированные вирусы осповакцины Анкара (MVA), содержащие промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген, и способы их применения. Изобретение относится к композициям и способам индукции сильных CD8 Т-клеточных и гуморальных
иммунных реакций на специфический(е) антиген(ы) путем проведения одной или более иммунизации рекомбинантным MVA млекопитающего, предпочтительно человека.
MVA происходит от штамма вируса осповакцины Анкара, поражающего кожу (хориоаллантоисно-го вируса осповакцины Анкара (CVA)), который в течение многих лет поддерживался в Институте вакцинации, Анкара, Турция, и использовался в качестве основы для вакцинации людей. Однако из-за частых тяжелых поствакцинальных осложнений, связанных с вирусами осповакцины (VACV), было предпринято несколько попыток создания более аттенуированной и безопасной противооспенной вакцины.
В период с 1960 по 1974 профессору Anton Mayr удалось успешно аттенуировать CVA путем более чем 570 последовательных пассажей в клетках CEF (Mayr et al., 1975, Passage History: Abstammung, Ei-genschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA. Infection 3: 6-14). В рамках начального этапа разработки противооспенной вакцины на основе MVA были проведены клинические исследования MVA-517 (соответствующего 517-му пассажу) в комбинации с Lister Elstree (Stickl, 1974, Smallpox vaccination and its consequences: first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine "MVA". Prev.Med. 3(1): 97-101; Stickl and Hochstein-Mintzel, 1971, Intracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus ("MVA virus"). Munch Med Wochenschr. 113: 1149-1153) у субъектов, подверженных риску нежелательных реакций на введение противооспенной вакцины. В 1976 MVA, полученный из посевного материала MVA-571 (соответствующего 571-му пассажу), был зарегистрирован в Германии в качестве первичной вакцины в двухэтапной программе инъекционной противооспенной вакцинации. В дальнейшем MVA-572 были вакцинированы приблизительно 120000 европеоидов, большинство из которых дети от 1 до 3 лет. При этом не сообщалось о серьезных побочных эффектах, несмотря на то, что многие из субъектов принадлежали к популяции, имеющей высокий риск осложнений, связанных с обычным вирусом осповакцины (Mayr et al., 1978, The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behaviour in organisms with a debilitated defence mechanism (author's transl). Zentralbl. Bacteriol. (B) 167: 375-390). MVA-572 был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур животных, Лаборатория исследования и производства вакцин, Лабораторная служба общественного здравоохранения, Научно-производственный центр микробиологии, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир SP4 0JG, Соединенное Королевство под номером ЕСАСС V9401
2707.
Так как для аттенуации MVA было использовано множество пассажей, существует ряд различных штаммов или изолятов, в зависимости от номера пассажа в клетках CEF. Все штаммы MVA получены от доктора Mayr и большинство происходит от MVA-572, который применялся в рамках программы по эра-дикации оспы в Германии, или от MVA-575, который интенсивно использовался в качестве ветеринарной вакцины. MVA-575 был депонирован 7 декабря 2000 в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС) под регистрационным номером V001 20707.
Путем серийного культивирования (более 570 пассажей) CVA в первичных фибробластах эмбриона цыпленка был получен аттенуированный вирус CVA-MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара). MVA был дополнительно пассирован компанией Bavarian Nordic и получил наименование MVA-BN. У MVA, как и у MVA-BN, отсутствует приблизительно 13% (26,5 кб, соответствующих шести крупным и множеству мелких делеционных сайтов) генома по сравнению с предковым вирусом CVA. Деле-ции затрагивают некоторые гены вирулентности и тропизма, а также большой фрагмент гена, кодирующего белок включений типа A (ATI), и ген, кодирующий структурный белок, который направляет зрелые вирусные частицы в тельца-включения типа А. Образец MVA-BN был депонирован 30 августа 2000 в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС) под номером V00083008.
MVA-BN может прикрепляться к клеткам человека и проникать в них, где вирусные гены крайне эффективно экспрессируются. При этом не происходит сборки и высвобождения дочерних вирионов. MVA-BN и его производные вводились многим типам животных и более чем 2000 людей, в том числе страдающим от иммунодефицита. Все вакцинации были признаны в целом безопасными и хорошо переносимыми.
Во множестве различных публикаций представлено мнение, что все штаммы MVA одинаковы и представляют собой высокоаттенуированные безопасные живые вирусные векторы. Однако в результате доклинических испытаний было показано, что MVA-BN демонстрирует исключительные аттенуирован-ность и эффективность по сравнению с другими штаммами MVA (WO 02/42480). MVA-BN, вариантные штаммы MVA, как, например, депонированные в ЕСАСС под номером V00083008, имеют способность к репродуктивной репликации в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF) in vitro, но не способны к репродуктивной репликации в клетках человека, в которых могут репродуктивно реплицироваться MVA 575 или MVA 572. К примеру, MVA-BN не способен к репродуктивной репликации в кератиноцитах человека линии НаСаТ, клетках почки эмбриона человека линии 293, клетках остеосаркомы человека линии 143В и клетках аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa. Более того, штаммы MVA-BN не реплицируются при моделировании на мышах, не способных к продуцированию зрелых В- и Т-клеток и в связи с этим имеющих тяжелый иммунодефицит и являющихся в высшей степени восприимчивыми к реплицирующемуся вирусу. Дополнительным или альтернативным свойством штаммов MVA-BN является способность к индукции по меньшей мере существенно схожего уровня иммунитета при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации, по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием
ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации.
Термин "не способный к репродуктивной репликации" применяется в настоящей заявке, как определено в WO 02/42480 и патенте США 6761893, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Таким образом, данный термин относится к вирусу, который через 4 дня от начала инфекции демонстрирует степень амплификации, составляющую менее чем 1, что выявляется с помощью методов, описанных в патенте США 6761893, который включен в настоящий документ посредством ссылки. "Степень амплификации" вируса представляет собой соотношение количества вирусов, происходящих из инфицированной клетки (Выход) к исходному количеству вирусов, использованных для инфицирования клеток (Вход). Соотношение между Выходом и Входом, составляющее "1", описывает статус амплификации, при котором количество вирусов, происходящих из инфицированной клетки, совпадает с исходным количеством вирусов, использованных для инфицирования клеток.
Согласно одному из вариантов реализации изобретения MVA-BN или его производные характеризуются индуцированием, по меньшей мере, существенно схожего уровня иммунитета при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации, по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации. Вирус осповакцины рассматривается как индуцирующий, по меньшей мере, существенно схожий уровень иммунитета при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации, по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации в случае, если ответ ЦТЛ, оцененный с помощью "анализа 1" или "анализа 2", раскрытых в WO 02/42480, предпочтительно с помощью обоих анализов, является, по меньшей мере, существенно схожим при проведении вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации, по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации. Более предпочтительно, чтобы ответ ЦТЛ после проведения вакцинации в режиме прайм-буст с использованием вируса осповакцины как для первичной иммунизации, так и для реиммунизации, оцененный с помощью по меньшей мере одного из анализов, был более интенсивным по сравнению с вакцинацией в режиме прайм-буст с использованием ДНК для первичной иммунизации и вируса осповакцины для реиммунизации. Наиболее предпочтительно, чтобы ответ ЦТЛ был более интенсивным при его оценке с помощью обоих анализов.
В WO 02/42480 раскрыт способ получения вирусов осповакцины, имеющих свойства MVA-BN. Высокоаттенуированный вирус MVA-BN может быть получен, например, путем дополнительного пассирования модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), такого как MVA-572 или MVA-575.
Таким образом, было показано, что MVA-BN имеет самый высокий профиль аттенуированности по сравнению с другими штаммами MVA и является безопасным даже для животных с тяжелым иммунодефицитом.
Несмотря на то, что репликация MVA в клетках млекопитающих резко подавлена, его гены эффективно транскрибируются, при этом блок вирусной репликации происходит на уровне сборки и выхода вируса. (Sutter and Moss, 1992, Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89: 10847-10851; Carroll and Moss, 1997, Host range and cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia virus: propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line. Virology 238: 198-211.) Несмотря на высокую аттенуированность и сниженную вирулентность MVA-BN, доклинические исследования показали, что он вызывает как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции на VACV и продукты гетерологичных генов, клонированных в геном MVA (Harrer et al., 2005, Therapeutic Vaccination of HIV-1-infected patients on HAART with recombinant HIV-1 nef-expressing MVA: safety, immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption. Antiviral Therapy 10: 285-300; Cosma et al., 2003, Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nef-specific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals. Vaccine 22(1): 21-29; Di Nicola et al., 2003, Clinical protocol. Immunization of patients with malignant melanoma with autologous CD34(+) cell-derived dendritic cells transduced ex vivo with a recombinant replication-deficient vaccinia vector encoding the human tyrosinase gene: a phase I trial. Hum Gene Ther. 14(14): 1347-1360; Di Nicola et al., 2004, Boosting T cell- mediated immunity to tyrosinase by vaccinia virus-transduced, CD34(+)- derived dendritic cell vaccination: a phase I trial in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 10(16): 5381-5390).
