EA 032102B1 20190430

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032102b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из (2S,4S)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил] метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил] метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты или их фармацевтически приемлемой соли.

2. Соединение по п.1, представляющее собой (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.

3. Соединение по п.2, представляющее собой (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту

4. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или соль по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

5. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для ингибирования активности киназы Aurora A.

6. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для лечения рака.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легких, рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака предстательной железы, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака шейки матки, рака головы и шеи, рака пищевода, рака яичников, немелкоклеточного рака легких и неходжкинской лимфомы.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой мелкоклеточный рак легких.

9. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак предстательной железы.

10. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы.

11. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак шейки матки.

12. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак головы и шеи.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

5. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для ингибирования активности киназы Aurora A.

6. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для лечения рака.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой мелкоклеточный рак легких.

9. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак предстательной железы.

10. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы.

11. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак шейки матки.

12. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак головы и шеи.

Евразийское <") 032102 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201790838
(22) Дата подачи заявки 2015.11.06
(51) Int Cl C07D 401/14 (2006.01) A61K31/4545 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)
(54) ИНГИБИТОР КИНАЗЫ AURORA A
(31) 62/079,742
(32) 2014.11.14
(33) US
(43) 2017.12.29
(86) PCT/US2015/059390
(87) WO 2016/077161 2016.05.19
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US)
(72) Изобретатель:
Генри Джеймс Роберт (US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Гизатуллина Е.М., Глухарёва А.О., Дементьев В.Н., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А.
(RU)
(56) WO-A1-2013129443 WO-A1-2009104802
(57) Изобретение обеспечивает аминопиридиновое соединение, выбранное из группы, I
состоящей из (28,48)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1Н-пиразол-3- I 1 ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
(2Я,4Я)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
или его фармацевтически приемлемую соль, которые ингибируют Aurora А и, следовательно, могут быть подходящими для лечения рака.
Область техники
Изобретение относится к аминопиридиновому соединению или его фармацевтически приемлемым солям, которые ингибируют Aurora А и могут быть подходящими для лечения рака.
Уровень техники
Киназы Aurora представляют собой семейство серин/треонинкиназ и являются ключевыми регуляторами митоза. Существует три человеческих гомолога киназ Aurora, А, В и С, из которых Aurora А участвует в раковых заболеваниях различного гистологического происхождения и в случае сверхэкспрессии может обладать онкогенными свойствами.
Анеуплодия или геномная нестабильность является одним из наиболее преобладающих признаков рака. В частности, эндоредупликация и последующая полиплоидия, вызванные ингибированием Aurora В, являются одним из главных путей геномной нестабильности. Кроме того, фенотип эндоредупликации ДНК/полиплоидии может сохраняться для многих клеточных делений без полного уничтожения раковых клеток. Альтернативно, селективное ингибирование Aurora А приводит к митотическому блоку во многих раковых клетках. В дальнейшем митотический блок зачастую развивается в апоптоз или гибель раковых клеток, что является гораздо более желательным качеством противоракового лекарства, чем эндо-редупликация ДНК/полиплоидия под действием ингибиторов Aurora В или двойных ингибиторов Aurora А/В. Кроме того, описано, что некоторые ингибиторы Aurora В и двойные ингибиторы Aurora А/В, проходящие клинические испытания, приводят к нейтропении и цитотоксичности костного мозга у пациентов, тогда как некоторые относительно селективные ингибиторы Aurora А, проходящие клинические испытания, не вызывают указанных расстройств. Следовательно, необходимо селективно ингибировать Aurora А и снижать или избегать ингибирования Aurora В или двойного ингибирования Aurora А/В. Таким образом, селективное ингибирование Aurora А может быть полезно для противораковой терапии.
