[RU]

1. Применение N-концевого A β1-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, где антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у указанного индивидуума с синдромом Дауна еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

2. Применение по п.1, где указанные нарушения памяти и/или когнитивные нарушения представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.

3. Применение по п.1, где указанные нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии у индивидуума с синдромом Дауна представляют собой нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии AD-типа.

4. Применение по п.1, где указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой: (а) индивидуума от молодого до среднего возраста, (б) индивидуума среднего возраста, (в) индивидуума молодого возраста, (г) индивидуума детского возраста.

5. Применение по п.4, где указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.

6. Применение по п.1, где антигенный пептид A β модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты, связанной с N- и/или C-концом пептида.

7. Применение по п.6, где антигенный пептид A β модифицирован с помощью: а) 4 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида, или б) 2 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида.

8. Применение по п.1 для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, не вызывающее воспалительной реакции.

9. Применение по любому из пп.1-7, где антигенный пептид представлен в виде композиции, содержащей антигенный пептид в терапевтически эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

10. Применение по п.9, где композиция содержит адъювант.

11. Способ лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

12. Способ по п.11, в котором указанное нарушение или указанная аномалия представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.

13. Способ по п.11, предназначенный для улучшения сохранения или полного восстановления когнитивной способности у индивидуума с синдромом Дауна, предусматривающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10.

14. Способ по любому из пп.11-13, в котором указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой: а) индивидуума от молодого до среднего возраста; б) индивидуума среднего возраста; в) индивидуума молодого возраста или г) индивидуума детского возраста.

15. Способ по п.14, в котором указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.

16. Способ предотвращения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

(57) Реферат / Формула:

1. Применение N-концевого A β1-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, где антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у указанного индивидуума с синдромом Дауна еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

2. Применение по п.1, где указанные нарушения памяти и/или когнитивные нарушения представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.

3. Применение по п.1, где указанные нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии у индивидуума с синдромом Дауна представляют собой нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии AD-типа.

4. Применение по п.1, где указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой: (а) индивидуума от молодого до среднего возраста, (б) индивидуума среднего возраста, (в) индивидуума молодого возраста, (г) индивидуума детского возраста.

5. Применение по п.4, где указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.

6. Применение по п.1, где антигенный пептид A β модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты, связанной с N- и/или C-концом пептида.

7. Применение по п.6, где антигенный пептид A β модифицирован с помощью: а) 4 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида, или б) 2 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида.

8. Применение по п.1 для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, не вызывающее воспалительной реакции.

9. Применение по любому из пп.1-7, где антигенный пептид представлен в виде композиции, содержащей антигенный пептид в терапевтически эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

10. Применение по п.9, где композиция содержит адъювант.

11. Способ лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

12. Способ по п.11, в котором указанное нарушение или указанная аномалия представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.

13. Способ по п.11, предназначенный для улучшения сохранения или полного восстановления когнитивной способности у индивидуума с синдромом Дауна, предусматривающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10.

14. Способ по любому из пп.11-13, в котором указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой: а) индивидуума от молодого до среднего возраста; б) индивидуума среднего возраста; в) индивидуума молодого возраста или г) индивидуума детского возраста.

15. Способ по п.14, в котором указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.