MVA-BN и вакцины на основе рекомбинантного MVA-BN могут быть получены, пассированы, продуцированы и произведены в клетках CEF, культивируемых в среде без сыворотки. С учетом известных характеристик многие рекомбинантные варианты MVA-BN были предложены для доклинической и клинической разработки. Между MVA-BN, основой вирусного вектора и различными вакцинами на основе рекомбинантного MVA не было обнаружено отличий по аттенуированности (недостаточности репликации в линиях клеток человека) или безопасности (по результатам доклинических исследований токсичности или клинических исследований).
Индукция сильных гуморальной и клеточной иммунных реакций на продукт чужеродного гена, экспрессируемый VACV-вектором, затруднена вследствие того, что продукт чужеродного гена должен
конкурировать с более чем 150 антигенами вектора VACV за распознавание и индукцию специфических антител и Т-клеток. Особую проблему представляет иммунодоминирование CD8 Т-клеточных антигенных детерминант вектора, которое препятствует индукции сильной CD8 Т-клеточной реакции на продукт чужеродного гена. (Smith et al., Immunodominance of poxviral-specific CTL in a human trial of recombinant-modified vaccinia Ankara. J. Immunol. 175:8431-8437, 2005). Это относится к реплицирующимся VACV-векторам, таким как Dryvax, а также к нереплицирующимся векторам, например NYVAC и MVA.
Для экспрессии рекомбинантного антигена ("неоантигена") вектором VACV могут использоваться только поксвирус-специфические промоторы, но не обычные эукариотические промоторы. Это обусловлено особенностями биологии поксвирусов, которые реплицируются в цитоплазме и привносят свою собственную, независимую от клетки транскрипционную машинерию, не распознающую типичные эу-кариотические промоторы.
Цикл вирусной репликации подразделен на две основных фазы: раннюю фазу, включающую первые 2 ч от начала инфекции до репликации ДНК, и позднюю фазу, начинающуюся вместе с репликацией вирусной ДНК на 2-4 ч от начала инфекции.
Поздняя фаза охватывает остаток цикла вирусной репликации от ~2-20ч от начала инфекции до высвобождения дочерних вирионов из инфицированной клетки. Существует ряд типов поксвирусных промоторов, отличающихся периодами цикла вирусной репликации, в течение которых они являются активными, и называемых в соответствии с этим, например, ранние и поздние промоторы. (См., например, Davison and Moss, J. Mol. Biol. 210:771-784, 1989; Davison and Moss, J. Mol. Biol. 210:749-769, 1989; and Hirschmann et al., Journal of Virology 64:6063-6069, 1990, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки).
Тогда как ранние промоторы могут быть активны также на позднем этапе инфекции, активность поздних промоторов ограничивается поздней фазой. Промоторы третьего класса, называемые промежуточными промоторами, активны в течение перехода от ранней к поздней фазе и зависимы от репликации вирусной ДНК. Последнее относится также к поздним промоторам, однако транскрипция с промежуточных промоторов начинается раньше, чем с типичных поздних промоторов и нуждается в другом наборе транскрипционных факторов.
В последние годы становится все более очевидным, что выбор временного класса поксвирусного промотора для экспрессии неоантигена оказывает сильное влияние на силу и качество неоантиген-специфической иммунной реакции. Было показано, что Т-клеточные реакции на неоантигены, экспрес-сированные под контролем позднего промотора, являются более слабыми, чем на такой же антиген, экс-прессированный под контролем раннего промотора. (Bronte et al., Antigen expression by dendritic cells correlates with the therapeutic effectiveness of a model recombinant poxvirus tumor vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 94:3183-3188, 1997. Coupar et al., Temporal regulation of influenza hemagglutinin expression in vaccinia virus recombinants and effects on the immune response. Eur. J. Immunol. 16:1479-1487, 1986).
Еще более поразительно, как недавно было показано, что при повторных аутологичных иммуниза-циях VACV, как и VACV-вектором MVA, дефектным по репликации, CD8 Т-клеточные реакции на антигены, находящиеся под контролем исключительно позднего промотора, могут полностью отсутствовать. Это нарушение привело к тому, что антиген-специфическая CD8 Т-клеточная реакция почти не проявляется после вторичной иммунизации. (Kastenmuller et al., Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. J. Exp. Med. 204:2187-2198, 2007).
Следовательно, ранняя экспрессия неоантигенов VACV-векторами, по-видимому, является определяющей для эффективных неоантиген-специфических CD8 Т-клеточных реакций. Было также показано, что антиген, экспрессированный VACV-вектором в ранней фазе, конкурирует не только с антигенами, экспрессированными в поздней фазе, но также и с другими антигенами, экспрессированными в ранней фазе, за иммунодоминирование в течение CD8 Т-клеточной реакции. (Kastenmuller et al., 2007). Специфические свойства ранних участков поксвирусных промоторов, следовательно, могут быть крайне важны для индукции неоантиген-специфической Т-клеточной реакции. Более того, согласно общепринятой точке зрения большее количество антигена способствует индукции более сильных антиген-специфических иммунных реакций (для информации относительно поксвирусов, см., например, Wyatt et al., Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines. Vaccine 26:486-493, 2008).
Ранее был описан промотор, сочетающий в себе 4 ранних промоторньгх элемента и поздний промо-торный элемент гена ATI (Funahashi et al., Increased expression in vivo and in vitro of foreign genes directed by A-type inclusion body hybrid promoters in recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 65:5584-5588, 1991; Wyatt et al., Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines. Vaccine 26:486-493, 2008). Было показано, что он обеспечивает повышенную раннюю экспрессию антигена. Тем не менее, Т-клеточные реакции, индуцированные антигеном, экспрессия которого находится под контролем подобного промотора, были исследованы только после однократной иммунизации и явно не отличались от реакций, имевших место в случае экспрессии под контролем типичного промотора Pr7.5K. (Funahashi et al., Increased expression in vivo and in vitro of foreign genes directed by A-type inclusion body hybrid promoters in recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 65:5584-5588, 1991).
Jin et al. в Arch. Virol. 138:315-330, 1994 было описано конструирование рекомбинантных промоторов VACV, состоящих из промотора ATI VACV в сочетании с тандемными повторами (2-38 копий) му-тантного промотора Pr7.5, функционально связанного с геном CAT. До 10 копий мутантного промотора Pr7.5 включительно эффективно повышали раннюю экспрессию генов. Дальнейшее увеличение количества копий, похоже, имеет подавляющее действие. Для всех конструктов количество белка CAT, производимое в присутствии цитозин арабинозида (AraC) (т. е. если цикл вирусной репликации был остановлен в ранней фазе), составляло менее чем одну десятую количества, производимого в отсутствие AraC (Jin et al. Arch. Virol. 138:315-330, 1994).
Недавно было показано, что повторные иммунизации мышей рекомбинантным MVA, экспресси-рующим OVA под контролем гибридного ранне-позднего промотора (pHyb), содержащего пять копий сильного раннего элемента, приводят к развитию исключительных острых CD8 Т-клеточных реакций и реакций CD8 Т-клеток памяти по сравнению с OVA, экспрессия которого находится под контролем Pr7.5 и PrS (Baur et al., Journal of Virology, Vol. 84 (17): 8743-8752 (2010)). Кроме того, после трех или более иммунизаций белок B8R, происходящий из MVA, заменяется OVA, экспрессированным под контролем pHyb, в качестве иммунодоминантного CD8 Т-клеточного антигена. Id.
Assarsson et al. в P.N.A.S. 105: 2140-45, 2008 оценили одновременные уровни экспрессии 223 аннотированных генов вируса осповакцины в течение инфекции и определили их динамику с помощью геномных микрочипов высокой плотности. Они обнаружили, что многие гены штамма WR вируса оспо-вакцины имеют высокие уровни транскрипции. Assarsson et al. привели примеры высокоэкспрессирован-ных генов: предранних VACWR-059 (белок, связывающий двухцепочечную РНК) и VACWR-184 (продукт неизвестен); раннего VACWR-018 (продукт неизвестен); ранне-позднего VACWR-131 (капсидный белок); позднего VACWR-169 (продукт неизвестен). Assarsson et al. указали на то, что вследствие исключительно высоких уровней экспрессии эти гены могут представлять особый интерес для будущих исследований, но не определили, какие промоторы инициируют транскрипцию этих генов.
Yang et al. в P.N.A.S. 107:11513-11518, 2010 применили глубокое секвенирование РНК для анализа динамики транскриптомов вируса осповакцины (VACV) в течение инфекции. До репликации вирусной ДНК были выявлены транскрипты со 118 ORF VACV; после репликации были описаны транскрипты с 93 дополнительных ORF. Высокое разрешение позволило определить точные границы многих мРНК, включая сквозные транскрипты, и расположение сайтов инициации транскрипции и перекрывающихся промоторов.
