[RU]

1. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.

2. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина, выбранную из группы, включающей в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.

3. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.

4. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.1 в эффективном количестве.

5. Композиция по п.4, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.

6. Композиция по п.4, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.

7. Композиция по п.4, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.

8. Композиция по п.4, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.

9. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.2 в эффективном количестве.

10. Композиция по п.9, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.

11. Композиция по п.9, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.

12. Композиция по п.9, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.

13. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.3 в эффективном количестве.

14. Композиция по п.13, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.

15. Композиция по п.13, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.

16. Композиция по п.13, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.

17. Композиция по п.13, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.

(57) Реферат / Формула:

1. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.

2. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина, выбранную из группы, включающей в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.

3. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.

4. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.1 в эффективном количестве.

5. Композиция по п.4, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.

6. Композиция по п.4, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.

7. Композиция по п.4, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.

8. Композиция по п.4, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.

9. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.2 в эффективном количестве.

10. Композиция по п.9, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.

11. Композиция по п.9, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.

12. Композиция по п.9, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.

13. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.3 в эффективном количестве.

14. Композиция по п.13, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.

15. Композиция по п.13, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.

16. Композиция по п.13, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.

17. Композиция по п.13, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.

---

Евразийское 032164 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201501065
(22) Дата подачи заявки
2014.05.13
(51) Int. Cl. A61K38/42 (2006.01)
(54) СОДЕРЖАЩАЯ МОДИФИЦИРОВАННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ ВЕЩЕСТВО НА ОСНОВЕ ГЕМОГЛОБИНА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ РАКА И ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ
(31) 61/822,463; 14/275,885
(32) 2013.05.13; 2014.05.13
(33) US
(43) 2016.04.29
(86) PCT/US2014/037749
(87) WO 2014/186301 2014.11.20 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ВИЖН ГЛОБАЛ ХОЛДИНГС ЛТД.
(CN)
(72) Изобретатель:
Вон Бин Ло (US), Вай Норман Фунг Мань (CA), Гок Суй Цзи, Вон Мань Цзинь, Мань Корнелиа Вин Инь (CN)
(74) Представитель:
Песиков Э.П. (RU)
(56) US-A1-20090023632 US-A1-20120003221 US-A-5688488
(57) В изобретении описано средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин, а также композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина. Гемоглобин способен нацеливаться на раковые клетки, а лекарственное вещество (т.е. действующее вещество/лекарственное средство) способно эффективно уничтожать раковые клетки. Лекарственное вещество на основе гемоглобина согласно изобретению может применяться для лечения рака различных типов, такого как рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода, рак предстательной железы, рак желудка и рак головного мозга. Композиция может применяться отдельно или в сочетании с другим(ими) лекарственным средством(ами), таким как химиотерапевтическое средство, и обеспечивать синергетический эффект при лечении рака, ингибировании метастазов и/или уменьшении рецидивов. Заявленный в изобретении меченный двумя красителями конъюгат 5FU на основе гемоглобина и/или меченный одним красителем конъюгат 5FU на основе гемоглобина также может применяться для визуализации живых клеток и диагностической визуализации.
Уведомление об авторском праве/разрешение
Часть сведений, содержащихся в настоящем патентном документе, подлежит охране законами об авторском праве. Владелец авторского права не возражает против факсимильного воспроизведения кем-либо настоящего патентного документа или описания в том виде, как оно хранится в досье или материалах ведомства по патентам и товарным знакам, но в остальном резервирует все авторские права. К технологиям, экспериментам и данным, раскрытым далее и на прилагаемых чертежах, относится следующее уведомление: авторское право (c) 2014, Vision Global Holdings Limited, все права зарезервированы.
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Приоритет настоящей заявки испрашивается на основании предварительной патентной заявки 61/822463, поданной 13 мая 2013 г., и обыкновенной патентной заявки US 14/275885, поданной 13 мая 2014 г., содержание которых во всей полноте в порядке ссылки включено в настоящую заявку.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к лекарственному веществу на основе гемоглобина, подвергнутому химической модификации с целью создания вещества, обладающего способностью выбирать мишенью раковые клетки. Настоящее изобретение дополнительно относится к модели химической технологии с целью создания лекарственного вещества на основе гемоглобина. Настоящее изобретение дополнительно относится к лекарственному веществу на основе гемоглобина, содержащему фармацевтические композиции для таргетного лечения рака у людей и животных, в частности рака печени, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и опухолей, индуцированных или связанных с соответствующими клетками-предшественниками. Кроме того, в настоящем изобретении предложен меченный флуоресцентным веществом модифицированный гемоглобин, используемый при визуализации живых клеток и диагностической визуализации.
Предпосылки создания изобретения
Химиотерапия предусматривает применение противораковых лекарств для лечения раковых клеток. Химиотерапия применяется в течение многих лет и является одним из наиболее распространенных методов лечения рака. В большинстве случаев химиотерапия действует путем нарушения способности раковых клеток расти или размножаться. Различные группы лекарств действуют различным образом, борясь с раковыми клетками. Химиотерапия может применяться отдельно в случае рака некоторых типов или в сочетании с другими методами, такими как облучение (или лучевая терапия) или хирургическое вмешательство. Часто для борьбы с раком конкретного типа используется сочетание химиотерапевтических средств. Существует более широко применяемых 50 химиотерапевтических средств.
Хотя химиотерапия может являться достаточно эффективной при лечении рака некоторых типов, химиотерапевтические средства достигают всех частей тела, а не только раковых клеток. По этой причине во время лечения может возникать множество побочных эффектов. Соответственно существует потребность в способе снижения дозировки химиотерапевтических средств с целью ослабления побочных эффектов и поддержании эффективности химиотерапии во время лечения рака. Снижение дозировки может быть благоприятным как для пациентов (уменьшение побочных эффектов), так и для производителей химиотерапевтических средств (снижение стоимости производства).
Распространенные средства лучевой терапии включают комплекс родия-105, комплекс самария-153 и другой родственный комплекс; эти средства также имеют множество побочных эффектов.
Для рака различных типов характерна гипоксия. Гипоксия и анемия (которая способствует гипоксии опухолей) могут приводить к резистентности к ионизирующему излучению и химиотерапии в результате лишения опухолевых клеток кислорода, необходимого для цитотоксического действия этих средств. Гипоксия также может снижать восприимчивость опухоли к лучевой терапии и химиотерапии за счет одного или нескольких опосредованных механизмов, которые включают протеомные и геномные изменения.
Соответственно существует потребность в усовершенствованном лечении рака путем нацеливания на раковые клетки и ткани с одновременным уменьшением воздействия на нераковые клетки и ткани.
Краткое изложение сущности изобретения
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.
В настоящем изобретении предложено средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы
В одном из вариантов изобретения средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака содержит молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина, выбранную из группы, включающей
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.
В соответствии с одним из вариантов изобретения средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака содержит молекулу химически модифицированного сшитого тетра-мерного гемоглобина формулы
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.
В соответствии с еще одним вариантом изобретения композиция для лечения рака содержит средство на основе гемоглобина в эффективном количестве.
В другом варианте изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.
В еще одном варианте изобретения композиция предназначена для внутривенного, внутрибрюшин
ного или подкожного введения.
В соответствии с одним из вариантов изобретения заявлена композиция, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.
В другом варианте изобретения заявлена композиция, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.
В другом варианте изобретения композиция предназначена для лечения рака поджелудочной железы, лейкоза, рака головы и шеи, колоректального рака, рака легкого, рака молочной железы, рака печени, рака носоглотки, рака пищевода или рака головного мозга.
В еще одном варианте изобретения композиция предназначена для лечения рака, которым является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.
В соответствии с одним из вариантов изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.
В еще одном варианте изобретения композиция предназначена для лечения рака поджелудочной железы, лейкоза, рака головы и шеи, колоректального рака, рака легкого, рака молочной железы, рака печени, рака носоглотки, рака пищевода или рака головного мозга.
В другом варианте изобретения композиция предназначена для лечения рака, которым является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.
Хотя распространенные химиотерапевтические средства и средства лучевой терапии широко применяются при лечении различных пациентов, они имеют множество побочных эффектов. Эти недостатки могут быть преодолены путем химической модификации гемоглобина и его связывания с одним или несколькими лекарственными средствами. В отличие от хорошо известных лекарственных средств против рака (например, химиотерапевтических средств, включающих 5-фторурацил, темозоломид, цисплатин), лекарственное вещество на основе гемоглобина согласно настоящему изобретению не только способно выбирать мишенью раковые клетки, но также является значительно более эффективным при лечении опухолей. Кроме того, поскольку таргетные противораковые лекарственные вещества на основе гемоглобина могут применяться в малых дозах, значительно уменьшен их неблагоприятный побочный эффект.
