EA 32479B1 20190628

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032479b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Катионный полимер на основе гликогена, содержащий по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а) в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -{[(C ₁ -C ₆ )алкил]ди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ ) алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(С ₁ -C ₆ ) алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкиламино}-(C ₁ -C ₆ )алкила, [три(C ₁ -C ₆ ) алкиламмонио]-(С ₁ -C ₆ )алкила, азоциклил(C ₁ -C ₆ )алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (C ₁ -C ₆ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и n равно целому числу, которое больше или равно 1; и (b) в которой R ₁ выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей группы, выбранной из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(C ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкиламино}-(C ₁ -C ₆ )алкила, [три(C ₁ -C ₆ )алкиламмонио]-(С ₁ -C ₆ )алкила, у которых (С ₁ -C ₆ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; X ₁ и X ₂ , которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR ₂ , у которой R ₂ выбран из атома водорода, (C ₁ -C ₆ )алкила и Н-[NH-(С ₁ -C ₆ )алкил] _p -, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С ₁ -C ₆ )алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и m равно целому числу, которое больше или равно 1; при условии, что по меньшей мере один из R, R ₁ , X ₁ и X ₂ представляет собой азотсодержащую группу, как указано соответственно для каждого из R, R ₁ , X ₁ и X ₂ , и при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, полученного реакцией гликогена с хлоридом N-(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония.

2. Катионный полимер на основе гликогена по п.1, у которого указанные группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [N,N-ди(C ₁ -C ₃ )алкиламино]-(C ₁ -C ₃ )алкила, {[N,N-ди(С ₁ -C ₃ ) алкиламино]-(C ₁ -C ₃ )алкилди(C ₁ -C ₃ )алкиламмонио}-(С ₁ -C ₃ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₃ )алкиламино]-(C ₁ -C ₃ ) алкиламино}-(С ₁ -C ₃ )алкила, [три(C ₁ -C ₃ )алкиламмонио]-(C ₁ -C ₃ )алкила, азоциклил-(С ₁ -C ₃ )алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (С ₁ -C ₃ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.

3. Катионный полимер на основе гликогена по п.2, у которого указанные группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из N,N-диметиламиноэтила, N,N-диметиламинопропила, N,N-диэтиламиноэтила, [(N,N-диметиламиноэтил)диметиламмонио]этила, [(N,N-диметиламинопропил)диметиламмонио]пропила, [(N,N-диэтиламиноэтил)диэтиламмонио]этила, пиперидил-N-этила или морфолинил-N-этила.

4. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого R ₁ представляет собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [N,N-ди(C ₁ -C ₃ )алкиламино]-(C ₁ -C ₃ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₃ )алкиламино]-(C ₁ -C ₃ )алкилди(C ₁ -C ₃ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₃ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₃ )алкиламино]-(C ₁ -C ₃ )алкиламино}-(C ₁ -С ₃ )алкила или [три(C ₁ -C ₃ )алкиламмонио]-(C ₁ -C ₃ )алкила, у которых (C ₁ -C ₃ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.

5. Катионный полимер на основе гликогена по п.4, у которого R ₁ представляет собой атом водорода или карбоксиметильную группу.

6. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого X ₁ и X ₂ , которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой азотсодержащую группу -NHR ₂ , у которой R ₂ представляет собой атом водорода или Н-[NH-(C ₁ -C ₄ )алкил] _p -, где p равно целому числу, которое больше или равно 1, и (C ₁ -C ₄ )алкильные группы могут быть одинаковыми или разными.

7. Катионный полимер на основе гликогена по п.6, у которого указанная группа Н-[NH-(C ₁ -C ₄ )алкил] _p - представляет собой полиэтиленимин с молекулярной массой от 50 до 3000 Да, спермин (H ₂ N(СН ₂ ) ₃ NH(СН ₂ ) ₄ NH(СН ₂ ) ₃ NH ₂ ) или спермидин (H ₂ N(CH ₂ ) ₄ NH(CH ₂ ) ₃ NH ₂ ).

8. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого указанные повторяющиеся звенья (а) и (b) содержат по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способна ионизироваться при физиологическом значении рН и выбрана из группы, состоящей из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкиламино}-(С ₁ -C ₆ )алкила и азоциклил-(C ₁ -C ₆ )алкила, и по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способна ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, и выбрана из группы, состоящей из NH ₂ -{[(С ₁ -С ₃ )алкил]ди(C ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ )алкила и {[N,N-ди(C ₁ -C ₃ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкилди(C ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -С ₆ )алкила.

9. Комплекс катионного полимера на основе гликогена по любому из пп.1-8 и анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты.

10. Комплекс по п.9, где указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве между 5 и 60 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.

11. Комплекс по п.10, где указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве между 10 и 50 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая (А) комплекс (1) катионного полимера на основе гликогена, содержащего по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а) в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащую группу, выбранную из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -С ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(C ₁ -C ₆ )алкилди(C ₁ -С ₆ )алкиламмонио]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкиламино}-(C ₁ -C ₆ )алкила, [три(C ₁ -C ₆ ) алкиламмонио]-(С ₁ -C ₆ )алкила, азоциклил(C ₁ -C ₆ )алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (С ₁ -C ₆ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и n равно целому числу, которое больше или равно 1; и (b) в которой R ₁ выбран из атома водорода, карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащей группы, выбранной из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(C ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкиламино}-(C ₁ -C ₆ )алкила, [три(C ₁ -C ₆ )алкиламмонио]-(С ₁ -C ₆ )алкила, у которых (C ₁ -C ₆ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; X ₁ и X ₂ , которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR ₂ , у которой R ₂ выбран из атома водорода, (C ₁ -C ₆ )алкила и Н-[NH-(С ₁ -C ₆ )алкил] _p -, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С ₁ -C ₆ )алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и m равно целому числу, которое больше или равно 1; при условии, что по меньшей мере один из R, R ₁ , X ₁ и X ₂ представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно для каждого из R, R ₁ , X ₁ и X ₂ , и (2) анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты; и (В) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, в которой указанным анионным соединением является нуклеиновая кислота.

14. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пп.12 и 13, пригодная для инъекционного применения.

15. Применение комплекса (1) катионного полимера на основе гликогена, содержащего по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а) в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащую группу, выбранную из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -{[(C ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио]}-(C ₁ -C ₆ ) алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -C ₆ )алкиламмонио]}-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(С ₁ -C ₆ ) алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -C ₆ )алкиламино}-(С ₁ -C ₆ )алкила, [три(С ₁ -C ₆ ) алкиламмонио]-(С ₁ -C ₆ )алкила, азоциклил(C ₁ -C ₆ )алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (C ₁ -C ₆ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами, и n равно целому числу, которое больше или равно 1; и (b) в которой R ₁ выбран из атома водорода, карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащей группы, выбранной из NH ₂ -(C ₁ -C ₆ )алкила, [N,N-ди(С ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(C ₁ -C ₆ )алкилди(С ₁ -С ₆ )алкиламмонио]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(С ₁ -С ₆ )алкилди(C ₁ -C ₆ )алкиламмонио}-(C ₁ -C ₆ )алкила, NH ₂ -[(C ₁ -С ₆ )алкиламино]-(C ₁ -C ₆ )алкила, {[N,N-ди(C ₁ -C ₆ )алкиламино]-(C ₁ -С ₆ )алкиламино}-(C ₁ -C ₆ )алкила, [три(C ₁ -C ₆ )алкиламмонио]-(C ₁ -С ₆ )алкила, у которых (C ₁ -C ₆ )алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; X ₁ и X ₂ , которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR ₂ , у которой R ₂ выбран из атома водорода, (C ₁ -C ₆ )алкила и Н-[NH-(C ₁ -C ₆ )алкил] _p -, где p равно целому числу, которое больше или равно 1, и (C ₁ -C ₆ )алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и m равно целому числу, которое больше или равно 1; при условии, что по меньшей мере один из R, R ₁ , X ₁ и X ₂ представляет собой азотсодержащую группу, как определено соответственно для каждого из R, R ₁ , X ₁ и X ₂ , и (2) анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты для доставки или трансфекции указанного анионного соединения в определенную фармакологическую мишень.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

14. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пп.12 и 13, пригодная для инъекционного применения.