Orubu et al в PLoS ONE 7(6):e40167, 2012 показали, что сильные ранние промоторы, под контролем которых находится экспрессия нефункциональных или второстепенных открытых рамок считывания (ORF) MVA, могут быть использованы для иммуногенной экспрессии рекомбинантного антигена. Точная замена MVA-ортологов C11R, F11L, A44L и B8R на модельный антиген, расположенный таким образом, чтобы использовать тот же кодон инициации трансляции, сделала возможной раннюю экспрессию трансгена, подобную или несколько более интенсивную, чем та, что достигается с помощью широко используемого промотора р7.5 или коротких синтетических промоторов. Аналогично частота антиген-специфических CD8+ Т-клеток, индуцированных путем однократного введения или первичной иммунизации аденовирусом и реиммунизации rMVA у мышей, при использовании эндогенных промоторов в их исходных геномных локусах была такой же или несколько повышенной по сравнению с типичными конструктами. Усиление иммуногенности, наблюдаемое при использовании промоторов C11R или F11L, в сравнении с р7.5 было подобно усилению иммуногенности, имевшему место при сравнении промотора mH5 с р7.5.
Сильные Т-клеточные гуморальные иммунные реакции на антигены, кодируемые рекомбинантны-ми поксвирусами, могут повысить эффективность вакцины. Следовательно, в данной области техники существует потребность в композициях и способах, вызывающих сильные Т-клеточные и гуморальные иммунные реакции на антигены, кодируемые рекомбинантными поксвирусами, такими как MVA. Изобретение удовлетворяет эту потребность.
Краткая сущность изобретения
Изобретение предлагает рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, и способы их применения. В одном варианте реализации изобретения изобретение предлагает способ индукции устойчивой CD8 Т-клеточной реакции на неоантиген у млекопитающего, предпочтительно человека, включающий проведение одной или более иммунизации вирусом MVA млекопитающего, в том числе человека.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая по меньшей мере на 95, 98 или 100% идентична SEQ ID NO:1.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию второй нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 31 нуклеотида, которая по меньшей мере на 95, 98 или 100% идентична SEQ ID NO:1.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 2 ко
пии нуклеотидной последовательности, состоящей из по меньшей мере 40 нуклеотидов, которая на 100%
идентична SEQ ID NO:1.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит SEQ ID N0:2. Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена upstream-последовательность гена MVA013.5L (SEQ ID N0:3). Приведены последовательности промоторов Pr13.5-short и Pr13.5-long. Подчеркнут пунктирной линией Pr13.5-long (Пол. 15878-15755). Подчеркнут жирной линией Pr13.5-short (Пол. 15808-15755). Подчеркнуты сплошной линией стартовый кодон ATG гена MVA013.5 (Пол. 15703-15701); стоп-кодон ТАА гена MVA014L (Пол. 15878-15856). Черные стрелки снизу: сайты инициации транскрипции, определенные с помощью ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (Пол. 15767 и 15747). Серые стрелки сверху: сайты инициации транскрипции, приведенные Yang et al., 2010, suppl. data. Заключен в рамку коровый промотор, приведенный Yang et al., 2010, suppl. data (Пол. 15913-15899). Положения приведены на основании последовательности DQ983238.1 в GenBank.
На фиг. 2 представлены последовательность и положение промоторов Pr13.5-long и Pr13.5-short в геноме MVA (SEQ ID N0:3). В upstream-последовательности гена MVA013.5 расположен прямой повтор, состоящий из 44 п.о. Заключена в рамку повторяющаяся последовательность, состоящая из 44 п.о., расположенная в upstream-последовательности промотора 13.5, отделенного спейсером, состоящим из 36 п.о. Подчеркнут пунктирной линией Pr13.5-long (Пол. 15878-15755). Подчеркнут жирной линией Pr13.5-short (Пол. 15808-15755). Подчеркнут сплошной линией стартовый кодон ATG гена MVA013.5 (Пол. 15703-15701). Положения приведены на основании последовательности DQ983238.1 в GenBank.
На фиг. 3 представлены результаты измерения уровней мРНК гена овальбумина в клетках HeLa, инфицированных упомянутыми конструктами, с помощью RT-qPCR в указанные моменты с начала инфекции.
На фиг. 4 представлены результаты измерения белковой экспрессии Ova с помощью FACS в виде средней интенсивности флуоресценции (СИФ) в клетках HeLa, инфицированных упомянутыми конструктами, в указанные моменты с начала инфекции. Среднее значение интенсивности флуоресценции для клеток дикого типа (не содержащих ген Ova), составляющее 399 СИФ, представляет собой фоновый уровень флуоресценции.
На фиг. 5 представлено среднее соотношение клеток Ova+/B8R+ у мышей, вакцинированных упомянутыми конструктами, после первой, второй и третьей иммунизации.
На фиг. 6 представлено среднее соотношение 0va+/В8R+Т-клеточных реакций у мышей на десятую неделю после третьей иммунизации упомянутыми конструктами.
Фиг. 7А и 7В иллюстрируют образование антител после первой, второй и третьей иммунизации упомянутыми конструктами. А. Среднее геометрическое титра (СГТ) антител. В. Соотношение СГТ в сравнении с промотором PrS. Промоторы MVA50L + PrSSL и MVA170R + PrSSL являются промоторами MVA соответствующих генов, слитыми с 5'-концом синтетического короткого сильного позднего промотора PrSSL (Short Strong Late) непосредственно upstream от ATG гена овальбумина. (ААТТТТТААТА-ТАТАА; SEQ ID N0:7; РСТ W0 2010/060632 A1.)
На фиг. 8A-8F представлено выравнивание последовательности SEQ ID N0:1 с нуклеотидными последовательностями различных поксвирусных промоторов Pr13.5 с помощью BLAST. Идентичные нук-леотиды обозначены точками, отсутствующие нуклеотиды обозначены тире, а замены представлены буквами.
На фиг. 9A-9D представлены учетные номера и названия последовательностей, использованных для выравнивания, представленного на фиг. 8A-8F.
Подробное описание сущности изобретения
Клетки HeLa инфицировали MVA-BN, после чего получали РНК. Синтезировали специфические праймеры к различным 0RF MVA и проводили ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (FirstChoice(r) RLM-RACE Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germany) для получения ПЦР-продуктов, соответствующих РНК MVA, кодирующим эти 0RF. ПЦР-продукты были секвенированы для определения сайтов инициации транскрипции. Исходя из этих данных были определены промоторы для транскрипции мРНК, кодирующих эти 0RF. Для контроля экспрессии гена овальбумина (0VA) в MVA-конструкты были вставлены промоторы MVA для следующих 0RF: MVA13.5 (CVA022; WR 018), MVA050L (E3L; WR 059), MVA022L (K1L; WR 032) и MVA170R (B3R; WR 185).
Клетки HeLa были инфицированы рекомбинантными вирусами MVA in vitro, а белковую экспрессию овальбумина оценивали с помощью анализа FACS. Анализ FACS не обнаружил белковой экспрессии овальбумина на второй или даже четвертый час от начала инфекции для конструктов, содержащих промоторы MVA050L (E3L; WR 059), MVA022L (K1L; WR 032) и MVA170R (B3R; WR 185). В то же время для промотора MVA13.5 (CVA022; WR 018) интенсивная экспрессия овальбумина была выявлена уже после двух часов.
Предполагаемый коровый элемент промотора для 0RF MVA13.5L был ранее определен в Yang et al., 2010, как содержащий 15 нт коровую последовательность и нетранслируемую лидерную последовательность размером 177 нт. Тем не менее в настоящем исследовании установлено, что сайты инициации
транскрипции, используемые 0RF MVA13.5L, находятся более чем на 100 нуклеотидов downstream от сайта инциации, определенного Yang et al. Соответственно промотор MVA13.5, определенный изобретателями, отличается от корового элемента промотора, определенного Yang et al.
Промотор MVA13.5, определенный изобретателями, содержит повтор, состоящий из более чем 40 нуклеотидов:
TAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTA (SEQ ID N0:1). Повторяющаяся последовательность встречается также у многих других поксвирусов, например вируса оспы лошадей, вируса оспы обезьян, вируса оспы коров, вируса натуральной оспы, вируса осповакцины, вируса оспы верблюдов, вируса оспы кроликов, вируса оспы мышей и вируса оспы гололапых песчанок (фиг. 8 и 9).
Были созданы два MVA-конструкта с промоторами, содержащими одну копию (MVA13.5 short; SEQ ID N0:1) или две копии (MVA13.5 long; SEQ ID N0:2) повтора, контролирующего экспрессию гена овальбумина (0VA). После инфицирования клеток HeLa обоими конструктами in vitro была выявлена интенсивная экспрессия овальбумина (фиг. 4).
