EA 32482B1 20190628

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032482b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, при этом указанный способ включает следующие стадии: проведение анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем приведения образца в контакт с меткой и с праймером, который может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, при этом праймер иммобилизован на твердой фазе и является молекулой нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну из структур, представленную формулами (16) и (16b), метка ковалентно связана с праймером так, что является частью праймера, метка представляет собой фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, и метка не излучает свет, когда праймер не гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, тогда как если праймер гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, метка излучает свет, анализ осуществляют путем детекции светового излучения из метки, вызванного гибридизацией праймера с нуклеиновой кислотой-мишенью, и нуклеиновую кислоту-мишень, которая гибридизована с праймером, удаляют путем промывания, праймер снова гибридизуется с другой нуклеиновой кислотой-мишенью, и снова осуществляют анализ путем детекции светового излучения из метки где в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или остов искусственного основания нуклеиновой кислоты; Е является (i) атомной группой, имеющей остов дезоксирибозы, остов рибозы или структуру, полученную из одного из этих сахаров, или (ii) атомной группой, имеющей пептидную структуру или пептоидную структуру; каждый из Z ¹¹ и Z ¹² является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, и они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга; каждый из L ¹ , L ² и L ³ является линкером (соединяющий атом или соединяющая атомная группа), длина их основной цепи (число атомов в основной цепи) является произвольной, каждый из L ¹ , L ² и L ³ может содержать или может не содержать в основной цепи каждый из атомов С, N, О, S, Р и Si, каждый из L ¹ , L ² и L ³ может содержать или может не содержать в основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира, и L ¹ , L ² и L ³ могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга; D представляет собой CR, N, Р, Р=O, В или SiR и R является атомом водорода, алкильной группой или произвольным заместителем; b является одинарной связью, двойной связью или тройной связью; или, альтернативно, в формулах (16) и (16b) каждый из L ¹ и L ² является линкером, L ³ , D и b могут отсутствовать и L ¹ и L ² могут быть напрямую связаны с В при условии, что в формуле (16) Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S; и в формуле (16b) E является атомной группой, описанной в подпункте (ii), где праймер гибридизуют с нуклеиновой кислотой-мишенью путем приведения праймера в контакт с образцом, тем самым вызывая реакцию амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, и через некоторое время осуществляют анализ нуклеиновой кислоты-мишени путем последующего измерения степени амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в реакции амплификации.

2. Способ по п.1, согласно которому имеются две или более разновидности нуклеиновых кислот-мишеней и соответствующие нуклеиновые кислоты-мишени детектируют раздельно.

3. Способ по п.1 или 2, согласно которому используются две или более разновидностей праймеров.

4. Способ по любому из пп.1-3, согласно которому поверхность твердой фазы, на которой иммобилизован праймер или зонд, является плоской поверхностью, плоской поверхностью чипа, сферической поверхностью или трехмерной поверхностью.

5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому поверхность твердой фазы покрыта покрытием для уменьшения фона.

6. Способ по п.5, согласно которому покрытие для уменьшения фона осуществляется путем прививочной полимеризации.

7. Способ по любому из пп.1-6, согласно которому в формулах (16) и (16b) длина основной цепи (число атомов основной цепи) каждого из L ¹ , L ² и L ³ является целым числом 2 или более.

8. Способ по любому из пп.1-7, согласно которому в формулах (16) и (16b) каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо представляет собой группу, полученную из любого из следующих красителей: тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина, а также их производных.

9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул (7)-(9): где X ¹ и X ² являются S, О или Se; n'' является 0 или положительным целым числом; каждый из R ¹ -R ¹⁰ и R ¹³ -R ²¹ независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей алкильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой; один из R ¹¹ и R ¹² является связывающей группой, которая связана с L ¹ или L ² в формулах (16) и (16b), а другой является атомом водорода или низшей алкильной группой; когда множество R ¹⁵ присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга; когда множество R ¹⁶ присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга; X ¹ , X ² и R ¹ -R ²¹ в Z ¹¹ и X ¹ , X ² и R ¹ -R ²¹ в Z ¹² могут соответственно быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.

10. Способ по п.9, согласно которому в формулах (7)-(9) в R ¹ -R ²¹ низшая алкильная группа является линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 6 и низшая алкоксигруппа является линейной или разветвленной алкоксигруппой с числом атомов углерода от 1 до 6.

11. Способ по п.9 или 10, согласно которому в формулах (7)-(9) в R ¹¹ и R ¹² соединяющая группа является полиметиленовой карбонильной группой с числом атомов углерода 2 или более и она связана с L ¹ или L ² в формулах (16) и (16b) во фрагменте карбонильной группы.

12. Способ по любому из пп.9-11, согласно которому каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо является атомной группой, представленной формулой (7) или (8), и Z ¹¹ и Z ¹² , представленные формулой (7) или (8), являются группой, представленной следующими формулами (19) или (20): где X ¹ , R ¹ -R ¹⁰ , R ¹³ и R ¹⁴ и R ¹¹ и R ¹² являются идентичными таковым в формулах (7)-(9).

13. Способ по п.12, согласно которому каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19), где X ¹ является S; R ¹ -R ¹⁰ являются атомами водорода; один из R ¹¹ и R ¹² является связывающей группой, которая связана с L ¹ или L ² в формулах (16) и (16b), а другой является метильной группой.

14. Способ по п.12, согласно которому каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19), где X ¹ является S; R ¹ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁹ и R ¹⁰ являются атомами водорода; R ² , R ³ и R ¹² являются метильными группами; R ⁸ является атомом галогена; R ¹¹ является соединяющей группой, которая связана с L ¹ или L ² в формулах (16) и (16b).

15. Способ по п.9, согласно которому каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (7), где X ¹ является S; n является 1; R ¹ -R ¹⁰ , R ¹⁵ , R ¹⁶ и R ¹⁷ являются атомами водорода; R ¹¹ является связывающей группой, которая связана с L ¹ или L ² в формулах (16) и (16b); и R ¹² является метильной группой.

16. Способ по п.9, согласно которому каждый из Z ¹¹ и Z ¹² независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул: где в каждой из приведенных выше химических формул n является целым положительным числом.

17. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила).

18. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой 2-амино-6-(N,N-диметиламино)пурин пиридин-2-он, 5-метилпиридин-2-он, 2-амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо[(4,5)-b]пиридин, 5-йодо-2-оксо(1Н)пиридин 2-оксо(1Н)пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин, 7-(2-тиенил)имидазо[4,5-b]пиридин, бромотимин, азааденин или азагуанин.

19. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой Py, Py der., Pu или Pu der., при этом Py является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 1 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 5 в 6-членном кольце, представленном следующей формулой (11): Py der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного кольца Py замещен атомом N, С, S или О и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель; Pu является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 9 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 8 в конденсированном кольце, представленном следующей формулой (12): и Pu der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного кольца Pu замещен атомом N, С, S или О и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель.

20. Способ по любому из пп.1-19, согласно которому структура, представленная формулой (16), является структурой, представленной следующей формулой (16-1) или (16-2), и структура, представленная формулой (16b), является структурой, представленной следующей формулой (16b-1) или (16b-2): где в формулах (16-1), (16-2), (16b-1) и (16b-2) l, m и n' являются произвольными, l, m и n' могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, каждый из l, m и n' может в своей основной цепи содержать, а может и не содержать каждый из С, N, О, S, Р и Si и каждый из l, m и n' может в своей основной цепи содержать каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира; В, Е, Z ¹¹ , Z ¹² и b являются идентичными таковым в формулах (16) и (16b); в формулах (16-1) и (16-2) по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S.

21. Способ по п.20, согласно которому в формулах (16-1), (16-2), (16b-1) и (16b-2) каждый из l, m и n' является целым числом 2 или более.

22. Способ по любому из пп.1-6, согласно которому молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну из нуклеотидных структур, представленных следующими химическими формулами: 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2, их геометрическими изомерами и стереоизомерами, а также их солями: где n является целым положительным числом.

23. Способ по п.16 или 22, согласно которому длина линкера n заключена в интервале от 2 до 6.

24. Способ по п.1, согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени осуществляется методом мостиковой ПЦР.

25. Способ по п.24, согласно которому в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, указанные метки отличаются друг от друга, в методе мостиковой ПЦР одновременно определяют наличие или отсутствие мутации во множестве локусов в нуклеиновой кислоте-мишени или одновременно анализируют уровни экспрессии множества локусов путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.

26. Способ по п.24, согласно которому в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующими праймерами, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, указанные метки отличаются друг от друга, в методе мостиковой ПЦР количественное соотношение мутаций в целом образце, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень, определяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.

27. Способ по п.24, согласно которому в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, указанные метки отличаются друг от друга, и в методе мостиковой ПЦР качество образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, проверяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.

28. Способ по п.23, согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени обусловлена изотермическим методом амплификации.

29. Способ по любому из пп.1-28, согласно которому два или более пятен на праймере иммобилизованы на твердой фазе в произвольном позиционном взаиморасположении.

30. Способ по любому из пп.1-29, согласно которому указанной нуклеиновой кислотой-мишенью является РНК, при этом указанный способ дополнительно включает стадию, вызывающую реакцию обратной транскрипции РНК, и реакция обратной транскрипции вызвана раньше реакции амплификации или в одно и то же время, что и реакция амплификации на твердой фазе, имеющей иммобилизованный на ней праймер.

31. Способ по любому из пп.1-30, согласно которому реакция амплификации вызвана с помощью ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, обратной транскриптазы (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) или RNA-зависимой РНК-полимеразы.

32. Способ по любому из пп.1-31, согласно которому наличие или отсутствие мутации в нуклеиновой кислоте-мишени обнаруживают путем анализа кривой плавления после реакции амплификации.

33. Способ по любому из пп.1-32, согласно которому анализ кривой плавления осуществляют с помощью зонда, и зонд включает фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.

34. Способ по п.33, согласно которому используют две или более разновидностей зондов, каждый из которых включает фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

3. Способ по п.1 или 2, согласно которому используются две или более разновидностей праймеров.

23. Способ по п.16 или 22, согласно которому длина линкера n заключена в интервале от 2 до 6.

