EA 032222B1 20190430

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032222b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Антагонистическое антитело, которое связывает IL-13 человека, включающее тяжелую цепь и легкую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 для CDR-H2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, и вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.

2. Антитело по п.1, в котором тяжелая цепь включает последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 31.

3. Антитело по п.1, в котором легкая цепь включает последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 23.

4. Антагонистическое антитело, которое связывает IL-13 человека, имеющее тяжелую цепь, которая включает последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 31, и легкую цепь, включающую последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 23.

5. Антагонистическое антитело, связывающее IL-13 человека, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.

6. Антагонистическое антитело по одному из пп.1-5, к которому присоединена эффекторная или репортерная молекула.

7. Антагонистическое антитело по любому из пп.1-5 или 6, имеющее связывающее сродство в отношении выделенного IL-13 человека, составляющее 30 пМ или более.

8. Последовательность выделенной ДНК, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь(цепи) антитела по одному из пп.1-7.

9. Вектор клонирования или экспрессии, включающий одну или несколько последовательностей ДНК по п.8.

10. Вектор по п.9, включающий последовательности, представленные в SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 28.

11. Клетка-хозяин, включающая один или несколько векторов клонирования или экспрессии по п.10.

12. Способ получения антитела по одному из пп.1-7, включающий культивирование клетки-хозяина по п.11 и выделение антитела.

13. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по одному из пп.1-7 в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентом, растворителем или носителем.

14. Применение антитела по одному из пп.1-7 для лечения патологического расстройства, опосредованного IL-13 или связанного с повышенным уровнем IL-13.

15. Применение фармацевтической композиции по п.13 для лечения патологического расстройства, опосредованного IL-13 или связанного с повышенным уровнем IL-13.

16. Применение антитела по одному из пп.1-7 для профилактики патологического расстройства, которое опосредовано IL-13 или ассоциировано с повышенным уровнем IL-13.

17. Применение фармацевтической композиции по п.13 для профилактики патологического расстройства, которое опосредовано IL-13 или ассоциировано с повышенным уровнем IL-13.

18. Применение антитела по одному из пп.1-7 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано IL-13 или ассоциировано с повышенным уровнем IL-13.

19. Способ лечения человека с патологическим расстройством или риском патологического расстройства, опосредованного IL-13, включающий введение субъекту эффективного количества фрагмента Fab или Fab' анти-IL-13 антитела путем ингаляции, в котором фрагмент антитела Fab или Fab' является фрагментом антитела по одному из пп.1-7.

20. Применение по одному из пп.16-18, в котором патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из астматических расстройств, атопических расстройств, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), состояний, включающих воспаление дыхательных путей, эозинофилии, фиброза и избыточной выработки слизи, воспалительных состояний, аутоиммунных состояний, опухолей, в том числе злокачественных, вирусной инфекции и супрессии иммунных ответов 1 типа.

21. Способ по п.19, в котором патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из астматических расстройств, атопических расстройств, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), состояний, включающих воспаление дыхательных путей, эозинофилии, фиброза и избыточной выработки слизи, воспалительных состояний, аутоиммунных состояний, опухолей, в том числе злокачественных, вирусной инфекции и супрессии иммунных ответов 1 типа.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

8. Последовательность выделенной ДНК, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь(цепи) антитела по одному из пп.1-7.

9. Вектор клонирования или экспрессии, включающий одну или несколько последовательностей ДНК по п.8.

10. Вектор по п.9, включающий последовательности, представленные в SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 28.

11. Клетка-хозяин, включающая один или несколько векторов клонирования или экспрессии по п.10.

