|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Соединение, имеющее структуру формулы I  или его фармацевтически приемлемая соль, где R 1 представляет собой CH 3 или CH 2 -CH 3 , R 2 представляет собой H или CH 3 , R 3 представляет собой H или NH 2 и n равен 1 или 2. 2. Соединение по п.1, где n равен 1, R 1 представляет собой метил, R 2 представляет собой метил и R 3 представляет собой NH 2 . 3. Соединение формулы (Ii)  формулы (Iii)  формулы (Iiii)  формулы (Iiv)  формулы (Iv)  или формулы (Ivi)  4. Соединение, имеющее структуру формулы II  или его фармацевтически приемлемая соль, где R 1 представляет собой CH 3 или CH 2 -CH 3 , R 2 представляет собой H или CH 3 , R 4 представляет собой CH 3 , (CH 2 ) 4 NH 2 или (CH 2 ) 3 NHC(=O)NH 2 , R 5 представляет собой H, С(CH 3 )(CH 3 ), R 6 представляет собой NHC(=O) или CH 2 ; n равен 1 или 2 и m равен 0, 1, 2 или 3. 5. Соединение по п.4, где n равен 1, R 1 представляет собой метил, R 2 представляет собой метил и R 3 представляет собой NH 2 . 6. Соединение по п.4, где n равен 1, m равен 1, R 1 представляет собой метил, R 2 представляет собой метил, R 3 представляет собой NH 2 , R 4 представляет собой (CH 2 ) 4 NH 2 , R 5 представляет собой H и R 6 представляет собой CH 2 . 7. Соединение формулы (IIi)   формулы (IIii)  формулы (IIiii)  или формулы (IIiv)  8. Конъюгат антитело-лекарственное средство, представляющий собой конъюгат соединения по любому из пп.4-7, где антитело является специфическим к раковому антигену. 9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8, где антитело представляет собой моноклональное антитело. 10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8 или 9, где антитело представляет собой алемтузумаб, бевацизумаб, брентуксимаб, цетуксимаб, гемтузумаб, ипилимумаб, офатумумаб, панитумумаб, ритуксимаб, тозитумомаб или трастузумаб. 11. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая (1) соединение по любому из пп.1-7 или (2) конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.8-10. 12. Применение соединения по любому из пп.1-7 для лечения рака. 13. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.8-10 для лечения рака. 14. Применение по п.12 или 13, где субъект страдает от плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака желудочно-кишечного тракта, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы, глиомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, колоректального рака, карциномы эндометрия, миеломы, карциномы слюнной железы, рака почки, базальноклеточной карциномы, меланомы, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака яичка, рака пищевода, видов рака головы и шеи, слизеобразующего рака яичников, холангиокарциномы или папиллярного рака почки.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Соединение, имеющее структуру формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, где R 1 представляет собой CH 3 или CH 2 -CH 3 , R 2 представляет собой H или CH 3 , R 3 представляет собой H или NH 2 и n равен 1 или 2. 2. Соединение по п.1, где n равен 1, R 1 представляет собой метил, R 2 представляет собой метил и R 3 представляет собой NH 2 . 3. Соединение формулы (Ii) формулы (Iii) формулы (Iiii) формулы (Iiv) формулы (Iv) или формулы (Ivi) 4. Соединение, имеющее структуру формулы II или его фармацевтически приемлемая соль, где R 1 представляет собой CH 3 или CH 2 -CH 3 , R 2 представляет собой H или CH 3 , R 4 представляет собой CH 3 , (CH 2 ) 4 NH 2 или (CH 2 ) 3 NHC(=O)NH 2 , R 5 представляет собой H, С(CH 3 )(CH 3 ), R 6 представляет собой NHC(=O) или CH 2 ; n равен 1 или 2 и m равен 0, 1, 2 или 3. 5. Соединение по п.4, где n равен 1, R 1 представляет собой метил, R 2 представляет собой метил и R 3 представляет собой NH 2 . 6. Соединение по п.4, где n равен 1, m равен 1, R 1 представляет собой метил, R 2 представляет собой метил, R 3 представляет собой NH 2 , R 4 представляет собой (CH 2 ) 4 NH 2 , R 5 представляет собой H и R 6 представляет собой CH 2 . 7. Соединение формулы (IIi) формулы (IIii) формулы (IIiii) или формулы (IIiv) 8. Конъюгат антитело-лекарственное средство, представляющий собой конъюгат соединения по любому из пп.4-7, где антитело является специфическим к раковому антигену. 9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8, где антитело представляет собой моноклональное антитело. 10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8 или 9, где антитело представляет собой алемтузумаб, бевацизумаб, брентуксимаб, цетуксимаб, гемтузумаб, ипилимумаб, офатумумаб, панитумумаб, ритуксимаб, тозитумомаб или трастузумаб. 11. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая (1) соединение по любому из пп.1-7 или (2) конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.8-10. 12. Применение соединения по любому из пп.1-7 для лечения рака. 13. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.8-10 для лечения рака. 14. Применение по п.12 или 13, где субъект страдает от плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака желудочно-кишечного тракта, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы, глиомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, колоректального рака, карциномы эндометрия, миеломы, карциномы слюнной железы, рака почки, базальноклеточной карциномы, меланомы, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака яичка, рака пищевода, видов рака головы и шеи, слизеобразующего рака яичников, холангиокарциномы или папиллярного рака почки.
Евразийское 032203 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201691963
(22) Дата подачи заявки 2015.04.10
(51) Int. Cl.
C07D 277/30 (2006.01) A61K31/426 (2006.01) A61K31/427 (2006.01)
(54) ПРОИЗВОДНЫЕ ТУБУЛИЗИНА
(31) 61/978,460
(32) 2014.04.11
(33) US
(43) 2017.06.30
(86) PCT/US2015/025235
(87) WO 2015/157594 2015.10.15
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МЕДИММЬЮН ЭлЭлСи (US)
(72) Изобретатель:
Гинджипалли Лакшмаях, Тоадер Дорин, Ван Фэнцзян (US)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(56) US-A1-20130197259 US-A1-20080108820 US-A1-20130129753 US-A1-20060148014
(57) Предложены новые производные тубулизина, которые могут быть полезны в качестве цитотоксических агентов для обеспечения терапевтических эффектов в лечении различных видов рака отдельно или в виде конъюгатов лекарственных средств с антителами. Производные тубулизина состоят из тетрапептидного каркаса, содержащего метил- и этилзамещенные пиперидины. Конъюгаты тубулизина дополнительно содержат моноклональное антитело, присоединенное посредством сукцинимидного линкера.
Предшествующий уровень техники
Тубулизины представляют собой класс цитостатических тетрапептидов, которые были выделены из миксобактерий (Sasse F et al J. Antibiotics, 2000, 879). Общим признаком тубулизинов является их тетра-пептидная структура, в которой только IIe (изолейцин) является природной аминокислотой, а три других представляют собой сложные неприродные аминокислоты: Мер (R-N-метилпипеколиновую кислоту), Tuv (тубувалин) и Tut (тубутирозин) или Tup (тубуфенилаланин). В дальнейшем были описаны дополнительные члены этого семейства (Steinmettz et al, Angew. Chem. Int. Ed.2004, 4888). Большинство природных тубулизинов демонстрировало pM цитотоксическую активность в отношении клеточных линий рака, которая коррелировала с ингибированием полимеризации тубулина. Механизм действия тубулизинов описан у Sasse (Khalil MW et al ChemBioChem, 2006, 678), который показал, что тубулизин А является более эффективным в ингибировании полимеризации тубулина, чем другие вещества, связывающиеся с доменом бета-тубулина, предназначенным для связывания соединений барвинка (фомопсин, доластатин и гемиастерлин). Природные тубулизины демонстрировали стабильно более высокую токсичность по сравнению с доластатином. Кроме того, сообщалось (Kaur G et al, Biochem. J, 2006, 235), что тубулизин А вызывает апоптоз в клеточных линиях рака и помимо сильной противоопухолевой активности демонстрирует антиангиогенную активность в животных моделях. На основании этих данных были приложены значительные усилия для поиска синтетических аналогов, сопоставимых по эффективности с природными тубулизинами. Присутствие ^О-ацеталь-содержащего Tuv создает проблему для синтеза тубулизи-нов и вызывает опасения относительно их стабильности. Некоторые группы идентифицировали синтетические аналоги, в которых N^-ацеталь заменен простой метильной группой без значительной потери цитотоксической активности (Patterson, A et al, Chem. Eur. J. 2007, 9534; Wipf P et al Org. Lett. 2007, 1605).
В некоторых сообщениях раскрыты конъюгаты тубулизинов с фолатом (Leamon CP et al, Cancer Res. 2008, 9839), наноконъюгаты с циклодекстрином (Schluep TS et al Clin. Cancer Res. 2009, 15:181), а также дендримерные конъюгаты (Floyd WC, ChemMedChem 2011, 49). В одном сообщении раскрыта конъюгация тубулизинов с моноклональными антителами (US2011/0027274).
Новые производные тубулизина могут быть полезны в качестве цитотоксических агентов для обеспечения терапевтических эффектов в лечении различных видов рака в монотерапии, в виде лекарственных конъюгатов или в комбинации с другими видами химиотерапии.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены соединения, имеющие структуру формулы I
где R1 представляет собой CH3 или CH2-CH3;
представляет собой H или CH3; R3 представляет собой H или NH2; и n равен 1 или 2;
или их фармацевтически приемлемые соли.
В некоторых аспектах n равен 1 и R1 представляет собой метил.
В некоторых аспектах R2 представляет собой метил.
В некоторых аспектах R3 представляет собой NH2.
В некоторых аспектах n равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил и R3 представляет собой NH2.
Соединения формулы I являются цитотоксичными и могут быть полезными для лечения рака. Согласно настоящему изобретению также предложены соединения, имеющие структуру формулы II
где R1 представляет собой CH3 или CH2-CH3;
представляет собой H или CH3; R4 представляет собой CH3, (CH2)4NH2 или (CH2)3NHC(=O)NH2;
R5 представляет собой Н; QCH^CH^; R6 представляет собой NHC(=O) или CH2; n равен 1 или 2; и m равен 0, 1, 2 или 3.
В некоторых аспектах n равен 1 и R1 представляет собой метил. В некоторых аспектах R2 представляет собой метил. В некоторых аспектах R представляет собой NH2.
В некоторых аспектах n равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил и R3 представляет собой NH2.
В некоторых аспектах R4 представляет собой (CH2)4NH2. В некоторых аспектах R5 представляет собой Н. В некоторых аспектах R6 представляет собой CH2. В некоторых аспектах m равен 1.
В некоторых аспектах n равен 1, m равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил, и R3 представляет собой NH2, R4 представляет собой (CH2)4NH2: R5 представляет собой H и R6 представляет собой CH2.
Соединения формулы I и соединения формулы II могут быть конъюгированы с антителом традиционными способами получения конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). В некоторых аспектах изобретения соединения формулы I и II конъюгированы с антителом посредством лизинов и цистеинов антитела с получением конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Предложены некоторые конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно данному изобретению, где антитело представляет собой моноклональное антитело. Предложены другие конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно данному изобретению, где антитело является специфическим к раковому антигену. Предложены другие конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно изобретению, где антитело представляет собой алемтузумаб, бевацизумаб, брентуксимаб, цетуксимаб, гемтузумаб, ипилимумаб, офатумумаб, па-нитумумаб, ритуксимаб, тозитумомаб или трастузумаб.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. Предложены фармацевтические композиции, содержащие ADC по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Также согласно данному изобретению предложены способы лечения рака, включающие введение субъекту, страдающему от рака, эффективного количества соединения формулы I или соединения формулы II. Также согласно данному изобретению предложены способы лечения рака, включающие введение субъекту, страдающему от рака, эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство, представляющего собой соединение формулы I или соединение формулы II, конъюгированное с антителом. В некоторых аспектах изобретения субъект страдает от плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака желудочно-кишечного тракта, лимфомы Ход-жкина, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы, глиомы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, ко-лоректального рака, карциномы эндометрия, миеломы, карциномы слюнной железы, рака почки, базаль-ноклеточной карциномы, меланомы, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака яичка, рака пищевода, видов рака головы и шеи, слизеобразующего рака яичников, холангио-карциномы или папиллярного рака почки.
Также предложены способы лечения рака, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I. Согласно данному изобретению также предложен способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей ADC по настоящему изобретению.
В некоторых аспектах способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В некоторых аспектах по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент представляет собой радионуклид или химиотерапевтический агент.
Подробное описание изобретения
где R1 представляет собой CH3 или CH2-CH3; R2 представляет собой H или CH3; R3 представляет собой H или NH2; и
Согласно настоящему изобретению предложены соединения, имеющие структуру формулы I
n равен 1 или 2;
или их фармацевтически приемлемые соли.
В некоторых аспектах n равен 1 и R1 представляет собой метил.
В некоторых аспектах R2 представляет собой метил.
В некоторых аспектах R3 представляет собой NH2.
В некоторых аспектах n равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил, и R3 представляет собой NH2.
Конкретные примеры соединений по изобретению формулы I включают соединения от (К) до (Ivi).
где
R1 представляет собой CH3 или CH2-CH3;
представляет собой H или CH3; R5 представляет собой CH3, (CH2)4NH2 или (CH2)3NHC(=O)NH2;
представляет собой Н; QCH3)(CH3);
представляет собой NHC(=O) или CH2; n равен 1 или 2; и m равен 0, 1, 2 или 3.
В некоторых аспектах n равен 1 и R1 представляет собой метил. В некоторых аспектах R2 представляет собой метил. В некоторых аспектах R3 представляет собой NH2.
В некоторых аспектах n равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил, и R3 представляет собой NH2.
В некоторых аспектах R4 представляет собой (CH2)4NH2. В некоторых аспектах R5 представляет собой Н. В некоторых аспектах R6 представляет собой CH2. В некоторых аспектах m равен 1.
Конкретные примеры соединений по изобретению формулы II включают соединения от (IIi) до
(Ilvi)
В некоторых аспектах изобретения n равен 1. В других аспектах изобретения n равен 2. В тех случаях, когда n равен 2, R1 заместители по пиперидиновому кольцу могут находиться на одном атоме углерода в кольце или могут находиться на разных атомах углерода в кольце. В некоторых аспектах изобретения, когда n равен 1, R1 заместитель кольца находится в пара-положении относительно атома азота. В других аспектах изобретения, когда n равен 1, R1 заместитель находится в мета-положении относительно атома азота в пиперидиновом кольце.
Соединения формулы I и II могут быть конъюгированы с антителами с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). В ADC комплексе соединения формулы I и соединения формулы II выступают в качестве терапевтических группировок, которые доставляются к интересующей терапевтической мишени с помощью антитела, с которым они конъюгированы. Фармацевтические композиции, содержащие ADC, образованные посредством конъюгации соединений формулы I и формулы II и антитела, также предложены. Также предложены способы получения ADC с использованием соединений формулы I и соединений формулы II. Также предложены способы лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение ADC по настоящему изобретению. Способы лечения рака дополнительно включают введение ADC по настоящему изобретению в комбинации с химиотерапевтическим агентом.
Чтобы настоящее изобретение было понято лучше, предварительно будут определены некоторые термины. Дополнительные определения даны в ходе подробного описания.
Предшествующее письменное описание, как считают, является достаточным, для того чтобы специалист в данной области техники смог осуществить на практике воплощения изобретения. В предшествующем описании и примерах подробно изложены некоторые воплощения и описан лучший вариант осуществления, предполагаемый авторами изобретения. Следует принимать во внимание, однако, что независимо от того, насколько подробно вышеизложенное может быть представлено в тексте, воплощения можно осуществить на практике множеством способов, а формула изобретения включает любые их эквиваленты.
Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понимать, что это изобретение не
ограничивается конкретными композициями или стадиями способа и по существу может варьировать. Использованные в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа "один", "какой-либо" и "этот" включают множественные значения, если в контексте четко не оговорено иное. Термины "один" (или "какой-либо"), а также термины "один или более чем один" и "по меньшей мере один" могут быть здесь использованы взаимозаменяемо.
Кроме того, термин "и/или", в тех случаях, когда он использован здесь, следует понимать как конкретное раскрытие каждого из двух конкретных признаков или компонентов вместе с другим или без него. Таким образом, термин "и/или", использованный здесь в выражении, таком как "А и/или В", подразумевает включение "А и В," "А или В," "А" (отдельно) и "В" (отдельно). Подобным образом, термин "и/или", использованный здесь в выражении, таком как "А, В и/или С" подразумевает включение каждого из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно) и С (отдельно).
Если не оговорено особо, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в той области техники, к которой относится данное изобретение. Например, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; и the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, обеспечивают специалисту общий словарь многих терминов, используемых в данном изобретении.
Единицы измерения, префиксы и символы обозначаются в форме, в которой они приняты в Международной системе единиц (СИ). Диапазоны числовых значений включают числа, определяющие диапазон. Если не оговорено особо, аминокислотные последовательности написаны слева направо в направлении от аминокислотного остатка к остатку, содержащему карбоксигруппу. Разделы, представленные здесь, не ограничивают различные аспекты, которые могут иметься посредством ссылки на описание в целом. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно определены посредством ссылки на описание во всей его полноте.