Евразийское 032482 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201590455
(22) Дата подачи заявки 2013.08.29
(51) Int. Cl. C12N15/09 (2006.01) C12M1/00 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)
(54) СПОСОБ АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ-МИШЕНИ
(31) 2012-190715
(32) 2012.08.30
(33) JP
(43) 2015.11.30
(86) PCT/JP2013/073233
(87) WO 2014/034818 2014.03.06
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ (JP)
(72) Изобретатель:
Хайясизаки Йосихиде, Итох Масаеси, Аракава Такахиро, Усуи Кенго, Уемура Сотаро, Митани Ясумаса (JP)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2008111485 JP-A-2009171935
IKEDA S. et al., Hybridization-sensitive on-off DNA probe: application of the exciton coupling effect to effective fluorescence quenching, Chem. Asian J., 2008, vol. 3, no. 6, p. 958-968
LEZHAVA A. et al., Exciton primer-mediated SNP detection in SmartAmp2 reactions, Hum. Mutat., 2010, vol. 31, no. 2, p. 208-217
OKAMOTO A., ECHO probes: a concept of fluorescence control for practical nucleic acid sensing, Chem. Soc. Rev., 2011, vol. 40, no. 12, p. 5815-5828
KIMURA Y. et. al., Effect of thiazole orange doubly labeled thymidine on DNA duplex formation, Biochemistry, 2012 Jul. (online), vol. 51, no. 31, p.
6056-6067
WO-A1-2012091091
(57) Изобретение связано со способом анализа нуклеиновой кислоты-мишени, посредством которого нуклеиновую кислоту-мишень можно быстро и легко анализировать. Для достижения указанной цели в изобретении предложен способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, включающий в себя следующую стадию: анализ нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем приведения образца в контакт с меткой и с праймером, который может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Праймер иммобилизован на твердой фазе. Метка не излучает свет, когда праймер не гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, тогда как если праймер гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, излучение света меткой происходит. Анализ осуществляют путем детекции излучаемого меткой света, вызванного гибридизацией праймера с нуклеиновой кислотой-мишенью.
Область изобретения
Настоящее изобретение связано со способом анализа нуклеиновой кислоты-мишени.
Предшествующий уровень техники
Генотипирование, включающее в себя анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP, single nucleotide polymorphisms) и генных мутаций, может обеспечить основу для индивидуализированной медицины ("tailor-made medicine"), и потребность в генотипировании стремительно возрастает. С целью уменьшения побочных эффектов фармацевтических препаратов Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств Соединенных Штатов пытается в настоящее время вменить в обязанность заявителям новых лекарственных средств прикладывать информацию относительно SNP и генных мутаций, имеющих отношение к эффекту указанных лекарственных средств. В Японии также наблюдается растущая потребность в анализах SNP и генных мутаций.
Устройство для определения числа копий нуклеиновой кислоты или мутации (мутаций) в нуклеиновой кислоте широко используется в научных и клинических целях. Было открыто множество биомаркеров, с помощью которых путем определения числа копий одного гена или мутации (мутаций) в одном гене можно предсказать реактивность в отношении того или иного лекарственного средства, прогноз заболевания и т.д. Примеры таких биомаркеров включают в себя биомаркеры для препаратов Иресса и Герцептин. Однако во многих случаях высокая точность предсказания не может быть достигнута с использованием только одного биомаркера, поскольку in vivo поддержание гомеостаза регулируется целой сетью различных систем.
В частности, в последние годы предложена концепция "Basin Network", которая образована взаимовлиянием факторов транскрипции и некодирующих РНК (ncRNA) (непатентные документы 1-3). Для поддержания морфологии клетки ограниченное число факторов транскрипции и ncRNA всегда взаимодействует друг с другом на каждом из лежащих в основе концепции уровне, и, в частности, считается, что регуляция на уровне транскрипции вносит большой вклад в поддержание клеточной морфологии. Концентрации указанных специфических факторов транскрипции и ncRNA в ядре являются либо константными, либо колеблющимися в определенных пределах, и никогда не выходят за рамки указанных областей. При любом их отклонении баланс сети, образованной между факторами транскрипции и ncRNA в ядре, изменяется и смещается в сторону последующей формы сети. Таким образом, и морфология клетки смещается в сторону последующей формы, такой как дифференцировка, появление признаков злокачественности или старения.
Список цитируемых документов
Патентный документ (документы).
Непатентный документ 1: Nature Genetics 41, 553-562 (2009);
Непатентный документ 2: Nature Genetics 41, 563-571 (2009);
Непатентный документ 3: Nature Genetics 41, 572-578 (2009).
Краткое описание изобретения
Проблема, решаемая с помощью настоящего изобретения "Basin Network", является сетью, которая позволяет осуществлять регуляцию на уровне транскрипции в ядре. Однако на самом деле "Basin Network" воздействует на регуляцию на следующих уровнях: эпигеномные состояния (модификации, такие как образование гетерохроматина и метилирование ДНК) геномных ДНК в ядрах; деградация и метаболизм РНК как таковой, например РНК-интерференция; уровень трансляции РНК; и, кроме того, на уровнях функционирования белков, таких как прямое связывание с белками. Таким образом, на современном уровне знаний, даже если состояние РНК или ДНК изучается в отношении одного гена, нет возможности предсказать, как функционируют указанные сети. Для того чтобы диагностировать прогноз злокачественной опухоли, реактивность в отношении лекарственного средства (то есть реагирует ли или не реагирует пациент на лекарственное средство), как будет описано ниже, и т. д., необходимы соответствующие технические средства, которые позволят измерить и определить функциональное состояние клетки. Кроме того, гены, такие как гены факторов транскрипции и ncRNA, которые вносят свой вклад в такие регу-ляторные состояния, по своей природе имеют низкий уровень экспрессии, и изменения в уровне экспрессии таких генов надо будет определять в состоянии, когда они проявляют физиологическую активность, то есть когда они экспрессируются на низких уровнях. Кроме того, в реальной клинической практике необходимо, чтобы уровни экспрессии указанных генов легко измерялись в амбулаторном отделении, операционной комнате и т. д., и чтобы сразу же мог быть получен результат измерения.
С учетом вышесказанного, объектом настоящего изобретения является способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени, который позволит быстро и легко осуществить анализ нуклеиновой кислоты-мишени.
Способы решения проблемы
Для того чтобы достичь вышеуказанного результата, в настоящем изобретении предложен способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, включающий в себя анализ нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем приведения указанного образца в контакт с меткой и с праймером или зондом, который может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. В указанном способе праймер или зонд должен быть иммобилизован на твердой фазе. Метка не испускает свет, когда праймер или зонд не гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, тогда как если праймер или зонд гибридизуется с нук
леиновой кислотой-мишенью, метка излучает свет, и анализ производят путем детектирования света, испускаемого указанной меткой.
Эффекты, получаемые в настоящем изобретении
Благодаря способу анализа нуклеиновой кислоты-мишени возможно быстро и легко осуществлять анализ нуклеиновой кислоты-мишени.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлены фотографии, показывающие, что продукт амплификации нуклеиновой кислоты-мишени был получен, когда в примере 1 была использована пара праймеров.
На фиг. 2 представлена фотография, показывающая, что получение продукта амплификации нуклеиновой кислоты-мишени не наблюдалось, когда в примере 1 был использован только прямой праймер.
Фиг. 3 представляет собой фотографию, на которой представлен результат проверки качества оли-гонуклеотидов, синтезированных в примере 2-А.
На фиг. 4 показан результат электрофореза продукта, полученного после ПЦР в примере 2-В.
Фиг. 5 представляет собой фотографию, на которой представлен результат синтеза ДНК-матрицы для синтеза матричной РНК бета-актина в примере 2-С.
На фиг. 6 показан результат синтезирования матричной РНК бета-актина с использованием набора CUGA 7 для транскрипции in vitro (CUGA 7 in vitro Transcription Kit) в примере 2-С.
На фиг. 7 показан результат операции термоблока для проведения реакций GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного GenePro Insitu "Japanese Version" B-4 блоком, и результаты проверки ПЦР-реакции в реакционной ячейке, полученной с использованием предметного стекла микроскопа в примере 2-D.
Фиг. 8 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-Е.
Фиг. 9 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-Е.
Фиг. 10 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-Е.
Фиг. 11 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения покровного стекла после ПЦР с иммобилизованными праймерами с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-F.
На фиг. 12 показан результат электрофореза образца после двухступенчатой ОТ-ПЦР в примере 2-
На фиг. 13 показан результат электрофореза образца после одноступенчатой ОТ-ПЦР в примере 2-
На фиг. 14 показан результат электрофореза образца после одноступенчатой ОТ-ПЦР, выполненной в ячейке, полученной с помощью стеклянной подложки в примере 2-I.
Фиг. 15 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения покровного стекла после осуществления мостиковой ОТ-ПЦР (bridge RT-PCR) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-J.
Фиг. 16 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения другого покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-J.
Фиг. 17 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (концентрация матричной РНК) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-K.
Фиг. 18 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения другого покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (концентрация матричной РНК) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-K.
Фиг. 19 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения еще одного покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (концентрация матричной РНК) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-K.
Фиг. 20 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения еще одного покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (концентрация матричной РНК) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-K.
Фиг. 21 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (количество циклов ПЦР) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-L.
Фиг. 22 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения другого покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (количество циклов ПЦР) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-L.
Фиг. 23 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения еще одного покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (количество циклов ПЦР) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-L.
Фиг. 24 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения еще одного покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (количество циклов ПЦР) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-L.
Фиг. 25 представляет собой фотографию, на которой представлен результат наблюдения еще одного покровного стекла после мостиковой ОТ-ПЦР (количество циклов ПЦР) с помощью флуоресцентного микроскопа в примере 2-L.
Фиг. 26 представляет собой фотографию, на которой представлен результат мостиковой ОТ-ПЦР с помощью флуоресцентно меченого набора иммобилизованных специфических праймеров в примере 2-
Фиг. 27 представляет собой фотографию, на которой представлен результат мостиковой ОТ-ПЦР с помощью флуоресцентно меченого набора иммобилизованных специфических праймеров в примере 2-
Фиг. 28 представляет собой схематическую картину, являющуюся примером применения Eprobe. Вызывая гибридизацию Eprobe с препаратом образца на микрочипе, на котором иммобилизован Eprobe, и затем обнаруживая флуоресцентный сигнал, определяют наличие или отсутствие целевого продукта или наличие или отсутствие мутации. Промывание микрочипов дает возможность выполнять детекцию такого рода, используя один и тот же микрочип. Таким образом, микрочип можно использовать повторно без какой-либо специальной модификации препарата образца и в дальнейшем без необходимости в какой-либо конкретной ферментативной цветной реакции после гибридизации.
Фиг. 29 представляет собой схематическую картину, являющуюся примером применения Eprimer в мостиковой ОТ-ПЦР. Путем отжига Eprimer к препарату образца на микрочипе, на котором иммобилизован Eprobe для осуществления метода мостиковой ОТ-ПЦР и затем детекции флуоресцентного сигнала, определяют наличие или отсутствие целевого продукта или наличие или отсутствие мутации.
Способ осуществления настоящего изобретения Здесь и далее настоящее изобретение будет более подробно описано со ссылкой на иллюстративные примеры. Следует отметить, однако, что настоящее изобретение не ограничено последующими примерами.
Настоящее изобретение может быть описано также, например, в следующих подпунктах [1]-[42]. Следует отметить, однако, что настоящее изобретение никоим образом ими не ограничено.
[1] Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, где указанный способ включает следующие стадии:
проведение анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем приведения образца в контакт с меткой и с праймером или зондом, который может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, при этом праймер или зонд иммобилизован на твердой фазе,
метка не испускает свет, когда праймер или зонд не гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, тогда как если праймер или зонд гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, метка испускает свет, и анализ осуществляют путем детекции света, испускаемого указанной меткой.
[2] Способ, описанный в подпункте [1], согласно которому после анализа нуклеиновой кислоты-мишени, нуклеиновую кислоту-мишень извлекают, чтобы дать возможность повторного использования праймера или зонда.
[3] Способ, описанный в подпункте [1] или [2], согласно которому имеются две или более разновидностей нуклеиновых кислот-мишеней, и соответствующие нуклеиновые кислоты-мишени детектируют раздельно.
[4] Способ, описываемый в любом из подпунктов [1]-[3], согласно которому используются две или более разновидностей праймеров или зондов.
[5] Способ, описанный в любом из подпунктов [1]-[4], согласно которому поверхность твердой фазы, на которой иммобилизован праймер или зонд, является плоской поверхностью, плоской поверхностью чипа, сферической поверхностью или трехмерной поверхностью.
[6] Способ, описанный в любом из подпунктов [1]-[5], согласно которому поверхность твердой фазы покрыта покрытием для уменьшения фона.
[7] Способ, описанный в подпункте [6], согласно которому покрытие для уменьшения фона осуществляется путем прививочной полимеризации.
[8] Способ, описанный в любом из подпунктов [1]-[7], согласно которому метка представляет собой фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.
[9] Способ, описанный в любом из подпунктов [1]-[8], согласно которому праймер или зонд включает в себя метку как часть их самих, и метка ковалентно связана с праймером или зондом.
[10] Способ, описанный в подпункте [9], согласно которому праймер или зонд является молекулой нуклеиновой кислоты, включающей в себя по меньшей мере одну из структур, представленных следующими формулами (16)-(18b):
(18 b)
где В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или остов искусственного основания нуклеиновой кислоты;
Е является:
(i) атомной группой, имеющей остов дезоксирибозы, остов рибозы или структуру, полученную из одного из этих сахаров; или
(ii) атомной группой, имеющей пептидную структуру или пептоидную структуру, каждый из Z11 и Z12 является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, при этом они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
каждый из L1, L2 и L3 является линкером (связующим атомом или связующей атомной группой), длина их основной цепи (число атомов в основной цепи) является произвольной, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждый из атомов С, N, О, S, Р и Si, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира, и L1, L2 и L3 могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
D представляет собой CR, N, Р, Р=0, В или SiR и R является атомом водорода, алкильной группой или произвольным заместителем;
b является одинарной связью, двойной связью или тройной связью,
или, альтернативно, в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 является линкером, L3, D и b могут отсутствовать, и L1 и L2 могут быть напрямую связаны с В, при условии, что
в формулах (16), (17) и (18) Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S;
в формулах (16b), (17b) и (18b) E является атомной группой, описанной в подпункте (ii); и
в формулах (17) и (17b) соответствующие В могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, и соответствующие Е могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.
[11] Способ, описанный в подпункте [10], согласно которому в формулах (16)-(18b) длина основной цепи (число атомов основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 является целым числом от 2 или более.
[12] Способ, описанный в подпункте [10] или [11], согласно которому в формулах (16)-(18b) каждый из Z11 и Z12 независимо представляет собой группу, полученную из любого из следующих красителей: тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина, а также их производных.
[13] Способ, описанный в любом из подпунктов [10]-[12], согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул (7)-(9):
где X1 и X2 являются S, О или Se;
n'' является 0 или положительным целым числом, каждый из R1-R10 и R13-R21 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей алкильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой;
один из R11 и R12 является соединяющей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b), a другой является атомом водорода или низшей алкильной группой;
когда множество R15 присутствует в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
когда множество R16 присутствует в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
1 О 101 11 1 О 101 10
X, X и R-R в Z и X, X и R-R в Z могут соответственно быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.
[14] Способ, описанный в подпункте [13], согласно которому в формулах (7)-(9) в R1-R21 низшая ал-кильная группа является линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 6 и низшая алкоксигруппа является линейной или разветвленной алкоксигруппой с числом атомов углерода от 1 до 6.
[15] Способ, описанный в подпункте [13] или [14], согласно которому в формулах (7)-(9) в R11 и R12 связывающая группа является полиметиленовой карбонильной группой с числом атомов углерода от 2 или более, и она связана с L1 или L2 в формулах (16)-(17b) во фрагменте карбонильной группы.
[16] Способ, описанный в любом из подпунктов [13]-[15], согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной формулой (7) или (8), и Z11 и Z12, представленные формулой (7) или (8), являются группой, представленной следующими формулами (19) или (20):
где X1, R1-R10, R13 и R14 и R11 и R12 идентичны таковым в формулах (7)-(9).
[17] Способ, описанный в подпункте [16], согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19), где X1 является S; R1-R10 являются атомами водорода;
один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b), a другой является метильной группой.
[18] Способ, описанный в подпункте [16], согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной формулой (19),
где X1 является S;
R1, R4, R5, R6, R7, R9 и R10 являются атомами водорода; R2, R3 и R12 являются метильными группами; R8 является атомом галогена;
R11 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16)-(18b). [19] Способ, описанный в подпункте [13], согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной формулой (7), где X1 является S; n является 1;
R1-R10, R15, R16 и R17 являются атомами водорода;
R11 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16)-(18b); и R12 является метильной группой.
[20] Способ, описанный в подпункте [13], согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной одной из следующих формул:
где в каждой из приведенных выше химических формул n является целым положительным числом.
[21] Способ, описанный в любом из подпунктов [10]-[20], согласно которому в формулах (16)-(18b) В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила).
[22] Способ, описанный в любом из подпунктов [10]-[20], согласно которому в формулах (16)-(18b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой 2-амино-6-^^-диметиламино)пурин пи-ридин-2-он, 5-метилпиридин-2-он, 2-амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо^^-^пиридин, 5-йодо-2-оксо(1Н)пиридин 2-оксо-(1Н)пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин, 7-(2-тиенил)-имидазо[4,5-b]пиридин, бромотимин, азааденин или азагуанин.
[23] Способ, описанный в любом из подпунктов [10]-[20], согласно которому в формулах (16)-(18b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой Py, Py der., Pu, или Pu der., при этом Py является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 1 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 5 в 6-членном кольце, представленном следующей формулой (11):
( 1 1
Py der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного кольца Py замещен атомом N, С, S или О, и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель;
Pu является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 9 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 8 в конденсированном кольце, представленном следующей формулой (12):
(1 2)
и Pu der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного кольца Pu замещен атомом N, С, S или О, и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель.
[24] Способ, описанный в любом из подпунктов [10]-[23], согласно которому
структура, представленная формулой (16), является структурой, представленной следующей формулой (16-1) или (16-2);
структура, представленная формулой (16b), является структурой, представленной следующей фор
мулой (16b-1) или (16b-2);
структура, представленная формулой (17), является структурой, представленной следующей формулой (17-1);
структура, представленная формулой (17b), является структурой, представленной следующей формулой (17b-1);
структура, представленная формулой (18), является структурой, представленной следующей формулой (18-1); и
структура, представленная формулой (18b), является структурой, представленной следующей формулой (18Ь-1):
где формулах (16-1)-(18b-1)
l, m и n' являются произвольными, l, m и n' могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, каждый из l, m и n' могут в своей основной цепи содержать или не содержать каждый из С, N, О, S, Р и Si, и каждый из l, m и n' могут в своей основной цепи содержать или не содержать каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира;
В, Е, Z11, Z12 и b являются идентичными таковым в формулах (16)-(18b);
в формулах (16-1), (16-2), (17-1) и (18-1) по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S.
[25] Способ, описанный в подпункте [24], согласно которому в формулах (16-1)-(18b-1) каждый из l, m и n является целым числом от 2 или более.
[26] Способ, описанный в подпункте [10], согласно которому молекула нуклеиновой кислоты включает в себя по меньшей мере одну из нуклеотидных структур, представленных следующими химическими формулами 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2, их геометрическими изомерами и сте-реоизомерами, а также их солями:
где в химических формулах 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2 n является положительны-мым целым числом.
[27] Способ, описанный в подпункте [20] или [26], согласно которому длина линкера n заключена в интервале от 2 до 6.
[28] Способ, описанный в любом из подпунктов [1]-[27], согласно которому указанный "праймер или зонд" является праймером, праймер гибридизуют с нуклеиновой кислотой-мишенью путем приведения указанного праймера в контакт с образцом, тем самым вызывая реакцию амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, и через некоторое время осуществляют анализ нуклеиновой кислоты-мишени путем последующего измерения степени амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в реакции амплификации.
[29] Способ, описанный в подпункте [28], согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени обусловлена методом мостиковой ПЦР.
[30] Способ, описанный в подпункте [29], согласно которому в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает в себя метку, ковалентно связанную с праймером, и, таким образом, включает в себя указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, указанные метки отличаются друг от друга, и в методе мостиковой ПЦР одновременно определяют наличие или отсутствие мутации во множестве локусов в нуклеиновой кислоте-мишени или одновременно анализируют уровни экспрессии множества локусов путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции. [31] Способ, описанный в подпункте [29], согласно которому в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает в себя метку, ковалентно связанную с праймером, и, таким образом, включает в себя указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, указанные метки отличаются друг от друга, и в методе мостиковой ПЦР количественное соотношение мутаций в целом образце, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень, определяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.
[32] Способ, описанный в подпункте [29], согласно которому
в качестве праймера используют пару праймеров,
каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает в себя метку, ковалентно связанную с праймером, и, таким образом, включает в себя указанную метку как часть его самого,
каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,
указанные метки отличаются друг от друга, и
в методе мостиковой ПЦР качество образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, проверяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.
[33] Способ, описанный в подпункте [28], согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени обусловлена изотермическим методом амплификации.
[34] Способ, описанный в любом из подпунктов [28]-[33], согласно которому два или более пятен на праймере иммобилизованы на твердой фазе в произвольном позиционном взаиморасположении.
[35] Способ, описанный в любом из подпунктов [28]-[34], согласно которому нуклеиновой кислотой-мишенью является РНК, при этом указанный способ дополнительно включает в себя стадию, вызывающую реакцию обратной транскрипции РНК, и причем реакция обратной транскрипции вызвана раньше реакции амплификации или в одно и то же время, что и реакция амплификации на твердой фазе, содержащей иммобилизованный на ней праймер.
[36] Способ, описанный в любом из подпунктов [28]-[35], согласно которому реакция амплификации вызвана с помощью ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, обратной транскриптазы (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) или РНК-зависимой РНК-полимеразы.
[37] Способ, описанный в любом из подпунктов [28]-[36], согласно которому наличие или отсутствие мутации в нуклеиновой кислоте-мишени обнаруживают путем анализа кривой плавления после реакции амплификации.
[38] Способ, описанный в подпункте [37], согласно которому анализ кривой плавления осуществляют с помощью зонда, и зонд включает в себя фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.
[39] Способ, описанный в подпункте [38], согласно которому используют две или более разновидностей зондов, каждый из которых включает в себя фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.
[40] Способ, описанный в любом из подпунктов [1]-[27], согласно которому указанный "праймер или зонд" является зондом.
[41] Способ, описанный в подпункте [40], согласно которому указанный образец содержит нуклеиновую кислоту-мишень, которая амплифицирована заранее.
[42] Способ, описанный в подпункте [40] или 41, согласно которому наличие или отсутствие мутации в нуклеиновой кислоте-мишени обнаруживают путем последующего анализа кривой плавления.
Термины.
Некоторые из терминов, используемых в настоящем изобретении (то есть термины, используемые в настоящем описании), будут описаны ниже. Термины, специально здесь не определяемые, должны быть интерпретированы как имеющие то же значение, которое обычно подразумевают под ними специалисты в данной области. Сокращения, используемые для обозначения ДНК, РНК, нуклеотидов, полинуклеоти-дов и т.д., соответствуют сокращениям, установленным в руководстве "Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences" (изданном патентной организацией Японии) и обычно используемым в данной области.
В настоящем изобретении термин "полинуклеотид" или "олигонуклеотид" означает нуклеиновую кислоту, которая относится как к ДНК, так и к РНК. Термин ДНК охватывает понятия кДНК, геномной ДНК и синтетической ДНК. Термин РНК хватывает понятия суммарной РНК, мРНК, рРНК, ки-RNA, микроРНК, мяРНК (snRNA), мякРНК (snoRNA), некодирующие РНК (non-coding RNA) и синтетические РНК. Кроме того, в настоящем описании термин "полинуклеотид" или "олигонуклеотид" и термин "нуклеиновая кислота" используются взаимозаменяемым образом.
Подразумевается, что термин "ген", используемый в настоящем изобретении, означает не только двухцепочечную ДНК или двухцепочечную РНК, но охватывает также и соответствующие включенные в них одноцепочечные ДНК, такие как положительная цепь (или смысловая цепь) и комплементарная цепь (или антисмысловая цепь). Кроме того, термин "ген" особо не ограничен последовательностью оснований или длиной последовательности гена.
В настоящем изобретении, если специально не указано иное, термин "ген" включает в себя двухце-почечную ДНК, включая человеческую геномную ДНК; одноцепочечную ДНК (положительная цепь), включая кДНК; одноцепочечную ДНК, имеющую комплементарную последовательность (комплементарная цепь) в отношении положительной цепи; ее фрагменты; и геном человека. Здесь "ген" необязательно означает "ген", представленный специфической последовательностью оснований (или определенной последовательность с идентификационным номером), но этот термин охватывает также и "нуклеиновую кислоту", кодирующую РНК, имеющую биологическую функцию, эквивалентную биологической функции РНК, кодируемой специфической последовательностью оснований (например, гомологом); мутант, такой как полиморфизм; и производное. Примеры "нуклеиновой кислоты", кодирующей такой гомолог, мутант или производное, включают в себя "нуклеиновые кислоты", каждая из которых имеет последовательность оснований, которая в особо жестких условиях гибридизуется с последовательностью, комплементарной определенной последовательности оснований или последовательности оснований, в которой и является t в определенной последовательности оснований. Термин "ген" не указывает на тип функциональной области и включает в себя также, например, экспрессируемые регуляторные области, кодирующие области, экзоны и интроны.
В настоящем изобретении термин "продукт транскрипции" означает РНК, синтезированную с по
следовательности ДНК гена в качестве матрицы. Когда РНК-полимераза связывается с участком, называемым "промотором", расположенным выше участка расположения гена, это вызывает связывание ри-бонуклеотидов с последовательностью оснований ДНК от 3'-конца ДНК так, чтобы они были комплементарны ДНК. Таким образом синтезируется РНК. Такая РНК охватывает не только ген как таковой, но и полную последовательность, от точки начала транскрипции до конца поли-А-последовательности, включая различные области, такие как кодирующие области, экспрессируемые регуляторные области, экзоны и интроны.