Евразийское
патентное
ведомство
032222
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки
201101303
(22) Дата подачи заявки
2010.03.10
(51) Int. Cl.
C07K16/24 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) A61P11/06 (2006.01)
C07K 16/46 (2006.01)
C12N15/13 (2006.01)
(54)
МОЛЕКУЛЫ АНТИТЕЛ, ОБЛАДАЮЩИЕ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ IL-13 ЧЕЛОВЕКА
(31) 0904214.4
(32) 2009.03.11
(33) GB
(43) 2012.05.30
(86) PCT/GB2010/000432
(87) WO 2010/103274 2010.09.16
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЮСБ ФАРМА С.А. (BE)
(72) Изобретатель:
Гоззард Нил, Лосан Аластэр Дейвид Гриффитс, Лайтвуд Даниел Джон, Палфрамен Роджер Томас, Смит Брайан Джон, Тайсон Керри Луис
(GB)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(56) WO-A2-2006055638 WO-A2-2008086395 US-A1-2006063228 GB-A-2403952 US-A1-2008075720 US-A1-2004115194 US-A1-2005271660
(57) В изобретении описаны молекулы антител, обладающие специфичностью в отношении антигенных детерминант IL-13 человека, терапевтические применения молекул антител и способы получения указанных молекул антител.
Область техники
Изобретение относится к антителам против интерлейкина-13 (IL-13) и к их фрагментам, например к их связывающим фрагментам, композициям, включающим указанные антитела и фрагменты, и особенно к их применению для предупреждения и/или лечения различных заболеваний, включая астму, аллергию, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), фиброз и/или рак.
Предпосылки создания изобретения
IL-13 является короткоцепочечным цитокином, последовательность которого на 25% идентична последовательности IL-4. Он включает примерно 132 аминокислоты, формируя вторичную структуру из четырех спиралей, простирающихся на остатки 10-21 (спираль А), 43-52 (спираль В), 61-69 (спираль C) и 92-110 (спираль D), наряду с двумя р-цепями, простирающимися на остатки 33-36 и 87-90. Структура IL-13 была установлена, выявляя заранее рассчитанную конформацию пучка из четырех спиралей вверх-вверх-вниз-вниз, также установленную у IL-4 (Eisenmesser 2001).
IL-13 человека является гликопротеином массой 17 кДа, клонированным из активированных Т-клеток (Zurawski, de Vries, Immunol. Today 15, 1994, p. 19-26), и вырабатывается активированными Т-клетками линии Th2, хотя Th0 и Th1 CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки и несколько популяций клеток, не являющихся Т-клетками, например тучных клеток, также вырабатывают IL-13 (Zurawski, de Vries, Immunol. Today, 13, 1994, p. 19-26).
К функциям IL-13 относятся
переключение изотипа иммуноглобулина на IgE в В-клетках человека (Punnonen, Aversa и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, p. 3730-3734);и
подавление выработки цитокина воспаления и у мышей, и у человека (de Waal Malefyt, Figdor и др., J. Immunol. 151, 1993, p. 6370- 6381; Doherty, Kastelein и др., J. Immunol. 151, 1993, p. 7151-7160).
IL-13 связывается со своими рецепторами на поверхности клеток, IL-13 Rod и IL-13 Ra2. IL-13Ra1 взаимодействует с IL-13 с низким сродством (KD - 10 нМ) с последующим рекрутментом IL-4Ra для формирования сигнального гетеродимерного рецепторного комплекса со сродством высокой степени (KD~0,4 нМ) (Aman, Tayebi и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, p. 29265-29270; Hilton, Zhang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, p. 497-501).
Комплекс IL-4R/IL-13Ra1 экспрессируется на клетках многих типов, например на В-клетках, моноцитах/макрофагах, дендритных клетках, эозинофилах, базофилах, фибробластах, эндотелиальных клетках, эпителиальных клетках дыхательных путей и клетках гладких мышц дыхательных путей (Graber, Gretener и др., Eur. J. Immunol. 28, 1998, p. 4286-4298; Murata, Husain и др., Int. Immunol. 10, 1998, p. 11031110; Akaiwa, Yu и др., Cytokine 13, 2001, p. 75-84).
Лигирование комплекса рецепторов IL-13Ra1/IL-4R приводит к активированию различных метаболических путей передачи сигнала, включая сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции (STAT6) и метаболические пути инсулинового рецептора к субстрату-2 (insulin receptor substrate-2 - IRS-2) (Wang, Michieli и др., Blood 1995, 86, 4218-4227; Takeda, Kamanaka и др. J. Immunol. 1996, 157, p. 3220-3222).
Отдельно цепь IL-13Ra2 обладает высоким сродством (KD~0,25-0,4 нМ) в отношении IL-13 и функционирует и в качестве рецептора-ловушки, отрицательно регулирующего связывание IL-13 (Donaldson, Whitters и др. J. Immunol. 161, 1998, p. 2317-2324), и в качестве сигнального рецептора, который индуцирует синтез TGF-b и фиброз через метаболический путь AP-I у макрофагов и возможно клеток других типов (Fichtner-Feigl, Strober и др. Nat. Med. 2006, 12, p. 99-106).
Несколько предклинических исследований на животных моделях астмы показали, что IL-13 играет важную роль при астме. Эти данные включают устойчивость к астме у мышей с нокаутом IL-13, а также подавление фенотипа астмы антагонистами IL-13 (растворимые рецепторы IL-13, анти-П^-13 монокло-нальные антитела и др.) в различных мышиных моделях (Sela, Harefuah 137, 1999, p. 317-319; Wills-Karp, Chiaramonte, Curr. Opin. Pulm. Med. 9, 2003, p. 21-27; Wills-Karp, Immunol. Rev. 202, 2004, p. 175-190). Многочисленные исследования показали, что фармакологическое введение рекомбинантного IL-13 в легкие мышей и морских свинок индуцирует гиперсекрецию слизи в воздушных путях, эозино-филию и гиперактивность дыхательных путей (ГДП) (Grunig, Warnock и др., Science 282, 1998, p. 22612263; Wills-Karp, Luyimbazi и др., Science 282, 1998, p. 2258-2261; Kibe, Inoue и др., Am. J. Respir. Crit.
Care Med. 167, 2003, p. 50-56; Vargaftig, Singer, Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 284, 2003, p. L260-69; Vargaftig, Singer, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 28, 2003, p. 410-419).
Указанные свойства IL-13 были воспроизведены в системах трансгенных мышей с конститутивной или индуцибельной экспрессией IL-13 (Zhu, Homer и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, p. 779-788; Zhu, Lee и др., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 164, 2001, p. S67-70; Lanone, Zheng и др., J. Clin. Invest. 110, 2002, p. 463-474). Хроническая трансгенная сверхэкспрессия IL-13 также индуцирует субэпителиальный фиброз и эмфизему. У мышей, дефицитных по IL-13 (и IL-4) сигнальной молекуле STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) не может развиться индицированная аллергеном ГДП и сверхсинтез слизи (Kuperman, Huang и др., Nat. Med. 8, 2002, p. 885-889). Исследования с применением растворимого IL-13 рецепторного гибридного белка (sDL-13Ro 2Fc) показали ключевую роль этого цитокина в экспериментальном заболевании воздушных путей, индуцированном аллергеном овальбумином (OVA) (Grunig,
Warnock и др., Science 282, 1998, p. 2261-2263; Wills-Karp, Luyimbazi и др., Science 282, 1998, p. 22582261; Taube, Duez и др., J. Immunol. 169, 2002, p. 6482-6489).
Эффективность лечения антителом к IL-13 (анти-П^-13) также была показана на модельных мышах с хронической астмой. Помимо проявляемых свойств по сверхсекреции слизи и ГДП указанная модель хронической астмы указывает на несколько признаков болезни человека, которые утрачены в более острых моделях. К ним относится эозинофилия ткани легкого, локализованная во внутриэпителиальном пространстве, а также фиброз гладкой мускулатуры, согласно измерениям повышенных отложений коллагена. Модель хронической астмы индуцируется повторными аэрозольными иммунизациями овальбу-мином (OVA) мышей, чувствительных к OVA, один раз в неделю в течение в общей сложности 4 недель. Анти-П^-13 антитело, введенное на протяжении последних 2 недель иммунизации OVA (с 36 суток с эффективностью прочтения, оцененной на 53 сутки исследования), существенно подавляет ГДП, воспаление легких, гиперплазию бокаловидных клеток, сверхсекрецию слизи и фиброз дыхательных путей (Yang, Li и др., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005).
Также был показан терапевтический эффект антагониста IL-13 по подавлению ГДП на модели астмы у примата (Американское торакальное общество, Сан-Диего, 2005).
IL-13 вовлечен в патогенез астмы человека повышенных уровней иРНК IL-13, и белок был обнаружен в легких у пациентов с астмой, коррелирующий с тяжестью заболевания (Huang, Xiao и др., J. Immunol. 155, 1995, p. 2688-2694). Кроме того, были идентифицированы генетические полиморфизмы IL-13, которые приводят к повышенным уровням IL-13 и связаны с астмой и атопией (Heinzmann, Мао и др.,
Hum. Mol. Genet. 9, 2000, p. 549-559; Hoerauf, Kruse и др., Microbes. Infect. 4, 2002, p. 37-42; Vercelli, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2, 2002, p. 389-293; Heinzmann, Jerkic и др., J. Allergy Clin. Immunol. 112, 2003, p. 735-739; Chen, Ericksen и др., J. Allergy. Clin. Immunol. 114, 2004, p. 553-560; Vladich, Brazille и др., J. Clin. Invest., 2005), и повышенные уровни IL-13 были обнаружены в легких пациентов с астмой (Huang, Xiao и др., J. Immunol. 155, 1995, p. 2688-2694; Arima, Umeshita-Suyama и др., J. Allergy Clin. Immunol. 109, 2002, 980-987; Berry, Parker и др., J. Allergy Clin. Immunol. 114, 2004, p. 1106-1109). Генетическая связь IL-13 и астмы была установлена на том основании, что индивидуумы с полиморфизмом в гене IL- 13, который вызывает повышенные уровни IL-13 в плазме, обладают повышенным риском ато-пии и астмы (Wills-Karp, Respir. Res. 1, 2000, p. 19-23).
В связи с ролью IL-13 человека в различных расстройствах человека были разработаны терапевтические подходы для подавления или противодействия действию IL-13. В частности, антитела, которые связывают и нейтрализуют IL-13, рассматривались в качестве средств подавления действия IL-13. Однако в данной области существует потребность в соответствующих и/или улучшенных антителах, способных связывать IL-13, особенно IL-13 человека. В частности, антитела способны нейтрализовать IL-13 человека. Настоящее изобретение предусматривает новое семейство связывающих белков, антител с пересаженными областями CDR, гуманизированных антител и их фрагментов, способных связывать IL-13 человека, причем связывать с высоким сродством, и связывать и нейтрализовать IL-13 человека.
Краткое описание изобретения
Изобретение относится к новым IL-13-специфическим антителам и фрагментам, например к их IL-13-связывающим фрагментам, в частности к нейтрализующим антителам и фрагментам.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает аминокислотную последовательность для каждой из областей CDR 1, 2, 3 из тяжелой цепи (CDR Н) и CDR 1, 2, 3 из легкой цепи (CDR L); аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела крысы; последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи антитела крысы; и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью;
фиг. 2 - последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области легкой цепи антитела крысы; последовательность ДНК вариабельной области и константной области легкой цепи антитела крысы; аминокислотную последовательность легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью;
фиг. 3 - последовательность ДНК легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью; аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы; последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы; аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью;
фиг. 4 - последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы;
фиг. 5 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью;
фиг. 6 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью;
фиг. 7 - аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела; последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела; аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью; последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела;
фиг. 8 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью; последовательность ДНК вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью;
фиг. 9 - аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела; последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела; аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью; последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела;
фиг. 10 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела; аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью; последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела;
фиг. 11 - аминокислотную последовательность и последовательность ДНК акцепторного каркасного участка человека VK 1 2-1-(1)02 JK4 и акцепторного каркасного участка человека VH2 3-1 2-26 JH4;
фиг. 12 - выравнивание легких цепей по антителу крысы, акцепторного каркасного участка и гуманизированных легких цепей, а также тяжелых цепей. Области CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Донорные остатки G49 и R71 выделены жирным шрифтом, курсивом и отмечены чертой сверху;
фиг. 13 - воздействие антитела Ab652 на содержание эотаксина-3 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), измеренное через 24 ч после иммунизации аллергеном. Данные представлены средней величины ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу;
фиг. 14 - воздействие антитела Ab652 на количество эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), измеренное через 24 ч после иммунизации аллергеном. Данные нормализованы по количеству эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) в исследовании на стадии скрининга. Средняя величина ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу;
фиг. 15 - воздействие антитела Ab652 на пик устойчивости воздушных путей, измеренной не позднее 15 мин после иммунизации аллергеном. Данные выражают средней величины ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу;
фиг. 16 - воздействие антитела Ab652 на устойчивость воздушных путей, измеренную через 24 ч после иммунизации аллергеном. Данные нормализованы по устойчивости воздушных путей, измеренной до воздействия аллергена. Средняя величина ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу.
Остатки в вариабельных доменах антитела обычно нумеруют по системе, разработанной Kabat и др. Эта система описана Kabat и др. в кн.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1987, Министерства здравоохранения и социальных служб США, Национального института здравоохранения США, США (в настоящем описании систему нумерации обозначают "Kabat и др."). Эту систему нумерации применяют в настоящем описании, если не указано иначе.
Обозначения остатков по Kabat не всегда прямо соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков. Реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, которые по прямой нумерации по Kabat соответствуют или укорочению, или удлинению за счет инсерции структурного компонента, будь то каркасный участок или комплементарно детерминируемая область (complementarity determining region - CDR), основной вариабельной доменной структуры. Точная нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания гомологичных остатков в последовательности антитела со "стандартно" пронумерованной последовательностью по Kabat.
Комплементарно детерминируемые области (CDR) вариабельного домена тяжелой цепи локализованы по остаткам 31-35 (CDR-H1), по остаткам 50-65 (CDR-H2) и по остаткам 95-102 (CDR-H3) по системе нумерации по Kabat. Однако по нумерации Chothia (Chothia С., Lesk A.M., J. Mol. Biol., 196, 1987, p. 901-917), петлевой эквивалент CDR-H1 имеет протяженность с остатка 26 по остаток 32. Область "CDR-H1", применяемая в настоящем изобретении, включает остатки 26-35, что описано путем комбинирования системы нумерации по Kabat и топологического петлевого выражения по Chothia.
Области CDR вариабельного домена легкой цепи локализованы по остаткам с 24 по 34 (CDR-L1), по остаткам с 50 по 56 (CDR-L2) и по остаткам с 89 по 97 (CDR-L3) по системе нумерации по Kabat.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является антагонистическим антителом.
Понятие "антагонистическое антитело" в контексте настоящего изобретения означает антитело, способное ингибировать и/или нейтрализовать биологическое действие по передаче сигнала IL-13, например, путем блокирования связывания или существенного снижения связывания IL-13 с рецептором IL-13 и таким образом подавляя активирование рецептора.
Антитела для применения в настоящем изобретении могут быть получены каким-либо соответствующим методом, известным в данной области. Полипептид IL-13, в том числе гибридный полипептид, содержащий IL-13, или клетки, (рекомбинантно) экспрессирующие полипептид, могут применяться для получения антител, которые специфически распознают IL-13. Полипептид IL-13 может быть "зрелым" полипептидом или его биологически действующим фрагментом или производным. Полипептиды IL-13 могут быть получены методами, известными в данной области, из генетически сконструированных клеток-хозяев, включающих системы экспрессии, или они могут быть выделены из природных биологических источников. В настоящем описании понятие "полипептиды" означает пептиды, полипептиды и белки. Эти термины используют взаимозаменяемо, если не указано иначе. Полипептид IL-13 в некоторых случаях может быть частью более крупного белка, например гибридного белка, например гибридизован-ного с аффинной меткой.
Антитела, выработанные против полипептида IL-13, могут быть получены, если требуется иммунизация животного, путем введения полипептидов животному, но предпочтительно не человеку, по известным обычным протоколам (см., например, кн.: "Handbook of Experimental Immunology", 1986, под ред. D.M. Weir, изд-во Blackwell Scientific Publishers, Оксфорд, Великобритания, т. 4). Можно иммунизировать многих теплокровных животных, например кроликов, мышей, крыс, овец, коров, верблюдов или свиней. Однако наиболее пригодными для иммунизации являются мыши, кролики, свиньи и крысы.
К антителам для применения в настоящем изобретении относятся целые антитела и их функционально действующие фрагменты или производные, которые могут быть моноклональными, гуманизированными, полностью принадлежащими человеку или химерными антитела, но ими перечень не ограничивается.
Моноклональные антитела могут быть получены каким-либо методом, известным в данной области, например, методом с применением гибридом (Kohler, Milstein, Nature, 256, 1975, p. 495-497), методом с применением триом, методом с применением гибридом В-клеток человека (Kozbor и др., Immunology Today, 4, 1983, с. 72) и методом с применением EBV-гибридом (в кн: "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", 1985, изд-во Alan R Liss, p. 77-96).
Антитела для применения в настоящем изобретении также могут быть получены, используя методы отдельных лимфоцитарных антител путем клонирования и экспрессии кДНК вариабельных областей иммуноглобулинов, полученных от отдельных лимфоцитов, отобранных для выработки специфических антител, например, методами, описанными в работах Babcook J. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15), 1996, p. 7843-78481; WO 92/02551; WO 2004/051268 и WO 2004/106377.
Скрининг антител может проводиться, используя методы измерения связывания с IL-13 и/или методы измерения способности блокировать связывание IL-13 с одним или несколькими из его рецепторов. Примером анализа связывания является метод ELISA, например, в котором используют гибридный белок IL-13, иммобилизованный на планшетах, и применяемое конъюгированное вторичное антитело для обнаружения анти-П^-13 антитела, связанного с IL-13. Примером анализа блокирования является жидкостная цитометрия, основанная на анализе измерения блокирования лигандного белка IL-13, связывающегося с IL-13R. Флуоресцентно меченое вторичное антитело применяют для обнаружения количества ли-гандного белка IL-13, связывающегося с IL-13R.
Гуманизированные антитела (которые включают CDR-пересаженные антитела) являются молекулами антител, включающими одну или несколько комплементарно детерминируемых областей (CDR) от других видов, за исключением человека, и каркасный участок от молекулы иммуноглобулина человека (см., например, US 5585089, WO 91/09967). Следует учесть, что может понадобиться перенести скорее остатки CDR, определяющие специфичность, а не целую область CDR (см., например, Kashmiri и др., Methods, 36, 2005, p. 25-34). Гуманизированные антитела могут необязательно дополнительно включать один или несколько остатков каркасного участка, полученного от других видов, за исключением человека, от которых получены области CDR.
Химерные антитела состоят из элементов, производных от двух разных видов таким образом, что элемент сохраняет свойства вида, от которого он получен. Обычно химерное антитело может включать вариабельную область от одного вида, например мыши, крысы, кролика или другого близкого вида, и константную область от другого вида, например от человека.
Антитела для применения в настоящем изобретении также могут быть получены различными методами фагового дисплея, известными в данной области, включая те, которые описаны Brinkman и др. (J. Immunol. Methods, 182, 1995, p. 41-50), Ames и др. (J. Immunol. Methods, 184, 1995, p. 177-186), Kettlebor-ough и др. (Eur. J. Immunol. 24, 1994, p. 952-958), Persic и др. (Gene, 187, 1997, p. 9-18), Burton и др. (Advances in Immunology, 57, 1994, p. 191-280), а также описанные в WO 90/02809, WO 91/10737,
WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, US 5698426, US 5223409,
US 5403484, US 5580717, US 5427908, US 5750753, US 5821047, US 5571698, US 5427908, US 5516637,
US 5780225, US 5658727, US 5733743 и US 5969108.
В полной мере антителами человека являются те антитела, в которых вариабельные области и константные области (при их наличии) и тяжелой цепи, и легкой цепи, все происходят от человека или в основном идентичны последовательностям, происходящим от человека, но не обязательно от того же антитела. К примерам, которые в полной мере являются антителами человека, могут относиться антитела, полученные, например, описанными выше методами фагового дисплея, и антитела, выработанные мышами, у которых мышиный иммуноглобулин вариабелен, и необязательно гены константной области замещены их аналогами от человека, что описано в общих терминах, например, в EP 0546073, US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5661016, US 5770429, EP 0438474 и EP 0463151.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающее тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает по меньшей мере одну область CDR, имеющую последовательность, приведенную на фиг. 1, SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, CDR, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 для CDR-H2, и/или CDR, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 для CDR-H3.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающее тяжелую цепь, причем по меньшей мере две области из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 вариабельного домена тяжелой цепи выбраны из числа следующих последовательностей: последовательности, представленной SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 для CDR-H2, и последовательности, представленной SEQ ID NO: 3 для CDR-H3. Например, антитело может включать тяжелую цепь, в которой CDR-H1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и CDR-H2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В другом варианте антитело может включать тяжелую цепь, в которой CDR-H1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и CDR-H3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или антитело может включать тяжелую цепь, в которой CDR-H2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и CDR-H3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. Во избежание ошибок следует учитывать, что все перестановки включены.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающее тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 для CDR-Ш, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 для CDR-H2 и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 для CDR-H3.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающее легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает по меньшей мере одну область CDR, имеющую последовательность, представленную в на фиг. 1, SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, область CDR, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и/или область CDR, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающее легкую цепь, причем по меньшей мере две области из числа CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 вариабельного домена легкой цепи выбраны из следующих последовательностей: последовательности, представленной SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, последовательности, представленной SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 для CDR-L3. Например, антитело может включать легкую цепь, в которой CDR-L1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и CDR-L2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. В другом варианте антитело может включать легкую цепь, в которой CDR-L1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и CDR-L3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или антитело может включать легкую цепь, в которой CDR-L2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и CDR-L3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. Во избежание ошибок следует учитывать, что все перестановки включены.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающее легкую цепь, в которой вариабельный домен включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.
