|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ производства обогащенной композиции иммуноглобулинов из плазмы или криообедненной плазмы, отличающийся тем, что способ включает этапы: (а) совместное осаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из плазмы или криообедненной плазмы путем добавления к плазме или криообедненной плазме этанола в конечной концентрации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН от 5,0 до 6,0 и при температуре от -3 до -10°С с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; (б) отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; (в) суспендирование первого осадка в воде или буфере, имеющем низкую электропроводность; (г) обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO 2 ) и (д) отделение растворимой фракции первой суспензии от нерастворимой фракции первой суспензии с получением обогащенной композиции иммуноглобулинов, причем плазма или криообедненная плазма не была подвергнута начальному осаждению этанолом до выполнения этапа (а). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет от 21 до 29%. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет от 23 до 27%. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет 25%. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет от 5,1 до 5,9. 6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет от 5,3 до 5,7. 7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет 5,5. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что первый этап осаждения выполняют при температуре от -5 до -9°С. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что первая суспензия имеет рН от 4,0 до 5,4. 10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что первая суспензия имеет рН от 4,7 до 5,1. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что первая суспензия имеет проводимость от 0 до 4 мСм/см. 12. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что первая суспензия имеет проводимость от 0,5 до 2 мСм/см. 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO 2 ) добавляют к первой суспензии в конечной концентрации от 15 г/кг первого осадка до 80 г/кг первого осадка. 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что этап (а) включает использование этанола в концентрации в диапазоне от 24 до 26% при уровне рН в диапазоне от 5,3 д 5,7 и температурой в диапазоне от -6 до -8°С. 15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 90% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а). 16. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 95% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а). 17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этапы: (е) осаждение иммуноглобулинов из растворимой фракции первой суспензии, полученной на этапе (д), путем добавления этанола к ней с получением второго осадка и второй надосадочной жидкости; (ж) суспендирование второго осадка с образованием второй суспензии и (з) отделение растворимой фракции второй суспензии от нерастворимой фракции второй суспензии с получением дополнительно обогащенной композиции иммуноглобулинов. 18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обеспечение связывания иммуноглобулинов, содержащихся в обогащенных композициях, с катионообменным материалом; и элюирование иммуноглобулинов с получением элюата, обогащенного иммуноглобулинами. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что способ дополнительно включает контактирование иммуноглобулинов, содержащихся в обогащенном элюате, с анионообменным материалом; и извлечение иммуноглобулинов, не связавшихся с анионообменным материалом, с получением элюата, обогащенного иммуноглобулинами. 20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этап инактивации и/или удаления вирусов. 21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что из нерастворимой фракции первой суспензии выделяют альфа-1-антитрипсин (A1PI). 22. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что из нерастворимой фракции первой суспензии выделяют фибриноген, фактор Н или интер-альфа-ингибитор трипсина (I αIp). 23. Способ по любому из пп.1-22, дополнительно включающий этап выделения белка крови из плазмы или криообедненной плазмы путем адсорбции на твердой фазе перед этапом (а). 24. Способ по любому из пп.1-13, в котором отделенная нерастворимая фракция первой суспензии содержит по меньшей мере 80% альфа-1-антитрипсина (A1PI), содержащегося в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а).
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ производства обогащенной композиции иммуноглобулинов из плазмы или криообедненной плазмы, отличающийся тем, что способ включает этапы: (а) совместное осаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из плазмы или криообедненной плазмы путем добавления к плазме или криообедненной плазме этанола в конечной концентрации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН от 5,0 до 6,0 и при температуре от -3 до -10°С с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; (б) отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; (в) суспендирование первого осадка в воде или буфере, имеющем низкую электропроводность; (г) обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO 2 ) и (д) отделение растворимой фракции первой суспензии от нерастворимой фракции первой суспензии с получением обогащенной композиции иммуноглобулинов, причем плазма или криообедненная плазма не была подвергнута начальному осаждению этанолом до выполнения этапа (а). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет от 21 до 29%. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет от 23 до 27%. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет 25%. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет от 5,1 до 5,9. 6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет от 5,3 до 5,7. 7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет 5,5. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что первый этап осаждения выполняют при температуре от -5 до -9°С. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что первая суспензия имеет рН от 4,0 до 5,4. 10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что первая суспензия имеет рН от 4,7 до 5,1. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что первая суспензия имеет проводимость от 0 до 4 мСм/см. 12. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что первая суспензия имеет проводимость от 0,5 до 2 мСм/см. 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO 2 ) добавляют к первой суспензии в конечной концентрации от 15 г/кг первого осадка до 80 г/кг первого осадка. 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что этап (а) включает использование этанола в концентрации в диапазоне от 24 до 26% при уровне рН в диапазоне от 5,3 д 5,7 и температурой в диапазоне от -6 до -8°С. 15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 90% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а). 16. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 95% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а). 17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этапы: (е) осаждение иммуноглобулинов из растворимой фракции первой суспензии, полученной на этапе (д), путем добавления этанола к ней с получением второго осадка и второй надосадочной жидкости; (ж) суспендирование второго осадка с образованием второй суспензии и (з) отделение растворимой фракции второй суспензии от нерастворимой фракции второй суспензии с получением дополнительно обогащенной композиции иммуноглобулинов. 18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обеспечение связывания иммуноглобулинов, содержащихся в обогащенных композициях, с катионообменным материалом; и элюирование иммуноглобулинов с получением элюата, обогащенного иммуноглобулинами. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что способ дополнительно включает контактирование иммуноглобулинов, содержащихся в обогащенном элюате, с анионообменным материалом; и извлечение иммуноглобулинов, не связавшихся с анионообменным материалом, с получением элюата, обогащенного иммуноглобулинами. 20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этап инактивации и/или удаления вирусов. 21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что из нерастворимой фракции первой суспензии выделяют альфа-1-антитрипсин (A1PI). 22. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что из нерастворимой фракции первой суспензии выделяют фибриноген, фактор Н или интер-альфа-ингибитор трипсина (I αIp). 23. Способ по любому из пп.1-22, дополнительно включающий этап выделения белка крови из плазмы или криообедненной плазмы путем адсорбции на твердой фазе перед этапом (а). 24. Способ по любому из пп.1-13, в котором отделенная нерастворимая фракция первой суспензии содержит по меньшей мере 80% альфа-1-антитрипсина (A1PI), содержащегося в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а).
Евразийское 032478 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.06.28
(21) Номер заявки 201491564
(22) Дата подачи заявки 2013.02.25
(51) Int. Cl.
C07K16/06 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) A61K 35/51 (2015.01) C07K1/30 (2006.01)
(54) СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ОБОГАЩЁННОЙ КОМПОЗИЦИИ
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ИЗ ПЛАЗМЫ ИЛИ КРИООБЕДНЁННОЙ ПЛАЗМЫ
(31) 61/602,488
(32) 2012.02.23
(33) US
(43) 2015.04.30
(86) PCT/US2013/027681
(87) WO 2013/126904 2013.08.29
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД
(US); БАКСАЛТА ГМБХ (CH)
(72) Изобретатель:
Брукшвайгер Леопольд, Гундингер Томас, Нюрнбергер Юлиа, Тешнер Вольфганг, Шварц Ханс-Петер (AT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A-4476109
WO-A2-03034982
WO-A1-2011149472
WO-A2-2010138736
RADOSEVICH M.
immunoglobulin G: Trends ". r ,
quality control and quality assurance", VOX SANGUINIS, S. KARGER AG, BASEL, CH, vol. 98, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 12-28, XP009141581, ISSN: 0042-9007 the whole document
BUCHACHER ANDREA ET AL.:
"Purification of intravenous immunoglobulin G from human plasma - aspects of yield and virus safety", BIOTECHNOLOGY JOURNAL, WILEY-VCH VERLAG, WEINHEIM, DE, vol. 1, no. 2, 1 February 2006 (2006-02-01), pages 148-163, XP009141576, ISSN: 1860-6768 the whole document
KISTLER P. ET AL.: "LARGE SCALE PRODUCTION OF HUMAN PLASMA
FRACTIONS", VOX SANGUINIS, S. KARGER AG,
BASEL, CH, vol. 7, 1 January 1962 (1962-01-01),
pages 414-424, XP001048178, ISSN: 0042-9007 the whole document
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет относительно предварительной заявки на патент США с серийным № 61/602488, поданной 23 февраля 2012 года, раскрытие которой включено в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте для любых целей.
Уровень техники
Продукты иммуноглобулинов из плазмы человека были впервые использованы в 1952 году для лечения иммунодефицита. Первоначально способом выбора являлось внутримышечное или подкожное введение выделенного из плазмы изотипа G иммуноглобулина (IgG). Однако эти способы не позволяли введение больших количеств IgG, необходимых для эффективного лечения различных заболеваний. Соответственно, были разработаны продукты IgG, которые можно было вводить внутривенно. Обычно внутривенный иммуноглобулин (ВВИГ) содержит пул иммуноглобулинов G (IgG), иммуноглобулинов из плазмы более тысячи доноров крови. Препараты, как правило, содержат более 95% немодифициро-ванного IgG, имеющего интактные Fc-зависимые эффекторные функции и только ничтожные количества иммуноглобулина A (IgA) и иммуноглобулина М (IgM). Как правило, ВВИГ стерилизуют фильтрацией, и производственный процесс включает этапы инактивации и/или удаления вирусов. Эти очищенные продукты IgG в основном используются при лечении трех основных категорий медицинских состояний: (1) иммунодефицитов: агаммаглобулинемии, сцепленной с Х-хромосомой, гипогаммаглобулинемии (первичных иммунодефицитов), и приобретенных состояний ослабленного иммунитета (вторичных иммуно-дефицитов), характеризующихся низкими уровнями антител; (2) воспалительных и аутоиммунных заболеваний; и (3) острых инфекций.
В частности, у многих людей с первичным иммунодефицитом недостаточно антител, необходимых для того, чтобы сопротивляться инфекции. В некоторых случаях такие дефициты могут быть восполнены инфузией очищенных IgG, обычно посредством внутривенного введения (т. е. терапии ВВИГ). Обычно таким образом лечат некоторые первичные иммунодефицитные расстройства, в том числе агаммаглобу-линемию, сцепленную с X-хромосомой (Х-СА), вариабельный не классифицируемый иммунодефицит (ВНИД), синдром гипериммуноглобулинемии М (ГИМ), тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) и некоторые дефициты подкласса IgG (Blaese and Winkelstein, J. Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Immune Deficiency Foundation; 2007).
В то время как лечение IgG может быть очень эффективным для контроля первичных иммунодефи-цитных расстройств, этот вид терапии является лишь временным замещением антител, которые не вырабатываются в организме, а не лечением заболевания. Соответственно, пациенты зависят от повторных доз терапии IgG, которые, как правило, вводят около одного раза в месяц в течение всей продолжительности жизни. Этот вид терапии предъявляет большое требование непрерывного производства композиций IgG. Однако, в отличие от других биопрепаратов, которые производятся с помощью экспрессии ре-комбинантных ДНК-векторов in vitro, IgG фракционируют из донорской крови и плазмы человека. Таким образом, уровень коммерчески доступного IgG ограничен доступным предложением сданной донорской крови и плазмы.
Спросом на IgG управляют несколько факторов, включая одобрение видов лечения IgG, выявление дополнительных показаний к применению, для которых эффективна терапия IgG, и повышение диагностики у пациентов, и назначение IgG Примечательно, что мировой спрос на IgG в период между 1990 и 2009 годом увеличился более чем в четыре раза и продолжает увеличиваться с ежегодным темпом роста в диапазоне от около 7 до 10% (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367). Например, национальная служба крови Австралии сообщила, что за 2008-2009 финансовый год спрос на IgG в Австралии вырос на 10,6% (годовой отчет национальной службы крови Австралии за 2008-2009 гг.).
Отчасти из-за растущего мирового спроса и колебаний доступной поставки продуктов иммуноглобулинов, несколько стран, включая Австралию и Англию, ввели в действие программы управления спросом для защиты поставок этих продуктов пациентам с наивысшей потребностью в периоды дефицита продуктов.
Сообщалось, что в 2007 году фракционировали 26,5 миллионов литров плазмы, произведя 75,2 метрических тонн IgG, при среднем выходе продукции 2,8 грамма на литр (Robert P., см. выше). В этом же докладе высказано предположение, что к 2012 году ожидается увеличение общего выхода IgG до около 3,43 грамм на литр. Тем не менее, в связи с продолжающимся ростом мирового спроса на IgG, по прогнозам в диапазоне от около 7% до 13% в год, в период с настоящего времени до 2015 года для удовлетворения мирового спроса возникнет необходимость дальнейшего улучшения общего выхода IgG.
Коммерческие поставщики продуктов IgG используют ряд способов приготовления IgG. Обычной проблемой современных способов производства IgG является существенная потеря IgG в процессе очистки, которая по оценкам составляет по меньшей мере от 30 до 35% от общего содержания IgG в исходном материале. Одна из проблем состоит в поддержании качества вирусной инактивации и удаления примесей, которые могут вызвать побочные реакции, при одновременном повышении эффективности процесса для увеличения выхода IgG. При текущих уровнях производства IgG, то, что может считаться небольшим увеличением выхода, фактически является весьма значительным. Например, 2% увеличение эффективности на уровне производства 2007 года, равное дополнительным 56 мг на литр, будет произ
водить 1,5 дополнительных метрических тонн IgG.
В четвертом выпуске опубликованной серии конструктивных работ по приготовлению и свойствам белков сыворотки и плазмы Conn et al. (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475) впервые описали способ спиртового фракционирования белков плазмы (способ 6), который предоставляет возможность выделения из плазмы человека фракции, обогащенной IgG. Несколько лет спустя, Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc, 1949, 71(2): 541-550) расширили способы Кона, опубликовав способ (способ 9), приводящий к выделению более чистого препарата IgG.
В то время как эти способы заложили основу для целой индустрии получаемых из плазмы белков крови, они были не в состоянии предоставить препараты IgG с достаточно высокой чистотой для лечения некоторых иммунных заболеваний, включая синдром Кавасаки, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру и первичные иммунодефициты. По существу, для того, чтобы предоставить композиции IgG с более высокой чистотой, были разработаны дополнительные методологии с использованием различных способов, таких как ионообменная хроматография. Норре et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), Falksveden (патент Швеции № 348942) и Falksveden и Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) были одними из первых, кто использовал для этой цели ионообменную хроматографию.
Различные современные способы очистки иммуноглобулинов из плазмы используют этап осаждения, например, осаждение каприлатом (Lebing (Lebing et al., Vox Sang 2003 (84):193-201) и осаждение этанолом фракции (I+)II + III по Кону (Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30) в сочетании колоночной хроматографией. Совсем недавно Teschner et al. (Vox Sang, 2007 (92):42-55) описали способ производства продукта 10% IgG, в котором сначала из пула плазмы удаляют криоосадок, а затем осуществляют модифицированное фракционирование этанолом по Кону-Онкли в холоде с последующей обработкой промежуточного продукта Р/Д, ионообменной хроматографией, нанофильтрацией и, необязательно, ультрафильтрацией/диафильтрацией.
Несмотря на чистоту, безопасность и выход, предоставляемые этими способами выделения IgG, выход извлекаемого из плазмы IgG все еще может быть улучшен. Например, Teschner et al. сообщают, что их способ приводит к увеличению выхода IgG на 65% (Teschner et al., см. выше). Как сообщалось в ходе различных встреч по продуктам из плазмы, при крупномасштабном получении IgG, как, например, в компаниях Baxter, CSL Behring, Upfront Technology, Cangene, Prometric BioTherapeutics и Финского Красного Креста, средние выходы представлены в конечном контейнере в диапазоне от около 61% до около 65%. Хотя это лучше, чем в ранее применяемых способах, это количество извлечения IgG по-прежнему представляет потерю в процессе выделения по меньшей мере около трети IgG, находящегося во фракции пула плазмы.
В связи с ограниченным предложением плазмы, доступной для производства продуктов, получаемых из плазмы, выделение нескольких белков крови из общего исходного пула плазмы может быть достигнуто посредством интеграции очисток в единую структуру. Например, IgG обычно обогащают посредством образования осадка фракции II+III по Кону или осадка А по Кистлеру-Нитшманну, соответствующие надосадочные жидкости которых затем используют для производства альфа-1-антитрипсина (A1PI) и альбумина. Аналогичным образом, были описаны несколько способов производства фактора Н из побочных продуктов, образующихся в процессе производства иммуноглобулинов IgG, в том числе в публикациях WO 2008/113589 и WO 2011/011753.
Таким образом, существует потребность в улучшенных и более эффективных способах производства терапевтических продуктов IgG. Кроме того, эти способы должны также предоставлять возможность производства из одного источника плазмы дополнительных продуктов, получаемых из плазмы. Настоящее изобретение удовлетворяет эти и другие потребности, предоставляя способы выделения IgG, которые дают выходы приблизительно на 20-25% выше, чем достижимые в настоящее время, а также предоставляя композиции IgG. Преимущественно, способы, представленные в настоящем документе, предоставляют возможность совместного выделения других терапевтически важных белков, получаемых из плазмы крови, включая альфа-1-антитрипсин (A1PI), фактор Н, белки интер-альфа-ингибиторы (IaIp), протромбиновые комплексы, фактор VII (FVII), фактор VIII (FVIII), антитромбин III (ATIII), фибриноген, бутирилхолинэстеразу и другие.
Краткое описание изобретения
Современные способы производства ВВИГ и альфа-1-антитрипсина (A1PI) основаны на многократных этапах осаждения белка для отделения иммуноглобулина IgG и A1PI от других компонентов, обнаруживаемых в плазме человека. Например, многие производители используют вариацию способа 6 по Кону-Онкли, в котором применяются три начальных этапа спиртового осаждения. Первый этап осаждения, называемый также осаждением фракции I, выполняется при высоком уровне рН (7,2) и низкой концентрации этанола (8-10% об./об.) для того, чтобы осадить белок, такой как фибриноген и фактор XIII от IgG и A1PI, которые остаются в надосадочной жидкости. Затем из надосадочной жидкости фракции I осаждают IgG во второй реакции осаждения, называемой также осаждением фракции II+III, которая выполняется при умеренном уровне рН (6,8) и высокой концентрации этанола (20-25%) Основная часть A1PI остается в надосадочной жидкости реакции осаждения фракции II+III, а затем отделяется от альбумина в третьей начальной реакции осаждения, называемой осаждением фракции I-IV-1, которая выпол
няется при низком уровне рН (5,2) и умеренной концентрации этанола (18%).
К сожалению, поскольку в описанном выше способе Кона-Онкли, а также сопоставимом процессе Кистлера-Нитшманна, в котором используют четыре начальных осаждения для фракционирования IgG и A1PI, индивидуальные компоненты отделяются в сложных сериях реакций осаждения, фракционирование является неэффективным. Значительную потерю выхода IgG и A1PI на этих начальных этапах осаждения можно отнести к частичному осаждению в нецелевых фракциях, а также к неполному осаждению в целевых фракциях. Например, IgG в некоторой степени соосаждается с фибриногеном и фактором XIII в осадке фракции I, a некоторое количество IgG не осаждается посредством осаждения фракции II+III. После очищения растворенного осадка фракции II+III, выход IgG, как правило, составляет от 75 до 85% от IgG, находящегося в исходном пуле Кона. Соответственно, после этих двух этапов фракционирования теряется от 15 до 25% от общего содержания IgG в исходном материале.
Настоящее раскрытие улучшает извлечение IgG и A1PI из пула плазмы посредством устранения необходимости многократных начальных этапов осаждения. Напротив, способы, описанные в настоящем документе, основаны на одном начальном этапе осаждения, в котором захватываются вместе все белки, которые обычно осаждаются в осадках фракции I, фракции II+III и фракции IV-1. Этот единственный этап осаждения упоминается в настоящем документе как "осаждение фракции I+II+III+IV-1", "осаждение фракции I-IV-1", или "начальное осаждение при низком уровне рН, высокой концентрации спирта." Преимущественно, было обнаружено, что IgG и A1PI могут быть эффективно извлечены из осадка фракции I-IV-1 без использования последующих осаждений белка. Кроме того, было обнаружено, что осадок фракции I-IV-1 включал почти все содержимое IgG и A1PI источника плазмы, в то время как альбумин остается в надосадочной жидкости. Вместе взятые, эти преимущества приводят к значительному увеличению общего извлечения этих важных коммерческих продуктов.
Как показано в примерах, использование этапа осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (осаждение фракции I-IV-1) в качестве начального этапа очистки IgG из криообедненной плазмы предоставляет возможность производства композиций IgG фармацевтического качества с беспрецедентными количествами произведенного продукта, составляющими 4,3-4,7 г IgG/л источника плазмы. Эти выходы произведенного продукта представляют увеличение выхода приблизительно на 20-25% по сравнению с самыми современными в данной области техники производственными процессами, такими как те, которые используются для производства лекарственного средства GAMMAGARD LIQUID(r) (Baxter International; Дирфилд, штат Иллинойс) из аналогичного типа плазмы.