Евразийское 032479 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201491613
(22) Дата подачи заявки
2013.02.21
(51) Int. Cl. C08B 37/00 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01)
(54) КАТИОННЫЕ ПОЛИМЕРЫ НА ОСНОВЕ ГЛИКОГЕНА
(31) 12159710.8
(32) 2012.03.15
(33) EP
(43) 2014.12.30
(86) PCT/EP2013/053422
(87) WO 2013/135471 2013.09.19
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АЦЬЕНДЕ КИМИКЕ РЬЮНИТЕ АНДЖЕЛИНИ ФРАНЧЕСКО А.К.Р.А.Ф. С.П.А. (IT)
(72) Изобретатель:
Руссо Винченцо, Либерати Элиза, Каццолла Никола (IT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) PAL S. ET AL.: "Synthesis, characterization and flocculation characteristics of cationic glycogen: A novel polymeric flocculant", COLLOIDS AND SURFACES. A, PHYSICACHEMICAL AND ENGINEERING ASPECTS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 289, no. 1-3, 15 October 2006 (2006-10-15), pages 193-199, XP027995507, ISSN: 0927-7757 [retrieved on 2006-10-15] the whole document
US-B1-7144713
ЕР^1-2275085
(57) Изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, комплексам указанных катионных полимеров с анионными соединениями, фармацевтическим композициям, содержащим указанные комплексы, и применению указанных комплексов для доставки или трансфекции указанных анионных соединений к определенной фармакологической мишени, такой как, например, орган, ткань или клетка.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, комплексам, содержащим указанные полимеры и по меньшей мере одно анионное соединение, и применению указанных комплексов для доставки анионных соединений.
В частности, катионные полимеры на основе гликогена являются применимыми в качестве невирусных векторов для трансфекции нуклеиновых кислот.
Описание предшествующего уровня техники
Для уменьшения побочных действий активных ингредиентов и максимизации их терапевтической эффективности были разработаны системы с регулируемым высвобождением, в которых лекарственная форма регулирует фазу высвобождения активного ингредиента, а также системы, способные доставлять и направлять активный ингредиент к определенной фармакологической мишени.
В частности, доставляющие и направляющие системы должны взаимодействовать с активными ингредиентами таким образом, чтобы полученный комплекс был стабильным при хранении и введении, но высвобождал активный ингредиент в заданной фармакологической мишени.
Обычно связи, которые образуются между системой доставки и активным ингредиентом являются нековалентными, например, электростатическими, ионными или ван-дер-ваальсовыми связями, водородными связями и тому подобными связями.
Проблема разработки доставляющих и направляющих систем относится частично к активным ингредиентам с низкой молекулярной массой и частично к полимерам и молекулам с высокой молекулярной массой, например нуклеиновым кислотам.
В частности, указывается способ сознательной инсерции последовательностей нуклеиновых кислот и/или генетических конструкций в клетки-мишени с целью компенсации отсутствия гена, сверхэкспрессии гена, заглушения экспрессии гена или введения новых функций в указанную клетку в области генной терапии, обозначаемый термином "трансфекция".
Этот способ, как представляется, является перспективным как при лечении генетических заболеваний, так и при разработке стратегий для лечения и предотвращения хронических заболеваний.
Однако, при введении in vivo в нативной форме нуклеиновые кислоты, подобно другим полианионным веществам, быстро разлагаются катионными ферментами (например, нуклеазами и протеазами) и слабо поглощаются клетками.
Генные векторы, которые изучены и разработаны до настоящего времени, включают в себя вирусные системы (ретровирусы, аденовирусы и т.д.) и невирусные системы (липосомы, полимеры, пептиды и т.д.).
Известно, что вирусные векторы имеют более высокую эффективность трансфекции по сравнению с невирусными системами. Однако применение вирусных векторов in vivo ограничено многими недостатками, например риском репликации, возможностью индуцирования иммунных реакций, тем фактором, что только субреплицированные клетки являются применимыми в качестве мишеней, низкой емкостью заряда генов больших размеров или произвольной инсерцией фрагментов ДНК.
В настоящей области известно, что применение генных терапий на основе невирусных векторов имеет многочисленные преимущества, среди которых имеются относительная безопасность и низкие стоимости препаратов.
Невирусные генные векторы, например катионные полимеры, липосомы и синтетические векторы, были широко исследованы в качестве альтернативы применению вирусных векторов.
^^Диэтиламиноэтилдекстран (DEAE-декстран) был одним из первых химических производных природного полимера, который применяли для регулируемого высвобождения активных ингредиентов (например, для регулируемого высвобождения в слизистой оболочке, как описано, например, в WO 90/09780) и затем в качестве агента трансфекции (как описано, например, в ЕР 1738769).
DEAE-декстран представляет собой поликатионный полимер, полученный взаимодействием N,N-диэтиламиноэтилхлорида и декстрана, который представляет собой линейный полимер, у которого звенья глюкозы связываются посредством а-1,6-связей, и который имеет небольшое число разветвлений, у которых мономеры глюкозы связаны посредством а-1,4-связей (нумерация показана в приведенной ниже формуле).
DEAE-декстран, представленный следующей структурной формулой, имеет два заместителя, содержащие азотистые остатки, у которых атомы азота имеют отличные друг от друга физико-химические характеристики:
Первый заместитель содержит третичную функциональную аминогруппу (обозначается как N') с pKa приблизительно 9,5, которая при физиологическом значении рН имеет ионизированную форму. Второй заместитель, известный как "тандем", содержит четвертичную аммониевую группу (N ), которая имеет постоянный положительный заряд и влияет на кислотность второй третичной функциональной аминогруппы (обозначенной как N"), которая имеет pKa приблизительно 5,7 и затем, при физиологическом значении рН, находится в неионизированной форме (F. Gubensek, Journal of Macromolecular Science: Part A - Chemistry - 2 (5) 1968, 1045-1054).
Известно, однако, что положительные заряды DEAE-декстрана in vivo взаимодействуют с анионными биологическими структурами, другими, чем нуклеиновые кислоты, что приводит к появлению токсичности.
В общем, механизм образования комплексов между катионными полимерами и нуклеиновыми кислотами и последующей доставки можно суммировать следующим образом.
Генетический материал образует комплекс с катионными полимерами посредством слабых связей, например электростатических связей. Образование этого комплекса защищает нуклеиновую кислоту от деградации под воздействием нуклеазы и позволяет нуклеиновой кислоте доставляться в клетку, поскольку положительные заряды, присутствующие на поверхности комплекса, взаимодействуют с клеточной мембраной, стимулируя эндоцитоз комплекса посредством образования цитоплазматических телец.
Внутренняя часть цитоплазматических телец имеет значение рН приблизительно 4,5-5, которое является значительно более кислотным, чем значение рН цитоплазматической среды, которое равно приблизительно 7,3. Это различие в рН поддерживается посредством АТФ-зависимого протонного насоса, присутствующего на эндосомальной мембране, которая выталкивает ионы Н из цитозоля в цитоплазма-тическое тельце. Кислотное значение рН промотирует активность лизосомальных нуклеаз, которые являются ферментами, ответственными за деградацию нуклеиновых кислот гидролизом фосфодиэфирных связей между нуклеотидными субъединицами.
Полимеры с буферной способностью ингибируют активность лизосомальных нуклеаз и в то же время изменяют осмолярность цитоплазматических телец.
Фактически, хотя полимеры секвестрируют ионы Н , другие ионы Н требуются цитозолю, в то время как ионы Cl- должны поддерживать электрическую нейтральность цитоплазматического тельца. Однако, потребность в ионах Н и Cl- приводит к увеличению концентрации ионов внутри цитоплазма-тического тельца с последующим увеличением осмолярности цитоплазматического тельца относительно цитозоля. Увеличению осмолярности требуется вода из цитозоля. В результате цитоплазматическое тельце набухает до тех пор, пока оно не разорвется, высвобождая при этом комплекс полимер-нуклеиновая кислота в цитоплазму.
Этот механизм, известный как "механизм протонной губки", был описан, среди прочего, в публикации J-P. Behr "The proton sponge: a trick to enter cells the viruses did not exploit" (Chimia, 1997, 51, 34-36) в отношении к полиэтилениминовым полимерам (PEI) и более широко описан в публикации Н. Eliyahu et al. "Polymers for DNA delivery" (Molecules, 2005, 10, 34-64).
Полиэтиленимины (PEI) являются линейными или разветвленными катионными полимерами, характеризующимися высокой эффективностью высвобождения олигонуклеотидов и плазмид в клетки, in vitro, как описано, например, в публикации О. Boussif et al. "A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, 72977301) и в международной патентной заявке WO 02/100435. PEI описываются как полимеры с высокой плотностью заряда, которая защищают нуклеиновые кислоты от деградации нуклеазами. Считается, что высокая буферная способность PEI защищает нуклеиновую кислоту от деградации в цитоплазматических тельцах во время фазы включения клетками индуцированием осмотического набухания (механизм "протонной губки") цитоплазматического тельца, что делает возможным высвобождение комплекса вектор
нуклеиновая кислота в цитоплазму.
Другим полимером, который был широко изучен в качестве агента трансфекции, является поли(Ь-лизин) (PLL), который был описан, например, в международной патентной заявке WO 03/063827 и который характеризуется первичными аминогруппами, которые ионизируются при физиологическом значении рН и которые взаимодействуют с фосфатными группами нуклеиновых кислот, которые являются отрицательно заряженными. Однако, токсичность и эффективность трансфекции PLL прямо пропорциональны его молекулярной массе: когда молекулярная масса полимера увеличивается, наблюдается увеличенная эффективность трансфекции, с одной стороны, и увеличенная цитотоксичность, с другой стороны. Кроме того, основная цепь PLL слабо деградирует в физиологических условиях, и ее накопление может привести в конце концов к токсичным последствиям.
Что касается большинства катионных полимеров, комплексы PLL с нуклеиновыми кислотами также имеют физико-химические недостатки. Например, способы получения предоставляют небольшую возможность для регулирования размера, и это может привести к присутствию крупных частиц с ограниченной диффузионной способностью и/или возможностью осаждения на этапе изготовления или введения. Кроме того, оказывается, что кислотно-основные характеристики PLL не обеспечивают возможность достижение высокой эффективности трансфекции, вероятно вследствие ограниченной возможности высвобождения нуклеиновой кислоты в цитоплазматическую среду.
Другие катионные полимеры, как природные, так и синтетические, были описаны в предшествующем уровне техники в качестве агентов для трансфекции нуклеиновых кислот.
Например, в международной патентной заявке WO 03/078576 описывается хитозан в качестве агента трансфекции для нуклеиновых кислот.
Хитозан является природным линейным полимером, состоящим из звеньев D-глюкозамина и N-ацетил^-глюкозамина, произвольно распределенных в полимере, связанных посредством р-1,4-связей и содержащих аминогруппу с pKa приблизительно 6,5.
Для применения в качестве агентов трансфекции для нуклеиновых кислот были проведены также обширные исследования дендримеров, содержащих положительно ионизируемые группы, например структуры поли(амидоамина) (РАМАМ), макромолекул линейной структуры; метакриловых полимеров (таких как ^^диметиламиноэтилметакрилат, DMAEMA), поли(этиленимин) (PEI) и производные этих полимеров с солюбилизирующими, функциональными или направляющими группами, например, полимерных структур, содержащих поли(этиленгликоль) (ПЭГ).
Линейные поли(амидоамины) (РАМАМ), описанные, например, в международной патентной заявке WO 97/25067, являются водорастворимыми полимерами, которые позволяют получать растворимые и/или диспергируемые комплексы. Величину pKa катионных групп этих полимеров предпочтительно следует сохранять между 7 и 8, поскольку известно, что более низкие
величины pKa приводят к снижению их способности загружаться нуклеиновыми кислотами. Кроме того, высвобождение комплексов, образованных из дендримеров на основе РАМАМ и нуклеиновых кислот, цитоплазматическими тельцами, включает в себя эффект "протонной губки". В частности, C.L. Waite et al. в публикации "Acetylation of РАМАМ dendrimers for cellular delivery of siRNA" (BMC Biotechnology, 2009, 9:38) описывают, что частичное ацетилирование остатков первичных аминов снижает как буферную способность дендримеров на основе РАМАМ, так и высвобождение siPHK.
Катионные полимеры были разработаны также для других применений, отличных от применений в качестве агентов трансфекции для нуклеиновых кислот.
Например, в параграфе 2.2 статьи Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 183-199) описывается, как катионизировали гликоген включением катионного мономера хлорида ^(3-хлор-2-гидрокстропил)триметиламмония в главную цепь полисахарида гликогена. Было обнаружено, что указанный катионный полимер является эффективным в качестве агента флокуляции в суспензиях железной руды.
Известно, что идеальный агент трансфекции должен обеспечивать высокую эффективность транс-фекции без необходимости проведения манипуляции с физиологической мишенью; он не должен быть токсичным при эффективной дозе и должен быть биоразрушаемым, чтобы избежать каких-либо продолжительных побочных действий.