В настоящем изобретении термин "микроРНК (miRNA)" означает РНК, которая сначала была транскрибирована как РНК-предшественник, имеющая шпилькообразную структуру, затем была расщеплена ферментом, расщепляющим дцРНК и обладающим расщепляющей активностью РНКазы III, и встроена в белковый комплекс, называемый RISC, где она вовлечена в процесс ингибирования трансляции мРНК. Здесь термин "miRNA" означает не только "miRNA", представленную специфической последовательностью оснований (или специфической последовательностью с идентификационным номером), но включает в себя также и предшественники (pre-miRNA, pri-miRNA) молекул "miRNA", и, таким образом, охватывает "miRNA", кодирующие miRNA, имеющие биологическую функцию, эквивалентную miRNA, кодируемой указанными предшественниками (например, гомологи); мутантами, такими как полиморфизмы; и производными.
В настоящем изобретении термин "зонд" не особо ограничен и означает, например, Eprobe; поли-нуклеотид, используемый для того, чтобы осуществлять специфическую детекцию РНК, продуцируемой при экспрессии гена, или полинуклеотид, полученный из указанной РНК; и/или комплементарный ему полинуклеотид.
Термин " праймер" не особо ограничен и означает, например, Eprobe; полинуклеотид, состоящий из последовательных нуклеотидов, которые специфически распознают и амплифицируют РНК, продуцируемую путем экспрессии гена, или полинуклеотид, полученный из указанной РНК; и/или комплементарный ему полинуклеотид.
В настоящем изобретении термин "комплементарный полинуклеотид (комплементарная цепь, обратная цепь)" относится к полинуклеотиду, который находится в комплементарном соотношении, в терминах нуклеотидов (в смысле соотношений пар оснований, таких как А:Т (U) и G:C), с полноразмерной последовательностью или частичной последовательностью, имеющей последовательность оснований, определяемую идентификационным номером последовательности, или имеющей последовательность, полученную путем замены и на t в данной последовательности оснований (для удобства, здесь полноразмерная последовательность или частичная последовательность называются "положительной цепью"). Такая комплементарная цепь может не только быть идеально комплементарной последовательности оснований целевой положительной цепи, но может также находиться и в комплементарном соотношении с участком, которым она может в жестких условиях гибридизоваться с целевой положительной цепью.
В настоящем изобретении термин "жесткие условия" означает условия, при которых зонд гибриди-зуется с последовательностью-мишенью в значительно большей степени, чем другие последовательности (например, по меньшей мере в два раза большей, чем фоновые уровни). Жесткие условия зависят от последовательности и широко варьируют, в зависимости от окружающей среды, в которой происходит гибридизация. Контролируя жесткость гибридизации и/или условия промывки, можно идентифицировать целевую последовательность, которая на 100% комплементарна зонду.
В настоящем изобретении термин "мутант" означает, в случае нуклеиновой кислоты, природным образом образующийся мутант, вызванный полиморфизмом, мутацией или т. п.; мутант, включающий в себя делецию, замену, добавление и/или вставку 1, 2, 3 или более оснований, предпочтительно 1 или 2 оснований в последовательности оснований, полученной путем замены и на t в последовательности оснований или в их частичной последовательности; мутант, включающий в себя делецию, замену, добавление и/или вставку 1 или 2 или более оснований, предпочтительно 1 или нескольких оснований в последовательности оснований РНК-предшественника молекулы miRNA, последовательности оснований, полученной путем замены и на t в последовательности оснований или в их частичной последовательности; мутант, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере приблизительно на 50, по меньшей мере приблизительно на 70, по меньшей мере приблизительно на 80, по меньшей мере приблизительно на 90, по меньшей мере приблизительно на 95, по меньшей мере приблизительно на 97, по меньшей мере приблизительно на 98 или по меньшей мере приблизительно на 99% каждой из описанных выше последовательностей оснований или их частичным последовательностям; или нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с полинуклеотидом или олигонуклеотидом, который включает в себя каждую из описанных выше последовательностей оснований или их частичные последовательности, в жестких условиях, как определено выше.
В настоящем изобретении "% идентичности" может быть определен с помощью системы зондирования белка или гена, такой как обычно используемые системы BLAST или FASTA, с введением или без введения гэпа в целевую последовательность.
В настоящем изобретении термин "производное" охватывает Eprobe, Eprimer и модифицированную нуклеиновую кислоту, и примеры с их использованием включают в себя, но не ограничены производны
ми, меченными флюорофором или т.п.; производные, включающие в себя модифицированный нуклеотид (например, нуклеотид, включающий в себя такую группу, как галоген, алкил, такой как метил, алкокси-группу, такую как метокси-, тио- или карбоксиметил; и нуклеотид, который претерпел восстановление основания, насыщение двойной связи (связей), дезаминирование, замену молекулы (молекул) кислорода молекулой (молекулами) серы, или т. п.); и PNA (пептидо-нуклеиновые кислоты).
Термин "анализ", используемый в настоящем изобретении, включает в себя, например, качественный анализ, количественный анализ, полуколичественный анализ и детектирование мутаций.
В настоящем изобретении термины "прогноз, определение, детекция или диагноз (а также их грамматические вариации)" никак особо не ограничены и означают, например, прогноз, определение, детекцию или диагностику вещества, напрямую или косвенно используемого для скрининга вещества-кандидата, которое применимо для профилактики, улучшения состояния или лечения злокачественной опухоли или любого другого заболевания, для диагностических целей, независимо от того, обнаружена ли у субъекта злокачественная опухоль или любое другое заболевание, для определения степени тяжести злокачественной опухоли или любого другого заболевания, того, улучшилось или не улучшилось состояние при злокачественной опухоли или любом другом заболевании, или для определения степени улучшения. Примеры таких веществ включают в себя нуклеотид, олигонуклеотид и полинуклеотид, который специфически распознает и связывается с геном, уровень экспрессии которого in vivo, особенно в ткани или в крови, варьирует, когда субъект страдает от злокачественной опухоли или любого другого заболевания. Благодаря описанным выше свойствам, описанные выше нуклеотид, олигонуклеотид и по-линуклеотид могут быть эффективно использованы в качестве зонда для детекции гена, экспрессируемо-го in vivo, в ткани или в клетке, или в качестве праймера для амплификации гена, экспрессируемого in vivo.
В настоящем изобретении термин "образец", используемый для прогнозирования, определения, детекции или диагностики, особо не ограничен и может быть, например, любым биологическим образцом, который характеризуется изменением в гене или в экспрессии гена, сопровождающимся запуском злокачественного процесса или любого другого заболевания или изменением физических условий. В частности, примеры образца включают в себя ткани и сосуды вокруг тканей; лимфатические узлы и органы; органы, в которых подозревают наличие метастазов злокачественных клеток; кровь, мочу, слюну, экскременты, волосы, кожу и пот; и любой другой материал, который может быть получен из живого организма.
Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени согласно настоящему изобретению.
Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени согласно настоящему изобретению имеет, например, следующие признаки. Следует отметить, однако, что описания, касающиеся указанных признаков, носят лишь иллюстративный характер и никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.
В свете описанных выше проблем, имеющих отношение к концепции "Basin Network" и т.п., необходимо, чтобы способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени согласно настоящему изобретению удовлетворял следующим условиям (1)-(3), например:
(1) способ анализа должен быть связан с технологией, которая может в одно и то же время осуществить количественный анализ множества локусов;
(2) способ анализа должен иметь высокую чувствительность так, чтобы можно было измерить очень низкий уровень экспрессии РНК, такой как уровень экспрессии РНК фактора транскрипции; и
(3) способ анализа должен обеспечить очень быстрый и легкий анализ нуклеиновой кислоты-мишени так, чтобы указанный способ анализа мог быть использован в клинической практике.
В последние годы лекарственное средство не может быть легко одобрено без маркера, с помощью которого можно было бы отличить систему, отвечающую на лекарственное средство, от не отвечающей, и это делает практическое применение многих лекарственных средств затруднительным. Как специально описано ниже, реактивность лекарственного средства, прогноз и т. д. контролируется на уровне сетей. Таким образом, как нечто само собой разумеющееся, предсказание клинически полезной информации путем анализа только одного гена является очень затруднительным и теоретически неоправданным. Существует тенденция к использованию системной биологии для сбора информации о клинических предсказаниях.
В подобных обстоятельствах существует потребность в технологии, которая позволила бы осуществлять количественную оценку множества локусов в образце, полученном от одного индивида. Кроме того, чтобы успешно выполнить измерение и определение в терминах системной биологии, необходимо исследовать множественные локусы одновременно. Кроме того, в клинических сайтах ожидается организация РОСТ (портативный терминал сбора данных), и становится более и более важным то, чтобы информация о состоянии пациента могла быть получена сразу же из образца, взятого у пациента, в поликлинике, больничной палате, операционной и т.д. Таким образом, необходима технология, которая позволит легко осуществлять такого рода измерения.
Для этих целей обычно используют микрочипы. В способе детекции с использованием микрочипа метку, такую как флуоресцентный краситель, вводят в РНК (ДНК) образца с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ДНК-полимераза), и осуществляют гибридизацию такой ме
ченой нуклеиновой кислоты с чипом, содержащим на своей поверхности иммобилизованный праймер или зонд. Однако чтобы исключить фон, необходима операция по удалению избытка меченой нуклеиновой кислоты, что требует больших усилий и временных затрат. Кроме того, необходимо также сканирование. Таким образом, детектирование с использованием микрочипа связано с проблемой в том отношении, что время, необходимое для выполнения всего процесса, достаточно велико. Чтобы произвести анализ большого числа генов одновременно, необходима технология, в которой использовался бы такой микрочип или подобное ему устройство. Однако такая технология сопряжена с некоторыми проблемами, такими как необходимость отмывать и удалять избыток меченой нуклеиновой кислоты, и эти процессы требуют усилий и времени; требуемые операции достаточно сложны; и воспроизводимость результатов не очень высокая.
С другой стороны, количественная ОТ-ПЦР и количественная ПЦР используются в качестве высокочувствительных методов. Однако, согласно этим методикам, разные праймеры должны быть сконструированы для соответствующих целевых последовательностей генов (локусов). Поскольку указанные праймеры вводят во взаимодействие отдельно в разных реакционных растворах (содержащихся в пробирках), РНК или ДНК, используемые в качестве матрицы-шаблона, должны быть разделены на число реакционных растворов и только затем добавлены к соответствующим реакционным растворам. Следовательно, в случае, когда в наличии имеется только очень малое количество образца нуклеиновой кислоты, само собой разумеется, что число генов (множественные локусы), количественно оцениваемых указанными методами, ограничено.
То есть в случае количественной ОТ-ПЦР или количественной ПЦР матрица-шаблон должна быть распределена между столькими реакционными растворами, сколько областей-мишеней (локусов) предстоит оценить количественно, и когда целевую матрицу делят на части и распределяют между реакционными растворами, возникновение количественных вариаций между указанными частями физически неизбежно, что приводит к ошибкам измерения. Кроме того, поскольку соответствующие реакционные растворы содержат разные количества последовательностей праймеров и целевых последовательностей, эффективности амплификации в таких реакционных растворах неодинаковы. Как описано выше, благодаря ошибкам в распределении между реакционными растворами, в настоящее время методы количественной ОТ-ПЦР или количественной ПЦР не дают возможность точно измерить ошибки, вызванные факторами амплификации.
На микрочипе иммобилизован зонд или праймер, в котором использована последовательность оснований, которые могут быть нацелены на многочисленные, от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч, виды генов. Если тестируемый образец добавлен к микрочипу, ген, содержащийся в образце, связывается с зондом или праймером. Измеряя каким-нибудь количественным способом оценки такое связывание, можно узнать количество указанного гена в тестируемом образце. Гены, на которые будут направлены зонд или праймер, иммобилизованные на микрочипе, могут быть свободно вычленены.
Также и при определении области злокачественного поражения (образец, полученный во время операции или эндоскопии) у пациента со злокачественной опухолью и области с нормальной тканью у пациента со злокачественной опухолью и сравнении уровней экспрессии генов в указанных областях, можно оценить группу генов, которые служат маркерами рака. Кроме того, в результате сравнения характера экспрессии генов, когда субъект находится в хорошем физическом состоянии, с характером экспрессии генов, когда субъект находится в плохом физическом состоянии, с целью определения физических состояний субъекта, субъект может получить возможность подвергаться тесту и диагностике даже в том случае, если он является лишь потенциальным пациентом, без каких-либо симптомов заболевания.
Микрочип имеет преимущества в том отношении, что с его помощью можно изучать множественные локусы; и количественная оценка множества локусов может быть осуществлена в одном растворе меченой нуклеиновой кислоты. Однако микрочип требует трудоемких операций амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и введения метки в нуклеиновую кислоту-мишень, а кроме того, требуется время для того, чтобы вызвать гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с праймером или зондом. Кроме того, чувствительность детекции у микрочипа не столь высока. Кроме того, микрочип имеет узкую спектральную зону действия и может детектировать только известные последовательности. Кроме того, при детекции мутаций микрочип характеризуется низким отношением "сигнал-помеха", так что точность определения не столь высока. Как описано выше, с микрочипом связано много проблем.
В отличие от этого, мультиплексная количественная ПЦР (qOT-ПЦР) имеет преимущества в том, что в мультиплексной количественной ПЦР можно добиться высокой чувствительности и широкой спектральной зоны; количество матричного гена может быть измерено во время нарастания (Ct), в ходе процесса амплификации; и информация относительно мутации может быть получена путем составления графика кривой плавления. И наоборот, в противном случае необходимо конструировать различные праймеры для каждой из нуклеиновых кислот-мишеней, что связано со сложным процессом, отнимающим время и требующим усилий. Кроме того, для обеспечения различных реакционных систем надо, чтобы соответствующие локусы реагировали раздельно, в разных пробирках. Это требует усилий для измерения и обеспечения стольких реакционных растворов, сколько локусов подлежит детекции. Кроме того, нуклеиновая кислота (РНК, ДНК), которая должна быть использована в качестве матрицы и т.п.,
должна быть разделена на число реакций, которые должны быть вызваны. Здесь возникает проблема, связанная с необходимостью располагать большим количеством матричной нуклеиновой кислоты.
Для того чтобы скомпенсировать указанные недостатки, можно использовать множественную мос-тиковую количественную ОТ-ПЦР, которая имеет существенные преимущества. Мостиковая ПЦР, осуществляемая на чипе, не требует различных реакционных систем, поскольку праймер иммобилизован на чипе (относительно мостиковой ПЦР см., например, JP 10 (1998)-505492 А). Реакция может быть осуществлена в одной жидкой фазе, так что нет необходимости вызывать реакции для соответствующих локу-сов в отдельных пробирках. В мостиковой ПЦР нет необходимости в трудоемких операциях по измерению и обеспечению такого же количества реакционных растворов, что и локусов, подлежащих анализу. Кроме того, отпадает необходимость разделять нуклеиновую кислоту (РНК, ДНК), подлежащую использованию в качестве матрицы и т.п., на порции, по количеству реакций, так что мостиковая ПЦР может быть выполнена с использованием малого количества матричной нуклеиновой кислоты. В частности, с использованием РНК, собранной из одной клетки, можно количественно оценить большое число локу-сов, и реакцию можно вызвать даже в случае, когда количество РНК не превышает 1 мкл (в случае, когда размер чипа составляет 1x1 мм, 50 нл РНК, вероятно, будет достаточно). В зависимости от цели осуществления метода мостиковой ПЦР, может быть эффективно добавление РНКазыН заранее.
Кроме того, когда экситонный праймер (Eprimer, см., например, патенты Японии №№ 4761086 и 4370385) применяется к множественной количественной мостиковой ОТ-ПЦР, необязательно метить нуклеиновую кислоту-мишень, и детекцию образца, подлежащего измерению, такого как РНК или ДНК, можно осуществить просто путем нанесения образца как такового на чип. Чувствительность множественной мостиковой количественной ОТ-ПЦР улучшена по сравнению с таковой множественной количественной ОТ-ПЦР, а другие преимущества множественной мостиковой количественной ОТ-ПЦР также считаются равными или превосходящими таковые множественной количественной ОТ-ПЦР. В отличие от методов, в которых используется жидкая фаза, во множественной мостиковой количественной ОТ-ПЦР, используя один и тот же чип, можно осуществить количественную оценку множества образцов или одновременно осуществить количественную оценку разных генов или различных областей в одном и том же гене, используя красители с разными длинами волн поглощения. Это дает возможность обеспечить внутренний контроль в каждой реакции, так что удовлетворяются основные требования в отношении наборов для клинического тестирования. В частности, микрочип с использованием экситонного зонда (Eprobe) имеет преимущества в том, что нет необходимости флуоресцентно метить вещество, подлежащее детекции, такое как, например, продукт амплификации ПЦР; а также в том, что, промывая микрочип после детекции гибридизации и затем добавляя следующий образец, можно использовать микрочип повторно, без необходимости внесения какой-либо специальной метки или развития цветной реакции. Кроме того, в связи с современной экологией многоразовые микрочипы очень востребованы.
Более конкретно, с использованием настоящего изобретения открывается возможность количественной оценки большого числа образцов, используя единственный чип, тогда как для осуществления количественной ОТ-ПЦР на каждый образец требуется по одной пробирке. Таким образом, во множественной мостиковой количественной ОТ-ПЦР нет необходимости отдельно осуществлять амплификацию и мечение стадий, включая получение кРНК на микрочипе, при этом все стадии могут быть выполнены на чипе. Кроме того, кластеры, образуемые мостиковой ПЦР, значительно меньше, чем пятна на матрице. Таким образом, кластеры могут быть посчитаны вручную, когда их плотность мала, и это дает возможность не только посчитать кластеры, но и определить их количественно на основе интенсивности флуоресценции. Более того, интенсивность флуоресценции поддерживается кластерами даже в низком диапазоне флуоресценции (поскольку флуоресценция не становится менее концентрированной при ее распределении по всему пятну). Таким образом, ожидается, что, по сравнению с микрочипом, здесь может быть достигнут более широкий динамический диапазон при следовых количествах. В частности, при использовании Eprimer, только амплифицированные кластеры излучают флуоресценцию, которая легко может быть измерена, и для этого не требуется какой бы то ни было специальной операции.
В настоящем изобретении, во время детекции и измерения флуоресценции, процесс амплификации (то есть образования кластеров) с помощью мостиковой ПЦР наблюдают на основе флуоресценции. Таким образом, источник лазерных лучей для возбуждения не требуется, и детекции можно достичь с помощью простого лампового источника света. Кроме того, что касается ячейки для детектирования флуоресценции, здесь нет необходимости в сверхчувствительной ячейке EMCCD, и для измерения достаточно обычной ячейки CCD. То есть преимущество состоит в том, что используемые здесь измерительные приборы могут быть упрощены. В настоящем изобретении, поскольку только амплифицированные кластеры излучают флуоресценцию, можно уменьшить фоновый свет так, чтобы создать возможность получения более чистых изображений. Кроме того, в случае, когда возникает необходимость отсканировать более обширную область при высокой скорости, можно использовать метод линейного сканирования. Применение указанного метода дает возможность получать изображения движения при перемещении предметного столика с постоянной скоростью, а затем получить одно неподвижное изображение, на котором показана более широкая область. В соответствии с этим методом, можно в принципе осуществлять анализ сколь угодно увеличивающегося числа разновидностей образцов (при сколь угодно обширной области
измерения), хотя ограничение может быть обусловлено границами перемещения предметного столика.
Способ анализа нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может быть осуществлен, например, с помощью ДНК-чипа. Далее здесь будет описан такой ДНК-чип, со ссылкой на иллюстративный пример.
ДНК-чип (или микрочип) имеет, например, по меньшей мере один или более описанных выше оли-гонуклеотидных производных, иммобилизованных на нем. Иммобилизация является концепцией, относящейся к категории явлений, включающих в себя адсорбцию. Эта концепция включает в себя также явления связывания посредством ковалентной связи или т.п.
Диаметр каждого пятна ДНК на поверхности субстрата во время получения ДНК-чипа (или микрочипа) особо не ограничен, и обычно он составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 20000 мкм, более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 2000 мкм, и еще более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 200 мкм. Также и расстояние между пятнами ДНК на поверхности субстрата особо не ограничено и обычно составляет от приблизительно 1 до приблизительно 50000 мкм, более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 5000 мкм, а еще более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 500 мкм.
Примеры носителя, который должен быть использован в ДНК-чипе (или микрочипе), включают в себя, но не ограничены стеклом, таким как микропористое стекло или пористое стекло; полистиролом; металлом и магнитной бусинкой, имеющей ферромагнитное ядро, покрытое глицин-метакрилатом. Носитель может иметь любую форму, такую как форма в виде пластинки (в качестве субстрата) или в виде бусинки.
ДНК-чип может быть чипом, используемым в технологии "probe-on-carrier" ("зонд-на-носителе"). Метод "probe-on-carrier" является технологией, при которой ДНК-чип синтезируют на микропористом стекле (CPG), которое считается наиболее подходящим материалом для синтеза ДНК, а затем, не отделяя молекулу зонда от носителя CPG, ДНК-зонд, связанный с CPG, используют для детекции SNP. Предпочтительно, чтобы CPG, приемлемый для использования, имел диаметр частиц от 50 до 50000 А, более предпочтительно от 500 до 5000 А. При использовании указанного метода "probe-on-carrier" операцию иммобилизации ДНК-зонда можно опустить, таким образом повышая производительность синтеза ДНК-чипа. Поскольку методом "probe-on-carrier" можно достичь очень высокой эффективности реакции синтеза ДНК порядка 99,8% или более, можно обеспечить получение ДНК-зонда с высокой степенью чистоты, что оказывает благоприятное воздействие в отношении того, что значительно улучшается точность ДНК-чипа. Более того, CPG, снабженный необходимым ДНК-зондом, может производиться в больших масштабах, что позволит снизить его цену и улучшить контроль его качества. В большинстве обычно используемых чипов ДНК детектирование осуществляется в двух измерениях на плоской поверхности предметного стекла микроскопа. В отличие от этого, в соответствии со способом "probe-on-carrier", в котором используется CPG, возможны трехмерное детектирование и высокая плотность расположения зонда ДНК, а это дает возможность осуществления высокочувствительной детекции.
Когда уже существующую систему синтеза ДНК используют в описанном выше способе "probe-on-carrier", в процессе удаления защитной группы фрагмента основания нуклеиновой кислоты (обработка аммонием) может наблюдаться явление, при котором связь Si-О во фрагменте линкера расщепляется, и приблизительно 90% ДНК-зонда открепляется от поверхности носителя.
Иммобилизация олигонуклеотидного производного на поверхности носителя может быть достигнута путем связывания олигонуклеотидного производного с поверхностью через соответствующий линкер, например, путем образования связи металл-сера или т. п. На поверхности носителя могут быть иммобилизованы олигонуклеотидные производные не только одного типа, но также и две или более разновидностей олигонуклеотидного производного. К заместителю, не связанному с носителем, могут быть присоединены флуоресцентная молекула, гасящая молекула или т. п., так что можно осуществить его детекцию, когда заместитель используется в качестве ДНК-чипа или т. п.
ДНК-чип (или микрочип) может быть использован в способе идентификации нуклеиновой кислоты в образце, и т.д. Способ идентификации осуществляют, сначала гибридизуя образец с ДНК-чипом (или микрочипом). Гибридизация может быть вызвана, например, путем добавления от приблизительно 0,01 до приблизительно 1000 мкМ образца к олигонуклеотидному производному, иммобилизованному на ДНК-чипе (или микрочипе). Условия гибридизации - это от приблизительно нескольких секунд до приблизительно нескольких десятков часов при температуре, например, от 0 до 100°С, более предпочтительно от 20 до 90°С, а еще более предпочтительно от 30 до 80°С, хотя указанные условия варьируют в зависимости от типа полинуклеотидного производного. Следует отметить, однако, что условия гибридизации не ограничены указанными выше рамками.
После завершения гибридизации чип от 2 до 5 раз промывают соответствующим промывочным раствором, в зависимости от типа чипа. Олигонуклеотидное производное может быть использовано в способе идентификации нуклеиновой кислоты или детекции гена описанным выше способом. Примеры технологии детекции гена включают в себя, но ими не ограничены, реакцию ПЦР в режиме реального времени, помимо описанных выше технологий с использованием ДНК-чипа или микрочипа.
В настоящем изобретении термин "детекция или детектирование (и его грамматические вариации)"
никак особо не ограничен и означает, например, тщательное улавливание флуоресцентного сигнала зонда или праймера, амплифицированного в виде пятен на субстрате-чипе, со ссылкой на изображение флуоресценции. В качестве устройства для детекции необходим обычно используемый флуоресцентный микроскоп. Нужно, в частности, чтобы флуоресцентный микроскоп включал в себя источник света для возбуждения Eprobe или Eprimer, дихроичное зеркало, фильтр возбуждения, флуоресцентный фильтр и ячейку для детектирования. Кроме того, для измерения интенсивности флуоресценции зонда Eprobe или праймера Eprimer на основе временной последовательности, необходимо сканировать одно и то же изображение снова и снова с высокой точностью и в широком диапазоне, так что необходима контролируемая стадия с высокой точностью позиционирования. Примеры ячеек для детектирования включают в себя таковые, которые не амплифицируют или которые могут амплифицировать флуоресцентный сигнал, а также ячейки с однострочной разверткой, которые могут получать изображения последовательно в широком диапазоне.
Способ идентификации нуклеотида в нуклеиновой кислоте-мишени включает следующие стадии: инициация гибридизации, отжиг, или реакция удлинения между олигонуклеотидным производным или т. п. и нуклеиновой кислотой-мишенью в образце; и обнаружение продукта гибридизации или продукта амплификации. В способе идентификации нуклеотида в нуклеиновой кислоте-мишени согласно настоящему изобретению сначала олигонуклеотидное производное гибридизуют с нуклеиновой кислотой-мишенью в образце. Образец, который должен быть использован, не имеет особых ограничений, нужно только, чтобы он содержал нуклеиновую кислоту. Примеры образцов включают в себя клеточные экстракты, жидкости организма, такие как кровь, продукты ПЦР и олигонуклеотиды. Условия гибридизации праймера или зонда таковы, как описано выше.
Примеры способа амплификации биологического образца включают в себя метод мостиковой ПЦР. В методе мостиковой ПЦР 5'-конец используемого в нем праймера иммобилизован на подложке, реакция удлинения происходит тогда, когда праймер гибридизуется (отжигается) с целевым продуктом. Кроме того, повторяя тепловую денатурацию, отжиг и реакцию удлинения на носителе, из области целевой амплификации получают продукт амплификации в биологической пробе-мишени, если область целевой амплификации присутствует. В частности, в настоящем изобретении путем иммобилизации Eprimer, который включает в себя последовательность, специфичную в отношении области амплификации-мишени на микрочипе, только в случае, когда имеет место целевая амплификация, реакция амплификации происходит только на участке, на котором иммобилизован Eprimer, так что сигнал флуоресценции от Eprimer может быть измерен непосредственно.
" Экситонный эффект" (экситонное спаривание) является эффектом, при котором, например, множество красителей агрегирует в параллельной конфигурации, образуя Н-агрегаты, и в результате проявляется слабое флуоресцентное излучение. Предположительно, этот эффект получается следующим образом. То есть состояние возбуждения красителя разделяется на два энергетических уровня в результате Давыдовского расщепления, происходит возбуждение в более высоком энергетическом уровне, а затем, при внутренней конверсии, переход на более низкий энергетический уровень, и, таким образом, излучение оказывается термодинамически запрещенным. Однако эти описания никоим образом не ограничивают настоящее изобретение. Возможное возникновение экситонного эффекта может быть подтверждено появлением полосы поглощения красителей, которые образовали Н-агрегаты, в более короткой области длин волн по сравнению с полосой поглощения одного красителя. Примеры красителей, которые характеризуются таким эффектом, включают в себя тиазоловый оранжевый и его производные, оксазоловый желтый и его производные, цианин и его производные, гемицианин и его производные, и метиловый красный и его производные, а также группы красителей, обычно называемые цианиновыми красителями и азокрасителями. В соответствии с экситонным эффектом, например, в случае, когда флуоресцентный краситель согласно настоящему изобретению соединяется с нуклеиновой кислотой, интенсивность флуоресценции в одноцепочечном состоянии тормозится, и, тем самым, это позволяет в дальнейшем эффективно регистрировать структуру двойной спирали.
Eprimer или Eprobe могут быть, например, молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей структуру, описанную в патенте Японии № 4370385, или могут быть молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей, например, структуру, описанную ниже.
В нуклеиновой кислоте-зонде согласно настоящему изобретению структурой молекулы нуклеиновой кислоты может быть, например, меченая нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере одну из структур, представленных следующими формулами (16)-(18b). В настоящем изобретении меченая нуклеиновая кислота охватывает также таутомеры и стереоизомеры указанных структур, а также соли этих структур, таутомеры и стереоизомеры. Здесь, далее, каждая из структур, представленных соответствующими формулами и имеющих фрагменты Z11 и Z12 красителя, характеризующиеся флуоресценцией, могут быть обозначены как "меченая структура". Меченая нуклеиновая кислота, содержащая меченую структуру, может быть обозначена как "меченый зонд".