С помощью RT-qPCR была оценена динамика экспрессии РНК овальбумина под контролем различных промоторов в инфицированных клетках HeLa in vitro. Как MVA13.5 short, так и MVA13.5 long продемонстрировали высокие уровни ранней экспрессии РНК (фиг. 3). MVA13.5 long продемонстрировал наивысшие уровни ранней белковой экспрессии.
CD8 Т-клеточные реакции на 0VA, экспрессируемый с рекомбинантных конструктов под контролем промоторов PrS, Pr7.5 opt + spacer, Pr13.5 short и Pr13.5 long, были оценены у мышей после одной, двух и трех иммунизации рекомбинантным MVA (фиг. 5-6). 0VA-специфические и B8R(вирус)-специфические CD8 Т-клеточные реакции были оценены путем определения количества CD8 Т-клеток, специфически связывающихся с гексамерами МНС I класса. Декстрамеры МНС I класса образовывали комплекс с соответствующими H-2Kb-связывающими пептидами SIINFEKL (SEQ ID N0:4) для 0VA или TSYKFESV (SEQ ID N0:5) для вирусного пептида B8R.
Среднее соотношение 0VA-специфических к B8R-специфическим CD8 Т-клеткам составляло примерно 2,5 для MVA13.5-long после трех иммунизации. Три других конструкта продемонстрировали среднее соотношение, составляющее менее чем 1. Таким образом, инверсия иерархии иммунодоминиро-вания может быть достигнута путем применения для экспрессии неоантигена промотора Pr13.5 long, но не других промоторов.
Гуморальные иммунные реакции на 0VA, экспрессируемые с рекомбинантных конструктов под контролем различных промоторов, были оценены у мышей после одной, двух и трех иммунизаций ре-комбинантным MVA (фиг. 7А-В). Гуморальная иммунная реакция для MVA13.5 long была существенно более интенсивной, чем реакция, наблюдаемая при применении рекомбинантного MVA, содержащего промотор PrS. Следовательно, применение промотора Pr13.5 long для контроля экспрессии неоантигена MVA обеспечивает неожиданно превосходные результаты.
Промоторы Pr13.5.
Изобретение охватывает выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие или состоящие из промотора Pr13.5. В рамках настоящего изобретения "промотор Pr13.5" содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0:1. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения "промотор Pr13.5" может относиться к нуклеотидной последовательности MVA, синтетической последовательности или аналогичной поксвирусной последовательности из поксвируса, отличного от MVA. В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID N0:1. Длина нуклеотидной последовательности составляет предпочтительно 40, 41, 42, 43, 44 или 45 оснований.
Процент идентичности может быть определен путем визуальной оценки и математического расчета. Кроме того, процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей может быть определен путем сравнения информации о последовательностях с помощью компьютерной программы GAP, версия 6.0, описанной Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) и предлагаемой Генетической компьютерной группой Университета Висконсина (UWGCG). Предпочтительные параметры по умолчанию для программы GAP включают: (1) унитарную матрицу сравнения (имеющую значение 1 для совпадений и 0 для несовпадений) для нуклеотидов и весовую матрицу сравнения Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, как описано Schwartz and Dayhoff, eds. в Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) штраф за каждый пропуск, составляющий 3,0, и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ на месте каждого пропуска; (3) отсутствие штрафов за концевые пропуски. Могут использоваться и другие программы, применяемые специалистами в области сравнения последовательностей.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 функционально связан с ге-терологичной нуклеотидной последовательностью. В рамках настоящего изобретения "гетерологичная нуклеотидная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, которая в природе не
связана с промотором. В рамках настоящего изобретения "функционально связанный" означает, что промотор может контролировать экспрессию гетерологичной нуклеотидной последовательности в клетке, инфицированной поксвирусом. В предпочтительном варианте реализации изобретения гетерологич-ная нуклеотидная последовательность кодирует неоантиген. В рамках настоящего изобретения неоантиген означает антиген, который не экспрессируется поксвирусным вектором в естественных условиях.
Промотор Pr13.5 может быть функционально связан с гетерологичной нуклеотидной последовательностью с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В различных вариантах реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность вводится в 13.5 0RF поксвируса.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 является поксвирусным промотором природного происхождения. Например, промотор Pr13.5 может происходить от промотора Pr13.5 модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), вируса оспы обезьян, вируса оспы коров, вируса натуральной оспы, вируса осповакцины, вируса оспы верблюдов, вируса оспы кроликов, вируса оспы мышей или вируса оспы гололапых песчанок. Источники предпочтительных промоторов Pr13.5 могут быть выбраны среди вирусов, представленных на фиг. 9. Предпочтительные промоторы Pr13.5 могут быть выбраны среди последовательностей, представленных на фиг. 8.
В различных вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 является синтетическим промотором Pr13.5.
Промотор Pr13.5 может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более копий последовательности, состоящей по меньшей мере из 40, 41, 42, 43, 44 или 45 нуклеотидов, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID N0:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит 1 копию нуклео-тидной последовательности SEQ ID N0:1.
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит 1 копию нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:1 и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более копий последовательности, состоящей по меньшей мере из 40, 41, 42, 43 или 44 нуклеотидов, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID N0:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID N0:1.
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит 1 копию нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая по меньшей мере на 95, 96,
97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID N0:1, и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более копий второй нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 31 нуклеотида, которая по меньшей мере на 95, 96, 97,
98, 99 или 100% идентична SEQ ID N0:1. В предпочтительном варианте реализации изобретения вторая нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45 оснований.
В предпочтительном варианте реализации изобретения повторяющиеся последовательности разделены 20-80 нуклеотидами, более предпочтительно 30-40 нуклеотидами, наиболее предпочтительно 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидами.
B предпочтительном варианте реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит по меньшей мере одну копию последовательности:
TAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTATTGCTCTTGTGAC
TAGAGACTTTAGTTAAGGTACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAG
GTTGGTAGTA (SEQ ID N0:2).
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор Pr13.5 содержит одну или более нуклео-тидных замен, представленных на фиг. 8.
Изобретение охватывает способы экспрессии неоантигена, включающие функциональное связывание промотора Pr13.5 с гетерологичной нуклеотидной последовательностью.
Рекомбинантные поксвирусы, содержащие промоторы Pr13.5.
Изобретение предлагает рекомбинантный поксвирусный вектор, содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с гетерологичной нуклеотидной последовательностью. В одном варианте реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность вставлена в 13.5 0RF поксвируса таким образом, чтобы функционально связать гетерологичную нуклеотидную последовательность с эндогенным вирусным промотором Pr13.5. В другом варианте реализации изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность связана с промотором Pr13.5 и вставлена в геномный сайт, отличный от 13.5 0RF.
В предпочтительном варианте реализации изобретения поксвирусный вектор происходит от по-ксвирусов, принадлежащих к подсемейству Chordopoxvirinae. Поксвирусы включают вирусы, принадлежащие к родам 0rthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Lepripoxvirus, Suipoxvirus, Mollus-cipoxvirus и Yatapoxvirus. Наиболее предпочтительными являются поксвирусы, принадлежащие к родам 0rthopoxvirus и Avipoxvirus.
Другие поксвирусы, такие как вирус оспы енотов и вирус оспы мышей, могут быть использованы в настоящем изобретении, например, для производства вакцины для иммунизации диких животных. В настоящее изобретение включены также представители родов Capripoxvirus и Lepripoxvirus, поскольку они пригодны для использования в качестве векторов для крупного рогатого скота и кроликов соответственно.
В других вариантах реализации изобретения поксвирус происходит от вирусов рода Avipoxvirus. Примеры вирусов рода Avipoxvirus, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают любые вирусы оспы птиц, такие как вирус оспы кур, вирус оспы канареек, вирус оспы юнко, вирус оспы майн, вирус оспы голубей, вирус оспы попугаев, вирус оспы перепелов, вирус оспы павлинов, вирус оспы пингвинов, вирус оспы воробьев, вирус оспы скворцов и вирус оспы индеек. Предпочтительными вирусами рода Avipoxvirus являются вирус оспы канареек и вирус оспы кур.
В предпочтительном варианте реализации изобретения поксвирус представляет собой вирус оспо-вакцины, наиболее предпочтительно MVA. Изобретение охватывает рекомбинантные вирусы MVA, созданные на основе любых возможных вирусов MVA. Предпочтительными вирусами MVA являются вариантные штаммы MVA - MVA-BN, как, например, депонированный в ЕСАСС под номером V00083008; MVA-575, депонированный 7 декабря 2000 в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС) под регистрационным номером V001 20707, и MVA-572, депонированный в Европейской коллекции клеточных культур животных как ЕСАСС V9401 2707. Предпочтительными являются также производные от депонированных штаммов.