Молекулы антител по настоящему изобретению соответственно включают комплементарную легкую цепь или комплементарную тяжелую цепь соответственно.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоя
щему изобретению включает тяжелую цепь, в которой вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 для CDR-H2, или последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, и легкую цепь, в которой вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и/или последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.
Следует учесть, что одно или несколько аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть произведено в областях CDR, предусмотренных в настоящем изобретении, без существенного изменения способности антитела связываться с IL-13 и нейтрализовать действие IL-13. Влияние аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть легко исследовано специалистом в данной области, например, с помощью методов, описанных в настоящем изобретении, особенно тех, которые проиллюстрированы в примерах, для определения связывания IL-13 и подавления взаимодействия IL-13/рецептора IL-13.
Таким образом, настоящее изобретение предусматривает антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, включающего одну или несколько областей CDR, выбранных из CDRH-1 (SEQ ID NO: 1), CDRH-2 (SEQ ID NO: 2), CDRH-3 (SEQ ID NO: 3), CDRL-1 (SEQ ID NO: 4), CDRL-2 (SEQ ID NO: 5) и CDRL-3 (SEQ ID NO: 6), в котором одна или несколько аминокислот в одной или нескольких областях CDR замещены на другую аминокислоту, например, сходную аминокислоту, описанную ниже.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, которое включает CDRH-1 (SEQ ID NO: 1),
CDRH-2 (SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 20), CDRH-3 (SEQ ID NO: 3), CDRL-1 (SEQ ID NO: 4), CDRL-2
(SEQ ID NO: 5) и CDRL-3 (SEQ ID NO: 6), например, в котором одна или несколько аминокислот в одной или нескольких областях CDR замещены на другую аминокислоту, например, сходную аминокислоту, описанную ниже.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает три области CDR, причем последовательность CDRH-1 по меньшей мере на 60% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH-2 по меньшей мере на 60% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и/или CDRH-3 по меньшей мере на 60% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, в которой вариабельный домен тяжелой цепи включает три области CDR, в которых последовательность CDRH-1 по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, CDRH-2 по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и/или CDRH-3 по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3.
Понятие "идентичности" в контексте настоящего изобретения означает, что при каком-либо определенном положении в выравниваемых последовательностях аминокислотный остаток идентичен у двух последовательностей. Понятие "сходства" в контексте настоящего изобретения означает, что в каком-либо определенном положении в выравниваемых последовательностях аминокислотные остатки между последовательностями имеют сходный тип. Например, лейцин может быть замещен на изолейцин или валин. К другим аминокислотам, которые часто могут быть замещены друг на друга, относятся, но ими не ограничиваются
фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты с ароматическими боковыми цепями), лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты с основными боковыми цепями), аспартат и глутамат (аминокислоты с кислотными боковыми цепями), аспарагин и глутамин (аминокислоты с амидными боковыми цепями), и цистеин и метионин (аминокислоты с серосодержащими боковыми цепями).
Степень идентичности и точности может быть легко рассчитана (в кн.: "Computational Molecular Biology", 1988, под ред. Lesk A.M., Oxford University Press, Нью-Йорк; в кн.: "Biocomputing. Informatics and Genome Projects", 1993, под ред. Smith D.W., изд-во Academic Press, Нью-Йорк; в кн.: "Computer Analysis of Sequence Data", 1994, под ред. Griffin A.M., Griffin H.G., изд-во Humana Press, Нью-Джерси, часть 1; в кн.: "Sequence Analysis in Molecular Biology", 1987, von Heinje G., изд-во Academic Press; в кн.: "Sequence Analysis Primer", 1991, под ред. Gribskov M. и Devereux J.M., изд-во Stockton Press, Нью-Йорк) программное обеспечение BLAST(tm) доступно от фирмы NCBI (Altschul S.F. и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, p. 403-410; Gish W., States D.J., Nature Genet. 3, 1993, p. 266-272; Madden T.L. и др., Meth. Enzymol. 266, 1996, p. 131-141; Altschul S.F. и др., Nucleic. Acids. Res. 25, 1997, p. 3389-3402; Zhang J., Madden T.L., Genome Res. 7, 1997, p. 649-656).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает легкую цепь, в которой вариабельный домен легкой цепи включает три области CDR, причем последовательность CDRL-1 по меньшей мере на 60% идентична или сходна с последовательностью,
представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL-2 по меньшей мере на 60% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и/или CDRL-3 по меньшей мере на 60% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает легкую цепь, в которой вариабельный домен легкой цепи включает три области CDR, в которых последовательность CDRH-1 по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, CDRL-2 по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, и/или CDRL-3 по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или сходна с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотренное антитело является моноклональным антителом по настоящему изобретению.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотренное антитело является химерным антителом по настоящему изобретению.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотренное антитело является молекулой CDR-пересаженного антитела, включающего одну или несколько областей CDR, представленных SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, или их вариантов. В контексте настоящего изобретения понятие "молекула антитела с пересаженной областью CDR" относится к молекуле антитела, в которой тяжелая цепь и/или легкая цепь содержит одну или несколько областей CDR (включая при необходимости одну или несколько модифицированных CDR) из антитела-донора (например, моноклонального антитела мыши или крысы), пересаженных в каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела-акцептора (например, антитела человека). По этой теме см. обзор Vaughan и др., Nature Biotechnology, 16, 1998, p. 535-539. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения только один или несколько специфически детерминирующих остатков из одной или нескольких областей CDR, описанных в настоящем изобретении выше, переносят в каркасный участок антитела человека (см., например, Kashmiri и др., Methods, 36, 2005, p. 25-34), что предпочтительнее, чем перенос целой области CDR. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения только специфически детерминируемые остатки из одной или нескольких областей CDR, описанных в настоящем изобретении выше, перенесены в каркасный участок антитела человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения только определяющие специфичность остатки из каждой описанной выше области CDR переносят в каркасный участок антитела человека.
Если пересаживают области CDR или определяющие специфичность остатки, может применяться какая-либо последовательность соответствующей вариабельной области акцепторного каркасного участка, имеющая отношение к классу/типу антитела-донора, от которого происходят области CDR, включая области каркасных участков мыши, обезьяны и человека. Соответствующим образом, антитело с пересаженной областью CDR по настоящему изобретению содержит вариабельный домен, включающий области акцепторного каркасного участка человека, а также одну или несколько областей CDR или определяющие специфичность остатки, описанные выше. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализующее CDR-пересаженное антитело, в котором вариабельный домен включает акцепторные каркасные участки человека и области CDR, происходящие не от человека.
Примерами каркасных участков человека, которые могут применяться в настоящем изобретении, являются участки KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и POM (Rabat и др., см. выше). Например, KOL и NEWM могут применяться для тяжелой цепи, REI может применяться для легкой цепи, a EU, LAY и РОМ могут применяться и для тяжелой цепи, и для легкой цепи. В другом варианте могут применять последовательности зародышевой линии человека; они доступны на сайте http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/.
В антителе по настоящему изобретению с пересаженной областью CDR акцепторные тяжелая и легкая цепи необязательно должны происходить из одного и того же антитела и могут при необходимости включать цепи, содержащие каркасные участки, производные от разных цепей.
Соответствующий каркасный участок для тяжелой цепи CDR-пересаженного антитела по настоящему изобретению происходит от последовательности подгруппы зародышевой линии человека VH2 3-1 2-26 вместе с JH4 (SEQ ID NO: 41). Таким образом, предусмотрено нейтрализующее антитело с пересаженными областями CDR, включающее по меньшей мере одну область CDR от донора, которым не является человек, причем каркасный участок тяжелой цепи является производным от последовательности подгруппы зародышевой линии человека VK2 3-1 2-26 вместе с JH4. Последовательность JH4 человека
следующая: (YFDY)WGQGTLVTVS (SEQ ID NO: 43). Мотив YFDY является частью CDR-H3, но не частью каркасного участка 4 (Ravetch J.V. и др., Cell, 27, 1981, p. 583-591).
Соответствующий каркасный участок для легкой цепи антитела с пересаженной областью CDR по настоящему изобретению произволен от последовательности подгруппы зародышевой линии человека VK1 2-1 1-02 вместе с JK4 (SEQ ID NO: 39). Таким образом, предусматривают нейтрализующее антитело с пересаженной областью CDR, включающее по меньшей мере одну область CDR донора (но не человека), причем каркасный участок легкой цепи является производным от последовательности подгруппы человека 2-1 1-02 вместе с JK4. Последовательность JK4 является следующей: (LT)FGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 44). Мотив LT является частью CDR-L3, но не является частью каркасного участка 4 (Hieter P.A. и др., J. Biol. Chem., 257, 1982, p. 1516-1522).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каркасный участок легкой и/или тяжелой цепи выбран из последовательностей SEQ ID NO: 39-42.
Кроме того, в антителе по настоящему изобретению с пересаженными областями CDR необязательно, чтобы каркасные участки имели в точности ту же последовательность, что и у акцепторного антитела. Например, необычные остатки могут быть заменены на более часто встречаемые остатки для класса или типа акцепторной цепи. В другом варианте выбранные остатки в акцепторных каркасных участках могут быть заменены таким образом, что они соответствуют остатку, обнаруженному в том же положении в антителе-доноре (см. Reichmann и др., Nature, 332, 1998, p. 323-324). Такие изменения следует сохранять для минимизации необходимости восстановления сродства антитела-донора. Протокол для отбора остатков в акцепторных каркасных участках, который может быть понадобиться произвести изменения, представлен в WO 91/09967.
Соответствующим образом, молекула антитела по настоящему изобретению с пересаженными областями CDR, если акцепторная тяжелая цепь имеет последовательность VH2 человека 3-12-26 вместе с JH4, тогда акцепторные каркасные участки тяжелой цепи включают, помимо одной или нескольких областей CDR донора, остаток донора по меньшей мере по одному из положений 49 и 71 (по Kabat и др., (см. выше)) (см. фиг. 12).
Таким образом, предусматривают антитело с пересаженным областями CDR, в котором по меньшей мере остатки в положениях 49 и 71 вариабельного домена тяжелой цепи являются остатками донора.
Остатки донора являются остатками антитела-донора, т.е. антитела, от которого изначально происходят области CDR. Предпочтительно остатки являются глицином и аргинином по положениям 49 и 71, соответственно.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31.
Следует учитывать, что одно или несколько аминокислотных замещений, добавлений и/или деле-ций может быть проведено в вариабельных доменах антитела, предусмотренного в настоящем изобретении, без существенного изменения способности антитела связываться с IL-13 и нейтрализовать действие IL-13. Влияние аминокислотных замещений, добавлений или делеций может быть легко проверено специалистами в данной области, например, с помощью методов, описанных в примерах, для определения связывания IL-13 и/или блокирования лиганда/рецептора.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 31.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 23. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной
SEQ ID NO: 23.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31, и легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 31, и вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 23. Соответствующим образом, антитело включает тяжелую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 31, и легкую цепь, причем вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательно
сти, представленной SEQ ID NO: 23.
Молекулы антитела по настоящему изобретению могут включать молекулу целого антитела с тяжелой цепью и легкой цепью полной длины или с их фрагментом и могут быть, но ими перечень не ограничивается, фрагментом Fab, модифицированными фрагментами Fab, Fab', модифицированными фрагментами Fab', F(ab')2, Fv, однодоменными антителами (например, VH, или VL, или VHH), scFv, двух-, трех-или четырехвалентными антителами, фрагментом Bis-scFv, антителами двойной специфичности, антителами тройной специфичности, антителами специфичности четырех типов и эпитоп-связывающими фрагментами какого-либо из указанных выше соединений (см., например, Holliger и Hudson, Nature Biotech. 23(9), 2005, p. 1126-1136; Adair, Lawson, Drug Design Reviews - Online 2(3), 2005, p. 209-217). Методы создания и получения таких фрагментов антител известны в данной области (см., например, Verma и др., Journal of Immunological Methods, 216, 1998, p. 165-181). К другим фрагментам антител для применения в настоящем изобретении относят фрагменты Fab и Fab', описанные в международных патентных заявках WO 2005/003169, WO 2005/003170 и WO 2005/003171, и фрагменты Fab-dAb, описанные в международной патентной заявке WO 2009/040562. Поливалентные антитела могут обладать множественной специфичностью или могут быть моноспецифическими (см., например, WO 92/22853 и WO 05/113605).
Домены константной области молекулы антитела по настоящему изобретению, если они имеются, могут быть выбраны, учитывая предложенные функции молекулы антитела и, в частности, эффекторные функции, которые могут быть необходимыми. Например, домены константной области могут быть доменами IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, могут применяться домены константной области IgG человека, особенно изотипов IgG1 и IgG3, если молекула антитела предназначена для терапевтических целей и необходимы эффекторные функции антитела. В другом варианте могут применяться изотипы IgG2 и IgG4, если молекула антитела предназначена для терапевтических целей и эффекторные функции антитела не требуются, например, просто для блокирования действия IL-13. Следует учитывать, что варианты последовательности таких доменов константной области также могут применяться. Например, могут применяться молекулы IgG4, в которых серин в положении 241 заменен на пролин согласно описанию Angal и др., Molecular Immunology, 30 (1), 1993, p. 105-108. Специалистам в данной области также следует учитывать, что антитела могут претерпевать различные посттрансляционные модификации. Тип и степень таких модификаций часто зависит от линии клеток-хозяев, применяемых для экспрессии антитела, а также от условий культивирования. К таким модификациям могут относиться вариации гликозилирования, окисления метионина, формирования дикетопиперазина, изомеризации ас-партата и деамидации аспарагина. Часто встречаемой модификацией является утрата карбокси-концевого основного остатка (например, лизина или аргинина) из-за действия карбоксипептидаз (согласно описанному в работе Harris R.J., Journal of Chromatography 705, 1995, p. 129-134). Однако в антителе Ab652 по настоящему изобретению отсутствует С-концевой лизин и в тяжелой, и в легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь антитела включает домен СН1 и легкая цепь антитела включает домен CL, или каппа, или лямбда.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, предусмотренное по настоящему изобретению, является антагонистическим антителом, обладающим специфичностью в отношении IL-13 человека, в котором константная область тяжелой цепи включает модифицированную шарнирную область. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает антитело, в котором тяжелая цепь включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, или состоит из нее.
Следует учесть, что одно или несколько аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть произведено в вариабельных и/или константных доменах, предусмотренных в настоящем изобретении, без существенного изменения способности антитела связываться с IL-13 и нейтрализовы-вать действие IL-13. Влияние аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть легко исследовано специалистом в данной области, например, за счет применения способов, описанных в настоящем изобретении, особенно тех, которые проиллюстрированы в примерах, для определения связывания IL-13 и блокирования взаимодействия IL-13/рецептора IL-13.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь, причем тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 35. Соответствующим образом, антитело включает тяжелую цепь с последовательностью, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 35.
В одном из вариантов осуществления изобретения молекула антитела по настоящему изобретению включает легкую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 27. Например, антитело включает легкую цепь, причем легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 27.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, в котором тяжелая цепь включает или состоит из последовательности, представленной SEQ ID NO: 35, и легкая
цепь включает или состоит из последовательности, представленной SEQ ID NO: 27.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 35, и легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 27. Обычно антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 98% идентична или подобна последовательности, представленной
SEQ ID NO: 27.
Биологические молекулы, например антитела или фрагменты, содержат кислотные и/или основные функциональные группы, тем самым, обеспечивая молекуле сетевой положительный или отрицательный заряд. Количество общего "наблюдаемого" заряда может зависеть от полной аминокислотной последовательности, локальной окружающей среды заряженных групп в структуре 3D и во внешней среде, окружающей молекулы. Изоэлектрическая точка (pI) означает величину pH, при которой определенная молекула или поверхность не несет сетевого электрического заряда. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело или фрагмент по настоящему описанию обладает изоэлектрической точкой (pI), равной по меньшей мере 7. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело или его фрагмент обладает изоэлектрической точкой, равной по меньшей мере 8, например 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 или 9. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения pI антитела равна 8.
Антитело к IL-13 и его фрагменты по настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, чтобы иметь определенную изоэлектрическую точку. В результате могут быть получены антитела и/или фрагменты с более прочными свойствами, в частности с соответствующими профилями растворимости и/или стабильности.
Таким образом, в одном из объектов настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело против IL-13, сконструированное так, чтобы иметь изоэлектрическую точку, отличную от изо-электрической точки исходного идентифицированного антитела. Антитело, например, может быть сконструировано путем замещения аминокислотного остатка, например, замещением кислотного аминокислотного остатка на один или несколько основных аминокислотных остатков. В другом варианте остатки основных аминокислот могут быть добавлены или остатки кислых аминокислот могут быть удалены. В другом варианте, если молекула имеет неприемлемую величину pI, могут быть внедрены кислые остатки для понижения величины pH в случае необходимости. Величина pI сконструированного антитела или фрагмента может, например, составлять величину 8 или более, например 8,5 или 9. Важно, что после изменения величины pI следует позаботиться о том, чтобы сохранить требуемое действие антитела или фрагмента. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сконструированное антитело или фрагмент обладает тем же или в значительной степени тем же действием, что и "немодифицированное" антитело или фрагмент.
Программы, например, ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html и http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html могут применяться для прогнозирования изоэлектрической точки антитела или фрагмента.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению применимы для доставки путем вдыхания, например распылением. В одном из примеров физические свойства антител по настоящему изобретению, например связывающее сродство и эффективность, существенно не изменяются при напылении. В одном из примеров антитела по настоящему изобретению высокостабильны. Одним из показателей стабильности антитела является температура плавления (Tm). Температура плавления может быть определена каким-либо соответствующим методом, известным в данной области, например с применением анализа Thermofluor (Ericsson и др., Analytical Biochemistry 357, 2006, p. 289-298) или DSC (differential scanning calorimetry - дифференциальной сканирующей калориметрии). Предпочтительно антитела, предусмотренные настоящим изобретением, имеют высокую температуру плавления (Tm), обычно по меньшей мере 75°С. В одном из примеров антитело по настоящему изобретению обладает величиной Tm по меньшей мере 75°С. В другом примере антитело по настоящему изобретению обладает величиной Tm по меньшей мере 80°С. В еще одном из примеров антитело по настоящему изобретению обладает величиной Tm по меньшей мере 83°С.
Настоящее изобретение также предусматривает специфическую область или эпитоп IL-13 человека, которые связываются антителом, предусмотренным в настоящем изобретении, в частности антителом, включающим последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 35) и/или последовательность легкой цепи
(SEQ ID NO: 27).