Кроме того, агент трансфекции должен быть полимером, должен образовывать частицы размером меньше микрона (т.е. меньше 10-6 м) и предпочтительно должен образовывать наночастицы, так как известно, что размер может ограничить как диффузионную способность комплекса во внеклеточной среде, так и эффективность эндоцитоза/фагоцитоза в клетках.
Наконец, полимерная структура должна содержать аминогруппы и/или атомы азота, характеризующиеся различными величинами pKa. Фактически, аминогруппы с величинами pKa выше, чем величина физиологического рН, облегчают комплексообразование нуклеиновой кислоты при физиологическом значении рН; аминогруппы с величинами pKa около величины эндосомального рН активируют механизм "протонной губки" и обеспечивают высвобождение комплекса полимер-нуклеиновая кислота в цитоплазму; наконец, четвертичные аммониевые группы обеспечивают комплексообразование и высвобождение из цитоплазматического тельца независимо от величины рН.
Сущность изобретения
Заявитель обратился к разрешению проблемы разработки новых полимеров, которые можно применять как для доставки активных ингредиентов с низкой молекулярной массой, так и в качестве невирусных векторов для нуклеиновых кислот, и которые могут преодолеть недостатки материалов, известных в предшествующем уровне техники.
Неожиданно заявителем теперь было обнаружено, что гликоген можно модифицировать так, чтобы получить новые катионные производные.
Указанные новые катионные производные гликогена преимущественно характеризуются низкой цитотоксичностью.
Заявитель полагает, что это обусловлено главным образом двумя причинами. Во-первых, гликоген является биосовместимый полимером, который представляет собой продукт метаболизма и хранения Сахаров во всех животных организмах, где он непрерывно продуцируется и разрушается. Кроме того, заявитель полагает, что многочисленные разветвления в гликогене создают структуру стабильной сферической конформации, которая способна селективно уменьшать доступ к катионным зарядам: растворимые молекулы могут диффундировать внутрь полимерной структуры и образовывать комплексные соединения посредством катионных центров, тогда как в противоположность этому, взаимодействия с более сложными структурами не будут больше допускаться по стерическим причинам. Эта сферическая конформация может сделать возможным уменьшение токсичности катионных зарядов, которые обычно повреждают клеточные мембраны.
Заявителем было обнаружено, что новые катионные производные гликогена сохраняют характеристики биосовместимости природного полимера, из которого они получены.
Заявителем также обнаружено, что эти новые катионные производные гликогена способны образовывать комплексы с анионными соединениями, которые имеют размеры и молекулярные массы в широком диапазоне.
Указанные комплексы преимущественно имеют нанометровый размер и не проявляют никакую агрегацию, когда они находятся в растворе, даже при высоких концентрациях.
Заявителем обнаружено, что новые катионные производные гликогена могут доставлять анионные соединения к определенным физиологическим мишеням (например, органам, тканям и клеткам).
Заявителем также обнаружено, что катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению способны проникать в клетки.
Следовательно, указанные новые катионные производные гликогена можно применять для доставки анионных соединений в клетки.
Наконец, заявителем обнаружено, что катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению можно применять в качестве стабилизаторов при хранении белков и ферментов и в качестве соадъювантов при получении вакцин.
Новые катионные производные гликогена предпочтительно содержат заместители, имеющие аминогруппы, характеризующиеся величинами pKa, которые отличаются друг от друга, что способствует как комплексообразованию анионных соединений, так и высвобождению комплексов полимер-анионное соединение из цитоплазматического тельца в цитоплазму.
Новые катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют низкую вязкость и, следовательно, их можно применять в фармацевтических композициях для введения в виде инъекций.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к новым катионным полимерам на основе модифицированного гликогена, в частности настоящее изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, которые содержат по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
0R (а),
в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием или азотсодержащую группу, выбранную из NH2-(C1-C6)ал-кила, [N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(C 1-C6)алкила, NH2-{[(CrQ^iciui^^C 1 -C6)алкиламмонио}-C1 -^ал-кила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкилди(C1-C6)алкиламмонио}-(С1-С6)алкила, NH2-[(C1-C6) алкиламино]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(C1-C6)алкиламино}-(C1-C6)алкила, [три(С1-С6) алкиламмонио]-(C1-C6)алкила, азоциклил^-Оалкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (C1-C6)алкилы^ые цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и
n равно целому числу, которое больше или равно 1; и (b)
OR,
(b) ,
в которой R1 выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей группы, выбранной из NH2-(C1-C6)алкила, [N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, KH^^CrC^!-килди(C1-C6)алкиламмонио]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкилди(C1-C6)алкил-аммонио}-(C1-C6)алкила, NH2-[(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6) алкиламино}-(С1-C6)алкила, [три (С1-C6)алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, у которых (С1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидро-ксильными группами;
X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR2, у которой R2 выбран из атома водорода, (С1-C6)алкила и ^[№1-^-^^-кил]^, где p равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-C6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и
m равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из R, R1, X1 и X2 представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно, для каждого из R, R1, X1 и X2, и
при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, полученного реакцией гликогена с хлоридом N-(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония.
Вышеуказанное выражение "при условии, что по меньшей мере один из R, R1, X1 и X2 представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно для каждого из R, R1, X1 и X2", означает, что в случае, когда R представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для R, в случае, когда R1 представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для R1, в случае, когда X1 представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для X1, и в случае, когда X2 представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для X2.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к комплексу гликогена на основе катионного полимера и анионного соединения.
Согласно предпочтительному варианту, указанное анионное соединение является активным ингредиентом. Указанное анионное соединение преимущественно представляет собой нуклеиновую кислоту.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей комплекс гликогена на основе катионного полимера и анионного соединения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению комплекса гликогена на основе катионного полимера и анионного соединения для доставки или трансфекции указанного анионного соединения в определенную фармакологическую мишень, например орган, ткань или клетку.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления, указанное анионное соединение является активным ингредиентом. Указанное анионное соединение преимущественно представляет собой нуклеиновую кислоту.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 -8 представлено восемь гелей агарозы, полученных после электрофореза геля, как описано в примере 5. На всех фиг. 1-8 показано, что высевали маркеры siPHK (*) и ДНК (*), получая при этом соответствующие окрашенные полосы, применяемые для сравнительных целей и проверки функционирования способа электрофореза.
На фиг. 1 представлен гель агарозы, на котором высевали комплексы, полученные из полимера 3 согласно изобретению и siPHK, при различных концентрациях (от 0,5 до 8 мас.%). Полимер 3, не содержащий нуклеиновую кислоту (0%), применяли в качестве сравнительного образца для проверки того, что катионный полимер согласно данному изобретению не мешает обнаружению пятна, относящегося к siPHK.
На фиг. 2 представлен гель агарозы, на котором высевали комплексы, полученные из полимера 3 согласно изобретению и siPHK, при концентрациях от 10 до 20 мас.%; полимер 3, не содержащий нуклеиновую кислоту (0%), в качестве сравнительного образца с целью проверки того, что катионный полимер согласно данному изобретению не мешает обнаружения пятна, относящегося к siPHK; и полимер 50 (немодифицированный гликоген полглумит(tm)) в качестве сравнительного образца для проверки того, что гликоген, не модифицированный согласно настоящему изобретению, не способен образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами.
На фиг. 3 представлен гель агарозы, на котором высевали комплексы, полученные из полимера 3
согласно изобретению и siPHK, при различных концентрациях (от 30 до 800 мас.%).
На фиг. 4 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 1, 2 и 6 согласно изобретению и siPHK, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 5 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 10, 14 и 15 согласно изобретению и siPHK, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 6 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 8, 12 и 16 согласно изобретению и siPHK, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 7 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 21, 24 и 25 согласно изобретению и siPHK, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 8 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 20, 23 и 28 согласно изобретению и siPHK, при концентрациях 5 и 20% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 9 показана кривая титрования для полимеров 2, 3 и 4 согласно изобретению, полученных, как описано в примере 8.
На фиг. 10 показана кривая титрования для полимеров 4 (полимер согласно изобретению) и 18 (сравнительный полимер), полученных, как описано в примере 8.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании и в формуле изобретения, которая представлена ниже, термин "катионный полимер" означает полимер с общим положительным зарядом при физиологическом значении рН.
В настоящем описании и в формуле изобретения, которая представлена ниже, термин "гликоген" означает обычно гомополимер глюкозы, характеризующийся высокой степенью разветвленности, у которого мономеры глюкозы связаны посредством а-(1,4)-связей в линейных цепей, в то время как цепи разветвления обычно привиты посредством а-(1,6)-связей, но без ограничения, каждый мономер глюкозы 7-11, как показано в следующей формуле:
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин "на основе гликогена" применяют для указания того, что полимер содержит структуру гликогена, описанную выше, которая частично модифицирована для получения катионного полимера согласно настоящему изобретению.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин "повторяющееся звено" означает мономер, который присутствует по меньшей мере один раз в катионном полимере согласно настоящему изобретению.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин "(C1-C6)алкил" означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, например, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, втор-пентил, 3-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, втор-гексил или неогексил.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин "азо-циклил" означает 5- или 6-членное ароматическое или алифатическое гетероциклическое кольцо, такое как, например, кольцо пиррола, пирролина, пирролидина, пиридина или пиперидина. Предпочтительно вышеуказанное 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо может содержать по меньшей мере второй гетероатом, выбранный из N, О и S, и представлять собой, например, кольцо диазола, оксазина или тиа-зина. Предпочтительно, указанное гетероциклическое кольцо представляет собой алифатическое кольцо.
Более предпочтительно гетероциклическое кольцо представляет собой кольцо морфолина или пи-пиридина.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин "комплекс" означает продукт, полученный взаимодействием катионного полимера на основе гликогена согласно настоящему изобретению по меньшей мере с одним анионным соединением посредством некова-лентных связываний (например, посредством образования электростатических, ионных или ван-дер-ваальсовых связей, водородных связей и тому подобного).
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлены ниже, термин "ак
тивный ингредиент" содержит природные, полусинтетические или синтетические молекулы, которые после введения способны взаимодействовать с биологической функцией клетки или живого организма и, возможно, модифицировать указанную биологическую функцию. Активные ингредиента, которые являются применимыми согласно настоящему изобретению, являются таким образом молекулами с общим отрицательным зарядом, другими словами, анионными молекулами, которые можно применять для лечения, профилактики или диагностики патологического состояния. Указанные анионные молекулы могут быть органическими или неорганическими. Например, они могут быть органическими анионными молекулами и могут иметь низкую молекулярную массу (например, аминокислоты, сульфамиды или витамины) или высокую молекулярную массу (например, вакцины или глюкозаминогликаны, такие как гепарин).
