|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные ДНК-зонды, используемые для выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, имеющие следующий нуклеотидный состав: kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCG GCTAC-3', kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3', PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1, PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2. 2. Способ выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, включающий выделение ДНК из клинических образцов или суспензии штаммов, проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов, которые имеют следующие нуклеотидные составы: kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3', kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3', PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1, PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2, при этом режим амплификации 1 цикл 95°C - 15 мин; 45 циклов 95°C -15 с, 65°C - 30 с, а оценку результатов производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналам FAM (520 нм) и R6G (557 нм) и при наблюдении экспоненциального роста сигнала флуоресценции ПЦР по каналу R6G в диапазоне 18-38 цикл амплификации определяют наличие в образце ДНК Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные ДНК-зонды, используемые для выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, имеющие следующий нуклеотидный состав: kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCG GCTAC-3', kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3', PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1, PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2. 2. Способ выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, включающий выделение ДНК из клинических образцов или суспензии штаммов, проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов, которые имеют следующие нуклеотидные составы: kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3', kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3', PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1, PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2, при этом режим амплификации 1 цикл 95°C - 15 мин; 45 циклов 95°C -15 с, 65°C - 30 с, а оценку результатов производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналам FAM (520 нм) и R6G (557 нм) и при наблюдении экспоненциального роста сигнала флуоресценции ПЦР по каналу R6G в диапазоне 18-38 цикл амплификации определяют наличие в образце ДНК Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing.
Евразийское 032489 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201700085
(22) Дата подачи заявки 2017.02.03
(51) Int. Cl. C12Q1/68 (2006.01) C12N15/11 (2006.01)
(54) ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДНК-ЗОНДЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS КЛОНАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА 2-W148 ГЕНОТИПА BEIJING В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
(43) 2018.08.31
(96) 2017000005 (RU) 2017.02.03
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
ПРОБЛЕМ ЗДОРОВЬЯ СЕМЬИ И РЕПРОДУКЦИИ ЧЕЛОВЕКА" (RU)
(72) Изобретатель:
Огарков Олег Борисович, Синьков Вячеслав Владимирович, Жданова Светлана Николаевна, Рычкова Любовь Владимировна (RU)
(56) RU-C2-2528866 RU-C1-2562866
MOKROUSOV Igor et al. Russian "Successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. Journal of Clinical Microbiology, November 2012, Volume 50, Number 11, p. 3757-3759
ABD-ELSALAM Kamel A. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. African Journal of Biotechnology, May 2003, Vol. 2 (5), pp.
91-95
(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, микробиологии, генетике, лабораторной и молекулярной диагностике, и касается олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентных ДНК-зондов и способа выявления возбудителя туберкулеза генотипа Beijing клонального комплекса 2-W148 (CC2-W148) с использованием предлагаемых праймеров и зондов. Изобретение может использоваться для ДНК, выделенной из штаммов Mycobacterium tuberculosis, и для ДНК из мокроты, осадка мочи, ликвора, биопсий, аутопсий. Предложен способ определения CC2-W148 методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на мутацию 2541_2542delCA в гене kdpD. Способ отличается тем, что идентификация CC2-W148 проводится по уникальной делеции в kdpD, выявляемой специфическими праймерами kdpDF 5'- GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3' и kdpDR 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3' и флуоресцентно-мечеными зондами FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1 и R6G-5'-GGCGGGCTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2. Регистрацию производят по флуоресценции FAM (520 нм) и R6G (557 нм) при ПЦР-РВ. Присутствие CC2-W148 вызывает экспоненциальный рост флуоресценции по R6G между 18-38 циклами, при любом другом генотипе флуоресценция регистрируется по FAM между 18-38 циклами. Предложенное изобретение позволяет быстро, с высокой специфичностью выявлять CC2-W148 в исследуемом материале.
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, микробиологии, генной инженерии, клинической лабораторной диагностике, молекулярной диагностике, и может быть использовано для лабораторного определения штаммов микобактерий туберкулеза, относящихся к клональному комплексу 2-W148 генотипа Beijing. Предлагаемое изобретение может использоваться как для образцов ДНК выделенных из чистых культур Mycobacterium tuberculosis, так и для ДНК, выделенных из клинических образцов (мокроты, осадка мочи, спиномозговой жидкости, биопсий, аутопсий).
