|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий стадию ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала в реакторе объемом 1 м 3 или более с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, одна из которых является GH61, где применяют от 0,05 до 3,0 мг ферментной композиции/г исходного сырья по сухому веществу, гидролиз проводят при температуре 45°C или более, время протекания гидролиза составляет от 5 до 150 ч, pH в ходе гидролиза составляет от 3,0 до 6,4, в течение стадии ферментативного гидролиза лигноцеллюлозный материал барботируют кислородом, причем содержание сухого вещества лигноцеллюлозного материала на стадии гидролиза составляет 10 мас.% или более. 2. Способ по п.1, включающий предварительную обработку лигноцеллюлозного материала паром, горячей водой, или разбавленной кислотой, или разбавленным основанием перед стадией гидролиза. 3. Способ по п.1 или 2, включающий отмывку лигноцеллюлозного материала. 4. Способ по любому из пп.1-3, включающий извлечение сахарного продукта из реактора. 5. Способ получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии: осуществление способа по любому из пп.1-4 и ферментация микроорганизмом гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации, выбранного из группы, включающей биогаз, этанол, бутанол, молочную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, лимонную кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, β-лактамный антибиотик, цефалоспорин, витамин, лизин, метионин, триптофан, треонин, аспарагиновую кислоту, протеазу, целлюлазу, амилазу, глюканазу, лактазу, липазу, лиазу, оксидоредуктазу, трансферазу или ксиланазу. 6. Способ по п.5, включающий извлечение продукта ферментации. 7. Способ по любому из пп.1-6, где кислород во время барботирования лигноцеллюлозного материала добавляют неравномерно, причем в течение одной части времени барботирования к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени, где промежуток времени, в течение которого кислород добавляют меньше, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза и где концентрация кислорода в жидкой фазе в течение указанного промежутка по меньшей мере в 2 раза ниже по сравнению с его концентрацией в течение промежутка времени, при котором добавляют больше кислорода. 8. Способ по пп.1-6, где в течение одного промежутка времени ферментативного гидролиза лигноцеллюлозный материал не барботируют кислородом, причем промежуток времени, в течение которого не добавляют кислород, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза. 9. Способ по любому из пп.1-6, где кислород во время барботирования лигноцеллюлозного материала добавляют неравномерно, причем в течение одной части времени барботирования к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени, где промежуток времени, в течение которого добавляют больше кислорода, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза и где концентрация кислорода в жидкой фазе в течение указанного промежутка по меньшей мере в 2 раза выше по сравнению с его концентрацией в течение промежутка времени, при котором добавляют меньше кислорода. 10. Способ по пп.1-6, где в течение одного промежутка времени ферментативного гидролиза лигноцеллюлозный материал не барботируют кислородом, причем промежуток времени, в течение которого добавляют кислород, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза. 11. Способ по любому из пп.1-10, где ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или более. 12. Способ по любому из пп.1-11, где ферментную композицию получают из гриба штаммов Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Rasamsonia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma. 13. Способ по любому из пп.1-12, где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 14 мас.% или более. 14. Способ по п.13, где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно от 14 до 33 мас.%. 15. Способ по любому из пп.1-14, где ферментативный гидролиз проводят в реакторе периодического действия, периодического действия с подпиткой или для непрерывного культивирования. 16. Способ по любому из пп.5-15, где ферментацию осуществляют микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С 5 -сахар. 17. Способ по п.16, где микроорганизм является дрожжами.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий стадию ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала в реакторе объемом 1 м 3 или более с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, одна из которых является GH61, где применяют от 0,05 до 3,0 мг ферментной композиции/г исходного сырья по сухому веществу, гидролиз проводят при температуре 45°C или более, время протекания гидролиза составляет от 5 до 150 ч, pH в ходе гидролиза составляет от 3,0 до 6,4, в течение стадии ферментативного гидролиза лигноцеллюлозный материал барботируют кислородом, причем содержание сухого вещества лигноцеллюлозного материала на стадии гидролиза составляет 10 мас.% или более. 2. Способ по п.1, включающий предварительную обработку лигноцеллюлозного материала паром, горячей водой, или разбавленной кислотой, или разбавленным основанием перед стадией гидролиза. 3. Способ по п.1 или 2, включающий отмывку лигноцеллюлозного материала. 4. Способ по любому из пп.1-3, включающий извлечение сахарного продукта из реактора. 5. Способ получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии: осуществление способа по любому из пп.1-4 и ферментация микроорганизмом гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации, выбранного из группы, включающей биогаз, этанол, бутанол, молочную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, лимонную кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, β-лактамный антибиотик, цефалоспорин, витамин, лизин, метионин, триптофан, треонин, аспарагиновую кислоту, протеазу, целлюлазу, амилазу, глюканазу, лактазу, липазу, лиазу, оксидоредуктазу, трансферазу или ксиланазу. 6. Способ по п.5, включающий извлечение продукта ферментации. 7. Способ по любому из пп.1-6, где кислород во время барботирования лигноцеллюлозного материала добавляют неравномерно, причем в течение одной части времени барботирования к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени, где промежуток времени, в течение которого кислород добавляют меньше, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза и где концентрация кислорода в жидкой фазе в течение указанного промежутка по меньшей мере в 2 раза ниже по сравнению с его концентрацией в течение промежутка времени, при котором добавляют больше кислорода. 8. Способ по пп.1-6, где в течение одного промежутка времени ферментативного гидролиза лигноцеллюлозный материал не барботируют кислородом, причем промежуток времени, в течение которого не добавляют кислород, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза. 9. Способ по любому из пп.1-6, где кислород во время барботирования лигноцеллюлозного материала добавляют неравномерно, причем в течение одной части времени барботирования к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени, где промежуток времени, в течение которого добавляют больше кислорода, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза и где концентрация кислорода в жидкой фазе в течение указанного промежутка по меньшей мере в 2 раза выше по сравнению с его концентрацией в течение промежутка времени, при котором добавляют меньше кислорода. 10. Способ по пп.1-6, где в течение одного промежутка времени ферментативного гидролиза лигноцеллюлозный материал не барботируют кислородом, причем промежуток времени, в течение которого добавляют кислород, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза. 11. Способ по любому из пп.1-10, где ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или более. 12. Способ по любому из пп.1-11, где ферментную композицию получают из гриба штаммов Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Rasamsonia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma. 13. Способ по любому из пп.1-12, где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 14 мас.% или более. 14. Способ по п.13, где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно от 14 до 33 мас.%. 15. Способ по любому из пп.1-14, где ферментативный гидролиз проводят в реакторе периодического действия, периодического действия с подпиткой или для непрерывного культивирования. 16. Способ по любому из пп.5-15, где ферментацию осуществляют микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С 5 -сахар. 17. Способ по п.16, где микроорганизм является дрожжами.
Евразийское 032496 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201500516
(22) Дата подачи заявки 2013.11.07
(51) Int. Cl. C12P1/00 (2006.01) C12P19/14 (2006.01)
(54) СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО МАТЕРИАЛА И ФЕРМЕНТАЦИИ САХАРОВ
(31) 12191957.5; 13174656.2; 13176083.7; 13176500.0; 13184701.4; 13184702.2
(32) 2012.11.09; 2013.07.02; 2013.07.11; 2013.07.15; 2013.09.17; 2013.09.17
(33) EP
(43) 2015.08.31
(86) PCT/EP2013/073255
(87) WO 2014/072395 2014.05.15
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Беркхаут Михаэл Петрус Йозеф, Нордам Бертус (NL)
(74) Представитель:
Саломатина И.С., Фелицына С.Б. (RU)
(56) PODKAMINER ET AL.: "Ethanol
and anaerobic conditions reversibly inhibit commercial cellulase activity in thermophilic simultaneous saccharification and fermentation (tSSF)", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, vol. 5, 15 June 2012 (2012-06-15), pages 43-51, XP021108101, See page 44 (last paragraph) - page 49 (until Methods); online publication
BEY ET AL.: "Cello-oligosaccharide oxidation reveals differences between two lytic polysaccharide monooxygenases (family GH61) from Podospora anserina", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 79, 2 November 2012
(2012-11-02), pages 488-496, XP008160285, See
page 488 (Abstract); early online publication
KOSTYLEV ET AL.: "Synergistic interactions in cellulose hydrolysis", BIOFUELS, vol. 3, January 2012 (2012-01), pages 61-70, XP002693861, See page
VIIKARI ET AL.: "Lignocellulosic ethanol: From science to industry", BIOMASS AND BIOENERGY, vol. 46, 6 June 2012 (2012-06-06),
pages 13-24, XP002718612, See sections 4.1 (GH61), 4.1.4 (Talaromyces), and 4.2.2 (GH61); online publication
LEVASSEUR ET AL.: "Expansion of the
enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes", BIOTECHNOLOGY FOR
BIOFUELS, vol. 6, 21 March 2013 (2013-03-21),
pages 41-54, XP0021147399, See page 45 (AA9/ GH61); early online publication
(57) Изобретение относится к способу получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающему следующие стадии: a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала; b) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала; c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, в результате чего ферментная композиция, по меньшей мере, включает GH61; в результате чего d) применение менее чем 7,5 мг ферментной композиции/г глюкана (на сухое вещество и на фермент как белок) или менее чем 3,0 мг ферментной композиции/г исходного сырья (на сухое вещество и на фермент как белок); e) ферментация гидролизованного лигноцеллюлозного материала с получением продукта ферментации и f) необязательно, извлечение продукта ферментации; в котором перед и/или в течение ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способу ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров.
Уровень техники
Лигноцеллюлозный растительный материал, в настоящем документе также называемый исходным сырьем, представляет собой возобновляемый источник энергии в форме сахаров, которое может быть превращено в ценные продукты, например в сахара или биотопливо, такое как биоэтанол. При осуществлении этого способа (лигно- или геми)целлюлозу, присутствующую в исходном сырье, таком как пшеничная солома, кукурузная солома, рисовая шелуха и т.п., превращают в редуцирующих сахара с помощью ферментов, воздействующих на (геми)целлюлозу, которые затем необязательно превращают в ценные продукты, такие как этанол, под действием микроорганизмов, таких как дрожжи, бактерии и грибы.
Поскольку (геми)целлюлоза представляет собой кристаллическое вещество, заключенное в сети лигнина, то превращение в редуцирующие сахара в целом протекает медленно и не полностью. Как правило, ферментативный гидролиз необработанного исходного сырья дает выход по сахарам <20% от теоретического количества. После применения химической и термофизической предварительной обработки (геми)целлюлоза становится более доступной для действия разлагающих целлюлозу ферментов, и, таким образом, превращение протекает быстрее и дает более высокие выходы.
Типичный выход этанола из глюкозы, полученной из предварительно обработанной кукурузной соломы, равен 40 галлонам этанола на 1000 кг сухой кукурузной соломы (Badger, P., Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses, 2002, J. Janick and A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA) или 0,3 г этанола на 1 г исходного сырья. Максимальный выход этанола по отношению к целлюлозе равен приблизительно 90%.
Разлагающие целлюлозу ферменты - большинство из них продуцируются такими видами, как Trichoderma, Humicola и Aspergillus, - коммерчески применяют для преобразования предварительно обработанного исходного сырья в затор, содержащий нерастворимую (геми)целлюлозу, полученные из нее редуцирующих сахара и лигнин. Разлагающие целлюлозу термостабильные ферменты, полученные из Rasamsonia, применяют для разрушения исходного лигноцеллюлозного сырья, и данные ферменты известны своей термостабильностью, см. WO 2007/091231. Полученный затор применяют для ферментации, в ходе которой редуцирующие сахара превращаются в дрожжевую биомассу (клетки), углекислый газ и этанол. Этанол, полученный таким образом, называют биоэтанолом.
Гидролиз, представляющий собой обычный способ получения сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного исходного сырья, также называемый разжижение, предварительное осаха-ривание или осахаривание, как правило, происходит в ходе процесса, длящегося от 6 до 168 ч (Kumar, Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517-526) при повышенных температурах от 45 до 50°C, и в нестерильных условиях. В ходе этого гидролиза присутствующая целлюлоза частично (как правило, от 30 до 95%, в зависимости от активности ферментов и условий гидролиза) превращается в редуцирующие сахара. В случае ингибирования ферментов соединениями, присутствующими в предварительно обработанном исходном сырье, и высвободившимися сахарами и, для того чтобы свести к минимуму тепловую инактивацию, данный период повышения температуры сводят к минимуму, насколько это возможно.
Следующая за гидролизом ферментация протекает в ходе отдельной, предпочтительно анаэробной, стадии способа или в том же самом, или в другом сосуде, в котором температуру снижают до 30-33°C (мезофильный способ) для приспособления к росту биомассы микроорганизмов и продукции ее этанола, как правило, дрожжами. В ходе данного способа ферментации оставшийся (геми)целлюлозный материал превращается в редуцирующие сахара под действием ферментов, уже присутствующих со стадии гидролиза, в то время как производится биомасса микроорганизмов и этанол. Ферментацию заканчивают в тот момент, когда (геми)целлюлозный материал превращается в ферментируемые сахара, а все ферментируемые сахара превращаются в этанол, углекислый газ и клетки микроорганизмов. Это может продолжаться до 6 дней. В целом, общее время гидролиза и ферментации может достигать 13 дней.
Полученный таким образом ферментированный затор состоит из неферментируемых сахаров, не-гидролизуемого (геми)целлюлозного материала, лигнина, клеток микроорганизмов (чаще всего дрожжевых клеток), воды, этанола, растворенного углекислого газа. Во время этих последовательных стадий этанол отгоняют из затора и дополнительно очищают. Оставшуюся суспензию твердых веществ высушивают и применяют в качестве, например, горючего, удобрения или корма для скота.
В WO 2010/080407 предлагают обрабатывать целлюлозный материал с помощью целлюлазной композиции в анаэробных условиях. Удаление или исключение активных форм кислорода может повысить эффективность ферментных систем, гидролизующих целлюлозу. Гидролиз целлюлозного материала, например лигноцеллюлозы, под действием ферментной композиции может снижаться из-за окислительного повреждения компонентов ферментной композиции и/или окисления целлюлозного материала, например, под действием молекулярного кислорода.
WO 2009/046538 раскрывает способ обработки лигноцеллюлозного исходного сырья из растительных материалов для высвобождения ферментируемых сахаров с применением способа ферментативного гидролиза для обработки материалов, который осуществляют при пониженном давлении и который дает
обогащенный по сахарам технологический поток, включающий снижение количества летучих саха-ров/ингибирующих ферментацию соединений, таких как фурфурол и уксусная кислота. Помимо удаления летучих ингибирующих соединений, другие соединения и/или молекулы, которые тоже удаляют, включают азот, кислород, аргон и углекислый газ.
С каждой партией исходного сырья добавляют ферменты для того, чтобы сделать максимальным выход и скорость получения ферментируемых сахаров, высвобождающихся из предварительно обработанного лигноцеллюлозного исходного сырья в течение заданного времени способа. В целом, расходы на производство ферментов, отношение выходов по этанолу к исходному сырью и инвестициям представляют собой основные факторы затрат в общих затратах на производство (Kumar, S. Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517-526). До настоящего времени снижение вклада ферментов в стоимость достигали путем применения ферментных препаратов из одного или нескольких микробных источников (WO 2008/008793) с более широкой и/или высокой (специфической) гидролитической активностью, применение которых было направлено на снижение потребности в ферментах, повышение скоростей превращения и/или повышение выходов при превращении и, таким образом, на снижение суммарных затрат при получении этанола в целом. Это требует больших инвестиций в научно-исследовательские разработки данных ферментных продуктов. В случае, когда ферментный продукт состоит из ферментов, происходящих из нескольких микробных источников, необходимы крупные капитальные инвестиции для производства каждого отдельного ферментного соединение.
Поэтому желательно усовершенствовать приведенный выше способ, включающий гидролиз и ферментацию.
Раскрытие изобретения
Таким образом, цель изобретения заключается в обеспечении способа, в котором стадию гидролиза проводят в усовершенствованных условиях. Другая цель изобретения заключается в обеспечении способа, включающего гидролиз с уменьшенным временем способа. Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способа, в котором дозировка фермента может быть снижена и в то же время выход целевого продукта гидролиза сохранится на прежнем уровне или даже увеличится. Еще одна цель заключается в обеспечении способа, включающего гидролиз, в котором условия способа гидролиза оптимизируют. Еще одна дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способа, включающего гидролиз, в котором выход целевого продукта гидролиза увеличивают, применяя такую же дозировку фермента. В соответствии с изобретением достигают одну или несколько из данных целей.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:
a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала;
b) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала;
c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, в результате чего ферментная композиция, по меньшей мере, включает GH61;
d) в результате чего применение менее чем 7,5 мг ферментной композиции/г глюкана (на сухое вещество и на фермент как белок) или менее чем 3,0 мг ферментной композиции/г исходного сырья (на сухое вещество и на фермент как белок);
e) необязательно, извлечение сахарного продукта,
в котором после предварительной обработки и перед и/или во время энзиматического гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород.