В настоящем изобретении термин "последовательность нуклеиновой кислоты-мишени" относится не только к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которую нужно амплифицировать, но охватывает также и комплементарную ей последовательность.
В формулах (16)-(18b)
В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (адени-на, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или остов искусственного основания нуклеиновой кислоты; Е является:
(i) атомной группой, имеющей остов дезоксирибозы, остов рибозы или структуру, полученную из одного из этих сахаров, или
(ii) атомной группой, имеющей пептидную структуру или пептоидную структуру, каждый из Z11 и Z12 является атомной группой, характеризующейся флуоресценцией, и они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
каждый из L1, L2 и L3 является линкером (соединяющим атомом или соединяющей атомной группой), длина их основной цепи (число атомов основной цепи) является произвольной, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждый из атомов С, N, О, S, Р и Si, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, имино-группы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира, и L1, L2 и L3 могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга,
D представляет собой CR, N, Р, Р=0, В или SiR, и R является атомом водорода, алкильной группой или произвольным заместителем;
b является одинарной связью, двойной связью или тройной связью;
или, альтернативно, в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 является линкером, L3, D и b могут отсутствовать и L1 и L2 могут быть напрямую связаны с В, при условии, что в формулах (16), (17) и (18) Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S;
в формулах (16b), (17b) и (18b) E является атомной группой, описанной в подпункте (ii); и в формулах (17) и (17b) соответствующие В могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, и соответствующие Е могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от
друга. 1 2 3
В формулах (16)-(18b) длина основной цепи (число атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 предпочтительно является целым числом 2 или более. Ее верхний предел особо не ограничен и составляет, например, 100 или менее, более предпочтительно 30 или менее, и особенно предпочтительно 10 или менее.
Z11 и Z12 являются фрагментами флуоресцентного красителя, которые характеризуются экситонным эффектом. При такой конфигурации изменения в среде вокруг флуоресцентных красителей при связывании с последовательностью-мишенью, например увеличение флуоресценции при образовании структуры двойной спирали, становятся больше, и, следовательно, последовательность-мишень может быть обнаружена более эффективно.
Z11 и Z12 особо не ограничены, лишь бы только они характеризовались экситонным эффектом. Более предпочтительно, чтобы каждый из Z11 и Z12 независимо являлся, например, группой, полученной из любого из следующих красителей: тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемициани-на, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, а также их производных. Кроме того, по обстоятельствам, может быть использована группа, полученная из любого другого известного красителя. Известны многие флуоресцентные красители, которые изменяют интенсивность флуоресценции при связывании с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК. В качестве типичного примера, известно, что этидия бромид характеризуется сильной флуоресценцией при интеркаляции в структуру двойной спирали ДНК, и его часто используют для обнаружения ДНК. Кроме того, известны также флуоресцентные красители, интенсивность флуоресценции которых можно контролировать в соответствии с микроскопической полярностью, такие как пиренкарбоксиамид и продан. Тиазоловый оранжевый является флуоресцентным красителем с бензотиазоловым кольцом и хинолиновым кольцом, соединены друг с другом группой метина. Обычно он характеризуется слабой флуоресценцией, но дает сильную флуоресценцию при интеркаляции в ДНК, имеющую структуру двойной спирали. Другие примеры включают в себя такие красители, как флуоресцеин, Cy5 и Cy3.
где X1 и X2 являются S, Se или О;
n'' является 0 или положительным целым числом;
каждый из R1-R10 и R13-R21 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей ал-кильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой;
один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16)-(18b), а другой является атомом водорода или низшей алкильной группой;
когда множество R15 присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
когда множество R16 присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
1 О 1 01 11 1 О 191 19
X, Xи R-R В Z и X, X и R-R В Z могут соответственно быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.
В формулах (7)-(9) более предпочтительно, чтобы в R1-R21 низшая алкильная группа являлась линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 6, и низшая алкокси-группа является линейной или разветвленной алкоксигруппой с числом атомов углерода от 1 до 6.
В формулах (7)-(9) более предпочтительно, чтобы в R11 и R12 связывающая группа являлась полиме-тиленовой карбонильной группой с числом атомов углерода, составляющим по меньшей мере 2, и была связана с L1 или L2 в формуле (16)-(18) или (18b) во фрагменте карбонильной группы. Верхний предел числа атомов углерода полиметиленовой карбонильной группы особо не ограничен и составляет, например, 100 или менее, предпочтительно 50 или менее, более предпочтительно 30 или менее, и особенно предпочтительно 10 или менее.
Когда каждый из Z11 и Z12 представлен любой из формул (7)-(9), более предпочтительно, чтобы, например, каждый из них был независимо группой, представленной формулами (19) или (20):
В формулах (19) и (20) X означает -S- или -О-. Каждый из R1-R10 и R13 и R14 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей алкильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой. Один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16)-(18b), а другой является атомом водорода или группой низшего алкила.
Особенно предпочтительно, чтобы каждый из Z11 и Z12 независимо являлся фрагментом красителя, представленного одной из следующих химических формул.
Особенно предпочтительно, чтобы в каждой из приведенных выше химических формул n являлось положительным целым числом, причем в интервале от 2 до 6.
В формулах (16)-(18b) В может иметь остов природного основания нуклеиновой кислоты, а также, как описано выше, может иметь остов искусственного основания нуклеиновой кислоты. Например, В предпочтительно является структурой, представленной Py (пиримидиновое кольцо), Py der., Pu (пурино-вое кольцо) или Pu der. Py является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 1 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 5 в 6-членном кольце, представленном формулой (11). Py der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного кольца Py замещен атомом N, С, S или О, и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель. Pu является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 9 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 8 в конденсированном кольце, представленном формулой (12). Pu der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного кольца Pu замещен атомом N, С, S или О, и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель.
тх ^ТХ
(11) (12)
Молекула нуклеиновой кислоты в нуклеиновокислотном зонде согласно настоящему изобретению может включать в себя, например, по меньшей мере одну из нуклеотидных стрктур, представленных следующими химическими формулами 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2, их геометрическими изомерами и стереоизомерами, а также их солями.
В химических формулах 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2 длина линкера n предпочтительно является положительным целым числом, причем в интервале от 2 до 6.
Число меченых структур, входящих в нуклеиновокислотный зонд согласно настоящему изобретению, особо не ограничено и составляет, например, от приблизительно 1 до приблизительно 100, предпочтительно от примерно 1 до приблизительно 20. В меченом зонде участок, на котором включена меченая структура, также особо не ограничен.
В нуклеиновокислотном зонде (меченая нуклеиновая кислота) согласно настоящему изобретению остов из оснований каждой нуклеиновой кислоты особо не ограничен. Примеры таковых включают в себя олигонуклеотиды, модифицированные олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, модифицированные олигонуклеозиды, полинуклеотиды, модифицированные полинуклеотиды, полинуклеозиды, модифицированные полинуклеозиды, ДНК, модифицированные ДНК, РНК, модифицированные РНК, LNA, PNA (пептидо-нуклеиновые кислоты), их химерные молекулы и другие структуры. Кроме того, остов из осно
ваний каждой нуклеиновой кислоты может быть природным или искусственно синтезированным остовом. В случае нуклеиновокислотного зонда согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота особо не ограничена, если, например, ею обеспечено спаривание оснований. В случае образца нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, указанная нуклеиновая кислота особо не ограничена, если, например, она служит в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи. Следовательно, нуклеиновая кислота может быть нуклеотидным производным, часть которого, например, или которое целиком образовано полностью искусственной структурой. Примеры искусственных оснований, которые входят в состав нуклеиновой кислоты, включают в себя, но не ограничены 2-амино-6-(^№диметиламино)пурин пиридин-2-оном, 5-метилпиридин-2-оном, 2-амино-6-(2-тиенил)пурином, пиррол-2-карбальдегидом, 9-метилимидазо[(4,5)-b]пиридином, 5-йодо-2-оксо(1Н)пиридин 2-оксо-(1Н)пиридином, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурином и 7-(2-тиенил)-имидазо[4,5-b]пиридином. В нуклеино-вокислотном зонде согласно настоящему изобретению основным остовом предпочтительно является олигонуклеотид, полинуклеотид, ДНК или их модифицированный продукт. В настоящем изобретении "нуклеотид" может быть, например, либо дезоксинуклеотидом, либо рибонуклеотидом, и каждый из "олигонуклеотида" и "полинуклеотида" может состоять либо из дезоксинуклеотида, либо из рибонуклео-тида, или же может содержать оба этих типа нуклеотидов. В настоящем изобретении количество оснований, которое составляет нуклеиновую кислоту, особо не ограничено. Обычно термин "нуклеиновая кислота" является синонимом термина "полинуклеотид". Обычно термин "олигонуклеотид" используется как термин, указывающий на то, что такой полинуклеотид составлен из особенно малого числа оснований по сравнению с другими полинуклеотидами. Обычно, например, 2-100-мерный, чаще приблизительно 2-50-мерный полинуклеотид называют "олигонуклеотидом", но он не ограничен указанными числовыми значениями. В настоящем изобретении термин "полинуклеотид" также следует интерпретировать как, например, полинуклеотид и олигонуклеотид, а также искусственно синтезированные нуклеиновые кислоты, такие как пептидо-нуклеиновая кислота, морфолин-нуклеиновая кислота, метилфосфонат-нуклеиновая кислота и S-олиго-нуклеиновая кислота.
Обычно пептидо-нуклеиновая кислота (PNA) имеет структуру, в которой дезоксирибозная основная цепь олигонуклеотида заменена пептидной основной цепью. Примеры пептидной основной цепи включают в себя повторяющийся элемент ^(2-аминоэтил)глицина, связанный амидной связью. Примеры основания, которое может быть связано с основной пептидной цепью PNA, включают в себя, но не ограничены образующимися природным образом основаниями, такими как тимин, цитозин, аденин, гуанин, инозин, урацил, 5-метилцитозин, тиоурацил и 2,6-диаминопурин; и искусственными основаниями, такими как бромтимин, азааденин и азагуанин.
Обычно LNA является нуклеиновой кислотой, имеющей две циклические структуры, в сахаро-фосфатном остове (скелете) которых атом водорода в 2'-положении и атом углерода в 4'-положении ри-бозы связаны друг с другом посредством метиленовой поперечной связи. Когда олигонуклеотид, содержащий LNA, отжигают с ДНК, конформация двойной спирали видоизменяется, и в результате термостабильность увеличивается. LNA имеет более высокую аффинность связывания с нуклеиновой кислотой, чем обычный олигонуклеотид. Таким образом, например, в зависимости от условий конструирования олигонуклеотида, можно добиться более надежной и сильной гибридизации.
Число оснований, содержащихся в Eprimer или Eprobe, особо не ограничено и может составлять, например, от приблизительно 3 до приблизительно 100, предпочтительно от 6 до 50 и более предпочтительно от 6 до 25.
Неочищенный материал Eprimer или Eprobe особо не ограничен и может представлять собой, например, нуклеиновую кислоту или меченое вещество, описанное ниже.
Таким соединением является соединение, имеющее структуру, полученную из мононуклеозида или мононуклеотида, а такой структурой является соединение, представленное следующими формулами (1), (lb) или (1с), его таутомеры или стереоизомеры, а также его соли.
(1) (lb) (1с)
В формулах (1)-(1 с)
В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (адени-на, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или остов искусственного основания нуклеиновой кислоты;
Е является:
(i) атомной группой, имеющей остов дезоксирибозы, остов рибозы или структуру, полученную из одного из этих сахаров, или
(ii) атомной группой, имеющей пептидную структуру или пептоидную структуру, каждый из Z11 и Z12 является атомом водорода, защитной группой или атомной группой, которая обладает флуоресценцией, и могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, Q является О, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), или NH, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (ii);
X является атомом водорода, защитной группой гидроксильной группы, с которой защита может быть снята кислотой, фосфатной группой (монофосфатной группой), бифосфатной группой или трифос-фатной группой, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), или атомом водорода или защитной группой аминогруппы, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (ii);
Y является атомом водорода, защитной группой гидроксильной группы или фосфорамидитной группой, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), или атомом водорода или защитной группой, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (ii);
каждый из L1, L2 и L3 является линкером (связующим атомом или связующей атомной группой), длина основной цепи которого (число атомов в основной цепи) является произвольной, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждый из С, N, О, S, Р и Si, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира, и L1, L2 и L3 могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
D представляет собой CR, N, Р, Р=0, В или SiR, и R является атомом водорода, алкильной группой или произвольным заместителем;
b является одинарной связью, двойной связью или тройной связью;
или, альтернативно, в формуле (1) каждый из L1 и L2 является линкером, L3, D и b могут отсутствовать и L1 и L2 могут быть напрямую связаны с В;
в формуле (1b) Т является связью фосфорной кислоты (PO4-), в которой по меньшей мере один атом кислорода (О) может быть замещен атомом серы (S), когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), или NH, когда Е является атомной группой, описанной в подпункте (ii).
В формулах (1), (1b) и (1c) E предпочтительно является атомной группой, имеющей структуру основной цепи, например ДНК, модифицированной ДНК, РНК, модифицированной РНК, LNA или PNA (пептидо-нуклеиновая кислота).
В формулах (1) и (1с) предпочтительно, чтобы атомная группа, представленная как
являлась атомной группой, представленной одной из следующих формул (2)-(4):
¦OY
(2)
(4)
В формулах (2)-(4) и (2b)-(4b)
А является атомом водорода, гидроксильной группой, алкильной группой, алкоксигруппой или электроноакцепторной группой, каждый из М и J является СН2, NH, О или S и могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
В, X и Y соответственно идентичны таковым в формулах (1), (1b) или (1с), и в формулах (2)-(3b) по меньшей мере один атом О, находящийся в связи фосфорной кислоты, может быть замещен атомом S.
Е предпочтительно является атомной группой, имеющей, например, структуру основной цепи ДНК, модифицированной ДНК, РНК или модифицированной РНК, например, с точки зрения облегченного синтеза. Однако Е может быть атомной группой, имеющей структуру основной цепи LNA или PNA (пеп-тидо-нуклеиновая кислота).
В формулах (2) и (2b) предпочтительно, чтобы в А, например, алкильная группа была метильной группой, алкоксигруппа была метоксильной группой, а электроноакцепторная группа была галогеном.
В формулах (1), (1b) или (1 с) предпочтительно, чтобы длина основной цепи (число атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 была целым числом 2 или более. Верхний предел длины основной цепи (количество атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3, как описано выше, особо не ограничен и составляет, например, 100 или менее.
Сб ь) (6с)
В формулах (5)-(6с) l, m и n' являются произвольными, l, m и n' могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, каждый из l, m и n' может содержать, а может и не содержать каждый из С, N, О, S, Р и Si в своей основной цепи, и каждый из l, m и n' может содержать, а может и не содержать в своей основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира. В, Е, Z11, Z12, b, X, Y и Т являются соответственно идентичными таковым в формулах (1) и (1b). В формулах (5), (6), (6b) и (6с) каждый из l, m и n предпочтительно является целым числом от 2 или более. Верхние пределы для чисел l, m и n особо не ограничены и составляют, например, 100 или менее, более предпочтительно 30 или менее, и особенно предпочтительно 10 или менее.
В таком соединении предпочтительно, чтобы Z11 и Z12 были фрагментами красителя, который характеризуется экситонным эффектом. Это позволяет существенно усилить флуоресценцию, например, при образовании структуры двойной спирали, с тем, чтобы двойную спираль можно было обнаруживать более эффективно. Следует отметить, однако, что в таком соединении, даже когда Z11 и Z12 не являются фрагментами красителя, которые не характеризуются экситонным эффектом, или даже когда только один фрагмент красителя (краситель), который обладает флуоресценцией, встроен в одну молекулу, все еще возможно осуществить эффективную детекцию структуры двойной спирали.
Предпочтительно, чтобы Z11 и Z12 являлись, например, фрагментами красителя, обладающего флуоресцентными свойствами, как описано выше. Фрагменты красителей, обладающие флуоресцентными свойствами, особо не ограничены, лишь бы только они характеризовались экситонным эффектом. Более предпочтительно, чтобы каждый из Z11 и Z12 независимо являлся, например, группой, полученной из любого из следующих красителей: тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина, а также их производных. Кроме того, по обстоятельствам, может быть использована группа, полученная из любого другого известного красителя. Известны многие флуоресцентные красители, которые изменяют интенсивность флуоресценции при связывании с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК. В качестве типичного примера, известно, что этидия бромид характеризуется сильной флуоресценцией при интеркаляции в структуру двойной спирали ДНК, и его часто используют для обнаружения ДНК. Кроме того, известны также флуоресцентные красители, интенсивность флуоресценции которых можно контролировать в соответствии с микроскопической полярностью, такие как пиренкарбоксиамид и продан. Тиазоловый оранжевый является флуоресцентным красителем с бензотиазоловым кольцом и хинолиновым кольцом, соединенными друг с другом метиновой группой. Обычно он характеризуется слабой флуоресценцией, но дает сильную флуоресценцию при интеркаляции в ДНК, имеющую структуру двойной спирали. Другие примеры включают в себя такие красители, как флуоресцеин и Cy3.
Более предпочтительно, чтобы каждый из Z11 и Z12 независимо был, например, атомной группой, представленной любой из следующих формул (7)-(9):
где X1 является S, О или Se;
n'' является 0 или целым положительным числом;
каждый из R1-R10 и R13-R21 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей ал-кильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой;
один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (1), (1b) или (1с) или NH в формулах (5), (6), (6b) или (6с), а другой является атомом водорода или низшей ал-кильной группой;
когда множество R15 присутствует в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
когда множество R16 присутствует в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
X1 и R1-R21 в Z11 и X1 и R1-R21 в Z12 могут соответственно быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.
В формулах (7)-(9) более предпочтительно, чтобы в R1-R21 низшая алкильная группа являлась линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 6, и низшая алкокси-группа являлась линейной или разветвленной алкоксигруппой с числом атомов углерода от 1 до 6.
В формулах (7)-(9) более предпочтительно, чтобы в R11 и R12 связывающая группа являлась полиме-тиленовой карбонильной группой с числом атомов углерода, составляющим по меньшей мере 2, и связывалась с L1 или L2 в формуле (1), (1b) или (1 с) или с NH в формуле (5), (6), (6b) или (6c) во фрагменте карбонильной группы. Верхний предел числа атомов углерода полиметиленовой карбонильной группы особо не ограничен и составляет, например, 100 или менее.
Когда каждый из Z11 и Z12 представлен любой из формул (7)-(9), более предпочтительно, чтобы каждый из них независимо представлял собой, например, группу, представленную формулами (19) или (20):
В формулах (19) и (20) X означает -S- или -О-. Каждый из R1-R10 и R13 и R14 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей алкильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой. Один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формуле (1), (1b) или (1с) или NH в формулах (5), (6), (6b) или (6c), а другой является атомом водорода или низшей алкильной группой.
Такое соединение может быть, например, соединением, имеющим структуру, представленную следующей формулой (10), его таутомером или стереоизомером, или его солью.
(10)
В формуле (10) Е, Z11, Z12, Q, X и Y являются соответственно идентичными таковым в формуле (1).
В формулах (1), (1b) и (1 с) В может иметь остов природного основания нуклеиновой кислоты, а также, как описано выше, может иметь остов искусственного основания нуклеиновой кислоты. Например, В предпочтительно является структурой, представленной Ру, Py der., Pu или Pu der. Py является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 1 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 5 в 6-членном кольце, представленном формулой (11). Py der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного кольца Py замещен атомом N, С, S или О, и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель. Pu является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 9 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 8 в конденсированном кольце, представленном формулой (12). Pu der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного кольца Pu замещен атомом N, С, S или О, и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель.
N- 5 N
В формулах (13) и (14) Е, Z11, Z12, Q, X и Y являются соответственно идентичными таковым в формуле (1) и Ру, Py der., Pu и Pu der. являются такими, как определено выше.
Когда такое соединение имеет фосфорамидитную группу, предпочтительно, чтобы фосфорамидит-ная группа была представлена, например, следующей формулой (15):
-P(OR22)N(R23)(R24) (15).
В формуле (15) R22 является защитной группой фосфатной группы и каждый из R23 и R24 является алкильной группой или арильной группой.
В формуле (15) более предпочтительно, чтобы R15 являлся цианоэтильной группой и чтобы в R16 и R17 алкильная группа была изопропиловой группой, а арильная группа была бы фенильной группой.
В данном соединении, например, соединение, представленное приведенной выше формулой (1), может быть соединением, представленным следующей формулой (21):
(2 1)
В формуле (21) А является атомом водорода или гидроксильной группой. Предпочтительно, чтобы А было атомом водорода. В является остатком аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила. Например, аденин и гуанин связаны с двойной спиралью в 8 положении, а цитозин и тимин или урацил связаны с двойной спиралью в 5 положении. Каждый из Z11 и Z12 независимо является фрагментом красителя, который обладает флуоресценцией, атомом водорода или защитной группой аминогруппы. Особенно предпочтительно, чтобы каждый из них независимо был остатком производного тиазолового оранжевого или производного оксазолового желтого. X является атомом водорода, защитной группой гидроксильной группы, с которой защита может быть снята кислотой, монофосфатной группой, бифосфатной группой
(2 2)
В формуле (22) А является атомом водорода или гидроксильной группой. Каждый из Z11 и Z12 независимо является фрагментом красителя, который обладает флуоресценцией, атомом водорода или защитной группой аминогруппы, и особенно предпочтительно остатком производного тиазолового оранжевого или производного оксазолового желтого. X является атомом водорода, защитной группой гидро-ксильной группы, с которой защита может быть снята кислотой, монофосфатной группой, бифосфатной группой или трифосфатной группой. Y является атомом водорода, защитной группой гидроксильной группы или фосфорамидитной группой.
В соединении формулы (21) или (22), когда каждый из Z11 и Z12 является атомом водорода или защитной группой аминогруппы, в одной молекуле содержатся две аминогруппы (или защищенные аминогруппы). Таким образом, используя эти аминогруппы, в одну молекулу можно включить две меченые молекулы. Например, когда меченую нуклеиновую кислоту получают, например, путем ее соединения с флуоресцентным веществом или с хемилюминесцентным веществом, можно улучшить чувствительность детекции нуклеиновой кислоты. Кроме того, как и в случае, когда каждый из Z11 и Z12 является фрагментом красителя, который обладает флуоресценцией, мечение нуклеиновой кислоты специфическим флуоресцентным веществом создает возможность облегченной детекции такой нуклеиновой кислоты.
Кроме того, соединение формулы (21) или (22), в котором каждый из Z11 и Z12 представляет собой фрагмент красителя, который обладает флуоресценцией, является нуклеозидом или нуклеотидом, модифицированным двумя флуоресцентными молекулами, каждая из которых является, например, производным тиазолового оранжевого или производным оксазолового желтого. Когда зонд, состоящий из одноце-почечной нуклеиновой кислоты, содержащей такое соединение, используется как таковой, он излучает очень слабую флуоресценцию в силу тушения, обусловленного экситонным спариванием. Однако он излучает сильную флуоресценцию, когда гибридизуется с ДНК или РНК. То есть, например, флуоресценция производного тиазолового оранжевого или производного оксазолового желтого строго подавляется их деформированной структурой, но когда производное тиазолового оранжевого или производное оксазолового желтого связывается с ДНК, структурная деформация исчезает, и это состояние фиксируется, позволяя им, таким образом, излучать сильную флуоресценцию. Флуоресценция может быть обнаружена, например, по возбуждению, выполняемому с использованием аргонового лазера с длиной волны 488 нм или 514 нм, но способ детекции этим не ограничивается.
Соединение, представленное формулами (1), (1b) или (1с), может быть использовано, например, для синтеза Eprimer или Eprobe (меченая нуклеиновая кислота). То есть указанное соединение может быть использовано в качестве маркирующего вещества для нуклеиновой кислоты (реагент для маркировки нуклеиновой кислоты). Например, с помощью соединения, представленного формулой (1), (1b) или (1 с) в качестве нуклеотидного субстрата, и проведения реакции синтеза нуклеиновой кислоты с использованием одноцепочечной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, или путем химического синтеза одноце-почечной нуклеиновой кислоты (например, такой способ химического синтеза как фосфорамидитный метод, который осуществляется с использованием автоматического синтезатора нуклеиновых кислот) с использованием соединения, представленного формулой (1), (1b) или (1 с), можно получить нуклеиновую кислоту, в одной молекуле которой содержится по меньшей мере одна молекула указанного соединения. В этом случае каждый из фрагментов красителя Z11 и Z12 может быть фрагментом красителя, который обладает флуоресценцией, но может быть также и атомом водорода или защитной группой. Когда каждый из фрагментов красителя Z11 и Z12 является, например, фрагментом, который обладает флуоресценцией, может быть получен меченый зонд согласно изобретению. Когда каждый из фрагментов красителя Z11 и Z12 является атомом водорода или защитной группой, меченый зонд согласно изобретению может быть получен путем дальнейшей замены атома или группы фрагментом красителя, который обладает флуоресценцией.
Число соединений, представленных формулами (1), (1b) или (1с), которые включены в Eprimer или Eprobe, особо не ограничено. Оно составляет, например, от приблизительно 1 до приблизительно 100, предпочтительно от примерно 1 до приблизительно 20.
Такое соединение или нуклеиновая кислота (меченый зонд) может иметь структуру, представленную, например, любой из следующих формул (23)-(25). В такой конфигурации оно может быть использовано в качестве флуоресцентного Eprobe (fluorescencEprobe) со встроенным в него красителем. Однако соединение, подходящее в качестве fluorescencEprobe, этим не ограничено.
I 'И
(2 3)
В формуле (23) два красителя (флуоресцентных) связаны с основанием В. Участок, на котором основание В связывается с линкером, особо не ограничен. Например, основание В связано с линкером в одном положении, выбранном из положения 4, положения 5 и положения 6 пиримидина и положения 2, положения 3, положения 6, положения 7 и положения 8 пурина. Линкер имеет один сайт связывания с основанием. По пути линкер разветвляется по меньшей мере на два и связывается с красителями на их концах. Способом, используемым для связывания линкера с основанием или с красителем, может быть не только образование связи посредством катализируемой металлом реакции, реакции конденсации с образованием кольца, реакции Майкла или т.п., с двойной связью или тройной связью, но также и образование амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи или реакции образования имина или т.п. Что касается линкера, его длины (l, m и n) являются произвольными, и он может содержать одинарную связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, аминную, иминную, эфирную связь, связь простого тиоэфира, связь сложного тиоэфира или т.п. Кроме того, предпочтительно, чтобы линкер не препятствовал экситонному эффекту, вызванному димеризаци-ей. Разветвленной частью (X) является каждый атом углерода, кремния, азота, фосфора, бора, и может произойти протонирование (например, NH+) или окисление (например, Р=Э). Предпочтительно, чтобы краситель был таким красителем, у которого при димеризации обнаруживается экситонный эффект, и участок, на котором краситель связывается с линкером, может быть любым его участком. В формуле (23) показан дезоксирибонуклеотид, который является частичной структурой ДНК. Однако вместо дезокси-рибонуклеотида нуклеиновокислотным остовом может быть рибонуклеотид (РНК), или может быть также модифицированная по сахару нуклеиновая кислота, такая как 2'-О-метил-РНК или 2'-фтор-ДНК, нуклеиновая кислота, модифицированная по фосфорной кислоте, такая как фосфоротиоатная нуклеиновая кислота, или функциональная нуклеиновая кислота, такая как PNA или LNA (BNA).
