|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, включающий слияние первых протопластов, полученных из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill., имеющих, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, со вторыми протопластами, полученными из растения Petroselinum crispum, имеющими, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифицированный ядерный геном; регенерацию из слитых протопластов растения Petroselinum crispum, обладающего цитоплазматической мужской стерильностью. 2. Способ по п.1, в котором указанные первые протопласты получены из растения Foeniculum vulgare Mill NCIMB 42055. 3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором указанные вторые протопласты получены из растения Petroselinum crispum var. Tuberosum NCIMB 42056. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором слияние протопластов опосредованно полиэтиленгликолем. 5. Растение Petroselinum crispum, полученное способом по любому из пп.1-4, обладающее цитоплазматической мужской стерильностью и содержащее митохондрии и/или хлоропласты, из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill NCIMB 42055. 6. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. tuberosum. 7. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. crispum. 8. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. neapolitanum. 9. Растение Petroselinum crispum по любому из пп.5-8, где растение Petroselinum crispum является гибридом. 10. Части растения, в том числе семена или ткани, полученные из растения по любому из пп.5-9.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, включающий слияние первых протопластов, полученных из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill., имеющих, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, со вторыми протопластами, полученными из растения Petroselinum crispum, имеющими, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифицированный ядерный геном; регенерацию из слитых протопластов растения Petroselinum crispum, обладающего цитоплазматической мужской стерильностью. 2. Способ по п.1, в котором указанные первые протопласты получены из растения Foeniculum vulgare Mill NCIMB 42055. 3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором указанные вторые протопласты получены из растения Petroselinum crispum var. Tuberosum NCIMB 42056. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором слияние протопластов опосредованно полиэтиленгликолем. 5. Растение Petroselinum crispum, полученное способом по любому из пп.1-4, обладающее цитоплазматической мужской стерильностью и содержащее митохондрии и/или хлоропласты, из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill NCIMB 42055. 6. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. tuberosum. 7. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. crispum. 8. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. neapolitanum. 9. Растение Petroselinum crispum по любому из пп.5-8, где растение Petroselinum crispum является гибридом. 10. Части растения, в том числе семена или ткани, полученные из растения по любому из пп.5-9.
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
032108 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2019.04.30
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
(51) Int. Cl. C12N15/82 (2006.01) A01H1/00 (2006.01) C07K14/345 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ОБЛАДАЮЩИХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ РАСТЕНИЙ PETROSELINUM CRISPUM, ОБЛАДАЮЩИЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ РАСТЕНИЯ PETROSELINUM CRISPUM, ИХ СЕМЕНА И ИХ РАСТИТЕЛЬНЫЕ ЧАСТИ
(43) 2015.09.30
(86) PCT/EP2012/073328
(87) WO 2014/079498 2014.05.30
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БЕЙО ЗАДЕН Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Глас Корнелис, Дол Николас Йоханнес, Ван Каппеллен Витте, Схрейвер Альбертус Йоханнес Мария (NL)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) TAN F ET AL.: "Preliminary Study of
Asymmetric Protoplast Fusion Between Celery (Apium graveolens L.) and CMS Carrot (Daucus carota L.)", ACTA HORTICULTURAE SINICA, vol. 36, no. 8, 2009, pages 1169-1176, XP002710005, the whole document
DUDITS D ET AL: "INTERGENERIC GENE TRANSFER MEDIATED BY PLANT PROTOPLAST FUSION", MOLECULAR AND GENERAL GENETICS, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, vol. 179, no. 2, 1 January 1980 (1980-01-01), pages 283-288, XP008122352, ISSN: 0026-8925 the whole document
ASTLEY D: "Report of a Workshop on umbellifer crops genetic resources", 19970831 31 August 1997 (1997-08-31), pages 1-58, XP007922091, Retrieved from the Internet: URL:http://www.ecpgr.cgiar.org/ fileadmin/bioversity/publications/pdfs/574_Report_of _a_workshop_on_Umbel1ifer_crop_genetic_resources_ 31_August_1997_Krak%C3%B3w_Poland.pdf#page= 11
SACCARDO F ET AL: "Production of new fennel hybrids for improving bulb yield and quality [Foeniculum vulgare Mill.] = Ottenimento di ibridi F1 di finocchio per il miglioramento del grumolo [Foeniculum vulgare Mill.]",
ATTI V GIORNATE SCIENTIFICHE S.O.I. (2000) = [5. SCIENTIFIC MEETING OF ITALIAN HORTICULTURAL SOCIETY], SIRMIONE, BRESCIA (ITALY), 28-30 MAR 2000, vol. 1, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 159-160, XP009167785,
EP-A1-0771523
WO-A1-8607379
JIHONG LIU ET AL: "Intergeneric somatic hybridization and its application to crop genetic improvement", PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 82, no. 1, 1 July 2005 (2005-07-01), pages 1944, XP019268591, ISSN: 1573-5044
GEORG MELCHERS ET AL: "One-step
generation of cytoplasmic male sterility by fusion ofmitochondrial-inactivated tomato protoplasts with nuclear-inactivated Solanum protoplastsv",
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 89, 1 August 1992 (1992-08-01), pages 68326836, XP007922066, ISSN: 0027-8424
(57) Данное изобретение относится к способам получения обладающих цитоплазматической мужской стерильностью растений Petroselinum crispum, обладающим цитоплазматической мужской стерильностью растениям Petroselinum crispum и к семенам, клеткам, тканям и частям указанного растения. Конкретно данное изобретение относится к способу получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, содержащему слияние первых протопластов, полученных из растения Foeniculum vulgare Mill., имеющих, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, со вторыми протопластами, полученными из растения Petroselinum crispum, имеющими, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифицированный ядерный геном, и регенерацию из слитых протопластов обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum.
Данное изобретение относится к способам получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, обладающим цитоплазматической мужской стерильностью растениям Petroselinum crispum и к семенам, клеткам, тканям и частям указанного растения.