16. Способ предотвращения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

---

Евразийское 032494 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201400376
(22) Дата подачи заявки
2012.09.21
(51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01) A61P25/00 (2006.01)
(54) N-КОНЦЕВОЙ АР1-15 АНТИГЕННЫЙ ПЕПТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНДИВИДУУМА С СИНДРОМОМ ДАУНА
(31) PCT/US2011/052992
(32) 2011.09.23
(33) US
(43) 2014.09.30
(86) PCT/US2012/056728
(87) WO 2013/044147 2013.03.28
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АЦ ИММУНЕ С.А. (CH)
(72) Изобретатель:
Пфайфер Андреа, Мус Андреас, Мадани Риме (CH), Беличенко Павел Васильевич, Мобли Уилльям Чарлз
(US)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(56) WO-A2-2007068411 WO-A2-2010106127
STOLTZNER S.E. ET AL.: "TEMPORAL ACCRUAL OF COMPLEMENT PROTEINS IN AMYLOID PLAQUES IN DOWN'S SYNDROME WITH ALZHEIMER'S DISEASE", AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY; [10640], AMERICAN SOCIETY FOR INVESTIGATIVE PATHOLOGY, US, vol. 156, no. 2, 1 February 2000 (2000-02-01), pages 489-499, XP001146406, ISSN: 0002-9440, cited in the application, abstract
ROIZEN NANCY J.: "Complementary and alternative therapies for Down syndrome", MENTAL
RETARDATION AND DEVELOPMENTAL
DISABILITIES RESEARCH REVIEWS 2005, vol. 11, no. 2, 2005, pages 149-155, XP002689521, ISSN: 1080-4013, page 151, column 1, paragraph 4
(57) В изобретении описано применение N-концевого Ap-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений, или аномалий памяти и/ или когнитивных нарушений, или аномалий у индивидуума, причем этот антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки. Кроме того, изобретение также раскрывает способ лечения и/или облегчения нарушений, или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений, или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна (DS) с применением указанных фрагментов антигенного пептида, происходящих из амилоидного белка или амилоидоподобного белка и содержащих эти фрагменты композиций.
Настоящее изобретение относится к средствам лечения связанной с амилоидом патологии у пациентов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна (DS). В частности, настоящее изобретение относится к антигенным пептидным фрагментам, происходящим из амилоидного белка или амилоидопо-добного белка, которые предназначены для лечения деменции альцгеймеровского типа (AD) у пациентов от молодого до среднего возраста, страдающих синдромом Дауна (DS).
Генетическое нарушение, такое как синдром Дауна (DS), представляет собой наиболее распространенную трисомию, и оно встречается у одного из 700-1000 новорожденных. По существующим оценкам предполагается, что 25% или более индивидуумов возрастом свыше 35 лет с синдромом Дауна имеют признаки и симптомы деменции альцгеймеровского типа (Stanton L.R и Coetzee R.H., 2004). Этот процент повышается с возрастом. При DS присутствуют три копии всей хромосомы 21 или по меньшей мере ее части (трисомия по хромосоме 21) (Antonarakis и др., 2004; Moncaster и др., 2010). В результате присутствия трех копий гена амилоидного белка-предшественника (APP) происходит образование избытка амилоида-Р (Ap), одного из основных аномальных (патологических) белков, которые, как хорошо известно, ответственны за развитие болезни Альцгеймера (AD) (Ballard и др., 2011). Поэтому выдвинуто предположение о том, что Ap, по-видимому, играет роль в развитии деменции альцгеймеровского типа у большинства людей с DS (Lee и др., 2005; Liu и др., 2005; Gilman и др., 2005).
У людей с синдромом Дауна дефекты памяти AD-подобного типа могут быть связаны с несколькими патологическими белками, такими как Ap, Tau, Dyrk1A, ApoE и т.д. Повышение уровня Ap начинается уже на эмбриональной стадии, прогрессирует при рождении и продолжает увеличиваться с возрастом (Stoltzner и др., 2000). Кроме того, было установлено, что в спинномозговой жидкости (СМЖ) уровни Ap42 ниже, а уровни tau выше у более взрослых (> 40 лет), чем у более молодых людей с DS (Tapiola и др., 2001). Поскольку Ap откладывается в бляшках, ApoE можно выявлять во многих бляшках у пациентов возрастом 12 лет и его содержание постоянно увеличивается с возрастом (Lemere и др., 1996). Ней-рофибриллярные сплетения (NFT) выявляют в головном мозге людей с DS на четвертом десятке жизни. Указанные NFT, по-видимому, являются результатом накопления tau. Установлено, что гиперфосфори-лирование может быть связано со сверхэкспрессией киназы, обозначенной как DyrklA (тирозин-фосфорилирующая и регулирующая киназа двойной специфичности 1A) (Lemere и др., 1996; Liu и др., 2008). Таким образом, у людей с DS к 40-летнему возрасту может развиваться связанная с амилоидом патология и у большинства из них к 60-летнему возрасту проявляются клинические симптомы, сходные с симптомами болезни Альцгеймера, такие как снижение когнитивной функции и нарушение памяти
(Stanton, 2004).
В то время как индивидуумы с DS получают медицинское обслуживание в основном в связи с различными проблемами с их здоровьем (такими как сердечное нарушение, инфекционные болезни и гипо-тиреоидизм), специфическое лечение нейропатологических признаков, т.е. ментальной недееспособности и дефицита памяти, редко рассматривается. В настоящее время проводится лишь небольшое количество клинических испытаний, все с целью повышения умственных способностей или снижения поражения нервов. Для людей с DS применяют лекарственные средства, предназначенные также для лечения AD, которые все действуют на холинергическую систему или глутаматергическую нейротрансмиссию, такие как ривастигмин или донепезил, ингибиторы холинэстеразы и мемантин, антагонист NMDA-рецептора (Prasher, 1993; Prasher, 2004). Однако данные об их эффективности в отношении людей с DS отсутствуют. В настоящее время рассматривается много модифицирующих амилоид вариантов лечения, включая направленную на Ap иммунотерапию (Rafii, 2010). В настоящее время несколько вакцин достигли фаз клинических исследований (Weiner и Frenkel, 2006) после того, как на созданных на мышах моделях AD было установлено, что они эффективно снижают церебральную нагрузку Ap и приводят к реверсии снижения когнитивных способностей. В отличие от AD, для DS не применяют иммунотерапии, направленные на Ap.
Среди нескольких подходов лечения когнитивного нарушения у взрослых людей с DS исследования, проведенные с использованием ингибиторов ацетилхолинэстеразы (AChEI) или антагонистов NMDA-рецептора, продемонстрировали лишь невысокую эффективность или отсутствие действие (Fernandez и др., 2007, Hanney и др., 2012). В противоположность этому, получено важное доказательство гипотезы о том, что амилоид играет роль в ухудшении когнитивной функции у людей с DS; Netzer с коллегами продемонстрировали на смоделированном на мышах DS, что изменение расщепления APP с помощью ингибитора у-секретазы оказывает благоприятное воздействие на память (Netzer и др., 2010). Эти данные, полученные в исследованиях на мышиных моделях, продемонстрировали, что необходимо наличие повышенного уровня гена APP, т.е. родительского белка пептида Абета, ответственного за отложение амилоида, для связанной с возрастом дегенерации нейронов, что характерно для DS и AD (Salehi и др., 2006, 2009). Таким образом, направленное воздействие на амилоид может представлять собой перспективную терапевтическую стратегию предупреждения развития AD. Развитие иммунотерапии, направленной на Ap, базируется на гипотезе о том, что если молекула оказывает направленное воздействие и секвестирует Ap (в растворимой форме и в виде олигомеров) in situ, то эта молекула может усиливать удаление Абета из головного мозга и приносить клиническую пользу людям с DS. Предполагается, что антитела, образовавшиеся в ответ на обработку анти-Ap- вакцинами, должны связываться с отложениями
фибриллярного Ap, в конце концов, солюбилизируя или ингибируя рост предшественников бляшек (пред-бляшек). В настоящее время олигомеры Ap рассматриваются как наиболее токсичные виды Ap, которые больше всех нарушают когнитивные функции у людей с DS (Teller и др., 1996).
Таким образом, существует необходимость в превентивной терапии, направленной на предупреждение или замедления развития клинических симптомов, ассоциированных со связанной с амилоидом патологией у индивидуумов с синдромом Дауна (DS), в частности, таких, как нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии.
В частности, существует необходимость в лечении клинических симптомов, ассоциированных со связанной с амилоидом патологией у индивидуумов с синдромом Дауна (DS), которое приводит к улучшению способности к научению у индивидуумов с синдромом Дауна (DS) и/или улучшению или восстановлению памяти и/или когнитивных (познавательных) способностей.
В настоящем изобретении предложены антигенные пептиды, предназначенные для применения в превентивной терапии и для лечения когнитивных нарушений AD-типа у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна.
Первым вариантом осуществления настоящего изобретения является применение N-концевого Ap 1-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, где антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в ли-посому, а у указанного индивидуума с синдромом Дауна еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
При этом указанные нарушения памяти и/или когнитивные нарушения представляют собой нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как, неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.
В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения указанные нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии у индивидуума с синдромом Дауна представляют собой нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии AD-типа.
Группа пациентов, подлежащая лечению, - это индивидуумы с синдромом Дауна. Причем эти индивидуумы могут представлять собой:
(а) индивидуумов от молодого до среднего возраста,
(б) индивидуумов среднего возраста,
(в) индивидуумов молодого возраста,
(г) индивидуумов детского возраста.
В частности, они могут иметь возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.
В предпочтительном варианте осуществления заявленного применения антигенный пептид Ap модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты, связанной с N- и/или C-концом пептида. Причем антигенный пептид Ap может быть модифицирован с помощью:
а) 4 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида или
б) 2 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида.
Описанное в изобретении применение для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна не вызывает воспалительной реакции.
А в предпочтительном варианте применяемый антигенный пептид включен в композицию, содержащую антигенный пептид в терапевтически эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом. Причем эта композиция может содержать адъювант.
Вторым объектом данного изобретения является способ лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида или композиции, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
Причем указанное нарушение или указанная аномалия представляют собой нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.
Описанный способ может быть предназначен для улучшения сохранения или полного восстановления когнитивной способности у индивидуума с синдромом Дауна, предусматривающий введение ука
занному индивидууму антигенного пептида или композиции. При этом указанный индивидуум с синдромом Дауна может быть:
а) индивидуумом от молодого до среднего возраста;
б) индивидуумом среднего возраста;
в) индивидуумом молодого возраста или
г) индивидуумом детского возраста.
В частности, его возраст может составлять менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.
Третьим объектом данного изобретения является способ предотвращения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида или композиции, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
Лечение когнитивных нарушений или аномалий AD-типа у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна с помощью антигенного пептида, представленного в настоящем описании, обеспечивает терапевтические действия, которые не сопровождаются индукцией нежелательных побочных действий, таких как менингоэнцефалит и микрогеморрагия.
Антигенный пептид, указанный в настоящем описании, выводят из амилоидного белка или амилои-доподобного белка, выбранного из группы, включающей белок-прион, белок tau, альфа-синуклеин, хан-тингтин и амилоид-p или из комбинации, включающей один или несколько вышеуказанных пептидов.
Причем указанный фрагмент антигенного пептида Ap соответствует N-концевой области пептида Ap, в частности, N-концевой области, содержащей по меньшей мере 5, в частности по меньшей мере 6, в частности по меньшей мере 7, в частности по меньшей мере 8, в частности по меньшей мере 9, в частности по меньшей мере 10, в частности по меньшей мере 11, в частности по меньшей мере 12, в частности по меньшей мере 13, в частности по меньшей мере 14, в частности все остатки Apl-15-фрагмента.
При этом массив, состоящий из большого количества повторов, на поверхности липосомы может содержать 10 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 50 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 100 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 200 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 300 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 400 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 500 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя.
Антигенная композиция, представленная в настоящем описании, может содержать конформацион-ный антиген, в частности антиген Ap, представленный в настоящем описании, в котором более 30%, в частности более 40%, в частности более 50%, в частности более 60%, в частности более 70%, в частности более 80%, в частности более 90%, в частности более 95% и вплоть до 100%, находится в бета-складчатой конформации.
При использовании липосомы, в качестве носителя, композицию антигенного пептида можно выбирать таким образом, чтобы ее общий чистый заряд был идентичен заряду на поверхности носите-ля/адъюванта, к которому пептид присоединен. Электростатические силы отталкивания, которые обладают эффективностью между одинаково заряженной поверхностью носителя/адъюванта и антигенного пептида, но в частности, между одинаково заряженной поверхностью носителя и аминокислотными остатками, из которых состоит антигенный пептид, и более предпочтительно между одинаково заряженной поверхностью носителя и одинаково заряженными аминокислотными остатками, из которых состоит антигенный пептид, могут приводить к тому, что антигенный пептид приобретает определенную высокоспецифическую и стабилизированную конформацию, которая гарантирует высокую биологическую активность. В результате этого антигенный пептид экспонируется и презентуется в конформации, которая обладает высокой биологической активностью и позволяет иммунной системе целевого организма свободно взаимодействовать с антигенными детерминантами, входящими в антигенную конструкцию в биологически активной конформации, что приводит к сильному и специфическому для конформации иммунному ответу, выражающемуся, например, в образовании высокого титра антител в целевом организме.
Иммунный ответ можно дополнительно усиливать при использовании липосомы в качестве носителя, поскольку липосома может функционировать в качестве адъюванта, усиливающего или стимулирующего иммунный ответ в организме животного- или человека-мишени, подлежащего лечению с помощью терапевтической вакцины, предлагаемой в изобретении. Липосома необязательно может содержать также дополнительный адъювант, такой, например, как липид A, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, но предпочтительно детоксифицированный липид A, такой как монофосфорильный или дифосфорильный липид A, или любой другой адъювант, такой, например, как квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, LPS, ODN (олигодинуклеотид) CpG, Pam2CSK4, Pam3CSK4, dsPHK, ssPHK, мурамилдипептид, Quil Q, QS-21.
QS-21.
Липосомы, которые можно применять в композициях, включают липосомы, известные специалистам в данной области. Можно использовать любые стандартные липиды, применяемые для приготовления липосом. Для создания композиций можно применять стандартные состоящие из двух или нескольких слоев липосомы. Хотя можно применять любой метод приготовления липосом, известный специалистам в данной области, наиболее предпочтительные липосомы получают согласно методу, описанному у Alving и др., Infect. Immun. 60, 1992, с. 2438-2444, (Lauer и др., 1992), публикации включены в настоящее описании в качестве ссылки. Липосома может обладать двойной функцией, поскольку ее можно использовать в качестве носителя, содержащего надмолекулярную конструкцию, описанную выше, и в тоже время функционировать в качестве адъюванта, предназначенного для усиления или стимуляции иммунного ответ в организме животного- или человека-мишени, подлежащего лечению с помощью терапевтической вакцины. Липосома может необязательно содержать дополнительный адъювант или иммуномо-дулятор или оба указанных агента, таких, например, как липид A, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, но предпочтительно липид A, более конкретно деток-сифицированный липид A, такой как монофосфорильный или дифосфорильный липид A, или квасцы.
Липосома может состоять из компонентов, выбранных из группы, включающей димиристоилфос-фатидилхолин (DMPC), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPEA), димиристоилфосфатидилглице-рин (DMPG) и холестерин.
В качестве замены катионных липидов в мембране липосом можно применять анионные липиды, выбранные из группы, включающей:
а) диацилфосфолипиды с "головными" группами фосфотидилглицерина, фосфатидилсерина, фос-
