EA 032116B1 20190430

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032116b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Применение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли при лечении хронической обструктивной болезни легких.

2. Применение по п.1, при котором вводимая доза N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.

3. Применение по п.1 или 2, при котором лечение снижает риск респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента.

4. Применение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли в способе облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента.

5. Применение по п.4, при котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.

6. Применение по любому из пп.1-5, при котором способ лечения касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.

7. Применение по п.6, при котором пациент также получает терапию, которая включает введение активного ингредиента, выбранного из бронходилататора, антихолинергического средства или кортикостероида.

8. Применение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления медикамента для лечения хронической обструктивной болезни легких.

9. Применение по п.8, при котором вводимая доза N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.

10. Применение по п.8 или 9, при котором лечение снижает риск респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента.

11. Применение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления медикамента для способа облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента.

12. Применение по п.11, при котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.

13. Применение по любому из пп.8-12, при котором способ лечения касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.

14. Способ лечения хронической обструктивной болезни легких, который включает введение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли нуждающемуся в таком лечении пациенту.

15. Способ по п.14, в котором вводимая доза N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.

16. Способ снижения риска респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента, который включает введение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли такому пациенту, проявляющему симптомы хронической обструктивной болезни легких.

17. Способ облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента, который включает введение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли такому пациенту.

18. Способ по п.17, в котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.