Возбудитель туберкулеза человека - Mycobacterium tuberculosis - имеет клональную структуру популяции, представленную отдельными генетическими семействами. При этом генетическое семейство (или генотип) Beijing характеризуется пандемическим распространением с наиболее тяжелым течением болезни. Показано разделение этого генотипа на семь клональных комплексов (clonal complexes, CC), доминирующих в различных регионах мира: CC1, CC2-W148, CC3, CC4, CC5, CC6, BL7 (Merker M., Blin С., Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249). Наиболее тяжелые формы туберкулеза вызывают субтипы CC1 и CC2-W148. Представители клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing (синонимы: CC2-W148 генотипа Beijing, субтип W148, клональный комплекс 2 W148) преобладают у больных с тяжелыми формами туберкулеза, демонстрируют высокую вирулентность (Вишневский Б.И. и др. Вирулентность микобактерий туберкулеза//Проблемы туберкулеза. - 2002, - №10, с. 33-36) и трансмиссивность (Mokrousov I et al. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: in search of informative variable-number tandem-repeat loci//J Clin Microbiol. 2008 Nov;46(11):3576-84), ассоциацию с лекарственной устойчивостью (Toungoussova О. et al. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia // J. Clin. Microbiol. - 2002. -Vol.40. - p.1930-1937).
Таким образом, своевременное выявление CC2-W148 генотипа Beijing на ранних этапах заболевания является важной составляющей диагностики туберкулеза и имеет предиктивный эффект на тактику лечения с учетом высокой вероятности развития множественной лекарственной устойчивости и широкой лекарственной устойчивости туберкулеза, а также рецидивов заболевания у пациентов, пораженных возбудителями клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing. С учетом клинической и эпидемиологической значимости клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing необходимо наличие доступного и быстрого метода его детекции. Однако до настоящего времени нет достаточно чувствительных, специфичных и при этом быстрых методов выявления микобактерий туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клиническом материале, не разработаны специфические праймеры, флуоресцентные ДНК-зонды, используя которые можно выявлять Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах. Поэтому разработка новых и усовершенствование существующих методов выявления микобактерий туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клиническом материале остается актуальной задачей.
Известен метод обнаружения штаммов субтипа W148 (метод типирования IS6110-RFLP), основанный на гибридизационном анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих инсерционный элемент IS6110 (Van Embden J. et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology//J. Clin. Microbiol. -1993. -Vol. 31. -p.406-409). Метод базируется на определении количества и локализации в геноме М. tuberculosis небольшого (около 1350 п.о.) мобильного генетического элемента - инсерционной последовательности IS6110, имеющей сайт рестрикции PvuII (Thierry D. et al. IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex//NAR. - 1990. - Vol.18(1). - p.188). Фрагменты IS6110 распределяются в кольцевой хромосоме М. tuberculosis хаотичным образом, а их число может варьировать от 0 до 26 копий на геном. В процессе обработки рестриктазой PvuII геномная ДНК М. tuberculosis распадается на несколько фрагментов, количество и длина которых зависит от числа IS6110 элементов и их локализации в геноме МТБ. Фрагменты разделяются при помощи гель-электрофореза и визуализируются методом Саузерн-блот гибридизации с мечеными зондами, комплементарными последовательности IS6110. Таким образом, для каждого штамма получается уникальный гибридизационный паттерн, в том числе и для представителей субтипа W148.
Однако данный способ обладает рядом серьезных недостатков - трудоемкость методики, необходимость использовать большое количество бактериальной массы, длительность процедуры анализа (до 40 дней), сложность обработки результатов. Поэтому данный метод неприменим для использования в практических бактериологических лабораториях.
Также известен способ выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing, основанный на определении генетического полиморфизма VNTR локусов генома М. tuberculosis, называемый MIRU-VNTR. Способ включает ПЦР амплификацию 24 участков генома возбудителя с последующим электрофоретическим анализом полученных результатов. Способ осуществляется следующим образом: изоляты с микробиологической среды Левенштейна-Иенсена собирают бактериологической петлей в полипропиленовые пробирки с крышкой объемом 1,5 мл. Экстракцию и очистку ДНК микобактерий производят стандартным методом путем обработки бактерий лизоциомом, протеина-зой К, цетилтриметиламмоний бромидом и додоцелсульфатом натрия для разрушения клеточной стенки
и вторичных метаболитов, протеинов и полисахаридов с последующей экстракцией ДНК с использованием фенола и хлороформа и осаждением в изопропаноле, который обеспечивает высокий выход высококачественной ДНК. MIRU-VNTR генотипирование проводят путем постановки проведения 24 ПЦР реакций с праймерами и в условиях, описанных в международном протоколе (http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/files/MIRU-VNTRtypingmanualv6.pdf, дата просмотра 01.06.2016 г). После проведения ПЦР размер полученных ампликонов оценивают с помощью электрофореза в 3% агарозе по сравнению с референс-ладером для определения молекулярных размеров полученных ампликонов. Заключение о принадлежности субтипу CC2-W148 может быть сделано после сравнения полученного 24-х цифрового профиля с профилями клонального комплекса 2-W148, приведенными в статье Merker M., Blin С, Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the Mycobacte-rium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249.