Большинство лекарственных средств очень дороги. В случае уменьшения лечебной дозы может быть значительно снижена стоимость лечения для каждого пациента. Лекарственное вещество на основе гемоглобина является эффективным решением уменьшения лечебной дозы, поскольку модифицированный гемоглобин может выбирать мишенью раковые клетки.
Заявленное лекарственное вещество на основе гемоглобина может быть конъюгировано с флуорес-центным(и) зондом(ами) для обеспечения визуализации живых клеток и диагностической визуализации. В частности, лекарственное вещество на основе гемоглобина, сопряженное с флуоресцеином, который может поглощаться клетками рака печени и рака молочной железы. Поглощение только что конъюгиро-ванных с флуоресцеином лекарственных веществ на основе гемоглобина клетками подтверждается путем их немедленного применения на клетках в серии описанных далее исследований поглощения живыми клетками. Поглощение конъюгированного с флуоресцеином лекарственного вещества на основе гемоглобина клетками рака печени (например, клетками линии HepG2) и клетками рака молочной железы наблюдается через 15 мин после применения и достигает максимума через 1 ч после применения.
Одна или несколько молекул флуоресцеина (например, семь молекул флуоресцеина) могут быть связаны с одной молекулой стабилизированного гемоглобина с целью усиления сигнала визуализации живых клеток и диагностической визуализации. В настоящем изобретении также предусмотрено сравнение лекарственного вещества на основе гемоглобина, конъюгированного с флуоресцентным(и) зон-дом(ами) и без флуоресцентного(ых) зонда(ов), для выбора мишенью раковых клеток с целью лечения рака. В одном из сравнительных исследований согласно настоящему изобретению дозировка лекарственного вещества на основе гемоглобина может быть уменьшена по сравнению с дозировкой одного только лекарственного средства. Это подтверждает, что заявленное лекарственное вещество на основе гемоглобина может значительно ослаблять побочные эффекты лекарственного средства.
Соответственно согласно первой особенности настоящего изобретения предложен гемоглобин, химически модифицированный одной или несколькими функциональными группами, которые могут использоваться для связывания с лекарственным средством для нацеливания на раковые клетки. Согласно второй особенности настоящего изобретения предложено химическое связывание модифицированного гемоглобина или стабилизированного гемоглобина с лекарственным средством (действующим веществом) посредством расщепляемой или нерасщепляемой связи или линкера с целью уничтожения раковых
клеток. Лекарственное средство или действующее вещество, которое может быть связано с молекулой гемоглобина согласно настоящему изобретению, включает без ограничения химиотерапевтическое средство, например 5-фторурацил, темозоломид, цисплатин, или средство лучевой терапии, например комплекс родия-105, комплекс самария-153 и другой родственный комплекс, или любое другое лекарственное средство, обладающее доказанной эффективностью при лечении или облегчении рака и способное посредством линкера легко связываться с молекулой стабилизированного гемоглобина или молекулой химически модифицированного гемоглобина согласно настоящему изобретению. Помимо связывания с лекарственным средством молекула стабилизированного или модифицированного гемоглобина согласно настоящему изобретению также может связываться с клеточной или флуоресцентной меткой, включая без ограничения флуоресцентные белки, небелковые органические флуорофоры, флуоресцентные нано-частицы и люминесцентный краситель на металлической основе.
В настоящем изобретении дополнительно предложены содержащие лекарственное вещество на основе гемоглобина фармацевтические композиции для таргетного лечения рака у людей и животных. Композиция содержит эффективное количество упомянутого лекарственного вещества и фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание для лечения рака. Согласно третьей особенности настоящего изобретения предложен способ применения содержащей лекарственное вещество на основе гемоглобина фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для лечения рака путем введения композиции нуждающемуся в этом объекту, страдающему опухолями и раком различных типов. Композиция может вводиться объекту различными способами, включая без ограничения внутривенное, внутрибрюшинное и подкожное введение. Лекарственное вещество на основе гемоглобина как в расщепляемой, так и нерасщепляемой формах содержит действующее вещество, такое как хи-миотерапевтическое средство (например, 5-фторурацил, 5FU), эффективность которого доказана при испытаниях in vitro и in vivo на моделях рака, включая рак печени (злокачественную гепатому), колорек-тальный рак, немелкоклеточный рак легкого, лейкоз, глиобластому, рак молочной железы (рак молочной железы с тройным негативным фенотипом) и рак поджелудочной железы.
Лекарственное вещество на основе гемоглобина согласно настоящему изобретению также химически модифицировано с целью обеспечения нацеливания на раковые клетки, что делает его более эффективным для уничтожения раковых клеток. Гемоглобин (Hb) может быть химически модифицирован и связан с различными лекарственными средствами (например, 5FU, темозоломидом, цисплатином и т.д.). Гемоглобин различного происхождения является белком, который нацелен на раковые клетки. За счет этой способности нацеливания обеспечивается эффективное уничтожение раковых клеток, стволовых раковых клеток и/или клеток-предшественников рака. По существу, может уменьшаться доза лекарственного вещества.
Лекарственное вещество на основе гемоглобина согласно настоящему изобретению может применяться для лечения рака различных типов, таких как рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода и рак головного мозга. В настоящем изобретении предложено лекарственное вещество на основе гемоглобина, способы лечения рака и способы лечения и/или подавления метастазов раковой ткани и рецидивов раковой ткани, включая без ограничения рак печени (примером которого может служить ксе-нотрансплантат опухоли, индуцированной клетками-предшественниками рака печени), рак молочной железы, в особенности рак молочной железы с тройным негативным фенотипом (примером которого может служить ксенотрансплантат опухоли, индуцированной клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом). Клетки внутри опухоли являются разнородными по своей природе. В целом, предполагается, что они представляют собой (1) по большей части раковые клетки с ограниченной способностью к делению и (2) небольшую популяцию стволовых раковых клеток (CSC), также известных как клетки-предшественники, которые могут образовывать новые опухолевые клетки и обладают высокой способностью к метастазированию по своей природе. В силу присущей CSC резистентности к химическому воздействию и способности к метастазированию было предположено, что они отвечают за рецидивы рака у пациентов. Наилучшей репрезентативной моделью метастазирования и рецидивов опухолей являются модели индуцированных клетками-предшественниками опухолей у мышей, описанные в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения.
Поскольку гемоглобин способен доставлять кислород для уничтожения стволовых раковых клеток, а лекарственное вещество способно уничтожать раковые клетки, лекарственное вещество на основе гемоглобина согласно настоящему изобретению должно обеспечивать синергетический эффект при лечении рака.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана схема создания лекарственного вещества на основе гемоглобина. Лекарственное вещество на основе гемоглобина может быть образовано одним или несколькими лекарственными средства, которые могут быть связаны с модифицированным гемоглобином. Модифицированный гемоглобин или стабилизированный гемоглобин может быть химически связан с лекарственным средством посредством расщепляемой (1А) или нерасщепляемой связи (1В).
На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность гемоглобина другого вида.
На фиг. 3A показан гемоглобин, химически модифицированный (1) ангидридом, (2) кетеном и (3) NHS эфиром.
На фиг. 3B показан гемоглобин, химически модифицированный (1) карбиноламином, (2) карбонатом, (3) аминалом, (4) мочевиной, (5) амидом (с двумя углеродными цепями), (6) амидом (с одной углеродной цепью), (7) дисульфидом с алкильной цепью, (8) дисульфидом с карбиноламином и (9) дисульфидом.
На фиг. 4 показана схема синтеза (А) (нерасщепляемого) конъюгата Hb-5FU-алкила и (В) (расщепляемого) конъюгата Hb-SFU-карбиноламин.
На фиг. 5 показаны результаты жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) (А) стабилизированного гемоглобина, (В) (нерасщепляемого) конъюгата 5FU на основе модифицированного гемоглобина или (нерасщепляемого) конъюгата Hb-SFU-алкил и (С) (расщепляемого конъюгата) 5FU на основе модифицированного гемоглобина или (расщепляемого) конъюгата Hb-5FU-карбиноламин.
На фиг. 6 показано высвобождение 5FU из (А) из модели (расщепляемого) конъюгата 5FU-карбиноламин и модели (нерасщепляемого) конъюгата SFU-алкил и (В) из конъюгата 5FU на основе гемоглобина ((расщепляемого) конъюгата Hb-5FU-карбиноламина) по данным жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР).
На фиг. 7 показана эффективность (размер опухоли) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии Capan-1 моделированного на животном рака поджелудочной железы.
На фиг. 8 показана эффективность (вес опухоли) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии Capan-1 моделированного на животном рака поджелудочной железы.
На фиг. 9 показан прирост веса у животных моделей (мышей) с ксенотрансплантатом клеток линии Capan-1 после лекарственной терапии.
На фиг. 10 показана эффективность (размер опухоли) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии SMMC-7221 моделированного на животном рака печени.
На фиг. 11 показана эффективность (вес опухоли) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии SMMC-7221 моделированного на животном рака печени.
На фиг. 12 показана эффективность (размер опухоли) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток-предшественников/стволовых клеток CD133+ линии HepG2 моделированного на животном рака печени.
На фиг. 13 показана эффективность (размер опухоли) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток-предшественников/стволовых клеток CD44+CD24^mnm MCF7 моделированного на животном рака молочной железы.
На фиг. 14 показана эффективность in vitro (цитотоксичность) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии НСТ116 рака толстой кишки.
На фиг. 15 показана эффективность in vitro (цитотоксичность) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии НСТ460 немелкоклеточного рака легкого.
На фиг. 16 показана эффективность in vitro (цитотоксичность) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии HL60 острого лейкоза.
На фиг. 17 показана эффективность in vitro (цитотоксичность) 5FU на основе гемоглобина в отношении клеток линии А172 рака головного мозга.
На фиг. 18 показана эффективность in vitro (цитотоксичность) 5FU на основе гемоглобина в отношении рака молочной железы.
На фиг. 19 показана эффективность in vitro (цитотоксичность) 5FU на основе гемоглобина в отношении рака молочной железы.
На фиг. 20 показана структура темозоломида (TMZ) и модифицированного гемоглобина, связанного с TMZ.
На фиг. 21 показаны результаты ЖХ-МС TMZ на основе гемоглобина.
На фиг. 22 показано, что одна или несколько молекул флуоресцеина могут быть связаны с одной молекулой гемоглобина.
На фиг. 23 показано, что (А) меченный флуоресцентным веществом модифицированный гемоглобин, (В) (нерасщепляемый) конъюгат Hb-5FU-алкила-FL, меченный одним флуоресцентным красителем, (С) конъюгат Hb-5Fu-Dan-TAM, меченный двумя флуоресцентными красителями, могут успешно проникать в клетки рака печени. Стрелками указано, где обнаружен сигнал флуоресценции (метка одним или двумя флуоресцентными веществами) в клетках под микроскопом с использованием различных фильтров микроскопа.