Соответственно, наряду с другими аспектами, настоящее изобретение представляет новый процесс фракционирования плазмы, в котором плазму или криообедненную плазму разделяют на начальном этапе на осадок фракции I-IV-1 и надосадочную жидкость фракции I-IV-1. Осадок фракции I-IV-1 содержит почти все иммуноглобулины (например, IgG, IgA и IgM) и альфа-1 ингибитор эластазы (A1PI), в то время как надосадочная жидкость содержит в основном альбумин.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу производства обогащенной композиции иммуноглобулинов из плазмы или криообедненной плазмы, отличающийся тем, что способ включает этапы: (а) соосаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из плазмы или криообед-ненной плазмы путем добавления к плазме или криообедненной плазме этанола в конечной концентрации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН от 5,0 до 6,0 и при температуре от -3 до -10°С с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; (б) отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; (в) суспендирование первого осадка в воде или буфере, имеющем низкую электропроводность; (г) обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2); и (д) отделение растворимой фракции первой суспензии от нерастворимой фракции первой суспензии, причем плазма или криообедненная плазма не была подвергнута начальному осаждению этанолом до выполнения этапа
(а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная концентрация этанола на первом этапе осаждения составляет 25±4%. В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная концентрация этанола составляет 25±3%. В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная концентрация этанола составляет 25±2%. В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная концентрация этанола составляет 25±1%. В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная концентрация этанола составляет 25%.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, уровень рН первого этапа осаждения составляет 5,5±0,4. В одном варианте реализации способов, описанных выше, уровень рН составляет 5,5±0,3. В одном варианте реализации способов, описанных выше, уровень рН составляет 5,5±0,2. В одном варианте реализации способов, описанных выше, уровень рН составляет 5,5±0,1. В одном варианте реализации способов, описанных выше, уровень рН составляет 5,5.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, уровень рН поддерживается в течение всей продолжительности первого этапа осаждения.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый этап спиртового осаждения включает добавление спирта путем распыления.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый этап спиртового осаждения включает добавление спирта в месте, расположенном рядом с турбинной мешалкой. В другом варианте реализации спирт вводят в раствор более чем в одном месте. В одном варианте реализации спирт вводят в раствор через множество маленьких каналов. В конкретном варианте реализации многочисленные места добавления спирта расположены на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи них. В другом варианте реализации спирт вводят в раствор через канал распылителя, содержащий множество отверстий. В конкретном варианте реализации одно или более из соответствующих отверстий множества отверстий в канале распылителя расположены на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи их.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый этап осаждения выполняют при температуре от -3 до 10°С. В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый этап осаждения выполняют при температуре от -5 до -9°С.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый осадок суспендируют с 4-60 л буфера на кг осадка. В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый осадок суспендируют с 8-15 л буфера на кг осадка.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первая суспензия имеет уровень рН от 4,0 до 5,4. В одном варианте реализации способов, описанных выше, первая суспензия имеет уровень рН от 4,7 до 5,1.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первая суспензия имеет проводимость от 0 до 4 мСм/см. В одном варианте реализации способов, описанных выше, первая суспензия имеет проводимость от 0,5 до 2 мСм/см.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, первый осадок суспендируют в буфере, содержащем ацетат и/или фосфат.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, растворимую часть первой суспензии отделяют от нерастворимой части первой суспензии путем центрифугирования или фильтрации.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, этап отделения растворимой части первой суспензии от нерастворимой части первой суспензии включает: (i) смешивание тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с первой суспензией; и (ii) отделение SiO2 от суспензии.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO2) имеет среднюю площадь поверхности от 350 до 410 м2/г.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO2) добавляют к первой суспензии в конечной концентрации от 15 г/кг первого осадка до 80 г/кг первого осадка.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 90% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или крио-обедненной плазме, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 95% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или крио-обедненной плазме, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дополнительно включает этапы: (е) осаждение иммуноглобулинов из растворимой фракции первой суспензии, полученной на этапе (д), путем добавления этанола к ней с получением второго осадка и второй надосадочной жидкости; (ж) сус-пендирование второго осадка с образованием второй суспензии; и (з) отделение растворимой фракции второй суспензии от нерастворимой фракции второй суспензии с получением дополнительно обогащенной композиции иммуноглобулинов.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, второй этап осаждения представляет собой этап спиртового осаждения.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, второй этап спиртового осаждения включает добавление этанола к растворимой фракции первой суспензии до достижения конечной концентрации этанола в диапазоне от 22 до 28% при уровне рН в диапазоне от 6,5 до 7,5.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, второй этап спиртового осаждения включает добавление спирта путем распыления.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, второй этап спиртового осаждения включает добавление спирта в месте, расположенном рядом с турбинной мешалкой. В другом варианте реализации спирт вводят в раствор более чем в одном месте. В одном варианте реализации спирт вводят в раствор через множество маленьких каналов. В конкретном варианте реализации многочисленные места добавления спирта расположены на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи них. В другом варианте реализации спирт вводят в раствор через канал распылителя, содержащий множество отверстий. В конкретном варианте реализации одно или более из соответствующих отверстий множества отверстий в канале распылителя расположены на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи их.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, второй этап осаждения выполняют при
температуре в диапазоне от -3 до -10°С.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 90% содержимого иммуноглобулинов IgG, находящихся в криообед-ненной плазме, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 95% содержимого иммуноглобулинов IgG, находящихся в криообед-ненной плазме, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дополнительно включает этап обогащения с использованием анионообменной хроматографии.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дополнительно включает этап обогащения с использованием катионообменной хроматографии.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дополнительно включает этап инактивации или удаления вирусов.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ включает этап инактивации вирусов растворителем/детергентом (Р/Д).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ включает этап нанофильтрации.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ включает этап инкубации композиции при уровне рН от 4,0 до 5,0 и температуре от 20 до 40°С в течение по меньшей мере одной недели.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная обогащенная IgG композиция содержит по меньшей мере 98% IgG.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, конечная обогащенная IgG композиция содержит по меньшей мере 99% IgG.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дает выход по меньшей мере 4 г IgG на литр криообедненной плазмы, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дает выход по меньшей мере 4,25 г IgG на литр криообедненной плазмы, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, способ дает выход по меньшей мере 4,5 г IgG на литр криообедненной плазмы, используемой на этапе (а).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, из нерастворимой фракции первой суспензии дополнительно очищают альфа-1-антитрипсин (A1PI).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, из нерастворимой фракции первой суспензии дополнительно очищают фибриноген.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, из нерастворимой фракции первой суспензии дополнительно очищают фактор Н.
В одном варианте реализации способов, описанных выше, из нерастворимой фракции первой суспензии дополнительно очищают белок интер-альфа-ингибитор трипсина (Icdp).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, нерастворимую фракцию первой суспензии обрабатывают тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2).
В одном варианте реализации способов, описанных выше, из первой надосадочной жидкости дополнительно очищают альбумин.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения иммунодефицита, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у индивидуума, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение субъекту обогащенной композиции иммуноглобулинов, полученной способом по изобретению.
Краткое описание графических материалов
На чертеже изображено графическое представление схемы фракционирования плазмы в соответствии с одним вариантом реализации, описанным в настоящем документе.
Подробное описание изобретения
I. Введение.
Среди других аспектов настоящее изобретение представляет более эффективный способ выделения терапевтических белков из пула плазмы. Способы, представленные в настоящем документе для фракционирования пула плазмы, обеспечивают более высокие выходы многих терапевтически важных белков крови, получаемых из плазмы, в том числе иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI). В особенно важном аспекте настоящее изобретение представляет способы, которые значительно увеличивают выход иммуноглобулина G (IgG), выделенного из плазмы, по сравнению с существующими в настоящее время в данной области техники способами, используемыми для производства терапевтических композиций IgG. В одном варианте реализации эти улучшенные выходы достигаются посредством осаждения иммуноглобулинов и AIP1 из исходного образца плазмы (называемого в настоящем документе также "пул Кона") в условиях низкого уровня рН, высокой концентрации спирта. Этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта приводит в результате к захвату большей части композиции иммуноглобулинов исходного пула Кона. По сравнению с существующими в настоящее время в данной области техники процессами производства иммуноглобулинов, способы, представленные в настоящем
документе, значительно уменьшают количество иммуноглобулина, которое терялось при предшествующем фракционировании плазмы.
Способы по изобретению уменьшают количество этапов осаждения белка, необходимых для выделения белков из человеческой плазмы при достаточно высокой чистоте для терапевтического введения, при этом одновременно увеличивают выход извлечения терапевтически важных белков крови, таких как иммуноглобулин G (IgG). В частности, указанные способы устраняют необходимость в начальном этапе осаждения с высоким уровнем рН, низкой концентрацией спирта, обычно называемым осаждением фракции I, который используется в производственных процессах, производных от схем фракционирования по Кону-Онкли, Кистлеру-Нитшманну и Дойч. Вместо этого, в способах, представленных в настоящем документе, используют начальный этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (также называемый в настоящем документе осаждением фракции I-IV-1), который распределяет основную часть содержимого IgG, IgA, IgM и альфа-1-антитрипсина (A1PI) плазмы в осадок, а основную часть альбумина в надосадочную жидкость. Затем IgG отделяют от IgA, IgM, и A1PI с помощью различных средств, что дает в результате высокий выход композиций IgG. По сравнению со способами, в которых используется этап осаждения фракции I, захват большей части IgG на начальном этапе осаждения фракции I-IV-1 повышает конечный выход производственного процесса по меньшей мере на 10-25%.
Э. Д. Кон впервые установил способ фракционирования плазмы с использованием этанола вместо солей в 1946 году. С этого времени осаждение этанолом стало способом выбора для крупномасштабного производства продуктов, получаемых из плазмы, таких как IgG и A1PI. Как правило, в этих производственных процессах используют ряд этапов этанольного фракционирования, предоставляя неочищенные фракции различных белков крови, получаемых из плазмы, которые в дальнейшем обогащают различными другими последующими процедурами/способами.
Процедуры по Кону были первоначально разработаны для получения альбумина с относительно высокой чистотой (95%) путем фракционного осаждения спиртом. Тем не менее, Онкли и др., Дойч и др. и Кистлер и Нитшманн быстро осознали, что в качестве исходного материала для очистки высоко обогащенных композиций иммуноглобулинов может быть использован конкретный белковый осадок (фракция II+III) из способа Кона номер 6. В целях достижения более высокой чистоты и безопасности, необходимой для внутривенного введения композиций IgG, в процессы производства IgG после этапов спиртового фракционирования были добавлены несколько этапов очистки и доочистки (например, адсорбция в универсальных или всех различных хроматографических способах, проточная фильтрация и т. д.).
Как правило, виды производства IgG в качестве исходного материала для последующего техноло-
гического процесса опираются либо на осадок фракции II+III по способу 6 Кона или на осадок А по Ки-
стлеру-Нитшманну. Обе фракции формируются в двухэтапном процессе, в котором: i.) белки, такие как
фибриноген и фактор XIII, удаляют посредством начального этапа осаждения (осаждение фракции I),
выполняемого при высоком уровне рН (7,2) с низкой концентрацией этанола (8-10% об./об.); и ii.) IgG
осаждают из надосадочной жидкости фракции I при уровне рН 6,8 с 20-25% концентрацией (об./об.) эта-
нола (фракция или при уровне рН 5,85 с 19% концентрацией этанола (об./об.) (осадок А), в то вре-
мя как альбумин и значительная часть A1PI остаются в надосадочной жидкости. Однако, использование
в качестве исходного материала для производства композиций IgG осадка фракции II+III или осадка А,
приводит к потере IgG на нескольких этапах процесса, как описано выше.
Чтобы преодолеть эти проблемы, авторы настоящего изобретения разработали начальный этап очистки, в котором иммуноглобулины и A1PI осаждаются совместно, чтобы обеспечить исходный материал, включающий почти все содержимое IgG и A1PI из источника плазмы, в то время как альбумин остается в надосадочной жидкости. Этот этап фракционирования по существу сворачивает этапы фракционного осаждения I, II+III и IV-1, как описано Онкли и др. (выше) до одной реакции осаждения, называемой в настоящем документе осаждением фракции I+II+III+IV-1 (или фракции I-IV-1).
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способ производства композиции иммуноглобулинов с высоким выходом для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения, с использованием в качестве исходного материала осадка фракции I-IV-1. В различных вариантах реализации способ дополнительно включает отделение альфа-1-антитрипсина (A1PI) в нерастворимую фракцию суспензии, образующейся при экстрагировании иммуноглобулина из осадка фракции I-IV-1.
Отделенная нерастворимая фракция затем может быть использована в качестве исходного материала для производства композиции A1PI, получаемой из плазмы.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способы производства терапевтической композиции белка, выделенного из пула плазмы. В некоторых вариантах реализации эти способы производства включают начальный этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (например, этанола), что увеличивает извлечение различных белков крови, по сравнению с традиционными способами. В некоторых вариантах реализации способы могут быть использованы для производства одной или более терапевтических композиций, которые содержат иммуноглобулин (например, IgG), альбумин, альфа-1-антитрипсин (A1PI), бутирилхолинэстеразу, фактор Н, или белок интер-альфа-ингибитор трипсина (IccI), выделенные из крови, плазмы человека, или их производное.
II. Определения.
Используемый в настоящем документе термин "лечение IgG" относится в целом к терапевтическому способу внутривенного, подкожного или внутримышечного введения композиции иммуноглобулинов IgG пациенту для лечения ряда состояний, таких, как иммунодефициты, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. Иммуноглобулины IgG, как правило, объединяют в пул и получают из плазмы. Могут быть использованы целые антитела или фрагменты. Иммуноглобулины IgG могут быть введены в состав для подкожного введения в более высоких концентрациях (например, больше чем 10%) или введены в состав для внутримышечного введения. Это особенно характерно для препаратов специфических IgG, которые готовят для специфических антигенов (например, фактора Rho D, токсина коклюша, токсина столбняка, токсина ботулизма, бешенства и т.д.) в более высоких титрах, по сравнению со средними.
Как используется в настоящем документе, термин "криообедненная плазма" относится к надоса-дочной жидкости, образовавшейся после удаления криоосадка, образовавшегося посредством оттаивания плазмы или пула плазмы при температурах, близких к замораживающим, например, при температуре ниже около 10°С, предпочтительно при температуре не выше, чем около 6°С. В контексте настоящего изобретения "плазма" может относиться взаимозаменяемо к извлеченной плазме (т. е. к плазме, которая была отделена от цельной крови ex vivo) или к источнику плазмы (т.е. к плазме, собранной с помощью плазмафереза). Криоосаждение обычно выполняют, например, посредством размораживания ранее замороженного пула плазмы, которая уже была исследована на безопасность и прошла анализ качества, хотя можно также использовать и свежую плазму. После полного оттаивания замороженной плазмы при низких температурах, выполняют отделение твердых криоосадков от жидкой надосадочной жидкости в холоде (например, при температуре < 6°С) при помощи центрифугирования и фильтрации.
Как используется в настоящем документе, "пул Кона" относится к исходному материалу, используемому для фракционирования образца плазмы или пула образцов плазмы. Пулы Кона могут включать одно или более из цельной плазмы, криообедненной плазмы и криообедненной плазмы, которая подвергалась этапу предварительной обработки. В некоторых вариантах реализации пул Кона представляет собой образец криообедненной плазмы, из которого на этапе предварительной обработки были удалены один или несколько факторов крови, например, посредством адсорбции на твердой фазе (например, гид-роксиде алюминия, тонкоизмельченном диоксиде кремния и т.д.), или на хроматографическом этапе (например, ионообменной или гепаринаффинной хроматографии). Из образца криообедненной плазмы до фракционирования могут быть выделены различные белки крови, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, активность, шунтирующая ингибиторы к фактору восемь (FEIBA), фактор IX-комплекс, фактор VII, комплексы протромбина и/или антитромбин III.
Используемый в настоящем документе термин "обогащенная композиция" относится к белковой композиции, выделенный из образца плазмы, в которой чистота белка выше, по сравнению с чистотой белка в исходном образце плазмы. В одном варианте реализации белок в обогащенной композиции является по меньшей мере на 25% более чистым, чем в исходном образце плазмы. В других вариантах реализации обогащенная композиция является по меньшей мере на 50, 75, 100%, 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно, 10-кратно или более чистой по сравнению с исходным образцом плазмы. Например, обогащенная композиция IgG, в которой 70% от общего белка составляет IgG, является 7-кратно обогащенной по сравнению с исходным образцом плазмы, в котором IgG составляет 10% от количества общего белка.
Используемый в настоящем документе термин "диффузное добавление" относится к средствам добавления вещества в жидкую систему делокализованным образом. Диффузное добавление может быть достигнуто, например, путем распыления или разбрызгивания жидкости (например, спирта, средства, модифицирующего уровень рН, растворителя, детергента или другой жидкости) в жидкую систему (например, фракцию плазмы), введения жидкости в систему во многих местах, введения жидкости в систему через канал распылителя, введения жидкости на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи них, или распределение химического вещества, находящегося в твердом состоянии, по расширенной области жидкой системы.
Используемый в настоящем документе термин "распыление" относится к средствам доставки жидкого вещества в систему, например, во время этапа спиртового осаждения, такого как этап осаждения фракции I-IV-1, в виде мелких капель или аэрозоля жидкого вещества. Распыление может быть достигнуто при помощи любого устройства, находящегося под давлением, такого как контейнер (например, флакон для распыления), который имеет распыляющую головку или сопло, и приводится в действие вручную или автоматически для создания мелкодисперсного аэрозоля из жидкости. Как правило, распыление выполняется в то время, когда система, получающая жидкое вещество, непрерывно перемешивается или иным образом смешивается, чтобы обеспечить быстрое и равномерное распределение жидкости в системе.
Используемый в настоящем документе термин "растворитель" включает в себя любое жидкое вещество, способное растворять или диспергировать одно или более других веществ. Растворитель может быть по природе неорганическим, таким как вода, или он может быть органической жидкостью, такой
как этанол, ацетон, метилацетат, этилацетат, гексан, петролейный эфир и т.д. Как используется в термине "обработка растворителем-детергентом", растворитель означает органический растворитель (например, три-н-бутилфосфат), который является частью смеси растворителя-детергента, используемой для инактивации в растворе вирусов с липидной оболочкой.
Используемый в настоящем документе термин "детергент" используется в данной заявке взаимозаменяемо с термином "сурфактант" или "поверхностно-активное вещество". Поверхностно-активные вещества, как правило, представляют собой органические соединения, которые являются амфифильными, т. е. содержащими как гидрофобные группы ("хвосты"), так и гидрофильные группы ("головы"), которые делают поверхностно-активные вещества растворимыми как в органических растворителях, так и в воде. Поверхностно-активное вещество может быть классифицировано по наличию в его "голове" формально заряженных групп. Неионное поверхностно-активное вещество не имеет заряженных групп в "голове", в то время как ионное поверхностно-активное вещество несет в своей "голове" результирующий заряд. Цвиттерионный сурфактант содержит "голову" с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры обычных поверхностно-активных веществ включают: анионные (на основе сульфатных, сульфонатных или карбоксилатных анионов): перфтороктаноат (ПФОА или ПФО), перфтороктансуль-фонат (ПФОС), додецилсульфат натрия (ДСН), лаурилсульфат аммония и другие алкилсульфатные соли, лауретсульфат натрия (также известный как этерифицированный лаурилсульфат натрия или ЭЛСН), ал-килбензолсульфонат; катионные (на основе четвертичных аммониевых катионов): цетилтриметиламмо-ния бромид (ЦТАБ) известный также как гексадецилтриметиламмония бромид и другие соли алкилтри-метиламмония, цетилпиридина хлорид (ЦПХ), полиэтоксилированный талловый амин (ПОЭА), бензал-кония хлорид (БАХ), бензэтония хлорид (БЗХ); длинноцепочечные жирные кислоты и их соли: в том числе каприлат, каприловая кислота, гептаноат, капроновая кислота, гептановая кислота, нановая кислота, декановая кислота и т.п.; цвиттерионные (амфотерные): додецилбетаин; кокамидопропилбетаин; ко-коамфоглицинат; неионные: алкил поли(этиленоксид), алкилфенол поли(этиленоксид), сополимеры по-ли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида) (коммерческое название полоксамеры или полоксамины), ал-килполиглюкозиды, включая октилглюкозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамид МЭА, кокамид ДЭА, полисорбаты (Твин 20, Твин 80 и т.д.), детергенты типа Тритон и оксид додецилдиметиламина.
Термин "терапевтически эффективное количество или доза" или "достаточное/эффективное количество или доза" означает дозу, вызывающую эффекты, для которых её вводят. Точная доза будет зависеть от цели лечения, и будет устанавливаться специалистом в данной области техники с использованием известных способов (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (тома 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999) и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20-e издание, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams &
Wilkins).
Используемые в настоящем документе термины "начальное осаждение при низком уровне рН, высокой концентрации спирта" и "осаждение фракции I-IV-1" взаимозаменяемо относятся к осаждению белков из пула Кона при конечной концентрации спирта (обычно этанола) от 20 до 30% (об./об.) и уровне рН от 5,0 до 6,0. Как правило, полученный в результате осадок фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 90% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона. В предпочтительном варианте реализации иммуноглобулины содержат иммуноглобулины IgG. В другом предпочтительном варианте реализации альфа-1-антитрипсин (A1PI) осаждают совместно с иммуноглобулинами при осаждении фракции I-IV-1.
III. Фракционирование плазмы.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способы фракционирования терапевтических белков из объединенной в пул плазмы с использованием начального этапа осаждения, в котором большая часть содержимого иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) исходной плазмы осаждается, а большая часть содержимого альбумина исходной плазмы сохраняется в надосадочной жидкости. Начиная с этого начального этапа осаждения, количество терапевтически важных белков крови может быть произведено с высокими выходами извлеченного продукта.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ фракционирования белков крови в образце плазмы, при этом способ включает осаждение иммуноглобулинов и A1PI из исходной плазмы в условиях низкого уровня рН, высокой концентрации спирта. Этот этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта приводит к образованию осадка (называемого также в настоящем документе осадком фракции I-IV-1) и надосадочной жидкости (называемой также в настоящем документе надосадочной жидкостью фракции I-IV-1).
Надосадочная жидкость фракции I-IV-1 будет содержать по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% содержимого альбумина исходной плазмы. Соответственно, эта надосадочная жидкость может быть использована в качестве исходного материала для производства фармацевтической композиции альбумина.
Осадок фракции I-IV-1 будет содержать по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере
95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% содержимого иммуноглобулинов исходной плазмы. В конкретном варианте реализации осадок фракции I-IV-1 содержит по меньшей мере 98%, предпочтительно 99% содержимого IgG исходной плазмы. Соответственно, этот осадок может быть использован в качестве исходного материала для производства фармацевтической композиции иммуноглобулинов. В одном варианте реализации осадок фракции I-IV-1 используют как исходный материал для производства фармацевтической композиции IgG. В еще одном варианте реализации осадок фракции I-IV-1 используют как исходный материал для производства фармацевтической композиции иммуноглобулинов, которая содержит более одного подтипа иммуноглобулинов.
Подобным образом, осадок фракции I-IV-1 будет содержать по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% содержимого A1PI исходной плазмы. Соответственно, этот осадок может быть использован в качестве исходного материала для производства фармацевтической композиции A1PI.
Осадок фракции I-IV-1 также будет содержать по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% содержимого фактора Н исходной плазмы. Соответственно, этот осадок может быть использован в качестве исходного материала для производства фармацевтической композиции фактора Н.
Осадок фракции I-IV-1 также будет содержать, по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% содержимого интер-альфа-ингибитора (IaIp) исходной плазмы. Соответственно, этот осадок может быть использован в качестве исходного материала для производства фармацевтической композиции IaIp.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способ отделения иммуноглобулинов от A1PI, обнаруживаемого в осадке фракции I-IV-1. В одном варианте реализации способ включает растворение иммуноглобулинов в суспензии осадка фракции I-IV-1, при этом сохраняя A1PI в нерастворимой части суспензии, а затем разделение растворимой и нерастворимой частей, например, путем фильтрации или центрифугирования. В одном варианте реализации разделению способствует обработка суспензии фракции I-IV-1 тонкоизмельченным диоксидом кремния перед разделением растворимой и нерастворимой частей. Без привязки к теории, диоксид кремния может связываться с A1PI, который сорастворяется с иммуноглобулинами, повышая количество A1PI, распределенного в нерастворимую часть суспензии.
Кроме того, известно, что при определенных условиях с частицами диоксида кремния связываются фактор Н и IaIp (см., публикации WO/2011/011753, PCT/US2011/45099, и PCT/US2011/038247; раскрытия которых прямо включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей). Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ отделения иммуноглобулинов от A1PI, фактора Н, и IaIp, обнаруживаемых в осадке фракции I-IV-1, при этом способ включает суспендирование осадка фракции I-IV-1 в воде или буфере с низкими значениями проводимости, достаточном для растворения иммуноглобулинов; обработку суспензии диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части, где растворимая часть содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть содержит A1PI, фактор Н и IaIp.
В одном варианте реализации способов, представленных выше, отделенная растворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 80% содержимого IgG образца исходной плазмы. В предпочтительном варианте реализации отделенная растворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 90% содержимого IgG образца исходной плазмы. В более предпочтительном варианте реализации отделенная растворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 95% содержимого IgG образца исходной плазмы. В других вариантах реализации растворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого IgG образца исходной плазмы.