Предпочтительно в течение стадии с) энзиматического гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород.
В соответствии с воплощением изобретения в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза, предпочтительно кислород не добавляют к лигноцеллюлозному материалу.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта ферментации из лиг-ноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:
a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала;
b) необязательно, промывка необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала;
c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, в результате чего ферментная композиция, по меньшей мере, включает
GH61;
d) ферментация гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации;
e) в результате чего применение менее чем 7,5 мг ферментной композиции/г глюкана (на сухое вещество и на фермент как белок) или менее чем 3,0 мг ферментной композиции/г исходного сырья (на сухое вещество и на фермент как белок);
f) необязательно, извлечение продукта ферментации,
в котором после предварительной обработки и перед и/или во время энзиматического гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород.
Предпочтительно в течение стадии с) энзиматического гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород.
В соответствии с воплощением изобретения в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют кислород и в течение части времени ферментативного гидролиза к лигноцеллюлозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза, предпочтительно кислород не добавляют к лигноцеллюлозному материалу.
В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения часть времени, в течение которой добавляют меньше кислорода или предпочтительно кислород не добавляют, равна от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
В соответствии с другим предпочтительным воплощением изобретения часть времени, в течение которой добавляют больше кислорода, равна от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза, более предпочтительно часть времени, в течение которой добавляют больше кислорода, равна:
a) от 12 до 50% и предпочтительно от 20 до 40%, если кислород добавляли во второй половине времени ферментативного гидролиза;
b) от 2 до 30%, предпочтительно от 4 до 25% и более предпочтительно от 5 до 20% от общего времени ферментативного гидролиза, если кислород добавляли в первой половине времени ферментативного гидролиза; или
c) комбинация (а) и (b).
Преимущественно концентрация кислорода в жидкой фазе гидролиза в течение части времени, когда добавляют кислород, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше концентрации кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда кислорода добавляли меньше или кислород не добавляли.
В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением изобретения в части времени, когда кислород добавляли, концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствовал лигноцел-люлозный материал, в ходе ферментативного гидролиза, равна по меньшей мере 0,001 моль/м3, предпочтительно по меньшей мере 0,002 моль/м3 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,003 моль/м3 и еще более предпочтительно более чем 0,01 моль/м3, например более чем 0,02 или 0,03 моль/м3. В реакторах объемом менее чем 1 м3 величины DO менее чем 0,01 или 0,02 моль/м3 будут получены при медленном перемешивании. Интенсивное смешивание или перемешивания при такой шкале вводит часть газовой фазы свободного пространства в реакционную жидкость. Например, смешивание или перемешивание может создать воронку, которая затянет кислород в жидкость. В целом, продувка свободного пространства воздухом в комбинации с (энергичным) смешиванием или перемешиванием введет достаточно кислорода в целлюлозный материал в реактор для гидролиза для реакторов, размером вплоть до 100 л - 1 м3. В более широком масштабе, например, в реакторе размером 50 м3 или более, например 100 м3, так много энергии потребуется для энергичного перемешивания, что с экономической точки зрения это не найдет применения в способе промышленной эксплуатации. В целом в крупных реакторах перемешивание или смешивание без введения воздуха или кислорода приведет к величинам DO менее чем 0,01 моль/м3.
В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением изобретения при добавлении кислорода (в той части времени, когда кислород добавляли) концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствовал лигноцеллюлозный материал, в ходе ферментативного гидролиза, предпочтительно равна самое большее 80% от насыщающей концентрации кислорода в условиях протекания реакции гидролиза, более предпочтительно самое большее 0,12 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,09 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,06 моль/м3, даже еще более предпочтительно самое большее 0,045 моль/м3 и наиболее предпочтительно самое большее 0,03 моль/м3. Температура и давление влияют на DO. Приведенные выше предпочтительные и типичные величины, выраженные в моль/м3, относятся к нормальному атмосферному давлению и температуре, равной примерно 62°C. Специалисту в данной области техники известны подходящие величины DO на основе современных учений.
В соответствии с другим предпочтительным воплощением изобретения реактор для ферментативного гидролиза имеет объем, равный 1 м3 или более. Время протекания ферментативного гидролиза на
стоящего способа предпочтительно равно от 5 до 150 ч. В соответствии с дополнительным предпочтительным аспектом изобретения ферментную композицию получают из гриба, предпочтительно микроорганизма рода Rasamsonia, или ферментная композиция включает фермент грибов, предпочтительно фермент Rasamsonia. В соответствии с еще одним дополнительным предпочтительным аспектом изобретения содержание сухого вещества на стадии гидролиза (с) равно 10 мас.% или более предпочтительно 14 мас.% или более и еще более предпочтительно от 14 до 33 мас.%. Ферментативный гидролиз предпочтительно протекает в реакторе периодического действия, в реакторе периодического действия с подпиткой и/или в реакторе для непрерывного культивирования. Предпочтительно кислород, который вводят в настоящем способе, представляет собой кислородсодержащий газ, такой как воздух. Термин "меньше кислорода добавляют к лигноцеллюлозному материалу или меньше кислорода присутствует в лигноцел-люлозном материале" в течение части времени ферментативного гидролиза означает, что вводят по меньшей мере на 50% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 70% меньше, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% меньше кислорода (выраженного в моль кислорода/м3), например, в виде пузырей или меньше кислорода присутствует по сравнению с тем, сколько его добавляют или сколько его присутствует в течение другой части времени ферментативного гидролиза, при которой меньше кислорода добавляют.
В предпочтительном воплощении кислород добавляют в виде (газообразных) пузырей.
Удивительно, но в соответствии с изобретением путем добавления кислорода можно достичь многих преимуществ способа, включая оптимальные температурные условия, уменьшение времени способа, уменьшение дозировки фермента, повторное применение ферментов, увеличенные выходы и другие оптимизации способа, приводящие к снижению затрат.
В воплощении примененная стабильная ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или более. В соответствии с дополнительным воплощением гидролиз предпочтительно проводят при температуре 45°C или более, предпочтительно при температуре 50°C или более и более предпочтительно при температуре 55°C или более. Способ изобретения будет проиллюстрирован более подробно ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Влияние барботирования перед гидролизом азотом или воздухом 10%-ного исходного сырья aCS на общее количество глюкозы (г/л), высвобождаемое под действием смеси ТЕС-210 (1), смеси
4E-GH61 (2) и смеси 4E-EG (3).
Фиг. 2. Глюкоза, полученная по примеру 2: 1 = эксперимент 1: без аэрации, 2 = эксперимент 2: непрерывная аэрация, 3 = эксперимент 3: аэрация начиная с 72 ч и до конца.
Фиг. 3. Влияние времени аэрации на количество глюкозы, полученное в ходе ферментативного гид-
ролиза: = без аэрации, ••• = аэрация между временами гидролиза 0 и 100 ч, = аэрация между
временами гидролиза 0 и 7 ч и аэрация между временами гидролиза 72 и 100 ч.
Фиг. 4. Влияние времени аэрации на количество глюкозы, полученное в ходе ферментативного гидролиза в эксперименте 1 (¦ = аэрация между временами гидролиза 0 и 100 ч) и 2 (? = аэрация между временами гидролиза 72 и 100 ч).
Фиг. 5. Влияние времени аэрации на количество глюкозы, полученное в ходе ферментативного гидролиза, -¦- аэрация между временами гидролиза 72 и 100 ч и -•- аэрация между временами гидролиза 0 и 7 ч.
Фиг. 6. Эффект концентрации растворенного кислорода (DO) на гидролиз глюкана в предварительно обработанном лигноцеллюлозном сырье как функция времени гидролиза для 2,5 мг/г фермента и DO=0,030 моль/м3 (-¦-) и 3,5 мг/г фермента и DO0,005 моль/м3 (-¦-).
Осуществление изобретения
На протяжении всего настоящего описания и сопровождающей формулы изобретения слова "включают и такие вариации, как "включает", "включающий", следует интерпретировать включительно. То есть, данные слова предназначены для выражения потенциального включения других элементов или целых чисел, конкретно не перечисленных, где позволяет контекст. Множественное и единственное число применяют в настоящем документе для обозначения одного или более чем одного (т.е. одного или по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера "элемент" может означать один элемент или более чем один элемент.
В контексте настоящего изобретения "усовершенствованный", "увеличенный", "сниженный" применяют, чтобы показать, что настоящее изобретение демонстрирует преимущество по сравнению с такой же ситуацией, способом или условиями способа, за исключением того, что не добавляют никакого дополнительного кислорода. В контексте настоящего изобретения "измеряли в тех же условиях" или "анализировали в тех же условиях" и т.п. означает, что способ изобретения и такой же способ без добавления кислорода (или с добавлением меньшего количества кислорода) осуществляют в тех же условиях (за исключением добавления кислорода) и что результаты настоящего способа при сравнении со способом без добавления кислорода (или с добавлением меньшего количества кислорода) оценивают с применением таких же условий, предпочтительно с помощью такого же анализа и/или такой же методики, более предпочтительно в рамках такого же или параллельного эксперимента. Условия гидролиза представляют со
бой пример таких условий.
В предшествующем уровне техники предлагается улучшить гидролиз целлюлолитического материала, применяя анаэробные условия (WO 2010/080407) или пониженное давление (WO 2009/046538) в ходе ферментативного гидролиза. В способах в обоих документах уровень кислорода был понижен. Неожиданно было обнаружено, что гидролиз настоящего изобретения приводит в результате к усовершенствованному продукту реакции, который дает более высокие количества продуктов, представляющих собой (восстанавливающие) сахара, и/или желаемых продуктов ферментации в ферментации, следующей за гидролизом, по сравнению со способом, в котором кислород не добавляют. В целом увеличение в наблюдаемое превращение глюкозы было равно от 5 до 15% (мас./мас.) или даже вплоть до 25% (мас./мас.).
Кислород может быть добавлен несколькими способами. Например, кислород может быть добавлен в виде газообразного кислорода, в виде газа, обогащенного кислородом, такого как обогащенный кислородом воздух, или в виде воздуха (пример кислородсодержащего газа). Кислород может быть добавлен непрерывно или с перерывами. Термин "кислород добавляют" означает, что кислород добавляют к жидкой фазе (включающей лигноцеллюлозный материал) в реакторе для гидролиза, и не означает, что кислород присутствует в свободном пространстве в реакторе над жидкой фазой (в комбинации с медленным перемешиванием или без перемешивания), в результате чего кислород вынужден диффундировать из свободного пространства в жидкую фазу.
Поэтому предпочтительно, чтобы кислород добавляли в виде пузырьков, наиболее предпочтительно в виде небольших пузырьков.
В случае, если фермент может быть поврежден из-за присутствия или добавления кислорода, может быть применена более мягкая поставка кислорода. В этом случае может быть найден баланс между усовершенствованной продукцией глюкозы и поведением фермента. Добавление кислорода к целлюлолити-ческому материалу может быть выполнено в ходе ферментативного гидролиза. В случае, если кислород добавляют в газообразной форме, кислородсодержащий газ может быть введен, например продут, в содержимое целлюлолитического материала в ректоре для жидкого гидролиза. В другом воплощении изобретения кислородсодержащий газ вводят в поток жидкого целлюлолитического материала, который входит в реактор для гидролиза. В еще одном воплощении изобретения кислородсодержащий газ вводят вместе с целлюлолитическим материалом, который входит в реактор для гидролиза, или с частью жидкого содержимого реактора, который проходит через внешний контур реактора. В большинстве случаев добавление кислорода перед входом в реактор для гидролиза было недостаточно, и добавление кислорода также может быть выполнено в ходе гидролиза. В другом воплощении изобретения в газовую фазу, находящуюся в верхней части реактора (в свободном пространстве), непрерывно или с перерывами вносили новые порции кислородсодержащего газа. В последнем случае (энергичное) смешивание или перемешивание было необходимо для поставки кислород в виде пузырьков и/или путем диффузии в жидкое содержимое реактора, предпочтительно в комбинации с повышенным давлением в реакторе. В целом продувка свободного пространства воздухом в комбинации с (энергичным) смешиванием или перемешиванием может ввести достаточно кислорода в целлюлозный материал в реакторе для гидролиза для реакторов размером вплоть до 100 л - 1 м3. В более широком масштабе, например, в реакторе размером 50 м3 или более, например 100 м3, для энергичного перемешивания требуется так много энергии, что с экономической точки зрения это не найдет применения в способе промышленной эксплуатации.
В соответствии с настоящим изобретением кислород может быть добавлен перед стадией гидролиза, в течение части стадии гидролиза, в течение всей стадии гидролиза или в комбинации перед или в течение стадии гидролиза. Преимущественно кислород добавляют в течение части стадии гидролиза. Добавление кислорода в течение только части гидролиза может быть выполнено, например, в случае если происходит окислительное повреждение фермента(ов). В случае, если кислород присутствует в содержимом реактора для гидролиза, или на сахарный продукт, или на гидролизат, формируемый на стадии гидролиза, может быть оказано воздействие или он может быть поврежден на последующей стадии ферментации, добавление кислорода может быть выполнено с исключением последней части гидролиза и, таким образом, кислород (большая часть кислорода) будет поглощен, прежде чем гидролизованная биомасса войдет в реактор для ферментации. Преимущественно кислород, предпочтительно в виде (газообразных) пузырей, добавляют на последней части стадии гидролиза.
Авторы изобретения представили гипотезу о том, что в первой части (энзиматического) гидролиза (стадии гидролиза) аморфные полисахариды гидролизуются до сахаров, таких как глюкоза, а во второй части стадии гидролиза оставшиеся кристаллические полисахариды превращаются в сахара. Аморфные полисахариды, например, превращаются в олигосахариды под действием эндоглюканаз, после этого оли-госахариды могут быть превращены в сахара под действием целлобиогидролаз и бета-глюкозидаз (BG). В соответствии с настоящей гипотезой аморфные полисахариды расположены на внешней стороне полисахаридов или полисахаридных комплексов, тогда как кристаллические полисахариды расположены относительно в большей степени с внутренней стороны полисахаридов или полисахаридных комплексов, присутствующих в лигноцеллюлозном материале. Такое превращение кристаллических полисахаридов может продолжаться даже тогда, когда большая часть аморфных полипептидов гидролизуется. В осо
бенности добавление кислорода выгодно в ходе гидролиза кристаллических полисахаридов, например при разрушении полисахаридов до олигосахаридов. В соответствии с данной гипотезой добавление кислорода в особенности полезно во второй части стадии гидролиза. В целом, сокращение времени добавления кислорода (или сокращение второй части гидролиза) необходимо в случае относительно низкого количества кристаллических полисахаридов в лигноцеллюлозном материале по сравнению с гидролизом лигноцеллюлозного материала, в котором присутствуют относительно большие количества кристаллических полисахаридов. Авторы изобретения также утверждают, что добавление кислорода выгодно для гидролиза кристаллических полисахаридов. Таким образом, добавление кислорода очень полезно, в особенности в фазе, в которой кристаллические полисахариды атакуются ферментами. Вне этой фазы может быть эффективнее не добавлять кислород. Таким образом, поставку кислорода можно начинать только во второй части или второй половине гидролиза. В конце гидролиза, когда большая часть кристаллических полисахаридов разрушится, добавление кислорода предпочтительно останавливают. На последней части второй части или второй половины гидролиза большинство полисахаридов превращаются в олиго-сахариды, которые во время дальнейшего разрушения до сахаров меньшего размера больше не нуждаются в кислороде. Таким образом, предпочтительно меньше кислорода по сравнению с добавлением кислорода во время аэрированной части добавляют к лигноцеллюлозному материалу в конце гидролиза или более предпочтительно кислород не добавляют к лигноцеллюлозному материалу в конце гидролиза. Эта гипотеза приведена исключительно в качестве возможного объяснения эффекта, замеченного авторами изобретения, и настоящее изобретение не подпадает под данную теорию или не подтверждает ее правильность.
Авторы изобретения также заметили, что аэрация в течение ферментативного гидролиза в начале гидролиза приводит к увеличению продукции глюкозы в ходе гидролиза.
На фиг. 3 показан эффект аэрации. По сравнению с неаэрируемым гидролизом (показанным как "неаэрируемая" кривая) аэрация в начале гидролиза (показанная как кривая "аэрация 0-7 ч") приведет к немедленному увеличению в продукции глюкозы и, например, уже через 24 ч гидролиза было обнаружено, что продукция глюкозы соответствует продукции глюкозы без аэрации при 60 ч гидролиза в идентичных условиях (за исключением, аэрации). По сравнению с неаэрируемым гидролизом аэрация в последней части гидролиза (показанная как кривая "аэрация 72-100 ч") приведет к немедленному увеличению в продукции глюкозы после аэрации и, например, уже через 24 ч после начала аэрации (на 72 ч) в гидролизе обнаруживают увеличение продукции глюкозы на 30% по сравнению с продукцией глюкозы без аэрации в идентичных условиях (за исключением аэрации). Авторы изобретения полагают, что путем применения аэрации как при старте, так и в последней части гидролиза (применяя период без аэрации между интервалами с аэрацией) можно увеличить продукцию глюкозы, что в результате приведет к увеличению продукции глюкозы, которое будет больше по сравнению с продукцией при двух отдельных увеличениях. Настоящее объяснение дано для руководства и инструктирования специалиста в данной области техники, чтобы он мог выбрать правильные условия для настоящего способа гидролиза.