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин "нуклеиновая кислота" означает нуклеотидные макромолекулы природного или синтетического происхождения, которые являются двухцепочечными или одноцепочечными и которые имеют общий отрицательный заряд. В частности, этот термин включает в себя олигонуклеотиды, РНК (siPHK, dsPHK, ssRNA, shPHK, miPHK, rPHK, hnPHK, mPHK, tPHK, snPHK, пре-mPHK, каталитическую РНК, антисмысловую РНК), ДНК (сДНК, mtfJHK, ssДHK, dsДHK, антисмысловую ДНК, плазмиднную ДНК).
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, выражения "доставка активного ингредиента" и "доставление активного ингредиента" означает перенос активного ингредиента в виде комплекса с катионным полимером согласно настоящему изобретению к конкретной физиологической мишени, например ткани или органу.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термины "трансфекция" и "трансфицирование" означает введение последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, в частности в цитоплазму и/или ядро.
В частности, настоящее изобретение относится к катионному полимеру на основе гликогена, содержащему по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
(а),
в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из NH^Cr^^!-кила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-C6)алкилди(С1-C6)алкиламмонио]-(C1-C6)ал-кила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкилди(С1-C6)алкиламмонио}-(C1-C6)алкила, NH^^Q-Cfs) алкиламино]-(C1-C6)алкила, {[N, N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкиламино}-(C1-C6)алкила, [три (C1-C6)алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, азоциклил-(C1-C6)алкила, у которых (C1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одним или несколькими гидроксиль-ными группами;
п равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь)
*2 (Ь),
в которой R1 выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей группы, выбранной из NH2-(C1-C6)алкила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-C6)ал-килди(С1-C6)алкиламмонио]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкилди(С1-C6)алкил-аммонио}-(С1-C6)алкила, NH2-[(С1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкила, {[N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(С1-C6) алю^ими(tm)}-^^^!!^, [три(С1-C6)алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, у которых (С1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидро-ксильными группами;
X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR2, у которой R2 выбран из атома водорода, (С1-C6)алкила и Н-[NH-(С1-C6)ал-кил]^, где p равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-C6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и
m равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из R, R1, X1 и X2 представляет собой азотсодержащую группу, как указано соответственно для каждого из R, R1, X1 и X2, и
при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, по
лученного реакцией гликогена с хлоридом ^^-хлор^-гидроксшгоопш^триметиламмония, как описано в частности в параграфе 2.2 статьи Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289,
2006, pages 193-199).
Группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, предпочтительно представляют собой атом водорода;
карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [NN-zr^Q-C^-алкиламино] -(C1 -О^алкила, { Р^-ди^ -О^алкиламино] -(С1 -С3)алкилди(С1 -С3)алкиламмонио }-(С1-С3) алкила, {^^-ди^-С^алкиламиноНС^С^алкиламино^С^С^алкила или [три(С1-С3)алкиламмонио]-(C1-C3)алкила, азоциклил-(C1-C3)алкила, у которых (С1-C3)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
Гетероциклическое кольцо, содержащее по меньшей мере один атом N и представленное термином "азоциклил", является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, таким как, например, кольцо пиррола, пирролина, пирролидина, пиридина или пиперидина. Указанное 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо преимущественно содержит по меньшей мере второй гетероатом, выбранный из N, О и S, и представлено, например, кольцом оксадиазола, оксазина и тиазина. Указанное гетероциклическое кольцо предпочтительно является циклоалифатическим. Еще более предпочтительно, указанное гетероциклическое кольцо является кольцом морфолина или пиперидина.
Более предпочтительно, группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из N,N-диметиламиноэтила, ^^диметиламинопропила, N,N-диэтиламиноэтила, [(N,N-диметиламиноэтил) диметиламмонио] этила, [^^-диметиламиноггоопил^иметиламмонио] пропила, [(N,N-диэтиламиноэтил) диэтиламмонио]этила, [триметиламмонио]-2-гидроксипропила, пиперидил-^этила или морфолинил-N-этила.
R1 предпочтительно представляет собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу выбранную из [N,N-ди(С1-C3)-алкиламино]-(C1-C3)алкила, {[N,N-ди(C1-C3)алкил-амино] -(С1 -C3)алкилди(С1 -С3)алкиламмонио } -(С1 -С3)алкила, {[N,N-ди(С1 -С3)алкиламино] -(С1 -С3)алкил-амино}-(С1-С3)алкила, или [три(С1-C3)алкиламмонио]-(С1-C3)алкила, у которых (С1-C3)алкилы^ые цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
Более предпочтительно R1 представляет собой атом водорода или карбоксиметильную группу.
X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -NHR2, в котором R2 представляет собой атом водорода или Н-[NH-(C1-C4)алкил]p-, где p равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С4)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными.
Указанная группа Н-[NH-(C1-C4)алкил]p- предпочтительно представляет собой полиэтиленимин с молекулярной массой от 50 до 3000 Да и более предпочтительно с молекулярной массой от 1000 до 2300 Да, спермин (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2) или спермидин (H2N(CH2)4NH(CH2)4NH2).
Примерами фармацевтически приемлемых органических оснований являются трометамин, лизин, аргинин, глицин, аланин, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, пропиламин, дипропиламин, трипропиламин, этилендиамин, моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтано-ламин, гуанидин, морфолин, пиперидин, пирролидин, пиперазин, 1-бутилпиперидин, 1-этил-2-метил-пиперидин, N-метилпиперазин, 1,4-диметилпиперазин, N-бензилфенэтиламин, N-метилглюкозамин и трис(гидроксиметил)аминометан.
Примерами фармацевтически приемлемых неорганических оснований являются гидроксиды или карбонаты щелочных металлов или щелочноземельных металлов, такие как, например, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, карбонат натрия, карбонат калия и карбонат кальция.
Указанные повторяющиеся звенья (а) и (b) преимущественно расположены произвольно в цепях гликогена.
Примеры повторяющихся звеньев (а) и (b) представлены соответственно в таблицах А и В, приведенных ниже.
Таблица А. Примеры повторяющихся звеньев (а)
Положение заместителя
Заместитель
Повторяющееся звено формулы (а)
г\1,г\1-диэтил-аминоэтил
Hof 1\1,г\1-диметил-аминоэтил
НзС\м/СНз
но-[ <Г^> -о-Л-"
N.N-диметил-аминопропил
сн3
[(г\1,1М-диэтил-аминоэтил)-диэтилам-монио]этил
сн2
HO-rKjZ!^o^H
[(N.N-диметил-аминопропил)-диметилам-монио]пропил
сн3
НзС\1
[(N.N-диметил-аминоэтил)-диметилам-монио]этил
НзС^СНз НзС\С-СНз
сн3
h3g\L
[триметилам-монио]-2-гидроксипро-пил
^он
[триметилам-монио]-2-гидрокси-пропил
н.Д'0"'
сн3
[(г\1,г\1-диметил-аминопропил) диметилам-монио]пропил
сн3
г\1,1\1-диметил-аминопропил
Н3С СН3
[(N.N-диэтил-аминоэтил) диэтилам-монио]этил
2,3
N.N-диэтил-
СН^
аминоэтил
НзС J ^СН3
н3с
^он сн2
г\1,г\1-диметил-
"о-[ <^З^о^-"
аминоэтил
сн3
",с^сн,
N.N-диметил-аминоэтил
N.N-диэтил-аминоэтил
но"\_ \__|/ о-Ц-н
карбоксиметил
натриевая соль карбоксиметила
А"*
сн2
триметилам-монио-2-гидроксипро-пил
сн^
1\1,г\1-диэтил-аминоэтил
[триметилам-
монио]-2-
гидроксипропил
[(1\1,г\1-диэтил-аминоэтил) диэтиламмо-нио]этил
1\1,г\1-диметил-аминопропил
сн3
сХон
карбоксиметил
[(N.N-диметил-аминопропил) диметилам-монио]пропил
натриевая соль карбоксиметила
сн3 Дсн3
НзС\Г
карбоксиметил
[триметилам-монио]пропил
HgC^I ^CHj
сн3
N.N-диэтил-аминоэтил
^-сн3
натриевая соль карбоксиметила
N-этилпиперидил
он n
N-этилморфо-линил
но^КЦ^о^-
он п
Таблица В. Примеры повторяющихся звеньев (Ь)
Положение заместителя
Заместитель
Повторяющееся звено формулы (Ь)
Спермин
/ОН ОН NH
2,3
Спермин
/ОН
сн2
^-NH NH
/ nh V^~/ lm^s^/~N"
Тетраэтилен-пентамин
/ОН
LL-o
ОН NH
HN \ l^H^-NH^
2,3
Тетраэтилен-пентамин
/ОН
сн2
^-NH NH
Карбоксиметил
сн2
ОН NH
Тетраэтилен-пентамин
Карбоксиметил
^•NH NH / NH^/^^ NH^^^-NH
2,3
Спермин
Полиэтилен-имин (мол. масса = 1300 Да)
/ОН
Jp^^ ^NH2
Полиэтилен-имин (мол. масса = 2000 Да)
он(tm)
Полиэтилен-имин
CH2
JP^^ %H2
Карбоксиметил
Полиэтилен-имин
1\1,1\1-диэтил-аминоэтил
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанные повторяющиеся звенья (а) и (b) содержат по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способны ионизироваться при физиологическом значении рН и которая облегчает комплексообразование указанного анионного соединения, и по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая является ионизируемой при значении рН ниже физиологического значения рН и которая облегчает высвобождение комплекса из цитоплазматических телец.
Указанные азотсодержащие группы, которые способны ионизироваться при физиологическом значении рН, предпочтительно присутствуют в числовых процентах от 1 до 30% относительно общего числа
гидроксильных групп в гликогене, применяемом для получения катионных полимеров согласно настоящему изобретению.
Указанные азотсодержащие группы, которые способны ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, предпочтительно присутствуют в числовых процентах от 0,1 до 10% относительно общего числа гидроксильных групп в гликогене, применяемом для получения катионных полимеров согласно настоящему изобретению.
Для целей настоящего изобретения указанными азотсодержащими группами, которые способны ионизироваться при физиологическом значении рН, являются №Н2-(С1-Сб)алкил, [М,М-ди(С1-Об)алкила-мино] -(С1 -Сб)алкил, NH2-[(C1 -Сб)алкиламино] -(С-Сб)алкил, {[N,N^(Q -Сб)алкиламино] -(С1 -Сб)алкила-мино}-(С1-Сб)алкил и азоциклил-(С1-Сб)алкил.
Указанными азотсодержащими группами, которые способны ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, преимущественно являются МН2-{[(С1-С3)алкил]ди(С1-Сб) алкиламмонио } -(С1 -Сб)алкил и {[N,N^(Q -Сб)алкиламино] -(С1 -С3)алкилди(С1 -Сб)алкиламмонио }-(С1 -Сб)алкил.
Новые катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению преимущественно имеют низкую вязкость и, следовательно, их можно применять в фармацевтических композициях для введения в виде инъекций. В частности, новые катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению имеют вязкость менее 10 мПа и предпочтительно менее 5 мПа, измеренную при концентрации 1% в PBS ротационным вискозиметром.
Гликоген, применяемый для получения катионных полимеров согласно настоящему изобретению, можно получать по одному из методов, известных в данной области.
Гликоген предпочтительно получают, как описано в международной патентной заявке WO 94/03502.
Указанный гликоген предпочтительно получают из видов Mytilus edulis и Mytilus galloprovincialis.
Другие источники гликогена, которые можно применять для целей настоящего изобретения, включают в себя моллюски, такие как устрицы и Grepidula fornicata, и богатые гликогеном органы позвоночных животных, такие как печень и мышцы.
Указанный гликоген, по существу, предпочтительно не содержит азотсодержащие соединения и редуцирующие сахара. Применяемое в настоящем описании и в формуле изобретения, представленной ниже, выражение "по существу не содержит азотсодержащие соединения и редуцирующие сахара", означает, что содержание азота составляет менее 60 частей на миллион, измеренное при помощи метода Кьель-даля, и содержание редуцирующих сахаров составляет меньше 0,25%, измеренное при помощи метода F.D. Snell and Snell ("СоюпшеМс Methods of Analysis", New York, 1954, vol. III, p. 204).
Гликоген, применяемый согласно настоящему изобретению, предпочтительно характеризуется также содержанием углерода от приблизительно 44% до приблизительно 45%, молекулярной массой приблизительно (2,5+0,1)х10б дальтон и вращением плоскости поляризации света (a)D20 197±2,0 (с=1, в воде).
Более предпочтительно гликоген, применяемый согласно настоящему изобретению, является гликогеном полглумит(tm), изготовленным Aziende СЫпи^ Riunite Angelini Francesco A.CR.A.F.S.p.A.
Специалист в данной области техники легко поймет, что настоящее изобретение по существу не относится к новым классам соединений с терапевтической эффективностью. Вернее, настоящее изобретение относится к применению катионного полимера на основе гликогена, описываемого ранее, для получения комплекса по меньшей мере с одним анионным соединением.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к комплексу катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения, в котором указанный катионный полимер на основе гликогена содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев (а) и (b), описанных ранее.
Указанное анионное соединение предпочтительно является органическим или неорганическим соединением с низкой молекулярной массой или высокой молекулярной массой.
Более предпочтительно, указанное анионное соединение представляет собой активный ингредиент, относящийся, например, к одному из следующих классов активных ингредиентов: противоинфекцион-ных агентов, например, антибиотиков и противовирусных средств; аналгетических средств; средств, снижающих аппетит; антигельминтных средств; противоастматических средств; противосудорожных средств; антидепрессантов; противодиабетических средств; антидиаррейных средств; антигистаминных средств; противовоспалительных средств; средств против мигрени; противорвотных агентов; противоопухолевых средств; средств против болезни Паркинсона; противозудных агентов; антипсихотических агентов; жаропонижающих средств; смазмолитических средств; антихолинергических средств; симпато-миметиков; производных ксантина; лекарственных средств для сердечнососудистой системы, например блокаторов калиевых, кальциевых каналов, бета-блокаторов, альфа-блокаторов и антиаритмических средств; гипотензивных средств; диуретиков и антидиуретиков; вазодилаторов центрального и периферического действия; стимуляторов центральной нервной системы; сосудосуживающих средств; противо
