EA 032231B1 20190430

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032231b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Полимерная каркасная структура формулы (Id), применяемая для конъюгирования с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM) где каркасная структура включает поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаль) (PHF), имеющий молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа; D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу ≤5 кДа; между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе; X представляет собой CH ₂ , О или NH; m представляет собой целое число от 1 до 300; m ₁ представляет собой целое число от 1 до 140; m ₇ представляет собой целое число от 1 до 40; m ₃ представляет собой целое число от 1 до 18 и сумма m, m ₁ , m ₃ и m ₇ составляет от 15 до 300.

2. Каркасная структура по п.1, где PHF имеет молекулярную массу от 2 до 20 кДа, m ₇ представляет собой целое число от 1 до 20, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 10, m ₁ представляет собой целое число от 1 до 70 и сумма m, m ₁ , m ₃ и m ₇ составляет от 15 до 150.

3. Каркасная структура по п.1, где PHF имеет молекулярную массу от 3 до 15 кДа, m ₇ представляет собой целое число от 2 до 15, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 8, m ₁ представляет собой целое число от 2 до 50 и сумма m, m ₁ , m ₃ и m ₇ составляет от 20 до 110.

4. Каркасная структура по п.1, где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа, m ₇ представляет собой целое число от 3 до 10, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 5, m ₁ представляет собой целое число от 5 до 35 и сумма m, m ₁ , m ₃ и m ₇ составляет от 40 до 75.

5. Каркасная структура по любому из пп.1-4, где D независимо выбирается из соединения ауристатина, ингибитора топоизомеразы, соединения калихимицина, соединения барвинка, соединения тубулизина, соединения дуокармицина, соединения пирролобензодиазепина, ингибитора киназы, ингибитора KSP, майтанзиноида, лекарственного средства, связывающего, алкилирующего или интеркалирующего ДНК, ингибитора РНК-полимеразы, ингибитора синтеза белка и их аналогов.

6. Каркасная структура по п.1, имеющая формулу (Ia) где m ₂ представляет собой целое число от 1 до 40, сумма m, m ₁ , m ₂ и m ₃ составляет от 15 до 300.

7. Каркасная структура по п.6, где PHF имеет молекулярную массу от 2 до 20 кДа, m ₂ представляет собой целое число от 1 до 20, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 10, m ₁ представляет собой целое число от 1 до 70 и сумма m, m ₁ , m ₂ и m ₃ составляет от 15 до 150.

8. Каркасная структура по п.6, где PHF имеет молекулярную массу от 3 до 15 кДа, m ₂ представляет собой целое число от 2 до 15, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 8, m ₁ представляет собой целое число от 2 до 50 и сумма m, m ₁ , m ₂ и m ₃ составляет от 20 до 110.

9. Каркасная структура по п.6, где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа, m ₂ представляет собой целое число от 3 до 10, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 5, m ₁ представляет собой целое число от 5 до 35 и сумма m, m ₁ , m ₂ и m ₃ составляет от 40 до 75.

10. Каркасная структура по п.6, имеющая формулу (A) где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до 75; m ₁ представляет собой целое число от 5 до 35; m ₂ представляет собой целое число от 3 до 10; m ₃ представляет собой целое число от 1 до 5 и сумма m, m ₁ , m ₂ и m ₃ составляет от 40 до 75.

11. Каркасная структура по любому из пп.1-10, дополнительно включающая PBRM, конъюгированную с PHF через малеимидную группу.

12. Каркасная структура по п.11, которая при конъюгировании с PBRM имеет формулу (Ie) где один из X _a и X _b представляет собой H, а другой представляет собой малеимидоблокирующий фрагмент или X _a и X _b вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод; m _3a представляет собой целое число от 0 до 17; m _3b представляет собой целое число от 1 до 8, где сумма m _3a и m _3b составляет m ₃ ; сумма m, m ₁ , m ₇ , m _3a и m _3b составляет от 15 до 300 и m ₅ представляет собой целое число от 1 до 10.

13. Каркасная структура по п.11, которая при конъюгировании с PBRM имеет формулу (Ib) где один из X _a и X _b представляет собой H, а другой представляет собой малеимидоблокирующий фрагмент или X _a и X _b вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод; m _3a представляет собой целое число от 0 до 17; m _3b представляет собой целое число от 1 до 8, где сумма m _3a и m _3b составляет m ₃ ; сумма m, m ₁ , m ₂ , m _3a и m _3b составляет от 15 до 300 и m ₅ представляет собой целое число от 1 до 10.

14. Каркасная структура по п.13, где PHF имеет молекулярную массу от 2 до 20 кДа, сумма m, m ₁ , m ₂ , m _3a и m _3b составляет от 15 до 150, m ₁ представляет собой целое число от 1 до 70, m ₂ представляет собой целое число от 1 до 20, m _3a представляет собой целое число от 0 до 9, m _3b представляет собой целое число от 1 до 8 и m ₅ представляет собой целое число от 2 до 8.

15. Каркасная структура по п.13, где PHF имеет молекулярную массу от 3 до 15 кДа, сумма m, m ₁ , m ₂ , m _3a и m _3b составляет от 20 до 110, m ₁ представляет собой целое число от 2 до 50, m ₂ представляет собой целое число от 2 до 15, m _3a представляет собой целое число от 0 до 7, m _3b представляет собой целое число от 1 до 8 и m ₅ представляет собой целое число от 2 до 4.

16. Каркасная структура по п.13, где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа, сумма m, m ₁ , m ₂ , m _3a и m _3b составляет от 40 до 75, m ₁ представляет собой целое число от 5 до 35, m ₂ представляет собой целое число от 3 до 10, m _3a представляет собой целое число от 0 до 4, m _3b представляет собой целое число от 1 до 5 и m ₅ представляет собой целое число от 2 до 4.

17. Каркасная структура по п.13, имеющая формулу (B) где PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 5 до 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до 75; m ₁ представляет собой целое число от 5 до 35; m ₂ представляет собой целое число от 3 до 10; m _3a представляет собой целое число от 0 до 4; m _3b представляет собой целое число от 1 до 5; сумма m, m ₁ , m ₂ , m _3a и m _3b составляет от 40 до 75 и m ₅ представляет собой целое число от 2 до 4.

18. Каркасная структура по любому из пп.1-17, где PBRM имеет молекулярную массу более чем 40 кДа.

19. Полимерная каркасная структура формулы (Ic) где каркасная структура включает PHF, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа; X представляет собой CH ₂ , О или NH; m представляет собой целое число от 1 до 300, m ₆ представляет собой целое число от 2 до 180, m ₃ представляет собой целое число от 1 до 18 и сумма m, m ₆ и m ₃ составляет от 15 до 300.

20. Фармацевтическая композиция, включающая каркасную структуру по любому из пп.11-18 и фармацевтически приемлемый носитель.

21. Применение каркасной структуры по любому из пп.11-18 в лечении онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака заднего прохода, астроцитомы, лейкоза, лимфомы, рака головы и шеи, рака печени, рака яичек, рака шейки матки, саркомы, гемангиомы, рака пищевода, рака глаза, рака гортани, рака рта, мезотелиомы, рака кожи, миеломы, рака полости рта, рака прямой кишки, рака горла, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака почки или рака желудочно-кишечного тракта.

22. Применение фармацевтической композиции по п.20 в лечении онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака заднего прохода, астроцитомы, лейкоза, лимфомы, рака головы и шеи, рака печени, рака яичек, рака шейки матки, саркомы, гемангиомы, рака пищевода, рака глаза, рака гортани, рака рта, мезотелиомы, рака кожи, миеломы, рака полости рта, рака прямой кишки, рака горла, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака почки или рака желудочно-кишечного тракта.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

18. Каркасная структура по любому из пп.1-17, где PBRM имеет молекулярную массу более чем 40 кДа.