В одном варианте реализации способов, представленных выше, отделенная нерастворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 70% содержимого A1PI образца исходной плазмы. В предпочтительном варианте реализации отделенная нерастворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 80% содержимого A1PI образца исходной плазмы. В более предпочтительном варианте реализации отделенная нерастворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 90% содержимого A1PI образца исходной плазмы. В более предпочтительном варианте реализации отделенная нерастворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 95% содержимого A1PI образца исходной плазмы. В других вариантах реализации отделенная нерастворимая часть суспензии фракции I-IV-1 включает в себя по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91%, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого A1PI образца исходной плазмы.
Белки крови, фракционированные с использованием начального этапа массового осаждения (например, осаждения фракции I-IV-1) могут быть дополнительно обогащены с помощью соответствующих процедур, таких как, например, осаждение (например, спиртовым фракционированием или фракциони
рованием полиэтиленгликолем), хроматографические способы (ионообменная хроматография, аффинная хроматография, иммуноаффинная хроматография и т.д.), фильтрация (ультрафильтрация/диафильтрация, нанофильтрация), ультрацентрифугирование, электрофоретическая подготовка и т.п.
A. Приготовление криообедненной плазмы.
Исходный материал, используемый для приготовления концентрированных композиций IgG, обычно состоит либо из восстановленной плазмы (т.е. плазмы, которая была отделена от цельной крови ex vivo) или из источника плазмы (т.е. плазмы, собранной с помощью плазмафереза). Процесс очистки обычно начинается с размораживания ранее замороженного пула плазмы, которая уже была исследована на безопасность и прошла анализ качества. Размораживание, как правило, проводят при температуре не выше 6°С. После полного оттаивания замороженной плазмы при низких температурах выполняют центрифугирование в холоде (например, при температуре <6°С), чтобы отделить твердые криоосадки от жидкой надосадочной жидкости. В качестве альтернативы, этап разделения может быть выполнен путем фильтрации, а не центрифугирования. Жидкую надосадочную жидкость (также называемую "криообед-ненная плазма", после удаления центрифугированием из свежеразмороженной плазмы нерастворимых в холоде белков) затем подвергают обработке на следующем этапе. В это время можно выполнить различные дополнительные этапы для выделения фактора активности, шунтирующей ингибиторы к фактору восемь (FEIBA), фактора IX-комплекса, фактора VII, антитромбина III, комплексов протромбина и т.д.
B. Первое событие осаждения - осаждение фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ фракционирования белков крови в образце плазмы, при этом способ включает осаждение иммуноглобулинов и A1PI из исходной плазмы на первом этапе осаждения в условиях низкого уровня рН, высокой концентрации спирта. Этот этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта приводит к образованию осадка (осадок фракции I-IV-1) и надосадочной жидкости (надосадочная жидкость фракции I-IV-1).
В одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют путем смешивания этанола с пулом исходной плазмы (пулом Кона) до конечной концентрации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 5,0 до 6,0. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±1% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,5. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,4. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,3. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,2. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,1. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5. В других вариантах реализации конечную концентрацию этанола и рН первого этапа осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1, табл. 2, табл. 3, табл. 4, табл. 5, табл. 6, табл. 7 и табл. 8. Таблица 1. Комбинации уровня рН и конечной концентрации этанола, пригодные для осаждения пула Кона при низком уровне рН, высокой концентрации спирта
129
167
205
243
281
6,0±0,2
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
130
Вар.
168
Вар.
206
Вар.
244
Вар.
282
5,0±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
131
Вар.
169
Вар.
207
Вар.
245
Вар.
283
5,1±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
132
Вар.
170
Вар.
208
Вар.
246
Вар.
284
5,2±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
133
Вар.
171
Вар.
209
Вар.
247
Вар.
285
5,3±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
134
Вар.
172
Вар.
210
Вар.
248
Вар.
286
5,4±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
135
Вар.
173
Вар.
211
Вар.
249
Вар.
287
5,5±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
136
Вар.
174
Вар.
212
Вар.
250
Вар.
288
5,6±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
Вар.
137
Вар.
175
Вар.
213
Вар.
251
Вар.
289
5,7±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
100
Вар.
138
Вар.
176
Вар.
214
Вар.
252
Вар.
290
5,8±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
101
Вар.
139
Вар.
177
Вар.
215
Вар.
253
Вар.
291
5,9±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
102
Вар.
140
Вар.
178
Вар.
216
Вар.
254
Вар.
292
6,0±0,1
Вар.
Вар.
Вар.
103
Вар.
141
Вар.
179
Вар.
217
Вар.
255
Вар.
293
Вар.
Вар.
Вар.
104
Вар.
142
Вар.
180
Вар.
218
Вар.
256
Вар.
294
5,1
Вар.
Вар.
Вар.
105
Вар.
143
Вар.
181
Вар.
219
Вар.
257
Вар.
295
5,2
Вар.
Вар.
Вар.
106
Вар.
144
Вар.
182
Вар.
220
Вар.
258
Вар.
296
5,3
Вар.
Вар.
Вар.
107
Вар.
145
Вар.
183
Вар.
221
Вар.
259
Вар.
297
5,4
Вар.
Вар.
Вар.
108
Вар.
146
Вар.
184
Вар.
222
Вар.
260
Вар.
298
5,5
Вар.
Вар.
Вар.
109
Вар.
147
Вар.
185
Вар.
223
Вар.
261
Вар.
299
5,6
Вар.
Вар.
Вар.
110
Вар.
148
Вар.
186
Вар.
224
Вар.
262
Вар.
300
5,7
Вар.
Вар.
Вар.
111
Вар.
149
Вар.
187
Вар.
225
Вар.
263
Вар.
301
5,8
Вар.
Вар.
Вар.
112
Вар.
150
Вар.
188
Вар.
226
Вар.
264
Вар.
302
5,9
Вар.
Вар.
Вар.
113
Вар.
151
Вар.
189
Вар.
227
Вар.
265
Вар.
303
Вар.
Вар.
Вар.
114
Вар.
152
Вар.
190
Вар.
228
Вар.
266
Вар.
304
Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ фракционирования белков крови в образце плазмы, при этом способ включает этапы: осаждение иммуноглобулинов и A1PI на первом этапе осаждения посредством добавления в пул Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; где первая надосадочная жидкость включает в себя по меньшей мере 75% содержимого альбумина пула Кона. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.).
В одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 90% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 99% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более конкретном варианте реализации содержимое иммуноглобулинов исходного пула Кона относится к содержимому IgG, IgA и IgM исходного пула Кона. В одном конкретном варианте реализации содержимое иммуноглобулинов исходного пула Кона относится к содержимому IgG исходного
пула Кона.
В одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 80% содержимого альфа-1-антитрипсина (A1PI) исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 90% содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения.
В одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 70% содержимого фактора Н исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 80% содержимого фактора Н исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 90% содержимого фактора Н исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого фактора Н исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%
или более содержимого фактора Н исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения.
В одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 70% содержимого интеральфа-ингибитора (IaIp) исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 80% содержимого IaIp исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 90% содержимого IaIp исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого IaIp исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%
или более содержимого IaIp исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения.
Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ фракционирования белков крови в пуле Кона, при этом способ включает этапы: осаждение иммуноглобулинов, A1PI, фактора Н и IaIp на первом этапе осаждения посредством добавления в пул Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; при этом первый осадок включает в себя i) по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 99% содержимого IgG исходного пула Кона, ii) по меньшей мере, 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 97% содержимого A1PI исходного пула Кона, iii) по меньшей мере, 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% содержимого фактора Н исходного пула Кона и iv) по меньшей мере, 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% содержимого IaIp исходного пула Кона, и при этом дополнительно первая надосадочная жидкость включает в себя по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% содержимого альбумина пула Кона. В одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют путем смешивания этанола с пулом исходной плазмы (пулом Кона) до конечной концентрации от 22 до 28% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 5,0 до 6,0. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±1% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,5. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,4. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,3. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,2. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,1. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5. В других вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН первого этапа осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7.
IV. Приготовление композиций иммуноглобулинов.
Обычно препараты иммуноглобулинов в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены из любых подходящих исходных материалов плазмы, например, восстановленной плазмы или источника плазмы. В типичном примере кровь или плазма собрана от здоровых доноров. Как правило, кровь собирают у того же вида животных, что и субъект, которому будут вводить препарат иммуноглобулинов (обычно называемых "гомологичными" иммуноглобулинами). Выделенная плазма или источник плазмы могут быть или могут не быть криоосажденными, чтобы предоставить криообедненную плазму.
Кроме того, плазма или криообедненная плазма могут быть также обработаны для того, чтобы удалить один или несколько факторов крови путем адсорбции, ионообменной хроматографии или другого хрома-тографического способа. Затем иммуноглобулины осаждают из исходного материала плазмы или крио-обедненной плазмы, называемого также "пулом Кона", в условиях низкого уровня рН, высокой концентрации спирта с образованием осадка фракции I-IV-1.
Иммуноглобулины из осадка фракции I-IV-1 могут быть дополнительно обогащены с помощью соответствующих процедур, таких как, например, осаждение (спиртовое фракционирование или фракционирование полиэтиленгликолем), хроматографические способы (например, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, иммуноаффинная хроматография и т.д.), фильтрация (ультрафильтра-ция/диафильтрация, нанофильтрация), ультрацентрифугирование, электрофоретическая подготовка и т.п. (См., например, публикации Conn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); патенты США под номерами 5122373 и 5177194; PCT/US2010/036470 и PCT/US2011/038247; раскрытия которых включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте для любых целей).
А. Первичный технологический процесс.
Среди других аспектов настоящее изобретение представляет способы фракционирования белков, находящихся в пуле плазме, путем выполнения начального этапа осаждения, в котором осаждается большая часть содержимого иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина исходной плазмы. Для того чтобы дополнительно повысить чистоту отдельных белков плазмы (например, IgG, A1PI, фактора Н, IaIp и т. д.), обнаруживаемых в осадке и надосадочной жидкости начального этапа осаждения, эти композиции могут быть дополнительно обогащены посредством фракционирования (например, при помощи спиртового осаждения, ПЭГ осаждения, высаливания и т.д.), хроматографии, фильтрации или другого способа. Хотя использование этих различных способов обогащения белков, получаемых из плазмы, может быть выполнено в любом порядке, в конкретном варианте реализации первый осадок и/или надоса-дочную жидкость сначала фракционируют (например, осаждением этанолом), а затем обогащают с использованием способов хроматографии и/или фильтрации. В контексте настоящего изобретения начальная реакция осаждения и последующее фракционирование совокупно называют этапами "первичного технологического процесса", в то время как этапы хроматографии и фильтрации совокупно называют этапами "вторичного технологического процесса".
1. Массовое осаждение иммуноглобулинов.
Как описано в настоящем документе, авторы данного изобретения открыли улучшенный способ фракционирования плазмы человека для очищения терапевтически полезных белков крови, таких как иммуноглобулины, альфа-1-антитрипсин (A1PI), фактор Н, белки интер-альфа-ингибиторы (IaIp), альбумин, фибриноген, и т.д. Этот способ включает начальный этап очистки, в котором осаждают большую часть содержимого иммуноглобулинов, A1PI, фактора Н, IaIp и фибриногена исходного пула Кона (т.е. крови, плазмы и/или предварительно обработанной плазмы), а большинство содержимого альбумина исходного пула Кона остается в надосадочной жидкости. Преимущественно, авторы данного изобретения разработали способ отделения иммуноглобулинов от A1PI, фактора Н и IaIp путем экстрагирования из начального осадка иммуноглобулинов, но не других белков. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что обработка суспензии начального осадка тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) улучшает удержание A1PI, фактора Н и IaIp в нерастворимой фракции. Без привязки к теории, авторы настоящего изобретения полагают, что при определенных условиях A1PI, фактор Н и IaIp, которые могут быть изначально экстрагированы из осадка, связываются с тонкоизмельченным диоксидом кремния, который затем удаляют с нерастворимой частью суспензии. Отделение полученной в результате надосадочной жидкости (т.е. растворимой фракции суспензии) предоставляет обогащенный раствор, содержащий большинство содержимого иммуноглобулинов исходной фракции Кона.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов из пула Кона, при этом способ включает этапы: соосаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на первом этапе осаждения с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; и извлечение растворимой фракции первой суспензии, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. Как правило, для осаждения иммуноглобулинов и A1PI могут использоваться любые химическое средства, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, спиртовое осаждение (например, с применением этанола или метанола), осаждение с помощью водорастворимых полимеров (например, ПЭГ или декстрана) и высаливание (например, с применением фосфата аммония, сульфата аммония, цитрата натрия и т.д.). В предпочтительном варианте реализации осаждение представляет собой спиртовое осаждение, предпочтительно осаждение этанолом. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют путем смешивания этанола с пулом Кона до конечной концентрации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 5,0 до 6,0. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.).
В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 2 5±1% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,5. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,4. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,3. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,2. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,1. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5. В других вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН первого этапа осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
Способы, представленные в настоящем документе, обеспечивают значительно более высокие выходы извлечения иммуноглобулинов в конечном обогащенном продукте благодаря осаждению большей части содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона в начальной реакции осаждения по сравнению с существующими в данной области техники процедурами очистки, которые основаны на начальных этапах осаждения с низкой концентрацией спирта (т.е. осаждении фракции I).
Соответственно, в одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 90% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 99% содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В одном конкретном варианте реализации содержимое иммуноглобулинов исходного пула Кона относится к содержимому IgG исходного пула Кона.
Как показано в примерах, представленных в настоящем документе, использование начального этапа осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (т. е. осаждение фракции I-IV-1) приводит к осаждению по меньшей мере 99% содержимого IgG исходного пула Кона. Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5, 0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надо-садочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение IgG из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.).
Как свидетельствуют данные, представленные в табл. 15 и таб. 31, более 97% содержимого альфа-1-антитрипсина (A1PI) пула Кона также осаждается на начальном этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирова-ние первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; и извлечение растворимой фракции первой суспензии, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
Кроме того, было установлено, что более 90% содержимого альбумина пула Кон не осаждается на начальном этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (табл. 33), и, таким образом, может быть извлечено из надосадочной жидкости. Соответственно в одном варианте реализа
ции настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; и извлечение растворимой фракции первой суспензии, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG. 2. Экстрагирование и отделение иммуноглобулинов.
По сравнению с осадком фракции II+III по Кону или осадком А по Кистлеру-Нитшманну, начальный осадок, образованный при помощи способов, представленных в настоящем документе, содержит значительно более высокие уровни белков, не являющихся иммуноглобулинами, в том числе A1PI и фибриногена. Например, как продемонстрированно в табл. 30, около 100% содержимого фибриногена исходного пула Кона соосаждается с иммуноглобулинами в начальной реакции осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Это является отличием от схем очистки по Кону-Онкли и Ки-стлеру-Нитшманну, в которых основная часть фибриногена удаляется на начальном этапе осаждения при низкой концентрации спирта (осаждение фракции I). Подобным образом, как продемонстрированно в табл. 15 и 31, более 97% содержимого альфа-1-антитрипсина (A1PI) исходного пула Кона со-осаждается с иммуноглобулинами в начальной реакции осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. В отличие от этого, большая часть A1PI не со-осаждается с иммуноглобулинами в схемах очистки по Кону-Онкли и Кистлеру-Нитшманну. Скорее, A1PI обнаруживается в надосадочной жидкости фракции II+III или надосадочной жидкости А.
Соответственно, для предоставления композиций иммуноглобулинов фармацевтического качества, из композиции иммуноглобулинов необходимо удалить примеси, такие как A1PI и фибриноген, присутствующие в начальном осадке. Это может быть достигнуто, например, путем дальнейшего фракционирования первого осадка (например, с помощью дифференциального осаждения с использованием спирта, неионных гидрофильных полимеров или высаливания), хроматографических способов или способов фильтрации.
В одном варианте реализации первый осадок суспендируют в воде для инъекций (ВДИ) или в буфере с низкой ионной силой, который подходит для экстрагирования иммуноглобулинов из осадка. В некоторых вариантах реализации суспензию затем обрабатывают тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2), и растворимую часть суспензии, содержащую иммуноглобулины, отделяют от нерастворимой части суспензии, содержащей большую часть A1PI и фибриногена.
Подходящие растворы для экстрагирования первого осадка, как правило, имеют уровень рН от 4,0 до 5,5. В некоторых вариантах реализации раствор будет иметь уровень рН в диапазоне от 4,5 до 5,0, В других вариантах реализации раствор для экстрагирования будет иметь уровень рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,7±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,8±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,9±0,1. Как правило, эти требования к уровню рН могут быть выполнены с помощью буферного вещества, выбранного, например, из ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящие концентрации буфера обычно находятся в диапазоне от 5 до 100 мМ или от 10 до 50 мМ, или 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ буферного вещества.
Экстрагирующий буфер предпочтительно будет иметь проводимость от 0,5 до 2,0 мСм/см. Например, в некоторых вариантах реализации проводимость экстрагирующего буфера будет составлять 0,5±0,1 мСм/см или 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1, 1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1, 1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 или 2,0±0,1 мСм/см. Специалисту в данной области техники известно как создавать экстрагирующие буферы, имеющие соответствующую проводимость. В одном конкретном варианте реализации экстрагирующий буфер содержит 5 мМ одноосновного натрия фосфата и 5 мМ ацетата при уровне рН 4,8±0,2 и проводимости от 0,7 до 0,9 мСм/см.
В одном варианте реализации тонкоизмельченный диоксид кремния смешивают с суспензией фракции I-IV-1 перед фильтрацией. В одном варианте реализации этот этап предварительной обработки
включает добавление тонкоизмельченных частиц диоксида кремния (например, коллоидного диоксида кремния; Аэросил(r)) с последующим инкубационным периодом от 40 до 80 мин, в течение которого суспензию постоянно перемешивают. В некоторых вариантах реализации инкубационный период будет находиться в диапазоне от около 50 мин до около 70 мин, или около 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или более минут. Как правило, обработку будут осуществлять при температуре в диапазоне от 0 до 10°С или от 2°С до 8°С. В некоторых вариантах реализации обработка может быть выполнена при температуре около 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С. В конкретном варианте реализации обработку выполняют при температуре в диапазоне от 2 до 10°С. В предпочтительном варианте реализации обработку выполняют при температуре в диапазоне от 5 до 10°С.
В одном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации от 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В другом варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации от 30 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 80 г/кг осадка фракции I-IV-1. В некоторых вариантах реализации коллоидный диоксид кремния может быть добавлен в концентрации около 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 или около 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,
95 или 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В одном конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния (например, Аэросил 380 или аналогичный) добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±20 г/кг осадка фракции I-IV-1. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1. Перемешивание происходит при температуре от 2 до 8°С в течение по меньшей мере от 50 до 70 мин.
В некоторых вариантах реализации SiO2 добавляют в композицию иммуноглобулинов в концентрации от 0,01 г/г общего белка до 10 г/г общего белка. В другом варианте реализации SiO2 добавляют в композицию иммуноглобулинов в концентрации от 0,01 г/г общего белка до 5 г/г общего белка. В другом варианте реализации SiO2 добавляют в композицию иммуноглобулинов в концентрации от 0,02 г/г общего белка до 4 г/г общего белка. В одном варианте реализации SiO2 добавляют в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере 0,1 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,2 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,25 г на грамм общего белка. В других конкретных вариантах реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 1 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 2 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 2,5 г на грамм общего белка. В других конкретных вариантах реализации тон-коизмельченный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,01 г/г
общего белка или по меньшей мере 0,02 г, 0,03 г, 0,04 г, 0,05 г, 0,06 г, 0,07 г, 0,08 г, 0,09 г, 0,1 г, 0,2 г, 0,3
г, 0,4 г, 0,5 г, 0,6 г, 0,7 г, 0,8 г, 0,9 г, 1,0 г, 1,5 г, 2,0 г, 2,5 г, 3,0 г, 3,5 г, 4,0 г, 4,5 г, 5,0 г, 5,5 г, 6,0 г, 6,5 г, 7,0 г, 7,5 г, 8,0 г, 8,5 г, 9,0 г, 9,5 г, 10,0 г или более на грамм общего белка.
Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95% до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
Кроме того, было установлено, что более 90% содержимого альбумина пула Кон не осаждается на начальном этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (табл. 33), и, таким образом, может быть извлечено из надосадочной жидкости. Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на
первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20% до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонко-измельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н, и IaIp, и где дополнительно от 80% до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, находящийся в растворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG. 3. Фракционирование.
В одном варианте реализации иммуноглобулины, извлеченные из растворимой части первой суспензии (пастообразной суспензии I-IV-1), дополнительно обогащают путем фракционирования. Как правило, может быть использован любой способ фракционирования (например, спиртовое или полимерное осаждение, высаливание и т. д.). В предпочтительном варианте реализации иммуноглобулины дополнительно обогащают путем фракционирования растворимой части первой суспензии посредством осаждения этанолом. В одном варианте реализации иммуноглобулины обогащают путем добавления этанола к растворимой части первой суспензии в конечной концентрации и при уровне рН, подходящих для осаждения иммуноглобулинов, в то время как по меньшей мере одна примесь не осаждается. В другом варианте реализации иммуноглобулины обогащают путем добавления этанола к растворимой части первой суспензии в конечной концентрации и при уровне рН, подходящих для осаждения по меньшей мере одной примеси, в то время как иммуноглобулины не осаждаются.
Дополнительное фракционирование материала, извлеченного на начальном этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта, является необязательным. В некоторых вариантах реализации композиция иммуноглобулинов, извлеченная на начальном этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта, может быть дополнительно обогащена с использованием одного или более различных этапов вторичного технологического процесса, описанных в настоящем документе. В других вариантах реализации композиция, извлеченная на начальном этапе осаждение при низком уровне рН, высокой концентрации спирта, может быть подвергнута дополнительной обработке посредством использования одного или более дополнительных этапов осаждения. В некоторых вариантах реализации дополнительный этап осаждения иммуноглобулинов может быть использован для концентрирования композиции иммуноглобулинов, подготовки иммуноглобулина для хранения, и/или подготовки композиции иммуноглобулинов для транспортировки.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов из пула Кона, при этом способ включает этапы: со-осаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на первом этапе осаждения с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление A1PI из суспензии; осаждение иммуноглобулинов из первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины, и второй надосадоч-ной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из первой суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В иллюстративном варианте реализации второй этап осаждения выполняют путем смешивания с растворимой частью второй суспензии (например, фильтратом или надосадочной жидкостью суспензии, образованными после фильтрации или центрифугирования) этанола в конечной концентрации от 22 до 28% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 6,5 до 7,5. В одном варианте реализации этанол подмешива
ют до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В другом варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25±1% (об./об.). В другом варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,5. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,4. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,3. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 1,0±0,2. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,1. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0. В конкретном варианте реализации второй этап осаждения выполняют с использованием конечной концентрации этанола 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3.