Понятно, что во всех случаях, когда аспекты описаны здесь с помощью формулировки "содержащий", другие аналогичные аспекты, описанные с помощью терминов "состоящий из" и/или "состоящий по существу из" также предусмотрены.
Аминокислоты обозначены здесь либо с помощью общеизвестных трехбуквенных кодов, либо с помощью однобуквенных кодов, рекомендованных Объединенной Комиссией ИЮПАК-ИЮБ (IUPAC-IUB) по биохимической номенклатуре.
Термины "ингибировать", "блокировать" и "подавлять" использованы здесь взаимозаменяемо и относятся к любому статистически значимому снижению биологической активности, включая полную блокаду активности. Например, "ингибирование" может относиться к снижению биологической активности на примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%.
Оценить пролиферацию клеток можно при использовании методов, известных в данной области техники, с помощью которых измеряют скорость деления клеток, и/или фракцию клеток в клеточной популяции, подвергнутую клеточному делению, и/или скорость потери клеток клеточной популяцией вследствие терминальной дифференцировки или клеточной гибели (например, введения тимидина).
Термины "антитело" или "иммуноглобулин", использованные здесь взаимозаменяемо, включают целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент или отдельные цепи и их комбинации (например, биспецифические антитела).
Типичное антитело содержит по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (здесь сокращенно VH) и константной области тяжелой цепи (здесь сокращенно CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (здесь сокращенно VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH и VL области могут быть дополнительно разделены на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными областями (FW). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FW, расположенных в следующем порядке от N-конца к С-концу: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Приводимые в качестве примера антитела по настоящему изобретению включают типичные антитела, scFv (одноцепочечные вариабельные фрагменты антител) и их комбинации, где, например, scFv ковалентно связано (например посредством пептидных связей или посредством химического линкера) с N-концом или тяжелой цепи и/или легкой цепи типичного антитела, либо интеркалировано в тяжелую цепь и/или легкую цепь типичного антитела.
Термин "антитело" означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывает мишень, такую как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации
вышеуказанного, с помощью по меньшей мере одной антигенраспознающей области в вариабельном участке молекулы иммуноглобулина. Использованный здесь термин "антитело" включает интактные по-ликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты), одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv), стабилизированные дисульфидными связями scFv, полиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух интактных антител и/или их антигенсвязывающих фрагментов, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие распознающую антиген часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую распознающую антиген область, при условии, что такие антитела проявляют требуемую биологическую активность.
Антитело может относиться к любому из пяти главных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM или их подклассов (изотипов) (например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), основанных на идентичности константных доменов их тяжелых цепей, обозначаемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов обладают различными и хорошо известными субъединичными структурами и трехмерными конфигурациями. Антитела могут быть свободными или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоактивные изотопы и так далее, с образованием ADC.
Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к части интактного антитела и относится к распознающим антиген вариабельным участкам интактного антитела. В данной области техники известно, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена с помощью фрагментов полноразмерного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, одноцепочечные антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.
"Моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, вовлеченных в высокоспецифичное распознавание и связывание отдельной антигенной детерминанты или эпитопа. В этом их отличие от поликлональных антител, которые, как правило, включают разные антитела, направленные против разных антигенных детерминант.
Термин "моноклональное антитело" включает как интактные, так и полноразмерные моноклональ-ные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (scFv), слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую участок распознавания антигена. Кроме того, "мо-ноклональное антитело" относится к таким антителам, полученным любым числом способов, включая гибридому, фаговую селекцию, экспрессию рекомбинантных антител и с помощью трансгенных животных (например экспрессию человеческого антитела в трансгенной мыши), но не ограничиваясь ими.
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, имеющему происхождение из не являющегося челевеческим иммуноглобулина (например мышиного), которое было сконструировано так, чтобы содержать минимальные не являющиеся человеческими последовательности. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из CDR заменены остатками из CDR не являющихся человеческими видов (например, мыши, крысы, кролика или хомяка), обладающими требуемой специфичностью, сродством и емкостью (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). В некоторых случаях FW остатки человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками антитела из не являющихся человеческими видов, обладающего требуемой специфичностью, и/или сродством, и/или емкостью.
Термин "конъюгат антитело-лекарственное средство" (ADC) относится к конъюгату, содержащему по меньшей мере одно антитело, связывающееся с соответствующим эпитопом, конъюгированное по меньшей мере с одним соединением формулы I или соединением формулы II. Соединения формулы I и соединения формулы II могут быть конъюгированы с антителами с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), тем самым соединения формулы I и соединения формулы II могут выступать в качестве терапевтических группировок, которые доставляются к интересующей терапевтической мишени с помощью антитела, с которым они конъюгированы.
В некоторых аспектах ADC содержит две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять терапевтических группировок. В некоторых конкретных аспектах ADC содержит две, три или четыре терапевтические группировки. В некоторых аспектах все терапевтические группировки являются одинаковыми. В некоторых аспектах по меньшей мере одна терапевтическая группировка отличается от остальных.
Терапевтическая группировка относится к отдельной молекуле соединения формулы I или отдельной молекуле соединения формулы II.
Термин "субъект" относится к любому животному (например млекопитающему), включая людей, приматов, грызунов и тому подобных, но не ограничиваясь ими, которое предназначено быть реципиентом конкретного лечения. Как правило, термины "субъект" и "пациент" используют здесь взаимозаменяемо по отношению к субъекту-человеку.
Термин "фармацевтическая композиция" относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает биологическую активность активного ингредиента, и который не содержит дополнительных недопустимых компонентов, токсичных для субъекта, которому будет вводиться данная композиция. Такая композиция может быть стерильной.
Термины, такие как "лечение", или "излечение", или "лечить", или "облегчение", или "облегчать", относятся как к (1) терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, облегчают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или расстройства, так и к (2) профилактическим или предупреждающим мерам, которые предупреждают и/или замедляют развитие целевого патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже имеется расстройство; тех, кто имеет предрасположенность к приобретению расстройства; и тех, у кого расстройство должно быть предупреждено. В некоторых аспектах, субъекта успешно "лечат" от рака согласно способам по настоящему изобретению, если пациент демонстрирует, например, полную, частичную или временную ремиссию определенного вида рака.
Термины "рак", "опухоль", "раковый" и "злокачественный" обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры раковых заболеваний включают карциному, включая аденокарциномы, лимфомы, бласто-мы, меланомы, саркомы и лейкозы, но не ограничиваются ими. Более
конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак желудочно-кишечного тракта, ходжкинскую и неход-жкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, такой как гепатокарцинома и гепатома, рак мочевого пузыря, рак молочной железы (включая гормонально опосредованный рак молочной железы, см., например, Innes et al. (2006) Br. J. Cancer 94:1057-1065), рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишки, карциному эндометрия, миелому (такую как множественная миелома), карциному слюнной железы, рак почки, такой как почечно-клеточная карцинома и опухоли Вильмса, базально-клеточную карциному, меланому, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак яичка, рак пищевода, различные типы рака головы и шеи и раковые заболевания муцинозного происхождения, такие как муцинозный рак яичника, холангиокарцинома (печени) и папиллярная карцинома почки.
Использованный здесь термин "цитотоксический агент" определен широко и относится к веществу, которое ингибирует или препятствует функционированию клеток, и/или вызывает разрушение клеток (клеточную смерть), и/или оказывает антинеопластические/антипролиферативные воздействия. Например, цитотоксический агент прямо или опосредованно предотвращает развитие, созревание и распространение злокачественных опухолевых клеток. Термин включает также такие агенты, которые вызывают только цитостатический эффект и ни в коей мере не вызывают цитотоксический эффект. Термин включает химиотерапевтические агенты, которые указаны далее, а также другие антагонисты HER2 (рецептора человеческого эпидермального фактора роста 2 типа), антиангиогенные агенты, ингибиторы тирозинкиназ, ингибиторы протеинкиназы А, члены семейства цитокинов, радиоактивные изотопы и токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения.
Термин "химиотерапевтический агент" является частным случаем термина "цитотоксический агент", включающим природные или синтетические химические соединения. Примеры химиотерапевти-ческих агентов включают алкилирующие агенты, например мустаргены, этилениминовые соединения, алкилсульфонаты и другие соединения с алкилирующим действием, такие как нитрозомочевины, цис-платин и дакарбазин; антиметаболиты, например антагонисты фолиевой кислоты, пурина и пиримидина; ингибиторы митоза, например алкалоиды барвинка и производные подофиллотоксина; цитотоксические антибиотики и производные камптотецина. Другими химиотерапевтическими агентами являются амифо-стин (ethyol(r)), цисплатин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, мехлорэтамин (мустарген), стрептозоцин, циклофосфамид, карнустин (BCNU), ломустин (CCNU), доксорубицин (Adriamycin(r)), доксорубицин липосомальный (doxil(r)), гемцитабин (gemzar(r)), даунорубицин, даунорубицин липосомальный (daunoXome(r)), прокарбазин, митомицин, цитарабин, этопозид, метотрексат, 5-фторурацил (5-FU), винб-ластин, винкристин, блеомицин, паклитаксел (taxol(r)), доцетаксел (taxotere(r)), альдеслейкин, аспарагина-за, бусульфан, карбоплатин, кладрибин, камптотецин, СРТ-11, 10-гидрокси-7-этил-камптотецин (SN3S), гефитиниб (Iressa(r)), дакарбазин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевина, ифосфамид, идаруби-цин, месна, интерферон альфа, интерферон бета, иринотекан, митоксантрон, топотекан, лейпролид, меге-строл, мелфалан, меркапропурин, пликамицин, митотан, пэгаспаргаза, пентостатин, пипоброман, плика-мицин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, урамустин, винорелбин, хлорамбуцил, ингибиторы ароматазы и их комбинации.
В соответствии со способами по настоящему изобретению соединения и ADC по настоящему изобретению могут быть введены пациенту для стимулирования положительного терапевтического ответа в отношении рака. Термин "положительный терапевтический ответ" применительно к лечению рака относится к облегчению симптомов, связанных с заболеванием.
Например, положительная динамика заболевания может быть охарактеризована как полный ответ. Термин "полный ответ" относится к отсутствию клинически диагностируемого заболевания с нормализацией любых результатов ранее проведенных исследований. Альтернативно, положительная динамика заболевания может быть классифицирована как частичный ответ. "Положительный терапевтический ответ" включает уменьшение или подавление прогрессирования и/или длительности течения рака, уменьшение или ослабление степени тяжести рака, и/или ослабление одного или более чем одного его симптома вследствие введения соединений по настоящему изобретению.
В конкретных аспектах такие термины относятся к одному, двум или трем результатам, полученным после введения соединений по настоящему изобретению:
1) стабилизация, уменьшение или элиминация популяции раковых клеток;
2) стабилизация или уменьшение роста опухоли;
3) ослабление канцерогенеза;
4) уничтожение, удаление или контроль первичного, местно-распространенного и/или метастатического рака;
5) снижение смертности;
6) увеличение длительности или частоты выживаемости без признаков заболевания, безрецидивной выживаемости, выживаемости без прогрессирования и/или общей выживаемости;
7) увеличение степени ответа, длительности ответа или числа пациентов, поддающихся лечению или находящихся в состоянии ремиссии;
8) снижение частоты госпитализации;
9) уменьшение срока госпитализации;
10) опухоль сохраняет свой размер и не увеличивается или увеличивается менее чем на 10%, предпочтительно менее чем на 5%, предпочтительно менее чем на 4%, предпочтительно менее чем на 2%; и
11) увеличение числа пациентов, находящихся в состоянии ремиссии;
12) уменьшение числа видов адъювантной терапии (например химиотерапии или гормональной терапии), которые в ином случае потребовались бы для лечения рака.
Клинический ответ можно оценить при использовании скрининговых методов, таких как ПЭТ (по-зитронно-эмиссионная томография), сканирование с помощью магнитной резонансной томографии (МРТ), рентгенография, компьютерное томографическое сканирование (КТ), проточная цитометрия или анализ с помощью клеточного сортера с активацией флуоресценции (КСАФ), гистология, макропатология и биохимический анализ крови, включая изменения, выявляемые с помощью ИФА (иммунофермент-ного анализа), РИА (радиоиммунного анализа), хроматографии и тому подобного, но не ограничиваясь ими. Помимо этих положительных терапевтических ответов субъект, проходящий лечение, может испытывать благоприятное воздействие от облегчения симптомов, связанных с заболеванием.
Соединения по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с любыми известными видами терапии рака, включая любой агент или комбинацию агентов, которые, как известно, являются полезными, или которые использовались или используются в настоящее время для лечения рака, например рака толстой кишки, рака легкого, рака желудка, плоскоклеточного рака головы и шеи и рака молочной железы. Противораковые агенты включают лекарственные средства, используемые для лечения злокачественных новообразований, например раковых опухолей. Медикаментозная терапия может быть использована отдельно или в комбинации с другими видами лечения, такими как хирургия или лучевая терапия. Некоторые классы лекарственных средств могут быть использованы при лечении рака в зависимости от природы пораженного органа. Например, виды рака молочной железы в большинстве случаев индуцированы эстрогенами и могут подвергаться лечению лекарственными средствами, которые инактивируют половые гормоны. Аналогично, рак предстательной железы может быть подвергнут лечению лекарственными средствами, которые инактивируют андрогены, мужские половые гормоны.
Противораковые агенты для применения в некоторых способах по настоящему изобретению включают, среди прочего, антитела, антиметаболиты, алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы, агенты, воздействующие на микротрубочки, ингибиторы киназ, ингибиторы синтеза белка, иммунотера-певтические агенты, гормональные препараты, глюкокортикоиды, ингибиторы ароматазы, ингибиторы mTOR (мишени рапамицина млекопитающих), химиотерапевтические агенты, ингибиторы протеинкина-зы В, ингибиторы фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), ингибиторы циклинзависимых киназ (CDK), RLr9, CD289, ингибиторы ферментов, анти-TRAIL (антитела к зависимому от фактора некроза опухоли лиганду, индуцирующему апоптоз), ингибиторы MEK (киназы митоген-активируемой протеинкиназы) и тому подобное.
В случаях, когда комбинированные виды терапии включают введение соединений по настоящему изобретению в комбинации с введением другого терапевтического агента, способы по настоящему изобретению включают совместное введение при использовании отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке. В некоторых аспектах соединения формулы I, соединения формулы II и/или ADC, описанные здесь, вводят в комбинации с другими лекарственными средствами, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное и терапевтический агент (терапевтические агенты) могут быть введены последовательно в
любом порядке или совместно (то есть одновременно или в пределах одного и того же временного интервала).
Комбинированное лечение может обеспечить "синергизм" и подтвердить "синергетический эффект", то есть эффект, достигаемый при совместном использовании активных ингредиентов больше, чем сумма эффектов, которые возникают в результате использования соединений по отдельности. Синерге-тический эффект может быть достигнут, когда активные ингредиенты: (1) приготовлены в виде одного препарата и вводятся или доставляются совместно в объединенной стандартной лекарственной форме; (2) доставляются по очереди или одновременно в виде отдельных препаратов; или (3) по какой-либо другой схеме. При доставке по схеме лечения с поочередным введением синергетический эффект может быть достигнут, когда соединения вводят или доставляют последовательно, например путем разных инъекций в отдельных шприцах. В основном, при лечении с поочередным введением эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят последовательно, то есть периодически, тогда как при комбинированном лечении эффективные дозы двух или более активных ингредиентов вводят совместно.
Соединения и ADC по настоящему изобретению (терапевтические агенты) могут быть введены пациенту посредством перорального, парентерального, ингаляционного или местного пути введения. Использованный здесь термин "парентеральный" включает, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Однако в других способах, соответствующих описываемым здесь принципам, ADC могут быть использованы для избирательно направленных соединений по настоящему изобретению для доставки терапевтических агентов непосредственно к месту нежелательной клеточной популяции, тем самым усиливая воздействие терапевтического агента на пораженную ткань.
Как здесь отмечено, терапевтические агенты по настоящему изобретению могут быть введены в виде фармацевтически приемлемой композиции для лечения раковых заболеваний in vivo. Как правило, соединения по настоящему изобретению будут приготовлены в виде растворов для внутривенного введения или в виде лиофилизированных концентратов для разведения с целью приготовления внутривенных растворов (например с физиологическим раствором, 5%-ной декстрозой или сходными изотоническими растворами). Фармацевтические композиции могут содержать фармацевтически приемлемые носители, включая, например, воду, иониты, белки, буферные вещества и соли. Также могут присутствовать консерванты и другие вспомогательные вещества. Носитель может являться растворителем или дисперсионной средой. Подходящие препараты для применения в способах лечения, раскрытых здесь, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980).
В любом случае стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены посредством включения терапевтических агентов по настоящему изобретению в требуемом количестве в соответствующий растворитель с последующей стерилизующей фильтрацией. Далее препараты можно упаковывать и продавать в форме набора. Такие изделия могут иметь этикетки или листки-вкладыши, указывающие, что соответствующие композиции применимы для лечения субъекта, страдающего от заболевания или расстройства или предрасположенного к нему.