Ингибиторы Aurora А известны в данной области техники. В WO 2008/026768, ЕР 2062887 и WO2009/104802 описаны некоторые аминопиридиновые соединения, обладающие селективным ингиби-рующим действием в отношении Aurora А. В WO 2013/129443 раскрыты некоторые пиперидиновые соединения, обладающие селективной ингибирующей активностью в отношении Aurora A.
Сохраняется потребность в обеспечении альтернативных ингибиторов Aurora A для лечения рака. Также сохраняется потребность в обеспечении селективных ингибиторов Aurora А, которые снижают или не вызывают ингибирование Aurora В или двойное ингибирование Aurora А/В. Соответственно, в настоящем изобретении предложены некоторые ингибиторы Aurora А, которые могут быть пригодны для лечения рака. Кроме того, в настоящем изобретении представлены некоторые селективные ингибиторы Aurora А, которые могут снижать ингибирование Aurora В или двойное ингибирование Aurora А/В.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении представлено соединение, которое представляет собой 1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпипери-дин-4-карбоновую кислоту
или ее фармацевтически приемлемую соль.
Подробное описание изобретения
(2R,4R)-1 - [(3 -Хлор-2-фторфенил)метил] -4-[[3 -фтор-6-[(5 -метил-1 И-пиразол-3 -ил)амино] -2-пиридил] метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
Предпочтительно в настоящем изобретении представлено соединение, которое выбрано из группы, состоящей из (28,48)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил] метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
или ее фармацевтически приемлемую соль.
В качестве конкретного варианта реализации, в настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой (2Я,4Я)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту.
В качестве конкретного варианта реализации, в настоящем изобретении предложено также соединение, которое представляет собой (28,48)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту.
В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метил-пиперидин-4-карбоновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция, содержащая (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпипери-дин-4-карбоновлй кислоты.
В настоящем изобретении предложена (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1И-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В настоящем изобретении предложена (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]ме-тил]-2-метилпиперидин-4-карбоновая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении рака. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения при лечении рака, содержащая (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.
В настоящем изобретении предложена также (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновая кислота для применения в терапии. В настоящем изобретении предложена (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновая кислота для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту.
В настоящем изобретении предложено применение (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для лечения рака. В настоящем изобретении предложено также применение (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты в производстве лекарственного средства для лечения рака.
В настоящем изобретении предложена трет-бутиламинная соль (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)
метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты в кристаллической форме. В настоящем изобретении предложена также трет-бутиламинная соль (2R,4R)-1-[(3 -хлор-2-фторфенил)метил] -4-[[3 -фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3 -ил) амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты в кристаллической форме, характеризующейся диаграммой порошковой рентгеновской дифракции с характеристическими пиками, выраженными в 28±0,2°, при 17,0° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 11,5, 23,2 и 15,0°.
В настоящем изобретении предложена аммониевая соль (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты в кристаллической форме. В настоящем изобретении предложена также аммониевая соль (2R,4R)-1-[(3 -хлор-2 -фторфенил)метил] -4-[[3 -фтор-6-[(5 -метил-1 ^пиразол^ -ил)амино] -2 -пиридил] метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты в кристаллической форме, характеризующейся диаграммой порошковой рентгеновской дифракции с характеристическими пиками, выраженными в 28±0,2°, при 4,6° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 13,8, 17,2 и 15,9°.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации способов и применений, описанных в настоящем документе, в которых рак выбран из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легких, рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака предстательной железы, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака шейки матки, рака головы и шеи, рака пищевода, рака яичников, немелкоклеточного рака легких и неходжкинской лимфомы. Предпочтительные виды рака представляют собой мелкоклеточный рак легких, рак предстательной железы, трижды негативный рак молочной железы, рак шейки матки и рак головы и шеи.
В настоящем изобретении предложена также (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновая кислота или ее фармацевтически приемлемая соль для применения при одновременном, раздельном или последовательном введении в комбинации с одним или более химиотерапевтическими агентами при лечении рака.