19. Способ по любому из пп.14-18, который касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское 032116 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201692013
(22) Дата подачи заявки 2015.03.31
(51) Int. Cl.
A61K31/166 (2006.01) A61P 31/00 (2006.01)
(54) НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ 1Ч,1Ч-БИС-2-МЕРКАПТОЭТИЛ-ИЗОФТАЛАМИДА
(31) 1406115.4
(32) 2014.04.04
(33) GB
(43) 2017.03.31
(86) PCT/GB2015/050999
(87) WO 2015/150793 2015.10.08
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭМЕРАМЕД ЛИМИТЕД (IE)
(72) Изобретатель:
Хейли Бойд Юджин (US), Клингберг Рагнар Аксель Теодор (SE)
(74) Представитель:
Агуреев А.П., Фелицына С.Б. (RU) (56) RISHI В. PATEL ET AL: "Thiol-redox antioxidants protect against lung vascular endothelial cytoskeletal alterations caused by pulmonary fibrosis inducer, bleomycin: comparison between classical thiol-protectant, N-acetyl-l-cysteine, and novel thiol antioxidant, N,N' -bis-2-mercaptoethyl isophthalamide", TOXICOLOGY MECHANISMS AND METHODS, vol. 22, no. 5, 1 June 2012 (2012-06-01), pages 383-396, XP055199056, ISSN: 1537-6516, DOI: 10.3109/15376516.2012.673089 cited in the application abstract; p. 8, middle; p. 12,
first full
US-A1-2010227812
RAHMAN IRFAN: "Antioxidant therapeutic advances in COPD", THERAPEUTIC ADVANCES
IN RESPIRATORY DISEASE, SAGE
PUBLICATIONS LTD, UK, vol. 2, no. 6, 1 December 2008 (2008-12-01), pages 351-374, XP008171192, ISSN: 1753-4658, DOI: 10.1177/1753465808098224,
p. 357 to p. 361, col. 1
(57) В соответствии с изобретением представлен ^№бис-2-меркаптоэтил-изофталамид либо его фармацевтически приемлемые соли или производные для применения при системной регенерации аскорбата, а тем самым при терапевтическом лечении хронической обструктивной болезни легких.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается нового применения известного соединения, хелатирующего тяжелые металлы.
Предшествующий уровень техники
Хроническая обструктивная болезнь легких (COPD) является обструктивным заболеванием легких, которое характеризуется хронической затрудненностью дыхания, одышкой, кашлем и выделением мокроты.
Во всем мире COPD, как полагают, затрагивает почти 600 млн лиц. Подавляющее большинство пациентов с COPD являются курильщиками или бывшими курильщиками.
Существует много возможных причин COPD, причем табакокурение является наиболее распространенной. Другие причины включают загрязнение воздуха, особенно от сжигания топлива (например, древесный дым). Также у заболевания может быть и генетический компонент.
Предполагается, что COPD вызывается длительным воздействием этих раздражителей, что порождает воспалительные реакции в легких. Это приводит к сужению бронхов и разрушению легочной ткани (эмфиземе).
Хотя считается, что COPD в большой степени является предотвращаемым заболеванием (например, путем уменьшения воздействия вызывающих его патогенов), оно по-прежнему является третьей самой распространенной в мире причиной смерти.
Лечение больных представляет серьезную проблему. В настоящее время первая линия лечения включает ингаляционные бронходилататоры и кортикостероиды. Однако ухудшение дыхания у страдающих COPD обычно существенно не улучшается при применении существующих в настоящее время лекарств, а это значит, что зачастую применяются более радикальные меры, в том числе кислородная терапия и даже трансплантация легких. При обострении симптомов часто требуется госпитализация.
Из-за отсутствия эффективных способов лечения экономическое бремя COPD огромно и оценивается в 2,1 трлн долларов в 2010 г. Социально-экономические издержки от COPD могут возрасти, так как в развитых и развивающихся странах повышается долговечность. В ЕС прямые затраты на лечение 2 млн наиболее пострадавших пациентов составляет около 30 млрд евро в год (15 000 евро на 1 пациента в год). Прямые затраты на лечение других 20 млн больных составляют около 10 млрд евро (500 евро на 1 пациента в год). Таким образом, общие затраты составляют около 40 млрд евро, не считая дополнительных косвенных издержек из-за снижения производительности. При COPD очень распространены сопутствующие заболевания, что еще больше раздувает стоимость лечения.
Таким образом, существует огромная, клинически неудовлетворенная потребность в новых и/или лучших средствах лечения COPD. Также существует явная потребность в улучшенных способах лечения, способных воздействовать на ключевые патологические процессы, с потенциалом для изменения течения заболевания, уменьшения числа пациентов, прогрессирующих к более тяжелым стадиям заболевания.
]Ч,]Ч-бис-2-меркаптоэтил-изофталамид (NBMI) был впервые описан в патенте США за номером US 6,586,600 В2. Его применение в качестве пищевой добавки, а также для снятия окислительного стресса раскрыто в патентной заявке US 2010/0227812. NBMI известен как сильный хелатор тяжелых металлов, включая ртуть, кадмий и свинец. См. также Patel et al., Toxicology Mechanisms and Methods, 22, 383
(2012).
Аналоги NBMI были раскрыты среди прочего в US 8,426,368 В2 и международных патентных заявках WO 2011/038385 и WO 2012/121798.
Однако ни в одном из вышеуказанных документов не изложено потенциальное применение NBMI или родственных соединений при возможном лечении COPD.
Общеизвестно, что у больных COPD происходит усиление окислительного стресса в легких и системно, как в результате окислительной нагрузки от самого сигаретного дыма, так и от повышенного выделения активных форм кислорода (ROS) из активирующихся при этом воспалительных клеток.
Эукариотические клетки обладают внутриклеточными ферментными системами, которые регенерируют аскорбат из продукта его окисления, дегидроаскорбата (DHA), тем самым предотвращая его необратимое окисление до дальнейших продуктов, не несущих антиоксидантной функции (например, см. Corti et al., Arch. Biochem. Biophys., 500, 107 (2010)). Следовательно, этот механизм необходим для поддержания клеточных концентраций аскорбата и может происходить либо ферментативно под действием дегидроаскорбатредуктаз типа глутаредоксина (см. Saaranen et al., Antioxid. Redox Signal., 12, 15 (2010)) и протеин-дисульфидизомеразы (Nardai et al., J. Biol. Chem., 276, 8825 (2001)), а также неферментативным путем через его восстановление под действием GSH (Winkler et al., Free Radic. Biol. Med., 17, 333 (1994)).
Недавнее исследование показало, что вливание аскорбата повышает устойчивость к усталости скелетных мышц у пациентов с COPD (например, см. Rossman et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp.
Physiol., 305 (2013)).
Мы обнаружили, что NBMI не только способен ингибировать высвобождение ключевых противовоспалительных маркеров типа интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-8 (IL-8) и альфа-фактора некроза опухолей (TNF-a), которые экспрессируются у больных COPD (например, см. Rubini et al., Inflamm. Allergy Drug Targets, 12, 315 (2013); Thorleifsson et al., Respir. Med., 103, 1548 (2009); Tang, J. Interferon Cy