Такая специфическая область или эпитоп полипептида человека IL-13 могут быть идентифицированы каким-либо соответствующим методом картирования эпитопа, известным в данной области, в комбинации с каким-либо из антител, предусмотренных настоящим изобретением. К примерам таких методов относится скрининг пептидов различной длины, производных от IL-13, для связывания антитела по настоящему изобретению с наименьшим фрагментом, который может специфически связываться с антите
лом, содержащим последовательность эпитопа, распознаваемого антителом. Пептиды IL-13 могут быть получены синтетически или протеолитическим расщеплением полипептида IL-13. Пептиды, которые связывают антитело, могут быть идентифицированы, например, методом масс-спектрометрии. В другом примере ЯМР-спектроскопия или рентгеноструктурная кристаллография могут применяться для идентификации эпитопа, связанного антителом по настоящему изобретению. Будучи идентифицированным, фрагмент эпитопа, который связывает антитело по настоящему изобретению, при необходимости может применяться в качестве иммуногена для получения дополнительных антагонистических антител, которые связывают тот же эпитоп.
Антитела, которые перекрестно блокируют связывание антитела по настоящему изобретению, в частности антитело, включающее последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 31) и последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 27), могут быть сходным образом применимы для противодействия активности IL-13. Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, которое перекрестно блокирует связывание какого-либо из антител, описанных выше, с IL-13 человека, и/или перекрестно блокируется в результате связывания IL-13 каким-либо из этих антител. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое антитело связывает тот же эпитоп, что и описанное выше антитело. В другом варианте осуществления настоящего изобретения перекрестно блокирующее нейтрализующее антитело связывает эпитоп, который граничит и/или перекрывается с эпитопом, связываемым антителом, описанным в настоящем изобретении выше. В другом варианте осуществления настоящего изобретения перекрестно блокирующее нейтрализующее антитело по данному объекту настоящего изобретения не связывается с тем же эпитопом, что и антитело по настоящему изобретению, или с эпитопом, который граничит и/или перекрывается с указанным эпитопом.
Перекрестно блокирующие антитела могут быть идентифицированы, используя какой-либо соответствующий метод, известный в данной области, например, используя метод конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или метод BIAcore, если связывание перекрестно блокирующего антитела с IL-13 человека предупреждает связывание антитела по настоящему изобретению или vice versa.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антагонистическое антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека, которое перекрестно блокирует связывание антитела, чья тяжелая цепь включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и чья легкая цепь включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27 с IL-13 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения перекрестно блокирующие антитела, предусмотренные настоящим изобретением, ингибируют связывание антитела, включающего последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 35, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 27, больше чем на 80%, например больше чем на 85%, например больше чем на 90%, особенно больше чем на 95%.
В другом варианте или дополнительно антагонистические антитела по данному объекту настоящего изобретения могут быть перекрестно блокированы в результате связывания с IL-13 человека антителом, включающим последовательность тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 35, и последовательность легкой цепи, представленной SEQ ID NO: 27. В настоящем изобретении также предусмотрена молекула антагонистического антитела, обладающая специфичностью в отношении IL-13 человека, который перекрестно блокируется в результате связывания IL-13 человека антителом, включающим последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 35, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 27. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антагонистические антитела, предусмотренные по данному объекту настоящего изобретения, подавляются в результате связывания IL-13 человека антителом, включающим последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 35, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 27, более чем на 80%, например более чем на 85%, например более чем на 90%, особенно более чем на 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела перекрестного блокирования по настоящему изобретению, которые полностью являются антителами человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела перекрестного блокирования по настоящему изобретению, которые являются гуманизированными антителами. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела перекрестного блокирования по настоящему изобретению, которые обладают сродством в отношении IL-13 человека, составляющим 100 пМ или или более высоким. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела перекрестного блокирования по настоящему изобретению, которые обладают сродством в отношении IL-13 человека, составляющим 50 пМ или более.
В одном из вариантов осуществления изобретения предусмотрены антитела перекрестного блокирования по настоящему изобретению, которые обладают изоэлектрической точкой, составляющей, по меньшей мере, величину 7, например по меньшей мере 8, например 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0.
Молекулы антител по настоящему изобретению соответствующим образом обладают высоким связывающим сродством, особенно исчисляемым в пикомолях. Сродство можно измерить, используя какой
либо соответствующий метод, известный в данной области, включая поверхностный плазмонный резонанс, в том числе метод BIAcore, согласно описанному в настоящем изобретении в примерах, используя выделенный природный или рекомбинантный IL-13. В одном из примеров сродство измеряют, используя рекомбинантный IL-13 человека согласно описанному в настоящем изобретении в примерах. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 100 пМ или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 50 пМ или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 40 пМ или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 30 пМ или более . В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 20 пМ или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению полностью является молекулой антитела человека или гуманизирована и обладает связывающим сродством, составляющим примерно 100 пМ или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению полостью является молекулой антитела человека или гуманизирована и обладает связывающим сродством, составляющим примерно 30 пМ или более.
Следует учитывать, что сродство антител, предусмотренных настоящим изобретением, может быть изменено каким-либо соответствующим методом, известным в данной области. Таким образом, настоящее изобретение также относится к вариантам молекул антител по настоящему изобретению, обладающими улучшенным сродством в отношении IL-13. Такие варианты могут быть получены по ряду протоколов для вызревания сродства, включая мутирование областей CDR (Yang и др., J. Mol. Biol., 254, 1995, p. 392-403), перетасовку цепи (Marks и др., Bio/Technology, 10, 1992, p. 779-783), применение мутаторных штаммов Е.coli (Low и др., J. Mol. Biol., 250, 1996, p. 359-368), перетасовку ДНК (Patten и др., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 1997, p. 724-733), фаговый дисплей (Thompson и др., J. Mol. Biol., 256, 1996, p. 77-88) и половую ПЦР (Crameri и др., Nature, 391, 1998, p. 288-291). Vaughan и др. (см. выше) описывают такие методы вызревания сродства.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы антитела по настоящему изобретению блокируют взаимодействие между IL-13 и рецептором IL-13, в частности молекулы антитела по настоящему изобретению блокируют взаимодействие между IL-13 и IL-13Ra1 и взаимодействие между IL-13 и IL-13 Ra2. Многочисленные исследования, позволяющие определять способность антитела блокировать это взаимодействие, описаны в настоящем изобретении в примерах. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено нейтрализирующее антитело, обладающее специфичностью в отношении IL-13 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептором IL-13 человека, применяемым в исследовании, является природный IL-13 Ra1 человека или природный IL-13Ra2 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептором IL-13 человека, применяемым в исследовании, является рекомбинантный IL-13 Ra1 человека или рекомбинантный IL-13Ra2 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения IL-13 человека, применяемым в исследовании, является рекомбинантный IL-13 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело является гуманизированным или полностью принадлежащим человеку антителом или его фрагментом.
При необходимости антитело для применения в настоящем изобретении может быть конъюгирова-но с одной или несколькими эффекторными молекулами. Следует учитывать, что эффекторная молекула может включать одну эффекторную молекулу или две или несколько таких молекул, связанных таким образом, что они формируют одну часть молекулы, которая может быть присоединена к антителам по настоящему изобретению. Если требуется получить фрагмент антитела, связанный с эффекторной молекулой, он может быть получен стандартными химическими или рекомбинантными методами манипуляции ДНК - методами, в которых фрагмент антитела связывают прямо или через соединяющий агент с эффекторной молекулой. Методы конъюгации таких эффекторных молекул с антителами известны в данной области (см. кн.: Hellstrom и др. "Controlled Drug Delivery", 1987, 2-е изд., под ред. Robinson и др., p. 623-653; Thorpe и др., Immunol. Rev., 62, 1982, p. 119-158; Dubowchik и др., Pharmacology and Therapeutics, 83, 1999, p. 67-123). Определенные химические методы включают, например, методы из патентов WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 и WO 03031581. В другом варианте, если эффекторная молекула является белком или полипептидом, связь может быть достигнута методами рекомбинации ДНК, например, описанными в WO 86/01533 и EP 0392745.
К понятию "эффекторная молекула" в контексте настоящего изобретения относятся, например, ан-тинеопластические агенты, лекарственные средства, токсины, белки биологического действия, например ферменты, другие антитела или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, особенно радиоак
тивные иодиты, радиоизотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, например флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть обнаружены с помощью ЯМР или электронной спиновой резонансной спектроскопии (ЭСР).
Примеры эффекторных молекул могут включать цитотоксины или цитотоксические агенты, включающие какой-либо агент, губительный для клетки (например, убивающий клетку). К примерам относятся комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин, мэйтанзиноиды, спонгистатины, ризоксин, галихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, гигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокор-тикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги и гомологи.
К эффекторным молекулам также относятся, но ими не ограничиваются, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, меклоретамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфан бусульфан, дибромманит, стрептозотоцин, митомицин С, и цис-дихлордиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее называвшийся дауноми-цином) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее называвшийся актиномицином), блеомицин, митрамицин, антрамицин (AMC), калихимицины или дуокармицины), и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).
К другим эффекторным молекулам могут относиться хелатированные радионуклиды, например 111In и 90Y, Lu177, висмут213, калифорнии252, иридий192 и вольфрам188/рений188; или лекарственные средства, например, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин, но ими перечень не ограничивается.
К другим эффекторным молекулам относятся белки, пептиды и ферменты. Целевые ферменты включают, но ими не ограничиваются, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. Целевые белки, полипептиды и пептиды включают, но ими не ограничиваются, иммуноглобулины, токсины, например абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад, или дифтерийный токсин, белок, например, инсулин, фактор некроза опухоли, а-интерферон, р-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или активатор тканевого плазминогена, тромбический агент или анти-ангиогенный агент, например ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологического ответа, например лимфокин, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальный ко-лониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (granulocyte colony stimulating factor - G-CSF), фактор роста нервов (nerve growth factor - NGF) или другой фактор роста и иммуноглобулины.
К другим эффекторным молекулам могут относиться выявляемые вещества, применимые, например, в диагностике. К примерам выявляемых веществ относятся различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные нуклиды, металлы с эмиссией позитронов (для применения в политронной эмиссионной томографии) и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. См. US 4741900 по ионам металлов, которые могут конъюгировать с антителами для применения в диагностике. К соответствующим примерам относятся пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; к соответствующим простетическим группам относятся стрептавидин, авидин и биотин; соответствующие флуоресцентные материалы, к которым относятся умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоциа-нат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансил хлорид и фикоэритрин; к соответствующим люминесцентным материалам относится люминол; к соответствующим биолюминесцентным материалам относятся люцифераза, люциферин и экворин; к соответствующим радиоактивным нуклидам относятся 125I, 131I, 111In и 99Tc.
В другом примере эффекторная молекула может повысить период полураспада антитела in vivo, и/или понизить иммуногенность антитела, и/или повысить доставку антитела через эпителиальный барьер к иммунной системе. К примерам соответствующих эффекторных молекул данного типа относятся полимеры, альбумин, альбумин-связывающие белки или альбумин-связывающие соединения, например,
описанные в WO 05/117984.
Если эффекторная молекула является полимером, она может быть синтетическим или природным полимером, например, необязательно замещенным прямым или разветвленным полиалкиленовым, поли-алкениленовым или полиоксиалкиленовым полимером или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например, гомо- или гетерополисахаридом.
К специфическим необязательным заместителям, которые могут присутствовать на указанных выше синтетических полимерах, относятся одна или несколько гидроксигрупп, метильных групп или ме-токсигрупп.
К специфическим примерам синтетических полимеров относятся необязательно замещенные прямые или разветвленные поли(этиленгликоли), поли(пропиленгликоли), поли(виниловые спирты) или их производные, особенно необязательно замещенные поли(этиленгликоли), например метоксиполи(этилен-гликоли) или их производные.
Специфические природные полимеры включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные.
В контексте настоящего изобретения понятие "производные" относится к радиоактивным производным, например, тиол-селективным реакционным группам, например, малеимидам и др. Реакционная группа может быть связана непосредственно или через сегмент линкера с полимером. Следует принять во внимание, что остаток такой группы может в некоторых веществах формировать часть продукта лин-керной группы между фрагментом антитела и полимером.
Размер полимера при необходимости можно варьировать, но обычно может находиться в среднем диапазоне молекулярной массы от 500 до 50000 Да, например от 5000 до 40000 Да, например от 20000 до 40000 Да. Размер полимера в частности может быть выбран в зависимости от применения продукта, например, его способности локализоваться в определенных тканях, например в опухолях, или продлевать период полураспада при циркуляции в организме (см. обзор Chapman, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 2002, p. 531-545). Таким образом, например, если предназначено, чтобы продукт покинул кровеносное русло и проник в ткань, он может быть благоприятным для применения низкомолекулярного полимера, например, с молекулярной массой примерно 5000 Да. Для тех применений, когда продукт сохраняется в кровеносном русле, может быть полезным применение полимера с повышенной молекулярной массой, например, с молекулярной массой в диапазоне от 20000 до 40000 Да.
Соответствующие полимеры включают полиалкиленовые полимеры, например поли(этилегликоль) или, особенно, метоксиполиэтиленгликоль или его производное, и особенно с молекулярной массой в диапазоне примерно от 15000 до примерно 40000 Да.
В одном примере антитела для применения в настоящем изобретении присоединены к по-ли(этиленгликолевым) (ПЭГ) частям молекул. В одном предпочтительном примере антитело является фрагментом антитела и молекулы ПЭГ могут быть присоединены через какую-либо доступную аминокислотную боковую цепь или концевую аминокислотную функциональную группу, локализованную во фрагменте антитела, например через какую-либо аминогруппу, иминогруппу, тиоловую, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут естественным образом присутствовать во фрагменте антитела или могут быть сконструированы во фрагменте, используя методы рекомбинации ДНК (см., например, US 5219996, US 5667425, WO 98/25971). В одном из примеров молекула антитела по настоящему изобретению является модифицированным фрагментом Fab, причем модификация является дополнением по С-концу одной или нескольких аминокислот тяжелой цепи, что позволяет присоединять эффекторную молекулу. Соответствующим образом дополнительные аминокислоты формируют модифицированную шарнирную область, содержащую один или несколько цистеиновых остатков, к которым может быть присоединена эффекторная молекула. Многочисленные сайты могут быть применены для присоединения двух или нескольких молекул ПЭГ.
Соответствующим образом молекулы ПЭГ могут быть ковалентно связаны через тиоловую группу по меньшей мере одного остатка цистеина, локализованного во фрагменте антитела. Каждая молекула полимера, присоединенная к фрагменту модифицированного антитела, может быть ковалентно связана с атомом серы в остатке цистеина, локализованном во фрагменте. Ковалентная связь обычно может быть дисульфидной связью или, в частности, связью сера-углерод. Если тиоловую группу применяют в качестве точки присоединения соответствующим образом активированных эффекторных молекул, например тиоловых избирательных производных, например, могут применяться малеимиды и производные цис-теина. Активированный полимер может применяться в качестве исходного материала при получении модифицированных полимером фрагментов антител, согласно описанному выше. Активированный полимер может быть каким-либо полимером, содержащим тиоловую реакционноспособную группу, например, а-галогенкарбоновую кислоту или эфир, например иодоацетамид, имид, например, малеимид, ви-нил-сульфон или дисульфид. Такие исходные материалы могут быть коммерческими (например, фирмы Nektar, ранее называвшейся Shearwater Polymers Inc., Huntsville, Алабама, США) или могут быть получены из коммерчески доступных исходных материалов с помощью обычных химических методов. Некоторые молекулы ПЭГ включают 20К метокси-ПЭГ-амин (получаемый от фирмы Nektar, ранее называвшейся Shearwater, фирмы Rapp Polymere и фирмы SunBio) и М-ПЭГ-SPA (получаемый от фирмы Nektar, ранее называвшейся Shearwater).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело представляет модифицированный фрагмент Fab или ПЭГелированный фрагмент diFab, т.е. обладающий ковалентно присоединенным ПЭГ (поли(этиленгликолем)), например, по методу, описанному в EP 0948544 или EP 1090037 [см. также кн.: "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, под ред. J. Milton Harris, изд-во Plenum Press, Нью-Йорк; кн.: "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, под ред. J. Milton Harris и S. Zalipsky, American Chemical Society, Вашингтон, округ Колумбия; в кн.: "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, изд-во М. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, Нью-Йорк; Chapman A., Advanced Drug Delivery Reviews 54, 2002, p. 531-545]. В одном из примеров ПЭГ присоединен к цистеину в шарнирной области. В одном из примеров ПЭГ-модифицированный фрагмент Fab содержит малеимидную группу, ковалентно связанную с одной тиоловой группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина может быть кова
лентно связанным с малеимидной группой, и к каждой из аминных групп в остатке лизина может быть присоединен полимер метоксиполи(этиленгликоль) с молекулярной массой примерно 20000 Да. Суммарная молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к фрагменту Fab, таким образом может примерно составлять 40000 Да.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают молекулу антагонистического антитела, обладающую специфичностью в отношении IL-13 человека, которая является модифицированным фрагментом Fab', имеющим тяжелую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, и имеющую с С-конца тяжелой цепи модифицированную шарнирную область, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина, к которому присоединена эффекторная молекула. Соответствующим образом эффекторной молекулой является ПЭГ, который присоединяют методами, описанными в WO 98/25971 и WO 2004072116 или в WO 2007/003898. Эффекторные молекулы могут быть присоединены к фрагментам антител, используя методы, описанные в международных патентных заявках WO 2005/003169, WO 2005/003170 и WO 2005/003171.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к антителу или фрагменту не присоединена эффекторная молекула.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенную последовательность ДНК, кодирующую тяжелую и/или легкую цепь (цепи) молекулы антитела по настоящему изобретению. Соответствующим образом последовательность ДНК кодирует тяжелую или легкую цепь молекулы антитела по настоящему изобретению. Последовательность ДНК по настоящему изобретению может включать синтетическую ДНК, например, получаемую химической обработкой, например кДНК, геномную ДНК или какую-либо их комбинацию.
Последовательности ДНК, кодирующие молекулу антитела по настоящему изобретению, могут быть получены методами, известными специалистам в данной области. Например, последовательности ДНК, кодирующие частично или полностью тяжелые и легкие цепи антитела, могут быть синтезированы, исходя из установленных последовательностей ДНК или на основании соответствующих аминокислотных последовательностей.
ДНК, кодирующая последовательности акцепторных каркасных участков, доступна и широко используется специалистами в данной области и может быть легко синтезирована, исходя из известных аминокислотных последовательностей.
Стандартные методы молекулярной биологии могут применяться для получения последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела по настоящему изобретению. Требуемые последовательности ДНК могут быть синтезированы полностью или частично, используя методы синтеза олигонуклеотидов. Могут применяться соответствующие методы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Примеры соответствующих последовательностей предусмотрены в настоящем изобретении. Соответствующий сигнальный пептид для тяжелой цепи может кодироваться, например, сигнальным пептидом мыши MEWSWVFLFF LSVTTGVHS (SEQ ID NO: 45). Соответствующий сигнальный пептид для легкой цепи может кодироваться, например, сигнальным пептидом мыши MSVPTQVLGL LLLWLTDARC (SEQ ID NO: 46), который расщепляется с образованием молекулы антагонистического антитела по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также предусматривает выделенную последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела по настоящему изобретению, которая включает последовательности SEQ ID NO: 32, 34 или 36 или 38. Настоящее изобретение также предусматривает выделенную последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела по настоящему изобретению, которая включает последовательности SEQ ID NO: 24, 26, 28 или 30.