Следует понимать, что следующие термины, упомянутые выше и по всему тексту настоящего изобретения, если не указано иное, имеют следующие значения.
"Фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество" представляет собой среду, общепринятую в данной области техники для доставки биологически активных агентов млекопитающим, например, людям.
"Фармацевтически приемлемые соли" или "фармацевтически приемлемая соль" относится к относительно нетоксичной неорганической и органической соли или солям соединения согласно настоящему изобретению.
"Эффективное количество" означает количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящему изобретению, которое вызывает биологический или медицинский ответ или требуемый терапевтический эффект в ткани, системе, организме животного, млекопитающего или человека, наблюдаемый исследователем, ветеринаром, врачом или иным клиницистом.
Термины "лечение", "лечить", "лечащий" и т.п. включают замедление или реверсирование развития расстройства. Указанные термины включают также облегчение, улучшение, снижение, исключение или ослабление одного или более симптомов расстройства или патологического состояния, даже если указанное расстройство или патологическое состояние фактически не исключено и даже если прогрессиро-вание расстройства или патологического состояния само по себе не замедлено или не реверсировано.
Соединение согласно настоящему изобретению можно приводить во взаимодействие, например, с многочисленными неорганическими и органическими кислотами и основаниями с получением фармацевтически приемлемых солей. Такие фармацевтически приемлемые соли и общие методики их получения известны в данной области техники. См., например, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, том 66, № 1, январь 1977.
Соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно составляют в виде фармацевтической композиции, используя фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество, и вводят различными способами. Предпочтительно, указанные композиции предназначены для перорального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., ред., 21-ое изд., Mack Publishing Co., 2005).
Фактически вводимое количество соединения согласно настоящему изобретению определяет врач с учетом релевантных обстоятельств, включая патологическое состояние, подлежащее лечению, выбранный способ введения, фактическое вводимое соединение согласно настоящему изобретению, возраст, массу тела и реакцию индивидуального пациента, а также тяжесть симптомов пациента. Суточные дозы обычно составляют от примерно 1 до примерно 1000 мг. В некоторых случаях могут быть более подхо
дящими уровни доз, которые меньше нижнего предела вышеуказанного диапазона, а в других случаях могут быть использованы более высокие дозы. Уровни доз могут быть определены специалистом в данной области техники.
Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемые соли могут быть получены посредством многочисленных способов, известных в данной области техники, а также способов, описанных ниже в разделе "Способы получения и примеры". Конкретные стадии синтеза каждого из описанных способов могут быть различным образом комбинированы с получением соединений согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей.
Реагенты и исходные материалы обычно легкодоступны для специалистов в данной области техники. Другие реактивы могут быть получены по стандартным методикам органической и гетероциклической химии, методикам, известным специалистам в данной области техники, и способам, описанным ниже в разделе "Примеры", включая все новые способы. Настоящее изобретение дополнительно иллюстрировано далее в разделе "Способы получения и примеры". Если не указано иное, то названия и нумерация соединений, представленных в настоящем документе, были получены с помощью Accelrys Draw 4.1.
Индивидуальные изомеры, энантиомеры или диастереомеры могут быть выделены или разделены специалистами в данной области техники в любой удобной точке синтеза соединений при помощи таких способов, как технология селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques, et al., John Wiley and Sons, Inc., 1981)).
Специалистам в данной области техники понятно, что соединение согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один хиральный центр. В частности, соединение согласно настоящему изобретению содержит два хиральных центра. Настоящее изобретение включает все отдельные энантио-меры или диастереомеры, а также смеси энантиомеров и диастереомеров указанных соединений, включая рацематы.
Предпочтительно, что соединение согласно настоящему изобретению существует в виде одного энантиомера или диастереомера. Отдельный энантиомер или диастереомер может быть получен, исходя из хиральных реагентов или технологиями стереоселективного или стереоспецифического синтеза. Альтернативно, отдельный энантиомер или диастереомер может быть выделен из смесей стандартными технологиями хиральной хроматографии или кристаллизации.
Специалистам в данной области техники известно, что соединение с пиразолильным кольцом может существовать в виде пары таутомеров, в которых атом водорода может мигрировать между двумя атомами азота в пиразолильном кольце.