Недостатки данного способа: может проводиться только с чистыми культурами, не позволяет выявлять ДНК исследуемого субтипа в клинических образцах, таких как мокрота, ликвор, операционные био-птаты, кроме того, способ длителен, сложен, трудоемок, т.к. требует проведения ПЦР и электрофореза 24 реакций.
Известны олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентно-меченый зонд и способ определения ми-кобактерий туберкулеза генотипа Beijing, основанный на определении вставки элемента IS6110 в локусе генома dnaA-dnaN, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с использованием двух
специфических праймеров 5'-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA и 5'-CGCCGGGACTGTATGAGTCT и флуоресцентно-меченого зонда R6G-5'-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCA-3'-BHQ2. Оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналу R6G с длиной волны 555 нм, причем при наличии в образце ДНК штамма микобактерий туберкулеза генотипа Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР при анализе чистой ДНК происходит между 10-15 циклами, а при анализе клеточных лизатов между 15 и 20 циклами. (Патент РФ № 2528866, опубликовано 20.09.2014, Бюл.
№ 26).
Данный метод позволяет определить генотип Beijing, однако не позволяет устанавливать принадлежность к клональному комплексу 2-W148. Кроме того, способ не позволяет выявлять микобактерии туберкулеза генотипа Beijing в клинических образцах.
Задача изобретения - создание высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для выявления клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing, разработка быстрого, чувствительного, специфичного способа выявления клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, повышение доступности способа.
Поставленная задача решается тем, что для выявления клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing были использованы разработанные (сконструированные) нами синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные ДНК-зонды, которые имеют следующие нуклеотидные последовательности: праймеры kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3'(SEQ ID NO: 1) и kdpD R 5'-
TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3'(SEQ ID NO: 2), флуоресцентно-меченые зонды PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1 (SEQ ID NO: 3), PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2 (SEQ ID NO: 4).
Задача решается также тем, что способ выявления клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing, включает выделение ДНК из клинических образцов или суспензии штаммов, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и флуоресцентными ДНК-зондами, при этом праймеры имеют нуклеотидные последовательности kdpD F 5'- GGCGGCACGAT-
TTCGGCTAC-3' и kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3', флуоресцентно-меченые зонды PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1; PROBE48 R6G-5'-GGCGGG
CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2, в режиме амплификации (1 цикл 95°C - 15 мин; 45 циклов 95°C - 15 с, 65°C - 30 с) и оценку результатов. Оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналам FAM (520 нм) и R6G (557 нм). При наличии в образце ДНК штамма ми-кобактерий туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в ПЦР в режиме реального времени наблюдается экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР по каналу R6G в диапазоне 18-38 цикл амплификации.
Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы показал, что предлагаемое техническое решение отличается от других решений в данной и смежных областях. Так авторами не найдены олиго-нуклеотидные праймеры, флуоресцентные ДНК-зонды и способы выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing, которые включали бы предлагаемые режимы. А именно сконструированные авторами олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентные ДНК-зонды и предлагаемые режимы способа выявления позволяют быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие в исследуемом образце Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing. Предлагаемый способ основан на выявлении делеции двух нуклеотидов 2541_2542delCA, приводящей к сдвигу рамки считывания в гене kdpD.
Таким образом,предлагаемый способ отличается тем, что для идентификации клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing использована уникальная делеция в гене kdpD с использованием двух
специфических праймеров, kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCG GCTAC-3' и kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3', и двух флуоресцентно-меченых зондов, PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ и PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2.
Немаловажным отличием от ранее предложенных методов являются следующие параметры: предлагаемый способ может использоваться как для образцов ДНК выделенных из чистых культур Mycobac-terium tuberculosis, так и для ДНК, выделенных из клинических образцов (мокроты, осадка мочи, спинномозговой жидкости, хирургического материала), в основы подхода положена ПЦР в реальном времени, что уменьшает вероятность кросс-контаминации при лабораторной диагностике. Метод может быть использован не только для генотипирования, но и для выявления возбудителя туберкулеза в клиническом материале.