Основные методы, с помощью которых векторы могут быть сконструированы, методы трансфекции и методы культивирования, известны специалистам в данной области. По методам см. кн.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, под ред. F.M. Ausubel, изд-во Wiley Interscience, Нью-Йорк, и в кн.: "Maniatis Manual", изд-во Cold Spring Harbor Publishing.
Также предусматривают клетку-хозяина, включающую один или несколько векторов экспрессии или клонирования, которые включают одну или несколько последовательностей ДНК, кодирующих антитело по настоящему изобретению. Какая-либо соответствующая клетка-хозяин/система вектора может применяться для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела по изобретению. Может применяться бактериальная микробная система, например Е.coli, и другие микробные системы, или эукариотические, например системы экспрессии клеток-хозяев млекопитающих. К соответствующим клеткам-хозяевам млекопитающих относятся клетки CHO, клетки миеломы или гибридомы.
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения молекулы антитела по настоящему изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор по настоящему изобретению в условиях, приводящих к экспрессии белка с ДНК, кодирующей молекулу антитела по настоящему изобретению, и к выделению молекулы антитела.
Молекула антитела может включать только полипептид тяжелой или легкой цепи, в этих случаях только кодирующая последовательность полипептида тяжелой цепи или легкой цепи должна быть ис
пользована для трансфекции клеток-хозяев. Для получения продуктов, включающих и тяжелую, и легкую цепи, линия клеток может быть трансфицирована двумя векторами, из которых первый вектор кодирует полипептид легкой цепи, и второй вектор кодирует полипептид тяжелой цепи. В другом варианте могут применять один вектор, включающий последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.
Антитела и фрагменты по настоящему изобретению экспрессируются клетками-хозяевами с хорошими уровнями. Таким образом, свойства антител и/или фрагментов представляются оптимизированными и пригодными для коммерческого процессинга.
Поскольку антитела по настоящему изобретению применимы для лечения и/или профилактики патологического состояния, настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую или диагностическую композицию, включающую молекулу антитела по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, растворителями или носителем. Таким образом, предусматривают применение антитела по настоящему изобретению для получения лекарственного средства.
Композиция обычно может быть поставлена части стерильной фармацевтической композиции, которая в норме включает фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый адъювант.
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения фармацевтической или диагностической композиции, включающий добавление и смешивание молекул антитела по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, растворителями или носителями.
Молекула антитела может быть единственным действующим ингредиентом в фармацевтической или диагностической композиции или может дополняться другими действующими ингредиентами, включая другие ингредиенты антител, например антитела анти-TNF, анти-П^-1р, анти-Т-клетки, анти-IFNy или анти-LPS, или ингредиенты, не являющиеся антителами, например ксантины. К другим соответствующим действующим ингредиентам относятся антитела, способные индуцировать устойчивость, например антитела анти-CD3 или анти-CD4.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, фрагмент или композицию по настоящему описанию применяют в комбинации с фармацевтически действующим агентом, например кортикостероидом (например, флутиказоном пропионатом) и/или бета-2-агонистом (например, салбута-молом, салметеролом или формотеролом) или ингибиторами роста и пролиферации клеток (например, рапамицином, циклофосфаном, метотрексатом) или в другом варианте с ингибитором CD28 и/или CD40. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитором является низкомолекулярное соединение. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором является антитело, специфическое в отношении мишени.
Фармацевтические композиции соответствующим образом включают терапевтически эффективное количество антитела по настоящему изобретению. Понятие "терапевтически эффективное количество" в контексте настоящего изобретения относится к количеству терапевтического агента, необходимого для лечения, облегчения состояния или предупреждения заболевания или состояния, на которые нацелен агент, или для проявления выявляемого терапевтического или профилактического эффекта. Для какого-либо антитела терапевтически эффективное количество может быть сначала оценено или в анализе с применением культуры клеток, или на животных моделях, обычно в грызунах, кроликах, собаках, свиньях или приматах. Модель животного также может применяться для определения соответствующего диапазона концентрации и способа введения. Такая информация затем может применяться для определения соответствующих доз и способов введения людям.
Определенное терапевтически эффективное количество для человека может зависеть от тяжести заболевания, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы тела и пола субъекта, питания, времени и частоты введения, комбинации (комбинаций) лекарственных средств, реакции чувствительности и устойчивости/ответа на лечение. Такое количество может быть определено в ходе обычного эксперимента и зависит от решения лечащего врача. Обычно терапевтически эффективное количество может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг. В другом варианте доза может составлять 1-500 мг/сутки, например от 10 до 100, 200, 300 или 400 мг/сутки. Фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в форме стандартных доз, содержащих заранее определенное количество действующего агента по настоящему изобретению.
Композиции могут вводиться отдельно пациенту или могут вводиться в комбинации (например, одновременно, последовательно или раздельно) с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.
Доза, в которой вводят молекулу по настоящему изобретению, зависит от природы состояния, подвергаемого лечению, степени имеющегося воспаления и от того, применяют ли молекулу антитела профилактически или для лечения имеющегося состояния.
Частота дозирования может зависеть от периода полураспада молекулы антитела и длительности этого эффекта. Если молекула антитела обладает коротким периодом полураспада (например, 2-10 ч), может потребоваться вводить одну или несколько доз в сутки. В другом варианте, если молекула антитела имеет длинный период полураспада (например, 2-15 суток), может потребоваться вводить дозу один раз в сутки, один раз в неделю или даже один раз каждые 1-2 месяца.
Фармацевтически приемлемый носитель сам не должен индуцировать выработку антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, и не должен быть токсичным. Соответствующие носители могут быть крупными, медленно метаболизируемыми макромолекулами, например белками, полипептидами, липосомами, полисахаридами, полимерами молочной кислоты, полигликолевыми кислотами, полимерами аминокислот, сополимерами аминокислот и инактивированных вирусных частиц.
Могут применяться фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, например гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, например ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно включать жидкости, например воду, физиологический раствор, глицерин и этанол. Дополнительно в таких композициях могут содержаться вспомогательные вещества, например увлажняющие или эмульгирующие агенты, или вещества для забуферивания pH. Такие носители позволяют перерабатывать фармацевтические композиции в таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, гидросмеси и суспензии для проглатывания пациентом.
К соответствующим формам для введения относятся формы, пригодные для парентерального введения, например путем инъекции или инфузии, например болюсной инъекции или непрерывной инфу-зии. Если продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может быть представлен в форме суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном растворителе и может содержать соответствующие форме агенты, например суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/ или диспергирующие агенты. В другом варианте молекулы антитела могут быть в сухой форме для восстановление перед применением с помощью соответствующей стерильной жидкости.
Будучи переработанными, композиции по настоящему изобретению могут вводиться непосредственно субъекту. Субъектами, подвергаемыми обработке, могут быть животные. Однако в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения композиции адаптированы для введения людям.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в составах по настоящему изобретению величина pH итогового раствора отличается от величины изоэлектрической точки антитела или фрагмента, причем если pH состава составляет 7, тогда величина pI 8-9 или выше может быть приемлемой. Не давая какого-либо теоретического обоснования, высказывают предположение, что такое положение может в конечном счете обеспечить итоговый состав с улучшенной стабильностью, например, антитела или фрагмента, сохраняющегося в растворе.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться каким-либо из способов, включающих введение пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интра-медуллярное, внутриоболочечное, внутрижелудочковое, чрескожное (например, см. WO 98/20734), подкожное, внутрибрюшинное, внутриназальное, энтеральное, местное, подъязычное, внутривлагалищное или ректальное, но ими перечень способов введения не ограничивается. Гипоспреи (безыгольные инжекторы) также могут применяться для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Обычно терапевтические композиции могут быть получены в инъекционных формах, или жидких растворов, или суспензий. Также могут быть получены твердые формы, пригодные для раствора или суспензии в жидком растворителе перед инъекцией. Предпочтительно молекулы антител по настоящему изобретению вводят подкожно, ингаляцией или местно.
Непосредственное введение композиций обычно проводится с помощью подкожной, внутрибрю-шинной, внутривенной или внутримышечной инъекции или доставкой в межтканевое пространство. Композиции также могут вводиться в определенную специфическую ткань. Дозированное лечение может быть по схеме введения одной дозы или по схеме многократного дозирования.
Следует учитывать, что действующий ингредиент в композиции может быть молекулой антитела. При этом он может быть чувствительным к разрушению в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композицию вводят через желудочно-кишечный тракт, композиция должна содержать агенты, которые защищают антитело от разрушения, но которые высвобождают антитело, поскольку она всасывается из желудочно-кишечного тракта.
С исчерпывающим анализом фармацевтически приемлемых носителей можно ознакомиться в кн.: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1991, изд-во Mack Publishing Company, Нью-Джерси.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают состав для местного применения, в том числе для ингаляции.
Соответствующие препараты для ингаляции включают порошки для вдыхания, мерные аэрозоли, содержащие газы под давлением или ингаляционные растворы, не содержащие газы под давлением (например, распыляемые растворы или суспензии). Ингаляционные порошки по настоящему изобретению,
содержащие действующее вещество, могут включать исключительно указанные выше действующие вещества или смесь указанных выше действующих веществ с физиологически приемлемым эксципиентом.
Такие ингаляционные порошки могут включать моносахариды (например, глюкозу или арабинозу), дисахариды (например, лактозу, сахарозу, мальтозу), олиго- и полисахариды (например, декстраны), многоатомные спирты (например, сорбит, маннит, ксилит), соли (например, натрий хлорид, кальций карбонат) или их смеси. Соответствующим образом используемые моно- или дисахариды, лактоза или глюкоза, обычно, но не исключительно, применяются в форме гидратов.
Частицы для отложения в легких должны иметь размер частиц менее 10 мкм, например 1-9 мкм, например 0,1-5 мкм, в частности 1-5 мкм. Размер действующих частиц, например антитела или фрагмента антитела, особенно важен.
Газы под давлением, которые могут применяться для получения ингаляционных аэрозолей, известны в данной области. Соответствующие газы под давлением отбирают среди углеводов, например п-пропана, н-бутана или изобутана, и галогенуглеводородов, например хлор- и/или фтор-производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Указанные выше газы под давлением могут применяться по отдельности или в смесях.
Особенно приемлемыми газами под давлением являются производные галогенированных алканов, выбранные из TG 11, TG 12, TG 134а и TG227. Среди указанных выше галогенуглеводородов особенно применимы TG134a (1,1,1,2-тетрафторэтан) и TG227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан) и их смеси.
Ингаляционные аэрозоли, содержащие газ под давлением, также могут содержать другие ингредиенты, например сопутствующие растворители, стабилизаторы, поверхностно-активные агенты (поверхностно-активные вещества, ПАВ), антиоксиданты, смазывающие агенты и средства для поддержания величины pH. Все эти ингредиенты известны в данной области.
Ингаляционные аэрозоли, содержащие газ под давлением, также могут содержать действующее вещество до 5 мас.%. Аэрозоли по настоящему изобретению содержат, например, 0,002-5, 0,01-3, 0,015-2, 0,1-2, 0,5-2 или 0,5-1 мас.% действующего вещества.
В другом варианте местное введение в легкие раствора или суспензии состава осуществляют, например, с помощью устройства небулайзера, например небулайзера, соединенного с компрессором (например, небулайзера Pari LC-Jet Plus(R), соединенного с компрессором Pari Master(R) фирмы Pari Respiratory Equipment, Inc., Ричмонд, Вирджиния).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен состав в отдельных ампулах, содержащих стандартную дозу для доставки путем распыления.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело в лиофили-зированной форме для восстановления или в другом варианте состава-суспензии.
Антитело по изобретению может доставляться диспергированным в растворителе, например в форме раствора или суспензии. Оно может быть суспендировано в соответствующем физиологическом растворе, например в физрастворе, в фармацевтически приемлемом растворителе или буферном растворе. Буферные растворы, известные в данной области, могут содержать 0,05-0,15 мг динатриевого эдитата, 8,0-9,0 мг NaCl, 0,15-0,25 мг полисорбата, 0,25-0,30 мг безводной лимонной кислоты и 0,45-0,55 мг цитрата натрия в 1 мл воды таким образом, чтобы достичь величины, примерно равной pH 4,0-5,0. Выше было указано, что суспензия может быть получена, например, из лиофилизированного антитела.
Терапевтические составы для растворов и суспензий также могут содержать один или несколько эксципиентов. Эксципиенты известны в данной области и включают буферы (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), EDTA, натрий хлорид, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии могут быть инкапсулированы в ли-посомы или биоразрушаемые микросферы. Состав обычно предусматривают главным образом в стерильной форме, которую получают в ходе стерильных процессов.
Также могут предусматриваться процессы получения и стерилизации путем фильтрации буферного раствора растворителя, применяемого для получения состава, асептической суспензии антитела в стерильном буферном растворе растворителя и распределение состава в стерильные емкости методами, известными рядовым специалистам в данной области.
Состав для распыления по настоящему изобретению может быть предусмотрен, например, отдельных стандартных доз (например, в запечатанных пластиковых контейнерах или в ампулах), упакованных в фольгу. Каждая ампула содержит стандартную дозу в объеме, например, 2 мл, растворителя/буферного раствора.
Полагают, что антитела по настоящему изобретению применимы для доставки путем распыления.
Также предусматривают, что антитело по настоящему изобретению может вводиться с помощью генной терапии. Чтобы этого добиться, последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи молекулы антитела под контролем соответствующих компонентов ДНК, интродуцированы в пациента таким образом, что цепи антитела экспрессируются с последовательностей ДНК и собираются in situ.
Настоящее изобретение также предусматривает молекулу антитела (или композиции, включающие ее) для применения в лечении воспалительных заболеваний, например острого или хронического воспалительного заболевания. Соответствующим образом молекула антитела (или композиции, включающие ее) могут применяться для уменьшения воспалительного процесса или для предупреждения воспалительного процесса. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено снижение in vivo активированных Т-клеток, в частности тех, которые вовлечены в ненадлежащие воспалительные иммунные ответы, например рекрутированные поблизости/в месте локализации такого ответа.
Снижение активированных Т-клеток, осуществляемое в настоящем изобретении, может на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более по сравнению с их количеством до лечения или при отсутствии лечения.
Преимущественно лечение антителом, фрагментом или композицией по настоящему изобретению может допустить понижение уровня активированных Т-клеток без снижения у пациентов общего уровня Т-клеток (неактивных Т-клеток). Это может привести к ослабленным побочным эффектам и возможно предотвращает истощение Т-клеток у пациента.
Настоящее изобретение также предусматривает молекулу антитела по настоящему изобретению для применения в лечении или профилактике патологического расстройства, опосредованного IL-13 или связанного с повышенным уровнем IL-13.
Патологическое состояние или расстройство, например, может быть выбрано из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибных и паразитарных), эндотоксического шока, ассоциированного с инфекцией, артрита, например ревматоидного артрита, астмы, например тяжелой астмы, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), воспаления тазовых органов, болезни Альцгей-мера, воспаления кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрона, целиакии, холецистита, пилонидального заболевания, перитонита, псориаза, васкулита, спаек после хирургического вмешательства, удара, диабета I типа, болезни Лайма, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, болезни центральной и периферической нервной системы, вызванные иммуноопосредованным воспалением, например рассеянного склероза, волчанки (например, системной красной волчанки) и синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, базедовой болезни, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пемфигуса, первичного билиарного цирроза печени, саркоидоза, склеродермы, гранулематоза Вегенера, других аутоиммунных расстройств, панкреатита, травмы (хирургической), заболевания трансплантат-против-хозяина, отторжения трансплантата, болезни сердца, включая ишемические заболевания, например инфаркт миокарда и атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбцию костей, остеопороз, остео-артрит, периодонтит и гипохлоргидрию.
Настоящее изобретение также предусматривает молекулу антитела по настоящему изобретению для применения в лечении или профилактике боли, особенно боли, ассоциированной с воспалением.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению снижает устойчивость к лечению воспаления, особенно устойчивости легких к лечению воспаления.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению снижает уровни белка IL-13 в бронхиальной ткани, например, по сравнению с уровнями до лечения. Снижение может быть на 5, 10, 20, 30, 40% или более.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению снижает уровни белка IL-13 в жидкости после промывки носа и/или в бронхоальвеолярной жидкости, например, по сравнению с уровнями до лечения. Снижение может быть на 5, 10, 20, 30, 40% или более.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению снижает приток эозинофилов, например, по сравнению с уровнями до лечения. Снижение может быть на 5, 10, 20, 30, 40% или более, например, при лечении на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6 или большего числа недель.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению применимо для снижения ненадлежащих уровней бокаловидных клеток, например, при лечении гиперплазии бокаловидных клеток, например хронической гиперплазии бокаловидных клеток. Снижение может наблюдаться после лечения на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6 или большего числа недель.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению применимо для снижения ненадлежащих уровней вдыхаемой окиси азота (FeNO) относительно уровней до лечения. Вдыхаемая окись азота предположительно является фактором риска или маркером воспаления легких.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению применимо для предупреждения ненадлежащего отложения коллагена, ассоциированного с воспалительной реакцией, в частности перибронхиального отложения коллагена.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело по настоящему изобретению применимо для предупреждения ненадлежащего ангиогенеза, ассоциированного с воспалительной реакцией.
Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрено антитело для применения в лечении и в методах лечения по настоящему изобретению.
Антитело по настоящему изобретению, применяемое в настоящем изобретении, также относится к фрагментам и производным, описанным в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение молекулы антитела, фрагмента или композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредуется IL-13 или связано с повышенным уровнем IL-13, например, согласно описанию настоящего изобретения, в частности при следующих патологических расстройствах: ревматоидном артрите, астме или ХОЗЛ.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение молекулы антитела, фрагмента или композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения или профилактики одного или нескольких медицинских симптомов, описанных в настоящем изобретении.
Молекула антитела, фрагмента или композиция по настоящему изобретению могут применяться в каком-либо лечении, если требуется уменьшить воздействие IL-13 в организме человека или животного. IL-13 может циркулировать в организме или может содержаться на нежелательно высоком уровне в определенной части организма, например в области воспаления.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулу антитела по настоящему изобретению или композицию, включающую это антитело, применяют для контроля воспалительного заболевания, например, описанного в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение также предусматривает способ лечения людей или животных, больных или подверженных риску заболевания, опосредованного IL-13, включающий введение субъекту эффективного количества молекулы антитела по настоящему изобретению или композиции, включающей это антитело. В одном из примеров молекулу антитела вводят ингаляцией.
В одном из примеров расстройство выбрано из каких-либо симптомов, предусмотренных выше. В одном из примеров расстройство выбрано из группы, включающей астматические расстройства, атопи-ческие расстройства, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), состояния, включающие воспаление дыхательных путей, эозинофилию, фиброз и избыточное выделение слизи, воспалительные состояния, аутоиммунные состояния, опухоли или онкологические заболевания, вирусную инфекцию и подавление экспрессии защитных иммунных ответов первого типа.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ очистки антитела (в частности, антитела или фрагмента антитела по настоящему изобретению).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ очистки антитела (в частности, антитела или фрагмента антитела по настоящему изобретению), включающий стадии проведения анионообменной хроматографии без связывания, в результате которой загрязнения остаются в колонке, а антитело поддерживается в несвязанной фракции. Эта стадия, например, может проводиться при pH примерно 6-8.