Несколько примеров (частичной) аэрации в ходе ферментативного гидролиза приведены в примерах для того, чтобы продемонстрировать положительный эффект настоящего изобретения. Этот положительный эффект обнаружили для нескольких субстратов или типов исходного сырья и, таким образом, считается, что он имеет место при гидролизе всех типов субстратов или всех типов исходного сырья.
Несколько примеров ферментных композиций ферментативного гидролиза приведены в примерах для того, чтобы показать положительный эффект настоящего изобретения. Этот положительный эффект обнаружили для несколько ферментных композиций и, таким образом, считается, что он имеет место для всех типов гидролизующих ферментных композиций.
В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения часть времени, в течение которой добавляют меньше кислорода или предпочтительно кислород не добавляют, равна от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза. В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением изобретения часть времени, в течение которой добавляют больше кислорода, равна от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза. В целом концентрация кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда добавляют кислород, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше концентрации кислорода в жидкой фазе в течение части времени, когда кислорода добавляют меньше или кислород не добавляют.
В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением изобретения в течение части времени, при котором добавление кислорода имеет место в жидкой фазе (с помощью аэрации или добавления кислорода), концентрация кислорода (DO) в жидкой фазе, в которой в ходе ферментативного гидролиза присутствует лигноцеллюлозный материал, равна по меньшей мере 0,001 моль/м3, предпочтительно по меньшей мере 0,002 моль/м3, более предпочтительно по меньшей мере 0,003 моль/м3 и еще более предпочтительно более чем 0,01 моль/м3, например более чем 0,02 или 0,03 моль/м3. В реакторах объемом менее чем 1 м3 при медленном перемешивании будут получены величины DO менее чем 0,01 или 0,02 моль/м3. Интенсивное смешивание или перемешивание при такой шкале вводит часть газовой
фазы свободного пространства в реакционную жидкость. Например, смешивание или перемешивание может создать воронку, которая затянет кислород в жидкость. В целом продувка свободного пространства кислород (например, в виде воздуха) в комбинации с (энергичным) смешиванием или перемешиванием введет достаточно кислорода в целлюлозный материал в реакторе для гидролиза для реакторов размером вплоть до 100 л - 1 м3. В более широком масштабе, например, в реакторе размером 50 м3 или более, например 100 м3, для энергичного перемешивания требуется так много энергии, что с экономической точки зрения это не найдет применения в способе промышленной эксплуатации. В целом в крупных реакторах перемешивание или смешивание без введения воздуха или кислорода приведет к величинам DO менее чем 0,01 моль/м3.
В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением изобретения при генерации кислорода или получении концентрации кислорода в жидкой фазе (аэрации или добавлении кислорода) концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствует лигноцеллюлозный материал в ходе ферментативного гидролиза, равна в течение части времени, когда добавляют кислород, предпочтительно самое большее 80% от насыщающей концентрации кислорода в условиях протекания реакции гидролиза, более предпочтительно самое большее 0,12 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,09 моль/м3, еще более предпочтительно самое большее 0,06 моль/м3, даже еще более предпочтительно самое большее 0,045 моль/м3 и наиболее предпочтительно самое большее 0,03 моль/м3. Температура и давление влияют на DO. Приведенные выше предпочтительные и типичные величины (моль/м3) относятся к нормальному атмосферному давлению и к температуре, равной примерно 62°C. Специалисту в данной области техники известны подходящие величины DO на основе современных учений.
В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением изобретения концентрация кислорода в жидкой фазе, в которой присутствовал лигноцеллюлозный материал, в ходе ферментативного гидролиза в течение части времени, когда кислорода добавляют меньше или кислорода не добавляют, равна менее чем 0,02 моль/м3, предпочтительно менее чем 0,01 моль/м3, более предпочтительно менее чем 0,005 моль/м3 и наиболее предпочтительно менее чем 0,001 моль/м3.
Добавление кислорода в виде воздуха или другого кислородсодержащего газа в соответствии с изобретением также может быть применено, по меньшей мере, к содержимому реактора для гидролиза с частичным перемешиванием или смешиванием. Настоящий способ изобретения в особенности показал свои преимущества на опытном производстве и в промышленных масштабах. Предпочтительно реактор для гидролиза имел объем 1 м3 или более предпочтительно более чем 10 м3 и наиболее предпочтительно 50 м3 или более. В целом, реактор для гидролиза был меньше чем 3000 или 5000 м3 Авторы изобретения выдвинули теорию, согласно которой, в особенности при больших масштабах, для гидролиза доступно недостаточно кислорода, что может быть связано с ограничениями в переносе кислорода в реакторе, например в целлюлолитической биомассе. В экспериментах, проводимых в лабораторном масштабе, данная кислородная недостаточность может не иметь такой важной роли. Отношение площади поверхности (или площади контакта кислорода с содержимым реактора) к объему реактора более благоприятно для мелкомасштабных экспериментов в сравнении с крупномасштабными экспериментами. Кроме того, выполнять смешивание в мелкомасштабных экспериментах будет относительно легче, чем в крупномасштабных.
Также в ходе данных мелкомасштабных экспериментов транспорт кислорода из свободного пространства реактора гидролиза происходит быстрее по сравнению с ситуацией в крупномасштабных экспериментах. Эта теория приведена исключительно в качестве возможного объяснения замеченного авторами изобретения эффекта, и настоящее изобретение не подпадает под данную теорию или не подтверждает ее правильность. В соответствии с дополнительным воплощением изобретения добавление кислорода может быть применено для контроля, по меньшей мере частично, гидролиза.
В крупном масштабе (например, в реакторе, имеющем объем более 1 м3) было замечено, что добавление кислорода приводило к улучшению гидролиза и/или к более быстрому гидролизу. Кроме того, авторы изобретения смогли дополнительно усовершенствовать способ гидролиза, применив меньшие количества ферментов (по белку) и по-прежнему получив высокие уровни гидролиза. Одну из основных затрат при гидролизе представляет собой стоимость фермента или ферментной композиции. Поэтому снижение количества необходимых ферментов представляет собой огромную экономическую выгоду.
Способ настоящего изобретения делает возможным применение фермента (или ферментной композиции) в количестве менее чем 7,5 мг фермента/г глюкана, предпочтительно менее чем 6,0 мг фермента/г глюкана, более предпочтительно менее чем 5,0 мг глюкана/г исходного сырья, еще более предпочтительно менее чем 4,0 мг фермента/г глюкана и наиболее предпочтительно менее чем 2,5 мг фермента/г глю-кана (на сухое вещество и на фермент как белок).
Содержание глюкана в обработанном кислотой исходном сырье равно примерно от 25 до 50% (мас./мас.) (по сухому веществу). Для кукурузной соломы содержание глюкана равно примерно от 30 до 45% (мас./мас.) (по сухому веществу).
Таким образом, в общем количество фермента (или ферментной композиции) от 0,1 до 7,5 мг фермента/г глюкана, предпочтительно от 0,2 до 7,5 мг фермента/г глюкана, более предпочтительно от 0,2 до 6,0 мг фермента/г глюкана, еще более предпочтительно от 0,2 до 5,0 мг фермента/г глюкана, еще более
предпочтительно от 0,2 до 4,0 мг фермента/г глюкана и наиболее предпочтительно от 0,2 до 2,5 мг фермента/г глюкана (на сухое вещество и на фермент как белок) будет применено в способе изобретения.
Способ настоящего изобретения позволяет применять фермент (или ферментную композицию) в количестве менее чем 3,0 мг фермента/г исходного сырья, предпочтительно менее чем 2,5 мг фермента/г исходного сырья, более предпочтительно менее чем 2,0 мг фермента/г исходного сырья, еще более предпочтительно менее чем 1,5 мг фермента/г исходного сырья и наиболее предпочтительно менее чем 1,0 мг фермента/г исходного сырья (на сухое вещество и на фермент как белок).
В общем количество фермента (или ферментной композиции) от 0,05 до 3,0 мг фермента/г исходного сырья, предпочтительно от 0,1 до 3,0 мг фермента/г исходного сырья, более предпочтительно от 0,1 до 2,5 мг фермента/г исходного сырья, еще более предпочтительно от 0,1 до 2,0 мг фермента/г исходного сырья, еще более предпочтительно от 0,1 до 1,5 мг фермента/г исходного сырья и наиболее предпочтительно от 0,1 до 1,0 мг фермента/г исходного сырья (на сухое вещество и на фермент как белок) будет применено в способе изобретения.
Путем применения данных количеств фермента (или ферментной композиции) может быть получен уровень степени превращения глюкана, равный более 70%, предпочтительно более чем 72%. В общем, могут быть получены уровни превращения глюкана от 70 до 90%, предпочтительно от 72 до 90% и еще более предпочтительно от 74 до 90%. Определение уровня превращения глюкана описано в примерах.
Способ изобретения преимущественно применяют в комбинации с применением термостабильных ферментов.
Термин "термостабильный фермент" означает, что фермент имеет температурный оптимум, равный 60°C или выше, например 70°C или выше, такой как 75°C или выше, например 80°C или выше, такой как 85°C или выше. Например, они могут быть изолированы из термофильных микроорганизмов или могут быть сконструированы специалистом и искусственно синтезированы. В одном из воплощений полинук-леотиды могли быть изолированы или получены из термофильных или термоустойчивых нитевидных грибов или изолированы из нетермофильных или нетермоустойчивых грибов, но было показано, что они термостабильные.
Термин "термофильный гриб" означает гриб, который растет при температуре 50°C или выше. Термин "термоустойчивый гриб" означает гриб, который растет при температуре 45°C или выше, имея максимум около 50°C.
Примеры штаммов термофильных грибов представляют собой Rasamsonia emersonii (ранее известные как Talaromyces emersoni, Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii и Rasamsonia emersonii применяют в настоящем документе взаимозаменяемо).
Подходящие клетки термофильных или термоустойчивых грибов могут представлять собой клетку Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus или Thielavia, предпочтительно клетку Rasamsonia emersonii. Предпочтительные термофильные или термоустойчивые грибы представляют собой Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus и Thielavia terrestris.
Термофильные грибы не ограничены конкретным таксономическим порядком и встречаются по всему дереву жизни грибов. Примеры представляют собой Rhizomucor в мукоровых, Myceliophthora в сордариевых и Talaromyces, Thermomyces и Thermoascus у эуроциевых (Mouchacca 1997). Большинство видов Talaromyces представлять собой мезофилы, за исключением видов в пределах секций Emersorii и Thermophila. Секция Emersonii включает Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus и Talaromyces leycettanus, все они хорошо растут при 40°C. Talaromyces bacillisporus термоустойчивый, Т. leycettanus от термоустойчивого до термофильного и Т. emersonii и Т. byssochlamydoides истинные термофилы (Stolk and Samson 1972). Единственный член Talaromyces секции Thermophila, T. Thermophilus, быстро растет при 50°C (Evans and Stolk 1971; Evans 1971; Stolk and Samson 1972). Современная классификация этих термофильных видов Talaromyces в основном базируется на фенотипических и физиологических признаках, таких как их способность расти при температурах выше 40°C, на окраске аскоспора, структуре покрова аскомы и формирование определенного типа ана-морфа. Stolk и Samson (1972) утверждают, что члены секции Emersonii имеют анаморфы или серии Paecilomyces (Т. byssochlamydoides и Т. leycettanus), или серии Penicillium cylindrosporum (T. emersonii и Т. bacillisporus). Позднее, Pitt (1979) отнес виды, принадлежащие к серии Penicillium cylindrosporum, к роду Geosmithia, на основе различных признаков, таких как формирование конидий из терминальных пор, а не на воротничках (шейках), признак, относящийся к Penicillium и Paecilomyces. Внутри рода Geosmithia только G. argillacea термоустойчивый, Stolk et al. (1969) и Evans (1971) предложили связь с членами Talaromyces sect. Emersonii. Филогенетическая связь термофильных видов Talaromyces с Talaromyces и трихокомовыми неизвестна. См., J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek 2012 Feb; 101(2):
403-21.
Rasamsonia представляет собой новый род, включающий термоустойчивые и термофильные виды Talaromyces и Geosmithia (J. Houbraken et al vida supra). На основании фенотипических, физиологических и молекулярных данных Houbraken et al. предложили отнести виды Т. emersonii, Т. byssochlamydoides, Т. eburneus, G. argillacea и G. cylindrospora к новому роду Rasamsonia. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii и Rasamsonia emersonii применяют в настоящем документе взаимозаменяемо.
Предпочтительные термофильные грибы представляют собой Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus и Thermoascus aurantiacus.
"Нитчатые грибы" включают все нитчатые формы подотдела Eumycota и Oomycota (по определению Hawksworth et al., В Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Нитчатые грибы характеризуются мицелиальной стенкой, которая состоит из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и другие сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит за счет удлинения гифов, и катаболизм углерода облигатно аэробный. Нитчатые грибковые штаммы включают, без ограничений, штаммы Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Rasamsonia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma.
Несколько штаммов нитчатых грибов легко доступны для любого пользователя в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Германский банк микроорганизмов (DSM), Центральное бюро грибковых культур (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований, Северный региональный исследовательский центр (NRRL). Примеры таких штаммов включают Aspergillus niger CBS 513,88, Aspergillus oryzae АТСС 20423, IFO 4177, АТСС 1011, АТСС 9576, ATCC14488-14491, АТСС 11601, АТСС12892, P. chrysogenum CBS 455,95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393,64,
Acremonium chrysogenum ATCC 36225 или АТСС 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 или АТСС
56765 или АТСС 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense C1, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 и производные от них.
Преимущество экспрессии и продукции ферментов (например, по меньшей мере двух, трех или четырех различных целлюлаз) в подходящий микроорганизм может заключаться в высоком выходе ферментной композиции, которая может быть применена в способе настоящего изобретения.
В соответствии с изобретением путем добавления кислорода можно достичь многих преимуществ способа, включая оптимальные температурные условия, сокращение времени способа, уменьшение дозировки фермента, повторное применение ферментов и другие оптимизации способа, приводящие к снижению затрат. Преимущественно изобретение обеспечивает способ, в котором стадию гидролиза проводят в усовершенствованных условиях. Изобретение также обеспечивает способ, включающий гидролиз с сокращенным временем способа. Кроме того изобретение обеспечивает способ, в котором дозировка фермента может быть снижена, а в то же время выход целевого продукта гидролиза может быть сохранен на том же уровне. Другое преимущество изобретения заключается в том, что настоящий способ, включающий гидролиз, может привести к условиям способа, которые оптимизируют. Еще одно дополнительное преимущество изобретения заключается в том, что выход целевого продукта гидролиза способа, включающего гидролиз, увеличивают, применяя такую же дозировку фермента.
Стабильная ферментная композиция
Стабильная ферментная композиция в настоящем документе означает, что ферментная композиция сохраняет активность после реакции гидролиза, время которой было равно 30 ч, предпочтительно по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% от своей первоначальной активности после реакции гидролиза, время которой было равно 30 ч. Предпочтительно ферментная композиция сохраняет активность после реакции гидролиза, время которой было 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ч.
Ферментная композиция может быть получена с помощью ферментации подходящего субстрата с подходящим микроорганизмом, например с Rasamsonia emersonii или Aspergillus niger, в котором ферментная композиция продуцируется микроорганизмом. Микроорганизм может быть изменен так, чтобы улучшить или производить целлюлазную композицию. Например, микроорганизм может быть мутирован с помощью классических методик улучшения штамма или с помощью методов рекомбинантной ДНК. Таким образом, микроорганизмы, перечисленные в настоящем документе, могут быть применены как таковые для получения целлюлазной композиции или могут быть изменены для увеличения продукции или для получения измененной целлюлазной композиции, которая могла бы включать гетерологич-ные целлюлазы, т.е. ферменты, которые исходно не производились данным микроорганизмом. Предпочтительно для получения целлюлазной композиции применяют гриб, более предпочтительно нитчатый гриб. Преимущественно применяют термофильный или термоустойчивый микроорганизм. Необязательно, применяют субстрат, который индуцирует экспрессию ферментов в ферментной композиции во время продукции ферментной композиции.
Ферментную композицию применяют для высвобождения сахара из лигноцеллюлозы, которая включает полисахариды. Основные полисахариды представляют собой целлюлозу (глюканы), гемицел-люлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторое количество гемицеллюлозы может присутствовать в виде глюкоманнанов, например, в исходном сырье, полученном из древесины. Ферментативный гидролиз данных полисахаридов до растворимых сахаров, включающих мономеры и мультимеры, например глюкозу, целлобиозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, происходит под действием различных ферментов, работающих согласованно. Термин "сахарный продукт" означает продукт ферментативного гидролиза исходного сырья или лигноцеллюлозного материала. Сахарный продукт будет включать растворимые сахара, включая как мономеры, так и мультимеры, предпочтительно будет включать глюкозу. Примеры других сахаров представляют собой целлобиозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы. Сахарный продукт может быть применен как таковой или может быть дополнительно обработан, например очищен.