В формуле (24) два красителя (Fluo) связаны с основанием В. Участки, на которых основание В связывается с линкерами, особо не ограничены. Например, основание В связано с линкерами в двух положениях, выбранных из положения 4, положения 5 и положения 6 пиримидина и положения 2, положения 3, положения 6, положения 7 и положения 8 пурина. Каждый из двух линкеров имеет один сайт связывания с основанием, а на другом своем конце связывается с красителем. Способом, используемым для связывания линкера с основанием или с красителем, может быть не только образование связи посредством катализируемой металлом реакции, реакции конденсации с образованием кольца, реакции Майкла или т. п., с двойной связью или тройной связью, но также и образование амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи или связи, образованной в результате реакции образования имина, или т.п. Что касается линкеров, их длины (l и m) являются произвольными, и они могут содержать одинарную связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, аминную, иминную, эфирную связь, связь простого тиоэфира, связь сложного тиоэфира или т.п. Кроме того, предпочтительно, чтобы линкеры не препятствовали экситонному эффекту, вызванному димеризацией. Предпочтительно, чтобы краситель был таким красителем, у которого при димеризации обнаруживается экситонный эффект, и участок, на котором краситель связывается с линкером, может быть любым его участком. В формуле (24) приведен дезоксирибонуклеотид, который является частичной структурой ДНК. Однако вместо дезоксирибонуклеотида нуклеиновокислотным остовом может быть рибонуклеотид
(2 5)
В формуле (25) один краситель (Fluo) соединен с каждым основанием (В1, В2) непрерывной цепи нуклеотидов. Участок, на котором каждое основание связывается с линкером, особо не ограничен. Например, каждое основание соединено с линкером в одном положении, выбранном из положения 4, положения 5 и положения 6 пиримидина и положения 2, положения 3, положения 6, положения 7 и положения 8 пурина. Каждый из двух линкеров имеет один сайт связывания с основанием, а на другом своем конце соединяется с красителем. Способом, используемым для соединения линкеров с основаниями или с красителями, может быть не только образование связи посредством, например, катализируемой металлом реакции, реакции конденсации с образованием кольца, реакции Майкла с двойной связью или тройной связью, но также, например, и образование амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи или связи, образованной, например, в результате реакции образования имина.
Что касается линкеров, их длины (l и m) являются произвольными, и они могут содержать одинарную связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, аминную, иминную, эфирную связь, связь простого тиоэфира, связь сложного тиоэфира или т.п. Кроме того, предпочтительно, чтобы линкеры не препятствовали экситонному эффекту, вызванному димериза-цией. Предпочтительно, чтобы краситель был таким красителем, у которого при димеризации обнаруживается экситонный эффект, и участок, на котором краситель соединяется с линкером, может быть любым его участком. В формуле (25) приведен дезоксирибонуклеотид, который является частичной структурой ДНК. Однако вместо дезоксирибонуклеотида нуклеиновокислотным остовом может быть рибонуклеотид (РНК), или может быть также модифицированная по сахару нуклеиновая кислота, такая как 2'-О-метил-РНК или 2'-фтор-ДНК, модифицированная по фосфорной кислоте нуклеиновая кислота, такая как фос-форотиоатная нуклеиновая кислота, или функциональная нуклеиновая кислота, такая как PNA или LNA (BNA).
Когда соединение или нуклеиновая кислота (например, меченая нуклеиновая кислота согласно изобретению) имеет изомер, такой как таутомер или стереоизомер (например, геометрический изомер, кон-формер или оптический изомер), любой из изомеров может быть использован в настоящем изобретении. Соль соединения или нуклеиновой кислоты может быть солью присоединения кислот, а также может быть солью присоединения оснований. Кроме того, кислота, которая образует соль присоединения кислот, может быть неорганической кислотой или органической кислотой, а основание, которое образует соль присоединения оснований, может быть неорганическим основанием или органическим основанием. Неорганическая кислота особо не ограничена, и ее примеры включают в себя серную кислоту, фосфорную кислоту, фтористоводородную кислоту, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, йодистоводородную кислоту, гипофтористую кислоту, гипохлористую кислоту, гипобромистую кислоту, гипойодистую кислоту, фтористую кислоту, хлористую кислоту, бромистую кислоту, йодистую кислоту, фторноватую кислоту, хлорноватую кислоту, бромноватую кислоту, йодноватую кислоту, пер-фторную кислоту, перхлорную кислоту, пербромную кислоту и перйодную кислоту. Органическая кислота также особо не ограничена, и ее примеры включают в себя пара-толуолсульфокислоту, метансуль-фоновую кислоту, щавелевую кислоту, пара-бромбензолсульфоновую кислоту, карбоновую кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту и уксусную кислоту. Неорганическое основание особо не ограничено, и его примеры включают в себя гидроокись аммония, гидроксид щелочного металла, гидроксид щелочноземельного металла, карбонат и гидрокарбонат. Их более специфические примеры включают в себя гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат калия, карбонат натрия, бикарбонат натрия, гидрокарбонат калия, гидроксид кальция и карбонат кальция. Органическое основание также не ограничено, и его примеры включают в себя этаноламин, триэтиламин и трис-(гидроксиметил)аминометан. Способ получения их солей также особо не ограничен. Они могут быть получены способом, в котором, например, кислоты или основания, как описано выше, добавляются, в случае необходимости, к молекуле, связывающейся с донором/рецептором электрона с помощью известного способа. Кроме того, когда заместитель или т.п. имеет изомер, может быть использован любой из
изомеров. Например, в случае "нафтильной группы" это может быть 1-нафтильная группа или 2-нафтильная группа.
Кроме того, в настоящем изобретении алкильная группа особо не ограничена. Примеры таковой включают в себя метильную группу, этильную группу, н-пропильную группу, изопропильную группу, н-бутильную группу, изобутильную группу, втор-бутильную группу и трет-бутильную группу. То же самое относится и к группам, содержащим в своих структурах алкильные группы (например, алкиламино-группу и алкоксигруппу). Более того, перфторалкильная группа особо не ограничена. Ее примеры включают в себя перфторалкильные группы, полученные из метильной группы, этильной группы, н-пропильной группы, изопропильной группы, н-бутильной группы, изобутильной группы, втор-бутильной группы и трет-бутильной группы. То же самое относится и к группам, содержащим в своих структурах перфторалкильные группы (например, перфторалкил-сульфонильную группу и перфторура-цильную группу). В настоящем изобретении ацильная группа особо не ограничена. Ее примеры включают в себя формильную группу, ацетильную группу, пропионильную группу, изобутирильную группу, валерильную группу, изовалерильную группу, пивалоильную группу, гексаноильную группу, циклогек-саноильную группу, бензоильную группу и этоксикарбонильную группу. То же самое относится и к группам, содержащим в своих структурах ацильные группы (например, ацилоксигруппу и алканоилокси-группу). В настоящем изобретении число атомов углерода в ацильной группе включает в себя атом углерода карбонильной группы. Например, алканоильная группа (ацильная группа) с атомом углерода в количестве 1 указывает на формильную группу. Кроме того, в настоящем изобретении "галоген" относится к необязательному галогеновому элементу, и такие примеры включают в себя фтор, хлор, бром и йод. В настоящем изобретении защитная группа аминогруппы особо не ограничена. Ее примеры включают в себя трифторацетильную группу, формильную группу, С1-6-алкилкарбонильную группу (например, ацетильную и этилкарбонильную), С1-6-алкилсульфонильную группу, трет-бутилоксикарбонильную группу (здесь далее называемую также "Boc"), бензилоксикарбонильную группу, аллилоксикарбонильную группу, флуоренил-метилоксикарбонильную группу, арилкарбонильную группу (например, фенилкарбониль-ную и нафтилкарбонильную), арилсульфонильную группу (например, фенилсульфонильную и нафтил-сульфонильную), С1-6-алкилоксикарбонильную группу (например, метоксикарбонильную и этоксикарбо-нильную), С7-10-аралкилкарбонильную группу (например, бензилкарбонильную), метильную группу и аралкильную группу (например, бензильную, дифенилметильную и тритильную группу). Указанные группы могут быть замещены, например, одним-тремя атомами галогена (например, фтора, хлора или брома) или нитрогруппами. Их специфические примеры включают в себя пара-нитробензилоксикарбонильную группу, пара-хлорбензилоксикарбонильную группу, моно-хлорбензилокси-карбонильную группу и пара-метоксибензилокси-карбонильную группу. В настоящем изобретении защитная группа гидроксильной группы (включая и такую, с которой кислотой может быть снята защита) особо не ограничен. Ее примеры включают в себя диметокситритильную группу, мономе-токситритильную группу и пиксильную группу.
Способ получения Eprimer или Eprobe особо не ограничен. Например, Eprimer или Eprobe могут быть получены, в зависимости от обстоятельств, со ссылкой на известный способ синтеза (способ получения). В частности, Eprimer или Eprobe могут быть получены в соответствии со способом, описанным, например, в патенте Японии № 4370385.
В качестве одного из иллюстративных примеров соединение, представленное приведенной выше формулой (21), может быть получено способом, включающим в себя стадии реагирования трис-(2-аминоэтил)амина с соединением, представленным следующей формулой (26), после того, как активируют карбоксильную группу указанного соединения; защиты аминогруппы; и осуществления реакции для защиты гидроксильной группы, присутствующей в соединении, полученном выше с защитной группой, и реакции присоединения фосфорной кислоты или фосфорамидитной группы к гидроксильной группе, присутствующей в полученном выше соединении.
(2 6)
В формуле (26) А является атомом водорода или гидроксильной группой. В является остатком аде-нина, гуанина, цитозина, тимина или урацила.
Например, для получения Eprimer или Eprobe может быть использован следующий способ (способ синтеза). То есть в качестве простого метода маркировки ДНК широко используется способ, в котором активную аминогруппу, содержащуюся в ДНК, и активированную карбоксильную группу в маркировочном агенте подвергают взаимодействию друг с другом в буферном растворе. Такой способ может быть использован для получения как соединения, так и нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобрете
нию, и он может быть использован, в частности, для введения линкера или красителя. Примеры способа введения аминогруппы включают в себя способ с использованием аминомодификатора фосфорамидита, коммерчески доступного в GLEN RESEARCH.
Каждый из фрагментов красителя Z11 и Z12 может быть преобразован, например, из формы с защит-
ной группой в форму с атомом водорода (то есть защитную группу удаляют), и затем атом водорода мо-
жет быть замещен фрагментом красителя (красителем), обладающим флуоресцентными свойствами.
Способ удаления защитной группы особо не ограничен, и, в зависимости от обстоятельств, может быть
использован какой-нибудь из известных способов. Способ замещения фрагментом красителя (красите-
лем), обладающим флуоресцентными свойствами, также особо не ограничен. Например, соединение или
нуклеиновую кислоту согласно изобретению, где каждый из Z11 и Z12 является атомом водорода, можно
ввести в реакцию с флуоресцентной молекулой (красителем). Например, предпочтительно, чтобы по
меньшей мере один из Z11 и Z12 был активной аминогруппой, потому что это позволит соединению или
нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению более легко реагировать с флуоресцентной мо-
лекулой (красителем). Более предпочтительно, чтобы были активными аминогруппами. Флу-
оресцентная молекула (краситель) также особо не ограничена и может быть, например, соединением,
представленным любой из формул (7)-(9) (где оба, R11 и R12, являются атомами водорода или низшими
алкильными группами, или карбоксиметиленовыми группами). Кроме того, в случае нуклеиновой кисло-
ты (полинуклеотид, полинуклеозид, олигонуклеотид или олигонуклеозид) стадия удаления защитной
группы и стадия замещения фрагментом красителя (красителем), обладающим флуоресцентными свой-
ствами, может быть реализована либо до, либо после полимеризации (синтез нуклеиновой кислоты). На-
пример, с точки зрения предотвращения разрушения части красителя в процессе синтеза предпочтитель-
но вводить фрагмент красителя (краситель), обладающего флуоресцентными свойствами, после полиме-
ризации (синтеза нуклеиновой кислоты).
Как описано выше, краситель особо не ограничен, и можно использовать любые красители. Например, предпочтителен цианиновый краситель, и особенно предпочтителен тиазоловый оранжевый. Циа-ниновый краситель имеет химическую структуру, в которой, например, два гетероцикла, имеющих два гетероатома, соединены друг с другом метиновым линкером. Можно синтезировать флуоресцентные красители, используя различные длины волн возбуждения/испускания, меняя, например, тип гетероцик-лов или длину метинового линкера или вводя заместитель в гетероциклы. Кроме того, относительно легко также введение линкера для введения ДНК. Хотя тиазоловый оранжевый в воде едва излучает флуоресценцию, при взаимодействии с ДНК или РНК он излучает сильную флуоресценцию. Считается, что взаимодействие с нуклеиновой кислотой препятствует взаимодействию между молекулами красителя и предотвращает вращение вокруг метинового линкера, локализованного между указанными двумя гете-роциклами молекул красителя, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Способ применения красителя тиазолового оранжевого хорошо известен. Его применение возможно, например, в соответствии с публикацией KS. Rye, M.A. Quesada, K. Peck, R.A. Mathies and A.N. Glazer, High-sensitivity two-color detection of double-stranded DNA with a confocal fluorescence gel scanner using ethidium homodimer and thiazol orange, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 327-33; а также L.G. Lee, С.Н. Chen and L.A. Chiu, Thiazol orange: a new dye for reticulocyte analysis, Cytometry, 1986, 7, 508-17.
В настоящем изобретении, как описано выше, остов из оснований (основный остов) в Eprimer или Eprobe особо не ограничен. Это может быть, например, любой из олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов, модифицированных олигонуклеозидов, полинуклеотидов, модифицированных полинуклеотидов, полинуклеозидов, модифицированных полинуклеозидов, ДНК, модифицированных ДНК, РНК, модифицированных РНК, LNA, PNA (пептидо-нуклеиновые кислоты), а также могут быть другие структуры. Основным остовом предпочтительно является [остов] ДНК, модифицированной ДНК, РНК или модифицированной РНК, поскольку зонд нуклеиновой кислоты может быть легко синтезирован, а кроме того, например, может легко осуществляться замещение красителем (введение молекулы красителя). Способ введения молекулы красителя в LNA или PNA особо не ограничен, и можно использовать любой наиболее подходящий из известных способов. В этом отношении можно, в частности, сослаться, например, на публикацию Analytical Biochemistry 2000, 281, 26-35, Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M (2000) Anal Biochem. 281, 26-35. Hrdlicka, P. J., Babu, B. R., Sorensen, M. D., Harrit, N., Wengel, J. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127, 13293-13299.
Способ синтезирования нуклеиновой кислоты, имеющей в качестве основного остова олигонуклео-тид, модифицированный олигонуклеотид, олигонуклеозид, модифицированный олигонуклеозид, поли-нуклеотид, модифицированный полинуклеотид, полинуклеозид, модифицированный полинуклеозид, ДНК, модифицированную ДНК, РНК или модифицированную РНК, хорошо известен. Например, она может быть синтезирована так называемым фосфорамидитным способом. Фосфорамидитный реагент, служащий для этого в качестве сырого материала, также может быть легко синтезирован известным способом. Когда нуклеиновой кислотой согласно настоящему изобретению является ДНК, в частности короткая олиго-ДНК, ее можно с легкостью синтезировать, например, с помощью автоматизированного ДНК-синтезатора или т. п. Кроме того, можно также синтезировать длинноцепочечную нуклеиновую кислоту (ДНК) и т. д., например, методом ПЦР. Как описано выше, положение, в котором осуществляется
связывание ДНК и молекулы красителя друг с другом, особо не ограничено, и особенно предпочтительно, чтобы это было, например, положение 5 тимидина. Трифосфорная кислота нуклеотидного производного с различными заместителями, наращиваемая от положения 5 тимидина, имеет, как известно, относительно высокую эффективность введения, осуществляемого с использованием ДНК-полимеразы. Соответственно нуклеиновую кислоту согласно изобретению можно с легкостью синтезировать не только тогда, когда это, например, короткая олиго-ДНК, но также тогда, когда это длинноцепочечная ДНК.
В частности, fluorescencEprobe (меченая нуклеиновая кислота) согласно настоящему изобретению, который является одноцепочечной ДНК, с используемым в его получении, например, тиазоловым оранжевым, имеет, например, следующие преимущества:
(1) он может быть легко синтезирован, потому что его можно получить просто путем введения - в буферном растворе красителя в ДНК, синтезируемую с помощью автоматизированного ДНК-синтезатора; и (2) можно также получить длинноцепочечную fluorescencEprobe в результате реакции красителя с длинноцепочечной ДНК, полученной ферментативным способом. Кроме того, он может быть возбужден светом, имеющим относительно большую длину волны порядка, например, 500 нм.
Далее будут описаны фрагменты флуоресцентного красителя [праймера] Eprimer или [зонда] Eprobe. Каждый из фрагментов флуоресцентного красителя может быть, например:
(i) таковым, который излучает флуоресценцию, с двумя планарными химическими структурами, содержащимися в одной молекуле, которые излучают не в одной и той же плоскости, а под определенным углом, образованным этими планарными структурами, но которые локализованы таким образом, что когда указанная молекула претерпевает связывание с бороздкой или интеркаляцию в нуклеиновую кислоту, они располагаются в одной плоскости;
(ii) таковым, образованным по меньшей мере двумя группами молекул красителя, которые не проявляют флуоресцентного излучения в силу экситонного эффекта, имеющего место тогда, когда по меньшей мере две молекулы красителя агрегируют, располагаясь параллельно друг другу, но характеризуются флуоресцентным излучением, когда агрегатное состояние распадается, когда указанная молекула претерпевает связывание с бороздкой или интеркаляцию в молекулу-мишень, например нуклеиновую кислоту, или
(iii) таковым, характеризующимся тем, что имеет химическую структуру по меньшей мере из двух молекул красителя, содержащихся в одной молекуле, при этом указанные по меньшей мере две молекулы красителя не проявляют флуоресцентного излучения в силу экситонного эффекта, имеющего место тогда, когда они агрегируют, располагаясь параллельно друг другу, но характеризуются флуоресцентным излучением, когда агрегатное состояние распадается, когда указанная молекула претерпевает связывание с бороздкой или интеркаляцию в молекулу-мишень, например нуклеиновую кислоту. В случае (ii) или (iii) предпочтительно, чтобы молекулы красителя были такими, как определено в подпункте (i).
В приведенных выше формулах Z11 и Z12 являются фрагментами красителя, которые характеризуются экситонным эффектом. При такой конфигурации изменения в среде вокруг флуоресцентных красителей при связывании с последовательностью-мишенью, например увеличение флуоресценции при образовании структуры двойной спирали, становятся больше, и, следовательно, последовательность-мишень может быть обнаружена более эффективно.
Как описано выше, краситель особо не ограничен, и могут быть использованы любые красители. Например, предпочтителен цианиновый краситель, и особенно предпочтителен тиазоловый оранжевый. Цианиновый краситель имеет химическую структуру, в которой, например, два гетероцикла, имеющие гетероатомы, соединены друг с другом метиновым линкером. Можно синтезировать флуоресцентные красители с различными длинами волн возбуждения/испускания, например, путем изменения типа гете-роциклов или длины метинового линкера или путем введения заместителя в указанные гетероциклы. Кроме того, относительно легко также введение линкера для введения ДНК. Хотя тиазоловый оранжевый в воде едва излучает флуоресценцию, при взаимодействии с ДНК или РНК он излучает сильную флуоресценцию. Считается, что взаимодействие с нуклеиновой кислотой препятствует взаимодействию между молекулами красителя и предотвращает вращение вокруг метинового линкера, локализованного между указанными двумя гетероциклами молекул красителя, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Способ применения красителя тиазолового оранжевого хорошо известен. Его применение возможно, например, в соответствии с публикацией KS. Rye, M.A. Quesada, K. Peck, R.A. Mathies and A.N. Glazer, High-sensitivity two-color detection of double-stranded DNA with a confocal fluorescence gel scanner using ethidium homodimer and thiazol orange, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 327-33; а также L.G. Lee, С.Н. Chen and L. A. Chiu, Thiazol orange: a new dye for reticulocyte analysis, Cytometry, 1986, 7, 508-17.
Примеры настоящего изобретения будут описаны ниже. Следует отметить, однако, что настоящее изобретение никоим образом не может быть ограничено приведенными ниже примерами или сведено к ним.
Примеры
Молекулы нуклеиновых кислот были синтезированы на основе методов, описанных в приведенных ниже примерах синтеза, или эквивалентных им методов. Указанные способы синтеза (способы получения) являются теми же самыми, которые описаны в примерах, приведенных в патенте Японии № 4370385.
Примеры 1-3 промежуточного синтеза.
В соответствии со следующей схемой 1 были синтезированы (продуцированы) соединения 102 и 103, включающие в себя две активные аминогруппы, каждая из которых защищена трифторацетильной группой, и затем был синтезирован фосфорамидит 104.
Схема 1. Реакционный агент и условия реакции.
(a) (i) N-Гидроксисукцинимид, дихлорэтан/ДМФ (EDC/ДМФ), (ii) трис (2-аминоэтил) амин/СН3С1Ч, (iii) CF3COOEt, Et3N;
(b) DMTrCl/пиридин;
(c) 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфорамидит, Ш-тетразол/CH^N.
Схема 1 будет более подробно описана ниже.
Пример 1 промежуточного синтеза. Синтез 2-[2-рЧ^-бис-(2-Трифторацетамидо-этил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридин (соединение 102).
Исходный материал, (Е)-5-(2-карбоксивинил)-2'-дезоксиуридин (соединение 101), синтезировали согласно Tetrahedron 1987, 43, 20, 4601-4607. То есть сначала 71 мл 1,4-диоксана добавляли к 430 мг ацетата палладия(П) (FW (молекулярная масса по формуле соединения) 224,51) и 1,05 г трифенилфосфина (FW 2 62,29), и затем к этому добавляли 7,1 мл триэтиламина (FW 101,19, d=0,726). Полученное нагревали и перемешивали при 70°С. После того как реакционный раствор из красновато-коричневого превратился в черновато-коричневый, в него добавляли 14,2 г 2'-дезокси-5-йодуридина (FW 354,10) и 7,0 мл метилакрилата (FW 86,09, d=0,956), который суспендировали в 1,4-диоксане. Полученное нагревали с обратным холодильником при 125°С в течение 1 ч. После этого, еще в горячем состоянии, фильтровали, осадок промывали метанолом, и затем собирали фильтрат. После того как раствор выпаривали из фильтрата при пониженном давлении, полученный таким образом продукт очищали на колонке с силикагелем (5-10% метанол/дихлорметан). Растворитель собранной фракции выпаривали при пониженном давлении, и белый твердый остаток сушили при пониженном давлении. Приблизительно 100 мл воды сверхвысокой чистоты добавляли к сухому твердому веществу, и туда же добавляли 3,21 г гидроксида натрия (FW 40,00). Полученное перемешивали в течение ночи при 25°С. После этого в раствор для подкисления добавляли концентрированную соляную кислоту. Полученный таким образом преципитат фильтровали, промывали водой сверхвысокой чистоты и затем сушили при пониженном давлении. Таким образом, 8,10 г (выход: 68%) требуемого соединения (соединение 101) было получено в виде белого порошка. Бы
ло получено подтверждение того, что белый порошок является требуемым соединением 101, поскольку значение, полученное методом 1Н-ЯМР, совпадало со ссылочным значением. Значение, полученное методом 13С-ЯМР, описано ниже.
(Е)-5-(2-Карбоксивинил)-2'-дезоксиуридин (соединение 101): 13С-ЯМР (ДМСО^6): 8 168,1, 161,8, 149,3, 143,5, 137,5, 117,8, 108,4, 87,6, 84,8, 69,7, 60,8, 40,1.
Далее, 1,20 г (Е)-5-(2-карбоксивинил)-2'-дезоксиуридина 101 (с молекулярным весом 298,25), 925 мг N-гидроксисукцинимида (с молекулярным весом 115,09) и 1,54 г 1-этил-З-(3-диметиламинопро-пил)карбодиимида(с молекулярным весом 191,70) помещали в колбу, снабженную мешалкой, и к этому добавляли 20 мл ДМФ, затем полученное перемешивали при 25°С в течение 16 ч. Туда добавляли приблизительно 1 мл уксусной кислоты, 300 мл метиленхлорида и 100 мл воды сверхвысокой чистоты, после чего интенсивно перемешивали. Водный слой удаляли, и дополнительно добавляли 100 мл воды сверхвысокой чистоты, после чего еще дважды промывали таким же образом. Полученный таким образом преципитат фильтровали, промывали метиленхлоридом и затем сушили при пониженном давлении. Раствор выпаривали из фильтрата, метиленхлорид добавляли к полученному таким образом преципитату, и затем преципитат восстанавливали таким же образом, как описано выше. Полученные таким образом преципитаты собирали, а затем суспендировали в 80 мл ацетонитрила. Полученное интенсивно перемешивали. Затем сразу добавляли 3,0 мл трис-(2-аминоэтил)амина (с молекулярным весом 146,23, d=0,976), с последующим перемешиванием при 25°С в течение 10 мин. После этого добавляли 4,8 мл этилтрифторацетата (с молекулярным весом 142,08, d=1,194), и затем добавляли 5,6 мл триэтиламина (с молекулярным весом 101,19, d=0,726). Полученное перемешивали при 25°С в течение 3 ч. Раствор выпаривали, и полученный таким образом продукт очищали на колонке с силикагелем (5-10% MeOH/CH2Cl2). Раствор выпаривали, полученный таким образом продукт растворяли в малом количестве ацетона, и затем к нему добавляли простой эфир. В результате был получен белый преципитат. Его фильтровали и затем промывали эфиром. После этого его сушили при пониженном давлении. Таким образом, было получено 884 мг (33,5%) требуемого вещества (соединение 102).
Осуществляли такой же синтез, как описано выше, за исключением того, что были незначительные изменения в количествах, например, используемых неочищенных материалов и растворов, в длительности реакции и предпринятых стадиях. В результате выход был улучшен до 37%. Более конкретно, 597 мг (2,0 ммоль) (Е)-5-(2-карбоксивинил)-2'-дезоксиуридина 101 (с молекулярным весом 298,25), 460 мг (4,0 ммоль) N-гидроксисукцинимида (с молекулярным весом 115,09) и 767 мг (4,0 ммоль) 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид-гидрохлорида (с молекулярным весом 191,70) помещали в колбу, снабженную мешалкой. После этого туда же добавляли 5,0 мл ДМФ, а затем перемешивали при 25°С в течение 3 ч. Затем добавляли туда приблизительно 0,5 мл уксусной кислоты и 100 мл метиленхлорида, и затем было добавлено 100 мл воды сверхвысокой чистоты. Полученное интенсивно перемешивали. Полученный таким образом преципитат фильтровали, промывали водой, а затем сушили при пониженном давлении в течение ночи. Полученный в результате белый осадок суспендировали в 50 мл ацетонитрила и интенсивно перемешивали. Затем сразу добавляли 3,0 мл (20 ммоль) трис-(2-аминоэтил)амина (с молекулярным весом 146,23, d=0,976), после чего перемешивали при 25°С в течение 10 мин. После этого добавляли 4,8 мл этилтрифторацетата (с молекулярным весом 142,08, d=1,194) и, кроме того, 5,6 мл (40 ммоль) триэтиламина (с молекулярным весом 101,19, d=0,726), а затем перемешивали при 25°С в течение 16 ч. Раствор выпаривали, и полученный таким образом продукт очищали на колонке с силикагелем (510% MeOH/CH2Cl2). Раствор выпаривали, и полученный таким образом продукт растворяли в малом количестве ацетона, и затем в него добавляли простой эфир. В результате был получен белый преципитат. Его фильтровали, а затем промывали простым эфиром. Потом его сушили при пониженном давлении. Таким образом, 453 мг (37%) требуемого вещества (соединение 102) было получено в виде белого порошка. Аппаратурные аналитические значения соединения 102 приведены ниже.
2-[2-[N,N-бис-(2-Трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридин (соединение 102).
1H ЯМР (CD3OD): 8 8,35 (с, 1Н), 7,22 (д, J=15, 6 Гц, 1Н), 7,04 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,26 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 4,44-4,41 (м, 1Н), 3,96-3,94 (м, 1Н), 3,84 (дд, J=12,2, 2,9 Гц, 1Н), 3,76 (дд, J=12,2, 3,4 Гц, 1Н), 3,373,30 (м, 6Н), 2,72-2,66 (м, 6Н), 2,38-2,23 (м, 2Н). 13С ЯМР (CD3OD): 8 169,3, 163,7, 159,1 (кв., J=36,4 Гц), 151,2, 143,8, 134,3, 122,0, 117,5 (кв., J=286 Гц), 110,9, 89,1, 87,0, 71,9, 62,5, 54,4, 53,9, 41,7, 38,9, 38,7. HRMS (масс-спектрометрия высокого разрешения) (ESI, ионизация методом электрораспыления) вы-числ. для C22H29F6N6O8 ([M+H]+) 619,1951, получено 619,1943.
Пример 2 промежуточного синтеза. Синтез 5'-О-диметокситритил-(2-[2-рч[^-бис-(2-трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина.
(5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-бис-(2-трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезокси-уридин, соединение 103).
5'-Гидроксильную группу соединения 102 защищали группой DMTr. Таким образом, было получено Соединение 103. Более конкретно, сначала 618 мг соединения 102 (с молекулярным весом 618,48) и 373 мг 4,4'-диметокситритилхлорида (с молекулярным весом 338,83) помещали в регенерационную кол
бу, содержащую мешалку. Затем в нее добавляли 10 мл пиридина и перемешивали при 25°С в течение 16 ч. Добавляли малое количество воды, растворитель выпаривали, а полученный таким образом продукт очищали на колонке с силикагелем (2-4% МеОН, 1% Et3N/CH2Cl2). Растворитель фракции, содержащей требуемое соединение 103, выпаривали. Таким образом, было получено 735,2 мг (79,8%) требуемого вещества (соединение 103). Аппаратурные аналитические значения соединения 103 указаны ниже.
5'-О-DMTr-(2-[2-[N,N-бис-(2-Трифторацетамидоэтил)]-аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезокси-уридин (соединение 103).
1H ЯМР (CD3OD): 8 7,91 (с, 1Н), 7,39-7,11 (м, 9Н), 7,02 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,93 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,80-6,78 (м, 4Н), 6,17 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 4,38-4,35 (м, 1Н), 4,06-4,04 (м, 1Н), 3,68 (с, 6Н), 3,32-3,22 (м, 8Н), 2,66-2,55 (м, 6Н), 2,40 (ддд, J=13,7, 5,9, 2,9 Гц, 1Н), 2,33-2,26 (м, 1Н). 13С ЯМР (CD3OD): 8 168,9, 163,7, 160,1, 159,1 (кв., J=36,9 Гц), 151,0, 146,1, 143,0, 137,0, 136,9, 134,1, 131,24, 131,16, 129,2, 128,9, 128,0, 122,5, 117,5 (кв., J=286,7 Гц), 114,2, 110,9, 88,1, 87,9, 87,6, 72,6, 65,0, 55,7, 54,2, 53,9, 41,7, 38,9, 38,6. HRMS (ESI) вычисл. для C43H47F6N6O10 ([M+H]+) 921.3258, получено 921,3265.
Пример 3 промежуточного синтеза. Синтез 5'-О-диметокситритил-(2-[2-^Д-бис-(2-трифторацетамидоэтил)]-аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина, 3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит(5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-бис-(2-трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карба-моил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина, 3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит, соединение
104).
Прежде всего, 188 мг (0,20 ммоль) соединения 103 (с молекулярным весом 920,85) выдерживали до образования азеотропа с CH3CN, и к нему добавляли 28,6 мг (0,40 ммоль) 1 Н-тетразола (с молекулярным весом 70,05). Сушили в вакууме в течение ночи с использованием вакуумного насоса. Затем к полученному добавляли 5, 1 мл CH3CN, чтобы растворить в нем указанный реагент, потом перемешивали. После этого к полученному сразу добавляли 194 мкл (0,60 ммоль) 2-цианоэтил^Д,№,№-тетраизопропил-фосфорамидита (с молекулярным весом 301,41, d=0,949), смесь перемешивали при 25°С в течение 2 ч. После этого к ней добавляли смесь из 50 мл этилацетата и 50 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и осуществляли разделение жидкостей. Полученный таким образом органический слой промывали насыщенным раствором соли, а затем сушили с использованием сульфата магния. Сульфат магния удаляли путем фильтрации, и затем раствор выпаривали. Неочищенный продукт, полученный таким путем разделением жидкостей, образовывал азеотроп с CH3CN. После этого, полагая, что продукт (соединение 104) был получен со 100% выходом, получали 0,1 М раствор CH3CN, который был использован для синтеза ДНК. Тот факт, что соединение 104 получено, был подтвержден данными 31Р-ЯМР (CDCl3) и HRMS (ESI) неочищенного продукта. Полученные значения приведены ниже.
