[RU]

1. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замену R30S, или S35D, или обе относительно SEQ ID NO: 1; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замену S55R, или S56G, или обе относительно SEQ ID NO: 1; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и b) легкую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замену R28P или N29K относительно SEQ ID NO: 2; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из Y48F и N51V и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из S89A, D91W, D92S, G93S и V94T и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2.

2. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: а) тяжелую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замены R30S и S35D относительно SEQ ID NO: 1; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замены S55R и S56G относительно SEQ ID NO: 1; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и b) легкую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замены R28P и N29K относительно SEQ ID NO: 2; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей замены Y48F и N51V относительно SEQ ID NO: 2; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей замены S89A, D91W, D92S, G93S и V94T относительно SEQ ID NO: 2.

3. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: (а) тяжелую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (b) легкую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 17.

4. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ⁸ М ^-1 .

5. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ⁹ М ^-1 .

6. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ¹⁰ М ^-1 .

7. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ¹¹ М ^-1 .

8. Изолированное антитело по одному из пп.1, 2 или 3, где антитело является антителом IgG.

9. Изолированное антитело по п.8, где антитело является антителом IgG2.

10. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения свертывания крови, содержащая терапевтически эффективное количество моноклонального антитела по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

(57) Реферат / Формула:

1. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замену R30S, или S35D, или обе относительно SEQ ID NO: 1; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замену S55R, или S56G, или обе относительно SEQ ID NO: 1; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и b) легкую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замену R28P или N29K относительно SEQ ID NO: 2; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из Y48F и N51V и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из S89A, D91W, D92S, G93S и V94T и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2.

2. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: а) тяжелую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замены R30S и S35D относительно SEQ ID NO: 1; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замены S55R и S56G относительно SEQ ID NO: 1; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и b) легкую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замены R28P и N29K относительно SEQ ID NO: 2; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей замены Y48F и N51V относительно SEQ ID NO: 2; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей замены S89A, D91W, D92S, G93S и V94T относительно SEQ ID NO: 2.

3. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: (а) тяжелую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (b) легкую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 17.

4. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ⁸ М ^-1 .

5. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ⁹ М ^-1 .

6. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ¹⁰ М ^-1 .

7. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10 ¹¹ М ^-1 .

8. Изолированное антитело по одному из пп.1, 2 или 3, где антитело является антителом IgG.

9. Изолированное антитело по п.8, где антитело является антителом IgG2.

10. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения свертывания крови, содержащая терапевтически эффективное количество моноклонального антитела по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