В предпочтительном варианте реализации изобретения MVA имеет способность к репродуктивной репликации в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF) или других линиях клеток птиц in vitro или в яйце, содержащем эмбрион, in vivo, но не способен к репродуктивной репликации в человеческих клетках, в которых могут репродуктивно реплицироваться MVA 575 или MVA 572. В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения MVA не способен к репродуктивной репликации в кератиноцитах человека линии НаСаТ, клетках почки эмбриона человека линии 293, клетках остеосаркомы человека линии 143 В и клетках аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) отличается способностью к репродуктивной репликации в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF) in vitro, а также большей, чем у MVA-575, аттенуированностью в кератиноцитах человека линии НаСаТ, в клетках остеосаркомы человека линии 143В и клетках аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa. В предпочтительном варианте реализации изобретения вирус MVA позволяет достичь в клетках CEF степени амплификации, составляющей более чем 500.
Любой антиген, включая антигены, индуцирующие Т-клеточную реакцию, может быть экспресси-рован рекомбинантным MVA, предлагаемым в настоящем изобретении. Предпочтительными являются вирусные, бактериальные, грибковые и раковые антигены. Крайне предпочтительными антигенами являются антигены HIV-1, антигены вируса лихорадки денге, специфический антиген простаты (PSA) и простатическая кислая фосфатаза (РАР), антигены HER-2/Neu, антигены сибирской язвы, антигены вируса кори, вируса гриппа, пикорнавируса, коронавируса и антигены респираторно-синцитиального вируса. В предпочтительном варианте реализации изобретения антиген представляет собой чужеродный антиген или неоантиген.
Изобретение охватывает способы создания рекомбинантных поксвирусов, предпочтительно MVA, включающие вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности в поксвирус таким образом, чтобы гетерологичная нуклеотидная последовательность была функционально связана с промотором
Pr13.5.
Изобретение распространяется на применение рекомбинантных поксвирусов, предлагаемых в настоящем изобретении, в производстве лекарства или вакцины для лечения или профилактики инфекций и заболеваний млекопитающих, в том числе человека.
Изобретение распространяется на применение рекомбинантных поксвирусов, предлагаемых в настоящем изобретении, для лечения или профилактики инфекций и заболеваний млекопитающих, в том числе человека.
Изобретение распространяется на использование рекомбинантных поксвирусов, предлагаемых в настоящем изобретении, в качестве вакцин, в особенности для лечения или профилактики инфекций и заболеваний млекопитающих, в том числе человека.
Наборы, содержащие рекомбинантный MVA.
Изобретение предлагает наборы, содержащие рекомбинантный поксвирусный вектор, предпочтительно вирус MVA согласно настоящему изобретению. Набор может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре или более контейнеров или флаконов с рекомбинантным поксвирусным вектором, предпочтительно вирусом MVA, вместе с инструкциями по введению вируса млекопитающим, в том числе человеку. В инструкциях может быть указано, что рекомбинантный вирус вводится млекопитающему, предпочтительно человеку, в однократной или многократной (т.е. 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.) дозировке в определенные моменты времени (например, через по меньшей мере 4 недели, через по меньшей мере 6 недель, через по меньшей мере 8 недель после предыдущего введения). В предпочтительном варианте реализа
ции изобретения в инструкциях указано, что рекомбинантный вирус предназначен для введения млекопитающим, предпочтительно человеку, по меньшей мере в 1, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3 или по меньшей мере в 4 дозировках.
Способы индуцирования CD8 Т-клеточной и/или гуморальной иммунной реакции.
Изобретение предлагает способы индуцирования CD8 Т-клеточной и/или гуморальной иммунной реакции у хозяина. В предпочтительных вариантах реализации изобретения способ включает проведение по меньшей мере одной, двух, трех, четырех или пяти иммунизаций млекопитающего, в том числе человека, рекомбинантным поксвирусом, предпочтительно MVA, содержащим промотор Pr13.5.
Введение хозяину.
Рекомбинантный поксвирус, предпочтительно MVA согласно настоящему изобретению, может применяться для лечения целого ряда млекопитающих, включая людей и даже людей с ослабленным иммунитетом. Таким образом, настоящее изобретение предлагает также фармацевтическую композицию и вакцину для индуцирования иммунной реакции у млекопитающего, в том числе человека.
В предпочтительном варианте реализации изобретения вакцина содержит рекомбинантный поксви-рус, предпочтительно MVA, в интервале концентраций от 104 до 109 TCID50Am (дозы, инфицирующей 50% культуры клеток), предпочтительно в интервале концентраций от 105 до 5х108 TCID50Ara, более предпочтительно в интервале концентраций от 106 до 108 TCID50/мл и наиболее предпочтительно в интервале концентраций от 107 до 108 ТСГО50/мл, в особенности 108 TCID^/мл.
Предпочтительная доза для вакцинации млекопитающего, предпочтительно человека, составляет от 106 до 109 TCID50, более предпочтительно 107 TCID50 или 108 TCID50, в особенности 108 TCID50.
Как правило, фармацевтическая композиция может включать один или более фармацевтически приемлемых и/или одобренных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, физиологический раствор, глицерол, этанол, масло, увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества или подобные им. Подходящие носители обычно представляют собой крупные, медленно метаболизируемые молекулы, такие как белки, полисахариды, полилактиды, полигликолиды, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или подобные им.
Для изготовления вакцин рекомбинантный поксвирус, предпочтительно MVA согласно настоящему изобретению, может быть превращен в физиологически приемлемую форму. Это может быть сделано на основе опыта изготовления поксвирусных вакцин, которые применялись для противооспенной вакцинации (как описано Stickl et al. 1974).
Например, очищенный вирус может храниться при -80°С с титром, составляющим 5х108 ТСГО50/мл, в смеси с примерно 10 мМ трис, 140 мМ NaCl, pH 7,4. Для изготовления вакцины для инъекции можно, например, лиофилизировать 102-108 вирусных частиц в 100 мкл - 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно стеклянной ампуле. Кроме того, вакцина для инъекции может производиться путем ступенчатой лиофилизации вируса в лекарственном препарате. Лекарственный препарат может содержать вспомогательные добавки, такие как ман-нит, декстран, сахар, глицин, лактоза или поливинилпирролидон или другие добавки, такие как антиок-сиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, сывороточный альбумин человека), пригодные для введения in vivo. Затем стеклянная ампула запаивается, после чего она может храниться при температурах от 4°С до комнатной в течение нескольких месяцев. При этом, когда ампула не используется, предпочтительно хранить ее при температурах до -20°С.
В целях вакцинации или лечения лиофилизат может быть растворен в водном растворе, предпочтительно физиологическом растворе или буфере трис, а затем применяться систематически или местно, т.е. парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраназально или любым другим путем введения, известным квалифицированному специалисту. Способ применения, доза и количество введений могут быть оптимизированы специалистами в данной области техники в известном порядке. Тем не менее, чаще всего при вакцинации млекопитающего, предпочтительно человека, второе введение проводят примерно на вторую - шестую недели после первого введения вакцины. Третье, четвертое и последующие введения чаще всего проводятся примерно на вторую - шестую недели после предыдущего введения.
Настоящее изобретение предлагает способы иммунизации млекопитающих, в том числе человека. В одном варианте реализации изобретения проводится иммунизация млекопитающих, в том числе крыс, кроликов, мышей и людей, включающая введение дозы рекомбинантного MVA млекопитающему, предпочтительно человеку. В одном варианте реализации изобретения первая доза содержит 108 TCID50 ре-комбинантного вируса MVA, а вторая и дополнительные дозы (т.е. третья, четвертая, пятая и т.д.) содержат 108 TCID50 вируса. Введения могут проводиться в первой дозировке (для первичной иммунизации) и второй или дальнейших дозировке(ах) для реиммунизации.
Иммунизация может быть проведена систематически или местно, т.е. парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраназально или любым другим путем введения, известным квалифицированному специалисту.
CD8 Т-клеточные и гуморальные иммунные реакции.