Евразийское 032231 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201690744
(22) Дата подачи заявки
2014.10.10
(51) Int. Cl. A61K47/48 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)
(54) КОНЪЮГАТЫ БЕЛОК-ПОЛИМЕР-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО
(31) 61/890,046; 61/975,455; 61/988,011; 62/010,972
(32) 2013.10.11; 2014.04.04; 2014.05.02;
2014.06.11
(33) US
(43) 2016.09.30
(86) PCT/US2014/060170
(87) WO 2015/054659 2015.04.16
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МЕРСАНА ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Юрковетский Александр В., Йин Мао, Лоуинджер Тимоти Б., Томас Джошуа Д., Стивенсон Чэри А., Гуриджала
Вену Р. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-2013101546
YURKOVETSKIY A. ET AL.: "FULLY DEGRADABLE HYDROPHILIC POLYALS FOR PROTEIN MODIFICATION", BIOMACROMOLECULES, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 6, no. 5, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 2648-2658, XP008057395, ISSN: 1525-7797, DOI: 10.1021/BM049210K the whole document
MOORTHY S.S. PALANKI ET AL.:
"Development of novel linkers to conjugate pharmacophores to a carrier antibody", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY
LETTERS, PERGAMON, AMSTERDAM, NL, vol. 22, no. 13, 8 May 2012 (2012-05-08),
pages 4249-4253, XP028490988, ISSN: 0960-894X, I DOI: 10.1016/J.BMCL.2012.05.040 [retrieved on 1 2012-05-17] Scheme 2; figure 3
(57) В изобретении описана полимерная каркасная структура, применяемая для конъюгирования с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM) для образования конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство. Каркасная структура включает одну или более концевых малеимидных групп. В изобретении также раскрывается конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство, приготовленный с помощью каркасной структуры. В изобретении также описаны композиции, включающие конъюгаты, способы их получения и способы лечения различных заболеваний с помощью конъюгатов или их композиций.
Родственные заявки
Эта заявка на основании Кодекса законов США 35 USC § 119(e) испрашивает приоритет заявки на патент США № 61/890046, зарегистрированной 11 октября 2013 г., № 61/975455, зарегистрированной 4 апреля 2014 г., № 61/988011, зарегистрированной 2 мая 2014 г., и № 62/010972, зарегистрированной 11 июня 2014 г. Содержание каждой из этих заявок включено в описание настоящего изобретения путем ссылок на них.
Уровень техники
Как правило, лекарственные препараты в основном состоят из синтетических низкомолекуряных веществ, которые вводят перорально (в виде твердых пилюль или жидкостей) или в виде инъекций. За последние тридцать лет лекарственные формы (т.е. композиции, которые позволяют регулировать направление и/или скорость доставки лекарственного средства и обеспечивают доставку лекарственного средства в заданное место, когда это требуется) становятся все более распространенными и все более сложными. Тем не менее, многие вопросы и проблемы, касающиеся разработки новых методов лечения, а также механизмов, с помощью которых они могут быть реализованы, остаются нерешенными. Например, многие лекарственные препараты проявляют ограниченную или же пониженную активность и терапевтический эффект в силу того, что они обычно либо подвергаются частичному разложению до того, как достигают требуемого органа или области в организме, либо накапливаются в тканях, не являющихся объектом лечения, либо в силу и той, и другой причины.
Поэтому одной задачей в области создания систем доставки лекарственных средств является доставка лекарственных препаратов в неизменном виде в конкретно заданные области организма с помощью системы, которая может стабилизировать лекарственное средство и регулировать in vivo перенос лекарственного средства, используя либо физиологические, либо химические механизмы, либо и те, и другие.
В качестве лекарственных средств с направленной доставкой были разработаны конъюгаты антитело-лекарственное средство. Антитела против антигенов поверхности различных раковых клеток были конъюгированы с различными цитотоксическими средствами, которые ингибируют различные важные клеточные мишени, такие как микротрубочки (мейтанзиноиды, ауристатины, таксаны: патенты США №№ 5208020, 5416064, 6333410, 6441163, 6340701, 6372738, 6436931, 6596757 и 7276497); ДНК (калихи-мицин, доксорубицин, аналоги СС-1065; патенты США №№ 5475092, 5585499, 5846545, 6534660, 6756397 и 6630579). Конъюгаты антител с некоторыми из этих цитотоксических средств в настоящее время активно исследуются в клинике в качестве противораковой терапии (Ricart, A.D., and Tolcher, A.W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-255; Krop et al., 2010, J. Clin. Oncol, 28, 2698-2704). Однако существующие конъюгаты антитело-лекарственное средство характеризуются рядом недостатков. Основным недостатком является их неспособность обеспечивать достаточную концентрацию лекарственного средства в требуемом месте вследствие ограниченного числа целевых антигенов и относительно умеренной цитотоксичности противораковых лекарственных средств, таких как метотрексат, дауномицин, мей-танзиноиды, таксаны и винкристин. Одним подходом для достижения значительной цитотоксичности является связывание большого числа молекул лекарственного средства, либо непосредственно, либо косвенно, с антителом. Однако такие сильно модифицированные антитела часто характеризуются неудовлетворительным связыванием с антигеном-мишенью и быстрым in vivo выведением из кровотока. Поэтому для того чтобы лекарственное средство проявляло максимальную цитотоксичность, существует необходимость в создании возможности обеспечения достаточной концентрации лекарственного средства в требуемом месте.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгату белок-полимер-лекарственное средство, который является биоразлагаемым, биосовместимым и характеризуется высокой концентрацией лекарственного средства, а также сильным связыванием с антигеном-мишенью. Настоящее изобретение также относится к полимерной каркасной структуре, применяемой для конъюгирования с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM) с получением конъюгата белок-полимер-лекарственное средство.
В одном аспекте изобретение относится к полимерной каркасной структуре формулы (Id), применяемой для конъюгирования с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM)
где каркасная структура включает поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформаль) (PHF), имеющий молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа;
в каждом случае присутствия D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5 кДа,
^ между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе,
X представляет собой CH2, О или NH;
m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140, m7 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18, сумма m, m1, m3 и m7 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300. Каркасная структура формулы (Id) может включать один или более из следующих характерных признаков.
Когда PHF в формуле (Id) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, m7 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 70, и сумма m, m1, m3 и m7 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150.
Когда PHF в формуле (Id) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, m7 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 15, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, m1 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 50, и сумма m, m1, m3 и m7 составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110.
Когда PHF в формуле (Id) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, m7 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35, и сумма m, m1, m3 и m7 составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75.
В каждом случае присутствия малеимидного фрагмента в m3 звене формулы (Id) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM.
В одном варианте осуществления сумма m1 и m7 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 180.
Каркасная структура формулы (Id) может дополнительно включать PBRM, конъюгированную с D-содержащей каркасной структурой через одну или более малеимидных групп D-содержащей каркасной структуры, образуя конъюгат белок-полимер-лекарственное средство. Например, каркасная структура формулы (Id) дополнительно включает одну PBRM, конъюгированную с D-содержащей каркасной структурой через две или более малеимидных групп (например, до пяти) каркасной структуры. Например, одна PBRM соединена с одной или более D-содержащей полимерной каркасной структурой формулы (Id).
В конкретных вариантах осуществления конъюгат полимера с лекарственным средством (Id), когда он конъюгирован с PBRM, имеет формулу (Ie)
где один из Xa и Xb представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеи-мидо, или Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 17,
m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, где сумма m3a и m3b составляет m3, сумма m, m1, m7, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300, и m5 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10.
В конъюгате белок-полимер-лекарственное средство формулы (Id) каждое D может представлять собой один и тот же или отличающийся фрагмент, и каждая PBRM может представлять собой один и тот же или отличающийся фрагмент.
В конкретных вариантах осуществления отношение между D и PBRM может составлять приблизительно 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 или 6:1.
В некоторых вариантах осуществления отношение между D и PBRM может составлять приблизительно 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 или 10:1.
В других вариантах осуществления отношение между D и PBRM может составлять приблизительно 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 или 12:1.
В конкретных вариантах осуществления отношение между PHF и PBRM может составлять приблизительно 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или 2:1.
В некоторых вариантах осуществления отношение между PHF и PBRM может составлять приблизительно 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или 2:1.
В других вариантах осуществления отношение между PHF и PBRM может составлять приблизительно 4:1, 3:1 или 2:1.
В одном варианте осуществления D представляет собой: a) соединение ауристатина, (b) соединение калихимицина, (c) соединение дуокармицина, (d) ингибитор топоизомеразы, (e) соединение пирролобен-зодиазепина, (f) соединение барвинка, (g) ингибитор синтеза белка, (h) ингибитор РНК-полимеразы, (i) тубулин-связывающее соединение или их аналоги.
В конкретном варианте осуществления D представляет собой: a) соединение ауристатина, (b) соединение калихимицина, (c) соединение дуокармицина, (d) соединение камптотецина, (e) соединение пирролобензодиазепина, (f) соединение барвинка или их аналоги.
В одном варианте осуществления соединение ауристатина представляет собой ауристатин, доласта-тин, монометилауристатин Е (MMAE), монометилауристатин F (MMAF), ауристатин F гидроксипропи-ламид (AF НРА) или ауристатин F фенилендиамин (AFP).
В одном варианте осуществления дуокармицин или его аналог представляет собой дуокармицин А, дуокармицин В1, дуокармицин В2, дуокармицин C1, дуокармицин С2, дуокармицин D, дуокармицин SA, СС-1065, адозелезин, бизелезин или карзелезин.
В одном варианте осуществления соединение камптотецина представляет собой камптотецин, СРТ-11 (иринотекан), SN-38 или топотекан.
В одном варианте осуществления соединение пирролобензодиазепина представляет собой мономер пирролобензодиазепина, симметричный димер пирролобензодиазепина или несимметричный димер пир-ролобензодиазепина.
В одном варианте осуществления D представляет собой AF НРА, и отношение между AF НРА и PBRM может составлять приблизительно 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 или 6:1.
В другом варианте осуществления отношение между AF НРА и PBRM может составлять приблизительно 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 или 10:1.
В еще одних вариантах осуществления отношение между AF НРА и PBRM может составлять приблизительно 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 или 12:1.
В другом аспекте изобретение относится к полимерной каркасной структуре формулы (Ia), используемой для конъюгирования с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM)
где каркасная структура включает поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформаль) (PHF), имеющий молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа; X представляет собой CH2, О или NH;
m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300,
m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140,
m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40,
m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18 и
сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300.
Каркасная структура формулы (Ia) может включать один или более из следующих характерных признаков.
Когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 70 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150.
Когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, m2 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 15, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, m1 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 50 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110.
Когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, m2 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75.
В каждом случае присутствия малеимидного фрагмента в m3 звене формулы (Ia) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM.
В одном варианте осуществления каркасная структура формулы (Ia) имеет формулу (A) или (A1)
где PHF имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 75, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35, m2 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5, сумма m, m1, m2 и m3 составляет от 40 до приблизительно 75.
Например, в каждом случае присутствия малеимидного фрагмента в m3 звене формулы (A) или (A1) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM.
Каркасная структура формулы (Ia) дополнительно включает PBRM, конъюгированную с каркасной структурой через одну или более малеимидных групп полимерной каркасной структуры. Например, каркасная структура формулы (Ia) дополнительно включает одну PBRM, конъюгированную с каркасной структурой через две или более малеимидных групп (например, до пяти) каркасной структуры.
PBRM имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более, 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа или 100-140 кДа).
PBRM имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более, 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа или 100-140 кДа) и
имеет сульфгидрильную (т.е. -SH или тиольную) группу.
PBRM конъюгирована с несущим лекарственное средство полимерным конъюгатом через сульфгидрильную группу PBRM, соединенную с малеимидной группой несущего лекарственное средство полимерного конъюгата, см., например, атом серы (-S-) в m3b звене внутри скобок в любой описанной в изобретении формуле, например формуле (Ib), (B), (B1) или (Ie). В вариантах осуществления атом серы является частью PBRM и образован из сульфгидрильной (тиольной) группы в PBRM, которая реагировала с малеимидной группой с образованием связи (сульфидной связи) с несущим лекарственное средство полимерным конъюгатом.
где один из Xa и Xb представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеи-мидо, или Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 17,
m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, где сумма m3a и m3b составляет m3 (например, целое число от 1 до приблизительно 18),
сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300 и m5 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10.
Каркасная структура формулы (Ib) может включать один или более из следующих характерных признаков.
PBRM имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более, 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа или 100-140 кДа).
PBRM имеет сульфгидрильную (т.е. -SH или тиольную) группу.
Суммарное число ковалентных связей (например, сульфидной связи), образованных между PHF и PBRM (или суммарное число точек присоединения), составляет 10 или менее.
Когда PHF в формуле (Ib) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 70, m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 9, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8 и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 8.
Когда PHF в формуле (Ib) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110, m1 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 50, m2 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 15, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 7, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8 и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
Когда PHF в формуле (Ib) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35, m2 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 4, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5 и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
В конкретных вариантах осуществления отношение между ауристатином F гидроксипропиламидом (AF НРА) и PBRM может составлять приблизительно 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 или 6:1.
В некоторых вариантах осуществления отношение между AF HPA и PBRM может составлять приблизительно 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 или 10:1.
В других вариантах осуществления отношение между AF НРА и PBRM может составлять приблизительно 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 или 12:1.
В конкретных вариантах осуществления отношение между PHF и PBRM может составлять приблизительно 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или 2:1.
В некоторых вариантах осуществления отношение между PHF и PBRM может составлять приблизительно 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или 2:1.
В других вариантах осуществления отношение между PHF и PBRM может составлять приблизи-
тельно 4:1, 3:1 или 2:1.
Фрагменты, блокирующие малеимидо (например, Xa или Xb), представляют собой фрагменты, которые могут быть ковалентно присоединены к одному из двух олефиновых углеродных атомов в результате реакции малеимидной группы с тиолсодержащим соединением формулы (II)
R90- (СН2) d_SH
(И) ,
где R90 представляет собой NHR91, OH, COOR93, CH (NHR91) COOR93 или замещенную фенильную груп-
R93 представляет собой водород или C1-4 алкил; R91 представляет собой водород, CH3 или CH3CO и d представляет собой целое число от 1 до 3.
В одном варианте осуществления соединение, блокирующее малеимидо, формулы (II) может представлять собой цистеин, N-ацетилцистеин, цистеинметиловый эфир, N-метилцистеин, 2-меркаптоэтанол, 3-меркаптопропановую кислоту, 2-меркаптоуксусную кислоту, меркаптометанол (т.е. HOCH2SH), бен-зилтиол, в котором фенил замещен с помощью одного или более гидрофильных заместителей, или 3-аминопропан-1-тиол. Один или более гидрофильных заместителей на фениле включают OH, SH, меток-си, этокси, COOH, CHO, COC1-4 алкил, NH2, F, циано, SO3H, PO3H и другие подобные заместители.
В другом аспекте группа, блокирующая малеимидо, представляет собой -S-(CH2)d-R90, в которой
R90 представляет собой OH, COOH или CH(NHR91)COOR93;
R93 представляет собой водород или CH3; R91 представляет собой водород или CH3CO и d представляет собой 1 или 2.
В другом варианте осуществления группа, блокирующая малеимидо, представляет собой -S-CH2-CH(NH2)COOH.
В некоторых вариантах осуществления группа, блокирующая малеимидо, является водорастворимой.
Каркасная структура формулы (lb) имеет формулу (В) или (В1)
где PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 5 до 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до 75, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35, m2 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 4, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5,
сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75 и
m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
В конкретных вариантах осуществления в формуле (B) или (B1) суммарное число точек присоединения составляет 10 или менее.
Изобретение также предлагает полимерные каркасные структуры формулы (1с)
где каркасная структура включает PHF, имеющий молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа;
X представляет собой CH2, О или NH;
m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300,
m6 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 180,
m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18,
сумма m, trig и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300.
Каркасная структура формулы (Ic) может включать один или более из следующих характерных признаков.
Когда PHF в формуле (Ic) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150, m6 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 90 и m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10.
Когда PHF в формуле (Ic) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110, m6 представляет собой целое число от приблизительно 4 до приблизительно 65 и m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8.
Когда PHF в формуле (Ic) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75, m6 представляет собой целое число от приблизительно 8 до приблизительно 45 и m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5.
В каждом случае присутствия малеимидного фрагмента в m3 звене формулы (Ic) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM. Каркасная структура формулы (Ic) имеет формулу (C) или (C1)
где PHF имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 75, m6 представляет собой целое число от приблизительно 8 до приблизительно 45, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5 и сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75.
В каждом случае присутствия малеимидного фрагмента в m3 звене формулы (C) или (C1) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM.
Каркасная структура формулы (Ic) может дополнительно включать одну или более молекул лекарственного средства (D), соединенных с PHF.
В одном варианте осуществления, D-содержащая каркасная структура формулы (Ic) имеет формулу
(Id).
В раскрытой в изобретении формуле, такой как формула (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (A), (A1), (B), (B1), (C), (C1) или (E), разрыв или пробел между полиацетальными звеньями указывает, что звенья могут быть соединены друг с другом в любом порядке. Кроме того, в раскрытой в изобретении конкретной формуле (например, в формуле в табл. D) для заключенных в скобки структур, т.е. полиацетальных мономерных звеньев, не указывается число повторяющихся звеньев (например, m1, m2, m3 и так далее) с целью упрощения иллюстрации, и это не следует истолковывать так, как-будто бы имеется только одно каждое повторяющееся звено.
Примеры PBRM включают, но этим не ограничивая, полноразмерные антитела, такие как IgG и IgM, фрагменты антител, такие как Fabs, scFv, scFvFc, верблюжьи Fab2 и другие подобные, малые белки и пептиды.
В одном варианте осуществления PBRM представляет собой полноразмерное антитело или гуманизированное антитело против 5T4 scFvFc. Например, PBRM представляет собой лиганд (LG), включающий иммуноглобулин или его функциональный фрагмент, который нацелен на человеческий онкофе-тальный белок 5T4.
В дополнительном варианте осуществления предлагается терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат, применяемый в противоопухолевых терапиях.
Терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат включает:
(a) лиганд (LG), который включает иммуноглобулин или его функциональный фрагмент, который
нацелен на человеческий онкофетальный белок 5Т4, при этом лиганд (например, который в некоторых
вариантах осуществления имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более) связан к тому
же с m5 в полимерных каркасных структурах (b), где m5 имеет числовое значение от единицы до прибли-
зительно десяти;и
(b) полимерную каркасную структуру, включающую поли(1-гидроксиметилэтиленгидрокси-
метилформаль) (PHF), который имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40
кДа, где полимерная каркасная структура включает случайным образом расположенные мономерные
звенья m, гт, m2, m3a и m3b, определяемые следующим образом:
(i) m3a
где m3a отсутствует или от 1 до приблизительно 17 мономерных m3a звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре и в каждом звене, Xa и Xb независимо выбираю из (A): один представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеимидо, или (B): Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
(ii) m3b
где сульфидная связь (-S-) образует точку присоединения к LG, и где от 1 до приблизительно 8 мономерных m3b звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре, где сумма m3a и m3b составляет от 1 до 18, и где атом серы является частью лиганда (LG);
(iii) m
где от 1 до приблизительно 300 мономерных m звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре; (iv) mi
где от 1 до приблизительно 140 мономерных m1 звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре; и (v): m2
ОН О
где от 1 до приблизительно 40 мономерных m2 звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре; где в каждом из мономерных звеньев m, m1, m2, m3a и m3b Х представляет собой CH2, О или NH, и сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300, и где в каждом случае присутствия D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5 кДа, и ^ между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе.
В одном варианте осуществления терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат имеет следующую структуру:
где PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 5 до 10 кДа; m имеет численное значение от 1 до 75, m1 имеет численное значение от приблизительно 5 до приблизительно 35, m2 имеет численное значение от приблизительно 3 до приблизительно 10, m3a имеет численное значение от 0 до приблизительно 4, m3b имеет численное значение от 1 до приблизительно 5, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75 и m5 имеет численное значение от 2 до приблизительно 4.
В дополнительном варианте осуществления предлагается терапевтическое анти-5Т4 лекарственное средство и нацеленный конъюгат, применяемый в противоопухолевых терапиях. Конъюгат включает полимерную каркасную структуру, включающую поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаль) (PHF), имеющий молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, где конъюгат имеет следующую структуру:
где m5 имеет численное значение от 1 до 10; m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300; m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140; m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40; m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 17; m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8; где сумма m3a и m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18; и сумма m, mb m2 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300; Х представляет собой NH; один из Xa или Xb представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеимидо; и где в каждом случае присутствия D представляет собой
независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5 кДа, и ^ между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе; где ANTI-5T4 представляет собой анти-5Т4 лиганд, который включает иммуноглобулин или его функциональный фрагмент, который является селективным в отношении человеческого онкофетального антигена 5Т4. Например, молекулярная масса анти-5Т4 составляет по меньшей мере приблизительно 40 кДа.
В еще одном дополнительном варианте осуществления предлагается терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат, применяемый в противоопухолевых терапиях, который включает анти-5Т4 и полимерную каркасную структуру поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаль) (PHF), включающую показанные ниже звенья, которые могут быть случайным образом соединены друг с другом
где ANTI-5T4 представляет собой конструкцию одноцепочечного антитела, включающую аминную последовательность, обозначенную как SEQ ID NO: A, PHF имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, среднее отношение полимерной каркасной структуры к антителу против 5Т4 составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1, отношение AF НРА к антителу против 5Т4 составляет от приблизительно 12:1 до приблизительно 18:1.
В некоторых вариантах осуществления полимерная каркасная структура изобретения содержит расположенные случайным образом мономерные звенья m, m1, m2, m3a и m3b. В некоторых вариантах осуществления полимерная каркасная структура изобретения содержит расположенные случайным образом мономерные звенья m, m1, m2 и m3b.
В некоторых вариантах осуществления полимерная каркасная структура изобретения содержит расположенные случайным образом мономерные звенья m, m1, m7, m3a и m3b. В некоторых вариантах осуществления полимерная каркасная структура изобретения содержит расположенные случайным образом мономерные звенья m, m1, m7 и m3b.
В другом аспекте изобретение предлагает композиции, включающие конъюгаты, способы их получения и способы их применения при лечении различных расстройств, включая, но этим не ограничивая, онкологическое заболевание. Онкологическое заболевание, которое целенаправленно подвергают лечению, представляет собой рак заднего прохода, астроцитому, лейкоз, лимфому, рак головы и шеи, рак печени, рак яичек, рак шейки матки, саркому, гемангиому, рак пищевода, рак глаза, рак гортани, рак рта, мезотелиому, рак кожи, миелому, рак полости рта, рак прямой кишки, рак горла, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак почки или рак желудочно-кишечного тракта.
Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей описанную в изобретении полимерную каркасную структуру или конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу диагностирования расстройства у субъекта, относительно которого существуют подозрения о наличии у него этого расстройства. Способ включает введение эффективного количества описанного в изобретении конъюгата субъекту, относительно которого существуют подозрения о наличии у него расстройства, или проведение анализа для детектирования антигена-мишени/рецептора-мишени во взятом у субъекта образце с целью определения, имеет ли место экспрессия антигена-мишени или рецептора-мишени у субъекта.
Если не определено иначе, то все используемые в описании изобретения технические и научные
термины имеют значения, которые являются общепринятыми для специалиста в той области, к которой относится это изобретение. В описании изобретения формы единственного числа часто включают множественное число, если из текста явно не следует противоположное. Несмотря на то, что при осуществлении или проверке настоящего изобретения могут быть использованы способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в изобретении способам и материалам, тем не менее, ниже описаны подходящие способы и материалы. Содержание всех упоминаемых в описании изобретения публикаций, патентных заявок, патентов и других литературных источников включено в изобретение путем ссылки на них. Предполагается, что приводимые в описании изобретения ссылки не являются прототипом заявляемого изобретения. В случае возникновения противоречий приоритет следует отдавать настоящему описанию, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстрациями и их не следует считать ограничениями для изобретения.
Одно из преимуществ настоящего изобретения заключается в том, что описанные в изобретении конъюгаты белок-полимер-лекарственное средство или полимерные каркасные структуры значительно повышают биодоступность вводимых лекарственных средств и/или повышают биодоступность белка, присоединенного к полимерному носителю. Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что эффективность описанных в изобретении конъюгатов белок-полимер-лекарственное средство повышается или, по меньшей мере, сохраняется практически на том же самом уровне при увеличении загрузки лекарственного средства в конъюгатах. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что конъюгаты белок-полимер, образованные в результате конъюгации тиола с цистеиновым фрагментом белка, характеризуются значительно более высокой стабильностью. Другие характерные черты и преимущества изобретения станут очевидными из следующих далее подробного описания изобретения и пунктов формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток ВТ474 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, PBRM (трастузумаба) при 10 мг/кг, конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство, описанных в примере 4 или примере 13, при 2,5 и 5 мг/кг.
На фиг. 2 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток JIMT-1 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, PBRM (трастузумаба) при 10 мг/кг, конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство, описанных в примере 4 или примере 7, при 2,5 мг/кг.
На фиг. 3 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток HL-60 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, PBRM (линтузумаба) при 20 мг/кг, или конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство, описанных в примере 8, при 20 мг/кг.
На фиг. 4 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток JIMT-1 клеток (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, PBRM (трастузумаба) при 20 мг/кг, кадсила(r) при 20 мг/кг или конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство, описанных в примере 14, при 2, 0,67 или 0,3 мг/кг.
На фиг. 5 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо или конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство, описанного в примере 15, при 3, 1 или 0,3 мг/кг.
На фиг. 6 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство, описанных в примере 14, при 0,67 мг/кг, или в примере 16, при 3 мг/кг.
На фиг. 7 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо или конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство, описанного в примере 33, при 0,67 мг/кг; в примере 43А, при 1 мг/кг или примере 43С при 0,67 или 3 мг/кг.
На фиг. 8 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, конъюгата полимер-лекарственное средство, описанного в примере 5А, при 0,22 мг/кг, или конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство, описанных в примере 30B или примере 30C, в каждом случае при 2 мг/кг, в примере 40 при 0,67 мг/кг, или примере 43В при 1 мг/кг, или в примере 38 при 10 мг/кг, или в примере 39 при 10 мг/кг, в каждом случае вводимых один раз в неделю в течение 3 недель.
На фиг. 9 графически приведены данные по ответной реакции опухоли у мышей, инокулированной под кожу с помощью опухолевых клеток JIMT-1 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введе
ния в виде разовой дозы на 1-й день плацебо, примера 40 при 1 мг/кг и примера 43С при 2 мг/кг.
На фиг. 10 графически приведены фармакокинетические данные по плазме для конъюгированного AF НРА (суммарно), неконъюгированного AF НРА и AF (обозначенного как "свободный AF-HPA") и трастузумаба у мышей, которым инокулировали под кожу клетки ВТ474, после болюсного внутривенного введения конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство, описанного в примере 4, при 5 мг/кг, 3 животных/момент времени.
На фиг. 11 графически приведены данные по аффинности и кинетике 5Т4-специфического scADC к человеческому 5Т4 внеклеточному домену, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса. Аффинность связывания (KD <30 pM) является такой же, как аффинность связывания неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc.
На фиг. 12 графически приведены данные по противоопухолевой активности 5Т4-специфического scADC, измеренной в модели ксенотрансплантации опухоли А431. Объем опухоли определяется в указанный день. Объемы выражают как mean±SEM (среднее значение±стандартная ошибка среднего значения. Статистический анализ проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа, затем методом апостериорного анализа по критерию Бонферрони, используя программу Graph Pad Prism (Version.5).
На фиг. 13 графически приведены данные по противоопухолевой активности 5Т4-специфического scADC у безтимусных мышей, несущих MDA-MB-231 5T4, сверхэкспрессирующий трансфицированную ксенотрансплантированную опухоль. Объемы выражают как mean±SEM (среднее значение±стандартная ошибка среднего значения). Статистический анализ проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа, затем методом апостериорного анализа по критерию Бонферрони, используя программу Graph Pad Prism (Version.5).
Подробное описание конкретных предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Настоящее изобретение предлагает новые конъюгаты белок-полимер-лекарственное средство, полимерные каркасные структуры для получения конъюгатов, способы синтеза конъюгатов или полимерных каркасных структур, содержащие их фармацевтические композиции и различные варианты применения конъюгатов.
Настоящее изобретение также предлагает новые конъюгаты полимер-лекарственное средство, способы синтеза конъюгатов, содержащие их фармацевтические композиции и различные варианты применения конъюгатов.
Настоящее изобретение также предлагает новые производные лекарственных средств, способы синтеза производных, содержащие их фармацевтические композиции и различные варианты применения производных лекарственных средств.
Определения/терминология
В изобретения также более подробно описываются конкретные соединения настоящего изобретения и определения конкретных функциональных групп. Для целей этого изобретения химические элементы определяются в соответствии с Периодической таблицей элементов по версии службы Chemical Abstracts (CAS), приведенной в Справочнике по химии и физике (Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.) на внутренней стороне обложки, а конкретные функциональные группы обычно определяются так, как описано в изобретении. Кроме того, общие принципы органической химии, так же как и конкретные функциональные фрагменты и их реакционная способность, описаны в монографии "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, содержания которых включено в изобретение путем ссылки на них. Кроме того, для обычного специалиста в этой области является очевидным, что в описанных в изобретении методах синтеза могут применяться различные защитные группы.
Подразумевается, что в следующем далее описании и пунктах формулы изобретения применение формы единственного числа охватывает как форму единственного числа, так и форму множественного числа, если только в описании изобретения не указано иное или налицо явное противоречие с контекстом. Если не указано иначе, то термины "состоящий", "имеющий", "относящийся", как в выражении "относящийся к химической формуле", "включающий" и "содержащий", следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие "включая, но этим не ограничивая"). Например, полимерная каркасная структура конкретной формулы включает все мономерные звенья, представленные в формуле, и может также включать дополнительные мономерные звенья, не представленные в формуле. Кроме того, во всех случаях, когда в варианте осуществления применяется термин "включающий" или другой открытый термин, следует иметь в виду, что аналогичный вариант осуществления может быть заявлен более узко путем применения промежуточного термина "состоящий в основном из" или замкнутого термина "состоящий из".
Термин "примерно", "приблизительно" или "приблизительный", когда его используют в отношении численного значения, означает, что он включает ряд или диапазон значений. Например, "приблизительно X" включает диапазон значений, которые представляют собой отклонение ±20%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, ±0,5%, ±0,2% или ±0,1% от X, где Х представляет собой численное значение. В одном варианте осуществления термин "приблизительно" относится к диапазону значений, которые на 5% больше или меньше указанной величины. В другом варианте осуществления термин "приблизительно" относится к диапазону
значений, которые на 2% больше или меньше указанной величины. В другом варианте осуществления термин "приблизительно" относится к диапазону значений, которые на 1% больше или меньше указанной величины.
Предполагается, что перечисление диапазонов величин применяют просто для того, чтобы в сокращенной форме указать индивидуально каждую отдельную величину, попадающую в указанный диапазон, если в описании изобретения не указано иначе, и каждая отдельная величина приводится в описании изобретения, как если бы ее индивидуально упомянули в изобретении. Применяемый в описании изобретения диапазон, если не указано иначе, включает два предела диапазона. Например, выражения "при этом Х представляет собой целое число между 1 и 6" и "при этом Х представляет собой целое число от 1 до 6" оба означают, что "Х представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6", т.е. термины "между Х и Y" и "в диапазоне от Х до Y" включают Х и Y и целые числа между ними.
Все описанные в изобретении методы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если в изобретении не указано иначе или же это явно не находится в противоречии с контекстом. Использование в изобретении всех без исключения примеров или выражений, в которых что-либо приводится в качестве примера (например, "такой как"), предназначено исключительно для более подробной иллюстрации изобретения и не должно рассматриваться в качестве ограничения объема пунктов формулы изобретения, если в явном виде не заявляется иное. Ни одно выражение в описании изобретения не следует рассматривать в качестве указания на то, что любой незаявленный элемент является существенным для формулы изобретения.
"Антитело" относится к полноразмерному антителу или функциональному фрагменту антитела, содержащему иммуноглобулин. Под "функциональным фрагментом" подразумевается достаточная часть иммуноглобулина или антитела, фрагмент которой эффективно связывается или образует комплекс с молекулой клеточной поверхности для данной популяции клеток-мишеней, например с человеческим онкофетальным антигеном.
Используемый в изобретении человеческий онкофетальный антиген включает, например, опухоле-ассоциированные белки, такие как а-фетопротеин, карциноэмбриональный антиген, специфический антиген простаты и белок онкофетального антигена (известный также как незрелый рецепторный белок ламинина, который связан, например, с раком кишечника и нефробластомой).
Иммуноглобулин может быть очищен, получен рекомбинантно, получен синтетически или в результате их комбинации, используя методы, известные специалистам в этой области. Несмотря на то, что иммуноглобулины в IgG антителах или полученные из них лучше всего подходят для использования в этом изобретении, тем не менее, могут быть выбраны иммуноглобулины из любых классов или подклассов, например IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. Предпочтительно, чтобы иммуноглобулин относился к классу IgG, включающему, но этим не ограничивая, IgG подклассы (IgG1, 2, 3 и 4), или классу IgM, который способен специфично связывать указанный эпитоп на антигене. Антитела могут представлять собой ин-тактные иммуноглобулины, полученные из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут представлять собой иммунореактивные части интактных иммуноглобулинов. Антитела могут существовать в различных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, камелизированные однодоменные антитела, внутриклеточные антитела ("интратела"), рекомби-нантные антитела, антиидиотипические антитела, доменные антитела, линейное антитело, полиспецифическое антитело, фрагменты антител, такие как Fv, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, одноцепочеч-ные вариабельные фрагменты антител (scFv), тандемные/бис-scFv, Fc, pFc', scFvFc (или scFv-Fc), Fv (dsfv) с дисульфидными мостиками, биспецифические антитела (bc-scFv), такие как BiTE антитела; ка-мелизированные антитела, антитела с измененной поверхностью, гуманизированные антитела, полностью человеческие антитела, однодоменное антитело (sdAb, также известное как NANOBODY(r)), химерные антитела, химерные антитела, включающие по меньшей мере одну человеческую константную область, антитела с двойственным сродством, такие как ретаргетинговые белки с двойственным сродством (DART(tm)), двухвалентные (или бивалентные) одноцепочечные вариабельные фрагменты (di-scFvs, bi-scFvs), включающие, но этим не ограничивая, минитела, диатела, триатела или тритела, тетратела и другие подобные антитела, и поливалентные антитела. "Фрагмент антитела" относится по меньшей мере к части вариабельной области молекулы иммуноглобулина, которая связывает с его мишенью, т.е. к ан-тигенсвязывающей области. Используемый в описании изобретения термин "антитело" относится как к полноразмерному антителу, так и к фрагментам антитела, если не указано иначе.
"Белоксодержащая распознающая молекула" или "PBRM" относится к молекуле, которая распознает и связывает маркер или рецептор клеточной поверхности, такой как трансмембранный белок, поверхностный иммоболизированный белок или протогликан. Примеры PBRM включают, но этим не ограничивая, антитела (например, трастузумаб, цетуксимаб, ритуксимаб, бевацизумаб, эпратузумаб, велтузу-маб, лабетузумаб, В7-Ш, В7-Ю, СА125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, с-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, c-Kit, MUC1 и анти-5Т4) или пептиды (пептиды, направленные на LHRH рецептор, ЕС-1 пептид), липокалины, такие как, например, антикалины, белки, такие как, например, интерфероны, лимфокины, факторы роста, колониестимулирующие фак
торы и другие подобные, пептиды или мимики пептидов и другие подобные. Белоксодержащая распознающая молекула, помимо тагетирования конъюгата модифицированного полимера на конкретную клетку, ткань или область, может также обладать определенной терапевтической активностью, такой как антипролиферативная (цитостатическая и/или цитотоксическая) активность в отношении клетки-мишени или пути. Белоксодержащая распознающая молекула включает или может быть сконструирована так, чтобы включать по меньшей мере одну химически реакционноспособную группу, такую как, -COOH, первичный амин, вторичный амин -NHR, -SH, или химически реакционноспособный фрагмент или боковые цепи аминокислоты, такой как, например, тирозин, гистидин, цистеин или лизин. В одном варианте осуществления PBRM может представлять собой лиганд (LG) или тагетирующий фрагмент, который специфически связывается или образует комплексы с молекулой клеточной поверхности, такой как рецептор или антиген клеточной поверхности, для данной популяции клеток-мишеней. Вслед за специфическим связыванием или комплексообразованием лиганда с его рецептором клетка получает возможность захватить лиганд или лиганд-лекарственное средство-конъюгат, который затем проникает внутрь клетки. Используемый в изобретении лиганд, который "специфически связывается или образует комплекс с молекулой клеточной поверхности" или "таргетирует молекулу клеточной поверхности", преимущественно связан с молекулой клеточной поверхности за счет межмолекулярных сил. Например, лиганд может быть преимущественно связан с молекулой клеточной поверхности при величине константы аффинности KD меньше чем приблизительно 50 нМ, меньше чем приблизительно 5 нМ, или меньше чем приблизительно 500 пМ. Методы измерения аффинности связывания лиганда с молекулой клеточной поверхности хорошо известны; например, один метод называется методом поверхностного плазмон-ного резонанса (SPR). В одном варианте осуществления, лиганд используют для таргетирования, и он не обладает обнаруживаемым терапевтическим эффектом отдельно от лекарственного средства, доставку которого он осуществляет. В другом варианте осуществления, лиганд функционирует одновременно как в качестве таргетирующего фрагмента, так и в качестве терапевтического или иммуномодулирующего средства (например, для повышения активности действующего лекарственного средства или пролекарст-ва).
Используемый в изобретении термин "биологически совместимые" применяется для описания соединений, которые вызывают минимальные деструктивные эффекты или ответные реакции организма реципиента при контакте с жидкостями организма или живыми клетками или тканями. Так, используемый в изобретении термин "биологически совместимая группа" относится к алифатическому, циклоал-кильному, гетероалифатическому, гетероциклоалкильному, арильному или гетероарильному фрагменту, который подпадает под приводимое в изобретении определение термина "биологически совместимый". Используемый в изобретении термин "биологическая совместимость" также означает, что соединения характеризуются минимальными взаимодействиями с распознающими белками, например природными антителами, клеточными белками, клетками и другими компонентами биологических систем, если только такие взаимодействия не являются специально желательными. Поэтому вещества и функциональные группы, которые специально подобраны так, чтобы оказывать минимальные описанные выше воздействия, например, лекарственные средства и пролекарства, считают биологически совместимыми. Предпочтительно, чтобы соединения считались "биологически совместимыми" (за исключением соединений, которые должны быть цитотоксичными, таких как, например, антинеопластичные средства), если их добавление к нормальным клеткам in vitro при концентрациях, аналогичных предполагаемым системным in vivo концентрациям, приводило бы в результате к гибели клеток в количестве менее чем или равном 1% в течение времени, эквивалентного периоду полувыведения соединения in vivo (например, периода времени, требующегося для того, чтобы было удалено/выведено 50% введенного in vivo соединения), и их введение in vivo вызывало бы минимальные и приемлемые с медицинской точки зрения воспаление, реакцию на чужеродные тела, иммунотоксичность, химическую токсичность и/или другие такие отрицательные воздействия. В приведенном выше предложении термин "нормальные клетки" относится к клеткам, которые не являются целью уничтожения или же значительного повреждения с помощью испытуемого соединения.
"Биоразлагаемый". Используемый в изобретении термин "биоразлагаемые" полимеры представляют собой полимеры, которые восприимчивы к биологическому превращению in vivo. Используемые в изобретении "биоразлагаемые" соединения или фрагменты представляют собой соединения или фрагменты, которые при поглощении клетками могут разрушаться под воздействием лизосомальных или других химических превращений или в результате гидролиза на компоненты, которые клетки могут либо повторно использовать, либо которые могут быть удалены без значительного токсического воздействия на клетки. Используемый в изобретении термин "биорасщепляемый" имеет такое же значение, как термин "биораз-лагаемый". Предпочтительно, чтобы образовавшиеся в результате разрушения фрагменты приводили к небольшой перегрузке или не приводили к перегрузке органа или клеток или к патологическим процессам, вызываемым такой перегрузкой, или к другим отрицательным воздействиям in vivo. Примеры процессов биоразложения включают ферментативный и неферментативный гидролиз, окисление и восстановление. Описанные в изобретении подходящие условия для неферментативного гидролиза конъюгатов биоразлагаемый белок-полимер-лекарственное средство (или их компонентов, например биоразлагаемо
го полимерного носителя и связующих звеньев между носителем и антителом или молекулой лекарственного средства), включают, например, воздействие воды на биоразлагаемые конъюгаты при температуре и pH лизосомального внутриклеточного компартмента. Биоразложение некоторых конъюгатов белок-полимер-лекарственное средство (или их компонентов, например биоразлагаемого полимерного носителя и связующих звеньев между носителем и антителом или молекулой лекарственного средства) может быть также интенсифицировано вне клеток, например, в областях организма животного с низкими значениями pH, например в области воспаления, в непосредственной близости от активированных макрофагов или других клеток, выделяющих факторы, облегчающие разрушение. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления эффективный размер полимерного носителя при pH ~7,5 заметно не изменяется в течение от 1 до 7 дней и сохраняет около 50% своего исходного размера в течение, по меньшей мере, нескольких недель. С другой стороны, предпочтительно, чтобы при pH ~5 полимерный носитель заметно разрушался в течение от 1 до 5 дней и полностью превращался в низкомолекулярные фрагменты в течение от двух недель до нескольких месяцев. Целостность полимера при таких испытаниях может быть определена, например, методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Несмотря на то, что в некоторых случаях предпочтительным может быть более быстрое разрушение, тем не менее, обычно более желательно, чтобы полимер разрушался в клетках со скоростью, которая не превышает скорости метаболизации или экскреции фрагментов полимера клетками. В предпочтительных вариантах осуществления полимеры и побочные продукты биоразложения полимеров являются биологически совместимыми.