tokine Res., 34, 162 (2014) и Dadvand et al., Eur. Respir. J., (2014, Feb 20), но также, что весьма неожиданно, NBMI способен регенерировать аскорбат в жидкой фазе выстилки дыхательных путей. Кроме того, оказалось, что NBMI может выполнять это действие, функционируя в качестве донора электронов для рециркуляции аскорбата. Мы также обнаружили вне ожидания, что NBMI можно вводить пациентам для терапевтического лечения COPD, ослабляя симптомы и модифицируя/устраняя прогрессирование заболевания и не вызывая значительных отрицательных побочных эффектов.
Сущность изобретения
В соответствии с первым аспектом изобретения предусмотрен NBMI либо его фармацевтически приемлемая соль или производное для применения в способе лечения COPD. Такой способ включает введение фармацевтически эффективного количества NBMI нуждающимся в таком лечении пациентам.
Термин "COPD" охватывает такие заболевания, которые в литературе именуются по-разному как "хроническая обструктивная болезнь легких (COLD)" или "хроническая обструктивная болезнь дыхательных путей (COAD)", которые характеризуются, к примеру, хронической затрудненностью дыхания, одышкой, кашлем и выделением мокроты.
Во избежание сомнений в контексте настоящего изобретения термины "лечение", "терапия" и "способ терапии" включают терапевтическое или паллиативное лечение нуждающихся в этом больных COPD или другими приведенными здесь родственными заболеваниями. "Пациенты" включают больных людей.
Фармацевтически приемлемые соли NBMI, которые можно упомянуть, включают соли щелочноземельных и особенно щелочных металлов, как то соли лития, натрия, калия, рубидия, цезия и франция.
Такие соли могут быть получены стандартными способами, например при реакции NBMI с одним или несколькими эквивалентами соответствующего основания, необязательно в растворителе или в среде, в которой соль нерастворима, с последующим удалением данного растворителя или данной среды стандартными методами (например, под вакуумом, лиофилизацией или фильтрованием). Соли также могут быть получены путем замены противоиона активного ингредиента в виде соли с другим противоио-ном, к примеру с помощью подходящей ионообменной смолы.
Фармацевтически приемлемые производные NBMI включают глутатион, цистеин, альфа-дигидролипоевую кислоту, цистамин, тиофосфат, 5'-тиоаденозин, L-гомоцистеин, кофермент А, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол, производные йодацетата, бромацетата, фторацетата или хлорацетата. Такие производные могут быть получены, как описано, к примеру, в патентной заявке US 2011/0237776.
NBMI, его фармацевтически приемлемые соли и фармацевтически приемлемые производные в дальнейшем совокупно именуются просто как "NBMI".
В соответствии с другим аспектом изобретения предусмотрен способ лечения COPD у пациентов путем введения NBMI в достаточной, фармацевтически эффективной дозе, способной регенерировать аскорбат (например, системно) у данного пациента.
Специалистам в данной области хорошо известно, что "аскорбат" также может по-разному именоваться в литературе как аскорбиновая кислота, L-аскорбиновая кислота и/или витамин С.
COPD, как известно, связана с респираторной заболеваемостью и смертностью, риск которых в соответствии с изобретением может снижаться с помощью NBMI.
В соответствии со следующим аспектом изобретения предусмотрен способ снижения риска (т.е. предотвращения) респираторной заболеваемости и смертности у пациентов, который включает введение NBMI таким пациентам, проявляющим симптомы COPD.
Термин "заболеваемость" должен пониматься специалистами как включающий любые вызывающие, по крайней мере частично, нетрудоспособность болезни, заболевания, недомогания и/или вообще плохое состояние здоровья. "Респираторная" заболеваемость поэтому включает такие состояния, которые проявляются как последствия, например, COPD.
Как оказалось, NBMI применим для облегчения симптомов COPD, в том числе усталости (например, усталости скелетных мышц), одышки, кашля и выделения мокроты.
В соответствии со следующим аспектом изобретения предусмотрен способ облегчения одного или нескольких симптомов COPD у пациентов, страдающих COPD, который включает введение NBMI таким пациентам.
Хотя они и не ограничиваются только этим, применение и способы лечения по изобретению, которые можно упомянуть, включают такие, при которых пациентами являются курильщики или бывшие курильщики.
В описанных здесь применениях и способах NBMI предпочтительно вводится местно или системно, к примеру, перорально, внутривенно или внутриартериально (в том числе при помощи внутрисосуди-стых или других периваскулярных устройств/дозовых форм (например, стентов)), внутримышечно, на кожу, подкожно, через слизистые оболочки (например, под язык или за щеку), ректально, трансдермаль-но, интраназально, через легкие (например, путем ингаляции, трахеально или бронхиально), топически или любым другим парентеральным способом в виде фармацевтического препарата, содержащего соединение в фармацевтически приемлемой дозовой форме. Предпочтительные способы введения включают пероральное (в особенности), внутривенное, кожное или подкожное, интраназальное, внутримышечное или внутрибрюшинное введение.
NBMI обычно вводится в виде одной или нескольких лекарственных форм в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, которые можно выбирать с учетом предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики. Такие фармацевтически приемлемые носители могут быть химически инертными по отношению к активным соединениям и не иметь вредных побочных эффектов или токсичности в условиях применения. Такие фармацевтически приемлемые носители также могут придавать немедленное или модифицированное высвобождение NBMI.
Подходящие лекарственные формы могут быть коммерчески доступными или же описаны в литературе, к примеру Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995); Martindale, The Complete Drug Reference (35th Edition) и приведенные там документы, причем содержание всех этих документов включено сюда путем ссылки. С другой стороны, получение подходящих лекарственных форм может осуществляться специалистами и не по изобретению, а с помощью стандартных методов. Подходящие лекарственные формы для применения с NBMI также описаны в патентной заявке US 2010/0227812.
Количество NBMI в лекарственной форме зависит от тяжести заболевания и от подлежащего лечению пациента, а также от того, какие соединения используются, но может быть определено и без изобретения специалистами.
В зависимости от подлежащего лечению пациента, а также от способа введения NBMI можно вводить в различных терапевтически эффективных дозах нуждающимся в этом пациентам.