Кроме того, пектины и другие пектиновые вещества, такие как арабинаны, могут составлять значительную долю от сухой массы типичных клеточных стенок из неодревесненных тканей растения (примерно от четверти до половины сухой массы может быть представлено пектинами).
Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, соединенных р-1,4-связями. Линейная природа волокон целлюлозы, а также стехиометрия соединенной р-связью глюкозы (по отношению к а-) создает структуры, более склонные к образованию межнитевых водородных связей, по сравнению с сильно разветвленные соединенными а-связью структурами крахмала. Таким образом, полимеры целлюлозы бывают, как правило, менее растворимыми и образуют более прочно связанные волокна по сравнению с волокнами, обнаруживаемыми в крахмале.
Ферменты, которые могут быть включены в примененную в изобретении стабильную ферментную композицию, далее будут описаны более подробно.
GH61, эндоглюканазы (EG) и экзоцеллобиогидролазы (СВН) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы до таких продуктов, как целлоолигосахариды (целлобиозы в качестве основного продукта), тогда как р-глюкозидазы (BG) превращают олигосахариды, главным образом, целлобиозу и целлот-риозу в глюкозу.
Гемицеллюлоза представляет собой сложный полимер, и ее композиция часто варьирует в широких пределах от организма к организму и от одного типа ткани к другому. В целом, основной компонент ге-мицеллюлозы представляет р-1,4-связанную ксилозу, пятиуглеродный сахар. Однако данная ксилоза часто бывает разветвленной на 0-3 и/или 0-2 атоме ксилозы и может быть замещена связями с арабинозой, галактозой, маннозой, глюкуроновой кислотой, галактуроновой кислотой или путем этерификации до уксусной кислоты (и этерификацией феруловой кислоты до арабинозы). Гемицеллюлоза также может содержать глюкан, представляющий собой общий термин для обозначения соединенного р-связью шес-тиуглеродного сахара (такого как р-(1,3)(1,4)-глюканы и упомянутые выше гетероглюканы) и, кроме того, для глюкоманнанов (в которых как глюкоза, так и манноза присутствуют в линейной основной цепи, соединенные друг с другом р-связями).
Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например с a-L-арабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксилан-эстеразами, глюкуронидазами и р -ксилозидазами, катализируют гидролиз гемицеллюлоз.
Пектиновые вещества включают пектины, арабинаны, галактаны и арабиногалактаны. Пектины представляют собой наиболее сложные полисахариды в растительной клеточной стенке. Они надстраиваются вокруг основной цепи соединенных через а(1,4)-связь звеньев D-галактуроновой кислоты, которые перемежаются до некоторой степени L-рамнозой. В любой клеточной стенке существует ряд структурных единиц, которые соответствуют этому описанию и, как правило, считается, что в одной пектиновой молекуле основные цепи различных структурных единиц непрерывно связаны друг с другом.
Основные типы структурных единиц представляют собой галактуронан (гомогалактуронан), который может быть замещен метанолом по карбоксильной группе и ацетатом по 0-2 и 0-3; рамногалактуро-нан I (RGI), в котором звенья галактуроновой кислоты чередуются со звеньями рамнозы, несущими боковые цепи галактаном, присоединенные через (1,4)-связь, и арабинана, присоединенные через (1,5)-связь. Боковые цепи арабинана могут быть присоединены непосредственно к рамнозе или опосредованно через цепи галактана; ксилогалактуронан, с единственными ксилозильными звеньями по 0-3 галактуро-новой кислоты (тесно связанной с RGI); и рамногалактуронан II (RGII), особенно сложная минорная единица, содержащая необычные сахара, например, апиозу. Единица RGII может содержать два апио-зильных остатка, которые в подходящих ионных условиях могут обратимо образовывать сложные эфиры с боратом.
Композиция для применения в способе изобретения включает предпочтительно по меньшей мере две активности, хотя, как правило, композиция будет включать более чем две активности, например три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более активностей. Как правило, композиция изобретения
может включать по меньшей мере две различные целлюлазы или одну целлюлазу и по меньшей мере одну гемицеллюлазу. Композиция изобретения может включать целлюлазы, но не включать ксиланазы. Кроме того, композиция изобретения может включать вспомогательную ферментативную активность, т.е. дополнительную активность, которая или непосредственно, или опосредованно, приводит к разрушению лигноцеллюлозы. Примеры таких вспомогательных активностей указаны в настоящем документе.
Таким образом, композиция для применения в изобретении может включать GH61, эндоглюканаз-ную активность, и/или целлобиогидролазную активность, и/или р-глюкозидазную активность. Композиция для применения в изобретении может включать более чем одну ферментативную активность в одном или нескольких из данных классов. Например, композиция для применения в изобретении может включать две эндоглюканазные активности, например эндо-1,3(1,4)-р глюканазную активность и эндо-р-1,4-глюканазную активность. Такая композиция также может включать одну или несколько ксиланазных активностей. Такая композиция может включать вспомогательную ферментативную активность.
Композиция для применения в изобретении может быть получена из Rasamsonia emersonii. В изобретении предполагается, что основной набор (разрушающих лигноцеллюлозу) ферментативных активностей может быть получен из Rasamsonia emersonii. Как показано в настоящем документе, Rasamsonia emersonii может обеспечить высокоэффективный набор активностей для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. Данная активность затем может быть дополнена дополнительными ферментативными активностями из других источников. Такие дополнительные активности могут быть получены из классических источников и/или произведены генетически модифицированным организмом.
Активности в композиции для применения в изобретении могут быть термостабильными. В настоящем документе это означает, что активность имеет температурный оптимум, равный примерно 60°C или выше, например приблизительно 70°C или выше, такой как, примерно 75°C или выше, например приблизительно 80°C или выше, такой как 85°C или выше. Активности в композиции для применения в изобретении, как правило, не будут иметь такой же температурный оптимум, но предпочтительно тем не менее, будут термостабильными.
Кроме того, ферментативные активности в композиции для применения в изобретении могут быть способны работать при низких значениях pH. Для целей настоящего изобретения термин "низкие значения pH" указывает на pH, равный примерно 5,5 или ниже, примерно 5 или ниже, примерно 4,9 или ниже, примерно 4,8 или ниже, примерно 4,7 или ниже, примерно 4,6 или ниже, примерно 4,5 или ниже, примерно 4,4 или ниже, примерно 4,3 или ниже, примерно 4,2 или ниже, примерно 4,1 или ниже, примерно 4,0 или ниже, примерно 3,9 или ниже, или примерно 3,8 или ниже, примерно 3,7 или ниже, примерно 3,6 или ниже, или примерно 3,5 или ниже.
Активности в композиции для применения в изобретении могут быть определены комбинацией любых из вышеперечисленных температурных оптимумов и величин pH.
Композиция, примененная в способе изобретения, может включать в дополнение к активностям, полученным из Rasamsonia, целлюлазу (например, одну, полученную из источника, отличного от Rasamsonia), и/или гемицеллюлазу (например, одну, полученную из источника, отличного от Rasamsonia), и/или пектиназу.
Композиция для применения в изобретении может включать один, два, три, четыре или более классов целлюлаз, например одну, две три или четыре или все из GH61, эндоглюканазу (EG), одну или две экзоцеллобиогидролазы (СВН) и р-глюкозидазу (BG). Композиция для применения в изобретении может включать две или более из любых данных классов целлюлаз.
Композиция изобретения может включать активность, которая имеет другой тип целлюлазной активности, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности по сравнению с типом активности, обеспеченной композицией для применения в способе изобретения. Например, композиция изобретения может включать один тип целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пекти-назной активности, обеспеченной композицией, которая описана в настоящем документе, и второй тип целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, обеспеченной дополнительной целлюлозой/гемицеллюлазой/пектиназой.
В настоящем документе целлюлаза представляет собой любой полипептид, который способен разрушать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен разрушать целлюлозу, представляет собой полипептид, который способен катализировать процесс расщепления целлюлозы на звенья меньшего размера, или частично, например, на целлодекстрины, или полностью на мономеры глюкозы. Применение целлюлазы в соответствии с изобретением может привести, при контакте с целлюлозой, к смешанной популяции целлодекстринов и мономеров глюкозы. Такая деградация, как правило, будет проходить посредством реакции гидролиза.
Белки GH61 (семейство 61 гликозидгидролазы или иногда называемые EGIV) представляют собой кислородзависимые полисахаридмонооксигеназы (РМО) в соответствии с новейшими данными литературы. Часто в литературе указывают, что данные белки усиливают действие целлюлаз в отношении лиг-ноцеллюлозных субстратов. GH61 первоначально классифицировали как эндоглюканазу на основании измерений очень слабой эндо-1,4-Рч1-глюканазной активности у одного из членов семейства. Термин
"GH61", как применен в настоящем документе, следует понимать как семейство ферментов, которые обладают общими консервативными участками последовательности и фолдинга, чтобы быть классифицированы в семейство 61 согласно общепризнанной системе классификации CAZY GH (http://www.cazy.org/rH61.html). Семейство гликозидгидролазы 61 представляет собой член семейства гликозидгидролаз EC 3.2.1. В настоящем документе GH61 применяют как составную часть целлюлазы.
В настоящем документе гемицеллюлаза представляет собой любой полипептид, который способен разрушать или модифицировать гемицеллюлозу. Другими словами, гемицеллюлаза может быть способна разрушать или модифицировать одно или более из следующего: ксилана, глюкуроноксилана, арабинок-силана, глюкоманнана и ксилоглюкана. Полипептид, способный разрушать гемицеллюлозу, представляет собой полипептид, который способен катализировать процесс расщепления гемицеллюлозы на полисахариды меньшего размера, или частично, например, на олигосахариды, или полностью на мономеры сахаров, например на мономеры сахаров, представляющие собой гексозу или пентозу. Гемицеллюлаза в соответствии с изобретением может приводить к смешанной популяции олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с гемицеллюлозой. Такая деградация, как правило, будет происходить в ходе реакции гидролиза.
В настоящем документе пектиназа представляет собой любой полипептид, который способен разрушать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен разрушать пектин представляет собой полипептид, который способен катализировать процесс расщепления пектин на звенья меньшего размера, или частично, например, или на олигосахариды, или полностью на мономеры сахаров. Пектина-за в соответствии с изобретением может приводить к смешанной популяции олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с пектиназой. Такое деградация, как правило, будет происходить в ходе реакции гидролиза.
Соответственно, композиция изобретения может включать любую целлюлазу, например GH61, целлобиогидролазу, эндо-р-1,4-глюканазу, р-глюкозидазу или р-(1,3)(1,4)-глюканазу.
В настоящем документе целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4-р^-глюкозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с концов цепей. Данный фермент также может быть отнесен к целлюлазе, 1,4-р-целлобиозидазе, 1,4-р-целлобиогидролазе, 1,4-р-D-глюканцеллобиогидролазе, авицелазе, экзо-1,4-р-D-глюканазе, экзоцеллобиогидролазе или экзоглюканазе.
В настоящем документе эндо-р-1,4-глюканаза (ЕС 3.2.1.4) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4-р^-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или P-D-глюканах злаковых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в P-D-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Данный фермент также может быть отнесен к целлюлазе, авицелазе, р-1,4-эндоглюкангидролазе, р-1,4-глюканазе, карбоксиметилцеллюлазе, целлюдекстриназе, эндо-1,4-р-D-глюканазе, эндо-1,4-р-D-глюканогидролазе, эндо-1,4-р-глюканазе или эндоглюканазе.
В настоящем документе р-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать гидролиз терминальных, нередуцирующих остатков p-D-глюкозы с высвобождением p-D-глюкозы. Такой полипептид может иметь широкую специфичность в отношении P-D-глюкозидов и также может гидролизовать одно или несколько из следующего: p-D-галактозид, a-L-арабинозид, p-D-ксилозид или p-D-фукозид. Данный фермент также может быть отнесен к амигда-лазе, p-D-глюкозидглюкогидролазе, целлобиазе или гентобиазе.
В настоящем документе р-(1,3)(1,4)-глюканаза (ЕС 3.2.1.73) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз 1,4-р^-глюкозидных связей в p-D-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4-связи. Такой полипептид может действовать на лихенин и p-D-глюканы злаковых, но не на P-D-глюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Данный фермент также может быть отнесен к лихе-ниназе, 1,3-1,4-р^-глюкан-4-глюканогидролазе, р-глюканазе, эндо-р-1,3-1,4 глюканазе, лихеназе или Р-глюканазе со смешанными связями. ЕС 3.2.1.6, которая описана как эндо-1,3(4)-р-глюканаза, представляет собой альтернативу этому типу фермента. Данный тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в р^-глюкане, если остаток глюкозы, редуцирующая группа которого участвует в образовании гидроли-зуемой связи, самозамещен по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3-р-глюканазу, ламина-риназу, 1,3-(1,3;1,4)-р-D-глюкан-3-(4)-глюканогидролазу; субстраты включают ламинарии, лихенин и р^-глюканы злаковых.
Композиция изобретения может включать любую гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, р-ксилозидазу, a-L-арабинофуранозидазу, a-D-глюкуронидазу, ацетилксиланэстеразу, ферулоилэстера-зу, кумароилэстеразу, а-галактозидазу, р-галактозидазу, р-маннаназа или р-маннозидазу.
В настоящем документе эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4-р^-ксилозидные связи в ксиланах. Данный фермент также может быть отнесен к эндо-1,4-р-ксиланазе или 1,4-р^-ксиланксиланогидролазе. Альтернатива представляет собой глюкуроноарабиноксилан-эндоксиланазу ЕС 3.2.1.136, фермент, который способен гид-ролизовать 1,4-ксилозидные связи в глюкуроноарабиноксиланах.
В настоящем документе р-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз 1,4-р^-ксиланов, последовательно удаляя остатки D-ксилозы с нере-дуцирующих концов. Такие ферменты также могут гидролизовать ксилобиозу. Данный фермент также может быть отнесен к ксилан-1,4-р-ксилозидазе, 1,4-р^-ксилан-ксилогидролазе, экзо-1,4-р-ксилозидазе или ксилобиазе.
В настоящем документе a-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) представляет собой любой полипептид, который способен действовать на a-L-арабинофуранозиды, a-L-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Данный фермент также может быть отнесен к a-N-арабинофуранозидазе, арабинофуранозидазе или арабинозидазе.
В настоящем документе a-D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию, протекающую согласно следующему уравнению: a-D-глюкуронозид + Н(2)О = спирт + D-глюкуронат. Данный фермент также может быть отнесен к a-глюкуронидазе или a-глюкозидуроназе. Данные ферменты также могут гидролизовать 4-О-метилированную глюкуроновую кислоту, которая также может присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернатива представляет собой ЕС 3.2.1.131: ксилан-а-1,2-глюкуронозидазу, которая катализирует гидролиз а-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильных связей.
В настоящем документе ацетилксиланэстераза (ЕС 3.1.1.72) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать деацетилирование ксиланов и ксилоолигосахаридов. Такой полипептид может катализировать гидролиз ацетильных групп полимерного ксилана, ацетилированной ксилозы, ацетилированной глюкозы, a-нафтил-ацетата или р-нитрофенилацетата, но, как правило, не триацетилглицерина. Такой полипептид, как правило, не действует на ацетилированный маннан или пектин.
В настоящем документе ферулоилэстераза (ЕС 3.1.1.73) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию по следующему уравнению: ферулоил-сахарид + Н(2)О = ферулат + сахарид. Сахарид, например, может представлять собой олигосахарид или полисахарид. Фермент может, как правило, катализировать гидролиз 4-гидрокси-3-метоксициннамоильной (ферулоильной) группы эстерифицированного сахара, который обычно представляет собой арабинозу в "природных" субстратах, н-Нитрофенолацетат и метилферулат, как правило, представляют собой недостаточно хорошие субстраты. Данный фермент также может быть отнесен к гидролазе циннамоилового эфира, эстеразе феруловой кислоты или гидроксициннамоилэстеразе. Он также может быть отнесен к вспомогательному гемицел-люлазному ферменту, поскольку он может помогать ксиланазам и пектиназам разрушать гемицеллюлозу и пектин клеточной стенки растений.
В настоящем документе кумароилэстераза (ЕС 3.1.1.73) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию по следующему уравнению: кумароил-сахарид + Н(2)О = кумарат + сахарид. Сахарид, например, может представлять собой олигосахарид или полисахарид. Данный фермент также может быть отнесен к транс-4-кумароилэстеразе, транс-н-кумароилэстеразе, н-кумароилэстеразе или эстераза п-кумаровой кислоты. Данный фермент также входит в ЕС 3.1.1.73, поэтому также может быть отнесен к ферулоилэстеразе.