Препараты для парентерального введения могут находиться в виде однократной болюсной дозы, инфузии или ударной болюсной дозы, за которой следует поддерживающая доза. Эти композиции можно вводить через конкретные фиксированные или изменяющиеся интервалы времени, например один раз в сутки или по мере необходимости.
Композиция может быть введена в виде однократной дозы, многократных доз или в течение установленного периода времени в виде инфузии. Режимы
дозирования также можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например терапевтического или профилактического ответа).
Терапевтически эффективные дозы композиций по настоящему изобретению для лечения раковых заболеваний, включая, например рак толстой кишки, рак легкого, рак желудка, плоскоклеточный рак головы и шеи, меланому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы и рак молочной железы, варьируют в зависимости от многих различных факторов, включая способы введения, сайт-мишень, физиологическое состояние пациента, то, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые лекарственные препараты и то, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент является человеком, но не являющиеся человеком млекопитающие, включая трансгенных млекопитающих, также могут быть подвергнуты лечению. Лечебные дозы могут быть оттитрованы при использовании традиционных способов, известных специалистам в данной области техники, для достижения оптимальной безопасности и эффективности.
Количество терапевтического агента по настоящему изобретению, которое необходимо ввести, может быть легко определено специалистом в данной области техники без излишних экспериментов. Факторы, влияющие на способ введения и соответствующее количество агента, включают тяжесть заболевания, историю болезни и возраст, рост, вес, здоровье и физическое состояние индивидуума, подвергающегося лечению, но не ограничиваются ими. Аналогично, количество анти-HER2-связывающей молекулы, например антитела или его фрагмента, варианта или производного, которое необходимо ввести, будет зависеть от способа введения и того, будет ли субъект подвергаться воздействию однократной дозы или
многократных доз этого агента.
Согласно настоящему изобретению также предложено применение терапевтического агента по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения вида рака, включающего, например, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легкого, рак желудка, плоскоклеточный рак головы и шеи, меланому, рак поджелудочной железы и рак предстательной железы.
Согласно изобретению также предложено применение терапевтического агента по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта. В некоторых аспектах лекарственное средство применяют у субъекта, ранее проходившего лечение с применением по меньшей мере одной другой терапии.
Под термином "ранее проходивший лечение" или "предварительное лечение" имеется в виду то, что субъект получал один или более чем один вид терапии (например был подвергнут лечению с применением по меньшей мере одной другой противораковой терапии) перед приемом лекарственного средства, содержащего соединения по настоящему изобретению. Необязательно, чтобы субъект реагировал на предварительное лечение с применением предшествующей терапии или нескольких видов терапии. Таким образом, субъект, который принимает лекарственное средство, мог реагировать или мог не реагировать на предварительное лечение с применением предшествующей терапии или на одну или более чем одну предшествующую терапию в случаях, когда предварительное лечение включало виды множественной терапии.
Согласно настоящему изобретению также предложено совместное применение терапевтического агента и по меньшей мере одного другого вида терапии совместно в одной композиции или совместно вводимых в одно и то же время или в частично перекрывающиеся интервалы времени в отдельных композициях.
Согласно настоящему изобретению также предложено применение терапевтического агента в изготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта, где агент вводят перед тем, как подвергнуть субъекта лечению с применением по меньшей мере одной другой терапии.
Примеры
Аспекты настоящего изобретения могут быть дополнительно определены со ссылкой на следующие неограничивающие примеры, которые подробно описывают получение некоторых соединений и промежуточных соединений по настоящему изобретению и способы применения соединений по настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники будет понятно, что многие модификации, как материалов, так и способов, могут быть применены в пределах объема настоящего изобретения. Если не оговорено особо:
I) температуры даны в градусах Цельсия (°C); когда процессы проводят при комнатной температуре или температуре окружающей среды, это означает диапазон 18-25°C, если не оговорено особо;
II) растворы сушили над безводным сульфатом натрия или сульфатом магния; выпаривание органического растворителя проводили при использовании роторного испарителя при пониженном давлении (4,5-30 мм рт.ст.(0,6-4 кПа)) с температурой бани до 30°C;
III) хроматография означает флэш-хроматографию на силикагеле; тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на силикагелевых пластинах;
IV) обычно ход взаимодействий контролируют посредством ТСХ или жидкостной хроматогра-фии/масс-спектроскопиии (ЖХ/МС), а величины времени взаимодействия даны только с иллюстрационной целью;
V) конечные продукты имеют удовлетворительные спектры протонного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и/или масс-спектральные данные;
VI) выходы даны только с иллюстрационной целью и необязательно являются такими, какие можно получить при тщательном проведении процесса; получения повторяли, если требовалось больше материала;
VII) в случае наличия, данные ядерного магнитного резонанса (ЯМР) представлены в виде значений дельта (5) для основных диагностических протонов, приведенных в миллионных долях (м.д.) относительно тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта, определяемых при 300 или 400 МГц в d6-DMSO (диметилсульфоксиде), если не оговорено особо;
VIII) химические символы имеют свои обычные значения;
IX) доля растворителя указана в соотношении объем:объем (об./об.);
X) очистку соединений проводили при использовании одного или более чем одного из следующих способов:
a) флэш-хроматография на стандартном силикагеле;
b) флэш-хроматография на силикагеле при использовании системы разделения Isco Combiflash(r): флэш-колонка RediSep с нормальной фазой, скорость потока 30-40 мл/мин (ISCO MPLC);
c) полупрепаративная ВЭЖХ-система разделения Gilson: колонка YMC pack ODS-AQ, 100x20 мм, S 5 мкм 12 нм, вода (0,1% трифторуксусная кислота) и ацетонитрил (0,1% трифторуксусная кислота) в качестве растворителя, 20 мин; и
a)
Вое
DCM
DIAD
DIC
DCC
DIEA
DMA
DMF
EDCI
EtOAc Et20
Fmoc-OSu
MeOH
Na2C03
NaHC03
TEA
TFA
THF
HATU
XI) использовали следующие аббревиатуры:
mpem-бутоксикарбонил;
дихлорметан;
диизопропилазодикарбоксилат; Ы.Ы'-диизопропилкарбодиимид; Ы.Ы'-дициклогексилкарбодиимид; диэтилизопропиламин; N, /V-д и м ети л ацетам и д; Л/,Л/-диметилформамид; 1 -этил-3-(3-
диметиламинопропил)карбодиимид этилацетат; диэтиловый эфир;
DAST
ACN
Boc20
кислота Мельдрума
9-флуоренилметил-Ы-сукцинимидилкарбонат метанол; карбонат натрия; гидрокарбонат натрия; комнатная температура; триэтиламин; трифторуксусная кислота; тетрагидрофуран; гексафторфосфат 1 -[бис(диметиламино)метилен]-1 Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридиний-3-оксида трифторид диэтиламиносеры ацетонитрил
ди-трет-бутилдикарбонат 2,2-диметил-1,3-диоксан-4,6-дион Общая схема синтеза соединений 1-5
К раствору (2Я,4Я)-4-метилпиперидин-2-карбоновой кислоты (2 г; 13,97 ммоль) в МеОН (40 мл) и воде (40,0 мл) добавляли параформальдегид (2,52 г; 27,94 ммоль) и Pd/C (10%) (0,8 г; 7,52 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение ночи. Посредством ТСХ установили, что взаимодействие не завершено. Добавляли еще один эквивалент пара-формальдегида (2,52 г; 27,94 ммоль) и реакционную смесь перемешивали еще в течение 24 ч. ТСХ показала, что взаимодействие завершено, и реакционную смесь фильтровали, катализатор промывали МеОН (2x30 мл). Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением неочищенного продукта в виде белого твердого вещества, которое промывали эфиром (3x30 мл), сушили под глубоким вакуумом в течение ночи с получением (2Я,4Я)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоновой кислоты (1) (1,870 г; 85%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 158 (M+ 1); 1H ЯМР (400 МГц, D2O) 5 м.д. 0.97 (d, J=5,52 Гц, 3H), 1.54 (ушир. s, 1H), 1.71-1.87 (m, 3H), 1.91-2.07 (m, 1H), 2.84 (s, 3H), 3.13 (td, J=8,41, 3,76 Гц, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.65 (m, 1H).
Промежуточное соединение 2
Вос2О (243,0 г; 1,1 моль) по каплям добавляли к суспензии (Я)-3-амино-4-метилпентановой кислоты (имеющейся в продаже) (133,0 г; 1,0 моль) и Na2CO3 (212 г; 2,0 моль) в ацетоне (1 л) и воде (1 л) при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и органический растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток разбавляли водой (1 л) и промывали EtOAc (500 млх3). Водную фазу подкисляли 2н. раствором HCl до значения pH 3 и полученную смесь экстрагировали EtOAc (800 млх3). Объединенные экстракты промывали рассолом (800 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали с получением соединения (2) (224,0 г; выход 97%) в виде масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 3
Триэтиламин (67 г; 0,61 моль) добавляли к суспензии промежуточного соединения (2) (140,0 г; 0,61 моль) и гидрохлорида N,O-диметилгидроксиламина (74,1 г; 0,76 моль) в CH2Cl2 (1,4 л) при перемешивании при 0°C. Суспензию перемешивали в течение 0,5 часа и порциями добавляли EDCl (74 г; 0,61 моль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°C и добавляли воду (800 мл). Органическую фазу отделяли, промывали 5%-ным раствором KHSO4 (800 млх3), насыщенным раствором NaHCO3 (800 млх3) и рассолом (800 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Остаток очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:5) с получением соединения (3) (141,0 г; выход 84%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 5.26 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 2.60~2.80 (m, 2H), 1.85 (m, 1H), 1.41 (s, 9H), 0.90 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0.88 (d, J=6,6 Гц, 3H).
Промежуточное соединение 4
Йодэтан (250,0 г; 1,6 моль) добавляли к раствору промежуточного соединения (3) (55,0 г; 0,2 моль) в DMF (1,1 л) при перемешивании при 0°C. Затем порциями добавляли NaH (60%-ная суспензия; 24,0 г; 0,60 моль) при 0°C и реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Реакционную смесь осторожно гасили водой (2 л) и добавляли EtOAc (2 л). Органическую фазу отделяли, промывали 5%-ным раствором KHSO4 (800 млх3), насыщенным раствором NaHCO3 (800 млх3) и рассолом (800 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Остаток очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:10) с получени-
ем трет-бутил-(Я)-этил-(1-(метокси(метил)амино)-4-метил-1-оксопентан-3-ил)карбамата (35,1 г; выход
58%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 3.70 (s, 3H), 3.65 (m, 1H), 3.10-3.30 (m, 5H), 2.50~2.95 (m,
2H), 1.90~2.20 (m, 1H), 1.40~1.55 (m, 9H), 1.10 (t, J=7,2 Гц, 3H), 0.90 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0.88 (d, J=6,6 Гц,
3H).
Промежуточное соединение 5
Раствор n-BuLi (106 мл; 2,5 н. в гексане; 0,17 моль) по каплям добавляли к раствору промежуточно-
го соединения (50) (74 г; 0,24 моль) в безводном THF (500 мл) при -78°C в атмосфере N2 при перемеши-
вании в течение 1 ч. Суспензию перемешивали в течение еще 30 мин и затем по каплям добавляли раствор промежуточного соединения (4) (51,0 г; 0,17 моль) в безводном THF (300 мл) в течение 30 мин при
-78°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -78°C и затем оставляли для нагревания до
комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Реакцию останавливали посредством добавления 20%-ного водного раствора хлорида аммония (1 л) и органический растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученную смесь экстрагировали EtOAc (800 млх3). Объединенные органические фазы промывали 5%-ным раствором KHSO4 (800 млх3), насыщенным раствором NaHCO3 (800 млх3) и рассолом (800 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:10) с получением трет-бутил-(Я)-(1 -(4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)-метил)тиазол-2-ил)-4-метил-1 -оксопентан-3 -ил)(этил) карбамата (58,1 г; выход 73%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCb): 5 7.53 (m, 1H), 4.90 (s, 2H), 4.04 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 1.40 (s, 9H), 0.80~1.20 (m, 18H), 0.14 (s, 6H). Промежуточное соединение 6
LiBH4 (4,8 г; 0,22 моль) порциями добавляли к раствору промежуточного соединения (5) (47,1 г; 0,1 моль) в метаноле (500 мл) при комнатной температуре в течение 0,5 часа при перемешивании. Суспензию перемешивали в течение 2 ч и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в EtOAc (800 мл) и полученный раствор промывали насыщенным раствором NaHCO3 (500 млх3) и рассолом (500 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством колоночной флэш-хроматографии (EtOAc/гексан, 1:6) с получением трет-бутил-((1Я,3Я)-1-(4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)тиазол-2-ил)-1-гидрокси-4-метилпентан-3-ил)(этил)карбамата (13,5 г; выход 28%) и его изомера (6') (21,0 г; выход 45%). 1H ЯМР (300 МГц, CDQ3) 5 м.д. 0.06-0.05 (m, 6H) 0.76-0.89 (m, 15H) 1.12 (t, J=6,97 Гц, 3H) 1.39 (s, 9H) 1.55-2.05 (m, 3H) 2.86-3.21 (m, 2H) 3.76-3.96 (m, 1H) 4.73 (d, J=1,13 Гц, 4H) 7.01 (s, 1H). Промежуточное соединение 7
Ацетилхлорид (45,2 г; 0,58 моль) по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения (6) (34,0 г; 72 ммоль) в пиридине (500 мл) при 0°C при перемешивании в течение 10 мин. Реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Реакционную смесь гасили водой (200 мл) и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток обрабатывали CH2Cl2 (800 мл) и полученную смесь промывали 5%-ным раствором KHSO4 (800 млх3), насыщенным раствором NaHCO3 (800 млх3) и рассолом (800 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:10) с получением (1Я,3Я)-3-((трет-бутоксикарбонил)(этил)амино)-1-(4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)тиазол-2-ил)-4-метилпентилацетата (25,7 г; выход 69%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDQ3): 5 7.15 (m, 1H), 5.95 (m, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.04 (m, 1H), 3.10 (m, 2H), 2.35 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.00 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.25 (t, J=7,2 Гц, 3H), 0.80~1.10 (m, 15H), 0.08 (s, 6H). Промежуточное соединение 8
Раствор фторида тетрабутиламмония (65,3 г; 0,25 моль) в THF (200 мл) по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения (7) (25,7 г; 50 ммоль) в THF (300 мл) при 0°C при перемешивании. Реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 4 ч. Добавляли воду (800 мл) и органический растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток обрабатывали CH2Cl2 (800 мл) и полученную смесь промывали 5%-ным раствором KHSO4 (800 млх3), насыщенным раствором NaHCO3 (800 млх3) и рассолом (800 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:4) с получением (1Я,3Я)-3-((трет-бутоксикарбонил)(этил)амино)-1-(4-(гидроксиметил) тиазол-2-ил)-4-метилпентилацетата (19,5 г; выход 98%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 8.26 (m, 1H), 5.95 (m, 1H), 4.83 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.56 (s, 9H), 1.10~1.30 (m, 3H), 0.80~1.05 (m, 6H). Промежуточное соединение 9
Реактив Десса-Мартина (32,7 г; 75 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения (8) (20,0 г; 50 ммоль) в дихлорметане (300 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь промывали раствором гидроксида натрия (1 н; 300 млх3), раствором тиосуль
фата натрия (1 н.; 300 млх3), насыщенным раствором NaHCO3 (300 млх3) и рассолом (300 млх1), соответственно. Органический слой сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха с получением соответствующего альдегида. Этот неочищенный альдегид растворяли в трет-бутиловом спирте (500 мл) и по каплям добавляли раствор хлорита натрия (80%; 36,4 г; 320 ммоль) и моногидрата дигидрофосфата натрия (105 г; 0,77 моль) в воде (300 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч и разбавляли раствором соляной кислоты (0,1 н; 500 мл). Полученную смесь экстрагировали EtOAc (500 млх1) и объединенные органические слои промывали 5%-ным раствором KHSO4 (500 млх3) и рассолом (500 млх1), сушили над Na2SO4 и концентрировали досуха. Остаток очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (CH2Cl2/MeOH, 100:5) с получением 2-((1Я,3Я)-1-ацетокси-3-((трет-бутоксикарбонил)(этил)амино)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоновой кислоты (15,4 г; выход 58%). 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 9.90 (ушир. s, 1H), 8.27 (s, 1H), 5.96 (m, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.15 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.20 (t, J=7,2 Гц, 3H), 0.98 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0.88 (d, J=6,6 Гц, 3H). Промежуточное соединение 10
К раствору промежуточного соединения (9) (6,5 г; 15,68 ммоль) в DCM (60 мл) по каплям добавляли TFA (30 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. Растворитель выпаривали под вакуумом с получением неочищенной 2-((1Я,3Я)-1-ацетокси-3-(этиламино)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоновой кислоты. Неочищенный продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (7,2 грамм). ЖХ-МС: 315 (M+1).