фатидилинозита, L-a-фосфатидилинозит-4-фосфата или фосфатидной кислоты;
б) лизофосфолипиды с "головными" группами фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина или фос-
фатидной кислоты и
в) кардиолипин, дилизокардиолипин, монолизокардиолипин.
В качестве замены анионных липидов в мембране липосом можно также применять катионные ли-пиды, выбранные из группы, включающей:
а) диацильные фосфолипиды с "головными" группами 3-триметиламмонийпропана, 3-
диметиламмонийпропана, 3-этилфосфохолина или 3-фосфатидилэтаноламина; и
б) D-эритросфингозин, бромид диметилдиоктадециламмония, бромид N-[1-(2,3-
димиристилокси)пропил]-N,N-диметил-N-(2-гидроксиэтил)аммония, метилсульфат ^^№триметил-2-
бис-[(1-оксо-9-октадеценил)окси]-(2,2)-1-пропанамминия или гидрохлорид 3-[N-(N',N'-
диметиламиноэтан)карбамоил]холестерина.
Липидные цепи, присоединенные к указанным выше "головным" группам, могут быть:
а) насыщенными или ненасыщенными,
б) их длина может варьировать от (CH2)n, где n обозначает 3-24, и они могут быть симметрично или
асимметрично замещенными.
Итак, антигенная композиция, представленная в настоящем описании, может содержать липосом-ный препарат и адъювант, в частности, липид A, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, но предпочтительно липид A, более предпочтительно детоксифици-рованный липид A, такой как монофосфорильный или дифосфорильный липид A, или квасцы.
Липосомную композицию, которая содержит пептид Ap, сшитый с липофильными фрагментами, встроенными в липосомы, указанные в настоящем описании, можно получать с помощью методологии, указанной в настоящем описании.
Когда липосомы применяют в качестве носителя/адъюванта, то антигенный пептид можно дополнительно модифицировать путем сшивания с липофильным или гидрофобным фрагментом, который облегчает встраивание в липидный бислой липосомы, представляющей собой носитель/адъювант. Указанный гидрофобный фрагмент может представлять собой жирную кислоту, триглицерид, диглицерид, стероид, сфинголипид, гликолипид или фосфолипид.
Липофильный или гидрофобный фрагмент может представлять собой алкильную группу или жирную кислоту с углеродным каркасом, содержащим по меньшей мере 1 атом углерода, в частности по меньшей мере 2 атома углерода, в частности по меньшей мере 3 атома углерода, в частности по меньшей мере 4 атома углерода, в частности по меньшей мере 6 атомов углерода, в частности по меньшей мере 8 атомов углерода, в частности по меньшей мере 12 атомов углерода, в частности по меньшей мере 16 атомов углерода.
Липофильные или гидрофобные фрагменты могут представлять собой жирные кислоты, триглице-риды и фосфолипиды, в частности, жирные кислоты, в которых углеродный каркас жирной кислоты содержит по меньшей мере 4 атома углерода, в частности, липофильные фрагменты, включающие жирные кислоты, углеродный каркас которых состоит по меньшей мере примерно из 14 атомов углерода и вплоть примерно до 24 атомов углерода, более предпочтительно гидрофобные фрагменты, углеродный каркас которых состоит по меньшей мере из 14 атомов углерода. Примерами гидрофобных фрагментов являются пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, миристиновая кислота, лауриновая кислота, олеиновая
кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота и холестерин или DSPE (1,2-дистеароилглицеро-3-фосфатидилэтаноламин). Пальмитоилирование, создающее якорь для пептида в бислое липосомы благодаря относительно небольшой длине остатка C^o-жирной кислоты, приводит к тому, что пептид презентуется (экспонируется) на поверхности липосомы или непосредственно вблизи ее поверхности. Таким образом, клетки, в которых процессируется антиген, должны включать полную липосому с пептидом.
Антигенные конструкции могут содержать пептиды, модифицированные путем пэгилирования (с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) или модифицированного полиэтиленгликоля) или модифицированные с помощью других методов, например, с использованием пальмитиновой кислоты, как описано выше, полиаминокислот (например, полиглицина, полигистидина), полисахаридов (например, полига-лактуроновой кислоты, полимолочной кислоты, полигликолида, хитина, хитозана), синтетических полимеров (полиамиды, полиуретаны, сложные полиэфиры) или сополимеров (например, поли(метакриловой кислоты) и №(2-гидрокси)пропилметакриламида) и т.п.
Если для получения антигенной конструкции применяют ПЭГ, то свободный конец ПЭГ может быть ковалентно присоединен к молекуле фосфатидилэтаноламина (при этом жирная кислота может представлять собой миристиновую, пальмитиновую, стеариновую, олеиновую кислоту и т.д. или их комбинацию). Эту надмолекулярную структуру можно реконструировать в липосомах, содержащих фосфо-липиды и холестерин (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, холестерин в различных молярных соотношениях). Можно применять другие фосфолипиды. Липид A можно применять в концентрации примерно 40 мкг/пмоль фосфолипидов.
Итак, антигенные конструкции могут содержать последовательность антигенного пептида, указанную выше, ковалентно связанную по меньшей мере с одним с пэгилированным лизином на каждом конце, но предпочтительно с 1 или 2 на каждом конце. Длина цепи ПЭГ (полиэтиленгликоль) может варьировать от n=8 до n=150000 или более, предпочтительно от n=10 до n=80000, более предпочтительно от n=10 до n=10000. Длина цепи ПЭГ может не превышать n=45, предпочтительно находится в диапазоне от n=5 до n=40, более предпочтительно находится в диапазоне от n=10 до n=30 и еще более предпочтительно n=10.
Возможно осуществление последующей инсерции (пост-инсерции) других типов пептидов (например, антигенов) и/или типов адъювантов в наружный слой предварительно полученных липосом в различных концентрациях, как это описано в заявке EP 10188832, содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Метод пост-инсерции заключается в том, что предварительно получают липосомы в растворе и модифицируют антигенные пептиды помощью гидрофобных фрагментов, в результате чего модифицированный антигенный пептид приобретает мицеллярную форму. Метод дополнительно предусматривает высвобождение антигенных пептидов из мицелл путем индукции разрушения мицелл с последующей интеграцией в предварительно созданную липосому. Указанный процесс интеграции опосредуется гидрофобными взаимодействиями модифицированного антигена и/или адъюванта с (фосфо)липидным бислоем липосом. В частности, солюбилизацию модифицированного антигенного пептида и/или адъюванта в наружном слое липосом осуществляют без использования какой-либо химической реакции или дополнительной модификации молекулы посредством растворения солю-билизированного антигенного пептида или адъюванта (первоначально присутствующего в мицеллярной форме) при концентрации поверхностно-активного вещества, более низкой, чем критическая концентрация мицеллообразования. Затем находящийся в свободной форме антигенный пептид или адъювант интегрируют в наружный слой липосом посредством солюбилизации их гидрофобных доменов с помощью ацильного фрагмента фосфолипидов. Таким методом получают партию "пустых (незагруженных) липо-сом", которые можно загружать в зависимости от потребностей.
В частности, указанный метод пост-инерции для получения антигенной конструкции на основе ли-посом, включающей антигенный пептид, представленный в настоящем описании, который в различных вариантах модифицирован с помощью гидрофобных остатков, реконструированных в липосоме, может включать следующие стадии, на которых I) получают липосомы в растворе; II) получают модифицированный антигенный пептид путем добавления к N- и/или C-концу молекулы пептида по меньшей мере одного гидрофобного фрагмента; III) солюбилизируют модифицированный антигенный пептид в присутствии поверхностно-активного вещества; IV) разводят солюбилизированный пептид и необязательно адъювант до концентрации более низкой, чем критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) поверхностно-активного вещества; и V) загружают полученные липосомы разведенным солюбилизиро-ванным антигенным пептидом и необязательно адъювантом с получением предварительного препарата липосом и солюбилизируют добавленный пептид и необязательно адъювант в наружном слое липосом предпочтительно без помощи какой-либо химической реакции или дополнительной модификации молекулы.
В контексте настоящего описания понятие "критическая концентрация мицеллообразования", которую обозначают также, как ККМ означает концентрацию поверхностно-активных веществ, выше которой происходит спонтанное образование мицелл. При интродукции поверхностно-активных веществ (или любых поверхностно-активных соединений) в систему поверхностно-активные вещества должны сначала распределиться в поверхности раздела фаз, что приводит к снижению свободной энергии систе
мы посредством а) снижения энергии поверхности раздела фаз (рассчитанной как площадь х поверхностное натяжение) и б) предупреждения контакта с водой гидрофобных участков поверхностно-активного вещества. Затем, когда поверхность, охваченная поверхностно-активными веществами, возрастает, а свободная энергия поверхности (поверхностное натяжение) снижается и начинается агрегация поверхностно-активных веществ в мицеллы, вновь понижается свободная энергия системы в результате уменьшения области контакта гидрофобных участков поверхностно-активного вещества с водой. После достижения ККМ любое дополнительное введение поверхностно-активных веществ сразу должно увеличивать количество мицелл (IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2-ое изд., изд-во Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1997).
Важно, что этот метод приводит к высоким уровням включения пептида и/или адъюванта с уникальным молекулярным дисплеем, представляющим собой облицовку липосомы, на поверхности наружного слоя бислоя липосом. В частности, по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и вплоть до 100% реконструированного антигенного пептида присутствует на поверхности липосомы в виде конструкции, встроенной в липидный бислой посредством ее гидрофобных фрагментов.
Метод позволяет получать также препараты липосом с гомогенным распределением размеров, что характеризуется индексом полидисперсности от 0,4 до 0,6, в частности от 0,45 до 0,55, в частности 0,5. Кроме того, метод и конструкции позволяют обеспечивать высокую биодоступность пептида и/или адъ-юванта для иммунной системы и в результате обеспечивают повышенный иммунный ответ. Расщепление адъюванта, например, расщепление MPLA, минимизируется или отсутствует, что обеспечивает высокую воспроизводимость партий. Конструкции, полученные с использованием указанного выше метода, являются стабильными, пригодными для стерилизации фильтрацией и не индуцируют побочные иммунные ответы.
Таким образом, антигенная конструкция может содержать антигенный пептид, в реконструированной в липосоме форме, в которой по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и вплоть до 100% этого пептида присутствует на поверхности липосо-мы, который встроен в липидный бислой липосомы посредством его гидрофобных фрагментов.
Итак, липосомный препарат содержит указанную антигенную конструкцию, причем для препарата характерно гомогенное распределение размеров, при этом индекс полидисперсности составляет от 0,4 до 0,6, в частности от 0,45 до 0,55, в частности 0,5.
При этом антигенный пептид может презентоваться на поверхности молекулы-носителя в виде массива, состоящего из большого количества повторов, в частности, состоящего из повторов массива, который содержит по меньшей мере 10 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 50 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 100 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 200 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 300 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 400 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 500 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя.
Понятие "антитело" или "антитела" в контексте настоящего описания имеет известное с данной области значение и относится к молекулам или активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, прежде всего к молекулам иммуноглобулинов и к иммунологически активным фрагментам молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулам, которые содержат сайт связывания, иммунос-пецифически связывающийся с антигеном. Иммуноглобулин может представлять собой любой тип (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) или класс (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласс молекулы иммуноглобулина.
К "антителам" относятся моноклональные антитела, поликлональные, химерные, одноцепочечные, биспецифические, симианизированные (включающие участки обезьяньих антител), человеческие и гуманизированные антитела, а также их активные фрагменты. Например, к активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, относятся Fab- и F(ab')2-фрагменты, включая продукты экспрессионной библиотеки Fab-фрагментов иммуноглобулинов, и связывающиеся с эпитопом фрагменты любых антител и их указанных фрагментов.
Указанные активные фрагменты можно получать из антитела с помощью многочисленных методик. Например, очищенные моноклональные антитела можно расщеплять ферментом, таким как пепсин, и подвергать ЖХВР-гель-фильтрации. Затем соответствующую фракцию, содержащую Fab-фрагменты, можно собирать и концентрировать с помощью фильтрации через мембрану и т.п. Дополнительное описание общих методик выделения активных фрагментов антител см., например, у Khaw B. A. и др. J. Nucl. Med. 23, 1982, с. 1011-1019; Rousseaux и др., Methods Enzymology, 121, изд-во, Academic Press, 1986, с.
663-669.
Понятие "гуманизированное антитело" относится к типу сконструированного антитела, в котором CDR получены из иммуноглобулина организма-донора кроме человека, остальные выведенные из иммуноглобулина области получают из одного (или нескольких) человеческого(их) иммуноглобулина(ов).
Кроме того, поддерживающие каркас остатки (остатки каркасного участка) можно изменять для сохранения аффинности к связыванию. Методы получения "гуманизированных антител" хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Queen и др., Proc. Natl Acad Sci USA, 86, 1989, с. 1002910032 (1989), Hodgson и др., Bio/Technology, 9, 1991, с. 421).
"Гуманизированное антитело" можно получать также с помощью нового подхода генетической инженерии, который позволяет получать напоминающие человеческие поликлональные антитела с созревшей аффинностью в крупных животных, таких, например, как кролики.
Понятие "моноклональное антитело" хорошо известно в данной области и относится к антителу, которое в больших количествах получают в лабораторных условиях из индивидуального клона и которое распознает только один антиген. Моноклональные антитела, как правило, создают путем слияния продуцирующей антитела B-клетки, как правило, с коротким временем жизни, с быстро растущей клеткой, такой как раковая клетка (иногда ее называют "иммортализованной" клеткой). Образовавшаяся гибридная клетка или гибридома быстро размножается, создавая клон, который продуцирует антитело в больших количествах.
Понятие "нарушения и аномалии памяти и/или когнитивные нарушения и аномалии" относится прежде всего к клиническим симптомам, ассоциированным со связанной с амилоидом патологией у индивидуумов с синдромом Дауна (DS), но, в частности, к нарушениям и аномалиям, которые возникают в гиппокампе и/или префронтальной области коры головного мозга, и/или энторинальной области коры головного мозга. Примерами указанных нарушений и аномалий памяти и/или когнитивных нарушений являются (но, не ограничиваясь только ими) нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или речевая дисфункция, такая как афазия, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации (навигации) в незнакомой и знакомой местности, и/или пониженные исполнительные функции, такие как апатия, растормаживание, социальная изоляция, плохая рассудительность, сложности с планированием, и/или плохое абстрактное мышление, и/или изменения особенностей характера, и/или эмоциональные изменения, такие как апатия, возбуждение и психоз, и/или апраксия, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения, и/или другие неврологические признаки, включая пирамидные и экстрапирамидные синдромы, а также мио-клонические судороги или припадки.
Понятие "нарушение памяти" относится также к кардинальной особенности DS, которая часто проявляется раньше других симптомов. Даже, когда отсутствуют первичные жалобы, дефицит памяти может быть выявлен у большинства пациентов с DS в момент обследования врачом. Схема нарушения памяти при DS является очень характерной. При DS поражается главным образом декларативная память на факты и события, которая зависит от медиальных теменных структур, таких как энторинальная область коры головного мозга и гиппокамп, в то время как подкорковые системы, поддерживающие процессуальную память, в определенной степени сохраняются до поздних стадий развития болезни.
Эпизодическая память нарушается более выражено у молодых пациентов с DS по сравнению с памятью на факты, такие как словарный запас и понятия (семантическая память), которая часто нарушается несколько позднее. В эпизодической памяти существует различие между немедленным воспроизведением (например, мысленное повторение номера телефона), памятью на недавно произошедшие события (которая начинает играть роль, когда должен быть воспроизведен материал, который удален из сознания) и памятью на более ранние эпизоды. У молодых пациентов с DS значительно нарушается память на недавно произошедшие события, которая обеспечивается гиппокампом, энторинальной областью коры головного мозга в медиальной теменной доле. В противоположность этому, непосредственная память (которая зависит от префронтальной коры головного мозга) сначала сохраняется, поскольку относится к видам памяти, которые формируются в течение длительных периодов времени (лет) и которые можно воспроизводить в отсутствии функции гиппокампа.