В предпочтительном варианте реализации первую суспензию или ее растворимую фракцию перед выполнением второго этапа осаждения обрабатывают детергентом. В одном варианте реализации первую суспензию или ее растворимую фракцию перед выполнением второго этапа осаждения дополнительно обрабатывают цитратом. В конкретном варианте реализации к первой суспензии или ее растворимой фракции добавляют полисорбат-80, и композицию инкубируют в течение по меньшей мере 30 минут. В другом конкретном варианте реализации к первой суспензии или ее растворимой фракции дополнительно добавляют дигидрат цитрата натрия, и композицию инкубируют в течение по меньшей мере 30 дополнительных минут. В одном варианте реализации полисорбат-80 добавляют в конечной концентрации около 0,2% (мас./об.). В одном варианте реализации дигидрат цитрата натрия затем смешивают с раствором в конечной концентрации около 8 г/л. В конкретном варианте реализации инкубацию проводят при температуре в диапазоне от приблизительно 2 до 8°С при непрерывном перемешивании.
В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG из пула плазмы Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочнои жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG из пула плазмы Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания с первой суспензией этанола в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление A1PI из суспензии; извлечение растворимой фракции первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогаща
ют. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление A1PI из суспензии; извлечение растворимой фракции первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания с первой суспензией этанола в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99% до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В другом варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой на-досадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.17. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В предпочтительном варианте реализации от 90% до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В другом варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой на-досадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации альбумин, находящийся в первой надоса-дочной жидкости, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 12166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В предпочтительном варианте реализации от 90 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, находящийся в растворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте
реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3, с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение иммуноглобулинов из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, находящийся в растворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном варианте реализации иммуноглобулины извлекают из второго осадка посредством суспен-дирования осадка с холодным экстрагирующим буфером. Например, второй осадок суспендируют в соотношении 1 часть осадка к 2-15 частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости. В
предпочтительном варианте реализации второй осадок суспендируют в соотношении 1 часть осадка к 4-5 частям, предпочтительно 3,5 частям ВДИ. В одном варианте реализации этап суспендирования выполняют при температуре в диапазоне от 0 до 8°С. В одном варианте реализации конечный уровень рН раствора доводят до значений от 4,5 до 5,6, предпочтительно до 5,2±0,2. В одном варианте реализации эту корректировку рН выполняют с помощью уксусной кислоты. В одном варианте реализации проводимость суспензии повышают до 2,5-6,0 мСм/см, чтобы повысить растворимость иммуноглобулинов. В одном варианте реализации проводимость повышают посредством добавления хлорид натрия.
Подходящие растворы для экстрагирования второго осадка включают ВДИ и буферы с низкими значениями проводимости. В одном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 10 мСм/см. В других вариантах реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 мСм/см. В предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 6 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 4 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 2 мСм/см.
В одном варианте реализации растворимую часть суспензии, содержащую иммуноглобулины, отделяют от нерастворимой части. В одном варианте реализации это выполняют путем фильтрации суспензии через глубинный фильтр с номинальным размером пор от 0,1 мкм до 0,4 мкм. В одном варианте реализации номинальный размер пор глубинного фильтра равен 0,2 мкм (например, фильтр Cuno VR06 или аналогичный). В одном варианте реализации для того, чтобы извлечь дополнительный иммуноглобулин, после фильтрации фильтр промывают ВДИ или подходящим буфером и после промывания добавляют их к фильтрату. В предпочтительном варианте реализации промывку фильтра после фильтрации выполняют
с использованием раствора хлорида натрия с проводимостью в диапазоне от около 2,5 до около 6,0 мСм/см. В другом варианте реализации для извлечения растворимой части вторую суспензию центрифугируют.
В. Вторичный технологический процесс.
Фракции иммуноглобулинов, полученные после фракционирования с использованием начального этапа осаждения, в котором осаждаются иммуноглобулины и альфа-1-антитрипсин (A1PI), но не альбумин, могут быть дополнительно обогащены в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами, включая, без ограничения: хроматографию (например, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия (ХГВ), гидро-ксиапатитную хроматографию (ГАХ), аффинную хроматографию с белком А, иммуно-аффинную хроматографию, гель-хроматографию, и т.д.); фильтрацию (например, ультрафильтрацию и/или диафильтра-ция); и один или несколько этапов сокращения вирусов (например, нанофильтрацию, обработку растворителем и детергентом, УФ-облучение, термообработку, инкубацию при низком уровне рН и т.д.).
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов из пула Кона, включающий начальный этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта и по меньшей мере один этап вторичного технологического процесса (например, хроматографию). В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает второй этап осаждения, который выполняют перед по меньшей мере одним этапом вторичного технологического процесса (например, этап осаждения PptG). Второе осаждение является необязательным, поскольку суспензия осадка, полученного при начальном низком уровне рН, высокой концентрации спирта, может быть прямо использована для последующей очистки.
В одном варианте реализации иммуноглобулины, находящиеся в композиции, полученной из плазмы, приготовленной с использованием начального этапа осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта, дополнительно обогащают посредством выполнения по меньшей мере одного этапа хроматографии. В одном варианте реализации этап хроматографии выбирают из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ), гид-роксиапатитной хроматографии (ГАХ), аффинной хроматографии с белком А, иммуно-аффинной хроматографии, гель-хроматографии. В конкретном варианте реализации иммуноглобулины обогащают путем выполнения анионообменной хроматографии. В другом варианте реализации иммуноглобулины дополнительно обогащают путем выполнения катионообменной хроматографии. В конкретном варианте реализации иммуноглобулины дополнительно обогащают путем выполнения как катионообменной, так и анионообменной хроматографии.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, связывание иммуноглобулинов с катионообменной смолой; элюирование иммуноглобулинов с катионо-обменной смолы с получением катионообменного элюата; контактирование катионообменного элюата с анионообменной смолой; и извлечение иммуноглобулинов, которые не связываются со смолой, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный на этапе анионообменной хроматографии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В другом варианте реализации от 80 до 100%, предпочтительно от 90 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере один этап сокращения/инактивации вирусов. В предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере два этапа сокращения/инактивации вирусов. В более предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере три этапа сокращения/инактивации вирусов. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона
этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение иммуноглобулинов из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего иммуноглобулины, и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; извлечение иммуноглобулинов из второго осадка; связывание иммуноглобулинов с катионообменной смолой;
элюирование иммуноглобулинов с катионообменной смолы с получением катионообменного элюа-та; контактирование катионообменного элюата с анионообменной смолой; и извлечение иммуноглобулинов, которые не связываются со смолой, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный на этапе анионообменной хроматографии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В другом варианте реализации от 80 до 100%, предпочтительно от 90 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надоса-дочной жидкости. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере один этап сокращения/инактивации вирусов. В предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере два этапа сокращения/инактивации вирусов. В более предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере три этапа сокращения/инактивации вирусов. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В одном конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта; отделение осажденных иммуноглобулинов и A1PI; обогащение композиции иммуноглобулинов путем выполнения катионообменной хроматографии; и дополнительное обогащение композиции иммуноглобулинов путем выполнения анионообменной хроматографии. В одном варианте реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В одном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере один этап сокращения/инактивации вирусов. В предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере два этапа сокращения/инактивации вирусов. В более предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере три этапа сокращения/инактивации вирусов. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта; отделение осажденных иммуноглобулинов и A1PI; осаждение отделенных иммуноглобулинов на втором этапе осаждения; обогащение композиции иммуноглобулинов путем выполнения катионообменной хроматографии; и дополнительное обогащение композиции иммуноглобулинов путем выполнения анионо-обменной хроматографии. В одном варианте реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В одном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере один этап сокращения/инактивации вирусов. В предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере два этапа сокращения/инактивации вирусов. В более предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает по меньшей мере три этапа сокращения/инактивации вирусов. В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG.
В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулинов, при этом способ включает этапы: осаждение иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта; отделение осажденных иммуноглобулинов и A1PI; осаждение отделенных иммуноглобулинов на втором этапе осаждения; обработку композиции иммуноглобулинов растворителем и детергентом для инактива
ции вирусов; обогащение композиции иммуноглобулинов путем выполнения катионообменной хроматографии; дополнительное обогащение композиции иммуноглобулинов путем выполнения анионообмен-ной хроматографии; и нанофильтрация композиции иммуноглобулинов для удаления вирусов. В одном варианте реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В одном варианте реализации способ дополнительно включает концентрирование композиции иммуноглобулинов путем ультрафильтрации/диафильтрации до конечной концентрации белков от 5 до 25 г/л. В конкретном варианте реализации конечная концентрация обогащенной композиции иммуноглобулинов составляет 5±1% (мас./об.). В другом конкретном варианте реализации конечная концентрация обогащенной композиции иммуноглобулинов составляет 10±1% (мас./об.). В другом конкретном варианте реализации конечная концентрация обогащенной композиции иммуноглобулинов составляет 15±1% (мас./об.). В другом конкретном варианте реализации конечная концентрация обогащенной композиции иммуноглобулинов составляет 20±2% (мас./об.). В другом конкретном варианте реализации конечная концентрация обогащенной композиции иммуноглобулинов составляет 25±2% (мас./об.). В одном варианте реализации обогащенная композиция иммуноглобулинов представляет собой композицию IgG. С. Иллюстративное обогащение IgG из осадка фракции I-IV-1.
1. Экстрагирование осадка фракции I-IV-1.
Для того чтобы растворить содержимое IgG осадка фракции I-IV-1, используют холодный экстрагирующий буфер для ресуспендирования осадка фракционирования II+III в типичном соотношении 1 часть осадка к 15 частям экстрагирующего буфера. Можно использовать и другие подходящие соотношения для ресуспендирования, например, от 1:8 до 1:30, или от 1:10 до 1:20, или от 1:12 до 1:18, или от 1:13 до 1:17, или от 1:14 до 1:16. В некоторых вариантах реализации соотношение для ресуспендирова-
ния может составлять 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23,
1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 или выше.
Подходящие растворы для экстрагирования первого осадка, как правило, имеют уровень рН от 4,0 до 5,5. В некоторых вариантах реализации раствор будет иметь уровень рН в диапазоне от 4,5 до 5,0, В других вариантах реализации раствор для экстрагирования будет иметь уровень рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,7±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,8±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,9±0,1. Как правило, эти требования к уровню рН могут быть выполнены с помощью буферного вещества, выбранного, например, из ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящие концентрации буфера обычно находятся в диапазоне от 5 до 100 мМ или от 10 до 50 мМ, или 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ буферного вещества.
Экстрагирующий буфер предпочтительно будет иметь проводимость от 0,5 мСм/см до 2,0 мСм/см. Например, в некоторых вариантах реализации проводимость экстрагирующего буфера будет составлять
0,5±0,1 мСм/см или около 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1,
1,5±0,1, 1,6±0,1, 1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 или 2,0±0,1 мСм/см. Специалисту в данной области техники известно как создавать экстрагирующие буферы, имеющие соответствующую проводимость.
В иллюстративном варианте реализации осадок фракции I-IV-1 экстрагируют при соотношении пасты к буферу 1:15 с использованием экстрагирующего буфера, который содержит 5 мМ одноосновного натрия фосфата и 5 мМ ацетата, уровень рН которого доводят до 4,8±0,2 уксусной кислотой. В одном варианте реализации значения рН раствора поддерживают на уровне рН 4,8± 0,3 в течение всей продолжительности процесса экстрагирования. В конкретном варианте реализации значения рН раствора поддерживают на уровне рН 4,8±0,2 в течение всей продолжительности процесса экстрагирования.
Как правило, экстрагирование выполняют при температуре в диапазоне от 0 до 10°С или в диапазоне от 2 до 8°С. В некоторых вариантах реализации экстрагирование можно выполнять при температуре 0±1°С, 1±1°С, 2±1°С, 3±1°С, 4±1°С, 5±1°С, 6±1°С, 7±1°С, 8±1°С, 9±1°С или 10±1°С. В конкретном варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре в диапазоне от 2 до 10°С. Обычно, процесс экстрагирования будет продолжаться в течение периода от 60 до 300 мин, или в диапазоне от 120 до 240 мин, или в диапазоне от 150 до 210 мин, при непрерывном перемешивании композиции. В некоторых вариантах реализации процесс экстрагирования будет продолжаться в течение около 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 мин или более. В предпочтительном варианте реализации процесс экстрагирования будет продолжаться в течение по меньшей мере 160 минут при непрерывном перемешивании.
2. Обработка диоксидом кремния (SiO2).
По сравнению с очисткой по Кону-Онкли и Кистлеру-Нитшманну, начальные осадки, содержащие иммуноглобулин, образованные посредством способов, представленных в настоящем документе, содержат значительно более высокие уровни белков, не являющихся иммуноглобулинами, включая A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp. Известно, что фактор Н и IaIp могут связываться, а затем элюироваться из
тонкоизмельченного диоксида кремния (см., публикации WO 2011/011753 и PCT/US2011/045099, раскрытия обеих из которых прямо включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей). Преимущественно, было установлено, что включение этапа обработки SiO2 после экстрагирования осадка фракции I-IV-1 и перед фильтрацией суспензии фракции I-IV-1, помогает отделить A1PI, фибриноген, фактор Н, и IaIp в нерастворимый осадок на фильтре, образующийся при фильтрации суспензии фракции I-IV-1.
Соответственно, в одном варианте реализации тонкоизмельченный диоксид кремния смешивают с суспензией фракции I-IV-1 перед фильтрацией. В одном варианте реализации этот этап предварительной обработки включает добавление тонкоизмельченных частиц диоксида кремния (например, коллоидного диоксида кремния; Аэросил!!!) с последующим инкубационным периодом от 40 до 80 мин, в течение которого суспензию постоянно перемешивают. В некоторых вариантах реализации инкубационный период будет находиться в диапазоне от около 50 мин до около 70 мин, или около 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или более минут. Как правило, обработку будут осуществлять при температуре в диапазоне от 0 до 10°С, или от 2 до 8°С. В некоторых вариантах реализации обработка может быть выполнена при температуре около 0°С, 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или 10°С. В конкретном варианте реализации обработку выполняют при температуре в диапазоне от 2 до 10°С. В предпочтительном варианте реализации обработку выполняют при температуре в диапазоне от 5 до 10°С.
В некоторых вариантах реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации в диапазоне от 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В некоторых вариантах реализации коллоидный диоксид кремния может быть добавлен в концентрации около 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 или около 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В одном конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния (например, Аэросил 380 или аналогичный) добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1. Перемешивание происходит при температуре от 2 до 8°С в течение по меньшей мере от 50 до 70 мин.
В некоторых вариантах реализации SiO2 добавляют в композицию IgG в концентрации от 0,01 г/г общего белка до 10 г/г общего белка. В другом варианте реализации SiO2 добавляют в композицию IgG в концентрации от 0,01 г/г общего белка до 5 г/г общего белка. В другом варианте реализации SiO2 добавляют в композицию IgG в концентрации от 0,02 г/г общего белка до 4 г/г общего белка. В одном варианте реализации SiO2 добавляют в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере 0,1 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,2 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,25 г на грамм общего белка. В других конкретных вариантах реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 1 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 2 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 2,5 г на грамм общего белка. В других конкретных вариантах реализации тонкоизмельченный диоксид кремния добавляют в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,01 г/г общего белка или по меньшей мере 0,02 г, 0,03 г, 0,04 г, 0,05 г, 0,06 г, 0,07 г, 0,08 г, 0,09 г, 0,1 г, 0,2 г, 0,3 г, 0,4 г, 0,5 г, 0,6 г, 0,7 г, 0,8 г, 0,9 г, 1,0 г, 1,5 г, 2,0 г, 2,5 г, 3,0 г, 3,5 г, 4,0 г, 4,5 г, 5,0 г, 5,5 г, 6,0 г, 6,5 г, 7,0 г, 7,5 г, 8,0 г, 8,5 г, 9,0 г, 9,5 г, 10,0 г или более на грамм общего белка.
3. Фильтрация суспензии фракции I-IV-1.
Для того чтобы отделить растворимую часть суспензии фракции I-IV-1, содержащую иммуноглобулины, от нерастворимой части, содержащей фибриноген, A1PI, фактор Н и IaIp, суспензию фильтруют, обычно с использованием глубинной фильтрации. Глубинные фильтры, которые могут использоваться в способах, представленных в настоящем документе, включают металлические, стеклянные, керамические, органические (например, диатомитовые) глубинные фильтры и т.п. Примеры подходящих фильтров включают, без ограничения, фильтры Cuno 50SA, Cuno 90SA и Cuno VR06 (3М). В качестве альтернативы, этап разделения может быть выполнен путем центрифугирования, а не фильтрации.
В некоторых вариантах реализации для облегчения глубинной фильтрации после обработки диоксидом кремния к суспензии добавляют вспомогательный фильтрующий материал, например Celpure C300 (Advanced Minerals) или Hyflo-Super-Cel (World Minerals). Вспомогательный фильтрующий материал добавляют в конечной концентрации от 0,1 кг/кг осадка фракции I-IV-1 до 1,0 кг/кг осадка фракции I-IV-1, или от 0,2 кг/кг осадка фракции I-IV-1 до 0,8 кг/кг осадка фракции I-IV-1, или от 0,3 кг/кг осадка фракции I-IV-1 до 0,7 кг/кг осадка фракции I-IV-1. В других вариантах реализации вспомогательный фильтрующий материал может быть добавлен в конечной концентрации от 0,1 кг/кг осадка фракции I-IV-1 до 0,7 кг/кг осадка фракции I-IV-1, или от 0,2 кг/кг осадка фракции I-IV-1 до 0,6 кг/кг осадка фракции I-IV-1, или от около 0,3 кг/кг осадка фракции I-IV-1 до около 0,05 кг/кг осадка фракции I-IV-1. В некоторых вариантах реализации вспомогательный фильтрующий материал будут добавлять в конечной концентрации около 0,01 кг/кг осадка фракции I-IV-1 или около 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08,
0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг осадка фракции I-IV-1.
Для того чтобы минимизировать потери иммуноглобулинов во время фильтрации, необходимо промыть образовавшийся осадок на фильтре по меньшей мере одним мертвым объемом, предпочтительно по меньшей мере двумя мертвыми объемами, более предпочтительно по меньшей мере тремя мертвыми объемами буфера суспензии или аналогичного ему буфера, который не является достаточным для растворения белков, не являющихся иммуноглобулинами, находящихся в осадке на фильтре. В одном варианте реализации фильтр и осадок на фильтре после фильтрации промывают по меньшей мере 3,0 мертвыми объемами буфера. В другом варианте реализации фильтр и осадок на фильтре после фильтрации промывают по меньшей мере 3,6 мертвыми объемами буфера. В другом варианте реализации фильтр и осадок на фильтре после фильтрации промывают по меньшей мере 50% объема профильтрованной суспензии, используя подходящий буфер. В другом варианте реализации фильтр и осадок на фильтре после фильтрации промывают по меньшей мере 75% объема профильтрованной суспензии, используя подходящий буфер. В другом варианте реализации фильтр и осадок на фильтре после фильтрации промывают по меньшей мере 100% объема профильтрованной суспензии, используя подходящий буфер. Обычно, для промывания фильтра и осадка на фильтре необходимо использовать не более 200% объема профильтрованной суспензии.
В конкретном варианте реализации промывочный буфер представляет собой буфер для растворения, содержащий от 90 до 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. В одном варианте реализации уровень рН послепромывочного экстрагирующего буфера находится в диапазоне от около 4,6 до около 5,3. В предпочтительном варианте реализации уровень рН послепромывочного буфера находится в диапазоне от около 4,7 до около 5,2. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН после-промывочного буфера находится в диапазоне от около 4,8 до около 5,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН послепромывочного буфера находится в диапазоне от около 4,9 до около
5,0.
4. Обработка детергентом.
Затем образец подвергают обработке детергентом для удаления дополнительных примесей из фильтрата фракции I-IV-1. Способы обработки детергентом фракций, получаемых из плазмы, хорошо известны в данной области техники. Обычно, может быть использована любая стандартная обработка неионным детергентом в сочетании со способами, представленными в настоящем документе. Например, ниже приведен иллюстративный протокол обработки детергентом.
Полисорбат-80 добавляют к фильтрату фракции I-IV-1 в конечной концентрации около 0,2% (масс./об.) при перемешивании, и образец инкубируют в течение по меньшей мере 30 мин при температуре в диапазоне от около 2 до 8°С. Затем с раствором смешивают дигидрат цитрата натрия в конечной концентрации около 8 г/л, и образец инкубируют в течение дополнительных 30 минут при непрерывном перемешивании при температуре в диапазоне от около 2 до 8°С.
В некоторых вариантах реализации может быть использован любой подходящий неионный детергент. Примеры подходящих неионных детергентов включают, без ограничения, октилглюкозид, дигито-нин, С12Е8, луброл, тритон Х-100, нонидет Р-40, твин-20 (т.е. полисорбат-20), твин-80 (т.е. полисорбат-80), алкил поли(этиленоксид), детергент "Бридж", алкилфенол поли(этиленоксид), полоксамер, октилг-ликозид, децилмальтозид и т. п.
В одном варианте реализации улучшение процесса реализуется путем добавления реагентов детергентов (например, полисорбата-80 и дигидрата цитрата натрия) посредством диффузного добавления. Диффузное добавление этих реагентов минимизирует локальные колебания концентрации спирта и уровня рН по сравнению с добавлением в одной точке введения. В одном варианте реализации диффузное добавление включает распыление, а не струйное добавление. В другом варианте реализации диффузное добавление включает добавление реагента через множество каналов. В одном варианте реализации диффузное добавление включает добавление реагента через канал распылителя. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один канал, который используется для введения реагента в систему, расположен на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи них. В других вариантах реализации реагенты детергенты могут быть добавлены к модифицированному фильтрату фракции II+III в виде твердых веществ во время перемешивания образца, чтобы обеспечить быстрое распределение добавок. В некоторых вариантах реализации предпочтительно добавлять твердые реагенты путем раструшивания твердых веществ над делокализованной площадью поверхности фильтрата так, чтобы не происходило локальное чрезмерное увеличение концентрации, как, например, при струйном добавлении.
5. Второе событие осаждения - осаждение G.
Для того чтобы удалить остаточные примеси, второе осаждение выполняют при уровне рН от 6,5 до 7,5 с использованием 25% спирта. Коротко, экстрагирование фракции I-IV-1 доводят до уровня рН от 6,5 до 7,5, предпочтительно от 6,8 до 7,2, более предпочтительно от 6,9 до 7,1, наиболее предпочтительно 7,0 с помощью соответствующего раствора, модифицирующего уровень рН (например, гидроксида натрия или уксусной кислоты). Затем к раствору добавляют холодный спирт до конечной концентрации около 25% (об./об.), и смесь инкубируют при перемешивании при температуре в диапазоне от около -6°С до около -10°С в течение по меньшей мере 1 ч с образованием второго осадка (т.е. осадка G). В одном вари
анте реализации смесь инкубируют в течение по меньшей мере 2 ч или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более часов. В предпочтительном варианте реализации смесь инкубируют в течение по меньшей мере 2 ч. В более предпочтительном варианте реализации смесь инкубируют в течение по меньшей мере 4 ч. В еще более предпочтительном варианте реализации смесь инкубируют в течение по меньшей мере 8 ч.