---

Евразийское 032189 (13) B9
патентное
ведомство
(12) ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(15) Информация об исправлении
Версия исправления: 1 (W1 B1) исправления в формуле: п.2, 3
(48) Дата публикации исправления
2019.09.30, Бюллетень №9'2019
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201290849
(22) Дата подачи заявки
2011.03.01
(51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01) A61K39/395 (2006.01)
(31) 61/309,290
(32) 2010.03.01
(33) US
(43) 2013.05.30
(86) PCT/US2011/026766
(87) WO 2011/109452 2011.09.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАЙЕР ХЕЛЬСКЕР ЛЛСИ (US)
(72) Изобретатель:
Шольц Петер (DE), Ванг Зуози, Пан Юнлианг (US), Грудзинска Ёанна,
Фотсмайер Кристиан, Теббе Ян, Биркенфельд Йорг, Вобст Нина, Брюкнер Зимоне, Штайниг Зузанне
(DE)
(74) Представитель:
Беляева Е.Н. (BY)
(56) WO-A2-2010017196 US-A1-20050049403 US-A1-20030073638 US-A1-20040091974
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Представление перечня последовательностей
Перечень последовательностей к настоящей заявке представлен в электронном формате через систему электронной подачи EFS-Web и включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
Область изобретения
Настоящее изобретение предоставляет изолированные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI) и фармацевтическую композицию для лечения нарушения свертывания крови, содержащую указанные монокло-нальные антитела.
Уровень техники
Свертывание крови представляет собой процесс, когда для остановки кровотечения образуются сгустки крови. В этом процессе участвуют несколько проферментов и прокофакторов (или "факторов свертывания крови"), которые циркулируют в крови. Существует несколько путей взаимодействия данных проферментов и прокофакторов, с помощью которых они переходят (одновременно или последовательно) в активированную форму. В конечном итоге, процесс приводит к тому, что в результате активации протромбина получается тромбин путем активации фактора X (FXa) в присутствии фактора Va, ионов кальция и тромбоцитов. В свою очередь активированный тромбин стимулирует агрегацию тромбоцитов и превращает фибриноген в фибрин, который затем под воздействием активированного фактора XIII (FXIIIa) образует сетчатую основу тромба.
Процесс, приводящий к активации фактора X, может осуществляться двумя различными путями: контактным путем свертывания крови (ранее именовавшимся "внутренним путем свертывания крови") и путем тканевого фактора (ранее именовавшимся "внешним путем свертывания крови"). Ранее считалось, что каскад свертывания крови состоял из двух путей, имеющих равную значимость, объединенных в общий путь. Сегодня известно, что более значимым для инициации процесса свертывания крови является путь тканевого фактора.
Фактор X может быть активирован с помощью тканевого фактора (TF) в комплексе с активированным фактором VII (FVIIa). Комплекс фактора Vila и его важного кофактора - TF, является потенциальным инициатором каскада свертывания.
Путь тканевого фактора свертывания крови подавляется ингибитором пути тканевого фактора (TFPI). TFPI - это естественный, FXa-зависимый ингибитор по типу обратной связи комплекса FVIIa/TF. Он является одним из ингибиторов серин-протеазы Кунитц-типа. С точки зрения физиологии, TFPI связывает активизированный фактор X (FXa), в результате чего формируется гетеродимерный комплекс, который в свою очередь взаимодействует с комплексом FVIIa/TF, активность которого подавляется, и путь тканевого фактора свертывания крови блокируется. В принципе, блокирование активности TFPI может восстановить активность FXa и FVIIa/TF, таким образом, продолжительность активности пути тканевого фактора увеличивается, и генерация FXa усиливается, что является обыкновенным нарушением при гемофилии А и B.
На самом деле, некоторые предварительные результаты исследований указывают на то, что блокирование активности TFPI антителами нормализует увеличенное время свертывания крови или сокращает время кровотечения. Например, исследования Nordfang et al. продемонстрировали, что увеличенное про-тромбиновое время при гемофилии нормализовалось после обработки плазмы антителами TFPI (Thromb. Haemost, 1991, 66(4): 464-467). Подобным образом, исследования Erhardtsen et al. продемонстрировали, что время кровотечения при гемофилии А (модель кролика) существенно сократилось при использовании анти-TFPI антител (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394). Результаты этих исследований указывают на то, что ингибирование TFPI с помощью анти-TFPI антител может применяться при лечении гемофилии А или В. В данных исследованиях использовались исключительно поликлональные анти-TFPI антитела.
Моноклональные антитела против рекомбинантного человеческого TFPI (rhTFPI) были получены с использованием гибридомных методов. См. Yang et al., Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721. Производились исследования воздействия моноклонального антитела на протромбиновое время (РТ) и активированное частичное тромбопластиновое время (АРТТ). В результате исследований было обнаружено, что при введении анти-TFPI моноклонального антитела сокращается протромбиновое время при использовании плазмы с недостатком фактора IX. Предполагается, что путь тканевого фактора играет важную роль не только в физиологическом процессе свертывания крови, но также при кровотечениях, вызванных гемофилией (Yang et al., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300).
Соответственно для лечения гематологических заболеваний и рака необходимы антитела, специфические для TFPI.
Методами генной инженерии для лечения заболеваний человека были получены терапевтические антитела: мышиные, химерные, гуманизированные и полностью человеческие антитела. Было обнаружено, что мышиные моноклональные антитела не могут быть широко использованы в качестве лекарственных препаратов из-за короткого периода полураспада сыворотки, невозможности активирования эффек-торных функций человека и вырабатывания у человека антимышиных антител (Brekke and Sandlie,
"Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2, 53, 52-62, Jan. 2003). Было обнаружено, что при использовании химерных антител у человека начинает развиваться иммунная реакция. В гуманизированных антителах мышиный компонент еще более снижен. При использовании полностью человеческих антител, однако иммуногенность, вызванная наличием мышиного компонента в антителах, совершенно исключается. Таким образом, существует необходимость в разработке полностью человеческих антител, чтобы исключить иммуногенность, связанную с другими формами антител, полученных способами генной инженерии. В частности, при требующемся длительном профилактическом лечении гемофилии с применением анти-TFPI моноклональных антител, в случае использования мышиных антител или антител с компонентом мышиного происхождения высока вероятность развития иммунной реакции на терапию из-за необходимости частого введения препарата, а также из-за длительной терапии. Например, при лечении гемофилии А для терапии с применением антител препараты могут вводиться раз в неделю в течении всей жизни пациента. Это означает, что иммунная система в течение долгого времени будет подвергаться опасности. Таким образом, существует необходимость в разработке полностью человеческих антител для терапии с применением антител при лечении гемофилии и других, схожих наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови.
Терапевтические антитела были получены гибридомным методом, что описано в статье Koehler and Milstein "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256, 495497 (1975). Полностью человеческие антитела могут быть получены рекомбинантными способами в про-кариотических и эукариотических организмах. Получение антител в клетке-хозяине рекомбинантными способами является предпочтительным способом получения терапевтических антител по сравнению с использованием гибридомных методов. Получение антител рекомбинантными способами имеет следующие преимущества: большая стабильность продукта, возможна большая продуктивность и большая степень контроля при производстве, которая исключает или сводит к минимуму присутствие белков, полученных из организмов животных. Поэтому, желательно иметь возможность получать моноклональные анти-TFPI антитела рекомбинантным способом.
В дополнение, т.к. TFPI связывает активированный фактор X (FXa) с высокой аффинностью, эффективное анти-TFPI антитело должно обладать сопоставимой аффинностью. Таким образом, желательно иметь анти-TFPI антитело со связывающей аффинностью, сопоставимой со связыванием TFPI/FXa.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение представляет изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит:
a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замену R30S
или S35D или обе относительно SEQ ID NO: 1;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замену S55R или S56G или обе относительно SEQ ID NO: 1;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и
b) легкую цепь антитела человка, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замену
R28P или N29K относительно SEQ ID NO: 2;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из Y48F и N51V и их комбинаций относительно
SEQ ID NO: 2;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из S89A, D91W, D92S, G93S и V94T и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2.
Другим объектом изобретения является изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит:
a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замены R30S
и S35D относительно SEQ ID NO: 1;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замены S55R и S56G относительно SEQ ID NO: 1;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и
b) легкую цепь антитела человка, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замены
R28P и N29K относительно SEQ ID NO: 2;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей замены Y48F и
ii)
N51V относительно SEQ ID NO: 2;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей замены S89A, D91W, D92S, G93S и V94T относительно SEQ ID NO: 2.
Также настоящее изобретение представляет изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: (а) тяжелую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (b) легкую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность как показано в SEQ ID NO: 17.
Кроме того, объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения нарушения свертывания крови, содержащая терапевтически эффективное количество вышеуказанного монокло-нального антитела и фармацевтически приемлемый носитель.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, предоставленные моноклональные антитела к TFPI были оптимизированы, например, для получения антител с большей связывающей способностью или повышенной функциональной активностью.
Предпочтительно изолированное антитело является антителом IgG. Более предпочтительно изолированное антитело является антителом IgG2.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображена столбиковая диаграмма, иллюстрирующая 2А8 варианты с единичными аминокислотными заменами, которые в результате проведенного dPT анализа, проявили большую эффективность для сокращения времени свертывания крови с применением гемофильной А плазмы.
На фиг. 2 изображена диаграмма, которая демонстрирует эффективность выбранных анти-TFPI антител с единичной аминокислотной мутацией для сокращения времени свертывания крови гемофильной крови человека с индуцированным антифактор VIII антителом.
На фиг. 3 изображена диаграмма, которая демонстрирует, что 4B7-D62R имеет значительно большую эффективность для сокращения времени свертывания гемофильной А крови человека с индуцированным антителом по сравнению с исходным 4В7 антителом и, в меньшей степени, по сравнению вариантами с единичными аминокислотными заменами в 2А8.
На фиг. 4 изображена диаграмма, которая демонстрирует (в соответствии с введенными дозами препарата) выживаемость мышей, больных гемофилией А, которым было введено исходное антитело 2А8, а также 2А8 вариант с множественными аминокислотными заменами (А200) по сравнению с IgG1 контрольной мышью (СТХ IgG1).