Соединение согласно настоящему изобретению может быть получено в соответствии со способами синтеза, хорошо известными и принятыми в данной области техники. Подходящие условия реакций для стадий указанных реакций хорошо известны в данной области техники, и подходящие замены растворителей и совместных реагентов известны специалистам в данной области техники. Таким же образом, специалистам в данной области техники понятно, что синтетические промежуточные соединения, при необходимости или желании, могут быть выделены и/или очищены различными общеизвестными технологиями, и что зачастую можно использовать различные промежуточные соединения непосредственно на следующих стадиях синтеза с незначительной очисткой или без очистки. Кроме того, опытным специалистам понятно, что в некоторых случаях порядок введения фрагментов не критичен. Конкретный порядок стадий, необходимых для получения соединения согласно настоящему изобретению, зависит от конкретного синтезируемого соединения, исходного соединения и относительной подвижности замещенных фрагментов, что понятно опытным химикам. Все заместители, если не указано иное, являются такими, как определено ранее, и все реагенты являются общеизвестными и принятыми в данной области техники.
В данном контексте следующие термины имеют указанные значения: "АДФ" означает аденозин-5'-дифосфат; "АТФ" означает аденозин-5'-трифосфат; "BSA" относится к альбумину бычьей сыворотки; "ДНК" относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте; "ДМСО" относится к диметилсульфоксиду; "DTT" относится к дитиотреитолу; "ЭДТА" относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; "ЭГТК" относится к этиленгликольтетрауксусной кислоте; "FBS" относится к эмбриональной бычьей сыворотке; "IVTI" относится к in vivo ингибированию мишени; "HEPES" относится к 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоте; "MEM" относится к минимальной необходимой среде; "MS" относится к масс-спектроскопии; "ЯМР" относится к ядерному магнитному резонансу; "PBS" относится к фосфатно-солевому буферному раствору; "MSR" относится к минимальному значимому соотношению; "PMSF" относится к фенилметилсульфонилфториду; "PNPP" относится к гексагидрату динатриевой соли 4-нитрофенилфосфата; "psi" относится к фунтам на квадратный дюйм; "SCLC" относится к мелкоклеточному раку легких. "TAME" относится к гидрохлориду метилового эфира №альфа-4-тозил^-аргинина; "TED" относится к предельной эффективной дозе; "TPCK" относится к тозил-фенилаланил-хлорметил-кетону.
Способ получения 1. Метил-2-метилпиперидин-4-карбоксилата гидрохлорид
H-CI
В реакционную емкость загружали PtO2 (11,5 г). Затем емкость продували N2 и смачивали уксусной кислотой (225 мл). К суспензии добавляли метил-2-хлор-6-метилпиридин-4-карбоксилат (125 г) и уксусную кислоту (1000 мл). Закрывали реакционную емкость, продували N2, а затем продували H2 и повышали давление H2. Нагревали реакционную смесь при 60°С при 60 psi водорода в течение 7 ч. Проводили две отдельные реакции в одинаковом масштабе и при одинаковых условиях. Фильтровали реакционную смесь после каждой реакции и объединяли фильтраты. Концентрировали фильтраты под вакуумом с получением густого маслянистого вещества, содержащего небольшое количество уксусной кислоты. К густому маслянистому веществу добавляли метил-трет-бутиловый эфир (2 л) и перемешивали при комнатной температуре. Собирали полученное твердое вещество, промывали метил-трет-бутиловым эфиром (2х 1000 мл) и сушили под вакуумом при 35 °С с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (400 г). 1Н ЯМР (CDCl3) 5 1,55 (д, J=6,3 Гц, 3H); 1,85 (к, J=12,3 Гц, 1H); 2,23-1,98 (м, 3H); 2,59-2,46 (м, 1H); 2,85 (дт, J=13,0, 3,5 Гц, 1H); 3,20-3,06 (м, 1H); 3,53 (ш д, J=12,6 Гц, 1H); 3,69 (с, 3H); 9,7 (ш с, 1H)
Способ получения 2. Метил-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилат
а bp
В трехгорлую круглодонную колбу (1 л) добавляли метил-2-метилпиперидин-4-карбоксилата гидрохлорид (205,4 г, 1,06 моль), 1-(бромметил)-3-хлор-2-фторбензол (261 г, 1,17 моль), ацетонитрил (2050 мл) и карбонат калия (293 г, 2,12 моль). Реакционную смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 18 ч. Затем прекращали нагревание, отфильтровывали твердые вещества, а затем промывали твердые вещества ацетонитрилом (2x250 мл). Концентрировали фильтрат под вакуумом с получением зеленого неочищенного продукта. Растворяли в метил-трет-бутиловом эфире (2500 мл), добавляли CELITE(r), перемешивали, затем фильтровали. Промывали фильтрат водой. Экстрагировали органические соединение 1,25н. водным раствором хлористоводородной кислоты (200 мл), затем 1М водным раствором хлористо-водородной кислоты (1000 мл). Объединяли водные экстракты и подщелачивали до рН ~ 12 с помощью 48% водного раствора гидроксида натрия (250 г). Экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром (3 л). Сушили органические вещества над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде коричневого маслянистого вещества (272,8 г). МС (m/z): 300 (М+1).
Способ получения 3. Метил-(2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилат
Разделяли энантиомеры метил-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилата (272,8 г), используя сверхкритическую жидкостную хиральную хроматографию. Неподвижная фаза: Chi-ralpak IC, подвижная фаза: 3% изопропилового спирта и 0,2% диметилэтиламина. Собирали первый элю-ированный энантиомер (RT = 1,73 мин.). Собирали второй элюированный энантиомер в качестве указанного в заголовке соединения (158 г, выход 49,7%; RT = 2,19 мин.; МС (m/z): 300 (М+1).). Аналитические условия: Неподвижная фаза: Chiralpak IC, подвижная фаза: 5% изопропилового спирта / 0,2% изопропи-ламина, поток 3 мл/мин., температура: 35°С.
Способ получения 4. Метил-(2К,4К)-2-метилпиперидин-4-карбоксилата гидрохлорид
В трехгорлую колбу объемом 4000 мл добавляли метил-(2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилат (250 г, 0,834 моль), 1,2-дихлорэтан (1200 мл) и 1-хлорэтилхлорформиат (112 мл, 1,04 моль). Перемешивали при 70 °С с помощью механической мешалки в течение 72 ч. Добавляли 1-хлорэтилхлорформиат (30 мл, 0,227 моль) и перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 6 ч. Оставляли смесь охлаждаться до 60°С и через капельную воронку добавляли метанол (250 мл) в течение 30-45 мин. Перемешивали при 60-65°С в течение 18 ч. Добавляли метанол (400 мл) и перемешивали при 65-68°С в течение 5 ч. Оставляли смесь охлаждаться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение ночи. Концентрировали под вакуумом до суспензии. Разбавляли суспензию этилацетатом (1500 мл) и перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Собирали твердые вещества и промывали этилацетатом (1000 мл) с получением указанного в заголовке соединения в виде серого твердого вещества (136,5 г, выход 84,5%). Н1 ЯМР (399,81 МГц, d6-ДМСО): 5 1,22 (д, J= 6,5 Гц, 3H), 1,531,43 (м, 1H), 1,73-1,62 (м, 1H), 1,99-1,91 (м, 2Н), 2,71-2,63 (м, 1H), 2,89-2,83 (м, 1H), 3,15-3,12 (м, 1H), 3,23-3,20 (м, 1H), 3,59 (с, 3H), 9,03 (ш с, 1H), 9,44 (ш с, 1H).
Способ получения 5. О1-трет-Бутил-О4-метил-(2R,4R)-2-метилпиперидин-1,4-дикарбоксилат
Добавляли метил-(2R,4R)-2-метилпиперидин-4-карбоксилата гидрохлорид (136 г, 0,702 моль) и ди-хлорметан (1500 мл) в трехгорлую круглодонную колбу объемом 4 л, оснащенную верхнеприводной мешалкой. Добавляли диизопропилэтиламин (250 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких минут. Добавляли 4-пиридинамин-^№диметил (9,0 г, 0,74 моль). Охлаждали на бане изо льда/воды. Медленно добавляли раствор ди-трет-бутилдикарбоната (192 г, 0,88 моль) в дихлорметане (300 мл) в течение ~30 мин, поддерживая температуру от 5 до 10°С. Оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Добавляли раствор 10% щавелевой кислоты (2 л) и перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Разделяли слои. Промывали органические вещества 5% щавелевой кислотой (1 л). Промывали органические вещества водой, затем насыщенным раствором NaCl, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали под вакуумом. Растворяли в дихлорметане (250 мл). Наносили на слой диоксида кремния (250 мг), смоченный дихлор-метаном. Элюировали дихлорметаном (3 л). Концентрировали фильтрат под вакуумом и выдерживали под вакуумом в течение нескольких часов с получением указанного в заголовке соединения (146 г, выход 80,8%) в виде бледно-желтого маслянистого вещества. Н1 ЯМР (399,80 МГц, CDCl3): 5 1,05 (д, J= 6,8 Гц, 3H), 1,42 (с, 9Н), 1,76-1,66 (м, 1H), 1,99-1,94 (м, 3H), 2,55 (квинтет, J= 5,8 Гц, 1H), 3,10-3,02 (м, 1H), 3,67 (с, 3H), 3,85-3,78 (м, 1H), 4,18-4,10 (м, 1H).
Способ получения 6. 6-Бром-2-(бромметил)-3-фторпиридин
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 1000 мл, оснащенную обратным холодильником и отверстием для подачи азота, добавляли 6-бром-3-фтор-2-метилпиридин (50 г, 0,263 моль), N-бром-сукцинимид (100 г, 0,562 моль) и тетрахлорид углерода (500 мл). Перемешивая при комнатной температуре, частями добавляли 2,2'-азобис(изобутиронитрил). Перемешивали реакционную смесь в течение 72 ч при 75°С. Оставляли смесь охлаждаться до комнатной температуры и отфильтровывали твердые вещества. Промывали твердые вещества толуолом (2x100 мл). Концентрировали фильтрат до ~ 250 мл, разбавляли тетрагидрофураном (300 мл) и охлаждали до 0-5°С. В атмосфере азота медленно добавляли раствор диэтилфосфита (37 мл, 0,288 моль) и триэтиламина (40 мл, 0,287 моль) в тетрагидрофуране (100 мл) в течение 30 мин. Оставляли смесь медленно нагреваться до комнатной температуры в течение 1 ч. Концентрировали под вакуумом. Добавляли ледяную воду и перемешивали смесь до ее нагревания до комнатной температуры. Собирали твердые вещества и промывали водой (2x200 мл). Сушили твердые вещества под вакуумом. Растворяли в дихлорметане (500 мл) и фильтровали через слой диоксида кремния. Промывали указанный слой дихлорметаном (250 мл). Концентрировали фильтрат под вакуумом, разбавляли гексанами (500 мл) и концентрировали под вакуумом до ~100 мл. Собирали твердые вещества и промывали гексанами (100 мл) с получением указанного в заголовке соединения (48,0 г, выход 67,8%) в виде белого твердого вещества. Собирали твердые вещества из маточного раствора и сушили под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (5,2 г, выход 7,35%) в виде белого твердого вещества. Н1 ЯМР (399,80 МГц, CDCl3): 5 4,51 (д, J= 2,1 Гц, 2Н), 7,31-7,25 (м, 1H), 7,42 (дд, J= 3,5, 8,6 Гц, 1H).