Petroselinum crispum или петрушка принадлежит к семейству зонтичные или сельдерейные. Членами этого семейства являются плосколистная петрушка (P. crispum var. neapolitanum), петрушка с закручивающимися листами (P. crispum var. crispum) и петрушка Hamburg или корневая петрушка (P. crispum var. tuberosum).
Петрушка листового типа часто применяется в качестве гарнира и имеет типичный аромат, вызванный типичными летучими маслами, подобными миристицину, и флавоноидами в виде апиина.
Корневая петрушка имеет длинный, мясистый, белый стержневой корень, обычно применяемый в качестве овоща или используемый в супах или рагу. Корень богат каротином, витаминами В2 и С. Листья растения готовят подобно листовой петрушке. Корневая петрушка особенно популярна в Германии, Австрии, Венгрии и России. В Западной Европе эта культура в настоящее время является заново открываемой, особенно в органическом плодоводстве.
Другими членами семейства зонтичные являются, например, пастернак (Pastinaca sativa), морковь (Daucus carota L.), сельдерей (Apium graveolens L.), фенхель (Foeniculum vulgare Mill.), тмин (Carum carvi), анис (Pimpinella anisum), укроп (Anethum graveolens) и кориандр (Coriandrum sativum).
Для культивации петрушки в настоящее время доступны только перекрестноопыляющиеся кросс-бредные сорта. В результате отсутствия мужской стерильности или, например, самонесовместимости сельскохозяйственной культуры невозможно образование F1 гибридов.
F1 гибриды в целом обладают преимуществами над перекрестноопыляющимися культурами. В соответствии с руководством "Principles of Plant Genetics and Breeding" by G. Acquaah (Blackwell Publishing, ISBN-13: 978-1-4051-3646-4; 2007; chapter 18) гибридный сорт представляет собой F1 приплод планированного скрещивания между инбредными линиями. Критическое требование к производству гибридов заключается в том, что родители должны быть неидентичными. Эта дивергенция придает гибридам их превосходящие характеристики из-за задействования гетерозиса или гибридной силы. Гибридная сила может быть определена как увеличение размера, силы, плодородия и общей производительности гибридного растения по сравнению со средней производительностью двух родительских растений (Ibid, pages 334-335).
Пригодность F1 гибридов для петрушки считается имеющей преимущество над существующими в настоящее время перекрестноопыляющимися кроссбредными сортами по ряду причин. F1 гибриды по сравнению с доступными перекрестноопыляющимися сортами обычно имеют улучшенную всхожесть, более высокие урожайности, большую силу и/или высокое единообразие.
В целом F1 гибриды сельскохозяйственной культуры могут быть продуцированы с применением обладающих мужской стерильностью родительских линий, которые являются, по существу, неспособными самоопыляться и применяются в качестве материнских линий. Альтернативой, известной для культур Brassica, является применение самонесовместимых растений, которые не могут самоопыляться и, следовательно, это делает возможным производство F1 гибридов.
Обладающие мужской стерильностью родительские линии предоставляют генетическую композицию потомства, так как наследование признаков, по сути, фиксировано. Половина ядерного генетического материала потомства, т. е. ядерного генома, происходит от мужской родительской линии (обладающей мужской фертильностью), тогда как другая половина ядерного генетического материала потомства, т.е. ядерного генома, происходит от женской (обладающей мужской стерильностью) родительской линии, из которой получено семя F1.
Растения петрушки, однако, обычно являются как мужскими, так и женскими (т.е. однодомными), и отсутствие обладающих мужской стерильностью родительских растений, таких как в перекрестноопыляющихся кроссбредных сортах, делает невозможным на 100% достоверное предсказание генетической структуры или (ядерного) генотипа потомства. По меньшей мере, некоторое потомство в отсутствие обладающих мужской стерильностью растений в результате самоопыления содержит генетический материал или ядерный геном, происходящий только из одной родительской линии.
Термин "гибрид", "F1 гибрид" или "цибрид" часто применяется в данной области для обозначения того, что растения, к которым это относится, являются гетерозиготными, по меньшей мере, по нескольким (коммерчески интересующим) генотипическим признакам. Обычно "гибрид", "F1 гибридный" или " цибрид" обозначается в данной области как содержащий гетерозиготный ядерный геном.
Мужская стерильность у растений обычно относится к цитоплазматической мужской стерильности, в которой определяющий генетический фактор расположен в цитоплазме. Для многих растений продемонстрировано, что этот определяющий генетический фактор находится в митохондриях и обычно заключает в себе мутацию в митохондриальной ДНК.
Митохондрии наследуются потомством через яйцеклетку или, другими словами, женским наследованием и не посредством пыльцы или, другими словами, мужским наследованием. Цитоплазматическую мужскую стерильность также обозначают в данной области абревиатурой ЦМС.
В некоторых растениях помимо цитоплазматической мужской стерильности также наблюдается
ядерная (мужская) стерильность. Для ядерной (мужской) стерильности, в отличие от цитоплазматиче-ской кодируемой стерильности, генетический фактор в ядерном геноме или ДНК ядра ответствечает за наблюдаемую стерильность. Эта ядерная стерильность может относиться к мужской, женской или общей стерильности.
Оба типа стерильности, т.е. цитоплазматическая мужская стерильность и ядерная (мужская) стерильность могут быть легко определены. Цитоплазматическая мужская стерильность наследуется только через женскую родительскую линию. В отличие от этого, в качестве неотъемлемого результата присутствия в ядре ядерная стерильность обычно проявляет наследование по Менделю.
Посредством применения ЦМС перекрестное опыление будет приводить в результате к на 100% " чистым" или "настоящим" F1 гибридам. В отличие от этого, при применении нормальных однодомных растений петрушки в следующем поколении будет происходить некоторый процент самоопыления.
Фенхель является разновидностью семейства сельдерейные, в котором ЦМС является общим признаком, применение F1 гибридов для фенхеля является общеизвестным. В фенхеле не известен ни один ген, который восстанавливает фертильность; следовательно, он является идеальным источником ЦМС.