Однако доза, вводимая человеку, в контексте настоящего изобретения должна быть достаточной для эффективной терапевтической реакции в течение разумного периода времени (как описано выше). Специалистам должно быть известно, что на выбор точной дозы и состава и наиболее подходящего режима доставки также будут влиять среди прочего фармакологические свойства лекарственной формы, природа и тяжесть подлежащего лечению заболевания и физическое и психическое состояние получателя, а также возраст, состояние, масса тела, пол и реакция подлежащего лечению пациента, стадия, тяжесть заболевания, а также генетические различия между пациентами.
Введение NBMI может быть непрерывным или прерывистым (например, болюсом). Дозировка также может определяться временем и частотой введения.
Поэтому подходящие дозы NBMI составляют от 0,5 до 100,0 мг, в том числе от 1 до 60 мг, к примеру между 1,5 и 40 мг соединения на кг общей массы тела пациента в день.
В любом случае практикующий врач или другой специалист сможет на практике определить такую дозировку, которая будет наиболее подходящей для конкретного пациента. Вышеприведенные дозировки являются типичными для обычных случаев. Конечно в отдельных случаях могут быть оправданы более высокие или более низкие интервалы доз, которые находятся в рамках объема настоящего изобретения.
В описанных здесь применениях и способах NBMI также можно комбинировать с одним или несколькими активными ингредиентами, которые потенциально применимы или показаны для применения при лечении COPD. При этом такие пациенты могут и/или уже получают терапию на основе введения одного или нескольких из таких активных ингредиентов, причем под этим подразумевается получение предписанной дозы одного или нескольких из таких указанных здесь активных ингредиентов до, вместе с и/или после применения NBMI.
Такие активные ингредиенты включают бронходилататоры короткого действия (как то сальбута-мол/альбутерол, левосальбутамол/левальбутерол, пирбутерол, эпинефрин, эфедрин и тербуталин), брон-ходилататоры длительного действия (как то сальметерол, кленбутерол, формотерол, бамбутерол и инда-катерол), антихолинергические средства (как то тиотропий и ипратропий бромид), кортикостероиды (как то флунизолид, флутиказон пропионат, триамцинолон ацетонид, беклометазон дипропионат и будесо-нид) и другие препараты, используемые при лечении COPD, в том числе долгосрочные антибиотики (например, такие макролиды как эритромицин), муколитики и кислород.
NBMI также можно вводить совместно с антиоксидантами или хелаторами, включая витамин Е, витамин D, цистеин, цистин, глутатион (GSH), глутатион-липоевую кислоту (GSH), дигидролипоевую кислоту (DLPA), липоевую кислоту (LPA), N-ацетилцистеин (NAC), димеркаптопропансульфонат (DMPS), димеркаптоянтарную кислоту (DMSA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и их смеси.
Фармацевтически приемлемые соли других активных ингредиентов, применимых при лечении COPD, которые можно упомянуть, включают соли с кислотами и соли с основаниями. Такие соли могут быть получены стандартными способами.
Подходящие дозы других активных ингредиентов, включая те, что применимы при лечении COPD, известны специалистам в данной области и включают дозы, приведенные для конкретных препаратов в медицинской литературе типа Martindale, The Complete Drug Reference (35th Edition) и приведенных там документах, причем содержание всех этих документов включено сюда путем ссылки.
Везде, где в описании используется слова "примерно", "к примеру", в контексте количества (например, дозы активных ингредиентов) следует иметь в виду, что такие переменные являются приблизительными и при этом могут отличаться на ± 10%, к примеру на ± 5%, предпочтительно ± 2% (например, ± 1%) от приведенных здесь чисел.
Применения/способы, описанные здесь, могут иметь преимущество в том, что при лечении COPD они могут быть более удобными для врача и/или пациента, более эффективными, менее токсичными, иметь более широкий спектр активности, быть более сильными, давать меньше побочных эффектов или же они могут иметь другие полезные фармакологические свойства, чем аналогичные способы лечения, известные на предшествующем уровне техники для применения в такой терапии.
Далее изобретение раскрывается на следующих фигурах и примерах, но никоим образом не ограничивается ими.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлено на модели окисления аскорбата окисление аскорбата до DHA под действием 9,10-фенантренхинона (9,10-PQ) с последующей рециркуляцией DHA под действием NBMI и дитиотреи-тола (DTT).
На фиг. 2 представлено на модели окисления аскорбата окисление аскорбата до DHA под действием CuSO4 с последующей рециркуляцией DHA под действием NBMI и DTT при добавлении их через 10, 20 и 30 мин, причем кинетика окисления аскорбата и рециркуляции представлена на левой панели, а соответствующий немедленный скачок и устойчивое повышение концентрации аскорбата после добавления NBMI и DTT представлено на правой панели.
Примеры.
Пример 1. Ингибирование IL-6 и IL-8 при помощи NBMI.
Измеряли секрецию провоспалительных цитокинов - интерлейкина (IL)-6 и IL-8 (а также GM-CSF и МСР-1) в клеточных средах в ответ на воздействие частиц на клетки А549 и BEAS-2B следующим образом.
Клетки легочного эпителия высеивали при 5х104 в 24 -луночные планшеты. После преинкубации в течение 3 ч с NBMI, антиокислительным соединением ^ацетил^-цистеином (NAC), который использовался в качестве положительного контроля, или носителем среду удаляли.
Добавляли свежую среду, содержащую различные частицы (см. ниже) в разных концентрациях в общем объеме 0,5 мл еще на 24 ч. Затем отделяли супернатанты от клеток центрифугированием.
В бесклеточной жидкости измеряли IL-8, IL-6, GM-CSF и МСР-1 с помощью набора DuoSet ELISA Development kit (R &D Systems, Abingdon, UK) в соответствии с методикой производителя.
В качестве отрицательного контроля служило воздействие одной только среды. Каждый эксперимент проводили дважды в 4 повторах.
В общем, и диоксид титан типа Р25, и городская пыль (препарат SRM 1649 b) вызывали выработку провоспалительных цитокинов в линиях клеток легочного эпителия A549 и BEAS-2B.
Эффект преинкубации при 50 мкМ NBMI на вызванную частицами выработку цитокинов испытывали при различных концентрациях соответствующих частиц.
Исследование показало, что NBMI может снижать вызванную частицами секрецию провоспали-тельных цитокинов в обеих линиях клеток, хотя лишь в некоторых случаях снижение доходило до фонового уровня.
Самые высокие концентрации IL-8 и IL-6 достигались в супернатантах клеток А549 при обработке их TiO2 P25 при 75 мкг/см2. При этой дозе 50 мкМ NBMI снижал секрецию IL-8 на 29% и IL-6 на 38%.
При 100 мкг/см2 препарата городской пыли преинкубация клеток А549 с 50 мкМ NBMI снижала секрецию IL-8 на 30% и IL-6 на 38%.