На фиг. 24 показано преобразование каждого звена модифицированного флуоресцеин-6-карбоксисукцинимидиловым эфиром (F-6-NHS) гемоглобина при различных рН (рН 8,0, 8,3, 8,5, 8,8 и 9).
На фиг. 25 показано преобразование каждого звена модифицированного F-6-NHS гемоглобина при различных соотношениях F-6-NHS (3, 5, 7 и 9 экв.) и 1 экв. гемоглобина при рН 8,5.
На фиг. 26 показано преобразование каждого звена модифицированного F-6-NHS гемоглобина при соотношении F-6-NHS и модифицированного гемоглобина 7:1 в различных буферах (ацетатном, карбонатном и фосфатном) при рН 8,5.
На фиг. 27 показано преобразование модифицированного кетеном гемоглобина при различных условиях.
На фиг. 28 показано преобразование модифицированного ангидридом гемоглобина при различных условиях.
На фиг. 29 показана (А) схема и (В) определение характеристик конъюгата 5FU и модифицированного гемоглобина с расщепляемым дисульфидным линкером ((расщепляемого) конъюгата 5FU-алкил-дисульфид-NHS эфира) методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ИЭР-МС).
На фиг. 30 показана (А) схема и (В) определение характеристик меченного флуоресцином конъюга-та 5FU и модифицированного гемоглобина с алкильным нерасщепляемым линкером ((нерасщепляемого) конъюгата Hb-5FU-алкильного FL) методом ИЭР-МС.
На фиг. 31 показана (А) схема и (В) определение характеристик меченного флуоресцином конъюга-та 5FU и модифицированного гемоглобина с карбиноламиновым расщепляемым линкером ((расщепляемого) конъюгата Hb-5FU-карбиноламинового FL) методом ИЭР-МС.
На фиг. 32 показана (А) схема и (В) определение характеристик конъюгата 5FU и модифицированного гемоглобина с метками двумя флуоресцентными красителями (Hb-5FU-Dan-TAM).
Определения.
Термином "стволовая раковая клетка" обозначается различимая биологическими методами клетка в клоне опухолевых клеток, которая способна инициировать и поддерживать рост опухоли in vivo (т.е. инициирующая рак клетка).
Термином "расщепляемый конъюгат" обозначается конъюгат по меньшей мере с одним расщепляемым линкером, способный легко высвобождать связанное лекарственное средство/действующее вещество посредством реакции гидролиза или окислительно-восстановительной реакции.
Термином "нерасщепляемый конъюгат" обозначается конъюгат по меньшей мере с одним нерасще-пляемым линкером, не способный легко высвобождать связанное лекарственное средство/действующее вещество посредством реакции гидролиза или окислительно-восстановительной реакции.
Подробное описание изобретения
Как указано в разделе "Предпосылки создания изобретения", большинство раковых тканей, таких как раковые опухоли, характеризуются гипоксией. Для ослабления гипоксии может использоваться гемоглобин. Гемоглобин играет важную роль в газообмене между сосудистой системой и тканью у большинства позвоночных. Он отвечает за перенос кислорода и дыхательной системы в клетки организма посредством кровообращения, а также за выведение являющейся конечным продуктом обмена веществ двуокиси углерода из клеток в дыхательную систему, через которую выделяется двуокись углерода. Естественный гемоглобин является тетрамером, который является в целом стабильным в эритроцитах. Тем не менее, когда естественный гемоглобин извлекают из эритроцитов, он становится нестабильным в плазме и расщепляется на два сс-Р димера. Каждый из этих димеров имеет молекулярную массу приблизительно 32 кДа. Эти димеры могут вызывать существенное повреждение почек при фильтрации почками и экскреции. Разрыв тетрамерных связей также отрицательно сказывается на устойчивости функционального гемоглобин в системе кровообращения.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гемоглобин стабилизирован кросс-линкером с целью формирования стабилизированного тетрамера. Стабилизированный гемоглобин обладает способностью переносить кислород и может выбирать мишенью раковые клетки или ткани в организме человека или животного. Носитель кислорода на основе гемоглобина химически модифицирован и связан с химиотерапевтическим средством, инициирующим опосредованный рецепторами механизм, вызывающий локализацию комбинированного химиотерапевтического средства в цитоплазме раковых клеток с целью повышения эффективности как носителя кислорода на основе гемоглобина, так и химио-терапевтического средства.
На фиг. 1 А и 1 Б показана схема создания лекарственного вещества на основе гемоглобина. Одно или несколько "действующих веществ" или "лекарственное средство" (термины, используемые взаимозаменяемо) связано с модифицированным или стабилизированным гемоглобином и образует заявленное лекарственное вещество на основе гемоглобина. Выбор одного или нескольких конкретных действующих веществ может делаться в зависимости от типа раковой ткани-мишени и желаемого молекулярного размера полученного химически модифицированного продукта. Кроме того, при использовании нескольких действующих веществ выбранные действующие вещества могут являться одинаковыми или различаться. Иными словами, действующее вещество и т.д. может использоваться, если полученная молекула сохраняет эффективность и также способна связываться со стабилизированным гемоглобином для нацеливания на раковые клетки. Модифицированный гемоглобин или стабилизированный гемоглобин может быть химически связан с лекарственным средством/действующим веществом посредством расщепляемой (фиг. 1 А) или нерасщепляемый связи (фиг. 1 Б). В настоящем изобретении могут быть получены различные структуры для химической модификации гемоглобина, а стабилизированный гемоглобин может быть связан с лекарственным средством/ действующим веществом.
Некоторые лекарственные средства (например, химиотерапевтическое средство 5FU) не могут применяться в больших дозах из-за высокой токсичности. В настоящем изобретении химиотерапевтическое
средство 5FU химически связано со стабилизированным гемоглобином (~65 кДа). Источником гемоглобина может являться без ограничения цельная кровь крупного рогатого скота, человека, собак, свиней, лошадей и рекомбинантный гемоглобин и/или субъединицы. На фиг. 2 показан ориентация аминокислотных последовательностей гемоглобина крупного рогатого скота, человека, собак, свиней и лошадей соответственно, обозначенных В, Н, С, Р и Е (SEQ ID NOS. 1-5 цепи альфа-гемоглобина крупного рогатого скота, человека, собак, свиней и лошадей соответственно; SEQ ID NOS. 6-10 цепи бета-гемоглобина крупного рогатого скота, человека, собак, свиней и лошадей соответственно). Отличающиеся аминокислоты из различных источников заштрихованы. На фиг. 2 показано, что из сравнения аминокислотных последовательностей гемоглобина человека и гемоглобина крупного рогатого скота, собак, свиней и лошадей следует, что они обладают большим сходством.
Гемоглобин может быть химически модифицирован различными функциональными группами до связывания с лекарственным средством. Гемоглобин может быть модифицирован (1) ангидридом, (2) кетеном, (3) NHS эфиром, (4) изотиоцианатами, (5) изоцианатами, (6) активированными сложными эфи-рами (например, сложными фторфениловыми эфирами и карбонилазидами), (7) сульфонилхлоридами, (8) карбонилами с последующим восстановительным аминированием, (9) эпоксидами, (10) карбонатами, (11) фторбензолами, (12) сложными имидоэфирами, (13) производными гидроксиметилфосфина, (14) малеимидами, (15) алкилгалидами или галоацетамидами, (16) дисульфидами, (17) тиосульфатами, (18) содержащими азиридин реагентами, (19) производными акрилоила, (20) арилирующими средствами, (21) производными винилсульфона, (22) путем естественного химического лигирования (например, сложными тиоэфирами), (23) путем окисления перйодатом N-концевого серина или треонина с целью получения альдегидов для связывания с гидроксиламинами, гидразинами или гидразидами, (24) карбодиимидами, (25) 4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенолом, (26) карбонилдиимидазолом, (27) сульфо-NHS, (28) диазоалка-нами и соединениями диазоцетила, (29) путем реакции конденсации Манниха, (30) производными диазо-ния, (31) производными диазирина, (32) бензофенонами и антрахинонами, (33) путем N-концевой модификации посредством пиридоксаль-5-фосфатного биомиметрического трансаминирования, (34) путем введения биоортогональных функций (например, алкинов и азидов) с последующими биоортогональными реакциями конъюгации (например, реакцией Хьюсгена 1,3-диполярного присоединения алкинов и азидов, реакцией Штаудингера лигирования азидов и триарилфосфинов, реакцией Дильса-Альдера с участием алкенов и тетразинов, фотохимической реакцией с участием алкенов и тетразолов), (35) карбенои-дами металлов, (36) активированными палладием аллиловыми реагентами, (37) фотоаффинными метками. На фиг. 3А показан гемоглобин, химически модифицированный (1) ангидридом, (2) кетеном и (3) NHS эфиром. На фиг. 3Б показан гемоглобин, химически модифицированный (1) карбиноламином, (2) карбонатом, (3) аминалом, (4) мочевиной, (5) амидом (с двумя углеродными цепями), (6) амидом (с одной углеродной цепью), (7) дисульфидом с алкильной цепью, (8) дисульфидом с карбиноламином и (9) дисульфидом. С другой стороны, стабилизированный гемоглобин может быть непосредственно связан с лекарственным средством и/или флуоресцентным веществом посредством расщепляемых или нерасщеп-ляемых линкеров.
На фиг. 4А показан модифицированный гемоглобин, связанный с 5FU (Hb-FU) с использованием нерасщепляемого линкера (нерасщепляемый конъюгат), а на фиг. 4Б показан модифицированный гемоглобин, связанный с 5FU (Hb-FU) с использованием расщепляемого линкера (расщепляемый конъюгат). Методом ЖХ-МС было успешно продемонстрировано, что модифицированный гемоглобин связан с 5FU. Масса 5FU и Hb-FU составляют 130 Да и ~65 кДа соответственно. Расщепляемый линкер (например, карбиноламинные, дисульфидные, карбамидные, аминальные, карбонатные, сложноэфирные, кар-баматные, фосфатные, амидные, ацетальные, иминные, оксимовые, эфирные и сульфонамидные группы), который способен расщепляться в физиологических условиях, может вводиться между гемоглобином и лекарственным средством. Нерасщепляемый линкер, который содержит алкильные и арильные группы и не может быть легко расщеплен путем гидролиза и/или окислительно-восстановительной реакции, также может вводиться между гемоглобином и лекарственным средством. На фиг. 5 показаны результаты ЖХ-МС для (А) стабилизированного гемоглобина и (В) 5FU на основе модифицированного гемоглобина (не-расщепляемого конъюгата) и (С) 5FU на основе модифицированного гемоглобина (расщепляемого конъюгата). Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит заявленное лекарственное вещество на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и достижения терапевтического эффекта при лечении рака.
На фиг. 6А и 6Б соответственно показано высвобождение 5FU из (А) модели (расщепляемого) конъюгата 5FU-карбиноламин и модели (нерасщепляемого) конъюгата 5FU^raui и (В) из 5FU на основе гемоглобина с расщепляемым линкером (конъюгата Hb-5FU-карбиноламин). Осуществили высвобождение 5FU из модели (расщепляемого) конъюгата 5FU-карбиноламин и модели (нерасщепляемого) конъюгата 5ГО-алкил (фиг. 6А) в 50 мМ забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) и 50% плазме крови человека. Поместили 100 мкл образца (10 мкмоль/мл DMSO) в 1,5-мл пробирку производства компании Eppendorf, содержащую 900 мкл 50 мМ забуференного фосфатом физиологического раствора (рН 7,4) или 50% плазмы крови человека, и держали при комнатной температуре (25°С) или при температуре 37°С. В различные моменты времени взяли 100-мкл аликвотную пробу с целью анализа ме