Было продемонстрировано, что возможно получить скрещивание между петрушкой и фенхелем. Другими словами, скрещивание, в котором одна родительская линия, опылитель, является петрушкой и другая родительская линия является ЦМС фенхелем. Однако это скрещивание оказалось очень неэффективным. Вместо ожидаемого количества из по меньшей мере 2500 семян только очень ограниченное количество семян могло быть получено посредством цветения этих растений в присутствии мясных мух. Также большинство этих семян являлись нежизнеспособными. После прорастания семени требуемое потомство действительно было получено.
Хотя, в конечном счете, при помощи эмбрионального спасения это полученное потомство могло быть скрещено в дальнейшем с петрушкой, тем самым уменьшая количество ядерного генома фенхеля, после нескольких генераций возвратного скрещивания требовалась инбредная генерация, осуществляемая самоопылением.
С применением инбредной генерации, по сути, возможно отбирать потомство, имеющее требуемый фенотип (геном петрушки без характеристик фенхеля). Несмотря на это, большое количество поколений все еще будет содержать небольшие количества фенхеля ДНК, приводя к нежелательной характеристике или признакам в полученном гибриде. Нельзя предсказать, в какой временной точке эта остающаяся ДНК фенхеля будет элиминирована из ядерного генома.
Однако в данном случае для обладающего цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) фенхеля требуемая инбредная генерация гибрида фенхель-петрушка невозможна из-за того, что растения, необходимые для этого, обязательно являются обладающими мужской стерильностью, следовательно, осуществление инбредной генерации технически невозможно.
Принимая во внимание среди прочего вышеприведенные преимущества F1 гибридов, такие как улучшенная всхожесть, более высокие урожайности, большая сила и/или более высокое единообразие, в данной области существует потребность в предоставлении цитоплазматических, обладающих мужской стерильностью (ЦМС) растений Petroselinum crispums.
Соответственно среди прочих задач задача данного изобретения заключается в удовлетворении этой потребности.
Вышеприведенная потребность среди прочих потребностей удовлетворена в соответствии с первым аспектом данного изобретения предоставлением способа, как определено в п.1 прилагаемой формулы изобретения.
Особым образом вышеприведенная потребность среди прочих потребностей удовлетворена в соответствии с первым аспектом данного изобретения посредством способа для предоставления обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, содержащего
a) предоставление первых протопластов, полученных из растения, выбранного из группы, состоящей из Daucus carota L., Foeniculum vulgare Mill., Apium graveolens L. и Pastinaca sativa L., где первые разновидности протопластов имеют, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму по сравнению с растительными клетками, из которых они произведены; эти первые протопласты могут также быть обозначены как донорные протопласты;
b) предоставление вторых протопластов, полученных из растения Petroselinum crispum, в котором вторые протопласты имеют, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немодифици-рованный ядерный геном по сравнению с растительными клетками, из которых они произведены; эти вторые протопласты могут также быть обозначены как акцепторные протопласты;
c) слияние указанных первых и вторых протопластов с получением слитого продукта между акцепторным протопластом и донорным протопластом;
d) получение обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum из слитого продукта указанной первой и второй разновидности протопластов и необязательно
e) получение гибрида скрещиванием полученного обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum по этапу (d) с однодомным растением P. crispum.
В контексте данного изобретения растительный гибрид, гибрид F1 или цибрид являются растения
ми, которые содержат, по меньшей мере, гетерологичные или чужеродные органеллы, такие как митохондрии или хлоропласты. Другими словами, этот растительный гибрид, гибрид F1 или цибрид содержит органеллы, происходящие из другого растительного сорта, и эти органеллы не обнаруживаются в этих растениях в природе. Растительный гибрид, гибрид F1 или цибрид могут также быть обозначены как растения, которые, по меньшей мере частично, содержат цитоплазму, которая происходит или получена из другого сорта или разновидности.
Генотип ядра растений в соответствии с данным изобретением, по существу, является идентичным одному из родительских растений, а именно акцепторному растению. Однако ДНК цитоплазмы растений в соответствии с данным изобретением отличается от этого родительского растения. Эта цитоплазма, по меньшей мере частично, получена от другого родительского растения, донорного растения. Это другое родительское растение является растением другого сорта или разновидности, чем первое родительское растение.
Технологии и способы для предоставления протопластов, т.е. растительных клеток с, по меньшей мере частично, удаленной клеточной стенкой известны в данной области. В целом протопласты получают расщеплением выделенных растительных клеток или тканей со смесью подходящих разрушающих полисахарид ферментов, таких как целлюлазы, пектиназы и/или ксиланазы.
Технологии и способы слияния или комбинирования имеющихся протопластов известны в данной области. Слияние протопластов, например, может быть обеспечено комбинированием имеющихся протопластов в смеси и впоследствии подверганием этой смеси электрошоку или подверганием этой смеси композиции, содержащей полимер, такой как полиэтиленгликоль, и катион, такой как Ca2+, со щелочным
pH.
Технологии и способы для предоставления растения из имеющегося слитого продукта известны в данной области. Имеющийся слитый продукт может, например, быть стимулирован применением гормонов для генерирования клеточных стенок, для формирования каллуса впоследствии и регенерирования в полноценные растения. Предоставление необязательно может содержать, как, например, в случае предоставления F1 гибрида, один или более общепринятых этапов скрещивания, предпочтительно с сортами петрушки, представляющими коммерческий интерес.
Термин "инактивированный ядерный геном" в контексте данного изобретения обозначает ядерный геном, который больше не способен к митозу и/или мейозу. Другими словами, протопласт или растительная клетка, произведенная из него, с "инактивированным ядерным геномом" больше не являются способными к клеточному делению. Данная инактивация ядерного генома, например, может быть обеспечена посредством применения радиационной обработки данных протопластов с рентгеновской (X) или гамма (у) радиацией. Альтернативно ядро клетки может быть удалено ультрацентрифугированием в градиенте плотности.