Промежуточное соединение 11
К раствору промежуточного соединения (10) (5 г; 11,67 ммоль) и бикарбоната натрия (9,80 г; 116,71 ммоль) в смеси ацетона (300 мл) и воды (150 мл) добавляли (9H-флуорен-9-ил)метил-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (3,94 г; 11,67 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХМС показала, что взаимодействие завершено. Смесь подкисляли до значения pH 2 соляной кислотой и ацетон выпаривали под вакуумом. Продукт экстрагировали DCM (3х300 мл). Объединенные органические экстракты промывали 0,1%-ным раствором HCl (200 мл), рассолом (200 мл), сушили над Na2SO4 и упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии (си-ликагель, MeOH/DCM, MeOH от 0 до 5%) с получением 2-((1Я,3Я)-3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)кар-бонил)(этил)амино)-1-ацетокси-4-метилпентил)тиазол-4-карбоновой кислоты (3,53 г; 54,6%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 537.2 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) 5 м.д. 0.84 (d, J=6,78 Гц, 3H), 0.92-1.05 (m, 5H), 1.14 (d, J=3,01 Гц, 1H), 1.73 (dt, J=10,23, 6,43 Гц, 1H), 1.92-2.05 (m, 1H), 2.12-2.27 (m, 4H), 2.28-2.44 (m, 1H), 2.90-3.33 (m, 2H), 3.98 (t, J=9,29 Гц, 1H), 4.12-4.32 (m, 1H), 4.47-4.82 (m, 2H), 5.95 (dd, J=10,92, 2,89 Гц, 1H), 7.29-7.45 (m, 4H), 7.55-7.69 (m, 2H), 7.72-7.81 (m, 2H), 8.22-8.29 (m, 1H).
Промежуточное соединение 12
DMAP (106 г; 0,86 моль) добавляли к раствору Boc-L-4-нитро-фенилаланина (1800 г; 0,58 моль) и кислоты Мельдрума (92 г; 0,64 моль) в дихлорметане (1,5 л). Полученный раствор охлаждали при -5°C в атмосфере N2 с последующим добавлением DCC (240 г; 1,16 моль) в дихлорметане (1 л) в течение 1 ч. Смесь перемешивали в течение ночи при 0~5°C. Затем осажденную ^^-дициклогексилмочевину удаляли посредством фильтрации и фильтрат промывали 5%-ной водной HCl (1 лх3) и рассолом (1 лх1) и сушили над MgSO4. После удаления MgSO4 посредством фильтрации органическую фазу концентрировали досуха. Остаток растирали со смесью EtOAc/гексан (1:1; 500 мл) и сушили с получением трет-бутил-^)-(1 -(2,2-диметил-4,6-диоксо- 1,3-диоксан-5-ил)-3-(4-нитрофенил)-1 -оксопропан-2-ил)карбамата (130,0 г; выход 51 %) в виде желтого твердого вещества.
АсОН (400 мл) добавляли к раствору промежуточного соединения (12) (130,0 г; 0,298 моль) в ди-
Промежуточное соединение 13
хлорметане (1,5 л) при -5°C в атмосфере N2. Небольшими порциями добавляли твердый NaBH4 (22,7 г; 0,597 моль) в течение 2 ч (выделение газа и экзотермическая реакция). После перемешивания в течение дополнительных 3 ч при -5°C ТСХ показала, что взаимодействие завершено. Смесь гасили рассолом (1 л). Органический слой отделяли и последовательно промывали водой (1 лх2), насыщенным водным NaHCO3 (1 лх3) и рассолом (1 лх3) и сушили над MgSO4. Фильтрат концентрировали досуха с получением трет-бутил-(Я)-(1-(2,2-диметил-4,6-диоксо-1,3-диоксан-5-ил)-3-(4-нитрофенил)пропан-2-ил)карбамата (70,3 г; выход 55%) в виде желтого твердого вещества. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 8.18 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.41 (d, J=8,7 Гц, 2H), 4.58 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 2.97 (d, J=6,6 Гц, 2H), 2.27 (m ,2H), 1.80 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.35 (s, 9H). Промежуточное соединение 14
K2CO3 (35 г; 0,25 моль) и Mel (36 г; 0,25 моль) добавляли к раствору промежуточного соединения (13) (70,3 г; 0,167 моль) в ацетоне (400 мл) и DMF (400 мл). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. ТСХ показала, что исходное вещество полностью израсходовано. Добавляли воду (2 л) и смесь перемешивали в течение дополнительного часа. Осажденное твердое вещество собирали посредством фильтрации, промывали водой, сушили с получением трет-бутил-^)-(1-(4-нитрофенил)-3-(2,2,5-триметил-4,6-диоксо-1,3-диоксан-5-ил)пропан-2-ил)карбамата (34,5 г; выход 47%) в виде бледно-желтого твердого вещества. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 8.17 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.34 (d, J=8,7 Гц, 2H), 4.22 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 2.85 (m, 2H), 2.22 (m, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.31 (s, 9H).
Промежуточное соединение 15
Промежуточное соединение (14) (34,5 г; 79,1 ммоль) растворяли в толуоле (500 мл). Раствор нагревали с обратным холодильником в течение 40 ч. ТСХ показала, что взаимодействие завершено. Растворитель удаляли с получением трет-бутил-(5Я)-3-метил-5-(4-нитробензил)-2-оксопирролидин-1-карбокси-лата (30 г), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 16
K2CO3 (22 г; 0,16 моль) добавляли к раствору промежуточного соединения (15) (30 г; 79 ммоль) в МеОН (300 мл). Смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. ТСХ показала полное превращение. Растворитель удаляли, остаток растворяли в дихлорметане (500 мл), промывали рассолом (500 млх3) и сушили над MgSO4. После удаления MgSO4 посредством фильтрации органическую фазу концентрировали досуха. Остаток далее очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:10) и получали метил-(4Я)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-метил-5-(4-нитрофенил) пентаноат (23,5 г; выход за две стадии 81%) в виде диастереомерной смеси, 1:1. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 8.13 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7.34 (d, J=8,7 Гц, 2H), 4.43 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 2.85 (m, 2H), 2.65 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.50 (m, 1H), 1.30 (s, 9H), 1.15 (t, J=6,6 Гц, 3H). Промежуточное соединение 17
50 г соединения (16) подвергали хиральной хроматографии с использованием СФХ (сверхкритической флюидной хроматографии) на колонке Chiralpak с внутренним размером 21х250 мм, 5 мкм при использовании подвижной фазы А 90% диоксида углерода и фазы В 10% изопропанола при скорости потока 60 мл/мин. Разделение проводили при 40°C и детектирование при 270 нм. Достигали полного разделения пиков и выделяли две фракции. Пик В представлял собой целевой метил-(2S,4R)-4-((трет-бутоксикарбонил)-амино)-2-метил-5-(4-нитрофенил)пентаноат, и его получали в виде твердого вещества (27,4 г; 55%). Диастереомерный избыток более 99:1 на колонке Chiralpak IA 4,6х250 мм, 5 мкм, 10%
смесь метанол:изопропанол, 1:1, в гексане с 0,1% диэтиламиновым модификатором. ЖХ/МС (2 мин, спо-
соб Acid _CV10.olp 367 (M+1), 1,16 мин. 1H ЯМР (400 МГц, метанол^) 5 м.д. 8.16 (d, J=8,53 Гц, 2H),
7.46 (d, J=8,53 Гц, 2H), 3.79-3.93 (m, 1H), 3.68 (s, 3H), 2.90-2.99 (m, 1H), 2.71-2.81 (m, 1H), 2.47-2.59 (m, 1H), 1.81-1.95 (m, 1H), 1.55-1.66 (m, 1H), 1.32 (s, 9H), 1.21-1.25 (m, 2H), 1.16 (d, J=7,03 Гц, 3H).
Промежуточное соединение 18
Раствор промежуточного соединения (17) в 6н. водном растворе HCl (8,0 мл; 263,30 ммоль) нагревали при 130°C в микроволновой печи в течение 30 мин. Реакционную смесь лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-амино-2-метил-5-(4-нитрофенил)пентановой кислоты в виде твердого вещества. Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (3,2 г). ЖХ-МС: 253 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, D2O) 5 м.д. 1.12 (d, J=7,28 Гц, 3H), 1.62-1.76 (m, 1H), 1.90-2.02 (m, 1H), 2.56-2.68 (m, 1H), 3.023.11 (m, 2H), 3.58-3.69 (m, 1H), 7.47 (d, J=8,53 Гц, 2H), 8.18 (d, J=8,78 Гц, 2H).
Промежуточное соединение 19
К раствору промежуточного соединения 18 (0,43 г; 1,49 ммоль) и NaHCO3 (1,251 г; 14,89 ммоль) в смеси ацетона (30 мл) и воды (15 мл) добавляли (9H-флуорен-9-ил)метил-2,5-диоксопирролидин-1-илкарбонат (0,502 г; 1,49 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ/МС показала, что взаимодействие завершено. Смесь подкисляли до значения pH 2 соляной кислотой и ацетон выпаривали под вакуумом. Продукт экстрагировали DCM (3х60 мл). Объединенные органические экстракты промывали 1 н. раствором HCl (40 мл), рассолом (40 мл), сушили над Na2SO4 и упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (EtOAc от 0% до 100% в DCM) с получением (2S,4R)-4-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-2-метил-5-(4-нитрофенил) пентановой кислоты (0,630 г; 89%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 475,5 (M+H); 1H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) 5 м.д. 0.81-1.06 (m, 1H), 1.08-1.28 (m, 2H), 1.33-1.75 (m, 1H), 1.77-2.11 (m, 1H), 2.362.69 (m, 2H), 2.76-3.18 (m, 1H), 3.43-4.08 (m, 1H), 4.09-4.19 (m, 1H), 4.21-4.53 (m, 2H), 4.54-4.80 (m, 1H), 7.18-7.58 (m, 8H), 7.66-7.82 (m, 2H), 7.95-8.17 (m, 2H), 8.67 (ушир. s, 1H).
Промежуточное соединение 20
DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения (19) (0,380 г; 0,80 ммоль) в DCM (4,5 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем в смесь добавляли 2-хлортритилхлоридную смолу (нагрузка 0,4 ммоль/г; 0,5 г; 0,80 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, полученную смолу промывали DMF (3х6 мл), МеОН (3х6 мл) и DCM (3х6 мл), затем обрабатывали DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) и смесью MeOH/DCM (1:1; 5 мл) при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученную смолу отфильтровывали, промывали DMF (3х6 мл), МеОН (3х6 мл) и DCM (3х6 мл), сушили под глубоким вакуумом в течение ночи. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы и анализировали посредством ЖХ/МС. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 475 (M+1).
Промежуточное соединение 21
К промежуточному соединению на смоле (20) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 минут, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3х6 мл), МеОН (3х6 мл), DCM (3х6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 253 (M+H).
К промежуточному соединению на смоле (21) (0,5 г; 1,88 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (11) (1,108 г; 2,07 ммоль), HATU (1,428 г; 3,76 ммоль), 2,4,6-триметилпиридин (0,500 мл; 3,76 ммоль) и DIEA (0,656 мл; 3,76 ммоль) в DMF (5 мл) при комнатной температуре. Смесь перемеши-
Промежуточное соединение 22
вали при комнатной температуре в течение двух часов и полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 771 (M+H). Промежуточное соединение 23
К промежуточному соединению на смоле (22) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 мин, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 549 (M+1).
Промежуточное соединение 24
К раствору (2S,3S)-2-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-3-метилпентановой кислоты (Fmoc-изолейцин) (7 г; 19,81 ммоль) и пиридина (1,602 мл; 19,81 ммоль) в DCM (120 мл) добавляли через канюлю раствор DAST (3,11 мл; 23,77 ммоль) в DCM (20 мл) в течение 10 минут. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, разбавляли DCM (80 мл), промывали ледяной водой (2x200 мл), органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и упаривали под вакуумом с получением (9H-флуорен-9-ил)метил-(2S,3S)-1-фтор-3-метил-1-оксопентан-2-илкарбамата (6,65 г; 94%) в виде белого твердого вещества. Проводили тест на этерификацию, чтобы подтвердить количественное образование фторангидрида, растворив Fmoc-IIe-F (5 мг) в безводном МеОН (0,3 мл) и DIEA (0,030 мл) и оставив для взаимодействия при комнатной температуре в течение 15 мин. Смесь затем упаривали под вакуумом и анализировали посредством ЖХМС, которая показала присутствие менее 1% Fmoc-IIe-OH. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) 5 м.д. 0.83-1.12 (m, 6H) 1.18-1.37 (m, 1H) 1.42-1.59 (m, 1H) 2.01 (ушир. s, 1H) 4.26 (t, J=6,78 Гц, 1H) 4.44-4.63 (m, 3H) 5.20 (d, J=8,53 Гц, 1H) 7.31-7.39 (m, 2H) 7.40-7.47 (m, 2H) 7.61 (d, J=7,28 Гц, 2H) 7.80 (d, J=7,53 Гц, 2H).
Промежуточное соединение 25
К промежуточному соединению на смоле (23) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (24) (0,569 г; 1,60 ммоль), DMAP (4,89 мг; 0,04 ммоль) и DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) в DCM (5 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл), сушили под глубоким вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы и анализировали посредством ЖХ/МС. ЖХ/МС показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 884 (M+H).
Промежуточное соединение 26
К промежуточному соединению на смоле (25) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 мин, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 662 (M+1).
Промежуточное соединение 27
К промежуточному соединению на смоле (26) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (1) (0,252 г; 1,60 ммоль), HATU (0,608 г; 1,60 ммоль), 2,4,6-триметилпиридин (0,320 мл; 2,40 ммоль) и DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 801 (M+1).
Промежуточное соединение 28
К промежуточному соединению на смоле (27) добавляли раствор дигидрата хлорида олова (II) (1,805 г; 8,00 ммоль) и ацетат натрия (0,197 г; 2,40 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы и анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 771 (M+H).
Соединение 1
К промежуточному соединению на смоле (28) (0,1 г; 0,16 ммоль) добавляли DCM (1 мл), воду (0,200 мл) и TFA (1 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, затем фильтровали и смолу промывали смесью вода/TFA (1:1, 3x2 мл) и фильтрат упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (ACN/H2O 0,1% TFA, ACN от 5 до 50% за 14 мин). Чистые фракции лиофи-лизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-аминофе-нил)-2-метилпентановой кислоты (0,050 г; 35,3%) в виде твердого вещества. ЖХ/МС: 771,8 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, метанол^4) 5 м.д. 7.8 (s, 1H), 7.30 (d, J=8,53 Гц, 2H), 7.08-7.18 (m, 2H), 5.66 (d, J=13,05 Гц, 1H), 4.57 (d, J=8,53 Гц, 1H), 4.29 (ddd, J=9,98, 6,71, 2,89 Гц, 1H), 3.90 (ушир. s, 1H), 3.73 (d, J=6,27 Гц, 1H), 3.24-3.33 (m, 1H), 2.84 (d, J=7,28 Гц, 2H), 2.68 (ушир. s, 3H), 2.40-2.53 (m, 2H), 2.20-2.36 (m, 1H), 2.03-2.12 (m, 4H), 1.75-2.00 (m, 7H), 1.64 (ddd, J=14,12, 10,23, 4,02 Гц, 2H), 1.42-1.57 (m, 2H), 1.30 (t, J=7,15 Гц, 3H), 1.01-1.17 (m, 7H), 0.88-0.98 (m, 7H), 0.84 (t, J=7,40 Гц, 3H), 0.77 (d, J=6,53 Гц, 3H). Промежуточное соединение 29
К раствору 2-этилпиперидин-2-карбоновой кислоты (320 мг; 1,65 ммоль) в МеОН (4,0 мл) и воде (4,0 мл) добавляли параформальдегид (372 мг; 4,13 ммоль) и Pd/C (10%) (88 мг; 0,83 ммоль). Добавляли один эквивалент карбоната натрия (175 мг; 1,65 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ/МС показывала полное превращение исходного вещества. Реакционную смесь фильтровали через диатомит. Осадок на фильтре промывали МеОН (2x30 мл). Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенное твердое вещество суспендировали в метаноле (50 мл), и полученную суспензию фильтровали и фильтрат концентрировали с получением 2-этил-1-метилпиперидин-2-карбоновой кислоты (202 мг; 71,4%) в виде твердого вещества. ЖХ/МС: 172 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 3.58 (td, J=12,80, 3,51 Гц, 1H), 3.09-3.20 (m, 1H), 2.81 (s, 3H), 2.17-2.29 (m, 1H), 1.54-1.84 (m, 7H), 0.98 (t, J=7,40 Гц, 3H). Промежуточное соединение 30
0,96 ммоль) и DIPEA (0,168 мл; 0,96 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x4 мл), МеОН (3x4 мл) и DCM (3x4 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 815 (M+H). Промежуточное соединение 31
К промежуточному соединению на смоле (30) добавляли раствор дигидрата хлорида олова(П) (0,544 г; 2,41 ммоль) и ацетата натрия (0,059 г; 0,72 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 4 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 785 (M+H).