В некоторых вариантах реализации более высокий процент IgG может быть осажден из экстракта I-IV-1 при помощи корректирования уровня рН раствора во время и/или после добавления спирта в реакцию осаждения. Подобным образом, в связи с колебаниями уровня рН раствора во время процесса осаждения, рН реакционной смеси можно контролировать и/или корректировать на протяжении всего периода инкубации. В другом варианте реализации улучшение выхода IgG достигается путем добавления осаждающего спирта и/или раствора, используемого для корректировки уровня рН смеси, с помощью диффузного добавления спирта или средства, модифицирующего уровень рН. Диффузное добавление этих реагентов минимизирует локальные колебания концентрации спирта и уровня рН по сравнению с добавлением в одной точке введения. В одном варианте реализации диффузное добавление включает распыление, а не струйное добавление. В другом варианте реализации диффузное добавление включает добавление реагента через множество каналов. В одном варианте реализации диффузное добавление включает добавление реагента через канал распылителя. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один канал, который используется для введения реагента в систему, расположен на турбинной мешалке или другом дисперсионном элементе или вблизи них.
6. Суспендирование и фильтрация осадка G (Ppt G).
Для ресуспендирования PptG с целью растворения содержимого IgG осадка G используют холодный экстрагирующий буфер. Коротко, осадок G растворяют в соотношении 1 часть осадка к 2-5 частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости. В предпочтительном варианте реализации осадок G растворяют в соотношении 1 часть осадка к 1-15 частям, предпочтительно, 3,5 частям ВДИ. Этап суспендирования, как правило, выполняют при температуре в диапазоне от 0 до 8°С для достижения значения ЕП280-320 от 40 до 95. Конечный уровень рН раствора, который перемешивают в течение по меньшей мере 2 ч, затем доводят до значений от 4,5 до 5,6, предпочтительно до 5,2±0,2. В одном варианте реализации эту корректировку рН выполняют с помощью уксусной кислоты. Для увеличения растворимости IgG, проводимость суспензии повышают до значений в диапазоне от 2,5 до 6,0 мСм/см. В одном варианте реализации проводимость повышают посредством добавления хлорид натрия.
Подходящие растворы для экстрагирования осадка G включают ВДИ и буферы с низкими значениями проводимости. В одном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 10 мСм/см. В других вариантах реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 мСм/см. В предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 6 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 4 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 2 мСм/см.
Для того чтобы удалить любые нерастворенные частицы, раствор суспендированного PptG затем фильтруют при помощи соответствующего глубинного фильтра с номинальным размером пор от 0,1 мкм до 0,4 мкм. В одном варианте реализации номинальный размер пор глубинного фильтра составляет около 0,2 мкм (например, фильтр Cuno VR06 или аналогичный). В другом варианте реализации для извлечения очищенной надосадочной жидкости раствор суспендированного PptG центрифугируют. После фильтрации фильтр промывают ВДИ или подходящим буфером для извлечения дополнительного IgG, и после промывания добавляют их к фильтрату. В предпочтительном варианте реализации промывку фильтра после фильтрации выполняют с использованием раствора хлорида натрия с проводимостью в диапазоне от около 2,5 до около 6,0 мСм/см.
7. Обработка растворителем и детергентом (Р/Д).
Для того чтобы инактивировать различные вирусные примеси, которые могут присутствовать в получаемых из плазмы продуктах, очищенный фильтрат PptG затем подвергают обработке растворителем детергентом (Р/Д). Способы обработки детергентом получаемых из плазмы фракций хорошо известны в данной области техники (обзор см., Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42). Обычно, в сочетании со способами, представленными в настоящем документе, может быть использована любая стандартная Р/Д обработка. Например, ниже приведен иллюстративный протокол Р/Д обработки.
В очищенный фильтрат PptG добавляют тритон Х-100, твин-20, и три(н-бутил)фосфат (ТНБФ) в конечной концентрации около 1,0, 0,3, и 0,3%, соответственно. Затем смесь перемешивают при температуре в диапазоне от 18 до 25°С в течение по меньшей мере одного часа.
В одном варианте реализации Р/Д реагенты (например, тритон Х-100, твин-20 и ТНБФ) добавляют посредством диффузного добавления. В конкретном варианте реализации Р/Д реагенты добавляют путем распыления, а не струйного добавления. В другом варианте реализации реагенты детергенты добавляют к очищенному фильтрату PptG в виде твердых веществ во время его перемешивания, чтобы обеспечить быстрое распределение компонентов Р/Д. В некоторых вариантах реализации предпочтительно добав
лять твердые реагенты путем раструшивания твердых веществ над делокализованной площадью поверхности фильтрата так, чтобы не происходило локальное чрезмерное увеличение концентрации, как, например, при струйном добавлении.
8. Ионообменная хроматография.
Для дополнительной очистки и концентрации IgG может быть использована катионообменная и/или анионообменная хроматография. Способы очистки и концентрации IgG с помощью ионообменной хроматографии хорошо известны в данной области техники. Например, в патенте США № 5886154 описан способ, в котором осадок фракции II+III экстрагируют при низком уровне рН (в диапазоне от около 3,8 до 4,5) с последующим осаждением IgG с помощью каприловой кислоты, и в конце с осуществлением двух этапов анионообменной хроматографии. В патенте США № 6069236 описана схема хроматогра-фической очистки IgG, которая вообще не основана на спиртовом осаждении. В РСТ публикации № WO 2005/073252 описан способ очистки IgG, включающий экстрагирование осадка фракции II+III, обработку каприловой кислотой, обработку ПЭГ и единственный этап анионообменной хроматографии. В патенте США № 7186410 описан способ очистки IgG, включающий экстрагирование осадка фракции I+II+III или фракции II с последующим единственным этапом анионообменной хроматографии, который выполняется при щелочном рН. В патенте США № 7553938 описан способ, включающий экстрагирование осадка фракции I+II+III или фракции II+III, обработку каприлатом и один или два этапа анионообменной хроматографии. В патенте США № 6093324 описан способ очистки, включающий использование макропористой анионообменной смолы, функционирующей при уровне рН в диапазоне от около 6,0 до около 6,6. В патенте США № 6835379 описан способ очистки, основанный на катионообменной хроматографии при отсутствии спиртового фракционирования. Раскрытия приведенных выше публикаций включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте для любых целей.
В одном варианте реализации фильтрат PptG, обработанный Р/Д, может быть подвергнут и катио-нообменной хроматографии и анионообменной хроматографии. Например, в одном варианте реализации фильтрат PptG, обработанный Р/Д, контактирует с катионообменной смолой в подходящих условиях, чтобы IgG связался со смолой. Реагенты Р/Д могут быть смыты с адсорбированного IgG, который затем элюируют из смолы с помощью подходящего элюирующего буфера. Таким образом, этап катионообмен-ной хроматографии может быть использован для удаления из препарата реагентов Р/Д, концентрирования раствора, содержащего IgG, и/или удаления примесей из композиции.
В одном варианте реализации IgG элюируют из катионообменной смолы с помощью элюирующего буфера, имеющего рН в диапазоне от около 8,0 до 9,0, В некоторых вариантах реализации уровень рН элюирующего буфера может иметь значения рН в диапазоне от около 8,2 до около 8,8 или в диапазоне от около 8,4 до около 8,6, или уровень рН около 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. В предпочтительном варианте реализации уровень рН элюирующего буфера составляет около 8,5± 0, 1.
Подобным образом, для уменьшения примесей в композиции IgG, может быть использована анио-нообменная хроматография. В одном варианте реализации анионообменную хроматографию проводят в условиях раствора, в котором с анионообменной смолой связываются одна или несколько примесей, но не IgG. В конкретном варианте реализации анионообменную хроматографию выполняют в слегка кислых условиях, т.е. при уровне рН в диапазоне от 5,0 до 7,0, предпочтительно в диапазоне от 5,5 до 6,5, при низкой ионной силе, подходящей для связывания с анионообменной смолой примесей, но не IgG.
В конкретном варианте реализации элюат из катионообменной колонки может быть доведен до более низкого уровня рН, например, от около 5,5 до около 6,5 и разбавлен подходящим буфером так, чтобы проводимость раствора уменьшилась. В некоторых вариантах реализации уровень рН элюата из катион-ного обмена может быть доведен до значений рН в диапазоне от около 5,7 до около 6,7 или в диапазоне от около 5,9 до около 6,5, или рН около 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6 или 6,7. В предпочтительном варианте реализации уровень рН элюата доводят до значений рН около 6,4±0,1. Элюат затем нагружают на анионообменную колонку, которая связывает несколько обнаруживаемых в препарате примесей. Элюат из колонки, содержащий фракцию IgG, собирают во время нагрузки и промывания колонки. В некоторых вариантах реализации этапы ионообменной хроматографии по настоящему изобретению могут быть выполнены в режиме колонки, режиме ванны, или в комбинации этих двух режимов. В одном варианте реализации раствор, который используют для корректировки уровня рН композиции IgG перед анионообменной хроматографией, добавляют посредством диффузного добавления. В конкретном варианте реализации раствор добавляют путем распыления, а не струйного добавления.
9. Нанофильтрация.
В целях снижения вирусной нагрузки композиции IgG, представленной в настоящем документе, композиция, может подвергаться нанофильтрации с помощью подходящего устройства для нанофильт-рации. В некоторых вариантах реализации устройство для нанофильтрации будет иметь средний размер пор в диапазоне от около 15 нм до около 200 нм. Примеры нанофильтров, подходящих для этой цели включают, без ограничения, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N и 75N (Planova). В конкретном варианте реализации нанофильтр может иметь средний размер пор в диапазоне от около 15 нм до около 72 нм, или в диапазоне от около 19 нм и около 35 нм,
или составляющий около 15 нм, 19 нм, 35 нм или 72 нм. В предпочтительном варианте реализации нано-фильтр будет иметь средний размер пор около 35 нм, как, например в фильтре Asahi PLANOVA 35N или аналогичном. В конкретном варианте реализации композицию IgG, извлеченную на этапе анионного обмена, подвергают нанофильтрации с использованием нанофильтра, имеющего размер пор в диапазоне от 30 нм до 40 нм, предпочтительно 35±2 нм. В другом предпочтительном варианте реализации нанофильтр будет иметь средний размер пор около 19 или 20 нм, как, например, в фильтре Asahi PLANOVA 20N (19±2 нм) или аналогичном. В конкретном варианте реализации композицию IgG, извлеченную на этапе анионного обмена, подвергают нанофильтрации с использованием нанофильтра, имеющего размер пор в диапазоне от 15 нм до 25 нм, предпочтительно 19±2 нм. 10. Ультра-/диафильтрация (УФ/ДФ).
Ультрафильтрация/диафильтрация может выполняться для концентрирования композиции IgG на любом этапе в процессе очистки. В одном варианте реализации нанофильтрат концентрируют при помощи УФ/ДФ. В одном варианте реализации нанофильтрат могут концентрировать при помощи ультрафильтрации до концентрации белков в диапазоне от около 2% до около 10% (мас./об.). В некоторых вариантах реализации ультрафильтрацию осуществляют в кассете с открытым экраном канала и мембраной ультрафильтрации с обрезанием номинальной молекулярной массы (NMWCO) меньше, чем или около 100 кДа, или меньше или около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или меньше кДа. В предпочтительном варианте реализации мембрана для ультрафильтрации имеет NMWCO не более 50 кДа.
В одном варианте реализации мембрана с открытыми каналами используется со специально разработанными послепромывкой и формулировкой ближе к концу производственного процесса, чтобы в результате получить композиции IgG с повышенной приблизительно в два раза концентрацией белка (200 мг/мл) по сравнению с существующими в настоящее время ВВИГ (например, GAMMAGARD(r) LIQUID, 10% IgG), без влияния на выход и стабильность хранения. С большинством из коммерчески доступных мембран для ультрафильтрации нельзя достичь концентрации IgG 200 мг/мл без значительных потерь белка. Эти мембраны рано блокируются и, следовательно, трудно достичь адекватной последующей промывки. Поэтому необходимо использовать конфигурации мембран с открытыми каналами. Даже с мембранами с открытыми каналами для того, чтобы получить необходимую концентрацию без значительной потери белка (менее 2% потери), необходимо использовать специально разработанную процедуру последующей промывки. Еще более удивительным является тот факт, что концентрация белка выше 200 мг/мл не уменьшает емкость инактивации вирусов этапа хранения при низком рН.
После завершения этапа ультрафильтрации концентрат может быть дополнительно концентрирован с помощью диафильтрации для подготовки раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введения. В некоторых вариантах реализации раствор для диафильтрации может содержать стабилизирующее и/или буферное вещество. В предпочтительном варианте реализации стабилизирующее и буферное вещество представляет собой глицин в соответствующей концентрации, например, в диапазоне от около 0,20 М до около 0,30 М или в диапазоне от около 0,22 М до около 0,28 М, или в диапазоне от около 0,24 М до около 0,26 М, или в концентрации 0,20±0,01 М, 0,21±0,01 М, 0,22±0,01 М, 0,23±0,01 М,
0,24±0,01 М, 0,25±0,01 М, 0,26±0,01 М, 0,27±0,01 М, 0,28±0,01 М, 0,29±0,01 М или 0,3±0,01 М. В предпочтительном варианте реализации буфер для диафильтрации содержит 0,25±0,01 М глицина.
Как правило, минимальный объем обмена для диафильтрации по меньшей мере приблизительно 3-кратно превышает исходный объем концентрата или по меньшей мере приблизительно 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-кратно или более превышает исходный объем концентрата. Раствор IgG может быть концентрирован до конечной концентрации белка в диапазоне от около 5% до около 25% (мас./об.), или в диапазоне от около 6% до около 18% (мас./об.), или в диапазоне от около 7% до около 16% (мас./об.), или в диапазоне от около 8% до около 14% (мас./об.), или в диапазоне от около 9% до около 12%, или до конечной концентрации около 5% или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% или выше. В одном варианте реализации конечная концентрация белка, составляющая по меньшей мере около 23% достигается без добавления к концентрированному раствору послепромывочной фракции. В другом варианте реализации конечная концентрация белка, составляющая по меньшей мере около 24% достигается без добавления к концентрированному раствору послепромывочной фракции. В другом варианте реализации конечная концентрация белка, составляющая по меньшей мере около 24% достигается без добавления к концентрированному раствору послепромывочной фракции. В одном варианте реализации уровень рН раствора после диафильтрации будет составлять от 4,6 до 5,1.
В иллюстративном варианте реализации уровень рН композиции IgG перед ультрафильтрацией доводят до около 4,5. Раствор концентрируют до концентрации белка 5±2% мас./об. при помощи ультрафильтрации. Мембрана для УФ обладает обрезанием номинальной молекулярной массы (NMWCO) 50000 Да или менее (например, мембрана из полиэфирсульфона Millipore Pellicon). Затем концентрат диафильтруют против десяти объемов 0,25 М раствора глицина, рН 4,5±0,2. В течение всего процесса ультра-диафильтрации раствор поддерживают при температуре в диапазоне от около 2 до 8°С. После диафильтрации раствор концентрируют до концентрации белка, составляющей по меньшей мере 11% (мас./об.).
11. Композиция.
После завершения этапа диафильтрации, концентрацию белка раствора с помощью буфера для диафильтрации доводят до конечной концентрации в диапазоне от около 5% до около 20% (мас./об.), или в диапазоне от около 6 до около 18% (мас./об.), или в диапазоне от около 7 до около 16% (мас./об.), или в диапазоне от около 8% до около 14% (мас./об.), или в диапазоне от около 9% до около 12%, или до конечной концентрации около 5%, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25%. В одном варианте реализации конечная концентрация белка раствора находится в диапазоне от около 9% до около 11%, более предпочтительно около 10%.
Сформулированный основной объем раствора дополнительно стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр с абсолютным размером пор не более чем около 0,22 мкм, например около 0,2 мкм. Затем раствор в асептических условиях разливают в конечные контейнеры для соответствующего укупо-ривания, при этом производят отбор образцов для исследования.
В одном варианте реализации концентрацию композиции IgG дополнительно регулируют до уровня 10,2 ± 0,2% (мас./об.) при помощи буфера для диафильтрации. В другом варианте реализации концентрацию композиции IgG регулируют до уровня 15±1% (мас./об.). В другом варианте реализации концентрацию композиции IgG регулируют до уровня 20±1% (мас./об.). В другом варианте реализации концентрацию композиции IgG регулируют до уровня 25±1% (мас./об.). При необходимости уровень рН доводят до значений от около 4,4 до около 4,9. Наконец, раствор подвергают стерильной фильтрации и инкубируют в течение трех недель при температуре равной или составляющей около 30°С.
D. Иммуноглобулин G (IgG).
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулина G (IgG) из пула Кона, при этом способ включает этапы: со-осаждение IgG и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на первом этапе осаждения с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; и извлечение растворимой фракции первой суспензии, содержащей IgG, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. Как правило, для осаждения иммуноглобулинов и A1PI могут использоваться любые химическое средства, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, спиртовое осаждение (например, с применением этанола или метанола), осаждение с помощью водорастворимых полимеров (например, ПЭГ или декстрана) и высаливание (например, с применением фосфата аммония, сульфата аммония, цитрата натрия и т. д.). В предпочтительном варианте реализации осаждение представляет собой спиртовое осаждение, предпочтительно осаждение этанолом.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулина G (IgG) посредством осаждения IgG из криообедненной плазмы на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение IgG из криообедненной плазмы на первом этапе осаждения посредством добавления к криообедненной плазме этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение IgG из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают.
В одном варианте реализации способ включает этапы: осаждение IgG из криообедненной плазмы на первом этапе осаждения посредством добавления к криообедненной плазме этанола до конечной концентрации и уровня рН, выбранных из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение IgG из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают.
В одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют путем смешивания этанола с пулом Кона до конечной концентрации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 5,0 до 6,0. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 2 5±1% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,5. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,4. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,3. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,2. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,1. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5. В других вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН первого этапа осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7.
Способы, представленные в настоящем документе, обеспечивают значительно более высокие выходы извлечения IgG в конечном обогащенном продукте благодаря осаждению большей части содержимого иммуноглобулинов исходного пула Кона в начальной реакции осаждения по сравнению с существующими в данной области техники процедурами очистки, которые основаны на начальных этапах осаждения с низкой концентрацией спирта (т.е. осаждении фракции I).
Соответственно, в одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 90% содержимого IgG исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого IgG исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 99% содержимого IgG исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого IgG исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения.
Как показано в примерах, представленных в настоящем документе, использование начального этапа осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (т.е. осаждение фракции I-IV-1) приводит к осаждению по меньшей мере 99% содержимого IgG исходного пула Кона. Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение IgG из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию иммуноглобулинов. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; и извлечение растворимой фракции первой суспензии, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 12166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; и извлечение растворимой фракции первой суспензии, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7.
Для обеспечения композиций IgG фармацевтического качества, из композиции иммуноглобулинов необходимо удалить примеси, такие как A1PI и фибриноген, присутствующие в начальном осадке. Это может быть достигнуто, например, путем дальнейшего фракционирования первого осадка (например, с помощью дифференциального осаждения с использованием спирта, неионных гидрофильных полимеров или высаливания), хроматографических способов или способов фильтрации.
В одном варианте реализации первый осадок суспендируют в воде для инъекций (ВДИ) или в буфере с низкой ионной силой, который подходит для экстрагирования IgG из осадка, затем суспензию обрабатывают тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2), и растворимую часть суспензии, содержащую
IgG, отделяют от нерастворимой части суспензии, содержащей большую часть A1PI и фибриногена.
Подходящие растворы для экстрагирования первого осадка, как правило, имеют уровень рН от 4,0 до 5,5. В некоторых вариантах реализации раствор будет иметь уровень рН в диапазоне от 4,5 до 5,0, В других вариантах реализации раствор для экстрагирования будет иметь уровень рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,7±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,8±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,9±0,1. Как правило, эти требования к уровню рН могут быть выполнены с помощью буферного вещества, выбранного, например, из ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящие концентрации буфера обычно находятся в диапазоне от 5 до 100 мМ или от 10 до 50 мМ, или 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ буферного вещества.
Экстрагирующий буфер предпочтительно будет иметь проводимость от 0,5 до 2,0 мСм/см. Например, в некоторых вариантах реализации проводимость экстрагирующего буфера будет составлять 0,5±0,1
мСм/см или 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1,
1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 или 2,0±0,1 мСм/см. Специалисту в данной области техники известно как создавать экстрагирующие буферы, имеющие соответствующую проводимость. В одном конкретном варианте реализации экстрагирующий буфер содержит 5 мМ одноосновного натрия фосфата и 5 мМ ацетата при уровне рН 4,8±0,2 и проводимости от 0,7 до 0,9 мСм/см.
В одном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют перед разделением (например, фильтрацией или центрифугированием) в концентрации от 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В другом варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации от 30 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 80 г/кг осадка фракции I-IV-1. В некоторых вариантах реализации коллоидный диоксид кремния может быть добавлен в концентрации около 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 или около 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В одном конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния (например, Аэросил 380 или аналогичный) добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±20 г/кг осадка фракции I-IV-1. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1. Перемешивание происходит при температуре от 2 до 8°С в течение по меньшей мере от 50 до 70 мин.
Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит IgG, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит IgG, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н, и IaIp, и где дополнительно от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, находящийся в растворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся
в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации IgG, извлеченный из растворимой части первой суспензии дополнительно обогащают посредством фракционирования. Как правило, может быть использован любой способ фракционирования (например, спиртовое или полимерное осаждение, высаливание и т. д.). В предпочтительном варианте реализации IgG дополнительно обогащают путем фракционирования растворимой части первой суспензии посредством осаждения этанолом. В одном варианте реализации IgG обогащают путем добавления этанола к растворимой части первой суспензии в конечной концентрации и при уровне рН, подходящих для осаждения IgG, в то время как по меньшей мере одна примесь не осаждается. В другом варианте реализации IgG обогащают путем добавления этанола к растворимой части первой суспензии в конечной концентрации и при уровне рН, подходящих для осаждения по меньшей мере одной примеси, в то время как IgG не осаждается.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG из пула Кона, при этом способ включает этапы: соосаждение IgG и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на первом этапе осаждения с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление A1PI из суспензии; осаждение IgG из первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего IgG, и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из первой суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7.
В иллюстративном варианте реализации второй этап осаждения выполняют путем смешивания с растворимой частью второй суспензии (например, фильтратом или надосадочной жидкостью суспензии, образованными после фильтрации или центрифугирования) этанола в конечной концентрации от 22% до 28% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 6,5 до 7,5. В одном варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В другом варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25±1% (об./об.). В другом варианте реализации этанол подмешивают до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,5. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,4. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,3. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,2. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0±0,1. В другом варианте реализации второй этап осаждения выполняют при уровне рН 7,0. В конкретном варианте реализации второй этап осаждения выполняют с использованием конечной концентрации этанола 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3.
В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG из пула плазмы Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; осаждение IgG из первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7.
В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG из пула плазмы Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости;
суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; осаждение IgG из первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания с первой суспензией этанола в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надо-садочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 12166, перечисленных в табл. 1-7.