В настоящем документе a-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков a-D-галактозы в a-D-галактозидах, включая галактозу олигосахаридов, галактоманнанов, галактанов и арабиногалакта-нов. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать a-D-фукозиды. Данный фермент также может быть отнесен к мелибиазе.
В настоящем документе р-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков р^-галактозы в р^-галактозидах. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать a-L-арабинозиды. Данный фермент также может быть отнесен к экзо-(1-4)-р^-галактаназе или лактазе.
В настоящем документе р-маннаназа (ЕС 3.2.1.78) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать неупорядоченный гидролиз 1,4-р^-маннозидных связей в маннанах, галакто-маннанах и глюкоманнанах. Данный фермент также может быть отнесен к маннан-эндо-1,4-р-маннозидазе или эндо-1,4-маннаназе.
В настоящем документе р-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков р^-маннозы в р^-маннозидах. Данный фермент также может быть отнесен к маннаназам или манназой.
Композиция изобретения может включать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, р-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пек-татлиазу, a-рамнозидазу, экзогалактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамногалактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамногалактуронангалактуроногидролазу и ксилогалактуроназу.
В настоящем документе эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) представляет собой любой полипептид, который способен катализировать неупорядоченный гидролиз 1,4-а^-галактозидуроновых связей в пектате и других галактуронанах. Данный фермент также может быть отнесен к полигалактуроназе, пек-тиндеполимеразе, пектиназе, эндополигалактуроназе, пектолазе, пектингидролазе, пектинполигалакту-роназе, поли-а-1,4-галактуронидгликангидролазе, эндогалактуроназе, эндо^-галактуроназе или по-ли( 1,4-a-D-галактуронид) гликангидролазе.
В настоящем документе пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) представляет собой любой фермент, способный катализировать реакцию: пектин + n H2O = n метанол + пектат. Фермент может быть также известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза.
В настоящем документе эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89) представляет собой любой фермент, способный катализировать эндогидролиз 1,4-р^-галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент также может быть известен как арабиногалактанэндо-1,4-р-галактозидаза, эндо-1,4-р-галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4-р^-галактаногидролаза.
В настоящем документе пектинацетилэстеразу определяют как любой фермент, который обладает ацетилэстеразной активностью, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидро-ксильных группах остатков GalUA пектина.
В настоящем документе эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10) представляет собой любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (1- 4)-а^-галактуронанметилового эфира с образованием олигосахаридов с 4-деокси-6-О-метил-а^-галакт-4-энуронозиловыми группами на их нередуци-рующих концах. Фермент также может быть известен как пектинлиаза, пектин-трансэлиминаза; эндопек-тинлиаза, полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, PL, PNL или PMGL или (1- 4)-6-0-метил-а^-галактуронанлиаза.
В настоящем документе пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) представляет собой любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (1- 4)-а^-галактуронана с образованием олигосахаридов с 4-деокси-а^-галакт-4- энуронозиловыми группами на их нередуцирующих концах. Фермент также быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полига-лактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэли-миназа, лиаза пектиновой кислоты, пектиновая лиаза, лиаза а-1,4^-эндополигалактуроновой кислоты, PGA-лиаза, РРаза-N, лиаза эндо-а-1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты, пектин-трансэлиминаза, трансэлиминаза. полигалактуроновой кислоты или (1-4)-a-D-галактуронанлиаза.
В настоящем документе a-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) представляет собой любой полипептид, способный катализировать гидролиз терминальных нередуцирующих остатков a-L-рамнозы в a-L-рамнозидах или альтернативно в рамногалактуронане. Данный фермент также может быть известен как a-L-рамнозидаза Т, a-L-рамнозидаза N или a-L-рамнозид-рамногидролазе.
В настоящем документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) представляет собой любой полипептид, способный гидролизовать пектиновую кислоту на нередуцирующем конце, высвобождая дигалактуро-нат. Фермент также может быть известен как экзополи-а-галактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза.
В настоящем документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.67) представляет собой любой полипептид, способный катализировать реакцию: (1,4-а^-галактуронид)п + Н2О = (1,4-а^-галактуронид)п-1 + D-галактуронат. Фермент также может быть известен как галактуран-1,4-а-галактуронидаза, экзополига-лактуроназа, поли(галактуронат)гидролаза, экзо^-галактуроназа, экзо^-галактуронаназа, экзополи-D-галактуроназа или поли(1,4-a-D-галактуронид)галактуроногидролаза.
В настоящем документе экзополигалактуронат-лиаза (ЕС 4.2.2.9) представляет собой любой полипептид, способный катализировать элиминирующее расщепление 4-(4-деокси-а^-галакт-4-энуронозил)-D-галактуроната на редуцирующем конце пектата, т.е. деэстерифицированного пектина. Данный фермент может быть известен как пектат-дисахарид-лиаза, пектат-экзолиаза, трансэлиминаза экзопектино-вой кислоты, экзопектат-лиаза, трансэлиминаза экзополигалактуроновой кислоты, РАТЕ, экзо-РАТЕ, экзо-PGL или дисахарид-лиаза редуцирующего конца (1- 4)-а^-галактуронана.
В настоящем документе рамногалактуронан-гидролаза представляет собой любой полипептид, способный гидролизовать связь между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом в любой эндо-форме в строго чередующихся рамногалактуронановых структурах, состоящий из дисахарида [(1,2-a-L-рамноил-( 1,4)-а-галактозилуроновой кислоты].
В настоящем документе рамногалактуронан-лиаза представляет собой любой полипептид, который представляет собой любой полипептид, который способен расщеплять связи a-L-Rhap-(1- 4)-a-D-GalpA связи эндоспособом в рамногалактуронане посредством р-элиминации.
В настоящем документе рамногалактуронан-ацетилэстераза представляет собой любой полипептид, который катализирует деацетилирование основной цепи чередующихся остатков рамнозы и галактуро
новой кислоты в рамногалактуронане.
В настоящем документе рамногалактуронан-галактуроногидролаза представляет собой любой полипептид, способный гидролизовать экзоспособом галактуроновую кислоту от нередуцирующего конца строго чередующихся структур рамногалактуронана.
В настоящем документе ксилогалактуроназа представляет собой любой полипептид, который действует на ксилогалактуронан эндоспособом посредством расщепления основной цепи замещенной р-ксилозой галактуроновой кислоты. Данный фермент также может быть известен как ксилогалактуронан-гидролазе.
В настоящем документе a-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) представляет собой любой полипептид, который способен действовать на a-L-арабинофуранозиды, a-L-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Данный фермент также может быть отнесен к a-N-арабинофуранозидазе, арабинофуранозидазе или арабинозидазе.
В настоящем документе эндоарабинаназа (ЕС 3.2.1.99) представляет собой любой полипептид, способный катализировать эндогидролиз 1,5-а-арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент также может быть известен как эндоарабиназа, арабинан-эндо-1,5-а^-арабинозидаза, эндо-1,5-а^-арабинаназа, эндо-а-1,5-арабаназа; эндоарабаназа или 1,5-а^-арабинан-1,5-а^-арабинаногидролаза.
Композиция изобретения, как правило, будет включать по меньшей мере одну целлюлазу, и/или по меньшей мере одну гемицеллюлазу, и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых представляет собой полипептид в соответствии с изобретением). Композиция изобретения может включать GH61, целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или р-глюкозидазу. Такая композиция также может включать одну или несколько гемицеллюлаз и/или одну или несколько пектиназ.
Кроме того, в композиции изобретения могут присутствовать один или несколько (например, две, три, четыре или все) из перечисленных ферментов: амилаза, протеаза, липаза, лигниназа, гексозилтранс-фераза, глюкуронидаза или экспансии или индуцируемый целлюлозой белок или интегрирующий на целлюлозе белок или подобный белок (выше они названы вспомогательными активностями).
"Протеаза" включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также ферменты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими составляющими, такими как сахара (гликопептидазы). Множество протеаз, которые характеризуются в соответствии с ЕС 3.4 и которые подходят для применения в изобретении, включены в настоящий документ путем отсылки. Некоторые специфичные типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин и сериновые протеа-зы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы.
Термин "липаза" включает ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты и ацилгли-цериды, включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве структурных компонентов для ограничения потери воды и патогенных инфекций. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин.
Термин "лигниназа" включает ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать структуру лигниновых полимеров. Ферменты, которые могут разрушить лигнин, включают лигнинпероксидазы, марганец-пероксидазы, лакказы и феруоилэстеразы и другие ферменты, описанные в данной области техники, известные своей способностью деполимеризовать или в ином случае разрушать лигниновые полимеры. Также включают ферменты, способные гидролизовать связи, образованные между гемицел-люлозными сахарами (особенно арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают, но не ограничиваются ими, следующие группы ферментов: лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1.14), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1,10,3,2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73).
Термин "гексозилтрансфераза" (2,4,1-) включает ферменты, которые способны катализировать трансферазную реакцию, но которые могут также катализировать реакцию гидролиза, например, целлюлозы и/или продуктов деградации целлюлозы. р-глюканозилтрансфераза представляет собой пример гек-созилтрансферазы, которая может быть применена в изобретении. Такой фермент может быть способен катализировать деградацию (1,3)(1,4)-глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы.
Термин "глюкуронидаза" включает ферменты, которые катализируют гидролиз глюкуронозида, например, р -глюкуронозида с получением спирта. Многие глюкуронидазы были охарактеризованы, и они могут подходить для применения в изобретении, например, р-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроно-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфглюкозамин-глюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризи-нат-р-глюкуронидаза (3.2.1.128) или a-D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139).
Композиция для применения в изобретении может включать экспансин или экспансин-подобный белок, такое как сволленин (см., Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) или сволленин-подобный белок.
Экспансины вовлечены в ослабление структуры клеточной стенки в ходе роста растительной клетки. Предполагается, что экспансины разрушают водородные связи между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки, не обладая гидролитической активностью. Таким образом, они, как считается, позволяют раздвинуть волокна целлюлозы и расширить клеточную стенку. Сволленин, экспансин-подобный белок содержит домен N-концевого углеводсвязывающего модуля семейства 1 (CBD) и
С-концевой экспансин-подобный домен. Для целей настоящего изобретения экспансин-подобный белок или сволленин-подобный белок может включать один или оба таких домена и/или может разрушать структуру клеточных стенок (например, нарушая структуру целлюлозы), необязательно, без образования детектируемых количеств редуцирующих сахаров.
Композиция для применения в изобретении может представлять собой индуцируемый целлюлозой белок, например, полипептидный продукт гена cip1 или cip2 или аналогичных генов (см., Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34). 31988-31997, 2003), целлюлоза/целлюлосома-интегрирующий белок, например полипептидный продукт гена cipA или cipC, или скаффолдин или скаффолдиноподобный белок. Скаф-фолдины и белки, интегрирующие на целлюлозе, представляют собой мультифункциональные интегрирующие субзвенья, которые могут организовать целлюлолитические субзвенья в мультиферментный комплекс. Это достигается за счет взаимодействия двух комплементарных классов доменов, т.е. домена сцепления и стыковочного домена на каждой ферментной единице. Субъединица скаффолдина также несет модуль связывания с целлюлозой (СВМ), который опосредует прикрепление целлюлосомы к ее субстрату. Скаффолдин или белок, интегрирующий на целлюлозе, для целей настоящего изобретения может включать один или оба таких домена.
Композиция для применения в способе изобретения может состоять из члена каждого класса ферментов, упомянутых выше, нескольких членов одного класса ферментов или любой комбинации этих данных классов ферментов или вспомогательных белков (т.е. тех белков, которые упомянуты в настоящем документе и которые не имеют энзиматической активности per se, но, тем не менее, помогают при деградации лигноцеллюлозы).
Композиция для применения в способе изобретения может состоять из ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; (2) из ферментов, экспрессируемых клонированными генами; (3) из сложного бульона (такого как бульон, получаемый в результате роста микробного штамма в среде, в которой штаммы секретируют белки и ферменты в среды); (4) из клеточных лизатов штаммов, растущих как в (3); и/или (5) из растительного материала, экспрессирующего ферменты. Различные ферменты в композиции изобретения могут быть получены из различных источников.
Ферменты могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены, например, к лигноцеллюлозному исходному сырью. Альтернативно, ферменты продуцируют, но не выделяют, и неочищенный ферментационный бульон с клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и им подобные могут быть добавлены, например, в исходное сырье. Альтернативно, неочищенная клеточная масса или среда продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением антимикробных средств), а затем добавлены, например, в исходное сырье. Данные неочищенные смеси ферментов могут включать организм, продуцирующий фермент. Альтернативно, фермент может быть получен при ферментации, в которой используют (предварительно обработанное) исходное сырье (такое как кукурузная солома или пшеничная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут сами служить в качестве лигноцеллюлозного исходного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное исходное сырье.
В применениях и способах, описанных в настоящем документе, компоненты композиций, описанные выше, могут быть обеспечены одновременно (т.е. в качестве единой композиции per se), или отдельно, или последовательно.
Изобретение, таким образом, относится к способам, в которых применяют описанную выше композицию, и к применениям композиции в промышленных способах.
Лигноцеллюлозный материал
Лигноцеллюлозный материал в настоящем документе включает любой лигноцеллюлозный и/или гемицеллюлозный материал. Лигноцеллюлозный материал, подходящий для применения в качестве исходного сырья в изобретении, включает биомассу, например первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и отходы садоводства. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жом сахарного тростника, просо, мискант, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы, стержни кукурузных початков, стебли канолы, стебли соевых бобов, сахарное сорго, кукурузное зерно, включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница и ячмень (включая влажный помол и сухой помол), часто называемые "отруби или волокна", а также в качестве твердых коммунальных отходов, макулатуру и отходы садоводства. Биомасса также может представлять собой, без ограничений, травянистый материал, отходы сельского хозяйства, отходы лесного хозяйства, твердые коммунальные отходы, макулатуру, жом и отходы бумажного производства. "Сельскохозяйственная биомасса" включает ветки, кусты, стебли кустарников, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериалы, плоды, цветки, зерно, злаковые, травянистые культуры, листья, кору, хвою, бревна, корни, побеги, деревянистые культуры с коротким оборотом рубки, кустарники, просо, деревья, овощи, кожуру плодов, лозу, жом сахарной свеклы, пшеничную крупку, шелуху овса
и древесину твердых и мягких пород (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую деятельность, особенно, включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может представлять собой любую из вышеупомянутых биомасс, отдельно или в любой комбинации или их смесью. Предварительная обработка.
Исходное сырье, необязательно, может быть предварительно обработано путем нагревания, механической и/или химической модификации или любой комбинации таких способов с целью повышения доступности субстрата для ферментативного гидролиза, и/или гидролиза гемицеллюлозы, и/или солюби-лизации гемицеллюлозы, и/или целлюлозы, и/или лигнина любым способом, известным в данной области техники. В одном из воплощений предварительную обработку проводят, обрабатывая лигноцеллюло-зу паром, применяя обработку горячей водой или обработку разбавленной кислотой или разбавленным основанием.
Стадия промывки.
Необязательно, способ в соответствии с изобретением включает стадию промывки. Необязательная стадия промывки может быть применена для удаления водорастворимых соединений, которые могут действовать как ингибиторы на стадии ферментации. Стадия промывки может быть проведена известным способом.
Ферментативный гидролиз.
Ферментная композиция, примененная в способе изобретения, может чрезвычайно эффективно гидролизовать лигноцеллюлолитический материал, например кукурузную солому или пшеничную солому, который в дальнейшем может быть превращен в полезный продукт, такой как этанол, биогаз, бута-нол, молочную кислоту, пластмассы, органическую кислоту, растворитель, добавку к кормам для животных, лекарственный препарат, витамин, аминокислоту, фермент или сырье для химической промышленности. Кроме того, промежуточные продукты из способа, следующего за гидролизом, например молочная кислота в качестве промежуточного продукта при получении биогаза, могут быть применены в качестве строительного блока для других веществ. Настоящее изобретение проиллюстрировано получением этанола, но это сделано только в иллюстративных целях, а не как ограничение, в равной степени могут быть получены и другие упомянутые полезные продукты.
Способ в соответствии с изобретением включает стадию ферментативного гидролиза. Ферментативный гидролиз включает, без ограничений, гидролиз с целью перевода исходного сырья в жидкое состояние и гидролиз с целью высвобождения сахара их исходного сырья или и то, и другое. На данной стадии необязательно предварительно обработанный и необязательно промытый лигноцеллюлозный материал приводят в контакт с ферментной композицией в соответствии с изобретением. В зависимости от лигноцеллюлозного материала и предварительной обработки, различные условия реакции, например температура, дозировка фермента, время реакции гидролиза и концентрация сухого вещества, могут быть адаптированы специалистом для достижения желаемого превращения лигноцеллюлозы в сахар. Некоторые указания приведены ниже.