Соединение 2
К промежуточному соединению на смоле (31) добавляли DCM (2 мл) и TFA (0,493 мл; 6,40 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Смолу промывали смесью DCM/TFA (1:1; 3x2 мл) и фильтраты упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (ACN/H2O 0,1% муравьиная кислота, ACN от 10% до 50% за 14 минут). Чистые фракции лиофилизировали с получением (28,4Я)-4-(2-((1Я,3Я)-1-ацетокси-3-((28,38)-№ этил-2-(2-этил-1 -
метилпиперидин-2-карбоксамидо)-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-аминофенил)-2-метилпентановой кислоты (0,057 г; 20,31%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 785 (M+H); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 7.98 (s, 1H), 6.87 (m, J=8,28 Гц, 2H), 6.54 (m, J=8,03 Гц, 2H), 5.63-5.73 (m, 1H), 4.60-4.71 (m, 3H), 4.17 (ушир. s, 2H), 3.76 (dd, J=14,93, 7,15 Гц, 1H), 2.69 (d, J=6,53 Гц, 2H), 2.42 (ушир. s, 1H), 2.36 (s, 3H), 2.29 (ушир. s, 2H), 2.03-2.12 (m, 3H), 1.88 (d, J=9,79 Гц, 3H), 1.79 (ушир. s, 2H), 1.49-1.64 (m, 5H), 1.43 (ушир. s, 2H), 1.23-1.35 (m, 4H), 1.11 (d, J=7,78 Гц, 1H), 1.06 (d, J=7,03 Гц, 4H), 0.93 (d, J=15,81 Гц, 3H), 0.94 (d, J=15,56 Гц, 3H), 0.70-0.87 (m, 9H). Промежуточное соединение 32
К суспензии 1-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилпиперидин-2-карбоновой кислоты (1 г; 4,11 ммоль) и карбоната калия (0,852 г; 6,17 ммоль) в ACN (20 мл) по каплям добавляли бензилбромид (0,733 мл; 6,17 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ/МС показала образование требуемого продукта. Реакционную смесь разбавляли водой (2 мл) и экстрагировали этилацетатом (2x30 мл). Объединенные экстракты сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии (силика-гель, элюент гексан/этилацетат, 80/20) с получением 2-бензил-1-(трет-бутил)-2-метилпиперидин-1,2-дикарбоксилата (1,27 г; 92%) в виде масла. ЖХ-МС: 356 (M+Na); 1H ЯМР (400 МГц, CD2Cl2) 5 м.д. 7.337.45 (m, 5H), 5.13-5.27 (m, 2H), 3.91-4.09 (m, 1H) ,2.83-3.09 (m, 1H), 2.10-2.32 (m, 1H), 1.56-1.72 (m, 1H), 1.30-1.51 (m, 12H), 1.09 (qd, J=12,42, 4,64 Гц, 1H), 0.90-0.98 (m, 3H). Промежуточное соединение 33
К раствору промежуточного соединения (32) (1,2 г; 3,60 ммоль) в DCM (10 мл) по каплям добавляли TFA (4,16 мл; 53,99 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. ЖХ/МС показала полное снятие защитной группы Boc. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенное вещество подщелачивали насыщенным водным бикарбонатом натрия и водный слой экстрагировали этилацетатом (2x50 мл). Объединенные экстракты сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением бензил-2-метилпиперидин-2-карбоксилата
К раствору промежуточного соединения (33) (1,45 г; 6,22 ммоль) и DIEA (2,388 мл; 13,67 ммоль) в DCM (25 мл) по каплям добавляли бензилхлорформиат (0,875 мл; 6,22 ммоль) при 0°C. Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляли 30 мл DCM и 4 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, перемешивали в течение 5 мин. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали (2x30 мл) DCM. Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, гексан/этилацетат, 90/10) с получением дибензил-2-метилпиперидин-1,2-дикарбоксилата (1,32 г; 58%) в виде масла. ЖХ-МС: 268 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, метанол-dO 5 м.д. 7.21-7.42 (m, 10H), 5.04-5.18 (m, 2H), 5.00 (ушир. s, 2H), 4.91 (ушир. s, 1H), 3.88 (d, J=12,80 Гц, 1H), 3.17 (t, J=9,54 Гц, 1H), 1.83-1.97 (m, 1H), 1.55-1.78 (m, 4H), 1.51 (s, 3H).
Промежуточное соединение 35
Промежуточное соединение (34) подвергали СФХ разделению на хиральной колонке (Chiralpak AD, диоксид углерода/метанол, 90-10%) на два энантиомера для выделения требуемого продукта дибензил-(Я)-2-метилпиперидин-1,2-дикарбоксилата. ЖХ-МС: 368 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 7.197.44 (m, 10H), 5.04-5.15 (m, 2H), 5.00 (ушир. s, 2H), 3.88 (d, J=13,05 Гц, 1H), 3.17 (t, J=9,54 Гц, 1H), 1.841.97 (m, 1H), 1.55-1.78 (m, 5H), 1.51 (s, 3H); %ее (энантиомерный избыток): более 98; Оптическое вращение: [a]D: +2° (метанол).
Промежуточное соединение 36
К раствору промежуточного соединения (35) (600 мг; 1,63 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляли па-раформальдегид (49,0 мг; 1,63 ммоль) и палладий на угле (174 мг; 1,63 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ/МС показала исчерпание исходного вещества. Реакционную смесь фильтровали, катализатор промывали МеОН (2x30 мл). Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением неочищенного продукта в виде белого твердого вещества, которое промывали эфиром (3x30 мл), сушили под глубоким вакуумом в течение ночи с получением 1,2-диметилпиперидин-2-карбоновой кислоты (230 мг; 90%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 158 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, метанолч!4) 5 м.д. 3.03-3.18 (m, 1H), 2.76 (ушир. s, 3H), 2.01 (ушир. s, 1H), 1.83 (ушир. s, 2H), 1.72-1.81 (m, 1H), 1.62-1.71 (m, 2H), 1.48 (s, 3H). Оптическое вращение: aD +24° (метанол).
Промежуточное соединение 37
К промежуточному соединению на смоле (26) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (36) (0,189 г; 1,20 ммоль), HATU (0,608 г; 1,60 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (0,318 мл; 2,40 ммоль) и DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл) и сушили. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 801 (M+1).
Промежуточное соединение 3 8
К промежуточному соединению на смоле (37) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли раствор дигидрата хлорида олова(П) (1,384 г; 6,13 ммоль) и ацетата натрия (0,151 г; 1,84 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч и полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 771 (M+H).
Соединение 3
К промежуточному соединению на смоле (3S) (0,15 г; 0,24 ммоль) добавляли DCM (5 мл) и TFA (0,370 мл; 4,80 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем фильтровали и промывали DCM (2x50 мл). Фильтраты упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (ACN/H2O 0,1% муравьиная кислота, ACN от 10% до 50% за 14 минут). Чистые фракции лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((R)-1,2-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-аминофенил)-2-метилпентановой кислоты (0,037 г; 17,86%) в виде твердого вещества. ЖХ/МС: 771 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 7.97 (s, 1H), 6.87 (d, J=8,03 Гц, 2H), 6.53 (d J=8,03 Гц, 2H), 5.67 (d, J=12,80 Гц, 1H), 4.59 (d, J=8,28 Гц, 1H), 4.17 (ушир. s, 2H), 3.72 (d, J=7,28 Гц, 1H), 2.69 (d, J=6,27 Гц, 3H), 2.42 (ушир. s, 2H), 2.28 (ушир. s, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.07 (s, 3H),1.74-1.94 (m, 3H), 1.45-1.62 (m, 4H), 1.36 (ушир. s, 3H), 1.27 (t, J=7,03 Гц, 3H), 1.10 (s, 3H), 1.06 (d, J=7,03 Гц, 4H), 0.95 (d, J=6,53 Гц, 3H), 0.90 (d, J=6,78 Гц, 4H), 0.83 (t, J=7,40 Гц, 4H), 0.74 (d, J=6,27 Гц, 3H).
Промежуточное соединение 39
Триэтиламин (40 г; 0,4 моль) добавляли к суспензии Boc-L-фенилаланина (90 г; 0,34 моль) и гидрохлорида N,O-диметилгидроксиламина (36,5 г; 0,37 моль) в DCM (500 мл) при 0°C при перемешивании. Суспензию перемешивали в течение 10 мин и добавляли EDCl (соль HCl; 72 г; 0,37 моль). Суспензию перемешивали в течение еще 3 ч при 0°C. Смесь гасили насыщенным водным NaHCO3 (1 л). Слои разделяли и водную фазу реэкстрагировали DCM (500 млx3). Объединенные органические фазы промывали водой (1 лx3), 5%-ным водным KHSO4 (1 лx3), насыщенным водным NaHCO3 (1 лx3) и рассолом (1 лx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество далее очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:1) с получением ^)-трет-бутил-1-(метокси(метил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-илкарбамата (85,1 г; выход 81%) в виде белого твердого вещества. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.15-7.26 (m, 5H), 5.25 (bs, 1H), 4.95 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 2.83~3.07 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
Промежуточное соединение 40
Раствор промежуточного соединения (39) (97,1 г; 0,315 моль) в безводном THF (500 мл) по каплям добавляли к суспензии LiAlH4 (12,0 г; 0,316 моль) в безводном THF (200 мл) при -10°C при перемешивании в течение 1 часа. Суспензию перемешивали в течение еще 3 ч при 0°C, затем гасили водой (12 мл), 15%-ным водным NaOH (12 мл) и водой (12 млx3) при -10°C. После перемешивания в течение 0,5 ч смесь фильтровали, фильтрат концентрировали досуха с получением ^)-трет-бутил-1-оксо-3-фенил-пропан-2-илкарбамата (45,2 г; неочищенный), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1H ЯМР (300 МГц, CDO3): 5 9.65 (s, 1H), 7.17~7.33 (m, 5H), 4.80 (m, 1H), 2.80~3.15 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).
Промежуточное соединение 41
Раствор трифенилфосфина (173,7 г; 0,66 моль) и этил-2-бром-пропионата (100 г; 0,55 моль) в этил-ацетате (400 мл) нагревали с обратным холодильником в течение ночи. После охлаждения смесь фильтровали. Осадок на фильтре промывали этилацетатом и сушили с получением соли фосфония. Соль фос-фония растворяли в DCM (400 мл). Добавляли молекулярные сита (4 А; 50 г) с последующим добавлением по каплям триэтиламина (111 г; 1,1 моль) при комнатной температуре при перемешивании. Смесь перемешивали в течение еще 1 ч, затем фильтровали. Фильтрат промывали водой (300 млx3), 5%-ным водным KHSO4 (300 млx3) и рассолом (300 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество далее очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:10) с получением этил-(трифенилфосфоранилиден)пропионата (105 г; выход 52%) в виде твердого вещества. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.34~8.10 (m, 15H), 4.02 (q, J=7,2 Гц, 2H), 1.68 (m, 3H), 1.01 (t, J=7,2 Гц, 3H).
Промежуточное соединение 42
Раствор промежуточного соединения (40) (52 г; 0,21 моль) и промежуточного соединения (41) (76 г; 0,21 моль) в DCM (500 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток далее очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:10) с получением (S)-этил-4-(трет-бутоксикарбониламино)-2-метил-5-фенилпент-2-еноата (45,3 г; выход 64%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.17~7.32 (m, 5H), 6.53 (dd, J=1,2 и 9 Гц, 1H), 4.63 (m, 2H), 4.18 (q, J=7,2 Гц, 2H), 2.76~2.95 (m, 2H), 1.72 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.28 (t, J=7,2 Гц,
3H).
Промежуточное соединение 43
Промежуточное соединение (42) (45 г; 0,135 моль) растворяли в МеОН (600 мл), содержащем 10% Pd/C (10 г). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали через диатомит и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в ацетоне (200 мл) и добавляли водный NaOH (2 М; 135 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 ч. Реакционную смесь выливали в водный HCl (2 М; 135 мл) и экстрагировали DCM (300 млx3). Объединенные органические экстракты сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением ^)-4-(трет-бутоксикарбониламино)-2-метил-5-фенилпентановой кислоты (41,0 г; приблизительно 100% выход), которую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ-МС подтвердила ее струк-
туру.
Промежуточное соединение 44
Промежуточное соединение (43) (28 г; 0,091 моль) растворяли в безводном THF (200 мл) и охлаждали до -40°C. К этому раствору добавляли триэтиламин (10,1 г; 0,099 моль) с последующим добавлением по каплям этилхлорформиата (11 г; 0,10 моль) в течение 15 мин. Реакционную смесь перемешивали в течение еще 1 ч при -40°C и затем фильтровали для удаления осажденного вещества. Фильтрат охлажда
ли до 0°C и обрабатывали водной суспензией, содержащей борогидрид натрия (7,5 г; 0,197 моль) в воде (20 мл), в течение 30 мин. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин и при комнатной температуре в течение еще 30 мин. Смесь разбавляли EtOAc (500 мл) и промывали рассолом (500 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (200 млx3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным водным NaHCO3 (500 млx2) и рассолом (500 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением маслянистого остатка. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 10:1) с получением трет-бутил-(2R,4S)-5-гидрокси-4-метил-1-фенилпентан-2-илкарбамата (17,5 г; выход 65%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.15~7.29 (m, 5H), 4.60 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.45 (d, J=5,7 Гц, 2H), 2.71~2.11 (m, 4H), 1.78 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.25 (m, 1H). Промежуточное соединение 45
Перйодинан Десса-Мартина (39 г; 89,4 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения (44) (17,5 г; 59,7 ммоль) в DCM (300 мл) и суспензию перемешивали в течение 15 часов при комнатной температуре. Смесь промывали водным NaOH (1 н.; 300 млx3) и рассолом (300 млx3), сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:6) с получением трет-бутил-(3S,5R)-5-бензил-3-метил-2-оксопирролидин-1-карбоксилата (9,1 г; выход 53%) в виде масла. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.16~7.35 (m, 5H), 4.30 (m, 1H), 3.15 (dd, J=3,3 и 13,2 Гц, 1H), 2.73 (dd, J=9,6 и 13,2 Гц), 2.42 (m, 1H), 2.00~2.10 (m, 2H), 1.58 (s, 9H), 1.15 (d, J=6,9 Гц, 3H).
Промежуточное соединение 46
Промежуточное соединение (45) (9,0 г; 31,1 ммоль) и водный HCl (4 н.; 150 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 4 ч. После охлаждения растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в ацетоне (100 мл) и воде (100 мл). pH раствора доводили до значения 8,5 с помощью 2 М водного NaOH и по каплям добавляли раствор Fmoc-OSu (12 г; 35 ммоль) в ацетоне (20 мл), во время данного процесса pH этого раствора поддерживали на уровне 8~9 с помощью 2 М водного NaOH. Суспензию перемешивали в течение 4 ч, затем подкисляли 2 М водным HCl до pH 3, экстрагировали EtOAc (200 млx3). Объединенные органические фазы промывали водой (100 млx3), 5%-ным водным KHSO4 (100 млx3) и рассолом (100 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:1) с получением (2S,4R)-4-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-2-метил-5-фенилпентановой кислоты (5,3 г; выход 40%). ЖХ-МС: 430 [M+1]; 1Н ЯМР (400 МГц, метанол-dzO 5 м.д. 7.78-7.83 (m, 2Н), 7.59-7.65 (m, 2Н), 7.37-7.43 (m, 2Н), 7.28-7.35 (m, 2Н), 7.14-7.26 (m, 5Н), 6.94-7.01 (m, 1Н), 4.28-4.36 (m, 1Н), 4.21-4.27 (m, 1Н), 4.104.16 (m, 1Н), 3.84-3.93 (m, 1Н), 2.68-2.82 (m, 2Н), 2.48-2.60 (m, 1Н), 1.86-1.95 (m, 1Н), 1.42-1.51 (m, 1Н), 1.17 (d, J=7,03 Гц, 3Н), 1.09-1.14 (m, 1Н).
Схема
Промежуточное соединение 47
Этилхлорформиат (12,6 мл; 0,13 моль) по каплям добавляли к раствору I-Me-Boc-L-Val-OH (27,3 г; 0,12 моль) и триэтиламина (14,7 мл; 0,13 моль) в безводном THF (200 мл) при -20°C в течение 15 мин и полученную белую суспензию дополнительно перемешивали в течение 30 мин. Раствор диазометана (0,36 моль; приготовленный из 60 г №нитрозо-№метилмочевины и высушенный над гидроксидом калия) в эфире (500 мл) затем вводили в реакционную смесь через канюлю. Смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 5 ч, затем осторожно гасили водной уксусной кислотой (10%; 250 мл). Слои разделяли и органический слой промывали насыщенным бикарбонатом натрия (300 млx3) и рассолом (300 млx3), сушили (Na2SO4), концентрировали до примерно 200 мл. Остаток растворяли в THF (900 мл) и воде (100 мл). Раствор нагревали до 40°C и добавляли ацетат серебра (500 мг). Суспензию перемешивали в течение 5 ч, затем концентрировали до примерно 300 мл. Остаток экстрагировали EtOAc (500 млx3). Органический слой промывали насыщенным бикарбонатом натрия (300 млx3) и рассолом (300 мл), сушили (Na2SO4) концентрировали с получением ^)-3-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)-4-метилпентановой кислоты (23,8 г; выход 81%), которую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 10.08 (bs, 1Н), 4.00 (m, 1Н), 2.75 (m, 3Н), 2.55 (m, 2Н), 1.43 (s, 9h), 0.85~0.84 (m, 6Н). Промежуточное соединение 48
Триэтиламин (34,3 мл; 0,244 моль) добавляли к суспензии промежуточного соединения (47) (60 г; 0,244 моль) и гидрохлорида N,O-диметилгидроксиламина (23,9 г; 0,244 моль) в CH2Cl2 (300 мл) при перемешивании при 0°C. Суспензию перемешивали в течение 0,5 часа при этой температуре, затем порциями добавляли EDCl (46,9 г; 0,244 моль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение еще 2 ч при 0°C, затем гасили водой (300 мл). Органическую фазу отделяли и промывали 5%-ным водным KHSO4 (300 млx3), насыщенным водным NaHCO3 (300 млx3) и рассолом (300 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Остаток далее очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:3) с получением трет-бутил-(R)-(1-(метокси(метил)амино)-4-метил-1-оксопентан-3-ил)(метил)карбамата (52 г; выход 74%) в виде масла.