В одном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20% до 30% при уровне рН от 5, 0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление A1PI из суспензии; извлечение растворимой фракции первой суспензии; осаждение IgG из первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 12166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения.
В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление A1PI из суспензии; извлечение растворимой фракции первой суспензии; осаждение IgG из первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания с первой суспензией этанола в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения.
В другом варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой на-досадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение IgG из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В предпочтительном варианте реализации от 90 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости.
В другом варианте реализации способ включает этапы: осаждение от 99 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой на-досадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; удаление из суспензии A1PI; извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение IgG из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой
суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В одном варианте реализации A1PI, отделенный от первой суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В предпочтительном варианте реализации от 90 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит IgG, a нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение IgG из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит IgG, a нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, извлечение растворимой части первой суспензии; осаждение IgG из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3 с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит IgG, а нерастворимая часть суспензии
содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp; осаждение IgG из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции IgG, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого IgG и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит IgG, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp; осаждение IgG из растворимой части первой суспензии на втором этапе осаждения путем смешивания этанола с растворимой частью первой суспензии в конечной концентрации от 25±3% (об./об.) при уровне рН 7,0±0,3, с образованием второго осадка, содержащего IgG и второй надосадочной жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь; и извлечение IgG из второго осадка, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию IgG. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации IgG, извлеченный из второго осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого IgG пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на первом этапе осаждения, выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации IgG извлекают из второго осадка посредством суспендирования осадка с холодным экстрагирующим буфером. Например, второй осадок суспендируют в соотношении 1 часть осадка к 2-5 частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости. В предпочтительном варианте реализации второй осадок суспендируют в соотношении 1 часть осадка к 4-5 частям, предпочтительно 3,5 частям ВДИ. В одном варианте реализации этап суспендирования выполняют при температуре в диапазоне от 0 до 8°С. В одном варианте реализации конечный уровень рН раствора доводят до значений от 4,8 до 5,6, предпочтительно до 5,2±0,2. В одном варианте реализации эту корректировку рН выполняют с помощью уксусной кислоты. В одном варианте реализации проводимость суспензии повышают до 2,5-6,0 мСм/см, чтобы повысить растворимость IgG. В одном варианте реализации проводимость повышают посредством добавления хлорид натрия.
Подходящие растворы для экстрагирования второго осадка включают ВДИ и буферы с низкими значениями проводимости. В одном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 10 мСм/см. В других вариантах реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 мСм/см. В предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 6 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 4 мСм/см. В другом предпочтительном варианте
реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 2 мСм/см.
В одном варианте реализации растворимую часть суспензии, содержащую IgG, отделяют от нерастворимой части. В одном варианте реализации это выполняют путем фильтрации суспензии через глубинный фильтр с номинальным размером пор от 0,1 мкм до 0,4 мкм. В одном варианте реализации номинальный размер пор глубинного фильтра равен 0,2 мкм (например, фильтр Cuno VR06 или аналогичный). В одном варианте реализации для того, чтобы извлечь дополнительный IgG, после фильтрации фильтр промывают ВДИ или подходящим буфером и после промывания добавляют их к фильтрату. В предпочтительном варианте реализации промывку фильтра после фильтрации выполняют с использованием раствора хлорида натрия с проводимостью в диапазоне от около 2,5 до около 6,0 мСм/см. В другом варианте реализации для извлечения растворимой части вторую суспензию центрифугируют.
В одном аспекте настоящего изобретения предоставленные способы получения обогащенной композиции IgG дополнительно включают очистку по меньшей мере одного дополнительного фактора крови из того же пула Кона. В одном варианте реализации способы дополнительно включают очистку по меньшей мере двух дополнительных белков из того же пула Кона. В другом варианте реализации способы дополнительно включают очистку по меньшей мере трех дополнительных белков из того же пула Кона. В других вариантах реализации способы дополнительно включают очистку по меньшей мере четырех, пяти, шести или более дополнительных белков из того же пула Кона. Примеры белков крови, которые могут быть совместно очищены из того же самого пула Кона, что и IgG, включают, без ограничения, альбумин, альфа-1-антитрипсин (A1PI), фактор Н, белки интер-альфа-ингибиторы (IaIp), протром-биновые комплексы, фактор VII (FVII), фактор VIII (FVIII), антитромбин III (ATIII), фибриноген, бути-рилхолинэстеразу и другие.
В одном варианте реализации из того же пула Кона, что и IgG, дополнительно очищают альфа-1-антитрипсин (A1PI). В конкретном варианте реализации A1PI очищают из нерастворимой фракции первой суспензии.
В другом варианте реализации из того же пула Кона, что и IgG, дополнительно очищают фибриноген. В конкретном варианте реализации фибриноген очищают из нерастворимой фракции первой суспензии. В другом конкретном варианте реализации A1PI и фибриноген очищают из нерастворимой фракции первой суспензии.
В другом варианте реализации из того же пула Кона, что и IgG дополнительно очищают фактор Н. В конкретном варианте реализации фактор Н очищают из нерастворимой фракции первой суспензии. В другом конкретном варианте реализации A1PI и фактор Н очищают из нерастворимой фракции первой суспензии.
В другом варианте реализации из того же пула Кона, что и IgG, дополнительно очищают белки ин-тер-альфа-ингибиторы (IaIp). В конкретном варианте реализации IaIp очищают из нерастворимой фракции первой суспензии. В другом конкретном варианте реализации A1PI и IaIp очищают из нерастворимой фракции первой суспензии.
В другом варианте реализации из того же пула Кона, что и IgG, дополнительно очищают альбумин. В конкретном варианте реализации альбумин очищают из образованной первой надосадочной жидкости. В конкретном варианте реализации альбумин очищают из образованной первой надосадочной жидкости, в то время как по меньшей мере один дополнительный фактор крови очищают из нерастворимой части образованной первой суспензии.
В одном варианте реализации иммуноглобулины, извлеченные на этапе начального осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта, дополнительно обогащают согласно последующему фракционированию по Кистлеру-Нитшманну и Дойч и др. Например, извлеченная композиция иммуноглобулинов может быть подвергнута этапу, похожему на осаждение В по Кистлеру-Нитшманну или на осаждение Р-глобулина по Дойч и др. Условия, используемые на этих этапах, приводят к осаждению а- и Р-глобулинов, в то время как иммуноглобулин G остается в надосадочной жидкости.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции иммуноглобулина G (IgG), включающий этапы (i) соосаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на начальном осаждении при низком уровне рН, высокой концентрации спирта; (ii) извлечение иммуноглобулинов из осадка; (iii) осаждение по меньшей мере одного белка, не являющегося гамма-глобулином, из композиции иммуноглобулинов, извлеченных из первого осадка; и (iv) извлечение надосадочной жидкости на втором этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации указанные способы могут дополнительно включать дополнительные этапы осаждения (например, осаждение осадка G), этап анионного и/или катионного обмена, один или более этапов ульт-рафильтрации/диафильтрации и один или более этапов сокращения или инактивации вирусов (например, обработка Р/Д, нанофильтрация, инкубация при низком уровне рН и т.д.).
V. Приготовление композиций альфа-1-антитрипсина (A1PI).
Современные способы производства белков крови из донорской плазмы являются производными ранней работы, выполненной в 1940-е и 1950-е годы. Поскольку эта работа была сфокусирована главным образом на очистке альбумина и гамма-иммуноглобулинов (IgG), разработанные схемы фракционирова
ния не были оптимизированы для извлечения дополнительных белков крови, которые становятся все более и более терапевтически важными. Например, использование начального осаждения плазмы при высоком уровне рН, низкой концентрации спирта (например, осаждение фракции I) приводит в результате к частичной потере фактора Н, IaIp и, в некоторой степени, иммуноглобулинов в осадке фракции I. Кроме того, отделение иммуноглобулинов и A1PI, которое достигается последовательными этапами осаждения (например, осаждением фракции или осаждением А) является неполным, при этом происходит потеря иммуноглобулинов в надосадочной жидкости в связи с неполным осаждением, a A1PI теряется в осадке в связи с частичным осаждением. Соответственно, необходимы обновленные способы фракционирования, которые обеспечивают более высокие выходы множества белков крови.
Настоящее изобретение представляет способы, которые удовлетворяют этим требованиям за счет использования начального этапа осаждения, на котором фракционируют иммуноглобулины, A1PI и другие белки крови в начальном осадке, а альбумин в начальной надосадочной жидкости. В предпочтительном варианте реализации начальное осаждение выполняют в условиях низкого уровня рН, высокой концентрации спирта.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способ производства альфа-1-антитрипсина (A1PI) из объединенной в пул плазмы с помощью начального этапа, на котором осаждают большую часть содержимого иммуноглобулина и A1PI пула Кона. В конкретном варианте реализации этот начальный этап представляет собой этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Как показано в примерах, представленных в настоящем документе, в этих условиях осаждают больше, чем 95% содержимого A1PI исходного пула Кона. Кроме того, настоящее изобретение представляет способы эффективного разделения A1PI и иммуноглобулинов в этом начальном осаждении.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона, при этом способ включает этапы: со-осаждение иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения с образованием первого осадка и первой надо-садочной жидкости; растворение иммуноглобулинов, находящихся в первом осадке, с образованием первой суспензии, имеющей растворимую часть, содержащую иммуноглобулины, и нерастворимую часть, содержащую A1PI; разделение растворимой и нерастворимой частей первой суспензии; и извлечение A1PI из нерастворимой части первой суспензии, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. Как правило, для осаждения иммуноглобулинов и A1PI могут использоваться любые химическое средства, включая, но не ограничиваясь перечисленным, спиртовое осаждение (например, с применением этанола или метанола), осаждение с помощью водорастворимых полимеров (например, ПЭГ или декстрана) и высаливание (например, с применением фосфата аммония, сульфата аммония, цитрата натрия и т.д.). В предпочтительном варианте реализации осаждение представляет собой спиртовое осаждение, предпочтительно осаждение этанолом.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции A1PI посредством осаждения A1PI из криообедненной плазмы на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. В конкретном варианте реализации способ включает этапы: осаждение A1PI из криообедненной плазмы на первом этапе осаждения посредством добавления к криообедненной плазме этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20% до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение A1PI из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации A1PI, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают.
В одном варианте реализации способ включает этапы: осаждение A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации и уровня рН выбранных из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7 с образованием первого осадка и первой надо-садочнои жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение A1PI из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. В одном варианте реализации A1PI, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают.
В одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют путем смешивания этанола с пулом Кона до конечной концентрации от 22 до 28% (об./об.) при уровне рН в диапазоне от 5,0 до 6,0. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±2% (об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации
25±1%
(об./об.). В другом варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25% (об./об.). Подобным образом, в одном варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,5. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,4. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,3. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,2. В другом варианте
реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5±0,1. В другом варианте реализации первый этап осаждения выполняют при уровне рН 5,5. В других вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН первого этапа осаждения выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7.
Способы, представленные в настоящем документе, обеспечивают значительно более высокие выходы извлечения A1PI в конечном обогащенном продукте благодаря осаждению большей части содержимого A1PI исходного пула Кона в начальной реакции осаждения по сравнению с существующими в данной области техники процедурами очистки, которые основаны на начальных этапах осаждения с низкой концентрацией спирта (т. е. осаждении фракции I).
Соответственно, в одном варианте реализации способов, представленных в настоящем документе по меньшей мере 80% содержимого альфа-1-антитрипсина (A1PI) исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 90% содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В более предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 95% содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В наиболее предпочтительном варианте реализации по меньшей мере 97% содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более содержимого A1PI исходного пула Кона осаждают в начальной реакции осаждения.
Как показано в примерах, представленных в настоящем документе, использование начального этапа осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (т. е. осаждение фракции I-IV-1) приводит к осаждению по меньшей мере 95% содержимого A1PI исходного пула Кона. Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции A1PI, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости; и извлечение A1PI из первого осадка, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации A1PI, извлеченный из первого осадка, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции A1PI, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; растворение иммуноглобулинов, находящихся в первом осадке, с образованием первой суспензии, имеющей растворимую часть, содержащую иммуноглобулины и нерастворимую часть, содержащую A1PI; разделение растворимой и нерастворимой частей первой суспензии; и извлечение A1PI из нерастворимой части первой суспензии, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. В одном варианте реализации иммуноглобулины, извлеченные из растворимой части первой суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из нерастворимой фракции первой суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого иммуноглобулинов пула Кона осаждают на первом этапе осаждения.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции A1PI, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; растворение иммуноглобулинов, находящихся в первом осадке, с образованием первой суспензии, имеющей растворимую часть, содержащую иммуноглобулины и нерастворимую часть, содержащую A1PI; разделение растворимой и нерастворимой частей первой суспензии; и извлечение A1PI из нерастворимой части первой суспензии, где от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации иммуноглобулины, извлеченные из растворимой части первой суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из нерастворимой части первой суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого иммуноглобулинов пула Кона осаждают на первом этапе оса
ждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7.
В одном варианте реализации первый осадок суспендируют в воде для инъекций (ВДИ) или в буфере с низкой ионной силой, который подходит для экстрагирования иммуноглобулинов из осадка, суспензию затем обрабатывают тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2), и растворимую часть суспензии, содержащую иммуноглобулины, отделяют от нерастворимой части суспензии, содержащей большую часть содержимого A1PI.
Подходящие растворы для экстрагирования иммуноглобулинов из первого осадка, как правило, имеют уровень рН в диапазоне от 4,0 до 5,5. В некоторых вариантах реализации раствор будет иметь уровень рН в диапазоне от 4,5 до 5,0, В других вариантах реализации раствор для экстрагирования будет иметь уровень рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,7±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,8±0,1. В другом предпочтительном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера составляет 4,9±0,1. Как правило, эти требования к уровню рН могут быть выполнены с помощью буферного вещества, выбранного, например, из ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящие концентрации буфера обычно находятся в диапазоне от 5 до 100 мМ или от 10 до 50 мМ, или 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ буферного вещества.
Экстрагирующий буфер предпочтительно будет иметь проводимость от 0,5 до 2,0 мСм/см. Например, в некоторых вариантах реализации проводимость экстрагирующего буфера будет составлять 0,5±0,1
мСм/см или 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1,
1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 или 2,0±0,1 мСм/см. Специалисту в данной области техники известно как создавать экстрагирующие буферы, имеющие соответствующую проводимость. В одном конкретном варианте реализации экстрагирующий буфер содержит 5 мМ одноосновного натрия фосфата и 5 мМ ацетата при уровне рН 4,8±0,2 и проводимости от 0,7 до 0,9 мСм/см.
В одном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют перед разделением (например, фильтрацией или центрифугированием) в концентрации от 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В другом варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации от 30 г/кг осадка фракции I-IV-1 до 80 г/кг осадка фракции I-IV-1. В некоторых вариантах реализации коллоидный диоксид кремния может быть добавлен в концентрации около 20 г/кг осадка фракции I-IV-1 или около 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг осадка фракции I-IV-1. В одном
конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния (например, Аэросил 380 или аналогичный) добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±20 г/кг осадка фракции I-IV-1. В другом конкретном варианте реализации коллоидный диоксид кремния добавляют в суспензию фракции I-IV-1 до конечной концентрации 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1. Перемешивание происходит при температуре от 2 до 8°С в течение по меньшей мере от 50 до 70 мин.
Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции A1PI, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации в диапазоне от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; обработку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI; и извлечение A1PI из нерастворимой части первой суспензии, тем самым образуя обогащенную композицию A1PI. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации иммуноглобулины, извлеченные из первого осадка, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, удаленный из суспензии, дополнительно обогащают. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл. 1-7. В предпочтительном варианте реализации от 99 до 100% содержимого иммуноглобулинов пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет способ получения обогащенной композиции A1PI, при этом способ включает этапы: осаждение от 95 до 100% содержимого иммуноглобулинов и A1PI из пула Кона на первом этапе осаждения посредством добавления к пулу Кона этанола до конечной концентрации от 20 до 30% при уровне рН от 5,0 до 6,0 с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; об
работку первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии, где растворимая часть суспензии содержит иммуноглобулины, а нерастворимая часть суспензии содержит A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp, и где дополнительно от 80 до 100% содержимого альбумина пула Кона находится в первой надосадочной жидкости. В одном варианте реализации этанол смешивают с пулом Кона до конечной концентрации 25±3% (об./об.). В одном варианте реализации иммуноглобулины, находящиеся в растворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации A1PI, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фибриноген, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В другом варианте реализации фактор Н, находящийся в нерастворимой части суспензии дополнительно обогащают. В другом варианте реализации IaIp, находящийся в нерастворимой части суспензии, дополнительно обогащают. В еще одном варианте реализации альбумин, находящийся в первой надосадочной жидкости, дополнительно обогащают. В предпочтительном варианте реализации от 99% до 100% содержимого иммуноглобулинов пула Кона осаждают на первом этапе осаждения. В некоторых вариантах реализации конечную концентрацию этанола и уровень рН, которые используют на этапе осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта выбирают из вариантов 1-2166, перечисленных в табл.1-7. В конкретном варианте реализации растворимую и нерастворимую части первой суспензии разделяют посредством фильтрации. В одном варианте реализации SiO2 добавляют до конечной 40±10 г/кг осадка фракции I-IV-1.
В одном варианте реализации растворимую часть первой суспензии, содержащую IgG, отделяют от нерастворимой части, содержащей A1PI, путем фильтрации суспензии через глубинный фильтр с номинальным размером пор от 0,1 мкм до 0,4 мкм. В одном варианте реализации номинальный размер пор глубинного фильтра равен 0,2 мкм (например, фильтр Cuno VR06 или аналогичный). В одном варианте реализации для того, чтобы извлечь дополнительный IgG, после фильтрации фильтр промывают ВДИ или подходящим буфером и после промывания добавляют их к фильтрату. В другом варианте реализации для разделения растворимой и нерастворимой частей первую суспензию центрифугируют.
В одном варианте реализации A1PI извлекают из отделенной нерастворимой части посредством суспендирования нерастворимая части в экстрагирующем буфере A1PI. Например, в одном варианте реализации отделенную нерастворимую часть суспендируют в соотношении 1 часть нерастворимого материала к 2-15 частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости, с образованием второй суспензии. В другом варианте реализации отделенную нерастворимую часть суспендируют в соотношении 1 часть нерастворимого материала к 2-10 частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости. В другом варианте реализации отделенную нерастворимую часть суспендируют в соотношении 1 часть нерастворимого материала к 3-7 частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости. В других вариантах реализации отделенную нерастворимую часть суспендируют в соотношении 1 часть нерастворимого материала к 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более частям воды для инъекций (ВДИ) или буфера с низкими значениями проводимости. В одном варианте реализации экстрагирование проводят при перемешивании в течение по меньшей мере 2 ч. В другом варианте реализации экстрагирование проводят при перемешивании в течение по меньшей мере 4 ч. В другом варианте реализации экстрагирование проводят при перемешивании в течение по меньшей мере 8 ч. В другом варианте реализации экстрагирование проводят при перемешивании в течение от 6 до 12 ч. В одном варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре от 10 до 25°С. В другом варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре 17±5°С. В другом варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре 17±4°С. В другом варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре 17±3°С. В другом варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре 17±2°С. В другом варианте реализации экстрагирование выполняют при температуре 17±1°С. В одном варианте реализации растворимую часть, содержащую A1PI, отделяют от нерастворимой части посредством фильтрации, например, глубинной фильтрации. В другом варианте реализации растворимую часть, содержащую A1PI, отделяют от нерастворимой части посредством центрифугирования.
Подходящие растворы для экстрагирования A1PI включают ВДИ и буферы с низкими значениями проводимости. В одном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 10 мСм/см. В других вариантах реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 мСм/см. В предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 6 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 4 мСм/см. В другом предпочтительном варианте реализации буфер с низкими значениями проводимости имеет проводимость менее чем около 2 мСм/см. В одном варианте реализации ВДИ или буфер с низкими значениями проводимости имеет уровень рН в диапазоне от 8,0 до 9,5. В конкретном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера A1PI составляет 8,8±0,5. В конкретном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера A1PI составляет 8,8±0,4. В конкретном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера A1PI составляет 8,8±0,3. В конкрет
ном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера A1PI составляет 8,8±0,2. В конкретном варианте реализации уровень рН экстрагирующего буфера A1PI составляет 8,8±0,1. В других вариантах реализации уровень рН экстрагирующего буфера A1PI составляет 8,0±0,2, 8,1±0,2, 8,2±0,2, 8,3±0,2, 8,4±0,2, 8,5±0,2, 8,6±0,2, 8,7±0,2, 8,8±0,2, 8,9±0,2, 9,0±0,2, 9,1±0,2, 9,2±0,2, 9,3±0,2, 9,4±0,2 или 9,5±0,2.
В одном варианте реализации перед экстрагированием с помощью буфера A1PI, отделенную нерастворимую часть первой суспензии суспендируют в ВДИ или в буфере с низкой ионной силой, который не подходит для экстрагирования A1PI, с образованием промежуточной суспензии. В этом варианте реализации способ включает: суспендирование нерастворимой части в ВДИ или в буфере с низкой ионной силой при уровне рН не более 7,0; разделение растворимой и нерастворимой частей промежуточной суспензии; и извлечение A1PI в нерастворимой части промежуточной суспензии. В одном варианте реализации промежуточная суспензия образуется при помощи суспендирования нерастворимого материала в соотношении 1 часть нерастворимого материала к 2-15 частям ВДИ или буфера. В одном варианте реализации ВДИ или буфер с низкой ионной силой имеет уровень рН от 4,5 до 6,5. В другом варианте реализации буфер с низкой ионной силой имеет уровень рН 5,5±0,4. В другом варианте реализации буфер с низкой ионной силой имеет уровень рН 5,5±0,3. В другом варианте реализации буфер с низкой ионной силой имеет уровень рН 5,5±0,2. В другом варианте реализации буфер с низкой ионной силой имеет уровень рН 5,5±0,1. В других вариантах реализации буфер с низкой ионной силой имеет уровень рН 4,5±0,2,
4,6±0,2, 4,7±0,2, 4,8±0,2, 4,9±0,2, 5,0±0,2, 5,1±0,2, 5,2±0,2, 5,3±0,2, 5,4±0,2, 5,5±0,2, 5,6±0,2, 5,7±0,2,
5,8±0,2, 5,9±0,2, 6,0±0,2, 6,1±0,2, 6,2±0,2, 6,3±0,2, 6,4±0,2 или 6,5±0,2. В одном варианте реализации растворимую часть отделяют от нерастворимой части, содержащей A1PI, посредством фильтрации, например, глубинной фильтрации. В другом варианте реализации растворимую часть отделяют от нерастворимой части, содержащей A1PI, посредством центрифугирования.
В одном варианте реализации A1PI, экстрагированный из нерастворимой части первой суспензии дополнительно обогащают в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами, включая, без ограничения: хроматографию (например, анионообменную хроматографию, катионообмен-ную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия (ХГВ), гидроксиапатитную хроматографию (ГАХ), аффинную хроматографию с белком А, иммуно-аффинную хроматографию, гель-хроматографию, и т.д.); фильтрацию (например, ультрафильтрацию и/или диафильтрацию); и один или несколько этапов сокращения вирусов (например, нанофильтрацию, обработку растворителем и детергентом, УФ-облучение, термообработку, инкубацию при низком уровне рН и т.д.).