На фиг. 5 изображена диаграмма, которая демонстрирует, что, в результате применения 2А8 варианта, свертываемость гемофильной С (с недостатком FXI) плазмы человека повысилась в зависимости от дозировки, и его эффективность является сопоставимой с эффективностью FVIIa, полученного рекомби-нантными способами.
Подробное описание изобретения Определения
Термин "ингибитор пути тканевого фактора" или "TFPI" при использовании по тексту настоящего документа относится к любому варианту, изоформе или видовому гомологу TFPI человека, экспрессия которого происходит в клетках естественным образом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, в результате того, что антитело по изобретению связывает TFPI, время свертывания крови сокращается.
При использовании по тексту настоящего документа, термин "антитело" относится к целому антителу, а также к любому фрагменту, связывающему антиген (т.е. "антиген-связывающему фрагменту") или к одиночной цепи. Термин относится к молекуле иммуноглобулина полной длины (например, IgG антитело), которая встречается в природе, или которая формируется в результате обычных рекомбинаци-онных процессов в фрагменте иммуноглобулинового гена или к иммунологически активному фрагменту молекулы иммуноглобулина, такому как фрагмент антитела, который сохраняет специфическую связывающую активность. Вне зависимости от структуры, фрагмент антитела связывает тот же антиген, что распознается антителом полной длины. Например, фрагмент анти-TFPI моноклонального антитела связывается с эпитопом TFPI. Антиген-связывающая функция антитела может быть выполнена фрагментами антитела полной длины. Термин "антиген-связывающий фрагмент" относится к связывающим фрагментам, которые включают, например: (i) Fab (моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов); (ii) F(ab')2(бивалентный фрагмент, включающий Fab фрагменты, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области); (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов; (iv) Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одной ветки антитела, (v) a dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), состоящий из VH домена; (vi) изолированную определяющую комплементарность область (CDR); (vii) миниантитела, диатела, триотела, тетратела и каппа тела (см., например, Ill et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); (viii) IgG верблюда и (ix) IgNAR. Кроме того, несмотря на то, что эти два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодированы различными генами, они могут быть соединены рекомбинантными способами, при помощи синтетичечкого линкера, который позволяет им сформировать одиночную белковую цепь, в которой VL и VH участки образуют пары и формируют моновалентные молекулы (известные
как одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что подобные одноцепочечные антитела также будут включены в термин "антиген-связывающий фрагмент" антитела. Подобные фрагменты антитела получают с использованием стандартных методов, известных специалистам, и фрагменты проходят такой же анализ на полезность, как и полные антитела.
Более того, предполагается, что антиген-связывающий участок может находиться в миметическом антителе. Термин "миметическое антитело" или "миметик" при использовании по тексту настоящего документа относится к белку, который проявляет способность связывания, подобную способности связывания антитела, однако является меньшим альтернативным антителом или является белком, не являющимся антителом. Такое миметическое антитело может содержаться на подложке-носителе. Термин " подложка-носитель" относится к платформе полипептида для конструирования новых продуктов со специализированными функциями и характеристиками.
При использовании по тексту настоящего документа, термины "подавляет связывание" и "блокирует связывание" (например, в отношении подавления/блокирования связывания TFPI лигандом TFPI) используются взаимозаменяемо и относятся как к частичному, так и к полному подавлению или блокированию. Также, подразумевается, что подавление и блокирование включают любое ощутимое снижение в связывающей аффинности TFPI с физиологическим субстратом, возникающее при контакте с анти-TFPI антителом, по сравнению с TFPI, не контактирующим с анти-TFPI антителом, например, блокирование взаимодействия TFPI с фактором Xa или блокирование взаимодействия комплекса TFPI-фактор Ха с тканевым фактором, фактором VIIa или комплексом тканевый фактор/фактор VIIa приблизительно на по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.
Термины "моноклональное антитело" или "антитела с мономолекулярным составом" при использовании по тексту настоящего документа относятся к получению молекул антител с мономолекулярным составом. Антитело с мономолекулярным составом проявляет единичную специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу. Соответственно при использовании по тексту настоящего документа, термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, которые проявляют единственную специфическую связывающую способность и которые имеют вариабельные и константные области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, внедренные неспецифическим или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или путем соматической мутации in vivo).
При использовании по тексту настоящего документа, термин "изолированное антитело" относится к антителу, по существу, свободному от других антител с иными антигенными свойствами (например, изолированное антитело, связывающее TFPI, по существу свободно от антител, связывающих другие антигены, отличные от TFPI). Изолированное антитело, связывающее эпитоп, изоформу или вариант TFPI человека может, тем не менее, иметь перекрестную реактивность к другим родственным антигенам, например, к антигенам из других видов (например, к видовым гомологам TFPI). Кроме того, изолированное антитело может быть по существу свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.
При использовании по тексту настоящего документа, термин "специфически связывающий" относится к антителу, связывающему определенный антиген. Обычно антитело связывает антиген с аффинностью по меньшей мере около 105 М-1, причем связывает определенный антиген с более высокой аффинностью (например, в два раза более высокой), чем аффинность при связывании другого антигена (например, бычьего сывороточного альбумина, казеина), отличного от определенного антигена или антигена, родственного определенному. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное для антигена" используются взаимозаменяемо с термином "антитело, специфически связывающее антиген".
При использовании по тексту настоящего документа, термин "высокая аффинность" IgG антитела относится к связывающей аффинности, которая составляет, по меньшей мере, приблизительно 107 М-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 108М-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 109 М-1, 1010 M-1, 1011 M-1 или выше, например до 1013 М-1 или выше. Тем не менее, "высокая связывающая аффинность" может варьироваться для других изотипов антител. Например, "высокая аффинность" IgG изотипа относится к связывающей аффинности, которая составляет по меньшей мере приблизительно 1.0 х 107 М-1. При использовании по тексту настоящего документа термин "изотип" относится к классам антител (например, IgM или IgG1), которые кодированы генами константной области тяжелой цепи.
Термины "определяющая комплементарность область" или "CDR" относятся к одному из трех гипервариабельных участков в вариабельном участке тяжелой цепи или в вариабельном участке легкой цепи молекулы антитела, которые формируют N-терминальную антиген-связывающую поверхность, которая является комплементарной по отношению к трехмерной структуре связываемого антигена. Эти определяющие комплементарность области берут начало от N-конца тяжелой или легкой цепи, и именуются "CDR1", "CDR2 и "CDR3" соответственно. CDR участвуют в связывании антигенов антителами, и
CDR3 содержит единственный участок, специфичный для связывания антигенов антителами. Следовательно, антиген-связывающий сайт может включать шесть CDR и содержать CDR участки из V участков тяжелой и легкой цепи.
При использовании по тексту настоящего документа термин "консервативные замены" относится к модификациям полипептида, которые включают замену одной или более аминокислот на аминокислоты с подобными биохимическими свойствами, в результате чего полипептид не утрачивает свои биологические или биохимические функции. "Консервативная аминокислотная замена" - это замена, когда аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком с подобной боковой цепью. Специалистам известны семейства остатков аминокислот с подобными боковыми цепями. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с полярными неионными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предполагается, что антитела по настоящему изобретению могут иметь консервативные аминокислотные замены и сохранять активность.
Для нуклеиновых кислот и полипептидов термин "существенная гомология" означает, что две нуклеиновые кислоты или два полипептида или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными (при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов), по меньшей мере приблизительно на 80% нуклеотидов или аминокислот, обычно по меньшей мере приблизительно 85%, предпочтительно приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 или 99.5% нуклеотидов или аминокислот. Альтернативно, имеется существенная гомология, когда сегменты гибри-дизируют в условиях селективной гибридизации с комплементом цепочки. Изобретение включает нук-леотидные последовательности и полипептидные последовательности существенно гомологичные специфическим нуклеотидным последовательностям и аминокислотным последовательностям, перечисленным в настоящем документе.
Процентом идентичности между двумя последовательностями является функциональная зависимость количества идентичных положений в обеих последовательностях (т. е., % гомологии = количество идентичных положений/ общее количество положений х 100), включая количество разрывов, и длину каждого разрыва, которые необходимо вставить при оптимальном выравнивании двух последовательностей. Сравнивание последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием математического алгоритма, такого как, помимо прочего, модуль AlignX(tm) VectorNTI(tm) (Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния). Для AlignX(tm), взяты следующие параметры по умолчанию для множественного выравнивания: штраф на внесение делеции: 10; штраф на продолжение делеции: 0,05; диапазон штрафа на разрыв делеции: 8; % отсрочки для идентичности выравнивания: 40. (более подробная информация может быть найдена по адресу: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html).
Еще один способ определения общего соответствия между исследуемой последовательностью (последовательность по настоящему изобретению) и искомой последовательностью, также называемый глобальным выравниванием последовательностей, может производиться с использованием программного обеспечения CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22):4673-4680), на основе алгоритма Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). При выравнивании последовательностей как исследуемые, так и искомые последовательности являются последовательностями ДНК. В результате проведения указанного глобального выравнивания последовательностей определяется процент идентичности. Предпочтительными параметрами при выравнивании последовательностей ДНК с использованием CLUSTALW для расчета процента идентичности путем парных выравниваний являются: матрица = IUB, размер участка максимального совпадения = 1, количество непрерывно совпадающих к-плетов на участке парного выравнивания = 5, штраф за делецию = 3, штраф на внесение делеции =10, штраф на продолжение делеции = 0,1. Для множественного выравнивания, предпочтительными параметрами являются следующие параметры CLUSTALW: штраф на внесение де-леции = 10, штраф на продолжение делеции = 0,05; диапазон штрафа на разрыв делеции = 8; % отсрочка для идентичности выравнивания = 40.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток или в частично очищенной или по существу очищенной форме. Нуклеиновая кислота является "изолированной" или "по существу, очищенной" при очистке от других сопутствующих в природном окружении клеточных компонентов. Для изоляции нуклеиновой кислоты могут использоваться стандартные методы, такие как, например, следующие способы: обработка щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, колоночная хроматография и