тодом ЖХВР. Взяли аликвотные пробы из раствора образца в 50% плазме крови человека, затем разбавили равным объемом THF и встряхивали в течение 1 мин. После центрифугирования со скоростью 3200 об/мин в течение 2 мин с помощью пипетки взяли аликвотную пробу надосадочной жидкости и подвергли анализу методом ЖХВР. Осуществили высвобождение 5FU из 5FU на основе гемоглобина с расщепляемым линкером ((расщепляемого) конъюгата Hb-5FU-карбиноламин) (фиг. 6Б) в буфере DB (рН 7,4) и 50% плазме крови человека, подвергли анализу методом ЖХВР.
Распад модели (расщепляемого) конъюгата 5FU-карбиноламин происходил при следующих условиях со скоростью в убывающем порядке: 50% плазма крови человека при 37°C > PBS (рН 7,4) при 37°C > PBS (рН 7,4) при комнатной температуре (25°C). Модель (нерасщепляемого) конъюгата 5FU-алкил являлась стабильной при любых из этих условий.
Распад 5FU на основе гемоглобина с расщепляемым линкером ((расщепляемого) конъюгата Hb-5FU-карбиноламин) происходил при следующих условиях со скоростью в убывающем порядке: 50% плазма крови человека при 37°C > буфер DB (рН 7,4) при 37°C.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит лекарственное вещество на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и достижения терапевтического эффекта при лечении рака. Проведенные авторами исследования на животных выявили уменьшение роста опухолей у мышей с ксенотрансплантатом рака поджелудочной железы ксенотрансплантат (Capan-1), получавших 5FU на основе гемоглобина, на 20-22 об.% опухоли (на фиг. 7) и на 130 вес.% опухоли (фиг. 8). Не наблюдалась значительная потеря веса через 28 дней лечения (фиг. 9), что предполагает отсутствие цитототоксичности у 5FU на основе гемоглобина. У мышей с ксенотрансплантатом рака печени (SMMC7221), получавших 5FU на основе гемоглобина, можно наблюдать аналогичные тенденции уменьшения роста опухолей на 38 об.% опухоли (фиг. 10) и на 33 вес.% опухоли (фиг. 11). Проведенные авторами исследования на животных выявили значительное уменьшение роста опухолей у мышей с привитыми стволовыми клетками CD133+ рака печени или стволовыми клетками CD44+/CD24- рака молочной железы, получавших 5FU на основе гемоглобина. Обнаружено уменьшение роста опухолей на 188% в случае ксенотрансплантатов стволовых клеток CD133+ рака печени (LCSC) (фиг. 12) и на 200% в случае ксенотрансплантатов стволовых клеток CD44+CD24- рака молочной железы (BCSC) (фиг. 13) соответственно.
Обнаруженная способность 5FU на основе гемоглобина нацеливаться на другие раковые клетки продемонстрирована на различных моделях in vitro. Путем анализа методом МТТ определили цитоток-сичность 5FU на основе гемоглобина в отношении различных раковых клеток, которая составляет 20% гибели клеток линии НСТ116 колоректальной карциномы (фиг. 14), 60% % гибели клеток линии Н460 немелкоклеточного рака легкого (фиг. 15), 28% гибели клеток линии Jurkat лейкоза (фиг. 16), 57% гибели клеток линии А172 глиобластома головного мозга (фиг. 17), 35% гибели клеток линии MCF7 рака молочной железы (фиг. 18) и 20% гибели клеток линии Huh7 рака печени (фиг. 19).
На фиг. 20 показана структура темозоломида (TMZ) и модифицированного гемоглобина, связанного с TMZ. Методом ЖХ-МС было успешно продемонстрировано, что модифицированный гемоглобин связан с TMZ. На фиг. 21 показаны результаты ЖХ-МС для TMZ на основе гемоглобина.
На фиг. 22 показано, что одна молекула флуоресцеина (например, флуоресцеин-6-карбоксисукцинимидилового эфира, F-6-NHS) может связываться с молекулой гемоглобина. Как показано на фиг. 23А, меченный флуоресцентным веществом гемоглобин также может проникать в раковые клетки (например, клетки рака печени). Предполагается, что лекарственное вещество на основе модифицированного гемоглобина также способно эффективно уничтожать раковые клетки. С целью ясного документального подтверждения того, как различные формы 5FU на основе модифицированного гемоглобина могут проникать в раковые клетки, в настоящем изобретении применена визуализация живых клеток (фиг. 23А, 23Б). Воздействовали на клетки линии HepG2 рака печени и стволовые клетки CD133+ рака печени 0,0125 г/дл 5FU на основе модифицированного гемоглобина в течение 15 мин, после чего выделили живые клетки. 5FU на основе модифицированного гемоглобина проникал в цитоплазму раковых клеток через 15 мин после воздействия. Через 1 ч после воздействия также наблюдались пики поглощения.
Оптимизировали различные параметры модификации гемоглобина посредством F-6-NHS, включая рН, молярное отношение и буфер. На фиг. 24 показано преобразование каждого звена модифицированного F-6-NHS гемоглобина при различных рН (рН 8,0, 8,3, 8,5, 8,8 и 9). Предпочтительным условием химической модификации стабилизированного гемоглобина является рН 8,5. На фиг. 25 показано преобразование каждого звена модифицированного F-6-NHS гемоглобина при различных соотношениях F-6-NHS (3, 5, 7 и 9 экв.) и 1 экв. гемоглобина при рН 8,5. Предпочтительное соотношение F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина составляет 7:1. На фиг. 26 показано преобразование каждого звена модифицированного F-6-NHS гемоглобина при соотношении F-6-NHS и гемоглобина 7:1 в различных буферах (ацетатном, карбонатном и фосфатном) при рН 8,5. Не наблюдалось значительных различий в преобразовании в зависимости от буфера.
Оптимизировали различные параметры модификации гемоглобина кетеном, включая рН, температуру и молярное отношение. На фиг. 27 показано преобразование модифицированного кетеном гемогло
бина при различных условиях. Предпочтительными условиями являются рН 9, температура 37°C и соотношение 30:1.
Также оптимизировали различные параметры модификации гемоглобина ангидридом, включая рН и молярное отношение. На фиг. 28 показано преобразование модифицированного ангидридом гемоглобина при различных условиях. Предпочтительными условиями являются рН 9 и соотношение 30:1.
На фиг. 29А показана структура модифицированного гемоглобина, связанного с конъюгатом 5FU, содержащим дисульфид в качестве расщепляемого линкера ((расщепляемым) конъюгатом Hb-5FU-дисульфид). Методом ЖХ-МС было успешно продемонстрировано, что модифицированный гемоглобин связан с 5FU посредством расщепляемого дисульфидного линкера. На фиг. 29Б показаны результаты
ЖХ-МС.
С целью визуализации живых клеток или диагностической визуализации пометили конъюгаты 5FU на основе гемоглобина флуоресцентным красителем, например флуоресцеином-6. На фиг. 30 показана (А) схема и (В) определение характеристик меченного флуоресцином конъюгата 5FU и модифицированного гемоглобина с алкильным нерасщепляемым линкером ((нерасщепляемого) конъюгата Hb-5FU-алкильный FL) методом ИЭР-МС. На фиг. 31 показана (А) схема и (В) определение характеристик меченного флуоресцином конъюгата 5FU и модифицированного гемоглобина с карбиноламиновым расщепляемым линкером ((расщепляемого) конъюгата Hb-5FU-карбиноламинового FL) методом ИЭР-МС.
В целях визуализации также пометили конъюгаты 5FU на основе гемоглобина двумя флуоресцентными красителями (показанными на фиг. 32 А). Конъюгировали 2 молекулы 5FU-дансила и 2 молекулы TAMRA с одной молекулой модифицированного гемоглобина. Добавили раствор модифицированного гемоглобина (1 мл, 10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5) с 55 мкл TAMRA NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO и 55 мкл 5FU-дансил NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO. В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel P-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС (фиг. 32Б). Меченный двумя красителями конъюгат 5FU и модифицированного гемоглобина (Hb-5FU-Dan-TAM) также может поглощаться аналогично 5FU на основе гемоглобина, при этом в цитоплазме раковых клеток (фиг. 23В) обнаружен как 5FU-дансил (возбуждение на волне 488 нм), так и ТАМ на основе гемоглобина (возбуждение на волне 555 нм).
На рынке не предлагаются лекарственные вещества на основе гемоглобина. Содержащая лекарственное вещество на основе модифицированного гемоглобина фармацевтическая композиция, полученная в настоящем изобретении, способна нацеливаться на раковые клетки с достижением терапевтического эффекта. В случае применения для лечения рака содержащая лекарственное вещество на основе модифицированного гемоглобина фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению служит противораковым средством для уничтожения раковых клеток. Лекарственное вещество на основе модифицированного гемоглобина является удачным кандидатом для применения в малых дозах и может сочетаться с другими нацеленными на молекулы или цитотоксическими средствами.
Примеры
Следующие далее примеры приведены в качестве описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не имеют целью ограничить каким-либо образом объем настоящего изобретения.
Пример 1a. Синтез кетена.
По каплям добавили метансульфонилхлорид (MsCl) (4,1 ммоль в дихлорметане (DCM)) при 0°C в энергично перемешиваемый раствор 5-гексин-1-ола (4 ммоль) и триэтиламина (4,5 ммоль) в DCM (100 мл). Затем нагрели смесь до комнатной температуры с целью перемешивания в течение ночи. Влили (водный) бикарбонат натрия в реакционную смесь, и отделили органическую фазу. Экстрагировали водный слой с помощью DCM, промыли объединенные органические экстракты водой и соляным раствором, высушили на сульфате (MgSO4) и испарили растворитель. Очистили неочищенный мезилат путем хроматографии в испарительной колонне (20% этилацетат в н-гексане) и получили бесцветное масло.
Добавили йодид калия (2,5 ммоль) в реакционную смесь раствора мезилата (2 ммоль) в ацетоне (60 мл), нагрели и дефлегмировали в течение 20 ч. Отфильтровали осадок после охлаждения до комнатной температуры. Промыли осадок на фильтре ацетоном (20 мл) и испарили растворитель. Разбавили оставшееся масло простым эфиром (100 мл) и промыли (насыщенным, 10 мл) раствором тиосульфата натрия. Экстрагировали водный раствор простым эфиром, промыли объединенные органические экстракты соляным раствором, высушили на безводном сульфате магния и испарили растворитель. Подвергли остаток фракционной дистилляции в вакууме и получили соединение йодида: 5-гексин-1-йодид.
По каплям добавили бис-(триметилсилил)амид лития (1M в гексане, 20 мл) в раствор сложного метилового эфира фенилуксусной кислоты (2,73 г, 18,2 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (40 мл) при -78°C. Через 1 ч нагрели реакционную смесь до 0°C, и по каплям добавили в раствор 5-гексин-1-йодида (4,16 г, 20 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (5 мл). После перемешивания при 0°C в течение 1,5 ч быстро охладили реакционную смесь водой, промыли насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали простым диэтиловым эфиром. Объединили органические слои высушили на безводном сульфате магния и получили 4,17 г функционализированного алкинами сложного эфира.
Очистили раствор функционализированного алкинами сложного эфира (4,17 г, 18,1 ммоль) в мета
ноле (100 мл) и воде (2 мл) гранулами гидроокиси калия (1,5 г, 27 ммоль), нагрели и дефлегмировали в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь в вакууме. Добавили воду в реакционную смесь и затем промыли ее простым диэтиловым эфиром. Собрали водный слой, подкислили соляной кислотой и затем экстрагировали простым эфиром. Объединили органические слои, высушили на безводном сульфате магния, концентрировали в вакууме и получили функционализированную алкинами карбоновую кислоту в виде бесцветного масла.
Добавили оксалилхлорид (2 M в дихлорметане, 5 мл) в раствор функционализированной алкинами карбоновой кислоты (1,08 г, 5 ммоль) в сухом дихлорметане (5 мл) при комнатной температуре и перемешивали реакционную смесь в течение 2 ч. Дистиллировали растворитель в среде азота и получили светло-желтое масло. Растворили светло-желтое масло в сухом тетрагидрофуране (10 мл) и по каплям добавили в раствор сухой триэтиламин (6 мл, 20 ммоль) при 0°C. Перемешивали полученную смесь при 0°C в течение 2 ч. Профильтровали образовавшуюся соль в среде азота, дистиллировали фильтрат при 110°C (1 мм рт. ст.) и получили кетен в виде ярко-желтого масла.