В одном варианте реализации A1PI, экстрагированный из нерастворимой части первой суспензии дополнительно обогащают путем фракционирования. Как правило, может быть использован любой способ фракционирования (например, спиртовое или полимерное осаждение, высаливание и т.д.). В предпочтительном варианте реализации композицию дополнительно обогащают посредством осаждения A1PI из очищенного экстрагированного раствора с помощью двухвалентного катиона, предпочтительно цинка. В одном варианте реализации хлорид цинка добавляют в раствор до конечной концентрации от 1 мМ до 15 мМ. В конкретном варианте реализации хлорид цинка добавляют в раствор до конечной концентрации от 1 мМ до 4 мМ. В более конкретном варианте реализации хлорид цинка добавляют в раствор до конечной концентрации от 2,0 мМ до 3,0 мМ.
В некоторых вариантах реализации A1PI дополнительно обогащают в соответствии со способами очистки, известными в данной области техники, например, теми, которые описаны в публикациях WO 1995/35306, WO 1998/00154, и патентах США под номерами 5981715; 7807435; и 7879800, раскрытия которых включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте для любых целей.
VI. Фармацевтические композиции.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет композиции белков, получаемых из плазмы, которые производят в соответствии с любым из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации эти композиции будут составлены для фармацевтического введения (т.е. фармацевтические композиции).
В одном варианте реализации настоящее изобретение представляет полученную из плазмы белковую композицию, которую готовят при помощи способа, включающего этапы: со-осаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на первом этапе осаждения с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; суспендирование первого осадка с образованием первой суспензии; растворение иммуноглобулинов из первой суспензии с образованием растворимой части суспензии, содержащей иммуноглобулины, и нерастворимой части суспензии, содержащей A1PI, фибриноген, фактор Н и IaIp; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии. В некоторых вариантах реализации композиция содержит белок, получаемый из плазмы, который выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента или белка интер-альфа-ингибитора трипсина (IaI).
Как правило, для осаждения иммуноглобулинов и A1PI могут использоваться любые химическое средства, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, спиртовое осаждение (например, с применением этанола или метанола), осаждение с помощью водорастворимых полимеров (например, ПЭГ или дек- 48
страна) и высаливание (например, с применением фосфата аммония, сульфата аммония, цитрата натрия и т. д.). В предпочтительном варианте реализации осаждение представляет собой спиртовое осаждение, предпочтительно осаждение этанолом.
В одном варианте реализации композицию составляют для фармацевтического введения. В конкретном варианте реализации композицию составляют для внутривенного введения. В другом конкретном варианте реализации композицию составляют для внутримышечного введения. В другом варианте реализации композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте реализации композицию составляют для внутриглазного введения.
В одном варианте реализации фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, готовят путем составления композиции белков, получаемых из плазмы, с использованием способа, представленного в настоящем документе. Обычно, сформулированные композиции необходимо подвергать по меньшей мере одному, предпочтительно по меньшей мере двум, наиболее предпочтительно по меньшей мере трем этапам инактивации или удаления вирусов. Неограничивающие примеры этапов инактивации или удаления вирусов, которые могут быть использованы в способах, представленных в настоящем документе, включают обработку растворителем детергентом (Horowitz et al., Blood Coagul fibrinogenolysis 1994 (5 дополнение 3) :S21-S28 и Kreil et al., Transfusion 2003 (43) : 1023-1028, обе из которых прямо включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей), нанофильтрацию (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 и Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (часть 8) ) : 2021-2024, обе из которых прямо включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей), и инкубацию при низком уровне рН при высоких температурах (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 и Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19). В некоторых вариантах реализации композиция содержит белок, получаемый из плазмы, который выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента или белка интер-альфа-ингибитора трипсина (IaI).
В одном варианте реализации фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, будут содержать одно или более буферных веществ или средств, стабилизирующих уровень рН, пригодных для внутривенного, подкожного, внутримышечного и/или внутриглазного введения. Неограничивающие примеры буферных веществ, пригодных для составления композиции белков, получаемых из плазмы, представленных в настоящем документе, включают глицин, цитрат, фосфат, ацетат, глутамат, тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, малат, сукцинат, формиат, про-пионат, карбонат, или любую их комбинацию, доведенную до соответствующего уровня рН. Как правило, буферное вещество будет достаточным для поддержания подходящего уровня рН в композиции в течение продолжительного периода времени. В предпочтительном варианте реализации буферное вещество представляет собой глицин. В некоторых вариантах реализации композиция содержит белок, получаемый из плазмы, который выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента или белка интер-альфа-ингибитора трипсина (IaI).
В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, необязательно могут дополнительно содержать средство для регулирования осмолярности композиции. Неограничивающие примеры средств для регулирования осмолярности включают маннит, сорбит, глицерин, сахарозу, глюкозу, декстрозу, левулозу, фруктозу, лактозу, полиэтиленгликоли, фосфаты, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, глюконоглюкогептонат кальция, диметилсульфон и т.п.
Как правило, композиции, представленные в настоящем документе, будут иметь осмолярности, сопоставимые с физиологической осмолярностью, около 285-295 мосмоль/кг (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254. В некоторых вариантах реализации осмолярность композиции будет находиться в диапазоне от около 200 мосмоль/кг до около 350 мосмоль/кг, предпочтительно, в диапазоне от около 240 до около 300 мосмоль/кг. В конкретных вариантах реализации осмолярность композиции
будет составлять около 200 мосмоль/кг или 210, 220, 230, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285,
290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 340 или 350 мосмоль/кг.
Полученные из плазмы композиции, представленные в настоящем документе, обычно являются стабильными в жидком виде в течение длительного периода времени. В некоторых вариантах реализации композиции являются стабильными в течение по меньшей мере около 3 месяцев при комнатной температуре или, по меньшей мере около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 месяца при комнатной температуре. Обычно, композиции будут также стабильными в течение 6 или по меньшей мере около 18 месяцев в холодильнике (обычно в диапазоне от около 2°С до около 8°С), или в течение по меньшей мере около 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 или 45 месяцев в холодильнике.
VII. Способ лечения.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет способы лечения заболевания или расстройства, связанного с дефицитом или дисфункцией белка крови у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения терапевтически эффективной дозы белка, полученного из плазмы, приготовленного согласно
способу, представленному в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации композиция содержит белок, получаемый из плазмы, который выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента или белка интеральфа-ингибитора трипсина (IaI).
В одном аспекте настоящее изобретение представляет применение композиции белков, получаемых из плазмы, приготовленной согласно способу, представленному в настоящем документе для производства лекарственного средства для применения в лечении состояния, связанного с дефицитом или дисфункцией белка крови. В некоторых вариантах реализации белок, получаемый из плазмы, выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка интер-альфа-ингибитора трипсина (IaI).
В одном варианте реализации полученную из плазмы белковую композицию готовят при помощи способа, включающего этапы: со-осаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из пула Кона на первом этапе осаждения, с образованием первого осадка и первой надосадочной жидкости; сус-пендирование первого осадка с образованием первой суспензии; растворение иммуноглобулинов из первой суспензии с образованием растворимой части суспензии, содержащей иммуноглобулины, и нерастворимой части суспензии, содержащей A1PI, фибриноген, фактор Н, и IaIp; и отделение растворимой части суспензии от нерастворимой части суспензии. В некоторых вариантах реализации композиция содержит белок, получаемый из плазмы, который выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента или белка интеральфа-ингибитора трипсина (IaI).
VIII. Примеры.
Пример 1. NG2 С91.
Коммерческое производство композиций иммуноглобулина G (IgG) осуществляют путем фракционирования плазмы через серию реакций осаждения. В общепринятой методологии на первом этапе спиртового осаждения из криообедненной плазмы, содержащей иммуноглобулины, осаждаются примеси. Затем из полученной надосадочнои жидкости осаждают, а впоследствии дополнительно обогащают иммуноглобулины IgG. В попытке увеличить выход IgG, извлеченных из плазмы человека во время спиртового фракционирования, в реакциях осаждения IgG исследовали значения рН от 5,5 до 7,0 и концентрации этанола от 20 до 25%.
Коротко, надосадочная жидкость фракции I, промежуточный продукт, который используется в коммерческом производстве получаемых из плазмы продуктов иммуноглобулина G (IgG), альфа-1-антитрипсина (A1PI), и альбумина, была образована путем смешивания этанола в конечной концентрации 8% (об./об.) с криообедненной плазмой при уровне рН 7,2 ± 0,2, инкубации смеси при температуре 0°С, и отделения осадка (фракции I) из надосадочнои жидкости (надосадочнои жидкости фракции I). Полученную надосадочную жидкость фракции I затем аликвотировали в образцы по 600 г. Уровни рН отдельных образцов доводили до значений от 5,5 до 7,0, и этанол домешивали до конечной концентрации от 20 до 25%, как показано в табл. 9.
Как представлено в табл. 9, условия, аналогичные тем, которые используются для получения традиционного осадка фракции II+III по Кону (25% этанол, рН 6,8) и модифицированного осадка фракции который используется в производстве GAMMAGARD LIQUID(r) (Baxter International; Дирфилд, штат Иллинойс), приводят к потере 2,9 и 6,7% от общего IgG в надосадочнои жидкости вследствие неполного осаждения. Тем не менее, было установлено, что потери IgG значительно снижаются благодаря снижению рН реакции до 6,0 или ниже и использованию конечной концентрации этанола по меньшей мере 22,5%. Например, использование 22,5% спирта при уровне рН 5,5 приводит к потере всего лишь 0,4% от общего IgG в надосадочнои жидкости. Аналогично, использование 25% спирта при уровне рН 6,0 или 5,5 приводит к потере всего лишь 0,5 и 0,1% от общего IgG в надосадочной жидкости. Как представлено в табл. 10, это приравнивается к увеличению более чем на 300 мг IgG/л плазмы и 125 мг IgG/ л плазмы в осадке по сравнению с традиционным и модифицированным осадками фракции II+III, соответственно.
Пример 2. NG2 С96.
Было проведено экспериментальное сравнение схем очистки IgG, выполненных с начальным осаждением 8% этанолом и без него, чтобы определить, можно ли получить дальнейшее увеличение извлечения IgG при использовании осаждения при низком уровне рН (5,5), высокой концентрации этанола (25%), как указано в примере 1.
Коротко, проводят обработку 100 кг криообедненной плазмы с выполнением (NG2C96/1) или без выполнения (NG2C96/2) начального этапа осаждения (фракция I), который осуществляют с использованием конечной концентрации этанола 8% (об./об.) при уровне рН 7,4 и температуре 0°С. Значение рН криообедненной плазмы (NG2C96/1) или надосадочной жидкости фракции I (NG2C96/2) доводят до рН 5,5±0,1 и домешивают этанол до конечной концентрации 25% (об./об.). Затем смеси инкубируют при температуре -5±2°С в течение 5 ч, чтобы предоставить возможность осаждения белка. Полученные осадки (осадок (I)+II+III) и надосадочные жидкости (надосадочную жидкость (I)+II+III) разделяют центрифугированием. В связи с размером реакций осаждения, для каждой реакции необходимо два центрифугирования. Полученные от каждого центрифугирования осадки обрабатывают раздельно.
Осадок суспендируют в буфере, содержащем 5 мМ фосфата мононатрия, 5 мМ ацетата натрия и 600 мг/л ледяной уксусной кислоты в соотношении 1 часть осадка на 15 частей буфера, уровень рН доводят до 4,8±0,2, и для экстрагирования белков перемешивают течение 2 ч при температуре в диапазоне от 4°С до 8°С. После экстрагирующей инкубации 40 г коллоидного диоксида кремния (SiO^/кг осадка +
III смешивают с продуктами реакции и перемешивают в течение 50 мин при температуре в диапазоне от
4 до 8°С. Затем смешивают 400 г вспомогательного фильтрующего материала Cellpure/кг осадка
и продукты реакции фильтруют через мембраны Cuno 50SA для удаления нерастворимого ма-
териала, образуя фильтрат и осадок на фильтре. Осадок на фильтре промывают буфером, со-
держащим 5 мМ фосфата мононатрия, 5 мМ ацетата натрия и 150 мг/л ледяной уксусной кислоты, филь-
трат которого добавляют к фильтрату (I)+II+III.
К фильтратам добавляют полисорбат 80 до конечной концентрации 0,2% (мас./мас.), и инкубируют растворы в течение 30 мин. Затем к растворам добавляют дигидрат цитрата натрия до конечной концентрации 0,8% (мас./мас.) и инкубируют растворы в течение дополнительных 30 мин. После второй инкубации рН раствора доводят до 7,0 с помощью гидроксида натрия и смешивают с этанолом до конечной концентрации 25%. Чтобы обеспечить осаждение, температуру понижают до значений в диапазоне от 0°С до -10°С. Осадок (PptG) и надосадочную жидкость (надосадочную жидкость PptG) разделяют центрифугированием.
Определяют содержимое иммуноглобулинов IgG, IgA и IgM на каждом подэтапе реакций очистки. Как продемонстрированно в табл. 11, исключение начального этапа осаждения фракции I приводит к значительно большему выходу IgG в конечной композиции (при сравнении PptG растворенного NG2C96/2 (без осаждения фракции I) с NG2C96/1 (с осаждением фракции I). Так же, как и содержимого IgA (табл. 12) и IgM (табл. 13) растворенной фракции PptG, образованной без начального этапа осаждения фракции I.
Следует отметить, что этап осаждения фракции I используется, в частности, для удаления фибриногена из композиций, содержащих иммуноглобулины. Несмотря на то, что конечное содержимое фибриногена растворенной фракции PptG, образованной без начального этапа осаждения фракции I примерно в 6 раз больше, чем содержимое фракции PptG, образованной с начальным этапом осаждения фракции I, в указанной схеме фракционирования удаляется больше 99% содержимого фибриногена, находящегося в криообедненной плазме исходного материала (табл. 14).
Таблица 11. Содержимое IgG, выраженное в г/л исходной плазмы, в различных фракциях, образованных в ходе фракционирования плазмы с использованием реакции осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта с начальным этапом осаждения фракции I 8% этанолом и без
IgG
г/л плазмы
NG2C96/ 1
NG2C96/1 В
NG2C96/ 2
NG2C96/2 В
осаждение II+III
осаждение I+II+III
плазма
5,36
5,36
надосадочная жидкость I
5, 32
надосадочная жидкость
0, 11
растворенного Ppt I
надосадочная жидкость (I)+II+II I
0, 004
0, 007
суспензия (I)+II+III
4, 37
4, 72
5, 07
4,40
фильтрат (I)+II+III
4, 55
5, 33
5, 36
4,77
надосадочная жидкость растворенного осадка на фильтре
0, 10
0, 18
0, 08
0, 10
надосадочная жидкость PptG
0, 08
0, Об
0, 09
0, 05
растворенный PptG
4, 03
5, 03
Пример 3. NG2 С99.
Для дальнейшего изучения использования осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта вместо традиционных предшествующих этапов спиртового фракционирования по Кону-Онкли и Кистлеру-Нитшманну (т.е., фракции I и II по Кону; фракции I и II + III по Кону, или осадка А и осадка В с 8-10% этанолом по Кистлеру-Нитшманну), осадки PptG NG2C96/2 и NG2C96/2B объединяют и дополнительно обогащают иммуноглобулины IgG.
Коротко, объединенные осадки PptG NG2C96/2 и NG2C96/2B суспендируют в воде для инъекций (ВДИ), доводят до уровня рН 4,75±0,75 с помощью уксусной кислоты и до проводимости 4,5±1,5 мСм/см с помощью хлорида натрия. Добавляют вспомогательный фильтрующий материал, и фильтруют суспензию через мембраны Cuno VR06 с образованием очищенного фильтрата PptG (VR06). Затем обрабатывают очищенный фильтрат с помощью растворителей и детергентов (обработка Р/Д) в соответствии со стандартными процедурами.
Фильтрат, обработанный Р/Д, нагружают на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную буфером, содержащим 10 мМ ацетата натрия (рН 5,0), и собирают элюат (CM D/N). Затем колонку промывают буфером, содержащим 10 мМ ацетата натрия (рН 5,5), и собирают промывную жидкость (CM W). Иммуноглобулины элюируют с колонки с использованием элюирующего буфера, содержащего 55 мМ фосфата мононатрия и 10 мМ ТРИС (рН 8,5). Элюат собирают в трех фракциях: фракция 1 (CM E-VL), которая включает первую часть элюата, имеющего ОП280 менее 100 мЕП; фракция 2 (СМ Е), которая включает пик элюата, имеющего ОП280 более 100 мЕП на переднем крае пика элюирования и ОП280 более 400 мЕП на отстающем крае пика элюирования; и фракция 3 (CM E-NL), которая включает часть элюата на отстающей стороне пика, имеющего ОП280 менее 400 мЕП
Уровень рН и проводимость элюата фракции 2 доводят до 6,4 и 2,3 мСм/см с помощью ледяной уксусной кислоты и воды для инъекций (ВДИ), соответственно. Затем элюат фракции 2 нагружают на ани-онообменную смолу с ANX-сефарозой fast flow, уравновешенную буфером, содержащим 15 мМ фосфата мононатрия (рН 6,4) при концентрации нагрузки 100 мг белка/мл смолы. Собирают анионообменный элюат, содержащий большую часть IgG (ANX D/N). Белок, связывающийся с анионообменной смолой, элюируют из колонки с помощью раствора, содержащего 2 М хлорида натрия (ANX 2М NaCl).
К фракции анионообменного элюата добавляют глицин, и образец подвергают ультра- и диафильт-рации (УФ/ ДФ) с использованием Pellicon(r)2 Mini (Millipore) против раствора, содержащего 0,25 М глицина (рН 5,2) до достижения концентрации белка 5%. Раствор иммуноглобулина дополнительно концентрируют до конечной концентрации белка 10%, и рН доводят до 4,5 (диа-концентрат). Затем стерильно фильтруют 10% раствор иммуноглобулина с использованием Millipak 20 (Millipore) с образованием конечной композиции иммуноглобулина (конечный контейнер).
Определяют биохимический профиль для каждого подэтапа реакции очистки (табл. 15 и 16). Как
показано представленными данными, конечная композиция содержит только низкие уровни белков, не являющихся IgG, в пределах допустимых параметров для фармацевтического введения.
Пример 4. NG2 С100.
Для обоснования использования осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта без начального этапа осаждения при низкой концентрации спирта для удаления фибриногена, 200 кг криообедненной плазмы фракционируют и обогащают так, как описано для образца NG2C96/2 в примерах 2 и 3 с несколькими изменениями в процессе. Во-первых, этап осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта (осаждение I-IV1) выполняют с использованием 25% этанола при уровне рН 5,1, а не 5,5. Во-вторых, суспендированный осадок I-IV1 обрабатывают 33 г коллоидного диоксида кремния (8Ю2)/кг осадка I-IV1, а не 40 г 8Ю2/кг осадка. В-третьих, катионообменный элюат СМ нагружают на анионообменную смолу ANX в концентрации 150 мг белка/мл смолы ANX, а не 100 мг/мл смолы ANX. Наконец, анионообменный элюат, профильтрованный через фильтр Cuno VR06 пропускают через фильтр PLANOVA!!! 35N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.; Токио, Япония), чтобы выполнить этап нанофильтрации перед ультра-/диафильтрацией.
Содержимое IgG определяют на каждом этапе очистки, и результаты представлены в Таблица 17. По сравнению со средним выходом IgG для производственного процесса GAMMAGARD LIQUID(r) (3,7 г IgG/л источника плазмы), способ очистки, который использовали в этом примере, приводит к значительно более высокому выходу 4,4 г IgG/л источника плазмы. Это представляет собой увеличение выхода IgG почти на 20%. Биохимическая характеристика конечной композиции IgG представлена в табл. 10. Как видно из указанной таблицы, конечная композиция IgG имеет больше 99% чистоты, и содержание мономеров/димеров IgG составляет больше 99,8%. Конечный контейнер содержит только следы примесей, уровни которых находятся в пределах нормативных стандартов.
Активность
% станд.
РКА
партии 3
1, 59
РКА
ME/мл
1,2
НАЧПВ
0,773
Фактор Х1а
мЕ/мл
24,9
771, 6
удовлетвори
Внешний вид
5, 643
Кремний
мкг/л
664
Алюминий
мкг/л
<25
Глицин
0, 074
МОсмоль/к
Осмоляльность
Пироген
ЕС/США
уд./уд.
Плотность
г/см3
1,0301
Реагенты РД
Октоксинол 9
(тритон Х100)
м. д.
0, 50
Полисорбат 8 0
м. д.
<26
Три(н-
бутил)фосфат
м. д.
<0, 2
ЕД.
Исследование
измерения
Результат
Антитела
Дифтерия
МЕ/мл
8,0
Дифтерия
МЕ/мл
Корь
МЕ/мл
39, 63
HBs антиген
(ELISA)
отрицат.
HBs (ELISA)
мМЕ/мл
5775
Коэффицие
Полиомиелит
нт гг 176
0, 90
HAV (ELISA)
МЕ/мл
13, 8
Парво B19
(ELISA)
МЕ/мл
426
Гемофильная
палочка
Титр
1: 6400
Антитела
удовлетвори
анти-D
Гемагглютинин
ы анти А и
анти В
Анти А
Анти В
Пример 5. P02910NG2.
Для сравнения эффекта прохождения катионообменного элюата СМ по анионообменной колонке ANX при концентрации нагрузки 100 г белка/мл смолы ANX и 150 г белка/мл смолы ANX, 200 л криообедненной плазмы фракционируют на начальном этапе осаждения при низком уровне рН (5,4), высокой концентрации спирта (25%) и обрабатывают с образованием осадка PptG, как описано для образца NG2C96/2 в примерах 2 и 3. Определяют содержимое IgG, IgA и IgM образованных первичных фракций, результаты представлены в табл. 19-21, соответственно.
Полученный в результате осадок PptG разделяют на два образца по 1,8 кг, которые обогащают до конечного контейнера, как описано для образца NG2C96/2 в примерах 2 и 3, за исключением того, что один образец пропускают через анионообменную смолу ANX при концентрации нагрузки 100 мг белка/мл смолы ANX (P03010NG2), а другой пропускают через анионообменную смолу ANX при концентрации нагрузки 150 мг белка/мл смолы ANX (P03110NG2).
Содержимое IgG определяют на каждом этапе вторичного обогащения во время очищений, результаты представлены в табл. 22 и 23. По сравнению со средним выходом IgG для производственного процесса GAMMAGARD LIQUID(r) (3,7 г IgG/л источника плазмы), способы очистки, которые использовали в этом примере, приводят к значительно более высоким выходам 4,3 г IgG/л источника плазмы. Это представляет увеличение выхода IgG на 16%. Биохимические характеристики конечных композиций IgG представлены в табл. 16 и 17. Как видно из указанных таблиц, конечные композиции IgG имеют больше 99% чистоты, и содержание мономеров/димеров IgG составляет больше 99,8%.