другие способы, известные специалистам.
Оптимизированные моноклональные антитела, с высокой аффинностью и функциональной активностью
Некоторые анти-TFPI антитела были идентифицированы в более ранних исследованиях и описаны в заявке РСТ № PCT/US 2009/052702, зарегистрированной 4 августа 2009 г., которая включена в настоящую заявку посредством ссылки для любых возможных целей. Эти анти-TFPI антитела могут быть подвергнуты дальнейшей оптимизации, например, путем улучшения аффинности и блокирующей активности к TFPI. Подобная оптимизация может осуществляться, например, путем сайт-насыщающего мутагенеза определяющих комплементарность областей (CDR) или остатков вблизи CDR антител, т.е приблизительно 3 или 4 остатка, непосредственно прилегающих к CDR.
Кроме того, настоящее изобретение предоставляет моноклональные антитела с повышенной или высокой аффинностью к TFPI. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-TFPI антитела имеют связывающую аффинность по меньшей мере приблизительно 107 M-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 108 M-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 или выше, например до 1013 M-1 или выше.
Сайт-насыщающий мутагенез в определяющих комплементарность областях и в остатках, непосредственно прилегающих к CDR анти-TFPI исходного антитела, которое именуется в настоящем документе 2А8, использовался для оптимизации аффинности и функциональной активности антител. Предполагается, что такая же оптимизация может быть произведена в отношении антител, описанных в
предшествующей заявке PCT/US 2009/052702.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, сайт-насыщающий мутагенез определяющих комплементарность областей может производиться на анти-TFPI антителах. Для 2А8, CDR в тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO: 1 соответствуют остаткам FTFRSYGMS (остатки 27-35), SIRGSSSSTY-YADSVKG (остатки 50-66) и KYRYWFDY (остатки 99-106). Для 2А8 легкой цепи, показанной в SEQ ID
NO: 2, CDR соответствуют остаткам SGDNLRNYYAH (остатки 23-33), YYDNNRPS (остатки 48-55) и
QSWDDGVPV (остатки 88-96). Модификация может производиться в любой из CDR по отдельности или могут производиться комбинации модификаций. Помимо этого, в отдельной CDR могут быть произведены две и более модификаций. В других вариантах осуществления изобретения, модификации могут также быть внедрены в непосредственной близости от CDR, например, в пределах 3 или 4 остатков с каждой стороны каждой CDR.
Вкратце, были введены единичные и/или множественные аминокислотные модификации для оптимизации исходного антитела 2А8, например, для улучшения аффинности. Вначале, единичные аминокислотные модификации были внедрены в шесть CDR или в остатки, находящиеся в непосредственной близости к CDR антитела, после чего производился анализ связывающих свойств TFPI. Модификации, которые усиливают сигнал связывания TFPI, были выбраны для комбинирования с другой одной или несколькими модификациями, а также для проведения анализа на обнаружение дальнейшего увеличения сигнала связывания. После проведения каждого анализа, выбранные варианты антитела использовались для определения его аффинности к TFPI и блокирующей активности по отношению к активности TFPI, а также для определения того, насколько сокращается время свертывания. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения предоставлено изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, с повышенной аффинностью по сравнению с немодифи-цированными исходными антителами. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения предоставлено изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, с увеличенной блокирующей активностью TFPI по сравнению с немодифициро-ванными исходными антителами. В некоторых вариантах осуществления изобретения предоставлено изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, с уменьшенным временем свертывания по сравнению с немодифицированными исходными антителами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения для уменьшения дивергенции от последовательности зародышевой линии были внедрены дополнительные аминокислотные модификации. В других вариантах осуществления изобретения, аминокислотные модификации были произведены с целью, сделать свойства антитела более подходящими для производства в промышленных масштабах.
Антитело может быть видоспецифичным или давать перекрестную реакцию с несколькими видами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может специфически реагировать или давать перекрестную реакцию с TFPI человека, мыши, крысы, кролика, морской свинки, обезьяны, свиньи, собаки, кошки или других видов млекопитающих.
Антителом может являться любое антитело из различных классов антител, таких как, помимо прочего, IgG1 антитело, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, секреторное IgA, IgD и IgE антитела.
2A8 варианты
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, может предоставляться изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фак
тора, где антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, где указанная аминокислотная последовательность, содержит одну или более модификаций аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация тяжелой цепи 2А8 является заменой.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, замены находятся в CDR тяжелой цепи 2А8. В других вариантах осуществления изобретения, замены находятся вне CDR тяжелой цепи 2А8.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена в тяжелой цепи 2А8 находится в положении, выбранном из: S35, S55 и K99. В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена в тяжелой цепи 2А8 может также включать положение, выбранное из: R30 и S56. Например, замена может быть выбрана из: R30S, S35D, S55R, S56G и K99L. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать две или более замены, выбранных из: R30S, S35D, S55R, S56G и
K99L.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные SEQ ID NO: 1: S35D+K99L; S35D+S55R+K99L.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные SEQ ID NO: 1: R30S+S35D+S55R+K99L; S35D+K99L; S35D+S55R+K99L; S35D+S55R+S56G+K99L и S35D+S56G+K99L.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, замены находятся в CDR легкой цепи 2А8. В других вариантах осуществления изобретения, замены находятся вне CDR легкой цепи 2А8.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена в легкой цепи 2А8 находится в положении, выбранном из Y48, N51, D91 и D92. В некоторых вариантах осуществления изобретения замена в легкой цепи 2А8 может включать положение, выбранное из G93 и V94. Например, замена может быть выбрана из R28P, N29K, Y48F, N51V, S89A, D91W, D92S, G93S и V94T. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать две или более замены, выбранных из R28P, N29K, Y48F, N51V, S89A, D91W, D92S, G93S и V94T.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные SEQ ID NO: 2: Y48F+N51V; Y48F+D91W; Y48F+N51V+D91W и N51V+D91W.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные SEQ ID NO: N29K+Y48F+N51V+D91W; N51V+D91W; R28P+Y48F+N51V+D91W;
Y48F+D91K; Y48F+D91W; Y48F+N51V; Y48F+N51V+D91W; Y48F+N51V+D91W+D92S;
Y48F+N51V+D91W+G93S; Y48F+N51V+D91W+V94T и Y48F+N51V+S89A+D91W.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, содержит: а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10; а также b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17.
Способы получения антител к TFPI
Моноклональное антитело может быть получено рекомбинантными способами или путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельные области моноклонального антитела согласно вариантам осуществления изобретения в клетке-хозяине. С помощью вектора экспрессии подходящая клетка-хозяин может быть также трансфицирована нуклеиновой кислотой, содержащей нуклео-тидную последовательность, и использована для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способ получения моноклонального антитела, которое связывает TFPI человека, включающий:
(a) трансфицирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей моноклональное антитело по изобретению, в клетку-хозяина,
(b) культивирование клетки-хозяина для экспрессии указанного моноклонального антитела в клетке-хозяине, и, при необходимости,
(c) изолирование и очищение полученного моноклонального антитела, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую моноклональное антитело по настоящему изобретению.
Согласно одному из примеров для экспрессии указанных антител или фрагментов антител ДНК, кодирующие частичные легкие и тяжелые цепи или цепи полной длины, полученные стандартными способами молекулярной биологии, могут быть встроены в векторы экспрессии таким образом, что гены функционально связаны с регуляторными последовательностями транскрипции и трансляции. В данном контексте термин "функционально связанные" означает, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что регуляторные последовательности транскрипции и трансляции в векторе выполняют их пред
полагаемую функцию регуляции транскрипции и трансляции гена данного антитела. Вектор экспрессии и регуляторные последовательности экспрессии выбраны таким образом, что они являются совместимыми с используемой экспрессионной клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы или, более конкретно, оба гена встроены в один и тот же вектор экспрессии. Гены антител встраивают в вектор экспрессии стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или ли-гированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для создания полноразмерных генов антител любого изотипа антитела встраиванием их в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи желаемого изотипа таким образом, что Vu-сегмент функционально связывается с Cu-сегментом (сегментами) в данном векторе, и ^-сегмент функционально связывается с С-сегментом в этом векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид связывается в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т. е. сигнальным пептидом из белка, не являющегося иммуноглобулином).
В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы по настоящему изобретению несут регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые регулируют транскрипцию и трансляцию генов цепей антител. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Примеры регуляторных последовательностей для экспрессии клетки-хозяина млекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые определяют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающего, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьян 40 (SV40), аденовируса, (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Альтернативно, могут быть использованы невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор Р-глобина.
В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательносстям, рекомбинантные экс-прессирующие векторы могут нести дополнительные последовательности, например, последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США U.S. Pat. Nos. 4399216, 4634665 и 5179017, все Axel et al.). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен данный вектор. Примеры генов селектируемых маркеров включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах с отбором/амплификацией в присутствии метотрексата) и ген пео (для отбора в присутствии G418).
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей вектор (векторы) экспрессии, кодирующие тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными способами. Подразумевается, что различные формы термина "трансфекция" включают большое разнообразие способов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электро-порацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с использованием DEAE-декстрана и т.п. Хотя теоретически можно экспрессировать антитела по настоящему изобретению в любых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительной является экспрессия антител в эукариотиче-ских клетках и, наиболее предпочтительно, в клетках-хозяевах млекопитающих, так как такие эукарио-тические клетки и, в частности, клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, будут собираться и секретировать правильно уложенное и иммунологически активное антитело.