Термин "инактивированная цитоплазма" в контексте данного изобретения обозначает, что органел-лы в цитоплазме больше не способны к участию в клеточном делении. Другими словами, протопласт или растительная клетка, произведенная из него, с "инактивированной цитоплазмой" больше не является способной к клеточному делению. Данная инактивация цитоплазмы, к примеру, может быть обеспечена посредством подвергания данных протопластов реагентам, таким как йодацетамид или йодацетат.
Термин " немодифицированная цитоплазма" в контексте данного изобретения обозначает, что цитоплазма, по существу, подобна цитоплазме исходной клетки. Другими словами, протопласты с "немоди-фицированной цитоплазмой" рассматриваются как первоначальная цитоплазма, независимо от клетки, из которой произведен протопласт.
Термин "немодифицированный ядерный геном" в контексте данного изобретения обозначает, что ядерный геном, по существу, подобен ядерному геному исходной клетки. Другими словами, протопласты с "немодифицированным ядерным геномом" рассматриваются как обладающие первоначальным ядерным геномом, независимо от ядерного генома клетки, из которой произведен протопласт.
Посредством применения данного способа кодируемая ядром генетическая композиция или ядерный геном вторых протопластов, по существу, не изменяется. В результате обладающее цитоплазматиче-ской мужской стерильностью растение Petroselinum crispum предоставляется непосредственно, без необходимости в дальнейших (возвратных) этапах скрещивания.
Однако дополнительные этапы скрещивания могут быть применены для добавления дополнительных (представляющих коммерческий интерес) признаков данному обладающему цитоплазматической мужской стерильностью растению Petroselinum crispum. Эти скрещивания также охватываются данным изобретением при условии, что потомство сохраняет цитоплазматическую мужскую стерильность.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения донорное растение, выбранное из группы, состоящей из Daucus carota L., Foeniculum vulgare Mill., Apiurn graveolens L. и Pastinaca sativa L., имеет фенотип с цитоплазматической мужской стерильностью.
В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления данного способа способ дополнительно после этапа (c) или (d) содержит отбор диплоидных слитых продуктов и/или диплоидных растений.
В ряде случаев некоторые слитые продукты и/или растения, полученные после слияния протопла
стов, имеют уровень девиантной плоидности, такой как тетраплоидный, октаплоидный и иногда анеуп-лоидный уровень. Эти девиации часто в результате приводят к нежелательным растениям, таким как обладающие женской стерильностью растения. Следовательно, выгодно отбирать только такой слитый продукт и/или растения, например проточной цитометрией, которые с точки зрения содержания ядерной ДНК являются подобными диплоидному акцепторному растению.
Дополнительно проточная цитометрия предоставляет возможность детектировать и впоследствии элиминировать встречающиеся генетические девиации, такие как неожиданный и нежелательный ядерный геномный материал от первых протопластов, обнаруживаемых в слитом продукте.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления данного способа вышеприведенные описанные первые протопласты получены из Foeniculum vulgare Mill., предпочтительно из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления данного способа вышеприведенные описанные первые протопласты, имеющие, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, получают подверганием ионизирующей радиации, предпочтительно гамма-радиации, с дозой по меньшей мере 200 Гр, предпочтительно по меньшей мере 300 Гр и более предпочтительно по меньшей мере 400 Гр.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления данного способа вышеприведенные описанные вторые протопласты имеют, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, неинактивированный ядерный геном посредством подвергания воздействию йодацетамида, предпочтительно в концентрации по меньшей мере 5 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 10 мМ, наиболее предпочтительно по меньшей мере 15 мМ.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного способа этап (с) содержит опосредованное полиэтиленгликолем слияние протопластов.
Данный способ преимущественно предоставляет обладающие мужской цитоплазматической стерильностью растения Petroselinum crispum. Следовательно, в соответствии с дальнейшим аспектом данное изобретение относится к обладающему цитоплазматической мужской стерильностью растению Pet-roselinum crispum, получаемому по данному способу, содержащему митохондрии и/или хлоропласты, полученные из растения, предпочтительно обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения, выбранного из группы, состоящей из Daucus carota L., Foeniculum vulgare Mill., Apium graveo-lens L. и Pastinaca sativa L, предпочтительно содержащего митохондрии и/или хлоропласты, полученные из Foeniculum vulgare Mill.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого аспекта первый протопласт получен из растения Foeniculum vulgare Mill. с номером доступа NCIMB 42055 (депонировано 26 сентября, 2012 в NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9Ya, UK) и/или второй протопласт получен из растения Petroselinum crispum var. tuberosum с номером доступа NCIMB 42056 (депонировано 26 сентября, 2012 в NCIMB Ltd).
В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение относится к применению обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum в соответствии с данным изобретением для предоставления F1 гибридов Petroselinum crispum.
В соответствии с еще одним другим аспектом данное изобретение относится к семенам, частям растения, тканям или клеткам, полученным из или происходящим из имеющегося растения ЦМС петрушки, как описано выше.
В соответствии с еще одним другим аспектом данное изобретение относится к применению цитоплазмы, полученной из растения, предпочтительно обладающего мужской цитоплазматической стерильностью, выбранного из группы, состоящей из Daucus carota L., Foeniculum vulgare Mill., Apium graveolens L. и Pastinaca sativa L., предпочтительно Foeniculum vulgare Mill., для предоставления обладающего ци-топлазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum.
Данное изобретение в дальнейшем подробно описано в следующих примерах предпочтительных вариантов осуществления. В примерах осуществлены ссылки на прилагаемые фигуры.