Нарушения процессуальной памяти проявляется только у пациентов среднего возраста с DS. Речевая дисфункция, нарушения исполнительной функции и других доменов когнитивных функций развиваются с различной скоростью в процессе развития болезни. Гетерогенность клинического проявления DS, вероятно, отражает вариабельное топографическое распределение патологических поражений в головном мозге. Речевая дисфункция, такая как афазия, является общим симптомом DS и первые проявления речевой дисфункции, как правило, включают затруднения в поиске слов, многословие и пониженный словарный запас при спонтанной речи, и аномию в тестах на сопоставление названий. Эти дисфункции могут прогрессировать вплоть до включения связанных с парафазией ошибок, "убогого" содержания речи и нарушенного понимания. Однако пациенты могут, как правило, дословно повторять фразы вплоть до полного развития болезни.
Сложности с речью при DS часто обозначают как афазию типа Вернике и Брока. При использовании скоростного теста, в котором требуется создать за одну минуту перечень слов, пациентов с DS относят к существенно худшей категории (например, перечень животных), чем при использовании скоростного буквенного теста (например, перечня слов, начинающихся на букву F). Это отражает специфиче
ский дефицит семантической памяти.
Снижение зрительно-пространственного восприятия является еще одним проявляющимся рано признаком DS, который иногда является очень заметным в момент описания врачом случая. Нарушения зрительно-пространственного восприятия проявляется в виде неспособности положить предметы в нужное место предметов и сложности ориентации в незнакомой и знакомой местности. Более поздними признаками являются визуальная агнозия (неспособность распознавать объекты) и прозоагнозия (неспособность распознавать лица).
Нарушение исполнительной функции также встречается у пациентов с DS. Эти симптомы включают плохую критическую самооценку (интуитивное понимание) и пониженную способность к абстрактному мышлению. По мере развития болезни, как правило, происходят изменения личности (такие как развитие апатии, социальной невовлеченности и растормаживания), возникает плохая рассудительность и способность к планированию и неспособность завершать задачи. В этом случае может дополнительно присутствовать также депрессия, которую может оказаться трудным диагностировать при установлении деменции.
Пониженная критическая оценка собственного дефекта (анозогнозия) является другой характерной особенностью DS. Для пациентов нередко характерным является отрицание или недооценка их дефектов и попытка их объяснения, когда им на них указывают. Для воссоздания точной истории решающее значение имеет опрашивание дополнительного участника событий, например, супруга. Фактически, часто член семьи обращает внимание медиков на когнитивное нарушение. Снижение критической самооценки возрастает с течением времени по мере усиления общей серьезности болезни, и оно может ассоциироваться с нарушениями поведения; пациенты с относительно сохранившейся критической самооценкой с большей вероятностью могут подвергаться депрессии, в то время как пациенты с более нарушенной критической оценкой, вероятно, должны быть возбужденными, расторможенными и иметь признаки психического расстройства. Возникновение нарушений поведения, включая возбуждение, агрессию, аномальную подвижность и психоз (галлюцинации, навязчивые идеи, синдромы ошибочной идентификации), может приводить к выраженному состоянию психического перенапряжения (дистрессу) пациента и членов его семьи, и, как правило, проявляется на более поздних стадиях DS.
Более молодые пациенты с DS, как правило, характеризуются при обследовании нормальным неврологическим состоянием за исключением когнитивной функции. Хотя у пациентов с DS встречаются пирамидные и экстрапирамидные моторные синдромы, миоклонические судороги или припадки, они, как правило, проявляются на поздней стадии болезни. Аналогично этому, видимые простым глазом признаки (хватательный рефлекс, симптомы хоботка, симптом противодержания) и невоздержанность, являются скорее поздними, чем ранними особенностями DS.
Иммуногенная композиция может представлять собой терапевтическую вакцину, которая содержит антигенную конструкцию, представленную выше в настоящем описании, в терапевтически или профилактически эффективном количестве, и ее можно приготавливать в виде жидкого раствора или суспензии для инъекций, или также в твердой форме, которую требуется солюбилизировать перед инъекцией, включенную в состав, например, описанного ниже набора, предназначенного для применения композиции.
Понятие "терапевтически или профилактически эффективное количество" относится к количеству антитела, пептида, соединения или фармацевтической композиции, которое при введении человеку или животному является достаточным для оказания терапевтического действия или профилактического действия на человека или животного. Специалист в данной области легко может определять эффективное количество с помощью общепринятых процедур.
Иммуногенную композицию можно вводить человеку или животному, в частности, человеку или животному с синдромом Дауна, имеющему когнитивные нарушения или аномалии AD-типа, в частности нарушения или аномалии, возникающие в гиппокампе и/или префронтальной области коры головного мозга, и/или энторинальной области коры головного мозга, для индукции иммунного ответа у человека или животного, для облегчения симптомов AD-типа, ассоциированных с заболеванием, или для восстановления состояния, присущего здоровым индивидуумам, которые не поражены заболеванием.
Поскольку фактически у всех людей с синдромом Дауна могут в конце концов в определенный момент жизни возникать когнитивные нарушения AD-типа, также целесообразно вводить указанную вакцину людям с синдромом Дауна до проявления нарушений AD-типа. В этом случае вакцина может действовать в качестве средства для профилактического лечения.
Иммуногенную композицию можно вводить человеку или животному с использованием любых стандартных путей введения. Как правило, композицию можно вводить с использованием местного, орального, ректального, назального или парентерального (например, внутривенного, подкожного или внутримышечного) пути введения. Кроме того, композицию можно включать в обеспечивающие пролонгированное высвобождение матрицы, например, из биоразложимых полимеров, полимеры можно имплантировать в область, в которую требуется осуществлять введение, например, в область опухоли. Метод предусматривает введение однократной дозы, введение повторных доз с предварительно установленными временными интервалами и пролонгированное введение в течение предварительно определен
ного периода времени.
В конкретном варианте осуществления изобретения антигенную конструкцию, в частности имму-ногенную композицию, которая содержит антигенную конструкцию в терапевтически эффективном количестве, вводят в виде повторяющихся доз, прежде всего 1-15 доз, более предпочтительно 2-10 доз, более предпочтительно 3-7 доз и еще более предпочтительно 4-6 доз, с временными интервалами, составляющими 1-10 недель, предпочтительно с временными интервалами, составляющими 1-6 недель, более предпочтительно с временными интервалами, составляющими 1-4 недели и еще более предпочтительно с временными интервалами 2-3 недели. Иммунный ответ оценивают в полученных образцах сыворотки через приемлемый промежуток времени после ревакцинации, предпочтительно через 3-10 дней после ревакцинации, более предпочтительно через 4-8 дней после ревакцинации и более предпочтительно через 5-6 дней после ревакцинации, и определяют иммуногенность антигенной конструкции с помощью известной методологии, прежде всего с помощью одного из обычно применяемых иммуноанализов, таких, например, как ELISA.
В частности, композицию антигенного пептида вводят парентерально, предпочтительно с помощью внутрибрюшинной, внутривенной, подкожной и внутримышечной инъекции.
Доза композиции должна зависеть от состояния, подлежащего лечению, конкретной применяемой композиции и других клинических факторов, таких как вес, размер и состояние пациента, площадь поверхности тела, конкретное соединение или композиция, подлежащее/подлежащая введению, другие одновременно применяемые лекарственные средства и путь введения.
Иммуногенную композицию можно вводить в сочетании с другими биологически активными субстанциями и процедурами, предназначенными для лечения симптомов, ассоциированных с синдромом Дауна. Другие биологически активные субстанции могут быть компонентами той же композиции, которая уже содержит иммуногенную композицию, в форме смеси, при этом иммуногенную композицию и другую биологически активную субстанцию перемешивают в фармацевтически приемлемом растворителе и/или носителе или смешивают с ним, или они могут присутствовать отдельно в виде компонента других композиций, которые могут поступать в продажу отдельно или вместе в форме состоящего из компонентов набора.
Иммуногенную композицию можно вводить в сочетании с другой(ими) биологически актив-ной(ыми) субстанцией или субстанциями поочередно или последовательно. Например, иммуногенную композицию можно вводить одновременно с первой дополнительной биологически активной субстанцией или последовательно после или до введения указанной композиции. Если выбрана приемлемая схема, при которой более одной дополнительной обладающей биологической активностью субстанции вводят в сочетании по меньшей мере с одной иммуногенной композицией, то соединения или субстанции можно частично вводить одновременно, частично последовательно в различных комбинациях.
Смеси могут содержать помимо фармацевтической композиции, биологически активную субстанцию, такую, например, как известные соединения, применяемые для медикаментозного лечения симптомов AD-типа у детей или индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна.
Другая биологически активная субстанция или соединение может обладать биологическим действием, опосредуемым таким же или сходным механизмом, что и иммуногенная композиция или обладать неродственным механизмом действия или сочетанием родственных и/или неродственных механизмов действия.
Как правило, другое биологически активное соединение может представлять собой антитела к антигенному пептиду и связывающиеся с ним, которые указаны в настоящем описании, или соединения, применяемые для медикаментозного лечения неврологических нарушений, такие как энхансеры нейтронной трансмиссии, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, транквилизаторы на основе бензодиазепинов, усилители синтеза, накопления или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптического рецептора ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-A или -B, антагонисты рецептора №метил^-аспартатглутамата (NMDA), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антиокси-данты и антагонисты серотонергического рецептора.
В частности, смесь может содержать по меньшей мере одно другое биологически активное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений против окислительного стресса, антиапоптозных соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, таких как пирензепин и его метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты (3APS), 1,3-пропандисульфоната (1,3PDS), активаторов секретаз, ингибиторов p- и у-секретаз, тау-белков, нейромедиаторов, разрушителей p-складчатой конформации, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы (ChEI), таких как такрин, ривастиг-мин, донепезил и/или галантамин, и других лекарственных средств и пищевых добавок, в сочетании с терапевтической вакциной и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или эксципиентом.
Смеси могут содержать также ниацин или мемантин в сочетании с иммуногенной композицией и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или эксципиентом.
Смеси могут содержать "атипичные антипсихотические средства", такие, например, как клозапин,
зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, предназначенные для лечения позитивных и негативных психотических симптомов, включая галлюцинации, навязчивые идеи, нарушения мышления (проявляющиеся в выраженной непоследовательности действий, психическом расстройстве, расстройстве ассоциативного мышления) и эксцентричное или неорганизованное поведение, а также ангедонию, пониженную эмоциональную реакцию, апатию и отказ от общества, в сочетании с иммуногенной композицией и/или терапевтической вакциной и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или эксципиентом.
Другие соединения, которые можно применять в смесях в сочетании с фармацевтической композицией описаны, например, в WO 2004/058258 (см. прежде всего на с. 16 и 17), включая мишени терапевтических лекарственных средств (с. 36-39), алкансульфоновые кислоты и алкансерную кислоту (с. 39-51), ингибиторы холинэстеразы (с. 51-56), антагонисты NMDA-рецептора (с. 56-58), эстрогены (с. 58-59), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (с. 60-61), антиоксиданты (с. 61-62), аго-нисты рецепторов, активируемых пероксисомальными пролифераторами (PPAR) (с. 63-67), средства, понижающие уровень холестерина (с. 68-75); ингибиторы амилоида (с. 75-77), ингибиторы образования амилоида (с. 77-78), хелаторы металлов (с. 78-79), антипсихотические средства и антидепрессанты (с. 8082), пищевые добавки (с. 83-89) и соединения, повышающие доступность биологически активных субстанций в головном мозге (см. с. 89-93) и пролекарства (с. 93 и 94), указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки, но прежде всего соединения, упомянутые на указанных выше страницах.
Антигенная конструкция может содержать пептид Ap, который не содержит T-клеточный эпитоп и поэтому не обладает потенциальной способностью вызывать побочные действия, такие как неврологические осложнения, связанные со сверхактивированной системой комплемента. Это можно обеспечивать путем введения антигена, представляющего собой пептид Ap, предпочтительно антигена, представляющего собой пальмитоилированный пептид Ap, более предпочтительно антигена, представляющего собой пальмитоилированный пептид Ap1-15, но наиболее предпочтительно антигена, представляющего собой пальмитоилированный пептид Ap1-15, в сочетании с ингибитором системы комплемента.
Ингибитор системы комплемента может представлять собой соединение, выбранное из группы, состоящей из растворимого рецептора 1 человеческого комплемента, антитела к человеческому белку системы комплемента C5, такого, например, как гуманизированное моноклональное антитело к C5 или од-ноцепочечный фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, ингибитора-N О-эстеразы и встречающегося в естественных условиях ингибитора человеческого C1.
Модифицированный амилоидный пептидный антиген, такой, например, как антиген, представляющий собой пептид амилоида бета 1-15, можно синтезировать с помощью метода, описанного у Nicolau и др., 2002. Подход, описанный у Nicolau с соавторами, можно модифицировать, осуществляя сначала синтез антигенного пептида, который затем модифицируют путем осуществления прививки на смоле липо-фильного или гидрофобного фрагмента к концевым аминокислотным остаткам ранее полученного пептида. В частности, защищенную аминокислоту, прежде всего защищенную с помощью Fmoc аминокислоту, присоединяют к смоле с помощью известных методов химического сочетания. Защитную группу удаляют и сшивают со вторым защищенным аминокислотным остатком. Затем применяют стандартный автоматический пептидный синтез с использованием известной процедуры химической защиты, в частности Fmoc/tBu-химии, и стандартных защитных групп боковых цепей для синтеза антигенного Ap-пептида, прежде всего антигенного Apl-15-пептида, путем сочетания аминокислот 1-15 амилоидного белка Ap1-42 с получением пептидного фрагмента с требуемой последовательностью. На конечной стадии для удлинения пептидного фрагмента связывают две дополнительные аминокислоты. Затем Mtt-группы боковых цепей первых двух и последних двух аминокислот можно избирательно отщеплять и сшивать с пальмитиновой кислотой. После промывки смолы защитную группу
удаляют и одновременно отщепляют смолу с последующим удалением защитных групп боковых цепей с помощью стандартной методологии. После этого получают конечный продукт высокой чистоты и его идентичность подтверждают известными в данной области методами, такими, например, как масс-спектрометрия с использованием электроспрея.
Модифицированный амилоидный антигенный Ap-пептид, в частности, модифицированный антигенный Apl-15-пептид, можно реконструировать в конструкции, состоящей из липосом, прежде всего липосом на основе димиристоилфосатидиохолина (DMPC), димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPEA), димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG) и холестерина, необязательно содержащих мо-нофосфорильный липид A.
В качестве замены катионных липидов в мембране липосом возможно применение анионных липи-дов, выбранных из группы, состоящей из:
а) диацилфосфолипидов с "головными" группами фосфотидилглицерина, фосфатидилсерина, фос-
фатидилинозита, L-a-фосфатидилинозит-4-фосфата или фосфатидной кислоты;
б) лизофосфолипидов с "головными" группами фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина или фос-
фатидной кислоты и
в) кардиолипина, дилизокардиолипина, монолизокардиолипина.
В качестве замены анионных липидов в мембране липосом возможно применение катионных липи-дов, выбранных из группы, состоящей из:
а) диацильных фосфолипидов с "головными" группами 3-триметиламмонийпропана, 3-
диметиламмонийпропана, 3-этилфосфохолина или 3-фосфатидилэтаноламина; и
б) D-эритросфингозина, бромида диметилдиоктадециламмония, бромида N-[1-(2,3-