"Биодоступность". Термин "биодоступность" относится к системной доступности (т.е. к концентрациям в крови/плазме) данного количества лекарственного средства или соединения, вводимого субъекту. Биодоступность является абсолютным термином, в котором указывается как время (скорость), так и суммарное количество (доля) лекарственного средства или соединения, которое попадает в системное кровообращение из введенной лекарственной формы.
Используемое в изобретении "соединение, блокирующее малеимидо" относится к соединению, которое может реагировать с малеимидо с превращением его в сукцинимид, и "фрагмент, блокирующий малеимидо" относится к химическому фрагменту, присоединенному к сукцинимиду при конверсии. В конкретных вариантах осуществления соединение, блокирующее малеимидо, представляет собой соединение, имеющее терминальную тиольную группу для реакции с малеимидом. В конкретных вариантах осуществления соединение, блокирующее малеимидо, представляет собой водорастворимое соединение, вследствие чего реакция с малеимидом может проходить в водном растворе. Например, полученный фрагмент, блокирующий малеимидо, является водорастворимым или гидрофильным. В одном варианте осуществления соединение, блокирующее малеимидо, представляет собой цистеин, N-ацетилцистеин, цистеинметиловый эфир, N-метилцистеин, 2-меркаптоэтанол, 3-меркаптопропановую кислоту, 2-меркаптоуксусную кислоту, меркаптометанол (т.е. HOCH2SH), бензилтиол, в котором фенил замещен с помощью одного или более гидрофильных заместителей, или 3-аминопропан-1-тиол.
"Гидрофильный". Термин "гидрофильный", когда его используют, например, в отношении заместителей на мономерных звеньях полимера или на фрагменте, блокирующем малеимидо, которые придают им свойства гидрофильности или растворимости в воде, практически не отличается от общепринятого в науке значения этого термина, и он обозначает химические фрагменты, которые содержат ионизируемые, полярные или поляризуемые атомы, или же которые могут быть сольватированы молекулами воды. Так, используемая в изобретении гидрофильная группа относится к алифатическому, циклоалкильному, гетероалифатическому, гетероциклоалкильному, арильному или гетероарильному фрагменту, который подпадает под приведенное в изобретении определение термина "гидрофильный". Примеры конкретных подходящих гидрофильных органических фрагментов включают, без ограничения, алифатические или гетероалифатические группы, включающие цепочку атомов длиной приблизительно от одного до двенадцати атомов, гидроксил, гидроксиалкил, амин, карбоксил, амид, эфир карбоновой кислоты, тиоэфир, альдегид, нитрил, изонитрил, нитрозо, гидроксиламин, меркаптоалкил, гетероцикл, карбаматы, карбоно-вые кислоты и их соли, сульфоновые кислоты и их соли, эфиры сульфоновых кислот, фосфорные кислоты и их соли, фосфатные эфиры, полигликолевые эфиры, полиамины, поликарбоксилаты, полиэфиры и политиоэфиры. В конкретных вариантах осуществления гидрофильные заместители включают карбоксильную группу (COOH), альдегидную группу (CHO), кетоновую группу (COC1-4 алкил), метилол (CH2OH) или гликоль (например, CHOH-CH2OH или CH-(CH2OH)2), NH2, F, циано, SO3H, PO3H и другие подобные группы.
Термин "гидрофильный", когда его используют в отношении полимеров изобретения, обычно не отличается от общепринятого в науке значения этого термина и обозначает полимеры, включающие определенные выше гидрофильные функциональные группы. В предпочтительном варианте осуществления гидрофильный полимер представляет собой водорастворимый полимер. Гидрофильность полимера может быть непосредственно измерена путем определения энергии гидратации или определена путем исследования поведения полимера между двумя жидкими фазами или методом хроматографии на твердых фазах с известной гидрофобностью, таких как, например, С4 или C18.
"Полимерный носитель". Используемый в изобретении термин "полимерный носитель" относится к
полимеру или модифицированному полимеру, который применяют для ковалентного связывания, или который может быть ковалентно связан с одной или более молекул лекарственного средства через специально подобранное связующее звено и/или с одной или более PBRM через специально подобранное связующее звено.
"Физиологические условия". Используемая в изобретении фраза "физиологические условия" относится к диапазону химических (например, pH, ионная сила) и биохимических (например, концентрации ферментов) условий, которые характерны для внеклеточных жидкостей живых тканей. Для большинства нормальных тканей физиологическое значение pH составляет приблизительно от 7,0 до 7,4. Плазма циркулирующей крови и нормальная внутритканевая жидкость представляют собой типичные примеры нормальных физиологических условий.
"Полисахарид", "углевод" или "олигосахарид". Термины "полисахарид", "углевод" или "олигосаха-рид" являются общеизвестными и обычно относятся к веществам, имеющим химическую формулу (CH2O)n, где, как правило, n> 2, и их производным. Углеводы представляют собой полигидроксиальдеги-ды или полигидроксикетоны или продукты изменения этих веществ в результате простых химических превращений, таких как гидролиз, окисление или восстановление. Обычно углеводы присутствуют в форме циклических ацеталей или кеталей (таких как, глюкоза или фруктоза). Эти циклические звенья (моносахариды) могут быть соединены друг с другом с образованием молекул с малым числом (олигоса-хариды) или с некоторым числом (полисахариды) звеньев моносахаридов. Обычно углеводы с четко определенным числом, типом и расположением моносахаридных звеньев называют олигосахаридами, а углеводы, состоящие из смесей молекул с различным числом и/или расположением моносахаридных звеньев, называют полисахаридами. Термины "полисахарид", "углевод" и "олигосахарид" используются в изобретении взаимозаменяемо.
Полисахарид может включать природные сахара (например, глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, арабинозу, рибозу и ксилозу) и/или производные природных сахаров (например, 2'-фторрибозу, 2'-деоксирибозу и гексозу).
"Лекарственное средство". Используемый в изобретении термин "лекарственное средство" относится к соединению, которое является биологически активным и обеспечивает требуемый физиологический эффект после введения субъекту, если ему это необходимо (например, к активному фармацевтическому ингредиенту).
"Пролекарство". Используемый в изобретении термин "пролекарство" относится к предшественнику активного лекарственного средства, т.е. к соединению, которое может быть превращено в активное лекарственное средство. Обычно такое пролекарство является объектом воздействия химических реакций in vivo, которые превращают лекарственное средство в физиологически активную форму. В некоторых случаях пролекарство само по себе может обладать требуемым физиологическим эффектом. Требуемый физиологический эффект может представлять собой, например, терапевтический, цитотоксиче-ский, иммуномодулирующий или другие подобные эффекты.
"Цитотоксический". Используемый в изобретении термин "цитотоксический" означает токсичный для клеток или для выбранной популяции клеток (например, для раковых клеток). Токсический эффект может приводить к гибели клеток и/или лизису. В некоторых случаях токсический эффект может представлять собой сублетальное разрушающее действие на клетку, например замедление или прекращение клеточного роста. Для достижения цитотоксического эффекта лекарственное средство или пролекарство может быть выбрано, в частности, из группы, состоящей из средства, повреждающего ДНК, средства, разрушающего микротрубочки, или цитотоксического белка или полипептида.
"Цитостатический". Используемый в изобретении термин "цитостатический" относится к лекарственному средству или другому соединению, которое замедляет или останавливает рост и/или размножение клеток.
"Малая молекула". Используемый в описании изобретения термин "малая молекула" относится к молекулам, либо природным, либо созданным искусственно (например, путем химического синтеза), которые имеют относительно низкую молекулярную массу. Предпочтительными малыми молекулами являются биологически активные в том смысле, что они вызывают местный или системный эффект у животных, предпочтительно у млекопитающих, более предпочтительно у людей. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления малая молекула является лекарственным средством, и малую молекулу называют "молекулой лекарственного средства", или "лекарственным средством", или "терапевтическим средством". В конкретных вариантах осуществления молекула лекарственного средства имеет молекулярную массу меньше чем или равную приблизительно 5 кДа. В других вариантах осуществления молекула лекарственного средства имеет молекулярную массу меньше чем или равную приблизительно 1,5 кДа. В вариантах осуществления молекулу лекарственного средства выбирают из алкалоидов барвинка, ауристатинов, дуокармицинов, ингибиторов киназы, ингибиторов MEK, ингибиторов KSP, ингибиторов PI3 киназы, калихеамицинов, SN38, камптотецина, ингибиторов топоизомеразы, неприродных кам-птотецинов, ингибиторов синтеза белка, ингибитора РНК-полимеразы, пирролобензодиазепинов, май-танзиноидов, лекарственных средств, связывающих ДНК, лекарственных средств, вызывающих интерка-ляцию ДНК, и их аналогов. Предпочтительно, хотя и необязательно, чтобы лекарственное средство пред
ставляло собой средство, которое уже было признано безопасным и эффективным для применения соответствующим государственным органом или организацией, например Управлением США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA). Например, лекарственные средства, разрешенные для применения на людях, перечислены в своде федеральных правил FDA 21 C.F.R §§ 330,5, 331-361 и 440-460; лекарственные средства, разрешенные для применения на животных, перечислены в своде федеральных правил FDA 21 C.F.R §§ 500-589, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них, все считаются подходящими для использования с гидрофильными полимерами настоящего изобретения. Классы молекул лекарственных средств, которые могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения, включают, но этим не ограничивая, противораковые средства, радионуклиды, витамины, средства против СПИДа, антибиотики, иммунодепрессанты, противовирусные средства, ингибиторы ферментов, нейротоксины, опиоиды, снотворные средства, антигистаминные средства, смазывающие вещества, транквилизаторы, противосудорожные средства, миорелаксанты и проти-вопаркинсонические средства, антиспазмогенные средства и средства против мышечных судорог, в том числе блокаторы каналов, миотические средства и антихолинергические средства, противоглаукомные средства, антипаразитарные и/или антипротозойные средства, модуляторы взаимодействий клетка-экстрацеллюлярный матрикс, в том числе ингибиторы клеточного роста и антиадгезивные молекулы, сосудорасширяющие средства, ингибиторы синтеза ДНК, РНК или белка, антигипертензивные средства, анальгетики, жаропонижающие средства, стероидные и нестероидные противовоспалительные средства, антиангиогенные факторы, антисекреторные факторы, антикоагулянты и/или антитромботические средства, местные анестетики, офтальмологические средства, простагландины, антидепрессанты, нейролептики, противорвотные средства, радиофармацевтические средства. Многие крупные молекулы также являются лекарственными средствами, и такие крупные молекулы могут быть использованы в конъюга-тах и других конструкциях, описанных в изобретении. Примеры подходящих крупных молекул включают, например, молекулы на основе аминокислот. Молекулы на основе аминокислот могут, в частности, включать, например, пептиды, полипептиды, ферменты, антитела, иммуноглобулины или их функциональные фрагменты.
Более полный, хотя и не исчерпывающий, перечень классов и конкретных лекарственных средств, подходящих для применения в настоящем изобретении, можно найти в монографии "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999 и энциклопедии "Merck Index: An encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", Edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них. В предпочтительных вариантах осуществления лекарственное средство, используемое в этом изобретении, представляет собой терапевтическое средство, которое имеет антипролиферативную (цитостатическую и/или цитотоксическую) активность в отношении клетки-мишени или пути. Лекарственное средство может иметь химически реакционноспособную группу, такую как, например, -COOH, первичный амин, вторичный амин -NHR, -OH, -SH, -C(O)H, -C(O)R, -C(O)NHR2b, C(S)OH, -S(O)2OR2b, -P(O)2OR2b, -CN, -NC или -ONO, где R представляет собой алифатический, гетероалифатический, карбоциклический или гетероциклоалкильный фрагмент, и R2b представляет собой водород, алифатический, гетероалифатиче-ский, карбоциклический или гетероциклический фрагмент.
Используемые в описании изобретения "производное лекарственного средства" или "модифицированное лекарственное средство" или другие подобные термины относятся к соединению, которое включает молекулу лекарственного средства, предназначенного для введения с помощью конъюгата изобретения, и функциональную группу, способную связывать молекулу лекарственного средства с полимерным носителем.
Используемый в описании изобретения термин "активная форма" относится к форме соединения, которая проявляет ожидаемую фармацевтическую активность in vivo или in vitro. В частности, когда молекула лекарственного средства, предназначенного для доставки с помощью конъюгата изобретения, высвобождается из конъюгата, активная форма может представлять собой лекарственное средство само по себе или его производные, которые проявляют ожидаемые терапевтические свойства.
Высвобождение лекарственного средства из конъюгата может достигаться за счет разрушения био-разлагаемой химической связи связующего звена, которое связывает лекарственное средство с полимерным носителем. Активные производные лекарственного средства могут, соответственно, включать часть связующего звена.
"Диагностическая метка". Используемый в изобретении термин "диагностическая метка" относится к атому, группе атомов, фрагменту или функциональной группе, нанокристаллу или другому дискретному элементу рассматриваемой композиции, который может быть детектирован in vivo или ex vivo с помощью известных в науке аналитических методов. Связанные с конъюгатом настоящего изобретения такие диагностические метки позволяют осуществлять мониторинг конъюгата in vivo. В качестве варианта или дополнительно конструкции и композиции, которые включают диагностические метки, могут применяться для мониторинга биологических функций или структур. Примеры диагностических меток включают, без ограничения, метки, которые могут быть использованы в медицинских диагностических методиках, такие как, радиоактивные изотопы (радионуклиды) для гамма-сцинтиграфии и позитрон
эмиссионной томографии (PET), контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии (MRI) (например, парамагнитные атомы и суперпарамагнитные нанокристаллы), контрастные вещества для компьютерной томографии и других рентгеновских методов визуализации, средства для ультразвуковых диагностических методов (сонографии), средства для нейтронной активации (например, бор, гадолиний), флуорофоры для различных оптических методов и, в общем случае, фрагменты, которые могут испускать, отражать, поглощать, рассеивать или иным способом воздействовать на электромагнитные поля или волны (например, у-лучи, рентгеновское излучение, радиоволны, микроволновое излучение, видимый свет), частицы (например, а-частицы, электроны, позитроны, нейтроны, протоны) или другие формы радиации, например ультразвук.
Далее приводятся более общие термины, используемые в настоящем изобретении.
"Животное". Используемый в изобретении термин "животное" относится к людям, а также к животным, не относящимся к человеку, на любой стадии развития, включающим, например, млекопитающих, птиц, пресмыкающихся, земноводных, рыб, червеобразных и одноклеточных. Клеточные культуры и образцы живых тканей считают материалом, который может характеризовать множество животных. Предпочтительно, чтобы животное, не относящееся к человеку, представляло собой млекопитающее (например, грызуна, мышь, крысу, кролика, обезьяну, собаку, кошку, примата или свинью). Животным может быть трансгенное животное или человекоподобное существо. Термин "субъект" включает в себя животных.
"Эффективное количество". Обычно применительно к активному веществу или устройству доставки лекарственного средства термин "эффективное количество" обозначает количество, необходимое для достижения требуемой ответной биологической реакции. Для специалистов в этой области является очевидным, что эффективное количество средства или устройства может зависеть от таких факторов, как требуемый ожидаемый биологический результат, доставляемое средство, композиция инкапсулирующей матрицы, ткань-мишень и другие факторы. Например, эффективное количество содержащих антиген микрочастиц, вводимых для иммунизации пациента, представляет собой количество, которое приводит в результате к иммунной реакции, достаточной для предотвращения инфицирования организмом, имеющим вводимый антиген.
Используемый в изобретении термин "природная аминокислота" относится к любой одной из обычных природных L-аминокислот, обнаруживаемых в природных белках, глицину (Gly), аланину (Ala), валину (Val), лейцину (Leu), изолейцину (Не), лизину (Lys), аргинину (Arg), гистидину (His), про-лину (Pro), серину (Ser), треонину (Thr), фенилаланину (Phe), тирозину (Tyr), триптофану (Trp), аспара-гиновой кислоте (Asp), глутаминовой кислоте (Glu), аспарагину (Asn), глутамину (Gin), цистеину (Cys) и метионину (Met).
Используемый в изобретении термин "не встречающаяся в природе аминокислота" относится к любой аминокислоте, которая не является природной аминокислотой. Он включает, например, аминокислоты, которые содержат а-, Р-, ю-, D-, L-аминоацильные остатки. В более широком смысле не встречающаяся в природе аминокислота включает остаток общей формулы
где боковая цепь R отличается от боковых цепей природных аминокислот. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают, но этим не ограничивая, саркозин (N-метилглицин), цитруллин (cit), гомоцитруллин, р-уреидоаланин, тиоцитруллин, гидроксипролин, аллотреонин, пипеколиновую кислоту (гомопролин), а-аминоизомасляную кислоту, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, аллоизолейцин, нор-лейцин, а-метиллейцин, циклогексилглицин, р-циклогексилаланин, р-циклопентилаланин, а-метилпролин, фенилглицин, а-метилфенилаланин и гомофенилаланин.
"Аминоацил". В более широком смысле используемый в изобретении термин "аминоацил" включает в себя природные аминокислоты и не встречающиеся в природе аминокислоты.
"Полиамид" относится к гомо- или гетерополимерам природных аминокислот и не встречающихся в природе аминокислот. Иллюстративные примеры гомополимеров включают, но этим не ограничивая, полилизин, полиаргинин, поли-у-глутаровую кислоту и другие подобные гомополимеры. Иллюстративные примеры гетерополимеров включают, но этим не ограничивая, полимеры, содержащие пептидные фрагменты, выбранные из пептидаз, лизоцимов, металлопротеиназ и других подобных пептидных фрагментов.
"PHF" обозначает поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаль).
Используемые в изобретении термины "полимерное звено", "мономерное звено", "мономер", "звено мономера", "звено", все относятся к повторяющимся структурным звеньям в полимере.
Используемая в изобретении "молекулярная масса" или "MW" полимера или полимерного носителя/каркасной структуры или полимерных конъюгатов относится к средневесовой молекулярной массе,
если не указано иное.
Предполагается, что настоящее изобретение включает все изотопы атомов, входящих в настоящие соединения. Изотопы включают атомы, имеющие одинаковый атомный номер, но различные массовые числа. Общие примеры, без ограничения, изотопов водорода включают тритий и дейтерий. Изотопы углерода включают С-13 и С-14.
Предполагается, что настоящее изобретение включает все изомеры соединения, которые относятся и включают оптические изомеры и таутомерные изомеры, где оптические изомеры включают энантио-меры и диастереомеры, хиральные изомеры и нехиральные изомеры, и оптические изомеры включают выделенные индивидуальные оптические изомеры, так же как и смеси оптических изомеров, включающие рацемические и нерацемические смеси, где изомер может находиться в выделенной форме или в смеси с одним или более другими изомерами.
Полимерные носители
В примерах конкретных вариантов осуществления конъюгаты изобретения находят применение в биомедицинской области, такое как доставка лекарственного средства и тканевая инженерия, и носитель является биологически совместимым и биоразлагаемым. В конкретных вариантах осуществления носитель представляет собой растворимый полимер, наночастицу, гель, липосому, мицеллу, шовный материал, имплантат и другие. В конкретных вариантах осуществления термин "растворимый полимер" охватывает биоразлагаемый биологически совместимый полимер, такой как полиал (например, гидрофильный полиацеталь или поликеталь). В других конкретных вариантах осуществления носитель представляет собой полностью синтетический, полусинтетический или природный полимер. В других конкретных вариантах осуществления носитель является гидрофильным.
В конкретных примерах вариантов осуществления применяемые в настоящем изобретении носители представляют собой биоразлагаемые биологически совместимые полиалы, включающие по меньшей мере одну гидролизуемую связь в каждом мономерном звене, расположенном внутри главной цепи. Это гарантирует, что процесс разложения (в результате гидролиза/расщепления мономерных звеньев) будет в результате приводить к фрагментации полимерного конъюгата на мономерные компоненты (т.е. к разложению), и придает полимерным конъюгатам изобретения свойства биоразлагаемости. Свойства (например, растворимость, биоадгезивность и гидрофильность) биоразлагаемых биологически совместимых полимерных конъюгатов могут быть модифицированы путем последующего замещения дополнительных гидрофильных или гидрофобных групп. Примеры биоразлагаемых биологически совместимых полимеров, подходящих для осуществления изобретения, можно найти, в частности, в патентах США №№ 5811510, 5863990, 5958398, 7838619 и 7790150 и патентном документе U.S. Publication № 2006/0058512, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них. Указание по значимости, получению и применению этого типа полимеров можно найти в перечисленных выше документах. В конкретных вариантах осуществления предполагается, что настоящее изобретение будет особенно полезным в комбинации с упомянутыми выше патентными документами, а также с патентами США №№ 5582172 и 6822086, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них.
Конъюгаты этого изобретения являются гидрофильными, гидролизуемыми и включают молекулы лекарственных средств (например, алкалоиды барвинка или производные, ингибиторы топоизомеразы, такие как, например, SN38, камптотецин, топотекан, эксатекан, не встречающиеся в природе соединения или производные камптотецина, ауристатины, доластатины, неморубицин и его производные, PNU-159682, антрациклин, дуокармицины, ингибиторы киназы (например, ингибиторы PI3 киназы или ингибиторы MEK), ингибиторы KSP, калихемицины, пирролобензодиазепины, майтанзиноиды, элинафид, лекарственные средства, связывающие ДНК, лекарственные средства, вызывающие интеркаляцию ДНК, и стереоизомеры, изостеры, их аналоги и производные) и антитела (например, трастузумаб, цетуксимаб, ритуксимаб, бевацизумаб, эпратузумаб, велтузамаб, лабетузумаб, В7-Ш, В7-Ю, СА125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, с-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, NaPi2b, c-Kit, MUC1 и анти-5Т4) или пептиды (пептиды, таргетирующие LHRH рецептор, ЕС-1 пептид), ковалентно связанные с полимерным носителем с помощью связей, которые содержат одну или более биоразлагаемых химических связей. Так, в конкретных примерах вариантов осуществления носители, подходящие для осуществления настоящего изобретения, представляют собой полиали, имеющие по меньшей мере один ацетальный/кетальный атом кислорода в каждом мономерном звене, расположенном внутри главной цепи. Как уже обсуждалось выше, это гарантирует, что процесс разложения (в результате гидролиза/расщепления ацетальных/кетальных групп полимера) будет в результате приводить к фрагментации полимерного конъюгата на низкомолекулярные компоненты (т.е. к разложению). В конкретных вариантах осуществления биоразлагаемые биологически совместимые полимерные носители, используемые для получения полимерных конъюгатов изобретения, представляют собой природные полисахариды, гликополисахариды и синтетические полимеры полигликозида, полиацеталя, полиамида, полиэфира и полимеры полиэфирного происхождения и продукты их окисления, функционализации, модификации, сшивания и конъюгирования.
В других конкретных вариантах осуществления носитель представляет собой гидрофильный био-разлагаемый полимер, выбранный из группы, состоящей из углеводов, гликополисахаридов, гликолипи
дов, гликоконъюгатов, полиацеталей, поликеталей и их производных.
В конкретных примерах вариантов осуществления носитель представляет собой природный линейный и/или разветвленный биоразлагаемый биологически совместимый гомополисахарид, выбранный из группы, состоящей из целлюлозы, амилозы, декстрана, левана, фукоидана, каррагинана, инулина, пектина, амилопектина, гликогена и ликсинана.
В других конкретных примерах вариантов осуществления носитель представляет собой природный линейный и разветвленный биоразлагаемый биологически совместимый гетерополисахарид, выбранный из группы, состоящей из агарозы, гиалуронана, хондроитин сульфата, дерматан сульфата, кератан сульфата, альгиновой кислоты и гепарина.
В еще одних примерах вариантов осуществления полимерный носитель включает сополимер поли-ацеталя/поликеталя и гидрофильный полимер, выбранный из группы, состоящей из полиакрилатов, поливиниловых полимеров, полиэфиров, полиортоэфиров, полиамидов, полипептидов и их производных.
В еще одном варианте осуществления полимерный носитель представляет собой декстрин, который получают гидролизом крахмала, приготовленного из различных природных продуктов, таких как, например, пшеница, рис, кукуруза и маниока. В зависимости от структуры исходного крахмалсодержащего материала декстрин включает специфическое распределение а-1,4 связей и а-1,6 связей. Так как скорость биоразложения а-1,6 связей обычно меньше, чем скорость разложения а-1,4 связей, предпочтительно, чтобы доля а-1,6 связей была бы меньше чем 10% и более предпочтительно меньше чем 5%. В одном варианте осуществления молекулярная масса декстрина составляет от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, или от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, или от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа.
В конкретных вариантах осуществления носитель включает полисахариды, активированные путем селективного окисления циклических вицинальных диолов 1,2-, 1,4-, 1,6- и 2,6-пиранозидов и 1,2-, 1,5-, 1,6-фуранозидов или путем окисления полисахаридов, содержащих латеральный 6-гидрокси и 5,6-диол, перед конъюгированием с молекулами лекарственных средств или с PBRM.
В некоторых других вариантах осуществления полимерный носитель включает биоразлагаемый биологически совместимый полиацеталь, где, по меньшей мере, подмножество повторяющихся полиаце-тальных структурных звеньев имеет следующую химическую структуру:
где в каждом случае присутствия n заключенной в скобки структуры один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой представляет собой биологически совместимую группу и включает углеродный атом, ковалентно связанный с Cl, Rx представляет собой углеродный атом, ковалентно связанный с С2, n" представляет собой целое число в каждом случае присутствия, R3, R4, R5 и R6 представляют собой биологически совместимую группу и являются независимо водородом или органическим фрагментом, и в каждом случае присутствия n заключенной в скобки структуры по меньшей мере один из R1, R2, R3, R4, R5 и R6 включает функциональную группу, подходящую для связывания. В конкретных вариантах осуществления функциональная группа представляет собой гидроксильный фрагмент.
В одном варианте осуществления полимерный носитель включает активированные гидрофильные биоразлагаемые биологически совместимые полимеры, содержащие от 0,1 до 100% полиацетальных фрагментов, главная цепь которых представлена следующей химической структурой:
(-CH2-CHR7-O-CHR8-O-)o,
где R7 и R8 представляют собой независимо водород, гидроксил, гидроксиалкил (например, -CH2OH,
-CH(OH)-CH2OH), -CHO, -CH(OH)-CHO или -карбонил и
о представляет собой целое число от 20 до 2000.
В еще одних вариантах осуществления полимерный носитель включает биоразлагаемый биологически совместимый поликеталь, где, по меньшей мере, подмножество повторяющихся структурных звеньев поликеталя имеет следующую химическую структуру:
где в каждом случае присутствия R1 и R2 представляет собой биологически совместимую группу и Rx, R3, R4, R5, R6 определены в изобретении.
В конкретных вариантах осуществления кетальные звенья представляют собой мономеры формулы (IIa) или (IIb)
Биоразлагаемые биологически совместимые поликетальные полимеры и способы их получения описаны в патентах США №№ 5811510, 7790150 и 7838619, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них.
В одном варианте осуществления полимерный носитель может быть получен из частично окисленного декстрана (Р1^6)^-глюкозы) с последующим восстановлением. В этом варианте осуществления полимер включает образующуюся случайным образом смесь немодифицированного декстрана (A), звеньев ацеталя частично окисленного декстрана (B) и звеньев ацеталя полностью окисленного декстрана (С) следующих структур:
В другом варианте осуществления полимерный носитель включает немодифицированные ацеталь-ные звенья, т.е. полиацетальные сегменты. В некоторых вариантах осуществления полиацетали могут быть получены из полностью окисленного декстрана с последующим восстановлением. Эти полимеры описаны в патенте США № 5811510, содержание которого включено в изобретение путем ссылки на него, описание полиацеталей приводится от колонки 2, строка 65 до колонки 8, строка 55 и их синтез от колонки 10, строка 45 до колонки 11, строка 14. В одном варианте осуществления немодифицированный полиацетальный полимер представляет собой полимер поли(гидроксиметилэтиленгидрокси-метилформаль) (PHF).
Помимо полимеров поли(гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) главная цепь полимерного носителя может также включать сополимеры блоков поли(гидроксиметилэтиленгидрокси-метилформаля) и других ацетальных или неацетальных мономеров или полимеров. Например, полимеры полиэтиленгликоля применяют в основной цепи полимера в качестве реагента скрытого действия (stealth agent), так как они могут уменьшать взаимодействия между боковыми цепями присоединенных функциональных групп полимера. Такие группы могут также применяться для ограничения взаимодействий, например между сывороточными факторами и модифицированным полимером. Другие мономеры скрытого действия для введения в главную цепь полимера включают, например, этиленимин, метакриловую кислоту, акриламид, глутаминовую кислоту и их комбинации.
Ацетальные или кетальные звенья присутствуют в модифицированном полимере в количестве, эффективном для повышения биологической совместимости. Немодифицированное ацетальное или кеталь-ное звено может быть описано как "реагент скрытого действия", который обеспечивает модифицированным полимерам биологическую совместимость и растворимость. Кроме того, конъюгирование с поли-ацетальным или поликетальным полимером может повышать предрасположенность к метаболизму и разложению присоединенных к нему фрагментов и влиять на биораспределение, выведение и разложение.
Немодифицированные ацетальные звенья представляют собой мономеры формулы (III)
Мольная доля n немодифицированных полиацетальных звеньев представляет собой мольную долю, способную повышать биологическую совместимость, растворимость и увеличивать период полувыведения, от суммарного числа полимерных звеньев в модифицированном полимере. Мольная доля n может представлять собой минимальную долю немодифицированных мономерных ацетальных звеньев, необходимых для обеспечения биологической совместимости, растворимости, стабильности или конкретного периода полувыведения, или может представлять собой некую большую долю. Наиболее желательная степень токсичности - это ее практическое отсутствие, т.е. модифицированный полимер должен быть
практически инертным по отношению к субъекту. Однако для обычных специалистов в этой области является очевидным, что некоторая степень токсичности может быть допустима в зависимости от тяжести подвергаемого лечению заболевания или симптома, эффективности лечения, типа и степени ответной иммунной реакции и других подобных соображений.
В одном варианте осуществления главная цепь модифицированного полимера включает звенья формулы (IV)
где X' обозначает заместитель для гидроксильной группы главной цепи полимера.
Как показано в формуле (IV) и других описанных в изобретении формулах, каждое полиацетальное звено имеет единственную гидроксильную группу, присоединенную к глицериновому фрагменту звена, и X' группу (или другой заместитель, такой как -LD-D), присоединенную к гликольальдегидному фрагменту звена. Но это только для удобства изложения, а в действительности, следует считать, что полимер, имеющий звенья формулы (IV) и других описанных в изобретении формул, может содержать случайное распределение звеньев, имеющих X' группу (или другой заместитель, такой как -LD-D), присоединенную к гликольальдегидному фрагменту звеньев, и звеньев, имеющих единственную X' группу (или другой заместитель, такой как -LD-D), присоединенную к глицериновому фрагменту звеньев, так же как звеньев, имеющих две X' группы (или другие заместители, такие как -LD-D), одна из которых присоединена к гликольальдегидному фрагменту, а другая присоединена к глицериновому фрагменту звеньев.
В одном варианте осуществления биоразлагаемые биологически совместимые полиали, подходящие для осуществления настоящего изобретения, имеют молекулярную массу от приблизительно 0,5 до приблизительно 300 кДа. Например, биоразлагаемые биологически совместимые полиали имеют молекулярную массу от приблизительно 1 до приблизительно 300 кДа (например, от приблизительно 1 до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 2 до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 2 до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 5 до приблизительно 100 кДа, от приблизительно 10 до приблизительно 70 кДа, от приблизительно 20 до приблизительно 50 кДа, от приблизительно 20 до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 40 до приблизительно 150 кДа, от приблизительно 50 до приблизительно 100 кДа, от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, от приблизительно 6 до приблизительно 20 кДа или от приблизительно 8 до приблизительно 15 кДа). Например, биоразлагаемые биологически совместимые полиали, используемые для полимерной каркасной структуры или конъюгата изобретения, представляют собой PHF, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, 3-15 кДа или 5-10 кДа).
В одном варианте осуществления биоразлагаемые биологически совместимые полиали, подходящие для осуществления настоящего изобретения, подвергают модификации перед конъюгированием с лекарственным средством или PBRM. Например, полиали могут содержать субзвенья связующих звеньев LD или LP, такие как -С(=O)-Х-(CH2)v-C(=O)-, где Х представляет собой CH2, О или NH, и v представляет собой целое число от 1 до 6. В табл. А ниже приводятся некоторые примеры модифицированных поли-алей, подходящих для конъюгирования с лекарственным средством или PBRM или их производными. Если не указано иначе, то номера ссылок в табл. А-Е ниже соответствуют номерам примеров, описанных в изобретении; термин "ND" означает "не определяли"; и Х представляет собой CH2, О или NH.
Таблица А
Терапевтические средства
конкретных вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой малую мо-
лекулу, имеющую молекулярную массу, которая предпочтительно меньше или равна приблизительно 5 кДа, более предпочтительно меньше или равна приблизительно 4 кДа, более предпочтительно меньше или равна приблизительно 3 кДа, наиболее предпочтительно меньше или равна приблизительно 1,5 кДа или меньше или равна приблизительно 1 кДа.
В конкретных вариантах осуществления терапевтическое средство имеет величину IC50 меньше чем приблизительно 1 нМ.
В другом варианте осуществления терапевтическое средство имеет величину IC50 приблизительно больше чем 1 нМ, например терапевтическое средство имеет величину IC50 от приблизительно 1 до 50 нМ.
Некоторые терапевтические средства, имеющие величину IC50 больше чем приблизительно 1 нМ (например, "меньше чем у сильнодействующих лекарственных средств"), не подходят для конъюгирова-ния с PBRM с использованием принятых в данной области методов конъюгирования. Не привлекая в качестве обоснования какую-либо теорию, тем не менее, можно сделать вывод, что такие терапевтические средства имеют активность, которая является недостаточной для применения в таргетированных конъюгатах PBRM-лекарственное средство при использовании традиционных методов, так как достаточное количество одинаковых фрагментов лекарственного средства (т.е. более чем 8) не может быть конъ-югировано с помощью принятых в данной области методов, что приводит к ухудшению фармакокинети-ческих и физико-химических свойств конъюгата. Однако при использовании описанных в изобретении стратегий конъюгирования могут быть достигнуты достаточно высокие загрузки этих менее активных лекарственных средств, благодаря чему достигаются высокие загрузки терапевтического средства при сохранении требуемых фармакокинетических и физико-химических свойств. Таким образом, изобретение также относится к конъюгату PBRM-полимер-лекарственное средство, который включает PBRM, PHF и по меньшей мере восемь фрагментов терапевтического средства, где терапевтическое средство имеет величину IC50 больше чем приблизительно 1 нМ.
В конкретных вариантах осуществления от приблизительно 0,3 до приблизительно 15% мономеров включают терапевтическое средство, более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 12% и еще более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 10%.
Используемые в этом изобретении терапевтические средства в виде малых молекул (например, ан-типролиферативные (цитотоксические и цитостатические) средства, способные образовывать связь с полимерным носителем) включают цитотоксические соединения (например, широкого спектра действия), ингибиторы ангиогенеза, ингибиторы клеточного цикла, ингибиторы пути PBK/m-TOR/AKT, ингибиторы сигнального пути MAPK, ингибиторы киназы, ингибиторы белков теплового шока, ингибиторы HDAC, ингибиторы PARP, ингибиторы сигнального пути Wnt/Hedgehog и ингибиторы РНК-полимеразы.
Цитоксины широкого спектра действия включают, но этим не ограничивая, ДНК-связывающие или алкилирующие лекарственные средства, средства, стабилизирующие или дестабилизирующие микротрубочки, соединения платины и ингибиторы топоизомеразы I и ингибиторы синтеза белка.
Примеры ДНК-связывающих или алкилирующих лекарственных средств включают СС-1065 и его аналоги, антрациклины (доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, даунорубицин, неморубицин и их производные, PNU-159682), соединения биснафталимида, такие как элинафид (LU79553) и его аналоги, ал-килирующие средства, такие как калихимицины, дактиномицины, митромицины, пирролобензодиазепи-ны и другие подобные средства. Примеры аналогов СС-1065 включают дуокармицин SA, дуокармицин А, дуокармицин C1, дуокармицин С2, дуокармицин В1, дуокармицин В2, дуокармицин D, DU-86, KW-2189, адозелезин, бизелезин, карзелезин, seco-адозелезин и родственные аналоги и формы пролекарств, примеры которых описаны в патентах США №№ 5475092, 5595499,5846545, 6534660, 6586618, 6756397 и 7049316. Доксорубицин и его аналоги включают лекарственные средства, описанные в патенте США № 6630579. Калихимицины включают лекарственные средства, описанные в патентах США №№ 5714586 и 5739116. Дуокармицины включают лекарственные средства, описанные в патентах США №№ 5070092, 5101038, 5187186, 6548530, 6660742 и 7553816 В2 и в публикации Li et al., Tet Letts., 50:29322935 (2009).
Пирролобензодиазепины (PBD) и их аналоги включают лекарственные средства, описанные в публикациях Denny, Exp. Opin. Ther. Patents., 10(4):459-474 (2000) и Antonow and Thurston, Chem Rev., 28152864 (2010).
Примеры средств, стабилизирующих или дестабилизирующих микротрубочки, включают соединения таксанов, такие как паклитаксел, доцетаксел, тезетаксел и карбазитаксел; майтанзиноиды, ауриста-тины и их аналоги, производные алкалоида барвинка, эпотилоны и криптофицины.
Примеры майтанзиноидов или аналогов майтанзиноидов включают майтанзинол и аналоги майтан-зинола, майтанзин или DM-1 и DM-4, которые описаны в патентах США №№ 5208020, 5416064, 6333410, 6441163, 6716821, RE39151 и 7276497. В конкретных вариантах осуществления цитотоксиче-ское средство представляет собой майтанзиноид, другую группу антитубулиновых средств (ImmunoGen, Inc.; см. также Chari et al., 1992, Cancer Res. 52: 127-131), майтанзиноиды или аналоги майтанзиноидов. Примеры подходящих майтанзиноидов включают майтанзинол и аналоги майтанзинола. Подходящие майтанзиноиды раскрыты в патентах США №№ 4424219, 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929,
4331598,4361650,4362663,4364866,4450254,4322348,4371533,6333410, 5475092, 5585499 и 5846545.
Примеры ауристатинов включают ауристатин Е (также известный как производное доластатин-10), ауристатин ЕВ (AEB), ауристатин EFP (AEFP), монометилауристатин Е (MMAE), монометилауристатин F (MMAF), ауристатин F, ауристатин F фенилендиамин (AFP), ауристатин F НРА и доластатин. Подходящие ауристатины также описаны в патентных документах U.S. Publication №№ 2003/0083263, 2011/0020343 и 2011/0070248, РСТ Application Publication №№ WO 09/117531, WO 2005/081711, WO
04/010957, WO 02/088172 и WO 01/24763 и патентах США №№ 7498298, 6884869, 6323315, 6239104, 6124431, 6034065, 5780588, 5767237, 5665860, 5663149, 5635483, 5599902, 5554725, 5530097, 5521284,
5504191, 5410024, 5138036, 5076973, 4986988, 4978744, 48792 78, 4816444 и 4486414, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них.
Примеры алкалоидов барвинка включают винкристин, винбластин, виндезин и навельбин (вино-релбин). Подходящие алкалоиды барвинка, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, также раскрыты в патентных документах U.S. Publication Nos. 2002/0103136 и 2010/0305149 и в патенте США № 7303749 В1, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них.
Примеры соединений эпотилона включают эпотилон А, В, С, D, Е и F и их производные. Подходящие соединения эпотилона и их производные описаны, например, в патентах США №№ 6956036, 6989450, 6121029, 6117659, 6096757, 6043372, 5969145 и 5886026 и в патентных документах WO
97/19086, WO 98/08849, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890 и WO 99/28324, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них.
Примеры соединений криптофицина описаны в патентах США №№ 6680311 и 6747021.
Примеры соединений платины включают цисплатин (PLATINOL(r)), карбоплатин (PARAPLATIN(r)), оксалилатин (ELOXATINE(r)), ипроплатин, ормаплатин и тетраплатин.
Могут быть выбраны и другие дополнительные классы соединений или соединения с этими или другими формами цитотокситческого действия, включающие, например, митомицин С, митомицин А, даунорубицин, доксорубицин, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, аминоптерин, блеомицин, 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ол, пирролобензодиазепин (PBD) полиамид и его димеры. Другие подходящие цитотоксические средства включают, например, пуромицины, топоте-кан, ризоксин, эхиномицин, комбретастатин, нетропсин, эстрамустин, криптофизин, цемадотин, диско-дермолид, элеутеробин и митоксантрон.
Примеры ингибиторов топоизомеразы I включают камптотецин, производные камптотецина, аналоги камптотецина и неприродные камптотецины, такие как, например, СРТ-11 (иринотекан), SN-38, GI-147211C, топотекан, 9-аминокамптотецин, 7-гидроксиметилкамптотецин, 7-аминометилкамптотецин, 10-гидроксикамптотецин, (20S)-камптотецин, рубитекан, гиматекан, каренитецин, силатекан, луртотекан, экзатекан, дифломотекан, белотекан, луртотекан и S39625. Другие соединения камптотецина, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают соединения, описанные, например, в публикациях J. Med. Chem., 29:2358-2363 (1986); J. Med. Chem., 23:554 (1980); J. Med. Chem., 30:1774
(1987).
Ингибиторы ангиогенеза включают, но этим не ограничивая, ингибиторы MetAP2, ингибиторы VEGF, ингибиторы PIGF, ингибиторы VGFR, ингибиторы PDGFR, ингибиторы MetAP2. Примеры ингибиторов VGFR и PDGFR включают сорафениб (нексавар), сунитиниб (сутент) и ваталаниб. Примеры ингибиторов MetAP2 включают аналоги фумагиллола, обозначающие любое соединение, которое содержит ядро со структурой фумагиллина, включая фумагилламин, которые ингибирует способность MetAP2 удалять №г[2-терминальные метионины из белков, как описано в публикациях Rodeschini et al., J. Org. Chem., 69, 357-373, 2004 и Liu, et al., Science 282, 1324-1327, 1998. Неограничивающие примеры "аналогов фумагиллола" раскрыты в публикациях J. Org. Chem., 69, 357, 2004; J.Org. Chem., 70, 6870, 2005; European Patent Application 0354787; J. Med. Chem., 49,5645, 2006; Bioorg. Med. Chem., 11, 5051, 2003; Bio-org. Med. Chem., 14, 91, 2004; Tet. Lett. 40, 4797, 1999; WO 99/61432; патентах США №№ 6603812, 5789405, 5767293, 6566541 и 6207704.
Примеры ингибиторов развития клеточного цикла включают ингибиторы CDK, такие как, например, BMS-387032 и PD0332991; ингибиторы Rho-киназ, такие как, например, GSK429286; ингибиторы checkpoint киназ, такие как, например, AZD7762; ингибиторы aurora-киназ, такие как, например, AZD1152, MLN8054 и MLN8237; ингибиторы PLK, такие как, например, BI 2536, BI6727 (воласертиб), GSK461364, ON-01910 (эстибон); и ингибиторы KSP, такие как, например, SB 743921, SB 715992 (испи-незиб), МК-0731, AZD8477, AZ3146 и ARRY-520.
Примеры ингибиторов сигнального пути PI3K/m-TOR/AKT включают ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), ингибиторы GSK-3, ингибиторы ATM, ингибиторы ДНК-ПК и ингибиторы PDK-1.
Примеры ингибиторов PI3 киназ раскрыты в патенте США № 6608053 и включают BEZ235, BGT226, BKM120, CAL101, CAL263, деметоксивиридин, GDC-0941, GSK615, IC87114, LY294002, пало-мид 529, перифозин, PI-103, PF-04691502, PX-866, SAR245408, SAR245409, SF1126, вортманнин, XL147
и XL765.
Примеры ингибиторов AKT включают, но этим не ограничивая, АТ7867.
Примеры ингибиторов сигнального пути MAPK включают ингибиторы MEK, Ras, JNK, B-Raf и р38
MAPK.
Примеры ингибиторов MEK раскрыты в патенте США № 7517994 и включают GDC-0973,
GSK1120212, MSC1936369B, AS703026, RO5126766 и RO4987655, PD0325901, AZD6244, AZD 8330 и GDC-0973.
Примеры ингибиторов B-raf включают CDC-0879, PLX-4032 и SB590885.
Примеры ингибиторов В р38 MAPK включают BIRB 796, LY2228820 и SB202190.
Рецепторные тирозинкиназы (RTK) представляют собой рецепторы клеточной поверхности, которые часто связаны с сигнальными путями, стимулирующими неконтролируемую пролиферацию раковых клеток и неоангиогенез. Были идентифицированы многие RTK, которые сверхэкспрессируют или имеют мутации, приводящие к конститутивной активации рецептора, включающие, но этим не ограничивая, рецепторы VEGFR, EGFR, FGFR, PDGFR, EphR и семейство рецепторов RET. Примеры специфических мишеней RTK включают ErbB2, FLT-3, c-Kit, с-Met, HIF.
Примеры ингибиторов рецептора ErbB2 (семейства EGFR) включают, но этим не ограничивая, АЕЕ788 (NVP-AEE 788), BIBW2992, (афатиниб), лапатиниб, эрлотиниб (тарцеву) и гефитиниб (прессу).
Примеры ингибиторов RTK, действие которых направлено более чем на один сигнальный путь (по-литаргетные ингибиторы киназы), включают АР24534 (понатиниб), действие которого направлено на рецепторы FGFR, FLT-3, VEGFR-PDGFR и Bcr-Abl, АВТ-869 (линифаниб), действие которого направлено на рецепторы FLT-3 и VEGFR-PDGFR, AZD2171, действие которого направлено на рецепторы VEGFR-PDGFR, Flt-1 и VEGF, CHR-258 (довитиниб), действие которого направлено на рецепторы VEGFR-PDGFR, FGFR, Flt-3 и c-Kit, сунитиниб (сутент), действие которого направлено на VEGFR, PDGFR, KIT, FLT-3 и CSF-IR, сорафениб (нексавар) и ваталаниб, действие которых направлено на VEGFR, PDGFR, а также на внутриклеточные серин/треонин киназы в пути Raf/Mek/Erk.
Примеры ингибиторов белков теплового шока включают ингибиторы HSP90. Примеры ингибиторов HSP90 включают производные 17AAG, BIIB021, BIIB028, SNX-5422, NVP-AUY-922 и KW-2478.
Примеры ингибиторов HDAC включают белиностат (PXD101), CUDC-101, дроксиностат, ITF2357 (гивиностат, гавиностат), JNJ-26481585, LAQ824 (NVP-LAQ824, дациностат), LBH-589 (панобиностат), MC1568, MGCD0103 (моцетиностат), MS-275 (энтиностат), PCI-24781, пироксамид (NSC 696085), SB939, трихостатин А и вориностат (SAHA).
Примеры ингибиторов PARP включают инипариб (BSI 201), олапариб (AZD-2281), АВТ-888 (вели-пари6), AG014699, СЕР 9722, МК 4827, KU-0059436 (AZD2281), LT-673, 3-аминобензамид, А-966492 и
AZD2461.
Примеры ингибиторов сигнального пути Wnt/Hedgehog включают висмодегиб (RG3616/GDC-0449), циклопамин (11-деоксоиервин) (ингибиторы пути Hedgehog) и XAV-939 (ингибитор пути Wnt).
Примеры ингибиторов РНК-полимеразы включают аматоксины. Примеры аматоксинов включают а-аманитины, р-аманитины, у-аманитины, е-аманитины, амануллин, амануллиновую кислоту, аманина-мид, аманин и проамануллин.
Примеры ингибиторов синтеза белка включают соединения трихотецина.
В одном варианте осуществления лекарственное средство изобретения представляет собой неприродное соединение камптотецина, алкалоид барвинка, ингибитор киназы (например, ингибитор PI3 кина-зы (GDC-0941 и PI-103)), ингибитор MEK, ингибитор KSP, ингибитор РНК-полимеразы, ингибитор синтеза белка, ингибитор PARP, доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, дуокармицин, ауристатин, дола-статин, калихемицины, топотекан, SN38, камптотецин, экзатекан, неморубицин и их производные, PNU-159682, CC1065, элинафид, трихотецин, пирролобензодиазепины, майтанзиноиды, лекарственные средства, связывающие ДНК, или соединение платины и их аналоги. В конкретных вариантах осуществления, лекарственное средство представляет собой производное SN-38, камптотецин, топотекан, экзатекан, калихемицин, экзатекан, неморубицин, PNU-159682, антрациклин, майтанзиноид, таксан, трихотецин, CC1065, элинафид, виндезин, винбластин, PI-103, AZD 8330, доластатин, ауристатин Е, ауристатин F, соединение дуокармицина, испинезиб, пирролобензодиазепин, ARRY-520 и их стереоизомеры, изостеры и аналоги.
В другом варианте осуществления используемое в изобретении лекарственное средство представляет собой комбинацию двух или более лекарственных средств, таких как, например, ингибиторы PI3 киназы и ингибиторы mEK; цитотоксические соединения широкого спектра действия и соединения платины; ингибиторы PARP и соединения платины; цитотоксические соединения широкого спектра действия и ингибиторы PARP.
В еще одном варианте осуществления используемое в изобретении лекарственное средство представляет собой ауристатин F-гидроксипропиламид-L-аланин.
В одном варианте осуществления алкалоид барвинка представляет собой соединение формулы (V)
где R14 представляет собой водород, -C(O)-C1-3 алкил или -С^-хлорзамещенный C1-3 алкил; R15 представляет собой водород, -CH3 или -CHO;
когда R17 и R18 берут независимо, R18 представляет собой водород, и один из R16 или R17 представляет собой этил, а другой представляет собой гидроксил;
когда R17 и R18 берут вместе с углеродом, к которому они присоединены с образованием оксирано-вого кольца, R16 представляет собой этил;
R19 представляет собой водород, OH, аминогруппу, алкиламино или -[C(R20R21)]a-R22;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный С6-10 арил, полигидроксилированный C6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, C3-8 циклоалкил, гид-роксилированный С3-8 циклоалкил, полигидроксилированный C3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(О)(CH2)с-С(Н)(R2з)-N(H)(R2з), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, C3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород или X2, и NR77 образует азотсодержащий гетероциклический фраг-