Примеры клеток-хозяев млекопитающего для экспрессии рекомбинантных антител включают ова-риальные клетки китайского хомячка (СНО клетки) (включая dhfr- СНО клетки, описанные в статье Ur-laub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, используемые с DHFR-селектируемым маркером, например, как описано R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), NSO мие-ломные клетки, COS клетки, HKB11 клетки и SP2 клетки. При введении рекомбинантных векторов экспрессии, кодирующих гены антител, в клетки-хозяев млекопитающих антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белка, таких как ультрафильтрация, эксклюзионная хроматография, ионнообменная хроматография и
центрифугирование.
Использование частичных последовательностей антител для экспрессии полных антител
Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести CDR тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR являются более разнообразными между отдельными антителами, чем последовательности вне CDR. Поскольку последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических встречающихся в природе антител, конструированием векторов экспрессии, которые включают в себя последовательности CDR из специфического встречающегося в природе антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321: 522-525; and Queen, С. et al., 1989, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033). Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных, которые включают в себя последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности зародышевой линии будут отличаться от последовательностей генов "созревших" антител, так как они не будут включать полностью собранные изменчивые гены, которые формируются в результате VDJ рекомбинации в процессе созревания В-клетки. Необязательно получать полную последовательность ДНК определенного антитела для создания полного рекомбинант-ного антитела со связывающими свойствами, подобными свойствам оригинального антитела (см. WO 99/45962). Обычно для этой цели достаточно частичной последовательности тяжелой и легкой цепей, перекрывающей области CDR. Данная частичная последовательность используется для идентификации вариабельных и соединяющихся сегментов генов зародышевой линии, которые участвовали в создании рекомбинированных вариабельных генов антитела. Затем, для заполнения пропущенных фрагментов в вариабельных областях используется последовательность зародышевой линии. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепей расщепляются в ходе созревания белка и не влияют на свойства конечного антитела. Поэтому необходимо использовать соответствующую лидерную последовательность зародышевой линии для конструктов экспрессии. Для добавления отсутствующих последовательностей, клонированные последовательности кДНК могут комбинироваться с синтетическими олигонуклеотида-ми путем лигирования или ПЦР-амплификации. В качестве альтернативы, вся вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких, перекрывающих олигонуклеотидов и комбинирована ПЦР-амплификацией для создания полностью синтетического клона вариабельной области. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминация или введение определенных сайтов рестрикции, а также оптимизация определенных кодонов.
Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей используются для разработки перекрывающего набора синтетических олигонуклеотидов для создания синтетических V последовательностей со способностью кодирования аминокислот, идентичной природным последовательностям. Синтетические последовательности тяжелых и легких цепей могут иметь отличия от природных последовательностей. Например, цепочки повторяющихся нуклеиновых оснований прерывают для облегчения олигонуклеотидного синтеза и ПЦР-амплификации; оптимальные сайты инициации трансляции инкорпорируют в соответствии с правилами Козака (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); а вверх или вниз по ходу транскрипции от сайтов инициации транскрипции конструируются сайты рестрикции.
Для оптимизированного кодирования и соответствующего некодирования вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей последовательности цепей разбивают на фрагменты из 30-50 нуклеоти-дов, примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи, олигонуклеотиды могут быть собраны в перекрывающие двухцепочечные наборы, которые перекрывают сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем пулы используют как матрицы для получения продукты ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые раздельно амплифицируют с получением двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Затем эти перекрывающиеся продукты комбинируют путем ПЦР-амплификации с образованием полной вариабельной области. Желательно, включить перекрывающий фрагмент константной области тяжелой и легкой цепи в ПЦР-амплификацию для создания фрагментов, которые с легкостью могут быть клонированы в конструкты вектора экспрессии.
Реконструированные вариабельные области тяжелых и легких цепей затем комбинируют с клонированным промотором, последовательностями инициации трансляции, константной областью, 3' не-транслируемыми последовательностями, сайтами полиаденилирования и последовательностями терми-нации транскрипции для формирования конструктов вектора экспрессии. Конструкты экспрессии тяжелой и легкой цепей могут комбинироваться в один вектор, котрансфицированы, серийно трансфицирова-ны или трансфицированы по отдельности в клетки-хозяева, которые затем сливаются в одну клетку-хозяина, экспрессирующую обе цепи.
Таким образом, согласно еще одному аспекту структурные особенности человеческого анти-TFPI антитела используются для создания структурно родственных человеческих анти-TFPI антител, которые сохраняют функцию связывания TFPI. Более конкретно, одна или несколько CDR специфически идентифицированных областей тяжелых и легких цепей моноклональных антител по изобретению могут быть
комбинированы рекомбинантными способами с известными человеческими каркасными областями и CDR, в результате чего получаются дополнительные, полученные рекомбинантными способами, человеческие анти-TFPI антитела по изобретению.
Фармацевтические композиции Кроме того, настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество анти-TFPI моноклонального антитела, и фармацевтически приемлемый носитель. Под термином "фармацевтически приемлемый носитель" подразумевается вещество, которое может быть добавлено к активному компоненту для изготовления препарата согласно рецептуре или для стабилизации препарата и которое не вызывает значительных нежелательных побочных эффектов у пациента. Примеры подобных носителей хорошо известны специалистам и включают воду, сахара, такие как мальтозный сахар и сахароза, альбумин, соли, такие как хлорид натрия и т. д. Другие виды носителей описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Подобные композиции содержат терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного анти-TFPI монокло-нального антитела.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления инъекционных растворов или дисперсий. Способы использования подобных сред и агентов с фармацевтически активными веществами хорошо известны специалистам. Предпочтительно полученный состав композиции предназначена для парентеральной инъекции. Композиция может быть в форме раствора, микроэмульсии, липосомы или в любой другой форме, подходящей для высоких концентраций активного вещества. Носителем может быть растворитель или дисперсная среда, которые содержат, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), а также их подходящие смеси. В некоторых случаях в состав носителя могут входить изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.
Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения в требующийся объем соответствующего растворителя с одним из компонентов, перечисленных выше, или, при необходимости, с комбинацией таких компонентов, после чего следует этап стерилизующей микрофильтрации. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильную основу, содержащую основную дисперсионную среду и другие требующиеся компоненты из тех, что перечислены выше. В случае если при приготовлении стерильных инъекционных растворов используются стерильные порошки, некоторыми методами их получения являются вакуумная сушка и сушка замораживанием (лиофилизация), когда из раствора прошедшего стерилизующую фильтрацию получают порошок, содержащий активный компонент вместе с любым дополнительным компонентом по желанию.
Фармацевтическое применение
Моноклональное антитело может использоваться для терапевтических целей при лечении наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови. Например, моноклональные антитела в вариантах осуществления изобретения, описанных выше, могут использоваться для блокирования взаимодействия TFPI с FXa или для предотвращения TFPI-зависимого подавления активности TF/FVIIa. В качестве дополнения, моноклональное антитело может использоваться для восстановления генерации FXa, вызываемой TF/FVIIa, для того, чтобы избежать влияния недостаточности FVIII- или FIX-зависимой амплификации FXa.
Моноклональные антитела могут иметь терапевтическое применение для лечения нарушений свертывания крови, таких как тромбоцитопения, нарушения функции тромбоцитов и кровоточивость (например, гемофилия А, гемофилия В и гемофилия С). Лечение подобных нарушений может осуществляться путем введения терапевтически эффективного количества анти-TFPI моноклонального антитела пациенту, нуждающегося в таком лечении. Моноклональные антитела могут иметь терапевтическое применение при лечении неконтролируемых кровотечений с такими показаниями к применению, как травма или геморрагический инсульт. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ сокращения времени кровотечения путем введения терапевтически эффективного количества анти-TFPI моноклонально-го антитела по изобретению пациенту, нуждающегося в таком лечении.
Антитела могут использоваться для монотерапии или в сочетании с другими средствами терапии при лечении гемостатических расстройств. Например, полагается, что совместное введение одного или более антител по изобретению с фактором свертывания крови, таким как, например, фактор VIIa, фактор VIII или фактор IX может эффективно применяться при лечении гемофилии. В одном варианте осуществления изобретения предоставлен способ лечения наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови, включающий введение: (а) первой дозы моноклонального антитела, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора и (b) второй дозы фактора VIII или фактора IX, при этом дозы, введенные вместе, эффективно используются для лечения указанных нарушений. В другом варианте осуществления изобретения предоставлен способ лечения наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови, включающий введение: (а) первой дозы моноклонального антитела, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора и (b) второй дозы фактора VIII или фактора IX, при этом дозы, введенные вместе, эффективно используются для лечения указанных нарушений, причем
фактор VII совместно не вводится. Изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество комбинации моноклонального антитела по изобретению и фактора VIII или фактора IX, причем композиция не содержит фактор VII. В понятие "фактор VII" входит фактор VII и фактор VIIa. Эти комбинированные терапии способны снизить частоту необходимого введения фактора свертывания. Под совместным введением или под комбинированной терапией подразумевается применение двух лекарственных средств в одной композиции, либо в случае, когда они изготовлены раздельно, два лекарственных средства вводятся пациенту приблизительно одновременно, либо неодновременно, но в течение одного терапевтического периода.
В некоторых вариантах осуществления изобретения одно или несколько антител, описанных в настоящем документе, могут использоваться при лечении гемостатических расстройств. Например, полагается, что совместное введение одного или нескольких антител, описанных в настоящем документе, может использоваться для лечения гемофилии или каких-либо других гемостатических расстройств.