димиристилокси)пропил] -N,N-диметил-N-(2-гидроксиэтил)аммония, метилсульфата N,N,N-триметил-2-
бис-[(1-оксо-9-октадеценил)окси]-(2,2)-1-пропанамминия или гидрохлорида 3-[N-(N',N'-
диметиламиноэтан)карбамоил]холестерина.
Липидные цепи, присоединенные к указанным выше "головным" группам, могут быть
а) насыщенными или ненасыщенными,
б) их длина может варьировать от (CH2)n, где n обозначает 3-24, и они могут быть симметрично или
асимметрично замещенными.
Липосомы с добавлением липида A можно применять в качестве адъюванта для приготовления противоамилоидной вакцины.
Димиристоилфосфатидилхолин, -глицерин и холестерин смешивают, в частности в молярном соотношении 0,9:1,0:0,7. Затем добавляют сильный иммуномодулятор, такой, например, как монофосфо-рильный липид A, в приемлемой концентрации, прежде всего в концентрации от 30 до 50 мг на ммоль, более предпочтительно 40 мг на 1 ммоль фосфолипидов. Затем добавляют модифицированный антигенный Ap-пептид в молярном соотношении пептида и фосфолипидов от 1:30 до 1:200, прежде всего в молярном соотношении от 1:50 до 1:120, более предпочтительно 1:100. Растворители удаляют, например, выпариванием, и образовавшуюся пленку гидрируют стерильным буферным раствором, таким как ЗФР.
Липосомы можно получать также методом инъекции в перекрестном потоке, который описан, например, у Wagner и др., 2002. При инъекции липидных растворов в водной буферной системе липиды имеют тенденцию образовывать "осадки (преципитаты)" с последующей самоагрегацией в пузырьки. Размер полученных пузырьков зависит от таких факторов как концентрация липида, скорость перемешивания, скорость инъекции и выбор липидов. Предназначенная для получения система может состоять из модуля для инъекции в перекрестном потоке, емкостей для полярной фазы (например, раствор ЗФР-буфера), емкости для этанольного/липидного раствора и устройства для создания давления, но предпочтительно устройства для создания давления азота. В то время как водный или полярный раствор нагнетают насосом через модуль для перекрестной инъекции, этанольный/липидный раствор инъецируют в полярную фазу с помощью различных величин прилагаемого давления. Различные методы получения липосомных антигенных конструкций описаны в WO 2007/068411.
Так получают липосомную композицию, которая содержит пальмитоилированный Ap1-15, в частности, тетрапальмитоилированный Ap1-15, в сочетании с монофосфорильным липидом A (MPLA) в качестве адъюванта.
Индивидууму, подлежащему вакцинации, можно вводить подкожно еженедельно или через две недели четыре-десять, в частности пять-шесть, доз липосомной композиции. Можно периодически получать образцы крови и анализировать в отношении титра IgG.
Эффективность липосомной композиции в качестве иммуногена при введении детям и индивидуумам от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна и ее терапевтический потенциал в отношении лечения дефицита памяти у указанных индивидуумов можно демонстрировать на созданной на животных модели синдрома Дауна. В частности, применяли мышей линии Ts65Dn, которых широко используют в качестве животной модели DS. У мышей линии Ts65Dn имеет место трипликация мышиной хромосомы 16, которая содержит мышиный ген APP (Davisson и др., 1993; Netzer и др., 2010). У таких трансгенных мышей в 1,5 раза повышено содержание мышиного Ap (Hunter и др., 2004) и у них обнаружены нарушения поведения при оценке с помощью нескольких тестов на запоминание (Belichenko и др., 2009).
Липосомная композиция индуцирует повышенные титры антител, и титры указанных антител сохраняются на повышенном уровне даже через 40 дней после иммунизации. Таким образом, липосомная композиция, представленная в настоящем описании, может индуцировать сильный иммунный ответ и разрушает самотолерантность к Ap у обработанных индивидуумов с синдромом Дауна.
Продемонстрировано также, что липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обладает также способностью индуцировать у мышей с синдромом Дауна от молодого до среднего возраста титры IgG такого же уровня, который присутствует у животных из контрольной группы без синдрома Дауна. Липосомная композиция индуцирует более высокие титры антител изотипа IgG2a по сравнению с контрольной группой, в то время как титры антител изотипа IgG1 и IgG2b оказались сопоставимыми в обработанной и контрольной группе. Титры антител класса IgM оказались ниже в обработанной группе по сравнению с контрольной группой. Эти несколько более низкие титры IgM могут быть обусловлены измененной иммунной системой у мышей с синдромом Дауна. Таким образом, липосомная композиция позволяет преодолевать нарушенный адаптивный иммунный ответ на Ap, описанный у людей с DS (Monsonego и др., 2001).
Липосомная композиция, представленная в настоящем описании, является также безопасной и не индуцирует нежелательные побочные действия. В частности, обработка липосомной композицией не
приводит к клеточной активации в головном мозге, например, активации астроцитов или микроглии.
На животной модели установлено, что липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обеспечивает более высокий уровень способности к различению, что свидетельствует о том, что лечение приводит к существенному улучшению памяти у обработанных животных.
На животной модели при изучении с помощью теста, состоящего из сеансов по обучению, проверке условного рефлекса на сигнал (подсказку) и обстановку (контекст), установлено также, что липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обеспечивает повышенную способность к "замиранию" (к нахождению в состоянии без движения), достигающую уровня, сопоставимого с уровнем, обнаруженным у контрольных животных. Это позволяет предположить, что иммунизация является эффективной и повышает способность к запоминанию у подопытных животных.
Таким образом, липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обладает способностью восполнять дефициты памяти у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста, страдающих синдромом Дауна, в частности, у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна, у которых еще не образовались ассоциированные с Ap бляшки в головном мозге. У пациентов с синдромом Дауна присутствуют когнитивные аномалии, такие как нарушение памяти и аномальная активность.
Липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обладает также способностью восполнять дефициты памяти у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста, страдающих синдромом Дауна, в частности, у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна, у которых уже образовались ассоциированные с Ap бляшки в головном мозге.
Липосомная композиция может облегчать или восполнять дефицит памяти у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна, в частности, нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или речевую дисфункцию, такую как афазия, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или пониженные исполнительные функции, такие как апатия, растормажи-вание, социальная изоляция, плохая рассудительность, сложности с планированием и/или плохое абстрактное мышление, и/или изменения особенностей характера, и/или эмоциональные изменения, такие как апатия, возбуждение и психоз, и/или апраксия, и/или нарушения способности исполнять усвоенные задачи на выполнение движения, и/или другие неврологические признаки, включая пирамидные и экстрапирамидные синдромы, а также миоклонические судороги или припадки.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - схематическое изображение вакцины ACI-DS-01, которая представляет собой вакцину на основе липосом с тетрапальмитоилированным мышиным Ap1-15 в качестве антигена и MPLA в качестве адъюванта. Подчеркнуты аминокислотные различия между человеческим и мышиным Ap 1-15;
на фиг. 2 - титры антител к мышиному Ар 1-15 у мышей линии Ts65Dn, иммунизированных вакциной ACI-DS-01. На А и Б) - титры IgG к мышиному Ap40 или Ap42, обнаруженные в плазме мышей, иммунизированных ACI-DS-01. Индуцированные титры были обнаружены после второй иммунизации и сохранялись на высоком уровне даже через 40 дней после 6-й инъекции по сравнению с мышами, иммунизированными незагруженной липосомой. Не обнаружено различия между титрами, измеренными у мышей линий 2N и Ts65Dn. На В-Е) - изотипы IgG, обнаруженные после 4-й иммунизации. Ж) IgM-титры оказались заметно более низкими у мышей линии Ts65Dn. З) - одинаковые уровни титров IgG к MPLA обнаружены у всех мышей, иммунизированных ACI-DS-01. На графиках представлены средние значения±СКО (n=20 2N- ACI-DS-01, n=15 Ts65Dn-ACI-DS-01, n=18 2^"незагруженная" (обработка незагруженной вакциной) и n=11 Ts65Dn-"незагруженная". На графиках представлены средние значе-ния±СКО);
на фиг. 3 - данные об эффективности иммунизации в отношении способности к запоминанию. Различие в спонтанной локомоторной активности между мышами линий 2N и Ts65Dn оставалось на прежнем уровне после иммунизации. Б) У мышей, иммунизированных ACI-DS-01, обнаружено существенное увеличение коэффициента узнавания (RI) нового объекта по сравнению с группой, обработанной незагруженной вакциной. В) В опыте по оценке условно-рефлекторной реакции страха у иммунизированных мышей обнаружен пограничный уровень значимости для более высокого уровня "замирания" в процессе контекстуального сеанса. На графиках представлены средние значения±СКО (n=20 2N-ACI-DS-01, n=13 Ts65Dn ACI-DS-01, n=18 2№"незагруженная" и n=11 Ts65Dn-"незагруженная");
на фиг. 4 - данные об уровнях Ap40 у мышей, обработанных вакциной ACI-DS-01. А) - в коре головного мозга уровень Ap40 оказался заметно выше у мышей линии Ts65Dn по сравнению с мышами линии 2N. При применении вакцины ACI-DS-01 обнаружена тенденция к снижению уровней Ap42 и Ap40 в коре головного мозга и гиппокампе. Обнаружено статистически значимое снижение уровней Ap42 и Ap40 в мозжечке после обработки ACI-DS-01. На графиках представлены средние значения±СКО (n=10 2N-ACI-DS-01, n=10 Ts65Dn ACI-DS-01, n=8 2N-"незагруженная" и n=5 Ts65Dn-"незагруженная").
На Б и В) - данные, демонстрирующие корреляцию между соотношением уровней Ap40/42 в коре головного мозга или мозжечке и величиной RI. Г) - данные, демонстрирующие слабую корреляцию между титрами IgG к Ap и уровнем Ap40 в плазме мышей линии Ts65Dn, обработанных ACI-DS-01. Д) - данные, демонстрирующие выраженную корреляцию между титром IgG к Ap и величиной RI, (n=19 2N ACI-DS-01, n=13 Ts65Dn ACI-DS-01, n=18 2№"незагруженная" и n=11 Ts65Dn-"незагруженная");
на фиг. 5 - результаты исследований воспалительной реакции. А) - данные о массе тела и головного мозга. Б) - изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа иммунореактивности GFAP (слева) и CD45 (справа) у обработанных мышей линии 2N и Ts65Dn. Стрелками указаны индивидуальные CD45-позитивные микроглиальные клетки. Оптическую плотность иммунореактивности GFAP определяли количественно, и установлено отсутствие различия между группами. n=4 для каждой группы;
на фиг. 6 - срезы образцов головного мозга людей с DS, полученные после иммуноокрашивания сывороткой мышей, иммунизированных ACI-DS-02. Наличие позитивно окрашенных областей свидетельствуют о том, что антитело, образовавшееся в ответ на обработку ACI-DS-02, связывается с амилоидными бляшками в головном мозге людей с DS. Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным при использовании 6E10, т.е. поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и при использовании антитела, полученного в ответ на обработку вакциной ACI-24. Вакцина ACI-24 соответствует вакцине ACI-DS-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ACI-24, имеет последовательность человеческого Ap1-15, а вакцина ACI-DS-01 содержит последовательность мышиного Ap1-15 в качестве антигена (данные о трех аминокислотных различиях в этих двух антигенах представлены на фиг. 1). Не обнаружено окрашивания, когда срез инкубировали с сывороткой из мышей, иммунизированных ЗФР;
на фиг. 7 - результаты обучения мышей линии TS65Dn, иммунизированных вакциной ACI-DS-02, полученные в тесте по оценке условно-рефлекторной реакции страха. У мышей линии TS65Dn, иммунизированных ACI-DS-0, обнаружен более высокий уровень "замирания" в сеансе по обучению (научению) по сравнению с мышами линии TS65Dn, иммунизированными ЗФР, в частности, после третьего условно-рефлекторного стимула (CS). На графиках представлены средние значения±СКО (n=7 Ts65Dn-ACI-DS-02, n=7 2№ЗФР и n=4 Ts65Dn-ЗФР. На графиках представлены средние значения±СКО);
на фиг. 8 - срезы образцов головного мозга людей с DS, полученные после иммуноокрашивания сывороткой мышей, иммунизированных ACI-DS-03. Наличие позитивно окрашенных областей свидетельствуют о том, что антитело, образовавшееся в ответ на обработку ACI-DS-03, связывается с амилоидными бляшками в головном мозге людей с DS. Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным с использованием 6E10, т.е. поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и с использованием антитела, полученного в ответ на обработку вакциной ACI-24. Вакцина ACI-24 соответствует вакцине ACI-DS-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ACI-24, имеет последовательность человеческого Ap1-15, а вакцина ACI-DS-01 содержит последовательность мышиного Ap1-15 в качестве антигена (данные о трех аминокислотных различиях в этих двух антигенах представлены на фиг. 1). Не обнаружено окрашивания, когда срез инкубировали с сывороткой из мышей, иммунизированных ЗФР;
на фиг. 9 - результаты морфологического анализа мышей Ts65Dn, иммунизированных вакциной ACI-DS-01. Во всех группах оказались очень сходными: А) - количество ChAT+-клеток (клетки, положительные по холинацетилтрансферазе) в медиальной перегородке и Б) - оптическая плотность. В) - результаты, демонстрирующие, что площадь тела ChAT+-клеток возрастала у мышей линии Ts65Dn, иммунизированных ACI-DS-01, по сравнению с мышами линии Ts65Dn, обработанными "незагруженной" вакциной (n=4 2№"незагруженная", n=4 Ts65Dn-"незагруженная", n=4 2N-ACI-DS-01 и n=4 Ts65Dn-ACI-DS-01. На графиках представлены средние значения±СКО).
Примеры
Пример 1. Общая методология. 1.1. Животные.
Применяли мышей линии Ts65Dn, которых, как известно, используют при создании мышиной модели DS (Davisson и др., 1993) (n=30), и возраст которых соответствовал возрасту применяемой в качестве контроля линии 2N (n= 40). В момент начала исследования возраст мышей составлял 5 месяцев. В конце опыта (иммунизация и оценка поведения) возраст мышей составлял 9 месяцев. Таким образом, все образцы, взятые после умерщвления, были получены из 9-месячных мышей.
Для новорожденных мышей линии Ts65Dn характерна повышенная смертность (около 6%) главным образом из-за врожденных пороков сердца (Randall, 2006, Moore, 2006). Однако продолжительность жизни мышей может составлять вплоть до 18-24 месяцев. В настоящем исследовании показатель смертности составлял 15%. Размер выживших мышей был на 20% меньше, чем размер здорового приплода. Мыши с наиболее серьезными поражениями, которые погибали при рождении, не учитывались при анализе выживаемости, что приводило к недооценке воздействия генной трисомии на некоторые фенотипические признаки (т.е. дефект сердца). Однако для концепции настоящего изобретения выжившие мыши представляли собой адекватную модель DS для анализа связанных с амилоидом патологий и патологий AD-типа.
При использовании мышиной модели DS, которую применяли в указанных исследованиях, у мышей обнаружены повышенные уровни амилоида в возрасте 4 месяца (Hunter, 2004). В возрасте 9 месяцев
уровень амилоида бета превышал в 3 раза нормальный уровень, как это и предсказывалось, учитывая присутствие трех копий гена APP. Как и у людей с DS, старение представляет собой важный фактор отложения амилоида в головном мозге мышей линии Ts65Dn. Несмотря на связанное с возрастом накопление амилоида, у мышей линии TS65Dn не развивались бляшки. Однако у них имело место точное воспроизведение дегенерации популяции нейронов, наблюдаемой при AD и у людей с синдромом Дауна (Salehi и др., 2009).
В совокупности, особенности DS, обнаруженные на применяемой мышиной модели, включают присутствие патологических белков и фенотипических аспектов; т.е. наличие амилоидной нагрузки и когнитивного нарушения. Таким образом, мыши линии Ts65Dn позволяют точно воспроизводить патогенные процессы, характерные для DS. Поскольку у этих мышей в возрасте 6 месяцев начинается накопление амилоида на уровне, сопоставимом с уровнем у людей, то возраст подопытных мышей соответствовал людям с синдромом Дауна от молодого до среднего возраста.
Мыши, которых применяли для опыта по иммунизации с использованием вакцины ACI-DS-01, представляли собой мышей линии Ts65Dn из колонии, которую поддерживали в течение более 10 поколений путем скрещивания самок линии B6EiC3Sn-Ts(1716)65Dn (фирма Jackson Laboratory, Бар-Харбор, шт. Мэн) с самцами линии B6EiC3Sn F1/J A/a (фирма Jackson Laboratory). Указанную схему скрещивания применяли потому, что при родственном спаривании мыши с трисомией размножались очень плохо или не размножались совсем; фон B6C3 оказался наиболее эффективным. Для того чтобы отличать мышей линии 2N от мышей линии Ts65Dn, из образцов, полученных из хвоста, экстрагировали геномную ДНК. Применяли протокол количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (предоставленный фирмой Jackson Laboratory) для количественной оценки экспрессии гена Mx1, который присутствовал в виде трех копий у мышей Ts65Dn. Во всех опытах использовали самцов мышей. Их возраст в начале исследования составлял 4±0,3 месяца.
1.2. Получение вакцин - получение антигенной конструкции на основе липосом.
Код
вакцины
Последовательность антигенного пептидаа
Последовательность Ap
Конформация антигенного пептида в вакцине (%) по данным ATR-IR (инфракрасная спектроскопия нарушенного полного отражения)
ACI-DS-01