Фиг. 1 демонстрирует изображение гель-электрофореза продуктов амплификации. Треки 1 и 2 демонстрируют "беглецов", т.е. растения из клеточного слияния, демонстрирующие модель цитоплазмы петрушки; треки 3-8, 10 и 11 демонстрируют слитые растения в соответствии с данным изобретением, таким образом это является петрушкой с цитоплазмой фенхеля; трек 9 демонстрирует маркер ДНК 100 п.о.; треки 12-15 демонстрируют первоначальный акцепторный материал петрушки и треки 16 и 17 демонстрируют донорный материал фенхеля.
Фиг. 2 демонстрирует репрезентативную проточную цитограмму фенхеля.
Фиг. 3 демонстрирует репрезентативную проточную цитограмму петрушки.
Фиг. 4 демонстрирует репрезентативную проточную цитограмму гибрида из фенхеля и петрушки в соответствии с данным изобретением. Примеры.
Пример 1. Общий протокол.
Семена P. crispum var. Tuberosum (акцептор), а также семена донорного растения стерилизовали по
следующей обработкой с горячей водой, промывкой с 70% этанолом и обработкой с разбавленным бытовым отбеливателем. После споласкивания семян стерильной водой семена проращивали на MS30 или подобной среде.
Использовали только черешки из проростков. Протопласты выделяли обработкой материала после предварительного плазмолиза с разрушающими клеточную стенку ферментами, такими как пектиназа и целлюлаза в плазмолизирующем растворе. После фильтрации и центрифугирования протопласты доноров обрабатывали гамма радиацией. Протопласты акцепторов обрабатывали йодацетамидом (IOA). Обе разновидности протопластов комбинировали и впоследствии сливали. Во время полиэтиленгли-коль(ПЭГ)-опосредованного слияния протопласты не перемешивали, для того чтобы избежать нарушение процесса слияния.
После слияния ПЭГ постепенно вымывали и протопласты заливали в альгинат. Срезы отвердевшей среды с альгинатом, которые включали в себя слитые протопласты, переносили в жидкую среду, стимулирующую клеточное деление. В этой среде присутствовали сахар в виде глюкозы и гормоны в виде 2,4D, зеатина и им подобного.
После появления каллуса микрокаллусы удаляли из отвердевшей среды с альгинатом и переносили в среду для роста твердого каллуса. После достижения диаметра 8 мм и некоторой степени позеленения каллусы переносили на среду для регенерации. Регенерированные каллусы переносили на свежую среду для регенерации каждые 3 недели. На этой среде развивались черенки стебля и иногда соматический зародыш. Развившиеся черенки стебля помещали в среду BBW для укоренения. Соматический зародыш помещали в среду для роста зародыша и впоследствии помещали на MS30 или подобную среду.
Во время переноса из среды для клеточного деления (СРР) посредством среды для роста (CPPD) в среду для регенерации (M2+) и, в конечном счете, среду MS30 осмотическая концентрация среды постепенно снижалась.
Уровень плоидности полученных растений исследовали посредством определяющей относительное содержание ДНК проточной цитометрии образца листа. Растения с относительным содержанием ДНК, которое соответствует содержанию ДНК в первоначальных растениях петрушки, сохраняли, все другие растения уничтожали.
Сохраненные растения в дальнейшем анализировали посредством применения молекулярных биологических технологий. С применением ДНК, выделенных из листа, проверяли наличие требуемых митохондрий (т. е. от донора) посредством праймеров для ПЦР, являющихся специфичными к митохондри-альной ДНК фенхеля. Растения с цитоплазмой акцепторов (которые можно было считать беглецами) выбраковывали.
Остающиеся растения поддерживали скрещиваниями в тепличных и полевых условиях с исследованием их практической применимости. Характеристиками, представляющими интерес, являлись мужская стерильность, формирование семени и качество растения.
Пример 2. Поверхностная стерилизация семени.
Каждое из семян корневой петрушки (Petroselinum crispum var. tuberosum) в качестве акцептора и из фенхеля (Foeniculum vulgare Mill.) в качестве донора помещали в отдельные чайные сита. Сита помещали в водяную баню с 50°C на 10 мин. Впоследствии чайные сита погружали в смесь, состоящую из 70% этанола и 30% воды на 10 с. За этим следовала 20 мин обработка с 0,3% (мас./об) NaOCl+0,01% Tween 80. Эту и все следующие обработки выполняли в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха.
Впоследствии чайные сита с семенами промывали 3 раза со стерильной водой в течение 1, 3 и 5 мин соответственно.
Пример 3. Посев стартового материала для выделения протопластов.
Семена акцептора и донора отбирали из чайных сит примера 2 в стерильных условиях и помещали в среду MS30 в стеклянные контейнеры. Контейнеры с 8 семенами в каждом помещали в помещение с микроклиматом при 25°C (16 ч света, 4000 люкс). После от 3 до 5 недель проросшие растения были пригодны для выделения протопластов.
Пример 4. Выделение протопластов.
Черешки проросших акцепторных растений собирали в чашках Петри диаметром 9 см с 15 мл MLP. Когда все черешки были собраны, эти черешки разрезали на куски со средней длиной 1,5 мм.
Черешки проросших донорных растений также собирали и разрезали в MLP. Однако когда количества доступного материала было недостаточно (к примеру, в результате слабого прорастания семени), добавляли сами листья.
Раствор MLP удаляли аспирацией и замещали на 20 мл свежего раствора фермента в расчете на чашку Петри. Этот раствор фермента имеет очень специфичную силу тяжести по отношению к протопластам. Чашки Петри инкубировали при 25°C в течение ночи в темноте. Их помещали на орбитальный встряхиватель с амплитудой 15 мм и скоростью 30 об./мин. После этого инкубирования суспензии фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 110 мкм и 53 мкм соответственно. Фильтрат переносили в 12 мл пробирки для центрифугирования, в которые переносили 8 мл фильтрата в расчете на пробирку.
На этот слой суспензии фермент-протопласты осторожно пипетировали 3 мл промывочного раствора
W5 (с более низкой специфической силой тяжести) с последующим центрифугированием в течение 7 мин при 100xg. После центрифугирования полосы чистых протопластов были различимы в пробирках на границе раздела фермента и промывочного раствора. Разрушенные протопласты, клеточные стенки и им подобное собирали на дне пробирки.