Способ может дополнительно включать стадию первоначального захвата, на которой используют катионообменную хроматографию, проводимую, например, при величине pH примерно 4-5.
Способ может также включать дополнительную стадию (стадии) хроматографии, чтобы гарантировать, что загрязнения, связанные с продуктом и способом, соответствующим образом удалены из потока, содержащего продукт.
Процесс очистки также может включать одну или несколько стадий ультрафильтрации, например стадию концентрирования и двойной фильтрации.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают очищенное антитело или фрагмент антитела против IL, например гуманизированное антитело или фрагмент, в частности антитело или фрагмент по настоящему изобретению в существенной степени очищенной форме, особенно без эндотоксина и/или белка, или ДНК клеток-хозяев, или в значительной степени без них. Для этого антитела по настоящему изобретению обычно получают в клетках млекопитающих и при этом содержание эндотоксина обычно не представляет проблемы. В самом деле, содержание эндотоксина требует большего внимания, если антитела получают в бактериальных клетках.
Понятие "очищенной формы", указанное выше, применяют в том случае, если чистота составляет по меньшей мере 90%, например 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 мас.% или более.
Понятие "в существенной степени не содержит эндотоксина" обычно применяют к содержанию эндотоксина 1 ЕЭ (единицы эндотоксина)/мг продукта антитела или менее, например 0,5 или 0,1 ЕЭ/мг продукта.
Понятие "в существенной степени не содержит белка или ДНК" обычно применяют в том случае, если содержание белка и/или ДНК клеток-хозяев составляет 400 мкг/мг продукта антитела или менее, например 100 мкг/мг или менее, особенно 20 мкг/мг.
Молекула антитела по настоящему изобретению также может применяться в диагностике, например в диагностике in vivo и в выявлении состояний заболевания, в которые вовлечен IL-13.
Соответствующие анализы in vivo для выявления свойств антител по настоящему изобретению включают хроническую модель клещей домашней пыли, гиперчувствительность к метахолину и/или
овальбумину модели аллергического воспаления легких.
Включение в контекст настоящего описания предназначено для пояснения сути изобретения.
Технически соответствующие варианты осуществления настоящего изобретения могут быть объединены.
Описаны те варианты осуществления изобретения, которые включают определенные признаки/элементы. Сущность также распространяется на отдельные варианты осуществления изобретения, состоящие, или в значительной степени состоящие, из указанных признаков/элементов.
Настоящее изобретение дополнительно описывается иллюстрациями, приводимыми ниже только для тех примеров, которые относятся к прилагаемым фигурам, в которых
фиг. 1 показывает аминокислотную последовательность для каждой из областей CDR 1, 2, 3 из тяжелой цепи (CDR Н) и CDR 1, 2, 3 из легкой цепи (CDR L) (SEQ ID NO 1-6),
аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела крысы
(SEQ ID NO: 7),
последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи антитела крысы (SEQ ID NO: 8) и
аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 9);
фиг. 2 - последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 10),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области легкой цепи антитела крысы (SEQ ID NO: 11),
последовательность ДНК вариабельной области и константной области легкой цепи антитела крысы (SEQ ID NO: 12),
аминокислотную последовательность легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 13);
фиг. 3 - последовательность ДНК легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью
(SEQ ID NO: 14),
аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы
(SEQ ID NO: 15),
последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы (SEQ ID NO: 16),
аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 17);
фиг. 4 - последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 18),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы (SEQ ID NO: 19);
фиг. 5 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы (SEQ ID NO: 20),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 21);
фиг. 6 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 22);
фиг. 7 - аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 23),
последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела
(SEQ ID NO: 24),
аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 25),
последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 26),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 27);
фиг. 8 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 28),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 29),
последовательность ДНК вариабельной области и константной области легкой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 30);
фиг. 9 - аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 31),
последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела
(SEQ ID NO: 32),
аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного ан
титела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 33),
последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 34),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 35);
фиг. 10 - последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 36),
аминокислотную последовательность вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 37),
последовательность ДНК вариабельной области и константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 38);
фиг. 11 - аминокислотную последовательность и последовательность ДНК каркасного участка VK 1 2-1-(1)02 JK4 человека (SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40) и каркасного участка VH2 3-1 2-26 JH4
(SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42);
фиг. 12 - выравнивание легких цепей крысы, акцепторного каркасного участка и гуманизированных легких цепей, а также тяжелых цепей. Области CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Остатки донора G49 и R71 выделены жирным шрифтом, курсивом и подчеркнуты;
фиг. 13 - воздействие антитела Ab652 на содержание эотаксина-3 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), измеренное через 24 ч после иммунизации аллергеном обезьяны - модели астмы. Данные представлены средней величины ± средняя стандартная ошибка, n = 4-8 на группу;
фиг. 14 - воздействие антитела Ab652 на количество эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), измеренное через 24 ч после иммунизации аллергеном обезьяны - модели астмы. Данные нормализованы по количеству эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) в исследовании на стадии скрининга. Средняя величина ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу;
фиг. 15 - воздействие антитела Ab652 на пик устойчивости воздушных путей, измеренной не позднее 15 мин после иммунизации аллергеном обезьяны - модели астмы. Данные выражают средней величины ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу;
фиг. 16 - воздействие антитела Ab652 на устойчивость воздушных путей, измеренную через 24 ч после иммунизации аллергеном обезьяны - модели астмы. Данные нормализованы по устойчивости воздушных путей, измеренной до воздействия аллергена. Средняя величина ± средняя стандартная ошибка, n=4-8 на группу.
Примеры
1. Получение/отбор терапевтического антитела.
Крыс иммунизируют или очищенным IL-13 человека (фирма Peprotech), или фибробластами крысы, экспрессирующими IL-13 человека (экспрессируя примерно 1 мкг/мл в супернатант культуры), или в некоторых случаях комбинацией их обоих. После 3-6 иммунизации животных умерщвляют и забирают МКПК, селезенку, костный мозг и лимфатические узлы. Сыворотку подвергают мониторингу для выявления связывания с IL-13 человека в методе ELISA, а также для выявления способности нейтрализовать hIL-13 в анализе HEK-293 STAT-6 репортерных клеток (анализ HEK-Blue, фирма Invivogen).
Культуры SLAM (культуры В-клеток) получают способом, сходным со способом, описанным Zub-ler и др. (J. Immunol. 1985). Вкратце, 500-5000 спленоцитов или МКПК от иммунизированного животного культивируют в партиях из сотен 96-луночных планшетов с 200 мкл/лунку среды RPMI 1640 (фирма Gibco BRL), обогащенной 10% ФСТ (фирма РАА Laboratories Ltd.), 2% HEPES (фирма Sigma Aldrich), 1% L-глутамина (фирма Gibco BRL), 1% раствора пенициллина/стрептомицина (фирма Gibco BRL), 0,1% р-меркаптоэтанол (фирма Gibco BRL), 3% супернатанта культуры активированных спленоцитов кролика и облученных гамма-лучами клеток тимомы мыши EL-4-B5 (5х104 клеток/лунку) в течение 7 суток при 37°С в атмосфере 5% CO2. Супернатанты культур В-клеток исследуют методами скрининга и положительные супернатанты объединяют в эталонные планшеты. Выращенные В-клетки замораживают при -80°С в 100 мкл 10% DMSO в ФСТ.
Супернатанты культуры клеток SLAM сначала подвергают скринингу на способность связывать hIL-13 с помощью анализа, основанного на гранулах, методом флуорометрического исследования микрообъемов (fluorometric microvolume assay technology - FMAT). Это гомогенный анализ с применением биотинилированного IL-13 человека, нанесенного на стрептавидиновые гранулы, и козьего антикрысиного Fc-Cy5 конъюгата. Супернатанты с выявленной в этом анализе положительной реакцией затем помещают для анализа к репортерным клеткам IL-13R-STAT-6 HEK-293 (анализ HEK-Blue, фирма Invivogen) для идентификации нейтрализирующих агентов. Затем нейтрализирующие супернатанты профилируют в системе Biacore для оценки диссоциации, а также для описания способа осуществления нейтрализации. Нейтрализацию делят на категории bin 1 или bin 2. Bin 1 представляет антитело, которое связывается с IL-13 человека и предупреждает связывание IL-13Ra1 и в результате также блокирует IL-4R от связывания. Bin 2 представляет антитело, которое связывает hIL-13 таким образом, что позволяет связываться с IL-13Ra1, но предотвращает рекрутмент IL-4R в комплекс. Отбирают антитела, которые
действуют через bin 1.
Примерно 7500 IL-13-специфических супернатантов с выявленной положительной реакцией идентифицируют при первичном скрининге методом флуорометрического исследования микрообъемов (fluorometric microvolume assay technology - FMAT) в общей сложности из 27х100-планшетов клеток SLAM. В 800 лунках показана нейтрализация методом HEK-blue. В 170 лунках показаны требуемые профили Biacore, т.е. bin 1 антитела со скоростью диссоциации < 5х10-4/с. Было проведено клонирование вариабельной области из 170 таких лунок, в результате чего получают 160 успешно отобранных флуоресцирующих очагов. В 100 лунках вырабатываются генные пары вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи с последующей обратной транскрипцией методом (РВ)-ПЦР. Такие гены V-области клонируют в качестве антител полной длины IgG1 мыши и заново экспрессируют в системе временной экспрессии HEK-293. Анализ последовательности показал, что имеется 27 уникальных семейств антитела против IL-13 человека. Такие рекомбинантные антитела затем заново тестируют на способность блокировать рекомбинантный hIL-13 (полученный из B.coli и млекопитающего), рекомбинантный вариант hIL-13 (R130Q) (полученный из B.coli), природный дикого типа и вариант hIL-13 (полученные от человека-донора) и IL-13 макаки крабоеда (полученный из млекопитающего) в методе на основе клеток. Реком-бинантные антитела также анализируют по способности связывать вариант IL-13 человека (R130Q) и IL-13 макаки крабоеда в системе Biacore. Исходя из указанных признаков, 5 семейств антител соответствуют установленным критериям, т.е. до 100 пМ антитела с минимальным снижением эффективности и сродства для всех препаратов IL-13 человека и макаки крабоеда.
Проводят гуманизирование всех 5 семейств. Исходя из эффективности нейтрализации, сродства и содержания донора в гуманизированных пересаженных материалах, гуманизированное антитело СА154 652 (см. ниже) выбирают для дальнейшей работы.
1.1. Гуманизация.
Гуманизированное антитело, приведенное в настоящем изобретении (Ab652), получают пересадкой областей CDR из V-областей антитела крысы (SEQ ID NO:7 и 15) (CDR в настоящем изобретении представлены последовательностями 1-6) в каркасные участки V-области антитела зародышевой линии человека. Выравнивания последовательностей V-области антитела крысы (донора) с последовательностями V-области антитела зародышевой линии человека (акцептора) показаны на фиг. 12 вместе с разработанной гуманизированной последовательностью. Области CDR, пересаженные из последовательности донора в последовательность акцептора, представлены по нумерации Kabat (в кн.: Kabat и др. "Sequence of proteins of immunological interest", 1987. Вифезда, Мэриленд, Национальный институт здоровья, США), за исключением области CDR-H1, в которой определение дают одновременно по Chothia/Kabat (см. WO 91/09967). V-область человека VH2 3-12-26 плюс JH4 J-область (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) выбирают в качестве акцептора для областей CDR тяжелой цепи. Остатки каркасного участка тяжелой цепи все происходят от зародышевой линии человека за исключением остатков 49 и 71 (по нумерации Kabat), в которых остатки глицин (G49) и аргинин (R71), соответственно, удерживаются. Удержание этих двух остатков донора важна для проявляемого в полной мере действия гуманизированного антитела. V-область VK1 2-1-(1) 02 плюс JK4 J-область человека (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) выбирают в качестве акцептора для областей CDR легкой цепи. Остатки каркасного участка легкой цепи все происходят от гена зародышевых клеток человека.
Гены, кодирующие первоначальные последовательности V-области, разрабатывают и конструируют с помощью автоматизированного синтеза фирмы Entelechon GmbH. Ряд различных вариантов тяжелой цепи был созданы путем модификации гена VH с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Последовательность гена gL1 клонируют в векторе экспрессии pKH10.1 легкой цепи антитела UCB-Celltech человека, который содержит ДНК, кодирующую константную область каппа цепи человека (ал-лотип Km3) - см. SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 30. Восемь пересаженных генов VH (с gH1 по gH8) клонируют в векторе экспрессии pVhy4P FL тяжелой цепи гамма-4 человека UCB-Celltech, который содержит ДНК, кодирующую константную область тяжелой цепи гамма-4 человека с мутацией S241P, стабилизирующей шарнир (Angal и др., Mol. Immunol. 30(1), 1993, p. 105-108). Ген gH2 VH отбирают в качестве оптимального пересаживаемого материала тяжелой цепи для эффективности и биофизических свойств (описанных в настоящем изобретении ниже), и затем субклонируют в векторе pVhy1F3 фрагмента гамма-1 человека UCB-Celltech, который содержит ДНК, кодирующую домен СН1 гамма-1 человека (аллотип G1m17) (SEQ ID NO: 38). Совместная трансфекция получаемой плазмиды тяжелой цепи с плазмидой легкой цепи в клетки CHO-L761h приводит к экспрессии гуманизированного антитела в требуемом формате Fab. Настоящее антитело в изобретении обозначается "Ab652" (а также "Ab652 Fab").
Для облегчения получения стабильной линии клеток, экспрессирующей антитело Ab652, получают одну плазмиду, содержащую ДНК, которая кодирует кассеты экспрессии и тяжелой, и легкой цепи, и селективный маркер глутаминсинтетазы (ГС). Ген ГС позволяет отбирать рекомбинантные клетки CHO, допуская рост в средах, обогащенных ингибитором ГС метионин сульфоксимином (Bebbington и др., Biotechnol. 10(2), 1992, p. 169-175).
1.2. Измерение связывающего сродства.
Метод BIAcore осуществляет мониторинг связывания между биомолекулами в реальном времени без необходимости вводить метку. Одну из взаимодействующих биомолекул, называемую лигандом, иммобилизуют или непосредственно, или она захватывается на иммобилизованной поверхности, а другая, называемая анализируемой биомолекулой, содержится в растворе, протекающем над захватывающей поверхностью. Датчик обнаруживает изменение массы на поверхности сенсора, поскольку исследуемое вещество связывается с лигандом для формирования комплекса на поверхности. Это соответствует процессу ассоциации. Диссоциацию исследуемого вещества с лиганда подвергают мониторингу, когда исследуемое вещество замещают буфером. В анализе сродства Biacore лигандом является Ab652, а исследуемым веществом является IL-13 человека.
1.3. Анализ перекрестного связывания рецептора.
Анализ перекрестного связывания рецептора Biacore требует захвата анти-П^-13 Fab с последующим протоком IL-13 (в качестве первого исследуемого соединения) поверх захваченного лиганда для формирования стабильного комплекса на поверхности сенсора. Второе исследуемое вещество (рекомби-нантный растворимый рецептор IL-13) затем пропускают поверх такого стабильного комплекса. Проводят мониторинг количества связывающегося второго исследуемого соединения со стабильным комплексом. Анти-П^-13 антитела, которые не допускают связывания второго исследуемого соединения в стабильный комплекс антитело:П^-13, классифицируют в качестве конкурентов первого сайта. Такие анти-IL-13 антитела, которые позволяют второму исследуемому соединению связываться в стабильный комплекс антитело:П^-13, классифицируют в качестве конкурентов второго сайта.
Материалы.
Инструмент.
Biacore(r) 3000, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Сенсорный чип.
СМ5 (чистый для анализа). Номер в каталоге: BR-1001-14, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Чипы хранят при 4°С.
Набор для связывания амина.
Номер в каталоге: BR-1000-50, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция.
Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (ЭДХ). Концентрацию доводят до 75 мг/мл в дистиллированной воде и хранят аликвот объемом 200 мкл при -70°С.
N-гидроксисукцинимид (NFC). Концентрацию доводят до 11,5 мг/мл в дистиллированной воде и хранят аликвот объемом 200 мкл при -70°С.
1 М этаноламин гидрохлорид-NaOH pH 8,5. Хранят аликвот объемом 200 мкл при -70°С.
Буферы.
Подвижный буфер: HBS-EP (содержащий 0,01 М HEPES pH 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% поверхностно-активное вещество Р20). Номер в каталоге: BR-1001-88, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Буфер хранят при 4°С.
Буфер для иммобилизации: ацетат 5,0 (содержащий 10 мМ натрий ацетат pH 5,0). Номер в каталоге: BR-1003-51, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция. Буфер хранят при 4°С.
Захват лиганда.
Очищенный аффинной хроматографией фрагмент F(ab')2 козьего антитела против IgG человека, специфический фрагмент F(ab')2-. Фирма Jackson ImmunoResearch Inc. (Пенсильвания, США). Номер в каталоге: 109-006-097. Реагент хранят при 4°С.
Лиганд.
Антитело Ab652 (2,51, 21,7 и 3,86 мг/мл Fab), хранят при 4°С.
Анти-ЫЪ-13 mIgG (фирма R &D Systems Europe Ltd., Абингдон, Оксфорд. Номер в каталоге MAB-213, номер партии RL04).
Определяемые при анализе вещества.
Рекомбинантный IL-13 человека (0,2 мг/мл от D. Lightwood; фирма R &D Systems Europe Ltd, Абин-гдон, Оксфорд. Номер в каталоге 213-IL-050). Хранят при -70 С и оттаивают однократно для каждого анализа.
Рекомбинантный рецептор 1 hFc IL-13 человека (фирма R &D Systems Europe Ltd., Абингдон, Оксфорд. Номер в каталоге 146-IL-100). Хранят при -70°С и оттаивают однократно для каждого анализа.
Рекомбинантный рецептор 2 hFc IL-13 человека (фирма R &D Systems Europe Ltd., Абингдон, Оксфорд. Номер в каталоге 614-IL-100). Хранят при -70°С и оттаивают однократно для каждого анализа.
Раствор для регенерации.
40 мМ HCl получают разведением дистиллированной водой из исходного раствора 11,6 М (фирма BDH, Пул, Великобритания. Номер в каталоге: 101254Н).
5 мМ NaOH получают разведением дистиллированной водой из исходного раствора 50 мМ. Номер в каталоге: BR-1003-58, фирма Biacore AB, Упсала, Швеция.
Основное оборудование.
Биосенсор Biacore 3000 Biosensor, фирма GE Healthcare Ltd., Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA. Прибор эксплуатируют по протоколам производителя. 1.4. Измерение связывающего сродства антитела Ab652.
Формат исследования представляет захват антитела иммобилизованным антителом против фрагмента F(ab')2 и затем титрование hIL-13 человека над захваченной поверхностью.
Проводят анализ BIA (анализ биомолекулярного взаимодействия - Biamolecular Interaction Analysis), используя биосенсор BIAcore 3000 (BIAcore AB). Очищенный аффинной хроматографией фрагмент F(ab')2, козье антитело против IgG человека, специфический фрагмент F(ab')2 (фирма Jackson ImmunoResearch), иммобилизируют на сенсорном чипе СМ5 через аминное связывание с уровнем захвата "4000 единиц ответа (response units - RU). Пустую поверхность обрабатывают сходным образом, исключая из процедуры фрагмент F(ab')2. Буфер HBS-EP (10 мМ HEPES pH 7,4, 0,15М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% поверхностно-активное вещество Р20, BIAcore AB) применяют в качестве подвижного буфера при скорости тока 10 мкл/мин. Инъекцию 10 мкл Ab652 Fab в концентрации ~ 0,2 мкг/мл применяют для захвата иммобилизованным антителом против IgG человека - F(ab')2, чтобы допустить достаточное связывание IL-13, а также для минимизации ограниченных массовым транспортом эффектов связывания. IL13 человека титруют поверх захваченного антитела Ab652 в разных концентрациях (от 10 до 0,31 нМ) при скорости тока 30 мкл/мин. Поверхность регенерируют инъекцией 10 мкл 40 мМ HCl с последующим впрыскиванием 5 мкл 5 мМ NaOH при скорости тока 10 мкл/мин.
Кривые связывания за вычетом фона исследуют, используя программное обеспечение BIAevaluation (версия 3.2), следуя стандартным процедурам. Кинетические параметры определяют по алгоритму подбора.
1.5. Исследования перекрестного блокирования рецептора IL-13.
Для анализа перекрестного связывания рецептора в системе BIAcore требуется захват анти-И.-13 Fab с последующим поступлением IL-13 (в качестве первого исследуемого соединения) поверх захваченного лиганда для формирования стабильного комплекса на поверхности сенсора. Второе исследуемое соединение (рекомбинантный растворимый рецептор IL-13) затем пропускают поверх такого стабильного комплекса. Затем подвергают мониторингу количество связываемого второго исследуемого соединения со стабильным комплексом. Антитела против IL-13 (анти-П.-13 антитела), которые не допускают связывания второго исследуемого соединения со стабильным комплексом антитело:П.-13, классифицируют в качестве конкурентов оси 1. Такие антитела против IL-13, которые позволяют второму исследуемому соединению связываться со стабильным комплексом антитело:П^-13, классифицируют в качестве конкурентов оси 2.
Все эксперименты проводят, используя биосенсор Biacore 3000 при 25°С. Буфер HBS-EP применяют в качестве подвижного буфера при скорости тока 10 мкл/мин. Те же сенсорные поверхности применяют согласно описанному для определения сродства.
Инъекцию 0,2 мг/мл фрагмента Fab против IL-13 человека объемом 10 мкл применяют для захвата козьим F(ab')2 IgG, антитело против F(ab')2 человека-фрагмент специфической сенсорной поверхностью. Fab против IL-13 человека в концентрации 0,2 мкг/мл проявляет достаточное связывание антитела против IL-13 человека. IL-13 человека в концентрации 25 нМ впрыскивают поверх захваченного антитела и затем сразу растворимым рецептором IL-13 человека в концентрации 100 нМ при скорости тока 10 мкл/мин. Поверхность регенерируют двумя инъекциями 30 мкл 40 мМ HCl, с последующей инъекцией 5 мкл 5 мМ NaOH при скорости тока 30 мкл/мин.
IL-13 взаимодействует с каждым из двух рецепторов (IL-13Ra1 и IL-13Ra2) для формирования комплекса. Только комплекс hIL-13/hIL13 a1 подает сигналы. Таким образом, анти-ПЛ3 антитела, которые ингибируют IL-13-зависимую передачу сигнала, могут опосредовать такой эффект путем блокирования взаимодействия с hIL-13 a1. Сайт взаимодействия с антителом Ab652 на IL-13 человека использу
Кривые связывания за вычитанием фона анализируют, используя программное обеспечение BIAe-valuation, предоставленное производителем (версия 3.2), по стандартным процедурам.