H-Lys(Pal)-Lys(Pal)-Asp-Ala-Glu Phe-Gly-His-Asp-Ser-Gly-Phe-Glu-Val-Arg-His-Gln-Lys(Pal)-Lys(Pal)-OH
мышиный Api-15b (SEQ ID NO: 2)
73% бета-складка 19% случайная спираль 0% альфа-спираль и петли 8% бета-повороты
ACI-DS-02
H-Lys(Pal)-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Lys(Pal)-OH
человеческий (SEQ ID NO: 4) и мышиный (SEQ ID NO: 5) AP22-35
67% бета-складка 21% случайная спираль 0% альфа-спираль и петли 12% бета-повороты
ACI-DS-03
H-Lys(Pal)-Lys(Pal)-His-
Gln-Lys-Leu-Val-Phe-
Phe-Ala-Glu-Asp-Val-
Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-
Lys(Pal)-Lys(Pal)-OH
человеческий (SEQ ID NO: 6) и мышиный (SEQ ID NO: 7) AP14-29
57% бета-складка 19% случайная спираль 12% альфа-спираль и петли 11% бета-повороты
а Пептидные последовательности представлены в трехбуквенном коде; Pal обозначает пальмитоилированный остаток.
b Три аминокислотных различия в последовательности человеческого и мышиного Ap 1-15 подчеркнуты и представлены на фиг. 1. Липосомную антигенную конструкцию получали согласно методу, описанному в WO 2007/068411. Пальмитоилированные пептиды получали на фирме Polypeptide Laboratories (Страсбург, Франция). В целом липосомные вакцины получали путем солюбилизации димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG), холестерина и монофосфорильного липида A (MPLA) (все препараты получали от фирмы Avanti Polar Lipids Inc. шт. Алабама, США) в молярном соотношении 9:1:7:0,05 соответственно в этаноле при 60°C. Липид/этанольный раствор разводили в ЗФР, pH 7,4, давая образоваться многослойным пузырькам. Затем полученный препарат концентрировали ультрафильтрацией (устройство Vivaflow 200 с полиэфирсульфоновой мембраной с MWCO (молекулярновесовой предел) 100000) со скоростью потока 200 мл/мин и реакционный объем уменьшали с помощью стадии ультрафильтрации. Концентрированный раствор дополнительно подвергали диализу с помощью устройства Vivaflow 200, в котором осуществляли замену 10-кратного объема на ЗФР, pH 7,4. Затем многослойные липосомы гомогенизировали (7 циклов при давлении 15000-20000 фунтов/кв.дюйм) с последующим осуществление трех циклов экструзии через поликарбонатные фильтры (фирма Whatman) с размером пор 0,2 мкм и диаметром 47 мм. Как стадии гомогенизации, так и экструзии осуществляли с помощью устройства EmulsiFlex-C5 (фирма Avestin, Канада). Образовавшиеся однослойные липосомы без антигена разводили в ЗФР pH 7,4 и нагревали до 60°C перед добавлением пептида. Пальмитоилированный пептид растворяли в ЗФР, pH 11,4, дополненном 5,0% (p-OG). Для приготовления вакцин ACI-DS-01, ACI-DS-02 и ACI-DS-03 использовали соответствующие антигенные пептиды в концентрации 1,33, 0,67 и 1,06 мг/мл
соответственно. Образовавшийся раствор содержал поверхностно-активное вещество в концентрации, превышающей его критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), составляющую 0,73% (мас./об.). Затем этот пептидный раствор инъецировали в растворы липосом при 60°C и перемешивали в течение 30 мин, получая раствор с конечной концентрацией p-OG, существенно более низкой, чем его критическая концентрация мицеллобразования. Разрушение состоящих из поверхностно-активного вещества мицелл индуцирует включение пальмитоилированного антигена на поверхность ранее сформированных липосом. Затем указанный раствор липосом с антигеном концентрировали путем ультрафильтрации и осуществляли замену 10-кратного объема на ЗФР, pH 7,4 посредством диафильтрации (оба процесса осуществляли с помощью устройства с полиэфирсульфоновой мембраной с MWCO 100000 со скоростью потока 200 мл/мин). Затем образовавшиеся липосомы дважды стерилизовали фильтрацией, пропуская через шприцевые 0,2-микрометровые поликарбонатные фильтры и хранили при 5°C. Молярное соотношение пептида и липида в вакцине составляло 1:100.
1.3. Иммунизация вакциной ACI-DS-01.
Всех мышей иммунизировали путем подкожного (s.c.) введения 200 мкл ACI-DS-01 (51,2 мкг на дозу Pall-15, тетрапальмитоилированный пептид Ap1-15) или "незагруженной" липосомной вакцины. В целом осуществляли шесть инъекций в дни 1, 14, 28, 42, 56, 70 и 110. В эти же дни получали образцы крови из хвостовой вены непосредственно перед первой инъекцией вакцины в день -1 (предварительный образец крови), в день 56 (через 14 дней после 4-й инъекции) и при умерщвлении в день 110 (через 40 дней после 6-й инъекции). Мышей умерщвляли в конце эксперимента в возрасте 9 месяцев и изымали головной мозг.
1.4. Количественная оценка специфических в отношении мышиного Ap антител после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
Специфические в отношении Ap1-42 ответы в виде IgG определяли с помощью ELISA. В целом метод состоял в следующем: планшеты сенсибилизировали с помощью 10 мкг/мл мышиного Ap1-42 (фирма Bachem H5966, лот: 1013710, 1028321 или 1033165) или мышиного Ap1-40 (фирма Bachem H5638, лот: 1013645) в течение ночи при 4°C. После отмывки с помощью ЗФР-0,05% Твин 20 и блокады с помощью 1% БСА в планшеты добавляли серийные разведения плазмы и инкубировали при 37°C в течение
2 ч. Антитело к Ap 4G8 (фирма Covance SIG-39220, лот: 08EC00905, 1 мг/мл, разведенное в 4000 раз) и сыворотку мышей линии C57BL/6JOIaHsd (фирма Harlan), иммунизированных с помощью трех инъекций той же партии ACI-DS-01, применяли в качестве положительного контроля. После отмывки планшеты инкубировали с конъюгированным со щелочной фосфатазой (AP) антимышиным антителом в виде IgG (фирма Jackson Immunoresearch, Вест-Гроув, шт. Пенсильвания, США, каталожный №115-055-164, лот 87821, содержимое пробирки разведенное в соотношении 1/4000) в течение 2 ч при 37°C. После конечной отмывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом для AP (pNPP) и считывали при 405 нм с помощью планшет-ридера для ELISA. Результаты выражали в виде оптической плотности (ОП).
1.5. Поведенческие опыты после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
Всех мышей подвергали одинаковым сериям поведенческих опытов, начиная исследования после достижения примерно 8-месячного возраста. Каждую мышь держали в руках по 10 мин дважды в день в течение 7 дней, предшествующих исследованию, и в течение 3 дней между опытами. Опыты осуществляли в указанные дни (относительно последней иммунизации) и в следующем порядке: локомоторная активность (начало в день 11), задача на узнавание нового объекта, отсроченное на 24 ч (начало в день 18), T-лабиринт (начало в день 25) и контекстуальной тест на условно-рефлекторную реакцию страха (начало в день 34). Все поведенческие опыты проводили в течение светового дня между 7:00 A.M. и 7:00 P.M. и при комнатной температуре (22°C). В день опыта мышей выдерживали в их собственных клетках в течение светлой фазы суток в том же экспериментальном помещении в течение 2 ч для адаптации. В качестве показателя состояния беспокойства (страха) во время каждого опыта оценивали также количество фекальных шариков и капель мочи. Для снижения до минимума ольфакторных меток, сохранившихся с предыдущего опыта, каждое устройство тщательно чистили с помощью 10% этанола после каждого нахождения в нем животного. Уход за животными и все поведенческие опыты осуществляли вслепую, не предоставляя исследователю, осуществляющему уход за мышами, сведений о генотипе и варианте обработки.
1.5.1. Тест на спонтанную локомоторную активность после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
Мониторинг спонтанной локомоторной активности осуществляли в камерах из плексигласа, предназначенных для оценки активности (модель MED-OFA-MS; фирма Med Associates) (27,9*27,9*20 см), и с использованием программы для мониторинга активности (Activity Monitor, версия 4.3.6). Как описано у Belichenko с соавторами (Belichenko и др., 2009; Belichenko и др., 2007), мышей помещали в центр камеры в условия яркого освещения и осуществляли мониторинг активности в течение 10 мин, проводя три независимых опыта. Определяли средние величины суммарного расстояния, скорости, суммарного времени активности, уровней суммарной активности и вертикальной активности (проявляющейся в виде стойки у животных).
1.5.2. Задача на узнавание нового объекта после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
При создании изобретения использовали протокол Bevins и Besheer (Bevins и Besheer, 2006; O'Do-herty и др., 2005): осуществляли тест по научению с одной попытки с использованием несоответствующего образца для изучения опознавательной памяти в отношении двух объектов-образцов, находящихся в одинаковых условиях, оценивая научение и память через 24 ч (отсрочка на 24 ч). Перед тестированием мышам давали адаптироваться в черной камере из плексигласа (31 *24*20 см) в течение 10 мин в течение 2 последовательных дней в условиях регулирования освещенности окружающей среды. Активность мышей возрастом 8 месяцев при решении задачи по узнаванию регистрировали с помощью видеокамеры. Сначала в камеру помещали два идентичных объекта, согласно описанному ранее методу (Bevins и Besheer, 2006; O'Doherty и др., 2005). Мышь помещали у середины стены напротив объектов-образцов. После того, как мыши давали в течение 10 мин исследовать объекты, ее возвращали в колонию на 24 ч. Для теста по узнаванию объекта в камеру помещали один известный объект и один новый объект, и мышь вновь вносили в камеру и давали исследовать объекты в течение 3 мин. Узнавание объекта оценивали по одному опыту. Данные получали на основе непосредственного изучения результатов видеонаблюдения. В качестве результатов служили: 1) среднее значение суммарного времени исследования образцов-объектов как нового, так и знакомого, и 2) коэффициент дискриминации (контакт с новым объектом/суммарный контакт с обоими объектами).
1.5.3. Тестирование с использованием T-лабиринта после иммунизации с помощью ACI-DS-01. Для опыта использовали мышей 8-месячного возраста. При создании изобретения для оценки
функции гиппокампа применяли модифицированный протокол, предложенный Deacon и Rawlins (Deacon и Rawlins, 2006), и задачу с непрерывным чередованием в T-лабиринте. Лабиринт был сделан из прозрачного акрилового стекла (плексиглас), как описано у Deacon и Rawlins, 2006, с дополнительной скользящей дверцей в начале стартового рукава. При выполнении теста мышь помещали в начало исходного рукава спиной к закрытой скользящей дверце. После того, как открывали все дверцы, мышь бежала вдоль стартового рукава, выбирая, либо правый, либо левый целевой рукав. После того, как все четыре лапы мыши входили в один из целевых рукавов, скользящую дверцу, ведущую в другой целевой рукав, закрывали на 5 с, а затем все скользящие дверцы вновь открывали, давая мышам вернуться в стартовый рукав. Активность в T-лабиринте оценивали до тех пор, пока мыши не завершали 10 чередований. Эту процедуру повторяли в течение 3 последовательных дней, осуществляя в общей сложности 30 опытов. Балл спонтанных чередований определяли как количество чередований направлений поиска слева-направо и справа-налево, его выражали в виде процента от общего количества возможных чередований в процессе сеанса. Результаты представляли собой средние значения как баллов чередований, так и затраченного времени.
1.5.4. Контекстуальный тест на условно-рефлекторную реакцию страха после иммунизации с по-
мощью ACI-DS-01.
Для изучения зависящего от страха научения и воспроизведения осуществляли выработку зависящей от контекста (контекстуальной) и сигнала (подсказки) условно-рефлекторной реакции страха. Тест осуществляли с использованием камеры фирмы Coulbourn Instruments (Уайтхолл, шт. Пенсильвания, США). В первый день животных помещали в камеру (контекст А) на 3 мин для оценки исходного уровня, после чего на них воздействовали звуковым сигналом, спаренным с шоковым воздействием. Вызывающий шок электрический импульс (0,5 мА, 2 с) подавали после звукового сигнала (70 дБ, 2 кГц, 20 с) в каждой паре условно-рефлекторный/безусловно-рефлекторный стимул. Во второй день для осуществления опыта с использованием подсказки применяли новую камеру (контекст Б; новое помещение, новое ольфакторное окружение, новая текстура пола, синие пластиковые вставки для стен, дополнительный источник синего цвета и визуальные сигналы). После 3-минутного периода, предшествующего подаче звукового сигнала, на животных воздействовали в течение 3-минутного периода тестирования тремя звуковыми сигналами без шоковых воздействий. В последний день эксперимента мышей помещали в контекст А на 5 мин без воздействия каким-либо условно-рефлекторным или безусловно-рефлекторным стимулом (Saxe и др., 2006). Состояние "замирания" определяли как полное отсутствие движения в течение как минимум 0,75 с при оценке с помощью программы FreezeFrame (фирма Actimetrics, Эванстон, шт. Иллинойс). Получали данные о проценте "замирания" в каждый период времени.
1.6. Оценка массы тела и головного мозга после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
После проведения всех поведенческих опытов мышей подвергали глубокой анестезии пентобарби-талом натрия (200 мг/кг, i.p.) (фирма Abbott Laboratories), взвешивали и осуществляли транскардиальную перфузию в течение 1 мин с использованием 0,9% хлорида натрия (10 мл), а затем в течение 10 мин с использованием 4% параформальдегида в 0,1 М ЗФР, pH 7,4 (100 мл). После перфузии немедленно изымали головной мозг. Определяли массу головного мозга (включая обонятельные луковицы, кору, гиппо-камп, мозжечок, ствол головного мозга и шейный отдел (C1-C2) спинного мозга). Затем головной мозг помещали в фиксатор и хранили в нем до дальнейшего применения.
1.7. Применение иммунофлуоресценции для выявления воспалительной реакции после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
Срезы головного мозга предварительно инкубировали с 5% обезжиренного молока в 0,1 М ЗФР с
0,3% Тритон X-100. Затем срезы инкубировали в течение ночи при 4°C с кроличьим антителом к коровьему глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (фирма DAKO, Глоструп, Дания), разведенным в соотношении 1:500, или с поликлональным крысиным антителом к CD45 (фирма Pharmingen), разведенным в соотношении 1:5000. Осуществляли следующие инкубации (по 1 ч каждая при комнатной температуре): с биотинилированным ослиным антикроличьим вторичным антителом (1:200; фирма Jackson ImmunoResearch Labs, Вест-Гроув, шт. Пенсильвания, США) и с конъюгированным с флуоресцеинизо-тиоцианатом (ФИТЦ) стрептавидином (1:500; фирма Jackson ImmunoResearch Labs). В промежутке между указанными выше инкубациями осуществляли промывку с помощью ЗФР (3 раза, каждый раз по 20 мин). Срезы монтировали на стеклянные предметные стекла для микроскопа и накрывали покровными стеклами, используя 90% глицерина в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4. Для контроля специфичности окрашивания антителом отобранные срезы подвергали такому же протоколу обработки, но без первичных антител. Иммунофлуоресценция не выявлена в контрольных срезах. Срезы обследовали и сканировали с помощью конфокального микроскопа Radiance 2000 (фирма Bio-Rad, Хартфордшир, Великобритания), присоединенного к флуоресцентному микроскопу Nikon Eclipse E800. Лазер представлял собой лазер на смеси газов аргона и криптона с длиной волны возбуждения для ФИТЦ 488 нм (X). Применяли программу LaserSharp (фирма Bio-Rad) для создания оптимальных условий для регистрации изображений. Оптимальными условиями для конфокального изображения GFAP-иммунореактивности (IR) или CD45-IR были следующие: 20-кратные линзы объектива (фирма Nikon; Plan Apo 20x/0.75); мощность лазера 10 или 20%; коэффициент усиления - 34,7; сдвиг - 0,0; масштабный множитель - 3; скорость сканирования - 500 линий/с; каждый оптический срез сканировали трижды и применяли фильтрацию по Калману для уменьшения шума; размер изображения составлял 512*512 пикселей и размер пикселя был 0,48*0,48 мкм.
1.8. Статистический анализ после иммунизации с помощью ACI-DS-01.
Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (СКО) или среднеквадратичная ошибка среднего арифметического (стандартная ошибка) (SEM). Статистический анализ осуществляли на основе неспаренного двустороннего t-критерия. Вероятность p <0,05 рассматривали как значимую.
Пример 2. Иммунизация с помощью ACI-DS-01 приводит к образованию антител к мышиному Ap.
Липосомную вакцину ACI-DS-01 приготавливали согласно методологии SupraAntigen(tm) (WO 2005/081872, WO 2007/068411) с применением тетрапальмитоилированного мышиного пептида Ap1-15 (Palm1-15), H-Lys(Pal)-Lys(Pal)-Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Asp-Ser-Gly-Phe-Glu-Val-Arg-His-Gln-Lys(Pal)-Lys(Pal)-OH, встроенного в липосомы наряду с монофосфорильным липидом A (MPLA) (фиг. 1). Шесть доз ACI-DS-01 вводили подкожно и через две недели самцам мышей линии Ts65Dn и контрольным мышам соответствующего возраста (линия 2N). Анализ плазмы, собранной после 4-й дозы, продемонстрировал присутствие высоких титров IgG к мышиному Ap40 или Ap42 у мышей из групп, иммунизированных как Ts65Dn, так и 2N (фиг. 2А и 2Б). Титры индуцированных обработкой вакциной антител оставались повышенными даже через 40 дней после последней иммунизации. Никаких титров не обнаружено у мышей, иммунизированных "незагруженной" липосомой без антигена (фиг. 2А и 2Б). Таким образом, ACI-DS-01 обладает способностью нарушать самотолерантность к Ap на мышиной модели DS.
Анализировали подклассы IgG в плазме мышей, иммунизированных ACI-DS-01, после 4-й иммунизации. Осуществление ELISA с Ap40 позволило установить, что в Ts65Dn-группе титры IgG2a были выше, чем в 2№группе (фиг. 2Г), в то время как не было обнаружено разницы между двумя группами в отношении титров IgG1 и IgG2b (фиг. 2В и 2Д) (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; P=0,05). Титры IgG3 оказались более низкими в Ts65Dn-группе (фиг. 2Е) (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; P <0,001). Титры IgM у мышей линии Ts65Dn оказались несколько более низкими, но не статистически значимо, по сравнению с мышами линии 2N (фиг. 2Ж) (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; P=0,05). Аналогичные результаты получали при осуществлении ELISA с Ap42 (данные не представлены).