Иммунизации рекомбинантным MVA, предлагаемым в настоящем изобретении, могут индуцировать устойчивую CD8 Т-клеточную реакцию. В предпочтительных вариантах реализации изобретения после первой, второй, третьей, четвертой, пятой и т. д. иммунизации рекомбинантный MVA индуцирует у млекопитающего, предпочтительно человека, устойчивую CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген, более интенсивную, чем CD8 Т-клеточная реакция на иммуноминантную вирусную CD8 Т-клеточную антигенную детерминанту, кодируемую вектором MVA, например TSYKFESV (SEQ ID N0:5). В предпочтительном варианте реализации изобретения после первой, второй, третьей, четвертой, пятой и т.д. иммунизации у млекопитающего, предпочтительно человека, индуцируется иммунодоми-нантная Т-клеточная реакция на кодируемый антиген. В предпочтительном варианте реализации изобретения после второй, третьей, четвертой, пятой и т.д. иммунизации рекомбинантный MVA индуцирует у млекопитающего, предпочтительно человека, CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген, затрагивающую по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30 или 35% от общего количества CD8 Т-клеток. В предпочтительном варианте реализации изобретения после второй, третьей, четвертой, пятой и т. д. иммунизации рекомбинантный MVA усиливает CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 10 раз (т.е. от 1 до 2, 3, 4, 5 или 10% от общего количества CD8 Т-клеток) по сравнению с реакцией на кодируемый антиген после однократного введения или усиливает CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 10 раз по сравнению с Т-клеточной реакцией на вирусный антиген (например, B8R). В предпочтительном варианте реализации изобретения рекомби-нантный MVA вызывает CD8 Т-клеточную реакцию на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 10 раз более сильную, чем Т-клеточная реакция на вирусный антиген (например, B8R) после однократного введения. В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения CD8 Т-клеточная реакция на кодируемый антиген у млекопитающего, предпочтительно человека, значительно усиливается вследствие 2, 3, 4 или 5 и т.д. иммунизаций по сравнению с реакцией на поздний вирусный антиген (например, B8R).
Интенсивность CD8 Т-клеточной реакции может быть определена, например, путем отбора примерно 100-120 мкл крови в FACS/гепариновый буфер. МКПК могут быть получены путем лизиса эритроцитов с помощью лизирующего буфера для ККТ. Затем может быть проведено одновременное окрашивание 0VA- и B8R-специфических CD8 Т-клеток в образцах МКПК с помощью анти-CD8a-FITC, CD44-PerCPCy5.5 и декстрамеров МНС I класса, образующих комплекс с соответствующими H-2Kb-связывающими пептидами SIINFEKL (SEQ ID N0:4) или TSYKFESV (SEQ ID N0:5). Декстрамер МНС I класса SIINFEKL (SEQ ID N0:4) может быть помечен РЕ, а декстрамер TSYKFESV (SEQ ID N0:5) -АРС. Окрашенные клетки могут анализироваться с помощью проточной цитометрии в системе BD Biosciences BD LSR II. Возможно получать по десять тысяч CD8+ Т-клеток в каждом образце.
Кроме того, интенсивность CD8 Т-клеточной реакции может быть определена путем отбора крови у иммунизированного млекопитающего, предпочтительно человека, и отделения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Они могут быть ресуспендированы в питательной среде, содержащей 5 мкг/мл брефелдина А (BFA, "GolgiPlug", BD Biosciences) и 1 мкМ тестируемых пептидов, включая пептиды против иммунодоминантных антигенных детерминант MVA (т. е. TSYKFESV; SEQ ID N0:5) ("B8R") и пептиды, происходящие от экспрессируемого неоантигена. Затем МКПК можно инкубировать в течение 5 ч при 37°С в 5% СО2, собирать, ресуспендировать в 3 мл холодного ФСБ/10% ФТС/2 мМ ЭДТК и оставлять на ночь при 4°С. На следующий день МКПК могут быть окрашены антителами анти-CD8а-Рас-Blue (клон 53-6.7), анти-CD62L-PE-Cy7, анти^44-АРС-А1еха 750 и анти^4-PerCP-Су5.5 (все антитела от BD Biosciences). МКПК можно инкубировать с указанными антителами в необходимых разведениях в течение 30 мин при 4°С в темноте. После промывки клетки могут быть фиксированы и пермеабилизированы с помощью набора Cytofix/CytopermTM Plus (BD Biosciences) согласно инструкциям производителя. После промывки МКПК может быть проведено окрашивание внутриклеточного интерферона-у (IFN-у) с помощью FITC-конъюгированного анти-IFN-y антитела (BD biosciences), разведенного в пермеабилизирующем буфере для отмывки (BD Biosciences). Окрашенные клетки могут анализироваться с помощью проточной цитометрии.
Иммунизации рекомбинантным MVA, предлагаемым в настоящем изобретении, могут индуцировать устойчивую гуморальную иммунную реакцию. Гуморальные иммунные реакции могут быть оценены с помощью твердофазного ИФА.
В рамках настоящего изобретения "устойчивая CD8 Т-клеточная реакция" подразумевает больший процент неоантиген-специфических CD8 Т-клеток, чем процент, который наблюдается для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (5'AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAA-TATAA 3'; SEQ ID N0:6), после однократной иммунизации. В некоторых вариантах реализации изобретения при CD8 Т-клеточной реакции наблюдается по меньшей мере в 1,5 или 2 раза больше неоантиген-специфических CD8 Т-клеток, чем для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (SEQ ID N0:6), после однократной иммунизации.
В рамках настоящего изобретения "устойчивая гуморальная иммунная реакция" подразумевает титр
антител, более высокий, чем титр антител, наблюдаемый для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (SEQ ID N0:6), после однократной иммунизации. В некоторых вариантах реализации изобретения титр антител по меньшей мере в 1,5 или 2 раза больше, чем титр антител, наблюдаемый для такого же MVA-конструкта, содержащего промотор PrS (SEQ ID N0:6), после однократной иммунизации.
Тип индуцируемой рекомбинантным MVA реакции на неоантиген - "устойчивая CD8 Т-клеточная реакция" или "устойчивая гуморальная иммунная реакция" - может быть определен, как описано ниже в примерах. Например, как MVA13.5 short, так и MVA13.5 long индуцируют "устойчивую CD8 Т-клеточную реакцию", как определено в настоящем документе. MVA13.5 long индуцирует "устойчивую гуморальную иммунную реакцию", как определено в настоящем документе.
Несмотря на то, что способ предпочтительно включает однократное введение вектора, в некоторых вариантах реализации изобретения могут проводиться две, три, четыре, пять, шесть, семь или более им-мунизаций млекопитающего, предпочтительно человека, рекомбинантным MVA.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения кодируемый антиген представляет собой бактериальный, вирусный или опухолевый антиген. В предпочтительном варианте реализации изобретения антиген является чужеродным антигеном для млекопитающего, в том числе человека.
Примеры.
Пример 1. Конструирование MVA-рекомбинантов.
Клетки HeLa инфицировали MVA-BN при множественности заражения (M0I), составляющей 10 (10 TCID50 на клетку), а на второй и восьмой час от начала инфекции получали тотальную РНК. Синтезировали специфические праймеры к различным 0RF MVA и проводили ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (FirstChoice(r) RLM-RACE Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germany) для получения ПЦР-продуктов, соответствующих РНК MVA, кодирующим эти 0RF. ПЦР-продукты былы секвенированы для определения сайтов инициации транскрипции. Исходя из этих данных были определены промоторы для транскрипции РНК, кодирующих эти 0RF. В MVA-конструкты были вставлены промоторы MVA для следующих 0RF (Baur et al., Journal of Virology, Vol. 84 (17): 8743-8752 (2010)) для контроля экспрессии гена овальбумина (0VA): MVA13.5 (CVA022; WR 018), MVA050L (E3L; WR 059), MVA022L (K1L; WR 032) и MVA170R (B3R; WR 185).
Пример 2. Промотор-зависимые уровни экспрессии РНК in vitro.
Инфицирование клеток HeLa рекомбинантными вирусами MVA при M0I, составляющей 10, производилось с помощью прикрепления вирусов на льду в течение 1 ч. После прикрепления клетки промывали и собирали в нулевой момент времени (0 ч) или инкубировали при 37°С для сбора в другие моменты времени. Пробы отбирали на 0,5, 1, 2, 4 и 8 ч от начала инфекции. Клетки гомогенизировали и экстрагировали тотальную РНК. РНК подвергали ДНК-азному расщеплению, после чего с помощью олиго(dT)-праймирования была синтезирована кДНК. Полученные образцы кДНК использовались в качестве матрицы для одновременной амплификации кДНК 0VA и актина с помощью Taqman-qPCR. Реакцию проводили в циклере АВ7500 от Applied Biosystem. Результаты представлены на фиг. 3.
Пример 3. Промотор-зависимые уровни белковой экспрессии in vitro.
Клетки HeLa культивировали в DMEM с добавлением 10% ФТС.
Клетки HeLa инфицировали при M0I рекомбинантного вируса MVA, составляющей 10 (10 TCID50 на клетку). Инфицированные клетки отбирали на 1, 2, 4, 6, 8 и 24 ч от начала инфекции, фиксировали и пермеабилизировали. В половине клеток каждого образца проводили окрашивание белка 0VA с помощью антител кролика к 0VA цыпленка, а в другой половине проводили окрашивание антигенов MVA с помощью поликлональных антител кролика к VACV. Образцы анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur (BD Biosciences) и программного обеспечения FlowJo. Результаты представлены на фиг. 4.
Пример 4. Иммунизации и забор крови у мышей.
В этом исследовании использовались группы мышей (С57/В16). В каждой группе проводили суммарно три иммунизации. В качестве контроля иммунных реакций использовали ФСБ-инъецированную группу. Для оценки иммунных реакций в течение исследования отбирали кровь из хвостовой вены.