мент;
R82 представляет собой -NH или кислород; a представляет собой целое число от 1 до 6; c представляет собой целое число от 0 до 3; d представляет собой целое число от 1 до 3; f представляет собой целое число от 1 до 12.
Дополнительные примеры алкалоидов барвинка описаны в патентных документах US 8524214 B2 и
US 2002/0103136.
В одном варианте осуществления алкалоид барвинка формулы (V) представляет собой соединение
формулы (VI)
^^Y ^СНз
(23) О
где a представляет собой целое число от 1 до 6; g представляет собой целое число от 2 до 6 и c представляет собой целое число от 0 до 3.
В одном варианте осуществления в формуле (VI) R40 представляет собой
где R24 представляет собой H, Cl, F, ОН или алкил; или R24 и R25 могут быть взяты вместе с образованием необязательно замещенного пяти- или шестичленного кольца;
R25 представляет собой -H, -F, -OH, -CH3, -C^N-О-трет-бутил, -CH2CH2Si(CH3)3, ^((ОТ3)2)-трет-бутил, -O-C(O)-R29;
R29 представляет собой -NH2, -R28-C1-6 алкил-R22, 5-12-членный гетероциклоалкил, R28-C5-12 гетеро-циклоалкил-C1-6 алкил-R22 или -R28-C1-6 алкил-C^n арил-C1-6 алкил-R22; или R29 представляет собой определенный в изобретении R47;
R26 представляет собой -H, -CH2N(CH3)2, NH2 или NO2;
R27 представляет собой -H, этил, N-метилпиперидин, циклоалкил, -CH2OH, -CH2CH2NHCH(CH3)2 или -N-4-метилциклогексиламин;
R79 представляет собой -H или -С^^^С^сД^)]^^;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный С6-10 арил, полигидроксилированный С6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, С3-8 циклоалкил, гид-роксилированный С3-8 циклоалкил, полигидроксилированный С3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(О)(CH2)с-С(Н)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, C3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород или X2, и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
или R26 и R27, взятые вместе с двумя углеродными атомами, к которым они присоединены, и третий углеродный атом, соединяющий эти два углеродных атома, образуют необязательно замещенное шести-
членное кольцо;
R28 отсутствует, представляет собой NH или кислород;
a представляет собой целое число от 1 до 6;
c представляет собой целое число 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12;
u представляет собой целое число 0 или 1;
w представляет собой целое число 0 или 1; и
при условии, что соединение формулы (VII) должно содержать по меньшей мере один из R29 и R79. В одном варианте осуществления соединение камптотецина формулы (VII) представляет собой формулы (VIII), (Villa) или (VHIb) или формулы (XXV) или (XXVa)
где R30 представляет собой -NH2, -R^-^R^R^^-R^, -R28-C1-6 алкил-R22, 5-12-членный гетероциклоал-кил, R28-C5-12 гетероциклоалкил-C1-6 алкил-R22 или -R28-C1-6 алкил-С6-12 арил-C1-6 алкил-R22; R28 отсутствует, представляет собой NH или кислород;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный C6-10 арил, полигидроксилированный C6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, С3-8 циклоалкил, гид-роксилированный С3-8 циклоалкил, полигидроксилированный С3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(О)(CH2)с-С(Н)(R2з)-N(H)(R2з), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, С3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
а представляет собой целое число от 1 до 6;
с представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12.
В некоторых вариантах осуществления R30 представляет собой любую одну из следующих структур:
где a представляет собой целое число от 1 до 6; c представляет собой целое число от 0 до 3 и g представляет собой целое число от 2 до 6.
В одном варианте осуществления в формуле (VII) R30 представляет собой
\ NH2. \С
NH2 или '\ NH2
В другом варианте осуществления соединение формулы (VII) представляет собой соединение формулы (VIIa), (VIIb), (VIIc), (VIId), (VIIe) или (VIIf)
где R47 представляет собой аминогруппу, -R^^R^R^^-R^, ^9-С5-12 гетероциклоалкил-C1-6 ал-кил-R10, 5-12-членный гетероциклоалкил или -R9-C6-10 арил;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный С6-10 арил, полигидроксилированный С6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, С3-8 циклоалкил, гид-роксилированный C3-8 циклоалкил, полигидроксилированный C3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R10 представляет собой -OH, -NHR83, -N-(R83)Ru, -COOH, -R82-С (О)(CH2)с-С(Н)(R2з)-N(H)(R2з), ^-C^XC^^^C^-C^f-N^)^), -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77 или -R82-C(O)-[С(R2oR2l)]a-R82-R83;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, C3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
R9 отсутствует, представляет собой N-(R83) или кислород;
R83 представляет собой водород или CH3;
Rii представляет собой
каждый R12 независимо представляет собой водород, хлорид, CH3 или -OCH3; R13 представляет собой водород или -С(О)-(CH2)d-(O-CH2-CH2)f-NH2; R82 представляет собой -NH или кислород;
Х4 представляет собой боковую цепь лизина, аргинина, цитруллина, аланина или глицина;
Х5 представляет собой боковую цепь фенилаланина, валина, лейцина, изолейцина или триптофана;
каждый из Х6 и Х7 представляет собой независимо боковую цепь глицина, аланина, серина, валина
или пролина;
а представляет собой целое число от 1 до 6;
с представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12;
каждый u независимо представляет собой целое число 0 или 1;
или R11 представляет собой -Yu-Wq-R88,
где Y представляет собой любую одну из следующих структур:
в каждой из которых терминальная NR83 группа в Y находится рядом с R88;
R83 представляет собой водород или CH3;
каждый W представляет собой звено аминокислоты;
каждый R12' независимо представляет собой галоген, -C1-8 алкил, -O-C1-8 алкил, нитро или циано;
R88 представляет собой водород или -С(О)-(CH2)ff-(NH-C(О))aa-Ej-(CH2)bb-R85;
R85 представляет собой NH2 или ОН;
Е представляет собой -CH2- или -CH2CH2O-;
u представляет собой целое число 0 или 1;
q представляет собой целое число от 0 до 12;
аа представляет собой целое число 0 или 1;
bb представляет собой целое число 0 или 2;
ff представляет собой целое число от 0 до 10;
h представляет собой целое число от 0 до 4;
j представляет собой целое число от 0 до 12; и
когда Е представляет собой -CH2-, bb представляет собой 0 и j представляет собой целое число от 0 до 10; и когда Е представляет собой -0^0^^-, bb представляет собой 2 и j представляет собой целое число от 1 до 12;
или R11 представляет собой
где R83 представляет собой водород или CH3;
R84 представляет собой C1-6 алкил или С6-ю арил;
каждый R12' независимо представляет собой галоген, -C1.8 алкил, -O-C1.8 алкил, нитро или циано; h представляет собой целое число от 0 до 4 и u представляет собой целое число 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления Rn представляет собой "о
где каждый R12' независимо представляет собой хлорид, -CH3 или -OCH3;
R88 представляет собой водород или -С(О)-(CH2)ff-(CH2-CH2O)j-CH2-CH2-CH2; R82 представляет собой -NH или кислород;
Х4 представляет собой боковую цепь лизина, аргинина, цитруллина, аланина или глицина; Х5 представляет собой боковую цепь фенилаланина, валина, лейцина, изолейцина или триптофана; каждый из Х6 и Х7 независимо представляет собой боковую цепь глицина, аланина, серина, валина или пролина;
ff представляет собой целое число от 1 до 3; j представляет собой целое число от 1 до 12; h представляет собой целое число от 0 до 4; и каждый u независимо представляет собой целое число 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления
представляет собой цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, цитруллин-фенилаланин, цитруллин-лейцин, цитруллин-валин-глицин-глицин, глицин-фенилаланин-глицин-глицин, валин, пролин, лейцин или изолейцин.
В другом варианте осуществления R11 представляет собой любую одну из следующих структур:
В некоторых вариантах осуществления R47 представляет собой любую одну из следующих структур:
где a представляет собой целое число от 1 до 6; c представляет собой целое число от 0 до 3 и g представляет собой целое число от 2 до 6.
В другом варианте осуществления ауристатин представляет собой соединение формулы (X)
где каждый из R31 и R32 независимо представляет собой водород или C1-8 алкил, и не больше чем один из R31 и R32 представляет собой водород;
R33 представляет собой водород, C1-8 алкил, C3-8 карбоцикл, C6-10 арил, C1-8 алкил-C6-10 арил, X1-(C3-8 карбоцикл), C3-8 гетероцикл или X1-(C3-8 гетероцикл);
R34 представляет собой водород, C1-8 алкил, C3-8 карбоцикл, C6-10 арил, Х1-С6-10 арил, X1-(С3-8 карбоцикл), С3-8 гетероцикл или X1-(C3-8 гетероцикл);
R35 представляет собой водород или метил;
или R34 и R35 вместе с углеродным атомом, к которому они присоединены, образуют карбоцикличе-ское кольцо, имеющее формулу -(CR55R41)b-, где каждый из R55 и R41 независимо представляет собой водород или C1-8 алкил, и b представляет собой целое число от 3 до 7;
R36 представляет собой водород или C1-8 алкил;
R37 представляет собой водород, C1-8 алкил, C3-8 карбоцикл, C6-10 арил, -Х1-C6-10 арил, -X1-(C3-8 карбоцикл), C3-8 гетероцикл или -X1-(C3-8 гетероцикл);
каждый R38 независимо представляет собой водород, OH, C1-8 алкил, C3-8 карбоцикл или О-(C1-8 ал-
кил);
R53 представляет собой
или R54;
R39 представляет собой H, C1-8 алкил, C6-10 арил, -Х1-С6-10 арил, С3-8 карбоцикл, С3-8 гетероцикл, -Х1-С3-8 гетероцикл, -C1-8 алкилен-NH2 или (CH2)2SCH3;
каждый X1 независимо представляет собой C1-10 алкилен или C3-10 циклоалкилен; R44 представляет собой водород или C1-8 алкил; R45 представляет собой X3-R42 или NH-R19; X3 представляет собой О или S;
R19 представляет собой водород, OH, аминогруппу, алкиламино или -[QR^R^^-R^; R42 представляет собой аминогруппу, C1-6 алкиламино или -[C(R20R21)]a-R22;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный C6-10 арил, полигидроксилированный C6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, C3-8 циклоалкил, гид-роксилированный С3-8 циклоалкил, полигидроксилированный С3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(О)(CH2)с-С(Н)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)rR77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, С3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
R54 представляет собой ^^56)2-^^)2^6-10 арил, -C(R56)2--C(R56)2-C3-8 гетероцикл или -C^^-C(R56)2-C3-8 карбоцикл;
R56 независимо выбирают из H, OH, C1-8 алкила, C3-8 карбоцикла, -O-C1-8 алкила, -O-C(O)-R29 и -O-R23-O-C1-6 алкил-NH2;
R29 представляет собой аминогруппу, 5-12-членный гетероциклоалкил, -R28-C1-6 алкил-R22, R28-C5-12 гетероциклоалкил-C1-6 алкил-R22, -[С(R20R21)]a-R22 или -R28-C1-6 алкил-C6-12 арил-C1-6 алкил-R^; или R29 представляет собой определенный в изобретении R47;
R28 отсутствует, представляет собой NH или кислород;
a представляет собой целое число от 1 до 6;
c представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12.
В некоторых вариантах осуществления в соединении ауристатина формулы (X) R39 представляет собой бензил или
где R83 представляет собой водород или CH3;
R84 представляет собой C1-6 алкил или С6-10 арил;
каждый R12' независимо представляет собой галоген, -C1-8 алкил, -O-C1-8 алкил, нитро или циано; h представляет собой целое число от 0 до 4 и u представляет собой целое число 0 или 1; R53 представляет собой
или R54;
R39 представляет собой H, C1-8 алкил, C6-10 арил, O^-C^o арил, C3-8 карбоцикл, C3-8 гетероцикл, -Х1-C3-8 гетероцикл, -C1-8 алкилен-NH или (CH2)2SCH3,
каждый X1 независимо представляет собой C1-10 алкилен или C3-10 циклоалкилен; R45 представляет собой X3-R42 или NH-R19; X3 представляет собой О или S;
R19 представляет собой водород, OH, аминогруппу, алкиламино или -[QR^R^^-R^; R42 представляет собой H, аминогруппу, C1-6 алкиламино или -[QR^R^^-R^;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный С6-10 арил, полигидроксилированный С6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, С3-8 циклоалкил, гид-роксилированный С3-8 циклоалкил, полигидроксилированный С3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(О)(CH2)с-С(Н)(R23)-N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, С3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
R54 представляет собой -C(R56)2-С(R56)2-С6-10 арил, -C(R56)2--C(R56)2-C3-8 гетероцикл или -С^56)2--C(R56)2-C3-8 карбоцикл;
R56 независимо выбирают из H, OH, C1-8 алкила, С3-8 карбоцикла, -O-C1-8 алкила, -O-C(O)-R29 и -O-R23-O-C1-6 алкил-NH2;
R29 представляет собой аминогруппу, 5-12-членный гетероциклоалкил, -R28-C1-6 алкил-R22, R28-C5-12 гетероциклоалкил-C1-6 алкил-R^, -[С(R20R21)]a-R22 или -R28-C1-6 алкил-С6-12 арил-Ci^ алкил-R22; или R29 представляет собой определенный в изобретении R47;
R28 отсутствует, представляет собой NH или кислород; a представляет собой целое число от 1 до 6; с представляет собой целое число от 0 до 3; d представляет собой целое число от 1 до 3; f представляет собой целое число от 1 до 12.
В одном варианте осуществления соединение ауристатина формулы (Xa) представляет собой соединение формулы (Х1а) или формулы (Xlb)
и R83 представляет собой водород или CH3.
В одном варианте осуществления ауристатин формулы (X) представляет собой соединение формулы (XI), формулы (XII) или формулы (XIII),
где R42 представляет собой -CH3 или любую одну из следующих структур:
где соединение формулы (XI) представляет собой
где а представляет собой целое число от 1 до 6; c представляет собой целое число от 0 до 3; g представляет собой целое число от 2 до 6; где соединение формулы (XII) представляет собой
где R40 представляет собой водород, -ОН, -NH2 или любую из следующих структур:
он.
(2)
.он
(4)
(6)
(8) (10)
(12) сн,
9нз
NH-
NH,
NH,
(14)
сн-.
сн, о о
(16)
NH2
1-12
¦|-С(Н)(СН3)-(CH2)CNH2 (18) ?
(20)
о у сн3
NH?
(22)
Н3 СН3
NH,
Н(А(СН2)-^ ,
(23) О или (24)
где a представляет собой целое число от 1 до 6; g представляет собой целое число от 2 до 6 и c представляет собой целое число от 0 до 3; где соединение формулы (XIII) представляет собой
где R29 представляет собой аминогруппу, 5-12-членный гетероциклоалкил, -R28-C1-6 алкил-R^, R28-C5-12 гетероциклоалкил-C1-6 алкил-R22, -R^-^R^R^^-R^ или -R28-C1-6 алкил-С6-12 арил-C1-6 алкил-R^; или R29 представляет собой определенный в изобретении R47;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный C6-10 арил, полигидроксилированный C6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, C3-8 циклоалкил, гид-роксилированный C3-8 циклоалкил, полигидроксилированный C3-8 циклоалкил или боковую цепь при
родной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(0)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23), -Rg2-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-Rw;
каждый R23 независимо представляет собой водород, Ci-6 алкил, C6-io арил, С3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
R28 отсутствует, представляет собой NH или кислород;
a представляет собой целое число от 1 до 6;
c представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12.
В одном варианте осуществления в формуле (XII) R40 представляет собой
В одном варианте осуществления в соединении формулы (XIII) R29 представляет собой -NH2, 5-членный гетероциклоалкил, -R28-C1-6 алкил-R^, R28-C5-12 гетероциклоалкил-C1-6 алкил-R^ или -R28-C1-6 алкил-С6-12 арил-C1-6 алкил-R22; или R29 представляет собой определенный в изобретении R47;
R28 отсутствует, представляет собой NH или кислород;
R22 представляет собой -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(0)(CH2)с-C(H)(R2з)-N(H)(R2з), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, С3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
c представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12.
В еще одном варианте осуществления R29 представляет собой любую одну из следующих структур:
-j-NH-(CH2VMi2 -j-NH-(CH2VOH
(1) 1 8 ; (2) * g ;
(3)^ ; (4)'\ ;
- -O-(CH9VNH2
(5) * -g ; \
(6) Л NH2;
-j-(CH2)a-NH2 !-C(H)(CH3)-(CH2)CNH2
(7) * ; (8) ?
(9)
HV).
s CH3
-N-(CH9yOH
(10) " "g ;
iCH3 5 сн3 о
-f-N-(CH7)a.NH9 -l-N (CH2)a-0-C-(CH2)a-NH2
(11) " " ; (12) ?
(13) (15)
iQHs и 4?нз 9 N
-г-егн-л -пн ! i и /
•N-(CH2)g-o-c-(CH2)g-OH _U_(сн2)-o-c-( 1
(14) 8 9 V-J;
-j-N (CH2)g-0-C
(16)
HN 0^"NH2
(17) I
i 0 Tl 8 н T g н
(18)
NH2
где a представляет собой целое число от 1 до 6; с представляет собой целое число от 0 до 3 и g представляет собой целое число от 2 до 6.
В одном варианте осуществления ингибитор МЕК представляет собой соединение формулы (XIV)
где R43 представляет собой Н или -R46-R47;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный С6-10 арил, полигидроксилированный C6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, C3-8 циклоалкил, гид-роксилированный С3-8 циклоалкил, полигидроксилированный C3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NH2, -COOH, ^-C^XC^^-C^^-N^)^), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)rN(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, С3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
R46 представляет собой -С(О)-; -C(O)-O-, -C(O)-NH- или отсутствует;
R47 определен в изобретении;
a представляет собой целое число от 1 до 6;
с представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3; и
f представляет собой целое число от 1 до 12.
Дополнительные примеры ингибитора MEK раскрыты в патентном документе US 7517994 В2.
В некоторых вариантах осуществления R43 представляет собой -C(0)-(CH2)a-NH2 или -С(О)-C(H)(CH3)-(CH2)c-NH2; где а представляет собой целое число от 1 до 6 и с представляет собой целое число от 0 до 3.
В другом варианте осуществления соединение дуокармицина представляет собой соединение формулы (XV)
каждый из R51 и R52 независимо представляет собой водород или -OCH3; кольцо АА представляет собой либо фенильное кольцо, либо пирролильное кольцо. Дополнительные примеры соединений дуокармицина раскрыты в патентном документе US 7553816.
В одном варианте осуществления соединение дуокармицина формулы (XV) представляет собой соединение формулы (XVI), (XVII), (XVIII) или (XIX)
где R42 представляет собой C1-6 алкиламино или -[C(R20R21)]a-R22;
каждый из R20 и R21 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, гидроксилиро-ванный C6-10 арил, полигидроксилированный C6-10 арил, 5-12-членный гетероцикл, C3-8 циклоалкил, гид-роксилированный C3-8 циклоалкил, полигидроксилированный C3-8 циклоалкил или боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R22 представляет собой -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(0)(CH2)с-C(H)(R2з)-N(H)(R2з), -R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23) или -R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77;
каждый R23 независимо представляет собой водород, C1-6 алкил, C6-10 арил, C3-8 циклоалкил, -COOH или -COO-C1-6 алкил;
X2 представляет собой боковую цепь природной или неприродной аминокислоты;
R77 представляет собой водород, или X2 и NR77 образуют азотсодержащее циклическое соединение;
R82 представляет собой -NH или кислород;
a представляет собой целое число от 1 до 6;
c представляет собой целое число от 0 до 3;
d представляет собой целое число от 1 до 3;
f представляет собой целое число от 1 до 12.
В некоторых вариантах осуществления R42 представляет собой любую одну из следующих структур:
/^ Y ^СНз (23) О
где a представляет собой целое число от 1 до 6; g представляет собой целое число от 2 до 6 и c представляет собой целое число от 0 до 3.
В другом варианте осуществления соединение ингибитор KSP представляет собой соединение формулы (XXVI)
где R30 определен в изобретении.
В некоторых вариантах осуществления R30 представляет собой
где a представляет собой целое число от 1 до 6; c представляет собой целое число от 0 до 3 и g представляет собой целое число от 2 до 6.
В другом варианте осуществления соединение дуокармицина представляет собой дуокармицин А, дуокармицин В1, дуокармицин В2, дуокармицин C1, дуокармицин С2, дуокармицин D, СС-1065, адозе-лезин, бизелезин или карзелезин.
В другом варианте осуществления соединение ингибитора KSP представляет собой соединение формулы (XXVII), (XXVIII) или (XXIX)
R-HHN"
(XXVII) (XXVIII) (XXIX)
где R11 определен в изобретении.
Для любого специалиста в области фармацевтики является совершенно очевидным, что каждое из описанных в изобретении терапевтических средств может быть модифицировано таким образом, что полученное соединение все же будет сохранять специфичность и/или активность исходного соединения. Для специалиста будет также очевидно, что многие из этих соединений могут быть использованы вместо описанных в изобретении терапевтических средств. Поэтому терапевтические средства настоящего изобретения включают аналоги и производные описанных в изобретении соединений.
В табл. В ниже приводится большое число примеров терапевтических средств и их производных, подходящих для конъюгирования с образованием конъюгатов полимер-лекарственное средство-белок или каркасных структур полимер-лекарственное средство изобретения. Также приведены спектральные данные для некоторых соединений (ND в таблице означает "не определяли"). В этих примерах может также приводится активная форма лекарственного средства, которая высвобождается из конъюгатов in vitro или in vivo.
R40
m/z
У^\^он
803.5
789.1
R40
m/z
974.2
874.5
902.2
-ОН
788
СН3
803.4
СН3
803.4
СН3 О
сн3
874.4
СН3
874.4
Н3С О
уЛо^у(tm)2
СН3
874.4
Н3С о
yA0^VNH2
СН3
874.4
900.2
900.2
900.5
R40
m/z
900.5
H2N''/
1016.6
H2N'-./
m/z (XXVII)
0 Г NH /^N H2N^O S 0
<>
NH2
^O^Y^jj 0 |_| V 0
iO^NA^N^ANHJ^^^^NH2
H J 0
O^NH2
Белоксодержащие распознающие молекулы (PBRM)
Белоксодержащая распознающая молекула нацеливает конъюгаты лекарственное средство-полимерный носитель на конкретные ткани, клетки или участки в клетке. Белоксодержащая распознающая молекула может нацеливать модифицированный полимер на культуру или на целый организм или и на то, и на другое. В каждом случае белоксодержащая распознающая молекула имеет лиганд, который присутствует на поверхности таргетированной клетки (клеток), с которым она связывается с эффективной специфичностью, аффинностью и авидностью. В некоторых вариантах осуществления белоксодер-жащая распознающая молекула нацеливает модифицированный полимер на ткани, не относящиеся к печени. В других вариантах осуществления белоксодержащая распознающая молекула нацеливает модифицированный полимер на конкретную ткань, такую как печень, почка, легкое или поджелудочная железа.
Белоксодержащая распознающая молекула может нацеливать модифицированный полимер на клетку-мишень, такую как раковая клетка, на рецептор, экспрессированный на клетке, такой как раковая клетка, на матричную ткань или белок, связанный с раком, такой как опухолевый антиген. В качестве варианта клетками-мишенями могут быть клетки сосудистой сети опухоли. Белоксодержащие распознающие молекулы могут нацеливать полимер на конкретные типы клеток, например, специфически нацеливая на гепатоциты в печени, но не затрагивая купферовские клетки. В других случаях белоксодер-жащие распознающие молекулы могут нацеливать полимер на клетки ретикуло-эндотелиальной или лимфатической системы, или на профессиональные фагоциты, такие как макрофаги или эозинофилы. (B таких случаях сам по себе полимер может также быть эффективной системой доставки, не требующей специфического таргетирования).
В некоторых других вариантах осуществления белоксодержащая распознающая молекула может нацеливать модифицированный полимер, например, на участок внутри клетки, такой как ядро, цитоплазма или эндосома. В конкретных вариантах осуществления белоксодержащая распознающая молекула может усиливать клеточное связывание с рецепторами или цитоплазматический транспорт в ядро и вход в ядро или выделение из эндосом или других внутриклеточных везикул.
В конкретных вариантах осуществления белоксодержащие распознающие молекулы включают антитела, белки и пептиды или пептидные миметики.
В предпочтительном варианте осуществления белоксодержащая распознающая молекула включает сульфгидрильную группу, и белоксодержащую распознающую молекулу конъюгируют с конъюгатом полимер-лекарственное средство путем образования ковалентной связи с помощью сульфгидрильной группы и функциональной группы полимера.
Примеры антител или антител, полученных из Fab, Fab2, scFv или фрагментов тяжелых цепей верблюжьего антитела, специфичных к маркерам клеточной поверхности, включают, но этим не ограничивая, 5Т4, AOC3, ALK, AXL, C242, СА-125, CCL11, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD5, CD15, СА15-3, CD18, CD19, СА19-9, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD30, CD31, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD74, CD79-B, CD80, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD 154, CD326, CEA, агглютинирующий фактор, CTLA-4, CXCR2, EGFR (HER1) ErbB2, ErbB3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, EPHB4, FGFR (т.е. FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4), FLT3, рецептор фолиевой кислоты, FAP, GD2, GD3, GPNMB, HGF, HER2, HER3, HMI.24, ICAM, ICOS-L, рецептор IGF
1, VEGFR1, EphA2, TRPV1, CFTR, gpNMB, CA9, Cripto, c-KIT, c-MET, АСЕ, АРР, адренергический ре-цептор-р2, клаудин 3, мезотелин, MUC1, NaPi2b, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, RON, ROR1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-B4, IL-2 рецептор, IL-4 рецептор, IL-13 рецептор, интегрины (включая а4, avp3, avp5, avp6, а1р4, а4р1, а4р7, а5р1, а6р4, aIIbp3 интегрины), IFN-a, IFN-y, IgE, IgE, IGF-1 рецептор, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-22, IL-4, IL-5, IL-6, рецептор интерферона, ITGB2 (CD18), LFA-1 (CD11a), L-селектин (CD62L), муцин, MUC1, миостатин, NCA-90, NGF, PDGFRa, фосфатидилсерин, клетки рака предстательной железы, синегнойную палочку, вирус бешенства, RANKL, респираторно-синцитиальный вирус, резус-фактор, SLAMF7, сфингозин-1-фосфат, TAG-72, рецептор Т-клетки, тенасцин С, TGF-1, TGF^2, TGF-р, TNF-a, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевый антиген СТАА16.88, VEGF-A, VEGFR2, виментин и другие подобные антитела.
В одном варианте осуществления антитела или антитело, полученное из Fab, Fab2, scFv или фрагментов тяжелых цепей верблюжьего антитела, специфичных к маркерам клеточной поверхности, включают СА-125, С242, CD3, CD19, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD37, CD40, CD44, CD51, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD138, CD141, CD326, CEA, CTLA-4, EGFR (HER1), EibB2, EibB3,
FAP, рецептор фолиевой кислоты, IGF-1 рецептор, GD3, GPNMB, HGF, HER2, VEGF-A, VEGFR2,
VEGFR1, EphA2, ЕрСАМ, 5Т4, TAG-72, тенасцин С, TRPV1, CFTR, gpNMB, CA9, Cripto, АСЕ, АРР, PDGFRa, фосфатидилсерин, клетки рака предстательной железы, адренергический рецептор-р2, клаудин 3, муцин, MUC1, мезотелин, IL-2 рецептор, IL-4 рецептор, IL-13 рецептор и интегрины (включая a^3, a^5, а^6, а1р4, а4р1, а5р1, а6р4 интегрины), тенасцин С, TRAIL-R2 и виментин.
Примеры антител включают 3F8, абаговомаб, абциксимаб (РЕОПРО), адалимумаб (ХУМИРА), аде-катумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, ALD518, алемтузумаб (САМРАТН), алтумомаб, ама-туксимаб, анатумомаб, анрукинзумаб, аполизумаб, арцитумомаб (CEA-SCAN), аселизумаб, атлизумаб (тоцилизумаб, актемра, роактемра), аторолимумаб, бапинейзумаб, базиликсимаб (симулект), бавитукси-маб, бектумомаб (ЛИМФОСКАН), белимумаб (БЕНЛИСТА), бенрализумаб, бертилимумаб, бензилесо-маб (СКИНИТИМУН), бевацизумаб (АВАСТИН), бициромаб (ФИБРИСЦИНТ), биватузумаб, блинату-момаб, брентуксимаб, бриактнумаб, канакитумаб (ИЛАРИС), кантузумаб, капромаб, катумаксомаб (РЕ-МОВАБ), СС49, цеделизумаб, цертолизумаб, цетуксимаб (ЭРБИТУКС), цитатузумаб, циксутумумаб, кленоликсимаб, кливатузумаб, конатумумаб, CR6261, дацетузумаб, даклизумаб (ЗЕНАПАКС), дарату-мумаб, деносумаб (ПРОЛИА), детумомаб, дорлимомаб, дорликсизумаб, экромексимаб, экулизумаб (СО-ЛИРИС), эдобакомаб, эдреколомаб (ПАНОРЕКС), эфализумаб (РАПТИВА), эфунгумаб (МИКОГРАБ), элотузумаб, элсилимомаб, энлимомаб, эпитумомаб, эпратузумаб, эрлизумаб, эртумаксомаб (РЕКСО-МУН), этарацизумаб (АБЕГРИН), эксбивирумаб, фанолесомаб (NEUTROSPEC), фаралимомаб, фарлету-зумаб, фелвизумаб, фезакинумаб, фигитумумаб, фонтолизумаб (HuZAF), форавирумаб, фрезолимумаб, галиксимаб, гантерерумаб, гавилимомаб, гемтузумаб, гирентуксимаб, глембатумумаб, голимумаб (SIM-PONI), гомиликсимаб, ибализумаб, ибритумомаб, иговомаб (INDIMACIS-125), имциромаб (MYOSCINT), инфликсимаб (ремикейд), интетумумаб, инолимомаб, инотузумаб, ипилимумаб, иратумумаб, келикси-маб, лабетузумаб (CEA-CIDE), лебрикизумаб, лемалесомаб, лерделимумаб, лексатумумаб, либивирумаб, линтузумаб, лукатумумаб, лумиликсимаб, мапатумумаб, маслимомаб, матузумаб, меполизумаб (BOSA-TRIA), метелимумаб, милатузумаб, минретумомаб, митумомаб, моролимумаб, мотавизумаб (NUMAX), муромонаб-CD3 (ОРТОКЛОН ОКТ3), наколомаб, наптумомаб, натализумаб (ТИСАБРИ), небакумаб, нецитумумаб, нерелимомаб, нимотузумаб (THERACIM), нофетумомаб, окрелизумаб, одулимомаб, офа-тумумаб (арзерра), оларатумаб, омализумаб (КСОЛАР), онтецизумаб, опортузумаб, ореговомаб (ОВА-РЕКС), отеликсизумаб, пагибаксимаб, пализизумаб (СИНАГИС), панитумумаб (ВЕКТИБИКС), паноба-кумаб, пасколизумаб, пемтумомаб (ТЕРАГИН), пертузумаб (ОМНИТАРГ), пекселизумаб, пинтумомаб, приликсимаб, притумумаб, PRO 140, рафивирумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб (ЛУЦЕНТИС), раксиба-кумаб, регавирумаб, реслизумаб, рилотумумаб, ритуксимаб (РИТУКСАН), робатумумаб, ронтализумаб, ровелизумаб (LEUKARREST), руализумаб (ANTOVA), сатумомаб пендетид, севирумаб, сибротузумаб, сифалимумаб, силтуксимаб, сиплизумаб, соланезумаб, сонепцизумаб, сонтузумаб, стамулумаб, сулесо-маб (лейкоскан), такатузумаб (AFP-CIDE), тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, танезумаб, таплитумо-маб паптокс, тефибазумаб (AUREXIS), телимомаб, тенатумомаб, тенеликсимаб, теплизумаб, TGN1412, тицилимумаб (тремелимумаб), тигатузумаб, TNX-650, тоцилизумаб (атлизумаб, АКТЕМРА), торализу-маб, тоситумомаб (BEXXAR), трастузумаб (Герцептин), тремелимумаб, тукотузумаб, тувирумаб, урток-сазумаб, устекинумаб (STELERA), вапаликсимаб, ведолизумаб, велтузумаб, вепалимомаб, визилизумаб (NUVION), волоциксимаб (HUMASPECT), вотумумаб, залутумумаб (HuMEX-EGFr), занолимумаб (Hu-MAX-CD4), зиралимумаб и золимомаб.
В некоторых вариантах осуществления антитела нацелены на маркеры клеточной поверхности для 5Т4, СА-125, СЕА, CD3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD44, CD51, CTLA-4, ЕрСАМ, HER2, EGFR, FAP, рецептора фолиевой кислоты, HGF, интегрина a^3, интегрина а5р1, IGF-1 рецептора, GD3, GPNMB, муцина, MUC1, фосфатидилсерина, клеток рака предстательной железы, PDGFRa, TAG-72, тенасцина С, TRAIL-R2, VEGF-A и VEGFR2. В этом варианте осуществления антитела представляют собой абаговомаб, адекатумумаб, алацизумаб, алтумомаб, анатумомаб, арцитумомаб, бавитуксимаб, бе
вацизумаб (АВАСТИН), биватузумаб, блинатумомаб, брентуксимаб, кантузумаб, катумаксомаб, капро-маб, цетуксимаб, цитатузумаб, кливатузумаб, конатумумаб, дацетузумаб, эдреколомаб, эпратузумаб, эр-тумаксомаб, этарацизумаб, фарлетузумаб, фигитумумаб, гемтузумаб, глембатумумаб, ибритумомаб, иго-вомаб, интетумумаб, инотузумаб, лабетузумаб, лексатумумаб, линтузумаб, лукатумумаб, матузумаб, ми-тумомаб, наптумомаб эстафенотокс, нецитумумаб, опортузумаб, ореговомаб, панитумумаб, пемтумомаб, пертузумаб, притумумаб, ритуксимаб (РИТУКСАН), рилотумумаб, робатумумаб, сатумомаб, сибротузу-маб, таплитумомаб, тенатумомаб, тенатумомаб, тицилимумаб (тремелимума6), тигатузумаб, трастузумаб (Герцептин), тоситумомаб, тремелимумаб, тукотузумаб, целмолейкин, волоциксимаб и залутумумаб.
В конкретных вариантах осуществления антитела, нацеленные на маркеры клеточной поверхности для HER2, представляют собой пертузумаб или трастузумаб, и для EGFR антитело представляет собой цетуксимаб, и для CD20 антитело представляет собой ритуксимаб, и для VEGF-A антитело представляет собой бевацизумаб, и для CD-22 антитело представляет собой эпратузумаб или велтузумаб, и для СЕА антитело представляет собой лабетузумаб.
Примеры пептидов или пептидных миметиков включают пептиды, нацеленные на интегрин (RGD пептиды), пептиды, нацеленные на LHRH рецептор, пептиды, нацеленные на ErbB2 (HER2) рецептор, пептиды, нацеленные на специфический Т-клеточный антиген предстательной железы (PSMA), полученные из АроЕ белка пептиды, нацеленные на рецептор липопротеина LRP1, пептиды АроА белка, нацеленные на рецептор соматостатина пептиды, полученные из хлоротоксина пептиды и бомбезин.
В конкретных вариантах осуществления пептиды или пептидные миметики представляют собой пептиды, нацеленные на LHRH рецептор, и пептиды, нацеленные на ErbB2 (HER2) рецептор.
Примеры белков включают инсулин, трансферрин, фибриноген-у фрагмент, тромбоспондин, клау-дин, аполипопротеин Е, молекулы аффител, таких как, например, ABY-025, белки с анкириновым повтором, белки с алкиринподобными повторами и синтетические пептиды.
В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгаты белок-лекарственное средство-полимер включают цитоксины широкого спектра действия в комбинации с маркерами клеточной поверхности для HER2, такие как пертузумаб или трастузумаб, для EGFR, такие как цетуксимаб, для СЕА, такие как лабетузумаб, для CD20, такие как ритуксимаб, для VEGF-A, такие как бевацизумаб, или для CD-22, такие как эпратузумаб или велтузумаб.
В других вариантах осуществления изобретения используемые в изобретении конъюгаты белок-лекарственное средство-полимер или конъюгаты белок-полимер включают комбинации двух или более белоксодержащих распознающих молекул, такие как, например, комбинация биспецифичных антител, нацеленных на EGF рецептор (EGFR) на опухолевых клетках и на CD3 и CD28 на Т-клетках, комбинация антител или антитела, полученного из Fab, Fab2, scFv или фрагментов тяжелых цепей верблюжьего антитела, и пептидов или пептидных мимиков, комбинация антител или антитела, полученного из Fab, Fab2, scFv или фрагментов тяжелых цепей верблюжьего антитела, и белков, комбинация двух биспецифичных антител, таких как CD3 х CD19 плюс CD28 х CD22 биспецифичные антитела.
В других вариантах осуществления изобретения используемые в изобретении конъюгаты белок-лекарственное средство-полимер или конъюгаты белок-полимер включают белоксодержащие распознающие молекулы, которые представляют собой антитела против антигенов, такие как, например, тра-стузумаб, цетуксимаб, ритуксимаб, бевацизумаб, эпратузумаб, велтузамаб, лабетузумаб, В7-Ш, В7-Ю, СА125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, с-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, c-Kit, MUC1 и 5Т4.
В конкретном варианте осуществления изобретения конъюгаты белок-лекарственное средство-полимер или конъюгаты белок-полимер изобретения включают белоксодержащие распознающие молекулы, которые представляют собой антитела против 5Т4, такие как, например, гуманизированное анти-5Т4 scFvFc антитело.
Примеры подходящих 5Т4 таргетирующих лигандов или иммуноглобулинов включают те, которые производятся промышленностью, или которые описаны в патентной или непатентной литературе, например в патентных документах US 8044178, US 8309094, US 7514546, ЕР 1036091 (под торговой маркой TroVax(tm), фирмы Oxford Biomedica), EP 2368914 A1, WO 2013041687 A1 (Amgen), US 2010/0173382 и в публикации P. Sapra, et al., Mol. Cancer Ther. 2013, 12:38-47. Антитело анти-5Т4 раскрыто в предварительной заявке на патент США № 61/877439, зарегистрированной 13 сентября 2013 г., и в предварительной заявке на патент США № 61/835858, зарегистрированной 17 июня 2013 г. Содержание каждого из патентных документов и научных публикаций включено в изобретение путем ссылки на них.
Используемый в изобретении термин "5Т4 антиген-связывающий фрагмент" относится к полипептидной последовательности, способной селективно связывать 5Т4 антиген. В примерах конъюгатов 5Т4 антиген-связывающий фрагмент обычно включает одноцепочечную scFv-Fc форму, сконструированную из анти-5Т4 антитела. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv-Fc) представляет собой гибридный белок вариабельных областей тяжелых (VH) и легких цепей (VL) иммуноглобулина, соединенный с линкерным пептидом и дополнительно присоединенный к Fc-области, включающей шарнирную область и CH2 и CH3 области антитела (любые такие комбинации фрагментов антитела друг с другом или с дру
гими пептидными последовательностями иногда называют в изобретении "иммуногибридной" молекулой). Внутри такой scFvFc молекулы, scFv фрагмент может быть С-терминально связан с N-концом Fc-фрагмента с помощью линкерного пептида.
По меньшей мере часть 5Т4 антиген-связывающего фрагмента иммуногибридных молекул может быть получена из биологического материала, взятого у крыс или мышей. Например, можно получить иммуногибридную молекулу путем экспрессии полинуклеотида, сконструированного для кодирования, по меньшей мере, мышиный анти-5Т4 scFv области, имеющего полипептидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:A (см., например, предварительную заявку на патент США № 61/835858, зарегистрированную 17 июня 2013 г.). Кроме того, по меньшей мере часть 5Т4 антиген-связывающего фрагмента может быть получена хорошо известными методами в виде химерной или гуманизированной. См., Borras et al., J. Biol. Chem. 2010 Mar 19; 285(12):9054-66. Таким образом, может быть получена им-муногибридная молекула, имеющая 5Т4 антиген-связывающий фрагмент, с гуманизированным scFv фрагментом путем экспрессии полинуклеотида, сконструированного для кодирования, по меньшей мере, полипептидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: B (см., например, предварительную заявку на патент США № 61/835858, зарегистрированную 17 июня 2013 г.).
В некоторых примерах с помощью хорошо известных методов молекулярной биологии может быть сконструирована Fv часть 5Т4 антиген-связывающего фрагмента, включающая один или более аминокислотных заместителей в VH области. Fc часть 5Т4 антиген-связывающего фрагмента предпочтительно включает полипептидную последовательность, сконструированную из шарнирных CH2 и CH3 областей человеческого антитела против 5Т4. Например, можно сконструировать полинуклеотид для кодирования по меньшей мере Fc части, имеющей полипептидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: С (см., например, предварительную заявку на патент США № 61/835858, зарегистрированную 17 июня 2013 г.).
Полинуклеотид, кодирующий пептид, в котором одноцепочечные Fv и Fc области соединены вместе, может кодировать, по меньшей мере, химерный 5Т4 антиген-связывающий фрагмент конъюгата, имеющий полипептидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: D, или может кодировать гуманизированный 5Т4 антиген-связывающей фрагмент, полипептидную последовательность, приведенную в SEQ ID NOs: Е или F.
Полипептидный линкер, такой как линкер, имеющий полипептидную последовательность ASTC (SEQ ID NO: Y) или ASTX (SEQ ID NO: Z) (где "X" обозначает любую аминокислоту или непосредственную пептидную связь между соседними аминокислотами), может объединять С-конец ScFv части с N-концом Fc части 5Т4 антиген-связывающего фрагмента. Таким образом, можно сконструировать по-линуклеотид для кодирования, по меньшей мере, линкера, имеющего полипептидную последовательность, приведенную в SEQ ID NOs: Y или Z. Несмотря на то, что в качестве линкера может быть использована либо последовательность SEQ ID NO: Y, либо последовательность SEQ ID NO: Z, тем не менее, иммуногибридная молекула, имеющая пептидный линкер с последовательностью SEQ ID NO: Y, обладает преимуществом при сайт-специфическом конъюгировании вследствие присутствия остатка цистеина.
Предпочтительно, чтобы замещение, введение или делеция любой аминокислоты или использование пептидомиметика существенно не снижали аффинность или специфичность 5Т4 антиген-связывающего фрагмента. Иммуногибридная молекула, имеющая замещение, введение или делецию аминокислоты или пептидомиметик в 5Т4 в антиген-связывающем фрагменте, сохраняет предпочтительно более чем на 75%, предпочтительно более чем на 80%, предпочтительно более чем на 85%, предпочтительно более чем на 90% или предпочтительно более чем на 95% аффинность или специфичность при связывании 5Т4 антигена по сравнению с конъюгатом с немодифицированным 5Т4 антиген-связывающим фрагментом.
Анти-5Т4 одноцепочечное антитело-Fc гибридный белок ("анти-5Т4 scFv-Fc") получали в клетках линии CHO DG44, как это описано в предварительной заявке на патент США № 61/835858, зарегистрированной 17 июня 2013 г.).
SEQ ID NO: А: 5Т4-специфический мышиный scFv фрагмент
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTL
YNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGG
GSGGGGSGGGGSSIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTS
SRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: В: 5Т4-специфический гуманизированный scFv фрагмент
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTL
YNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQ QKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGG TKLEIK
SEQ ID NO: С: человеческий шарнирный -CH2-CH3 (Fcgammal)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: Y: сайт-специфическое конъюгирование-1
AS ТС
SEQ ID NO: Z: сайт-неспецифическое конъюгирование-1
ASTX
SEQ ID NO: D: химерный анти-5Т4 scFv-Fc фрагмент
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKF
KDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSSIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAG
VPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTCEPKSSDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: E: гуманизированный анти-5Т4 scFv-Fc фрагмент (ASTC)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTL
YNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGG
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQ
QKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGG
TKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: F: гуманизированный анти-5Т4 scFv-Fc фрагмент (ASTX)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWVSRINPNNGVTL
YNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGG
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQ
QKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGG
TKLEIKASTXEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Эти антитела могут быть получены рекомбинантно, синтетически или другим подходящим известным методом. В таких методах и конструкциях используют указанные в изобретении нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды и пептидные последовательности. В качестве варианта в таких методах и конструкциях для получения антител используют последовательности, которые являются природными или искусственно модифицированными, например природные варианты или кодон-оптимизированные варианты приведенных в изобретении последовательностей SEQ ID NOs (например, А). Известны различные схемы кодон-оптимизации. См., например, UpGene(tm) и Optimizer(tm), которые представляют собой методы, доступные через сеть Интернета. Кроме того, ряд коммерческих организаций осуществляют кодон-оптимизацию, используя собственные схемы, например, в частности, SignGen Laboratories, DNA2.0, OpenX.
Эти описанные в изобретении таргетирующие лиганды, линкеры и фрагменты лекарственного средства или пролекарства могут быть сформированы в терапевтическое лекарственное средство и тарге-тирующий конъюгат изобретения, например, с помощью раскрытых методик и способов. Терапевтические и таргетирующие конъюгаты изобретения и способы их получения описаны ниже с помощью неограничивающих примеров.
Конъюгаты или полимерные каркасные структуры
Конъюгаты изобретения включают одно или более присутствующих D, где D представляет собой терапевтическое средство, например лекарственное средство, где одно или более присутствующих D могут быть одинаковыми или различными.
В других конкретных вариантах осуществления одна или более присутствующая PBRM присоединена к полимерному носителю, где одна или более присутствующие PBRM могут быть одинаковыми или различными. В других конкретных вариантах осуществления один или более полимерных носителей, которые содержат одно или более присутствующих D, соединены с PBRM (например, с антителом).
Как уже обсуждалось в общем виде выше, в конкретных вариантах осуществления каждый полимерный носитель независимо имеет от приблизительно 0,1 до приблизительно 25% мономеров, включающих D, более предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 20%, более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 15% и еще более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 10%. Например, полимерный носитель представляет собой PHF, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа и имеет от приблизительно 0,3 до приблизительно 15% мономеров, включающих ауристатин F, более предпочтительно приблизительно 212%, более предпочтительно приблизительно 5-10%.
В конкретных вариантах осуществления, когда D представляет собой лекарственное средство, которое имеет величину IC50 <10 рМ для антипролиферативной активности в отношении широкого спектра клеточных линий, полимерный носитель представляет собой PHF, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, и имеет от приблизительно 0,1 до приблизительно 25% мономеров, включающих D, более предпочтительно приблизительно 2-10%, более предпочтительно приблизительно 2-5%.
В конкретных вариантах осуществления конъюгат этого изобретения имеет формулу (Id)
где в каждом случае присутствия D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5 кДа, и
% между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе,
m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140,
m7 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, где сумма m1 и m7 составляет m6 (т.е. от 2 до приблизительно 180).
В одном варианте осуществления D представляет собой a) соединение ауристатина, (b) соединение калихимицина, (c) соединение дуокармицина, (d) ингибитор топоизомеразы, (e) соединение пирролобен-зодиазепина, (f) соединение барвинка, (g) ингибитор синтеза белка, (h) ингибитор РНК-полимеразы, (i) тубулин-связывающее соединение или их аналоги.
В конкретном варианте осуществления D представляет собой (a) соединение ауристатина, (b) соединение калихимицина, (c) соединение дуокармицина, (d) соединение камптотецина, (e) соединение пирролобензодиазепина, (f) соединение барвинка или их аналоги.
Например, соединение ауристатина представляет собой ауристатин, доластатин, монометилаури-статин Е (MMAE), монометилауристатин F (MMAF), ауристатин F, AF НРА, фенилендиамин (AFP).
Например, дуокармицин или его аналог представляет собой дуокармицин А, дуокармицин В1, дуокармицин В2, дуокармицин C1, дуокармицин С2, дуокармицин D, дуокармицин SA, СС-1065, адозеле-зин, бизелезин или карзелезин.
Например, соединение камптотецина представляет собой камптотецин, СРТ-11 (иринотекан), SN-38 или топотекан.
Например, соединение пирролобензодиазепина представляет собой мономер пирролобензодиазепи
на, симметричный димер пирролобензодиазепина или несимметричный димер пирролобензодиазепина.
Конъюгат полимер-лекарственное средство формулы (Id) применяют для конъюгирования с PBRM, которая имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более или 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60-180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа или 100-140 кДа).
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более или 180 кДа или более), полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например, PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 кДа до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа или приблизительно 3-15 кДа или приблизительно 5-10 кДа).
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 40 до 200 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа или приблизительно 3-15 кДа или приблизительно 5-10 кДа).
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 40 до 80 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа). Например, PHF имеет молекулярную массу приблизительно 5 кДа, 10 кДа или 15 кДа.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, фрагменты антител, такие как, например, Fabs.
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 60 до 120 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа или приблизительно 3-15 кДа или приблизительно 5-10 кДа). Например, PHF имеет молекулярную массу приблизительно 5 кДа, 10 кДа или 15 кДа.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, верблюжьи Fab2, scFvFc и другие подобные фрагменты.
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 140 до 180 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа). Например, PHF имеет молекулярную массу приблизительно 5 кДа, 10 кДа или 15 кДа.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, полноразмерные антитела, такие как IgG, IgM.
где один из Xa и Xb представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий
В конкретных вариантах осуществления конъюгат полимер-лекарственное средство (Id) при конъю-гировании с PBRM имеет формулу (1е)
малеимидо, или Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 17,
m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, где сумма m3a и m3b составляет m3, сумма m, m1, m7, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300 и m5 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10.
PBRM имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более или 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60-180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа, или 100-140 кДа).
Например, PBRM имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более или 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60-180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа, или 100-140 кДа) и имеет сульфгидрильную (т.е. -SH или тиольную) группу.
Например, суммарное число сульфидных связей, образованных между PHF и PBRM (или суммарное число точек присоединения) составляет 10 или менее.
Например, отношение между m7 и m3b составляет большее чем 1:1 и меньшее чем или равное 10:1.
Например, отношение между m7 и m3b составляет приблизительно 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или
2:1.
Например, отношение между m7 и m3b составляет приблизительно от 2:1 до 8:1.
Например, отношение между m7 и m3b составляет приблизительно 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или 2:1.
Например, отношение между m7 и m3b составляет приблизительно от 2:1 до 4:1.
Например, отношение между m7 и m3b составляет приблизительно 4:1, 3:1 или 2:1.
Например, когда PHF в формуле (Ie) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, сумма m, m1, m7, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 70, m7 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 9, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 8.
Например, когда PHF в формуле (Ie) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, сумма m, m1, m7, m3a и m3b составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110, m1 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 50, m7 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 15, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 7, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
Например, когда PHF в формуле (Ie) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, сумма m, m1, m7, m3a и m3b составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35, m7 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 4, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5, и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
В конкретных вариантах осуществления, конъюгат белок-полимерное лекарственное средство этого изобретения имеет описанную в изобретении формулу (lb)
где один из Xa и Xb представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеимидо, или Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 17,
m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, где сумма m3a и m3b составляет m3, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300 и
m5 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10.
Например, PBRM имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более, 180 кДа или более или 200 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60-180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа, или 100-140 кДа).
Например, суммарное число сульфидных связей, образованных между PHF и PBRM (или суммарное число точек присоединения), составляет 10 или менее.
Например, отношение между m2 и m3b составляет больше чем 1:1 и меньше чем или равно 10:1. Например, отношение между m2 и m3b составляет приблизительно 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или
2:1.
Например, отношение между m2 и m3b составляет приблизительно от 2:1 до 8:1.
Например, отношение между m2 и m3b составляет приблизительно 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 или 2:1.
Например, отношение между m2 и m3b составляет приблизительно от 2:1 до 4:1.
Например, отношение между m2 и m3b составляет приблизительно 4:1, 3:1 или 2:1.