Соединение 104.
31Р ЯМР (CDCl3) 8 149,686, 149,430; HRMS (ESI) вычисл. для C52H64F6N8O11P ([M+H]+) 1121,4336, получено 1121,4342.
Пример 4. Промежуточный синтез: синтез олигомера ДНК.
Схема 2
Синтез олиго-ДНК с помощью автоматизированного ДНК-синтезатора с использованием соединения 104 осуществляли с помощью обычного фосфорамидитного метода (снятие защитной группы DMTr) по 1-микромолярной шкале. Таким образом, был синтезирован каждый из олигомеров ДНК с последовательностями, показанными в примерах, описанных ниже. Снятие защиты осуществляли концентрированной аммиачной водой (28 мас.%) при 55°С в течение 16 ч. Аммиак улетучивался под скоростным вакуумом, и полученный таким образом продукт пропускали через 0,45-мкм фильтр. После этого отделенный от него олигомер ДНК подвергали анализу методом ВЭЖХ с обращенной фазой, и пик, полученный приблизительно через 10,5 мин, очищали (CHEMCOBOND 5-ODS-H (торговое название); 10x150 мм, 3 мл/мин, 5-30% CH3CN/50 мМ буфер ТЕАА, рН 7 (20 мин), детектировали при 260 нм). Молекулярный вес очищенного таким образом продукта измеряли с использованием масс-спектрометра MALDI TOF с отрицательной химической ионизацией. В результате было подтверждение, что полученный продукт имеет искомую последовательность.
Для определения концентрации каждой синтезированной таким образом ДНК, каждую очищенную ДНК подвергали полной деградации при 25°С в течение 16 ч под действием кишечной щелочной фосфа-тазы теленка (50 Ед./мл), фосфодиэстеразы змеиного яда (0,15 Ед./мл) и нуклеазы Р1 (50 Ед./мл). Полу
ченные таким образом переваренные жидкости подвергали анализу методом ВЭЖХ с CHEMCOBOND 5-ODS-H (торговое название) (колонка 4,6x150 мм). В этом анализе был использован 0,1 М буфер ТЕАА (рН 7,0) в качестве проявителя, и скорость потока составляла 1,0 мл/мин. Концентрацию синтезированной ДНК определяли на основе сравнения с областью пика стандартного раствора, содержащего dA, dC, dG и dT, концентрация каждого из которых составляла 0,1 мМ. Кроме того, синтезированную ДНК идентифицировали также по масс-спектру MALDI TOF.
Пример синтеза молекулы нуклеиновой кислоты: синтез молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей в одной молекуле структуры, полученные из тиазолового оранжевого, в двух положениях
Схема 4
0=fj> -OH ?
105 U
Как показано на схеме 4, был синтезирован олигомер ДНК (олигонуклеотид) 110, который содержит в одной молекуле структуры, полученные из тиазолового оранжевого, в двух положениях. Более конкретное его описание приведено ниже.
Производное тиазолового оранжевого 107 было синтезировано, как указано ниже в схеме 5, со ссылкой на Organic Letters 2000, 6, 517-519.
Схема 5
а:>
112
112
111
в соответствии с описанием в
(1) Синтез N-метилхинолиниййодида (соединение 111).
Сначала N-метилхинолиниййодид (соединение 111) синтезировали _
указанной выше ссылке. Конкретно, 2,4 мл хинолина и 4 мл метилйодида добавляли к 42 мл безводного диоксана и перемешивали при 150°С в течение 1 ч. После этого полученное фильтровали, и преципитат собирали. Затем преципитат промывали простым эфиром и петролейным эфиром, а затем сушили. Таким образом, был получен N-метил-хинолиниййодид (соединение 111).
(2) Синтез 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолийбромида (соединение 112).
8 мл 2-метилбензотиазола (FW 149,21, d=1,173) и 9,4 г 5-бромвалериановой кислоты (5-бромпентановой кислоты) (FW 181,03) перемешивали при 110°С в течение 16 ч. Неочищенный продукт охлаждали до комнатной температуры, и полученное таким образом твердое вещество суспендировали в
20 мл метанола, и потом к нему добавляли 40 мл простого эфира. Полученный таким образом преципитат фильтровали, а затем промывали диоксаном до тех пор, пока не исчезал запах 2-метилбензотиазола. Полученный продукт промывали эфиром, а затем сушили при пониженном давлении. Таким образом было получено 9,8 г белого порошка. После этого измеряли 1Н-ЯМР этого белого порошка. В результате было обнаружено, что полученное является смесью 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолийбромида (соединение 112), который являлся требуемым веществом, которое было алкилировано в положении 2, и 3-(4-карбоксибутил)бензотиазолийбромида, в котором положение 2 не было алкилировано. Отношение протонных пиков было следующим: неалкилированные: алкилированные=10:3. Полученный неочищенный продукт без дополнительной обработки был использован для следующей реакции.
(3) Синтез 1-метил-4-[{3-(4-карбоксибутил)-2(3H)-бензотиазолилиден}метил]хинолинийбромида (соединение 107).
2,18 г неочищенного продукта, содержащего 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолийбромида (соединение 112), полученного в (2) выше, и 700 мг N-метил-хинолиниййодида (соединение 111) (FW 271,10) перемешивали в 10 мл метиленхлорида при 25°С в течение 2 ч в присутствии 3,6 мл триэтилами-на (FW 101,19, d=0,726). После этого к ним добавляли 50 мл простого эфира, и полученный таким образом преципитат фильтровали, промывали простым эфиром, а затем сушили при пониженном давлении. Преципитат суспендировали в 50 мл воды сверхвысокой чистоты, затем фильтровали, промывали водой сверхвысокой чистоты, а затем сушили при пониженном давлении. Затем преципитат суспендировали в 50 мл ацетонитрила, фильтровали, промывали ацетонитрилом, а затем сушили при пониженном давлении. Таким образом, было получено 307,5 мг порошка красного цвета (выход: 25,3%). Сравнение спектра 1 Н-ЯМР со ссылочным значением подтвердило, что полученный порошок красного цвета является искомым соединением (соединение 107).
Кроме того, можно было также синтезировать 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолийбромид (соединение 112) и 1-метил-4-[{3-(4-карбоксибутил)-2(3H)-бензотиазолилиден}метил]хинолинийбромид (соединение 107) следующим образом. Более конкретно, сначала 11,7 мл (92 ммоль) 2-метилбензотиазола (FW 149,21, d=1,173) и 13,7 г (76 ммоль) 5-бромвалериановой кислоты (5-бромпентановая кислота) (FW 181,03) перемешивали при 150°С в течение 1 ч. Неочищенный продукт охлаждали до комнатной температуры, и полученное таким образом твердое вещество суспендировали в 50 мл метанола. Далее, добавляли 200 мл простого эфира. Полученный таким образом преципитат фильтровали, промывали эфиром, а затем сушили при пониженном давлении. Таким образом, было получено 19,2 г светло-фиолетового порошка. Полученный порошок был смесью искомого соединения 112 (3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолийбромид) и 2-метилбензотиазолийбромида. Данную смесь подвергали анализу методом 1Н-ЯМР (в ДМСО^), и выход искомого соединения 112 составил 9,82 г (14 ммоль, 32%), согласно расчету из соотношения площадей пиков, между пиком при 8,5 м.д. (полученным из искомого соединения 112) и пиком при 8,0 м.д. (полученным из 2-метилбензотиазолийбромида).
Полученную смесь (неочищенный продукт) без очистки использовали в следующей реакции. Таким же способом, как описано выше, за исключением того, что 5-бромвалериановая кислота (5-бромпентановая кислота) была заменена 4-броммасляной кислотой (4-бромбутановая кислота), был синтезирован 3-(4-карбоксипропил)-2-метилбензотиазолийбромид с линкером (полиметиленовая цепь, соединенная с карбоксильной группой), имеющим количество атомов углерода n, равное 3, который был получен с выходом 4%. Кроме того, таким же образом, как описано выше, за исключением того, что 5-бромвалериановая кислота (5-бромпентановая кислота) была заменена б-брогексановой кислотой, был синтезирован 3-(4-карбоксипентил)-2-метилбензотиазолийбромид с линкером (полиметиленовая цепь, соединенная с карбоксильной группой), имеющим количество атомов углерода n, равное 5, который был получен с выходом 35%. Более того, таким же образом, как описано выше, за исключением того, что 5-бромвалериановая кислота (5-бромпентановая кислота) была заменена 7-бромгептановой кислотой, был синтезирован 3-(4-карбоксипропил)-2-метилбензотиазолийбромид с линкером (полиметиленовая цепь, соединенная с карбоксильной группой), имеющим количество атомов углерода n, равное 6, который был получен с выходом 22%.
Далее, 1,36 г (5,0 ммоль) N-метилхинолиниййодида (соединение 111) (FW 271,10), 7,0 мл (50 ммоль) триэтиламина (FW 101,19, d=0,726) и 100 мл метиленхлорида добавляли к 3,24 г смеси (неочищенный продукт), содержащей соединение 112 (3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолийбромид) и 2-метилбензотиазолийбромид. В результате был получен прозрачный раствор. Этот раствор перемешивали при 25°С в течение 16 ч. После этого раствор выпаривали при пониженном давлении. Затем к осадку добавляли ацетон (200 мл), и полученный таким образом преципитат фильтровали, а затем промывали ацетоном. Полученный таким образом осадок сушили при пониженном давлении, и осадок красного цвета, полученный после высушивания, промывали дистиллированной водой (50 мл). Позже его фильтровали, промывали дистиллированной водой и затем сушили при пониженном давлении. Таким образом, требуемое вещество (соединение 107) было получено в виде порошка красного цвета (654 мг, 1,3 9 ммоль, 28%). Сравнение спектра 1Н-ЯМР со ссылочным значением подтвердило, что полученный порошок красного цвета является искомым соединением (соединение 107). Значения пиков, полученные на основании 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР (ДМСОч16), и измеренные значения HRMS (ESI) представлены ниже. Соеди
нение 107.
1H ЯМР (ДМСО-16): 8 8,74 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,51 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,94-7,89 (м, 3H), 7,74-7,70 (м, 1Н), 7,65 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 7,55-7,51 (м, 1Н), 7,36-7,32 (м, 1Н), 7,21 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 6,83 (с, 1Н), 4,47 (т, J=7,1 Гц, 2Н), 4,07 (с, 3H), 2,22 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 1,77-1,63 (м, 4Н); 13С ЯМР (ДМСОЧ16, 60°С) 8 174,6,
158,8, 148,4, 144,5, 139,5, 137,6, 132,7, 127,9, 126,8, 125,5, 124,1, 123,7, 123,6, 122,4, 117,5, 112,6, 107,6,
87,4, 45,6, 42,0, 35,5, 26,2, 22,3; HRMS (ESI) вычисл. для C23H23N2O2S ([M.Br]+) 391,1480, получено
391,1475.
4-((3-(3 -Карбоксипропил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1 -метилхинолинийбромид с линкером (полиметиленовая цепь, соединенная с карбоксильной группой), имеющим количество атомов углерода n, равное 3, синтезировали из смеси 3-(4-карбоксипропил)-2-метилбензотиазолийбромида и 2-метилбензотиазолийбромида тем же самым способом, который был использован для соединения 107. В результате указанное соединение было получено с выходом 43%. Аппаратурные аналитические значения данного соединения приведены ниже.
4-((3-(3 -Карбоксипропил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1 -метилхинолинийбромид.
1H ЯМР (ДМСО-16) 8 8,85 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,59 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 8,02-7,93 (м, 3H), 7,78-7,70 (м, 2Н), 7,61-7,57 (м, 1Н), 7,42-7,38 (м, 1Н), 7,31 (д, J=6,8 Гц, 1Н), 7,04 (с, 1Н), 4,47 (т, J=8,1 Гц, 2Н), 4,13 (с, 3H), 2,52-2,48 (м, 2Н), 1,99-1,92 (м, 2Н); 13С ЯМР (ДМСО-dfe 60°C) 8 174,3, 158,9, 148,6, 144,5, 139,5,
137.7, 132,7, 127,9, 126,7, 125,6, 124,1, 124,0, 123,7, 122,5, 117,5, 112,5, 107,6, 87,7, 45,6, 42,0, 31,6, 22,4;
HRMS (ESI) вычисл. для C22H21N2O2S ([М.ВГ]+) 377,1324, получено 377,1316.
Кроме того, 4-((3-(3-карбоксипентил)бензо[d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолинийбро-мид с линкером (полиметиленовая цепь, соединенная с карбоксильной группой), имеющим количество атомов углерода n, равное 5, синтезировали из смеси 3-(4-карбоксипентил)-2-метилбензотиазолий-бромида и 2-метилбензотиазолийбромида тем же самым способом, который был использован для Соединения 107. В результате указанное соединение было получено с выходом 26%. Аппаратурные аналитические значения данного соединения приведены ниже.
4-((3-(3 -Карбоксипентил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1 -метилхинолинийбромид.
1H ЯМР (ДМСО-16) 8 8,70 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,61 (д, J=6,8 Гц, 1Н), 8,05-8,00 (м, 3H), 7,80-7,73 (м, 2Н), 7,60-7,56 (м, 1Н), 7,41-7,35 (м, 2H), 6,89 (с, 1Н), 4,59 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 4.16 (с, 3H), 2,19 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 1,82-1,75 (м, 2Н), 1,62-1,43 (м, 4Н); 13С ЯМР (ДМСО-dfe 60°C) 8 174,5, 159,0, 148,6, 144,7, 139,7,
137.8, 132,9, 127,9, 126,9, 125,2, 124,2, 123,8, 123.6, 122,6, 117,8, 112,6, 107,7, 87,4, 45,6, 42,1, 36,0, 26,3,
25,9, 24,9; HRMS (ESI) вычисл. для C24H25N2O2S ([М.ВГ]+) 405,1637, получено 405,1632.
Кроме того, 4-((3-(3 -карбоксигексил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1 -метилхинолинийбро-мид с линкером (полиметиленовая цепь, соединенная с карбоксильной группой), имеющим количество атомов углерода n, равное 6, синтезировали из смеси 3-(4-карбоксигексил)-2-метилбензотиазолийбромида и 2-метилбензотиазолийбромида тем же самым способом, который был использован в случае соединения 107. В результате указанное соединение было получено с выходом 22%. Аппаратурные аналитические значения данного соединения приведены ниже.
4-((3-(3 -Карбоксигексил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолинийбромид.
1H ЯМР (ДМСО-16) 8 8,72 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,62 (д, J=6,8 Гц, 1Н), 8,07-8,01 (м, 3H), 7,81-7,75 (м, 2Н), 7,62-7,58 (м, 1Н), 7,42-7,38 (м, 2Н), 6,92 (с, 1Н), 4,61 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 4.17 (с, 3H), 2,18 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 1,82-1,75 (м, 2Н), 1,51-1,32 (м, 6Н); 13С ЯМР (ДМСО-16, 60°C) 8 174,0, 159,1, 148,6, 144.7, 139,8,
137,8, 132,9, 127,9, 126,8, 125,0, 124,2, 123,8, 123,6, 122,6, 118,0, 112,7, 107,8, 87,4, 45,5, 42,1, 33,4, 27,9, 2
6,4, 25,5, 24,1; HRMS (ESI) вычисл. для C25H27N2O2S ([М.ВГ]+) 419,1793, получено 419,1788.
(4) Синтез сложного N-гидроксисукцинимидилового эфира 109 9,4 мг (20 мкмоль) 1-метил-4-[{3-(4-карбоксибутил^рЩ-бензотиазолилиде^метил^инолинийбромида (соединение 107) (FW 471,41), 4,6 мг (40 мкмоль) N-гидроксисукцинимида (соединение 108) (FW 115,09) и 7,6 мг (40 мкмоль) EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид) (FW 191,70) перемешивали в 1 мл ДМФ при 25°С в течение 16 ч. Таким образом, был получен сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир (соединение 109), в котором была активирована карбоксильная группа красителя (соединение 107). Продукт этой реакции не был очищен, и реакционный раствор (20 мМ красителя) использовали для реакции с олигомерной ДНК (олигонуклеотид) 105 без дальнейшей обработки.
Кроме того, 4-((3-(4-(сукцинимидилокси)-4-оксобутил)бензо[d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолинийбромид с линкером (полиметиленовая цепь), имеющим количество атомов углерода n, равное 3, был синтезирован тем же самым способом, который был использован в случае соединения 109, за исключением того, что вместо соединения 107 в качестве неочищенного материала было использовано соединение с линкером (полиметиленовая цепь), имеющим разное число атомов углерода. Кроме того, 4-((3-(4-(сукцинимидилокси)-4-оксогексил)бензо[d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолинийбромид с линкером (полиметиленовая цепь), имеющим количество атомов углерода n, равное 5, и 4-((3-(4-(сукцинимидилокси)-4-оксогептил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолинийбромид с линкером (полиметиленовая цепь), имеющим количество атомов углерода n, равное 6, были синтезированы таким же образом.
(5) Синтез олигомера ДНК (олигонуклеотид) 110, модифицированного двумя молекулами тиазоло-вого оранжевого.
Олигомер ДНК (олигонуклеотид) 105, имеющий две активные аминогруппы, был синтезирован обычным способом с применением автоматизированного ДНК-синтезатора, таким же образом, как и в примере 4 промежуточного синтеза. Далее, этот олигомер ДНК (олигонуклеотид) 105 вводили в реакцию со сложным N-гидроксисукцинимидиловым эфиром (соединение 109), таким образом синтезируя олиго-мер ДНК (олигонуклеотид) 110, который представлял собой молекулу нуклеиновой кислоты, имеющей в составе одной молекулы структуры, полученные из тиазолового оранжевого, в двух положениях. Более конкретно, сначала смешивали вместе 30 мкл олигомера ДНК 105 (с концентрацией цепей 320 мкМ), 10 мкл буфера Na2CO3/NaHCO3 (1 M, рН 9,0) и 60 мкл Н2О. После этого добавляли 100 мкл раствора ДМФ (20 мМ) сложного N-гидроксисукцинимидилового эфира (соединение 109) и вместе перемешивали. Полученной смеси давали отстояться при 25°С в течение 16 ч. После этого в нее добавляли 800 мкл Н2О. Затем полученную в результате смесь пропускали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и подвергали очистке путем ВЭЖХ с обращенной фазой (CHEMCOBOND 5-ODS-H 10x150 мм, 3 мл/мин, 5-30% CH3CN/50 мМ буфера ТЕАА (20 мин), детектировали при 260 нм).
Пример 1.
(Эксперимент, в котором были подсчитаны молекулы матричной РНК бета-актина, полученные методом мостиковой ОТ-ПЦР с помощью набора иммобилизованных специфических праймеров).
1. Праймеры настоящего примера были синтезированы путем биотинилирования 5'-концов специфических праймеров, представленных следующими последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2.
Прямой: 5'-AAA AAA AAA AGG CAT GGG TCA GAA GGA TT-3' (SEQ ID NO: 1) обратный' 5'-AAA AAA AAA AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3' (SEQ ID N0:2)
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC.) прикрепляли к покрытой биотином поверхности предметного стекла микроскопа (Alliance Technology) для получения реакционной ячейки. К ячейке добавляли 20 мкг/мл раствора белка авидина, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин так, чтобы покрытая биотином поверхность предметного стекла микроскопа в ячейке была полностью покрыта указанным раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, в течение которых происходила иммобилизация белка авидина на поверхности. После иммобилизации предметное стекло микроскопа трижды промывали физиологическим раствором, тем самым удаляя избыток авидинового белка.
3. К физиологическому раствору добавляли глицерин так, чтобы его концентрация составила 10%, и затем добавляли биотинилированные праймеры так, чтобы концентрация каждого праймера составила 3,3 мкмоль. В это время получали не только раствор, содержащий пару праймеров, но и раствор, содержащий только прямой праймер. К реакционной ячейке на иммобилизованном на авидине предметном стекле микроскопа добавляли раствор пары праймеров или раствор прямого праймера так, чтобы поверхность предметного стекла микроскопа в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, в течение которых происходила иммобилизация биотинилирован-ного праймера (праймеров). После иммобилизации предметное стекло микроскопа трижды промывали физиологическим раствором, тем самым удаляя избыток праймера (праймеров).
4. 1,6 мМ сульфата магния, 0,2 мМ dNTP, раствор SYBR Green, 200 единиц обратной транскрипта-зы Superscript III и 2 единицы Taq-полимеразы Platinum (далее Platinum Taq) смешивали с раствором буфера для Platinum Taq. Таким образом, получали реакционный раствор, который позволяет осуществлять в нем как реакцию обратной транскрипции, так и реакцию ПЦР. К полученному реакционному раствору добавляли матричную РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация в растворе составила 100 пМ. К ячейке на предметное стекло микроскопа, имеющее на своей поверхности иммобилизованную пару праймеров или только прямой праймер, добавляли 25 мкл реакционного раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC.).
5. Каждое предметное стекло микроскопа помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Предметное стекло микроскопа нагревали при 55°С в течение 30 мин и 94°С в течение 4 мин, и затем подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 68°С в течение 1 мин. После этого предметное стекло микроскопа инкубировали при 68°С в течение 5 мин, чтобы завершить реакцию.
6. После окончания реакции предметное стекло микроскопа возбуждали светом, используя для этого флуоресцентный микроскоп, при длине волны возбуждения 470 нм, и наблюдали флуоресценцию при 525 нм.
7. В результате, в случае, когда использовали пару праймеров, наблюдали флуоресценцию большого количества кластеров, что является демонстрацией того, что был получен продукт амплификации нуклеиновой кислоты-мишени (фиг. 1). И наоборот, в случае, когда использовали прямой праймер, такой
2.
флуоресценции не наблюдали (фиг. 2). Пример 2.
Пример 2-А. Конструирование праймеров и проверка их качества.
Для последовательности матричной РНК гена бета-актина человека (ссылочная последовательность NCBI: NM 001101.3) были сконструированы следующие олиго-праймеры. Термин "олиго-праймер" (который можно заменить здесь далее просто термином "олиго") относится к олигонуклеотиду, служащему в качестве праймера. То же самое относится и к последующему.
Bio-ON: биотинилированный 5'-конец,
Cy5: 3'-конец, флуоресцентно меченный с помощью Cy5,
U: T, меченный экситоновым красителем с короткой длиной волны (510/530),
Z: Т, меченный экситоновым красителем с большой длиной волны (570/590).
U (Т, меченный экситоновым красителем с короткой длиной волны (510/530)) и Z (Т, меченный экситоновым красителем с большой длиной волны (570/590)) имеют структуры, представленные соответственно следующими химическими формулами:
Z: Т, меченный экситоновым красителем (D570) с большой длиной волны (570/590)
Структура U (Т, меченный экситоновым красителем с короткой длиной волны (510/530)) является такой же, что и структура Т, меченного экситоновым красителем, в описанном выше олигомере ДНК (олигонуклеотид) 110. Нуклеиновые кислоты, содержащие U (Т, меченный экситоновым красителем с короткой длиной волны (510/530)), были синтезированы таким же образом, что и в примере синтеза. Нуклеиновые кислоты, содержащие Z (Т, меченный экситоновым красителем с большой длиной волны (570/590)), были синтезированы способом, эквивалентным таковым, использованным в примере синтеза.
Олиго-праймерам, представленным выше в табл. 1, присвоены следующие идентификационные номера.
Праймер ACTB-T7RNAF
(5' - С Т ААТ ACGAC Т С AC Т AT AGGGAGAAT GGAT GAT GAT AT CGCCGCGCT-3'' :
SEQ ID NO: 3)
с биотинилированным 5'-концом: SEQ с биотинилированным 5'-концом: SEQ
Праймер ACTB-RNAR (5'-CATTTTTAAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3' : SEQ ID NO: 4^ Праймер ACTB-5T (5' -GGCATGGGTCAGAAGGATT-3' : SEQ ID NO: 5) Праймер АСТВ-5'R (5'"AGGTGTGGTGCCAGATTTTC"3': SEQ ID N0: 6) Праймер ACTB-5T_5'Bio (5'-GGCATGGGTCAGAAGGATT-3 ID NO: 7).
Праймер ACTB-5'R_5'Bio (5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3 ID NO: 8).
Праймер АСТВ-5T_5rBioM (5'-AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT-3', с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO: 9).
Праймер ACTB-5'R_5'BioM <5' -AAAAAAAAAAAGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3' , c биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO: 10).
АСТВ-5'FExS (5'-GGCATGGGT*CAGAAGGATT-3' , с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO: 11, Т был маркирован в положении, отмеченном как "Т*м [вышеуказанный U]).
ACTB-5'R ExS (5'-AGGTGTGGT*GCCAGATTTTC-3', с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO:
12, Т был маркирован в положении, отмеченном как "Т*" [вышеуказанный U]).
АСТВ-5Т^^ (5'-GGCATGGGT*CAGAAGGATT-3', с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO:
13, Т был маркирован в положении, отмеченном как "Т*" [вышеуказанный Z]).
АСТВ-5•R_ExL (5'-AGGTGTGGT*GCCAGATTTTC-3', с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO:
14, Т был маркирован в положении, отмеченном как "Т*" [вышеуказанный Z]).
АСТВ-5T_5,BioM_Cy5 (5'-AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT-З', с биотинилированным 5'-концом и с 3'-концом, меченным посредством Cy5: SEQ ID NO: 15).
Компании Operon Biotechnologies, Inc. было поручено синтезировать олигонуклеотиды. Как описано выше, способы синтеза таких олигонуклеотидов были такими же, что и способ синтеза олигомера ДНК (олигонуклеотид) 110, или эквивалентными ему. Качество каждого из синтезируемых олиго-праймеров проверяли способом, описанным ниже.
1. Клон AK025375 Е. coli, относящийся к коллекции клонов кДНК Научного Центра RIKEN Omics и содержащий кДНК бета-актина человека, полосками наносили на агаровую среду LB, содержащую ампициллин, и культивировали при 37°С в течение ночи. После этого была получена единственная колония.
2. Указанную единственную колонию соскребали и суспендировали в 10 мкл стерильной дистиллированной воды.
3. В 0,2-мл пробирке для ПЦР получали реакционный раствор путем смешивания 1 мМ хлорида магния, 0,16 мМ dNTP и 1,25 единиц ДНК-полимеразы Taq HotStar (QIAGEN) с использованием буферного раствора для HotStar. К полученному реакционному раствору добавляли 1 мкл описанной выше суспензии клона Е. coli, содержащего кДНК бета-актина. К полученной в результате смеси добавляли одну из следующих пар праймеров (А), (В), (С) и (D):
пара праймеров (А) состояла из 0,5 мкМ праймера АСТВ-5Т
(5'-GGCATGGGTCAGAAGGATT-3': SEQ ID NO: 5) И Q5 mrM праймера АСТВ-5'R
(5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3' : SEQ ID NO: 6);
пара праймеров (В) состояла из 0,5 мкМ праймера ACTB-T7RNAF
пара праймеров (С) состояла из 0,5 мкМ праймера АСТВ-5Т5' Bio (5' - GGCATGGGTCAGAAGGATT-3' , с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO: 7) и 0,5 мкМ праймера АСТВ-5' R_5' Bio (5f - AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3' , с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO: 8); и
пара праймеров (D) состояла из 0,5 мкМ праймера АСТВ-5Т_5'ВюМ
(5'-AAAAAAAAAAGGC^^ SEQ ID NO: 9) и 0,5 мкМ
праймера ACTB-5'R_5'BioM (5'-AAAAAAAAAAAGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3', с биотинилированным 5'-концом: SEQ ID NO: 10). Таким образом, получали реакционный раствор ПЦР в общем объеме 50 мкл.
4. 0,2-мл пробирку ПЦР, содержащую реакционный раствор для ПЦР, помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Реакционный раствор нагревали при 95°С в течение 15 мин и затем подвергали 30 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин. После этого реакционный раствор инкубировали при 72°С в течение 10 мин, чтобы завершить реакцию.
5. После окончания реакции к 50 мкл реакционного раствора добавляли 90 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и к нему добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с, после чего этанол удаляли. Вновь добавляли 200 мкл 70% этанола и смеси давали отстояться в течение 15 с. Этанол удаляли, после чего смесь сушили в течение 3 мин с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. К ней добавляли 41 мкл стерильной дистиллированной воды и тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 4 0 мкл супернатанта.
6. Отмеряли 100 мкл бусинок MPG со стрептавидином (Takara Bio Inc.). Их помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 3 мин. После этого супернатант удаляли. Добавляли 100 мкл промывочного буфера (4,5 моль/л хлорида натрия, содержащего 50 ммоль/л этилендиаминтетраук-сусной кислоты), таким образом, чтобы бусинки суспендировались. Полученную таким образом суспензию помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 3 мин. После этого супернатант удаляли. Промывание промывочным буфером повторяли всего три раза. В заключение добавляли 200 мкл промывочного буфера для повторного суспендирования бусинок.
(5'- CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGATGATGATATCGCCGCGCT-3' : SEQ ID N0:3) и 0 5 мкМ ЩШй мера ACTB-RNAR (5'- CATTTTTAAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3' : SEQ ID NO: 4);
7. Отмеряли 20 мкл образца, содержащего пару праймеров (А), (С) или (D). К ним добавляли 2,2 мкл 10х буфера RnaseOne, и 51,8 мкл бусинок MPG со стрептавидином ресуспендировали с повторно добавленным промывочным буфером. После этого полученную в результате смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин. В процессе инкубации смесь подвергали суспендированию с помощью пипетки, 10 раз с 5-минутными интервалами. После окончания инкубации смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант собирали, и бусинки MPG со стрептавидином собирали. После этого осадок использовали в качестве образца.
8. Получали 1,0% агарозный гель, и использовали его для электрофореза в буфере ТАЕ при 100 В в течение 70 мин. После завершения электрофореза гель окрашивали посредством SYBR Gold в течение 10 мин при комнатной температуре при постоянном помешивании. После завершения окрашивания гель выводили, и полосы наблюдали при ультрафиолетовом облучении.
Фиг. 3 представляет собой фотографию, на которой показан результат проверки качества синтезированных олиго-праймеров. Объяснение фиг. 3:
-: праймеры не были биотинилированы, +: праймеры были биотинилированы. Полоса 1: маркер. Полоса 2: маркер. Полоса 3: пустая полоса.
Полоса 4: образец после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров В. Полоса 5: образец после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров А. Полоса 6: образец после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров С. Полоса 7: образец после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров D.
Полоса 8: образец супернатанта, полученный после приведения образца после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров А, в контакт со стрептавидиновыми бусинками.
Полоса 9: образец супернатанта, полученный после приведения образца после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров С, в контакт со стрептавидиновыми бусинками.
Полоса 10: образец супернатанта, полученный после приведения образца после ПЦР, предпринятой с помощью набора праймеров D, в контакт со стрептавидиновыми бусинками.
На основании результата, который виден на полосе 4, было сделано заключение, что набор олиго-праймеров для получения матрицы для синтеза матричной РНК бета-актина работает. На основании результатов, которые видны на полосах 5 и 8, было сделано заключение, что набор олиго-праймеров А для экспериментов ПЦР работает. Было также получено подтверждение того, что данные олиго-праймеры были синтезированы правильно, и что, как было предусмотрено, их не следовало биотинилировать.
На основании результатов, которые видны на полосах 6 и 9, было получено подтверждение того, что набор олиго-праймеров С работает. Было также получено подтверждение того, что данные олиго-праймеры были синтезированы правильно, и что их следовало биотинилировать, как и было предусмотрено. На основании результатов, которые видны на полосах 7 и 10, было получено подтверждение того, что набор олиго-праймеров D работает. Было также получено подтверждение того, что данные олиго-праймеры были синтезированы правильно, и что их следовало биотинилировать, как и было предусмотрено.
Пример 2-В. Получение ДНК бета-актина.
2. В 0,2-мл пробирке для ПЦР получали реакционный раствор путем смешивания 1 мМ хлорида
магния, 0,16 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера АСТВ-5Т
(5'-GGCATGGGTCAGAAGGATT-3': SEQ ID NO: 5), Q5 mrM праймера АСТВ-5'R
(5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3' : SEQ ID N0: 6) и 1> 25 единиц ДНК-ПОЛИмеразы Taq HotStar (QI-
AGEN) с использованием буферного раствора для HotStar. К полученному реакционному раствору до-
бавляли 1 мкл описанной выше суспензии клона Е. coli, содержащего кДНК бета-актина. Таким образом,
получали реакционный раствор ПЦР в общем объеме 50 мкл.
3. 0,2-мл пробирку ПЦР, содержащую реакционный раствор для ПЦР, помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Реакционный раствор нагревали при 95°С в течение 15 мин и затем подвергали 30 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После этого реакционный раствор инкубировали при 72°С в течение 10 мин, чтобы завершить реакцию.
4. После окончания реакции к 50 мкл реакционного раствора добавляли 90 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и к нему добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с,
1. Единственную колонию клона АК025375 Е. coli, содержащую кДНК бета-актина человека, со-
скребали и суспендировали в 10 мкл стерильной дистиллированной воды.
после чего этанол удаляли. Вновь добавляли 200 мкл 70% этанола и смеси давали отстояться в течение 15 с. Этанол удаляли, после чего смесь сушили в течение 3 мин с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. К ней добавляли 41 мкл стерильной дистиллированной воды и тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 40 мкл супернатанта.