Фармацевтические композиции могут приниматься парентерально пациентами, страдающими от гемофилии А или В, доза и частота приема препарата могут варьироваться в зависимости от степени тяжести кровотечения, либо (в случае профилактической терапии) в зависимости от степени тяжести нарушения системы свертывания крови пациента.
Композиции могут вводиться пациентам, нуждающимся в таком лечении, болюсным введением или постоянной инфузией. Например, при болюсном введении антитела по изобретению, в качестве Fab-фрагмента дозировка может составлять 0,0025-100 мг/кг массы тела, 0,025-0,25 мг/кг, 0,010-0,10 мг/кг или 0,10-0,50 мг/кг. При постоянной инфузии антитела по изобретению, в качестве Fab-фрагмента дозировка может составлять 0,001-100 мг/кг массы тела/мин, 0,0125-1,25 мг/кг/мин, 0,010-0,75 мг/кг/мин, 0,010-1,0 мг/кг/мин или 0,10-0,50 мг/кг/мин на протяжении 1-24 ч, 1-12 ч, 2-12 ч, 6-12 ч, 2-8 ч, либо 1-2 ч. При введении антитела по изобретению, в качестве антитела полной длины (с полной константной областью) дозировка может составлять приблизительно 1-10 мг/кг массы тела, 2-8 или 5-6 мг/кг. Подобные антитела полной длины обычно вводятся инфузией на протяжении 0,5-3 ч. Частота введения препарата зависит от степени тяжести состояния пациента. Частота введения препарата может варьироваться от трех раз в неделю до одного раза в две недели или одного раза в шесть месяцев.
В дополнение к этому композиции могут вводиться пациентам подкожной инъекцией. Например, анти-TFPI антитело может вводиться пациентам подкожной инъекцией при дозировке 10-100 мг один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц.
При использовании по тексту настоящего документа термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество анти-TFPI моноклональныого антитела или комбинации данного антитела и фактора VIII или фактора IX, которое требуется для повышения времени свертывания in vivo или для оказания ощутимой пользы пациенту, нуждающемуся в таком лечении, каким-либо другим способом. Точное количество будет зависеть от множества факторов, включающих, помимо прочего, такие факторы, как конкретные компоненты и физические характеристики терапевтической композиции, особенности обследуемой группы пациентов, индивидуальные особенности пациента и другие, подобные факторы. Точное количество может быть с легкостью определено специалистом в данной области.
Примеры
Пример 1. Клонирование, экспрессия и количественное определение уровней экспрессии антитела Тяжелая и легкая цепь Fab 2А8 и 4В7 дикого типа, несущие метку с-тус и гексагистидиновую метку на С-конце тяжелой цепи, были субклонированы в бактериальный вектор экспрессии рЕТ28а (No-vagen/Merck Chemicals Ltd., Ноттингем, Великобритания) и трансформированы в клетки Top10F' (Invitro-gen GmbH, Карлсруэ, Германия). В качестве альтернативы, могут использоваться другие бактериальные векторы экспрессии (например, система векторов pQE, Qiagen GmbH, Хильден, Германия) и штаммы (например, DH5cc, Invitrogen GmbH, Карлсруэ, Германия).
Варианты были получены стандартным олигонуклеотид-направленным сайт-специфическим мутагенезом и подтверждены секвенированием ДНК. В частности, аминокислотные остатки, находящиеся внутри или окружающие, определяющие комплементарность области, были модифицированы в тяжелой и/или легкой цепи.
Для того, чтобы иметь возможность использовать антитела дикого типа и мутантные антитела в качестве конкурентов, эпитопные метки, находящиеся на С-конце тяжелой цепи были удалены или замещены с помощью стандартных методов на основе ПНР. В частности, для 4В7 метку с-тус заменили на эпитопную метку гемагглютинина (НА) для всех анализируемых вариантов. Напротив, 4В7 дикого типа или варианты, используемые в качестве конкурентов, несли метку c-myc. В случае 2А8, c-myc-эпитопную метку заменили на НА-метку или удалили, в результате чего был получен вариант с 6х гис-тидиновыми эпитопными метками на С-конце.
Для экспрессии варианты были трансформированы в штамм BL21starDE3 Escherichia coli (Invitro-gen, C6010-03), инокулированы в выращенную в течение ночи культуру, в LB среде, содержащей кана-мицин (30 мкг/мл), и инкубировали при температуре 37°C в течение 18 ч. Экспрессионные культуры были получены путем инокулирования выращенной в течение ночи культуры 1:20 в свежую LB среду, со
держащую канамицин (30 мкг/мл). По прошествии 6 ч, для того чтобы вызвать экспрессию антитела, было добавлено 1 мМ изопропил-b-D-1-тиогалактопиранозида (Roth, 2316.5), и культуры инкубировали еще в течение 18 ч при температуре 30°C. В качестве альтернативы, инкубированные в течение ночи культуры инокулировали 1:20 в среду с автоиндукцией Overnight Express ТВ medium (Merck, 71491) и инкубировали при температуре 30°C в течение 24 ч.
Для количественного определения уровня экспрессии использовался иммуноферментный анализ (ELISA). Вкратце, пластины микротитратора (Nunc maxisorp black, 460518) инкубировали с Fab-специфическим антителом (Sigma, I5260), растворенном в буфере для иммобилизации (Candor Bioscience GmbH, 121500) при температуре 4°C в течение ночи, промыли PBST (фосфатно-солевой буферный раствор: 137 мМ NaCl, Merck 1.06404.5000; 2,7 мМ KCl, Merck 1.04936.1000; 10 мМ Na2HPO4, Merck
1.06586.2500, 1,8 мМ KH2PO4, Merck 1.04871.5000; с 0,05% твин 20 Acros Organics, 233360010), блокировали 2% молока в PBST в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем снова промыли. Культуры растворили в 0,25% обезжиренного молока (Fluka analytical, 70166) в PBS и оставили в пластинах микро-титратора в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки PBST, пойманные антитела инкубировали вместе с HRP-спаренным анти-Fab антителом (Sigma, A0293) и обнаружили путем инкубирования пластины с 10 мкМ субстрата Амплекс красный (Amplex red) (Invitrogen, A12222) в течение 10-30 мин при комнатной температуре в темноте, а затем было произведено измерение флуоресценции. Уровни экспрессии были нормализованы после определения концентрации, относительно очищенного антитела дикого типа (2А8 или 4В7).
Пример 2. Определение активности и межвидовой перекрестной реактивности полученных вариантов антитела
Для определения активности мутированных вариантов антитела на TFPI человека или мыши (American Diagnostica, 4900B и R &D Systems, 2975-P1, соответственно) использовался неконкурентный или конкурентный иммуноферментный анализ (ELISA). Вкратце, пластины микротитратора (Mesoscale Discovery, L21XA-4, либо Nunc maxisorp black, 460518) были покрыты 0,04-2 мкг/мл TFPI человека или мыши, растворенном в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) или в буфере для иммобилизации (Candor Bioscience GmbH, 121500), соответственно, и инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. После промывки, пластины блокировали 3% альбумина бычьей сыворотки (Sigma, A4503) в PBST в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем повторили стадию промывки. Для связывания антител на пластины добавили 10-25 мкл культурального супернатанта, который был нормализован до уровня экспрессии соответствующего антитела (если не указано иное) на 1 ч при комнатной температуре, а затем промыли PBST. Связанные антитела дикого типа или варианты антител затем идентифицировали с помощью специфического антитела, распознающего эпитопную метку, или либо с помощью конкурентного анализа. Для конкурентного анализа, добавляли 50-300 нМ конкурента или свободного антигена и инкубировали в течение от 20 мин до 24 ч при комнатной температуре. После промывки оставшиеся варианты идентифицировали с помощью специфического антитела, распознающего эпитопную метку, соединенного с пероксидазой хрена (Biomol, анти-c-myc А190-105Р для 2А8 вариантов и анти-НА А190-108Р для 4В7 вариантов) или с помощью анти-myc антитела (Sigma, C3956) или анти-НА антитела (Sigma, H6908), которое было предварительно помечено сульфо-NHS реагентом в соответствии с инструкциями производителя для электрохемилюминесцентного анализа (Mesoscale Discovery, R91AN-1). Для детекции сигнала, на пластины микротитратора добавили 10 мкМ субстрата Амплекс красный (Amplex red) (Invitrogen, A12222) и инкубировали в течение 10-30 мин при комнатной температуре в темноте, а затем было произведено измерение флуоресценции. Для детекции, на MSD пластинах MSD трис-буфер Read Buffer Т растворили 2х в H2O (Mesoscale Discovery, R92TC-1), добавили на пластины и детектировали электрохеми-люминесцентный сигнал на 620 нм при помощи Mesoscale Discovery Sector Imager 6000.
Пример 3. Единичные и множественные аминокислотные замены
В табл. 1 приведены несколько примеров единичных и множественных аминокислотных замен в тяжелой и легкой цепи 2А8. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ELISA). После нормализации до соответствующего уровня экспрессии, был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа на TFPI человека и мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и антител дикого типа (wt). Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений.
В табл. 2 приведены несколько примеров комбинированных аминокислотных замен в 2А8 TFPI антителах. В связи с тем, что в табл. 2 приведены не все возможные комбинации, предполагается, что TFPI антитело может содержать любую комбинацию предоставленных модификаций. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ELISA). Если не указано иное, варианты нормализировали до соответствующего уровня экспрессии, и был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа TFPI человека и мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и эталонных антител (HCK99L). Значения помечены знаком в случае если эффективность варианта анализировалась без предварительной нормализации и отношения вариант-эталон были нормализованы до уровня экспрессии путем деления сигнала анализа на уровень экспрессии. В случаях, когда для конкурентного иммунологического анализа ELISA использовался другой эталон, и варианты анализировались без предварительной нормализации, значения помечены знаком Для этих вариантов, указанное в таблице значение было получено путем умножения отношения вариант/альтернативный эталон на отношение альтернативный эталон/HC_K99L. Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений.
18.6*
5.0
18.2*
6.8
23.9*
6.3
22.8*
7.6
17.0*
4.0
16.5*
5.9
22.8*
6.4
19.9*
8.0
15.7*
3.9
13.7*
5.1
10.9*
3.1
9.0*
4.0
20.9*
5.3
20.3*
7.4
17.9*
4.5
19.1*
6.9
16.0*
3.6
14.7*
5.2
19.6*
4.9
18.1*
6.8
11.2*
2.8
11.6*
4.1
10.9*
2.8
12.6*
4.4
10.1*
2.7
7.9*
2.7
21.4*
5.2
18.7*
7.2
18.3*
4.6
13.3*
4.3
11.9*
2.1
9.3*
2.9
21.4*
3.6
16.8*
5.8
18.8*
4.4
12.3*
3.5
19.8*
3.3
15.5*
4.8
18.7*
3.4
15.1*
4.6
19.9*
4.0
20.3*
5.7
4.4*
1.3
6.1*
1.7
20.7*
4.1
20.5*
6.7
14.2*
2.7
15.6*
4.2
18.6*
4.0
19.3*
5.4
10.2*
2.1
13.6*
4.6
4.0*
0.9
4.6*
1.3
3.9*
1.2
3.0*
1.0
18.1*
4.3
18.2*
5.8
17.8*
4.2
16.9*
5.0
13.6*
2.8
10.6*
3.6
13.5*
2.8
6.5*
3.3
9.0*
2.0
4.7*
2.3
16.6*
3.8
9.3*
4.3
11.7*
2.9
7.9*
4.6
16.2*
3.9
12.1*
6.0
12.1*
2.8
7.7*
3.8
2.2*
0.9
2.4*
1.4
11.4*
2.7
7.1*
3.6
9.8*
2.5
5.9*
2.0
19.6*
3.5
21.4*
9.6
18.0*
4.9
15.4*
7.6
В табл. 3 приведены несколько примеров единичных и/или двойных аминокислотных замен в тяжелой и легкой цепи 4В7. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ELISA). После нормализации до соответствующего уровня экспрессии, был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа на TFPI человека и путем неконкурентного иммуноферментного анализа на TFPI мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и антител дикого типа. Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений.
В табл. 4 приведены несколько примеров комбинаций аминокислотных замен в 4В7 TFPI антителах. В связи с тем, что в табл. 4 приведены не все возможные комбинации, предполагается, что TFPI антитело может содержать любую комбинацию предоставленных модификаций. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ELISA). Если не указано иное, варианты нормализировали до соответствующего уровня экспрессии, и был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа на TFPI человека и мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и эталонных антител (HCD62R). В случаях, когда использовался другой эталон, и варианты анализировались без предварительной нормализации, значения помечены знаком "*". Для этих вариантов, указанное в таблице значение было получено путем умножения отношения вариант/альтернативный эталон на отношение альтернативный эталон/НС_D62R. Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений, nb - при используемых условиях анализа связывания не обнаружено.