В одном из аспектов изобретения гидролиз проводят при температуре 45°C или более, 50°C или более, 55°C или более, 60°C или более, 65°C или более или 70°C или более. Высокая температура в ходе гидролиза имеет много преимуществ, включая работу в оптимуме температуры ферментной композиции, снижение риска (бактериального) заражения, снижение вязкость, меньшее количество необходимой охлаждающей воды, применение охлаждающей воды с более высокой температурой, повторное применение ферментов и т.д.
В дополнительном аспекте изобретения количество добавленной ферментной композиции (в настоящем документе также называемое дозировка фермента или ферментная нагрузка) было низким. В воплощении количество фермента равно 6 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, 5 мг белка/г сухого вещества или ниже, 4 мг белка/г сухого вещества или ниже, 3 мг белка/г сухого вещества или ниже, 2 мг белка/г сухого вещества или ниже, или 1 мг белка/г сухого вещества или ниже (выражается как белок в мг белка/г сухого вещества). В воплощении количество фермента равно 0,5 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,4 мг ферментной композиции/г массы сухого вещества или ниже, 0,3 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,25 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,20 мг фермента /г массы сухого вещества или ниже, 0,18 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,15 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже или 0,10 мг фермента /г массы сухого вещества или ниже (выражается как сумма целлюлазных ферментов в мг фермента/г сухого вещества). Низкие дозировки фермента допустимы, поскольку из-за активности и стабильности ферментов возможно увеличение времени реакции гидролиза.
В дополнительном аспекте изобретения продолжительность реакции гидролиза равна 5 ч или более, 10 ч или более, 20 ч или более, 40 ч или более, 50 ч или более, 60 ч или более, 70 ч или более, 80 ч или более, 90 ч или более, 100 ч или более, 120 ч или более, 130 ч или более. В другом аспекте продолжительность реакции гидролиза равна от 5 до 150 ч, от 40 до 130 ч, от 50 до 120 ч, от 60 до 120 ч, от 60 до 110 ч, от 60 до 100 ч, от 70 до 100 ч, от 70 до 90 ч или от 70 до 80 ч. Благодаря стабильности ферментной
композиции можно увеличивать продолжительность реакции гидролиза с соответствующим повышением выхода сахара.
В ходе гидролиза pH может быть выбран специалистом. В дополнительном аспекте изобретения pH в ходе гидролиза может быть равен от 3,0 до 6,4. Стабильные ферменты изобретения могут иметь широкий диапазон pH, вплоть до 2 единиц pH, вплоть до 3 единиц pH, вплоть 5 единиц pH. Оптимум pH может составлять от 2,0 до 8,0, от 3,0 до 8,0, от 3,5 до 7,0, от 3,5 до 6,0, от 3,5 до 5,0, от 3,5 до 4,5, от 4,0 до 4,5 или может быть равен примерно 4,2.
В дополнительном аспекте изобретения стадию гидролиза проводят до тех пор, пока из лигноцел-люлозного материала не высвободится 70% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 92% или более, 95% или более доступного сахара.
Важно, что способ изобретения может быть осуществлен с применением сухого вещества (лигно-целлюлозного материала) в высокой концентрации в реакции гидролиза. Таким образом, изобретение может быть осуществлено с содержанием сухого вещества, равным примерно 5 мас.% или выше, примерно 8 мас.% или выше, примерно 10 мас.% или выше, примерно 11 мас.% или выше, примерно 12 мас.% или выше, примерно 13 мас.% или выше, примерно 14 мас.% или выше, примерно 15 мас.% или выше, примерно 20 мас.% или выше, примерно 25 мас.% или выше, примерно 30 мас.% или выше, примерно 35 мас.% или выше или примерно 40 мас.% или выше. В дополнительном воплощении содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 мас.% или более или от 14 до 33 мас.%.
Ферментация.
Способ в соответствии с изобретением включает стадию ферментации. Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение включает на стадии ферментации способы, в которых для ферментации источника углерода, включающего сахар(сахара), например, глюкозу, L-арабинозу и/или ксилозу, применяют микроорганизмы. Источник углерода может включать любой углеводный олиго- или полимер, включающий звенья L-арабинозы, ксилозы или глюкозы, такой, например, как лигноцеллюлоза, ксила-ны, целлюлоза, крахмал, арабинан и им подобные. Для высвобождения звеньев ксилозы или глюкозы из таких углеводов соответствующие карбогидразы (такие как ксиланазы, глюканазы, амилазы и им подобные) могут быть добавлены к среде ферментации или могут быть получены с помощью модифицированной клетки-хозяина. В последнем случае модифицированная клетка-хозяин может быть создана методами генетической инженерии для продуцирования и экскреции такой карбогидразы. Дополнительное преимущество применения олиго- или полимерных источников глюкозы заключается в том, что оно позволяет поддерживать низкие (сниженные) концентрации свободной глюкозы в ходе ферментации, например, применяя скорость-лимитирующие количества карбогидраз. Это, в свою очередь, будет препятствовать подавлению систем, необходимых для метаболизма и транспорта сахара, не представляющего собой глюкозу, такого как ксилозу. В предпочтительном способе модифицированная клетка-хозяин ферментирует как L-арабинозу (необязательно, ксилозу), так и глюкозу, предпочтительно одновременно, в таком случае предпочтительно применяют модифицированную клетку-хозяина, которая нечувствительна к глюкозной репрессии для предотвращения диакустического роста. В добавление к источнику L-арабинозы, необязательно, ксилозы (и глюкозы) в качестве источника углерода среда ферментации дополнительно будет включать соответствующий ингредиент, необходимый для роста модифицированной клетки-хозяина. Композиции среды ферментации для роста микроорганизмов, таких как дрожжи или нитчатые грибы, хорошо известны в данной области техники.
Продолжительность ферментации может быть меньше, чем при традиционной ферментации в тех же условиях, в которых часть ферментативного гидролиза по-прежнему должна принять участие в ходе ферментации. В одном из воплощений продолжительность ферментации равна 100 ч или менее, 90 ч или менее, 80 ч или менее, 70 ч или менее, или 60 ч или менее для композиции сахаров с 50 г/л глюкозы и соответствующих других сахаров из лигноцеллюлозного исходного сырья (например, 50 г/л ксилозы, 35 г/л L-арабинозы и 10 г/л галактозы). Для более разбавленных композиций сахаров продолжительность ферментации может быть соответственно снижена.
Способ ферментации может представлять собой аэробный или анаэробный способ ферментации. Анаэробный способ ферментации в настоящем документе определяют как цикл способа ферментации в отсутствие кислорода или как цикл способа ферментации, в котором кислород в значительной степени не потребляется, предпочтительно потребляется менее чем 5, 2,5 или 1 ммоль/л/ч, более предпочтительно 0 ммоль/л/ч (т.е. потребление кислорода не детектируется), и в котором органические молекулы служат в качестве как донора электронов, так и электронных акцепторов. В отсутствие кислорода NADH производимый в гликолизе и при образовании биомассы не может быть окислен путем окислительного фосфо-рилирования. Для решения этой проблемы многие микроорганизмы используют пируват или одно из его производных в качестве акцептора электрона и водорода, тем самым регенерируя NAD+. Таким образом, в предпочтительном анаэробном способе ферментации пируват применяют в качестве акцептора электрона (и водорода), и он восстанавливается до таких продуктов ферментации, как этанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин,
биогаз, р-лактамные антибиотики и цефалоспорин. В предпочтительном воплощении способ ферментации представляет собой анаэробный способ. Анаэробный способ предпочтителен, поскольку он дешевле аэробных способов: для него требуется менее специализированное оборудование. Кроме того, ожидается, что анаэробные способы дадут более высокий выход продукта по сравнению с аэробными способами. В аэробных условиях, как правило, выход биомассы выше, чем в анаэробных условиях. Вследствие этого, как правило, в аэробных условиях ожидаемый выход продукта ниже, чем в анаэробных условиях.
В другом воплощении способ ферментации представляет собой способ ферментации в условиях лимитирования по кислороду. Более предпочтительно способ ферментации представляет собой аэробный и в условиях лимитирования по кислороду способ ферментации. Лимитированный по кислороду способ ферментации представляет собой такой способ, в котором потребление кислорода лимитируется переносом кислорода из газообразной фазы в жидкость. Степень ограничения по кислороду определяют по количеству и композиции потока входящего газа, а также по фактическим характеристикам по смешиванию/переносу масс примененного ферментационного оборудования. Предпочтительно в способе в условиях лимитирования по кислороду скорость потребления кислорода равна по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.
Способ ферментации предпочтительно осуществляют при температуре, оптимальной для модифицированной клетки. Таким образом, для большинства клеток дрожжей или грибов способ ферментации осуществляют при температуре менее чем 42°C, предпочтительно менее чем 38°C. Для клеток-хозяев, представляющих собой дрожжевые клетки или клетки нитчатых грибов, способ ферментации предпочтительно осуществляют при температуре ниже чем 35, 33, 30 или 28°C и при температуре выше чем 20, 22
или 25°C.
В воплощении изобретения стадию ферментации проводят с микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С5-сахар. В воплощении способ представляет собой способ продукции этанола, поэтому способ включает стадию, включающую ферментирование среды, содержащей сахар(сахара) с микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С5-сахар, в результате чего клетка-хозяин способна ферментировать глюкозу, L-арабинозу и ксилозу до этанола. В воплощении этого способа микроорганизм, который способен ферментировать по меньшей мере один С5-сахар, представляет собой дрожжи. В воплощении дрожжи принадлежат к роду Saccharomyces, предпочтительно к виду Saccharomyces cerevisiae, в котором были сделаны генетические изменения. Пример такого микроорганизма и его получение подробно описаны в WO 2008/041840 и в заявке на Европейский патент ЕР10160622.6, зарегистрированной 21 апреля 2010 г. В воплощении способ ферментации для получения этанола представляет собой анаэробный способ ферментации. Термин "анаэробный" уже был определен выше в настоящем документе. В другом предпочтительном воплощении способ ферментации для получения этанола представляет собой аэробный способ ферментации. В другом предпочтительном воплощении способ ферментации для получения этанола представляет собой способ ферментации в условиях лимитирования по кислороду, более предпочтительно аэробный и в условиях лимитирования по кислороду способ ферментации. Лимитированные по кислороду условия уже были определены выше в настоящем документе.
В таком способе объемная производительность этанола предпочтительно равна по меньшей мере 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 или 10,0 г/л/ч этанола. Выход по этанолу на L-арабинозе и, необязательно, на ксилозе и/или глюкозе в способе предпочтительно равен по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98%. Выход по этанолу в настоящем документе определяют как процент от теоретического максимального выхода, который для глюкозы и L-арабинозы и, необязательно, ксилозы равен 0,51 г этанола на1 г глюкозы или ксилозы.
В одном из аспектов способ ферментации, ведущий к продукции этанола, имеет несколько преимуществ по сравнению с известными способами ферментации, применяемыми для получения этанола:
возможны анаэробные способы;
также возможны условия лимитирования по кислороду;
могут быть получены повышенные выходы по этанолу и повышенные объемы производства э танола;
примененный штамм может быть способен использовать L-арабинозу и, необязательно, ксилозу.
Альтернативно описанным выше способам ферментации, могут быть применены по меньшей мере две различные клетки, это означает, что данный способ представляет собой способ совместной ферментации. Все предпочтительные воплощения способов ферментации, такие как описаны выше, также представляют собой предпочтительные воплощения данного способа совместной ферментации: идентичный продукт ферментации, идентичный источник L-арабинозы и источник ксилозы, условия ферментации (аэробные или анаэробные условия, лимитированные по кислороду условия, температура, при которой способ осуществляют, эффективность производства этанола, выход этанола).
Способ ферментации может быть осуществлен без каких-либо требований к доведению pH в ходе способа. Другими словами, способ представляет собой способ, который может быть осуществлен без добавления какой-либо кислоты(т) или основания(ий). Однако это верно, за исключением стадии предварительной обработки, на которой кислота может быть добавлена. Дело в том, что композиция изобре
тения способна действовать при низких pH, и, таким образом, нет необходимости корректировать pH предварительно обработанного кислотой исходного сырья для того, чтобы могло бы протекать осахари-вание или гидролиз. Соответственно, способ изобретения может представлять собой безотходный способ с применением только органических продуктов без необходимости введения неорганических химических соединений.
Общее время реакции.
В соответствии с изобретением общее время реакции (или совокупное время реакции на стадии гидролиза и на стадии ферментации) может быть снижено. В одном из воплощений общее время реакции равно 300 ч или менее, 200 ч или менее, 150 ч или менее, 140 ч или менее, 130 или менее, 120 ч или менее, 110 ч или менее, 100 ч или менее, 90 ч или менее, 80 ч или менее, 75 ч или менее, или примерно 72 ч при 90%-ном выходе глюкозы. Соответственно, снижение общего времени может быть достигнуто при снижении выхода глюкозы.
Продукты ферментации.
Продукты ферментации, которые могут быть получены в соответствии с изобретением, включают аминокислоты, витамины, лекарственные препараты, кормовые добавки для животных, химические продукты специального назначения, химическое исходное сырье, пластмассы, растворители, различные виды топлива, или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол (термин "этанол" понимается как включающий этиловый спирт или смеси этилового спирта и воды).
Конкретные продукты с добавленной стоимостью, которые могут быть получены способами изобретения, включают, но не ограничиваются, различные виды биотоплива (включая биогаз, этанол и бу-танол); молочную кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту; акриловую кислоту; уксусную кислоту; 1,3-пропандиол; этилен; глицерин; пластмассы; химические продукты специального назначения; органическую кислоту, включая лимонную кислоту, янтарную кислоту и малеиновую кислоту; растворитель; добавку к кормам для животных; лекарственный препарат, такой как р-лактамный антибиотик или цефа-лоспорин; витамин; аминокислоту, такую как лизин, метионин, триптофан, треонин и аспарагиновую кислоту; фермент, такой как протеаза, целлюлаза, амилаза, глюканаза, лактаза, липаза, лиаза, оксидоре-дуктаза, трансфераза или ксиланаза; исходное химическое сырье или добавку к кормам для животных.
Разделение продуктов ферментации.
Способ в соответствии с изобретением, необязательно, включает извлечение продукта ферментации. Продукт ферментации может представлять собой продукт, отделенный от ферментационного бульона любым известным способом. Таким образом, для каждого продукта ферментации специалист будет способен выбрать надлежащую методику разделения. Например, этанол может быть отделен от дрожжевого ферментационного бульона путем перегонки, например перегонки традиционным способом с водяным паром/перегонки при пониженном давлении.
Некоторые воплощения изобретения будут подробно описаны ниже, но они никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.
Применение термостабильных ферментов в оптимальных температурных условиях.
В одном из воплощений изобретение относится к применению термостабильных ферментов, таких как ферменты из Rasamsonia, разлагающие целлюлозу, для получения редуцирующих сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного исходного сырья, без ограничений, в продукции этанола. Разлагающие целлюлозу ферменты из Rasamsonia, применяемые для предварительно обработанного лиг-ноцеллюлозного исходного сырья, демонстрируют максимальные скорости превращения при температуре в диапазоне от 50 до 70°C. Фермент сохраняет активность в данных условиях в течение 14 дней и более без полного прекращения активности.
При применении оптимальных температурных условий максимальное количество редуцирующих сахаров может быть высвобождено из исходного сырья (полный гидролиз) в самые короткие из возможных времена гидролиза. В этом случае 100% превращения целлюлозы в глюкозу достигали менее чем за 5 дней.
Теоретический максимальный выход (Yps max в 1 г продукта на 1 г глюкозы) продукта ферментации может быть получен из учебника биохимии. Для этанола 1 моль глюкозы (180 г) в соответствии с нормальным гликолитическим энзиматическим путем в дрожжах дает 2 моль этанола (=2x46 = 92 г этанола). Теоретический максимальный выход этанола из глюкозы, таким образом, равен 92/180 = 0,511 г этанола/г глюкозы.
Для биогаза (MW 74 г/моль) или изобиогаза, теоретический максимальный выход равен 1 моль биогаза на 1 моль глюкозы. Таким образом, Yps max для (изо-)биогаза = 74/180 = 0,411 г (изо-)биогаза/г глюкозы.
Для молочной кислоты выход ферментации для гомомолочной ферментации равен 2 моль молочной кислоты (MW = 90 г/моль) на 1 моль глюкозы. В соответствии с данной стехиометрией Yps max = 1 г молочной кислоты/г глюкозы.
Для других продуктов ферментации может быть выполнен аналогичный расчет.
Снижение издержек, достигаемое с применением разлагающих целлюлозу ферментов из Rasamsonia, будет достигаться в результате сокращения времени способа в целом.
Компенсация снижения дозировки фермента продлением времени гидролиза с помощью ферментов Rasamsonia.