Полосу, содержащую протопласты, собирали с применением пипетки и в новые пробирки собирали максимальное количество 4 мл суспензии. В эти пробирки добавляли дополнительный промывочный раствор W5 до конечного объема 12 мл. Пробирки центрифугировали снова с течение 7 мин при 100xg, и впоследствии промытые протопласты становились различимы в виде осадка на дне пробирки. Жидкий супернатант декантировали и протопласты осторожно ресуспендировали в конечном объеме промывочного раствора W5 11 мл.
Из каждой суспензии (донорной и акцепторной) отбирали 1 мл в качестве контроля. Образец этого контроля подвергали обсчету с применением гемоцитометра для определения общего количество выделенных протопластов.
Пробирку с протопластами доноров заворачивали в алюминиевую фольгу и помещали на лед. Гамма облучение выполняли с применением радиации с дозой 400 Гр. После радиации образец культивировали отдельно в качестве контроля.
Протопласты акцептора обрабатывали следующим образом: из соответствующего стокового раствора в W5 IOA добавляли до конечной концентрации 15 мМ. Инкубирование выполняли при комнатной температуре. Инкубирование прекращали центрифугированием протопластов, декантированием супер-натанта и ресуспендированием протопластов в промывочном растворе W5. Общее количество времени инкубирования составляло 15 мин, включая время центрифугирования.
Впоследствии акцепторные протопласты промывали один раз с промывочным раствором W5 при помощи центрифугирования. После этой обработки IOA отбирали контрольный образец обрабатываемых клеток и культивировали отдельно.
Пример 5. Слияние протопластов.
Протопласты из обеих суспензий протопластов смешивали в соотношении 1 акцептор:2 донорных протопласта. Эту суспензию распределяли в достаточное количество 10 мл пробирок для анализов таким образом, что в каждой тестовой пробирке содержался 1 млн протопластов.
После центрифугирования (7 мин при 100xg) объем доводили до 0,3 мл. К этой суспензии протопластов добавляли 400 мкл раствора ПЭГ. Предоставляли пробиркам с протопластами возможность отстаиваться 30 мин без возмущающего воздействия. Впоследствии добавляли 800 мкл разбавляющего раствора ПЭГ с последующим этапом ожидания 15 мин.
Затем в каждую пробирку добавляли 5 мл раствора CPW/Ca++ с последующим центрифугированием (7 мин при 100xg, без замедления впоследствии). Супернатант осторожно декантировали и осадок ресус-пендировали в 5 мл свежего раствора CPW/Ca++ и центрифугировали снова в тех же условиях.
После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 10 мл раствора установленного раствора А в расчете на пробирку. Клетки промывали при помощи центрифугирования, ресуспендировали в уравновешенном растворе А и центрифугировали снова, как описано выше. В конечном счете, клетки комбинировали в одной или, когда необходимо, в большем количестве 50 мл пробирок для анализа и ресуспен-дировали в уравновешенном растворе А до достижения плотности 400000 клеток на мл.
К этой суспензии добавляли равный объем раствора альгината и впоследствии суспензию высевали частями по 800 мкл на маленькие чашки Петри (ф 6 см) с раствором В. После 1 ч капли затвердевали из-за полимеризации альгината.
Пример 6. Регенерация.
Альгинатные срезы со слитыми протопластами промывали в среде СРР и переносили на чашки Петри со свежей средой СРР. Применяли 5 мл среды СРР в расчете срез 800 мкл. Еженедельно полную среду обновляли удалением старой среды аспирацией и добавлением свежей среды на чашки Петри. После приблизительно 3 недель были генерированы каллусы. В момент, когда эти каллусы достигали диаметра приблизительно 3 мм, их удаляли из альгината. Для этого срезы разрезали на 8 частей и среду замещали 15 мл 50 мМ Na-цитратного раствора. Чашки Петри помещали на орбитальный встряхиватель с амплитудой 15 мм и скоростью 30 об/мин.
После 1 ч альгинатный матрикс разрушали и каллусы высвобождали, собирали при помощи центрифугирования (7 мин при 100xg) и помещали на твердую среду CPPD. После 1 недели адаптации чашки Петри помещали на свет. Каждые 3 недели растущие каллусы переносили на свежую среду. В момент, когда каллусы зеленели и достигали диаметра приблизительно 8 мм, их помещали на среду для регенерации M2+. Каждые 3 недели среду обновляли переносом каллусов на новые чашки Петри с той же средой.
Стеблевые черенки, которые генерировались на среде, подвергали ускорению в среде BBW. Появлявшийся соматический зародыш помещали в среду MS20-GA3. Зрелые растения, выращенные на этой среде, переносили в среду MS20. Когда укорененные растения достигали 3-листовой стадии, их переносили в почву для дальнейшего развития в теплице.
Пример 7. Проточная цитометрия.
Уровень плоидности регенерированных растений определяли проточной цитометрией. С этой целью образец известного диплоидного растения измеряли в качестве стандарта и образцы регенерированных растений сравнивали с ним. Для каждого растения отбирали часть 1 см2 листа и разрезали в буфере DAPI (Partec, Munster, Germany) с применением лезвия бритвы.
Образец фильтровали с применением фильтра 30 мкм CellTrics(r) (Partec) и измеряли с Partec PA (Partec, Munster, Germany). Результаты продемонстрировали относительную величину плоидности по отношению к контролю. В дальнейшей экспериментальной работе применяли только растения с диплоидной моделью корневой петрушки.
Пример 8. Молекулярные исследования.
Для растений с доказанным диплоидным характером определяли наличие фрагмента ДНК, представляющего интерес (из цитоплазмы фенхеля и, следовательно, относящегося к требуемому признаку ЦМС).