Способ получения 7. О1-трет-Бутил-О4-метил-(2R,4R)-4-[(6-бром-3-фтор-2-пиридил)метил]-2-метилпиперидин-1,4-дикарбоксилат
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л добавляли О1-трет-бутил-О4-метил-(2R,4R)-2-метилпиперидин-1,4-дикарбоксилат (48,1 г, 0,187 моль) в тетрагидрофуран (470 мл) и охлаждали смесь до -78°С. По каплям добавляли диизопропиламид лития (10 мас.%) в гексанах (112,2 мл, 0,224 моль) в течение 30 мин, поддерживая внутреннюю температуру ниже -71°С. Перемешивали при -78°С в течение 1,5 ч. По каплям добавляли раствор 6-бром-2-(бромметил)-3-фторпиридина (60,4 г, 0,225 моль) в тетра-гидрофуране (470 мл) в течение 1 ч, поддерживая внутреннюю температуру ниже -71°С. Перемешивали при -78°С в течение 1 ч. Гасили реакцию добавлением насыщенного водного раствора хлорида аммония (150 мл). Собирали полученные твердые вещества, растворяли в воде (500 мл) и экстрагировали этилаце-татом (1000 мл). Объединяли экстракты, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали под вакуумом. Реакцию повторяли, используя 57,22 г О1-трет-бутил-О4-метил-(2R,4R)-2-метилпи-перидин-1,4-дикарбоксилата, в таких же реакционных условиях и объединяли полученные вещества для очистки. Очищали объединенное вещество хроматографией на силикагеле (градиент 5-15% гекса-ны/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (168,2 г) в виде светло-желтого маслянистого вещества. Н1 ЯМР (399,80 МГц, CDCb): 5 0,98 (д, J= 7,1 Гц, 3H), 1,43 (с, 9Н), 1,76 (дд, J= 6,0, 13,8 Гц, 1H), 2,02 (с, 2Н), 2,23 (дт, J= 13,9, 2,1 Гц, 1H), 3,09-2,98 (м, 3H), 3,71 (с, 3H), 3,90-3,87 (м, 1H), 4,40-4,37 (м, 1H), 7,19 (т, J= 8,5 Гц, 1H), 7,29 (дд, J= 3,4, 8,6 Гц, 1H).
Способ получения 8. Метил-(2R,4R)-4-[(6-бром-3-фтор-2-пиридил)метил]-1-[(3-хлор-2-фторфенил) метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилат
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 4 л добавляли О1-трет-бутил-О4-метил-(2R,4R)-4-[(6-бром-3-фтор-2-пиридил)метил]-2-метилпиперидин-1,4-дикарбоксилат (168,2 г, 0,378 моль) в 1,4-диоксан (945 мл). Медленно добавляли хлористоводородную кислоту (4 M в 475 мл 1,4-диоксана, 1,9 моль) в течение 20 мин. Перемешивали при комнатной температуре в течение 21 ч, затем при 50°С в течение 4 ч. Собирали твердые вещества и сушили под вакуумом при 45°С в течение 1 ч. Концентрировали фильтрат до твердого вещества и высушивали до конца. Добавляли объединенные твердые вещества, карбонат калия (105 г, 0,76 моль) и ацетонитрил (1200 мл) в трехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л. Перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, затем добавляли 3-хлор-2-фторбензилбромид (101,3 г, 0,453 моль). Перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Фильтровали смесь через CELITE(r). Концентрировали фильтрат до желтого маслянистого вещества. Очищали маслянистое вещество хроматографией на силикагеле (градиент от 100% дихлорметана до 7% метил-трет-бутилового эфира в дихлорметане за 70 мин) с получением указанного в заголовке соединения (153 г, 0,314 моль) в виде желтого маслянистого вещества). МС (m/z): 489 (М+1).
Способ получения 9. Метил-(2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[(3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил] метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилат
В реакционную емкость для работы под микроволновым излучением добавляли трет-бутиловый спирт (9,4 мл) и удаляли кислород продуванием азота в течение 5 минут. Добавляли ацетат палладия (II) (0,044 г, 0,196 ммоль) и 2-ди-трет-бутилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенил (0,251 г, 0,58 моль). Добавляли воду (0,014 мл) под поверхностью раствора. Нагревали смесь, используя инициирующие микроволны, до 100°С в течение 2 мин. Добавляли полученный раствор катализатора через шприц к следующей смеси.
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л добавляли метил-(2R,4R)-4-[(6-бром-3-фтор-2-пиридил)метил]-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилат (9,4 г, 0,019 моль), 5
метил-Ш-пиразол-3-амин (2,07 г, 0,021 моль) и трет-бутиловый спирт (65 мл). Нагревали смесь до 40-45 °С и продували азотом в течение 10 мин. К указанной смеси добавляли карбонат цезия (14,5 г, 0,045 моль) и раствор катализатора, полученный выше. Перемешивали при 40-45°С в течение 3,5 ч. Реакция не была завершена. Получали дополнительную смесь ацетата палладия (II) (0,0088 г, 0,039 ммоль), 2-ди-трет-бутилфосфино-2',4',6,-триизопропилбифенила (0,050 г, 0,103 ммоль), воды (2,8 мкл) и трет-бутилового спирта (2 мл). Нагревали полученную смесь, используя инициирующие микроволны, до 100°С в течение 2 мин, а затем добавляли ее к полученной выше смеси, в которой реакция протекла не до конца. Перемешивали реакционную смесь при 40-45°С в течение 2 ч. Разбавляли смесь этилацетатом (100 мл), фильтровали через слой CELITE(r) и промывали указанный слой этилацетатом (100 мл). Концентрировали под вакуумом. Повторяли реакцию, используя 129,35 г метил-(2R,4R)-4-[(6-бром-3-фтор-2-пиридил)метил]-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-2-метилпиперидин-4-карбоксилата, в таких же реакционных условиях, как описаны выше, и объединяли неочищенные вещества для очистки.