Благодаря высокой стабильности стабильных ферментов активности не прекращаются во времени, хотя меньше редуцирующих сахаров высвобождаются в ходе гидролиза. Можно снижать дозировку фермента и продлевать применение фермента, продлевая времена гидролиза с получением аналогичных уровней высвобождающихся редуцирующих сахаров. Например, 0,175 мл фермента/г сухого вещества исходного сырья приводит к выходу, равному приблизительно 90% от теоретического максимума редуцирующих сахаров из предварительно обработанного исходного сырья в течение 72 ч. При применении 0,075 мл фермента/г исходное сырье сухого вещества достигали приблизительно 90% превращения от теоретического максимума в течение 120 ч. Результаты показали, что благодаря стабильности ферментативной активности снижение дозировки фермента может быть скомпенсировано за счет продления времени гидролиза с получением такого же количества редуцирующего сахара. Такие же рассуждения для гидролиза предварительно обработанного исходного сырья при содержании сухого вещества выше чем 10% показывают, что компенсирующий эффект продленного времени гидролиза имеет место при 15% сухого вещества исходного сырья.
Снижение издержек, достигаемое с применением стабильных разлагающих целлюлозу ферментов, таких как ферменты Rasamsonia, в результате требующих меньших дозировок фермента приводят к сходным выходам гидролиза.
Снижение риска загрязнения со стабильными ферментами.
В традиционном способе превращения лигноцеллюлозного материала в этанол стадии способа предпочтительно выполняют в септических условиях для снижения эксплуатационных расходов. Таким образом, может происходить заражение и рост загрязняющих микроорганизмов, что приводит к нежелательным побочным эффектам, таким как продукция молочной кислоты, муравьиной кислоты и уксусной кислоты, потери в выходах этанола на субстрате, продукция токсинов и внеклеточных полисахаридов, которые могут существенно повлиять на производственные издержки. Высокая температура способа и/или короткое время способа будут ограничивать риск загрязнения в ходе гидролиза и ферментации. Термостабильные ферменты, такие как ферменты Rasamsonia, способны гидролизовать лигноцеллюлоз-ное исходное сырье при температурах выше 60°C. При данных температурах риск того, что загрязняющие микроорганизмы вызовут нежелательные побочные эффекты, будет наименьшим, практически равным нулю.
На протяжении стадии ферментации, на которой продуцируется этанол, температура, как правило, равна от 30 до 37°C и предпочтительно не будет увеличиваться из-за потерь в продукции. Если применять как можно более короткое время ферментации, то риски и эффекты заражения и/или роста загрязняющих микроорганизмов будут снижены, насколько это возможно. Со стабильными ферментами, такими как ферменты Rasamsonia, насколько можно более короткие времена ферментации могут быть применены (см. описание выше), и, таким образом, риски заражения и/или роста загрязняющих микроорганизмов будут снижены насколько это возможно. Снижение затрат, достигаемое путем применения разлагающих целлюлозу термостабильных ферментов из Rasamsonia, в этом случае происходит в результате снижения риска сбоев в способе, связанных с заражением.
Стабильные ферменты снижают затраты на охлаждение и увеличивают продуктивность заводов по производству спирта
Первая стадия после предварительной термической обработки представляет собой охлаждение предварительно обработанного исходного сырья до температур, при которых ферменты оптимально активны. В промышленных масштабах это, как правило, выполняют путем добавления (охлажденной) воды, что будет, помимо снижения температуры, уменьшать содержание сухого вещества. Путем применения термостабильных ферментов, таких как ферменты Rasamsonia, снижение расходов может быть достигнуто благодаря и тому, что (i) требуется меньшее охлаждение предварительно обработанного исходного сырья, поскольку в ходе гидролиза допускаются более высокие температуры, и (ii) меньше воды добавляют, что увеличивает содержание сухого вещества в ходе гидролиза и ферментации и, таким образом, увеличивает мощность производства этанола (полученное количество в единицу времени на объем) завода по производству спирта. Кроме того, путем применения термостабильных ферментов в соответствии с изобретением, таких как ферменты Rasamsonia, снижение расходов также может быть достигнуто путем применения охлаждающей воды, которая имеет более высокую температуру по сравнению с водой, которую применяют в способе с нетермостабильными ферментами.
Повторное применение ферментов после гидролиза со стабильными ферментами.
В конце гидролиза ферментативные активности, по всей видимости, будут низкими, поскольку мало редуцирующих сахаров высвобождается, когда превращена почти вся целлюлоза. Количество присутствующей энзиматической активности, однако, упадет лишь незначительно, предположительно, главным образом, из-за абсорбции ферментов на субстрате. Применяя разделение твердого вещества и жидкости после гидролиза, такое как центрифугирование, фильтрация, осаждение и т.п., 60% или более, например
70%, ферментативной активности в растворе может быть извлечено и повторно применено для гидролиза нового предварительно обработанного лигноцеллюлозного исходного сырья в ходе следующего гидролиза.
Кроме того, после разделения твердого вещества и жидкости фермент в растворе может быть отделен от раствора, содержащего редуцирующие сахара и другие продукты гидролиза, полученные в результате деятельности ферментов. Данное разделение может быть выполнено, без ограничений, с помощью (ультра- и микро)фильтрации, центрифугирования, осаждения, седиментации, с исходной адсорбцией фермента на носителе любого типа или без нее.
Например, после гидролиза предварительно обработанного исходного сырья с ферментной нагрузкой, равной 0,175 мл/г сухого вещества исходного сырья, редуцирующие сахара высвобождаются в количестве 50% от теоретического максимума в течение 20 ч, и после такого же гидролиза 90% от теоретически максимального количества редуцирующих сахаров высвобождается в течение 72 ч. С помощью центрифугирования и ультрафильтрации 60-70% ферментативной активности извлекают в ретентате, в то время как фильтрат содержит более чем 80% высвобожденных редуцирующих сахаров. Путем повторного использования ретентата, или как есть, или после дополнительной очистки и/или концентрации дозировка фермента на протяжении следующей стадии гидролиза может быть снижена на 60-70%. Снижение расходов, достигаемое путем применения разлагающих целлюлозу стабильных ферментов, таких как ферменты из Rasamsonia, в этом случае происходит в результате выполнения требования уменьшения дозировки фермента.
Повторное применение ферментов после гидролиза в комбинации с продукцией ферментов и повторным применением клеток дрожжей со стабильными ферментами.
Способ, включающий повторное применение ферментов после гидролиза, как описано выше, может быть скомбинирован с повторным применением продуцирующих этанол микроорганизмов после ферментации и с применением фильтрата, содержащего редуцирующие сахара, в качестве субстрата (очищенного и/или сконцентрированного или разбавленного) в ферментации фермент-продукция и в качестве субстрата для культивирования этанол-продуцирующих микроорганизмов.
Повторное применение ферментов после перегонки при пониженном давлении со стабильными ферментами.
Термостабильность ферментов, таких как ферменты из Rasamsonia, приводит к сохранению целлю-лолитической активности после гидролиза, ферментации и перегонки при пониженном давлении в тонкой барде. Полная активность фермента снижается на протяжении трех последовательных стадий способа. Таким образом, тонкая барда, полученная после перегонки при пониженном давлении, может быть применена повторно в качестве источника фермента для вновь запущенного цикла гидролиз-ферментация-перегонка способа превращения предварительно обработанной пшеничной соломы в этанол. Тонкая барда может быть применена или в сконцентрированной или (не)разбавленной форме и/или может быть очищена с дополнительной добавкой фермента или без нее.
Повторное применение ферментов в комбинации с добавкой фермента после перегонки при пониженном давлении с термостабильными ферментами.
В оптимальном способе количество фермента, которое добавляют в тонкую барду, перед ее повторным применением в новом цикле способа, равно количеству активности, потерянной в ходе трех последовательных стадий способа предыдущего цикла способа. В этом случае избегают передозировки фермента и, таким образом, получают наиболее эффективное применение фермента.
Кроме того, обеспечивая высокую дозировку фермента на первом цикле способа и дополнительное внесение в следующие циклы способа фермента в количестве, равном активности, потерянной в ходе трех последовательных стадий способа, на каждом цикле способа могут быть получены наивысшие из возможных скоростей гидролиза, что приводит к сокращению времени гидролиза до менее чем 48 ч в комбинации с наиболее эффективным применением ферментов.
Применение стабильных ферментов в системах с перемешиванием.
Благодаря перемешиванию в ходе гидролиза ферменты чаще приходят в контакт с субстратами, что приводит к более эффективному применению каталитической активности. Это приводит к снижению дозировок ферментов и, таким образом, к снижению затрат, если только перемешивание не имеет отрицательного влияния на ферменты. Стабильные ферменты, такие термостабильные ферменты из Rasamsonia, представляют собой устойчивые ферменты и могут противостоять условиям окружающей среды, которые характеризуются (локальным) высоким усилием сдвига и высокими температурами, которые возникают при интенсивном перемешивании суспензий. Применение стабильных ферментов в системе с перемешиванием, таким образом, выгодно и приведет к снижению дозировки и, таким образом, к снижению затрат.
Изобретение далее будет описано с помощью следующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Экспериментальная информация. Штаммы.
Штамм Rasamsonia (Talaromyces) emersonii был депонирован в CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Утрехт, Нидерланды, в декабре 1964 г., код доступа CBS 393.64.
Другие подходящие штаммы могут быть в равной степени использованы в настоящих примерах для демонстрации эффекта и преимуществ изобретения. Например, ТЕС-101, ТЕС-147, ТЕС-192, ТЕС-201 или ТЕС-210 представляют собой подходящие штаммы Rasamsonia, которые описаны в WO 2011/000949.
Получение предварительно обработанного кислотой субстрата из кукурузной соломы.
Предварительно обработанную разбавленной кислотой кукурузную солому (aCS) получали, как описано в работе Schell, D.J., Applied Biochemistry и Biotechnology (2003), vol. 105-108, p. 69-85. Применяли полупромышленный реактор для предварительной обработки, который работал в стационарных условиях при 190°C, продолжительность обработки - 1 мин и эффективная концентрация кислоты H2SO4 была равна 1,45% (мас./мас.) в жидкой фазе.
Анализы для определения белка.
1. Суммарный белок. ТСА биурет.
Способ представляет собой комбинацию осаждения белка трихлоруксусной уксусной кислотой (ТСА) для удаления мешающих веществ, что позволяет проводить определение концентрации белка с помощью колориметрической биуретовой реакции. В биуретовой реакции ион меди(11) восстанавливается до иона меди(1), который образует комплекс с азотами и углеродами пептидных связей в щелочном растворе. Фиолетовая окраска указывает на наличие белков. Интенсивность окраски и, следовательно, поглощение при 546 нм прямо пропорциональны концентрации белка в соответствии с законом Бера-Ламберта. Стандартизацию проводили с применением БСА (бычий сывороточный альбумин), и содержание белка выражают в граммах белка как эквивалент БСА/л или миллиграммах белка как эквивалент БСА/мл. Содержание белка рассчитывали с помощью стандартных протоколов расчета, известных в данной области техники, откладывая OD546 против концентрации образцов с известными концентрациями, с последующим расчетом концентрации неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии.
2. Индивидуальные белки с применением PAGE. Предварительная обработка образцов для SDS-PAGE.
Основываясь на определенной концентрации белка образцов, проводили получение следующих образцов. К 10 мкл образца добавляли 40 мкл воды MilliQ и 50 мкл ТСА (20%) для разведения образца в пять раз (~1 мг/мл) и осаждения белков. После инкубации 1 ч на льду образец центрифугировали (10 мин, 14000 rpm). Осадок промывали 500 мкл ацетона и центрифугировали (10 мин, 14000 rpm). Осадок обрабатывали, как описано ниже.
SDS-PAGE.
Осадок растворяли в 65 мкл воды MilliQ, 25 мкл буфера для образцов NuPAGE(tm) LDS (4x) "Invitrogen" и 10 мкл восстановителя для образцов NuPAGE(tm) (10x) "Invitrogen". Перед стадией денатурации образец разбавляли в 5 раз, применяя смесь MilliQ; буфер для образцов NuPAGE(tm) LDS и 10 мкл восстановителя для образцов NuPAGE в соотношении 65:25:10. После смешивания образцы инкубировали в термомиксере в течение 10 мин при 70°C. Растворы образцов наносили на 4-12% Bis-Tris гель (NuPAGE(tm) BisTris, "Invitrogen"). Образец (10 мкл) маркера М12 ("Invitrogen") также наносили на гель. Гель прогоняли при 200 V в течение 50 мин, применяя XCELL Surelock, с 600 мл 20x разбавленного буфера SDS в камере для внешнего буфера и 200 мл 20x разбавленного буфера SDS, содержащего 0,5 мл антиоксиданта (NuPAGE "Invitrogen") в камере для внутреннего буфера. После прогона, гель дважды промывали деминерализованной водой, гели фиксировали раствором 50% метанол/7% уксусная кислота в течение одного часа и окрашивали Sypro Ruby (50 мл на гель) в течение ночи. Изображение получали с помощью "Typhoon 9200" (610 ВР 30, Green (532 нм), РМТ 600V, 100 микрон) после промывки геля водой MilliQ.
Количественный анализ белка.
Применяя сканер "Typhoon", отношение между полосами белка в границах дорожки определяли стандартными способами, известными в данной области техники. Образец наносили в трех повторностях и уровень яркости определяли с помощью программы "Image quant". Величины выражали в относительных % белка к общему белку, рассчитывали, применяя уровень яркости выбранной полосы белка по отношению к суммарному уровню яркости всех белковых полос.
Расчет превращение глюкана:
% превращение глюкана (%)=(глюкоза (г/л)х 100%)/(глюкан (фракция на DM)xdm (г/кг)х 1,1), где глюкоза (г/л) = концентрация глюкозы в супернатанте после гидролиза; глюкан (фракция на dm) = содержание глюкана субстрата перед предварительной обработкой;
dm (г/кг) = сухое вещество гидролиза (например, 20% dm = 200 г/кг); 1,1 = увеличение массы из-за включения воды в ходе гидролиза. Пример расчета: глюкоза = 60 г/л;
фракция глюкана = 0,40 (равно 40% на сухое вещество);
dm = 200 г/кг;
пример превращения глюкана = (60x 100)/(0,4x200x 1,1)=68% превращения. Пример 1.
Оценка эффекта отсутствия кислорода в ходе гидролиза на целлюлолитическую активность смеси целлюлазных ферментов.
Эффект отсутствия кислорода в ходе гидролиза на целлюлолитическую активность трех различных ферментных смесей оценивали в соответствии с процедурами, описанными ниже. Реакции гидролиза проводили с исходным сырьем, представляющим собой предварительно обработанную кислотой кукурузную солому (aCS), при конечной концентрации DM, равной 10% (мас./мас.). Данный раствор исходного сырья получали разведением раствора концентрированного исходного сырья водой. Затем значение pH доводили до 4,5 раствором 4 М NaOH. Удаление кислорода из исходного сырья осуществляли в две стадии. Во-первых, раствор исходного сырья дегазировали с помощью ультразвука при пониженном давлении в ультразвуковой ванне (Bransonic 5510E-DTH, setting; Degas) в течение 15 мин. На второй стадии кислород дополнительно удаляли путем непрерывного барботирования током азота через 500 мл раствора 10% DM исходного сырья в течение 3 ч. Перед продувкой через раствор исходного сырья ток азота барботировали через воду для того, чтобы насытить его водным паром и предотвратить испарение воды из раствора исходного сырья. Одновременно 500 мл такой же партии 10% (мас./мас.) DM aCS бар-ботировали воздухом в качестве кислородсодержащего контрольного образца с аналогичными настойками и в соответствии с таким же протоколом.
Гидролиз обедненного по кислороду (барботированного азотом) и насыщенного кислородом (бар-ботированного воздухом) 10% (мас./мас.) растворов исходного сырья aCS проводили в герметичной 30-миллилитровой колбе для центрифугирования ("Nalgene Oakridge") в полном реакционном объеме, равном 10 мл. Колбы, уже содержащие раствор целлюлазы, примененный для эксперимента с истощением по кислороду, барботировали азотом перед заполнением и в ходе заполнения их исходным сырьем. Каждый гидролиз проводили в двух повторностях с 7,5 мг/г DM целлюлазной ферментной смеси, добавленной в общем объеме, не превышавшем 375 мкл. Три протестированные целлюлазные ферментные смеси включали смесь ТЕС-210 (смесь целлюлаз), смесь 4E-GH61 (состоящую из 9% (мас./мас.) от общего белка BG, 30% (мас./мас.) от общего белка CBHI, 25% (мас./мас.) от общего белка СВНП и 36% (мас./мас.) от общего белка GH61) и смесь 4E-EG (состоящую из 9% (мас./мас.) от общего белка BG, 30% (мас./мас.) от общего белка CBHI, 25% (мас./мас.) от общего белка СВНП и 36% (мас./мас.) от общего белка EG). ТЕС-210 ферментировали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO 2011/000949. Применяли смесь 4Е (как описано в WO 2011/098577).