5. Полученный таким образом образец раствора подвергали количественной оценке с помощью набора для биоанализа ДНК, bioanalyzer DNA 1000 kit (Agilent Technologies, Inc.).
На фиг. 4 показан результат электрофореза продукта, полученного после ПЦР. Как можно видеть на фиг. 4, было подтверждено, что продукт ПЦР размером в 133 п.н. может быть синтезирован, как было предусмотрено. Указанный продукт ПЦР для дальнейшего применения был использован в качестве матрицы в праймер-иммобилизованной ПЦР.
Пример 2-С. Получение матричной РНК бета-актина.
1. Единственную колонию клона АК025375 Е. coli, содержащую кДНК бета-актина человека, соскребали и суспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды.
2. В 0,2-мл пробирке для ПЦР получали реакционный раствор путем смешивания 1,5 мМ хлорида
магния, 0,2 мМ dNTP, 0,3 мкМ праймера ACTB-T7RNAF
(5'- CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGATGATGATATCGCCGCGCT-3': SEQ ID N0: 3), 0 3 ШсМ ЩШШ^ ACTB-RNAR (5'- CATTTTTAAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3' : SEQ ID NO: 4) и 1 единицы
ДНК-полимеразы KOD-Plus-Neo (TOYOBO) с использованием буферного раствора для KOD-Plus-Neo. К полученному реакционному раствору добавляли 1 мкл, 2 мкл, 5 мкл или 10 мкл описанной выше суспензии клона Е. coli, содержащего кДНК бета-актина. Таким образом, было получено четыре разновидности реакционных растворов ПЦР, каждый в общем объеме 50 мкл.
3. 0,2-мл пробирку для ПЦР, содержащую реакционный раствор ПЦР, помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Реакционный раствор нагревали при 94°С в течение 2 мин и затем подвергали 30 циклам следующей температурной обработки: 98°С в течение 10 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин. После этого реакционный раствор инкубировали при 68°С в течение 10 мин для завершения реакции.
4. К 50 мкл реакционного раствора после окончания реакции добавляли 90 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин указанную смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и к ней добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с, после чего этанол удаляли. Вновь добавляли 200 мкл 70% этанола, и смеси давали отстояться в течение 15 с. Этанол отбрасывали, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. К смеси добавляли 41 мкл стерильной дистиллированной воды и смешивали вместе. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 40 мкл супернатанта. Он был использован в качестве ДНК-матрицы для синтеза матричной РНК бета-актина.
5. Собранную ДНК-матрицу для синтеза матричной РНК бета-актина подвергали электрофорезу с использованием 1,0% агарозного геля и буфера ТАЕ при 100 В в течение 70 мин. После завершения электрофореза гель окрашивали буфером ТАЕ, содержащим SYBR Gold, в течение 10 мин при комнатной температуре и при встряхивании. После завершения окрашивания гель выводили, и полосы изучали при ультрафиолетовом облучении. Концентрацию продукта, полученного после ПЦР, определяли с помощью устройства NanoDrop 8000 (Thermo SCIENTIFIC).
6. В 0,2-мл пробирке для ПЦР получали реакционный раствор путем смешивания 1 М дитиотреито-ла, 0,16 мМ СТР, 0,16 мМ UTP, 0,16 мМ GTP, 0,16 мМ АТР и 1 мкл ферментативного раствора CUGA 7 (NIPPON GENE CO., LTD.) с буферным раствором для транскрипции в системе CUGA7. К нему добавляли ДНК-матрицу для синтеза матричной РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация составила 0,1 пмоль/л. Таким образом, получали реакционный раствор общим объемом 20 мкл. Реакционный раствор инкубировали при 37°С в течение 2 ч. После инкубации добавляли 2 мкл ферментативного раствора ДНКазы и полученную в результате смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин.
7. К 22 мкл реакционного раствора, после окончания реакции, добавляли 39,6 мкл реагента Agen-court AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин полученную смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали, с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и к ним добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с, после чего этанол удаляли. Вновь добавляли 200 мкл 70% этанола и давали смеси отстояться в течение 15 с. Этанол удаляли, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной
3.
пластинки. Добавляли 21 мкл стерильной дистиллированной воды и все это тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 20 мкл супернатанта. И вновь к ней добавляли 21 мкл стерильной дистиллированной воды и все это тщательно перемешивали. Полученную смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 20 мкл супернатанта, который смешивали с описанным выше собранным образцом. Таким образом, было получено 40 мкл раствора матричной РНК бета-актина.
8. Количественную оценку раствора матричной РНК бета-актина осуществляли с помощью набора для биоанализатора RNA6000 pico kit (Agilent Technologies, Inc.). Концентрацию измеряли с помощью устройства NanoDrop 8000 (Thermo SCIENTIFIC).
Фиг. 5 представляет собой фотографию, на которой показан результат синтезирования ДНК-матрицы для синтеза матричной РНК бета-актина. При синтезе ДНК-матрицы, показанной на фиг. 5, осуществляли реакцию ПЦР, меняя при этом количество добавляемой суспензии (1, 2, 5 и 10 мкл) клона АК025375 Е. coli, содержащего кДНК бета-актина человека. Как можно видеть на фиг. 5, уже когда добавленное количество суспензии составляло от 1 до 5 мкл, можно было синтезировать ДНК-матрицу для синтеза матричной РНК бета-актина требуемого размера в 1751 п.н.
На фиг. 6 показан результат синтезирования матричной РНК бета-актина с помощью набора CUGA 7 in vitro Transcription Kit. Как можно видеть на фиг. 6, можно было синтезировать продукт РНК требуемого размера в 1730 п.н.
Объяснение фиг. 6.
L: маркер.
Полоса 1: образец после синтеза РНК (без разведения).
Полоса 2: образец после синтеза РНК (10-кратное разведение дистиллированной водой, свободной
от РНКазы).
Полоса 3: образец после синтеза РНК (100-кратное разведение дистиллированной водой, свободной от РНКазы).
Полоса 4: образец после синтеза РНК (1000-кратное разведение дистиллированной водой, свободной от РНКазы).
Полоса 5: образец после синтеза РНК (10000-кратное разведение дистиллированной водой, свободной от РНКазы).
Полоса 6: образец после синтеза РНК (100000-кратное разведение дистиллированной водой, свободной от РНКазы).
Пример 2-D. Эксперимент по проверке работы термоблока для проведения реакций и по проверке ПЦР на субстрате предметного стекла микроскопа.
1. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к предметному стеклу микроскопа, чтобы получить реакционную ячейку.
2. Единственную колонию клона АК025375 Е. coli, содержащую кДНК бета-актина человека, соскребали и суспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды.
3. Реакционный раствор получали путем смешивания 1,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ dNTP, смеси праймеров (прямой: 5'- GGCATGGGTCAGAAGGATT-З', обратный: 5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-З', по 0,2 мкМ каждого), специфичных в отношении матричной РНК бета-актина, и 1 единицы ДНК-полимеразы Platinum Taq (Invitrogen) с буферным раствором для системы Platinum Taq.
К реакционному раствору добавляли 1 мкл описанной выше суспензии клона Е. coli, содержащего кДНК бета-актина. Таким образом, получали реакционный раствор ПЦР общим объемом 50 мкл. 25 мкл описанного выше реакционного раствора ПЦР добавляли к реакционной ячейке, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR).
Прямой: 5'-GGCATGGGTCAGAAGGATT-3' (SEQ ID NO: 16)
Обратный:5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3' (SEQ ID NO: 17)
4. Предметное стекло микроскопа, на котором вышеописанный реакционный раствор был заключен в реакционной ячейке, помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Предметное стекло микроскопа нагревали при 94°С в течение 4 мин, а затем подвергали 30 следующим циклам тепловой обработки: 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. После этого предметное стекло инкубировали при 72°С в течение 5 мин для завершения реакции.
5. После окончания реакции предметное стекло микроскопа извлекали, и, отделив покрывающую пленку, с помощью устройства для пипетирования собирали 20 мкл реакционного раствора. К 20 мкл собранного реакционного раствора добавляли 36 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Суперна-тант отделяли с осторожностью, чтобы не потерять бусинки, и добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученную в результате смесь выдерживали в течение 15 с, после чего удаляли этанол. Вновь добавляли 200
4.
мкл 70% этанола и смесь выдерживали в течение 15 с. Этанол удаляли, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. Добавляли 21 мкл стерильной дистиллированной воды и все это тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 20 мкл супернатанта.
6. Полученный таким образом образец раствора подвергали количественной оценке с помощью набора для биоанализа ДНК, bioanalyzer DNA 1000 kit (Agilent Technologies, Inc.).
На фиг. 7 показан результат проверки работы термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu, и результат проверки реакции ПЦР в реакционной ячейке, полученной с использованием предметного стекла микроскопа. Как можно видеть на фиг. 7, как и в случае эксперимента с ПЦР, выполненного с использованием пробирки для ПЦР (пример 2-А, Полоса 5), можно было синтезировать и продукт ПЦР размером 133 п.н. (полоса была бледная, но определенно распознаваемая). Это подтвердило функциональность термоблока для проведения реакций. Кроме того, было подтверждено, что реакцию ПЦР можно проводить в реакционной ячейке, полученной с использованием предметного стекла микроскопа.
Объяснение фиг. 7.
L: маркер.
Дорожка 1: образец после ПЦР.
Пример 2-Е. Эксперимент по проверке связывания биотинилированньгх праймеров с покровным стеклом.
1. Праймер настоящего примера (АСТВ-5Т 5'BioM Су5: SEQ ID NO: 15) был синтезирован путем модификации специфического праймера (5'-AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT-3' ) таким образом, что его 5'-конец был биотинилирован, а 3'-конец маркировали посредством Cy5.
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к покрытой биотином поверхности покровного стекла (Alliance Technology, Biotin/cover slip/Bio_02-C) для получения реакционной ячейки. 20 мкг/мл раствора стрептавидинового белка, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин, добавляли к ячейке так, чтобы покрытая биотином поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, осуществляя таким образом иммобилизацию стрептавидинового белка на поверхности покровного стекла. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, тем самым удаляя избыток стрептавидинового белка.
3. Глицерин добавляли к физиологическому раствору так, чтобы его концентрация составила 10%. В него добавляли Cy5-меченный биотинилированный праймер так, чтобы конечная концентрация праймера составила 50 пмоль/л или 200 пмоль/л. Таким образом, было получено две разновидности растворов Cy5-меченных биотинилированных праймеров, по 50 мкл в отдельных 0,5-мл пробирках. К реакционной ячейке на иммобилизованное на стрептавидине покровное стекло добавляли каждый из растворов Cy5-меченных биотинилированных праймеров так, чтобы поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию Cy5-меченного биотинилированного праймера. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыток праймера.
4. Добавляли 25 мкл физиологического раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TA-KARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR). Затем покровное стекло возбуждали светом, при длине волны возбуждения 640 нм, используя для этого флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (NIKON CORPORATION), и наблюдали флуоресценцию при 692±20 нм.
Каждая из фиг. 8, 9 и 10 представляет собой фотографию, на которой показан результат наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа. На фиг. 8 показан результат, полученный в отношении отрицательного контроля (без стрептавидина, добавляли 200 пМ Cy5-меченного биотинилированного праймера, промывали после инкубации); на фиг. 9 показан результат, полученный при добавлении 50 пМ олиго-Cy5 (промывали после добавления стрептавидина, добавляли 50 пМ Cy5-меченного биотинилиро-ванного праймера, промывали после инкубации), и на фиг. 10 показан результат, полученный при добавлении 200 пМ олиго-Cy5 (промывали после добавления стрептавидина, добавляли 200 пМ Cy5-меченного биотинилированного праймера, промывали после инкубации). Как можно видеть на фиг. 8, 9 и 10, изменение [количества] флуоресцирующих пятен, полученных в результате применения Cy5 в качестве метки в биотинилированном праймере, носило характер концентрационной зависимости, и на фотоизображении отрицательного контроля, в который стрептавидин добавлен не был, наблюдается отсутствие флуоресцирующего пятна. Полученные результаты подтвердили, что связывание биотинилирован-ного праймера было успешно достигнуто. Кроме того, данные результаты подтвердили, что способ промывки, используемый в настоящем эксперименте, является эффективным в удалении неспецифических биотинилированных праймеров.
Пример 2-F. Эксперимент, в котором с использованием полученной ДНК бета-актина проверяли эффективность реакционной системы ПЦР и эффективность праймер-иммобилизованной ПЦР в ячейке, полученной с использованием субстрата из стекла.
1. Пара праймеров настоящего примера была синтезирована путем биотинилирования 5'-концов специфических праймеров
(Прямой: 5'-AAA AAA AAA AGG CAT GGG TCA GAA GGA TT-3' (SEQ ID NO: 1), Обратный: 5'-AAA AAA AAA AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3' (SEQ ID NO: 2)).
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к покрытой биотином поверхности покровного стекла (Alliance Technology, Biotin/cover slip/Bio 02-C) для получения реакционной ячейки. 20 мкг/мл раствора стрептавидинового белка, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин, добавляли к ячейке так, чтобы покрытая биотином поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию стрептавидинового белка на поверхности покровного стекла. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыток стрептавидинового белка.
3. Глицерин добавляли к физиологическому раствору так, чтобы его концентрация составила 10%. Затем к нему были добавлены две разновидности праймеров, а именно биотинилированный прямой праймер и биотинилированный обратный праймер так, чтобы конечная концентрация каждого из этих праймеров составила 3,3 мкмоль/л. К реакционной ячейке на иммобилизованное на стрептавидине покровное стекло добавляли биотинилированный раствор пары праймеров так, чтобы поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию биотинилированной пары праймеров. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество праймеров.
4. Реакционный раствор получали путем смешивания 1,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ dNTP, раствора SYBR Green и 1 единицы ДНК-полимеразы Platinum Taq (Invitrogen) с раствором буфера для Platinum Taq. К реакционному раствору добавляли ДНК бета-актина так, чтобы ее концентрация составила 20 пМ. К ячейке на покровное стекло с иммобилизованной на нем парой праймеров добавляли 25 мкл реакционного раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for
in situ PCR).
5. Покровное стекло помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, Gene-Pro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro In-situ. Покровное стекло нагревали при 94°С в течение 4 мин и затем подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. После этого покровное стекло инкубировали при 72°С в течение 10 мин, чтобы завершить реакцию.
6. Покровное стекло после окончания реакции возбуждали светом при длине волны возбуждения 470 нм, используя для этого флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (NIKON CORPORATION), и наблюдали флуоресценцию при 525 нм.
Фиг. 11 представляет собой фотографию, на которой показан результат наблюдения покровного стекла после праймер-иммобилизованной ПЦР с использованием флуоресцентного микроскопа. Как можно видеть на фиг. 11, наблюдались флуоресцирующие пятна, полученные из SYBR Green, которые показывают, что в результате праймер-иммобилизованной ПЦР образовались кластеры двухцепочечной
ДНК.
Пример 2-G. Эксперимент, в котором эффективность реакционной системы двухстадийной ОТ-ПЦР проверяли с помощью матричной РНК бета-актина.
1. В 0,2-мл пробирке для ПЦР получали 10 мкл раствора, который содержал 2 мкл 1 мкМ праймера ACTB-5'R, 1 мкл 10 мМ dNTP и 1 мкг/мкл матричной РНК бета-актина. Пробирку для ПЦР помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems), и инкубировали при 65°С в течение 5 мин. После инкубации пробирку для ПЦР охлаждали на льду в течение 2 мин. К пробирке, содержащей реакционный раствор, были добавлены раствор буфера для обратной транскриптазы Superscript III, 2 мкл 0,1 М дитиотреитола и 4 мкл 25 мМ хлорида магния. Пробирку помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosys-tems), и инкубировали при 15°С в течение 20 мин. После инкубации к пробирке, содержащей реакционный раствор, были добавлены 1 мкл RNaseOUT и 1 мкл обратной транскриптазы Superscript III с концентрацией 200 единиц/мкл. Затем пробирку помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems), и давали реакции протекать при 55°С в течение 50 мин и при 70°С в течение 10 мин. После окончания реакции пробирку, содержащую реакционный раствор, охлаждали на льду в течение 2 мин. После охлаждения в пробирку добавляли 50 единиц РНКазы If (NEW
ENGLAND BioLabs) и 2 единицы РНКазы Н (TAKARA BIO INC.), и пробирку помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems), и инкубировали при 37°С в течение 30 мин.
2. После окончания реакции к 22 мкл реакционного раствора добавляли 39,6 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с, после чего этанол удаляли. Вновь добавляли 200 мкл 70% этанола и смеси давали отстояться в течение 15 с. Этанол отбрасывали, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. К ней добавляли 21 мкл стерильной дистиллированной воды и смешивали вместе. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 20 мкл супернатанта. Он был использован в качестве раствора продукта реакции обратной транскрипции.
3. В 0,2-мл пробирке для ПЦР получали реакционный раствор путем смешивания 1 мМ хлорида магния, 0,16 мМ dNTP и 1,25 единиц ДНК-полимеразы Taq HotStar (QIAGEN) с буферным раствором для HotStar Taq. К реакционному раствору добавляли 1 мкл описанного выше раствора продукта реакции обратной транскрипции. К полученной в результате смеси добавляли пару праймеров, состоящую из 0,5 мкМ ACTB-5'F праймера (5' - GGCATGGGTCAGAAGGATT-3' : SEQ ID NO: 5) и 0,5 мкМ ACTB-5'R праймера (5' -AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3' : SEQ ID NO: 6).
Таким образом, получали реакционный раствор ПЦР общим объемом 50 мкл.
4. 0,2-мл пробирку для ПЦР, содержащую реакционный раствор ПЦР, помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems). Реакционный раствор нагревали при 95°С в течение 15 мин и затем подвергали 30 циклам термальной обработки в следующих режимах: 94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После этого реакционный раствор инкубировали при 72°С в течение 10 мин для завершения реакции.
5. К 50 мкл реакционного раствора добавляли 90 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Су-пернатант отбрасывали, с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с, после чего этанол отбрасывали. Снова добавляли 200 мкл 70% этанола и смеси давали отстояться в течение 15 с. Этанол отбрасывали, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. К ней добавляли 41 мкл стерильной дистиллированной воды и все это тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого собирали 40 мкл су-пернатанта. Он был использован в качестве реакционного раствора ПЦР.
6. Полученный таким образом образец раствора подвергали количественному определению с помощью набора для биоанализа ДНК, bioanalyzer DNA 1000 kit (Agilent Technologies, Inc.).
На фиг. 12 показан результат электрофореза образца после двухступенчатой ОТ-ПЦР. Объяснение фиг. 12.
Полосы 1-3: образец после обратной транскрипции (1: без разведения, 2: 5-кратное разведение, 3: отрицательный контроль (без шаблонной РНК)).
Полосы 4-6: образец после ПЦР (4: без разведения, 5: 5-кратное разведение, 6: отрицательный контроль (без матричной РНК)).
Как видно из полос 4 и 5 на фиг. 12, может быть синтезирован продукт ОТ-ПЦР размером 133 п.н. Таким образом, было обнаружено, что матричная РНК бета-актина, синтезированная в примере 2-С, может быть использована в качестве матрицы в ОТ-ПЦР. Кроме того, было получено подтверждение того, что реакционная система для двухступенчатой ОТ-ПЦР, используемая в настоящем эксперименте, функционирует успешно.
Пример 2-Н. Эксперимент для проверки эффективности реакционной системы одноступенчатой
ОТ-ПЦР.
1. В 0,2-мл пробирке для ПЦР реакционный раствор получали путем смешивания 1,6 мМ сульфата
магния, 0,2 мМ dNTP, смеси праймеров (прямой:
5'-GGCATGGGTCAGAAGGATT-3' : SEQ ID NO: 16, обратный'
5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3': SEQ ID NO: 17, каждого по 0,2 мкМ), специфичных в отношении матричной РНК бета-актина, матричной РНК бета-актина в количестве, достаточном для достижения конечной концентрации 0,5 мкг/мкл, и 2 единиц ДНК-полимеразы Taq Platinum (Invitrogen) с буферным раствором для Platinum Taq. К реакционному раствору было добавлено 100, 200 или 500 единиц обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen). Таким образом, получали реакционный раствор, который
позволяет осуществлять как обратную транскрипцию, так и ПЦР.
2. 0,2-мл пробирку для ПЦР, содержащую реакционный раствор, помещали в термоблок для проведения реакций, GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems). Реакционный раствор нагревали при 55°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин и затем подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 30 с. После этого реакционный раствор инкубировали при 68°С в течение 5 мин для завершения реакции.
3. После завершения реакции к 50 мкл реакционного раствора добавляли 90 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали вместе. Затем смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученной в результате смеси давали отстояться в течение 15 с, после чего этанол отбрасывали. Снова добавляли 200 мкл 70% этанола и смеси давали отстояться в течение 15 с. Этанол отбрасывали, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. Добавляли 41 мкл стерильной дистиллированной воды и все это тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого 40 мкл супернатанта собирали.
4. Полученный таким образом образец раствора подвергали количественной оценке с использованием набора bioanalyzer DNA 1000 kit (Agilent Technologies, Inc.).
На фиг. 13 показан результат электрофореза образца после одноступенчатой ОТ-ПЦР. Как можно видеть на фиг. 13, наблюдали полосу, соответствующую целевому продукту в 133 п.н. Таким образом, было получено подтверждение того, что реакционная система для одноступенчатой ОТ-ПЦР успешно функционирует. Было подтверждено, что реакционная система функционирует успешно в любом из случаев, когда количество обратной транскриптазы Superscript III составляет 100 единиц, 200 единиц или 500 единиц.
Объяснение фиг. 13. L: маркер.
Полоса 1: образец после ОТ-ПЦР, без разведения (100 единиц обратной транскриптазы Superscript III было добавлено).
Полоса 2: образец после ОТ-ПЦР, разбавленный 5-кратно (было добавлено 100 единиц обратной транскриптазы Superscript III).
Полоса 3: образец после ОТ-ПЦР, без разведения (было добавлено 200 единиц обратной транскрип-тазы Superscript III).
Полоса 4: образец после ОТ-ПЦР, разбавленный 5-кратно (было добавлено 200 единиц обратной транскриптазы Superscript III).
Полоса 5: образец после ОТ-ПЦР, без разведения (было добавлено 500 единиц обратной транскрип-тазы Superscript III).
Полоса 6: образец после ОТ-ПЦР, разбавленный 5-кратно (было добавлено 500 единиц обратной транскриптазы Superscript III).
Полоса 7: образец после ОТ-ПЦР, без разведения (без матричной РНК бета-актина, служащей в качестве матрицы, было добавлено 100 единиц обратной транскриптазы Superscript III).
Пример 2-1. Эксперимент по проверке эффективности реакционной системы одноступенчатой ОТ-ПЦР в камере, полученной с использованием субстрата из стекла.
1. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к предмет-
ному стеклу микроскопа для получения реакционной камеры.
5'-GGCATGGGTCAGAAGGATT-3' : SEQ ID NO: 16, обратный' 5'-AGGTGTGGTGCCAGATTTTC-3': SEQ ID NO: 17, 0,2 мкМ каждый), специфичных в отношении матричной РНК бета-актина, 200 единиц обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen) и 2 единицы ДНК-полимеразы Taq Platinum (Invitrogen) смешивали с буферным раствором для Platinum Taq. Таким образом, получен реакционный раствор, который позволяет осуществлять как обратную транскрипцию, так и ПЦР. К полученному реакционному раствору добавляли матричную РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация в растворе составила 0,5 мкг/мкл.
3. 25 мкл реакционного раствора добавляли к реакционной камере, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR).
4. Предметное стекло микроскопа, на которое в реакционной ячейке был нанесен указанный выше реакционный раствор, помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Предметное стекло микроскопа нагревали при 55°С в течение 30 мин и при 94°С в течение 4 мин и затем подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 68°С в течение 1 мин. После этого предметное стекло микроскопа инкубировали при 68°С в течение 5
2. 1,6 мМ сульфата магния, 0,2 мМ dNTP, смесь праймеров (прямой:
мин для завершения реакции.
5. После завершения реакции извлекали предметное стекло микроскопа, и, убрав покрывающую пленку, с помощью устройства для пипетирования собирали 20 мкл реакционного раствора. К 20 мкл собранного реакционного раствора добавляли 36 мкл реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.) и смешивали их вместе. Затем смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин смесь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. Суперна-тант отбрасывали с осторожностью, чтобы не выбросить бусинки, и добавляли 200 мкл 70% этанола. Полученную в результате смесь выдерживали в течение 15 с, после чего этанол отбрасывали. Снова добавляли 200 мкл 70% этанола и давали смеси отстояться в течение 15 с. Этанол отбрасывали, после чего смесь сушили в течение 3 мин, с осторожностью, чтобы избежать загрязнения пылью. После сушки смесь перемещали к наружной стороне магнитной пластинки. К ней добавляли 21 мкл стерильной дистиллированной воды и все это тщательно перемешивали. Полученную в результате смесь вновь помещали на магнитную пластинку и давали отстояться в течение 5 мин. После этого 20 мкл супернатанта собирали.
6. Полученный таким образом образец раствора подвергали количественной оценке с помощью набора для биоанализа ДНК, bioanalyzer DNA 1000 kit (Agilent Technologies, Inc.).
На фиг. 14 показан результат электрофореза образца после одноступенчатой ОТ-ПЦР, осуществляемой в ячейке, полученной с использованием субстрата из стекла. Как можно видеть на фиг. 14, наблюдается полоса, соответствующая целевому продукту в 133 п.н. Таким образом, было получено подтверждение того, что реакционная система для одноступенчатой ОТ-ПЦР, осуществляемой в ячейке, полученной с использованием субстрата из стекла, успешно функционирует.
Объяснение фиг. 14.
L: маркер.
Полосы 1-3: образец после одноступенчатой ОТ-ПЦР.
Пример 2-J. Эксперимент, в котором были подсчитаны молекулы матричной РНК бета-актина, полученные путем мостиковой ОТ-ПЦР с помощью набора иммобилизованных специфических праймеров.
1. Праймеры настоящего примера были синтезированы путем биотинилирования 5'-концов специфических праймеров (прямой: 5'- ТАМ AM AM AGG CAT GGG TCA GAA GGA ТТ-З' (SEQ ID NO: D,
Обратный- 5'-AAA AAA AAA AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3' (SEQ ID NO: 2)).
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к покрытой биотином поверхности покровного стекла (Alliance Technology, Biotin/cover slip/Bio 02-C) получения реакционной камеры. 20 мкг/мл раствора стрептавидинового белка, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин, добавляли к ячейке так, чтобы покрытая биотином поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым иммобилизуя стрептавидиновый белок на поверхности покровного стекла. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество стрептавидинового белка.
3. Глицерин добавляли к физиологическому раствору так, чтобы его концентрация составила 10%. Затем к нему были добавлены две разновидности праймеров, а именно биотинилированный прямой праймер и биотинилированный обратный праймер так, чтобы конечная концентрация каждого из этих праймеров составила 3,3 мкмоль/л, или, альтернативно, в качестве отрицательного контроля, к нему был добавлен только прямой праймер так, чтобы конечная концентрация прямого праймера составила 6,6 мкмоль/л. К реакционной ячейке на иммобилизирующее стрептавидином покровное стекло добавляли, в качестве отрицательного контроля, биотинилированный раствор пары праймеров или раствор прямого праймера так, чтобы поверхность покровного стекла в каждой ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы защитить поверхность от высыхания, ячейку покрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию биотини-лированной пары праймеров или биотинилированного прямого праймера в качестве отрицательного контроля. После иммобилизации покровное стекло три раза промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыток праймера (праймеров).
4. 1,6 мМ сульфата магния, 0,2 мМ dNTP, раствор SYBR Green, 200 единиц обратной транскрипта-зы Superscript III (Invitrogen) и 2 единицы ДНК-полимеразы Taq Platinum (Invitrogen) смешивали с буферным раствором для Taq Platinum. Таким образом, получали реакционный раствор, в котором можно осуществлять как реакцию обратной транскриптазы, так и реакцию ПЦР. К полученному реакционному раствору добавляли матричную РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация в растворе составила 100 пМ. К ячейке на покровном стекле, на котором содержится иммобилизованная на нем пара праймеров или же только прямой праймер в качестве отрицательного контроля, добавляли 25 мкл реакционного раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ
PCR).
5. Каждое покровное стекло помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Покровное стекло нагревали при 55°С в течение 30 мин и при 94°С в течение 4 мин, и затем подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 68°С в течение 1 мин. После этого покровное стекло инкубировали при 68°С в течение 5 мин для завершения реакции.
6. После завершения реакции покровное стекло возбуждали светом при длине волны возбуждения 470 нм, используя для этого флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (NIKON CORPORATION), и наблюдали флуоресценцию при 52 5 нм.
Каждая из фиг. 15 и 16 является фотографией, на которой показан результат наблюдения покровного стекла после осуществления мостиковой ОТ-ПЦР с использованием флуоресцентного микроскопа. На фиг. 15 показан результат, полученный в отрицательном контроле (был иммобилизован только прямой праймер, добавляли 100 нМ матричной РНК бета-актина), а на фиг. 16 приведен результат, полученный, когда добавляли 100 пМ матричной РНК бета-актина. Как можно видеть на фиг. 15 и 16, флуоресцирующие пятна, полученные от красителя SYBR Green, наблюдались только в реакционной ячейке, в которой были иммобилизованы оба праймера, прямой праймер и обратный праймер. Из этих результатов было обнаружено, что флуоресцирующие пятна были получены из кластеров двухцепочечной ДНК, что подтверждает то, что реакционная система мостиковой ОТ-ПЦР успешно восстанавливается при использовании иммобилизованной пары праймеров.
Пример 2-K. Эксперимент, в котором были подсчитаны молекулы матричной РНК бета-актина, полученные методом мостиковой ОТ-ПЦР с помощью набора иммобилизованных специфических прайме-ров (воспроизводимость проверок в отношении концентрации шаблонной матричной РНК и амплификации).
1. Праймеры настоящего примера были синтезированы путем биотинилирования 5'-концов специфических праймеров (прямой:5'" (tm) (tm) ^ AGG CAT GGG ТСА GAA GGA ТТ-З' (SEQ ID NO: D,
обратный: 5' _AAA AAA AAA AAG GTG TGG TGC CAG ATT ТТС~3' (SEQ ID NO: 2)).