Промежуточное соединение 49
трет-Бутилнитрит (приготовленный из 0,61 моль NaNO2 и 110 мл трет-бутилового спирта) по каплям добавляли к суспензии CuBr2 (260 г; 1,16 моль) и этил-2-аминотиазол-4-карбоксилата (100 г; 0,58 моль) в ACN (500 мл) при 0°C в течение 1 ч. Смесь перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, затем гасили EtOAc (800 мл) и водой (800 мл). Смесь фильтровали и фильтрат разделяли на водную и органическую фазу. Водную фазу экстрагировали EtOAc (800 млx2). Объединенные органические экстракты промывали 5%-ным водным KHSO4 (300 млx3), насыщенным водным NaHCO3 (300 млx3) и рассолом (300 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха с получением этил-2-бромтиазол-4-карбоксилата (79,4 г; выход 58%), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): 5 7.45 (s, 1Н), 4.20 (q, J=7,2 Гц, 2Н), 1.25 (t, J=7,2 Гц, 3Н). Промежуточное соединение 50
NaBH4 (16,5 г; 0,43 моль) порциями добавляли к раствору промежуточного соединения (49) (68 г; 0,288 моль) в этаноле (500 мл) при 50°C в течение 0,5 ч при перемешивании. Суспензию нагревали с обратным холодильником в течение 5 ч и порциями добавляли другую часть NaBH4 (8,25 г; 0,22 моль).
Смесь нагревали с обратным холодильником в течение еще 12 ч. После ее охлаждения до комнатной
температуры растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в DCM (500 мл) и
промывали насыщенным водным NaHCO3 (300 млx3) и рассолом (300 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха с получением спирта. Спирт растворяли в DMF (300 мл) и добавляли имидазол (28,3 г; 0,416 моль). Раствор TBS-Cl (62, г; 0,16 моль) в THF (100 мл) по каплям добавляли к этому раствору при
комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 12 ч, затем гасили водой (800 мл) и экстрагиро-
вали EtOAc (800 млx2). Объединенные органические экстракты промывали 5%-ным водным KHSO4 (300 млx3), насыщенным водным NaHCO3 (300 млx3) и рассолом (300 млx1), сушили (Na2SO4) и концентри-
ровали досуха. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:30) с
получением 2-бром-4-((трет-бутилдиметилсилилокси)метил)тиазола (42,0 г; выход за две стадии 47%) в виде масла. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCb): 5 7.15 (t, J=1,5 Гц, 1Н), 4.84 (d, J=1,5 Гц, 2Н), 0.94 (s, 9Н), 0.12 (s, 6Н).
Промежуточное соединение 51
Раствор n-BuLi (77 мл; 2,5 н. в гексане; 0,19 моль) по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения (50) (53,9 г; 0,175 моль) в безводном THF (500 мл) при -78°C в атмосфере N2 при перемешивании в течение 1 ч. Суспензию перемешивали в течение 30 мин при этой температуре. Затем по каплям добавляли раствор промежуточного соединения (48) (50,4 г; 0,175 моль) в безводном THF (200 мл) в течение 30 мин при -78°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при этой температуре, затем оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Смесь гасили 20%-ным водным хлоридом аммония (1 л) и удаляли органический растворитель при пониженном давлении. Полученную смесь экстрагировали EtOAc (500 млx3). Объединенные органические фазы промывали 5%-ным водным KHSO4 (500 млx3), насыщенным водным NaHCO3 (500 млx3) и рассолом (500 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество далее очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:10) с получением ^)-трет-бутил-1-(4-((трет-бутилди-метилсилилокси)метил)тиазол-2-ил)-4-метил-1-оксо-пентан-3-ил(метил)карбамата (38,1 г; выход 48%) в виде масла. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCb): 5 7.55 (m, 1Н), 4.91 (s, 2Н), 4.27 (m, 1Н), 3.20-3.60 (m, 2Н), 1.90 (m, 1Н), 1.03 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0.97 (s, 9Н), 0.88 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0.15 (s, 6Н). Промежуточное соединение 52
NaBH4 (4,7 г; 125 ммоль) порциями добавляли к раствору промежуточного соединения (51) (38,0 г; 83,3 ммоль) в метаноле (200 мл) при комнатной температуре в течение 0,5 ч при перемешивании. Суспензию перемешивали в течение 2 ч и добавляли другую порцию NaBH4 (1,5 г; 40 ммоль) и смесь перемешивали в течение еще 2 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в EtOAc (200 мл), промывали насыщенным водным NaHCO3 (200 млx3) и рассолом (200 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество далее очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан, 1:6) ис получением трет-бутил-(1R,3R)-1-(4-((трет-бутилдиметилси-лилокси)метил)-тиазол-2-ил)-1-гидрокси-4-метилпентан-3-ил(метил)карбамата (16,2 г; выход 42%) и трет-бутил-(( 1S,3R)-1 -(4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-тиазол-2-ил)-1 -гидрокси-4-метилпен-тан-3-ил)(метил)карбамата (изомер; 17,3 г; выход 45%).
трет-Бутил-(1R,3R)-1 -(4-((трет-бутилдиметилсилилокси)метил)тиазол-2-ил)-1 -гидрокси-4-метил-пентан-3-ил(метил)карбамат (Ж^-изомер): 1Н ЯМР (300 МГц, CDCb): 5 7.11 (s, 1Н), 4.98 (bs, 1Н), 4.80 (s, 2Н), 4.68 (dt, J=11,7 Гц, 1Н), 3.95 (dt, J=3,3 и 12 Гц, 1Н), 2.75 (s, 3Н), 1.70~1.95 (m, 2Н), 1.49 (s, 9Н), 0.95 (s, 9Н), 0.85~0.95 (m, 6Н), 0.15 (s, 6Н).
трет-Бутил-(( 1S,3R)-1 -(4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)тиазол-2-ил)-1 -гидрокси-4-метилпентан-3-ил)(метил)карбамат (1S,3R-изомер): 1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.07 (s, 1Н), 5.01 (m, 1Н), 4.81 (s, 2Н), 4.81 (bs, 1Н), 3.86 (dt, J=3,3 и 10,5 Гц, 1Н), 2.35 (s, 3Н), 2.25 (m, 1Н), 1.74 (m, 1Н), 1.43 (s, 9Н), 1.00 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0.96 (s, 9Н), 0.84 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0.15 (s, 6Н). Промежуточное соединение 53
Ацетилхлорид (22,5 мл; 0,316 моль) по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения (52) (19,7 г; 43 ммоль) в пиридине (140 мл) при 0°C при перемешивании в течение 1 ч. Реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Смесь гасили водой (200 мл) и органический растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в DCM (500 мл) и промывали 5%-ным водным KHSO4 (200 млx3), насыщенным водным NaHCO3 (200 млx3) и рассолом (200 млx1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:10) с получением (Ж^)-3-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)-1-(4-((трет-бутилдиметилсилилокси)метил)-тиазол-2-ил)-4-метилпен-тилацетата (18,5 г; выход 86%) в виде масла. ЖХ-МС подтвердила ее структуру.
Промежуточное соединение 54
Раствор фторида тетрабутиламмония (45,7 г; 175 ммоль) в THF (100 мл) по каплям добавляли к раствору промежуточного соединения (53) (17,5 г; 35 ммоль) в THF (100 мл) при 0°C при перемешивании. Реакционную смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Смесь гасили водой (100 мл) и органический растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в CH2Cl2 (500 мл) и промывали 5%-ным водным KHSO4 (200 млх3), насыщенным водным NaHCO3 (200 млх3) и рассолом (200 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, EtOAc/гексан, 1:4) с получением (1R,3R)-3-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)-1-(4-(гидроксиметил)тиазол-2-ил)-4-метилпентилацетата (9,3 г; выход 69%) в виде масла. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCb): 5 7.15 (d, J=3 Гц, 1Н), 5.81~5.86 (m, 1Н), 4.74 (d, J=3 Гц, 2Н), 4.11 (m, 1Н), 2.70 и 2.63 (s, 3Н), 2.31 (m, 1Н), 2.15 (s, 3Н), 2.05 (m, 1Н), 1.70 (m, 1Н), 1.47 (s, 9Н), 0.98 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0.86 (d, J=6,6 Гц, 3Н).
Промежуточное соединение 55
Перйодинан Десса-Мартина (14,9 г; 34,2 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения (54) (8,8 г; 22,8 ммоль) в дихлорметане (250 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч, затем промывали водным гидроксидом натрия (1 н.; 200 млх3), водным тиосульфатом натрия (1 н.; 200 млх3), насыщенным водным NaHCO3 (200 млх3) и рассолом (200 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха с получением альдегида.
Этот неочищенный альдегид растворяли в трет-бутиловом спирте (250 мл) и по каплям добавляли раствор хлорита натрия (80%; 11,6 г; 102 ммоль) и моногидрата дигидрофосфата натрия (33,6 г; 244 ммоль) в воде (150 мл) в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали еще в течение 16 часов, затем разбавляли соляной кислотой (0,1 н.; 100 мл) и экстрагировали EtOAc (200 млх3). Объединенные органические слои промывали 5%-ным водным KHSO4 (200 млх3) и рассолом (200 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха с получением 2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоновой кислоты (7,5 г; выход 82%), которую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 8.26 (s, 1Н), 5.87-6.01 (m, 1Н), 4.15 (m, 1Н), 2.72 и 2.65 (s, 3Н), 2.35 (m, 1Н), 2.20 (s, 3Н), 2.18 (m, 1Н), 1.75 (m, 1Н), 1.49 (s, 9Н), 1.00 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0.88 (d, J=6,6 Гц, 3Н).
Промежуточное соединение 56
TFA (30 мл) добавляли к раствору промежуточного соединения (55) (7,4 г; 18,5 ммоль) в дихлорме-
тане (80 мл). Смесь перемешивали в течение 12 часов, и растворитель удаляли при пониженном давле-
нии. Остаток растворяли в ацетоне (100 мл) и воде (100 мл). pH раствора доводили до значения 8,5 с помощью 2 М водного NaOH и по каплям добавляли раствор Fmoc-OSu (6,2 г; 18,5 ммоль) в ацетоне (50 мл), во время данного процесса pH этого раствора поддерживали на уровне 8~9 с помощью 2 М водного NaOH. Суспензию перемешивали в течение 4 ч, подкисляли 2 М водным HCl до pH 3, экстрагировали EtOAc (200 млх3). Объединенные органические фазы промывали водой (100 млх3), 5%-ным водным KHSO4 (100 млх3) и рассолом (100 млх1), сушили (Na2SO4) и концентрировали досуха. Неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель, MeOH/CH2Cl2, 1:40) с получением 2-((1R,3R)-3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)(метил)амино)-1-ацетокси-4-метилпентил)тиазол-4-карбоновой кислоты (5,1 г; выход 53%). ЖХ-МС: 523 [M+1]; 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) 5 м.д. 0.56 (ушир. s, 1Н) 0.67-0.82 (m, 2Н) 0.83-0.96 (m, 2Н) 1.64 (dt, J=10,36, 6,57 Гц, 1Н) 1.88 (s, 1Н) 2.07 (s, 2Н) 2.09-2.17 (m, 1Н) 2.19-2.33 (m, 1Н) 2.52-2.67 (m, 3Н) 3.86-4.01 (m, 1Н) 4.08 (s, 1Н) 4.12-4.21 (m, 1Н) 4.29-4.40 (m, 1Н) 4.68 (dd, J=10,61, 5,56 Гц, 1Н) 5.85 (dd, J=10,86, 3,28 Гц, 1Н) 7.19-7.27 (m, 2Н) 7.27-7.35 (m, 2Н) 7.427.58 (m, 2Н) 7.61-7.71 (m, 2Н) 8.11-8.19 (m, 1Н). Промежуточное соединение 57
DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения (46) (0,344 г; 0,80 ммоль) в DCM (1,5 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем в смесь добавляли 2-хлортритилхлоридную смолу (0,5 г; 0,80 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, полученную смолу промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл), затем обрабатывали DIEA (0,419 мл; 2,40 ммоль) и смесью MeOH/DCM (1:1; 5 мл) при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученную смолу отфильтровывали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл) и DCM (3x6 мл), сушили под глубоким вакуумом в течение ночи. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы и анализировали посредством ЖХМС. Высушенную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 430 (M+1).
Промежуточное соединение 58
К промежуточному соединению на смоле (57) (0,5 г; 0,80 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 мин, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 208 (M+1).
Промежуточное соединение 59
К промежуточному соединению на смоле (58) (0,4 г; 0,64 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (56) (0,351 г; 0,67 ммоль), HATU (0,487 г; 1,28 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (0,256 мл; 1,92 ммоль) и DIEA (0,335 мл; 1,92 ммоль) в DMF (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы и анализировали посредством ЖХМС. Взаимодействие было завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 712 (M+1).
Промежуточное соединение 60
К промежуточному соединению на смоле (59) (0,4 г; 0,64 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 мин, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 491 (M+H).
Промежуточное соединение 61
К промежуточному соединению на смоле (60) (0,4 г; 0,64 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (24) (0,341 г; 0,96 ммоль), DMAP (3,91 мг; 0,03 ммоль) и DIEA (0,335 мл; 1,92 ммоль) в DCM (4 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл), сушили под глубоким вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы и анализировали посредством ЖХМС. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 825 (M+1).
К промежуточному соединению на смоле (61) (0,4 г; 0,64 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 мин, полученную смолу филь-
Промежуточное соединение 62
тровали, промывали DMF (3x6 мл), МеОН (3x6 мл), DCM (3x6 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 603 (М+1).
Промежуточное соединение 63
Раствор 4,4-диметилциклогексанона (30 г; 0,238 моль), гидрохлорида гидроксиламина (32,8 г; 0,476 моль) и ацетата натрия (39,0 г; 0,476 моль) в смеси H2O/EtOH (720 мл; 5/1) нагревали с обратным холодильником. Взаимодействие контролировали с помощью ТСХ и после завершения смесь охлаждали до комнатной температуры. Разбавляли дихлорметаном (500 мл). Органический слой отделяли, промывали рассолом (100 мл) и сушили над Na2SO4. Растворитель удаляли при пониженном давлении и получали оксим 4,4-диметилциклогексанона в виде бесцветного твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Промежуточное соединение 64
К перемешиваемой суспензии пентахлорида фосфора (120 г; 0,576 моль) в ксилоле (1000 мл) добавляли в течение 20 мин раствор промежуточного соединения (63) (27,2 г; 0,192 моль) в ксилоле (400 мл). Во время добавления температуру реакционной смеси поддерживали при 30-36°C с использованием водяной бани. Затем нагревали до 80°C и перемешивали в течение 1,5 ч. Гомогенную реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и вливали в насыщенный водный карбонат натрия (2000 мл). Смесь оставляли выстаиваться в течение ночи и собирали осадок. Получили 3,3-дихлор-5,5-диметилазепан-2-он (28,4 г) в виде коричневого твердого вещества, и его использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 8 6.51 (bs, 1H), 3.39-3.44 (m, 1H), 3.163.21 (m, 1H), 1.41-1.51 (m, 2H), 1.17 (s, 2H), 0.99 (s, 6H). Промежуточное соединение 65
Промежуточное соединение (64) (25,8; 0,123 моль) растворяли в ледяной уксусной кислоте (1300 мл) и перемешивали при 40 атм (4 МПа) в атмосфере водорода над Pd/C (13 г; 10%) в течение 2 ч при комнатной температуре. Катализатор отфильтровывали и фильтрат концентрировали под вакуумом. DCM (200 мл) и насыщенный водный NaHCO3 (200 мл) добавляли к остатку и смесь перемешивали в течение 10 мин. Органический слой отделяли, сушили над Na2SO4 и концентрировали под вакуумом с получением 3-хлор-5,5-диметилазепан-2-она (19,1 г), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 8 6.19 (brs, 1H), 4.75 (d, J=11 Гц, 1H), 3.30-3.36 (m, 1H), 3.11-3.17 (m, 1H), 1.91-2.09 (m, 2H), 1.39-1.59 (m, 2H), 1.14 (s, 3H), 1.04 (s, 3H). Промежуточное соединение 66
В колбу, в которую загружали промежуточное соединение (65) (16,1 г; 0,092 моль) и Ba(OH)2 (35,1 г; 0,11 моль), добавляли воду (400 мл). Эту смесь перемешивали в течение 2 ч при 110°C. Затем ее охла
ждали до комнатной температуры и добавляли раствор CBZ-хлорида (20,6 г; 0,121 моль) в THF (400 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем значение pH доводили до 3 при использовании 1 н. HCl. Неочищенный продукт экстрагировали этилацетатом (2x200 мл). Объединенный экстракт промывали рассолом (100 мл), сушили над Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением 1-((бензилокси)карбо-нил)-4,4-диметилпиперидин-2-карбоновой кислоты в виде вязкого масла (7 г). 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3): 5 7.33-7.38 (m, 5H), 5.16-5.19 (m, 2H), 4.78-4.88 (m, 1H), 3.95-3.99 (m, 1H), 3.23-3.27 (m, 1H), 2.07 (s, 2H), 1.64-1.71 (m, 1H), 1.37-1.40 (m, 2H), 0.97 (s, 3H), 0.93 (s, 3H). Промежуточное соединение 67
Два энантиомера разделяли с помощью колонки Chiralpak IC при использовании подвижной фазы А 90% диоксида углерода/подвижной фазы В 10% этанола (детектирование при 210 нм). (R)-1-((бензилокси)карбонил)-4,4-диметилпиперидин-2-карбоновая кислота: ЖХ-МС: 292 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) 5 м.д. 0.93 (s, 3H) 0.98 (s, 3H) 1.40 (d, J=11,80 Гц, 2H) 1.68 (dd, J=14,05, 7,28 Гц, 1H) 1.99-2.18 (m, 1H) 3.27 (m, J=12,30 Гц, 1H) 3.97 (m, J=12,80 Гц, 1H) 4.69-4.95 (m, 1H), 5.11-5.25 (m, 2H), 7.28-7.44 (m, 5H), 9.63 (ушир. s, 1H).