Центрифужные колбы, содержащие исходное сырье и раствор ферментов, помещали в печь-инкубатор (гибридизационная печь "Techne HB-1D") и инкубировали в течение 72 ч при 65°C, одновременно вращая в заданном положении 3 (12 rpm/мин). Затем образцы гидролиза охлаждали на льду и немедленно 50 мкл каждого супернатанта разводили в 1450 мкл воды со степенью чистоты I. Разбавленный супернатант затем фильтровали (0,45 мкм фильтр, Pall PN 454) и фильтраты анализировали на содержание сахара, как описано ниже.
Концентрации сахара разбавленного образца измеряли с помощью HPLC, оборудованного колонкой "Aminex HPX-87P" (Biorad #1250098), элюировали водой при 85°C со скоростью тока 0,6 мл/мин и количественно определяли путем интегрирования сигналов глюкозы, полученных при детекции показателя преломления (R.I.), калиброванного по стандартным растворам глюкозы.
Данные, представленные в табл. 1/на фиг. 1, показали, что высвобождение глюкозы из барботиро-ванного азотом исходного сырья было ниже, чем высвобождение глюкозы из барботированного воздухом исходного сырья при инкубации как со смесью ТЕС-210, так и со смесью 4E-GH61. Не наблюдали разницы в детектируемом высвобождении глюкозы между барботированным азотом и барботированным воздухом исходным сырьем для образцов, гидролизованных смесью 4E-EG.
На основании данных результатов мы заключили, что присутствие кислорода улучшает целлюлоли-тическое поведение целлюлазной смеси, которая содержит ферменты GH61.
Пример 2.
Эффект кислорода на целлюлолитическую активность целлюлазных ферментных смесей в ходе гидролиза лигноцеллюлозного исходного сырья.
В этом примере показан эффект кислорода на целлюлолитическую активность смеси ферментов в ходе гидролиза лигноцеллюлозного исходного сырья. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, представляющим собой кукурузную солому (aCS), в конечной концентрации, равной 20% (мас./мас.) DM. Данный раствор исходного сырья получали разведением концентрированного раствора исходного сырья водой. Затем pH доводили до pH 4,5 10%-ным раствором (мас./мас.) NH4OH.
Гидролиз осуществляли в перемешиваемом реакторе с контролируемым pH и контролируемой температурой с рабочим объемом, равным 1 л. Каждый гидролиз осуществляли в двух повторностях с 2,5 мг/г DM целлюлазной ферментной смеси ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты.
1) 1 л 20% aCS, pH 4,5, температура 62°C, скорость перемешивания 60 rpm (это соответствует уровню DO <0,002 моль кислорода на 1 м3), 2,5 мг/г dm смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч (эксперимент сравнения).
2) Как в эксперименте 1, но в начале гидролиза барботирование воздуха в раствор начинали к уровню растворенного кислорода, равному 20% (это соответствует величине 0,03 моль кислорода на 1 м3, измеренной с помощью электрода DO (растворенный кислород)). Данный уровень растворенного кислорода поддерживали на протяжении всего оставшегося гидролиза.
3. Как в эксперименте 1, но на 72-м часу барботирование воздуха в раствор к уровню растворенного кислорода, равному 20% (это соответствует величине 0,03 моль кислорода на 1 м3, измеренной с помощью электрода DO (растворенный кислород)). Данный уровень растворенного кислорода поддерживали на протяжении всего оставшегося гидролиза.
После гидролиза образцы охлаждали на льду и немедленно 50 мкл каждого супернатанта разводили в 1450 мкл воды со степенью чистоты I. Разбавленный супернатант затем фильтровали (0,45 мкм фильтр, Pall PN 454) и фильтраты анализировали на содержание сахара, как описано ниже.
Концентрацию сахара разбавленных образцов оценивали с помощью HPLC, оборудованного колонкой Aminex HPX-87P (Biorad #1250098), элюцию проводили водой при 85°C со скоростью тока 0,6 мл/мин и количественно определяли путем интегрирования сигналов глюкозы, полученных детекцией показателя преломления (R.I.), калиброванного по стандартным растворам глюкозы.
Результаты, приведенные на фиг. 2, ясно демонстрируют увеличение продукции глюкозы в случае добавления воздуха. Кроме того, добавление воздуха к реакции гидролиза во второй части времени приводит к превосходящей продукции глюкозы по сравнению с экспериментом, в котором воздух не добавляли или воздух добавляли на протяжении всей стадии гидролиза.
Пример 3.
Эффект частичной аэрации (во времени) на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного исходного сырья в полупромышленном масштабе.
В данном примере показан эффект концентрации растворенного кислорода на целлюлолитическую активность смеси ферментов или композиции в ходе гидролиза лигноцеллюлозного исходного сырья в полупромышленном масштабе. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, кукурузной соломой (aCS), в конечной концентрации, равной 20% (мас./мас.) DM. Раствор исходного сырья получали разведением суспензии концентрированного исходного сырья водой. pH доводили до pH 4,5 25%-ным (мас./мас.) раствором NH4OH.
Ферментативный гидролиз проводили в 270-литровом опытном реакторе с контролируемыми pH и температурой, с рабочим объемом 150 л. Растворенный кислород в ходе способа контролировали, регулируя скорость вращения крыльчатки при заданном воздушном потоке и избыточном давлении. Ферментативный гидролиз осуществляли в дозировке 2,5 мг (белка ТСА)/г dm целлюлазной ферментной смеси ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO 2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты. Эксперимент 1.
Аэрацию проводили с 0 до 120 ч: 150 л 20% pCS, pH 4,5, температура 62°C, избыточное давление 1 бар, воздушный поток в свободном пространстве 10 кг/ч, 3,75 мг ТСА/г dm смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч в 270-литровом опытном реакторе. Концентрацию растворенного кислорода (DO) реакционной смеси измеряли постоянно, применяя DO-электрод. Уровень DO поддерживали равным 0,15-0,22 моль/м3 путем регулирования скорости рабочего колеса.
Эксперимент 2.
Аэрацию проводили между 72 и 120 ч: 150 л 20% pCS, pH 4,5, температура 62°C, дозировка фермента - 2,50 мг ТСА/г dm смеси целлюлаз ТЕС-210 и полное время инкубации равно 120 ч в 270-литровом опытном реакторе. Концентрацию растворенного кислорода (DO) в реакционной смеси измеряли постоянно с помощью DO электрода. В течение первых 72 ч способа применяли следующие настройки: отсутствие избыточного давления, отсутствие воздушного потока в свободном пространстве и уровень DO поддерживали равным [0,02-0,05] моль/м3 путем регулирования скорости рабочего колеса. В течение последних 48 ч способа применяли следующие настройки: избыточное давление - 1 бар, воздушный поток в свободном пространстве - 10 кг/ч и уровень DO поддерживали равным 0,15-0,22 моль/м3 путем регулирования скорости рабочего колеса.
В ходе ферментативного гидролиза ежедневно отбирали образцы для анализа углеводов (глюкоза, целлобиоза) с помощью NMR и для анализа вязкости и измерения рН.
Анализ композиции предварительно обработанной кукурузной соломы выполняли с помощью химического гидролиза образцов и определения моносахаридов с помощью NMR.
Образцы, отобранные в ходе ферментативного гидролиза, анализировали на наличие (оли-го)сахаров, органических кислот и ингибиторов с помощью проточного NMR.
Результаты, представленные на фиг. 4, показали, что в ходе ферментативного гидролиза в эксперименте 2 с частичной аэрацией (? = аэрация между временами гидролиза, равными 72 и 100 ч) продуцируется больше глюкозы, чем в ходе ферментативного гидролиза в эксперименте 1 (¦ = аэрация между временами гидролиза, равными 0 и 100 ч).
Пример 4.
Эффект выбора времени поставки растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигно-целлюлозного исходного сырья.
В данном примере показан эффект выбора времени поставки растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного исходного сырья. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, кукурузной соломой (aCS) в конечной концентрации, равной 20% (мас./мас.) DM. Раствор исходного сырья получали разведением суспензии концентрированного исходного сырья водой. pH доводили до 4,5 25%-ным (мас./мас.) раствором NH4OH.
Ферментативный гидролиз проводили в 2-литровом реакторе с контролируемыми pH и температурой, с рабочим объемом 1 л. Растворенный кислород в ходе способа контролировали, регулируя скорость вращения крыльчатки и путем непрерывного добавления в свободное пространства свежего воздуха в случае с повышенной концентрацией растворенного кислорода. Ферментативный гидролиз осуществляли в дозировке, равной 1,5 мг (ТСА белок)/г dm целлюлазной ферментной смеси ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO 2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты.
Эксперимент 1.
Аэрацию проводили с 0 до 7 ч: 1 л 20% pCS, pH 4,5, температура 62°C, 1,5 мг ТСА/г dm смеси цел-люлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч. Концентрацию растворенного кислорода (DO) в реакционной смеси измеряли постоянно, применяя DO-электрод. DO поддерживали на уровне > 0,05 моль/м3 в течение первых 7 ч гидролиза. Между 7 и 120 ч времени гидролиза DO поддерживали на уровне <0,02 моль/м3.
Эксперимент 2.
Аэрацию проводили между 72 и 120 ч: 1 л 20% pCS, pH 4,5, температура 62°C, 1,5 мг ТСА/г dm смеси целлюлаз ТЕС-210, время инкубации 120 ч. Концентрацию растворенного кислорода (DO) реакционной смеси измеряли постоянно с помощью DO электрода. В течение первых 72 ч гидролиза DO поддерживали на уровне <0,01 моль/м3. Между 72 и 120 ч времени гидролиза DO поддерживали на уровне > 0,05 моль/м3.
В ходе ферментативного гидролиза ежедневно отбирали образцы для анализа углеводов (глюкоза, целлобиоза) с помощью NMR и для анализа вязкости и измерения pH.
Анализ композиции предварительно обработанной кукурузной соломы выполняли с помощью химического гидролиза образцов и определения моносахаридов с помощью NMR.
Результаты, представленные на фиг. 5, ясно демонстрируют увеличение скорости образования глюкозы при аэрировании реакционной смеси. Эксперимент 1, который аэрировали с 0 до 7 ч, ясно показал увеличение скорости образования глюкозы в течение первых 7 ч способа по сравнению с неаэрируемой ситуацией, на протяжении данной фазы способа в эксперименте 2. Кроме того, эксперимент 2 продемонстрировал увеличение скорости образования глюкозы между 72 и 120 ч по сравнению с неаэрируемой
ситуацией в течение данного периода в эксперименте 1. Пример 5.
Эффект кислорода на целлюлолитическую активность целлюлозных ферментных композиций при гидролизе лигноцеллюлозного исходного сырья с применением низкой дозировки фермента.
В данном примере показан эффект кислорода на целлюлолитическую активность ферментной композиции с применением низкой дозировки фермента при гидролизе лигноцеллюлозного исходного сырья. Реакции гидролиза осуществляли с предварительно обработанным кислотой исходным сырьем, которое представляло собой кукурузную солому (aCS), в конечной концентрации 20% (мас./мас.) DM. Данный раствор исходного сырья получали разведением концентрированного раствора исходного сырья водой. Затем pH доводили до значения 4,5 с помощью 10% (мас./мас.) раствора NH4OH. Содержание глюкана в примененной кукурузной соломе было равно 37% на сухое вещество.
Гидролиз осуществляли в реакторе с перемешиванием с контролируемым pH и с контролируемой температурой, с рабочим объемом 1 л. Каждый гидролиз осуществляли в двух повторах с 2,5 мг/г DM целлюлазной ферментной композиции (или смеси) ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949.
Были выполнены следующие эксперименты.:
1. 1 л 20% aCS, pH 4,5, температура 62°C, скорость вращения мешалки 60 rpm, 3,5 мг целлюлазной композиции ТЕС-210 на 1 г исходного сырья (по сухому веществу), время инкубации 120 ч (эксперимент сравнения) в закрытом реакторе. Уровень растворенного кислорода в реакционной смеси измеряли постоянно, применяя DO-электрод. Это медленное перемешивание привело к уровню растворенного кислорода 0,005 моль/м3.
2. Как в эксперименте 1, но с применением дозировки фермента, равной 2,5 мг ТЕС-210 на 1 г исходного сырья (по сухому веществу), и со скоростью вращения мешалки 250 rpm, со свободным пространством над реакционной смесью, в которое постоянно поставляли свежий воздух Повышенная скорость перемешивания в сочетании с поставкой свежего воздуха в свободное пространство приводила к уровню растворенного кислорода в реакционной смеси, равному 0,030 моль/м3.
В ходе гидролиза отбирали образцы для анализа. Образцы охлаждали на льду и незамедлительно 50 мкл каждого супернатанта разводили в 1450 мкл воды степени чистоты I. Затем разбавленные супер-натанты фильтровали (фильтр 0.45 мкм, Pall PN 454) и фильтраты анализировали на содержание сахара, как описано ниже.
Концентрации сахара в разбавленных образцах измеряли с помощью HPLC, оборудованного колонкой Aminex HPX-87P (Biorad #1250098), элюцию проводили водой при 85°C при скорости элюции 0,6 мл/мин и количественно определяли путем интегрирования сигналов глюкозы, полученных при детекции показателя преломления (R.I.), калиброванного по стандартным растворам глюкозы.
Результаты представлены на фиг. 6.
Превращения глюкана приведены в табл. 2.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий стадию ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала в реакторе объемом 1 м3 или более с применением ферментной композиции, включающей по меньшей мере две целлюлазы, одна из которых является GH61, где применяют от 0,05 до 3,0 мг ферментной композиции/г исходного сырья по сухому веществу, гидролиз проводят при температуре 45°C или более, время протекания гидролиза составляет от 5 до 150 ч, pH в ходе гидролиза составляет от 3,0 до 6,4, в течение стадии ферментативного гидролиза лигно-целлюлозный материал барботируют кислородом, причем содержание сухого вещества лигноцеллюлоз-ного материала на стадии гидролиза составляет 10 мас.% или более.
2. Способ по п.1, включающий предварительную обработку лигноцеллюлозного материала паром, горячей водой, или разбавленной кислотой, или разбавленным основанием перед стадией гидролиза.
3. Способ по п.1 или 2, включающий отмывку лигноцеллюлозного материала.
4. Способ по любому из пп. 1-3, включающий извлечение сахарного продукта из реактора.
5. Способ получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:
осуществление способа по любому из пп.1-4 и
ферментация микроорганизмом гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения
продукта ферментации, выбранного из группы, включающей биогаз, этанол, бутанол, молочную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, лимонную кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, Р-лактамный антибиотик, цефалос-порин, витамин, лизин, метионин, триптофан, треонин, аспарагиновую кислоту, протеазу, целлюлазу, амилазу, глюканазу, лактазу, липазу, лиазу, оксидоредуктазу, трансферазу или ксиланазу.
6. Способ по п.5, включающий извлечение продукта ферментации.
7. Способ по любому из пп.1-6, где кислород во время барботирования лигноцеллюлозного материала добавляют неравномерно, причем в течение одной части времени барботирования к лигноцеллю-лозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени, где промежуток времени, в течение которого кислород добавляют меньше, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза и где концентрация кислорода в жидкой фазе в течение указанного промежутка по меньшей мере в 2 раза ниже по сравнению с его концентрацией в течение промежутка времени, при котором добавляют больше кислорода.
8. Способ по пп.1-6, где в течение одного промежутка времени ферментативного гидролиза лигно-целлюлозный материал не барботируют кислородом, причем промежуток времени, в течение которого не добавляют кислород, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
9. Способ по любому из пп.1-6, где кислород во время барботирования лигноцеллюлозного материала добавляют неравномерно, причем в течение одной части времени барботирования к лигноцеллю-лозному материалу добавляют меньше кислорода по сравнению с другой частью времени, где промежуток времени, в течение которого добавляют больше кислорода, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза и где концентрация кислорода в жидкой фазе в течение указанного промежутка по меньшей мере в 2 раза выше по сравнению с его концентрацией в течение промежутка времени, при котором добавляют меньше кислорода.
12 3 Фиг. 1
10. Способ по пп.1-6, где в течение одного промежутка времени ферментативного гидролиза лигно-целлюлозный материал не барботируют кислородом, причем промежуток времени, в течение которого добавляют кислород, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза.
11. Способ по любому из пп.1-10, где ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или более.
12. Способ по любому из пп.1-11, где ферментную композицию получают из гриба штаммов Acre-monium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusa-rium, Geosmithia, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Rasamsonia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma.
13. Способ по любому из пп.1-12, где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно 14 мас.% или более.
14. Способ по п.13, где содержание сухого вещества на стадии гидролиза равно от 14 до 33 мас.%.
15. Способ по любому из пп.1-14, где ферментативный гидролиз проводят в реакторе периодического действия, периодического действия с подпиткой или для непрерывного культивирования.
16. Способ по любому из пп.5-15, где ферментацию осуществляют микроорганизмом, который способен ферментировать по меньшей мере один С5-сахар.
17. Способ по п.16, где микроорганизм является дрожжами.
10.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032496
- 1 -
(19)
032496
- 1 -
(19)
032496
- 1 -
(19)
032496
- 9 -
(19)
032496
- 29 -
|