Способ выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, включающий использование предлагаемых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов, может быть использован в любой диагностической лаборатории, оснащенной амплификатором с детекцией в реальном времени.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию "промышленная применимость".
Раскрытие изобретения
Задача выявления микобактерий туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing решается посредством применения полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием
двух специфических праймеров kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCG GCTAC-3' и kdpD R 5'-
TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3' и двух флуоресцентно-меченых зондов, содержащих участки "замкнутых нуклеотидов" (LNA): PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1 и PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2. Режимы амплификации ДНК на амплификаторе Light-Cycler Nano (Roche Life Science): 1 цикл 95°C - 15 мин, 45 циклов 95°C -15 с, 65°C - 30 с. Считывание флуоресценции при 65°C.
Увеличение сигнала выше порогового по каналу R6G означает выявление специфической делеции двух нуклеотидов 2541_2542delCA, приводящей к сдвигу рамки считывания в гене kdpD. Важно отметить, что разрушение kdpD гена, произошедшее вследствие природной мутации в штаммах клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing, является суррогатным маркером повышенной вирулентности штамма, поскольку искусственная делеция этого гена ведет к повышению вирулентности микобактерий туберкулеза на модели лабораторных животных (Parish T, Smith DA, Kendall S, Casali N, Bancroft GJ, Stoker NG. Deletion of two-component regulatory systems increases the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 2003 Mar; 71(3): 1134-40.).
Для выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2 -W148 генотипа Beijing в клинических образцах были использованы следующие сконструированные нами специфические праймеры и флуоресцентные ДНК-зонды:
kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCG GCTAC-3';
kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3';
PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1;
PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2.
Химический синтез праймеров и зондов осуществлялся по нашему заказу в НПФ "Синтол" (Москва), там же определялась концентрация олигонуклеотидов. Для работы использовалось разведение оли-гонуклеотидных праймеров и зондов из лиофильно-высушенного материала. Зонд PROBE37 мечен флуо-рофором FAM по 5'-концу и гасителем флуоресценции RTQ1 по 3'-концу. Детекцию сигнала проводили по "зеленому" (FAM/Green) каналу (длина волны 520 нм). Зонд PROBE48 мечен флуорофором R6G по 5'-концу и гасителем флуоресценции BHQ2 по 3'-концу. Детекцию сигнала проводили по "желтому" (R6G/Yellow) каналу детекции в термоциклере Ro-torGene6000 (длина волны 557 нм).
Указанные праймеры и зонды были подобраны исходя из результатов анализа распространения специфической делеции двух нуклеотидов 2541_2542delCA, приводящей к сдвигу рамки считывания в гене kdpD среди 1000 геномов возбудителя туберкулеза, полученных из открытой базы данных GMTV (http://mtb.dobzhanskycenter.org/).
Для оценки специфичности выбранных праймеров и зондов проводили исследование специфичности разработанной тест-системы на 450 ДНК штаммов туберкулеза, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока. Кроме того, сконструированные нуклеотидные последовательности анализировались с помощью программы BLAST. Было установлено отсутствие перекрестных реакций при использовании этих праймеров и зондов с ДНК других видов микроорганизмов и человека.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Выделение ДНК из клинических образцов.
1.1. К клиническому образцу или суспензии штаммов М. tuberculosis добавляют 2-3 объема 1% раствора CTAB (Sigma, #855820, Hexadecyltrimethylammonium bromide) в 50% изопропиловом спирте (ЧДА). Встряхивают. Такая обработка образцов позволяет произвести разжижение образца и стабилизировать внеклеточную ДНК образца, за счет взаимодействия положительно заряженной молекулы CTAB с отрицательно заряженной молекулой ДНК. В качестве клинических образцов использовались мокрота, ликвор, биопсийный материал (содержимое лимфоузлов), суспензия штаммов М. tuberculosis.
1.2. Далее стабилизированный клинический образец в объеме 3-5 мл центрифугируют в 50 мл полипропиленовых пробирках с крышкой в настольной центрифуге в течение 15 мин с центробежным ускорением не менее 4000g. Супернатант декантируется, осадок используется для выделения тотальной
ДНК.
1.3. ДНК выделяется набором ДНК-сорб-В (Интерлабсервис, Москва) согласно протоколу производителя.
К полученному осадку добавляют лизирующий реагент из расчета на 100 мкл осадка на 350 мкл ли-зирующего реагента. В случае если объем полученного осадка превышает 100 мкл, объем лизирующего реагента увеличивается пропорционально.