Промежуточное соединение 68
К раствору промежуточного соединения (67) (1,14 г; 3,91 ммоль) в МеОН (20 мл) и воде (20,00 мл) добавляли параформальдегид (0,705 г; 7,83 ммоль) и Pd/C (10%) (0,4 г; 3,76 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение ночи. Посредством ТСХ установили, что взаимодействие не завершено. Добавляли дополнительное количество параформальдегида (0,705 г; 7,83 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ показала, что взаимодействие завершено. Реакционную смесь фильтровали, катализатор промывали МеОН (2x20 мл). Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением неочищенного продукта в виде белого твердого вещества, которое промывали эфиром (3x20 мл), сушили под глубоким вакуумом в течение ночи с получением (Я)-1,4,4-триметилпиперидин-2-карбоновой кислоты (0,671 г; 100%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 172 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, D2O) 5 м.д. 0.96 (s, 3H) 1.01 (s, 3H) 1.49-1.63 (m, 3H) 1.83 (dt, J=14,56, 2,64 Гц, 1H) 2.79 (s, 3H) 3.08-3.18 (m, 1H) 3.273.34 (m, 1H) 3.54 (dd, J=12,80, 3,26 Гц, 1H).
Промежуточное соединение 69
К промежуточному соединению на смоле (62) (0,1 г; 0,16 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (68) (0,055 г; 0,32 ммоль), HATU (0,122 г; 0,32 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (0,064 мл; 0,48 ммоль), и DIEA (0,056 мл; 0,32 ммоль) в DMF (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x2 мл), МеОН (3x2 мл) и DCM (3x2 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 756 (M+1).
Соединение 4
К промежуточному соединению на смоле (69) (0,1 г; 0,13 ммоль) добавляли DCM (1 мл) и TFA (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, затем фильтровали, смолу промывали смесью DCM/TFA (1:1; 3x2 мл), фильтраты упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (ACN/H2O 0,1% TFA, ACN от 5% до 75% за 14 минут). Чистые фракции лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-N,3-диметил-2-((R)-1,4,4-триметилпиперидин-2-карбоксамидо)пентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-2
метил-5-фенилпентановой кислоты (30 мг; выход 30%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 756,5 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, метанол^) 5 м.д. 0.75 (dd, J=6,53, 2,01 Гц, 3H), 0.85 (td, J=7,34, 3,64 Гц, 4H), 0.90-0.99 (m, 11H), 1.01-1.16 (m, 9H), 1.45-1.66 (m, 6H), 1.67-1.85 (m, 4H), 1.86-1.97 (m, 1H), 2.03-2.06 (m, 3H), 2.16-2.34 (m, 2H), 2.39-2.51 (m, 1H), 2.66 (d, J=1,25 Гц, 3H), 2.75-2.85 (m, 2H), 3.02 (d, J=1,25 Гц, 3H), 3.16 (ушир. s, 1H), 3.79-3.93 (m, 1H), 4.29 (ушир. s, 2H), 4.57-4.66 (m, 1H), 5.55-5.70 (m, 1H), 7.01-7.18 (m, 5H), 7.98 (d, J=1,25 Гц, 1H).
Промежуточное соединение 70
К промежуточному соединению на смоле (62) (0,1 г; 0,16 ммоль) добавляли раствор промежуточного соединения (1) (0,050 г; 0,32 ммоль), HATU (0,122 г; 0,32 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (0,064 мл; 0,48 ммоль) и DIEA (0,056 мл; 0,32 ммоль) в DMF (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x2 мл), МеОН (3x2 мл) и DCM (3x2 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученную смолу использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 742 (M+1).
Соединение 5
К промежуточному соединению на смоле (70) (0,1 г; 0,16 ммоль) добавляли DCM (1 мл) и TFA (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, затем фильтровали, смолу промывали смесью DCM/TFA (1:1; 3x2 мл), фильтраты упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (ACN/H2O 0,1% TFA, ACN от 5% до 50% за 14 мин). Чистые фракции лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1 -ацетокси-3 -((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпипе-ридин-2-карбоксамидо)-N,3-диметилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-2-метил-5-фенилпентановой кислоты (0,040 г; 29,2%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 742 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 0.71-0.78 (m, 3H), 0.80-0.87 (m, 3H), 0.93 (dd, J=9,91, 6,65 Гц, 6H), 1.07 (d, J=7,03 Гц, 6H) ,1.42-1.65 (m, 3H), 1.74-1.85 (m, 3H), 1.86-1.98 (m, 3H), 2.05 (s, 4H), 2.16-2.35 (m, 2H), 2.382.51 (m, 1H), 2.59-2.72 (m, 3H), 2.77-2.83 (m, 2H), 3.02 (s, 3H), 3.84-3.94 (m, 1H), 4.20-4.35 (m, 2H), 4.564.65 (m, 1H), 5.57-5.67 (m, 1H), 7.03-7.09 (m, 1H), 7.13 (s, 4H), 7.91-8.02 (m, 2H). Промежуточное соединение 71
К раствору этил-2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-N,3-диметилпентанамидо)-1-гидрокси-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксилата (полученному, как описано в Patterson A. et al J. Org. Chem. 2008, 73, 4362) (1,2 г; 2,40 ммоль) в DCM (24 мл) добавляли равный объем TFA (24,00 мл) при перемешивании в течение 1 ч. Раствор затем концентрировали, разбавляли EtOAc и однократно промывали насыщенным NaHCO3 (водн.). Водную фракцию дважды обратно экстрагировали EtOAc и объединенные органические фракции сушили Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением Boc-незащищенного свободного амина, который передавали на следующую стадию без дополнительной очистки. К этому амину в CH2Cl2 (24 мл) добавляли НОВТ (0,368 г; 2,40 ммоль) и промежуточное соединение (1) (0,3969 г; 2,52 ммоль). Смесь затем охлаждали на бане с подсоленной водой и льдом при перемешивании и добавляли PS-карбодиимид (1,23 ммоль/г) (2,598 г; 2,88 ммоль). Баню нагревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение 14 ч. Смесь затем фильтровали, смолу промывали DCM и фильтрат концентрировали. Неочищенную смесь затем разбавляли EtOAc и однократно промывали насыщенным водным NaHCO3. Водную фракцию дважды подвергали обратной экстракции с EtOAc и объединенные органические фракции сушили Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением 4-МетилМер-связанного промежуточного соединения, которое использовали без дополнительной очистки. К неочищенному промежуточному соединению, разбавленному диоксаном (24 мл), добавляли раствор LiOH (0,230 г; 9,60 ммоль) в дегазированной воде (24 мл). После перемешивания в течение 5 часов раствор концентрировали. Остаток очищали с помощью колонки с силикагелем, элюировали смесью DCM/DCM:MeOH:NH4OH (от 90:10:1 до 70:30:1) (DCM:MeOH:NH4OH в виде градиента от 0 до 100%) при использовании нормально-фазовой флэш-хроматографии. Чистые фракции концентрировали
К раствору промежуточного соединения (71) (1,0026 г; 1,96 ммоль) в пиридине (19,47 мл) охлаждали на водяной бане со льдом и при перемешивании добавляли ангидрид уксусной кислоты (0,927 мл; 9,82 ммоль). Баню нагревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение 24 ч. Раствор затем охлаждали на водяной бане со льдом и добавляли раствор диоксана в дегазированной воде, 1:1 (об./об.) (40 мл). Баню нагревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение 22 ч. Остаток концентрировали посредством упаривания и остаток очищали посредством обращенно-фазовой хроматографии при использовании смеси ACN/H2O (0,1% TFA), ACN от 5% до 50% за 14 мин, чистые фракции лиофилизировали с получением 2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диме-тилпиперидин-2-карбоксамидо)-N,3-диметилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоновой кислоты (0,945 г; 72,2%) в виде бесцветного твердого вещества. ЖХ-МС: 551 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, метанол-dO 5 м.д. 0.85 (d, J=6,53 Гц, 3H), 0.88-0.98 (m, 4H), 0.98-1.08 (m, 6H), 1.10-1.28 (m, 4H), 1.59 (ddd, J=13,49, 7,47, 2,89 Гц, 1H), 1.70 (d, J=14,05 Гц, 1H), 1.81-2.12 (m, 5H), 2.12-2.25 (m, 3H), 2.32 (d, J=7,78 Гц, 2H), 2.72-2.93 (m, 4H), 3.07-3.18 (m, 4H), 4.02 (d, J=10,54 Гц, 1H), 4.10-4.39 (m, 1H), 4.65-4.76 (m, 1H), 5.64-5.80 (m, 1H), 8.30-8.39 (m, 1H), 8.66 (d, J=7,28 Гц, 1H).
Промежуточное соединение 73
Промежуточное соединение (72) (100 мг; 0,18 ммоль) добавляли к раствору 2,3,4,5,6-пентафтор-фенола (49,32 мг; 0,27 ммоль) и DIC (41,34 мкм; 0,27 ммоль) в DCM (5 мл) при 0°C. Раствор оставляли для достижения комнатной температуры, перемешивали в течение 4 ч, затем растворитель удаляли под вакуумом. В смесь добавляли EtOAc (4 мл) и полученную суспензию фильтровали через вакуум-фильтр с получением требуемой активированной кислоты в фильтрате. EtOAc удаляли под вакуумом, затем добавляли безводный DMF (1,3 мл) с последующим добавлением промежуточного соединения (18) (52,2 мг; 0,18 ммоль) и DIEA (0,213 мл). Смесь перемешивали в течение ночи и затем под глубоким вакуумом удаляли DMF. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой хроматографии (ACN/H2O с 10 мМ ацетата аммония, ACN от 10 до 80% за 20 мин) и чистые фракции лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N,3-диметилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-2-метил-5-(4-нитрофенил)пентановой кислоты (85 мг; 59,3%) в виде бесцветного твердого вещества. ЖХ-МС: 787 [M+1].
Соединение 6
В круглодонную колбу на 25 мл помещали магнитную мешалку и промежуточное соединение (73) (84,5 мг; 0,11 ммоль) и МеОН (5 мл), в атмосфере азота добавляли 10% Pd-C (50 мг; 0,47 ммоль). Смесь гидрировали при использовании баллона, заполненного водородом, в течение 1 ч при комнатной температуре. Предварительная ЖХ/МС показала полное превращение исходного вещества в продукт. Реакционную смесь фильтровали через набивку из диатомита и промывали МеОН на фильтре. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и в конце сушили под глубоким вакуумом с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N,3-диметилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-аминофенил)-2-метилпентановой кислоты (79 мг; 97%) в виде твердого вещества. ЖХ-МС: 757 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, метанол^4) 5 м.д. 8.10 (s, 1H) 6.99 (d, J=8,28 Гц, 2H) 6.65 (d, J=8,28 Гц, 2H) 5.66-5.78 (m, 1H) 4.71-4.80 (m, 1H) 4.24-4.43 (m, 2H) 3.13 (s, 3H) 2.77-2.83 (m, 2H) 2.61-2.71 (m, 1H) 2.49-2.56 (m, 1H) 2.44 (s, 3H) 2.27-2.40 (m, 2H) 2.17 (s, 3H) 1.86-2.04 (m, 4H) 1.74-1.83 (m, 1H) 1.53-1.69 (m, 3H) 1.31 (ушир. s, 3H) 1.17 (d, J=7,03 Гц, 4H) 0.981.07 (m, 8H) 0.93 (d, J=7,53 Гц, 6H) 0.83-0.87 (m, 3H).
Промежуточное соединение 74
К промежуточному соединению на смоле (28) (0,2 г; 0,32 ммоль) добавляли раствор (S)-2-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-6-(трет-бутоксикарбониламино)гексановой кислоты (0,300 г; 0,64 ммоль), HATU (0,243 г; 0,64 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (0,128 мл; 0,96 ммоль) и DIEA (0,168 мл; 0,96 ммоль) в DMF (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x2 мл), МеОН (3x2 мл) и DCM (3x2 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (74) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 1221 (M+1).
Промежуточное соединение 75
К промежуточному соединению на смоле (74) (0,2 г; 0,32 ммоль) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (2 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 мин, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x3 мл), МеОН (3x3 мл), DCM (3x3 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (75) использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 999 (M+H).
Промежуточное соединение 76
К промежуточному соединению на смоле (75) (0,2 г; 0,32 ммоль) добавляли раствор 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (0,148 г; 0,48 ммоль) в DMF (2 мл) с последующим добавлением N-метилморфолина (0,106 мл; 0,96 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x3 мл), DCM (3x3 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (76) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 1192 (M+1).
Соединение 7
К промежуточному соединению на смоле (76) (0,2 г; 0,32 ммоль) добавляли DCM (1 мл) и TFA (1 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин и фильтровали. Смолу промывали смесью DCM/TFA (1:1; 3x2 мл), объединенные фильтраты упаривали под вакуумом. Остаток очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (ACN/вода 0,1% TFA, ACN от 5 до 75% за 14 мин). Чистые фракции лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-((S)-6-амино-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)гексанамидо)фенил)-2-метилпентановой кислоты (0,095 г; 22,48%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 1092 [M+1]; 1H ЯМР (400 МГц, метанол^4) 5 м.д. 7.99 (s, 1H), 7.34 (d, J =8,53 Гц, 2H), 7.10 (d, J=8,53 Гц, 2H), 6.66 (s, 2H), 5.64 (d, J=10,79 Гц, 1H), 4.50-4.61 (m, 1H), 4.21-4.35 (m, 2H), 3.92 (d, J=9,29 Гц, 1H), 3.69 (ушир. s, 1H), 3.37 (t, J=7,15 Гц, 2H), 3.15-3.35 (m, 4H), 3.04 (dt, J=3,58, 1.85 Гц, 1H), 2.84 (t, J=7,65 Гц, 2H), 2.76 (d, J=7,03 Гц, 2H), 2.62 (ушир. s, 2H), 2.38-2.52 (m, 2H), 2.25 (t, J=11,54 Гц, 1H), 2.16 (t, J=7,40 Гц, 2H), 2.04-2.11 (m, 4H), 1.70-2.00 (m, 7H) 1.42-1.69 (m, 11H), 1.34-1.40 (m, 1H), 1.27 (t, J=6,78 Гц, 3H), 1.16-1.24 (m, 2H), 1.01-1.14 (m, 7H), 0.90 (d, J=6,78 Гц, 3H), 0.94 (d, J=6,53 Гц, 3H),
0.84 (t, J=7,40 Гц, 3H), 0.79 (d, J=6,53 Гц, 3H).
Промежуточное соединение 77
К промежуточному соединению на смоле (28) добавляли раствор (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)меток-си)карбонил)амино)-5-уреидопентановой кислоты (3,88 г; 9,76 ммоль), HATU (3,71 г; 9,76 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (2,59 мл; 19,52 ммоль) и DIEA (3,41 мл; 19,52 ммоль) в DMF (38 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x100 мл), МеОН (3x100 мл) и DCM (3x100 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (77) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 1150 (M+1).