Пример 1b. Модификация пептида и гемоглобина с использованием кетена.
Смешали в 1,0-мл пробирке производства компании Eppendorf раствор пептида YTSSSKNVVR в воде (1 мМ, 10 мкл), кетен (10 экв., 1 мкл 100 мМ исходного раствора кетена в сухом тетрагидрофуране) и фосфатный буфер (рН 6,3 и 7,4, 80 мкл). Выдержали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Определили преобразование пептида на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. Определили N-концевую избирательность методом МС/МС (тандемной масс-спектрометрии).
Смешали в 1,0-мл пробирке производства компании Eppendorf раствор стабилизированного гемоглобина в буфере (1,56 мМ, 40 мкл), кетен (10, 20, 30, 40 и 50 экв., 100 мМ исходного раствора кетена в сухом тетрагидрофуране) и фосфатный буфер (рН 6,3, 7,4 и 9, 160 мкл). Выдержали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи (один комплект при рН 9 и температуре 37°C). Определили преобразование белка на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. На фиг. 27 показано преобразование модифицированного кетеном гемоглобина при различных условиях (рН, температура, молярное отношение). Предпочтительными условиями являются рН 9, температура 37°C и соотношение 30:1.
Пример 2а. Синтез ангидрида.
В течение ночи перемешивали раствор функционализированной алкинами карбоновой кислоты (100 мг, 0.46 ммоль), (3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидид гидрохлорида (EDC) (180,5 мг, 0,94 ммоль) и триэтиламина (0.5 ммоль) в дихлорметане (20 мл) при комнатной температуре. Промыли реакционную смесь водой. Высушили органический слой на безводном сульфате магния, концентрировали в вакууме, очистили остаток путем колоночной флэш-хроматографии (элюирования 4% этилацетатом в н-гексане) и получили ангидрид.
Пример 2b. Модификация пептида и гемоглобина с использованием ангидрида.
Смешали в 1,0-мл пробирке производства компании Eppendorf раствор пептида YTSSSKNVVR в воде (1 мМ, 10 мкл), ангидрид (10 экв., 1 мкл 100 мМ исходного раствора ангидрида в сухом тетрагидро-фуране) и фосфатный буфер (рН 6,3 и 7,4, 80 мкл).
Выдержали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Определили преобразование пептида на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. Определили N-концевую избирательность методом МС/МС (тандемной масс-спектрометрии).
Смешали в 1,0-мл пробирке производства компании Eppendorf раствор стабилизированного гемоглобина в буфере (1,56 мМ, 40 мкл), ангидрид (10, 20, 30, 40 и 50 экв., 100 мМ исходного раствора ангидрида в сухом тетрагидрофуране) и фосфатный буфер (рН 6,3, 7,4 и 9, 160 мкл). Выдержали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи (один комплект при рН 9 и температуре 37°C). Определили преобразование белка на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. На фиг. 28 показано преобразование модифицированного ангидридом гемоглобина при различных условиях (рН, температура, молярное отношение). Предпочтительными условиями являются рН 9 и соотношение 30:1.
Пример 3a. Синтез NHS эфира.
В течение ночи перемешивали раствор функционализированной алкинами карбоновой кислоты (100 мг, 0,46 ммоль), N-гидроксисукцинимида (NHS) (64,4 мг, 0,56 ммоль), (3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидид гидрохлорида (EDC) (180,5 мг, 0,94 ммоль) и 4-ди(метиламино)пиридина (DMAP) (0,5 мг, каталитическое количество) в дихлорметане (20 мл) при комнатной температуре. Промыли реакционную смесь водой. Высушили органический слой на безводном сульфате магния, концентрировали в вакууме, очистили остаток путем колоночной флэш-хроматографии (элюирования 50% этилацетатом в н-гексане) и получили NHS эфир.
Пример 3b. Модификация пептида и стабилизированного гемоглобина с использованием NHS эфира.
Добавили 6,8 мкл (10 нмоль) раствора стабилизированного гемоглобина (100 мг/мл, 1,56 мМ) или 10 мкл исходного раствора YTSSSKNVVR (1 мМ) в 1,5-мл пробирку производства компании Eppendorf
со смешанным раствором 180 мкл PBS (рН 7,4, 10 мМ) и 5 мкл диметилсульфоксида (DMSO) (до конечной концентрации стабилизированного гемоглобина/YTSSSKNVVR 0,05 мМ). Добавили раствор (2 мМ) NHS эфира (0,8 мг) в сухом тетрагидрофуране (1 мл) порциями по 0,5 мкл (0,1 экв. на порцию, 10, 20 и 40 порций) и 1,0 мкл (0,2 экв. на порцию, 5, 10 и 20 порций) в течение 2 мин каждую порцию с немедленным последующим встряхиванием. Завершили добавление в течение 90 мин и выдержали реакционный раствор при комнатной температуре еще в течение 2,5 ч. Затем добавили в реакционный раствор 10 мкл раствор (20 мМ) этаноламина в PBS (рН 7,4, 10 мМ) и в течение 3 ч охлаждали остающийся свободный NHS эфир при комнатной температуре.
Пример 4а. Модификация стабилизированного гемоглобина флуоресцеин-6-NHS эфиром.
Модифицировали раствор (9,9 г/дл) стабилизированного гемоглобина флуоресцеин-6-карбоксисукцинимидиловым эфиром (F-6-NHS). Оптимизировали условия реакции (рН, соотношение, время, буфер) и определили характеристики реакционной смеси методом жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ИЭР-ЖХ/МС). Довели рН раствора стабилизированного гемоглобина до различных величин (рН 8,0, 8,3, 8,5, 8,8 и 9,0 соответственно) с помощью уксусной кислоты (0,2 М) и гидроокиси натрия (0,1 М) в среде азота. По каплям добавили в раствор стабилизированного гемоглобина различные количества (3, 5, 7 и 9 экв. соответственно) F-6-NHS в DMSO и перемешивали в течение различного времени реакции (2, 3, 4 и 5 ч соответственно) в среде азота в темноте. Удалили избыток F-6-NHS в колонке Bio Spin Tris 30 (10 к) (или центрифужном фильтре Ultra Amicon, 4 мл: 3 к), поместили раствор модифицированного гемоглобина в RA буфер (рН 7,5) и определили характеристики методом ИЭР-ЖХ/МС.
Пример 4b. Преобразование модифицированного F-6-NHS гемоглобина при различных рН.
Оптимизировали преобразование каждого звена модифицированного флуоресцеин-6-NHS (F-6-NHS) гемоглобина при различных рН (рН 8,0, 8,3, 8,5, 8,8 и 9). Определили преобразование на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. Осуществили модификацию при соотношении F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина 3:1 в 1 мл RA буфера в течение 4 ч в темноте. Результаты показаны на фиг. 24. Предпочтительная величина рН составляла 8,5. На фиг. 24 а означает сс-цепь, a1 означает сс-цепь, модифицированную монофлуоресцеином, а2 означает сс-цепь, модифицированную дифлуоресцеином, a3 означает сс-цепь, модифицированную трифлуоресцеином, 2а означает с -с -цепь, 2а1 означает с -с -цепь, модифицированную монофлуоресцеином, 2а2 означает с -с -цепь, модифицированную дифлуоресцеином, 2a3 означает с -с -цепь, модифицированную трифлуорес-цеином, 2Р означает Р-Р-цепь, 2Р1 означает Р-Р-цепь, модифицированную монофлуоресцеином, 2Р2 означает Р-Р-цепь, модифицированную дифлуоресцеином, 2Р3 означает Р-Р-цепь, модифицированную трифлуоресцеином, 2Р4 означает Р-Р-цепь, модифицированную тетрафлуоресцеином, 2Р' означает Р'-Р'-цепь, 2Р'1 означает Р'-Р'-цепь, модифицированную монофлуоресцеином, 2Р'2 означает Р'-Р'-цепь, модифицированную дифлуоресцеином, 2Р'3 означает Р'-Р'-цепь, модифицированную трифлуоресцеином, 2Р'4 означает Р'-Р'-цепь, модифицированную тетрафлуоресцеином.
Пример 4с. Преобразование модифицированного F-6-NHS гемоглобина при различных соотношениях F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина.
Осуществили преобразование каждого звена модифицированного флуоресцеин-6-NHS (F-6-NHS) гемоглобина при различных соотношениях F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина (3, 5, 7 и 9 экв.) в 1 мл RA буфера при рН 8,5 в течение 4 ч в темноте. Концентрация стабилизированного гемоглобина составляла 9,9 г/дл. Определили преобразование на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. Результаты показаны на фиг. 25. Предпочтительное соотношение F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина составляло 7:1.
Пример 4d. Преобразование модифицированного F-6-NHS гемоглобина при различном времени реакции.
Осуществили преобразование каждого звена модифицированного флуоресцеин-6-NHS (F-6-NHS) гемоглобина при соотношении F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина 7:1 в 1 мл RA буфера при рН 8,5 при различном времени реакции (2, 3, 4 и 5 ч) в темноте. Концентрация стабилизированного гемоглобина составляла 9,9 г/дл. Определили преобразование на основании подсчета общего числа ионов при анализе реакционных смесей методом ЖХ-МС. Предпочтительное время реакции составляло 4 ч.
Пример 4е. Преобразование модифицированного F-6-NHS гемоглобина в различных буферах.
Осуществили преобразование каждого звена модифицированного флуоресцеин-6-NHS (F-6-NHS) гемоглобина при соотношении F-6-NHS и стабилизированного гемоглобина 7:1 в различных буферах (ацетатном, карбонатном и фосфатном буферах) при рН 8,5 в течение 4 ч в темноте. Концентрация стабилизированного гемоглобина составляла 9,9 г/дл. Определили преобразование на основании массовой эффективности, т. е. отношения массы модифицированного звена к суммарной массе соответствующего исходного звена. Результаты показаны на фиг. 26. Не наблюдалось значительных различий в преобразовании при использовании буферов различных типов.
Пример 5а. Синтез (расщепляемого) конъюгата 5FU-карбиноламина и NHS эфира.
В течение 18 ч перемешивали раствор 5FU-карбиноламин-янтарной кислоты (375 мг, 1,86 ммоль), N-гидроксисукцинимид (299 мг, 2,60 ммоль), №(3-диметилшино1гоопил)-№-этилкарбодиимидид гидрохлорида (EDC, 499 мг, 2,60 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (DMAP, 30 мг, каталитическое количество) в дихлорметане (20 мл) и диметилформамиде (DMF) (1 мл) при комнатной температуре в среде азота. Профильтровали осадок и получили (расщепляемый) конъюгат 5FU-карбиноламина и NHS эфира.
Пример 5b. Модификация гемоглобина (расщепляемым) конъюгатом 5FU-карбиноламина и NHS эфира.
Добавили в 1 мл раствора модифицированного гемоглобина (10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5) 110 мкл (расщепляемого) конъюгата 5FU-карбиноламина и NHS эфира (100 мМ, 7 экв.) в DMSO. В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel P-30, определили характеристики методом использованием геля Bio-Gel Р-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС. Расчетный показатель преобразования составил 95%. С одной молекулой модифицированного гемоглобина было конъюгировано около 6 молекул расщепляемого 5-
FU.
Пример 6а. Синтез нерасщепляемого 5FU-NHS эфира.
По каплям добавили триэтиламин (1,08 мл, 7,69 ммоль) в раствор 5FU (1,00 г, 7.69 ммоль) в DMF (6 мл). После перемешивания в течение 10 мин по каплям добавили метилакрилат (1,38 мл, 15,4 ммоль). Выдержали реакционную смесь с перемешиванием при комнатной температуре в течение 20 ч. Концентрировали неочищенную смесь в вакууме, очистили методом флэш-хроматографии на силикагеле (элюи-рования 5% МеОН/ DCM) и получили сложный метиловый эфир в качестве продукта. Растворили раствор сложного метилового эфира (650 мг, 3,00 ммоль) в 5% HCl (35 мл). Нагревали реакционную смесь в условиях дефлегмации в течение 3 ч. После охлаждения реакционной смеси добавили H2O (20 мл) и экстрагировали органические слои этилацетатом (6x20 мл). Затем высушили объединенные органические слои (на MgSO4), профильтровали и концентрировали в вакууме. Очистили остаток методом флэш-хроматографии (элюирования 10% MeOH/DCM).
В течение 18 ч перемешивали раствор полученного продукта (375 мг, 1,86 ммоль), N-гидроксисукцинимида (299 мг, 2,60 ммоль), ^(3-диметилшино1гоопил)-№-этилкарбодиимидид гидрохлорида (EDC, 499 мг, 2,60 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (DMAP, 30 мг, каталитическое количество) в DCM (20 мл) и DMF (1 мл) при комнатной температуре в среде азота. Профильтровали осадок и получили (нерасщепляемый) конъюгат 5FU-алкила и NHS эфира.