Полученный лизат пипеткой переносят в полипропиленовую пробирку с крышкой объемом 1,5 мл. Затем в пробирку вносят 25 мкл сорбента универсального, ресуспендируют на вортексе 10 с при 3000 об/мин и оставляют при комнатной температуре на 5 мин. Сорбент осаждают центрифугированием в течение 30 с при 5000 об/мин. Добавляют в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осаждают сорбент универсальный центрифугированием при 5000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель. Добавляют в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, центрифугируют 30 с при 10000 об/мин на микроцентрифуге. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасы-ватель. Повторяют процедуру отмывки, а именно добавляют в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, центрифугируют 30 с при 10000 об/мин на микроцентрифуге. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасы-ватель. Помещают пробирки с пробами в термостат при температуре 65°C на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального, при этом крышки пробирок должны быть открыты. В пробирки добавляют по 70 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешивают на вортексе. Помещают в термостат при температуре 65°C на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Центрифугируют пробирки с пробами на максимальных оборотах (не менее 4000G) микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
2. Идентификация (выявление) клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing.
2.1. Материал для выявления - тотальная ДНК выделенная, как описано выше, из клинического образца или чистой культуры.
2.2. Условия проведения ПЦР в реальном времени (конечная концентрация реагентов).
К 12,5 мкл пробы (8-10 нг ДНК), полученной выделением с помощью набора ДНК-сорб-В (как описано выше), добавляют 12,5 мкл смеси, содержащей 2-кратный буфер для ПЦР (Интерлабсервис); прай-мер kdpDF 5'-GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3' 0,5 мМ, праймер kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3' 0,5 мМ, зонд PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1 0,1 мМ, зонд PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2 0,1 мМ, сульфат магния (Интерлабсервис) 2,5 мМ, смесь четырех 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов (Интерлабсервис) 200 мкМ, TaqF полимераза - 0,3 ед. Конечный объем реакционной смеси 25 мкл.
2.2. Условия проведения ПЦР в реальном времени (режим амплификации):
1 цикл 95°C - 15 мин, 45 циклов: 95°C - 15 с, 65°C - 30 с. Оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналам FAM (520 нм) и R6G (557 нм). Считывание флуоресценции
при 65°C.
В качестве положительной контрольной используют ДНК типичного штамма CC2-W148 Beijing, определенного методом MIRU-VNTR по 24 локусам. В качестве положительного контроля на штаммы,
отличные от штамма CC2-W148 Beijing, использовали ДНК генотипов LAM, Ural, Haarlem, определенные методом MIRU-VNTR по 24 локусам. В каждой серии исследований используется два отрицательных контроля. 1 отрицательный контроль выделения, для этого ПЦР проводят с образцом, представляющим собой стерильную дистиллированную воду, проведенную через все этапы выделения ДНК (Бланк-контроль). 2 отрицательный контроль реакционной смеси, представляющий собой стерильную дистиллированную воду, добавленную в реакцию вместо ДНК. 3. Оценка результатов.
ПЦР в реальном времени проводят на амплификаторе LightCycler Nano (Roche Life Science) или любом другом пригодном для детекции флуорофоров. При наличии в образце ДНК штамма микобакте-рий туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в ПЦР в режиме реального времени наблюдается экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР по каналу R6G в диапазоне 18-38 цикл амплификации, а при анализе образца, содержащего любой другой генотип или субтип Мусо-bacterium tuberculosis, рост сигнала флуоресценции ПЦР происходит по каналу FAM между 18-38 циклами амплификации. Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам
- анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу FAM регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для М. tuberculosis (за исключением CC2-W148 генотипа Beijing), по каналу R6G-фрагмента ДНК, специфического для CC2-W148 генотипа Beijing. Результаты интерпретируют по наличию (отсутствию) пересечения нормализованной кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне (как правило, 0,1) пороговой линией, что соответствует наличию (отсутствию) значения порогового цикла Ct.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1. Брали мокроту от больного фиброкавернозным туберкулезом в объеме 2 мл и помещали в пробирку с винтовой крышкой, К исследуемой мокроте добавляли 4 мл 1% раствора CTAB (Sigma, #855820, Hexadecyltrimethylammonium bromide) в 50% изопропиловом спирте (ЧДА). Встряхивали на вортексе в течение 10 с при 3000 об/мин. Стабилизированный клинический образец в объеме 6 мл центрифугировали в той же пробирке в настольной центрифуге 15 мин с центробежным ускорением 4000g. Супернатант сливали, осадок объемом 200 мкл заливали 700 мкл лизирующего раствора из набора ДНК-сорб-В (Интерлабсервис, Москва). Полученный лизат в объеме 900 мкл пипеткой переносили в полипропиленовую пробирку с крышкой объемом 1,5 мл. Затем в пробирку вносили 25 мкл сорбента универсального, ресуспендировали на вортексе 10 с при 3000 об/мин и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Затем сорбент осаждали центрифугированием в течение 30 с при 5000 об/мин. Удаляли супер-натант. Добавляли в пробу 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешивали на вортексе до полного ре-суспендирования сорбента универсального. Осаждали сорбент универсальный центрифугированием при 5000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удаляли надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель. Добавляли в пробу 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, центрифугировали в течение 30 с при 5000 об/мин на микроцентрифуге. Удалили надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель.