Мышей иммунизировали интраперитонеально при 108 TCID50 соответствующих вирусов MVA в растворе ФСБ (300 мкл, общий объем) на 0, 4 и 8 недели. Заборы крови для анализа Т-клеток проводили на первую неделю после каждой иммунизации, а заборы крови для анализа антител - на третью неделю после каждой иммунизации.
Пример 5. Окрашивание Т-клеток и определение антител.
У каждой мыши отбирали примерно 100-120 мкл крови в FACS/гепариновый буфер. МКПК получали путем лизиса эритроцитов с помощью лизирующего буфера для ККТ. Затем проводили одновременное окрашивание 0VA- и B8R-специфических CD8 Т-клеток в образцах МКПК с помощью анти-CD8a-FITC, CD44-PerCPCy5.5 и декстрамеров МНС I класса, образующих комплекс с соответствующими H-2Kb-связывающими пептидами: SIINFEKL (SEQ ID N0:4) или TSYKFESV (SEQ ID N0:5). Декстрамер МНС I класса SIINFEKL (SEQ ID N0:4) был помечен РЕ, а декстрамер TSYKFESV (SEQ ID N0:5) - АРС. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии в системе BD Biosciences
BD LSR II. Получали по десять тысяч CD8+ Т-клеток в каждом образце. Результаты представлены на фиг. 5-6.
Получали сыворотку из цельной крови. Для определения специфических антител проводили твердофазный ИФА овальбумина и твердофазный ИФА MVA (набор Serazym от Seramun Diagnostika GmbH, Heidesee, Germany). Результаты представлены на фиг. 7.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> BAVARIAN NORDIC A/S
<120> ПРОМОТОР PR13.5 ДЛЯ УСТОЙЧИВЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ И ГУМОРАЛЬНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ
<130> BN83PCT <150> 61/719,429
<151> 2012-10-28 <160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> ДНК
<213> Вирус коровьей оспы
<400> 1
taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agta 44
<210> 2 <211> 124 <212>
ДНК
<213> Вирус коровьей оспы
<400> 2
taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60 agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120
agta 124
<210> 3
<211> 273
<212> ДНК
<213> Вирус коровьей оспы
<400> 3
tagacgacat gatagaggag gtatccattg acgataatcg tttatcaaca ctaccgttag 60
aaattagaca tttgattttc tcgtacgcgt tcctataaaa atagaaacta taatcatata 120
atagtgtagg ttggtagtat tgctcttgtg actagagact ttagttaagg tactgtaaaa 180
atagaaacta taatcatata atagtgtagg ttggtagtag ggtactcgtg attaatttta 240
ttgttaaact tgtccttaag tcttattaat atg 273
<210> 4 <211> 8
<212> Протеин
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид OVA
<400> 4
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5
<210> 5
<211> 8
<212> Протеин
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид B8R <400> 5
Thr Ser Tyr Lys Phe Glu Ser Val 1 5
<210> <211> <212> <213>
37 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический промотор
<400> 6
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataa 37
<210> 7
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический промотор
<400> 7
aatttttaat atataa 16
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ индукции CD8 Т-клеточного ответа на неоантиген у человека, включающий одно или более введений рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), где рекомби-нантный MVA содержит промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, причем промотор Pr13.5 содержит 1 или 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая на 100% идентична SEQ ID N0:1.
2. Способ по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 нуклеотидов, которая на 100% идентична SEQ ID N0:1.
3. Способ по п.1, в котором промотор Pr13.5 содержит SEQ ID N0:2.
4. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) для индукции CD8 Т-клеточного ответа на неоантиген у человека, содержащий промотор Pr13.5, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей неоантиген, в котором промотор Pr13.5 содержит 1 или 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 оснований, которая на
1.
100% идентична SEQ ID N0:1.
5. Рекомбинантный MVA по п.4, в котором промотор Pr13.5 содержит 2 копии нуклеотидной последовательности, состоящей по меньшей мере из 40 нуклеотидов, которая на 100% идентична SEQ ID
N0:1.
6. Рекомбинантный MVA по п.4, в котором промотор Pr13.5 содержит SEQ ID N0:2.
Г , г , 1 , , , , ,Г Г 'Г! т Г 1 L Г Г Г ч ¦> I ,ТТ т [ " ,ч ffu juTTG TCGTACGCGT TCGTATAAAA
Pr13.5-long
ATAGAAACTA ТААТСАТАТА AIAGTGIAGG 'TTGGTAGIAI TGCTCTTGTG ACTAGAGACT TTAGT TAAGG TACTGTAAAA ATAGAAACTA TAATCATATA
f
Pr13.5-short
T'GTGT" т т TT TGT^ TT~ 1 ,,T"i T Тт "TT"'TTTT' TT TTT T TV T"TT"TT""T "T
Фиг. 1
TTl T , 1 Tl Г т T- T- ,Л Г ПТ ,ТЬн ,G ТА T ¦? j- г г
Pr13.5-lons ^^^^^^^^^^T^^^^v
J Pr13.5-short
15773 -T GTGT т у "Tu T JT*-}T ТТГЛ T ,TI "TT -TTmT-. ТТЛч^ T T J TT ^ T T TT-TT -T T
3 о x; i-o о о
MVA13.5-short
Pr7.5 opt + MVA13.5 spacer long Фиг. 6
PrS
пустой вектор
?¦ Ш :Q X
w Ф
4000
400
V V
01 Q. U
Фиг. 8A
Фиг. 8В
94486471 94486471
7431 7388
7508 7464
7442 7399
7519 7475
Фиг. 8С
Фиг. 8D
Фиг. 8Е
Фиг. 8F
7 029 6969 7045 6921
12589 12669 7621 7 697 3 9f'7
16191 16119 27891 27813 27477
28418 28500
29621 2 82 60 28343 15206 15154 15703 15651 15206 15154 15279 15227 14870 14818 15033 14981 _ -
13289 13356 13318 13385 13452
gi[383866716|JQ410350.1
gi!3 734495 5 81JN654986.1
gi!3 734493181JN654985.1
gi|373449076|JN654984.1
gil3734488471JN654983.1
gil373448604[JN654982.1
gi[373448367|JN654981.1
gi|373448133[JN654980.1
gi|373447891|JN654979.1
gil373447653[JN654978.1
gi[373447414|JN654977.1
gi 373447173 .1X634970.1
gi|325558812|HQ420898.1
gi|3255585951HO420897.1
gil325558381jHQ420896.1
gi|325558165|HQ420895.1
gi[325557951|HO420894.1
gi[ 167412463IE U410304.1
gill 608578761AM501482.1
gi|149786253|EF675191.1
gilll9352440[DQ121394.1 gil90819652;DQ439815.1
gill 156074201DQ983239.1 gill 15607419IDQ983 238.1 gill 156074181DQ983 237.1
Вирус оопы мышей из коллекции АКТК:VR-1431, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax. клон DPP21. полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP20, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax. клон DPP19, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP17, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP16. полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP15, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP13. полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP12. полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax. клон DPP11, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP10, полный геном Штамм вируса осповакцины Dryvax, клон DPP9, полный геном Вирус оспы коров Germany 2002JVIKY. полный геном Вирус оспы коров Germany_1998_2, полный геном Вирус оспы коров Germany_1990_2, полный геном Вирус оспы коров Germany_1980_EP4, полный геном Вирус оспы коров France_2001_Nancy, полный геном Вирус осповакцины GLV-II168. полный геном
Вирус осповакцины Анкара, хориоаллантоисный вирус осповакцины Анкара (CVA), экзом
Штамм вируса осповакцины MVATGN33.1, модифицированный вирус Анкара, полный геном
Штамм вируса осповакцины Lister, клон VACV107, полный геном Штамм вируса осповакцины DUKE, полный геном
Штамм вируса осповакцины AGR-MVA-572, прегеномная последовательность Штамм вируса осповакцины MVA-BN, геномная последовательность Штамм вируса осповакцины MVA-572, геномная последовательность
gi|l 15607417[DQ983236.1 Штамм вируса осповакцины MVA-I721, геномная последовательность
giimi84167|DO792504.1 gill09726482|DQ437592.1
gi[109726279|DO437591.1
gill 097260761DO437590.1
gi[1097258721DO437589.1
gi|109725669|DO437588.1 gi[109725465[DQ437587.1
gi[109725262|DO437586.1
Изолят вируса оспы лошадей MNR-76. полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Syria 1972 V 72-199, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Sumatra 1970 Y 70-222. полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Somalia 1977, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Pakistan 1969 (Rafig Lahore), полная последовательность