кашлевых средств; противоотечных средств; гормонов; снотворных средств; иммунодепрессантов; мио-релаксантов; парасимпатолитиков; психостимуляторов; седативных средств; транквилизаторов.
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанное анионное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.
Указанную нуклеиновую кислоту предпочтительно выбирают из олигонуклеотидов, РНК (siPHK, dsPHK, ssPHK, shRNA, miPHK, rPHK, hnPHK, mPHK, tPHK, snPHK, пре-mPHK, каталитической РНК, антисмысловой РНК) и ДНК (сДНК, mtДHK, ssДHK, dsДHK, антисмысловой ДНК, плазмидной ДНК).
Заявителем было обнаружено, что указанный комплекс способен образовывать нанометровые частицы со средним диаметром (Z) между 1 и 200 нм, предпочтительно между 20 и 100 нм и более предпочтительно между 30 и 50 нм.
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве от 5 до 60 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
Указанный комплекс предпочтительно содержит указанное анионное соединение в количестве от 10 до 50 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
Указанный комплекс более предпочтительно содержит указанное анионное соединение в количестве от 10 до 30 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
Комплекс катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения можно преимущественно получить в виде фармацевтической композиции.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей комплекс катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, причем указанный катионный полимер на основе гликогена содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев (а) и (б), описанных ранее.
В одном предпочтительном варианте осуществления указанное анионное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.
Термин "эксципиент" означает любой агент, известный в данной области техники, который является подходящим для получения фармацевтической формы.
Примерами эксципиентов, которые являются пригодными согласно настоящему изобретению, являются консерванты, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, соли, регулирующие осмотическое давление, эмульгаторы, подсластители, корригенты, красители и тому подобное.
Указанную фармацевтическую композицию можно получить в виде дозированной лекарственной формы согласно способам, известным в данной области.
Указанная фармацевтическая композиция предпочтительно предназначена для инъекционного применения, например, в форме водного раствора, суспензии или эмульсии, или она может быть в форме порошка, который пересоздают с целью приготовления водного раствора, суспензии или эмульсии для внутривенного, внутримышечного, подкожного, чрескожного или внутрибрюшинного введение.
Альтернативно, указанная фармацевтическая композиция может быть, например, в форме таблеток, капсул, таблеток, покрытых оболочкой, гранул, растворов и сиропов для перорального введения; содержащих лекарственное средство пластырей, растворов, паст, кремов или помады для чрескожного введения; суппозиториев для ректального введения; стерильного раствора для аэрозольного введения; для немедленного и пролонгированного высвобождения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению комплекса катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения, для доставки или переноса указанного анионного соединения к определенной фармакологической мишени, например органу, ткани или клетке, причем указанный катионный полимер на основе гликогена содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев (а) и (б), описанных ранее.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, указанное анионное соединение является активным ингредиентом. Указанное анионное соединение преимущественно представляет собой нуклеиновую кислоту. Указанной фармакологической мишенью преимущественно является клетка.
В предпочтительном варианте осуществления катионный полимер на основе гликогена согласно настоящему изобретению может быть конъюгирован, непосредственно или посредством спейсера, с направляющей группы, которая способна связываться очень специфическим образом с мишенью, присутствующей на поверхности клетки и облегчить поглощение комплекса определенной клеткой (например, опухолевыми клетками, клетками печени, кроветворными клетками и тому подобными клетками).
Направляющую группу можно также применять для направления катионного полимера к компар-тменту клетки (например, ядру, митохондрию и тому подобному компартменту).
Направляющие группы можно выбрать, например, из фолиевой кислоты, моносахаридов, олигоса-харидов, пептидов, белков и олигомеров гиалуроновой кислоты.
Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, однако, без ограничения его никоим образом.
Примеры
Пример 1. Получение катионных полимеров на основе гликогена, содержащих звено (а).
(i) Синтез катионных полимеров на основе гликогена, содержащих азотсодержащие группы 10 г гликогена полглумит(tm) (61,73 ммоль глюкозы) растворяли в 124 мл 1 н NaOH (для синтеза продуктов 17, 9-11 и 13-15) или 2н. NaOH (для синтеза продуктов 8, 12 и 16) в двугорлой круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником. После того, как растворение было завершено, смесь нагревали до 70°С и перемешивали в течение 2 ч.
В зависимости от желаемого продукта, добавляли один из следующих реагентов от (I) до (VI) в количествах (выраженных как ммоль реагента), представленных в табл. 1:
(i) гидрохлорид 2-хлор^ДЧ-диэтилэтиленамина;
(ii) гидрохлорид 3-хлор^ДЧ-диметилпропиламина;
(iii) гидрохлорид 2-хлор^ДЧ-диметилэтиламина;
(iv) раствор 60 масс.% хлорида 3-хлор-2-гидроксипропилтриметиламмония в H2O;
(v) 1-(2-хлорэтил)пиперидин и
(vi) 4-(2-хлорэтил)морфолин.
Смесь перемешивали при 70°С в течение ночи.
На следующий день нагревание прекращали и смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры. Неочищенный продукт реакции затем медленно выливали в 400 мл ацетона. После того, как добавление было закончено, полученную суспензию перемешивали в течение приблизительно 30 мин. После прекращения перемешивания смесь оставляли для осаждения до тех пор, пока не достигалось разделение супернатанта и осадка.
Супернатант выгружали и полученный осадок дважды промывали ацетоном (200 мл). Полученное таким образом твердое вещество отфильтровывали, растворяли в 200 мл дистиллированной воды, регулировали рН до нейтрального значения 1н. раствором HCl и, наконец, подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величина 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
Выходы продуктов синтеза приводятся ниже в табл.1.
Таблица 1
Класс
полимера
Реагент
Ммоль реагента
Выход в % (масс./масс.)
Диэтиламиноэтил-(DEAE)гликоген
(i)
2, 65
(i)
15, 43
(i)
30, 87
(i)
61, 73
Диметиламинопропил-(DMAP)гликоген
(ii)
15, 43
(ii)
30, 87
(ii)
61, 73
(ii)
123,46
Диметиламиноэтил-(DMAE)гликоген
(iii)
15, 43
(iii)
30, 87
(iii)
61, 73
(iii)
123,46
2-Гидроксипропил-триметиламмоний (2-ОН-РТМА)-гликоген
(iv)
15, 43
(iv)
30, 87
(iv)
61, 73
(iv)
123,46
Гетероциклическое производное гликогена
(v)
30, 87
(vi)
30, 87
Посредством описанного метода были получены катионные полимеры 1-16 и 40-41, имеющие структуры, показанные ниже в табл. 2.
В представленных структурах аббревиатура "Glu" означает, что полимерная цепь может продолжаться повторяющимися звеньями немодифицированной глюкозы или повторяющимися звеньями со
гласно настоящему изобретению. Кроме того, для облегчения визуализации не представлены разветвления и заместители представлены только в положении 6 и на разных повторяющихся звеньях.
Специалист в данной области техники легко поймет, что тоже самое повторяющееся звено может содержать от одного до трех заместителей, которые могут быть одинаковыми или разными, и что эти заместители могут независимо присутствовать в положениях 2, 3 и/или 6.
Таблица 2
(ii) Синтез катионных полимеров на основе гликогена, содержащих азотсодержащие группы и кар-боксиметильные группы.
Гликоген полглумит(tm), содержащий по меньшей мере одну карбоксиметильную группу (гликоген-
СМ), синтезировали, как описано ниже.
9,57 г (59,07 ммоль глюкозы) безводного гликогена полглумит(tm), высушенного заранее в сушильном шкафу при 60°С в вакууме до постоянной массы, помещали в двугорлую круглодонную колбу, которая снабжена магнитной мешалкой и через которую пропускали поток азота, и растворяли в 200 мл безводного диметилсульфоксида. После того как растворение было завершено, добавляли гидрид натрия в количествах, указанных в табл.3, и смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее добавляли хлорацетат натрия в количествах, приведенных в табл.3, и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре.
На следующий день смесь медленно выливали в ацетон (800 мл) и полученную суспензию перемешивают в течение приблизительно 30 мин. Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (400 мл), снова отфильтровывали и растворяли в дистиллированной воде (200 мл). Полученный раствор подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величина 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
Степень превращения в производные (дериватизации) (DD), означающая число молекул глюкозы, превращенных в производное карбоксиметильной группой на 100 мономеров глюкозы, определяли способом ИК-спектроскопии, путем построения калибровочной кривой смесей, содержащих известный титр гликогена полглумит(tm) и ацетата натрия.
Полученный таким образом гликоген-МС применяли в последующих синтезах для получения кати-онных полимеров, содержащих азотсодержащие группы.
В частности, были синтезированы гликогены-СМ, содержащие диэтиламиноэтильные (DEAE-гликоген-СМ) и 2-гидроксипропилтриметиламмониевые (2-ОН-РТМА-гликоген-СМ) группы.
DEAE-гликоген-СМ
1 г продукта 103 растворяли в 10,8 мл 1 н NaOH в двугорлой круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, и нагревали при 70°С в течение 2 ч.
Добавляли 0,929 г гидрохлорида 2-хлор^^-диэтилэтиламина (5,4 ммоль) и смесь перемешивали в течение ночи при 70°С.
На следующий день нагревание прекращали и смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры. Неочищенный продукт реакции затем медленно выливали в 100 мл ацетона. В конце добавления полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин.
Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (100 мл), растворяли в 50 мл дистиллированной воды, рН регулировали до 6,5-7 при помощи 1 н хлористо-водородной кислоты и, наконец, подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
2-ОН-РТМА-гликоген-СМ
2,5 г продукта 103 растворяли в 27 мл 1н. NaOH в двугорлой круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, и нагревали при 70°С в течение 2 ч.
Затем добавляли раствор хлорида 3-хлор-2-гидроксипропилметиламмония (60 мас.% раствор в Н2О, 8,1 ммоль) и смесь перемешивали при 70°С в течение ночи.
На следующий день нагревание прекращали и смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры. Неочищенный продукт реакции затем медленно выливали в 80 мл ацетона.
Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (80 мл), растворяли в 50 мл дистиллированной воды и подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
Катионные полимеры 17 и 19, полученные с помощью описанных способов, указаны ниже в табл. 4. Для облегчения визуализации не показаны разветвления и заместители показаны только в положе
нии 6 и на разных повторяющихся звеньях. В показанных структурах аббревиатура "Glu" означает, что полимерная цепь может продолжаться повторяющимися звеньями немодифицированной глюкозы или повторяющимися звеньями согласно настоящему изобретению.
Специалист в данной области техники легко поймет, что одно и то же повторяющееся звено может содержать от одного до трех заместителей, которые могут быть одинаковыми или разными, и что эти заместители могут независимо присутствовать в положениях 2, 3 и/или 6 одного и того же повторяющегося звена.
Пример 2. Получение катионных полимеров на основе гликогена, содержащих звено (b).
Гликоген полглумит(tm) окисляли периодатом калия согласно следующему методу.
20 г гликогена полглумит(tm) (123,46 ммоль глюкозы) растворяли в 400 мл дистиллированной воды в темной стеклянной колбе. Добавляли периодат калия в количествах, приведенных в таблице 5 (указаны в ммоль реагента) и смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре.
Реакцию останавливали добавлением избытка этиленгликоля (26 мл) с продолжением перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре.
Смесь подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Затем смесь фильтровали через фильтр 0,45 мкм и сушили вымораживанием.
Затем степень окисления (% окисленных мономеров глюкозы) определяли титрованием 0,1 н NaOH хлористоводородной кислоты, выделяемой в результате реакции между гидрохлоридом гидроксиламина и свободными альдегидными группами, присутствующими на различных углеводах. Реакция приводится ниже:
Гликоген- (CH=0) z+z •Н2М-ОН*НС1=гликоген- (CH=N-OH) z+z ¦ H20+z *НС1. Процент окисленных мономеров определяли посредством следующей формулы:
DD = VxNx0,5xl00
W/162
в которой
V = мл NaOH;
N = нормальность NaOH;
W = мг безводного образца;
162 = молекулярная масса повторяющегося звена глюкозы.
Окисленный гликоген полглумит(tm), полученный таким образом, подвергали взаимодействию с одним из указанных ниже реагентов (VII)-(X), применяемых в количествах, (указаны в ммоль реагента), приведенных в табл. 6.
(VII) Спермин (Fluka, ссылка № 85590);
(VIII) тетраэтиленпентамин (Fluka, ссылка № 15652843);
(VII)
(IX) раствор полиэтиленимина с мол. массой 1300 при концентрации его 50 масс.% в воде (Aldrich, ссылка 482595);