Маловероятно, что указанные выше более низкие уровни титров некоторых подклассов антител, обнаруженные у мышей линии Ts65Dn, являются результатом способности мышей линии Ts65Dn давать иммунный ответ, поскольку титры IgG к MPLA были сопоставимы у всех мышей (фиг. 23).
Пример 3. Иммунизация с помощью ACI-DS-01 восстанавливает дефицит памяти у мышей линии
Ts65Dn.
У мышей линии Ts65Dn присутствует много признаков присущих DS когнитивных аномалий, таких как нарушение памяти и аномальная активность. Для изучения эффективности вакцины ACI-DS-01 осуществляли серию поведенческих тестов через 2 недели после последней иммунизации. Мышей подвергали тестированию в следующем порядке: "открытое поле", узнавание объекта, T-лабиринт и условно-рефлекторная реакция страха.
Анализ результатов теста в "открытом поле" продемонстрировал, что мыши линии Ts65Dn обладают существенно более высокой спонтанной локомоторной активностью по сравнению с мышами линии 2N (данные не представлены). После иммунизации с использованием ACI-DS-01 мыши линии Ts65Dn продолжали сохранять существенно более высокую активность по сравнению с обработанными ACI-DS
01 мышами линии 2N (фиг. 3А, неспаренный односторонний t-критерий; p=0,0004). При изучении в T-лабиринте у мышей линий 2N и Ts65Dn обнаружено отсутствие существенного различия как в отношении баллов чередований, так и затраченного на чередование времени ни до, ни после обработки (данные не представлены).
Способность к пространственному запоминанию оценивали с помощью теста на узнавание объекта (ORT). Для мышей линии Ts65Dn характерен низкий коэффициент дискриминации и поэтому плохая способность к узнаванию нового объекта. После обработки мышей линии Ts65Dn с помощью ACI-DS-01 у них обнаружен более высокий коэффициент дискриминации, свидетельствующий о том, что обработка приводит к значительному улучшению памяти (фиг. 3Б, неспаренный односторонний t-критерий; p=0,03, однонаправленный дисперсионный анализ; генотип, P=0,12, вакцина, P=0,002. Взаимодействие (контакт) P=0,54). Следует отметить, что такие же результаты получены для 2№группы.
Тест на условно-рефлекторную реакцию страха состоял из сеанса по обучению, сеанса с подсказкой и контекстуального сеанса. В процессе сеанса по обучению или сеанса с подсказкой во всех группах был выявлен одинаковый уровень "замирания" (фиг. 3В). В процессе контекстуального сеанса у мышей линии Ts65Dn, обработанных "незагруженной" вакциной (только липосома без антигена), обнаружен более низкий процент "замирания", чем у контрольных мышей линии 2N. В противоположность этому, у мышей линии Ts65Dn после иммунизации обнаружена повышенная способность к "замиранию", достигающая уровня, сопоставимого с уровнем, обнаруженным у мышей линии 2N (неспаренный односторонний t-критерий; P=0,04) (однонаправленный дисперсионный анализ, генотип, P=0,01, вакцина, P=0,16. Взаимодействие P=0,33). Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация была эффективной и повышала способность к запоминанию у мышей линии Ts65Dn.
В целом эти результаты свидетельствуют о том, что обработка с помощью ACI-DS-01 может восстанавливать дефицит памяти у мышей линии Ts65Dn.
Пример 4. Механизм действия вакцины ACI-DS-01 в отношении снижения когнитивного дефицита.
Для решения вопроса о воздействии индуцированных ACI-DS-01 антител на уровень Ap, осуществляли ELISA с использованием белковых экстрактов из гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка. Ни в одной из указанных областей не обнаружено существенного различия между уровнями Ap после обработки с помощью ACI-DS-01; ни касательно Ap40, ни касательно Ap42 (фиг. 4А). Важно отметить, что соотношение Ap-40/42 в коре и мозжечке статистически значимо коррелировало с более высоким коэффициентом узнавания (RI) (фиг. 4Б и 4В. Кора головного мозга; коэффициент корреляции Пирсона r=-0,3248, P=0, 0,03. Мозжечок; коэффициент корреляции Пирсона r=-0,4127, P=0,009). Эти результаты позволяют предположить, что соотношение Ap-40/42 может быть ответственно за когнитивный дефицит. Дополнительный анализ продемонстрировал, что содержание Ap42 в плазме находилось на необнаружи-ваемом уровне. В противоположность этому, повышенный уровень Ap40 в плазме, по-видимому, должен ассоциироваться с более высокими титрами анти-Ap IgG, измеренными в группе мышей линии Ts65Dn, обработанных ACI-DS-01 (фиг. 4Г; коэффициент корреляции Пирсона r=0,51, P =0,09). Кроме того, величина RI коррелировала с титрами анти-Ap IgG (фиг. 4Д; коэффициент корреляции Пирсона r=0,3154,
P=0,007).
Эти результаты позволяют предположить, что индуцированные ACI-DS-01 антитела могут приводить к клиренсу Ap из головного мозга в плазму, что, в свою очередь, может приводить к улучшению памяти.
Пример 5. Морфология нейронов в мышиных моделях синдрома Дауна.
Анализировали размер, количество и оптическую плотность холинергических нейронов в основании переднего мозга (BFCN). Два среза, сделанные на уровне BFCN, окрашивали антителом к ChAT (фирма Millipore, каталожный № AB144P, лот № 2010060). Площадь медиальной перегородки (MS) сканировали с помощью конфокального микроскопа для количественной оценки. Рассчитывали следующие параметры: 1) плотность ChAT+-клеток в MS; 2) площадь индивидуальных ChAT+-нейронов и 3) среднюю оптическую плотность ChAT в индивидуальных нейронах. Визуализировали холинергические нейроны в медиальной перегородке и применяли программу ImageJ для подсчета количества нейронов, оценки оптической плотности окрашивания и очерчивания площади тела клетки.
Результаты. Количество ChAT+-клеток в медиальной перегородке и оптическая плотность оказались сходными у мышей линий 2N и Ts65Dn, обработанных "незагруженной" вакциной (фиг. 9А и 9Б).
Количество ChAT+-клеток в медиальной перегородке оказалось сходным у обработанных ACI-DS-01 мышей линий 2N и Ts65Dn (фиг. 9A) (2№"незагруженная"=27,5±7,2 на срез размером 100 мкм; Ts65Dn-"незагруженная"=23,9±7,0; 2N-ACI-DS-01=36,6±4,6; Ts65Dn-ACI-DS-01=20,9±6,6). Оптическая плотность, характеризующая окрашивание индивидуальных ChAT+-клеток в медиальной перегородке, также оказалась сходной у обработанных ACI-DS-01 мышей линий 2N и Ts65Dn (фиг. 9Б) (2N-"незагруженная"=79,9±3,5 условных единиц; Ts65Dn-"незагруженная"=74,7±2,6; 2N-ACI-DS-01=71,9±2,6; Ts65Dn-ACI-DS-01=75,8±4,5). Площадь тела ChAT+-клеток в медиальной перегородке оказалась ниже у мышей линии Ts65Dn по сравнению с мышами линии 2N (фиг. 9В). Площадь тела ChAT+-клеток в медиальной перегородке обработанных ACI-DS-01 мышей линии Ts65Dn оказалась существенно выше по сравнению с обработанными "незагруженной" вакциной мышами (Ts65Dn-veh) (Ts65Dn
"незагруженная"=179±6 мкм2; Ts65Dn-ACI-DS-01=201±8, p=0,031). У обработанных ACI-DS-01 мышей линий 2N и Ts65Dn обнаружена сходная площадь тела клеток (2N-ACI-DS-01= 208±8 мкм2; Ts65Dn-ACI-DS-01=201±8, p=0,55) (фиг. 9В). Эти результаты свидетельствуют о восстановлении площади тела клетки у ChAT+-клеток в медиальной перегородке после обработки ACI-DS-01. Аналогично этому, результаты свидетельствуют о безопасности вакцины ACI-DS-01, поскольку количество ChAT+-клеток не изменялось после иммунизации вакциной. Эти морфологические исследования свидетельствуют о меньшей атрофии нейронов после иммунизации с помощью ACI- DS-01, демонстрируя, что вакцину можно применять для предупреждения нейродегенерации.
Пример 6. Безопасность липосомной вакцины ACI-DS-01.
Для решения вопроса о том, может ли иммунизация с использованием ACI-DS-01 индуцировать опасность, осуществляли определение веса тела, общие наблюдения и определяли маркеры воспаления. Перед обработкой мыши линии Ts65Dn имели существенно более низкий вес по сравнению с мышами линии 2N (дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; p=0,001). Иммунизация не приводила к значимому изменению веса тела (фиг. 5А). Масса головного мозга оказалась сходной во всех четырех группах мышей (фиг. 5А). Результаты иммуногистохимического анализа продемонстрировали отсутствие различия в количестве позитивных по глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) клеток астроглии или CD45-позитивных клеток микроглии. Полученные результаты оказались сходными для коры головного мозга и гиппокампа (фиг. 5). Эти результаты свидетельствуют о том, что вакцинация с использованием ACI-DS-01 не индуцировала воспалительный ответ.
Для подтверждения специфичности индуцированных ACI-DS-01 антител осуществляли изучение перекрестной реактивности. Срезы головного мозга мышей линий 2N и Ts65Dn окрашивали антисывороткой обработанных ACI-DS-01 мышей линии 2N.
В целом указанные результаты свидетельствуют о безопасности вакцины ACI-DS-01.
Пример 7. Общая методология экспериментов с вакцинами ACI-DS-02 и ACI-DS-03.
7.1. Иммунизация вакциной ACI-DS-02 и ACI-DS-03.
Самцов мышей линии Ts65Dn (фирма Jax laboratory B6EiC3Sn.BLiA-Ts(1716)65Dn/DnJ), возраст которых в начале исследования составлял 4±0,3 месяца, иммунизировали путем подкожных (s.c.) инъекций 200 мкл ACI-DS-02 (18,6 мкг на дозу дипальмитоилированного пептида Ap22-39) (n=6 Ts65Dn-мыши) или ЗФР (n=4 Ts65Dn-мыши). Всего осуществляли четыре инъекции в дни 1, 14, 28 и 42. Через 1 неделю после каждой иммунизации отбирали образцы крови из хвоста; т.е. в дни 7, 21, 35 и 49.
Такую же процедуру осуществляли при иммунизации вакциной ACI-DS-03 (38,6 мкг на дозу Pal 1429, тетрапальмитоилированный пептид Ap14-29) (n=7 Ts65Dn-мыши) или ЗФР (n=4 Ts65Dn-мыши).
Мышам из применяемого в качестве контроля приплода (n=7, 2 N-мыши), делали такие же инъекции, но с ЗФР.
7.2. Количественная оценка специфических в отношении мышиного Ap антител.
Определяли ответы в виде специфических в отношении Ap1-42 IgG с помощью ELISA. В целом метод состоял в следующем: планшеты сенсибилизировали, используя по 10 мкг/мл человеческого Ap1-42 (фирма Bachem H1368, лот: 1000255), в течение ночи при 4°C. После отмывки с помощью ЗФР-0,05% Твин 20 и блокирования 1% БСА в планшеты добавляли серийные разведения плазмы и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. В качестве положительного контроля применяли антитело к Ap 6E10 (антитело 6E10 фирмы Covance SIG-39320, лот: 09GC01254 пузырек а, 1 мг/мл, разведение 1000*). После отмывки планшеты инкубировали с конъюгированным со щелочной фосфатазой (AP) антимышиным антителом в виде IgG (фирма Jackson Immunoresearch Вест-Гроув, шт. Пенсильвания, каталожный № 115-055-164, лот 87821, разведение в пузырьке 1/4000) в течение 2 ч при 37°C. После конечной отмывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом AP (pNPP) и считывали при 405 нм с помощью планшет-ридера для ELISA. Результаты выражали в виде оптической плотности (ОП).
7.3. Поведенческие опыты.
Всех мышей подвергали одинаковым сериям поведенческих тестов, начиная с возраста около 6±0,3 месяца. Все поведенческие опыты проводили в течение светового дня в период между 7:00 A.M. и 7:00 P.M. и при комнатной температуре (22°C).
7.3.1. Задача на узнавание пространственного объекта.
Перед тестированием мышей помещали в камеру из серого полипропилена (диаметр 40 см, высота 32,4 см), выдерживали в течение 10 мин без какого-либо объекта в условиях с регулируемым естественным освещением. На следующий день и в процессе сессии по обучению два идентичных объекта (кубики из конструктора Лего или стеклянный черный сосуд) помещали (на 10 мин) на одну сторону лабиринта. Тест на сохранение в памяти осуществляли через 3 ч после обучения, один из идентичных объектов передвигали на противоположную сторону лабиринта и оставляли на 10 мин. Все сеансы регистрировали на видео, используя программу для слежения Ethovision XT 8.0. Измеряемые параметры представляли собой среднее суммарное время исследования образца-объекта, как нового, так и известного, и коэффициент дискриминации (контакт с новым объектом/суммарный контакт с обоими объектами).
7.3.2. Задача на запоминание в водном лабиринте.
Для анализа долговременной памяти проводили опыты в водном лабиринте. При проведении теста
по адаптации мышей помещали в первый день в водный лабиринт (диаметр: 165 см, высота: 64 см) с видимой являющейся внешним стимулом платформой (диаметр 11 см, высота: 37 см). Этот тест состоял из 5 попыток по 120 с каждая с 30-минутным интервалом между попытками. Последнюю 6-ю попытку осуществляли в отсутствии видимой являющейся внешним стимулом платформы. Начиная со следующего дня, мышей подвергали 4-дневным тренировкам со скрытой (погруженной) платформой. Каждый день мышам давали осуществлять 6 попыток по 120 с каждая с 30-минутными интервалами между попытками. В начале опыта мышь погружали в воду, повернув мордой к грани резервуара в одной из стартовых точек (северо-восток, юго-восток, юго-запад и северо-запад). Стартовые точки изменяли от попытки к попытке, в то время как предназначенная для спасения платформа находилась в фиксированном положении (западный квадрант) в течение всего эксперимента. Если мышь находила платформу в течение 120 с, ей давали оставаться на платформе в течение 15 с. Если ей не удавалось найти платформу в течение 120 с, то попытку прекращали и мышь осторожно продвигали к платформе и давали находиться на ней в течение 15 с. Измеряемые параметры включали: продолжительность требуемого для спасения латентного периода (с) в различных частях лабиринта, количество посещений каждого квадранта лабиринта, расстояние (см), на которое животное перемещалось в каждом квадранте, расстояние (см) до целевой зоны, время нахождения (%) в каждом квадранте, время нахождения (%) внутри более широкой окружности вокруг целевой платформы, во время пробной попытки, количество пересечений более широкой окружности вокруг целевой платформы, во время пробной попытки, и скорость (см/с). 7.3.3. Контекстуальный тест на условно-рефлекторную реакцию страха.
Контекстуальный тест и оценку условно-рефлекторной реакции страха осуществляли для изучения зависящего от страха научения и воспроизведения. Тест осуществляли с использованием камер фирмы Med Associates Instruments. В первый день животных помещали в камеру (контекст А) на 2 мин для оценки исходного уровня, затем на них воздействовали четырьмя звуковыми сигналами, спаренными с шоковым воздействием (условно-рефлекторные стимулы, CS). Вызывающий шок звуковой стимул продолжительностью 30 с (5000 Гц, 80 дБ) заканчивался одновременно с 2-секундным шоковым воздействием электрического импульса на лапу (0,7 мА) в каждой паре условно-рефлекторный/безусловно-рефлекторный стимул. На второй день мышей на 5 мин помещали в контекст А без воздействия какого-либо условно-рефлекторного/безусловно-рефлекторного стимула. В последний день эксперимента для теста с подсказкой применяли новую камеру (контекст Б; новое помещение, новое ольфакторное окружение, новая текстура пола, синие пластиковые вставки для стен, дополнительный источник синего цвета и визуальные стимулы). После 2-минутного периода, предшествующего подаче звукового сигнала, на животных воздействовали тремя звуковыми сигналами без вызывающего шок электрического импульса в течение 8-минутного периода тестирования. Состояние "замирания" определяли как полное отсутствие движения в течение как минимум 0,75 с. Получали данные о проценте "замирания" в каждый период времени.
7.4. Иммуноокрашивание амилоидных бляшек в образцах головного мозга людей с DS с помощью индуцированных вакцинами ACI-DS-02 и ACI-DS-03 антител к Ap.
Срезы головного мозга людей с DS окрашивали индуцированными вакцинами антителами к Ap, присутствующими в сыворотке мышей, иммунизированных вакциной ACI-DS-02. Для процедуры имму-ноокрашивания применяли пул сыворотки из пяти мышей линии C57BL/6, иммунизированных вакциной ACI-DS-02, в разведении 1/100. В целом метод состоял в следующем: криосрезы толщиной 10 мкм, полученные из головного мозга человека возрастом 59 лет с DS, инкубировали в 4% параформальдегида (фирма Sigma-Aldrich, 252549) в течение 20 мин. После инкубации в 70% муравьиной кислоты (фирма Merck, 1.00264.1000) и 10% Тритон Х-100 (фирма Sigma, 234729) каждый раз по 15 мин срезы блокировали в течение 2 ч в 10% сыворотки здоровой козы (NGS, фирма Invitrogen, 6210072) в ЗФРТ (ЗФР плюс 0,5% Тритон Х-100). Инкубацию с первичным антителом (сыворотка иммунизированных мышей) в ЗФРТ с 10% NGS осуществляли в течение ночи. На следующий день и после промывки в ЗФРА срезы инкубировали с конъюгированным с Alexa Fluor 488 козьим антимышиным IgG AffiniPure (фирма Jackson ImmunoResearch, 115-545-146). Срезы монтировали в ProLong Gold (фирма Invitrogen, P36931). В качестве положительного контроля применяли первичное антитело к Ap 6E10 (фирма Covance, SIG-39320, антитело к Ap (к N-концевой области Ap, используя разведение 1:10000). Сыворотку мышей линии C57BL/6, иммунизированных ЗФР, применяли в качестве отрицательного контроля. Сыворотку мышей линии C57BL/6, иммунизированных ACI-24, применяли в качестве контроля. Вакцина ACI-24 соответствует вакцине ACI-DS-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ACI-24, представляет собой последовательность человеческого Ap1-15, а вакцина ACI-DS-01 содержит в качестве антигена последовательность мышиного Ap1-15 (три аминокислотных различия в двух указанных антигенах см. на фиг. 1).
7.5. Статистический анализ.
Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (СКО) или среднеквадратичная ошибка среднего арифметического (стандартная ошибка) (SEM). Статистический анализ осуществляли с использованием неспаренного двустороннего t-критерия. Вероятность p <0,05 рассматривали как значимую.
Пример 8. Иммунизация с использованием ACI-DS-02 приводит к образованию антител к человече
скому Ap.