Образец листа или каллуса с массой от 100 до 200 мг замораживали в пробирке эппендорф при -20°C. После размораживания образец размельчали в 350 мкл буфера для экстракции ДНК. Впоследствии добавляли дополнительное количество 350 мкл буфера для экстракции ДНК. После центрифугирования (10 мин при 10000xg) супернатант декантировали и осадок переносили в 125 мкл буфера для экстракции ДНК. После этого посредством смешивания добавляли 175 мкл буфера для ядерного лизиса и 60 мкл 10% N-лаурилсаркозина.
Эту смесь инкубировали при 65°C в течение 20 мин с последующей экстракцией с 50-100 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт. Экстракт центрифугировали при 10000xg в течение 10 мин и суперна-тант переносили в новую пробирку эппендорф. 500 мкл изопропанола с температурой -20°C добавляли в эту пробирку для анализа и пробирку центрифугировали при 10000xg в течение 2 мин.
После декантирования супернатанта осадок промывали с 100 мкл 70% этанола (4°C) и после высушивания осадок растворяли в 125 мкл буфера ТЕ. В конечном счете этот раствор ДНК разбавляли (10x) стерильной водой.
Выделенную цитоплазматическую ДНК анализировали посредством технологии ПЦР на наличие характерного фрагмента. Для каждой комбинации донор-акцептор разрабатывали протокол для обеспечения отчетливого различения между обоими возможными партнерами по слиянию.
8 72°С 5 мин
9 2 0°С 2 0 мин
вать, например, посредством гель-электрофореза. Применяемые агарозные гели были составлены из 1,5%-агарозного буфера TAE и обеспечены бромидом этидия для визуализации полос ДНК с применением УФ света. Иллюстративные результаты такого гель-электрофореза полученных амплификацией продуктов продемонстрированы на фиг. 1. Фиг. 1 демонстрирует, что растения в соответствии с данным изобретением (треки 3-8, 10 и 11) обеспечивали цитоплазматическую амплификацию продукта с идентичным размером продукта амплификации донорного растения фенхеля, тогда как продукт амплификации акцепторного растения корневой петрушки отсутствовал. Соответственно это демонстрирует, что фенотипически корневые растения петрушки в соответствии с данным изобретением имеют цитоплазму, полученную из фенхеля. Пример 10. Гибриды.
Десять выбранных корневых растений петрушки J10666 и десять обладающих мужской стерильностью растений фенхеля J531 яровизировали в незамораживаемой камере в течение зимы. Весной эти растения переносили вместе в теплицу. После визуальной проверки первых соцветий фенхеля на мужскую стерильность растения выделяли в непроницаемой для насекомых камере. В эти камеры помещали куколок крылатых насекомых, обеспечивая наличие крылатых насекомых для опыления. Когда необходимо, вводили новых куколок крылатых насекомых до тех пор, пока растения не завершали цветение.
Семена собирали после созревания обладающих мужской стерильностью растений фенхеля. Не-опыленное соцветие контрольного растения фенхеля не формировало семя. Это демонстрирует, что эти растения являлись действительно обладающими мужской стерильностью. Из всех собранных 39 семян только 1 семя проросло. Проточноцитрометрический и молекулярный анализ продемонстрировал, что это растение действительно являлось промежуточным между фенхелем и корневой петрушкой. Результаты проточноцитрометрического анализа продемонстрированы на фиг. 2-4, где третье изображение демонстрирует гибридный характер идентифицированного растения.
Композиция сред.
Если не указано иное, среды и растворы, приведенные ниже для тканевого культивирования, являлись подвергнутыми автоклавированию (при 120°С в течение 20 мин).
Среда MS20, MS30 в расчете на литр
Соли MS, включая витамины 4,4 0 грамма
(Duchefa, Haarlem, NL, art M0221)
Сахароза 20 resp. 30 граммов
Агар Daichin 8 граммов
рН 5, 8 Раствор фермента.
Раствор EKW, содержащий:
Целлюлаза R10 1,5% Мацерозим 0,1% рН 5,б; стерилизован фильтром
W5.
L. Menczel, F, Nagy, Z. Kiss и Р. Maliga. Theor. Appl. Genet 70: 590-594 (1981).
Раствор ПЭГ 50 мл
ПЭГ6000 15 граммов
Сахароза 2 грамма
СаС12 2Н20 0,075 грамма
рН 5,7; стерилизован фильтром
Разбавленный раствор ПЭГ 50 мл
Глицин 0,188 грамма
Глюкоза (Sigma) 2,7 грамма
СаС12 2Н20 0,368 грамма
рН 10,5 (доведен с Юн КОН); 520 мОсм/кг;
стерилизован фильтром
CPW/Ca++ 200 мл
CPW 10 x сток 20 мл
Маннит 13,3 грамма
СаС12-2Н20 1П7 грамма
рН 5,7; 53 0 мОсм/кг;
стерилизован фильтром CPW 10x стоковый раствор.
Frearson, Е. М., Power, J. В., Cocking Е. С. Developmental Biology, 33, 130-137 (1973).
Уравновешенный раствор А 250 мл
СаС12-2Н20 36, 8 мг
Маннит 19,7 грамма
рН 5,8, автоклавирован Раствор альгината; раствор В.
В. Damm, R. Schmidt and L. Willmitzer. Mol. Gen. Genet. 217: 6-12 (1989).
50 мм Na-цитратный раствор, MLP, EKW, CPP и CPPD.
R. Dirks, V. Sidorov and C. Tulmans: Theor. Appl. Genet. 93 809-815 (1996).
Среду CPP дополняли с 0,2 мг/л 2,4D и 0,1 мг/л зеатина.
Среду CPPD дополняли с 0,1 мг/л NAA и 0,2 мг/л зеатина.
М2+ среда в расчете на литр;
J.L. Vandemoortele, J.P. Billard, J. Boucaud and T.Gaspar (1994). Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent 59: 1455-1459 (1994).
Описанная среда M2 дополнена с 20 мг/л аденинсульфата и обозначена М2+.