Повторяли процедуру отмывки, а именно добавляли в пробу 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, центрифугировали в течение 30 с при 5000 об/мин на микроцентрифуге. Удалили надосадочную жидкость. Помещали пробирку с открытой крышкой в термостат при температуре 65°C на 5 мин для подсушивания сорбента универсального. Затем в пробирку добавляли 70 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешали на вортексе. Помещали в термостат при температуре 65°C на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Затем центрифугировали пробирку на максимальных оборотах микроцинтрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Проба готова к постановке ПЦР.
К 12,5 мкл пробы (8-10 нг ДНК), полученной выделением с помощью набора ДНК-сорб-В, как описано выше, добавили 12,5 мкл смеси, содержащей 2-кратный буфер для ПЦР (Интерлабсервис); праймер kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3' 0,5 мМ; праймер kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3' 0,5 мМ; зонд PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1 0,1 мМ, PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2 0,1 мМ; сульфат магния (Интерлабсервис) 2,5 мМ, смесь четырех 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов (Интерлабсервис) 200 мкМ, TaqF полимераза - 0,3 ед. Конечный объем реакционной смеси
- 25 мкл. Провели ПЦР при условиях: 1 цикл 95°C - 15 мин, 45 циклов 95°C - 15 с, 65°C - 30 с. Выявили нарастание роста флюоресценции по каналу R6G (557 нм) при полном отсутствии сигнала по каналу FAM (520 нм). Резюмировали обнаружение в исследуемой мокроте ДНК микобактерии туберкулеза кло-нального комплекса 2-W148 генотипа Beijing.
Для подтверждения полученного результата из мокроты были выделены штаммы, которые были подвергнуты процедуре MIRU-VNTR генотипирования по 24 локусам и идентификации полученных профилей согласно таблицам, опубликованным Merker et al. (Merker M., Blin С., Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249). В результате генотипирования была определена
принадлежность штамма к CC1 генотипа Beijing. После сравнения полученного 24-цифрового профиля с профилями клонального комплекса 2-W148, приведенными в статье Merker et al., был сделан вывод о принадлежности исследуемого штамма к CC2-W148 генотипа Beijing.
Пример 2. Брали ликвор от больного туберкулезным менингитом в объеме 1 мл. К исследуемому материалу добавляли 2 мл 1% раствора CTAB (Sigma, #855820, Hexadecyltrimethylammonium bromide) в 50% изопропиловом спирте (ЧДА). Встряхивали на вортексе в течение 10 с при 3000 об/мин. Стабилизированный клинический образец в объеме 3 мл центрифугировали в течение 15 мин с центробежным ускорением 4000g. Супернатант сливали, осадок объемом 100 мкл заливали 350 мкл лизирующего раствора из набора ДНК-сорб-В (Интерлабсервис, Москва). Полученный лизат в объеме 450 мкл пипеткой переносили в полипропиленовую пробирку с крышкой объемом 1,5 мл. Затем в пробирку вносили 25 мкл сорбента универсального, ресуспендировали на вортексе 10 с при 3000 об/мин и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Сорбент осаждали центрифугированием в течение 30 с при 5000 об/мин.
Добавляли в пробу 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешивали на вортексе до полного ресус-пендирования сорбента универсального. Осаждали сорбент универсальный центрифугированием при 5000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удаляли надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель. Добавляли в пробу 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, центрифугировали 30 с при 5000 об/мин на микроцентрифуге. Удалили надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель.Повторяли процедуру отмывки, а именно добавляли в пробу 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, центрифугировали 30 с при 5000 об/мин на микроцентрифуге. Удаляли надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель. Помещали пробирку с пробами с открытой крышкой в термостат при температуре 65°C на 5 мин для подсушивания сорбента универсального.