Например, когда PHF в формуле (Ib) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 70, m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 9, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 8.
Например, когда PHF в формуле (Ib) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110, m1 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 50, m2 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 15, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 7, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
Например, когда PHF в формуле (Ib) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75, m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35, m2 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 4, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5, и m5 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 4.
Например, фрагменты, блокирующие малеимидо, представляют собой фрагменты, которые могут быть ковалентно присоединены к одному из двух олефиновых углеродных атомов в результате реакции малеимидной группы с тиолсодержащим соединением формулы (II)
R90-(CH2)d-SH (II),
где R90 представляет собой NHR91, OH, COOR93, CH(NHR91)COOR93 или замещенную фенильную группу; R93 представляет собой водород или C1-4 алкил; R91 представляет собой водород, CH3 или CH3CO и d представляет собой целое число от 1 до 3.
Например, соединение, блокирующее малеимидо, формулы (II) может представлять собой цистеин, N-ацетилцистеин, цистеинметиловый эфир, N-метилцистеин, 2-меркаптоэтанол, 3-меркаптопропановую кислоту, 2-меркаптоуксусную кислоту, меркаптометанол (т.е. HOCH2SH), бензилтиол, в котором фенил замещен с помощью одного или более гидрофильных заместителей, или 3-аминопропан-1-тиол. Один или более гидрофильных заместителей на фениле включают OH, SH, метокси, этокси, COOH, CHO, COC1-4 алкил, NH2, F, циано, SO3H, PO3H и другие подобные.
Например, группа, блокирующая малеимидо, представляет собой -S-(CH2)d-R90, в котором
R90 представляет собой OH, COOH или CH(NHR91)COOR93;
R93 представляет собой водород или CH3; R91 представляет собой водород или CH3CO и d представляет собой 1 или 2.
Например, группа, блокирующая малеимидо, представляет собой -S-CH2-CH(NH2)COOH.
Например, когда PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа, (например, приблизительно 2-20 кДа или приблизительно 3-15 кДа или приблизительно 5-10 кДа), число лекарственных средств на один PHF (например, m2) представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, (например, приблизительно 1:20, или приблизительно 2:15, или приблизительно 3:10). Эта каркасная структура может быть использована, например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более или 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более или 180 кДа или более). В этом варианте осуществления отношение PBRM к PHF составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:9, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:8, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:7, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:4, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:3, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:2, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:2
до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:4 или от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:3.
Например, когда PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа), число лекарственных средств на один PHF (например, m2) представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, (например, приблизительно 1-20, или приблизительно 2-15, или приблизительно 3-10). Эта каркасная структура может быть использована, например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 140 до 180 кДа. В этом варианте осуществления отношение PBRM к PHF составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:9, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:8, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:7, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:4, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:3, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:2, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:4 или от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:3.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, полноразмерные антитела, такие как IgG, IgM.
Например, когда PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа), число лекарственных средств на один PHF (например, m2) представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40 (например, приблизительно 1:20, или приблизительно 2:15, или приблизительно 3:10). Эта каркасная структура может быть использована, например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 60 до 120 кДа. В этом варианте осуществления отношение PBRM к PHF составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:9, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:8, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:7, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:4, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:3, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:2, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:4 или от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:3.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, фрагменты антител, такие как, например, Fab2, scFcFv и верблюжьи.
Например, когда PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа), число лекарственных средств на один PHF (например, m2) представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, (например, приблизительно 1:20, или приблизительно 2:15, или приблизительно 3:10). Эта каркасная структура может быть использована, например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 40 до 80 кДа. В этом варианте осуществления отношение PBRM к PHF составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:9, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:8, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:7, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:4, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:3, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:2, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:6, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:5, от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:4 или от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:3.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, фрагменты антител, такие как Fabs.
В другом аспекте изобретение предлагает полимерную каркасную структуру, применяемую для образования конъюгата как с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM), так и с терапевтическим средством (D). Каркасная структура, не содержащая D, включает полимерный носитель, одно или более связующих звеньев, присоединенных к полимерному носителю, которые применяют для присоединения PBRM к полимерному носителю, и одно или более связующих звеньев, которые применяют для присоединения лекарственного средства (D) к полимерному носителю.
В конкретных вариантах осуществления, конъюгаты получают в несколько стадий. Эти стадии включают: (1) модифицирование полимера, для того чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой лекарственного средства или его производного; (2) реакцию модифицированного полимера с лекарственным средством или его производным для связывания лекарственного средства с полимером; (3) модифицирование конъюгата полимер-лекарственное средство, для того чтобы полимер содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой PBRM или ее производного; и (4) реакцию конъюгата модифицированный полимер-лекарственное средство с PBRM или ее производным с получением конъюгата этого изобретения. Стадия (3) может быть опущена, если модифицированный полимер, полученный на стадии (1), содержит функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой PBRM или ее производным.
В другом варианте осуществления конъюгаты получают в несколько стадий: (1) модифицировани
ем полимера для того, чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой первого лекарственного средства или его производного, (2) реакцией модифицированного полимера с первым лекарственным средством или его производным для связывания первого лекарственного средства с полимером, (3) модифицированием конъюгата полимер-лекарственное средство для того, чтобы он содержал другую функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой второго лекарственного средства или его производным, (4) реакцией конъюгата модифицированный полимер-лекарственное средство со вторым лекарственным средством или его производным для связывания второго лекарственного средства с конъюгатом полимер-лекарственное средство, (5) модифицированием конъюгата полимер-лекарственное средство, содержащего 2 различных лекарственных средства, для того чтобы полимер содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой PBRM или ее производным, и (6) реакцией модифицированного конъюгата полимер-лекарственное средство со стадии (5) с PBRM или ее производным с получением конъюгата этого изобретения. Стадии (5) и (6) могут быть повторены, если 2 различных PBRM или их производные конъюгируют для получения конъюгата полимер-лекарственное средство, включающего два различных лекарственных средства и две различных PBRM.
В еще одном варианте осуществления конъюгаты получают в несколько стадий. Эти стадии включают (1) модифицирование полимера, для того чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой лекарственного средства или его производного, (2) дополнительное модифицирование полимера, для того чтобы он также содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой PBRM или ее производным, (3) реакцию модифицированного полимера с лекарственным средством или его производным для связывания лекарственного средства с полимером и (4) реакцию конъюгата модифицированный полимер-лекарственное средство с PBRM или ее производным с получением конъюгата этого изобретения. Последовательность стадий (1) и (2) или последовательность стадий (3) и (4) может быть изменена. Кроме того, либо стадия (1), либо стадия (2) может быть опущена, если модифицированный полимер содержит функциональную группу, которая может реагировать как с функциональной группой лекарственного средства или его производных, так и с функциональной группой PBRM или ее производной.
В другом варианте осуществления конъюгаты получают в несколько стадий: (1) модифицированием полимера, для того чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой лекарственного средства или его производного, (2) дополнительным модифицированием полимера, для того чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой PBRM или ее производным, (3) реакцией модифицированного полимера с первым лекарственным средством или его производным для связывания первого лекарственного средства с полимером, (4) модифицированием конъюгата полимер-лекарственное средство, того чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой второго лекарственного средства или его производного, (5) реакцией конъюгата модифицированный полимер-лекарственное средство со вторым лекарственным средством или его производным для связывания второго лекарственного средства с конъюгатом полимер-лекарственное средство, (6) реакцией конъюгата модифицированный полимер-лекарственное средство, содержащего 2 различных лекарственных средства, для того чтобы полимер с PBRM или ее производным образовал конъюгат этого изобретения. Стадия (6) может быть повторена, если 2 различных PBRM или их производные конъюгируют для получения конъюгата полимер-лекарственное средство, включающего два различных лекарственных средства и две различных PBRM. Стадия (4) может быть проведена после стадии (1), для того чтобы модифицированный полимер содержал две различных функциональных группы, которые могут реагировать с двумя различными лекарственными средствами или их производными. В этом варианте осуществления модифицированный полимер, содержащий две различных функциональных группы, которые могут реагировать с двумя различными лекарственными средствами или их производными, может быть дополнительно модифицирован, для того чтобы он содержал функциональную группу, которая может реагировать с функциональной группой PBRM или ее производным; перед реакцией модифицированного полимера либо с двумя различными лекарственными средствами (стадия (3) и стадия (5)), либо с PBRM (стадия (6)).
Биоразлагаемые биологически совместимые конъюгаты изобретения могут быть получены при соблюдении необходимых требований биоразлагаемости и гидрофильности. Например, при физиологических условиях может достигаться соотношение между биоразлагаемостью и стабильностью. Например, известно, что в отличие от малых молекул молекулы с молекулярными массами выше определенной пороговой величины (обычно выше 40-100 кДа в зависимости от физической формы молекулы) не выводятся через почки и могут быть выведены из организма только в результате усвоения клетками и разложения во внутриклеточных компартментах, главным образом, в лизосомах. Это наблюдение является примером того, как могут создаваться функционально стабильные, но и биоразлагаемые материалы путем модулирования их стабильности при обычных физиологических условиях (pH 7,5±0,5) и при лизосо-мальной величине pH (pH около 5). Например, известно, что гидролиз ацетальных и кетальных групп катализируется кислотами, следовательно, полиали обычно будут менее стабильны в кислотной лизосо-мальной среде, чем, например, в плазме крови. Можно провести испытание с целью сравнения профиля
разложения полимера, например, при pH 5 и pH 7,5 при 37°C в водной среде и в результате определить ожидаемое соотношение для стабильности полимера в нормальной физиологической среде и в "диге-стивном" лизосомальном компартменте после усвоения клетками. Целостность полимера в таких испытаниях может быть измерена, например, с помощью эксклюзивной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Любой специалист в этой области может выбрать другие подходящие методы для изучения различных фрагментов разрушенных конъюгатов этого изобретения.
Во многих случаях будет предпочтительным, если при pH 7,5 эффективный размер полимера не будет заметно изменяться в течение от 1 до 7 дней и оставаться в пределах 50% от исходного размера, по меньшей мере, в течение нескольких недель. С другой стороны, предпочтительно, чтобы при pH 5 полимер заметно разрушался в течение от 1 до 5 дней и полностью превращался в фрагменты с низкой молекулярной массой в течение от двух недель до нескольких месяцев. Несмотря на то, что в некоторых случаях может быть предпочтительным более быстрое разложение полимера, тем не менее, обычно более желательно, чтобы полимер разлагался в клетках со скоростью, которая не превышает скорость метаболизма или экскреции фрагментов полимера клетками. Соответственно, в конкретных вариантах осуществления ожидается, что конъюгаты настоящего изобретения будут биоразлагаемыми, в частности, при усвоении клетками, и относительно "инертными" в отношении биологических систем, предпочтительно, чтобы продукты разложения носителя были незаряжены и значительно не изменяли pH среды. Предполагается, что обилие спиртовых групп может обеспечить низкую скорость распознавания полимера клеточными рецепторами, в частности фагоцитами. Главные цепи полимера настоящего изобретения обычно содержат немного, если они присутствуют, антигенных детерминант (характерных, например, для некоторых полисахаридов и полипептидов) и обычно не включают жесткие структуры, способные участвовать во взаимодействиях типа "ключ-замок" in vivo, если эти взаимодействия не являются желательными. Так, ожидается, что растворимые, сшитые и твердые конъюгаты этого изобретения имеют низкую токсичность и биоадгезию, что делает их подходящими для ряда биомедицинских применений.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения биоразлагаемые биологически совместимые конъюгаты могут образовывать линейные или разветвленные структуры. Например, биораз-лагаемые биологически совместимые полиальные конъюгаты настоящего изобретения могут быть хи-ральными (оптически активными). Необязательно, но биоразлагаемые биологически совместимые поли-альные конъюгаты настоящего изобретения могут быть скалемическими.
В конкретных вариантах осуществления конъюгаты изобретения являются водорастворимыми. В конкретных вариантах осуществления конъюгаты изобретения являются водонерастворимыми. В конкретных вариантах осуществления конъюгат изобретения находится в твердой форме. В конкретных вариантах осуществления конъюгаты изобретения являются коллоидами. В конкретных вариантах осуществления конъюгаты изобретения находятся в форме частиц. В конкретных вариантах осуществления конъюгаты изобретения находятся в форме геля.
Это изобретение также предлагает полимерную каркасную структуру, применяемую для конъюгирования с PBRM для образования описанного в изобретении конъюгата полимер-лекарственное средст-во-PBRM. Каркасная структура включает полимерный носитель формулы (Ia), используемый для образования конъюгата с белоксодержащей распознающей молекулой (PBRM), например с PBRM с молекулярной массой приблизительно 40 кДа или более
каркасная структура включает поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформаль) (PHF), имеющий молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа; X представляет собой CH2, О или NH;
m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140,
m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40,
m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18,
сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300.
Например, в каждом случае присутствия фрагмента малеимидо в m3 звене формулы (Ia) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM.
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу 40 кДа или более (например, 60 кДа или более, 80 кДа или более, 100 кДа или более, 120 кДа или более, 140 кДа или более, 160 кДа или более или 180 кДа или более или приблизительно 40-200 кДа, 40-180 кДа, 40-140 кДа, 60-200 кДа, 60-180 кДа, 60-140 кДа, 80-200 кДа, 80-180 кДа, 80-140 кДа, 100-200 кДа, 100-180 кДа или 100-140 кДа), полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа).
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 40 до 200 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа).
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 40 до 80 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа). Например, PHF имеет молекулярную массу приблизительно 5 кДа, 8 кДа, 10 кДа, 13 кДа или 15 кДа.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, фрагменты антител, такие как, например, Fabs.
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 60 до 120 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 5-30 кДа, приблизительно 5-20 кДа, или приблизительно 5-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа). Например, PHF имеет молекулярную массу приблизительно 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа или 40 кДа.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, верблюжьи, Fab2, scFcFv и другие подобные.
Например, для конъюгирования PBRM, имеющей молекулярную массу от 140 до 180 кДа, полимерный носитель каркасной структуры изобретения представляет собой полиацеталь, например PHF, имеющий молекулярную массу (т.е. молекулярную массу немодифицированного PHF) в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (например, приблизительно 2-20 кДа, или приблизительно 3-15 кДа, или приблизительно 5-10 кДа). Например, PHF имеет молекулярную массу приблизительно 5 кДа, 8 кДа, 10 кДа, 13 кДа или 15 кДа.
PBRMs в этом диапазоне молекулярных масс включают, но этим не ограничивая, например, полноразмерные антитела, такие как IgG, IgM.
Например, когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа (т.е. сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 1 до приблизительно 300), m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18 и/или m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140 (например, m1 составляет приблизительно 1-90).
Например, когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа (т.е. сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 1 до приблизительно 150), m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 10 и/или m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 70 (например, m1 составляет приблизительно 4-45).
Например, когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа (т.е. сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 1 до приблизительно 110), m2 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 15, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8 и/или m1 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 50 (например, m1 составляет приблизительно 4-30).
Например, когда PHF в формуле (Ia) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа (т.е. сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 1 до приблизительно 75), m2 представляет собой целое число от 3 до приблизительно 10, m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5 и/или m1 представляет собой целое число от 5 до приблизительно 35 (например, m1 составляет приблизительно 10-25).
Например, один или более полимерных носителей, несущих лекарственное средство, соединены с одной PBRM. Например, каркасная структура (например, конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство) включает PBRM с молекулярной массой приблизительно 40 кДа или более и один или более полимерных носителей, несущих D, соединенных с PBRM.
Например, каркасная структура дополнительно включает PBRM, соединенную с полимерным носителем через малеимидную группу.
Изобретение также предлагает полимерные каркасные структуры формулы (Ic) с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа
где X представляет собой CH2, О или NH;
m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300,
m6 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 180,
m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18 и
сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300.
Например, в каждом случае присутствия фрагмента малеимидо в m3 звене формулы (Ic) этот фрагмент предназначен для образования ковалентной связи с функциональной группой PBRM.
Например, когда PHF в формуле (Ic) имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 20 кДа (т.е. сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 150), m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 9, и/или m6 представляет собой целое число от 2 до приблизительно 90 (например, m6 составляет приблизительно 6-60).
Например, когда PHF в формуле (Ic) имеет молекулярную массу от приблизительно 3 до приблизительно 15 кДа (т.е. сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 20 до приблизительно 110), m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, и/или m6 представляет собой целое число от 4 до приблизительно 65 (например, m6 составляет приблизительно 6-45).
Например, когда PHF в формуле (Ic) имеет молекулярную массу от приблизительно 5 кДа до приблизительно 10 кДа, сумма m, m6 и m3 составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75, m6 представляет собой целое число от приблизительно 8 до приблизительно 45 и m3 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5.
В некоторых вариантах осуществления полимерную каркасную структуру (например, полиацеталь-ный полимер, такой как PHF) конъюгируют с PBRMs путем использования подхода биоконъюгирования на основе цистеина. См., например, патентные документы WO 2010100430 и US 7595292, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них. В одном варианте осуществления полимерная каркасная структура (например, полиацетальный полимер, такой как PHF) образует конъюгат с PBRM (например, антителом) через цистеины в шарнирной области антитела. Не привлекая для подтверждения какую-либо теорию, тем не менее, можно предположить, что полученный конъюгат стабилизируется за счет образования межцепных мостиковых структур.
Соответственно, изобретение также относится к полимерной каркасной структуре (например, поли-альному полимеру), включающей по меньшей мере два фрагмента, соединенных с полимерной каркасной структурой, в которой каждый фрагмент способен к конъюгированию с тиольной группой из аминокислоты (например, цистеина) в PBRM с образованием конъюгата белок-полимер. В одном варианте осуществления по меньшей мере два фрагмента, соединенных с полимерной каркасной структурой, представляют собой малеимидные группы.
В вариантах осуществления одну или более свободных тиольных групп в PBRM получают восстановлением белка. Одна или более свободных тиольных групп в PBRM затем реагируют по меньшей мере
с двумя фрагментами, содержащимися в полимерной каркасной структуре, которые способны конъюги-ровать с тиольной группой из аминокислоты, с образованием конъюгата PBRM с полимерной каркасной структурой. В одном варианте осуществления по меньшей мере два фрагмента, соединенных с полимерной каркасной структурой, представляют собой малеимидные группы.
В вариантах осуществления свободные тиольные группы в PBRM, которые используют для конъю-гирования, получают из дисульфидного мостика нативного белка или дисульфидного мостика белкового комплекса, состоящего из двух или более белковых цепей, соединенных дисульфидным мостиком. Ди-сульфидный мостик может представлять собой внутрицепной или межцепной мостик. В качестве варианта свободные тиольные группы в PBRM получают из цистеинов или непарных тиольных групп натив-ного белка, которые не принимают участие в образовании межцепного или внутрицепного мостика.
Дисульфидные связи могут быть восстановлены, например, дитиотреитолом, меркаптоэтанолом, трис-карбоксиэтилфосфином, дегидроаскорбиновой кислотой, сульфатом меди, используя традиционные методы. Белок может содержать один или более дисульфидных мостиков. Восстановление для получения свободных тиольных групп может быть контролируемым с восстановлением одного или более специфических дисульфидных мостиков в белке. В зависимости от степени восстановления дисульфида и стехиометрии фрагментов на полимерной каркасной структуре можно конъюгировать одну или более полимерных каркасных структур с белком. Иммобилизированные восстановители могут быть использованы в случае необходимости для восстановления меньшего числа дисульфидов, чем их суммарное число, т.е. для частичного восстановления, используя различные условия реакции или добавление денатурирующих средств.
Преимущества конъюгирования полимера с белком с помощью тиола включают, но этим не ограничивая, оптимизированный эффект, улучшенную консистенцию и однородность доз (так как число конъюгированных молекул полимера на один белок является практически одинаковым для каждой молекулы белка), специфическое конъюгирование, направленное на специфический остаток или остатки на каждом белке, и более легкую очистку. Кроме того, конъюгаты белок-полимер в результате тиольного конъюгирования характеризуются существенно улучшенным периодом полувыведения, средним временем удержания и/или почечным клиренсом в кровотоке по сравнению с неконъюгированным белком.
В некоторых вариантах осуществления описанные в изобретении конъюгаты лекарственное средст-во-полимер-PBRM, конъюгаты лекарственное средство-полимер, полимерные каркасные структуры, несущие лекарственное средство, или полимерные каркасные структуры, несущие PBRM, каждые обычно имеют коэффициент полидисперсности (PDI) <1,5, например <1,2.
Конъюгаты PBRM-лекарственное средство-полимер, полимерные каркасные структуры, несущие лекарственное средство, или полимерные каркасные структуры, несущие PBRM, могут быть очищены (т.е. могут быть удалены остаточные непрореагировавшие лекарственные средства, PBRM или исходные полимерные материалы) путем экстенсивной диафильтрации. В случае необходимости для удаления любых агрегированных полимерных конъюгатов PBRM-лекарственное средство может быть проведена дополнительная очистка с помощью эксклюзионной хроматографии. Обычно очищенные полимерные конъюгаты PBRM-лекарственное средство содержат <5% агрегированных полимерных конъюгатов PBRM-лекарственное средство, определенных с помощью эксклюзионной хроматографии или электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; <1% конъюгата полимер-лекарственное средство, определенного с помощью эксклюзионной хроматографии, и <2% неконъюги-рованных PBRM, определенных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой.
В табл. С и D ниже приведены примеры полимерных каркасных структур, несущих лекарственное средство, и конъюгатов полимер-лекарственное средство-белок изобретения соответственно. В табл. D m5 в химических структурах определяется так же, как в описанной выше формуле (Ib).
Ссылка #
полимер
Структура
Пример 3
6:1
он он чон у чонон °> =о
i° to
Пример 5
6:1
чон^он ЧонЧо он Ч
г г
Пример 6
6:1
но^° о=?~
Пример 12
4.5:1
НО HN^ ° 0=Г~
X = NH Пример19А Пример 19В Пример19С
2.4:1 4.6:1 2.6:1
он он ^он4-^ S> HS^ ОН > 0
(Кг^ (ЯгЧ.
|СргМа
он N\_^^\_^
Пример 21
2.5:1
Пример 25
1.7:1
он он он ОН S> HS> ^
HN HN HN
> =о > =о
0^
• -р
Пример 29
2.2:1
он он он о^ он о^ ^
г. 1 г.
г1 " > л
Пример 32
5.7:1
OH OH OH OH 0^ OH o^
^=o ^=o ^=o л-ь
HN HO HN ? ^ Ojs^NH 1 О Л-(
I * ъ ч
° °
MeO- Пример 37
2.1:1
SJHSJH OH он 0H °^=o
HN HN HNv
O^NH НЧ /-' NH2
Пример 42
4.2:1
чт°т° г -fT°r4 -fTr°r -frvi
он он он он он
1 1 1
HN HN
л Л
о о
-tYl°t "fYl°+ ^
SJHSJH он он он
"1 "1 1
SJHSJH ОНЧО^ NJH SH4O^
HN HN HN
^=0 ^=0 ^=0
Ссылка #
Отношение лекарственное средство
PBRM
Структура
Пример 4 Пример 7
12:1 -17:1
16:121:1
ТРАСТУЗУМАБ
Пример 8
10:1 -15:1
ЛИНТУЗУМАБ"(tm)
/ } i } i \
Пример 9
13:1 -18:1
Таблица D
Пример 10
12:1 -18:1
}: з. ? i \ К' 1
Пример 13
18:1 -23:1
1 1° 1У 1
PBRM g
СООН |СОгМа /
Пример 14
10:1 -15:1
ТРАСТУЗУМА
\" /
Пример 15
11:1 -16:1
ТРАСТУЗУМА
Пример 16
13:1 -18:1
/ Ks^^^^yi \ ' f 3- f ^ \
Пример 17
5:1 -10:1
Пример18А
19:1 -24:1
-Lj; ob &gfr J
Пример 18В
20:1 -25:1
ТРДСТУЗУМАБ- ^
/ 1 Ц| \
\ - I
Пример18С
23:1 -28:1
Пример 20А Пример 20В Пример 20С
13:1 -18:1
10:1 -14:1
8.5:1 -12:1
ТРАСТУЭУМАБ--
Пример 22
7.5:1 -10:1
T РАС TV ay Ч АБ - -s
Пример 23
6.5:1 -10:1
РИТУКСИМАБ-
Пример 26
8:1
ТРАСТ73УМ
Пример 27
4.5:1 -
РИТУКСИМАБ - -
$ 44]
Пример ЗОА Пример ЗОВ
11:1 -15:1
12:1 -16.5:1
ТРАСТУЗУМА
^ fey
Пример ЗОС
9.5:1 -13:1
о**
Пример 33
4:1 -6:1
ТРАСТУЗУМАБ
\ V-
Пример 34
2.5:1-
приблизительно
3.5:1
РИТУКСИМАБ - "
? I I 1 п
Пример 36
14.5:1
20:1
ТРАСТУЗУМАБ -L Р ( а ( > ~
Пример 38
4:1 -6:1
Пример 39
4:1 -6:1
РИТУКСИМ
Пример 40
14:1 -19:1
/ f 3- }\ \
,^РС.ТРАСТ,ЗУМАВ1^ Ar^l ^Ч^ХШ"]
V" •с" /
Пример 42А
19:1 -26:1
ТРАСТУЗУМАБ-
/ i" i г't \
\ А
Пример 42В
16:1 -22:1
? * ? ? J
\ /
Пример 43А Пример 43В Пример 43С
6:1 -9:1
12:1 -17:1
12:1 -16:1
Пример 44
Пример 45
| ¦¦ -j -|; j \
ТРАСТУЗУМАБ Р =^ о ^ С^^^^ J
В дополнительном примере предлагается анти-5Т4 терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат. Конъюгат включает: (a) лиганд (LG), который представляет собой иммуноглобулин или его функциональный фрагмент, который нацелен на человеческий онкофетальный белок 5Т4, при этом лиганд имеет молекулярную массу больше чем 40 кДа и связан с m5 полимерными каркасными структурами (b), где m5 составляет от 1 до приблизительно 10, и (b) полимерную каркасную структуру, включающую поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаль) (PHF), которая имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, где полимерная каркасная структура включает расположенные случайным образом мономерные звенья m, m1, m2, m3a и m3b, определяемые следующим образом: (i) m3a:
где m3a отсутствует или от 1 до приблизительно 17 мономерных m3a звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре и в каждом звене, Xa и Xb независимо выбирают из (A): один представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеимидо, или (B): Xa и Xb, вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
(ii) m3b, где сульфидная связь образует точку присоединения к LG, и
где от 1 до приблизительно 8 мономерных m3b звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре, где сумма m3a и m3b составляет от 1 до 18, и где атом серы является частью LG; (ш) ш:
где от 1 до приблизительно 300 мономерных m звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре; (iv) m,:
где от 1 до приблизительно 140 мономерных m1 звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре; и (v): m2:
где от 1 до приблизительно 40 мономерных m2 звеньев присутствуют в полимерной каркасной структуре; где в каждом из мономерных звеньев m, m1, m2, m3a и m3b, Х представляет собой СН2, О или NH, и сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300, и где в каждом случае присутствия D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5кДа, и ^ между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе. Предпочтительно, когда анти-5Т4 лиганд представляет собой определенный в изобретении иммуноглобулин или его функциональный фрагмент. Например, иммуноглобулин или его функциональный фрагмент выбирают из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела, иммуноадгезина, F(Ab)2, мини-антитела, Fab', однодоменного антитела, нанотела, одноцепочечного Fv, тандемного/бис-scFv, F(ab)3, scFv-Fc (или scFvFc), dsFv, диатела, триотела и тетратела.
В дополнительном примере терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат характеризуется структурами, изображенными формулой (Е)
где PHF имеет молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа; m составляет от 1 до 75, m1 составляет от приблизительно 5 до приблизительно 35, m2 составляет от приблизительно 3 до приблизительно 10, m3a составляет от 0 до приблизительно 4, m3b составляет от 1 до приблизительно 5, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от приблизительно 40 до приблизительно 75 и m5 составляет от 2
до приблизительно 4.
В дополнительном варианте осуществления предлагается нацеленный конъюгат терапевтического анти-5Т4 лекарственного средства, применяемый в противоопухолевых терапиях, который включает полимерную каркасную структуру, содержащую PHF, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, где конъюгат имеет следующую структуру:
где m5 составляет от 1 до 10, m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 300, m1 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 140, m2 представляет собой целое число от 1 до приблизительно 40, m3a представляет собой целое число от 0 до приблизительно 17, m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 8, где сумма m3a и m3b представляет собой целое число от 1 до приблизительно 18, и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от приблизительно 15 до приблизительно 300, Х представляет собой NH, один из Xa или Xb представляет собой H, а другой представляет собой фрагмент, блокирующий малеимидо, и где в каждом случае присутствия D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5 кДа, и ^ между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе, где ANTI-5T4 представляет собой анти-5Т4 лиганд, который включает иммуноглобулин или его функциональный фрагмент, который является селективным в отношении человеческого онкофетального антигена 5Т4. Например, молекулярная масса анти-5Т4 составляет по меньшей мере приблизительно 40 кДа. В одном варианте осуществления D представляет собой ауристатин или его аналог, присоединенный к карбонильному фрагменту m2 через фрагмент гидроксипропиламид^-аланин. В одном варианте осуществления отношение лекарственного средства к анти-5Т4 составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 30:1 или от приблизительно 12:1 до приблизительно 18:1. В другом варианте осуществления среднее отношение конъюгата PHF лекарственное средство к анти-5Т4 антителу составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно
4:1.
Эти конъюгаты могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью мольных процентов или
мольных долей различных звеньев, которые образуют конъюгат. Например, мономерное звено, включающее диэтиленгликольмалеимидной (EG2-MI) фрагмент, соединенный с лигандом, составляет мольную долю от приблизительно 2 до приблизительно 5 мол.%. В еще одном примере мономерное звено, несущее лекарственное средство, составляет мольную долю от приблизительно 5 до приблизительно 10 мол.%. Например, отношение лекарственного средства к анти-5Т4 составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 30:1 или от приблизительно 12:1 до приблизительно 18:1. В дополнительном примере среднее отношение PHF каркасной структуры, включающей лекарственное средство, к анти-5Т4 антителу составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или составляет от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1. В одном варианте осуществления конъюгат представляет собой анти-5Т4-((EG2-MI(3%)-(10 кДа PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala (8%)). Этот конъюгат может быть получен, как это описано в примере 10 и в более общем виде на схеме 5.
В еще одном дополнительном варианте осуществления предлагается терапевтическое лекарственное средство и нацеленный конъюгат, применяемый в противоопухолевых терапиях, который включает анти-5Т4 и PHF полимерную каркасную структуру, содержащую показанные ниже звенья, которые могут быть соединены случайным образом друг с другом
где анти-5Т4 представляет собой конструкцию одноцепочечного антитела, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: A, PHF имеет молекулярную массу от приблизительно 2 до приблизительно 40 кДа, среднее отношение полимерной каркасной структуры к анти-5Т4 антителу составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1, отношение AF-HPA к анти-5Т4 антителу составляет от приблизительно 12:1 до приблизительно 18:1.
Эти конъюгаты могут быть получены, как это описано в изобретении, и объединены с подходящими носителями в композиции, применяемыми для доставки субъекту. Эти композиции могут содержать смеси этих нацеленный конъюгатов анти-5Т4 лекарственных средств, т.е. одна композиция может содержать нацеленные конъюгаты анти-5Т4 лекарственного средства с различными лекарственными средствами и/или различными полимерными каркасными структурами.
Методы синтеза
Согласно настоящему изобретению для получения конъюгатов изобретения или содержащих их композиций и применяемых для их получения промежуточных соединений и компонентов (например, носителей и модификаторов) могут быть использованы любые доступные методы. Например, могут быть использованы полусинтетические и полностью синтетические методы.
Носители
Методы получения полимерных носителей (например, биологически совместимых биоразлагаемых полимерных носителей), применяемых для конъюгирования с модификаторами, известны в технике. Например, принципы синтеза можно найти в патентах США №№ 5811510, 5863990, 5958398, 7838619, 7790150, 8685383 и 8815226, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них. Для специалиста в области синтеза полимеров является известным, как можно применить эти методы для того, чтобы получить полимерные носители, используемые при осуществлении изобретения.
В одном варианте осуществления метод получения биоразлагаемых биологически совместимых по-лиальных конъюгатов настоящего изобретения включает процесс, с помощью которого подходящий полисахарид смешивают с эффективным количеством гликоль-специфического окислителя с образованием промежуточного альдегидного соединения. Промежуточное альдегидное соединение, которое само по себе является полиалем, может затем быть восстановлено до соответствующего полиола, сукцинолиро-ванного и соединенного с одним или более подходящими модификаторами с образованием биоразлагае-мого биологически совместимого полиального конъюгата, включающего сукцинамид-содержащие связи.
В другом предпочтительном варианте осуществления полностью синтетические биоразлагаемые биологически совместимые полиалы для применения в настоящем изобретении могут быть получены реакцией подходящего инициатора с подходящим соединением-предшественником.
Например, полностью синтетические полиалы могут быть получены конденсацией виниловых эфи-ров с защищенными замещенными диолами. Могут быть использованы другие методы, такие как полимеризация с раскрытием кольца, в которых эффективность метода может зависеть от степени замещения и объемности защитных групп.
Для любого специалиста в этой области является очевидным, что для получения высокомолекулярных продуктов могут быть оптимизированы системы растворителей, катализаторы и другие факторы. В конкретных вариантах осуществления носитель представляет собой PHF.
В вариантах осуществления полимерный носитель представляет собой PHF, имеющий коэффициент полидисперсности (PDI) меньше чем 1,5, например <1,2.
Лекарственные средства и производные лекарственных средств
В конкретных вариантах осуществления лекарственное средство может быть модифицировано перед конъюгированием с полимерным носителем. На схемах 1 и 2 показаны методы модифицирования алкалоида барвинка. На схеме 3 показан метод модифицирования производного неприродного камптоте
цина. На схеме 4 показан метод модифицирования ауристатина F. Большое число методов описаны в патентном документе US 2010/0305149, содержание которого включено в изобретение путем ссылки на него.
Реакция C23 эфира алкалоида барвинка с гидразином и затем обработка с помощью NaNO2 дает в результате активный азидный эфир. Реакция азидного эфира с соединением амина, таким как пропано-ламин или 1-аминопропан-2-ол, дает в результате производное алкалоида барвинка с функционализиро-ванным гидроксилом, которое может быть далее дериватизировано с помощью аминосодержащих соединений, таких как, например, производные аланина или метилаланина, для конъюгирования с полимерами (см. схему 1).
NH3+ TFA-
Обработка гидроксильного производного алкалоида барвинка с помощью защищенного аминосо-держащего эфира, такого как трет-бутоксиэтерифицированная аминокислота, и затем гидролиз эфира в трифторуксусной кислоте (TFA) дает трифлатную соль алкалоида барвинка (схема 2). Конъюгирование алкалоида барвинка с функционализированными полимерами дает в результате конъюгаты лекарственное средство-полимер, которые могут быть затем конъюгированы с PBRM или ее производным с получением конъюгатов белок-лекарственное средство-полимер.
Схема 3
10-Гидроксигруппу производного неприродного камптотецина, например SN38, селективно защищают путем реакции производного с трет-бутилдифенилсилилхлоридом (TBDPSiCl) в присутствии три-этиламина. 20-Гидроксигруппа может быть подвергнута реакции с трет-бутилкарбонилаланином с образованием производного аланина, используя методику, описанную в публикации Sapra, P. et al., Clin. Cancer Res., 14:1888-1896 (2008). В качестве варианта могут быть использованы другие аминокислоты, например глицин. С первичного амина снимают защиту путем удаления Вос-защитной группы в результате обработки трифторуксусной кислотой, затем удаляют TBDPS-защитную группу с помощью фторида тет-рабутиламмония (см. схему 3). Полученное аминодериватизированное соединение SN38 может быть конъюгировано с функционализированным полимером с образованием конъюгата лекарственное средство-полимер.
Обработка ауристатина F защищенным аминосодержащим эфиром, таким как трет-бутоксиэтерифицированный 2-гидроксипропиламин, и затем гидролиз эфира в HCl дает 2-гидрокси-пропиламино производное ауристатина F (см. схему 4). Конъюгирование производного ауристатина F с функционализированными полимерами дает конъюгаты лекарственное средство-полимер, которые могут быть далее конъюгированы с PBRM или ее производным с образованием конъюгатов белок-полимер-лекарственное средство.
Конъюгаты или полимерные каркасные структуры
На схеме 5 ниже приведена схема синтеза для получения несущих лекарственное средство полимерных каркасных структур изобретения. В одном варианте осуществления конъюгаты получают в несколько стадий: (1) полимер PHF модифицируют для того, чтобы он содержал COOH фрагмент (например, -C(O)-X-(CH2)2-COOH); (2) полимер затем дополнительно модифицируют, для того чтобы он содержал малеимидный фрагмент (например, EG2-MI), который может реагировать с функциональной группой PBRM; (3) модифицированный полимер, содержащий две различные функциональные группы, реагирует с функциональной группой лекарственного средства или его производного (например, AF-HPA-Ala) с образованием конъюгата полимер-лекарственное средство; (4) восстанавливают дисульфид-ные связи PBRM; (5) восстановленная PBRM затем реагирует с конъюгатом полимер-лекарственное средство с образованием конъюгата белок-полимер-лекарственное средство; и (6) оставшиеся малеимид-ные фрагменты необязательно реагируют с соединением, блокирующим малеимидо (например, цистеи-ном).
В другом варианте осуществления порядок стадий (2) и (3) может быть изменен, как это показано в правом боковом направлении на схеме 5 ниже.
Схема 6
он он он о
добавление EG2-MI и AF-HPA-AJa
l-\ HIV
N-\ HN-
11. Bt 2. Ц|
Восстановленная PBRM |истеин
\IHN> SHH-OH SIHS> ^""4 *-OH-O
> ° "p
H^ rttf HIT 0=^
> \ (^i У О ОМе О ОЩ Me
Фармацевтические композиции
Изобретение также предлагает фармацевтические композиции, включающие один или более описанных в изобретении конъюгатов белок-полимер-лекарственное средство в приемлемом носителе, таком как стабилизатор, буфер и другие подобные вещества. Конъюгаты могут быть введены и внедрены субъекту с помощью стандартных способов вместе или без стабилизаторов, буферов и других подобных веществ, образующих фармацевтическую композицию. Введение может быть местным (в том числе оф-тальмическим и в мембраны слизистой оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), пульмо-нальным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, перораль-ным или парентеральным введением, в том числе внутривенной, внутриартериальной, подкожной, внут-рибрюшинной или внутримышечной инъекцией или инфузией, или внутричерепным, например интрате-кальным или интравентрикулярным введением. Конъюгаты могут быть приготовлены и применены в виде стерильных растворов и/или суспензий для инъекций, лиофилизированных порошков для растворения перед инъекцией/инфузией, композиций для местного применения, в виде таблеток, капсул или эликсиров для перорального введения, или суппозиториев для ректального введения, и в виде других известных в технике композиций.
Фармакологическая композиция или состав относится к композиции или составу в удобной для введения форме, например для системного введения, в клетку или субъекту, включая, например, человека. Применение той или иной формы, отчасти, зависит от способа введения, например, перорального, ингаляционного, трансдермального или путем инъекции/инфузии. Такие формы не должны препятствовать достижению композицией или составом клетки-мишени (т.е. клетки, в которую требуется доставить лекарственное средство). Например, фармакологические композиции, инъецируемые в кровоток, должны быть растворимыми. Другими факторами, которые необходимо принимать во внимание, являются токсичность и формы, которые отрицательно влияют на проявление композицией или составом их лечебного действия.
Под "системным введением" подразумевают in vivo системную абсорбцию или аккумулирование модифицированного полимера в кровотоке и затем распределение его по всему организму. Способы вве
дения, которые приводят к системной абсорбции, включают, без ограничения, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, ингаляционное, пероральное, внутрилегочное и внутримышечное введение. Каждый из этих способов введения позволяет подвергать доступную ткань, пораженную болезнью, воздействию модифицированных полимеров. Было показано, что скорость попадания активного средства в кровоток зависит от его молекулярной массы или размера. Применение конъюгата этого изобретения позволяет осуществлять целенаправленную доставку лекарственного средства в конкретные клетки, такие как раковые клетки, в результате специфичности PBRM.
"Фармацевтически приемлемый состав" обозначает композицию или состав, которые позволяют осуществлять эффективное распределение конъюгатов в их фактическом месте нахождения наиболее целесообразным образом с точки зрения их ожидаемой активности. В одном варианте осуществления эффективная доставка происходит до очищения, осуществляемого ретикулоэндотелиальной системой, или продуцирования нецеленоправленного связывания, которое может приводить к снижению эффективности или к токсичности. Неограничивающие примеры средств, применяемых в композициях с конъюгатами, включают ингибиторы Р-гликопротеина (такие как Pluronic P85), которые могут усиливать поступление активных средств в ЦНС, биоразлагаемые полимеры, такие как микросферы полифЬ-лактид-когликолид) для доставки с замедленным высвобождением после интрацеребральной имплантации, и загруженные наночастицы, такие как наночастицы из полибутилцианоакрилата, которые могут доставлять активные средства через гематоэнцефалический барьер и могут изменять механизмы нейронного поглощения.
В объем изобретения также входят приготавливаемые для хранения или введения фармацевтические композиции, которые включают фармацевтически эффективное количество требуемых конъюгатов в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Соответствующие носители, разбавители и/или вспомогательные вещества для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтике. Например, могут быть использованы буферы, консерванты, наполнители, диспергирующие вещества, стабилизаторы, красители. Помимо этого, могут быть использованы антиоксиданты и суспендирующие средства. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ включают, но этим не ограничивая, (1) физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко, pH около 6,5, который может содержать от 1 до 25 мг/мл сывороточного альбумина человека, (2) 0,9% физиологический раствор (0,9% мас./об. NaCl) и (3) 5% (мас./об.) декстрозу.
Используемый в изобретении термин "фармацевтически эффективное количество" относится к количеству фармацевтического средства для лечения, облегчения или предотвращения выявленного заболевания или состояния или для оказания заметного терапевтического или ингибирующего эффекта. Эффект может быть обнаружен любым известным методом исследования. Точное эффективное количество для субъекта может зависеть от массы тела, размера и состояния здоровья субъекта, природы и степени тяжести состояния и лекарственного средства или комбинации лекарственных средств, выбранных для введения. Фармацевтически эффективные количества в конкретном случае могут быть определены с помощью хорошо известной врачам методики. В предпочтительном аспекте заболевание или состояние может быть подвергнуто лечению путем подавления транскрипции гена.
Для любого конъюгата фармацевтически эффективное количество может быть определено сначала путем проведения исследований, либо на клеточных культурах, например культурах неопластических клеток, либо на животных моделях, обычно на крысах, мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животная модель может также быть использована для определения соответствующего диапазона концентраций и способа введения. Такая информация может затем быть использована для определения подходящих доз и способов введения для людей. Терапевтическая/профилактическая эффективность и токсичность может быть определена с помощью стандартных фармацевтических методик на клеточных культурах или на экспериментальных животных, например ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции). Соотношение между токсическими и терапевтическими эффектами для дозы LD50/ED50 называют терапевтическим индексом. Фармацевтические композиции, которые характеризуются высокими значениями терапевтических индексов, являются предпочтительными. Доза может изменяться внутри этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы, восприимчивости пациента и способа введения.
Например, лекарственное средство или его производные, конъюгаты лекарственное средство-полимер или конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство могут быть оценены на их способность ингибировать опухолевый рост в различных клеточных линиях, используя люминесцентное исследование жизнеспособности клеток CellTiter-Glo(r). Кривые зависимости "доза-эффект" могут быть получены, используя программный продукт SoftMax Pro, и значения IC50 могут быть рассчитаны с помощью четы-рехпараметрической аппроксимирующей функции. Используемые клеточные линии могут включать те клеточные линии, которые являются мишенями для PBRM, и клеточные линии для контроля, которые не являются мишенью для PBRM, содержащейся в испытуемых конъюгатах.
В одном варианте осуществления конъюгаты приготавливают для парентерального введения путем инъекции, в том числе с помощью традиционных методов катетеризации, или инфузии. Композиции для инъекции могут присутствовать в виде дозированной лекарственной формы, например в ампулах или в