Пример 4. Очистка антител
Клетки осаждали центрифугированием при 9000 об./мин в течение 30 мин при температуре 4°C и хранили при температуре -20°C. Супернатант заменили на буфер А (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола рН8.0), концентрировали и очистили с использованием двухэтапной процедуры очистки. Вкратце, 100 мл концентрированного супернатанта загрузили на 5 мл Ni-NTA спин-колонки (Qiagen, 1018142) и промыли, сперва, 5х объемами колонки буфера А, а затем 5х объемами колонки 4,3% буфера В (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола рН8.0) и элюировали 7 объемами буфера В. Фракции комбинируются и диализируют в PBS. На втором этапе очистки, антитела, очищенные с помощью, Ni-NTA инкубировали с аффинной матрицей, специфичной для легкой цепи, то есть, с захватом и выбором лямбда или каппа (ВАС 0849.010 и ВАС 0833.10, соответственно) для 2А8 и 4В7, соответственно. После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C матрицу загрузили в колонку, промыли 5 пятью объемами PBS, 5 пятью объемами 500 мМ аргинина 100 мМ NaH2PO4, 100 мМ NaCl рН6,0, а затем снова 5 пятью объемами PBS. Антитела элюировали 6 объемами 100 мМ глицина рН3.0, а затем 3 объемами 100 мМ глицина рН2.0 в 1/10 общего объема 1 М HEPES рН 7.5 для нейтрализации элюата. В завершение, элюаты диализированы в PBS в течение ночи при температуре 4°C. Очищенные антитела анализировали с помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Пример 5. Измерение аффинности связывания TFPI антителом с использованием поверхностного плазмонного резонанса (Biacore)
Для анализа на поверхности были иммобилизованы TFPI человека или мыши. Для иммобилизации лиганда, в соответствии с инструкциями производителя, использовались сенсорные чипы СМ5 и амин-ный набор для иммобилизации (GE HealthCare). Количество иммобилизованного TFPI составляло, приблизительно, 70 RU для адаптации к массе антитела, которое может генерировать RMax из 100 RU. Исходные антитела и анти-TFPI антитела с развившейся аффинностью находились в подвижной фазе. Производилось определение аффинности, по меньшей мере, пяти различных концентраций (0,1, 0,4, 1,6, 6,4 и 25 нМ) очищенных антител.
С помощью анализа вариантов антител, содержащих единичные мутации в областях CDR, нами было идентифицировано большое количество клонов с более высоким сигналом при проведении имму-ноферментного анализа связывания (ELISA). Выбранные клоны были очищены, был проведен анализ их аффинности к TFPI человека или мыши с использованием Biacore. Как показано в табл. 5 и 6, эти клоны имеют более высокую аффинность к TFPI, чем исходные антитела 2А8 или 4В7. Хотя некоторые 2А8 мутанты имеют более низкую скорость ассоциации (ka) чем исходное антитело 2А8, все эти мутанты имеют гораздо более низкую скорость диссоциации (kd), чем 2А8. В целом, эти единичные мутации увеличили аффинность 2А8 в 1,47 - 7,22 раз, при использовании человеческого TFPI, и в 1,71 - 7,20 раз при использовании мышиного TFPI. При проведении нами анализа 4В7 вариантов, мутация D62R в CDR2 домене тяжелой цепи имела существенно увеличенный сигнал. Этот клон был выбран для определения аффинности. Как показано в табл. 5 и табл. 6, эта единичная мутация увеличивает аффинность 4В7 к TFPI человека с 11,1 нМ до 58,2 нМ, то есть в 191 раз. Низкая скорость диссоциации (kd) 4B7HcD62R в основном способствует улучшению аффинности, с 8,40х10-3/с (4B7) до 1,65х10-4 (4B7HcD62R), то есть, приблизительно, в 50 раз. Подобным образом, эта мутация увеличивает аффинность 4В7 к мышиному TFPI с 58,6 до 427 нМ, то есть в 137 раз.
Таблица 5. Аффинность выбранных 2А8 или 4В7 вариантов (единичная мутация) к
человеческому TFPI
Образец
Клон
ka (1/Мсек)
kd (1/сек.)
К I) (M)
Улучшение
2А8-1
HC_G33P
2.71E+06
2.24E-03
8.27E-10
2.70
2А8-2
HC_S31P
2.91E+06
3.33E-03
1.15E-09
1.95
2А8-3
HC_S31V
3.84E+06
1.43E-03
3.73E-10
6.00
2А8-4
HC_S35D
4.01E+06
3.80E-03
9.50E-10
2.35
2А8-6
НС 15 IE
1.29E+06
1.62E-03
1.26E-09
1.78
2А8-7
HC_S54F
2.81E+06
2.04E-03
7.27E-10
3.08
2А8-8
HC_S55R
4.30E+06
3.94E-03
9.17E-10
2.44
2А8-9
HC_K99L
2.60E+06
8.03E-04
3.09E-10
7.22
2А8-10
HC_K99V
2.55E+06
2.54E-03
9.95E-10
2.25
2А8-11
LC_A32N
2.70E+06
4.10E-03
1.52E-09
1.47
2А8-12
HCI5 ID
3.61E+06
4.95E-03
1.37E-09
1.63
2А8-13
LC_N51V
4.26E+06
2.20E-03
5.18E-10
4.32
2А8-14
LC_Y48F
2.64E+06
3.00E-03
1.14E-09
1.97
2А8-15
LC_D91K
4.33E+06
2.09E-03
4.82E-10
4.64
2А8-16
LC_D91L
4.41E+06
4.40E-03
9.99E-10
2.24
2А8-17
LC_D91W
3.86E+06
4.32E-03
1.12E-09
2.00
2А8-20
2A8wt
3.13E+06
7.00E-03
2.24E-09
1.00
4B7HCD62R
HC_D62R
2.83E+06
1.65E-04
5.82E-11
190.83
4В7
4B7wt
7.56E+05
8.40E-03
1.11E-08
1.00
Затем была исследованна связывающая аффинность множественных мутаций в 2А8 и 4В7. Как показано в табл. 7(а) и табл. 8(а), мутанты 2А8, которые содержат множественные мутации в CDR доменах, имеют более высокую аффинность, чем единично мутированные 2А8, как при связывании TFPI человека, так и мышиного TFPI. Например, 2А8-200 имеет в 53,7 раз более высокую аффинность, чем 2А8 при связывании TFPI человека, и в 55,4 раз более высокую аффинность при связывании TFPI мыши. Как показано в табл. 7(b) и табл. 8(b), мутанты 4В7, которые содержат множественные мутации в CDR доменах, имеют более высокую аффинность, чем единично мутированные 4В7, как при связывании TFPI человека, так и мышиного TFPI. Эти варианты из исходных последовательностей 2А8 и 4В7, приведенные в табл. 7 и 8, также приведены в перечне последовательностей. SEQ ID NO: 5-11 соответствуют вариантам тяжелой цепи 2А8, список которых приведен в табл. 7 и 8. SEQ ID NO: 12-18 соответствуют вариантам легкой цепи 2А8. SEQ ID NO: 19-26 соответствуют вариантам тяжелой цепи 4В7, список которых приведен в табл. 7 и 8. SEQ ID NO: 27-34 соответствуют вариантам легкой цепи 4В7.
Таблица 7(a). Аффинность выбранных 2А8 вариантов (множественные мутации) к TFPI человека
2А8НС
2А8 LC
разцы
S55
S56
К99
S21
R28
D91
D92
G93
-а-
1/Мсек)
(1/сек.)
D (М)
эе улучшена
ю О
<
ka (
KD кратн <
2А8-127
1.68Е+06
1.41Е-04
8.41 Е-11
2А8-143
2.88Е+06
1.05Е-04
3.64Е-11
50.9
2А8-200
2.87Е+06
9.88Е-05
3.44Е-11
53.7
2А8-216
3.29Е+06
1.54Е-04
4.67Е-11
39.6
2А8-227
3.28Е+06
1.23Е-04
3.75Е-11
49.4
2А8-д200
6.17Е+05
3.61 Е-05
5.84Е-11
31.7
2А8-д216
1.45Е+06
5.29Е-05
3.65Е-11
50.7
2А8 wt
2.05Е+06
3.80Е-03
1.85Е-09
Таблица 8(b). Аффинность выбранных 4В7 вариантов (множественные мутации) к TFPI мыши
О ю ни п з ]
4В7 НС
4В7 LC
¦о ^ т . о <а ^
^ О -^5 ,
см Z
G44
К55
D62
см >
F31
S32
D33
D97
В18.5
1.09Е+06
4.30Е-04
3.95Е-10
138.7
В2.0
6.99Е+06
3.15Е-04
4.51 Е-11
1213.5
В27.1
4.06Е+06
7.42Е-04
1.83Е-10
299.3
В32.5
4.52Е+06
4.68Е-04
1.04Е-10
528.4
В41.2
4.73Е+06
2.45Е-04
5.19Е-11
1055.7
В9.7
3.59Е+06
3.34Е-04
9.31 Е-11
588.2
дВ9.7
9.29Е+05
1.85Е-04
1.99Е-10
275.4
gB9.7-lgG
2.70Е+06
2.36Е-05
8.75Е-12
6251.4
4В7
3.15Е+06
1.72Е-01
5.47Е-08
Пример 6. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили большую эффективность при восстановлении активности FXa
Для того, чтобы определить улучшилась ли эффективность анти-TFPI антител с улучшенной аффинностью при восстановлении активности FXa путем блокирования подавляющего действия белка TFPI, нами был проведен также анализ восстановления FXa. При проведении этого анализа, различное указанное количество отдельных антител с улучшенной аффинностью (30 мкл) инкубировалось с определенным количеством человеческого, мышиного или крысиного рекомбинантного TFPI (20 мкл, 6,6 нМ) в общем объеме реакционной смеси 50 мкл в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации 50 мкл FXa (3,39 нМ) были добавлены к реакционной смеси и инкубированы при температуре 37°C в течение 30 мин. Затем, к реакционной смеси были добавлены 20 мкл субстрата Spectrozyme FXa. После инкубирования в течение 12 мин измерялся коэффициент поглощения каждой лунки при 405 нм с использованием планшет-ридера (Molecular Device). Для каждого опыта была получена линейная стандартная кривая такого же количества FXa (3,9 нМ), ингибируемого известными количествами TFPI. Активность FXa, восстановленная на 100%, определялась как активность FXa, без добавления какого-либо количества TFPI, а активность, восстановленная на 0%, определялась как активность FXa в присутствии белка TFPI (6,6 нМ). Для каждого отдельного анти-TFPI антитела был произведен расчет концентрации с половинной эффективностью подавления (IC50), некоторые результаты расчетов приведены в табл. 9. Для выбранных на второй стадии 2А8 вариантов был произведен расчет концентрации с половинной эффективностью (ЕС50), результаты расчетов приведены в табл. 10.
Пример 7. Антитела с улучшенной аффинностью по результатам анализа dPT, которые проявили большую эффективность при сокращении времени свертывания крови
Для того, чтобы определить улучшилась ли эффективность антител с улучшенной аффинностью при сокращении времени свертывания, был проведен анализ dPT, с помощью которого определялась эффективность воздействия выбранных антител с улучшенной аффинностью при сокращении времени свертывания с использованием человеческой гемофильной А плазмы. Анализ dPT был проведен способом, существенно не отличающимся от способа, описанного в работе Welsch et al. (Thrombosis Res., 1991, 64(2): 213-222). Вкратце, человеческая гемофильная А плазма (George King Biomedical) готовится следующим образом: плазма смешивается с 0,1 объема контрольного буфера (в качестве негативного контроля) или с указанными анти-TFPI антителами. После инкубирования в течение 30 мин при температуре 25°C, каждый из приготовленных образцов плазмы (100 мкл) соединяют с 100 мкл соответствующим образом растворенного Simplastin (Biometieux) (раствор 1:500), в качестве источника тробопластина, а также с 100 мкл 25 мМ хлорида кальция. Время свертывания было определено при помощи фиброметра STA4 (Stago) непосредственно после добавления хлорида кальция.
Пример 8. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили большую эффективность при сокращении времени свертывания человеческой гемофильной А крови с введенным анти-фактор VIII антителом
Для того чтобы определить, улучшилась ли эффективность антител с улучшенной аффинностью при сокращении времени свертывания, нами использовалась система ROTEM для проведения тестирования воздействия этих антител на время свертывания FVIII-нейтрализующей гемофильной А крови человека с введенными антителами, которая имитирует кровь пациентов, больных гемофилией А, с ингибиторами. Система ROTEM (Pentapharm GmbH) включает четырехканальное устройство, компьютер, стандарты плазмы, активаторы, а также чашки и иголки одноразового употребления. Параметры тромбэла-стографии системы ROTEM для гемостаза включают время свертывания (СТ), которое отражает время реакции (время, требующееся для того, чтобы получить амплитуду 2 мм после начала сбора данных), необходимое для инициации коагуляции, время тромбообразования (CFT) и угол альфа для отображения распространения коагуляции, и максимальная амплитуда и максимальный модуль упругости для отображения ригидности сгустка. В анализе с использованием ROTEM, 300 мкл свежевзятой цитратной цельной крови, в которой активность FVIII была нейтрализована путем добавления поликлональных ан
тител к FVIII, использовалось для тестирования эффективности воздействия анти-TFPI антител с улучшенной аффинностью по сравнению с исходными анти-TFPI антителами. Все компоненты растворялись и смешивались в соответствии с инструкциями производителя, сбор данных происходил в течение требующегося для каждой системы периода времени. Вкратце, образцы перемешивались путем забора и помещения 300 мкл крови или плазмы с помощью автоматизированной пипетки в чашки ROTEM 20 мкл CaCl2 (200 ммоль), непосредственно после этого образец перемешивался, и начинался сбор данных. Данные собирались в течение 2 ч с использованием компьютерной системы (версия 2.96) ROTEM.