В пробирку с пробой добавляли 70 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешивали на вортексе. Помещали пробирку с пробой в термостат при температуре 65°C на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Затем центрифугировали пробирку на максимальных оборотах микроцинтрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Проба готова к постановке ПЦР.
К 12,5 мкл пробы (8-10 нг ДНК), полученной выделением с помощью набора ДНК-Сорб, добавили 12,5 мкл смеси, содержащей 2-кратный буфер для ПЦР (Интерлабсервис); праймер kdpDF 5'-
GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3' 0,5 мМ; праймер kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3' 0,5 мМ; зонд PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1 0,1 мМ; PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2 0,1 мМ, сульфат магния (Интерлабсервис)
2,5 мМ, смесь четырех 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов (Интерлабсервис) 200 мкМ, TaqF полимераза - 0,3 ед. Конечный объем реакционной смеси 25 мкл. Провели ПЦР при следующих условиях: 1 цикл 95°C - 15 мин; 45 циклов 95°C - 15 с, 65°C - 30 с. Выявили нарастание роста флюоресценции по каналу FAM (520 нм). при полном отсутствии сигнала по каналу R6G (557 нм). Резюмировали обнаружение в исследуемом ликворе ДНК микобактерии туберкулеза, не относящейся к CC2-W148 генотипа Beijing.
Дополнительно из ликвора были выделены штаммы, которые были подвергнуты процедуре MIRU-VNTR генотипирования по 24 локусам и идентификации полученных профилей согласно таблицам, опубликованным Merker et al. (Merker M., Blin C., Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249). В результате генотипирования была определена принадлежность штамма к CC1 генотипа
Beijing.
Пример 3. Апробацию предлагаемого способа обнаружения штаммов М. tuberculosis, относящихся к клональному комплексу 2-W148 генотипа Beijing, проводили на коллекции из 450 образцов геномной ДНК штаммов М. tuberculosis. Все образцы были подвергнуты ранее генотипированию по 24 локусам MIRU-VNTR в ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ, Иркутск. Профили генотипа Beijing были определены на принадлежность к клональным комплексам CC1, CC2-W148, CC3, CC4, CC5, CC6, BL7 согласно таблицам, опубликованным Merker et al. (Merker M., Blin С, Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249). Профили штаммов, принадлежащих другим семействам, определены по открытым базам данных SITVIT (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/query) и MIRUVNTRplus (http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces). Среди тестируемых штаммов имелись следующие: 171 образец клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing, 114 образцов клонального комплекса CC1 генотипа Beijing, 51 образец генотипа LAM, 45 образцов генотипа Ural, 69 образцов с уникальными профилями (Orphan), не принадлежащих ни к одному из известных эпидемических генотипов. При этом результаты анализа обоими методами полностью совпали. Таким образом, предлагаемый способ показал 100% специфичность определения штаммов микобактерий туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing.
Пример 4. Апробацию предлагаемого способа обнаружения ДНК штаммов М. tuberculosis, относящихся к клональному комплексу 2-W148 генотипа Beijing, проводили на 78 клинических образцах, включавших 69 образцов мокроты, 6 образцов ликвора, 3 биопсийных образца, полученных в ОГБУЗ
Иркутской областной клинической туберкулезной больнице. Параллельно клинические образцы были исследованы на наличие ДНК М. tuberculosis на генетическом анализаторе GeneXpert GXXVI-16-L (США). При исследовании на анализаторе GeneXpert 69 образцов мокроты 27 были положительны на ДНК М. tuberculosis, a 42 отрицательны. Все образцы ликвора были отрицательны, среди 3 биопсийных образцов один был положительным при исследовании на анализаторе GeneXpert. Исследование, проведенное предлагаемым методом, выявило 14 образцов, содержащих ДНК CC2-W148 генотипа Beijing и 12 образцов, содержащих ДНК других генотипов или субтипов. Все отрицательные образцы при исследовании на генетическом анализаторе GeneXpert были отрицательны при исследовании предлагаемым способом. Один образец положительный при исследовании на генетическом анализаторе GeneXpert был отрицательным по отношению как к ДНК клонального комплекса CC2-W148 генотипа Beijing, так и по отношению к другим генотипам. Таким образом, чувствительность предлагаемого метода относительно ре-ференсного исследования на генетическом анализаторе GeneXpert составила 98,6%.