ют для определения в анализе BIAcore. Антитело Ab652 захватывается поверхностью с иммобилизованным антителом против фрагмента F(ab')2 человека, и затем hIL-13 в свою очередь захватывается антителом Ab652. Оценивают связывание растворимого IL-13 Ra1 с комплексом захваченного IL-13/антитела. Исследование повторяют с hIL-13Ra2, взятым вместо hIL-13Ra1. IL-13, презентированный антителом Ab652, не может связаться ни с одним из рецепторов IL-13, но коммерческое контрольное анти-П^-13 (mAb 213) антитело способно презентировать IL-13 на растворимый рецептор IL-13. Таким образом, антитело Ab652 ингибирует связывание IL-13 с обеими субъединицами рецептора hIL-13, действуя в качестве конкурента оси 1.
Сродство антитела Ab652 с hIL-13 определяют методом Biacore в трех независимых анализах. Сродство находится в диапазоне 9-24 пМ при средней величине 13,4 (+4,8) пМ. 1.6. Эффективность, основанная на клетках.
Эффективность Ab652 Fab по нейтрализации IL-13 in vitro исследуют, используя анализ HEK-BLUE(tm) STAT-6 (фирма Invivogen). Анализ включает клетки HEK293, стабильно экспрессирующие STAT-6 человека и стабильно экспрессирующие секретированную эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP) под контролем минимального промотора IFN-P, гибридизированного с четырьмя сайтами, связывающими STAT-6. Эффективность нейтрализации (IC50) антитела Ab652 оценивают, используя разные типы IL-13 человека, применяемые в анализе в концентрации 250 пг/мл. Эффективность нейтрализации оценивают в отношении рекомбинантного дикого типа IL-13 человека, вырабатываемого клетками-хозяевами бактерии (E.coli) и млекопитающего (фибробласты крысы). Эффективность нейтрализации оценивают в отношении природного дикого типа и варианта R130Q IL-13 человека, вырабатываемого Т-лимфоцитами человека, и в отношении рекомбинантного L-13 макаки крабоеда, вырабатываемого в клетках млекопитающего. R130Q hIL-13 не очищают, а концентрацию определяют методом hIL-13 ELI-SA. IL-13 макаки крабоеда очищают и применяют в концентрации, допускающей при исследовании ответ, равный ответу 250 пг/мл hIL-13. Кроме того, нейтрализующую эффективность CA154_652.g2 Fab измеряют после распыления, используя сетевой небулайзер PARI eFLOW(r). Табл. 4: величины IC50 фрагмента Ab652 Fab против многочисленных форм IL-13 в анализе HEK Blue Assay. Для определения функционального сродства IL-13 проводят титрования в присутствии фиксированных концентраций антитела Ab652. Данные анализируют с помощью регрессивного анализа Schild-plot для определения величин KD для нейтрализации рекомбинантного дикого типа IL-13 человека и рекомбинантного IL-13 макаки крабоеда. Табл. 5: IC50 и KD величины Ab652 Fab против множественных форм IL-13 в анализе HEK Blue Assay.
В целом, указанные данные показывают, что фрагмент Ab652 Fab сходным образом эффективен при нейтрализации и рекомбинантного, и природного IL-13 человека, полученных из бактериального источника и от млекопитающего. Эффективность CA154_652.g2 против IL-13 макаки-крабоеда в данном исследовании не более чем в три раза ниже, чем против IL-13 человека, также выработанного из фибробластов крысы. Эффективность CA154_652.g2 не изменяется в результате распыления с применением сетевого небулайзера PARI eFLOW(r).
1.7. Физическое описание антитела Ab652.
Выше было описано, что 8 разных пересаженных вариабельных областей антител получают, используя области CDR, полученные от выбранных антител крысы (SEQ ID NO: 1-6, фиг. 1). Выбор области Ab652 (gL1gH2) из этих 8 пересаженных областей основан на эффективности, которая описана выше, и биофизических показателях.
Исходя из данных, полученных для всех исследованных пересаженных вариабельных областей, было выбрано антитело 652, поскольку оно
поддерживает наивысшее сродство в отношении hIL-13 и варианта IL-13;
обладает наивысшей точкой плавления, Tm (показатель повышенной стабильности);
обладает наивысшей стабильностью pH (по круговому дихроизму), т.е. проявляет меньшее разрушение при низкой величине pH;
не агрегирует при качании или распылении.
Напротив, некоторые из других исследованных пересаженных последовательностей проявляют снижение связывающего сродства, слабую стабильность pH и агрегирование при качании и/или распылении.
1.7.1. Эффект распыления.
Чтобы определить, пригодно ли антитело Ab652 для распыления, применяют сетевой небулайзер PARI eFLOW(r). Объемы по 2,5 мл раствора антитела Ab652 в 50 мМ ацетате натрия/125 мМ хлориде натрия при pH5 распыляют при комнатной температуре (примерно 21°C) и собирают конденсированием распыляемого продукта в холодных пробирках для сбора. Последующий анализ показывает отсутствие очевидного разрушения. Исследование также повторяют, используя раствор в ФСБ, pH 7. Включают положительный контроль IgG4, для которого было установлено агрегирование во время распыления. Анализ распыленных образцов проводят ионообменной хроматографией, SDS-PAGE, методом динамического лазерного светорассеяния и связывания лиганда, уделяя особое внимание наличию агрегирования материала. Не было выявлено каких-либо изменений при применении указанных методов, показывая, что антитело Ab652 устойчиво к разрушению во время распыления.
1.7.2. Краткие физические характеристики антитела Ab652.
Изоэлектрическая точка pI (isoelectric point) = 8 (средняя величина по двум измерениям). Температурная стабильность Tm 84°С.
Агрегирования антитела Ab652 не наблюдают, если антитело было подвержено встряхиванию/перемешиванию или распылению.
2. Роль антитела Ab652, показанная у обезьян, являющихся моделью астмы. Задача.
Задача настоящего исследования заключается в оценке эффективности антитела Ab652 у обезьян, являющихся моделью астмы. Основными конечными точками оценки являются воздействие на количество клеток в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), уровни цитокина и ранние и поздние изменения функции легких, оцениваемые по устойчивости легких (lung resistance -RL).
Методы.
Антитело Ab652 высвобождают, используя световой небулайзер. Исследования по моделированию дыхания проводят, используя типичные параметры вентиляции и устанавливая трубки, используемые для проведения исследования. Результаты исследований по стимуляции дыхания показывают, что 40,4% материала, заполняющего небулайзер, может быть высвобождено на уровне эндотрахеальной трубки.
Животных для исследования отбирают на основе ранее установленных показателей функционирования легких и по подсчетам эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ). На стадии скрининга животных подвергают иммунизации антигеном Ascaris suum (A.suum) перед делением на группы лечения для описания их реакции в норме (без обработки) на A.suum. После стадии скрининга животных делят на группы на основании подсчета клеток в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и по показателям функции легких, полученным на стадии скрининга. На стадии лечения животные получают или распыленный растворитель (ФСБ), или распыленное антитело Ab652 при уровне доз в ингаляторе 0,1, 1, 10 или 60 мг/животное/сутки. Дозы вводят путем распыления на -2, -1, 1, 2 и 3 сутки. На 1 и 2 сутки лечения введение проводят примерно за 30 мин до иммунизации A.suum.
Процедуры иммунизации идентичны для обоих сеансов. Каждое животное иммунизируют на 1 и 2 сутки и показатели функции легких (RL) записывают на протяжении по меньшей мере 15 мин после каждой иммунизации аллергеном и через 24 ч после каждой иммунизации аллергеном. Бронхоальвеолярный лаваж собирают перед первой иммунизацией и примерно через 24 ч после второй иммунизации для оценки общего числа клеток, морфологии и дифференциального подсчета для оценки степени воспаления легких. Образцы супернатантов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) собирают и исследуют для определения концентрации хемокина.
Результаты.
Распыленное антитело Ab652 существенно ингибирует повышение в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) эотаксина-3 в низких дозах в мг/сут. (фиг. 13). Распыленное антитело Ab652 вызывает дозозави-симое ингибирование повышения в БАЛ эозинофилов, измеренных между стадией скрининга и стадией лечения (фиг. 14). Распыленное антитело Ab652 существенно и дозозависимым образом ингибирует пик раннего фазового ответа на 2 сутки, измеренный не позднее чем через 15 мин после иммунизации Ascaris на стадии лечения (фиг. 15). Распыленное антитело Ab652 существенно и дозозависимым образом ингибирует ответ поздней фазы, измеренный через 24 ч после введения аллергена на 2 сутки (фиг. 16).
Заключение.
Данные, полученные с распыленным антителом Ab652 на модели астмы у макак крабоедов с аллергеном Ascaris, показывают, что IL-13-вызванное аллергическое воспаление легких чувствительно к фармакологическому модулированию путем нейтрализации фрагмента анти-П^-13 Fab, высвобожденного непосредственно в дыхательные пути в форме аэрозоля. Важно, что антитело Ab652 обладает действием, проявляемым в низких дозах, выражаемых в мг/сутки.
Следует обязательно учитывать, что, хотя настоящее изобретение описывают только с помощью примеров, это не означает, что оно ими ограничивается, и модификации деталей могут быть произведены в рамках представленной ниже формулы изобретения. Предпочтительные признаки каждого варианта осуществления настоящего изобретения те же, что и у других вариантов осуществления настоящего изобретения, но с необходимыми правками (mutatis mutandis). Все публикации, включая, но ими не ограни
чиваясь, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем изобретении, включены в него посредством ссылок в зависимости от того, насколько каждая публикация конкретно показана для включения в настоящее изобретение ссылки, что было обосновано выше.
Перечень последовательностей
<110> ЮСБ ФАРМА С.А.
gaagatgaag gggtctatta ctgtcaacag ggttacaggt ttccgctcac gttcggttct gggaccaagc tggaattgaa a
<210> 9
<211> 127
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи антитела крысы с сигнальной последовательностью
<400> 9
Met Gly Val Pro Thr Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp lie Thr
15 10 15
Asp Ala He Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro His Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser He Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp
35 40 45
He Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gin Leu Leu He Tyr His Thr Ser Arg Leu Gin Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys He Ser
85 90 95
Asn Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Tyr
100 105 110
Arg Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 10
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи антитела крысы с сигнальной
последовательностью
<400> 10
atgggtgtcc ccactcagct cttggggttg ttgttactgt ggattacaga tgccatatgt gacatccaga tgacacagtc tccacattcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtctcc atcgaatgtc tagcaagtga ggacatttcc aattatttag cgtggtatca gcagaagcca ggaaaatctc ctcagctctt gatctatcat acaagtaggt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg gcagtggatc tggcacacag ttttctctca agatcagtaa catgcaacct gaagatgaag gggtctatta ctgtcaacag ggttacaggt ttccgctcac gttcggttct gggaccaagc tggaattgaa a
<210> 11 <211> 214 <212> БЕЛОК
cggttcagtg
gcagtggatc
tggcacacag
ttttctctca
agatcagtaa
catgcaacct
gaagatgaag
gggtctatta
ctgtcaacag
ggttacaggt
ttccgctcac
gttcggttct
gggaccaagc
tggaattgaa
acgggctgat
gctgcaccaa
ctgtatctat
cttcccacca
tccacggaac
agttagcaac
tggaggtgcc
tcagtcgtgt
gcctcatgaa
caacttctat
cccagagaca
tcagtgtcaa
gtggaagatt
gatggcactg
aacgacgaga
tggtgtcctg
gacagtgtta
ctgatcagga
cagcaaagac
agcacgtaca
gcatgagcag
caccctctcg
ttgaccaagg
ctgactatga
aagtcataac
ctctatacct
gtgaggttgt
tcataagaca
tcatcctcac
ccgtcgtcaa
gagcttcaac
aggaatgagt
240 300 360 420 480 540 600 642
<210> 13
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь крысы с сигнальной последовательностью <400> 13
Met Gly Val Pro Thr Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp He Thr
15 10 15
Asp Ala He Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro His Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser He Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp
35 40 45
He Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gin Leu Leu He Tyr His Thr Ser Arg Leu Gin Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys He Ser
85 90 95
Asn Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Tyr
100 105 110
Arg Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser He Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gin
130 135 140
Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Asp He Ser Val Lys Trp Lys He Asp Gly Thr Glu Arg Arg
165 170 175
Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser
195
200
205
His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro
210 215 220
Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230
<210> 14 <211> 702 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь крысы с сигнальной последовательностью
<400> 14 atgggtgtcc
ccactcagct
cttggggttg
ttgttactgt
ggattacaga
tgccatatgt
gacatccaga
tgacacagtc
tccacattcc
ctgtctgcat
ctctgggaga
aactgtctcc
120
atcgaatgtc
tagcaagtga
ggacatttcc
aattatttag
cgtggtatca
gcagaagcca
180
ggaaaatctc
ctcagctctt
gatctatcat
acaagtaggt
tgcaagatgg
ggtcccatca
240
cggttcagtg
gcagtggatc
tggcacacag
ttttctctca
agatcagtaa
catgcaacct
300
gaagatgaag
gggtctatta
ctgtcaacag
ggttacaggt
ttccgctcac
gttcggttct
360
gggaccaagc
tggaattgaa
acgggctgat
gctgcaccaa
ctgtatctat
cttcccacca
420
tccacggaac
agttagcaac
tggaggtgcc
tcagtcgtgt
gcctcatgaa
caacttctat
480
cccagagaca
tcagtgtcaa
gtggaagatt
gatggcactg
aacgacgaga
tggtgtcctg
540
gacagtgtta
ctgatcagga
cagcaaagac
agcacgtaca
gcatgagcag
caccctctcg
600
ttgaccaagg
ctgactatga
aagtcataac
ctctatacct
gtgaggttgt
tcataagaca
660
tcatcctcac
ccgtcgtcaa
gagcttcaac
aggaatgagt
702
<210> 15
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи крысы <400> 15
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin
15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
His Val Gin Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gin Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Thr He Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser 115
<210> <211> <212> <213>
16 357
днк
Искусственная
<220> <223>
Вариабельная область тяжелой цепи крысы
<400> 16 caggtgcagc
tgaaggagtc
aggacctggc
ctggtgcagc
cctcacagac
cctgtctctc
acctgcactg
tctctgggtt
ctcattaacc
aactatcatg
tgcagtgggt
tcggcagcct
ccaggaaaag
gtctggagtg
gatgggagta
atgtggagtg
atggagacac
atcatttaat
tcagttctca
aatctcgact
gagcatcagc
agggacacct
ccaagagcca
agttttctta
aaaatgagca
gtctgcaaac
tgaagacaca
gccacttact
actgtgccag
agatggaact
atagcagcta
tggactactt
tgattattgg
ggccaaggag
tcatggtcac
cgtctcg
<210> 17
<211> 138
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи крысы с сигнальной последовательностью
<400> 17
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Met Thr Phe Pro Ser Cys
15 10 15
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin
20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr His Val Gin Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser
65 70 75 80
Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Ser Ser Leu Gin Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr He Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser 130 135
<210> 18
<211> 414
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи крысы с сигнальной последовательностью
<400> 18
atggctgtcc tggtgctgtt gctctgcctg atgacatttc caagctgtgt cctgtcccag gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtgcagccct cacagaccct gtctctcacc tgcactgtct ctgggttctc attaaccaac tatcatgtgc agtgggttcg gcagcctcca ggaaaaggtc tggagtggat gggagtaatg tggagtgatg gagacacatc atttaattca gttctcaaat ctcgactgag catcagcagg gacacctcca agagccaagt tttcttaaaa atgagcagtc tgcaaactga agacacagcc acttactact gtgccagaga tggaactata gcagctatgg actactttga ttattggggc caaggagtca tggtcaccgt ctcg
<210> 19
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь антитела крысы <400> 19
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin
15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
His Val Gin Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gin Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Thr He Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
<223> Тяжелая цепь антитела крысы <400> 20
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagac cctgtctctc 60
acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc aactatcatg tgcagtgggt tcggcagcct 120
ccaggaaaag gtctggagtg gatgggagta atgtggagtg atggagacac atcatttaat 180
tcagttctca aatctcgact gagcatcagc agggacacct ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgagca gtctgcaaac tgaagacaca gccacttact actgtgccag agatggaact 300
atagcagcta tggactactt tgattattgg ggccaaggag tcatggtcac cgtctcgtca 360
gctgaaacaa cagccccatc tgtctatcca ctggctcctg gaactgctct caaaagtaac 420
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt caccgtgacc 480
tggaactctg gagccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctggg 540
ctctacactc tcaccagctc agtgactgta ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 600
acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccaga 660
aactgtggag gtgattgcaa gccttgtata tgtacaggct cagaagtatc atctgtcttc 720
atcttccccc caaagcccaa agatgtgctc accatcactc tgactcctaa ggtcacgtgt 780
gttgtggtag acattagcca ggacgatccc gaggtccatt tcagctggtt tgtagatgac 840
gtggaagtcc acacagctca gactcgacca ccagaggagc agttcaacag cactttccgc 900
tcagtcagtg aactccccat cctgcaccag gactggctca atggcaggac gttcagatgc 960
aaggtcacca gtgcagcttt cccatccccc atcgagaaaa ccatctccaa acccgaaggc 1020
agaacacaag ttccgcatgt atacaccatg tcacctacca aggaagagat gacccagaat 1080
gaagtcagta tcacctgcat ggtaaaaggc ttctatcccc cagacattta tgtggagtgg 1140
cagatgaacg ggcagccaca ggaaaactac aagaacactc cacctacgat ggacacagat 1200
gggagttact tcctctacag caagctcaat gtgaagaagg aaaaatggca gcagggaaac 1260
acgttcacgt gttctgtgct gcatgaaggc ctgcacaacc accatactga gaagagtctc 1320
tcccactctc cgggtaaa 1338
<210> 21
<211> 465
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь антитела крысы с сигнальной последовательностью <400> 21
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Met Thr Phe Pro Ser Cys
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin
20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr His Val Gin Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser
Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp He Tyr Val Glu Trp Gin
385 390 395 400
Met Asn Gly Gin Pro Gin Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met
405 410 415
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys
420 425 430
Glu Lys Trp Gin Gin Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
435 440 445
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
450 455 460
Lys 465
<210> 22 <211> 1395 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь антитела крысы с сигнальной последовательностью
<400> 22 atggctgtcc
tggtgctgtt
gctctgcctg
atgacatttc
caagctgtgt
cctgtcccag
gtgcagctga
aggagtcagg
acctggcctg
gtgcagccct
cacagaccct
gtctctcacc
120
tgcactgtct
ctgggttctc
attaaccaac
tatcatgtgc
agtgggttcg
gcagcctcca
180
ggaaaaggtc
tggagtggat
gggagtaatg
tggagtgatg
gagacacatc
atttaattca
240
gttctcaaat
ctcgactgag
catcagcagg
gacacctcca
agagccaagt
tttcttaaaa
300
atgagcagtc
tgcaaactga
agacacagcc
acttactact
gtgccagaga
tggaactata
360
gcagctatgg
actactttga
ttattggggc
caaggagtca
tggtcaccgt
ctcgtcagct
420
gaaacaacag
ccccatctgt
ctatccactg
gctcctggaa
ctgctctcaa
aagtaactcc
480
atggtgaccc
tgggatgcct
ggtcaagggc
tatttccctg
agccagtcac
cgtgacctgg
540
aactctggag
ccctgtccag
cggtgtgcac
accttcccag
ctgtcctgca
gtctgggctc
600
tacactctca
ccagctcagt
gactgtaccc
tccagcacct
ggcccagcca
gaccgtcacc
660
tgcaacgtag
cccacccggc
cagcagcacc
aaggtggaca
agaaaattgt
gcccagaaac
720
tgtggaggtg
attgcaagcc
ttgtatatgt
acaggctcag
aagtatcatc
tgtcttcatc
780
ttccccccaa
agcccaaaga
tgtgctcacc
atcactctga
ctcctaaggt
cacgtgtgtt
840
gtggtagaca
ttagccagga
cgatcccgag
gtccatttca
gctggtttgt
agatgacgtg
900
gaagtccaca
cagctcagac
tcgaccacca
gaggagcagt
tcaacagcac
tttccgctca
960
gtcagtgaac
tccccatcct
gcaccaggac
tggctcaatg
gcaggacgtt
cagatgcaag
1020
gtcaccagtg
cagctttccc
atcccccatc
gagaaaacca
tctccaaacc
cgaaggcaga
1080
acacaagttc
cgcatgtata
caccatgtca
cctaccaagg
aagagatgac
ccagaatgaa
1140
gtcagtatca
cctgcatggt
aaaaggcttc
tatcccccag
acatttatgt
ggagtggcag
1200
atgaacgggc
agccacagga
aaactacaag
aacactccac
ctacgatgga
cacagatggg
1260
Met Ser Val Pro Thr Gin Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
15 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp
35 40 45
He Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu He Tyr His Thr Ser Arg Leu Gin Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser
85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Tyr
100 105 110
Arg Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
115 120 125
<210> 26
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> VL антитела Ab652 с сигнальной последовательностью
<400> 26
atgtctgtcc ccacccaagt cctcggactc ctgctactct ggcttacaga tgccagatgc gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct cgtttctctg gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt ggtaccaaag ttgaaatcaa a
<210> 27
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь антитела АЬ652 (вариабельные и константные области) <400> 27
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp He Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu Gin Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Tyr Arg Phe Pro Leu
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala
100
105
110
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115
120
125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130
135
140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165
170
175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 28
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь антитела Ab652 (вариабельные и константные области)
<400> 28 gatatccaga
tgacccagag
tccaagcagt
ctctccgcca
gcgtaggcga
tcgtgtgact
attacctgtc
tggctagcga
ggacatctcc
aactacctgg
cgtggtatca
gcagaaaccg
ggtaaagcgc
cgaaactgct
gatctatcac
acttcccgtc
tgcaggacgg
tgttccgtct
cgtttctctg
gttccggttc
tggtacggac
ttcaccctga
ccatctcttc
tctgcagcca
gaagacttcg
cgacttacta
ctgccagcag
ggttaccgtt
ttccgctgac
cttcggtggt
ggtaccaaag
ttgaaatcaa
acgtacggta
gcggccccat
ctgtcttcat
cttcccgcca
tctgatgagc
agttgaaatc
tggaactgcc
tctgttgtgt
gcctgctgaa
taacttctat
cccagagagg
ccaaagtaca
gtggaaggtg
gataacgccc
tccaatcggg
taactcccag
gagagtgtca
cagagcagga
cagcaaggac
agcacctaca
gcctcagcag
caccctgacg
ctgagcaaag
cagactacga
gaaacacaaa
gtctacgcct
gcgaagtcac
ccatcagggc
ctgagctcgc
ccgtcacaaa
gagcttcaac
aggggagagt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 642
<223> Легкая цепь антитела АЬ652 (вариабельные и константные области) сигнальной последовательностью
<400> 30
atgtctgtcc ccacccaagt cctcggactc ctgctactct ggcttacaga tgccagatgc gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct cgtttctctg gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt ggtaccaaag ttgaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt
<210> 31
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> VH Ab652 <400> 31
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
15 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
His Val Gin Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Thr He Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115
<210> 32
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<22 3> VH Ab6 5 2
<400> 32
caggtgaccc
tgaaagaatc
tggtccggtt
ctggtgaaac
caacggaaac
cctgactctg
acgtgcaccg
tttctggttt
ctctctgacc
aactaccacg
ttcagtggat
tcgtcagccg
ccgggtaaag
cgctggaatg
gctgggtgtt
atgtggagcg
acggtgacac
cagcttcaac
tctgtgctga
aatctcgcct
gaccatctcc
cgtgatactt
ccaaatccca
ggttgtgctg
accatgacga
acatggaccc
ggtagatact
gcaacctact
actgtgcacg
tgatggcact
atcgcggcta
tggattactt
cgactattgg
ggtcagggta
ccctggttac
cgtctcg
<210> 33
<211> 138
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> VH антитела АЬ652 с сигнальной последовательностью <400> 33
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
15 10 15
Val His Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr His Val Gin Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser
65 70 75 80
Val Leu Lys Ser Arg Leu Thr He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin
85 90 95
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr He Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135
<210> 34
<211> 414
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> VH антитела Ab652 с сигнальной последовательностью