Конечный контейнер содержит только следы примесей, уровни которых находятся в пределах нормативных стандартов.
I-IVl после добавлен ия EtOH
266,
267,
I-IVl
надосадо чная
жидкость
247,
248,
0, 000 21
0, 0
0, 05
0, 001
0, 000
I-IV1
осадок
17,1
17,1
I-IVl экстрагиро
вание и фильтрация
использу емый I-IV1
осадок
11,2
17,1
I-IV1 суспензи
180,
275,
0, 353
97,
105,
2, 00
0,48
фильтрат CUNO
340,
522,
0, 110
57,
62, 2
1, 81
0,28
осаждение PptG
осаждени е PptG
2, 59
3, 96
надосадо чная
жидкость PptG
442,
677,
Таблица 25. Биохимическая характеристика конечной композиции IgG, обогащенной из криообедненной плазмы, с использованием начальной реакции осаждения при низком уровне рН (5,4), высокой концентрации спирта (25%этанола) и анионообменной ANX концентрации нагрузки 150 мг/мл смолы ANX
(P03110NG2)
Исследование
Ед. измерения
Результат
Общий белок - по
мг/мл
3393
Кьельдалю
Альбумин %
Чистота (ЦАЭ)
а/р глобулин
у-глобулин %
денат. Белок
Мономер
)4, 9047
Распределение по размеру молекул
Димер
Полимер
9122
)7б2
Фрагменты
IgG нес
г/л
95, 7
IgA (ELISA)
IgM (ELISA)
мг/дл
Фибриноген (ELISA)
мкг/мл
> ,33
Плазминоген (ELISA)
> ,27
комплемент СЗ
мг/дл
<19, 4
Исследование
Группа подкласса
Результат
lgGl (мг/мл)
54,0113
распределение подклассов IgG ±gGz (мг/мл)
lgG3 (мг/мл)
28,6462
lgG4 (мг/мл)
2,3599
Исследование
Ед. измерения
Результат
IgG Fc функция гемаггл.
Амидолитическая активность(PL-1) нмоль/мл мин
< К
Антикомпл. Активность
станд. партии 3
2, 261
РКА
МЕ/мл
1,8
), 763
< 4
НАЧТВ
> К
Внешний вид
Удовлетворит
4, 853
Фактор Х1а
мЕ/мл
<
SN13a
мЕ/мл
31,3
Осмоляльность
мосмоль/кг
Анализ тромбинообразования
109,81
Плотность
г/смЗ
1, 03'
Фактор I комплемента
мкг/мл
147
Профиль амидолитической
S-22!
< 5
активности
S-2266
< 5
S-2222
< 5
S-2251
< 5
S-2302
< 5
Реагенты РД
Октоксинол 9 (тритон Х100)
м. д.
<0, 1
Полисорбат 8(
м. д.
<26
Три(н-бутил)фосфат
м. д.
), 1414
Исследование
Ед. измерения
Результат
Антитела
Антитела анти-D
Удовлетворит
Гемагглютинины анти А и анти В
Анти А
Анти В
Пример 6. NG2C107B.
Была исследована возможность экстрагирования альфа-1-антитрипсина (A1PI) из нерастворимой части осадка, полученного при низком уровне рН, высокой концентрации спирта, который используется в производстве иммуноглобулинов IgG. Коротко, два образца по 500 кг (№1 и №3) нерастворимого осадка на фильтре, образованного во время фильтрации экстрагированного осадка фракции I-IV-1, вначале суспендируют в 2,8 частях воды (мас./мас.) при температуре 7±2°С, и уровень рН образцов доводят до 5,5±0,1. Суспензии фильтруют через мембрану CUNO 10СР с образованием фильтратов (1. фильтрат) и вторых осадков на фильтре. Затем вторые осадки на фильтре суспендируют в 5 частях воды (мас./мас.), температуру суспензий доводят до 17±2°С, уровень рН образцов доводят до 8,8±0,2, и затем образцы перемешивают в течение 8 ч при поддержании температуры и уровня рН, чтобы экстрагировать из нерастворимого материала A1PI.
После инкубации к образцам добавляют 10 ммоль Трис и 150 ммоль хлорида натрия на кг суспензии, и уровень рН доводят до 8,0±0,1. К образцам добавляют 176 г ПЭГ 3350 на кг суспензии, которую инкубируют при температуре 17±2°С в течение 1 ч. Затем суспензии фильтруют, чтобы удалить нерастворимые вещества из надосадочной жидкости (2.фильтрат), содержащей экстрагированный A1PI.
После этого из второго фильтрата осаждают неочищенный A1PI посредством добавления или 0,35 г хлорида цинка/кг фильтрата (2,5 мМ ZnCl; образец № 1) или 0,54 г/кг хлорида цинка/кг фильтрата (4,0 мМ ZnCl; образец № 3), доводят рН до 7,5±0,2, и инкубируют образцы при температуре 7±2°С в течение 3 ч. Осадок хлорида цинка извлекают при помощи центрифугирования (ZnCl2 цент.). A1PI экстрагируют из осадка хлорида цинка с помощью 50 мМ ЭДТА натрия (Zn-ЭДТА-конц.).
Содержимое и активность A1PI (а1А) определяют на каждом этапе процесса обогащения, результаты представлены в Таблица 26. Около 400 мг активного A1Pb0i источника плазмы извлекают на стадии экстрагирования ЭДТА. Следует отметить, что, когда A1PI экстрагируют при температуре 38±2°С и рН около 9,2, то извлекают около 600 мг активного A1PL0i источника плазмы. Таблица 26. Содержимое альфа-1-антитрипсина вторичных фракций, образующихся в процессе фракционирования плазмы с использованием начальной реакции осаждения при низком уровне рН (5,4), вы-
Экстр.
43, 03
3611,
0, 589
582,
9, 33
415,
71,3
н.рН
цент.
2.фильт
7860,
8167,
0,314
702,
17, 97
335,
47,8
рат
ZnCl2
8112,
8483,
цент.
ZnCl2
7913,
8275,
0, 003
7,23
0, 59
цент.
искл.
конц.
Zn-
1485,
1553,
1,38
587,
22, 87
365,
62, 3
EDTA-
конц.
Пример 7. P03410NG2A и В.
Было исследовано влияние уровня рН на извлечение IgG при осаждении криообедненной плазмы
при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Коротко, 100 л криообедненной плазмы, обрабо-
танной для удаления путем адсорбции фактора IX, фактора VII и антитромбина III (ATIII), фракциони-
руют с помощью осаждения с использованием 25% этанола при уровне рН 5,4 (образец A; P03410NG2A)
или 5,6 (образец В; P03410NG2B). Образцы затем обрабатывают с образованием осадка, называемого
осадок G (осадок PptG), и надосадочной жидкости (надосадочная жидкость PptG), как описано в примере
2, за исключением того, что с суспензией осадка I-IV-1 смешивают 50 г осадка I-IV-1, а не 40 г/кг
осадка.
Определяют содержимое IgG, IgA и IgM образованных фракций, результаты представлены в табл. 27-29, соответственно. Следует отметить, что около 90% содержимого IgG источника плазмы извлекают в фильтрате CUNO фракции I-IV-1, когда начальное осаждение осуществляют при уровне рН 5,4 (93,8%) или рН 5,6 (88,8%). Аналогичным образом, почти все содержимое IgA и IgM источника плазмы извлекают в суспензии фракции I-IV-1.
пул Кона
100,
100,
1,11
112,
100,
2,36
1,12
осаждение I-IV-1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
131,
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
123,
0, 00
0, 90
0, 15
0, 03
0, 00
I-IV1 осадок
6, 52
6, 55
I-IV-1 экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1 суспензия
104,
105,
1, 03
108,
17,9
5, 33
1,08
фильтрат CUNO
201,
203,
0,47
95, 0
15, 6
8,25
0, 94
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
жидкость PptG
261,
264,
пул Кона
100,
100,
0,438 1
44,1
100,
0, 92
0,44
осаждение I-IV1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
131,
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
123,
0, 000 29
0, 04
0, 01
0, 00
0, 00
I-IV1 осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-I-VI осадок
6,49
6, 55
I-IV1 суспензия
104, 49
105,
0, 432
45, 5
7, 53
2,24
0,45
фильтрат CUNO
201,
203,
0, 136
27,7
4, 58
2,41
0,28
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
жидкость PptG
261,
264,
Для дополнительной характеристики схемы фракционирования, определяли содержимое фибрино-
гена (табл. 30), A1PI (табл. 31), альфа-2-макроглобулина (табл. 32), альбумина (табл. 33), трансферрина
(табл. 34), и С3 (табл. 35) для различных первичных фракций.
Таблица 30. Содержимое фибриногена первичных фракций, образованных во время фракционирования
плазмы с использованием начального этапа осаждения при низком уровне рН (А = 5,4; В = 5,6), высокой
концентрации спирта (25%)
Фибриноген ELISA
масс а
расе ч.
масс а
мг/мл
чисто та
(%)
г/л плаз мы
пул Кона
101,
101,
1, 698
171,
100,
3, 57
1,70
осаждение I-IV1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101, 91
102, 37
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
132,
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
124,
<0, 00
0, 01
0, 00
0, 00
0, 00
I-IV1 осадок
7,11
7,16
I-IV1 экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-I-VI осадок
7, 07
7,16
I-IV1 суспензия
113,
115,
1,14
131,
21,5 4
6, 15
1,29
фильтрат CUNO
222,
225,
0, 03
6, 52
1, 07
0, 47
0,06
осаждение PptG
осаждение PptG
2,40
2,44
надосадоч ная
жидкость PptG
288,
292,
пул Кона
100,
100,
1, 698
171,
100,
3, 57
1,70
осаждение I-IV1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
131,
I-IVl надосадоч
123,
123,
0, 000
0, 11
0, 02
0, 00
0, 00
ная
жидкость
I-IV1 осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1 суспензия
104,
105,
1, 58
166,
27,4
8,17
1, 65
фильтрат CUNO
201,
203,
0, 02
4, 65
0,77
0,40
0, 05
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
жидкость PptG
261,
264,
пул Кона
100,
100,
1,15
115,
100,
2, 42
1,15
осаждение I-IV1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
131,
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
123,
0, 02
2,74
0,45
0, 10
0, 03
I-IV1
осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1 суспензия
104, 49
105,
0, 36
38, 4
6, 35
1,89
0, 38
фильтрат CUNO
2 01,
2 03,
0, 05
12,1
2,01
1,0 6
0, 12
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
жидкость PptG
261,
264,
0, 03
7, 94
1,31
1,88
0, 08
пул Кона
100,
100,
1,08
108,
100,
2,27
1,08
осаждение I-IV1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl
131,
131,
после добавлени я EtOH
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
123,
0, 001
0, 13
0, 02
0, 005
0, 00
I-IV1 осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1 суспензия
104,
105,
1,06
111,
18,4
5,49
1,11
фильтрат CUNO
201,
203,
0, 559
113,
18,8
9, 90
1,13
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
жидкость PptG
261,
264,
0, 142
37,5
6,20
8,88
0, 37
пул Кона
100,
100,
25, 1
2530,
100,
52, 84
25, 1
осаждение I-IV1
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
131,
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
123,
19, 9
2463, 72
406,
91, 43
24,4
I-IV1
осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагирова ние и фильтрация
используе мый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1
суспензия
104,
105,
1, 57
165, 5
27,3
8,13
1, 64
фильтрат CUNO
201,
203,
0, 69
141,2
23,3
12, 27
1,40
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
261,
264,
0, 54
143, 6
23,7
33, 96
1,43
осаждение I-IV1
I-IVl перед
добавление м EtOH
101,4
101,5
I-IVl после
добавления EtOH
131,4
131,5
I-IVl
надосадочн ая
жидкость
123, 4
123, 8
0, 82
102, 1
16,86
3,79
1,01
I-IV1
осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагирова ние и фильтрация
используем ый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1
суспензия
104, 4
105, 4
1,13
119, 1
19, 67
5, 85
1,18
фильтрат CUNO
201, 6
203, 8
0, 52
107, 4
17,73
9, 33
1, 07
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадочн ая
жидкость PptG
261, 4
264, б
0,38
101, 3
16, 73
23, 95
1,01
пул Кона
100,
100,
0,0648
6, 53
100,
0, 14
0, 06
осаждение I-IVl
I-IV1 перед добавлени ем EtOH
101,
101,
I-IVl после добавлени я EtOH
131,
131,
I-IVl
надосадоч
ная
жидкость
123,
123,
<0,000 06
<0, 0
<0, 0
<0, 00
<0, 00
I-IV1
осадок
6, 52
6, 55
I-IVl экстрагиров
ание и фильтрация
используе мый I-IV1 осадок
6,49
6, 55
I-IV1
суспензия
104, 49
105,
0, 570
60, 1
9, 92
2, 95
0, 60
фильтрат CUNO
201,
203,
0,0487
9, 93
1, 64
0,86
0, 10
осаждение PptG
осаждение PptG
2,19
2,21
надосадоч ная
жидкость PptG
261,
264,
Пример 8. P03510NG2 и P03610NG2.
Дополнительно исследовали эффект прохождения катионообменного элюата СМ по анионообмен-ной колонке ANX при концентрации нагрузки 100 г белка/мл смолы ANX и 150 г белка/мл смолы ANX во время вторичной обработки осадка PptG, образованного с использованием этапа начального осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Коротко, 2 кг осадка P03410NG2A PptG обрабатывают как описано в примере 4, при этом первый образец (P03510NG2) нагружают на анионообменную смолу ANX в концентрации 157 мг белка/мл смолы ANX, а второй образец (P03610NG2) нагружают на анионообменную смолу ANX в концентрации 106 мг белка/мл смолы ANX.
Содержимое IgG определяют на каждом вторичном этапе очистки, результаты представлены в табл. 22 и 23. По сравнению со средним выходом IgG для производственного процесса GAMMAGARD LIQUID(r) (3,7 г IgG/л источника плазмы), способы очистки, которые используют в этом примере, приводят к значительно более высоким выходам 4,72 г IgG и 4,67 г IgG на литр источника плазмы. Это представляет увеличение выхода IgG более чем на 25%. Биохимическая характеристика конечных композиций IgG представлена в табл. 38 и 39. Как видно из указанных таблиц, конечные композиции IgG имеют больше 99% чистоты, и содержание мономеров/димеров IgG составляет больше 99,8%. Конечный контейнер содержит только следы примесей, уровни которых находятся в пределах нормативных стандартов.
Пример 9. Дополнительная характеристика продуктов фракционирования.
Выход и чистоту иммуноглобулина G, которые достигаются с помощью способов очистки, включающих начальное осаждение при низком уровне рН, высокой концентрации спирта сравнивали с теми, которые достигаются при использовании традиционных промежуточных продуктов осаждения I и осаждения II+III по Кону.
Выход и чистоту трех крупномасштабных очисток IgG, в которых используют начальное осаждение при низком уровне рН, высокой концентрации спирта - партии 3010, описанной в примере 5 ("P03010NG2"); партии 3610, описанной в примере 8 ("P03610NG2"); и третьей партии 1111, которую получали аналогично партиям 3010 и 3610, сравнивают со средним выходом для GAMMAGARD LIQUID (10% иммуноглобулин для инфузии (человеческий), Baxter International), приготовленном на одном заводе-изготовителе в 2010 году. Процесс очистки GAMMAGARD LIQUID был, по существу, аналогичным процессам, используемым для получения партий 3010, 3610 и 1111, за исключением того, что процесс GAMMAGARD LIQUID протекал через промежуточные продукты фракции I по Кону и фракции II+III по Кону, а не через начальное осаждение при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Характеристика продуктов осадка G, образующихся в процессе приготовления экспериментальных партий и усредненные показатели для GAMMAGARD LIQUID представлены в табл. 40.
Как видно из табл. 40, использование этапа начального осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта приводит к значительному увеличению извлечения IgG на промежуточном этапе осадка G по сравнению со способом очистки GAMMAGARD LIQUID, протекающим через этапы осаждения фракции I и II+III по Кону (извлечение 88,9-96,6% IgG для начального этапа осаждения при высокой концентрации спирта, низком уровне рН в сравнении с 82,9% на этапах осаждения фракции I и II+III по Кону).
Промежуточные продукты осадка G IgG, образованные в экспериментальных партиях 3010, 3610 и 1111, имеют немного более низкую чистоту, чем средний промежуточный продукт осадка G GAMMA-GARD LIQUID, о чем свидетельствуют более высокие уровни компонента 3 комплемента (С3) и фибриногена, хотя содержание фибриногена этих промежуточных продуктов по-прежнему находится в пределах диапазона значений, наблюдаемых при производстве GAMMAGARD LIQUID. Однако, когда экспериментальные партии были подвергнуты дополнительной обработке, как описано выше, конечный продукт IgG, соответствовал всем исследованным производственным характеристикам, как показано в табл.
41.
Пример 10. Характеристика композиций альбумина.
Для дополнительного обоснования того, что новый процесс производства иммуноглобулина G, описанный в настоящем документе (например, проходящий через этап начального осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта), может поддерживать производство побочных продуктов белков плазмы, очищали альбумин из надосадочной жидкости с низким уровнем рН, высокой концентрацией спирта.
Способы очистки альбумина из надосадочных жидкостей фракции IV-1 и IV-4 по Кону хорошо известны в данной области техники. Обычно, надосадочные жидкости фракции IV-1 и IV-4 по Кону образуются в процессе, который протекает через промежуточные этапы спиртового осаждения, например, осаждения фракции I по Кону и фракции II+III по Кону. В настоящем примере, альбумин получают в соответствии со стандартными способами, за исключением того, что вместо надосадочной жидкости фракции IV-1 используют надосадочную жидкость начального осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта. Как продемонстрированно в табл. 42, очистка из надосадочной жидкости с низким уровнем рН, высокой концентрацией спирта приводит к с высокому выходу альбумина (18,92 г/л плазмы), который соответствует всем исследованным требованиям контроля качества. Таблица 42. Биохимическая характеристика композиции альбумина, полученной из надосадочной жидкости крупномасштабного осаждения при низком уровне рН, высокой концентрации спирта,
как описано выше
Исследование
Ед. измерения
AUF00111NG2 Конечный контейнер
Выход белка
г/л плазмы
18, 92
Аль бумин (ЦАЭ)
(%)
97, 3
(%) после 2 недель при 30°С
97, 8
ВЭЖХ
(% мономеров)
98, 1
Цитрат
мкмоль/мл
<0, 05
РКА
IE/мл
<4
Внешний осмотр
Забракованные флаконы (например, из-за частиц)
Нет
Понятно, что примеры и варианты реализации, описанные в настоящем документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что специалистам в данной области техники будут предложены различные модификации или изменения в их свете, которые должны быть включены в сущность и объем настоящей заявки и объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте для любых целей.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ производства обогащенной композиции иммуноглобулинов из плазмы или криообедненной плазмы, отличающийся тем, что способ включает этапы:
(а) совместное осаждение иммуноглобулинов и альфа-1-антитрипсина (A1PI) из плазмы или крио-
обедненной плазмы путем добавления к плазме или криообедненной плазме этанола в конечной концен-
трации от 20 до 30% (об./об.) при уровне рН от 5,0 до 6,0 и при температуре от -3 до -10°С с образовани-
ем первого осадка и первой надосадочной жидкости;
(б) отделение первого осадка от первой надосадочной жидкости;
(в) суспендирование первого осадка в воде или буфере, имеющем низкую электропроводность;
(г) обработка первой суспензии тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и
(д) отделение растворимой фракции первой суспензии от нерастворимой фракции первой суспензии
с получением обогащенной композиции иммуноглобулинов, причем плазма или криообедненная плазма
не была подвергнута начальному осаждению этанолом до выполнения этапа (а).
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет от 21 до 29%.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет от 23 до 27%.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечная концентрация этанола составляет 25%.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет от 5,1 до 5,9.
6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет от 5,3 до 5,7.
7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН составляет 5,5.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что первый этап осаждения выполняют при температуре от -5 до -9°С.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что первая суспензия имеет рН от 4,0 до 5,4.
10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что первая суспензия имеет рН от 4,7 до 5,1.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что первая суспензия имеет проводимость от 0 до 4 мСм/см.
12. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что первая суспензия имеет проводимость от
0,5 до 2 мСм/см.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO2) добавляют к первой суспензии в конечной концентрации от 15 г/кг первого осадка до 80 г/кг первого осадка.
14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что этап (а) включает использование этанола в концентрации в диапазоне от 24 до 26% при уровне рН в диапазоне от 5,3 д 5,7 и температурой в диапазоне от -6 до -8°С.
15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 90% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или крио-обедненной плазме, используемой на этапе (а).
16. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что обогащенная композиция иммуноглобулинов содержит по меньшей мере 95% от общего количества иммуноглобулина IgG в плазме или крио-обедненной плазме, используемой на этапе (а).
17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этапы:
(е) осаждение иммуноглобулинов из растворимой фракции первой суспензии, полученной на этапе
(д), путем добавления этанола к ней с получением второго осадка и второй надосадочной жидкости;
(ж) суспендирование второго осадка с образованием второй суспензии и
(з) отделение растворимой фракции второй суспензии от нерастворимой фракции второй суспензии
с получением дополнительно обогащенной композиции иммуноглобулинов.
18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обеспечение связывания иммуноглобулинов, содержащихся в обогащенных композициях, с катионообменным материалом; и элюирование иммуноглобулинов с получением элюата, обогащенного иммуноглобулинами.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что способ дополнительно включает контактирование иммуноглобулинов, содержащихся в обогащенном элюате, с анионообменным материалом; и извлечение иммуноглобулинов, не связавшихся с анионообменным материалом, с получением элюата, обогащенного иммуноглобулинами.
20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этап инактивации и/или удаления вирусов.
21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что из нерастворимой фракции первой суспензии выделяют альфа-1-антитрипсин (A1PI).
22. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что из нерастворимой фракции первой суспензии выделяют фибриноген, фактор Н или интер-альфа-ингибитор трипсина (Icdp).
23. Способ по любому из пп.1-22, дополнительно включающий этап выделения белка крови из плазмы или криообедненной плазмы путем адсорбции на твердой фазе перед этапом (а).
24. Способ по любому из пп.1-13, в котором отделенная нерастворимая фракция первой суспензии
18.
содержит по меньшей мере 80% альфа-1-антитрипсина (A1PI), содержащегося в плазме или криообедненной плазме, используемой на этапе (а).
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032478
032478
- 1 -
- 1 -
(19)
032478
032478
- 1 -
- 1 -
(19)
032478
032478
- 1 -
- 1 -
(19)
032478
032478
- 1 -
- 1 -
(19)
032478
032478
- 8 -
- 9 -
032478
032478
- 11 -
- 11 -
032478
032478
- 12 -
- 12 -
032478
032478
- 47 -
032478
032478
- 50 -
- 50 -
032478
032478
- 61 -
- 61 -
032478
032478
- 62 -
- 62 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 64 -
- 64 -
032478
032478
- 68 -
- 68 -
032478
032478
- 69 -
- 69 -
032478
032478
- 70 -
- 70 -
032478
032478
- 75 -
- 75 -
|