В дальнейшем от 12 пациентов из 14, у которых была обнаружена в клинических образцах ДНК CC2-W148 генотипа Beijing, выделены штаммы, которые были подвергнуты процедуре MIRU-VNTR генотипирования по 24 локусам и идентификации полученных профилей согласно таблицам, опубликованным Merker et al.(Merker M., Blin С., Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249). Все культуры были отнесены к субтипу CC2-W148. От 9 пациентов из 12, у которых была обнаружена в клинических образцах ДНК, не относящаяся к CC2-W148 генотипа Beijing, были выделены штаммы, которые были подвергнуты процедуре MIRU-VNTR генотипирования по 24 локусам и идентификации полученных профилей согласно таблицам, опубликованным Merker et al. (Merker M., Blin С., Mona S., Duforet-Frebourg N., Lecher S., Willery E., et al., Evolutionary history and global spread of the My-cobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat. Genet. 2015; 47(3):242-249). Все культуры были отнесены к другим генотипам и субтипам, отличным от CC2-W148. В частности, 4 штамма принадлежали генотипу Beijing клонального комплекса 1, 3 штамма относились к генотипу LAM, 1 к генотипу Ural и 1 штамм имел уникальный, не классифицируемый MIRU-VNTR профиль.
Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой специфичностью выявлять микобактерии туберкулеза клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в исследуемом материале, в том числе в клинических образцах.
Преимущества предлагаемого способа:
сокращение времени исследования (один день от забора материала); простая, однозначная и автоматизированная интерпретация результатов;
возможность экспресс-диагностики, способ позволяет проводить быстрый анализ большого количества образцов для оценки их принадлежности к CC2-W148 генотипа Beijing с целью раннего предупреждения возможных неблагоприятных исходов лечения туберкулеза;
возможность использования для проведения исследования клинических образцов (мокрота, ликвор и т.д.) и штаммов;
доступность способа, т.е. возможность применения способа в бактериологических лабораториях.
Перечень последовательностей
SEQUENCE LISTING
<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение"Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека"
Federal State Public Scientific Institution "Scientific Oentre for Family Health and Human Reproduction Problems"
<120> Олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентныеДНК-зонды и способ выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2 - W148 генотипа Beijing в клинических образцах <140> 201700085 <141> 2017.03.03 <160> 4
<210> 1 <211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер kdpDF1 для амплификации фрагмента генома микобактерии туберкулеза
<400> 1
ggcggcacgatttcggctac 20
<210> 2 <211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер kdpDF2 для амплификации фрагмента генома микобактерии туберкулеза
<400> 2
tcgtcgtcaatcaccaagacga 22
<210> 3 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид, модифицированный LNA
<220>
<221> модифицированное основание <222>
<223> LNA-цитозин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)..(14)
<223> LNA-тимин
<400> 3
ggcgggctcacagtggtgatc 21
<210> 4 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид, модифицированный LNA
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> LNA-гуанин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (21)..(21)
<223> LNA-аденин
<400> 4
ggcgggctcagtggtgatcgat 22
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные ДНК-зонды, используемые для выявления My-cobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, имеющие следующий нуклеотидный состав:
kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCG GCTAC-3',
kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3',
PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1,
PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2.
2. Способ выявления Mycobacterium tuberculosis клонального комплекса 2-W148 генотипа Beijing в клинических образцах, включающий выделение ДНК из клинических образцов или суспензии штаммов, проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов, которые имеют следующие нуклео-тидные составы:
kdpD F 5'-GGCGGCACGATTTCGGCTAC-3',
kdpD R 5'-TCGTCGTCAATCACCAAGACGA-3',
PROBE37 FAM-5'-GGCGGGCTCA(LNA-C)AG(LNA-T)GGTGATC-3'-RTQ1,
PROBE48 R6G-5'-GGCGGG CTCA(LNA-G)TGGTGATCG(LNA-A)T-3'-BHQ2,
при этом режим амплификации 1 цикл 95°C - 15 мин; 45 циклов 95°C -15 с, 65°C - 30 с, а оценку результатов производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналам FAM (520 нм) и R6G (557 нм) и при наблюдении экспоненциального роста сигнала флуоресценции ПЦР по каналу R6G в диапазоне 18-38 цикл амплификации определяют наличие в образце ДНК Mycobacterium tuberculosis клонально-го комплекса 2-W148 генотипа Beijing.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032489
- 1 -
(19)
032489
- 1 -
(19)
032489
- 2 -
(19)
032489
- 9 -
032489
- 9 -
|