К промежуточному соединению на смоле (77) добавляли 20%-ный раствор пиперидина в DMF (35 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение шести минут. Полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x100 мл), МеОН (3x100 мл) и DCM (3x100 мл) и сушили под вакуумом. Не-
Промежуточное соединение 78
большое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала слабый сигнал. Полученное промежуточное соединение на смоле (78) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 928 (M+1).
Промежуточное соединение 79
К промежуточному соединению на смоле (78) добавляли раствор (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)мето-кси)карбонил)амино)-3-метилбутановой кислоты (1,529 г; 4,50 ммоль), HATU (1,713 г; 4,50 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (1,294 мл; 9,76 ммоль) и DIPEA (1,705 мл; 9,76 ммоль) в DMF (20 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x75 мл), МеОН (3x75 мл) и DCM (3x75 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (79) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 1250 (M+1).
Промежуточное соединение 80
К промежуточному соединению на смоле (79) добавляли 20%-ный раствор пиперидина в DMF (20 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение шести минут и полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x75 мл), МеОН (3x75 мл) и DCM (3x75 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (80) использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 1028 (M+1).
Промежуточное соединение 81
К промежуточному соединению на смоле (80) добавляли раствор 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (1,157 г; 3,75 ммоль) в DMF (18 мл) с последующим добавлением 4-метилморфолина (1,032 мл; 9,38 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x75 мл), МеОН (3x75 мл) и DCM (3x75 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество смолы отщепляли посредством добавления TFA и анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала образование требуемого продукта. Промежуточное соединение на смоле (81) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 1220 (M+1).
Соединение 8
К смоле с промежуточным соединением (81) добавляли раствор TFA (2,9 мл; 37,4 ммоль) в DCM (40 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, полученную смолу фильтровали, промывали дополнительными 50 мл DCM. Объединенные экстракты концентрировали. Неочищенное вещество очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (способ: колонка С18, 0,1% TFA/вода/0,1% TFA/ацетонитрил, 0-40%, 30 мин). Чистые фракции лиофилизировали с получением
(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1 H-пиррол-1 -ил)гексанамидо)-3 -метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенил)-2-метилпентановой кислоты (0,620 г; 12,38%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 1220 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 8.03 (s, 1H), 7.30-7.44 (m, 2H), 7.07 (d, J=8,53 Гц, 2H), 6.69 (s, 2H), 5.535.68 (m, 1H), 4.52 -4.63 (m, 1H), 4.19-4.40 (m, 3H), 4.01-4.12 (m, 2H), 3.89-3.99 (m, 1H), 3.56-3.74 (m, 1H), 3.33-3.43 (m, 2H), 3.23-3.32 (m, 1H), 2.96-3.13(m, 4H), 2.83-2.95 (m, 1H), 2.66-2.83 (m, 3H), 2.57 (ушир. s, 3H), 2.40-2.52 (m, 2H), 2.14-2.24 (m, 3H), 2.02-2.11 (m, 4H), 1.87-2.00 (m, 5H), 1.72-1.87 (m, 4H), 1.42-1.68 (m, 10H), 1.16-1.28 (m, 5H), 1.09 (d, J=7,03 Гц, 6H,) 0.76-0.96 (m, 16H). Промежуточное соединение 82
HNBoc
К промежуточному соединению на смоле (3S) (0,35 г; 0,56 ммоль) добавляли раствор (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-6-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексановой кислоты (0,525 г; 1,12 ммоль), HATU (0,426 г; 1,12 ммоль), 2,4,6-триметилпиридина (0,223 мл; 1,68 ммоль) и DIPEA (0,293 мл; 1,68 ммоль) в DMF (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x5 мл), МеОН (3x5 мл) и DCM (3x5 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХМС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (82) использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 1221 (M+1).
Промежуточное соединение 83
HNBoc
К промежуточному соединению на смоле (82) добавляли 20%-ный пиперидин в DMF (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 минут и полученную смолу отфильтровывали, промывали DMF (3x5 мл), МеОН (3x5 мл), DCM (3x5 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (83) использовали на следующей стадии. ЖХ/МС: 999 (M+1).
Промежуточное соединение 84
К промежуточному соединению на смоле (83) добавляли раствор 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (0,259 г; 0,84 ммоль) в DCM (4 мл) с последующим добавлением 4-метилморфолина (0,185 мл; 1,68 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч, полученную смолу фильтровали, промывали DMF (3x5 мл), МеОН (3x5 мл), DCM (3x5 мл), сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы, анализировали посредством ЖХ/МС, которая показала, что взаимодействие завершено. Полученное промежуточное соединение на смоле (84) использовали на следующей стадии. ЖХ-МС: 1192 (M+1).
Промежуточное соединение 85
К промежуточному соединению на смоле (84) (0,35 г; 0,56 ммоль) добавляли TFA (0,216 мл; 2,80 ммоль) в DCM (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в DMSO и очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (0,1 TFA/вода/ацетонитрил, 20-80%, 14 минут). Фракции, содержащие чистый продукт, лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-(( 1 R,3R)-1 -ацетокси-3 -((2S,3 S)-2-( 1,2-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-((S)-6-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)гексанамидо)фе-нил)-2-метилпентановой кислоты (0,123 г; 18,42%) в виде белого твердого вещества. ЖХ/МС: 1192 (M+1).
Соединение 9
К промежуточному соединению (85) (95 мг; 0,08 ммоль) добавляли раствор TFA (0,123 мл; 1,59 ммоль) в DCM (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в DMSO и очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (0,1 TFA/вода/ацетонитрил, 10-70%, 10 минут). Фракции, содержащие чистый продукт, лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-(( 1R,3R)-1 -ацетокси-3-((2S,3S)-2-((R)-1,2-диметилпипери-дин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метилпентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-((S)-6-амино-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)гексанамидо)фенил)-2-метилпентано-вой кислоты (53,0 мг; 50,4%) в виде белого твердого вещества. ЖХ-МС: 1092 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 м.д. 7.97 (s, 1H), 7.36 (d, J=8,28 Гц, 2H), 7.11 (d, J=8,28 Гц, 2H), 6.65 (s, 2H), 5.63 (d, J=11,29 Гц, 1H), 4.34 (dd, J=8,2S, 5,77 Гц, 1H), 4.26 (ушир. s, 1H),3.75-3.60 (m, 1H), 3.32-3.46 (m, 4H), 3.30-3.25 (m, 1H), 2.71-2.90 (m, 5H), 2.49-2.62 (m, 3H), 2.27 (t, J=12,05 Гц, 1H), 2.17 (t, J=7,40 Гц, 3H) 2.00-2.12 (m, 5H), 1.84-1.96 (m, 3H), 1.72-1.84 (m, 4H), 1.58-1.69 (m, 5H), 1.47-1.56 (m, 4H), 1.36-1.44 (m, 5H), 1.14-1.30 (m, 6H), 1.01-1.10 (m, 4H), 0.93 (dd, J=13,93, 6,65 Гц, 7H), 0.74-0.86 (m, 7H).
Промежуточное соединение 86
К промежуточному соединению на смоле (75) (0,20 г; 0,16 ммоль) добавляли раствор 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (85 мг; 0,32 ммоль) в DCM с последующим добавлением DIEA (0,056 мл; 0,32 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, полученную смолу промывали DMF (3x3 мл), DCM (3x3 мл) и МеОН (3x3 мл) и сушили под вакуумом. Небольшое количество соединения отщепляли от смолы с помощью смеси TFA/DCM (1:2). После выпаривания растворителя неочищенный продукт анализировали посредством ЖХ/МС. ЖХ/МС показала, что реакция сочетания завершена. ЖХ/МС: 1050,37 (M+1).
Соединение 10
К промежуточному соединению на смоле (86) (0,20 г; 0,16 ммоль) добавляли смесь TFA/DCM (1:2; 3 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин и фильтровали. Смолу промывали DCM (3x3 мл), все фильтраты объединяли и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали посредством обращен-но-фазовой ВЭЖХ (Н2О и CH3CN с 0,1% TFA, CH3CN от 5 до 40% в размере 12 CV (объемов колонки)). Собранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-ацетокси-3
((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-диметилпиперидин-2-карбоксамидо)-N-этил-3-метилпентанамидо)-4-метил-пентил)тиазол-4-карбоксамидо)-5-(4-((S)-6-амино-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропа-намидо)гексанамидо)фенил)-2-метилпентановой кислоты в виде белого порошка (70 мг; 35%). ЖХ/МС: 1050,37 (M+1); 1H ЯМР (400 МГц, метанол-d.,) 5 7.99 (s, 1H), 7.35 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7.10 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6.65 (s, 2H), 5.64 (d, J=10,9 Гц, 1H), 4.56 (d, J=8,9 Гц, 1H), 4.28 (td, J=11,3, 10,0, 6,1 Гц, 2H), 3.92 (d, J=11,5 Гц, 1H), 3.69 (q, J=6,8 Гц, 3H), 3.31-3.23 (m, 1H), 3.18 (s, 1H), 2.83 (t, J=7,7 Гц, 3H), 2.76 (d, J=7,1 Гц, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.50-2.40 (m, 4H), 2.25 (t, J=12,8 Гц, 1H), 2.06 (s, 4H), 2.00-1.69 (m, 8H), 1.69-1.52 (m, 6H), 1.53-1.31 (m, 4H), 1.28 (d, J=6,4 Гц, 3H), 1.08 (d, J=7,1 Гц, 7H), 0.92 (dd, J=13,7, 6,7 Гц, 7H), 0.83 (t, J=7,4 Гц, 4H), 0.78 (d, J=6,6 Гц, 3H).
Общее описание конъюгации
ADC, содержащие антитела, могут быть получены стандартными способами, такими как, без ограничения, связывание с помощью альдегида/основания Шиффа, связывание с помощью сульфгидрильно-го линкера, связывание с помощью кислотолабильных связей, цис-аконитильного линкера, гидразоново-го линкера, способами, аналогичными описываемым Hamblett, Clin. Cancer Res. 2004, 10, 7063-7070; Do-ronina et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7), 778-784 и Francisco et al., Blood, 2003, 102, 1458-1465, и соответствующих модификаций следующего неограничивающего примера.
Антитело обрабатывают в присутствии восстановителя при использовании 40 эквивалентов ТСЕР (трис-2-карбоксиэтиленфосфин) в PBS (фосфатно-солевом буфере) при pH 7,2 и 1 мМ EDTA (этилен-диаминтетрауксусная кислота) в течение 3 ч при 37°C для удаления молекул, содержащих реакционно-способные тиольные группы, таких как цистеин, глутатион, металлы, и восстановления межцепочечных дисульфидных связей в антителе. За этой стадией следует два цикла диализа в PBS при pH 7,2, 1 мМ EDTA при 4°C при использовании диализных кассет с MWCO (номинальное отсечение по молекулярной массе) 10000 Да (Thermo Scientific). Проводят преобразование дисульфидных связей в антителе посредством окисления дегидроаскорбиновой кислотой в течение 4 ч при 25°C в PBS при pH 7,2, 1 мМ EDTA. После этого 20 молярных эквивалентов соединения формулы II конъюгируют через реакционноспособ-ные тиольные группы антитела путем инкубирования в течение 1 ч при 25°C в PBS при pH 7,2, 1 мМ EDTA, 10% об./об. DMSO (диметилсульфоксид) (Thermo Scientific). Конъюгаты очищают посредством фильтрации. Реакцию конъюгации останавливают посредством добавления 4 молярных эквивалентов N-ацетилцистеина (Sigma-Aldrich). Проводят диализ конъюгатов антитело-лекарственное средство при 4°C в течение ночи при использовании 20K MWCO кассеты в 5 мМ NaP04 при pH 6 и затем очищают при использовании картриджа объемом 5 мл с керамическим гидроксиапатитом (СНТ) типа I (Biorad). Конъюгаты элюируют с картриджа при использовании 10 мМ NaPO4 при pH 6 и линейного ингредиента от 0 до 2 М NaCl, и их можно концентрировать и изготавливать в виде препарата посредством замены буфера при использовании диализа в 20 мМ гистидин-HCl при pH 6,0.
Анализ пролиферации in vitro
Для определения относительной цитотоксичности соединений тубулизина по изобретению использовали панель линий раковых клеток человека (DU 145, NCl-N87, и MDA-MB-361), полученную из Американской коллекции тканевых культур (АТСС) (P.O. Box 1549, Manassa, VA 20108 (USA)). Клетки высевали в планшеты с культуральными средами с плотностью от 2000 до 5000 на лунку обработанных тканевой культурой 96-луночных планшетов в объеме 80 мкл и оставляли для адгезии в течение ночи. Готовили 5x концентрацию каждого тестируемого соединения посредством разбавления тестируемых образцов в культуральной среде. Двадцать микролитров каждого тестируемого образца добавляли к клеткам в двух или трех повторностях, так чтобы конечная кривая зависимости дозы находилась в пределах от 4 мкг/мл до 61 пг/мл с шагом серийного разведения 1:4. Обработанные клетки культивировали при 37°C/5% СО2 в течение периода времени от 72 до 144 ч. Для определения относительной цитоток-сичности использовали анализ жизнеспособности люминесцирующих клеток (The CellTiter-Glo Luminescent Viability Assay) от Promega. Вкратце, 100 мкл реагента CellTiter-Glo добавляли в каждую лунку, оставляли для инкубирования в течение 10 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании и затем считывали оптическую плотность каждого образца при 560 нм при использовании люминометра EnVision от Perkin Elmer. Процент жизнеспособности клеток подсчитывали с помощью следующей формулы: (средняя люминесценция обработанных образцов/средняя люминесценция контрольных (необработанных) образцов) x 100. Значения IC50 определяли при использовании нелинейного регрессионного анализа методом логистической регрессии с помощью программы GraphPad Prism. Не все соединения были проанализированы в отношении всех клеточных линий. В табл. I представлены данные анализа.
ND - не определяли.
Все ссылки, процитированные здесь, включая патенты, заявки на патенты, документы, учебные пособия и тому подобное, и ссылки, процитированные в них, если только они уже не раскрыты, таким образом включены здесь посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение, имеющее структуру формулы I
(I)
или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой CH3 или CH2-CH3,
представляет собой H или CH3, R3 представляет собой H или NH2 и n равен 1 или 2.
2. Соединение по п.1, где n равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил и R3 представляет собой NH2.
3. Соединение формулы (К)
формулы (Iii)
формулы (Iiii)
формулы (liv)
формулы (Iv)
или формулы (Ivi)
4. Соединение, имеющее структуру формулы II
(п)
или его фармацевтически приемлемая соль, где R1 представляет собой CH3 или CH2-CH3, R2 представляет собой H или CH3,
R4 представляет собой CH3, (C^^NH или (CH2)3NHC(=O)NH2, R5 представляет собой H, C(CH3)(CH3),
представляет собой NHC(=O) или CH2; n равен 1 или 2 и m равен 0, 1, 2 или 3.
5. Соединение по п.4, где n равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил и R представляет собой NH2.
6. Соединение по п.4, где n равен 1, m равен 1, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой метил, R3 представляет собой NH2, R4 представляет собой (CH2)4NH2, R5 представляет собой H и R6 представляет собой CH2.
7. Соединение формулы (Hi)
или формулы (IIiv)
(Iliv).
8. Конъюгат антитело-лекарственное средство, представляющий собой конъюгат соединения по любому из пп.4-7, где антитело является специфическим к раковому антигену.
9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8, где антитело представляет собой монокло-нальное антитело.
10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8 или 9, где антитело представляет собой алем-тузумаб, бевацизумаб, брентуксимаб, цетуксимаб, гемтузумаб, ипилимумаб, офатумумаб, панитумумаб, ритуксимаб, тозитумомаб или трастузумаб.
11. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая
(1) соединение по любому из пп.1-7 или
(2) конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.8-10.
12. Применение соединения по любому из пп.1-7 для лечения рака.
13. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.8-10 для лечения рака.
14. Применение по п.12 или 13, где субъект страдает от плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака желудочно-кишечного тракта, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы, глиомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой кишки, колоректаль-ного рака, карциномы эндометрия, миеломы, карциномы слюнной железы, рака почки, базальноклеточ-ной карциномы, меланомы, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака яичка, рака пищевода, видов рака головы и шеи, слизеобразующего рака яичников, холангиокарциномы или папиллярного рака почки.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032203
032203
- 1 -
- 1 -
(19)
032203
032203
- 1 -
- 1 -
(19)
032203
032203
- 1 -
- 1 -
(19)
032203
032203
- 1 -
- 1 -
(19)
032203
032203
- 4 -
- 3 -
(19)
032203
032203
- 10 -
032203
032203
- 10 -
032203
032203
- 10 -
032203
032203
- 13 -
- 13 -
032203
032203
- 16 -
032203
032203
- 21 -
- 21 -
032203
032203
- 23 -
032203
032203
- 26 -
- 26 -
032203
032203
- 33 -
032203
032203
- 38 -
- 38 -
032203
032203
- 39 -
- 39 -
032203
032203
- 39 -
- 39 -
032203
032203
- 39 -
- 39 -
|