упаковках для многократного приема, с добавленным консервантом. Конъюгаты могут быть введены парентерально в стерильной среде. Конъюгат в зависимости от используемой среды и концентрации может быть либо суспендирован, либо растворен в среде. Предпочтительно, чтобы в среде можно было бы растворить вспомогательные вещества, такие как местные анестетики, консерванты и буферные вещества. Используемый в изобретении термин "парентеральный" включает чрескожные, подкожные, внутри-сосудистые (например, внутривенные), внутримышечные или интратекальные методы инъекции или ин-фузии и другие подобные методы. Кроме того, предлагается фармацевтическая композиция, включающая конъюгаты и фармацевтически приемлемый носитель. Один или более из конъюгатов могут присутствовать вместе с одним или более нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями и/или вспомогательными веществами, и, в случае необходимости, с другими активными ингредиентами.
Стерильный инъецируемый препарат может также представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых сред и растворителей, которые могут быть использованы, находится вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для этой цели может быть использовано нераздражающее нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в инъецируемых препаратах находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
Описываемые в изобретении конъюгаты и композиции могут быть введены в соответствующей форме, предпочтительно парентерально, более предпочтительно внутривенно. Для парентерального введения конъюгаты или композиции могут представлять собой водные или неводные стерильные растворы, суспензии или эмульсии. В качестве растворителя или среды могут быть использованы пропиленгли-коль, растительные масла и пригодные для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Композиции могут также содержать вспомогательные вещества, эмульгаторы или диспергирующие вещества.
Для лечения указанных выше состояний применяют величины доз от приблизительно 0,001 до приблизительно 140 мг на 1 кг массы тела в сутки (от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 7 г в сутки на пациента). В некоторых вариантах осуществления вводимая пациенту доза составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления вводимая пациенту доза составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 15 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления вводимая пациенту доза составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 15 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления вводимая пациенту доза составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления вводимая пациенту доза составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мг/кг или от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления вводимая доза составляет от приблизительно 1 до приблизительно 15 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления вводимая доза составляет от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг массы тела субъекта. Количество конъюгата, которое может быть смешано материалами носителя для получения лекарственной формы с разовой дозой, зависит от подвергаемого лечению пациента и конкретного способа введения. Лекарственной формы с разовой дозой могут обычно содержать от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 75 мг или от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг или от приблизительно 0,01 до приблизительно 25 мг конъюгата.
Для внутривенного введения величины доз могут включать от приблизительно 0,01 до приблизительно 200 мг конъюгата на 1 кг массы тела животного. В одном аспекте композиция может включать от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг конъюгата на 1 кг массы тела животного. В другом аспекте вводимое количество соединения будет составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 25 мг/кг массы тела животного.
В некоторых вариантах осуществления конъюгаты могут быть введены следующим образом. Конъюгаты могут вводиться ежедневно в течение 5 дней либо внутривенно, болюс каждый день в течение около 5 дней, либо путем непрерывной инфузии в течение около 5 дней.
В качестве варианта конъюгаты могут вводиться один раз в неделю в течение шести недель или более. В качестве другого варианта конъюгаты могут вводиться один раз каждые две или три недели. Дозы в виде болюса вводят в объеме от приблизительно 50 до приблизительно 400 мл физиологического раствора, в который могут быть добавлены от приблизительно 5 до приблизительно 10 мл человеческого сывороточного альбумина. Непрерывные инфузии осуществляются в объеме от приблизительно 250 до приблизительно 500 мл физиологического раствора, в который могут быть добавлены от приблизительно 25 до приблизительно 50 мл человеческого сывороточного альбумина, в течение периода времени 24 ч.
В некоторых вариантах осуществления через период времени от приблизительно одной до приблизительно четырех недель после лечения пациенту может быть проведен второй курс лечения. Конкретные клинические протоколы, учитывающие способ введения, вспомогательные вещества, разбавители, дозы и время, могут быть определены специалистом в форме клинических предписаний.
В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может быть обеспечено на основе другой схемы регулярного введения, т.е. ежедневного, еженедельного, ежемесячного или ежегодного введения, или на основе схемы нерегулярного введения с изменяющимися днями, неделями, месяцами введения и так далее. В качестве варианта терапевтически эффективное количество, планируемое для введения, может изменяться. В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество для первой дозы составляет большую величину, чем терапевтически эффективное количество для одной или более из последующих доз. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество для первой дозы составляет меньшую величину, чем терапевтически эффективное количество для одной или более из последующих доз. Эквивалентные дозы могут быть введены в течение различных периодов времени, в том числе, но этим не ограничивая, приблизительно каждые 2 ч, приблизительно каждые 6 ч, приблизительно каждые 8 ч, приблизительно каждые 12 ч, приблизительно каждые 24 ч, приблизительно каждые 36 ч, приблизительно каждые 48 ч, приблизительно каждые 72 ч, приблизительно каждую неделю, приблизительно каждые две недели, приблизительно каждые три недели, приблизительно каждый месяц и приблизительно каждые два месяца. Число и частота доз, соответствующие полному курсу лечения, будут определяться на основе рекомендаций соответствующих органов государственного контроля и заключения лечащего врача. Описанные в изобретении терапевтически эффективные количества относятся к суммарным количествам, вводимым в течение заданного периода времени, т.е. если вводят более чем один другой описанный в изобретении конъюгат, то терапевтически эффективные количества соответствуют суммарному вводимому количеству. Следует иметь в виду, что конкретный уровень дозы для конкретного субъекта зависит от ряда факторов, включающих активность конкретного конъюгата, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, рацион питания, время введения, способ введения и скорость экскреции, комбинации с другими активными средствами и тяжести конкретного заболевания, подвергаемого лечению.
Для введения животному, не относящемуся к человеку, конъюгаты могут быть также добавлены в корм для животного или питьевую воду. Может быть удобным готовить корм для животного и питьевую воду так, чтобы животное получало терапевтически достаточное количество конъюгатов в процессе приема пищи. Может быть также удобным, чтобы конъюгаты представляли собой заранее приготовленную смесь для добавления в корм или питьевую воду.
Конъюгаты могут быть также введены субъекту в комбинации с другими терапевтическими соединениями для усиления суммарного терапевтического эффекта. Использование нескольких соединений для лечения заболевания может увеличивать положительные эффекты, уменьшая при этом побочные эффекты. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты используют в комбинации с химиотерапев-тическими средствами, такими как средства, раскрытые в патенте США № 7303749. В других вариантах осуществления химиотерапевтические средства включают, но этим не ограничивая, летрозол, оксалипла-тин, доцетаксел, 5-FU, лапатиниб, капецитабин, лейковорин, эрлотиниб, пертузумаб, бевацизумаб и гем-цитабин. Настоящее изобретение также предлагает фармацевтические наборы, включающие один или несколько контейнеров, заполненных одним или более конъюгатами и/или композициями настоящего изобретения, в том числе одним или более химиотерапевтическими средствами. Такие наборы могут также включать, например, другие соединения и/или композиции, устройство (устройства) для введения соединений и/или композиций и письменные инструкции в форме, установленной правительственным учреждением, регулирующим производство, применение или продажу лекарственных препаратов или биологических продуктов. Описанные в изобретении композиции могут быть расфасованы в виде разовой дозы или для непрерывного или периодического введения с перерывами. Для непрерывного введения упаковка или набор могут включать конъюгаты в каждой лекарственной форме (например, раствор или другую форму, описанные выше, или использоваться в доставке лекарственного средства), и, необязательно, инструкции по введению доз ежедневно, еженедельно или ежемесячно в течение предварительно установленного промежутка времени или в установленном порядке. Если требуется изменение концентраций композиции, компонентов композиции или относительных соотношений конъюгатов или средств внутри композиции в течение времени, упаковка или набор могут содержать последовательность дозированных единиц, которые обеспечивают требуемую варьируемость.
Известны ряд упаковок или наборов для дозирования фармацевтических средств для периодического перорального введения. В одном варианте осуществления упаковка имеет указатели для каждого периода. В другом варианте осуществления упаковка представляет собой маркированную блистерную упаковку, двойную дозирующую упаковку или бутылочку. Упаковочные средства для набора могут сами по себе быть предназначены для введения, такие как шприц, пипетка, капельница или другие такие приспособления, из которых композиция может быть нанесена на пораженный участок тела, инъецирована субъекту или даже нанесена и смешана с другими компонентами набора.
Способы применения Способы лечения
В конкретных предпочтительных вариантах осуществления изобретения конъюгат белок-полимер-лекарственное средство изобретения применяют в способах лечения животных (предпочтительно млекопитающих, наиболее предпочтительно людей, которые включают мужчин, женщин, младенцев, детей и
взрослых). В одном варианте осуществления конъюгаты настоящего изобретения могут применяться в способе лечения животных, который включает введение животному биоразлагаемого биологически совместимого конъюгата изобретения. Например, конъюгаты согласно изобретению могут быть введены в форме растворимых линейных полимеров, сополимеров, конъюгатов, коллоидов, частиц, гелей, твердых изделий, волокон, пленок и в других формах. Биоразлагаемые биологически совместимые конъюгаты этого изобретения могут быть использованы в качестве носителей лекарственного средства и компонентов носителей лекарственного средств в системах с контролируемым высвобождением лекарственного средства, препаратах для низкоинвазивных хирургических операций и в других случаях. Фармацевтические композиции могут быть инъецируемыми, имплантируемыми и вводимыми другими подобными способами.
В еще одном аспекте изобретение предлагает способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, если он в этом нуждается, включающий введение субъекту эффективного количества по меньшей мере одного конъюгата изобретения, где указанный конъюгат высвобождает одно или более терапевтических средств в результате биоразложения.
В другом варианте осуществления конъюгаты могут быть введены in vitro, in vivo и/или ex vivo для лечения пациентов и/или для модулирования роста выбранных популяций клеток, включающих, например, рак. В некоторых вариантах осуществления конкретные типы рака, которые могут быть подвергнуты лечению с помощью конъюгатов, включают, но этим не ограничивая, (1) твердые опухоли, включающие, но этим не ограничивая, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиальную саркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, рак поджелудочной железы, рак костей, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, рак пищевода, рак желудка, рак ротовой полости, рак носовой полости, рак горла, плоскоклеточную карциному, базально-клеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарци-ному, цистаденокарциному, медуллярный рак, бронхогенный рак, гипернефроидный рак, рак печени и желчных путей, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, рак яичка, мелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак легких, эпителиальный рак, глиому, глиобластому, мультиформную астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимо-му, пинеалому, гемангиобластому, акустическую невриному, олигодендроглиому, менингиому, рак кожи, меланому, нейробластому и ретинобластому, (2) гематологические онкологические заболевания, включающие, но этим не ограничивая, острый лимфобластный лейкоз ALL, острый лимфобластный В-клеточный лейкоз, острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз, острый миелобластный лейкоз AML, острый промиелоцитарный лейкоз APL, острый монобластный лейкоз, острый эритромиелозный лейкоз, острый мегакариобластный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз, острый нелимфоидный лейкоз, острый недифференцированный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз CML, хронический лимфо-цитарный лейкоз CLL, волосатоклеточный лейкоз, множественную миелому, острые и хронические лейкозы, например, лимфобластные миелогенные и лимфоцитарные миелоцитарные лейкозы и (3) лимфо-мы, такие как болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, макроглобулине-мию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и истинную полицитемию.
В другом варианте осуществления конъюгаты могут быть введены in vitro, in vivo и/или ex vivo для лечения пациентов и/или для модулирования роста выбранных клеточных популяций у пациентов, страдающих раком анального канала, астроцитомой, лейкозом, лимфомой, раком головы и шеи, раком печени, раком яичка, раком шейки матки, саркомой, гемангиомой, раком пищевода, раком глаза, раком гортани, раком ротовой полости, мезотелиомой, раком кожи, миеломой, раком полости рта, раком прямой кишки, раком горла, раком мочевого пузыря, раком молочной железы, раком матки, раком яичника, раком предстательной железы, раком легкого, раком толстой кишки, раком поджелудочной железы, раком почки или раком желудка.
В другом варианте осуществления онкологические заболевания выбирают из группы, состоящей из рака молочной железы, рака желудка, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и рака яичника.
В другом варианте осуществления конъюгаты могут быть введены in vitro, in vivo и/или ex vivo для лечения, предотвращения, снижения риска развития и/или отсрочки начала развития конкретных патологий, например рака. Например, конъюгаты изобретения применяют для лечения, предотвращения, замедления развития или же облегчения симптома онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака анального канала, астроцитомы, лейкоза, лимфомы, рака головы и шеи, рака печени, рака яичка, рака шейки матки, саркомы, гемангиомы, рака пищевода, рака глаза, рака гортани, рака ротовой полости, мезотелиомы, рака кожи, миеломы, рака полости рта, рака прямой кишки, рака горла, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака почки или рака желудка.
В другом варианте осуществления конъюгаты могут быть введены in vitro, in vivo и/или ex vivo для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как системная волчанка, ревматоидный артрит, псориаз и
множественный склероз, отторжения трансплантатов, таких как отторжение почечного трансплантата, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата легкого, отторжение трансплантата сердца и отторжение трансплантата костного мозга, реакция "трансплантат против хозяина", вирусных инфекций, такие как цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ-инфекция и СПИД, и паразитарных инфекций, таких как гиардиоз, амебиаз, шистосоматоз и другие подобные инфекции.
В конкретных вариантах осуществления конъюгаты могут быть также использованы для приготовления лекарственного препарата, применяемого для лечения или облегчения тяжести расстройств, таких как расстройства, характеризующиеся аномальным ростом клеток (например, рак).
В конкретных вариантах осуществления терапевтическое средство локализовано доставляется в конкретную клетку-мишень, ткань-мишень или орган-мишень.
В конкретных вариантах осуществления при реализации способа изобретения конъюгат дополнительно включает или связан с диагностической меткой. В конкретных примерах вариантов осуществления диагностическую метку выбирают из группы, состоящей из радиофармацевтических препаратов или радиоактивных изотопов для у-сцинтиграфии и позитронно-эмиссионной томографии, контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии (MRI), контрастного вещества для компьютерной томографии, контрастного вещества для метода рентгенологического исследования, вещества для метода ультразвуковой диагностики, вещества для нейтронной активации, фрагмента, который может отражать, рассеивать или подвергать изменению рентгеновское излучение, ультразвук, радиоволны и микроволны и флуорофоры. В конкретных примерах вариантов осуществления конъюгат дополнительно контролируют in vivo.
Примеры диагностических меток включают, но этим не ограничивая, диагностические радиофармацевтические препараты или радиоактивные изотопы для у-сцинтиграфии и позитронно-эмиссионной томографии, контрастное вещество для магнитно-резонансной томографии (MRI) (например, парамагнитные атомы и суперпарамагнитные нанокристаллы), контрастное вещество для компьютерной томографии, контрастное вещество для метода рентгенологического исследование, вещество для метода ультразвуковой диагностики, вещество для нейтронной активации, фрагмент, который может отражать, рассеивать или подвергать изменению рентгеновское излучение, ультразвук, радиоволны и микроволны и флуорофоры в различных оптических методах, и другие вещества. Диагностические радиофармацевтические препараты включают у-излучающие радионуклиды, например индий-111, технеций-99т, йод-131 и другие. Контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии (MRI) включают магнитные соединения, например парамагнитные ионы, железо, марганец, гадолиний, лантаниды, органические парамагнитные фрагменты и суперпарамагнитные, ферромагнитные и антиферромагнитные соединения, например коллоидный оксид железа, коллоидные ферриты, и другие соединения. Контрастные вещества для компьютерной томографии и других методов на основе рентгеновского излучения включают соединения, поглощающие рентгеновские лучи, например йод, барий, и другие вещества. Контрастные вещества для ультразвуковых методов включают соединения, которые могут поглощать, отражать и рассеивать ультразвуковые волны, например эмульсии, кристаллы, пузырьки газа и другие вещества. Другие примеры включают вещества, применяемые для нейтронной активации, такие как бор и гадолиний. Кроме того, могут применяться метки, которые способны отражать, преломлять, рассеивать или же подвергать изменению рентгеновское излучение, ультразвук, радиоволны, микроволны и другие виды излучения, применяемые в диагностических методах. Флуоресцентные метки могут применяться для получения изображения. В конкретных вариантах осуществления модификатор включает парамагнитный ион или группу.
В другом аспекте изобретение предлагает способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий приготовление водной композиции, по меньшей мере, одного конъюгата изобретения и парентеральное инъецирование указанной композиции субъекту.
В другом аспекте, изобретение предлагает способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий приготовление импланта, содержащего по меньшей мере один конъюгат изобретения, и имплантирование указанного импланта субъекту. В конкретных примерах вариантов осуществления им-плант представляет собой биоразлагаемую гелеобразную матрицу.
В другом аспекте изобретение предлагает способ лечения животного, если оно в нем нуждается, включающий введение конъюгата с помощью описанных выше способов.
В другом аспекте изобретение предлагает способ инициирования иммунной реакции у животного, включающий введение конъюгата с помощью описанных выше способов.
В другом аспекте изобретение предлагает способ диагностирования заболевания у животного, включающий стадии введения конъюгата с помощью описанных выше способов, где указанный конъю-гат включает поддающуюся обнаружению молекулу; и детектирования поддающейся обнаружению молекулы.
В конкретных примерах вариантов осуществления стадию детектирования поддающейся обнаружению молекулы осуществляют неинвазивно. В конкретных примерах вариантов осуществления стадию детектирования поддающейся обнаружению молекулы осуществляют с использованием подходящего
оборудования для визуализации.
В одном варианте осуществления способ лечения животного включает введение животному био-разлагаемого биологически совместимого конъюгата изобретения в виде тампона для хирургической раны, из которой была удалена опухоль или новообразование. Тампон из биоразлагаемого биологически совместимого конъюгата будет заполнять место опухоли в процессе восстановления и разлагаться и исчезать по мере заживления раны.
В конкретных вариантах осуществления конъюгат связывают с диагностической меткой для in vivo мониторинга.
Описанные выше конъюгаты могут применяться для терапевтического, профилактического лечения и диагностирования животных. Конъюгаты обычно предназначаются для парентерального введения, но в некоторых случаях они могут быть введены и другими способами.
В одном варианте осуществления растворимые или коллоидные конъюгаты вводят внутривенно. В другом варианте осуществления растворимые или коллоидные конъюгаты вводят путем местной (например, подкожной, внутримышечной) инъекции. В другом варианте осуществления, твердые конъюга-ты (например, частицы, имплантаты, системы доставки лекарственных средств) вводят путем имплантации или инъекции.
В другом варианте осуществления конъюгаты, включающие поддающуюся обнаружению метку, вводят для исследования характеристик и динамики распределения метки в организме животного.
В конкретных вариантах осуществления любой один или более из описанных в изобретении конъю-гатов могут быть применены при осуществлении любого из описанных выше способов.
В конкретных примерах вариантов осуществления конъюгат представляет собой конъюгат трасту-зумаб-PHF-лекарственное средство, ритуксимаб-PHF-лекарственное средство, линтузумаб-PHF-лекар-ственное средство или анти-5Т4-PHF-лекарственное средство.
В описании изобретения в тех случаях, когда композиции характеризуют как имеющие, содержащие или включающие конкретные компоненты, предполагается, что композиции также состоят в основном или состоят из перечисленных компонентов. Аналогично, в тех случаях, когда способы или процессы характеризуют как имеющие, содержащие или включающие конкретные стадии, процессы также состоят в основном или состоят из перечисленных стадий. Кроме того, следует иметь в виду, что порядок стадий или порядок осуществления конкретных действий является несущественным при условии, что изобретение остается осуществимым. Более того, две или более стадий или два или более действий могут быть проведены одновременно.
Методы синтеза изобретения допускают использование большого разнообразия функциональных групп, поэтому могут использоваться различные замещенные исходные материалы. Методы синтеза обычно позволяют получать требуемое конечное соединение в конце или почти в конце синтеза в целом, хотя в конкретных случаях может потребоваться дополнительное превращение соединения в его фармацевтически приемлемую соль, эфир или пролекарство.
Лекарственные соединения, применяемые для конъюгатов настоящего изобретения, могут быть получены различными способами, используя производимые промышленностью исходные материалы, описанные в научной литературе соединения или из легко получаемых промежуточных соединений с помощью стандартных методов и методик синтеза, либо являющихся известными для специалистов в этой области, либо очевидными для них в свете идеи изобретения. Стандартные методы и методики синтеза для получения органических молекул и для трансформаций и манипуляций с функциональными группами можно найти в соответствующей научной литературе или в стандартных руководствах в этой области. Не ограничиваясь какой-либо одной или несколькими ссылками на литературные источники, тем не менее, следует отметить, что ценными и общепризнанными руководствами по органическому синтезу являются классические монографии, такие как Smith, М.В., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; и Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3 rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999, содержание которых включено в изобретение путем ссылки на них. Следующие далее описания методов синтеза предназначены только для иллюстрации, и они не являются ограничениями для общих методик получения соединения настоящего изобретения.
Конъюгаты настоящего изобретения и лекарственные соединения, вводимые в них, могут быть удобно получены различными методами, известными специалистам в этой области. Конъюгаты или соединения этого изобретения, имеющие каждую из описанных в изобретении формул, могут быть получены в соответствии со следующими методиками из производимых промышленностью исходных материалов или исходных материалов, которые могут быть получены с использованием методик, описанных в литературе. Эти методики иллюстрируют получение репрезентативных конъюгатов этого изобретения.
После того как разработанные, выбранные и/или оптимизированные с помощью описанных выше методов конъюгаты получены, они могут быть подвергнуты ряду исследований, известных специалистам в этой области, для определения наличия у конъюгатов биологической активности. Например, конъюга-ты могут быть подвергнуты традиционным исследованиям, включающим, но этим не ограничивая, описанные ниже исследования для определения наличия у них предполагаемой активности, активности
и/или специфичности при связывании.
Кроме того, для ускорения проведения таких исследований может быть использован высокопроизводительный скрининг. В результате, можно быстро провести скрининг описанных в изобретении молекул конъюгатов на активность, используя известные в науке методы. Общая методология проведения высокопроизводительного скрининга описана, например, в монографии Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker и в патенте США № 5763263. При высокопроизводительных исследованиях могут применяться одна или более различных методик, включающих, но этим не ограничивая, описанные ниже методики.
Содержание всех упоминаемых в изобретении публикаций и патентных документов включено в изобретение путем ссылки на них, также как и содержание каждой конкретно и индивидуально указываемой публикации или документа включено в изобретение путем ссылки на него. Предполагается, что упоминаемые в описании изобретения любые публикации и патентные документы не являются прототипами, то же самое относится и к их содержанию и датам опубликования. Итак, изобретение изложено в форме рукописного описания, но для специалистов в этой области является очевидным, что изобретение может быть реализовано в различных вариантах осуществления, и что приведенное выше описание и приводимые ниже примеры являются только иллюстрациями и не ограничивают приводимую далее формулу изобретения.
Примеры
Следующие демонстрационные примеры являются иллюстрациями связующих звеньев, молекул лекарственных средств и PBRM и способов их получения. Эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничений для изобретения, и для любого специалиста в этой области является очевидным, что могут быть использованы другие реагенты и способы.
Описанные в изобретении конъюгаты могут быть получены в соответствии со схемами, изображенными в общем виде выше, и в соответствии с методами, описанными в примерах ниже. Используемый в некоторых примерах ниже термин "содержание", если не указано иначе, означает мольную долю или мольный процент структурных звеньев полимера, которые замещены на заданный фрагмент, такой как связующее звено, молекула лекарственного средства или PBRM. Соответственно, указываемые проценты для различных полимерных звеньев в конъюгатах полимер-лекарственное средство или PBRM-полимер-лекарственное средство, используемые в примерах ниже, являются мольными процентами, если не указано иное.
Сокращения.
В схемах реакций и примерах синтезов используют следующие сокращения. Этот список не следует считать полным списком сокращений, применяемых в изобретении, так как в схемах синтезов и примерах могут также использоваться дополнительные стандартные сокращения, которые хорошо известны специалистам в области органического синтеза.
ACN
Ацетонитрил
AF-HPA
Ауристатин F-гидроксипропиламид
Ala
Алании
|3-Аланин
вое
трет-Бутилоксикарбонил
DCC
N,N'-Дициклогексилкарбодиимид
DCM
Дихлорметан
DIEA
N,N-Диизопропилэтиламин
DMA
Диметилацетамид
DMAP
N,Ы-Диметилпиридин-4-амид
DMF
Диметилформамид
DMSO
Диметилсульфоксид
EDAC
N1-((этилимино)метилен)-N3,ЫЗ-диметилпропан-
1,3-диамина гидрохлорид
EDC-HC1 1-Этил-З-[3-диметиламинопропил]карбодиимида
гидрохлорид
GA Глутаровая кислота
HIC-HPLC Гидрофобное взаимодействие-высокоэффективная
жидкостная хроматография
HOAt 1-Гидрокси-7-азабензотриазол
HOBt 1-Гидроксибензотриазола гидрат
HPLC Высокоэффективная жидкостная хроматография
HPSEC Высокоэффективная эксклюзионная хроматография
HPV Гидроксипропилвиндезин
2HPV 2-Гидроксипропилвиндезин
MWC0 Номинальное отсечение по молекулярной массе
NHS 1-Гидроксипирролидин-2,5-дион (то есть, N-
гидроксисукцинимид) NMP Ы-метил-2-пирролидон
PBS Забуференный фосфатом физиологический раствор,
О,9% NaCl
EG Этиленгликоль
EG2 Диэтиленгликоль
Ml Малеимид или малеимидо
НРА-Ala Гидроксипропиламид-Ъ-аланин
PHF Поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксилметил-
формаль) или FLEXIMER(r)
RP-HPLC Высокоэффективная жидкостная хроматография с
обращенной фазой
SEC Эксклюзионная хроматография
TBSC1 трет-Бутилдиметилсилилового эфира хлорид
ТСЕР Трис[2-карбоксиэтил]фосфин
TEA Триэтиламин
ТЕАА Триэтиламмония ацетат
TFA Трифторуксусная кислота
WCX Хроматография на слабых катионообменниках
Общая информация
Малеимидо-EG2-NHS эфир был приобретен у фирмы Biomatrik, China.
Вос-диаминоэтан HCl был поставлен фирмой Chem-Impex International Inc., Wood Dale, IL.
Препарат кадсила(r) (адо-трастузумаб эмтанзин) для инъекции приобретался у фирмы-производителя Genentech.
Очистку методом ВЭЖХ (HPLC) осуществляли с использованием полупрепаративной колонки Phe-nomenex Gemini 5 мкм 110 А, 250x10 мм, 5 мкм.
Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили на колонке Tosoh Biosciences TSK gel G5000 (7,8 мм x 30 см, 10 мкм) или колонке Superose 12 (GE Healthcare).
Хроматографию на слабых катионообменниках (WCX) проводили на колонке ProPac WCX-10 (94 мм x 250 мм) (ThermoFisher).
Когда это было возможно, содержание лекарственного средства в конъюгатах определяли спектро-фотометрически или же для количественного определения содержания лекарственного средства использовали методы жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC/MS) или 1Н-ЯМР.
Содержание белка в конъюгатах белок-полимер-лекарственное средство определяли спектрофото-метрически при 280 нм или методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Молекулярные массы полимерных конъюгатов (приводимые в виде кажущихся средневесовых мо
лекулярных масс или пиковых молекулярных масс) определяли методом эксклюзионной хроматографии, используя в качестве стандартных молекулярных масс или полисахарид, или белок. Более конкретно для полимера или конъюгатов полимер-лекарственное средство в качестве стандарта молекулярной массы использовали полисахарид, а для конъюгатов белок-лекарственное средство-полимер использовали белок. Если конкретно не указано иначе, то приводимая молекулярная масса полимерного носителя представляет собой средневесовую молекулярную массу PHF; и молекулярная масса конъюгата полимер-лекарственное средство и конъюгатов белок-полимер-лекарственное средство представляет собой пиковую молекулярную массу. Конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство имеют пиковую молекулярную массу от приблизительно 160 до приблизительно 260 кДа. Синтезированные и исследованные полимеры и полимерные конъюгаты обычно имеют полидисперсность <1,5.
Конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство отделяли от оставшихся непорореагировавших конъюгатов лекарственное средство-полимер методом экстенсивной диафильтрации. В случае необходимости проводили дополнительную очистку методом эксклюзионной хроматографии и/или хроматографии на слабых катионообменниках для удаления любых агрегированных конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство. В целом, конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство обычно содержали <5% (по массе, например, <2 мас.%) агрегированной фракции, определенной методом эксклюзионной хроматографии (SEC), <0,5% (по массе, например, <0,1 мас.%) свободного (неконъюгированного) лекарственного средства, определенного методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC) или жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), <1 мас.% свободного конъюгата полимер-лекарственного средства, определенного методом SEC и/или RP-HPLC, и <2% (по массе, например, <1 мас.%) неконъюгированной PBRM, определенной методом HIC-HPLC и/или WCX HPLC. Восстановленные или частично восстановленные антитела получали с использованием описанных в литературе методик, см., например, Francisco et al., Blood 102 (4): 1458-1465 (2003). Суммарную концентрацию лекарственного средства (конъюгированного и неконъюгированного) определяли методом LC-MS/MS.
Для изучения фармакокинетических свойств, т.е. изучения зависимости абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство от времени, были разработаны методы анализа для измерения концентрации конъюгата PBRM-PHF-AF-HPA (т.е. конъюгиро-ванного AF-HPA) и концентрации высвобождаемого неконъюгированного AF-HPA и AF (свободного лекарственного средства), например, в образцах плазмы, опухоли и ткани. Для определения концентрации свободного лекарственного средства в образце подкисленный образец обрабатывали ацетонитрилом. Свободное лекарственное средство экстрагировали из надосадочной жидкости и анализировали методом LC-MS/MS. Для определения концентрации конъюгированного AF-HPA подкисленную плазму, гомоге-нат опухоли или ткани подвергали гидролизу в щелочной среде, затем подкисляли и осаждали белок с помощью ацетонитрила. Ацетонитрильную надосадочную жидкость, содержащую высвобожденные AF-HPA и AF, анализировали методом LC-MS/MS. Калибровочные кривые для свободного лекарственного средства и конъюгированного AF-HPA в плазме и гомогенате опухоли и ткани были линейными в диапазоне концентраций от 0,3 до 3000 нг/мл и от 10 до 20000 нг/мл соответственно. Суммарную концентрацию трастузумаба определяли методом ELISA.
Во всех описанных в изобретении экспериментах in vitro или in vivo, если не указано иначе, все используемые дозы указывались в расчете на PBRM (например, антитело) конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство.
Для характеристики специфичности и распределения сайтов биоконъюгирования цистеина в конъ-югатах PBRM-полимер-лекарственное средство использовали методы высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC), электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) или капиллярного электрофореза. В результате было получено позиционное распределение конъюгатов лекарственное средство-полимер на тяжелых (Н) и легких (L) цепях PBRM, и было показано, что конъюгирование с PBRM происходило преимущественно на межцепном цистеине шарнирных участков тяжелой цепи. Аналогичные результаты были получены для пептидных карт PBRM методом LC-MS.
Общие методики
Общая методика А. Конъюгирование полимера с соединительным звеном или лекарственным средством.
Обычно конъюгирование полимера (PHF-BA или PHF-GA) с аминосодержащим соединительным звеном, таким как, например, EG2-малеимид, или аминосодержащим соединительным звеном лекарственного средства, таким как, например, AF-HPA-Ala, HPV-Ala, проводят в водной среде или в смеси растворителей 10-90% органический растворитель/вода в присутствии активирующего средства, такого как, например, EDC-HCl. Типичные органические растворители включают, но этим не ограничивая, смешивающиеся с водой растворители, такие как, например, DMSO, DMF, DMA, NMP и ACN. Для ускорения взаимодействия добавляют коактиватор, такой как, например, NHS. Полимер сначала смешивают с аминосодержащим соединением, затем добавляют коактиватор (NHS) и затем активатор (EDC-HCl). Реак
цию проводят при 0-10°C, pH 4,5-7,5 в течение от 1 до 24 ч при температуре окружающей среды. Полученный конъюгированный полимерный продукт очищают диафильтрацией или эксклюзионной хроматографией (SEC). Продукт концентрируют до 2-50 мг/мл, величину pH доводят до 4,5-6,5 для обеспечения стабильности соединительного звена лекарственное средство-полимер, и конъюгат хранят замороженным при температуре от -20 до -80°C до момента последующего использования.
Конъюгирование полимера с аминосодержащим соединительным звеном или лекарственным средством можно проводить последовательно в любом порядке или одновременно.
Общая методика В. Частичное селективное восстановление белка (PBRM).
Частичное селективное восстановление межцепных дисульфидных групп или непарного дисульфида в соответствующей PBRM перед конъюгированием с конъюгатом полимер-лекарственное средство достигается путем использования восстановителя, такого как, например, TCEP, DTT или р-меркаптоэтанол. Когда восстановление проводят при избытке восстановителя, восстановитель удаляют перед конъюгированием методом эксклюзионной хроматографии (SEC). Степень конверсии PBRM ди-сульфидных групп в реакционноспособные сульфгидрильные группы зависит от стехиометрии PBRM, восстановителя, pH, температуры и/или продолжительности проведения реакции. Когда восстанавливают некоторые, но не все дисульфидные группы PBRM, восстановленная PBRM представляет собой частично восстановленную PBRM.
Общая методика С. Конъюгирование частично восстановленной PBRM с конъюгатом полимера и лекарственного средства.
Конъюгирование частично восстановленной PBRM с конъюгатом полимер-лекарственное средство приводят в нейтральных или слегка щелочных условиях (pH 6,5-8,5) при PBRM концентрациях 1-10 мг/мл и концентрациях конъюгата полимер-лекарственное средство 0,5-10 мг/мл. Конъюгат полимер-лекарственное средство обычно используют в 1-5,0-кратном избытке относительно требуемой стехиометрии для конъюгата белок-полимер-лекарственное средство. Когда PBRM конъюгируют с малеимид-ной группой конъюгата полимер-лекарственное средство, конъюгирование необязательно прерывают путем добавления водорастворимого соединения, блокирующего малеимидо, такого как, например, N-ацетилцистеин, цистеинметиловый эфир, N-метилцистеин, 2-меркаптоэтанол, 3-меркаптопропановая кислота, 2-меркаптоуксусная кислота, меркаптометанол (т.е. HOCH2SH), бензилтиол и другие подобные соединения.
Полученный конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство обычно очищают диафильтрацией для удаления любых примесей неконъюгированного конъюгата полимер-лекарственное средство, не-конъюгированного лекарственного средства и малой молекулы. В качестве варианта или дополнительно для очистки конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство могут быть использованы соответствующие методы хроматографического разделения, такие как, например, эксклюзионная хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием, ионообменная хроматография, такая как, например, хроматография на слабых катионитах, хроматография с обращенной фазой, хроматография на гидро-ксиапатите, аффинная хроматография или их комбинации. Полученный очищенный конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство обычно формируют в лекарственную форму в буфере при pH 5,0-6,5.
Пример 1. Синтез EG2-малеимид: (О-^-(3-малеимидо1фопионил)аминоэтил]-О'-[3-^-(2-аминоэтил)амино)-3-оксопропил]этиленгликоль)
('те2-малеимид" или "EG2-MI").
К охлажденной льдом суспензии малеимидо-EG2-NHS эфира (О-Р^-(3-малеимидо-пропионил)аминоэтил]-О'-[3-(N-сукцинимидилокси)-3-оксопропил]этиленгликоля (1,2 г, 2,82 ммоль) и Вос-диаминоэтана гидрохлорида (560 мг, 2,82 ммоль) в ACN (15 мл) добавляли по каплям TEA (0,571 г, 5,64 ммоль) при перемешивании. Полученную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли дополнительное количество Boc-диаминоэтана гидрохлорида (110 мг), для того чтобы реакция прошла до конца. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом и остаток очищали методом RP-HPLC (0-100% ACN в воде) с получением Вос-диаминоэтан-EG2-малеимида в виде бесцветного твердого вещества (1,18 г, 89% выход). ESI MS: рассчитано для C21H35N4O8 [M+H+] 471,3; получено 471,2.
Вос-диаминоэтан-EG2-малеимид (1,18 г, 2,508 ммоль) растворяли в 30% растворе TFA в DCM (20 мл) при 0°C, полученный раствор перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь концентрировали под вакуумом и затем очищали методом RP-HPLC (0-10% ACN в воде, содержащей 0,1% TFA) с получением названного соединения (EG2-малеимид) в виде бесцветного масла (1,04 г, 86%).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6+D2O): 5 6,95 (с, 2Н), 3,66-3,54 (м, 10Н), 3,34 (т, 2H, J=5,6 Гц), 3,27 (т,
2H, J=6,7 Гц), 3,18-3,10 (м, 2Н), 2,84 (т, 2H, J=6,2 Гц), 2,33 (кв, 4H, J=6,7 Гц); ESI MS: рассчитано для C16H27N4O6 [М+Н+] 371,2; получено 371,2.
Пример 2. Синтез 10К PHF-BA (30%)-EG2-MI (3%)
К раствору 10K PHF-BA (30%) (588 мг, 3,46 ммоль, полученному таким же образом, как это описано в патентном документе US 13/493899, в настоящий момент, патенте США 8685383, в примере 1) в воде (10 мл) добавляли раствор EG2-малеимид (102 мг, 0,211 ммоль, полученному таким же образом, как это описано в примере 1) в воде (5 мл), затем добавляли N-гидроксисукцинимид (NHS, 25 мг, 0,211 ммоль). Полученную смесь охлаждали до 5-10°C и величину pH доводили до 5,8 (от 5,3), используя 0,1N раствор NaOH. Затем к реакционной смеси добавляли EDC-HCl (94 мг, 0,486 ммоль) в воде (2 мл) в течение 40 мин. Реакционную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученный продукт очищали диафильтрацией на 3K MWCO мембране и лиофилизировали с получением названного соединения в виде желтовато-белого твердого продукта (0,460 г, 71% выход).
^-ЯМР (400 МГц, D2O): 6,9 ppm (уширенный синглет, MI), 5,0-4,7 ppm (м, 1H, О-Ш-О-, протон ацеталя в полимере), 4,3-3,6 ppm (м, О-CH^, протоны основной цепи полимера и связывающего звена), 3,4-3,3 ppm (м, CH2-NH-, протоны р-аланина и связывающего звена), 2,7-2,4 ppm (м, CH2-COOH-, протоны р-аланина и связывающего звена). Загрузка EG2-MI связывающего звена (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих EG2-MI связующее звено), определяемое методом 1Н-ЯМР, составляла 3 мол.%
структурных звеньев полимера.
Гомогенный раствор 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (3%) (144 мг, 11,08 мкмоль, полученного таким же образом, как описано в примере 2) в воде (4,2 г) охлаждали до 5-10°C. Величину pH доводили до 5,8, используя 1N HCl, затем добавляли ауристатин F-гидроксипропиламид-L-аланин•2TFA (AF-HPA-Ala-2TFA) (85 мг, 77,52 мкмоль, полученный таким же образом, как это описано в патентном документе US 13/493899, в настоящий момент, в патенте США 8685383, в примере 50), растворенный в NMP (1,4 мл) и NHS (16 мг в 0,5 мл воды). Смесь интенсивно перемешивали при 5-10°C, и величину pH доводили до 5,8 с использованием 0,1N NaOH. К полученной смеси добавляли свежеприготовленный водный раствор EDC-HCl (30 мг в 0,5 мл воды). Через 45 мин добавляли дополнительное количество EDC-HCl (30
мг в 0,5 мл воды), и полученную смесь перемешивали в течение 18-24 ч при поддержании величины pH
при 5,8. Анализ реакционной смеси методом RP-HPLC указывал на > 95% конверсию исходного соединения ауристатина. Продукт очищали диафильтрацией на 3K MWCO мембране, затем очищали методом HPLC и лиофилизировали с получением названного соединения (143 мг, 78% выход).
1Н-ЯМР (400 МГц, D2O): 7,15 ppm (уширенный синглет, AF-HPA ароматические протоны), 6,9 ppm
(уширенный синглет, MI), 5,0-4,8 ppm (м, 1H, протон О-CH-О-ацеталь полимера), 4,4-3,6 ppm (м, О-CH^, протоны основной цепи полимера и лекарственного средства/связывающего звена), 3,4-2,8 ppm (м, CH2-NH-, протоны р-аланина и лекарственного средства/связывающего звена), 2,2-1,8 ppm (м, CH2-COOH-, протоны р-аланина и лекарственного средства/связывающего звена) и 1,6-0,9 ppm (м, протоны лекарственного средства/связывающего звена).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла 8 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 6 AF-HPA молекул на полимерную цепь). Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 17 кДа.
Пример 4. Синтез трастузумаб-(Е02-М1 (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%))
К раствору трастузумаба (6,19 мл, 100 мг, 0,676 мкмоль) в ТЕАА буфере добавляли раствор TCEP (0,6 мл, 2,36 мкмоль, 0,678 мг) при перемешивании. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°C, затем охлаждали до ~0°C. Затем частично восстановленный трастузумаб добавляли к интенсивно перемешиваемому раствору 10K PHF-BA (30%)-EG2-MI (3%)-AF-HPA-Ala (8%) (76 мг, полученного таким же образом, как описано в примере 3) в ТЕАА буфере, pH 7,4 (26,5 мл) при 0°C. Перемешивание продолжали в течение 30 мин при 0°C. Реакцию прерывали водным раствором цистеина гидрохлорида (65 мг, 371 мкмоль, 1,9 мл). После перемешивания в течение 1 ч при температуре окружающей среды при pH 7,0 реакционную смесь подкисляли до pH 5,0. Неочищенный продукт очищали хроматографией, затем экс-клюзионной хроматографией с получением названного соединения (61 мг, 61% выход).
Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 180 кДа, PDI 1,15. Среднее отношение конъюгат PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство, трастузумаб-((PEG2-MI(3%))-(10 кДа PHF-BA(30%)-(AF-HPA-Ala(8%)) (2,5 мкг, полученный таким же образом, как описано выше) подвергали анализу методом SDS-PAGE, т.е. электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия) при невосстановительных и восстановительных условиях и визуализировали с помощью буфера Odyssey IRDye(r) Blue Protein Stain Buffer. При невосстановительных условиях конъюгат или нагревали при 70°C в течение 10 мин, или не нагревали перед анализом методом SDS-PAGE.
SGS-PAGE гели показали, что конъюгат был стабильным и не распадался при невосстановительных условиях, таких как 70°C в течение 10 мин. При восстановительных условиях конъюгат распадался на фрагменты тяжелых и легких цепей.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали методами, аналогичными методам, описанным выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемтузумаб, алем-тузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульф-гидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 5. Синтез 10K PHF-BA (30%)-AF-HPA-Ala (9%)
К гомогенному раствору 10K PHF-BA (30%) (700 мг, полученного таким же образом, как это описано в US 13/493899, в настоящий момент, в патенте США 8685383, в примере 1) в воде (20 мл) добавляли ауристатин F-гидроксипропиламид-L-аланин•2TFA (AF-HPA-Ala-2TFA) (460 мг, 417 мкмоль, полученный таким же образом, как это описано в US 13/493899, в настоящий момент, в патенте США 8685383, в примере 50), растворенный в NMP (67 г). Полученную смесь интенсивно перемешивали при охлаждении до 5-10°C. Величину pH доводили до 5,8, затем добавляли NHS (129 мг в 1 мл воды). К полученной смеси добавляли свежеприготовленный водный раствор EDC-HCl (223 мг в 1 мл воды). Через 30 мин добавляли дополнительное количество EDC-HCl (220 мг в 1 мл воды) и полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при поддержании pH 5,8. Анализ методом RP-HPLC указывал на > 95% конверсию исходного соединения ауристатина. Продукт очищали методом HPLC и лиофилизировали с получением названного соединения (859 мг, 83% выход).
^-ЯМР (400 МГц, D2O): 7,7-7,2 ppm (уширенный синглет, AF-HPA ароматические протоны), 5,0-
4,8 ppm (м, 1H, O-CH-О-ацеталь- протон полимера, частично перекрытый сигналом воды), 4,4-3,6 ppm
(м, протоны основной цепи полимера и лекарственного средства и/или связующего звена), 3,5-2,8
ppm (м, CH2-NH-, протоны р-аланина и лекарственного средства/связующего звена), 2,2-1,6 ppm (м, CH2-COOH-, протоны р-аланина и лекарственного средства/связующего звена) и 1,6-0,8 ppm (м, протоны лекарственного средства/связующего звена).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте, определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла 8,7 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 6 AF-НРА молекул на полимерную цепь). Конъюгат А: 10K PHF-BA (30%)-AF-НРА-Ala (9,5%) получали из 10K PHF-BA (30%) (100 мг), используя описанную выше методику.
Пример 6. Синтез 10К PHF-BA (30%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%)
К раствору 10K PHF-BA (30%)-AF-HPA-Ala (9%) (500 мг, 35 мкмоль, полученного таким же образом, как описано в примере 5) в воде (13,7 мл) добавляли раствор EG2-малеимид (83 мг, 0,139 ммоль, полученный таким же образом, как описано в примере 1), затем N-гидроксисукцинимид (NHS, 40 мг, 0,348 ммоль). Полученную смесь охлаждали до 5-10°C и величину pH доводили до 5,8 (от 4,6), используя 0,1N раствор NaOH. Затем к реакционной смеси добавляли в течение 40 мин двумя равными порциями EDC-HCl (174 мг, 0,91 ммоль) в воде (2 мл). Анализ реакционной смеси методом RP-HPLC указывал на > 95% конверсию EG2-малеимид. Реакционную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученный продукт очищали диа-фильтрацией на 3K MWCO мембране и лиофилизировали с получением названного соединения в виде желтовато-белого твердого продукта (0,57 г, 100% выход).
^-ЯМР (400 МГц, D2O): 7,4-7,2 ppm (уширенный синглет, AF-HPA ароматические протоны), 6,9 ppm (уширенный синглет, MI), 5,0-4,8 ppm (м, 1H, О-CH-О-ацеталь- протон полимера, частично перекрытый сигналом воды), 4,4-3,6 ppm (м, O-CH2- протоны основной цепи полимера и лекарственного
средства и/или связующего звена), 3,5-2,8 ppm (м, CH2-NH-, протоны р-аланина и лекарственного средства/связующего звена), 2,2-1,6 ppm (м, CH2-COOH-, протоны р-аланина и лекарственного средства/связующего звена) и 1,6-0,8 ppm (м, протоны лекарственного средства/связующего звена).
Загрузка EG2-MI связующего звена, определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла ~2 мол.% структурных звеньев полимера. Молекулярная масса названного соединения составляла приблизительно 20 кДа. В среднем, присутствовало 6 молекул AF-HPA на одну полимерную цепь.
Пример 7. Синтез трастузумаб-(Е02-М1 (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%))
К раствору трастузумаба (6,4 мл, 100 мг, 0,68 мкмоль) в ТЕАА буфере добавляли раствор TCEP (0,993 мг, 3,4 мкмоль) при перемешивании. Смесь инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Частично восстановленный трастузумаб затем добавляли к интенсивно перемешиваемому раствору 10K PHF-BA (30%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%) (86 мг, 4,7 мкмоль, полученного таким же образом, как описано в примере 6) в ТЕАА буфере, pH 7,4 (26,5 мл) при 0°C. Перемешивание продолжали в течение 45 мин при комнатной температуре. Реакцию прерывали водным раствором цистеина в ТЕАА буфере, pH 6,8 (65 мг, 371 мкмоль, 1,9 мл). После перемешивания в течение 1 ч при температуре окружающей среды при pH 7,0 реакционную смесь подкисляли до pH 5,8. Неочищенный продукт очищали методом SEC с получением названного соединения (35 мг, 35% выход).
Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 16:1 до приблизительно 21:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 210 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов,
аналогичных методике, описанной выше, включая другие производные PBRM, такие как, например, час-
тично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемтузумаб, алем-тузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульф-
гидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-
полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 8. Синтез линтузумаб-(Е02-М1 (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%))
ключением того, что использовали 10K PHF-BA (30%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%) (полученный таким же образом, как описано в примере 3 или примере 6), линтузумаб и отношение TCEP:линтузумаб
3,5:1.
Отношение AF-HPA к линтузумабу составляло от приблизительно 10:1 до приблизительно 15:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 184 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к линтузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов,
аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 9. Синтез ритуксимаб-(Е02-М1 (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (30%)-EG2-MI (3%)-AF-HPA-Ala (8%) (полученный таким же образом, как описано в примере 3 или примере 6), ритуксимаб и отношение TCEP:ритуксимаб 3,5:1.
Отношение AF-HPA к ритуксимабу составляло от приблизительно 13:1 до приблизительно 18:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 163 кДа. Среднее отношение PHF-лекарственное средство к ритуксимабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 10. Синтез aHTH-5T4-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%))
Названное соединение ("конъюгат анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство", или "анти-5Т4 scADC") получали таким же образом, как описано в примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (30%)-EG2-MI (3%)-AF-HPA-Ala (8%) (полученный таким же образом, как описано в примере 3 или примере 6) и анти-5Т4 scFvFc антитело, и отношение TCEP:анти-5Т4 scFvFc антитело 3:1. Анти-5Т4 scFvFc антитело (анти-5Т4 одноцепочечное антитело-Fc гибридный белок) получали рекомби-нантно в клетках линии CHO DG44, как раскрыто в предварительной заявке на патент США № 61/835858, зарегистрированной 17 июня 2013 г., содержание которой включено в изобретение путем ссылки на нее.
Отношение AF-HPA к анти-5Т4 антителу составляло от приблизительно 12:1 до приблизительно 18:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 200 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к анти-5Т4 антителу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 3:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов,
аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 11. Синтез 10К PHF-GA (29%)-EG2-MI (1%)
К раствору 10K PHF-GA (29%) (1,7 г, 10,1 ммоль, полученного таким же образом, как это описано в US 13/493899, в настоящий момент, в патенте США 8685383, в примере 2) в воде (35 мл) добавляли раствор EG2-малеимид (204 мг, 0,42 ммоль, полученный таким же образом, как описано в примере 1) в DMA (3 мл), затем добавляли N-гидроксисукцинимид (NHS, 70,3 мг, 0,611 ммоль). Полученную смесь охлаждали до 5-10°C. Затем к реакционной смеси добавляли двумя равными порциями в течение 40 мин EDC-HCl (269 мг, 1,402 ммоль) в воде (2 мл). Реакционную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученный продукт очищали диафильтрацией на 3K MWCO мембране и лиофилизировали с получением названного соединения в виде желтовато-белого твердого продукта (1,7 г, 91% выход).
1Н-ЯМР (400 МГц, D2O): 6,9 ppm (уширенный синглет, MI), 5,0-4,7 ppm (м, 1H, О-Щ-О-, ацеталь-
протон полимера, частично перекрытый сигналом воды), 4,4-3,6 ppm (м, протоны основной цепи
полимера и связующего звена), 3,3-2,6 ppm (м, протоны связующего звена), 2,5 ppm (м, CH2-CO-, глута-ровые протоны), 2,3 ppm (уширенный синглет, CH2-COO-, глутаровые протоны), 1,9 ppm (уширенный синглет, -CH2-CH2- CH2-CO-, глутаровые протоны).
Загрузка EG2-MI связующего звена, определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла 1 мол.% структурных звеньев полимера.
Пример 12. Синтез 10К PHF-GA (29%)-EG2-MI (1%)-AF-HPA-Ala (6%)
К гомогенному раствору 10K PHF-BA (29%)-EG2-MI (1%) (214 мг, 15 мкмоль, полученного таким же образом, как описано в примере 11) в воде (5,4 г) добавляли AF-HPA-Ala-2TFA) (98 мг, 90 мкмоль, полученный таким же образом, как это описано в патентном документе US 13/493899, в настоящий момент, в патенте США 8685383, в примере 50), растворенный в NMP (1,85 мл) и NHS (25 мг в 0,5 мл воды). Смесь интенсивно перемешивали при 5-10°C. К полученной смеси добавляли свежеприготовленный водный раствор EDC-HCl (40 мг в 0,8 мл воды). Через 30 мин добавляли дополнительное количество EDC-HCl (44 мг в 0,8 мл воды) и полученную смесь перемешивали в течение 18-24 ч при поддержании pH 5,8. Анализ методом RP-HPLC указывал на > 95% конверсию исходного соединения ауристатина. Продукт очищали диафильтрацией на 3K MWCO мембране и концентрировали до 10 мл с получением названного соединения (177 мг, 63% выход).
^-ЯМР (400 МГц, D2O): 7,4-7,2 ppm (уширенный синглет, AF-HPA ароматические протоны), 6,9 ppm (уширенный синглет, MI), 5,0-4,8 ppm (м, 1H, О-CH-О-, ацеталь- протоны полимера), 4,4-3,6 ppm (м, О-От[2- протоны основной цепи полимера и связующего звена), 3,4-2,9 ppm (м, протоны лекарственного средства, связующего звена), 2,5 ppm (уширенный триплет, CO-CH2-, глутаровые протоны), 2,4-2,2 ppm (м, CH2-COO-, глутаровые протоны и протоны лекарственного средства/связующего звена), 2,0-1,8 ppm (м, -CH2-CH2-CH2-CO-, глутаровые протоны), 1,5-0,8 (м, протоны лекарственного средства/связующего звена).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте, определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла 5,9 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 4,5 молекул AF-HPA на одну полимерную цепь). Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 17 кДа.
Пример 13. Синтез трастузумаб-(Е02-М1 (1%))-(10 кДа PHF-GA (29%))-(AF-HPA-Ala (6%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-GA (29%)-EG2-MI (1%)-AF-HPA-Ala (6%) (78 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 12) и трастузумаб (25 мг) и отношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 18:1 до приблизительно 23:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 200 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 4:1 до приблизительно 5:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 14. Синтез трастузумаб-(Е02-М1 (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%) (11 мг, полученный по методике, описанной в примере 3 или примере 6, трастузумаб (620 мг) и соотношение TCEP: трастузумаб 3,5:1.
Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 10:1 до приблизительно 15:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 183 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, на
пример, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 15. Синтез трастузумаб-(ЕС2-М 1(2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%) (243 мг, полученный по методике, описанной в примере 3 или примере 6), трастузумаб (435 мг) и отношение TCEP:трастузумаб 3:1.
Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 11:1 до приблизительно 16:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 197 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 16. Синтез ритуксимаб-(ЕС2-М1 (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%) (170 мг, полученный по методике, описанной в примере 3 или примере 6) 300 мг ритуксимаба и отношение TCEP:ритуксимаб 3:1.
Отношение AF-HPA к ритуксимабу составляло от приблизительно 13:1 до приблизительно 18:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 180 кДа. Среднее отношение PHF-лекарственное средство к ритуксимабу составляло от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 17. Синтез трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)-EG2-MI (2%)-AF-HPA-Ala (9%) (8,4 мг, полученный по методике, описанной в примере 3 или примере 6, трастузумаб (15 мг) и отношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 5:1 до приблизительно 10:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 183 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 18. Синтез трастузумаб-(Е02-М1 (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7.
Конъюгат А - отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 19:1 до приблизительно 24:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 201 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат В - отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 20:1 до приблизительно 25:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 224 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат С - отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 23:1 до приблизительно 28:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла 259 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 19. Синтез 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%)-(HPV-Ala (14%)
Гомогенный раствор 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%) (25,00 мг, 2,80 мкмоль, полученный таким же образом, как описано в примере 2) в воде (0,612 мл и NMP (0,14 мл)) охлаждали до 0°C. Добавляли 1-гидроксипирролидин-2,5-дион (8,06 мг, 0,07 ммоль) в NMP (0,14 мл), затем HPV-аланин (15,56 мг, 0,018 ммоль, полученный таким же образом, как это описано в патенте США № 8524214, в примере 1) в воде (0,250 мл). Смесь интенсивно перемешивали до тех пор, пока все материалы не растворялись, затем добавляли свежеприготовленный водный раствор EDC-HCl (6,71 мг в 0,125 мл воды). Через 45 мин добавляли дополнительное количество EDC-HCl (6,71 мг в 0,125 мл воды), и полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при поддержании pH 5,8. Анализ реакционной смеси методом RP-HPLC указывал на то, что реакция прошла не до конца. Смесь охлаждали до 0°C и добавляли EDC-HCl (12 мг в 0,250 мл). Величину pH доводили до 5,9 с помощью 0,1N NaOH и смесь перемешивали в течение еще 2 ч, после чего анализ реакционной смеси методом RP-HPLC указывал на полную конверсию исходного материала. Продукт очищали колоночной хроматографией (Sephadex G25 Gel), затем очищали методом HPLC и лиофилизировали с получением названного соединения (10,18 мг, 24% выход).
Конъюгат А: 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%)-(HPV-Ala (14%)) получали таким же образом, как описано выше. Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемое методом 1Н-ЯМР, составляло 14 мол.% полимерных структурных звеньев (т.е. в среднем 2,4 HPV-Ala молекулы на одну полимерную цепь).
Конъюгат В: 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%)-(HPV-Ala (7,7%)) получали, используя описанную выше методику. Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла 28,3 мол.% структурных звеньев полимера (т.е. в среднем 4,6 HPV-Ala молекул на полимерную цепь).
Конъюгат С: 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (3,5%)-(HPV-Ala (4,3%) получали, используя описанную выше методику. Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемая методом HPLC, составляла 4,3 мол.% структурных звеньев полимера (т.е. в среднем 2,6 HPV-Ala молекул на полимерную цепь).
Пример 20. Синтез трастузумаб-(ЕС2-М1 (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (14%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%)-(HPV-Ala (14%) (1,5 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 19), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 4:1.
Конъюгат А: трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (14%)). Отношение
HPV-Ala к трастузумабу составляло от приблизительно 13:1 до приблизительно 18:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 168 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат В: трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (7,7%)) получали, используя описанную выше методику, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%)-(HPV-Ala (7,7%) (5,7 мг, пример 19, конъюгат В), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 4:1. Отношение HPV-Ala к трастузумабу составляло от приблизительно 10:1 до приблизительно 14:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 180 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат С: трастузумаб-(EG2-MI (3,5%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (4,3%)) получали таким же образом, как это описано в этом примере, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (30%)EG2-MI (2,7%)-(HPV-Ala (4,3%) (4,2 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 19 конъюгат C), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 4:1. Отношение HPV-Ala к трастузумабу составляло от приблизительно 8,5:1 до приблизительно 12:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 181 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 21. Синтез 10К PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(испинезиб-РАВА-Уа1-Сй (3,5%))
К раствору 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%) (60,8 мг, полученного таким же образом, как описано в примере 2) в 5 мл NMP добавляли испинезиб-PABA-Val-Cit-NH2 (TFA соль, 10,0 мг, полученный таким же образом, как это описано в патенте США № 8815226, в примере 84), в NMP (0,5 мл). К этой смеси добавляли HATU (5,5 мг) в NMP (0,5 мл), затем DIEA (4,4 мг). Реакционную смесь перемешивали 5-10 мин при комнатной температуре. Неочищенную смесь очищали ультрафильтрацией с получением названного соединения (выход: 64% в расчете на испинезиб).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемое методом УФ, составляла 3,5 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 2,5 молекул испинезиб-PABA-Val-Cit на полимерную цепь).
Пример 22. Синтез трастузумаб-(EG2-MI(28%))-(10 кДа PHF-ВА (2,7%))-(испинезиб-PABA-Val-Cit-
(3,5%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(испинезиб-PABA-Val-Cit (3,5%)) (5,6 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 21), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение испинезиба к трастузумабу составляло от приблизительно 7,5:1 до приблизительно 10:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 23. Синтез ритуксимаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(испинезиб-PABA-Val-Cit-(3,5%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 22, за исключением того, что использовали ритуксимаб и отношение TCEP:ритуксимаб 3,5:1. Отношение испинезиба к ритуксимабу составляло от приблизительно 6,5:1 до приблизительно 10:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 24. Синтез ТНР-2-метил-испинезиб
Соединение 1. К раствору 4-(гидроксиметил)-2,6-диметоксифенола (2,77 г) в 25 мл DMA добавляли имидазол (1,13 г). Смесь охлаждали до 0°C в атмосфере аргона и затем добавляли TBSCl (2,49 г). Реакционную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 дней в атмосфере аргона, защищая от воздействия света. Реакционную смесь разбавляли с помощью DCM (300 мл) и промывали насыщенным водным раствором NH4O (100 мл), затем солевым раствором (100 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан/EtOAc, 0% В-30% В) с получением бесцветного масла (2,24 г, 50% выход).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) 5 8,17 (с, 1Н), 6,54 (с, 2Н), 4,59 (с, 2Н), 3,72 (с, 6Н), 0,89 (с, 9Н), 0, 05 (с, 6Н).
Соединение 2. К охлаждаемому льдом раствору соединения 1 (0,508 г), TEA (0,603 г) и DMAP (0,021 г) в 5 мл осушенного THF добавляли раствор 4-нитрофенилхлорформиата (0,68 г) в ~3 мл THF. Ледяную баню удаляли и перемешивание продолжали при комнатной температуре. Реакцию прерывали с помощью NH4Cl (20 мл) и затем экстрагировали этилацетатом (60 мл). Органические фазы промывали солевым раствором (20 мл), сушили над Na2SO4, затем концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат, 0% В-20% В) с получением соединения 2 в виде бесцветного твердого вещества (0,724 г, 92% выход).
1Н ЯМР (400 МГц, CDO3) 5 8,32-8,28 (м, 2Н), 7,51-7,48 (м, 2Н), 7,12 (с, 1Н), 6,64 (с, 1Н), 4,75 (д, 2H, J=12,9 Гц), 3,93 (д, 3H, J=13,5 Гц), 3,88 (с, 3Н), 1,0-0,94 (м, 9Н), 0,15 (с, 3Н), 0,12 (с, 3Н).
Соединение 3. К раствору соединения 2 (0,5 г) в 5 мл осушенного THF добавляли HOBt (0,291 г) и полученную смесь перемешивали в течение ~5 мин. К этой смеси добавляли 2-аминопропанол (0,324 г) и TEA (0,546 г). Полученную смесь перемешивали ~1 ч при 0°C, после чего анализ методом ТСХ указывал на то, что реакция прошла полностью. Смесь разбавляли с помощью DCM (60 мл) и промывали насыщенным водным раствором NH4Cl (20 мл), затем солевым раствором (20 мл). Органические фазы сушили (Na2SO4) и концентрировали с получением желтого масла. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат, 0% В-80% В) с получением соединения 3 в виде желтого масла (0,356 г, 83% выход).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) 5 7,50 (т, 1Н, J=5,8 Гц), 6,64 (с, 2Н), 4,68 (с, 2Н), 4,64 (д, 1H, J=4,8 Гц), 3,71 (с, 6Н), 3,70-3,61 (м, 1Н), 3,04-2,96 (м, 1Н), 2,96-2,86 (м, 1Н), 1,05 (д, 3H, J=6,1 Гц), 0,10 (с, 6Н); ESI MS: рассчитано для C^^N^Si (M+H) 400,2, получено 400,2.
Соединение 4. К охлаждаемому льдом раствору соединения 3 (0,358 г) DMAP (0,219 г) в 5 мл осушенного DCM добавляли раствор DCC (0,369 г) в ~5 мл DCM в атмосфере аргона. Ледяную баню удаляли и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали, разбавляли с помощью DCM (~60 мл) и промывали насыщенным водным раствором NH4O (2x20 мл), затем солевым раствором (~20 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали флэш-хроматографией на силикагеле с получением соединения 4 в виде бесцветного масла (0,422 г, 75% выход).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) 5 7,65 (с, 1Н), 7,39 (с, 1Н), 6,64 (с, 2Н), 4,93-4,84 (м, 1Н), 4,68 (с, 2Н),
3,71 (с, 6Н), 3,68-3,62 (м, 1Н), 3,62-3,47 (м, 4Н), 3,16 (т, 2H, J=5,9 Гц), 2,88 (с, 4Н), 2,01-1,93 (м, 2Н), 1,911,77 (м, 3Н), 1,75-1,66 (м, 1Н), 1,57-1,47 (м, 1Н), 1,39 (с, 9Н), 1,35-1,29 (м, 1Н), 1,28-1,22 (м, 1Н), 1,15-1,10
(м, 3Н), 0,92 (с, 9Н); ESI MS: рассчитано для C30^N2O^i (M+H) 627,3, получено 527,2 (M-Boc+H).
Соединение 5. Раствор соединения 4 (0,400 г) и дигидрата SnCl2 (0,144 г) в EtOH/вода (7,25 мл, 9:1) перемешивали при комнатной температуре ~3 ч в атмосфере аргона. По завершению реакции (TLC), реакционную смесь разбавляли с помощью 60 мл EtOAc и затем промывали насыщенным водным раствором NH4Cl (20 мл) и солевым раствором (20 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат, 0% В-100% В) с получением соединения 5 в виде бесцветного масла (0,220 г, 67% выход).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) 5 6,61 (с, 2Н), 5,82 (ус.с, 1Н), 5,16 (ус.с, 1Н), 4,87 (м, 1Н), 4,64 (с, 2Н), 3,90-3,75 (м, 8Н), 3,75-3,62 (м, 2Н), 3,62-3,51 (м, 1Н), 3,41-3,18 (м, 1Н), 2,31-2,13 (м, 2Н), 1,93-1,81 (м, 2Н), 1,44 (с, 9Н), 1,29 (д, 3H, J=6,6 Гц); ESI MS: рассчитано для C24H36N2O10 (M+H) 513,2, получено 413,2 (M-Boc+H).
Соединение 6. К раствору соединения 5 (0,220 г) в 2 мл осушенного THF добавляли TEA (0,152 г). Смесь охлаждали до 0°C и добавляли п-нитрофенолхлорформиат (0,087 г) в виде твердого вещества. Смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивали ~4 ч. Добавляли дополнительное количество хлорформиата (~0,05 г в ~1 мл THF) и смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью 30 мл EtOAc и затем промывали насыщенным водным раствором NH4Cl (10 мл), затем солевым раствором (10 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде масла. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан:EtOAc 0% В-90% В) с получением соединения 6 в виде бесцветного твердого вещества (0,257 г, 88% выход).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) 5 8,28 (д, 2H, J=9,3 Гц), 7,39 (д, 2H, J=9,8 Гц), 6,67 (с, 2Н), 5,90 (ус.с, 1Н), 5,23 (с, 2Н), 5,21-5,13 (м, 1Н), 4,87 (ус.с, 1Н), 3,89-3,76 (м, 8Н), 3,75-3,64 (м, 2Н), 3,63-3,53 (м, 1Н), 2,302,19 (м, 1Н), 1,95-1,83 (м, 2Н), 1,44 (с, 9Н), 1,29 (д, 3H, J=6,7 Гц); ESI MS: рассчитано для C31H39N3O14
(M+H) 678,2, получено 578,2 (M-Boc+H).
Соединение 7. К раствору соединения 6 (53,5 мг) в 0,5 мл осушенного DMA добавляли последовательно испинезиб (37,1 мг), DIEA (9,27 мг) и HOAt (2,93 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере азота. Неочищенную реакционную смесь очищали методом препаративной RP-HPLC (гексан:этилацетат 50% В-90% В в течение 25 мин, 0,1% TFA в обеих подвижных фазах) с получением соединения 7 в виде бесцветного твердого вещества (64 мг, 84% выход). ESI MS: рассчитано для C55H67ClN6O13 (M+H) 1055,5, получено 1055,4.
Соединение 8. К охлаждаемому льдом раствору соединения 7 (64 мг) в 2 мл осушенного DCM добавляли 1 мл TFA в атмосфере азота. Ледяную баню удаляли и смесь перемешивали 1 ч при комнатной температуре, после чего анализ методом LC/MS указывал на то, что реакция прошла полностью. Растворитель удаляли в роторном испарителе и остаток лиофилизировали с получением соединения 8 в виде бесцветного твердого вещества (64 мг, 99%). ESI MS: рассчитано для C50H59ClN6O11 (M+H) 955,4, получено 955,3.
Пример 25. Синтез 10К PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(ТНР-2-метил-испинезиб) (2,4%)
Названное соединение получали таким же образом, как описано в примере 21, используя 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%) (58,9 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 2) и ТНР-2-метил-испинезиб (10,0 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 24; 46% выход (в расчете на испинезиб).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемое методом УФ, составляла 2,4 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 1,7 молекул ТНР-2-метил-испинезиб на полимерную цепь).
Пример 26. Синтез трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(ТНР-2-метил-испинезиб (2,4%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(ТНР-2-метил-испинезиб) (2,4% мг, полученный таким же образом, как описано в примере 25), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение испинезиба к трастузумабу составляло от приблизительно 5:1 до приблизительно 8:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 3:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 27. Синтез ритуксимаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(ТНР-2-метил-испинезиб
(2,4%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 26, за исключением того, что использовали ритуксимаб и отношение TCEP:ритуксимаб 3,5:1. Среднее отношение испинезиба к ритуксимабу составляло от приблизительно 4,5:1 до приблизительно 7:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 28. Синтез валин-ацилоксиизопропилокси-ММАЕ
Соединение 1. ^)-2-(6ензилоксикарбониламино)-3-метилбутановую кислоту (4,76 г, 18,93 ммоль), 1-хлор-2-метилпропил 4-(метилтио)фенилкарбонат (2,6 г, 9,46 ммоль) и монооксид моносеребра(Г) моно-серебра(Ш) (2,193 г, 9,46 ммоль) нагревали при 90°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, остаток растирали с этиловым эфиром и твердые вещества промывали эфиром. Органические фазы промывали водой (4Х), водным раствором NaHCO3, сушили над Na2SO4 и концентрировали до масла соломенного цвета. Неочищенное масло в DCM очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан:EtOAc 0% В-20% В), затем методом HPLC С-18 с обращенной фазой, используя градиент ацетонитрил/вода от 20-95% ацетонитрила, забуференного с помощью 0,1% TFA, с получением бесцветного масла (2,78 г, 60% выход). Соединение было охарактеризовано с помощью методов 1H, 13С
ЯМР и масс-спектрометрии M/z=490,3.
Соединение 2. К охлажденному льдом раствору соединения 1 (2,5 г, 5,11 ммоль) в DCM (20 мл) добавляли по каплям раствор перуксусной кислоты в уксусной кислоте (12,14 г, 51,1 ммоль) и после завершения добавления перемешивали в течение 2 ч. Протекание реакции постоянно контролировали методом LC/MS. Через 2 ч к реакционной смеси добавляли 25 мл воды и перемешивали при охлаждении в течение 30 мин, органические фазы разбавляли с помощью 100 мл DCM, промывали ледяной водой (5х), водным раствором NaHCO3, сушили над Na2SO4 и концентрировали. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией на силикагеле (гексан:EtOAc 0% В-50% В).
Соединение 3. ММАЕ (300 мг, 0,418 ммоль), соединение 2 (436 мг, 0,836 ммоль), 3H-[1,2,3]триазоло[4,5-Ь]пиридин-3-ола гидрат (129 мг, 0,836 ммоль) и THF (25 мл) объединяли и перемешивали на ледяной бане. К полученной смеси добавляли триэтиламин (0,291 мл, 2,089 ммоль) и переме-
шивали при охлаждении в течение 15 мин, затем при 40°C до тех пор, пока реакция не прошла полно-
стью, что контролировалось методом LC/MS. Через 4 ч реакционную смесь разбавляли этилацетатом, промывали водным раствором NaHCO3, 5% водным раствором лимонной кислоты, сушили над Na2SO4, концентрировали и очищали хроматографией с обращенной фазой с получением соединения 3 в виде белого аморфного твердого вещества в форме TFA соли. LC/MS, M/z=1067,6.
Соединение 4. Раствор соединения 3 (150 мг, 0,141 ммоль) в THF (10 мл) и EtOH (10,00 мл) барбо-тировали аргоном. К этой смеси добавляли 10% палладий на угле (29,9 мг, 0,028 ммоль), затем подсоединяли баллон с водородом (0,283 мг, 0,141 ммоль) и постоянно контролировали протекание реакции методом LC/MS. После завершения реакции реакционную смесь очищали хроматографией с обращенной фазой, используя градиент ацетонитрила в воде, забуференной с помощью 0,1% TFA, в качестве подвижной фазы с получением названного соединения в виде белого аморфного твердого вещества в форме
TFA соли (56% выход). M/z=933,6.
Пример 29. Синтез 10К PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(валин-ацилоксиизопропилокси-ММАЕ) (3%)
К раствору 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%) (20 мг, полученного таким же образом, как описано в примере 2) в 1 мл NMP добавляли валин-ацилоксиизопропилокси-ММАЕ (9,98 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 28). К этой смеси добавляли HOAt (5,41 мг), EDC-HCl (7,62 мг) и DIEA (3,1 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем медленно добавляли к перемешиваемому раствору NaCl (1%, ~50 мл). Неочищенную смесь очищали диафильтра-цией с получением названного соединения (21% выход в расчете на MMAE).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера,
содержащих лекарственное средство), определяемая методом LC/MS, составляла 3,1 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 2,2 молекул MMAE-val-изопропилацилоксиизопропил-окси на полимерную цепь). Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 8,3
кДа.
Пример 30. Синтез трастузумаб((EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(валин-
Конъюгат А: трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(валин-ацилокси-изопропилокси-MMAE (3%)) получали по методике, описанной в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(валин-ацилоксиизопропилокси-ММАЕ (3%)) (5,6 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 29), TCEP и отношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Среднее отношение ММАЕ к трастузумабу составляло от приблизительно 11:1 до приблизительно 15:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 171 кДа.
Конъюгат В: трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(валин-ацилоксиизопропилокси-MMAE (9%)) получали по методике, описанной в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(валин-ацилоксиизопропилокси-MMAE) (9%) (31,7 мг, полученный по методике, описанной в примере 30), трастузумаб (57 мг), соотношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Среднее отношение ММАЕ к трастузумабу составляло от приблизительно 12:1 до приблизительно 16,5:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 224 кДа.
Конъюгат С: ритуксимаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(валин-ацилоксиизопропилокси-MMAE (9%)) получали путем замены конъюгата А на восстановленный ритуксимаб в описанной выше методике. Отношение ММАЕ к ритуксимабу составляло от приблизительно 9,5:1 до приблизительно 13:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 202 кДа.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 31. Синтез трет-бутилглицин AF-HPA трифторацетата
К охлаждаемому льдом раствору ^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3,3-диметилбутановой кислоты (67,6 мг, 0,292 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли DCC (0,046 мл, 0,292 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при охлаждении в течение 15-20 мин. Отдельно охлаждали AF-HPA (134 мг, 0,146 ммоль, полученный таким же образом, как это описано в патенте США № 8685383, в примере 18) и DMAP (53,6 мг, 0,438 ммоль) в DCM (5 мл), две реакционные смеси объединяли и перемешивали при охлаждении в
течение 20-30 мин, затем при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергали непрерывному анализу методом LC/MS. Через 4 ч анализ методом LC/MS указывал на то, что реакция полностью не прошла. Добавляли еще одну порцию активированного аминокислотой DCC эфира (1 экв. каждого в DCM) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, затем очищали методом HPLC, используя градиент 25-90% ацетонитрил/вода с подвижной фазой, забуференной с помощью 0,1% TFA. AF-HPA-Boc-трет-бутилглицин получали в виде белого аморфного твердого вещества в форме TFA соли (85% выход). M/z=1016,6.
К охлаждаемому льдом раствору AF-HPA-Boc-трет-бутилглицина (140 мг, 0,124 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли TFA (0,477 мл, 6,19 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при охлаждении в течение 1 ч, затем при комнатной температуре до тех пор, пока метод LC/MS не указывал на завершение реакции. Смесь концентрировали и полученный остаток очищали методом HPLC, используя градиент аце-тонитрил/вода от 10-90% ацетонитрила, забуференного с помощью 0,1% TFA, в качестве подвижной фазы. Названное соединение получали в виде белого аморфного твердого вещества в форме TFA соли.
M/z=917,6.
Пример 32. Синтез 10К PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(трет-бутилглицин AF-HPA) (7,5%)
К охлаждаемому льдом раствору 10K PHF-BA (28%)-PEG2-MI (2,7%) (137 мг, 10,84 мкмоль, полученного таким же образом, как описано в примере 2) в воде (5,5 мл) и NMP (1,375 мл) добавляли AF-HPA-трет-бутилглицин (67 мг, 0,065 ммоль, полученный таким же образом, как описано в примере 31) и
полученную смесь перемешивали при охлаждении в течение 15 мин, затем добавляли 1-
гидроксипирролидин-2,5-дион (15,59 мг, 0,135 ммоль). К реакционной смеси добавляли EDAC (51,9 мг, 0,271 ммоль). Через 30 мин добавляли еще раз такое же количество реагента. Через 4 ч доводили величину pH до 5,6 с помощью 0,1N NaHCO3 и добавляли еще одну порцию EDAC (50 мг), реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Продукт очищали гель-хроматографией и HPLC с обращенной фазой.
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера,
содержащих лекарственное средство), определяемая методом 1Н-ЯМР, составляла 7,5 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 5,7 молекул трет-бутилглицин AF-HPA на полимерную цепь).
Пример 33. Синтез трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-ВА (28%))-(третбутилглицин AF-
HPA (7,5%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(третбутилглицин AF-НРА) (7,5%) (45,7 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 32), трастузумаб и соотношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 4:1 до приблизительно 6:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 215 кДа.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 34. Синтез ритуксимаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(третбутилглицин^-НРА (7,5%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 33, за исключением того, что использовали ритуксимаб и отношение TCEP:ритуксимаб 3,5:1. Среднее отношение AF-HPA к ритуксимабу составляло от приблизительно 2,5:1 до приблизительно 3,5:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 202 кДа.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 35. Синтез val-AF-HPA трифторацетата
AF-HPA-Boc-валин получали таким же образом, как описано в примере 31, за исключением того, что использовали (^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутановую кислоту (63,5 мг, 0,292 ммоль). AF-HPA-Boc-валин получали в виде белого аморфного твердого вещества в форме TFA соли (85% выход). M/z=1002,6.
Названное соединение получали таким же образом, как описано в примере 31, за исключением того, что был использован AF-HPA-Boc-валин (128 мг, 0,115 ммоль) с получением 106 мг, 91% выход.
M/z=903,3.
Пример 36. Синтез трастузумаб-(ЕС2-М1 (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(val-AF-HPA (7,2%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(val AF-HPA) (7,2%) (52,3 мг, полученный по методике, описанной в примере 32), трастузумаб и соотношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение AF-НРА к трастузумабу составляло от приблизительно 14,5:1 до приблизительно 20:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 235 кДа.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 37. Синтез 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520) (2,9%)
К раствору 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(252 мг, полученного таким же образом, как описано в примере 2) в 23 мл NMP добавляли Any 520-PABA-Val-Cit-NH2 (37,6 мг, полученный по методике, описанной в патенте США № 8815226, в примере 84) в NMP (1 мл). К этой смеси добавляли HATU (22,8 мг) в NMP (1 мл), затем DIEA (20,7 мг). Реакционную смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре. Неочищенную смесь очищали диафильтрацией с получением названного соединения (47% выход в расчете на Arry 520).
Загрузка лекарственного средства в конъюгированном продукте (т.е. содержание звеньев полимера, содержащих лекарственное средство), определяемая методом УФ, составляла 2,9 мол.% структурных звеньев полимера (или в среднем приблизительно 2,1 молекул Arry 520-PABA-Val-Cit на полимерную цепь). Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 9,0 кДа.
Пример 38. Синтез трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(Val-Cit-PABA-Arry 520
(2,9%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,7%)-(Val-Cit-PABA-Arry 520) (2,9%) (55,6 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 38), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 2,5:1. Отношение Arry 520 к трастузумабу составляло от приблизительно 4:1 до приблизительно 6:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 245 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
того, что использовали ритуксимаб и отношение TCEP:ритуксимаб 2,5:1. Среднее отношение Arry 520 к ритуксимабу составляло от приблизительно 4:1 до приблизительно 6:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 231 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюга-те лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 40. Синтез sc-FvFc-трастузумаб-(EG2-MI (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala
(8%))
Названное соединение ("конъюгат scFvFc-трастузумаб полимер лекарственное средство" или "трастузумаб scADC") получали таким же образом, как описано в примере 4 или примере 7, за исключением
того, что использовали 10K PHF-BA (28%)-EG2-MI (2,8%)-AF-HPA-Ala (8%) (2,2 мг полученный таким
же образом, как описано в примере 3 или примере 6) и scFvFc трастузумаб антитело и отношение TCEP:scFvFc трастузумаб антитело 3:1.
Последовательность scFvFc трастузумаб антитела (трастузумаб одноцепочечный антитело-Fc гибридный белок) опубликована в публикации Olafsen et al., Cancer Res. 65(13):5907-16, 2005 с тремя модификациями константных областей: шарнир имеет одну мутацию (С^-S) для элиминации непарного цистеина, который обычно связан с константной областью легкой цепи (Yang and Rader, Cloning, Expression, and Purification of Monoclonal Antibody in scFv-Fc Format. Antibody Methods and Protocols. Ed. Proetzel and Ebersback, 2012). Две другие модификации также находятся в IgG1 последовательности. В публикации Olafsen et al., Cancer Res. 65(13):5907-16, 2005 сообщалось о создании трастузумаб-scFv-Fc (Н310А, H435Q) двойного мутанта, для того чтобы сократить период полувыведения фрагмента антитела с целью улучшения визуализации. Модификациям была подвергнута каноническая IgG1 последовательность.
Отношение AF-HPA к scFvFc трастузумаб антителу составляло от приблизительно 14:1 до приблизительно 19:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 182 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к scFvFc трастузумаб антителу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов,
аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, на-
пример, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM. Пример 41. Топотекан-аланин
Топотекан (0,500 г, 1,19 ммоль), BOC-ala-ОН (0,449 г, 2,37 ммоль) и ^^диметилпиридин-4-амин (0,145 г, 1,19 ммоль) растворяли в безводном CH2Cl2 (5,93 мл). Добавляли ЩФ-метандиили-дендициклогексанамин (DCC) (0,580 г, 2,81 ммоль) в безводном CH2Cl2 (1 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Добавляли дополнительное количество DCC (300 мг, 1,45 ммоль) и смесь перемешивали в течение 48 ч. Твердые вещества удаляли фильтрацией и раствор промывали 0,1N раствором HCl (2x5 мл), водой (5 мл) и солевым раствором (5 мл), затем сушили над MgSO4, затем подвергали RP-HPLC, элюируя с помощью 0,1% TFA/CH3CN: 0,1% TFA/вода (хроматограф CombiFlash(r), колонка C18, 100 G; 5 мин 0% В, увеличение до 100% В в течение 20 мин) с получением топотекан-BOC-аланин в виде твердого вещества (186,6 мг, 0,315 ммоль, 26,5% выход).
Топотекан-BOC-аланин (186,6 мг, 0,315 ммоль) растворяли в безводном CH2Cl2 (1,5 мл). Добавляли 2,2,2-трифторуксусную кислоту (1,205 мл, 15,74 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали RP-HPLC (C18, HPLC, элюируя с помощью 0,1% TFA:AcN/0,1% TFA; вода) с получением названного соединения в виде оранжево-желтого твердого вещества (93,0 мг, 0,189 ммоль, 60,0% выход).
Пример 42. Синтез трастузумаб-(EG2-MI (2,4%)-(10 кДа PHF-ВА (22,3%))-(топотекан-аланин (6,5%))
Конъюгат А: трастузумаб-^2^ (2,4%))-(10 кДа PHF-ВА (22,3%))-(топотекан-аланин (6,5%)) получали по методике, описанной в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (22,3%)EG2-MI (2,4%)-(топотекан-аланин) (6,5%) (19,3 мг, имеющий в среднем приблизительно 4,2 молекул топотекана на полимерную цепь, полученный по методике, описанной в примере 3 или примере 6), трастузумаб и соотношение TCEP:трастузумаб 3:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 256 кДа. Среднее отношение топотекана к трастузумабу составляло от приблизительно 19:1 до приблизительно 26:1. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 5:1.
Конъюгат В: ритуксимаб-(EG2-MI (2,4%))-(10 кДа PHF-ВА (22,3%))-(топотекан-аланин (13%)) получали путем замены на восстановленный ритуксимаб в описанной выше методике. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 212 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF
лекарственное средство к ритуксимабу составляло от приблизительно 16:1 до приблизительно 22:1.
Трастузумаб-(EG2-MI)-(10 кДа PHF-BA)-(топотекан-валин) получают, используя описанную выше методику, за исключением того, что использую 10K PHF-BA EG2-MI-(топотекан-валин), полученный по методике, описанной в примере 41.
Другие конъюгаты PBRM-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемтузумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела, описанные выше. Кроме того, получают конъюгаты PBRM-лекарственное средство с изменяющимися отношениями лекарственного средства к PBRM путем изменения числа сульфгидрильных групп PBRM и загрузки лекарственного средства.
Пример 43. Синтез трастузумаб-(ЕС2-М1 (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (7,3%))
Названное соединение получали, используя методику, описанную в примере 4 или примере 7, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,8%)-(HPV-Ala (7,2%) (8,36 мг, полученный таким же образом, как описано в примере 3 или примере 6), трастузумаб и соотношение TCEP:трастузумаб 2,5:1.
Конъюгат А: трастузумаб-(EG2-MI(2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (7,3%)). Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 183 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трастузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат В: трастузумаб-(EG2-MI (2,5%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,4%)) получали таким же образом, как это описано выше в этом примере, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,5%)-(HPV-Ala (8,4%) (полученный таким же образом, как описано в примере 3 или примере 6), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 3,5:1. Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 218 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к тра-стузумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Конъюгат С: трастузумаб-(EG2-MI (2,5%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,4%)) получали таким же образом, как это описано в этом примере, за исключением того, что использовали 10K PHF-BA (28%)EG2-MI (2,8%)-HPV-Ala (8,4%) (полученный таким же образом, как описано в примере 3 или примере 6), трастузумаб и отношение TCEP:трастузумаб 2,75:1. Отношение AF-HPA к трастузумабу составляло от приблизительно 12:1 до приблизительно 16:1. Молекулярная масса названного конъюгата составляла приблизительно 247 кДа. Среднее отношение конъюгата PHF-лекарственное средство к трасту-зумабу составляло от приблизительно 2:1 до приблизительно 4:1.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезируют методами, аналогичными методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемтузумаб, алемтузу-маб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгид-рильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 44. Синтез трастузумаб-(EG2-MI)-(10 кДа PHF-BA)-(SN38 аланин)
Названное соединение получают по методике, описанной в примере 42, за исключением того, что используют 10K PHF-BA EG2-MI-(SN38 аланин), полученный по методике, описанной в примерах 42 и
41.
Трастузумаб-(EG2-MI)-(10 кДа PHF-BA)-(SN-38 валин) получают, используя методику, описанную выше, за исключением того, что используют 10K PHF-BA EG2-MI-(SN-38 валин), полученный по методике, описанной в примерах 41 и 42.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезируют методами, аналогичными методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемтузумаб, алемтузу-маб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгид-рильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 45. Синтез трастузумаб-(ЕО2-М1)-(10 кДа РНР-ВА)-(камптотецин-аланин)
Названное соединение может быть получено по методике, описанной в примере 42, за исключением того, что используют 10K PHF-BA EG2-MI-(камптотецин-аланин), полученный по методике, описанной в примерах 42 и 41.
Трастузумаб-(EG2-MI)-(10 кДа PHF-BA)-(камптотецин-валин) получают, используя методику, описанную выше, за исключением того, что используют 10K PHF-BA EG2-MI-(камптотецин-валин), полученный по методике, описанной в примерах 41 и 42.
Другие конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство синтезировали с помощью методов, аналогичных методике, описанной выше, с использованием других производных PBRM, таких как, например, частично восстановленная форма цетуксимаба, ритуксимаб, бевацизумаб, нимотузумаб, гемту-зумаб, алемтузумаб, линтузумаб, анти-5Т4 или антимезотелин антитела. Кроме того, путем изменения числа сульфгидрильных групп в PBRM и загрузки лекарственного средства в конъюгате лекарственное средство-полимер получают конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство с различными соотношениями лекарственного средства к PBRM.
Пример 46. Исследование воздействия конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство на жизнеспособность клеток.
Исследовали антипролиферативные свойства конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство в опухолевых клеточных линиях in vitro, используя реагент Cell Titer-Glo (Promega Corp). Клетки высевали в 96-луночном планшете с черными стенками и позволяли им прилипнуть в течение ночи при 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO2. Клетки SKBR3, ВТ474, NCI-N87 cells (экспрессирующие HER2), клетки MCF7 (экспрессирующие низкие уровни HER2) и клетки JIMT1 (экспрессирующие средние уровни HER2) высевали с плотностью 5000 клеток на лунку. На следующий день заменяли среду на 50 мкл све
жей среды и добавляли в соответствующие лунки 50 мкл разбавленный в 2 раза исходный раствор конъ-югата PBRM-полимер-лекарственное средство, конъюгата лекарственное средство-полимер или лекарственного средства, перемешивали и инкубировали в течение 72 ч. Добавляли в лунки реагент Cell Titer-Glo при комнатной температуре и через 10 мин измеряли люминесцентный сигнал с помощью планшет-ридера SpectraMax M5 (Molecular Devices). Строили кривые зависимостей "доза-эффект", используя программный продукт SoftMax Pro. Значения IC50 получали в результате четырехпараметрической аппроксимации кривых.
Высевали клетки HL-60, экспрессирующие CD33, с плотностью 5000 клеток на лунку и обрабатывали конъюгатом PBRM-полимер-лекарственное средство в тот же самый день. Через 72 ч инкубации клетки анализировали, используя ту же самую описанную выше методику.
Высевали экспрессию клеток OVCAR-3, TF-1a и НСТ-15 и анализировали, используя ту же самую описанную выше методику.
Высевали и анализировали клетки линии А431, экспрессирующие 5Т4 (A431, линия клеток эпидер-моидной карциномы, полученные из Американской коллекции типовых культур (ATCC), Manassas Virginia US, номер депозита ATCC(r)CRL-1555); PC3 (линия клеток рака предстательной железы человека, АТСС(r) CRL-1435), MDAMB231-5T4 ОЕ и клеточную линию LLC1 в качестве отрицательного контроля целевой экспрессии клеток (клетки мелкоклеточного рака легкого, отрицательные в отношении экспрессии 5Т4), используя ту же самую методику, что и описанная выше. "MDAMB231-5T4 ОЕ" обозначает клетки рекомбинантного MDA-MB-231, сверхэкспрессирующие 5Т4 (получаемые стабильной трансфек-цией; раскрытые в предварительной заявке на патент США № 61/835858, зарегистрированной 17 июня 2013 г., содержание которой включено в изобретение путем ссылки на нее).
В табл. приведены результаты исследования антипролиферативных свойств конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство или на клетках, экспрессирующих HER2 (табл. I), клетках, экспресси-рующих CD33 (табл. II), или на клетках, экспрессирующих 5Т4 (табл. III).
В табл. IV приведены результаты исследования антипролиферативных свойств лекарственного средства, AF-HPA на клеточных линиях OVCAR-3 TF-1a.
В табл. I приводятся результаты для конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство трастузу-маб-да2-Ш (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA: трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4; трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 16:1 до приблизительно 21:1), пример 7; трастузумаб-^2^ (1%))-(10 кДа PHF-GA (29%))-(AF-HPA-Ala (6%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 18:1 до приблизительно 23:1), пример 13; трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 10:1 до приблизительно 15:1), пример 14; трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 11:1 до приблизительно 16:1), пример 15; и ритуксимаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-ЕП^трастузумаб от приблизительно 13:1 до приблизительно 18:1), пример 16; трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 5:1 до приблизительно 10:1), пример 17; трастузумаб-^2^ (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 19:1 до приблизительно 24:1), пример 18А; (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 20:1 до приблизительно 25:1), пример 18В; (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 23:1 до приблизительно 28:1), пример 18С; трасту-зумаб-да2-Ш (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (14%)), пример 20А; трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (7,7%)), пример 20В; трастузумаб-^2^ (3,5%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(HPV-Ala (4,3%)), пример 20С; sc-FvFc-трастузумаб-(EG2-MI (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8%)), пример 40; трастузумаб-^2^ (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (7,3%)), (отношение AF-HPA: трастузумаб от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1), пример 43А; трастузумаб-(EG2-MI (2,5%))-(10 кДа PHF-BA(28%))-(AF-HPA-Ala (8,4%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 16:1), пример 43С; свободное лекарственное средство (AF-HPA) и кадсила(r).
Результаты в табл. I показывают, что в случае клеточных линий SKBR3, ВТ474, N87 и JIMT1, экспрессирующих HER2, конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 4, пример 7, примеры 13-15, пример 17, примеры 18А-18С, пример 20А, пример 43A и пример 43C) проявляли более высокую антипролиферативную активность, чем в случае клеточной линии MCF7, обладающей низкой способностью экспрессировать HER2, и по сравнению с конъюгатом PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 16) или кадсила(r).
В табл. II приведены результаты для линтузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:линтузумаб от приблизительно 10:1 до приблизительно 15:1), пример 8; и ритуксимаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA :ритуксимаб от приблизительно 13:1 до приблизительно 18:1), пример 9; и для свободного лекарственного средства (AF-HPA).
HL-60
1С50 (нмоль/л)
Пример 8
0,77
Пример 9
6, 74
AF-HPA
4,8
Результаты в табл. II показывают, что, в случае клеточной линии HL-60, экспрессирующей CD33, конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 8) проявлял более высокую антипролифера-тивную активность по сравнению с контрольным конъюгатом PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 9).
В табл. III приведены результаты для конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство анти-5Т4-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:анти-5Т4 от приблизительно 12:1 до приблизительно 18:1), пример 10; и ритуксимаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:ритуксимаб от приблизительно 13:1 до приблизительно 18:1), пример 9; и для свободного лекарственного средства (AF-HPA).
Таблица III
Результаты в табл. III показывают, что, в случае клеточных линий А431, PC3 и mDAMB231OE, экспрессирующих 5Т4, конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 10) проявлял более высокую антипролиферативную активность по сравнению с контрольным конъюгатом PBRM-лекарственное средство (пример 9) и по сравнению с клеточной линией LLC1, не экспрессирующей клетки-мишени.
В табл. IV приведены результаты для свободного лекарственного средства (AF-HPA).
Таблица IV
OVCAR3
ic50
(нмоль/л)
TF-loc
1С50 (нмоль/л)
AF-HPA
0, 8
13, 8
Пример 47. Исследования связывания лигандов методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) фирмы Biacore.
Кинетику связывания конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство с иммобилизированным рецептором определяли методом BIAcore SPR. Константы связывания для PBRM в конъюгатах PBRM-полимер-лекарственное средство и только для одной PBRM могут быть определены с использованием стандартных методик BIAcore.
Используя стандартную реакцию сочетания амина, hErbB2 иммобилизируют в трех проточных каналах на поверхности сенсорного чипа поверхностного плазмонного резонанса при трех одинаковых плотностях. Трастузумаб легко связывался с иммобилизированным hErbB2, тем самым демонстрируя, что оба партнера по связыванию являлись активными. Параметры связывания ka (константу ассоциации или константу сродства) и KD (константу диссоциации) для конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство и для PBRM измеряют при 25°C, используя оптический биосенсор BioRad ProteOn XPR36, снабженный сенсорным чипом GLC и приведенный в равновесие с помощью подвижного буфера.
Результаты показывают, что PBRM в конъюгате PBRM-полимер-лекарственное средство распознается рецептором PBRM, и что связывание PBRM в конъюгате PBRM-полимер-лекарственное средство не оказывает значительного отрицательного эффекта в сравнении с неконъюгированной PBRM.
Пример 48. Анализ связывания с помощью возбужденной флуоресценции сортированных клеток
(FACS).
Связывание конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(Б02-М1 (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4, с клеточной поверхностью оценивали с использованием настольного цифрового проточного цитометра MACSQuant(r) Analyzer 10 в различных линиях раковых клеток человека. 100000 клеток инкубировали в 6% козьей сыворотке на льду. Добавляли к клеткам конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство или неконъюгированную PBRM и инкубировали на льду в течение 3 ч, затем клетки промывали ледяным PBS и инкубировали с вторичными флуоресцентно мечеными антителами на льду в течение 1 ч. После завершения клетки промывали с помощью PBS, фиксировали 1% па-раформальдегидом и анализировали на проточном цитометре. Связывание конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство с клеточной поверхностью определяли путем титрования и сравнивали со связыванием в случае неконъюгированной PBRM.
В табл. V приведена константа связывания (Kd) конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA: трастузу-маб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4, и только одного трастузумаба с клетками JFMT-L
Таблица V
Kd (нМ)
Пример 4
2,16
Трастузумаб
0, 92