На фиг. 2 и 3 приведен пример результата анализа, проведенного с использованием ROTEM, для определения эффективности анти-TFPI антител с улучшенной аффинностью для сокращения время свертывания. На фиг. 2 показана эффективность выбранных на первой стадии анализа анти-TFPI антител с развившейся аффинностью для сокращения времени свертывания гемофильной крови человека с индуцированным антителом. Антитела с существенно улучшенной аффинностью, 2А8-9 и 2А8-17, проявляют существенно большую эффективность при сокращении времени свертывания крови гемофильной А крови человека с индуцированным антителом, в то время как 2А8-10, связывающая аффинность к TFPI которых не улучшилась, сохранили такую же эффективность при свертывании крови, как и исходное 2А8 антитело.
Пример 9. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили улучшенный уровень выживаемости в модели рассечения хвостовой вены мышей, больных гемофилией А
Для того, чтобы определить, имеют ли антитела большую эффективность при сворачивании крови мышей, использовалась модель рассечения хвостовой вены мышей, больных гемофилией А. Через хвостовую вену мышам были введены дозы указанных количеств исходного анти-TFPI антитела 2А8 или указанных количеств А200 за 24 ч до нанесения мышам повреждений. По прошествии 24 ч после введения дозы препарата, было проведено рассечение левой хвостовой вены на расстоянии 2,7 мм от кончика (поперечное). По прошествии 24 ч после рассечения была произведена оценка выживаемости. Выяснилось, что уровень выживаемости имеет зависимость от дозировки при введении с рекомбинантным FVIII (10 IU/кг - 30 IU/кг).
Фиг. 2 демонстрирует, что выбранное антитело А200 с улучшенной аффинностью в значительной степени увеличило выживаемость мышей, больных гемофилией А (в соответствии с введенными дозами препарата), по сравнению с IgG1 контрольной мышью (СТХ IgG1) и проявило лучший уровень выживаемости, чем исходное антитело 2А8 (при одинаковых дозах введения).
Пример 10. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили улучшенную коагуляцию при использовании гемофильной С (с недостатком FXI) плазмы человека
Также, с помощью системы ROTEM был проведен анализ, в ходе которого тестировалась эффективность воздействия антител на время свертывания крови, с использованием человеческой плазмы с дефицитом фактора XI (FXI-недостаточной плазмы), которая имитирует плазму пациентов, больных гемофилией С. На фиг. 5 приведен результат анализа, проведенного с использованием ROTEM, для определения эффективности анти-TFPI антител с улучшенной аффинностью для сокращения время свертывания. На фиг. 5 изображена диаграмма, которая демонстрирует, что, в результате применения 2А8 варианта, 2А8-200, коагуляция гемофильной С плазмы человека улучшилась в зависимости от дозировки, и его эффективность является сопоставимой с эффективностью FVIIa, полученного рекомбинантными способами.
Так как настоящее изобретение описано в соответствии с конкретными примерами и вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение оставляет возможность для различных модификаций, изменений, а также замены каких-либо элементов на эквивалентные, без отступления от существа и объема настоящего изобретения. Соответственно, необходимо также понимать, что описание изобретения и примеры служат в качестве иллюстрации, а не ограничительного условия. Кроме того, все статьи, книги, патентные заявки и патенты, на которые ссылается настоящий документ, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Байер ХельсКер ЛЛСи
<120> Изолированные человеческие моноклональные антитела против ингибитора пути тканевого фактора (TFPI) и фармацевтическая композиция, содержащая их
<130> BHC 10 5 001 PCT
<160> 34
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Asp Gly Val Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 3
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 6
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Val Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Asp Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Val Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Asp Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220> <223>
<400>
Вариант
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Asp Gly Val Pro Trp
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 13
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Leu Asp Gly Val Pro Trp
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 14
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Trp Asp Gly Val Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 15
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Leu Asp Gly Val Pro Trp
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 16
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Leu Asp Gly Val Pro Trp
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 17
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220> <223>
<400>
Вариант
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
35 40 45
Tyr Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Leu Ser Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105
<210> 19
<211> 123
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Gln Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
<220>
<223> Вариант
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 21
<211> 123
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
<220>
<223> Вариант
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 24
<211> 123
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 25
<211> 123
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
<220>
<223> Вариант
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 27
<211> 114
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 27
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ile Ser
20 25 30
Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 28
<211> 114
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Arg
20 25 30
Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Thr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<220>
<223> Вариант
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Ser
20 25 30
Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Thr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 30
<211> 114
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Ser
20 25 30
Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 31
<211> 114
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Arg
20 25 30
Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<220>
<223> Вариант
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Arg
20 25 30
Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 33
<211> 114
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Arg
20 25 30
Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 34
<211> 114
<212> PRT
<213> Синтетическая
<220>
<223> Вариант
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Arg
20 25 30
Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит:
a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замену R30S,
или S35D, или обе относительно SEQ ID NO: 1;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замену S55R, или S56G, или обе относительно SEQ ID NO: 1;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и
b) легкую цепь антитела человека, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замену R28P или N29K относительно SEQ ID NO: 2;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из Y48F и N51V и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из S89A, D91W, D92S, G93S и V94T и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2.
2. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит:
a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замены R30S
и S35D относительно SEQ ID NO: 1;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замены S55R и S56G относительно SEQ ID NO: 1;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и
b) легкую цепь антитела человека, содержащую:
i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замены
R28P и N29K относительно SEQ ID NO: 2;
ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей замены Y48F и N51V относительно SEQ ID NO: 2;
iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей замены
S89A, D91W, D92S, G93S и V94T относительно SEQ ID NO: 2.
3. Изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит:
(a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID
NO: 10; и
(b) легкую цепь антитела человека, содержащую аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 17.
4. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 108 М-1.
5. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 109 М-1.
6. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 1010 М-1.
7. Изолированное антитело по п.1 или 2, где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 1011 М-1.
8. Изолированное антитело по одному из пп.1, 2 или 3, где антитело является антителом IgG.
9. Изолированное антитело по п.8, где антитело является антителом IgG2.
10. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения свертывания крови, содержащая тера-
певтически эффективное количество моноклонального антитела по любому из пп.1-9 и фармацевтически
приемлемый носитель.
Номер
Клон
Образец
НС S31V
2А8-3
НС K99L
2А8-9
LC D91W
2А8-17
Дикий тип
2А8
Номер
Клон
Образец
НС K99L
2А8-9
НС K99V
LC D91W
2А8-17
Дикий тип
2А8
Фиг. 2
Образец
Клон
2А8-9
НС K99L
4B7-D58R
НС D62R
4В7
Дикий тип 4В7
Фиг. 3
2А8
¦ 6400 ug/kg 2А8
- 3200 ug/kg 2А8 '0 ug/kg 2А8
- 6400 ug/kg CTXIgGI
A200
- 6400 ug/kg A200
- 1600 ug/kg A200
- 800 ug/kg A200 400 ug/kg A200
- 6400 ug/kg CTXIgGI
80006000" 4000 2000
в Рекомбинант фактора FVIIa • 2A8-200
-10 -8 -6 -4 -2 0 Концентрация (мкг/мл Log 10 [M])
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032189
032189
- 1 -
- 1 -
(19)
032189
032189
- 1 -
- 1 -
(19)
032189
032189
- 1 -
- 1 -
(19)
032189
032189
- 1 -
- 1 -
(19)
032189
032189
- 1 -
- 1 -
(19)
032189
032189
- 4 -
- 3 -
032189
032189
- 13 -
- 13 -
032189
032189
- 14 -
- 14 -
032189
032189
- 22 -
<170> PatentIn version 3.5
- 22 -
<170> PatentIn version 3.5
032189
032189
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
- 23 -
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
- 23 -
032189
032189
- 24 -
- 24 -
032189
032189
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
- 25 -
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
- 25 -
032189
032189
Val Thr Val Ser Ser 115
Ala Arg Val Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
- 27 -
- 26 -
032189
Val Thr Val Ser Ser
115
032189
Val Thr Val Ser Ser
115
¦ 30 ¦
¦ 30 ¦
032189
Val Thr Val Ser Ser
115
032189
Val Thr Val Ser Ser
115
¦ 30 ¦
¦ 30 ¦
032189
Val Thr Val Ser Ser
115
032189
Val Thr Val Ser Ser
115
¦ 30 ¦
¦ 30 ¦
032189
032189
- 31 -
- 31 -
032189
<400> 15
032189
<400> 15
- 32 -
- 32 -
032189
032189
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
032189
032189
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
032189
032189
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
032189
032189
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 20 <211> 123
- 34 -
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 20 <211> 123
- 34 -
032189
<212> PRT
<213> Синтетическая
032189
50 55 60
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala
- 35 -
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 23 <211> 123
- 36 -
032189
50 55 60
032189
50 55 60
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 26 <211> 123
- 38 -
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 26 <211> 123
- 38 -
032189
<212> PRT
<213> Синтетическая
032189
50 55 60
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
- 39 -
- 40 -
<210> 29 <211> 114
032189
50 55 60
032189
50 55 60
- 42 -
<210> 32 <211> 114
- 42 -
<210> 32 <211> 114
032189
<212> PRT
<213> Синтетическая
032189
<212> PRT
<213> Синтетическая
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
- 43 -
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
- 43 -
032189
50 55 60
032189
50 55 60
- 44 -
Arg Thr
- 44 -
Arg Thr
032189
032189
- 45 -
- 45 -
032189
032189
- 46 -
- 46 -
032189
032189
- 47 -
- 47 -
032189
032189
- 47 -
- 47 -
032189
032189
- 47 -
- 47 -