При 100 мкг/см2 TiO2 P25 преинкубация клеток BEAS-2B с 50 мкМ NBMI снижала секрецию IL-8
на 49% и IL-6 на 37%.
При 100 мкг/см2 препарата городской пыли преинкубация клеток BEAS-2B с 50 мкМ NBMI снижала секрецию IL-6 на 47%.
Преинкубация с 5 мМ NAC также эффективно снижала секрецию провоспалительных цитокинов. Пример 2. Регенерация аскорбата с помощью NBMI.
Исследовали, может ли NBMI функционировать в качестве донора электронов для рециркуляции аскорбата.
Кинетику окисления аскорбата, опосредованного и 1 мкМ 9,10-PQ, и 2 мкМ сульфата меди (CuSO4), исследовали методом анализа истощения аскорбата (Kelly et al., Res. Rep. Health Eff. Inst, 163, 3 (2011). 9,10-PQ использовали с тем, чтобы можно было изучать действие NBMI в отрыве от его хелатирующих свойств.
Все эксперименты проводили в трех повторах в 96-луночных планшетах UV с плоским дном (Greiner Bio-one) в конечном объеме 200 мкл. Воздействие запускали добавлением 20 мкл концентрированного раствора аскорбата (2 мМ) в каждую лунку, содержащую 160 мкл обработанной смолой Chelex-100 воды (содержащей 10% DMSO), плюс 10 мкл либо воды, маточного раствора CuSO4 при 4 мМ или маточного раствора 9,10-PQ при 2 мМ и 10 мкл NBMI (4 мМ и 200 мкМ).
Все растворы готовили на обработанной смолой Chelex-100 воде (содержащей 10% DMSO). Это давало конечные концентрации в лунках 200 мкМ аскорбата, 2 мкМ CuSO4 или 1 мкМ 9,10-PQ и от 10 до
200 мкМ NBMI.
Непосредственно перед добавлением аскорбата в каждую лунку при анализе планшет преинкубиро
вали 10 мин при 37°С в считывающем устройстве (Spectra Max 190). Во время обработки планшет содержали при этой температуре. После добавления аскорбата его концентрацию, остающуюся в каждой лунке, отслеживали через каждые 2 мин на протяжении 2 ч путем измерения поглощения при 265 нм. Концентрацию аскорбата определяли по стандартной кривой, а скорость окисления аскорбата определяли методом линейной регрессии по начальной части графика концентрации от времени с помощью программы OriginLab фирмы Microcal Software Limited (версия 5.0). Это делали для каждого из трех повторов, после чего скорость истощения аскорбата выражали в моль-сек-1х10-9 в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
Для экспериментов, в которых изучали влияние добавления NBMI к аскорбату, позже по ходу времени проводили анализ истощения CuSO4 и 9,10-PQ. Планшеты инкубировали только со 190 мкл в течение первых 55-60 мин, после чего их вынимали из считывающего устройства и в каждую лунку добавляли 10 мкл либо NBMI, либо известного восстановителя - маточного раствора DTT, либо воды. Затем планшет возвращали в считывающее устройство и отслеживали поглощение при 265 нм еще в течение 60 мин.
Определяли первоначальное повышение измеряемой концентрации аскорбата, которое именуется как "скачок", в качестве меры исходной способности к рециркуляции. Также определяли устойчивое "повышение" в течение оставшихся 60 мин инкубации. Разница между этими двумя отражает способность добавленных соединений ингибировать последующую скорость опосредованного CuSO4 или 9,10-PQ окисления аскорбата.
На фиг. 1 представлена кинетика окисления аскорбата, опосредованного инкубацией с 9,10-PQ, в течение первых 60 мин эксперимента. В это время добавляли NBMI (200 мкМ), и оказалось, что это приводит к немедленному повышению аскорбата скачком на 42,8 мкМ. После этого скорость окисления ас-корбата снижалась по сравнению с первым 60-минутным периодом.
Это скачкообразное повышение аскорбата, которое указывает на рециркуляцию DHA обратно в ас-корбат, было неожиданным и оказалось значительно большим в сравнении с тем, что достигалось при использовании DTT (200 мкМ), который давал меньшее первоначальное восстановление аскорбата в 5,1 мкМ, к тому же оно не было устойчивым.
На фиг. 2 представлена способность NBMI к рециркуляции DHA на модели CuSO4-аскорбат через 10, 20 и 30 мин инкубации. Опираясь на эти ранние моменты времени, скачкообразное повышение ас-корбата после добавления NBMI было наиболее заметным при большей из двух тестируемых концентраций с последующим угасанием скорости окисления, возможно, из-за хелатирующих свойств соединения.
Эти эксперименты повторяли при добавлении NBMI и DTT (оба при 200 мкМ) через 60 мин. При этом проявлялся немедленный "скачок" концентрации аскорбата на 7,93+6,58 мкМ с DTT в сравнении с повышением на 24,98+5,54 мкМ с NBMI. За оставшиеся 60 мин инкубации устойчивое "повышение" ас-корбата составляло 10,79+2,45 мкМ против 25,45+2,45 мкМ для DTT и NBMI соответственно.
Эти результаты указывают на доселе неизвестное и неожиданное свойство NBMI, свидетельствуя о том, что он может рециркулировать DHA обратно в аскорбат.
Пример 3. Лечение пациентки с COPD.
Пенсионерка, проживающая в США, которой несколько лет назад был поставлен диагноз COPD, регулярно испытывала приступы кашля 2-4 раза в сутки, начинавшиеся в любой час дня или ночи и продолжавшиеся от 40 до 75 мин.
Вследствие этих приступов кашля, дыхание у пациентки было неглубоким, ее горло раздраженным, а голос хриплым, уровень энергии у нее был очень низок, а качество жизни очень плохое.
Лечение три раза в день (во время еды) дозами по 100 мг NBMI в одной капсуле на протяжении 8 дней привело к значительному улучшению симптомов. На восьмой день лечения пациентка не испытывала никаких приступов кашля, и у нее значительно улучшилось дыхание.
Пример 4. Исследование in vivo "Курящие мыши" I.
Исследования показали, что сигаретный дым может вызвать воспалительную реакцию легких у мышей С57В1/6 и Balb/c при воздействии 5-6 сигарет в день 5 дней в неделю (например, см. D'hulst et al., Eur. Respir. J., 26, 204 (2005) и Jung et al., BMC Complement. Altera Med., 13, 219 (2013)).
Была разработана мышиная модель индуцированного сигаретным дымом (CS) заболевания дыхательных путей, в которой четыре группы мышей BALB/c подвергали воздействию CS (только в нос) с помощью курительной машины для сигарет, которая дает сочетание бокового и основного потока дыма из исследовательских сигарет с фильтром 7 дней в неделю на протяжении 2 недель.
В рамках 14-дневного исследования по определению дозы трем группам мышей вводили NBMI подкожно (5, 30 или 150 мг/кг) перед каждым воздействием CS. Проводили подсчет воспалительных клеток в бронхоальвеолярном смыве (BAL), анализ методом проточной цитометрии (FACS) и анализ цито-кинов в BAL.
Материалы и методы.
В данном исследовании использовали самок мышей BALB/c (Harlem Laboratories, Нидерланды). Их размещали в пластиковых клетках с впитывающей подстилкой и поддерживали 12-часовой цикл освещения. Пищу и воду давали ad libitum. Их содержание и экспериментальные протоколы были одобрены
Региональным комитетом по этике при экспериментах на животных в Umea. Мышам было 12 недель в самом начале протокола воздействия сигарет. Протокол воздействия CS.