Результаты показывают, что связывание PBRM в конъюгате PBRM-полимер-лекарственное средство с клеточной поверхностью было сопоставимо со связыванием неконъюгированной PBRM.
Может быть определено связывание PBRM в других конъюгатах PBRM-полимер-лекарственное средство с клеточными поверхностями других раковых клеток человека, и оно должно быть сопоставимо со связыванием неконъюгированной PBRM.
Пример 49. Исследования связывания лигандов методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) фирмы Biacore.
Кинетику связывания полимерного конъюгата PBRM-лекарственное средство с иммобилизирован-ным рецептором определяли методом BIAcore SPR Константы связывания для PBRM в конъюгатах PBRM-полимер-лекарственное средство, таких как трастузумаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA(30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4; трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 16:1 до приблизительно 21:1), пример 7, трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 5:1 до приблизительно 10:1), пример 17; и трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 19:1 до приблизительно 24:1), пример 18А; (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 20:1 до приблизительно 25:1), пример 18В; (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 23:1 до приблизительно 28:1), пример 18С; для PBRM в конъюгате PBRM-лекарственное средство (т.е. кадсила(r)) и для только одной PBRM (т.е. тра-стузумаба) определяли с использованием стандартных методик BIAcore.
Используя стандартную реакцию сочетания амина, hErbB2 иммобилизировали в трех проточных каналах на поверхности сенсорного чипа поверхностного плазмонного резонанса при трех одинаковых плотностях, трастузумаб легко связывался с иммобилизированным hErbB2, тем самым демонстрируя, что оба партнера по связыванию являлись активными. В табл. Х приведены параметры связывания ka (константа ассоциации или константа сродства) и KD (константа диссоциации), измеренные при 25°C для конъюгатов примера 4 и примера 7 и трастузумаба с использованием оптического биосенсора BioRad ProteOn XPR36, снабженного сенсорным чипом GLC и приведенного в равновесие с помощью подвижного буфера.
ка (M^V1)
KD (рМ)
Трастузумаб
9,90+0,lxlO5
2, 60+0, 1хЮ~5
26, 2+0, 1
Кадсила(r)
4,61+0,2х105
3, 17+0, 9хЮ~5
68,7+0,3
Пример 4
4, 61+0, ЗхЮ5
2, 60+0, 9хЮ~5
56, 3+0,3
Пример 7
5, 3+0, ЗхЮ5
2,43+0, 1хЮ~5
45, 9+0,3
Пример 14
3, 91+0, ЗхЮ5
2,56+0, 1хЮ~5
65,5+0,5
Пример 17
8, 30+0, 2хЮ5
2, 32+0, 2хЮ~5
28,0+0,1
Пример 18А
4, 67+0, 7хЮ5
2, 07+0,2хЮ~5
44,4+0,6
Пример 18В
3, 05+0, 2хЮ5
2,46+0, 1хЮ~5
80,7+0,6
Пример 18С
4, 25+0, 5хЮ5
2, 03+0, 1хЮ~5
47,7+0,5
Результаты показывают, что PBRM в конъюгате PBRM-лекарственное средство распознавалась PBRM рецептором.
Пример 50. Исследования in vivo эффективности, фармакокинетики и биораспределения.
Для того чтобы оценить эффективность и фармакокинетику конъюгата белок-лекарственное средство, использовали модели подкожных и ортотопических ксенотрансплантатов на мышах и крысах.
Испытуемые изделия вместе с соответствующими элементами управления вводят внутривенно (IV) путем инъекции в хвостовую вену или внутрибрюшинно. Для оценки циркулирующих уровней испытуемого изделия собирают пробу крови в заданные моменты времени путем пункции сердца в терминальном состоянии. Пробы выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин для коагуляции, затем центрифугируют в течение 10 мин при 1000 х g при 4°C и быстро замораживают при -80°C. Суммарные концентрации PBRM в пробах плазмы определяют, используя метод ELISA. Циркулирующую концентрацию лекарственного средства (конъюгированного и свободного) определяют методами LC/MS/MS.
Для оценки эффективности полимерного конъюгата PBRM-лекарственное средство измеряют размер опухоли, используя цифровые штангенциркули. Вычисляют объем опухоли и используют его для определения замедления роста опухоли.
Для определения биораспределения лекарственного средства вырезают опухоль и важные органы, такие как, например, печень, почки, селезенка, легкие, сердце, мышцы и мозг, быстро замораживают их в жидком азоте, хранят при -80°C. Определяют уровни PBRM и/или лекарственного средства в гомогена-тах тканей стандартными методами, такими как, например, методы ELISA или LC/MS/MS соответственно.
Пример 51. Распределение в тканях мышей после введения конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство.
Самкам мышей линии СВ-17 SCID инокулировали подкожно клетки опухоли ВТ474 (n=4 для каждой группы). Дозировали внутривенно в виде разовой дозы в 1-й день плацебо или конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство: трастузумаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4, при 5 мг/кг; и трастузумаб-(EG2-MI (1%))-(10 кДа PHF-GA (29%))-(AF-HPA-Ala (6%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 18:1 до приблизительно 23:1), пример 13, при 5 мг/кг.
Через 48 ч после введения мышей умерщвляли и собирали кровь путем стимуляции сердечной деятельности в терминальном состоянии. Отбирали органы: левую почку, почку, легкое, скелетную мышцу, селезенку и опухоль, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализа на конъюгированном, свободном AF-HPA и AF.
В табл. VII, VIII и VIIIA приведена концентрация конъюгированного лекарственного средства (конъюгированного AF-HPA, т.е. PBRM-PHF-AF-HPA); неконъюгированного (свободного) лекарственного средства (т.е. AF-HPA и AF); свободного AF-HPA и свободного AF в различных тканях. Концентрации приведены как нг AF-HPA (и/или AF) эквивалент/г ткани в виде среднего значения ± стандартное отклонение от среднего.
Результаты показывают, что высвобождаемое в ткани неконъюгированное AF-HPA далее метаболи-зируется до AF, в то время как в плазме неконъюгированное AF-HPA не превращается в AF.
Пример 52. Реакция роста опухоли на введение конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство.
Самкам мышей линии СВ-17 SCID инокулировали подкожно опухолевые клетки ВТ474 (n=10 для каждой группы) или клетки JIMT-1 (n=10 для каждой группы) или клетки NCI-N87 (n=10 для каждой группы). Самкам мышей линии NCr nu/nu инокулировали подкожно клетки HL-60 (n=10 для каждой группы). Испытуемые соединения или плацебо вводили внутривенно в виде разовой дозы в 1-й день. Размер опухоли измеряли в моменты времени, указанные на фиг. 1-9, используя цифровые штангенциркули. Вычисляли объем опухоли и использовали его для определения замедления роста опухоли. Мышей умерщвляли, когда опухоли достигали размера 1000 мм3. Объемы опухолей регистрировали как среднее значение (mean) ± стандартная погрешность среднего (SEM) для каждой группы.
На фиг. 1 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки опухоли ВТ474 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо; PBRM (трастузумаба) при 10 мг/кг; конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4, при 2,5 мг/кг и 5 мг/кг; или
трастузумаб-ДО2-Ш (1%))-(10 кДа PHF-GA (29%))-(AF-HPA-Ala (6%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 18:1 до приблизительно 23:1), пример 13, при 2,5 мг/кг и 5 мг/кг. Результаты показывают уменьшение объема опухоли для примеров 4 и 13 со 100% регрессиями при дозе 5 мг/кг и 100% и 80% выживаемостью с отсутствием опухоли, соответственно. Плацебо и только один трастузумаб характеризовались увеличением объема опухоли. Для уменьшения объема опухоли требовалось конъюгирование специфичной к HER2 клеткам PBRM (трастузумаба) с полимерным конъюгатом лекарственного средства, так как присутствие только одной PBRM не приводила к уменьшению объема опухоли.
На фиг. 2 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки JIMT-1 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения плацебо; PBRM (трастузумаба) при 10 мг/кг; конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (3%))-(10 кДа PHF-ВА (30%))-(AF-HPA-Ala (8%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4, при 2,5 мг/кг; или трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 16:1 до приблизительно 21:1), пример 7, при 2,5 мг/кг. Результаты показывают уменьшение объема опухоли как в примере 4, так и в примере 7. В частности, в испытуемой группе, в которой вводили конъюгат, описанный в примере 4, наблюдались 100% регрессии при дозе 2,5 мг/кг, которые включали в себя девять случаев полной регрессии (одно животное погибло, но не в результате лечения) и три случая выживания с отсутствием опухоли. В испытуемой группе, в которой вводили конъюгат, описанный в примере 7, наблюдались 100% регрессии, которые включали в себя полные регрессии, и во всех случаях опухоль отсутствовала (два животных с отсутствующей опухолью погибли в конце исследования, но не в результате лечения). Плацебо и только один трастузумаб приводили к увеличению объема опухоли. Конъюгирование PBRM, специфичной в отношении HER2 (трастузумаба), с конъюгатом лекарственное средство-полимер было необходимо для уменьшения объема опухоли, так как только одно PBRM не приводило к уменьшению объема опухоли).
Самкам мышей линии NCr nu/nu инокулировали подкожно клетки HL-60 (n=10 для каждой группы). Испытуемые соединения или плацебо дозировали внутривенно в виде разовой дозы в 1-й день. Размер опухоли измеряли в моменты времени, указанные на фиг. 3, используя цифровые штангенциркули. Вычисляли объем опухоли и использовали его для определения замедления роста опухоли. Мышей умерщвляли, когда опухоли достигали размера 2000 мм3. Объемы опухолей регистрировали как среднее значение (mean) ± стандартная погрешность среднего (SEM) для каждой группы.
На фиг. 3 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки HL-60 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо; PBRM (линтузумаб) при 20 мг/кг; или конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство лин-тузумаб-ДО2-Ш (2%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-НРА:линтузумаб от приблизительно 10:1 до приблизительно 15:1), пример 8, 20 мг/кг. Результаты показывают уменьшение объема опухоли для примера 8 со 100% регрессиями и 70% выживаемостью с отсутствием опухоли на 44-й день. Плацебо и только один линтузумаб характеризовались увеличением объема опухоли. Для уменьшения объема опухоли требовалось конъюгирование PBRM, специфичной к CD33 (линтузума6), с полимерным конъюгатом лекарственного средства, так как присутствие только одной PBRM не приводила к уменьшению объема опухоли.
На фиг. 4 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки JIMT-1 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо; PBRM (трастузумаба) при 20 мг/кг; кадсила(r) (конъюгат PBRM-лекарственное средство) при 20 мг/кг; или конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-НРА:трастузумаб от приблизительно 10:1 до приблизительно 15:1), пример 14, при 2 мг/кг, 0,67 мг/кг или 0,3 мг/кг. Результаты показывают уменьшение объема опухоли в примере 14 со 100% регрессиями при дозе 2 мг/кг и 100% выживаемостью с отсутствием опухоли. Плацебо, кадсила(r) и только один трастузумаб характеризовались увеличением объема опухоли. Для уменьшения объема опухоли требовалось конъюгирование специфичной к HER2 клеткам PBRM (трастузумаба) с полимерным конъюгатом лекарственного средства, так как присутствие только одной PBRM не приводила к уменьшению объема опухоли.
На фиг. 5 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо или конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 11:1 до приблизительно 16:1), пример 15, при 3 мг/кг, 1 мг/кг или 0,3 мг/кг. Результаты показывают дозозависи-мый эффект для конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 15), при этом самая высокая доза 3 мг/кг характеризуется полной регрессией объема опухоли с 100 полными ремиссиями. При средней дозе 1 мг/кг наблюдали 7 частичных и 1 полную регрессию у 10 животных.
На фиг. 6 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й
день плацебо, конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 11:1 до приблизительно 16:1), пример 14, при 0,67 мг/кг, или ритуксимаб-(EG2-MI (2%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (9%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 13,7 до приблизительно 18,7), пример 16, при 3 мг/кг. Результаты показывают замедление роста опухоли в случае конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 14). Плацебо или конъюгат ритуксимаб-лекарственное средство-полимер (пример 16) при дозе 3 мг/кг не оказывали действия на рост опухоли.
На фиг. 7 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо, конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(третбутилглицин AF-HPA (7,5%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 4:1 до приблизительно 6:1) пример 33, при 0,67 мг/кг; трастузумаб-(EG2-MI (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (7,3%)) (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1), пример 43А, при 1 мг/кг; или трастузумаб-(EG2-MI (2,5%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,4%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 16:1), пример 43C, при 0,67 мг/кг или 3 мг/кг. Результаты показывают замедление роста опухоли в случае конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство примера 43C при дозе 0,67 мг/кг, и доза 3 мг/кг показала 90% выживания с отсутствием опухоли на 115-й день.
На фиг. 8 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки NCI-N87 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо, конъюгата полимер-лекарственное средство 10K PHF-BA (30%)-AF-HPA-Ala (9,5%), пример 5А при 0,22 мг/кг; или конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство трастузумаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(валинацилоксиизопропилокси-MMAE (9%)), (отношение ММАЕ:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 16,5:1) пример 30B, при 2 мг/кг; ритук-симаб-(EG2-MI (2,7%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(валинацилоксиизопропилокси-MMAE (9%)) (отношение ММАЕ:ритуксимаб от приблизительно 9,5:1 до приблизительно 13:1), пример 30C при 2 мг/кг; sc-FvFc-трастузумаб-ДО2-Ш (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,1%)), (отношение AF-HPA:антитело scFvFc трастузумаб от приблизительно 14:1 до приблизительно 19:1), пример 40 при 0,67 мг/кг; или трастузумаб-ДО2-Ш (2,5%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,4%)), (отношение AF-HPA:трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 43В при 1 мг/кг; или дозировали один раз в неделю в течение 3 недель трастузумаб-(EG2-MI (2,65%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(Val-Cit-PABA-Arry 520 (2,9%)), (отношение Arry 520:трастузумаб от приблизительно 4:1 до приблизительно 6:1), пример 38 при 10 мг/кг; или дозировали один раз в неделю в течение 3 недель ритуксимаб-(EG2-MI (2,65%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(Val-Cit-PABA-Any 520 (2,9%)), (отношение Arry 520:трастузумаб от приблизительно 4:1 до приблизительно 6:1), пример 39 при 10 мг/кг. Результаты показывают замедление роста опухоли в случае конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство (пример 40 и пример 43В).
На фиг. 9 приведены результаты по реакции опухоли у мышей, которым инокулировали подкожно клетки JIMT-1 (n=10 для каждой группы), после внутривенного введения в виде разовой дозы в 1-й день плацебо или sc-FvFc-трастузумаб-(EG2-MI (2,8%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,1%)), (отношение AF-HPA:антитело scFvFc трастузумаб от приблизительно 14:1 до приблизительно 19:1), пример 40 при 1 мг/кг; или трастузумаб-ДО2-Ш (2,5%))-(10 кДа PHF-BA (28%))-(AF-HPA-Ala (8,4%)), (отношение AF-HPA: трастузумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 16:1), пример 43C при 2 мг/кг.
Пример 53. Исследование фармакокинетики в плазме мышей после введения конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство.
Самкам мышей линии CD-1 давали возможность акклиматизироваться в течение по меньшей мере 4 дней перед началом дозирования. Всем мышам давали привычный для них корм и неограниченно воду и их не переводили на голодание перед введением соединения. Испытуемые соединения или плацебо дозировали внутривенно в виде разовой дозы в 1-й день.
Мышам вводили внутривенно плацебо (n=3) или конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство, трастузумаб-ДО2-Ш (3%))-(10 кДа PHF-BA (30%))-(AF-HPA-Ala (8%))), (отношение AF-HPA: трасту-зумаб от приблизительно 12:1 до приблизительно 17:1), пример 4, при 5 мг/кг, n=3 для каждой группы). Плазму собирали через 5 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 7 дней и 14 дней после дозирования. Массу тела измеряли до дозирования в 1-й день и в 1-й, 7-о и 14-й день. Всех животных обследовали на протяжении четырнадцати дней по поводу смертности или осложнений.
Концентрации конъюгированного AF-HPA и неконъюгированного (свободного) лекарственного средства (такого как AF-HPA и AF) определяли методом LC/MS. Суммарную концентрацию трастузума-ба определяли методом ELISA.
Результаты на фиг. 10 показали, что трастузумаб имел концентрацию в плазме ~100 мкг/мл и период полувыведения ~12 дней, в то время как неконъюгированное AF-HPA и AF имело суммарную концентрацию в плазме <1 нг/мл. Конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство период полувыведения > 5 дней с величиной AUC0 to inf ~300 мкг-день/мл.
Пример 54. Исследование фармакокинетики в плазме мышей после введения конъюгатов PBRM
полимер-лекарственное средство.
Самкам мышей линии CD-1 давали возможность акклиматизироваться в течение по меньшей мере 4 дней перед началом дозирования. Всем мышам давали привычный для них корм и неограниченно воду и их не переводили на голодание перед введением соединения. Испытуемые соединения или плацебо дозировали внутривенно в виде разовой дозы в 1-й день.
Мышам вводили внутривенно плацебо (n=3) или конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство, описанные в примерах 4, 7, 18А, 18В и 18С. Плазму собирали через 5 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 7 дней и 14 дней после дозирования. Массу тела измеряли до дозирования в 1-й день и в 1-й, 7-й и 14-й день. Всех животных обследовали на протяжении четырнадцати дней по поводу смертности или осложнений.
Суммарные концентрации AF-HPA (конъюгированного AF-НРА и неконъюгированного (свободного) лекарственного средства (такого как AF-HPA и AF) определяли методом LC-MS/MS.
Таблица IX
Результаты в табл. IX показали, что конъюгаты PBRM-полимер-лекарственное средство имели периоды полувыведения ~120-154 ч (~5-6,4 дней) при величине AUC0 to 336 приблизительно от 19 до 25 мкг-ч/мл, которые не зависели от отношения AF-HPA к трастузумабу в конъюгатах PBRM-полимер-лекарственное средство.
Пример 55. Переносимость конъюгатов PBRM-полимер-лекарственное средство (определение максимально переносимой дозы (MTD)).
Переносимость конъюгата PBRM-полимер-лекарственное средство изучали на мышах линии CD-1. Конъюгат PBRM-полимер-лекарственное средство, пример 4, вводили в виде разовой дозы внутривенно при дозе 20 мг/кг, 40 мг/кг, 60 мг/кг (n=6 для каждой группы). Контрольная группа в качестве плацебо получала физиологический раствор. Животные постоянно находились под наблюдением по поводу проявления клинических признаков в течение двадцати одного дня. Для каждого исследуемого животного регистрировали массу тела на момент начала исследования (начальную величину), каждый день в течение первых пяти дней и приблизительно раз в два дня в дальнейшем. Результаты приведены в табл. X.
Группа
Доза (мг/кг)
Изменение на
7-ой день относительно начальной величины,%
Изменение на
21-ый день относительно
начальной величины, %
Смертность или осложнения
Плацебо
-1%
+ 7,3%
Отсутствуют
+ 3,7%
+14,8%
Отсутствуют
-20%
+10,8%
1 животное погибло на 7-ой день при потери массы тела 12%
-28%
4 животных находились в критическом состоянии и были умерщвлены на 9-ый день
Доза 20 мг/кг переносилась хорошо, не отмечалось ни одного случая потери массы тела ни у одной из мышей в этой группе. При дозе 40 мг/кг максимальная потеря массы тела ~20% наблюдалась на 7-й день. Одно животное в этой группе погибло на 7-й день и имело -12% потери массы тела за день до гибели. К концу исследования (на 21-й день) все выжившие животные (5 из 6) в этой группе исследования набрали массу тела относительно контрольной группы. Доза 60 мг/кг явно превышала максимально переносимую дозу, так как все животные в этой группе имели значительные потери массы тела на 7-й день и их состояние было критическим и их умерщвляли на 9-й день.
Результаты показывают, что максимально переносимая доза для мышей составляла приблизительно от 20 до 40 мг/кг.
Пример 56. Переносимость ауристатин F-гидроксипропиламид (определение максимально переносимой дозы (MTD)).
Переносимость ауристатин F-гидроксипропиламида (AF-НРА) оценивали на самках мышей линии CD-1. AF-HPA (полученный таким же образом, как это описано в патентном документе US 13/493899, в настоящий момент, в патенте США 8685383, в примере 48) вводили в виде разовой дозы внутривенно при дозе 1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг, 4,7 мг/кг (n=6 для каждой группы). Контрольная группа в качестве плацебо получала физиологический раствор. Животные постоянно находились под наблюдением по поводу проявления клинических признаков в течение двадцати одного дня. Для каждого исследуемого животного регистрировали массу тела на момент начала исследования (начальную величину), каждый день в течение первых пяти дней и приблизительно раз в два дня в дальнейшем. Результаты приведены в табл. XI.
Таблица XI
Изменения на
Изменения на
Группа
Доза (мг/кг)
7-ой день относительно
начальной величины, %
21-ый день относительно
начальной величины, %
Смертность или осложнения
Плацебо
-1%
+ 7,3%
Отсутствуют
1,6
11, 6%
+ 5, 5%
Отсутствуют
1 животное
погибло на 7-ой
день, 3 животных
находились в
3,2
-20%
+10,8%
критическом состоянии и были умерщвлены на 7-
ой день. Двое животных выжили
1 животное
погибло на 3-ий
день, 1 животное
находилось в
критическом
состоянии и было
умерщвлено на 3-
ий день, 3
4,7
-28%
животных
находились в
критическом
состоянии и были
умерщвлены на 4-
ый день и 1
животное на 5-ый
день. Выживших
животных не было
Переносимость дозы 1,6 мг/кг была приемлемой, потери массы тела на 7-й день составляли 11,6%. Животные полностью восстанавливались на 21-й день при увеличении массы тела на 5,5% относительно начальной величины. При дозе 3,2 мг/кг 1 животное погибло на 7-й день, 3 животных находились в критическом состоянии и были умерщвлены на 7-й день. К концу исследования (на 21-й день) 2 из 6 животных выжили. Доза 4,7 мг/кг явно превышала максимально переносимую дозу, так как все животные в этой группе или погибли, или находились в критическом состоянии и были умерщвлены.
Пример 57. Оценка аффинности и кинетики связывания конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство с человеческим 5Т4 (внеклеточным доменом) методом поверхностного плазмон-ного резонанса.
Аффинность и кинетические параметры при связывании конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство, полученного таким же образом, как описано в примере 10, с антигеном 5Т4 определяли методом поверхностного плазмонного резонанса, используя прибор BIAcore T200 фирмы GE Healthcare. 5T4-ECD-Fc антиген (человеческий 5Т4 внеклеточный домен, слитый с Fc доменом человеческого подтипа IgG1) ковалентно иммобилизировали на сенсорном чипе BIAcore CM5 методом сочетания с амином, используя реагенты, поставляемые в виде набора (GE Healthcare). При исследовании связывания конъюгат анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство или контрольные белки последовательно разводили до ряда концентраций в BIAcore подвижном буфере HBS-EP+ (забуференном с помощью HEPES физиологическом растворе с добавками EDTA и Р20) и омывали иммобилизированный антиген в течение фиксированного периода времени, требующегося для связывания, затем омывали только подвижным буфером для диссоциации антигена и, наконец, регенерировали поверхность, используя раствор с низким значением pH (10 мМ глицин-HCl, pH 2). Все реагенты BIAcore приобретали у фирмы GE Healthcare. Полученные в виде кривых данные называются сенсограммами и представляют собой исходные данные по связыванию. Данные апроксимировали с помощью 1:1 модели связывания Ленгмюра, используя программный продукт BIAevaluation (GE Healthcare), и определяли аффинность/кинетические параметры, такие как скорость ассоциации, скорость диссоциации и аффинность. Оценочные показатели аффинности представляют собой средние значения нескольких измерений.
Как показано на фиг. 11, конъюгат анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство (пример 10) связывался с человеческим 5Т4 внеклеточным доменом с высокой аффинностью (KD <30 пМ). Эта величина аналогична величине, полученной для неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc.
Пример 58. Связывание конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство с 5Т4 антигеном клеточной поверхности.
Связывание конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство (анти-5Т4 scADC) (пример 10) с клеточной поверхностью оценивали, используя проточный цитометр FACS Calibre (Beckton Dickinson), на различных линиях раковых клеток человека. Связывание конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство с клеточной поверхностью определяли титрованием и сравнивали со связыванием с клеточной поверхностью, измеренным для неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc антитела.
Для титрования конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство и неконъюгированно-го анти-5Т4 scFvFc использовали 5Т4 сверхэкспрессирующий рекомбинант MDA-MB-231 (MDA-MB-231-5T4 OE), MDA-MB-231 (негативный в отношении 5Т4; имеющийся в наличии в Американской кол
лекции типовых культур, Manassas Virginia US, под депозитным номером НТВ-26) и А431 (экспрессирующие 5Т4 естественным образом) клетки (A431, имеющийся в наличии в Американской коллекции типовых культур, Manassas Virginia US, под депозитным номером CRL-1555). Экспоненциально растущие клетки извлекали из колбы с культурой, используя буфер 0,5 мМ PBS/EDTA. Клетки два раза промывали с помощью PBS и инкубировали с анти-5Т4 scFvFc, анти-5Т4 scADC или с несвязывающим scFvFc гибридным белком (от 0,01 до 10 мкг/мл) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки промывали три раза с помощью PBS и инкубировали с анти-Fc специфическим FITC антителом в течение 45 мин при 4°C. После инкубации анти-Fc специфического FITC антитела клетки промывали три раза с помощью PBS и анализировали, используя проточную цитометрию (FACS Calibre, Becton Dickinson). Для образцов определяли средние значения интенсивностей флуоресценции (MFI).
Специфическое зависимое от дозы связывание с клеточной поверхностью для конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство (пример 10) было сопоставимо со связыванием неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc как в случае клеток А431, так и в случае 5Т4 сверхэкспрессирующих клеток MDA-MB-231. Связывание неродственного scFvFc гибридного белка составляло в 200 раз меньшую величину при 5 мкг/мл. Кроме того, клетки MDA-MB-231, которые являются негативными в отношении экспрессии 5Т4, не показывали никакого связывания с клеточной поверхностью как в случае анти-5Т4 scFvFc, так и в случае конъюгированного анти-5Т4 scFvFc ADC.
Пример 59. In vivo активность конъюгата анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство.
Материалы: шприцы объемом 1 мл фирмы Becton Dickinson (BD) (размер иглы 271/2), стерильная культуральная среда, стерильный забуференный фосфатом физиологический раствор, матригель фирмы BD Biosciences (номер по каталогу 354248), стерильные ватные тампоны, стерильные пробирки типа Эп-пендорф (1,5 мл, 2 мл), пипетки, фильтровальная бумага, 70% этиловый спирт/изопропиловый спирт, штангенциркуль с нониусом (Mitutoyo). Все другие используемые необходимые материалы имели аналитическую степень чистоты.
Животные: самок бестимусных голых мышей (Hsd: Athymic Nude-Foxnlnu) в возрасте 5-6 недель с массой тела 20-22 г получали от фирмы Harlan, Netherlands. Эксперименты над животными проводили в соответствии с требованиями Комитета по контролю и наблюдению за экспериментами на животных (CPCSEA), правительства Индии и Ассоциации по оценке и разрешению работы с лабораторными животными (AAALAC). В результате проверки институционным Комитетом по этике отношений к животным была присвоена "форма В" для проведения экспериментов на животных.
Размещение и кормление: животных содержали в среде с контролируемыми условиями при температуре 22±3°C, влажности 50±20%, цикле смены дня и ночи каждые 12 ч и 15-20 заменах в час воздуха на свежий воздух. Животных содержали по группам и в качестве подстилки использовали стерилизованные в автоклаве трубки из стержня кукурузного початка. В период проведения исследования животных кормили без ограничения сертифицированным облученным кормом для грызунов, используемых в лабораторных экспериментах.
Подготовка животных и идентификация животных: животным давали возможность акклиматизироваться в комнате для проведения экспериментов в течение по меньшей мере 5 дней. Каждому животному присваивали индивидуальный номер и на соответствующих клетках вывешивали карточки, в которых указывались эксперимент, номер исследования, дата имплантации опухоли, дата рандомизации, тип опухоли, мышиный штамм, пол и индивидуальный номер мыши. После рандомизации добавляли информацию о номере группы, испытуемом соединении, дозе, схеме и способе введения.
Приготовление опухолевых клеток: все методики осуществляли в подвергнутом стерилизации вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Для исследования были выбраны раковые клетки (a) А431 (эпи-дермоида), (b) рекомбинантные MDA-MB-231 (молочной железы) сверхэкспрессирующие 5Т4 (MDA-MB-231 5Т4++) (5Т4 OE), и (c) H1975 (немелкоклеточной карциномы легких) с конфлюентностью 7080% и жизнеспособностью > 90%. 5х106 клеток ресуспендировали в 200 мкл PBS или бессывороточной среды, содержащей 50% матригеля, хранящейся на льду.
Подкожная инъекция клеток: использовали безтимусных мышей (Hsd: Athymic Nude-Foxnlnu), содержавшихся в индивидуальных вентилируемых клетках (IVCs). Линии раковых клеток репродуцировали в животных путем подкожной инъекции в бока или спину животных. Имплантированную область постоянно контролировали на предмет роста опухоли. После того как опухоли можно было прощупать и они достигали требуемого объема (TV"150 мм3), животных рандомизировали на основе объема опухоли и начинали дозирование. Объем опухоли определяли путем двухмерного измерения с помощью штангенциркуля в день рандомизации (день 0) и затем один раз в три дня (т.е. в те же самые дни, в которые мышей взвешивали). С помощью штангенциркуля с нониусом измеряли длину (L) и ширину (W) опухоли. Объем опухоли (TV) рассчитывали по следующей формуле:
Объем опухоли (мм3)^ х W2/2,
где, L=длина, мм; W=ширина, мм.
Конъюгат анти-5Т4 scFvFc-полимер-лекарственное средство (пример 10) растворяли в стерильном 1 х PBS, в результате чего получали прозрачные растворы при всех приготовленных концентрациях и
вводили внутривенно через хвостовую вену. Испытуемый препарат приготавливали в свежем виде в дни его введения, объем дозы составлял 5 мл/кг массы тела. Для каждой группы использовали отдельно новый шприц и иглы.
Масса тела: данные наблюдений вывешивались на боковой части клетки, массу тела измеряли один раз каждые три дня на протяжении проведения исследования. Рассчитывали % изменения массы тела для каждой мыши.
Противоопухолевая активность: противоопухолевую активность оценивали как максимальное ин-гибирование объема опухоли относительно контрольной группы с плацебо. Анализ данных проводили, используя программу для статистической обработки Graph pad version 5.
Величина испытуемая группа/контрольная группа в % (% Т/C): Ингибирование опухоли на конкретный день (Т/С в %) рассчитывали из отношения средних TV величин испытуемой группы относительно контрольной группы, умноженное на 100%, следующим образом: Т/С (день Х) = (среднее значение TV испытуемой группы на день Х - среднее значение TV испытуемой группы на день 0)/(среднее значение TV контрольной группы на день Х - среднее значение TV
контрольной группы на день 0)х 100% Минимальное (или оптимальное) %Т/С значение, зарегистрированное для конкретной испытуемой группы во время проведения эксперимента, представляет собой максимальную противоопухолевую активность для соответствующего лечения. TV = объем опухоли (мм3).
Ингибирование роста опухоли (TGI): TGI рассчитывали, используя следующую формулу:
TGI=(1-T/C) х 100,
где Т = (среднее значение TV испытуемой группы на день Х - среднее значение TV испытуемой группы на день 0),
С = (среднее значение TV контрольной группы на день Х - среднее значение TV контрольной группы на день 0).
Клинические признаки: критическое состояние и смертность: каждое из животных обследовали на видимые общие клинические признаки один раз каждые три дня на протяжении проведения исследования. Всех животных оценивали с точки зрения критического состояния и смертности.
Статистический анализ: для оценки статистической значимости ингибирования опухоли применяли двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA и затем заключительный тест Бонферрони, используя программный продукт GraphPad Prism v5. Величины р <0,05 указывают на наличие статистически значимых различий между группами.
Результаты
Противоопухолевая активность в отношении А431-подкожного ксенотрансплантата.
В экспериментах с ксенотрансплантатом клеточной линии А431 ["Characterization of the A431 tumor xenograft as an in vivo model for testing epidermal growth factor-receptor antagonists", S. Robinson et al., Int. J. Oncol. 1992, 1(3):293-8], анти-5Т4 scADC, полученный таким же образом, как описано в примере 10, вводили внутривенно несущим опухоль мышам в следующих дозах: 10 мг/кг, разовая доза; 1 мг/кг, Q4D х 4; 3 мг/кг, Q4D х 4 и 6 мг/кг, Q4D х 4. "Q4D х 4" означает дозирование один раз каждые четыре дня, в общей сложности 4 дозы. Отдельной группе несущих опухоль мышей вводили неконъюгированный анти-5Т4 scFvFc (10 мг/кг IV, Q4D х 4). В этом исследовании анти-5Т4 scADC терапия продемонстрировала высокую противоопухолевую активность в отношении ксенотрансплантатов карциномы А431 при введении разовой дозы или повторяющихся доз при упомянутых выше уровнях доз (фиг/ 12). Лечение анти-5Т4 scADC при разовой дозе (10 мг/кг внутривенно) приводило в результате к оптимальной величине Т/С -4% на 24-й день. Было обнаружено, что % ингибирования роста опухоли (TGI) в группе с разовой дозой 10 мг/кг внутривенно составляет 104% (24-й день, р <0,001). Было обнаружено, что оптимальная величина Т/С в группах с повторяющимися дозами (1 мг/кг, 3 мг/кг и 6 мг/кг внутривенно, Q4D х 4) составляет -2%, -4% и -3% на 24 день соответственно. Кроме того, было обнаружено, что % ингибирования роста опухоли (TGI) в группах с повторяющимися дозами (1 мг/кг, 3 мг/кг и 6 мг/кг внутривенно, Q4D х 4) составляет 102% (24-й день, р <0,001), 104% (24-й день, р <0,001) и 103% (24-й день, р <0,001) соответственно. Отсутствовало значимое различие между группами, которые подвергали анти-5Т4 scADC лечению путем введения разовой дозы или повторяющихся доз. Введение неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc в дозе 10 мг/кг внутривенно, Q4D х 4 не приводило к какому-либо значительному % уменьшения объемов опухоли ксенотрансплантатов А431. Было обнаружено, что величина % Т/С на 24-й день составляет 87%. Различия в размерах опухолей между группой, которой вводили плацебо, и группой, которую подвергали лечению с помощью анти-5Т4 ScFvFc, не были статистически значимыми, и было обнаружено, что % ингибирования роста опухоли (TGI) при этой дозе составляет 13% (24-й день). После окончания медикаментозного лечения животные в группах, в которых вводили анти-5Т4 scADC, находились под наблюдением до 90-го дня, после чего исследование прекращали. В группе, в которой вводили повторяющиеся дозы анти-5Т4 scADC при 6 мг/кг, внутривенно, Q4D х 4, наблюдались связанные с лечением сильное снижение массы тела и смертность (7/10 животных) на 24-й день; выжившие животные в этой группе дозирования находились под наблюдением до 90-го дня. Полную регрессию роста опухоли
наблюдали во всех группах, подвергавшихся лечению анти-5Т4 scADC, и признаки возобновления роста опухоли отсутствовали вплоть до окончания исследования (включая 3/10 в группе дозирования при дозе 6 мг/кг, внутривенно, Q4Dх4).
Противоопухолевая активность в отношении MDA-MB-231 5Т4++-подкожного ксенотрансплантата.
В эксперименте с ксенотрансплантатами MDA-MB-231-5Т4 ОЕ, анти-5Т4 scADC, полученный таким же образом, как описано в примере 10, вводили несущим опухоль мышам в следующих дозах: 10 мг/кг IV, разовая доза; 1 мг/кг внутривенно, Q4Dх4; 3 мг/кг внутривенно, Q4Dх4 и 6 мг/кг внутривенно, Q4Dх4. Отдельной группе вводили неконъюгированный анти-5Т4 scFvFc (10 мг/кг внутривенно, Q4Dх 4). В этом исследовании анти-5Т4 scADC терапия продемонстрировала высокую противоопухолевую активность в отношении ксенотрансплантатов MDA-MB-231-5T4 ОЕ при введении разовой дозы или повторяющихся доз при упомянутых выше уровнях доз (фиг. 13). Лечение анти-5Т4 scADC при разовой дозе (10 мг/кг внутривенно) приводило в результате к оптимальной величине Т/С -25% на 18-й день. Было обнаружено, что % ингибирования роста опухоли (TGI) в группе с разовой дозой 10 мг/кг внутривенно составляет 125% (18-й день, р <0,001). Было обнаружено, что оптимальная величина Т/С в группах с повторяющимися дозами (1 мг/кг, 3 мг/кг и 6 мг/кг внутривенно, Q4Dх4) составляет -26%, -32% и -38% на 18-й день соответственно. Кроме того, было обнаружено, что % ингибирования роста опухоли (TGI) в группах с повторяющимися дозами (1 мг/кг, 3 мг/кг и 6 мг/кг внутривенно, Q4Dх4) составляет 126% (18-й день, р <0,001), 132% (18-й день, р <0,001) и 138% (18-й день, р <0,001) соответственно. Отсутствовало значимое различие между группами, которые подвергали лечению с помощью анти-5Т4 scADC путем введения разовой дозы или повторяющихся доз. Введение неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc в дозе 10 мг/кг внутривенно, Q4Dх4 характеризовалось умеренной противоопухолевой активностью в отношении ксенотрансплантатов MDA-MB-231 5T4 ОЕ. Было обнаружено, что величина % Т/С на 18-й день составляет 45%, и ингибирование роста опухоли (TGI) при этой дозе составляет 55% (18-й день, р <0,001). Кроме того, было обнаружено, что средний объем опухоли на 66-й день для группы, которой вводили плацебо, составляет 1763 мм3. В группах с повторяющимися дозами анти-5Т4 scADC (1 мг/кг, 3 мг/кг, внутривенно; Q4Dх4) и в группе с разовой дозой (10 мг/кг, внутривенно) наблюдалась полная регрессия роста опухоли в период от 45-го дня до 90-го дня, после чего исследование прекращали. Признаки возобновления роста опухоли отсутствовали в упомянутых выше группах, подвергнутых лечению с помощью анти-5Т4 scADC, вплоть до окончания исследования. Однако в группе, подвергнутой лечению анти-5Т4 scADC с повторяющимися дозами 6 мг/кг, внутривенно, Q4Dх4, наблюдались связанные с лечением сильное снижение массы тела и смертность (10/10) на 21-й день. Было обнаружено, что средний объем опухоли для группы, которую подвергали лечению неконъюгированным анти-5Т4 scFvFc антителом, на 72-й день составляет 1502 мм3. Было обнаружено, что величина % Т/С на 66-ой день для этой группы, подвергавшейся лечению антителом, составляет 60%, и ингибирование роста опухоли (TGI) при этой дозе составляет 40% (66-й день, р <0,001).
Противоопухолевая активность в отношении Н1975-подкожного ксенотрансплантата.
В экспериментах с ксенотрансплантатами, проводимых таким же образом, как в случае с клеточной линией H1975 карциномы легкого, анти-5Т4 scADC, полученный так же, как это описано в примере 10, вводили внутривенно несущим опухоль мышам (n=5 мышей в группе, исходный объем опухоли ~150 мм3) при следующих дозах: 0,3 мг/кг, Q4Dх4; 1 мг/кг, Q4Dх4 и 3 мг/кг, Q4Dх4. Отдельной группе вводили неконъюгированное анти-5Т4 scFvFc антитело при 3 мг/кг внутривенно, Q4Dх4. Лечение с помощью анти-5Т4 scADC (0,3 и 1 мг/кг, внутривенно; Q4Dх4) приводило в результате к частичной ремиссии (на 39-й день) ксенотрансплантатов опухоли Н1975 при введении в виде повторяющейся дозы при упомянутых выше уровнях доз. Лечение с помощью анти-5Т4 scADC при 3 мг/кг, внутривенно; Q4Dх4, приводило в результате к полной ремиссии (на 39-й день) ксенотрансплантатов опухоли H1975. Лечение с помощью анти-5Т4 scADC при 0,3, 1 и 3 мг/кг, внутривенно; Q4Dх4 давало в результате оптимальную величину Т/С -0,7%, -4% и -5% на 39-й день соответственно, и было обнаружено, что % ингибирования роста опухоли (TGI) составляет 101%, 104% и полную ремиссию (CR) (39-й день, р <0.001). Лечение с помощью неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc антитела характеризовалось очень низкой противоопухолевой активностью с величиной % Т/С, составляющей 88% на 39-й день, при этом величина % TGI составляла 12%. После окончания медикаментозного лечения животные в группах, в которых проводили лечение, находились под наблюдением до 81-го дня, после чего исследование прекращали. На 60-й день лечение с помощью анти-5Т4 scADC (0,3 мг/кг, внутривенно; Q4Dх4) приводило к полной ремиссии (3/5) у безтимусных мышей, несущих ксенотрансплантат Н1975, в то время как возобновление роста опухоли отмечалось у 2 животных от 39-го для 60-го дня, после чего животных в этой группе умерщвляли. Однако на 81-й день лечение с помощью анти-5Т4 scADC (1 и 3 мг/кг, внутривенно; Q4Dх4) приводило в результате к полной ремиссии (5/5; 81-й день) у бестимусных мышей, несущих ксенотрансплантаты H1975.
Противоопухолевая активность в отношении NCI-N87-подкожного ксенотрансплантата.
Эксперименты с ксенотрансплантатами клеток линии NCI-N87 (рака желудка) проводили таким же образом, как описанные выше эксперименты с ксенотрансплантатами опухолей. Анти-5Т4 scADC, полученный так же, как это описано в примере 10, вводили внутривенно несущим опухоль мышам с тяжелым
комбинированным иммунодефицитным синдромом (SCID) (n=10 мышей в группе, исходный объем опухоли ~135 мм3) при следующих дозах: 3 мг/кг, разовая доза и 3 мг/кг, Q4Dх3. Отдельной группе вводили неконъюгированное анти-5Т4 scFvFc антитело при 3 мг/кг внутривенно, Q4Dх3. В группе, в которой вводили разовую дозу 3 мг/кг анти-5Т4 scADC, был зафиксирован один смертный случай, не связанный с проведением лечения, и данные по этому животному были исключены из анализа. На 19-й день в группах, в которых проводили лечение с помощью анти-5Т4 scADC, отмечалось ингибирование роста опухоли на 92 и 87% при 3 мг/кг, разовой дозе и 3 мг/кг, Q4Dх3 соответственно. В обеих группах, в которых проводилось лечение с помощью анти-5Т4 scADC, достигались 100% полные ремиссии, которые сохранялись до конца исследования на 75-й день. Лечение с помощью неконъюгированного анти-5Т4 scFvFc антитела характеризовалось очень низкой противоопухолевой активностью с величиной ингибирования роста опухоли 14% на 19-й день; у всех животных в этой группе лечения объем опухоли достиг предельной величины 800 мм3 к 56-му дню.
Во всех случаях содержание всех публикаций, в том числе, например, непатентной литературы, патентных заявок и патентов, упоминаемых в этой заявке, включено в изобретение путем ссылки на них. Изобретение может быть осуществлено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или основных характеристик. Поэтому приведенные выше варианты осуществления следует рассматривать во всех аспектах только иллюстрациями, а не ограничениями для описываемого изобретения. Следовательно, объем изобретения определяется прилагаемыми пунктами формулы изобретения, а не приведенным выше описанием изобретения, и предполагается, что все вносимые изменения, не выходящие за рамки значений и диапазона эквивалентности пунктов формулы изобретения, входят в объем настоящего изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
где каркасная структура включает поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаль) (PHF), имеющий молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа;
D представляет собой независимо терапевтическое средство, имеющее молекулярную массу <5 кДа;
^ между D и карбонильной группой обозначает прямое или непрямое присоединение D к карбонильной группе;
X представляет собой CH2, О или NH; m представляет собой целое число от 1 до 300; m1 представляет собой целое число от 1 до 140; m7 представляет собой целое число от 1 до 40; m3 представляет собой целое число от 1 до 18 и сумма m, m1, m3 и m7 составляет от 15 до 300.
2. Каркасная структура по п.1, где PHF имеет молекулярную массу от 2 до 20 кДа, m7 представляет собой целое число от 1 до 20, m3 представляет собой целое число от 1 до 10, m1 представляет собой целое число от 1 до 70 и сумма m, m1, m3 и m7 составляет от 15 до 150.
3. Каркасная структура по п.1, где PHF имеет молекулярную массу от 3 до 15 кДа, m7 представляет собой целое число от 2 до 15, m3 представляет собой целое число от 1 до 8, m1 представляет собой целое число от 2 до 50 и сумма m, m1, m3 и m7 составляет от 20 до 110.
4. Каркасная структура по п.1, где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа, m7 представляет собой целое число от 3 до 10, m3 представляет собой целое число от 1 до 5, m1 представляет собой целое
2.
число от 5 до 35 и сумма m, mb m3 и m7 составляет от 40 до 75.
5. Каркасная структура по любому из пп.1-4, где D независимо выбирается из соединения ауристатина, ингибитора топоизомеразы, соединения калихимицина, соединения барвинка, соединения тубули-зина, соединения дуокармицина, соединения пирролобензодиазепина, ингибитора киназы, ингибитора KSP, майтанзиноида, лекарственного средства, связывающего, алкилирующего или интеркалирующего ДНК, ингибитора РНК-полимеразы, ингибитора синтеза белка и их аналогов.
6. Каркасная структура по п. 1, имеющая формулу (1а)
где m2 представляет собой целое число от 1 до 40, сумма m, m1, m2 и m3 составляет от 15 до 300.
7. Каркасная структура по п.6, где PHF имеет молекулярную массу от 2 до 20 кДа, m2 представляет собой целое число от 1 до 20, m3 представляет собой целое число от 1 до 10, m1 представляет собой целое число от 1 до 70 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от 15 до 150.
8. Каркасная структура по п.6, где PHF имеет молекулярную массу от 3 до 15 кДа, m2 представляет собой целое число от 2 до 15, m3 представляет собой целое число от 1 до 8, m1 представляет собой целое число от 2 до 50 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от 20 до 110.
9. Каркасная структура по п.6, где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа, m2 представляет собой целое число от 3 до 10, m3 представляет собой целое число от 1 до 5, m1 представляет собой целое число от 5 до 35 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от 40 до 75.
10. Каркасная структура по п.6, имеющая формулу (A)
где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до 75; m1 представляет собой целое число от 5 до 35; m2 представляет собой целое число от 3 до 10; m3 представляет собой целое число от 1 до 5 и сумма m, m1, m2 и m3 составляет от 40 до 75.
11. Каркасная структура по любому из пп.1-10, дополнительно включающая PBRM, конъюгирован-ную с PHF через малеимидную группу.
12. Каркасная структура по п.11, которая при конъюгировании с PBRM имеет формулу (Ie)
11.
(Ie) ,
где один из Xa и Xb представляет собой H, а другой представляет собой малеимидоблокирующий фрагмент или Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
m3a представляет собой целое число от 0 до 17;
m3b представляет собой целое число от 1 до 8,
где сумма m3a и m3b составляет m3;
сумма m, m1, m7, m3a и m3b составляет от 15 до 300 и
m5 представляет собой целое число от 1 до 10.
13. Каркасная структура по п.11, которая при конъюгировании с PBRM имеет формулу (lb)
где один из Xa и Xb представляет собой H, а другой представляет собой малеимидоблокирующий фрагмент или Xa и Xb вместе с углеродными атомами, к которым они присоединены, образуют двойную связь углерод-углерод;
m3a представляет собой целое число от 0 до 17;
m3b представляет собой целое число от 1 до 8,
где сумма m3a и m3b составляет m3;
сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от 15 до 300 и
m5 представляет собой целое число от 1 до 10.
14. Каркасная структура по п.13, где PHF имеет молекулярную массу от 2 до 20 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от 15 до 150, m1 представляет собой целое число от 1 до 70, m2 представляет собой целое число от 1 до 20, m3a представляет собой целое число от 0 до 9, m3b представляет собой целое число от 1 до 8 и m5 представляет собой целое число от 2 до 8.
15. Каркасная структура по п.13, где PHF имеет молекулярную массу от 3 до 15 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от 20 до 110, m1 представляет собой целое число от 2 до 50, m2 представляет собой целое число от 2 до 15, m3a представляет собой целое число от 0 до 7, m3b представляет собой целое число от 1 до 8 и m5 представляет собой целое число от 2 до 4.
16. Каркасная структура по п.13, где PHF имеет молекулярную массу от 5 до 10 кДа, сумма m, m1, m2, m3a и m3b составляет от 40 до 75, m1 представляет собой целое число от 5 до 35, m2 представляет собой целое число от 3 до 10, m3a представляет собой целое число от 0 до 4, m3b представляет собой целое число от 1 до 5 и m5 представляет собой целое число от 2 до 4.
17. Каркасная структура по п.13, имеющая формулу (B)
14.
где PHF имеет молекулярную массу в диапазоне от 5 до 10 кДа; m представляет собой целое число от 1 до 75; m1 представляет собой целое число от 5 до 35; m2 представляет собой целое число от 3 до 10; m3a представляет собой целое число от 0 до 4; m3b представляет собой целое число от 1 до 5; сумма m, mb m2, m3a и m3b составляет от 40 до 75 и m5 представляет собой целое число от 2 до 4.
18. Каркасная структура по любому из пп.1-17, где PBRM имеет молекулярную массу более чем 40
кДа.
19. Полимерная каркасная структура формулы (Ic)
где каркасная структура включает PHF, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 2 до 40 кДа; X представляет собой CH2, О или NH; m представляет собой целое число от 1 до 300, m6 представляет собой целое число от 2 до 180, m3 представляет собой целое число от 1 до 18 и сумма m, m6 и m3 составляет от 15 до 300.
20. Фармацевтическая композиция, включающая каркасную структуру по любому из пп.11-18 и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Применение каркасной структуры по любому из пп.11-18 в лечении онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака заднего прохода, астроцитомы, лейкоза, лимфомы, рака головы и шеи, рака печени, рака яичек, рака шейки матки, саркомы, гемангиомы, рака пищевода, рака глаза, рака гортани, рака рта, мезотелиомы, рака кожи, миеломы, рака полости рта, рака прямой кишки, рака горла, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака почки или рака желудочно-кишечного тракта.
22. Применение фармацевтической композиции по п.20 в лечении онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака заднего прохода, астроцитомы, лейкоза, лимфомы, рака головы и шеи, рака печени, рака яичек, рака шейки матки, саркомы, гемангиомы, рака пищевода, рака глаза, рака гортани, рака рта, мезотелиомы, рака кожи, миеломы, рака полости рта, рака прямой кишки, рака горла, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной же
20.
лезы, рака легкого, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака почки или рака желудочно-кишечного тракта.
о 1 ГтП
Дни Фиг. 13
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032231
032231
- 1 -
- 1 -
(19)
032231
032231
- 1 -
- 1 -
(19)
032231
032231
- 4 -
- 3 -
(19)
032231
032231
- 9 -
032231
032231
- 12 -
- 12 -
032231
032231
- 29 -
- 29 -
032231
032231
- 30 -
- 30 -
(i)
032231
032231
- 37 -
- 36 -
032231
032231
- 39 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 42 -
032231
032231
- 45 -
032231
032231
- 45 -
032231
032231
- 45 -
032231
032231
- 45 -
032231
032231
- 45 -
032231
032231
- 48 -
- 48 -
032231
032231
- 52 -
- 52 -
032231
032231
- 53 -
- 53 -
032231
032231
- 54 -
- 54 -
032231
032231
- 56 -
- 56 -
032231
Таблица С
032231
- 71 -
- 70 -
032231
Таблица С
032231
- 71 -
- 70 -
032231
Таблица С
032231
- 71 -
- 72 -
032231
032231
- 73 -
- 73 -
032231
032231
- 74 -
- 74 -
032231
032231
- 78 -
- 78 -
032231
032231
- 79 -
032231
032231
- 82 -
- 82 -
032231
032231
- 86 -
- 86 -
032231
032231
- 86 -
- 86 -
032231
032231
- 86 -
- 86 -
032231
032231
- 86 -
- 86 -
032231
Таблица I
032231
Таблица I
- 124 -
- 124 -
032231
Таблица II
032231
Таблица II
- 125 -
- 125 -
032231
032231
- 126 -
- 126 -
032231
Таблица VI
032231
Таблица VI
- 127 -
- 127 -
032231
Таблица VII
032231
Таблица VII
- 128 -
- 128 -
032231
032231
- 129 -
- 129 -
032231
032231
Таблица X
- 131 -
- 132 -
032231
032231
- 134 -
- 134 -
032231
032231
- 142 -
- 142 -
032231
032231
- 144 -
- 144 -