(X) раствор полиэтиленимина с мол. массой 2000 при концентрации его 50 мас.% в воде (Aldrich, 408700).
Производные синтезировали согласно следующему общему методу.
2 г окисленного гликогена полглумит(tm) растворяли в 200 мл боратного буфера при рН 8,5 в трех-горлой круглодонной колбе, снабженной механической мешалкой (модель IKA Labortechnik). Амин растворяли в 40 мл боратного буфера, медленно добавляли в реакционную колбу и смесь перемешивали механически при комнатной температуре.
Спустя 4 ч добавляли борогидрид натрия (473 мг; 12,5 ммоль) и смесь перемешивали механически в течение ночи при комнатной температуре.
На следующий день неочищенный продукт реакции медленно выливали в 400 мл ацетона и полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин. Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (400 мл), снова отфильтровывали и растворяли в дистиллированной воде (100 мл). Раствор нейтрализовали 1н. HCl и подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм и, наконец, сушили вымораживанием.
Таблица 6
Исходный окисленный гликоген
Реагент
Ммоль реагента
Выход в % (масс./масс. )
200
VII
0, 60
200
0, 48
200
0, 31
201
VII
0, 60
201
VIII
0, 41
201
VIII
0, 83
201
0, 48
201
0, 31
202
VII
1,20
202
0, 48
202
0, 96
Катионные полимеры 20-30, полученные с помощью описанных методов, показаны ниже в таблице 7. В показанных структурах, аббревиатура "Glu" означает, что полимерная цепь может продолжаться повторяющимися звеньями немодифицированной глюкозы или повторяющимися звеньями согласно настоящему изобретению. Для облегчения визуализации разветвления не показаны и заместители показаны на различных повторяющихся звеньях.
Таблица 7
Пример 3. Определение степени превращения в производные (дериватизации) (DD) катионных полимеров, содержащих повторяющиеся звенья типа (а).
Степень дериватизации относительно числа азотсодержащих групп, присутствующих в полимерах, содержащих повторяющиеся звенья (а), вычисляли превращением аминогрупп в соответствующие гидрохлориды и определением количества ионов галогена, присутствующих либо на аминогруппах, либо на четвертичных аммониевых группах.
Такую же процедуру применяли для гидрохлорида DEAE-декстрана (коммерческий продукт гидрохлорид DEAE-декстрана, Sigma, ссылка № D9885), используемого в качестве сравнительного продукта.
Количество ионов галогена определяли на массу сухого полимера, полученную путем вычитания содержания воды, определенного посредством метода Карла Фишера.
1 г производного амина растворяли в 10 мл дистиллированной воды. После завершения растворения добавляли 10 мл 1н. хлористо-водородной кислоты и смесь перемешивали в течение 30 мин. После того, как перемешивание было завершено, смесь выливали в ацетон (100 мл). Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (100 мл) и сушили в сушильном шкафу при 60°С в вакууме.
Количество ионов галогена выражали в массовых процентах, то есть как массу ионов галогена на 100 г катионного полимера.
Для целей определения считали, что каждый атом азота является независимо замещенным. Степень образования производных (дериватизации) вычисляли по уравнению, приведенному ниже. \н.I.(масса гидратироеанного образца)*100*М\А/(гидрохлорид мономера)
100 - %НгО
ДД = степень дериватизации;
H.I. = граммы ионов галогена на 100 г гидратированного образца;
MW = молекулярная масса мономера, замещенного одной группой гидрохлорида алкиламина;
35,45 = молекулярная масса хлора.
Полученные результаты представлены ниже в табл. 8.
Таблица 8
№ полимера
18 (*)
(*) Сравнительный полимер: DEAE-декстран.
Влияние степени дериватизации и функциональной группы изучали как функцию двух рабочих параметров, (i) тенденции к агрегации, которая должна быть минимизирована; и (ii) емкости заряда, которая должна быть максимизирована.
Пример 4. Измерение динамического рассеяния света (DLS).
Исследования динамического рассеяния света применяли для изучения тенденции к агрегации катионных полимеров.
Исследования динамического рассеяния света проводили, как указано ниже, на катионных полимерах на основе гликогена полглумит(tm), полученных, как описано в примере 1, и на соответствующих комплексах с siPHK (Invitrogen, ссылка поставщика № 1299001), полученных при различных массовых процентных отношениях siPHK/полимер.
Для изучений рассеяния света получали следующие растворы:
раствор 1: исходный раствор 0,1 мг/мл siPHK в ЗФР, не содержащем рибонуклеазу;
раствор 2: исходные растворы различных катионных полимеров при концентрации 0,2 мг/мл в ЗФР без рибонуклеазы, отфильтрованные через стерильные фильтры 0,22 мкм;
раствор 3: раствор ЗФР без рибонуклеазы, отфильтрованный через стерильный фильтр 0,22 мкм.
Аббревиатура ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) означает стандартный, за-буференный фосфатом физиологический раствор с рН 7,4, содержащий водный физиологический раствор 8 г/л хлорида натрия, 1,78 г/л фосфата натрия, 0,2 г/л хлорида калия и 0,27 г/л фосфата калия.
Образцы, которые анализировали, получали смешиванием растворов 1, 2 и 3 согласно отношениям, приведенным в табл. 9. Затем образцы дважды обрабатывали в течение 30 с перемешиванием и выдерживали в течение 30 мин. После последующей обработки перемешиванием в течение 30 с и выдерживанием в течение 1 ч, образцы анализировали DLS Zetasizer Nano Malvern, не забывая о том, что раствор необходимо обрабатывать перемешиванием 5 мин перед анализом.
Измерения проводили с помощью гелий-неонового лазера (^=632,8 нм) при 25°С и угле рассеяния 173°. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения Zetasizer.
Исследование делает возможным определение следующих параметров:
1) среднего диаметра (Z) катионных производных гликогена полглумит(tm), не содержащих siPHK (результаты приводятся в табл. 10);
2) отношения размеров наночастиц (результаты приводятся в таблице 10) и
3) максимального отношения в массовых процентах siPHK и полимера, для которого не наблюдали эффект агрегации (результаты приводятся в таблице 10).
1)
(1) Средний диаметр (Z).
Как можно видеть на таблице 10, все производные имеют средний диаметр (Z) меньше 100 нм. В отличие от DEAE-декстрана, катионные производные согласно изобретению преимущественно образуют наночастицы со средним диаметром (Z) меньше 70 нм.
(2) Отношение размеров.
Отношением размеров является ширина при средней высоте пика распределения размеров частиц, нормализованной средним диаметром, и таким образом это отношение описывает форму пика распределения размеров частиц.
Как можно видеть на таблице, все катионные полимеры согласно изобретению имеют распределение размеров с отношением размеров от 0,8 до 1,1, в отличие от DEAE-декстрана, который показал распределение размеров с отношением размеров, равным 4,5.
Это указывает на то, что с применение того же способа синтеза катионные полимеры на основе гликогена согласно настоящему изобретению можно получать в виде наночастиц регулируемых размеров с диапазоном размеров, близким к среднему значению.
(3) Максимальное массовое процентное отношение siPHK/полимер, для которого не наблюдается агрегация
Результаты показали, что катионные полимеры, содержащие все заместители согласно настоящему изобретению, образовывали комплексы без агрегирования частиц вплоть до 50 мас.% siPHK как функцию степени дериватизации.
Полимер 18 (DEAE-декстрана) образовывал комплексы без агрегирования частиц только вплоть до 20 мас.% siPHK.
Пример 5. Определение емкости заряда.
Емкость заряда определяли для ряда производных, содержащих повторяющиеся звенья (а) и (b), с помощью гель-электрофореза.
Комплексы получали согласно следующему способу.
Комплексы siPHK и различных полимерных производных получали с применение различных отношений siPHK/полимер (мас.%).
Растворы полимеров при различных концентрациях, описанных в таблицах 11 и 12, смешивали в ЗФР без РНазы, фильтровали через фильтр 0,2 мкм с раствором в воде siPHK (Invitrogen, ссылка № 1299001) с концентрацией 0,340 мг/мл без РНазы. Далее смеси обрабатывали перемешиванием в течение приблизительно 30 с, выдерживали в течение 15 мин при комнатной температуре, обрабатывали снова перемешиванием в течение 30 с и после выдерживания в течение приблизительно 30 мин подвергали гель-электрофорезу.
Гели проявляли загрузкой 10 мкл раствора каждого комплекса на 4% гель агарозы, содержащий краситель Green Gel Plus(tm) Nucleic Acid Stain 20000X, приготовленный в буфере MOPS-EDTA-ацетат натрия при отношении 1:200000.
Гели агарозы проявляли в течение одного часа при постоянном напряжении 80 В. Изображения получали с помощью системы ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
Полученные гели показаны на фиг. 1-8.
Комплексы полимера 3 (DEAE-гликогена) и siPHK получали с применением растворов полимеров и siPHK в количествах, приведенных ниже в таблице 11. Полимер 3 загружали siPHK в количестве от 0,5 масс.% до 800 масс.% siPHK.
Гели, на которые засевали комплексы полимера 3 и siPHK и которые затем проявляли электрофорезом, показаны на фигурах, перечисленных в табл. 11.
2,5
0,1
1,25
0, 1
0,1
0, 66
0, 1
0,5
0, 1
0, 333
0,1
0,2
0, 1
0,1
0,1
100
0, 05
0, 1
200
0, 025
0,1
400
0,0125
0,1
800
На фиг. 1 можно увидеть, что в колонках полимера 3 в комплексе с siPHK при процентном содержании ее от 0,5 до 8 мас.% отсутствует белая полоса, соответствующая только siPHK. Отсутствие полосы указывало на то, что полимер 3 был способен полностью образовывать комплекс с siPHK в количестве от 0,5 до 8 мас.% относительно массы полимера.
На фиг. 2 отсутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках полимера 3 в комплексе с siPHK, указывало на то, что полимер 3 был способен полностью образовывать комплекс с siPHK при процентном содержании ее от 10 до 20 мас.% относительно массы полимера. Присутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках полимера 50 (немодифицированный гликоген полглумит(tm)) указывало на то, что немодифицированный гликоген полглумит(tm) был не способен образовывать комплекс с siPHK даже при проценте, равном 10 мас.% относительно массы полимера.
На фиг. 3 отсутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках полимера 3 в комплексе с 30% siPHK, указывало на то, что полимер 3 был способен полностью образовывать комплекс с 30 мас.% siPHK относительно общей массы полимера. В противоположность этому, присутствие полосы, соответствующей содержанию siPHK от 50 до 800%, указывало на то, что полимер 3 был неспособен образовывать комплекс с 50 мас.% siPHK относительно общей массы полимера.
Эти исследования таким образом показали, что, максимальная емкость заряда полимера 3 была 30 мас.% siPHK. В противоположность этому, немодифицированный гликоген полглумит(tm) (полимер 50) был неспособен образовывать комплекс с siPHK.
Кроме того, комплексы полимер-siPHK были получены с применением следующих полимеров:
№ 1, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, содержащих повторяющееся звено (а);
№ 20, 21, 23, 24, 25, 28, содержащих повторяющееся звено (b).
Применяли две загрузки siPHK в процентах: 5 и 20% относительно массы полимера. Применяемые растворы указываются ниже в табл. 12.
На фиг. 4 присутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках комплекса полимера 1 соответственно с 5 и 20 мас.% siPHK, указывало на то, что полимер 1 (DEAE-полглумит с низкой степенью дериватизации) был неспособен образовывать комплекс с siPHK. Полимер 2 был способен образовывать комплексы с 5 масс.% siPHK относительно общей массы полимера и полимер 6 был также способен образовывать комплекс с 20 мас.% siPHK относительно общей массы полимера.
На фиг. 5 присутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках полимеров 10 и 14 в комплексах с 20 мас.% siPHK, указывало на то, что эти полимеры были способны образовывать комплексы с 5 мас.% siPHK. В противоположность этому, полимер 15 был способен образовывать комплексы с 20 мас.%
siPHK.
На фиг. 6 отсутствие полосы, соответствующей siPHK, указывало на то, что полимеры 8, 12 и 16 были способны образовывать комплексы с 20 мас.% siPHK.
На фиг. 7 присутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках полимеров 24 и 25, указывало на то, что эти полимеры были неспособны образовывать комплексы с 5% siPHK. В противоположность этому, полимер 21 также образовывал комплекс с 20% siPHK.
На фиг. 8 присутствие полосы, соответствующей siPHK в колонках полимеров 23 и 20 в комплексах с 20% siPHK, указывало на то, что эти полимеры образовывали комплексы с 5% siPHK. В противоположность этому, полимер 28 образовывал комплекс с 20% siPHK.
Таким образом, в общем исследования позволили показать, что только полимеры 1 (DEAE-гликоген с наименьшей степенью дериватизации), 24 и 25 были способны образовывать комплексы с менее чем 5
мас.% siPHK.
Все другие производные были способны образовывать комплексы с 20% siPHK, подобно сравнительному полимеру 18 (DEAE-декстрану). В противоположность этому, полимер 50 (немодифицированный гликоген полглумит(tm)) был неспособен образовывать комплексы с siPHK.
Пример 6. Исследования цитотоксичности катионных производных гликогена полглумит(tm).
Исследования токсичности проводили на (DEAE)-гликогене (полимеры 1-4), (DMAP)-гликогене (полимеры 5-8), (DMAE)-гликогене (полимеры 9-12), (2-ОН-РТМА)-гликогене (полимеры 13-16), на не-модифицированном гликогене полглумите(tm) (полимер 50), на гидрохлориде DEAE-декстрана (полимер 18) и на другом эталонном полимере, которые были широко исследованы для доставки нуклеиновых кислот, разветвленном полиэтиленимине (PEI) (Aldrich, ссылка № 40872-7) (полимер 60).
(а) Исследования катионных полимеров согласно изобретению.
Получение катионных полимеров.
Катионные полимеры растворяли в воде и соответствующим образом разводили в среде для культивирования клеток для получения конечных концентраций от 10 до 10-5 мг/мл и применяли для оценки цитотоксичности спустя 24, 48 и 72 ч для двух клеточных линий: MonoMac-6 и НТ2 9.