Объединяли два неочищенных продукта реакции. Очищали материал хроматографией на силикаге-ле, используя градиент от 30% этилацетата в смеси 1:1 дихлорметана/гексанов до 100% этилацетата, с получением 95 г розового твердого вещества. Добавляли твердое вещество в колбу объемом 4 л, содержащую тиол SILIAMETS(r) (120 г) и дихлорметан (2 л). Перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Фильтровали смесь через CELITE(r). Концентрировали фильтрат досуха с получением указанного в заголовке соединения (93,3 г) в виде белого пенистого вещества. МС (m/z): 504 (М+1).
Пример 1. (2R,4R)-1-[(3-Хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновая кислота
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 1 л добавляли метил-(2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил) метил]-4-[(3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбо-ксилат (19,95 г, 0,040 моль), хлористоводородную кислоту (36,5 мас.%) и воду (140 мл, 1,63 моль). Перемешивали при 93-96°С в течение 17 ч. Охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Растворяли остаток в воде (1000 мл) и охлаждали на ледяной бане. Доводили рН до 6,5 с помощью 5н. гидроксида натрия. Собирали полученные твердые вещества и промывали водой. Экстрагировали водный фильтрат 10% смесью изопропанола/дихлорметана (3x500 мл). Сушили и концентрировали до твердого вещества. Объединяли оба твердых вещества и растворяли в этаноле (200 мл). Разбавляли этилацетатом (1500 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Фильтровали и концентрировали под вакуумом до твердого вещества. Растворяли твердое вещество в 5% смеси мета-нола/дихлорметана, разбавляли этилацетатом (500 мл) и концентрировали до 300 мл. Отфильтровывали твердые вещества. Повторяли реакцию, используя 61,9 г метил-(2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[(3 -фтор-6-[(5 -метил-Ш-пиразол-3 -ил)амино] -2-пиридил]метил] -2-метилпиперидин-4-карбоксилата, в таких же реакционных условиях, как описаны выше. Объединяли фильтраты из обеих реакций. Концентрировали объединенные фильтраты до ~ 600 и разбавляли гексанами (600 мл). Собирали твердые вещества и сушили под вакуумом при 50°С в течение ночи. Концентрировали маточные растворы под вакуумом досуха и сушили твердые вещества под вакуумом при 50°С в течение ночи. Объединяли твердые вещества с получением указанного в заголовке соединения (63,44 г). МС (m/z): 490 (М+1). [a]20D + 17,3° (с 1,00, EtOH).
Пример 2. трет-Бутиламинная соль (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1 Н-пиразол-3 -ил)амино] -2-пиридил]метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
Добавляли (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту (580 мг) в 4 мл ацетона. Твердое вещество растворялось с образованием прозрачного желтого раствора при перемешивании при 60°С (температура плиты)/1000 об/мин. К раствору добавляли трет-бутиламин (150 мкл, 1,20 экв., 99,5%) и наблюдали образование осадка. Суспендировали смесь в течение еще 10 мин при 60°С, а затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Фильтровали твердое вещество вакуумной фильтрацией и сушили твердое вещество в вакуумной печи при 60 °С с получением указанного в заголовке соединения (635 мг, выход 95,26%).
Добавляли (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту (154 мг) в 2 мл ацетона. Твердое вещество растворялось с образованием прозрачного желтого раствора при перемешивании при 60 °С (температура шшты)/1000 об/мин. К раствору добавляли гидроксид аммония (29,8%, 50 мкл, 1,22 экв.) и наблюдали образование осадка. Суспендировали смесь в течение еще двух часов при 60°С, а затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Наблюдали образование густой суспензии ярко-белого твердого вещества. Фильтровали твердое вещество вакуумной фильтрацией и сушили твердое вещество в вакуумной печи при 60°С с получением указанного в заголовке соединения (145 мг, выход 90,81%).
Порошковая рентгеновская дифракция примеров 2 и 3.
Диаграммы ПРД кристаллических твердых веществ получали на рентгеновском порошковом ди-фрактометре Bruker D4 Endeavor, оснащенном источником CuKa (X = 1,54060 А) и детектором Vantec, работающем при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали от 4 до 40° 20 с шагом 0,009° 20 и скоростью сканирования 0,5 с/шаг, и с дивергенцией 0,6 мм, с неподвижной 5,28 мм антирассеивающей и 9,5 мм детекторной щелями. Сухой порошок укладывали на кварцевый держатель образца и при помощи предметного стекла обеспечивали гладкую поверхность. Диаграммы дифракции кристаллической формы получали при температуре и относительной влажности окружающей среды. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности пиков дифракции могут варьироваться из-за предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология и форма кристалла. При наличии эффекта предпочтительной ориентации, интенсивности пиков являются переменными, но положения характеристических пиков полиморфа не меняются. См., например, фармакопею США №23, национальный формуляр №18, страницы 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы угловые положения пиков могут незначительно варьироваться. Например, положения пиков могут смещаться вследствие изменения температуры или влажности, при которых анализируют образец, вследствие смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В представленном случае вариабельность положения пика, составляющая ± 0,2 в градусах 20, учитывает указанные возможные отклонения, не препятствуя точному определению указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы может быть основано на любой уникальной комбинации характеристических пиков (в единицах °20), как правило, более выраженных пиков. Диаграммы дифракции кристаллической формы, полученные при температуре и влажности окружающей среды, корректировали в соответствии со стандартными пиками NIST 675 при 8,853 и 26,774 градусах 2-тета.