<400> 34
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt ccattctcag gtgaccctga aagaatctgg tccggttctg gtgaaaccaa cggaaaccct gactctgacg tgcaccgttt ctggtttctc tctgaccaac taccacgttc agtggattcg tcagccgccg
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь антитела АЬ652 (вариабельные и константные области)
<400> 36 caggtgaccc
tgaaagaatc
tggtccggtt
ctggtgaaac
caacggaaac
cctgactctg
acgtgcaccg
tttctggttt
ctctctgacc
aactaccacg
ttcagtggat
tcgtcagccg
120
ccgggtaaag
cgctggaatg
gctgggtgtt
atgtggagcg
acggtgacac
cagcttcaac
180
tctgtgctga
aatctcgcct
gaccatctcc
cgtgatactt
ccaaatccca
ggttgtgctg
240
accatgacga
acatggaccc
ggtagatact
gcaacctact
actgtgcacg
tgatggcact
300
atcgcggcta
tggattactt
cgactattgg
ggtcagggta
ccctggttac
cgtctcgagc
360
gcttctacaa
agggcccatc
ggtcttcccc
ctggcaccct
cctccaagag
cacctctggg
420
ggcacagcgg
ccctgggctg
cctggtcaag
gactacttcc
ccgaaccggt
gacggtgtcg
480
tggaactcag
gcgccctgac
cagcggcgtg
cacaccttcc
cggctgtcct
acagtcctca
540
ggactctact
ccctcagcag
cgtggtgacc
gtgccctcca
gcagcttggg
cacccagacc
600
tacatctgca
acgtgaatca
caagcccagc
aacaccaagg
tggacaagaa
agttgagccc
660
aaatcttgt
669
<210> 37
<211> 242
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь антитела Ab652 (вариабельные и константные области) с сигнальной последовательностью
<400> 37
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
15 10 15
Val His Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr His Val Gin Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser
65 70 75 80
Val Leu Lys Ser Arg Leu Thr He Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin
85 90 95
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr He Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys
<210> 38
<211> 726
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь антитела АЬ652 {вариабельные и константные области)
сигнальной последовательностью
<400> 38
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt ccattctcag
gtgaccctga aagaatctgg tccggttctg gtgaaaccaa cggaaaccct gactctgacg
tgcaccgttt ctggtttctc tctgaccaac taccacgttc agtggattcg tcagccgccg
ggtaaagcgc tggaatggct gggtgttatg tggagcgacg gtgacaccag cttcaactct
gtgctgaaat ctcgcctgac catctcccgt gatacttcca aatcccaggt tgtgctgacc
atgacgaaca tggacccggt agatactgca acctactact gtgcacgtga tggcactatc
gcggctatgg attacttcga ctattggggt cagggtaccc tggttaccgt ctcgagcgct
tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa
tcttgt
<210> 39
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Акцепторный каркасный участок человека VK1 2-1-(1) 02.JK4 <400> 39
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антагонистическое антитело, которое связывает IL-13 человека, включающее тяжелую цепь и легкую цепь, причем вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 для CDR-H2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, и вариабельный домен легкой цепи включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 для
CDR-L3.
2. Антитело по п.1, в котором тяжелая цепь включает последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 31.
3. Антитело по п.1, в котором легкая цепь включает последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 23.
4. Антагонистическое антитело, которое связывает IL-13 человека, имеющее тяжелую цепь, которая включает последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 31, и легкую цепь, включающую последовательность вариабельного домена, представленную в SEQ ID NO: 23.
5. Антагонистическое антитело, связывающее IL-13 человека, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, включающую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.
6. Антагонистическое антитело по одному из пп.1-5, к которому присоединена эффекторная или ре-портерная молекула.
7. Антагонистическое антитело по любому из пп.1-5 или 6, имеющее связывающее сродство в отношении выделенного IL-13 человека, составляющее 30 пМ или более.
8. Последовательность выделенной ДНК, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь(цепи) антитела по одному из пп.1-7.
9. Вектор клонирования или экспрессии, включающий одну или несколько последовательностей
ДНК по п.8.
10. Вектор по п.9, включающий последовательности, представленные в SEQ ID NO: 36 и
SEQ ID NO: 28.
11. Клетка-хозяин, включающая один или несколько векторов клонирования или экспрессии по
п.10.
12. Способ получения антитела по одному из пп.1-7, включающий культивирование клетки-хозяина по п.11 и выделение антитела.
13. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по одному из пп.1-7 в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентом, растворителем или носителем.
14. Применение антитела по одному из пп.1-7 для лечения патологического расстройства, опосредованного IL-13 или связанного с повышенным уровнем IL-13.
15. Применение фармацевтической композиции по п.13 для лечения патологического расстройства, опосредованного IL-13 или связанного с повышенным уровнем IL-13.
16. Применение антитела по одному из пп.1-7 для профилактики патологического расстройства, которое опосредовано IL-13 или ассоциировано с повышенным уровнем IL-13.
17. Применение фармацевтической композиции по п.13 для профилактики патологического расстройства, которое опосредовано IL-13 или ассоциировано с повышенным уровнем IL-13.
18. Применение антитела по одному из пп.1-7 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано IL-13 или ассоциировано с повышенным уровнем IL-13.
19. Способ лечения человека с патологическим расстройством или риском патологического расстройства, опосредованного IL-13, включающий введение субъекту эффективного количества фрагмента Fab или Fab' анти-П^-13 антитела путем ингаляции, в котором фрагмент антитела Fab или Fab' является фрагментом антитела по одному из пп.1-7.
20. Применение по одному из пп.16-18, в котором патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из астматических расстройств, атопических расстройств, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), состояний, включающих воспаление дыхательных путей, эозинофилии, фиброза и избыточной выработки слизи, воспалительных состояний, аутоиммунных состояний, опухолей, в том числе злокачественных, вирусной инфекции и супрессии иммунных ответов 1 типа.
21. Способ по п.19, в котором патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из астматических расстройств, атопических расстройств, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), состояний, включающих воспаление дыхательных путей, эозинофилии, фиброза и избыточной выработки слизи, воспалительных состояний, аутоиммунных состояний, опухолей, в том числе злокачественных, вирусной инфекции и супрессии иммунных ответов 1 типа.
12.
SEQ ID No: 1
GFSLTNYHVQ
CDR HI
SEQ ID No: 2 CDR H2
VMWS DG DT S FN SVLKS
SEQ ID No: 3
DGTIAAMDYFDY
CDRH3
SEQ ID No: 4
LASEDISNYLA
CDR LI
SEQ ID No: 5
HTSRLQD
SEQ ID No: 6
QQGYRFPLT
Жирным шрифтом выделены области CDR вариабельной области легкой цепи антитела крысы
DIQMTQSPHS LSASLGETVS IECLASEDIS NYLAWYQQKP GKSPQLLIYH
TSRLQDGVPS RFSGSGSGTQ FSLKISNMQP EDEGVYYCQQ GYRFPLTFGS
GTKLELK
SEQ ID No: 8 ДНК вариабельной области легкой цепи антитела крысы
gacatccaga tgacacagtc tccacattcc ctgtctgcat ctctgggaga
aactgtctcc atcgaatgtc tagcaagtga ggacatttcc aattatttag
cgtggtatca gcagaagcca ggaaaatctc ctcagctctt gatctatcat
acaagtaggt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg gcagtggatc
tggcacacag ttttctctca agatcagtaa catgcaacct gaagatgaag
gggtctatta ctgtcaacag ggttacaggt ttccgctcac gttcggttct
gggaccaagc tggaattgaa a
Вариабельная область легкой цепи антитела крысы; SEQ ID No: 9 сигнальная последовательность подчеркнута MGVPTQLLGL LLLWITDAIC DIQMTQSPHS LSASLGETVS IECLASEDIS NYLAWYQQKP GKSPQLLIYH TSRLQDGVPS RFSGSGSGTQ FSLKISNMQP EDEGVYYCQQ GYRFPLTFGS GTKLELK
Фиг. 1
Вариабельная область легкой цепи антитела крысы; сигнальная последовательность SEQ ID No: 10 подчеркнута
atgggtgtcc ccactcagct cttggggttg ttgttactgt gqattacaga tgccatatgt gacatccaga tgacacagtc tccacattcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtctcc atcgaatgtc tagcaagtga ggacatttcc aattatttag cgtggtatca gcagaagcca ggaaaatctc ctcagctctt gatctatcat acaagtaggt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg gcagtggatc tggcacacag ttttctctca agatcagtaa catgcaacct gaagatgaag gggtctatta ctgtcaacag ggttacaggt ttccgctcac gttcggttct gggaccaagc tggaattgaa a
Легкая цепь антитела крысы (вариабельная область и SEQ ID No: 11 константная область)
DIQMTQSPHS LSASLGETVS IECLASEDIS NYLAWYQQKP GKSPQLLIYH
TSRLQDGVPS RFSGSGSGTQ FSLKISNMQP EDEGVYYCQQ GYRFPLTFGS
GTKLELKRAD AAPTVSIFPP STEQLATGGA SVVCLMNNFY PRDISVKWKI
DGTERRDGVL DSVTDQDSKD STYSMSSTLS LTKADYESHN LYTCEVVHKT
SSSPVVKSFN RNEC
Легкая цепь антитела крысы (вариабельная область и SEQ ID No: 12 константная область)
gacatccaga tgacacagtc tccacattcc ctgtctgcat ctctgggaga
aactgtctcc atcgaatgtc tagcaagtga ggacatttcc aattatttag
cgtggtatca gcagaagcca ggaaaatctc ctcagctctt gatctatcat
acaagtaggt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg gcagtggatc
tggcacacag ttttctctca agatcagtaa catgcaacct gaagatgaag
gggtctatta ctgtcaacag ggttacaggt ttccgctcac gttcggttct
gggaccaagc tggaattgaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatctat
cttcccacca tccacggaac agttagcaac tggaggtgcc tcagtcgtgt
gcctcatgaa caacttctat cccagagaca tcagtgtcaa gtggaagatt
gatggcactg aacgacgaga tggtgtcctg gacagtgtta ctgatcagga
cagcaaagac agcacgtaca gcatgagcag caccctctcg ttgaccaagg
ctgactatga aagtcataac ctctatacct gtgaggttgt tcataagaca
tcatcctcac ccgtcgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt
Легкая цепь антитела крысы; сигнальная последовательность подчеркнута
SEfQ ID по: 13
MGVPTQLLGL LLLWITDAIC DIQMTQSPHS LSASLGETVS IECLASEDIS NYLAWYQQKP GKSPQLLIYH TSRLQDGVPS RFSGSGSGTQ FSLKISNMQP EDEGVYYCQQ GYRFPLTFGS GTKLELKRAD AAPTVSIFPP STEQLATGGA SVVCLMNNFY PRDISVKWKI DGTERRDGVL DSVTDQDSKD STYSMSSTLS LTKADYESHN LYTCEVVHKT SSSPVVKSFN RNEC
Фиг. 2
Легкая цепь антитела крысы; сигнальная последовательность подчеркнута ccactcaqct cttggggttg ttgttactgt gqattacaga gacatccaga tgacacagtc tccacattcc ctgtctgcat aactgtctcc atcgaatgtc tagcaagtga ggacatttcc cgtggtatca gcagaagcca ggaaaatctc ctcagctctt acaagtaggt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg tggcacacag ttttctctca agatcagtaa catgcaacct gggtctatta ctgtcaacag ggttacaggt ttccgctcac gggaccaagc tggaattgaa acgggctgat gctgcaccaa cttcccacca tccacggaac agttagcaac tggaggtgcc gcctcatgaa caacttctat cccagagaca tcagtgtcaa gatggcactg aacgacgaga tggtgtcctg gacagtgtta cagcaaagac agcacgtaca gcatgagcag caccctctcg ctgactatga aagtcataac ctctatacct gtgaggttgt tcatcctcac ccgtcgtcaa gagcttcaac aggaatgagt
SEQ ID No: 15 Вариабельная область тяжелой цепи антитела крысы
QVQLKESGPG LVQPSQTLSL TCTVSGFSLT NYHVQWVRQP PGKGLEWMGV
MWSDGDTSFN SVLKSRLSIS RDTSKSQVFL KMSSLQTEDT ATYYCARDGT
IAAMDYFDYW GQGVMVTVS
SEQ ID No: 16 Вариабельная область тяжелой цепи антитела крысы
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagac
cctgtctctc acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc aactatcatg
tgcagtgggt tcggcagcct ccaggaaaag gtctggagtg gatgggagta
atgtggagtg atggagacac atcatttaat tcagttctca aatctcgact
gagcatcagc agggacacct ccaagagcca agttttctta aaaatgagca
gtctgcaaac tgaagacaca gccacttact actgtgccag agatggaact
atagcagcta tggactactt tgattattgg ggccaaggag tcatggtcac
cgtctcg
Вариабельная область тяжелой цепи антитела крысы; SEQ ID No: 17 сигнальная последовательность подчеркнута MAVLVLLLCL MTFPSCVLSQ VQLKESGPGL VQPSQTLSLT CTVSGFSLTN YHVQWVRQPP GKGLEWMGVM WSDGDTSFNS VLKSRLSISR DTSKSQVFLK MSSLQTEDTA TYYCARDGTI AAMDYFDYWG OGVMVTVS
Фиг. 3
Вариабельная область тяжелой цепи антитела крысы; SEQ ID No: 18 сигнальная последовательность подчеркнута
atgqctqtcc tggtgctgtt gctctgcctg atgacatttc caagctgtgt
cctqtcccag gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtgcagccct
cacagaccct gtctctcacc tgcactgtct ctgggttctc attaaccaac
tatcatgtgc agtgggttcg gcagcctcca ggaaaaggtc tggagtggat
gggagtaatg tggagtgatg gagacacatc atttaattca gttctcaaat
ctcgactgag catcagcagg gacacctcca agagccaagt tttcttaaaa
atgagcagtc tgcaaactga agacacagcc acttactact gtgccagaga
tggaactata gcagctatgg actactttga ttattggggc caaggagtca
tggtcaccgt ctcg
SEQ ID No: 19 Тяжелая цепь антитела крысы (вариабельная область и константная область)
QVQLKESGPG LVQPSQTLSL TCTVSGFSLT NYHVQWVRQP PGKGLEWMGV
MWSDGDTSFN SVLKSRLSIS RDTSKSQVFL KMSSLQTEDT ATYYCARDGT
IAAMDYFDYW GQGVMVTVSS AETTAPSVYP LAPGTALKSN SMVTLGCLVK
GYFPEPVTVT WNSGALSSGV HTFPAVLQSG LYTLTSSVTV PSSTWPSQTV
TCNVAHPASS TKVDKKIVPR NCGGDCKPCI CTGSEVSSVF IFPPKPKDVL
TITLTPKVTC VVVDISQDDP EVHFSWFVDD VEVHTAQTRP PEEQFNSTFR
SVSELPILHQ DWLNGRTFRC KVTSAAFPSP IEKTISKPEG RTQVPHVYTM
SPTKEEMTQN EVSITCMVKG FYPPDIYVEW QMNGQPQENY KNTPPTMDTD
GSYFLYSKLN VKKEKWQQGN TFTCSVLHEG LHNHHTEKSL SHSPGK
Фиг. 4
Тяжелая цепь антитела крысы (вариабельная область и константная область) tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagac acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc aactatcatg tcggcagcct ccaggaaaag gtctggagtg gatgggagta atggagacac atcatttaat tcagttctca aatctcgact agggacacct ccaagagcca agttttctta aaaatgagca tgaagacaca gccacttact actgtgccag agatggaact tggactactt tgattattgg ggccaaggag tcatggtcac gctgaaacaa cagccccatc tgtctatcca ctggctcctg caaaagtaac tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ctgagccagt caccgtgacc tggaactctg gagccctgtc cacaccttcc cagctgtcct gcagtctggg ctctacactc agtgactgta ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat aactgtggag gtgattgcaa gccttgtata tgtacaggct atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa agatgtgctc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acattagcca gaggtccatt tcagctggtt tgtagatgac gtggaagtcc gactcgacca ccagaggagc agttcaacag cactttccgc aactccccat cctgcaccag gactggctca atggcaggac aaggtcacca gtgcagcttt cccatccccc atcgagaaaa acccgaaggc agaacacaag ttccgcatgt atacaccatg aggaagagat gacccagaat gaagtcagta tcacctgcat ttctatcccc cagacattta tgtggagtgg cagatgaacg ggaaaactac aagaacactc cacctacgat ggacacagat tcctctacag caagctcaat gtgaagaagg aaaaatggca acgttcacgt gttctgtgct gcatgaaggc ctgcacaacc gaagagtctc tcccactctc cgggtaaa
Тяжелая цепь антитела крысы; сигнальная последовательность подчеркнута MTFPSCVLSQ VQLKESGPGL VQPSQTLSLT CTVSGFSLTN GKGLEWMGVM WSDGDTSFNS VLKSRLSISR DTSKSQVFLK TYYCARDGTI AAMDYFDYWG QGVMVTVSSA ETTAPSVYPL MVTLGCLVKG YFPEPVTVTW NSGALSSGVH TFPAVLQSGL SSTWPSQTVT CNVAHPASST KVDKKIVPRN CGGDCKPCIC FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV VVDISQDDPE VHFSWFVDDV EEQFNSTFRS VSELPILHQD WLNGRTFRCK VTSAAFPSPI TQVPHVYTMS PTKEEMTQNE VSITCMVKGF YPPDIYVEWQ NTPPTMDTDG SYFLYSKLNV KKEKWQQGNT FTCSVLHEGL HSPGK
Фиг. 5
SEQ ID No: 22 Тяжелая цепь антитела крысы; сигнальная последовательность подчеркнута
atgqctqtcc tggtgctqtt gctctgcctg atgacatttc caaqctqtgt
cctgtcccag gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtgcagccct
cacagaccct gtctctcacc tgcactgtct ctgggttctc attaaccaac
tatcatgtgc agtgggttcg gcagcctcca ggaaaaggtc tggagtggat
gggagtaatg tggagtgatg gagacacatc atttaattca gttctcaaat
ctcgactgag catcagcagg gacacctcca agagccaagt tttcttaaaa
atgagcagtc tgcaaactga agacacagcc acttactact gtgccagaga
tggaactata gcagctatgg actactttga ttattggggc caaggagtca
tggtcaccgt ctcgtcagct gaaacaacag ccccatctgt ctatccactg
gctcctggaa ctgctctcaa aagtaactcc atggtgaccc tgggatgcct
ggtcaagggc tatttccctg agccagtcac cgtgacctgg aactctggag
ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgggctc
tacactctca ccagctcagt gactgtaccc tccagcacct ggcccagcca
gaccgtcacc tgcaacgtag cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca
agaaaattgt gcccagaaac tgtggaggtg attgcaagcc ttgtatatgt
acaggctcag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaaaga
tgtgctcacc atcactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca
ttagccagga cgatcccgag gtccatttca gctggtttgt agatgacgtg
gaagtccaca cagctcagac tcgaccacca gaggagcagt tcaacagcac
tttccgctca gtcagtgaac tccccatcct gcaccaggac tggctcaatg
gcaggacgtt cagatgcaag gtcaccagtg cagctttccc atcccccatc
gagaaaacca tctccaaacc cgaaggcaga acacaagttc cgcatgtata
caccatgtca cctaccaagg aagagatgac ccagaatgaa gtcagtatca
cctgcatggt aaaaggcttc tatcccccag acatttatgt ggagtggcag
atgaacgggc agccacagga aaactacaag aacactccac ctacgatgga
cacagatggg agttacttcc tctacagcaa gctcaatgtg aagaaggaaa
aatggcagca gggaaacacg ttcacgtgtt ctgtgctgca tgaaggcctg
cacaaccacc atactgagaa gagtctctcc cactctccgg gtaaa
Фиг. 6
SEQ ID No: 23 Вариабельная область легкой цепи антитела АЬ652 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASEDIS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYH TSRLQDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYRFPLTFGG GTKVEIK
SEQ ID No: 24 Вариабельная область легкой цепи антитела АЬ652 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct cgtttctctg gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt ggtaccaaag ttgaaatcaa a
Вариабельная область легкой цепи антитела АЬ652; SEQ ID No: 25 сигнальная последовательность подчеркнута MSVPTQVLGL LLLWLTDARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASEDIS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYH TSRLQDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYRFPLTFGG GTKVEIK
Вариабельная область легкой цепи антитела АЬ652; SEQ ID No: 26 сигнальная последовательность подчеркнута atgtctgtcc ccacccaagt cctcggactc ctqctactct gqcttacaga tgccagatqc gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct cgtttctctg gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt ggtaccaaag ttgaaatcaa a
SEQ ID No: 27 Легкая цепь антитела Ab652 (вариабельная область и константная область)
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASEDIS NYLAWYQQKP GKAPKLLIYH
TSRLQDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYRFPLTFGG
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
Фиг. 7
SEQ ID No: 28 Легкая цепь антитела Ab652 (вариабельная область и константная область)
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga
tcgtgtgact attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg
cgtggtatca gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac
acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct cgtttctctg gttccggttc
tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca gaagacttcg
cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt
ggtaccaaag ttgaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat
cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt
gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga
cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag
cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt
SEQ ID No: 29 Легкая цепь антитела Ab652; сигнальная последовательность подчеркнута
MSVPTQVLGL LLLWLTDARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASEDIS
NYLAWYQQKP GKAPKLLIYH TSRLQDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
EDFATYYCQQ GYRFPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA
SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
SEQ ID No: 30 Легкая цепь антитела Ab652; сигнальная последовательность подчеркнута
atgtctgtcc ccacccaagt cctcggactc ctgctactct gqcttacaga
tgccagatgc gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca
gcgtaggcga tcgtgtgact attacctgtc tggctagcga ggacatctcc
aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgct
gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct cgtttctctg
gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca
gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac
cttcggtggt ggtaccaaag ttgaaatcaa acgtacggta gcggccccat
ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc
tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca
gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca
cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac
ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt
Фиг. 8
SEQ ID No: 31 Вариабельная область тяжелой цепи антитела АЬ652 QVTLKESGPV LVKPTETLTL TCTVSGFSLT NYHVQWIRQP PGKALEWLGV MWSDGDTSFN SVLKSRLTIS RDTSKSQWL TMTNMDPVDT ATYYCARDGT IAAMDYFDYW GQGTLVTVS
SEQ ID No: 32 Вариабельная область тяжелой цепи антитела АЬ652 caggtgaccc tgaaagaatc tggtccggtt ctggtgaaac caacggaaac cctgactctg acgtgcaccg tttctggttt ctctctgacc aactaccacg ttcagtggat tcgtcagccg ccgggtaaag cgctggaatg gctgggtgtt atgtggagcg acggtgacac cagcttcaac tctgtgctga aatctcgcct gaccatctcc cgtgatactt ccaaatccca ggttgtgctg accatgacga acatggaccc ggtagatact gcaacctact actgtgcacg tgatggcact atcgcggcta tggattactt cgactattgg ggtcagggta ccctggttac cgtctcg
Вариабельная область тяжелой цепи антитела АЬ652; SEQ ID No: 33 сигнальная последовательность подчеркнута MEWSWVFLFF LSVTTGVHSQ VTLKESGPVL VKPTETLTLT CTVSGFSLTN YHVQWIRQPP GKALEWLGVM WSDGDTSFNS VLKSRLTISR DTSKSQVVLT MTNMDPVDTA TYYCARDGTI AAMDYFDYWG QGTLVTVS
Вариабельная область тяжелой цепи антитела АЬ652; SEQ ID No: 34 сигнальная последовательность подчеркнута atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt ccattctcag gtgaccctga aagaatctgg tccggttctg gtgaaaccaa cggaaaccct gactctgacg tgcaccgttt ctggtttctc tctgaccaac taccacgttc agtggattcg tcagccgccg ggtaaagcgc tggaatggct gggtgttatg tggagcgacg gtgacaccag cttcaactct gtgctgaaat ctcgcctgac catctcccgt gatacttcca aatcccaggt tgtgctgacc atgacgaaca tggacccggt agatactgca acctactact gtgcacgtga tggcactatc gcggctatgg attacttcga ctattggggt cagggtaccc tggttaccgt ctcg
Тяжелая цепь фрагмента Fab антитела Ab652 SEQ ID No: 35 (вариабельная область и константная область) QVTLKESGPV LVKPTETLTL TCTVSGFSLT NYHVQWIRQP PGKALEWLGV MWSDGDTSFN SVLKSRLTIS RDTSKSQWL TMTNMDPVDT ATYYCARDGT IAAMDYFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVF DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQ1 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC
Фиг. 9
Тяжелая цепь фрагмента Fab антитела АЬ652 (вариабельная область и константная область) tgaaagaatc tggtccggtt ctggtgaaac caacggaaac acgtgcaccg tttctggttt ctctctgacc aactaccacg tcgtcagccg ccgggtaaag cgctggaatg gctgggtgtt acggtgacac cagcttcaac tctgtgctga aatctcgcct cgtgatactt ccaaatccca ggttgtgctg accatgacga ggtagatact gcaacctact actgtgcacg tgatggcact tggattactt cgactattgg ggtcagggta ccctggttac gcttctacaa agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa aaatcttgt
Тяжелая цепь фрагмента Fab антитела Ab652; сигнальная последовательность подчеркнута LSVTTGVHSQ VTLKESGPVL VKPTETLTLT CTVSGFSLTN GKALEWLGVM WSDGDTSFNS VLKSRLTISR DTSKSQVVLT TYYCARDGTI AAMDYFDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SC Тяжелая цепь фрагмента Fab антитела Ab652; сигнальная последовательность подчеркнута gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt gtgaccctga aagaatctgg tccggttctg gtgaaaccaa gactctgacg tgcaccgttt ctggtttctc tctgaccaac agtggattcg tcagccgccg ggtaaagcgc tggaatggct tggagcgacg gtgacaccag cttcaactct gtgctgaaat catctcccgt gatacttcca aatcccaggt tgtgctgacc tggacccggt agatactgca acctactact gtgcacgtga gcggctatgg attacttcga ctattggggt cagggtaccc ctcgagcgct tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg tgagcccaaa tcttgt
Фиг. 10
SEQ IN No: 39 Акцепторный каркасный участок человека VK1 2-1-(1) 02 JK4 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPLTFGG GTKVEIK
SEQ ID No: 40 Акцепторный каркасный участок человека VK1 2-1-(1) 02 JK4 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctctcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa ac
SEQ ID No: 41 Акцепторный каркасный участок человека VH2 3-1 2-26 JH4 QVTLKESGPV LVKPTETLTL TCTVSGFSLS NARMGVSWIR QPPGKALEWL AHIFSNDEKS YSTSLKSRLT ISKDTSKSQV VLTMTNMDPV DTATYYCARI YFDYWGQGTL VTVS
SEQ ID No: 42 Акцепторный каркасный участок человека VH2 3-1 2-26 JH4
caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac
cctcacgctg acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aatgctagaa
tgggtgtgag ctggatccgt cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt
gcacacattt tttcgaatga cgaaaaatcc tacagcacat ctctgaagag
caggctcacc atctccaagg acacctccaa aagccaggtg gtccttacca
tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacggata
tactttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cc
Фиг. 11
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032222
- 1 -
032222
- 1 -
032222
- 1 -
032222
- 1 -
032222
- 1 -
032222
- 1 -
032222
- 1 -
032222
- 4 -
032222
- 30 -
032222
- 34 -
032222
- 34 -
032222
- 35 -
032222
- 37 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 43 -
032222
- 45 -
032222
- 52 -
032222
- 53 -
032222
- 53 -
032222
- 53 -
032222
- 53 -
032222
- 58 -
032222
- 59 -