Животных подвергали вдыханию CS (и бокового, и основного потока дыма). Воздействие CS проводили в управляемой микропроцессором курительной машине для сигарет (ТЕ-10, Teague Enterprises, CA, США), которая вырабатывает дым из исследовательских сигарет (1R5F, University of Kentucky, Lexington, KY, США).
Сигареты автоматически подаются в карусель, прикуриваются, делаются затяжки и выбрасываются. Каждая сигарета курилась в течение 10 мин, а поток воздуха через машину был установлен на 12 л/мин. Сигареты хранились при -20°С до тех пор, пока не потребуются. Мышам подавали по 4 сигареты через каждые 10 минх3 (т.е. 12 сигарет за 30 мин) раз в день, 7 дней в неделю на протяжении 2 недель. Дым поступал в дымовую башню (EMMS, UK), обеспечивающую равное и одновременное воздействие CS.
Мышей помещали в пластиковые камеры и подвергали воздействию CS "только в нос". Контрольные мыши подвергались манипулированию каждый день и дышали комнатным воздухом, но их не вынимали из клеток.
Соответственно было 5 опытных групп, разделенных следующим образом:
1) ежедневное воздействие чистого воздуха (группа плацебо);
2) ежедневное воздействие CS (группа плацебо с воздействием CS);
3) ежедневное воздействие CS, обработка NBMI в дозе 5 мг/кг (группа NBMI 5 мг/кг)
4) ежедневное воздействие CS, обработка NBMI в дозе 30 мг/кг (группа NBMI 30 мг/кг)
5) ежедневное воздействие CS, обработка NBMI в дозе 150 мг/кг (группа NBMI 150 мг/кг).
На 15-й день мышей обескровливали и подвергали бронхоальвеолярному лаважу (BAL). Легкие подвергали лаважу 4 раза через трахеальные трубки в общем объеме 1 мл+3х1 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса без Ca2+/Mg2+ (HBSS, Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия).
Промывную жидкость после BAL сразу же центрифугировали (10 мин, 4°С, 1750 об/мин). После удаления супернатанта до дальнейшего анализа клеточный осадок ресуспендировали и затем разбавляли 0,5 мл PBS. Лейкоциты подсчитывали вручную в гемоцитометре с тем, чтобы можно быть внести 20000 клеток и центрифугировать на центрифуге Cytospin(r) (цитоцентрифуга Shandon(r) Cytospin 3, система выделения клеток).
Препараты после цитоцентрифуги окрашивали с помощью реагента May-Griinwald-Giemsa и проводили дифференциальный анализ легочных воспалительных клеток по стандартным морфологическим критериям, используя по 300 клеток от 1 препарата Cytospin.
Проводили анализ медиаторов воспаления в BAL и сыворотке на наличие интерлейкина (IL)-1a, IL-1Р, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL17, эотаксина, G-CSF, INFy, GM-CSF, KC, МСР-1, MIP-1a, MIP-1P, RANTES и TNFa. Все анализы на цитокины проводили одновременно с помощью мультиплексного набора (23-плексная панель BioPlex(tm) Pro Mouse Cytokine) в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad) и анализировали на установке Bio-Plex(tm) (Luminex Bio-Plex(tm)
200 System, Bio-Rad, Hercules, CA).
Лейкоциты из BAL анализировали методом проточной цитометрии на установке BD FACSort(tm) (Becton Dickinson, San Jose, CA). Клетки из BAL ресуспендировали в PBS, как описано выше. Окрашивание антителами проводили в 96-луночных планшетах при 2,0х 105 клеток на образец.
Клетки преинкубировали с блокирующим FcR антителом (ant-CD16/CD32; клон 2.4G2), чтобы уменьшить неспецифическое связывание. Для идентификации подтипов Т-клеток использовали следующие mAbs: CD3-FITC (клон 17А2), CD4-PE (клон Н129.19) и CD8a-PE-Cy5 (клон 53-6.7). В качестве отрицательного контроля использовали антитела соответствующего изотипа. Проточную цитометрию проводили на установке BD FACSort(tm) (Becton Dickinson, San Jose, CA) по стандартной методике и анализировали данные с помощью программного обеспечения BD FACSDiva. Все антитела получали из BD Sciences Pharmingen (San Diego, CA). Т-клетки определяли как CD3+.
Результаты представляли в виде среднего значения + стандартная ошибка среднего (S.E.M). Статистическую значимость оценивали параметрическими методами, используя двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для определения отличий между группами с последующим тестом post hoc Бонферро-ни. Когда это уместно, то использовали односторонний ANOVA или непарный t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считались результаты с р <0,05.
Статистический анализ проводили и строили графики с помощью GraphPad Prism (версия 6.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, США).
Результаты.
Всех животных взвешивали каждый день с 1-го по 15-й день через 24 ч после последнего воздействия дымом. Мыши не имели существенных отличий по весу в 1-й день. На 15-й день животные в группе NBMI 5 мг/кг имели меньший конечный вес (9,5+0,3 г), чем мыши, испытавшие воздействие CS (20,3+0,3 г, р <0,05). Все мыши, испытавшие воздействие CS, независимо от дозы NBMI, значительно похудели за период с 1-го по 15-й день.
Общее количество клеток в BAL у испытавших воздействие CS животных (15-й день) не было существенно выше, чем в контрольных группах (296700+43650 при CS и 284670+63200 клеток/мл без CS, p> 0,05). Воздействие CS вызывало значительное увеличение нейтрофилов в жидкости BAL (940+250 при CS и 260+160 клеток/мл без CS, р <0,05). На 15-й день у животных в группе NBMI 150 мг/кг и группе NBMI 30 мг/кг было значительно меньшее число нейтрофилов, чем у мышей, просто испытавших воздействие CS.
За 2 недели воздействия CS уровни медиаторов воспаления существенно не повышались, за исключением G-CSF в BAL. В группе NBMI 5 мг/кг понизился уровень MIP-1 по сравнению с группой плацебо с воздействием CS (р <0,05). Никаких других существенных отличий по анализируемым медиаторам воспаления не было.
За 2 недели воздействия CS уровни медиаторов воспаления в сыворотке не повышались существенно. В группе NBMI 150 мг/кг понизились уровни IL-1, IL-3, IL-6, эотаксина, MIP-1 и RANTES по сравнению с группой плацебо с воздействием CS. В группе NBMI 30 мг/кг повысился уровень IL-10 в сыворотке. Никаких других существенных отличий по анализируемым медиаторам воспаления не было.
За 2 недели воздействия CS не повысились существенно уровни клеток CD4 или клеток CD8 в жидкости BAL. Не отмечалось никаких существенных отличий между любыми группами.
У мышей в группе NBMI 150 мг/кг образовались ранки на загривке. В двух других группах NBMI не было никаких признаков изъязвления, равно как и в группах плацебо.
Пример 5. Исследование in vivo "Курящие мыши" II.
Из результатов исследования, описанного выше в примере 4, был сделан вывод, что двух недель курения сигарет, возможно, было недостаточно для того, чтобы вызвать воспалительную реакцию.
Поэтому за 14-дневным исследованием по определению дозы последовало 90-дневное исследование с использованием практически такой же установки и методики, описанных выше в примере 4.
При этом было 5 опытных групп, распределенных следующим образом:
1) ежедневное воздействие чистого воздуха (группа плацебо, гр. 1);
2) ежедневное воздействие CS (группа плацебо с воздействием CS, гр. 2);
3) ежедневное воздействие CS, обработка NBMI в дозе 30 мг/кг (группа NBMI 30 мг/кг, гр. 3);
4) ежедневное воздействие CS, обработка NBMI в дозе 60 мг/кг (группа NBMI 60 мг/кг, гр. 4);
5) ежедневное воздействие CS, обработка NBMI в дозе 150 мг/кг (группа NBMI 150 мг/кг, гр. 5).
На 91-й день животных взвешивали и анестезировали пентобарбиталом натрия (90 мг/кг массы тела, в/б). Мышей подвергали трахеотомии с помощью канюли 18-го калибра и проводили механическую вентиляцию в квазисинусоидальном режиме с помощью дыхательного аппарата для небольших животных (FlexiVent(tm), SCIREQ(r)) с частотой 3 Гц и дыхательным объемом (VT) в 12 мл/кг массы тела. Применяли положительное давление в конце выдоха 3 см Н2О.
Сердечный выброс у животных отслеживали посредством оценки механики дыхания. Мышей обездвиживали панкуронием (0,1 мг/кг массы тела, в/б (местные поставщики)), а затем проводили маневр из 4 вздохов при 3х^ в начале эксперимента, чтобы установить стабильную исходную механику дыхания и обеспечить одинаковость объема перед экспериментом.
Динамическую механику легких измеряли при синусоидальном стандартизованном дыхании и анализировали на однокомпартментной модели методом множественной линейной регрессии, получая сопротивление дыханию (RRS), эластичность (ERS) и податливость (CRS). Измерение RRS отражает и сужение проводящих дыхательных путей и изменения в легких. Измерения CRS и ERS отражают только события на периферии легких, в особенности закрытие дыхательных путей, ведущее к уменьшению вовлеченности ацинусов. Напротив, избирательное изменение CRS свидетельствует о более дистальном месте действия.
Более тщательные оценки механики легких проводили методом вынужденных колебаний (FOT) в соответствии с Jonasson et al., Respir. Res., 9, 23 (2008) и Respir. Physiol. Neurobiol., 165, 229 (2009). Параметры, которые получали при измерении FOT в этом исследовании, это ньютоновское сопротивление (RN), гасящее сопротивление (G), которое тесно связано с сопротивлением тканей и отражает диссипацию энергии в тканях легких, и эластичность тканей (Н), которая характеризует жесткость тканей и отражает запас энергии в тканях.
Динамические кривые давление-объем (PV) определяли путем раздувания легких до максимального давления в 30 см H2O и допуская пассивный выдох с помощью управляемого компьютером дыхательного аппарата Flexivent для измерения объема и давления. Собирали индивидуальные результаты от каждого животного. Все измерения PV проводились в трех повторах. Квазистатические петли PV получали при медленном ступенчатом раздувании и спадении легких. Петли PV выполняли для уровня PEEP в 3 см H2O. Коэффициент формы (k) нисходящего колена петли PV рассчитывали путем аппроксимации данных по уравнению Salazar-Knowles. Значение параметра к изменяется характерным образом при фиброзе и эмфиземе. Также получали квазистатическую податливость (Cst) и эластичность (Est) и объем вдыхаемого воздуха, достаточный для достижения 20 см водного столба.
Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) осуществляли в основном как описано выше в примере 4, равно как и анализ методом проточной цитометрии клеток из BAL и анализ медиаторов воспаления в BAL и
сыворотке.
Замороженную ткань легких гомогенизировали вместе с 1 мл PBS в пробирке на 2 мл с помощью вибрационной мельницы (Retch MM400) в течение 2 мин при 4°С. Сразу же после гомогенизации пробирку центрифугировали в течение 15 мин (1500 об/мин, 4°С). Надосадочную жидкость удаляли и сохраняли для определения концентрации белка на спектрофотометре NanoDrop (Proteins A280). После определения содержания белка отбирали равные количества белка из каждого образца для анализа трансформирующего фактора роста-бета (TGFP) 1-3. Анализ TGFP 1-3 проводили одновременно с помощью мультиплексного набора (Bio-Plex Pro TGF-P 3-Plex Immunoassay) в гомогенате легочной ткани в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad), а анализ проводили на установке Bio-Plex(tm) (Luminex Bio-Plex(tm) 200 System, Bio-Rad, Hercules, CA).
Животные, подвергавшиеся гистологическому анализу, не проходили тестирование дыхательной функции в целях сохранения целостности тканей. Извлекали правую долю легкого и фиксировали в 4% параформальдегиде до заливки в парафин. После заливки в парафин ткань нарезали на срезы толщиной 3 мкм и монтировали на положительно заряженные предметные стекла. Для оценки инфильтрации воспалительных клеток срезы депарафинировали, обезвоживали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистопатологическая оценка окрашенных срезов проводилась профессиональным патологоанатомом, специализирующимся на мелких животных, в Национальном ветеринарном институте (SVA) в Uppsala, Швеция.
Статистический анализ проводили в основном как описано выше в примере 4. Результаты.
За время 90-дневного воздействия погибло 5 мышей. В большинстве случаев они были подвергнуты эвтаназии из-за ухудшения состояния здоровья, как то большого снижения веса и летаргии, см. табл. 5. При анализе 6 мышей оказались явными выбросами, поэтому они были исключены из набора данных (табл. 2).
В приведенной ниже табл. 1 представлено количество мышей, использовавшихся для различных анализов. У всех мышей брали пробы крови.
Все испытавшие воздействие CS мыши заметно пострадали от него. У них была взъерошенная шерсть и потеря мышечной силы. Животные, получавшие NBMI (гр. 3 и гр. 4), выглядели в некоторой степени более здоровыми, чем в других группах, получавших плацебо (наблюдение зоотехника). Место инъекции для подкожного введения NBMI меняли, чтобы избежать рубцов и изъязвлений. Несмотря на это, у мышей в гр. 5 образовались ранки и шишки на загривке. Две другие группы NBMI не проявляли признаков изъязвления, равно как и группы плацебо. Контрольные животные получали DMSO в той же концентрации, что и NBMI в гр. 5.
Испытавшие воздействие CS животные проявляли значительные отличия по весу от контрольных животных на 90-й день. У контрольных мышей масса тела увеличилась на 15% (2,8+0,2 г), тогда как при воздействии CS у мышей масса тела существенно не возрастала (-0,1+0,3 г). Все животные, получавшие NBMI, прибавили в весе по сравнению с исходным весом (гр. 3 1,0 + 0,4 г, гр. 4 0,7 + 0,2 г и гр. 5 0,6 + 0,2 г). Общее количество клеток в BAL у подвергавшихся воздействию CS животных на 90-й день было значительно выше, чем в контрольных группах (246700+21980 клеток на мл при CS и 152000+20540 клеток/мл без CS, p <0,01). Воздействие CS вызывало значительное увеличение макрофагов в жидкости BAL (229300+21400 клеток/мл при CS и 134200+18600 клеток/мл без CS, p <0,01).