Штамм вируса натуральной оспы Nepal 1973, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Iran 1972 2602 Tabriz, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы India 1964 7125 Vellore, полный геном Фиг. 9А
gil 109725056IDO437585.1
gt|109724854iDO437584.1
gill09724650iDQ437583.1 ai K"724445l)0437382.1 gill097242431DO437581.1
gi! 109724039IDQ4375 80.1 gil944901041DO441448.1 gil944898961DQ441447.1 gi|944896951DQ441446.1 gij94489496|DQ441445.1 gil94489293[DQ441444.1
gi|94489094jDQ441443.1 gii944888941DQ441442.1 gi!94488693|DQ441441.1 gil94488492|DO441440.1 gi!94488292jDQ441439.1 gij94488092|DO441438.1 gil94487887|DQ441437.1
gi|94487685[DQ441436.1 gil944874841DQ441435.1
gi!944872781DQ441434.1
gi!944870781DO441433.1 gi!94486875|DQ441432.1
gi|944866731DQ441431.1 ¦-¦i 94486471 1)0441430.1 ui 94486268 DQ441429.1 gil944860651DQ441428.1 gi|944858631DQ441427.1
Штамм вируса натуральной оспы India 1964 7124 Vellore, полный геном
HI гамм вируса натуральной оспы Germany 1958 Heidelberg, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Congo 1970, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы China Horn 1948, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Bangladesh 1975 \ 75-550 Ванн, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Afghanistan 1970 Variolator 4, полный геном Штамм вируса натуральной оспы Yugoslavia 1972 V 72-164. полный геном
Штамм: вируса натуральной оспы United Kingdom 1952 Butler, полный геном
Штамм вируса натуральной оспы United Kingdom 1947 Higgins (Staffordshire), полный геном
натуральной оспы
натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы
натуральной оспы
натуральной оспы
натуральной оспы натуральной оспы натуральной оспы
United Kingdom 1 946 I Ianev. полный юном
Tanzania 1965 kembula, полный геном Sumatra 1970 V70-228, полный геном Sudan 1947 (Rumbec), полный геном Sudan 1947 (Juba), полный геном Somalia 1977 (V77-1605), полный геном Somalia 1977 (V77-1252). полный геном Sierra Leone 1969 (V68-258), полный геном South .Africa 1965 (103 T'vaal, Nelspruit),
South Africa 1965 (102 Natal, Ingwavuma),
Niger 1969 (001. importation from Nigeria),
Kuwait 1967 (K1629), полный геном Korea 1947 (Lee, Masterseed), полный геном Japan 1951 (Stillwell, Masterseed). полный
Штамм вируса натуральной оспы United Kingdom 1946 I linden (Middlesex), полный геном
Штамм вируса
Штамм вируса Штамм вируса Штамм вируса Штамм вируса Штамм вируса Штамм вируса Штамм вируса
Штамм вируса полный геном
Штамм вируса полный геном
Штамм вируса полный геном Штамм вируса Штамм вируса
Штамм вируса геном
Штамм вируса натуральной оспы Japan 1951 (Harper, Masterseed), полный геном натуральной оспы Japan 1946 (Yamada MS-2( A) Tokyo), полный
натуральной оспы India 1953 (New Delhi), полный геном натуральной оспы India 1953 (Kali-Muthu-M50 Madras), полный
Фиг. 9В
gi|944856591DQ441426.1 gil94485457|DQ441425.1
ai 94485254 1K,)441424.1
gi|944850531DQ441423,l
gil944848551DQ441422.1
gil94484657[DQ44142Ll
gii944844601DQ441420.1
ai 94484252 DQ441419.1
gij94484050!DQ441418.1
gil944838471DQ441417.1
gii94483641lDQ441416.1
gii906604531DQ43 7594.1
gil906602331DO437593.1 ai 38348838 ЛУ313847.1 ai 37331435 AV31 3848.1 gi|88900616!DQ377945.1 gij44971363IAY484669.1
gi|47088326jAY603355.1
gi|S6713341|AY678275.1
gi|56713625|AY678277.1
gi!56713624IAY678276.]
ai 18482913 AF438I65.1
gij22123748jAF012825.2
gill9717929iAY009089.1
gi|2772662[U94848.1
gi!29692106lAY243312.1
gij583055S|Y 16780.1
gij8857961Ul 8340.1
ai 883724 Г18338.1 ai 88368ft fl 8337.1 gi|4567581X69198.1 gil6969640jAF095689.1 gij623595!L22579.1
Штамм вируса натуральной оспы Guinea 1969 (005), полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Ethiopia 1972 (Ethl7 R14-1X-72 Addis), полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Ethiopia 1972 (Ethl6 R14-1X-72 Addis), полный геном
Штамм вируса натуральной оспы Congo 9 1970 (v74-227 Gispen), полный геном Штамм вируса натуральной оспы Bangladesh 1974 (Solaiman), полный геном Штамм вируса натуральной оспы Bangladesh 1974 (Shahzaman), полный геном Штамм вируса натуральной оспы Bangladesh 1974 (nur islam), полный геном Штамм вируса натуральной оспы Brazil 1966 (v66-39 Sao Paulo), полный геном Штамм вируса натуральной оспы Botswana 1973 (v73-225). полный геном Штамм вируса натуральной оспы Botswana 1972 (v72-143), полный геном Штамм вируса натуральной оспы Benin, Dahomey 1968 (v68-59), полный геном
Вирус оспы гололапых песчанок, штамм Dahomey 1968. полный геном
Вирус оспы коров Germany 91-3, полный геном
Штамм вируса осповакцины Acambis. клон 2000, полный геном
Штамм вируса осповакцины Acambis. клон 3, полный геном
Штамм вируса осповакцины 3737. полный геном
Вирус оспы кроликов, полный геном
Штамм вируса осповакцины Acambis 3000. модифицированный вирус Анкара (MYА), полный геном
Штамм вируса осповакцины LC16m8, полный геном Штамм вируса осповакцины LC16mO, полный геном Штамм вируса осповакцины Lister, полный геном Вирус оспы верблюдов М-96 Kazakhstan, полный геном Штамм вируса оспы мышей Moscow, полный геном Вирус оспы верблюдов CMS, полный геном
Штамм вируса осповакцины Анкара, полная геномная последовательность Вирус осповакцины \YR. полный геном Вирус малой оспы, полный юном
Вирус натуральной оспы Somalia-1977, левый вариабельный участок
Вирус натуральной оспы Garcia-1966. левый околотерминальный участок
Вирус натуральной оспы Congo-1965, левый околотерминальный участок Вирус натуральной оспы DNA, полный геном Вирус осповакцины (штамм Tian Tan), полный геном Вирус большой оспы (штамм Bangladesh-1975), полный геном Фиг. 9С
gi[335691|M22812.1
gij335317IM35027.1
gi|3 25 5 59026[HQ420899.1
gii325514012[HQ407377.1
gi|3255592381HO420900.1
gi|30795158|AF482758.2
gi|3 25 5 5 773 7|HQ420893.1
gij684494791DO011157.1
gii68449280!DQ011156.1
gi|68448677|DO011153.1
gi|59858806jAY753l85.1
gij582204701AY741551.1
gi|51342166IAY6()3973.1
gi|305194051X94355.2
gi[323098609|HQ857S63.1
gi|323098410[HO857562.1
ai 30087202511X1172544.1
gi[562369511AY743598.1
gi|68449077|DQ0U155.1
gi|684488761DQ011154.1
gi|17529780jAF380138.1
Вирус осповакцины, геном, левый участок
Вирус осповакцины Copenhagen, полный геном
Вирус оспы коров Norway_1994_MAN, полный геном
Вирус оспы коров Austria 1999, полный геном
Вирус оспы коров UK2000 JS2984, полный геном
Вирус оспы коров Brighton Red, полный геном
Вирус оспы коров Finland_2000_MAN, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян USA2003 039, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян Liberia 1970_184, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян I SA 2003 (144. полный геном
Штамм вируса оспы обезьян СОР-5 8. полный геном
Изолят вируса оспы обезьян Sierra Leone, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян MPXY-WR AIR7-61. полный геном
Вирус оспы коров GRI-90, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян D14L knockout, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян V79-I-005, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян Zaire 1979-005, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян Congo-8, частичная последовательность
Штамм вируса оспы обезьян Zaire_1979-005. полный геном
Штамм вируса оспы обезьян Congo J2003_3 58, полный геном
Штамм вируса оспы обезьян Zaire-96-I-16, полный геном
Фиг. 9D
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032498
032498
- 8 -
- 9 -
032498
032498
- 11 -
032498
032498
- 13 -
032498
032498
- 13 -
032498
032498
- 14 -
- 14 -
032498
032498
- 15 -
- 15 -
032498
032498
- 15 -
- 15 -
032498
032498
- 16 -
- 16 -
032498
032498
- 18 -
- 18 -
032498
032498
- 19 -
- 19 -
032498
032498
- 20 -
- 20 -
032498
032498
- 21 -
- 21 -