Пример 6b. Модификация гемоглобина нерасщепляемым 5FU-NHS эфиром.
Добавили в 1 мл раствора модифицированного гемоглобина (10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5) 110 мкл нерасщепляемого конъюгата 5FU-NHS (100 мМ, 7 экв.) в DMSO (диметилсульфоксиде). В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel Р-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС. Расчетный показатель преобразования составил 95%. С одной молекулой модифицированного гемоглобина было конъюгировано около 6 молекул нерасщепляемого 5-FU.
Пример 7а. Синтез расщепляемого конъюгата 5FU-дисульфида и N-гидроксисукцинимидного эфира.
По каплям добавили триэтиламин (0,25 мл, 0,75 ммоль) в раствор N-гидроксисукцинимидного эфира 5FU-пропионовой кислоты (179 мг, 0,6 ммоль) и 4-[[2-[(2-аминоэтил)дитио]этил]амино]-4-оксо-бутановой кислоты (126 мг, 0,5 ммоль) в DMF (5 мл). Выдержали реакционную смесь при комнатной температуре (25°C) с перемешиванием в течение 4 ч. Концентрировали неочищенную смесь в вакууме, очистили методом флэш-хроматографии (элюирования 5% CH3OH/CH2Cl2) и в качестве продукта получили (расщепляемый) конъюгат 5FU-дисульфида и янтарной кислоты.
В течение 12 ч перемешивали раствор конъюгата 5FU-дисульфида и янтарной кислоты (109 мг, 0,25 ммоль), N-гидроксисукцинимида (58 мг, 0,5 ммоль), №(3-диметиламино1гоопил)-№-этижарбодиимидид гидрохлорида (EDC, 96 мг, 0,5 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (DMAP, 1 мг, каталитическое количество) в DMF (5 мл) при комнатной температуре (25°C) в среде азота. Концентрировали неочищенную реакционную смесь в вакууме. Очистили остаток методом флэш-хроматографии (элюирования 5% CH3OH/CH2Cl2) и в качестве продукта получили (расщепляемый) конъюгат 5FU-дисульфида и NHS эфира в виде белого твердого вещества.
Пример 7b. Модификация гемоглобина (расщепляемым) конъюгатом 5FU-дисульфида и NHS.
Добавили 110 мкл (расщепляемого) конъюгата 5FU-дисульфида и NHS эфира (100 мМ, 7 экв.) в DMSO в 1 мл раствора модифицированного гемоглобина (10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5). В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel Р-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС. С одной молекулой модифицированного гемоглобина было конъюгировано около 4 молекул 5FU-дисульфида.
Пример 8. Синтез темозоломид-дисульфид^-гидроксисущинимидного эфира.
По каплям добавили триэтиламин (0,3 мл, 0,55 ммоль) в перемешанный раствор N-гидроксисукцинимидного эфира темозоломидовой кислоты (146 мг, 0,5 ммоль) и 4-[[2-[(2
аминоэтил)дитио]этил]амино]-4-оксо-бутановой кислоты (126 мг, 0,5 ммоль) в сухом DMF (5 мл) в ледяной водяной бане. Нагрели смесь до комнатной температуры (25°C) и затем перемешивали в течение 4 ч. Концентрировали неочищенную реакционную смесь в вакууме. Очистили остаток методом флэш-хроматографии (элюирования 40% CH3OH/CH2Cl2) и получили в качестве продукта темозоломид-дисульфид-янтарную кислоту в виде белого твердого вещества.
В течение 12 ч перемешивали раствор темозоломид-дисульфид-янтарной кислоты (78,5 мг, 0,18 ммоль), N-гидроксисукцинимида (31 мг, 0,27 ммоль) и №(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимидид гидрохлорида (EDC, 52 мг, 0,27 ммоль) в DMF (1 мл) при комнатной температуре (25°C) в среде азота. Концентрировали неочищенную реакционную смесь в вакууме. Очистили остаток методом флэш-хроматографии (элюирования 5% CH3OH/CH2Cl2) и получили в качестве продукта темо-золомид дисульфид N-гидроксисукцинимидный эфир в виде белого твердого вещества.
Пример 9. Модификация гемоглобина флуоресцеином-6-NHS и расщепляемым конъюгатом 5FU и
NHS эфира.
Добавили 55 мкл флуоресцеина-6-NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO и 55 мкл расщепляемого конъюгата 5FU-NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO в 1 мл раствора модифицированного гемоглобина (10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5). В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel P-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС. С одной молекулой модифицированного гемоглобина было конъюгировано около 2,5 молекулы расщепляемого 5FU и 2,5 молекулы флуоресцеина.
Пример 10. Модификация гемоглобина флуоресцеином 6-NHS и нерасщепляемым конъюгатом 5FU и NHS эфира (меченным одним флуоресцентным красителем).
Добавили 55 мкл флуоресцеина-6-NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO и 55 мкл нерасщепляемого конъюгата 5FU-NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO в 1 мл раствора модифицированного гемоглобина (10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5). В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel P-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС. С одной молекулой модифицированного гемоглобина было конъюгировано около 2,5 молекулы нерасщепляемого 5FU и 2,5 молекулы флуоресцеина.
Пример 11. Синтез различных соединений меченного двумя флуоресцентными красителями конъю-гата гемоглобина-5FU для визуализации живых клеток.
Предшественники синтеза меченного двумя флуоресцентными красителями конъюгата гемоглоби-ra-5FU для визуализации живых клеток включают комплекс меди и лизина, 5FU^romi, 5FU-дансил-лизин, 5FU-дансил-лизин-NHS эфир, 5FU-дансил-лизин-этаноламин, 5FU-дансил-лизин-янтарную кислоту, 5FU-дансил-лизин-NHS эфир.
Пример 11а. Формирование комплекса меди и лизина.
Одной порцией добавили сульфат меди(П) (пентагидрат, 2,15 г, 8,60 ммоль) в раствор L-лизина (3,14 г, 17,2 ммоль) в растворе гидрокарбоната натрия (1 М, 40 мл). В течение 3 ч перемешивали темно-синюю суспензию, а затем добавили метанол (15 мл). В течение 24 ч перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре. Профильтровали полученную синюю суспензию, высушили в вакууме и получили комплекс меди и лизина (синий порошок).
Пример 11b. Получение SFU-лизина.
Растворили комплекс меди и лизина (72,4 мг, 0,21 ммоль) и бикарбонат натрия (34,4 мг, 0,41 ммоль) в H2O (5 мл). После 1 ч перемешивания при комнатной температуре добавили (нерасщепляемый) конъю-гат 5FU-алкила и NHS эфира (123 мг, 0,41 ммоль) в мутную синюю суспензию. Продолжили перемешивание при комнатной температуре в течение 16 ч и наблюдали за это время, как цвет изменился на прозрачный светло-синий (без осадка). Затем добавили сульфид натрия (16,4 мг, 0,21 ммоль), после чего реакционная смесь приобрела серо-коричневый цвет. Довели рН неочищенной смеси до 4 с использованием разбавленной соляной кислоты. Затем профильтровали осадок, концентрировали оставшийся фильтрат в вакууме и промыли холодным метанолом (20 мл). Получили неочищенный прозрачный остаток, который без очистки использовали на следующей стадии.
Пример 11с. Получение 5FU-дансил-лизина.
По каплям добавили триэтиламин (2 мл) в раствор 5FU-лизина (271 мг, 0,82 ммоль) диметилформа-миде (6 мл) при 0°C. После перемешивания в течение 15 мин добавили 5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонилхлорид (270 мг, 1,00 ммоль) и наблюдали, как после этого цвет изменился с прозрачного на зеленовато-коричневый. После перемешивания в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч концентрировали реакционную смесь в вакууме, затем очистили методом флэш-хроматографии (элюи-рования 20% метанолом/дихлорметаном) и получили 5FU-дансил-лизин в виде желтого твердого вещества.
Пример 11d. Получение 5FU-дансил-лизин-NHS эфира.
Добавили TV-гидроксисукцинимид (50,4 мг, 0,26 ммоль), №(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимидид гидрохлорид (30,0 мг, 0,26 ммоль) и 4-(диметиламин)пиридин (4 мг, катализатор) в раствор 5FU-дансил-лизина (98,0 мг, 0,17 ммоль) в диметилформамиде (3 мл). Перемешивали реакционную смесь в темноте при комнатной температуре в течение 18 ч. После этого концентрировали реакци
онную смесь в вакууме, затем очистили методом флэш-хроматографии (элюирования 20% метано-лом/дихлорметаном), и получили 5FU-дансил-лизин-NHS эфир в виде желтого твердого вещества. Пример 11e. Получение 5FU-дансил-лизин-этаноламина.
По каплям добавили этаноламин (500 мкл) в раствор 5FU-дансил-лизин-NHS эфира (103 мг, 0,16 ммоль) в диметилформамиде (1,5 мл) при комнатной температуре. В течение 12 ч перемешивали реакционную смесь в темноте. После этого концентрировали реакционную смесь в вакууме, затем очистили методом флэш-хроматографии (элюирования 20% метанолом/дихлорметаном) и получили 5FU-дансил-лизин-этаноламин в виде желтого твердого вещества.
Пример 11f. Получение 5FU-дансил-лизин-янтарной кислоты.
Добавили триэтиламин (0,50 мл) и янтарный ангидрид (40,0 мг, 0,42 ммоль) в раствор 5FU-дансил-лизин-этаноламина (28,0 мг, 0,05 ммоль) в тетрагидрофуране (2 мл). Нагрели реакционную смесь и де-флегмировали в течение 3 ч. После охлаждения концентрировали реакционную смесь в вакууме, очистили методом флэш-хроматографии (элюирования 20% метанолом/дихлорметаном), и получили 5FU-дансил-лизин-янтарную кислоту в виде желтого твердого вещества.
Пример 11g. Получение 5FU-дансил-лизин-NHS эфира.
Добавили N-гидроксисукцинимид (18,0 мг, 0,07 ммоль), №(3-диметиламино1гоопил)-№-этилкарбодиимидид гидрохлорид (22,0 мг, 0,07 ммоль) и 4-(диметиламин)пиридин (2 мг, катализатор) в раствор 5FU дансил-лизин-янтарной кислоты (26,0 мг, 0,04 ммоль) в диметилформамиде (1 мл). Перемешивали реакционную смесь в темноте при комнатной температуре в течение 20 ч. Удалили растворитель в вакууме, очистили неочищенный остаток методом флэш-хроматографии (элюирования 20% метано-лом/дихлорметаном) и получили 5FU-дансил-лизин-NHS эфир в виде желтой пленки.
Пример 12. Модификация гемоглобина TAMRA-NHS и 5FU-дансил-NHS эфиром с целью визуализации живых клеток.
Добавили 55 мкл TAMRA NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO и 55 мкл 5FU-дансил-NHS (100 мМ, 3,5 экв.) в DMSO в 1 мл раствора модифицированного гемоглобина (10 г/дл, 1,56 мМ, буфер DB, рН 8,5). В течение 4 ч перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре, затем очистили с использованием геля Bio-Gel P-30 и определили характеристики методом ИЭР-МС. С одной молекулой модифицированного гемоглобина было конъюгировано около 2 молекул 5FU-дансила и 2 молекулы
TAMRA.
Пример 13. Культура и реагенты для раковых клеток различных линий.
Культивировали раковые клетки в DMEM (Invitrogen) с 10% фетальной телячьей сывороткой (FBS), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C. С целью создания условий нормального снабжения кислородом инкубировали клетки в среде O2, содержащей 5% CO2; с целью создания условий гипоксии инкубировали клетки в среде, содержащей 0,1-0,5% O2 (с использованием автоматического газосмесителя Quorum FC-7 для CO2/O2/N2) и 5% CO2. Использовали сравнимые условия для культивирования линий как адгезивных, так и неадгезивных раковых клеток, включая клетки линий HepG2, Huh7 и SMMC7221 рака печени, клетки линий 4Т1, MCF7 и MDA-MB231 рака молочной железы, клетки линий А172 и U87MG глиобластомы головного мозга, клетки линий НСТ116 и НТ29 колоректальной карциномы, клетки линий Н60 и Jurkat лейкоза, клетки линий А549 и Н460 немелкоклеточного рака легкого, клетки линий JF305 и Capan-1 рака поджелудочной железы.
Пример 14. Выделение, культивирование и реагенты для стволовых раковых клеток/клеток-предшественников.