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к покрытой биотином поверхности покровного стекла (Alliance Technology, Biotin/cover slip/Bio 02-C) для получения реакционной камеры. 20 мкг/мл раствора стрептавидинового белка, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин, добавляли к ячейке так, чтобы покрытая биотином поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым позволяя стрептавидиновому белку иммобилизоваться на поверхности покровного стекла. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество стрептавидинового белка. В это время получали также содержащий глицерин физиологический раствор, к которому, вместо стрептавидина, добавляли воду, свободную от РНКазы, и его добавляли к покрытому биотином покровному стеклу в качестве отрицательного контроля.
3. Глицерин добавляли к физиологическому раствору так, чтобы его концентрация составила 10%. Затем к полученному добавляли две разновидности праймеров, а именно биотинилированный прямой праймер и биотинилированный обратный праймер так, чтобы конечная концентрация каждого из указанных праймеров составила 3,3 мкмоль/л. К реакционной ячейке на иммобилизованное на стрептавидине покровное стекло и к ячейке отрицательного контроля добавляли биотинилированный раствор пары праймеров так, чтобы поверхность покровного стекла в каждой ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию биотини-лированной пары праймеров. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество праймеров.
4. 1,6 мМ сульфата магния, 0,2 мМ dNTP, раствора SYBR Green, 200 единиц обратной транскрипта-зы Superscript III (Invitrogen) и 2 единицы ДНК-полимеразы Taq Platinum (Invitrogen) смешивали с буферным раствором для системы Platinum Taq. Таким образом, получали реакционный раствор, который позволяет осуществлять в нем как реакцию обратной транскрипции, так и реакцию ПЦР. К полученному реакционному раствору добавляли матричную РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация в растворе составила 100 нМ, 100 пМ или 100 фМ. К ячейке на покровное стекло с иммобилизованной на нем парой праймеров или к ячейке на покровное стекло в качестве отрицательного контроля добавляли 25 мкл реакционного раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal
for in situ PCR).
5. Каждое покровное стекло помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Покровное стекло нагревали при 55°С в течение 30 мин и при 94°С в течение 4 мин и затем подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и
5.
68°С в течение 1 мин. После этого покровное стекло инкубировали при 68°С в течение 5 мин для завершения реакции.
6. После завершения реакции покровное стекло возбуждали светом при длине волны возбуждения 470 нм, используя для этого флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (NIKON CORPORATION), и наблюдали флуоресценцию при 525 нм.
Каждая из фиг. 17-20 является фотографией, на которой показан результат наблюдения покровного стекла после осуществления мостиковой ОТ-ПЦР с помощью флуоресцентного микроскопа (концентрация матричной РНК). На фиг. 17 показан результат, полученный в случае отрицательного контроля (без стрептавидина, добавляли 100 нМ матричной РНК бета-актина); на фиг. 18 показан результат, полученный, когда добавляли 100 фМ матричной РНК бета-актина; на фиг. 19 показан результат, полученный, когда добавляли 100 пМ матричной РНК бета-актина; и на фиг. 20 показан результат, полученный, когда добавляли 100 нМ матричной РНК бета-актина. Как можно видеть из фиг. 17-20, количество флуоресцирующих пятен, полученных из SYBR Green, увеличивалось при увеличении добавляемого количества матричной РНК бета-актина (100 фМ, 100 пМ и 100 нМ).
Пример 2-L. Эксперимент, в котором были подсчитаны молекулы матричной РНК бета-актина, полученные методом мостиковой ОТ-ПЦР с использованием набора иммобилизованных специфических праймеров (количество циклов ПЦР).
1. Праймеры настоящего примера были синтезированы путем биотинилирования 5'-концов специфических праймеров (прямой: 5' - AAA AAA AAA AGG CAT GGG TCA GAA GGA TT-3' (SEQ ID NO: 1), обратный: 5'_AAA AAA AAA AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3' (SEQ ID NO: 2)).
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к покрытой биотином поверхности покровного стекла (Alliance Technology, Biotin/cover slip/Bio 02-C), чтобы получить реакционную ячейку. К ячейке добавляли 20 мкг/мл раствора стрептавидинового белка, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин так, чтобы покрытая био-тином поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию стрептавидинового белка на поверхности покровного стекла. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество стрептавидинового белка.
3. Глицерин добавляли к физиологическому раствору так, чтобы его концентрация составила 10%. Затем к нему добавляли две разновидности праймеров, а именно биотинилированный прямой праймер и биотинилированный обратный праймер так, чтобы конечная концентрация каждого из указанных прай-меров составила 3,3 мкмоль/л, или, альтернативно, в качестве отрицательного контроля, к нему добавляли только прямой праймер так, чтобы конечная концентрация прямого праймера составила 6,6 мкмоль/л. К реакционной ячейке на иммобилизованное на стрептавидине покровное стекло добавляли биотинили-рованный раствор пары праймеров или биотинилированный раствор прямого праймера в качестве отрицательного контроля так, чтобы поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию биотинилированной пары праймеров или биотинилированного прямого праймера в качестве отрицательного контроля. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыток праймера (праймеров).
4. 1,6 мМ сульфата магния, 0,2 мМ dNTP, раствор SYBR Green, 200 единиц обратной транскрипта-зы Superscript III (Invitrogen) и 2 единицы ДНК-полимеразы Taq Platinum (Invitrogen) смешивали с буферным раствором для системы Platinum Taq. Таким образом, получали реакционный раствор, который позволяет осуществлять в нем как реакцию обратной транскрипции, так и реакцию ПЦР. К полученному реакционному раствору добавляли матричную РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация в нем составила 100 пМ. К ячейке на покровное стекло с иммобилизованной на нем парой праймеров или к ячейке на покровное стекло в качестве отрицательного контроля добавляли 25 мкл реакционного раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR).
5. Каждое покровное стекло помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Покровное стекло нагревали при 55°С в течение 30 мин и при 94°С в течение 4 мин, и затем, для проведения реакции, подвергали 10, 20, 30 или 40 циклам следующей температурной обработки: при 94°С в течение 1 мин, при 60°С в течение 1 мин и при 68°С в течение 1 мин.
6. После завершения каждой серии циклов покровное стекло извлекали и охлаждали при температуре 4°С в светоэкранирующих условиях. Покровное стекло возбуждали светом при длине волны возбуждения 470 нм, используя для этого флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (NIKON CORPORATION), и наблюдали флуоресценцию при 525 нм.
Каждая из фиг. 21-25 является фотографией, на которой показан результат наблюдения покровного стекла после осуществления метода мостиковой ОТ-ПЦР с помощью флуоресцентного микроскопа (чис
ло циклов ПЦР). На фиг. 21 показан результат, полученный в качестве отрицательного контроля (только прямой праймер был иммобилизован); на фиг. 22 показан результат, полученный, когда количество циклов ПЦР составляло 10; на фиг. 23 показан результат, полученный тогда, когда количество циклов ПЦР составляло 20; на фиг. 24 показан результат, полученный тогда, когда количество циклов ПЦР составляло 30; и на фиг. 25 показан результат, полученный тогда, когда количество циклов ПЦР составляло 40. Когда количество циклов ПЦР составляло 20, образование кластеров ДНК методом мостиковой ПЦР не обнаруживалось тем методом наблюдения, который был использован в настоящем эксперименте. Когда количество циклов ПЦР составляло 30 или более, наблюдались кластеры ДНК.
Пример 2-М. Эксперимент, в котором были подсчитаны молекулы матричной РНК бета-актина, полученные методом мостиковой ОТ-ПЦР, с использованием набора иммобилизованных специфических праймеров, меченных флуоресцентными красителями, которые характеризуются собственной эмиссией/тушением флуоресценции.
1. В качестве флуоресцентных праймеров, которые характеризуются собственной эмисси-
ей/тушением флуоресценции (были получены экситонные праймеры, S. Ikeda, A. Okamoto, Chem. Asian J.
2008, 3, 958-968.), ACTB-5'F_EXS (5' - GGCATGGGT*CAGAAGGATT-3' , с биотинилированным 5'-
концом: SEQ ID NO: 11) и ACTB-5'R_ExS (5' -AGGTGTGGT*GCCAGATTTTC-3' , с биотинилирован-
ным 5'-концом: SEQ ID NO: 12) (положение, обозначенное как "Т*", является флуоресцентно меченным).
2. Адгезивную рамку (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR) прикрепляли к покрытой биотином поверхности покровного стекла (Alliance Technology, Biotin/cover slip/Bio_02-C), чтобы получить реакционную ячейку. 20 мкг/мл раствора стрептавидинового белка, полученного с использованием физиологического раствора, содержащего глицерин, добавляли к ячейке так, чтобы покрытая био-тином поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию стрептавидинового белка на поверхности покровного стекла. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество стрептавидинового белка.
3. Глицерин добавляли к физиологическому раствору так, чтобы его концентрация составила 10%. Затем к нему добавляли две разновидности праймеров, а именно биотинилированный экситонный прямой праймер и биотинилированный экситонный обратный праймер так, чтобы конечная концентрация каждого из указанных праймеров составила 3,3 мкмоль/л, или, альтернативно, к нему добавляли, в качестве отрицательного контроля, только прямой праймер так, чтобы конечная концентрация прямого праймера составила 6,6 мкмоль/л. К реакционной ячейке на иммобилизованное на стрептавидине покровное стекло добавляли биотинилированный раствор пары праймеров или биотинилированный раствор прямого праймера в качестве отрицательного контроля так, чтобы поверхность покровного стекла в ячейке была полностью покрыта раствором. Чтобы предохранить поверхность от высыхания, ячейку накрывали крышкой от чашки Петри. Затем ячейке давали отстояться при 37°С в течение 30 мин, тем самым осуществляя иммобилизацию биотинилированной экситонной пары праймеров или биотинилиро-ванного экситонного прямого праймера в качестве отрицательного контроля. После иммобилизации покровное стекло трижды промывали физиологическим раствором, таким образом удаляя избыточное количество праймера (праймеров).
4. 1,6 мМ сульфата магния, 0,2 мМ dNTP, 200 единиц обратной транскриптазы Superscript III (Invi-trogen) и 2 единицы ДНК-полимеразы Taq Platinum (Invitrogen) смешивали с буферным раствором для системы Platinum Taq. Таким образом, получали реакционный раствор, который позволяет осуществлять в нем как реакцию обратной транскрипции, так и реакцию ПЦР. К полученному реакционному раствору добавляли матричную РНК бета-актина так, чтобы ее концентрация в растворе составила 100 пМ. К ячейке на покровное стекло с иммобилизованной на нем парой праймеров или к ячейке на покровное стекло в качестве отрицательного контроля добавляли 25 мкл реакционного раствора, и ячейку закрывали покрывающей пленкой (TAKARA BIO INC., Takara Slide Seal for in situ PCR).
5. Каждое покровное стекло помещали в реакционную камеру термоблока для проведения реакций, GenePro Thermal Cycler (Bioer Technology Co., Ltd.), снабженного "японской версией" В-4 блока GenePro Insitu. Покровное стекло нагревали при 55°С в течение 30 мин и при 94°С в течение 4 мин и затем, для проведения реакции, подвергали 40 циклам следующей температурной обработки: при 94°С в течение 1 мин, при 60°С в течение 1 мин и при 68°С в течение 1 мин. После этого покровное стекло инкубировали при 68°С в течение 5 мин для завершения реакции.
6. После завершения реакции покровное стекло возбуждали светом при длине волны возбуждения 470 нм, используя для этого флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (NIKON CORPORATION), и наблюдали флуоресценцию при 520 нм.
Каждая из фиг. 26 и 27 является фотографией, на которой показан результат мостиковой ОТ-ПЦР, полученный с использованием набора иммобилизованных специфических праймеров. На фиг. 26 показан результат, полученный при рассмотрении отрицательного контроля (был иммобилизован только прямой праймер, было добавлено 100 пМ матричной РНК бета-актина); и на фиг. 27 показан результат, получен
ный, когда были иммобилизованы экситонный прямой праймер и экситонный обратный праймер, и было добавлено 100 пМ матричной РНК бета-актина. Когда ОТ-ПЦР осуществляли с обоими праймерами, прямым и обратным флуоресцентными праймерами (экситонные праймеры), которые характеризуются собственной эмиссией флуоресценции при образовании иммобилизованной двухцепочечной ДНК, после ОТ-ПЦР, как и в случае, когда был использован SYBR Green, наблюдались флуоресцирующие пятна, полученные из кластеров ДНК.
Промышленная применимость
Как подробно описано выше, в соответствии со способом с применением набора и устройства для анализа нуклеиновой кислоты-мишени согласно настоящему изобретению нуклеиновую кислоту-мишень можно подвергнуть легкому и быстрому анализу. В настоящем изобретении предложены, например, композиция для предсказания, определения, детекции или диагностики, используемая в предсказании, определении, детекции или диагностике физических условий (состояний) и прогноза различных заболеваний; способ предсказания, определения, детекции или диагностики физических условий (состояний) и прогноза различных заболеваний с применением указанной композиции; набор и устройство для предсказания, определения, детекции или диагностики физических условий (состояний) и прогнозе различных заболеваний с применением указанной композиции. Таким образом, согласно настоящему изобретению могут быть получены высокоточные результаты в тестировании, диагностике и т.д. заболеваний, например, в областях медицины. Следовательно, настоящее изобретение является промышленно применимым.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Kabushiki kaisha DNAFORM
<120>
СПОСОБ АНАЛИЗА
<130>
TF13032WO
<150>
JP2012-190715
<151>
2012-08-30
<160>
<170>
PatentIn versi
<210>
<211>
<212>
ДНК
<213>
Искусственная :
<220>
<223>
праймер
<400>
aaaaaaaaaa ggcatgggtc
<210>
<211>
<212>
ДНК
<213>
Искусственная
<220>
<223>
праймер
<400>
aaaaaaaaaa aggtgtggtg
<210>
<211>
<212>
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 3
ctaatacgac tcactatagg gagaatggat gatgatatcg ccgcgct 47
<210> 4
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 4
catttttaag gtgtgcactt ttattcaact ggtc 34
<210> <211> <212> <213>
19 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 5
ggcatgggtc agaaggatt
<210> 6
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 6
aggtgtggtg ccagattttc 20
<210> <211> <212> <213>
19 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 7
ggcatgggtc agaaggatt
<210> 8
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 8
aggtgtggtg ccagattttc 20
<210> <211> <212> <213>
29 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 9
aaaaaaaaaa ggcatgggtc agaaggatt 29
<210> 10
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 10
aaaaaaaaaa aggtgtggtg ccagattttc 30
<210> <211> <212> <213>
11 20 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> n представляет собой введенную в тимин метку-краситель, характеризующуюся экситонным эффектом
<400> 11
ggcatgggtn cagaaggatt 20
<210> <211> <212> <213>
12 21 ДНК
Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n представляет собой введенную в тимин метку-краситель, характеризующуюся экситонным эффектом
<400> 12
aggtgtggtn gccagatttt c 21
<210> 13
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n представляет собой введенную в тимин метку-краситель, характеризующуюся экситонным эффектом
<400> 13
ggcatgggtn cagaaggatt 20
<210>
<211>
<212>
ДНК
<213>
Искусственная
<220>
<223>
праймер
<220>
<221>
misc_feature
<222>
(10)..(10)
<223>
n представляет
собой введенную в тимин метку-краситель, характеризующуюся экситонным эффектом
<400> 14
aggtgtggtn gccagatttt c 21
<210> 15
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 15
aaaaaaaaaa ggcatgggtc agaaggatt 29
<210> 16
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 16
ggcatgggtc agaaggatt 19
<210> 17
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 17
aggtgtggtg ccagattttc 20
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, при этом указанный способ включает следующие стадии:
проведение анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем приведения образца в контакт с меткой и с праймером, который может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью,
при этом праймер иммобилизован на твердой фазе и является молекулой нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну из структур, представленную формулами (16) и (16b),
метка ковалентно связана с праймером так, что является частью праймера,
метка представляет собой фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситон-ным эффектом, и метка не излучает свет, когда праймер не гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, тогда как если праймер гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, метка излучает свет,
анализ осуществляют путем детекции светового излучения из метки, вызванного гибридизацией праймера с нуклеиновой кислотой-мишенью, и
нуклеиновую кислоту-мишень, которая гибридизована с праймером, удаляют путем промывания, праймер снова гибридизуется с другой нуклеиновой кислотой-мишенью, и снова осуществляют анализ путем детекции светового излучения из метки
z12
где в формулах (16) и (16b)
В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (адени-на, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или остов искусственного основания нуклеиновой кислоты; Е является
(i) атомной группой, имеющей остов дезоксирибозы, остов рибозы или структуру, полученную из одного из этих сахаров, или
(ii) атомной группой, имеющей пептидную структуру или пептоидную структуру;
каждый из Z11 и Z12 является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется эк-ситонным эффектом, и они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
каждый из L1, L2 и L3 является линкером (соединяющий атом или соединяющая атомная группа), длина их основной цепи (число атомов в основной цепи) является произвольной, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждый из атомов С, N, О, S, Р и Si, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира, и L1, L2 и L3 могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
D представляет собой CR, N, Р, В или SiR и R является атомом водорода, алкильной группой или произвольным заместителем;
b является одинарной связью, двойной связью или тройной связью;
или, альтернативно,
в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 является линкером, L3, D и b могут отсутствовать и L1 и L2 могут быть напрямую связаны с В при условии, что в формуле (16) Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S; и
в формуле (16b) E является атомной группой, описанной в подпункте (ii),
где праймер гибридизуют с нуклеиновой кислотой-мишенью путем приведения праймера в контакт с образцом, тем самым вызывая реакцию амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, и
через некоторое время осуществляют анализ нуклеиновой кислоты-мишени путем последующего измерения степени амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в реакции амплификации.
2. Способ по п.1, согласно которому имеются две или более разновидности нуклеиновых кислот-мишеней и соответствующие нуклеиновые кислоты-мишени детектируют раздельно.
3. Способ по п.1 или 2, согласно которому используются две или более разновидностей праймеров.
4. Способ по любому из пп.1-3, согласно которому поверхность твердой фазы, на которой иммобилизован праймер или зонд, является плоской поверхностью, плоской поверхностью чипа, сферической поверхностью или трехмерной поверхностью.
5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому поверхность твердой фазы покрыта покрытием для уменьшения фона.
6. Способ по п.5, согласно которому покрытие для уменьшения фона осуществляется путем прививочной полимеризации.
7. Способ по любому из пп.1-6, согласно которому в формулах (16) и (16b) длина основной цепи (число атомов основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 является целым числом 2 или более.
8. Способ по любому из пп.1-7, согласно которому в формулах (16) и (16b) каждый из Z11 и Z12 независимо представляет собой группу, полученную из любого из следующих красителей: тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина, а также их производных.
9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул (7)-(9):
где X1 и X2 являются S, О или Se;
n'' является 0 или положительным целым числом;
каждый из R1-R10 и R13-R21 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей ал-кильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой;
один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b), а другой является атомом водорода или низшей алкильной группой;
когда множество R15 присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
когда множество R16 присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;
X1, X2 и R1-R21 в Z11 и X1, X2 и R1-R21 В Z12 могут соответственно быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.
10. Способ по п.9, согласно которому в формулах (7)-(9) в R1-R21 низшая алкильная группа является линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 6 и низшая алкокси-группа является линейной или разветвленной алкоксигруппой с числом атомов углерода от 1 до 6.
11. Способ по п.9 или 10, согласно которому в формулах (7)-(9) в R11 и R12 соединяющая группа является полиметиленовой карбонильной группой с числом атомов углерода 2 или более и она связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b) во фрагменте карбонильной группы.
12. Способ по любому из пп.9-11, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной формулой (7) или (8), и Z11 и Z12, представленные формулой (7) или (8), являются группой, представленной следующими формулами (19) или (20):
где X1, R1-R10, R13 и R14 и R11 и R12 являются идентичными таковым в формулах (7)-(9).
13. Способ по п.12, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19),
где X1 является S;
R1-R10 являются атомами водорода;
один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b), а другой является метильной группой.
14. Способ по п.12, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19),
где X1 является S;
R1, R4, R5, R6, R7, R9 и R10 являются атомами водорода; R2, R3 и R12 являются метильными группами; R8 является атомом галогена;
R11 является соединяющей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b).
15. Способ по п.9, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (7),
где X1 является S; n является 1;
R1-R10, R15, R16 и R17 являются атомами водорода;
R11 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b); и R12 является метильной группой.
16. Способ по п.9, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул:
16.
СН3
где в каждой из приведенных выше химических формул n является целым положительным числом.
17. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной
группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, ти-
мина или урацила).
18. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной
группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой 2-амино-6-(К,1Ч-диметиламино)пурин пиридин-2-он, 5-метилпиридин-2-он, 2-амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо[(4,5)-Ь]пиридин, 5-йодо-2-оксо(1Н)пиридин 2-оксо(1Н) пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин, 7-(2-тиенил)имидазо[4,5-Ь] пиридин, бромотимин, азааденин или азагуанин.
19. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой Py, Py der., Pu или Pu der., при этом Py является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 1 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 5 в 6-членном кольце, представленном следующей формулой (11):
(1 1)
Py der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного кольца Py замещен атомом N, С, S или О и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель;
Pu является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 9 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 8 в конденсированном кольце, представленном следующей формулой (12):
7 6
и Pu der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного кольца Pu замещен атомом N, С, S или О и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель.
20. Способ по любому из пп.1-19, согласно которому структура, представленная формулой (16), является структурой, представленной следующей формулой (16-1) или (16-2), и структура, представленная формулой (16Ь), является структурой, представленной следующей формулой (16Ь-1) или (16Ь-2):
где в формулах (16-1), (16-2), (16b-1) и (16b-2) l, m и n' являются произвольными, l, m и n' могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, каждый из l, m и n' может в своей основной цепи содержать, а может и не содержать каждый из С, N, О, S, Р и Si и каждый из l, m и n' может в своей основной цепи содержать каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира;
В, Е, Z11, Z12 и b являются идентичными таковым в формулах (16) и (16b);
в формулах (16-1) и (16-2) по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S.
21. Способ по п.20, согласно которому в формулах (16-1), (16-2), (16b-1) и (16b-2) каждый из l, m и n' является целым числом 2 или более.
22. Способ по любому из пп.1-6, согласно которому молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну из нуклеотидных структур, представленных следующими химическими формулами: 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2, их геометрическими изомерами и стереоизомерами, а также их солями:
ОСН3
ТУ.
" (/Л
н f II
где n является целым положительным числом.
23. Способ по п.16 или 22, согласно которому длина линкера n заключена в интервале от 2 до 6.
24. Способ по п.1, согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени осуществляется методом мостиковой ПЦР.
25. Способ по п.24, согласно которому
в качестве праймера используют пару праймеров,
каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с прай-мером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого,
каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,
указанные метки отличаются друг от друга,
в методе мостиковой ПЦР одновременно определяют наличие или отсутствие мутации во множестве локусов в нуклеиновой кислоте-мишени или одновременно анализируют уровни экспрессии множества локусов путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.
26. Способ по п.24, согласно которому
в качестве праймера используют пару праймеров,
каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с прай-мером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующими праймерами, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,
указанные метки отличаются друг от друга,
в методе мостиковой ПЦР количественное соотношение мутаций в целом образце, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень, определяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.
27. Способ по п.24, согласно которому
в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре прайме-ров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого,
каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,
указанные метки отличаются друг от друга, и в методе мостиковой ПЦР качество образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, проверяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.
28. Способ по п.23, согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени обусловлена изотермическим методом амплификации.
29. Способ по любому из пп.1-28, согласно которому два или более пятен на праймере иммобилизованы на твердой фазе в произвольном позиционном взаиморасположении.
30. Способ по любому из пп.1-29, согласно которому указанной нуклеиновой кислотой-мишенью является РНК, при этом указанный способ дополнительно включает стадию, вызывающую реакцию обратной транскрипции РНК, и реакция обратной транскрипции вызвана раньше реакции амплификации или в одно и то же время, что и реакция амплификации на твердой фазе, имеющей иммобилизованный на ней праймер.
31. Способ по любому из пп.1-30, согласно которому реакция амплификации вызвана с помощью ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, обратной транскриптазы (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) или RNA-зависимой РНК-полимеразы.
32. Способ по любому из пп.1-31, согласно которому наличие или отсутствие мутации в нуклеиновой кислоте-мишени обнаруживают путем анализа кривой плавления после реакции амплификации.
33. Способ по любому из пп.1-32, согласно которому анализ кривой плавления осуществляют с помощью зонда, и зонд включает фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситон-ным эффектом.
34. Способ по п.33, согласно которому используют две или более разновидностей зондов, каждый из которых включает фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.
28.
Отрицательный контроль - одноцветный
Фиг. 2
Фиг. 3
s/ssoee J/JOOSOO
Степень разведения *" раствора матричной РНК бета-актина
Фиг. 6
(п.н.) Полоса :¦ "Plafinum маркеров ; Taq
-- <- Маркер
"- Целевой продукт *- Маркер
Фиг. 7
50 пМ Су5-олиго (промывка после добавления стрептавидина, добавлено 50 пМ Су5-меченного биотинилированного праймера, промывка после инкубации)
Фиг. 9
200 пМ Су5-олиго (промывка после добавления стрептавидина, добавлено 200 пМ Су5-меченного биотинилированного праймера, промывка после инкубации)
Фиг. 10
Фиг. 11
(П.Н.) ПоЛОСа :П°слеОТ i] После ОТ <". После ОТ... После ПЦР J После ПЦР.... После ПЦР,-.
маркеров;
н.) Полоса 1пппп^ОьГ После ОТ-.,, После ОТ- После ОТ,,, После ОТ-....После ОТ- ,
1^ - "~""""> ""^ Маркер
see -
Целевой продукт
Фиг. 13
170 -150-
120 -
но - I 100 -" 30 - **
<- Маркер
Фиг. 14
Отрицательный контроль
(иммобилизован только прямой праймер, ,
добавлено 100 нМ матричной РНК бета-актина)
Целевой продукт
200 мкм
Отрицательный контроль
(без стрептавидина, добавлено 100 нМ матричной РНК бета-актина)
Фиг. 17
> й РНК бета-актина
Фиг. 18
Добавлено 100 нМ матричной РНК бета-актина
Фиг. 20
Отрицательный контроль (иммобилизован только прямой праймер)
Фиг. 21
ПЦР: 10 циклов
Фиг. 22
ПЦР: 20 циклов
Фиг. 23
ПЦР: 30 циклов
Фиг. 24
200 мкм
ПЦР: 40 циклов
Фиг. 25
Отрицательный контроль (иммобилизован только прямой праймер, добавлено 100 пМ матричной РНК бета-актина)
Фиг. 26
Иммобилизован экситонный прямой праймер и экситонный обратный праймер, добавлено 100 пМ матричной РНК бета-актина)
Фиг. 27
^ ^ ^ образу ^ *(tm) \^ W
; А ,,В ...fiX '' / А Ъ У/ ' / А В , Gr
! Пятно А: положит. ¦ Пятно В: отрицат. I Пятно С: положит.
,, , А , Д,
ы i.
\ Сигнальная детекция Eprobe I Результаты образца 3 ! Пятно А: отрицат. ! Пятно В: отрицат. Пятно С: положит.
Пятно А: положит. Пятно В: положит. Пятно С: отрицат.
Фиг. 28
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032482
032482
- 1 -
- 1 -
(19)
032482
032482
- 1 -
- 1 -
(19)
032482
032482
- 2 -
- 1 -
(19)
032482
032482
- 4 -
- 3 -
032482
032482
- 3 -
032482
032482
- 6 -
032482
032482
- 5 -
032482
032482
- 8 -
- 6 -
032482
032482
- 7 -
032482
032482
- 7 -
032482
032482
- 9 -
032482
032482
- 10 -
- 10 -
032482
032482
- 11 -
- 11 -
032482
032482
- 12 -
- 12 -
032482
032482
- 14 -
- 14 -
032482
032482
- 15 -
- 15 -
032482
032482
- 23 -
- 23 -
032482
032482
- 24 -
- 24 -
032482
032482
- 27 -
- 27 -
032482
032482
- 28 -
- 28 -
032482
032482
- 29 -
- 29 -
032482
032482
- 31 -
- 31 -
032482
032482
- 33 -
- 33 -
032482
032482
- 33 -
- 33 -
032482
032482
- 34 -
- 34 -
032482
032482
- 38 -
- 38 -
032482
032482
- 38 -
- 38 -
032482
032482
- 48 -
- 48 -
032482
032482
- 48 -
- 48 -
032482
032482
- 48 -
- 48 -
032482
032482
- 48 -
- 48 -
032482
032482
- 66 -
- 66 -
032482
032482
- 67 -
- 67 -
032482
032482
- 67 -
- 67 -
032482
032482
- 67 -
- 67 -
032482
032482
- 67 -
- 67 -
032482
032482
- 67 -
- 67 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 68 -
- 68 -
032482
032482
- 76 -
- 76 -
032482
032482
- 77 -
- 77 -
032482
032482
- 77 -
- 77 -
032482
032482
- 77 -
- 77 -
032482
032482
- 78 -
032482
032482
- 78 -
032482
032482
- 80 -
032482
032482
- 80 -
032482
032482
- 81 -
- 81 -
032482
032482
- 82 -
- 82 -
032482
032482
- 83 -
032482
032482
- 83 -
032482
032482
- 86 -
- 86 -