Четыре дозы ACI-DS-02 вводили подкожно и через 2 недели самцам мышей линии Ts65Dn, возраст которых соответствовал возрасту применяемой в качестве контроля линии 2N. Анализ плазмы, полученной через 7 дней после введения каждой дозы, позволил определить титры антител в виде IgG к человеческому Ap42 в иммунизированных мышах как из Ts65Dn-, так и из 2№группы (данные не представлены). Титры IgG у мышей линии Ts65Dn, иммунизированных ACI-DS-02, существенно отличались от титров у мышей, иммунизированных ЗФР, в день 21 и 35 (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; P=0,01 и 0,05 соответственно). Таким образом, вакцина ACI-DS-02 обладает способностью разрушает самотолерантность к Ap на мышиной модели DS.
Титры IgM анализировали в плазме мышей, иммунизированных вакциной ACI-DS-02. Результаты, полученные с помощью ELISA, которые осуществляли с применением Ap42, продемонстрировали, что в иммунизированной Ts65Dn-группе титры IgM оказались выше, чем в группе, иммунизированной ЗФР, в день 7, день 35 и день 49 (однонаправленный дисперсионный анализ, анализ апостериорных сравнений Тьюки; P <0,01, P <0,05 и P <0,01 соответственно, данные не представлены).
Пример 9. Индуцированные ACI-DS-02 антитела к человеческому Ap распознают амилоидные бляшки при DS.
Эксперимент с использованием иммуноокрашивания продемонстрировал, что индуцированные ACI-DS-02 антитела связываются с амилоидными бляшками в образцах головного мозга людей с DS (фиг. 6). Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным с использованием 6E10, поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и с окрашиванием антителом, индуцированным ACI-24. Вакцина ACI-24 соответствует вакцине ACI-DS-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ACI-24, представляет собой последовательность человеческого Ap1-15, вакцина ACI-DS-01 содержит в качестве антигена последовательность мышиного Ap1-15 (три аминокислотных различия в двух указанных антигенах см. на фиг. 1). Никакого окрашивания не обнаружено, когда срез инкубировали с сывороткой мышей, иммунизированных ЗФР. Этот результат свидетельствует о том, что иммунизация с использованием вакцины ACI-DS-02 индуцирует образование антител, которые распознают амилоидные бляшки в головном мозге людей с DS.
Пример 10. ACI-DS-02 повышает способность к ассоциативному научению в тесте на условно-рефлекторную реакцию страха.
При оценке условно-рефлекторной реакции у мышей линии Ts65Dn, иммунизированных вакциной ACI-DS-02, выявлена тенденция к повышению уровней "замирания" после получения каждого условно-рефлекторного стимула (фиг. 7А). Повышенный уровень "замирания" значимо отличался от уровня у иммунизированных ЗФР мышей линии Ts65Dn только после третьего условно-рефлекторного стимула (CS3) (двусторонний дисперсионный анализ, оценка по продолжительности реакции, P <0,0001, тенденция для вакцины (P=0,09), апостериорный критерий Бонферрони, P=0,05 при CS3).
Известно, что процесс научения может опосредоваться механизмом, зависящим от синаптической пластичности (Johansen, 2011). Однако, известно, что ранее приобретенная память о страхе (контекстуальный сеанс, сеанс с подсказкой и сеанс по оценке торможения условного рефлекса) могут опосредоваться различными нейронными механизмами. Полученный результат позволяет предположить, что иммунизация с использованием ACI-DS-02 улучшает фазу обучения/выработки условно-рефлекторной реакции страха, во время которой происходит научение.
Пример 11. Иммунизация с использованием ACI-DS-03 индуцирует производство антител к человеческому Ap.
Четыре дозы ACI-DS-03 вводили подкожно и через 2 недели самцам мышей линии Ts65Dn, возраст которых соответствовал возрасту применяемой в качестве контроля линии 2N. Анализ плазмы, полученной через 7 дней после введения каждой дозы, позволил определить титры антител в виде IgG к человеческому Ap42 у иммунизированных мышей как из Ts65Dn-, так и из 2№группы (данные не представлены). Титры IgG у мышей линии Ts65Dn, иммунизированных ACI-DS-02, существенно отличались от титров у мышей, иммунизированных ЗФР, в день 21 (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; P=0,05). Таким образом, вакцина ACI-DS-03 обладает способностью разрушает самотолерантность к Ap на мышиной модели DS.
Титры IgM анализировали в плазме мышей, иммунизированных вакциной ACI-DS-03. Результаты, полученные с помощью ELISA, которые осуществляли с применением Ap42, продемонстрировали, что в иммунизированной Ts65Dn-группе титры IgM оказались выше, чем в группе, иммунизированной ЗФР, в день 7 и 49 (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; P <0,01, P <0,05 и P <0,01 соответственно, данные не представлены).
Пример 12. Индуцированные ACI-DS-03 антитела к человеческому Ap распознают амилоидные бляшки при DS.
Эксперимент с использованием иммуноокрашивания продемонстрировал, что индуцированные ACI-DS-03 антитела связываются с амилоидными бляшками в образцах головного мозга людей с DS (фиг. 8). Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным с использованием 6E10, поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и с окрашиванием антителом, индуцированным ACI-24.
Вакцина ACI-24 соответствует вакцине ACI-DS-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ACI-24, представляет собой последовательность человеческого Ap1-15, вакцина ACI-DS-01 содержит в качестве антигена последовательность мышиного Ap1-15 (три аминокислотных различия в двух указанных антигенах см. на фиг. 1). Никакого окрашивания не было обнаружено, когда срез инкубировали с сывороткой мышей, иммунизированных ЗФР. Этот результат свидетельствует о том, что иммунизация с использованием вакцины ACI-DS-03 индуцирует образование антител, которые распознают амилоидные бляшки в головном мозге людей с DS.
Пример 13. Инфракрасная спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения.
Проводили анализ образцов липосом в виде гидратированной D2O тонкой пленки, полученной из 15 мкл, высушенной на ZnSe-кристалле. Спектры получали с помощью спектрофотометра BRUKER TENSOR 27, предназначенного для ИК-спектрометрии с преобразованием Фурье (FTIR), снабженного охлаждаемым жидким азотом детектором из теллурида ртути-кадмия и связанного с устройством BioATR-ll. Для каждого спектра получали 2000 сканированных изображений с разрешением 2 см-1 с использованием чистого ATR-кристалла для получения фонового уровня, усредняли и подвергали FT-преобразованию. Верхний и нижний пределы частоты свертки составляли 4000 см-1 и 900 см-1. Камеру для образца постоянно продували высушенным воздухом и все измерения осуществляли при 25°C. Затем зарегистрированные спектры вырезали в области амидной полосы I, корректировали на фоновый уровень и метили. Для выявления перекрывающихся компонентов в широкой амидной полосе I, применяли методы сужения [с использованием второй производной и Фурье-самодеконволюции (FSD)]. На основе анализа главных выявленных полос с использованием следующих частотных диапазонов в D2O: p-складка -1613-1637 см-1, случайная спираль - 1637-1646 см-1, а-спираль/петли - 1646-1662 см-1, p-повороты - 16621682 см-1, антипараллельная p-складка - 1682-1698 см-1 были сделаны качественные заключения об основной вторичной конформации. Количественный анализ осуществляли путем подгонки кривой с помощью соответствующей прикладной программы, входящей в пакет программ OPUS, с использованием полос, идентифицированных в спектрах 2-й производной и FSD, в качестве исходных величин для индивидуальных компонентов. Предполагалось, что пики компонентов имели смешанную форму Гаусс-Лоренцовского типа. Итерационный процесс осуществляли следующим образом: фиксировали частоты и давали возможность варьироваться ширинам, интенсивностям и формам пиков, а затем при осуществлении второго итерационного процесса давали возможность варьироваться также и частотам. Оценки вторичной структуры осуществляли путем расчета % площади, соответствующей всей области амида I для каждой полосы вторичной структуры, исходя из предположения одинаковой абсорбционной способности различных компонентов.
Перечень ссылок
1. Antonarakis S.E., Lyle R., Dermitzakis E.T., Reymond A., Deutsch S.,
Chromosome 21 and down syndrome: from genomics to pathophysiology. Nat. Rev. Genet. 5, 2004, cc. 725-738.
2. Ballard C, Gauthier S., Corbett A., Brayne C, Aarsland D., Jones E., Alzheimer's disease. Lancet. 377, 2011, cc. 1019-1031.
3. Belichenko N.P., Belichenko P.V., Kleschevnikov A.M., Salehi A., Reeves R.H., MobleyW.C, The "Down syndrome critical region" is sufficient in the mouse model to confer behavioral, neurophysiological, and synaptic phenotypes characteristic of Down syndrome. JNeurosci. 29, 2009, cc. 5938- 5948.
4. Belichenko P.V., Kleschevnikov A.M., Salehi A, Epstein C.J., Mobley W.C., Synaptic and cognitive abnormalities in mouse models of Down syndrome: exploring genotype-phenotype relationships. J Сотр. Neurol. 504, 2007, cc. 329-345.
5. Bevins R.A., Besheer J., Object recognition in rats and mice: a one-trial non-matching-to-sample научение task to study 'recognation memory'. Nat. Protoc. 1, 2006, cc. 1306-1311.
6. Davisson M.T., Schmidt C, Reeves R.H., Irving N.G., Akeson E.C, Harris B.S., Bronson R.T., Segmental trisomy as a mouse model for Down syndrome. Prog. Clin. Biol. Res. 384, 1993, cc. 117-133.
2.
7. Deacon R.M., Rawlins J.N., T-maze alternation in the rodent. Nat. Protoc. 1, 2006, cc.7-12.
8. Gilman.S., Roller M., Black R.S., Jenkins L., Griffiths G., Fox N.C., Eisner L., Kirby L., Boada R.M., Forette F., Orgogozo J.M., Clinical effects of A{beta} immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology, 2005.
9. Hunter C.L., Bimonte-Nelson H.A., Nelson M., Eckman C.B., Granholm A.C., Behavioral and neurobiological markers of Alzheimer's disease in Ts65Dn mice: effects of estrogen. Neurobiol. Aging. 25, 2004, cc. 873-884.
10. Johansen I. P., Cain C.K., Ostroff L.E и LeDoux J.E., Molecular Mechanisms of Fear Learning and Memory. Cell 147, 2011.
11. Lee M., Bard F., Johnson-Wood K., Lee С, Ни K., Griffiths G., Black R.S., Schenk D., Seubert P., Abeta42 immunization in Alzheimer's disease generates Abeta N-terminal antibodies. Ann. Neurol. 58, 2005, cc. 430-435.
12. Lemere C.A., Blusztajn J.K., Yamaguchi H., Wisniewski Т., Saido T.C, Selkoe D.J., Sequence of deposition of heterogeneous amyloid beta- peptides and APO E in Down syndrome: implications for initial events in amyloid plaque formation. Neurobiol Dis. 3, 1996, cc. 16-32.
13. Liu F., Grundke-Iqbal I., Iqbal K., Oda Y., Tomizawa K., Gong C.X., Truncation and activation of calcineurin a by calpain I in Alzheimer disease brain. J. Biol. Chem. 280, 2005, cc. 37755-37762.
14. Liu F., Liang Z., Wegiel J., HwangY.W., Iqbal K., Grundke-Iqbal I., Ramakrishna N., Gong C.X., Overexpression of DyrkIA contributes to neurofibrillary degeneration in Down syndrome. FASEB J. 22, 2008, cc. 3224-3233.
15. Moncaster J.A., Pineda R., Moir R.D., Lu S., Burton M.A., Ghosh J.G., Ericsson M., Soscia S.J., Mocofanescu A., Folkerth R.D., Robb R.M., Kuszak J.R., Clark J.I., Tanzi R.E., Hunter D.G., Goldstein L.E., Alzheimer's disease amyloid-beta links lens and brain pathology in Down syndrome. PLoS One 5, 2010, el0659.
16. Monsonego A., Maron R., Zota V., Selkoe D.J., WeinerH.L., Immune hyporesponsiveness to amyloid beta-peptide in amyloid precursor protein transgenic mice: implications for the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease., изд-во Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 2001, cc. 10273-10278.
17. NetzerW.J., Powell C, Nong Y., Blundell J., Wong L., Duff K., FlajoletM., Greengard P., Lowering beta-amyloid levels rescues научение and memory in a Down syndrome mouse model. PLoS One 5, 2010, el0943.
18. Nicolau C, Greferath R., Balaban T.S., Lazarte J.E., Hopkins R.J., A liposome-based therapeutic vaccine against beta -amyloid plaques on the pancreas of transgenic NORBA mice, изд-во Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 2002, cc. 23322337.
19. O'Doherty A., Ruf S., Mulligan C, HildrethV., Errington M.L., Cooke S., Sesay A., Modino S., Vanes L., Hernandez D., Linehan J.M., Sharpe P.Т., Brandner S., Bliss T.V., Henderson D.J., Nizetic D., Tybulewicz V.L, Fisher E.M., An aneuploid mouse strain carrying human chromosome 21 with Down syndrome phenotypes, изд-во Science. 309, 2005, cc. 2033-2037.
20. PrasherV.P,. Down's syndrome, longevity, and Alzheimer's disease. Br. J Psychiatry. 162, 1993, c. 711 .
10.
21. Prasher V.P., Review of donepezil, rivastigmine, galantamine and memantine for the treatment of dementia in Alzheimer's disease in adults with Down syndrome: implications for the intellectual disability population. Int. J Geriatr. Psychiatry. 19, 2004, cc. 509-515.
22. Rafii M.S., The pulse of drug development for Alzheimer's disease. Rev. Recent. Clin. Trials, 5, 2010, cc. 57-62.
23. Saxe M.D., Battaglia F., Wang J.W., Malleret G., David D.J., Monckton J.E., Garcia A.D., Sofroniew M.V., Kandel E.R., Santarelli L., Hen R., Drew M R,. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus, изд-во Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2006, cc. 17501 -17506.
24. Stanton L.R, Coetzee R.H., Down's syndrome and dementia. B: Advances in Psychiatric Treatment. Ref Type: Generic, 10, 2004, cc. 50-58.
25. Stoltzner S.E., Grenfell T.J., Mori C, Wisniewski K.E., Wisniewski T.M., Selkoe D.J., Lemere C.A., Temporal accrual of complement proteins in amyloid plaques in Down's syndrome with Alzheimer's disease. Am. J. Pathol. 156, 2000, cc. 489-499.
26. Tapiola Т., Soininen H., PirttilaT., CSF tau and Abeta42 levels in patients with Down's syndrome. Neurology. 56, 2001, cc. 979-980.
27. Weiner H.L, Frenkel D., Immunology and immunotherapy of Alzheimer's disease. Nat. Rev. Immunol. 6, 2006, cc. 404-416.
28. Fernandez F., Morishita W., Zuniga E., Nguyen J., Blank M., Malenka R.C. и Garner CC, 2007.
29. Hanney M., Prasher V., Williams N., Jones E.L., Aarsland D., Corbett A., Lawrence D., Yu L.M., Tyrer S., Francis P.Т., Johnson Т., Bullock R. и Ballard C, Memantine for Dementia in Adults Older Than 40 Years With Down's Syndrome (MEADOWS): a Randomised, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. Lancet 379, 2012, cc. 528-536.
30. Salehi A., Delcroix J-D., Belichenko P.V., Zhan K., Wu C, Valletta J. C, Takimoto-Kimura R., Kleschevnikov A. M., Sambamurti K., Chung P.P., Xia W.,Villar A., Campbell A.W., Kulnane L.S., Nixon R.A., Lamb B.T., Epstein C.J., Stokin G.B., Goldstein L.S.B., Mobley W.C, Increased App Expression in a Mouse
Model of Down's Syndrome Disrupts NGF Transport and Causes Cholinergic Neuron
Degeneration, Neuron, 51, 2006, cc. 29-42.
31. Salehi A., Faizi M., Colas D., Valletta J., Laguna J., Takimoto-Kimura R., Kleschevnikov A., Wagner S. L., Aisen P., Shamloo M., Mobley W. C, Restoration Norepinephrine-Modulated Contextual Memory in a Mouse Model of Down Syndrome, Sci Transl Med 1, 2009, 7ral7.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение N-концевого Ap1-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, где антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у указанного индивидуума с синдромом Дауна еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
2. Применение по п.1, где указанные нарушения памяти и/или когнитивные нарушения представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнако
1.
мой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.
3. Применение по п.1, где указанные нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии у индивидуума с синдромом Дауна представляют собой нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии AD-типа.
4. Применение по п.1, где указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой:
(а) индивидуума от молодого до среднего возраста,
(б) индивидуума среднего возраста,
(в) индивидуума молодого возраста,
(г) индивидуума детского возраста.
5. Применение по п.4, где указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.
6. Применение по п.1, где антигенный пептид Ap модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты, связанной с N- и/или C-концом пептида.
7. Применение по п.6, где антигенный пептид Ap модифицирован с помощью:
а) 4 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида, или
б) 2 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с N- и/или C-концом пептида.
8. Применение по п.1 для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, не вызывающее воспалительной реакции.
9. Применение по любому из пп.1-7, где антигенный пептид представлен в виде композиции, содержащей антигенный пептид в терапевтически эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.
10. Применение по п.9, где композиция содержит адъювант.
11. Способ лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
12. Способ по п.11, в котором указанное нарушение или указанная аномалия представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.
13. Способ по п.11, предназначенный для улучшения сохранения или полного восстановления когнитивной способности у индивидуума с синдромом Дауна, предусматривающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10.
14. Способ по любому из пп.11-13, в котором указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой:
а) индивидуума от молодого до среднего возраста;
б) индивидуума среднего возраста;
в) индивидуума молодого возраста или
г) индивидуума детского возраста.
15. Способ по п.14, в котором указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.
16. Способ предотвращения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
15.
15.
15.
15.
15.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032494
032494
- 1 -
- 1 -
(19)
032494
032494
- 1 -
- 1 -
(19)
032494
032494
- 2 -
- 1 -
(19)
032494
032494
- 8 -
- 9 -
032494
032494
- 23 -
- 23 -
032494
032494
- 24 -
- 24 -
032494
- 26 -
032494
- 26 -
032494
032494
- 29 -
- 29 -