Клеточная линия MonoMac-6.
Клеточная линия моноцитов/макрофагов человека MonoMac-6 была любезно пожертвована проф. Mantovani (Humanitas, Italy).
Клетки сохраняли в инкубаторе при 37°С в атмосфере с 5%.
CO2, в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 2% L-глутамина, 1% раствором пенициллина/стрептомицина, 1% незаменимых аминокислот, 1% 100 мМ пирувата натрия и 1% щавелевоуксусной кислоты.
Клетки, которые растут в суспензии, сохраняли в культуре пассированием, выполняемым один раз в неделю посредством разведений клеточной культуры 1:4 в новой свежей полной среде.
Клеточная линия HT29.
Клетки аденокарциномы ободочной кишки человека HT-29, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС Maryland, USA), сохраняли в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM с высоким содержанием глюкозы, рН 7,4), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 2% L-глутамина, 1% раствором пенициллина/стрептомицина, 1% незаменимых аминокислот, 1% 100 мМ раствора пирувата натрия и 2% 1 М раствора HEPES.
Клетки, которые растут посредством прилипания, сохраняли в культуре выполнением пассирований один раз в неделю, высевали 300000 клеток на колбу перед обработкой системой трипсин/EDTA для выделения клеток из монослоя.
Анализ цитотоксичности.
Клетки Моно Mac-6 и HT-29, которые высевали в 96-луночных планшетах (10000 клеток/лунку) за 24 ч до эксперимента, инкубировали с катионными производными при различных концентрациях в течение 24, 48 и 72 ч.
В конце обработки испытываемыми соединениями жизнеспособность клеток определяли как функцию продуцирования аденозинтрифосфата (АТФ), используя набор ATPIite (Perkin-Elmer).
Анализ набором ATPIite основан на генерации люминесценции, продуцированной после реакции АТФ, присутствующей в клетках, с люциферазой и d-люциферином, добавленными в лунки перед считыванием данных. Интенсивность генерированной люминесценции прямо пропорциональна концентрации АТФ, присутствующего в образце, и измеряется с помощью люминометра (VICTOR-3 Wallac).
Перед проведением измерения люминометром, 50 мкл раствора для лизиса (0,5% Triton X-100 в 0,2 н NaOH) в 100 мкл культуральной среды добавляли в каждую лунку. После 5 мин инкубации при комнатной температуре и с перемешиванием со скоростью 700 оборотов в минуту к каждой лунке добавляли 50 мкл набора ATPIite и после перемешивания в течение 5 мин планшет инкубировали в течение еще 10 минут в темноте перед выполнением измерения люминесценции.
Для каждого производного эксперименты проводили в двух повторностях.
Процент выживаемости клеток определяли с учетом средних величин люминесценции для обработанных клеток и средних величин для необработанных контрольных клеток.
Процент жизнеспособности клеток (% CV) для каждого производного предоставляли в виде среднего процента относительно контроля согласно следующему уравнению:
Средняя интенсивность люминесценции обработанных клеток
Жизнеспособность (%) = X 1 00
Средняя интенсивность люминесценции необработанных клеток
Соединение считается цитотоксичным, когда процент жизнеспособности клеток меньше 50%.
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран;
50 = немодифицированный гликоген полглумит(tm); 60 = полиэтиленимин (PEI).
Результаты в табл. 13 делают возможным демонстрацию того, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению являются нецитотоксичными при концентрации 0,01 мг/мл.
111
152
156
150
107
142
367
105
110
131
121
123
121
346
104
105
123
381
114
114
125
109
149
326
113
131
159
150
110
124
138
109
120
152
18 (*)
50 (*)
105
167
108
125
158
60 (*)
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран; 50 = немодифицированный гликоген полглумит(tm); 60 = (PEI).
Результаты в таблице 14 позволили показать, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению являются нецитотоксичными при концентрации 0,1 мг/мл, в отличие от DEAE-декстрана и PEI.
Результаты в табл. 15 позволили показать, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению, за исключением полимера 7, являются нецитотоксичными при концентрации 1 мг/мл, в отличие от DEAE-декстрана и PEI. Показано, что производное 7 является цитотоксичным только на культуре клеток в суспензии.
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран; 50 = немодифицированный гликоген полглумит(tm); 60 = PEI. Результаты в табл. 16 позволили показать, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению являются нецитотоксичными при концентрации 10 мг/мл, в отличие от DEAE-декстрана и PEI.
(b) Исследования флуоресцентных производных катионных полимеров согласно настоящему изобретению.
Исследования цитотоксичности проводили также с применением флуоресцентных производных ка-тионных полимеров согласно настоящему изобретению для целей определения наиболее нецитотоксич-ной концентрации, при которой проводили исследования включения клетками полимеров.
Флуоресцентные производные катионных полимеров согласно настоящему изобретению синтезировали следующим образом.
500 мг одного из катионных полимеров согласно настоящему изобретению растворяли в отсутствие света в 10 мл дистиллированной воды в двугорлой круглодонной колбы, снабженной магнитной мешалкой. Добавляли 2 мл 1н. NaOH и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Затем добавляли 36 мг флуоресцеинизотиоцианата (FITC), растворенного приблизительно в 0,3 мл ДМСО. Смесь перемешивали при комнатной температуре на протяжении ночи.
На следующий день 20 мл ацетона выливали в реакционную колбу и после перемешивания в течение приблизительно 30 мин делали возможным осаждение полимера. Супернатант выгружали и осадок дважды промывали приблизительно 20 мл ацетона.
Осадок затем растворяли приблизительно в 10 мл дистиллированной воды и раствор подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды в отсутствие света. После завершения диализа раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкл и сушили вымораживанием.
Эти исследования проводили на адгезивных клетках НТ29, полученных, как описано ранее.
Результаты представлены ниже в таблице 17, в которых флуоресцентные производные катионных полимеров согласно настоящему изобретению были обозначены такими же номерами, как в таблице 2, с добавлением "f".
(*) сравнительный образец: 18f = флуоресцентное производное DEAE-декстрана.
Из полученных результатов было видно, что самая высокая концентрация, при которой все флуоресцентные производные катионных полимеров согласно настоящему изобретению были нецитотоксичными в течение 24-часового периода, составляла 1 мг/мл. В противоположность этому, флуоресцентное производное DEAE-декстрана было очень токсичным при всех анализированных концентрациях.
Пример 7. Исследования поглощения клетками.
Исследования поглощения клетками проводили через 2, 6 и 24 ч, применяя флуоресцентные производные катионных полимеров настоящего изобретения (lf-16f) и гидрохлорида DEAE-декстрана при концентрации 1 мг/мл, т.е. наиболее высокой концентрации, анализированной при исследовании цито-токсичности, при которой оказалось, что флуоресцентные производные lf-16f были нецитотоксичными в течение периода 24 ч.
Исследования проводили с применением клейких клеток НТ29, обработанных согласно следующей процедуре.
Клетки HT-29, которые высевали за день до эксперимента при плотности 20000 клеток/лунку, инкубировали с соответствующими флуоресцентными производными при концентрации 1 мг/мл в течение 2, 6 и 24 ч. В конце каждого периода инкубации среду удаляли из лунок и клетки промывали три раза стандартным забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) с рН 7,4. Затем клетки обрабатывали 200 мкл раствора для лизиса (0,5% тритона X-100 0,5% в 0,2н. NaOH) и флуоресценцию измеряли флуориметрией (к возбуждения 485 нм; к излучения 535 нм). Для каждого соединения и для каждого периода времени вычисляли среднюю флуоресценцию двух повторностей, величины которой приводятся в табл. 18.
Эффективное количество поглощения клеток для флуоресцентных производных вычисляли построением калибровочной кривой для каждого флуоресцентного производного в растворителе для лизиса клеток (0,5% тритона X-100 в 0,2н. NaOH).
Из калибровочных кривых и из наблюдаемых интенсивностей флуоресценции вычисляли количество в мг/мл поглощения клетками, как указано в табл. 19.
(*) флуоресцентный DEAE-декстран.
Полученные результаты показали степень поглощения клетками катионных полимеров согласно изобретению по сравнению с DEAE-декстраном.
Кроме того, было отмечено, что степень дериватизации была прямо пропорциональна влиянию на поглощение клетками полимеров.
Пример 8. Оценка буферной емкости.
Буферную емкость оценивали для проверки того, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению могут иметь такие характеристики, что они могут также индуцировать эффект "протонной губки", который считается необходимым для того, чтобы сделать возможным высвобождение комплекса полимер-нуклеиновая кислота из цитоплазматических телец после клеточного поглощения.
Катионные полимеры согласно изобретению (DEAE-гликоген) и DEAE-декстран титровали при превращении в гидрохлорид (как описано в примере 2) посредством NaOH, причем мониторинг титрования проводили варьированием рН.
100 мг гидрохлорида полимера растворяли в 100 мл дистиллированной воды, причем раствор перемешивали на протяжении ночи при комнатной температуре. На следующий день раствор титровали 0,01 н NaOH, причем добавление титранта проводили дозиметром и мониторинг титрования проводили рН-метром.
Исследования титрования, проводимые на катионных производных согласно настоящему изобретению, сделали возможным идентификацию распределения pKa при рН ниже физиологического значения рН и приблизительно при физиологическом значении рН в диапазоне приблизительно 4,5-8, которое придает катионным полимерам изобретения высокую буферную емкость.
Величины pKa приблизительно при физиологическом значении рН были применимы для придания катионным полимерам изобретения положительного заряда, необходимого для образования комплекса с нуклеиновыми кислотами.
Величины pKa при рН ниже физиологического значения рН были применимы для обеспечения освобождения комплексов из цитоплазматических телец в цитоплазму (посредством эффекта "протонной губки").
На фиг. 9 представлены кривые титрования для катионных полимеров 2, 3 и 4 (DEAE-гликогена согласно настоящему изобретению) для сравнительных целей. Можно отметить, что в рамках одного и того же класса производных емкость буфера увеличивалась, когда увеличивалась степень дериватизации.
Кроме того, было обнаружено, что полимер 4 (DEAE-гликоген) и продукт 18 (DEAE-декстран) имели сходную степень дериватизации и сравнимую буферную емкость, как показано на фигуре 10.
Пример 9. Реологические измерения.
Реологические исследования проводили на катионных производных 1-16 согласно настоящему изобретению (DEAE-, DMAP-, DMAE-, 2-ОН-РТМА-гликоген) и на гидрохлориде DEAE-декстрана при концентрации 1% в ЗФР. Измерения проводили с помощью ротационного вискозиметра Bohlin Gemini 150, который пилотировали программным обеспечением Bohlin R6 40.5.32, оснащали геометрией конус-плоскость 2°/55 мм, температуру которого термостатически поддерживали при 25°С инструментом Peltier Bohlin и измерения которым проводили способом "регулируемого напряжения" в диапазоне напряже
ния сдвига 1 -5 Па.
Все анализированные образцы показали очень низкую величину вязкости порядка мПа. Эта характеристика позволяет применять катионные производные согласно настоящему изобретению также в виде инъекций. В качестве примера в табл. 20 представлены величины вязкости различных производных при одной величине напряжения (2,5 Па).
(*) Сравнительный образец: DEAE-декстран.
Пример 10. Исследования цитотоксичности комплексов катионных производных комплекса гликогена с анионными молекулами.
Клетки HT-29 высевали за день до эксперимента при плотности 10000 клеток/лунку в объеме 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% сыворотку.
В день эксперимента среду удаляли из лунок и добавляли 150 мкл среды DME М, содержащей 2,5% сыворотку. Затем добавляли 50 мкл комплексов, образованных из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентных siPHK. Комплексы, образованные из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентной siPHK получали согласно следующей процедуре.
Приготовляли четыре растворы, каждый из которых содержал 6,283 мг катионного полимера 3, 7, 11 и 15 в 40 мл ЗФР без РНазы. К 142,86 мкл каждого из растворов добавляли 6,6 мкл раствора siPHK в ЗФР без РНазы (концентрация 20 мкМ), и спустя несколько минут каждый раствор разводили 350,54 мкл ЗФР без РНазы. Конечная концентрация siPHK в растворах была 264 нМ, что соответствует 10 мас.% siPHK относительно массы полимера.
Полученные таким образом растворы перемешивали в течение приблизительно 30 с, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, снова перемешивали в течение 30 с и выдерживали в течение 5 мин. Перед выполнением эксперимента растворы перемешивали в течение 30 с.
Растворы (50 мкл) катионных полимеров 3, 7, 11 и 15 в 40 мл ЗФР без РНазы, к которым не добавляли siPHK, применяли в качестве образцов для первого сравнения.
Комплексы siPHK и реагента для трансфекции липофектамина(r) 2000, полученные согласно процедуре, описанной изготовителем Life-technologies(tm) для трансфекции siPHK, и содержащие такое же количество siPHK, как и количество, применяемое в комплексах с полимерами, применяли в качестве образцов для второго сравнения.
Реагент для трансфекции липофектамин(r) 2000, к которому не добавляли siPHK, применяли в качестве образца для третьего сравнения.
Комплексы и все сравнительные образцы, полученные, как описано выше, помещали в контакт с клетками. Клетки инкубировали в течение 4 и 24 ч при 37°С, после чего супернатант удаляли и добавляли 100 мкл среды, содержащей 2,5% сыворотку.