Отобрали или выделили предполагаемые стволовые клетки/клетки-предшественники рака печени и рака молочной железы (CD133+ LCSC и CD44+/CD24- BCSC) из клеток рака печени человека методом проточного цитометрического анализа. Эти отобранные клетки обладали потенциалом самообновления и дифференциации для образования опухолей у мышей линии NOD/SCID при введении лишь в небольшом количестве и образования сфероидов ш vitro, а также природной высокой резистентностью к химическому воздействию. Осуществили сортировку активированную флуоресценцией сортировку клеток (FACS) линии HepG2 рака печени с использованием конъюгированного с РЕ моноклонального антитела мышей против CD133 человека (BD Biosciences) и линии MCF7 рака молочной железы с использованием конъю-гированного с РЕ моноклонального антитела мышей против CD24 человека и конъюгированного с АРС моноклонального антитела мышей против CD44 человека (BD Biosciences). Использовали изотипы IgG1k-PE, IgG2B-PE и IgG2Akappa-APC (Coulter Ltd.) в качестве контроля. Осуществили анализ и сортировку образцов в сортере FACS Aria II (BD Biosciences). Отобрали 25% наиболее ярко окрашенных и 25% наименее ярко окрашенных клеток в качестве позитивных и негативных популяций. Затем проверили стволовость отсортированных клеток методом вестерн-блоттинга и окрашивания CD133, Oct 4 и Sox2 маркерами плюрипотентности.
Затем перенесли отсортированные LCSC в условия неадгезивного культивирования в базальной среде человека Mammocult (Stem Cell Technology Ltd.), дополненной непосредственно перед использованием усилителем пролиферации Mammocult (Stem Cell Technology Ltd.), 0,48 мкг/мл свежерастворенного гидрокортизона и 4 мкг/мл гепарина. В среду не добавляли антибиотики. Профильтровали полученную свежую среду с использованием 0,2 мкм связующих фильтров с низким содержанием белка (Millipore
Ltd). Выращивали сфероиды LCSC в суспензии, пока их диаметр не достиг около 70 мкм. Сфероиды LCSC, диаметр которых превышал 70 мкм, подвергли пересеву путем центрифугирования со скоростью 1000 об/мин в течение 3 мин с последующей физической диссоциацией с помощью трипсина-EDTA в течение 1 мин, и затем повторно суспендировали в новой среде.
Пример 15. Микроскопия живых клеток с длительными паузами на раковых клетках.
Высеяли раковые клетки (например, клетки линии HepG2 рака печени) на лунки микроплашета со стеклянным дном (MatTek Corporation). Отобрали живые клетки при заданных увеличениях (63х, 20х) с использованием широкопольного микроскопа Zeiss Observer Z1, оснащенного камерой с регулируемой средой/температурой и механизированным предметным столиком для многопозиционного отбора. Осуществили инкубацию в замкнутой системе визуализации живых клеток, продутой 0,1% O2 и 5% CO2 (предварительно смешанными). Подвергли клетки воздействию (1) (нерасщепляемого) конъюгата Hb-5FU^KM-FL, меченного одним флуоресцентным красителем, и (2) конъюгата Hb-5Fu-Dan-TAM, меченного двумя флуоресцентными красителями, в течение 15 мин до визуализации каждые 3 мин в течение 2 ч. Обработали изображения посредством обращения свертки и сжали с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Device), чтобы получить изображения в близком к покадровому режиме с длительными паузами. Изображения показаны на фиг. 23А-23В.
Пример 16. Анализ цитотоксичности линий раковых клеток.
Определили жизнеспособность клеток методом анализа пролиферации с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). Так, высеяли клетки линии HepG2 или Huh7 рака печени на 96-луночный микропланшет с плоским дном (по 6000 клеток на лунку) и в течение 24 ч культивировали в 100 мкл питательной среды при 37°C в среде, содержащей 5% CO2. Затем заменили питательную среду в каждой лунке на 100 мкл питательной среды, которая не содержала лекарств или содержала только 5FU или 5FU на основе модифицированного гемоглобина (Hb-FU) с другими химиоте-рапевтическими средствами в их концентрациях IC50. После 24-часовой инкубации 5FU или Hb-FU добавили в каждую лунку 20 мкл МТТ в качестве реагента для мечения (5 мг/мл в растворе PBS) в течение следующих 4 ч при 37°C. Осторожно извлекли питательную среду и затем добавили в каждую лунку 200 мкл DMSO в качестве солюбилизатора, чтобы полностью растворить кристаллы формазана. Определили спектральную поглощательную способность на волне длиной 570 с помощью прибора Multiskan EX (производства компании Thermo Electron Corporation), при этом каждая точка на графике отображает средние величины ± стандартное отклонение для трех лунок.
Пример 17. Формирование различных моделей ксенотрансплантата опухоли у иммунодефицитных бестимусных мышей и мышей линии NOD/SCID и схема приема.
Привили раковые клетки человека мышам линии BALB/бестимусным мышам с целью формирования двух моделей подкожной опухоли. До лечения произвольным образом распределили мышей по девяти различным группам (по 4-8 мышей в группе). Животные получали (1) RA-буфер, (2) только стабилизированный гемоглобин (4 дозы, по 1 дозе в неделю) в количестве 0,4 г/кг (для человека 1 г/кг) (внутривенно), (3) 5FU (4 дозы, по 1 дозе в неделю) в количестве 80 мг/кг (внутривенно), (4) 5FU и стабилизированный гемоглобин (стабилизированный гемоглобин за 1 ч до 5FU), (5) множество доз стабилизированного гемоглобина (стабилизированный гемоглобин каждый первый день и четвертый день в течение 4 недель), (6) нерасщепляемый конъюгат стабилизированного гемоглобина и 5FU (4 дозы, по 1 дозе в неделю) в количестве 0,4 г/кг (внутривенно) и (7) расщепляемый конъюгат стабилизированного гемоглобина и 5FU (4 дозы, по 1 дозе в неделю) в количестве 0,4 г/кг (внутривенно).
Определили онкогенность раковых клеток путем подкожного введения 1-5x106 раковых клеток в боковую область 5-недельным мышам линии BALB/бестимусным мышам. Подкожно ввели 1x105 успешно выделенных клеток-предшественников мышам линии NOD/SCID с целью формирования ксе-нотрансплантата. В каждую группу входило от четырех до восьми животных. После обнаружения опухолей размером около 0,3-0,5 см3 измеряли размер опухолей каждые три дня с помощью штангенциркулей и вычисляли объем опухолей (в см3) согласно формуле (LxWxW)/2. Взвесили мышей перед умерщвлением, немедленно после этого взвесили извлеченные опухоли и получили их изображения.
SEQUENCE LISTING
<110> Vision Global Holdings Ltd. WONG, Bing Lou
<120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING MODIFIED HEMOGLOBIN-BASED
THERAPEUTIC AGENT FOR CANCER TARGETING TREATMENT AND DIAGNOSTIC IMAGING
<130> P7009PC00 <160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 141
<212> PRT
<213> Bovine
<400> 1
Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Gly Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Gly Gly His Ala Ala Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met
20 25 30
Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu
35 40 45
Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Ala Lys Val Ala Ala
50 55 60
Ala Leu Thr Lys Ala Val Glu His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
85 90 95
Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Ser Leu Leu Val Thr Leu Ala Ser His
100 105 110
Leu Pro Ser Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Leu Ala Asn Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
20 25 30
Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp
35 40 45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala
50 55 60
Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala
65 70 75 80
Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro
85 90 95
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala
100 105 110
His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
115 120 125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 3
<211> 141
<212> PRT
<213> Canine
<400> 3
Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Ile Lys Ser Thr Trp Asp Lys
1 5 10 15
Ile Gly Gly His Ala Gly Asp Tyr Gly Gly Glu Ala Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Phe Gln Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu
35 40 45
Ser Pro Gly Ser Ala Gln Val Lys Ala His Gly Lys Lys Val Ala Asp
50 55 60
Ala Leu Thr Thr Ala Val Ala His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
65 70 75 80
Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala Tyr Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
85 90 95
Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Cys His
100 105 110
His Pro Thr Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Phe Ala Ala Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> Porcine
<400> 4
Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Ala Asp Val Lys Ala Ala Tyr Gly Lys
1 5 10 15
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Ala Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met
20 25 30
Phe Leu Gly Phe Thr Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu
35 40 45
Ser His Gly Ser Asp Glu Val Lys Ala His Gly Glu Lys Val Ala Asp
50 55 60
Ala Leu Thr Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Met Pro Gly Ala Leu
65 70 75 80
Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
85 90 95
Asp Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Ser Thr Leu Ala Val His
100 105 110
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Asp Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Leu Ala Asp Val Ser Thr Val Leu Asp Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 5 <211> 142
<212> PRT
<213> Equine
<400> 5
Met Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Ser
1 5 10 15
Lys Val Gly Gly His Ala Gly Glu Phe Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
20 25 30
Met Phe Leu Gly Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp
35 40 45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Ala His Gly Lys Lys Val Gly
50 55 60
Asp Ala Leu Thr Leu Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala
65 70 75 80
Leu Ser Asn Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro
85 90 95
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Ser Thr Leu Ala Val
100 105 110
His Leu Pro Asn Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
115 120 125
Phe Leu Ser Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 6
<211> 145
<212> PRT
<213> Bovine
<400> 6
Met Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Val
20 25 30
Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser
35 40 45
Thr Ala Asp Ala Val Met Asn Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly Lys
50 55 60
Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Met Lys His Leu Asp Asp Leu
65 70 75 80
Lys Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu His
85 90 95
Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Val Val
100 105 110
Leu Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp
115 120 125
Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Arg Tyr
130 135 140
His 145
<210> 7
<211> 147
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp
1 5 10 15
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
85 90 95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105 110
Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln
115 120 125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135 140
Lys Tyr His
145
<210> 8
<211> 141
<212> PRT
<213> Canine
<400> 8
Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Ile Lys Ser Thr Trp Asp Lys
1 5 10 15
Ile Gly Gly His Ala Gly Asp Tyr Gly Gly Glu Ala Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Phe Gln Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu
35 40 45
Ser Pro Gly Ser Ala Gln Val Lys Ala His Gly Lys Lys Val Ala Asp
50 55 60
Ala Leu Thr Thr Ala Val Ala His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
65 70 75 80
Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala Tyr Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
85 90 95
Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Cys His
100 105 110
His Pro Thr Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Phe Ala Ala Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 9
<211> 147
<212> PRT
<213> Porcine
<400> 9
Met Val His Leu Ser Ala Glu Glu Lys Glu Ala Val Leu Gly Leu Trp
1 5 10 15
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Asn Ala Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu Gln Ser Phe Ser Asp Gly Leu Lys His Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Lys Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Gln
85 90 95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Ile Val