Воздействие CS не вызывало увеличения числа инфильтрирующих нейтрофилов и лимфоцитов в жидкости BAL по сравнению с контрольной группой (гр. 1). У животных, получавших NBMI (30, 60 и 150 мг/кг), не было существенного снижения числа макрофагов в BAL. Однако отмечалась тенденция к снижению числа нейтрофилов в гр. 4 и гр. 5 и снижение числа лимфоцитов в группах, получавших
NBMI.
После 90-дневного воздействия CS не возрастали существенно уровни Т-хелперов (CD4+/CD3+) или Т-цитотоксических (CD8+/CD3+) лимфоцитов в жидкости BAL, как показал анализ FACS. Процентное содержание обоих типов лимфоцитов существенно не изменялось после обработки NBMI. Однако поскольку после обработки NBMI снижалось общее число лимфоцитов, наблюдалось значительное снижение Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8+/CD3+) в жидкости BAL у получавших NBMI животных по сравнению с гр. 2.
90-дневное воздействие CS вызывало структурные изменения в легких по сравнению с контрольными животными (гр. 2 против гр. 1), о чем свидетельствуют вызванные CS изменения и в крупных, и в малых дыхательных путях за счет повышения ERS и Н вместе со снижением CRS. Вызванное CS снижение коэффициента гистерезисности ц отражает уменьшение гетерогенности в легких.
Более высокие дозы NBMI (гр. 4 и гр. 5) вызывали значительное увеличение сопротивления малых и крупных дыхательных путей (RRS и G).
У мышей, испытавших воздействие CS (гр. 2), измеряли кривые PV и сравнивали с мышами, получавшими комнатный воздух (гр. 1). При воздействии CS легкие становились значительно жестче, и требовалось большее давление для их раздувания. Животные, получавшие NBMI (30, 60 и 150 мг/кг), не проявляли существенных изменений дыхательной функции по сравнению с группой плацебо (гр. 2). Воздействие дыма не влияло на Cst, Est и k.
90-дневное воздействие CS не вызывало существенного повышения уровней медиаторов воспаления в BAL и сыворотке. В группе NBMI 150 мг/кг (гр. 5) уровни MIP-1P (p <0,05) и GM-CSF (р <0,01) в сыворотке снижались по сравнению с группой плацебо с воздействием CS (гр. 2). Никаких других существенных отличий по анализируемым медиаторам воспаления не было.
Испытавшие воздействие CS животные (гр. 2) не проявляли повышения уровня TGFp в гомогенатах легких по сравнению с контрольной группой (гр. 1). У животных, получавших NBMI, содержание TGFp 1-3 существенно не изменялось по сравнению с группой плацебо, получавшей CS (гр. 2).
В просвете бронхов и альвеолах у всех легких проявлялось немного макрофагов. В получавших обработку группах макрофаги были несколько более многочисленны и проявляли цитоплазматические гранулы желтоватого пигмента или черного пигмента. Черным пигментом могла быть сажа от воздействия сигарет, а желтоватым пигментом - липофусцин.
У испытавших CS животных наблюдалось небольшое число лейкоцитов (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги) в некоторых альвеолярных перегородках, а также субплеврально в периферических участках легких. Небольшое повышение числа макрофагов в подвергшихся воздействию сигарет группах было слабовыраженным, и легкие оставались вполне ниже порога воспаления. Наблюдавшиеся изменения не были настолько интенсивными, чтобы вызвать клинические признаки.
Контрольные животные в данном исследовании проявляли значительно лучшую функцию дыхательных путей и больший прирост веса, чем испытавшие воздействие CS мыши, но увеличение числа клеток в жидкости BAL не отличалось существенно от гр. 2. Контрольные мыши получали такую же обработку, что и гр. 2, кроме воздействия CS-дыма. Однако все животные находились в одном и том же помещении в лаборатории.
Заключение.
Испытавшие воздействие CS мыши проявляли потерю веса (или отсутствие повышения веса), возрастание макрофагов и большую жесткость легких наряду со снижением податливости дыхания.
Обработка NBMI (гр. 3 и гр. 4) улучшала состояние здоровья у мышей, подвергавшихся ежедневному воздействию CS в течение 90 дней. Положительный эффект обработки подтверждается увеличением веса и тенденцией к снижению числа лимфоцитов и снижением клеток CD8+ в жидкости BAL по сравнению с группой плацебо с воздействием CS (гр. 2).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение ^№бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли при лечении хронической обструктивной болезни легких.
2. Применение по п.1, при котором вводимая доза ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.
3. Применение по п.1 или 2, при котором лечение снижает риск респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента.
4. Применение ^№бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли в способе облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента.
5. Применение по п.4, при котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.
6. Применение по любому из пп.1-5, при котором способ лечения касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.
7. Применение по п.6, при котором пациент также получает терапию, которая включает введение
активного ингредиента, выбранного из бронходилататора, антихолинергического средства или кортико-стероида.
8. Применение ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления медикамента для лечения хронической обструктивной болезни легких.
9. Применение по п.8, при котором вводимая доза ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.
10. Применение по п.8 или 9, при котором лечение снижает риск респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента.
11. Применение ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления медикамента для способа облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента.
12. Применение по п.11, при котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.
13. Применение по любому из пп.8-12, при котором способ лечения касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.
14. Способ лечения хронической обструктивной болезни легких, который включает введение N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли нуждающемуся в таком лечении пациенту.
15. Способ по п.14, в котором вводимая доза ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.
16. Способ снижения риска респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента, который включает введение ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли такому пациенту, проявляющему симптомы хронической обструктивной болезни легких.
17. Способ облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента, который включает введение ^^бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли такому пациенту.
18. Способ по п.17, в котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.
19. Способ по любому из пп.14-18, который касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.
8.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032116
- 1 -
(19)
032116
- 1 -
(19)
032116
- 1 -
(19)
032116
- 4 -
(19)
032116
- 11 -