Среда BBW в расчете на литр
Соли MS (Duchefa art М0221) 4,40 грамма
Сахароза 2 0 граммов
IAA 2 мг
Агар Daichin 8 граммов
рН 6, 0
MS2 0-GA3 в расчете на литр
Соли MS (Duchefa art М0221) 4,40 грамма
Сахароза 2 0 граммов
GA3 1 мг
Агар Daichin 8 граммов
рН 5, 8
ДНК буфер для экстракции. 0,35 М сорбит.
0,1 М основание Трис (pH 7,5).
0,005 М Na2-EDTA.
0,02 М NaHSO3 (свежедобавленный).
Буфер для ядерного лизиса.
0,2 М основание Трис (pH 7,5).
0,05 М Na2-EDTA. 2 М NaCl.
2% СТАВ (цетилтриметиламмония бромид). Хлороформ:изоамиловый спирт.
24 объема хлороформа + 1 объем изоамилового спирта. ТЕ буфер.
10 мМ Трис-NaOH (pH 8,0).
2 мМ Na2-EDTA.
NEB буфер 2, NEB буфер 3 и раствор BSA.
Получали у New England Biolabs, Ipswich, MA01938, USA. ТАЕ буфер (конечные концентрации). 40 мм трис-уксусная кислота, pH 8,5.
2 мМ Na2-EDTA.
Агароза 1,5% (мас./об). Бромид этидия 0,5 мкг/мл.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Bejo Zaden B.V.
<120> СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ОБЛАДАЮЩИХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ РАСТЕНИЙ PETROSELINUM CRISPUM, ОБЛАДАЮЩИХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ РАСТЕНИЙ PETROSELINUM CRISPUM И СЕМЯН И ИХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЧАСТЕЙ
<130> 4/2NJ60/17
<160> 5
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1 <211> 22 <212> ДНК
<213> искусственные последовательности
<220>
<221> источник
<222> 1..22
<223> /тип молекулы="ДНК"
/замечание="последовательность праймера p3558" /организм="искусственные последовательности"
<400> 1
caaaagtatg aaaagctgga gg 22
<210> 2 <211> 22 <212> ДНК
<213> искусственные последовательности
<220>
<221> источник
<222> 1..22
<223> тип молекулы="ДНК"
/замечание="последовательность праймера p7054" /организм="искусственные последовательности"
<400> 2
ccttttttga tcccgctgga gg 22
<210> 3 <211> 23 <212> ДНК
<213> искусственные последовательности
<220>
<221> источник
<222> 1..23
<223> /тип молекулы="ДНК"
/замечание="последовательность праймера p10987" /организм="искусственные последовательности"
<400> 3
cccaatcttt aaggaagaga tcg 23
<210> 4 <211> 22 <212> ДНК
<213> искусственные последовательности <220>
<221> источник <222> 1..22
<223> /тип молекулы="ДНК"
/замечание="последовательность праймера p10988" /организм="искусственные последовательности"
<400> 4
atgtctccgt cgctgacgtt cg 22
<210> 5
<211> 23 <212> ДНК
<213> искусственные последовательности
<220>
<221> источник <222> 1..23
<223> /тип молекулы="ДНК"
/замечание="последовательность праймера p11087" /организм="искусственные последовательности"
<400> 5
gtacgataga attcctcggt gcg 23
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Petroselinum crispum, включающий
слияние первых протопластов, полученных из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill., имеющих, по существу, инактивированный ядерный геном и, по существу, немодифицированную цитоплазму, со вторыми протопластами, полученными из растения Petroselinum crispum, имеющими, по существу, инактивированную цитоплазму и, по существу, немоди-фицированный ядерный геном;
регенерацию из слитых протопластов растения Petroselinum crispum, обладающего цитоплазматиче-ской мужской стерильностью.
2. Способ по п.1, в котором указанные первые протопласты получены из растения Foeniculum vulgare Mill NCIMB 42055.
3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором указанные вторые протопласты получены из растения Petroselinum crispum var. Tuberosum NCIMB 42056.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором слияние протопластов опосредованно полиэтиленглико-
лем.
5. Растение Petroselinum crispum, полученное способом по любому из пп.1-4, обладающее цито-плазматической мужской стерильностью и содержащее митохондрии и/или хлоропласты, из обладающего цитоплазматической мужской стерильностью растения Foeniculum vulgare Mill NCIMB 42055.
6. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. tuberosum.
7. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. crispum.
8. Растение Petroselinum crispum по п.5, представляющее собой Petroselinum crispum var. neapolita-
num.
9. Растение Petroselinum crispum по любому из пп.5-8, где растение Petroselinum crispum является гибридом.
10. Части растения, в том числе семена или ткани, полученные из растения по любому из пп.5-9.
File: 73170
оал\л\ ШАЪАЪ -lone:
Общий счет 446 lOUt* клеток/мл
I I
Пропускаемый счет: 78 (17,49%)
300 -счет
гт -
Пик Индекс Режим Среднее Площадь Площадь% CV%
15D -
100 -
0 50
100
150
200
260
300
' 1 ' 1 360
400
450 FL1600 ра^ес
РАК GAIN Ш 377.5 tin
i.am
L-L U-L Скорость ifii/cl 1.30 ZQ 999 Частота [l/cl 2
LfttlF 14] 68.6
print
Фиг. 2
File: 73163
02.11,11 Ш:40:09 ЛОХХ7Л
Общий счет 1011 ТУ У/*г клеток/мл
Пропускаемый счет: 71 (7,02%)
Пик Индекс Режим Среднее Площадь Площадь% CV%j
Л 1,000 21 22,39 79 7,81 25,68
2 4,40В 98 38,53 621 31,42 г,П
Разб.
1,000
print
Фиг. 4
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032108
- 1 -
032108
- 1 -
032108
- 1 -
032108
- 1 -
032108
- 4 -
032108
- 8 -
032108
- 9 -
032108
- 13 -
|