В конце обработки образцов тестируемыми соединениями, жизнеспособность клеток определяли как функцию продуцирования аденозинтрифосфата (АТФ), используя набор ATPIite (Perkin-Elmer), как описано выше в примере 6.
Результаты, полученные, как описано в примере 6, представили ниже в таблице 21 как процент живых клеток.
Полученные результаты показали, что комплексы, полученные из катионных полимеров согласно настоящему изобретению и siPHK, не были цитотоксическими.
Поэтому катионные полимеры 3, 7, 11 и 15 применяли в следующем исследовании включения клетками комплексов.
Пример 11. Исследования включения клетками катионных производных гликогена в комплексе с люминесцентными анионными молекулами.
Исследования проводили способом, подобным способу, который описан выше в примере 7, применяя адгезивные клетки HT29. HT29 клетки высевали за день до эксперимента при плотности 20000 клеток/лунку в объеме 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% сыворотку.
В день эксперимента, среду удаляли из лунок и добавляли 150 мкл среды DMEM, содержащей 2,5% сыворотку. Затем добавляли 50 мкл комплексов, образованных из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентной siPHK.
Комплексы, образованные из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентной siPHK, получали согласно следующей процедуре.
Приготовляли четыре раствора, каждый из которых содержал 6,2832 мг катионного полимера 3, 7, 11 и 15 в 40 мл ЗФР без РНазы. К 142,86 мкл каждого из этих растворов добавляли 6,6 мкл раствора siPHK в ЗФР без РНазы (концентрация 20 мкМ) и спустя несколько минут каждый раствор разводили 350,54 мкл ЗФР без РНазы. siPHK метили флуоресцентным соединением А1еха-488. Конечная концентрация siPHK была 264 нМ, что соответствует 10 мас.% siPHK относительно массы полимера.
Полученные таким образом растворы перемешивали в течение приблизительно 30 с, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, перемешивали в течение еще 30 с и выдерживали в течение 5 мин. Перед выполнением эксперимента растворы снова перемешивали в течение еще 30 с.
Комплекс siPHK и реагента для трансфекции липофектамина(r) 2000, полученный согласно процедуре, описанной производителем Life-technologies(tm) для трансфекции siPHK и содержащий такое же количество siPHK, как и количество, применяемое в комплексах с полимерами, применяли в качестве первого сравнительного образца.
Флуоресценцию только siPHK измеряли для последующего сравнения.
Комплексы и все сравнительные образцы, полученные, как описано выше, помещали в контакте с клетками.
Клетки инкубировали в течение 4 ч при 37°С и после удаления супернатанта клетки промывали дважды 200 мкл ЗФР.
Далее клетки обрабатывали 200 мкл раствора для лизиса (0,5% тритона X-100 в 0,2 н NaOH) в течение 5 минут при комнатной температуре при перемешивании.
Флуоресценцию, испускаемую siPHK, меченой А1еха-488, которая поглощалась, измеряли флуори-метром (к возбуждения 485 нм; к испускания 535 нм.) после того, как комплексы полимеров и siPHK выдерживали в контакте с клетками в течение 4 ч.
Для каждого полимера эксперимент проводили в трех повторностях и вычисляли среднюю величину интенсивности флуоресценции. Из этой величины вычитали среднюю величину интенсивности флуоресценции, вычисленную только для культуральной среде, которая была равна 1366, получая при этом величину конечной интенсивности флуоресценции.
Такую же процедуру применяли для первого образца для сравнения (липофектамин(r) 2000 +
siPHK), для которого средняя величина интенсивности флуоресценции только для культуральной среды была равна 1328.
Результаты представлены в табл. 22.
Полученные результаты показали, что катионные полимеры согласно изобретению способны индуцировать включение siPHK в клеточную мембрану. Кроме того, катионные полимеры согласно изобретению делают возможным включение большего количества siPHK, чем комплекс, применяемый в качестве сравнения и включающий в себя липофектамин(r) 2000.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Катионный полимер на основе гликогена, содержащий по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
DR (а) /
в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из NH2-(CrC6^-кила, [N,N-ди(С1 -^^^ламино]-^ 1 -^алкила, NH2- {[(C1 ^6)алкил]ди(С г^алкиламмонио }-(C1-C6) алкила, {[N,N^(C^^^килами^]-^г^алкилд^С 1 -^алкиламмонио }-(C^^алкила, NH2-[(С 1 -C6) алкиламино]-^ -^алкила, {[N,N^(C 1 -^^^ламино]-^ г^алкиламино }-(C1 -^)алкила, [три^ 1 -C6) алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, азоциклил(C1-C6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (^-О^ал^льные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и
п равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь)
OR, -о
*2 (Ь) ,
в которой R1 выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с
фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей
группы, выбранной из NH2-(C1-C6)алкила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-
C6)алкилди(С 1 -C6)алкиламмонио]-(C 1 -C6)алкила, {[N,N-ди(C 1 -^алкиламино] -(С1 -C6)алкилди(С 1 -
^алкиламмонио }-(C1 -C6)алкила, NH2- [(С1 -^алкиламиноК^ -C6)алкила, {[N,N-ди(C 1 -^^килами^] -(С1-C6)алкиламино}-(C1-C6)алкила, [три(C1-C6)алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, у которых (С1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами;
X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR2, у которой R2 выбран из атома водорода, (C1-C6)алкила и Н-[№Т-(Сг ^алкил^-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (Сг^алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и
m равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из R, R1, X1 и X2 представляет собой азотсодержащую группу, как указано соответственно для каждого из R, R1, X1 и X2, и
при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, по
лученного реакцией гликогена с хлоридом N-(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония.
2. Катионный полимер на основе гликогена по п.1, у которого указанные группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [N,N-ди(C1-C3)алкиламино]-(C1-C3)алкила, {[N/N^^Q-Q) алкиламино]-(C1-C3)алкилди(C1-C3)алкиламмонио}-(С1-C3)алкила, {[N,N-ди(C1-C3)алкиламино]-(C1-C3) алкиламино}-(С1-C3)алкила, [три(C1-C3)алкиламмонио]-(C1-C3)алкила, азоциклил-(С1-C3)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (Сг^алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
3. Катионный полимер на основе гликогена по п.2, у которого указанные группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из ^^диметиламиноэтила, ^^диметиламинопропила, N,N-диэтиламиноэтила, [(^^диметиламиноэтил)диметиламмонио]этила, [(^^диметиламинопропил)диме-тиламмонио]пропила, [(N,N-диэтиламиноэтил)диэтиламмонио]этила, пиперидил-N-этила или морфоли-нил-N-этила.
4. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого R1 представляет собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [N,N-ди(C1-C3)алкиламино]-(C1-C3)алкила, {[N,N-ди(C1-C3)алкиламино]-(C1-C3)алкилди(C1-C3)алкиламмонио}-(C1-C3)алкила, {[N,N-ди(C1-C3)алкиламино]-(C1-C3)алкиламино}-(C1-С3)алкила или [три(C1-C3)алкиламмонио]-(C1-C3)алкила, у которых (C1-C3)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
5. Катионный полимер на основе гликогена по п.4, у которого R1 представляет собой атом водорода или карбоксиметильную группу.
6. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой азотсодержащую группу -NHR2, у которой R2 представляет собой атом водорода или Н-[NH-(C1-C4)алкил]p-, где p равно целому числу, которое больше или равно 1, и (C1-C4)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными.
7. Катионный полимер на основе гликогена по п.6, у которого указанная группа №[N№(^-0!^-кил]р- представляет собой полиэтиленимин с молекулярной массой от 50 до 3000 Да, спермин (H2N(СН2)зNH(СН2)4NH(СН2)зNH2) или спермидин (H^CH^NH^H^bNH^).
8. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого указанные повторяющиеся звенья (а) и (b) содержат
по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способна ионизироваться при физиологическом значении рН и выбрана из группы, состоящей из NH2-(C1-C6)алкила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкилами-но}-(С1-C6)алкила и азоциклил-(C1-C6)алкила, и
по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способна ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, и выбрана из группы, состоящей из ^^-{[(СгС^ал-кил]ди(C1-C6)алкиламмонио}-(C1-C6)алкила и {[N,N-ди(C1-C3)алкиламино]-(C1-C6)алкилди(C1-C6)алкил-аммониоИ^-С^лкши.
9. Комплекс катионного полимера на основе гликогена по любому из пп.1-8 и анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой
кислоты.
в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащую группу, выбранную из NH2-(C1-C6)ал-
10. Комплекс по п.9, где указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве между 5 и 60 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
11. Комплекс по п.10, где указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве между 10 и 50 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая (А) комплекс (1) катионного полимера на основе гликогена, содержащего по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
10.
кила, [N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-C6)алкилди(C1-С6)алкиламмонио]-(C1-C6)ал-кила, {[NjN^^C 1 -C6)алкиламино]-(С 1-C6)алкилди(С 1-C6)алкиламмонио} -(C1 -^алкила, NH2-[(С ^Оал-киламино]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкиламино}-(C1-C6)алкила, [три(C1-C6) алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, азоциклил(C1-C6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (Сг^алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и
п равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь)
в которой R1 выбран из атома водорода, карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащей группы, выбранной из NH2-(C1-C6)алкила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-C6)алкил-ди(С1-C6)алкиламмонио]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкилди(С1-C6)алкиламмо-нио}-(C1-C6)алкила, NH2-[(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкил-амино}-(C1-C6)алкила, [три(C1-C6)алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, у которых (C1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидро-ксильными группами;
X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR2, у которой R2 выбран из атома водорода, (C1-C6)алкила и Н-[NH-(С1-C6)ал-кил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (Сг^алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и
m равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из R, R1, X1 и X2 представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно для каждого из R, R1, X1 и X2,
и (2) анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты;
и (В) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, в которой указанным анионным соединением является нуклеиновая кислота.
14. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пп.12 и 13, пригодная для инъекционного применения.
15. Применение комплекса (1) катионного полимера на основе гликогена, содержащего по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
в которой группы R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащую группу, выбранную из NH2-(C1-C6)ал-кила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-{[(C1-C6)алкилди(С1-C6)алкиламмонио]}-(C1-C6) алкила, {[N,N^^C 1-C6)алкиламино]-(С 1-C6)алкилди(С 1-C6)алкиламмонио]} -(C1-C6)алкила, NH2-[(С 1-C6) алкиламино]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(С1-C6)алкиламино}-(С1-C6)алкила, [три^-^) алкиламмонио]-(С1-C6)алкила, азоциклил(C1-C6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (C1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими
гидроксильными группами, и
в которой R1 выбран из атома водорода, карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащей группы, выбранной из NH2-(C1-C6)алкила, [N,N-ди(С1-C6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-
п равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь)
C6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио]-(C1-C6)алкила, {[ТЧ^-ди^ -C6)алкиламино]-(С1-С6)алкилди(C1-C6)ал-киламмонио}-(C1-C6)алкила, NH2-[(C1-С6)алкиламино]-(C1-C6)алкила, {[N,N-ди(C1-C6)алкиламино]-(C1-С6)алкиламино}-(C1-C6)алкила, [три(C1-C6)алкиламмонио]-(C1-С6)алкила, у которых (C1-C6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами;
X1 и X2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -NHR2, у которой R2 выбран из атома водорода, (^-^алкала и Н-[NH-(C1-C6)ал-кил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (C1-C6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и
m равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из R, R1, X1 и X2 представляет собой азотсодержащую группу, как определено соответственно для каждого из R, R1, X1 и X2,
и (2) анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты для доставки или трансфекции указанного анионного соединения в определенную фармакологическую мишень.
3 3 3 50 50 3 SiPHK ДНК
10% 15% 20% 10% 80% 0% (*) (*)
Фиг. 2
ззззз siPHK з ДНК
зз ззз з siPHK ДНК
ЧГГ- ПГР- 100"- /00% .100"- "00"- !* ! !* !
Фиг. 3
1 1 2 2 6 6 SiPHK ДНК
10 10 15 15 14 14 SiPHK ДНК
ДНК 8 8 16 16 12 12 SiPHK
(1) 5% 20% 5% 20% 5% 20% (2)
Фиг. 6
ДНК 24 24 21 21 25 25 SiPHK
ДНК 23 23 28 28 20 20 SiPHK
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
1 5% 20% 5% 20% 5% 20% (*)
Фиг. 8
2 5% 20% 5% 20% 5% 20% (*)
Фиг. 8
---------------
------------------------------------------------------------
---------------
------------------------------------------------------------
032479
- 1 -
(19)
032479
- 1 -
(19)
032479
- 1 -
(19)
032479
- 9 -
032479
- 9 -
032479
- 13 -
032479
- 38 -