100 105 110
Val Val Leu Ala Arg Arg Leu Gly His Asp Phe Asn Pro Asn Val Gln
115 120 125
Ala Ala Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135 140
Met Val Gln Leu Ser Gly Glu Glu Lys Ala Ala Val Leu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Asp Lys Val Asn Glu Glu Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Asn Pro Gly Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu His Ser Phe Gly Glu Gly Val His His Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
85 90 95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105 110
Val Val Leu Ala Arg His Phe Gly Lys Asp Phe Thr Pro Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Ser Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135 140
Lys Tyr His
145
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы
II ,
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.
2. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина, выбранную из группы, включающей
2.
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.
3. Средство на основе гемоглобина для нацеливания на раковые клетки и лечения рака, содержащее молекулу химически модифицированного сшитого тетрамерного гемоглобина формулы
oJN-N А N
X ,
в которой X означает стабилизированный тетрамерный гемоглобин.
4. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.1 в эффективном количестве.
5. Композиция по п.4, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.
6. Композиция по п.4, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.
7. Композиция по п.4, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.
8. Композиция по п.4, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.
9. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.2 в эффективном количестве.
10. Композиция по п.9, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного
введения.
а-гемоглобина
ir^SF?j:rTirTJ^KSF-T^EbSEi3JiSAI,S^!FL3FErTFT"FrHF &LЈH3EAC"r;HS -T^SFA2FTKIF.3WDFI3:-PJ13DrG5FJiI,DRrFC5FEr'rFn;i-F':HFri;EG5bCVFJlHG -'LEAMri^'TJAiGF-iAIffiSHlAGAEi^EI^SFTTTrTYFPJFDLChS-DS-'FJi.-ii M"L?AAICTNYr.AA*L К'ЗЗНАЗЕF3AEALSKSFL3FEITFTf FE -IFDISr 5:iJTJd3
АК,"А*АЬТГА-.~ h-IiDI E ~kLZ EL В EL -iAFvLF "DFV.rFr.Ll - 4 3LLYTLM HFSLFTF
rF-'AEALTriAVAF'T^Fi^cAL^ELHAriFiF-"^
FF^AEALTTAVAh^iDDLE 3ALCAL3DLHAjf7JjFT^FT^FFJJj5HCLL,7FLACbHFXEFrF E Г YADALTFJ.7 :-rZ,ZZ'.t 3AL _ Al 11 -i~r "" F '.'Г P? IL Г J'? LL J TLA' > L F11 FT F FF -1EAL7LAY G> -LDDIЕ ЗА!31 .Т. 311-iA.-''iFY3F YA FF1L ? LLJ1ЧА"-f-LFNIFTF
--IILTAl.EFjib- Ж r I F--DE' SLrEiO,: Ei-/ ' 1E*TC3 F FES ГЗЕ L -T ADA' IRMLTEEEFr- TALrt'-r 71 -"'~> E' StrEAL 3E^-iP Ti-FFEZFGELJTEI^'TSISN"
-"IJEAEETMFDT^E I _-C--tA'_-E'\ 3'jjEA1DFTF J^FETT?- FEHFEI. _ЕЪГ
1ГГЯЬ SAEEFEA'T 3LyGF."N-YDE"jCEAL ЗР~1ГЛ*± EFT 1E.FFZ2 FGEL??IA2.A"~M3N' MV ;L43?EГАЛ"Y-AL711Г II -SEE ' Г jZAL l-P-l-/'' /Е'ГГ FFECF3EL:"JE
г F._TJw-' 3 Г K""LD-5 Г THGMT HL E DLF .'I FAAL 3 ELH С E TZ.WZ FF.: ТТ1Л. Л Г • rLA?-4
rK'.TJ^lSFK т -AFJDGLAFLEHbF nZFATLZE HIEEI.H' Г EEHF4bLr-.KYL\ "_ TLAdH чС',Тл11л Г'.АЭА1ГТЛ. \riLEDLE _-^L 'AL = L " -IP'-KLF .ТЕ .7 Г"Ы Jd TIYTLA JH
ггт-Акзгк-Lа;ГЗ2> ЛГЛ1ЕК1ТЗГЕАГ^;Е-НСО;ЬН7Г-РЕ*ЗГЙШ.СН"1(tm)
ЕГГ-^АНЗГК'- K°F3 , ,-'"r LEKLF ЗТ ГААЬ 3 EL К " E Г.1Н7'F Е;Г=Х1. 31ГЛ/' LA-.H
ГЗ ZJTF- LG'-DFQ^ -A3' IAALAd= :r
Г3-ЕГТРЕ"'_А^'- i y'AKALA.".- r
h3TEJTF-l 'HA3LEKFFAA"? TYLT
Т'зт-17*тEELCJ зv:r.-А_-"А> :А1А. •:-
Фиг. 2
11. Композиция по п.9, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.
12. Композиция по п.9, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.
13. Композиция для лечения рака, содержащая средство на основе гемоглобина по п.3 в эффективном количестве.
14. Композиция по п.13, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, соль, буфер, воду или их сочетание.
15. Композиция по п.13, предназначенная для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.
16. Композиция по п.13, в которой раком является рак поджелудочной железы, лейкоз, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак легкого, рак молочной железы, рак печени, рак носоглотки, рак пищевода или рак головного мозга.
17. Композиция по п.13, в которой раком является опухоль, представляющая собой злокачественную гепатому, опухоль, индуцированную клетками-предшественниками рака печени, глиобластому или опухоль, индуцированную клетками-предшественниками с тройным негативным фенотипом.
11.
Нерасщепляемая схема
(А) |
"|Е_.
Фиг. 4
Рост ксенотрансплантата раковой опухоли поджелудочной железы Сарап-1, моделированной на бестимусных мышах
Расщепляемый YQ23-3FU Нерасщепляемый YQ23-5FU
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина, Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат Hb-5FU-anKJiiia.
Фиг. 7
Средний вес ксенотрансплантата раковой опухоли поджелудочной железы Сарап-1
2J5-I 2J0-? 1J5-
1J0-
Контроль 5FU
Расщепляемый Нерасщепляемый
шшшшшшшшшшш
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат Hb-5FU-anKmia
Фиг. 8
Изменение веса мышей с ксенотрансплантатом рака поджелудочной железы Capan-1 nocj фармакотерап ия
TZJZT
f * f # ? ?
Расще: Нерасщег
конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина; конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат Hb-5FU-anKima
Фиг. 9
Рост ксенотрансплантата раковой опухоли печени SMMC7221, моделированной на бестимусных мышах
а Контроль . Расщепляемый конъюгат -•- Нерасщепляемый конъюгат
S 40
6 9 12 15 1В 21 24 27 30 33
Число дней после первого введения
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5РТ1-алкила
Фиг. 10
Средний вес ксенотрансплантата раковой опухоли печени SMMC7721
Контроль 5FU Hb + 5FU
Мультидозы Hb + 5FU
Расщепляемый конъюгат
шШШШШШШШ
конъюгат
тшшшшт
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЪ-5Ри-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-алкила
Фиг. 11
к CDI33+ раковой опухоли печени (HepG2), моделированной на
3. Расщепляемый конъюгат
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5РЦ-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-алкила.
Фиг. 12
Рост стволовых клеток CD44+CD24- раковой опухоли моделированной на животных
железы (MCF7),
1 Контроль 2. 5FU
3 Нерасщепляемый конъюгат 4. Расщепляемый конъюгат
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-алкила.
Фиг. 13
Анализ МТТ клеток линии НСТ116 рака толстой кишки
*, р < 0,05 по сравнению с контролем
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбинолами1 Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-алкила
Фиг. 14
Анализ МТТ клеток линии Н460 рака легкого
v*" / / / / / У
/ / / / / / / / / / / /
/ / /
*, р < 0,01 по сравнению с контролем
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Р11-алкила
Фиг. 15
Анализ МТТ к.
о снабжения кислородом)
щ 1
/ / / / / / / /
*, р < 0,05 по сравнению с контролем; **, р < 0,001 по сравнению с контролем
Расщепляемый Нерасщепляемый
(расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ти-карбиноламина; (нерасщепляемый) конъюгат Hb-5FU-anKnna
Фиг. 16
Анализ МТТ клеток линии А172 рака головного мозга
5 по сравнению с контролем;
о сравнению с контролем
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ти-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-алкила
Фиг. 17
Анализ МТТ клеток линии MCF-7 рака молочной железы
г / / /
*, р < 0,001 по сравнению с контролем
Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5РЦ-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат НЬ-5Ти-алкила
Фиг. 18
Анализ МТТ клеток линии Huh-7 рака печени
*, р < 0,05 по сравнению с контролем Расщепляемый конъюгат: (расщепляемый) конъюгат НЬ-5Ри-карбиноламина; Нерасщепляемый конъюгат: (нерасщепляемый) конъюгат Hb-5FU-anKima
Фиг. 19
ТИЩТемозол оми д)
\ Катион метиодиазония ((алкилирующее ДНК средство)]
Распад TMZ (обнаруженный частично в спектре МС); йт = 68
а = а цепь, al = а цепь, модифицированная монофлуоресцином, а2 = а цепь, модифицированная дифлуоресцином, аЗ = а цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2а = а-а цепь, 2al = а-а цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2а2 = а-а цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2аЗ = а-а цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р = рЗ-J3 цепь, 2(31 = |3-|3 цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2|32 = (3-Р цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2|33 = р-Р цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р4 = Р-Р цепь, модифицированная тетрафлуоресцином, 2Р' = р'-р' цепь, 2Р'1 = Р'-Р' цепь, модифицированная монофлуоресцином. 2Р'2 = Р'-Р' цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2Р'3 = Р'-Р' цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р'4 = р'-р' цепь, модифицированная тетрафлуоресцином.
а = а цепь, al = а цепь, модифицированная монофлуоресцином, а2 = а цепь, модифицированная дифлуоресцином, аЗ = а цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2а = а-а цепь, 2a 1 = а-а цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2а2 = а-а цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2аЗ = а-а цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р = Р-Р цепь, 2|31 = р-Р цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2Р2 = р-р цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2РЗ = Р-Р цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р4 = р-Р цепь, модифицированная тетрафлуоресцином, 2Р' = р'-Р' цепь, 2J34 = Р'-Р' цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2Р'2 = Р'-Р' цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2Р'3 = Р'-Р' цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р'4 = Р'-Р' цепь, модифицированная тетрафлуоресцином.
Фиг. 25
а = а цепь, al = а цепь, модифицированная монофлуоресцином, а2 = а цепь, модифицированная дифлуоресцином, аЗ = а цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2а = а-а цепь, 2a 1 = а-а цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2а2 = а-а цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2аЗ = а-а цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2(3 = (3-(3 цепь, 2(31 = (3-(3 цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2(32 = Р-Р цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2рЗ = Р-Р цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р4 = Р-Р цепь, модифицированная тетрафлуоресцином, 2Р' = Р'-Р' цепь, 2J34 = Р'-Р' цепь, модифицированная монофлуоресцином, 2Р'2 = Р'-Р' цепь, модифицированная дифлуоресцином, 2Р'3 = Р'-Р' цепь, модифицированная трифлуоресцином, 2Р'4 = Р'-Р' цепь, модифицированная тетрафлуоресцином.
Фиг. 26
0.8-
а 0.6
pH6,r.t. pH7,r.t. рН 9, r.t. рН9,37°С
а = а цепь,
а+1М = а цепь, модифицированная моноангидридом а+2М = а цепь, модифицированная диангидридом а+ЗМ = а цепь, модифицированная триангидридом а+4М = а цепь, модифицированная тетраангидридом
Фиг. 28
Дисульфид
(раещешшемьм) EFU-arenui-flBtyraiina-NHS э4ир
I расщепляем(tm)) конъите Нй-5РЦ-ашип#"Еупьфвда
Фиг. 29А
(расщепляемый)
UXO 16203 18ЮЗ ЖиСО
J-tam й?Пг ' 31.00 ЗО90С згш
Фиг. 29В
(нерасщепляемый)
Соединение с одним красителем - гемоглобин, 5FUи флуоресцином Название - (нерасщепляемый) коньюгат НЬ-БРи-алкил-дисульфида
о t,'*~l"''l Фяуоресцин-8-NHS
Фиг. 30А
Коньюгат с одним красителем для визуализации - гемоглобин, мвчвннкй (расщепляемым) SFU и фгтуоресиипом
Название = (расщепляемый) конъюгат НЬ-бРи-карВииояашн-РЕ.
°~ 0.^.0 Фпуореецин-6-NHS
Фиг. 31 А
Краситель дансил
(Рясщипляаиыя) 5FИ-адммьный эфир-0"гы>
Фиг. 32А
и Hb-5FU-Dait-TAM
5-FU Краситагь дансял
^"Линкер[
Коньюгат Hb-5FU-Dan-TAM
газа мм
Фиг. 32В
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032164
- 1 -
(19)
032164
- 1 -
(19)
032164
- 4 -
(19)
032164
- 16 -
032164
- 17 -
032164
- 23 -
032164
- 26 -
032164
- 29 -
032164
- 29 -
032164
- 29 -
032164
- 29 -
032164
- 29 -
032164
- 30 -
032164
- 30 -
032164
- 30 -
032164
- 30 -
032164
- 31 -
032164
- 31 -
032164
- 34 -
032164
- 35 -
032164
- 38 -
032164
- 38 -
032164
- 38 -