Характеристики полученного образца примера 2 получали с помощью диаграммы ПРД, используя излучение CuKa, имеющей пики дифракции (значения 2-тета), представленные ниже в табл. 1, и, в частности, имеющей пики при 17,0° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 11,5°, 23,2 ° и 15,0°; с допуском углов дифракции 0,2°.
Характеристики полученного образца примера 3 получали с помощью дифрактограммы ПРД, используя излучение CuKa, имеющей пики дифракции (значения 2-тета), представленные ниже в таблице 2, и, в частности, имеющей пики при 4,6° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 13,8°, 17,2° и 15,9°; с допуском углов дифракции 0,2°.
Рентгеновская кристаллическая структура киназы Aurora А с применением примера 3.
Каталитический домен киназы Aurora А (остатки 125-391 последовательности NP_003591) экспрес-сировали в клетках насекомых Sf9 с N-концевой полигистидиновой меткой, расщепляемой протеазой TEV. Экспрессированный белок выделяли связыванием с никель-хелатообразующей колонкой. После расщепления гистидиновой метки белок дополнительно очищали, пропуская через эксклюзионную хро-матографическую колонку (16/600 S200; GE Lifesciences), уравновешенную в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия с рН 7,0, 250 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT и 0,1 мМ Р,у-имидоаденозин-5'-трифосфата (AMP-PNP). В очищенный белок киназы Aurora А в концентрации 8,3 мг/мл добавляли дополнительное количество AMP-PNP до конечной концентрации 2 мМ и кристаллизовали при 21°С посредством диффузии из паровой фазы. Кристаллизацию проводили смешиванием 0,8 мкл белка с 0,8 мкл резервуарного раствора, содержащего 100 мМ MES с рН 4,6, 23% ПЭГ 3350 и 150 мМ сульфата аммония, и уравновешивали относительно того же резервуара в лотках сидячей капли. Монокристалл киназы Aurora A в комплексе с AMP-PNP пропитывали в течение ночи в растворе, содержащем 2 мМ примера 3, и переносили в раствор, содержащий 20% полиэтиленгликоля 400, и замораживали быстрой заморозкой в жидком азоте. Данные рентгеновской дифракции до 1,96 А получали из замороженного кристалла на установке для проведения рентгеновских исследований группы совместного доступа лаборатории Lilly Research Laboratories (LRL-CAT APS 31ID) в компании Advanced Photon Source, Аргонн, штат Иллинойс. Использовали рентгеновские лучи с длиной волны 0,9793 А для получения 180 кадров в 1° осцилляциях, с расстоянием до детектора 185 мм. Структуру киназы Aurora А с применением примера 3 определяли с помощью молекулярного замещения и уточняли до R-фактора 20,6% и свободного R-фактора 25,6%. Результат представлен с примером 3 и обеспечивает данные о стереохимии. Он также обеспечивает данные о стереохимии примеров 1 и 2, поскольку пример 1 использовали в качестве исходного вещества для получения примеров 2 и 3.
Результаты следующих анализов демонстрируют, что соединение примера 1 согласно настоящему изобретению является ингибитором Aurora А. Кроме того, результаты следующих анализов демонстрируют, что соединение примера 1 является селективным ингибитором Aurora А, который может обеспечивать снижение ингибирования Aurora В или двойного ингибирования Aurora А/В. Кроме того, результаты следующих анализов демонстрируют, что соединение примера 1 вызывает митотический блок клеточного цикла посредством ингибирования активности киназы Aurora А. Кроме того, соединение примера 1 демонстрирует направленное ингибирование in vivo киназы Aurora А, но не Aurora В, в образцах ксенотрансплантатной опухоли, а также значительную эффективность против роста опухоли в модели мелкоклеточного рака легких NCI-H446 на бестимусных мышах. Анализ киназы Aurora A
В данном анализе измеряли способность исследуемых соединений ингибировать активность киназы Aurora A in vitro посредством измерения поляризации АДФ-флуоресценции TRANSCREENER(r) в формате 96-луночного черного планшета (CORNING(r) COSTAR(r) 3694). В киназном буфере [50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) с рН 7,4, 4 мМ MgCl2, 0,01% TRITON(tm) X-100 и 2 мМ дитиотреитола (DTT)] получали раствор аденозинтрифосфата (АТФ) и активационной петли киназы Aurora A (ENOGEN(r), №326861) в конечных концентрациях 20 мкМ АТФ и 150 мкМ активационной петли киназы Aurora А, соответственно. К раствору добавляли фермент Aurora А в конечной концентрации 0,096 нг/мкл. Исследуемые соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% диметилсульфокси-де (ДМСО) с получением 10-точечной кривой зависимости от дозы в конечных концентрациях, начинающихся с 20 мкМ. Буфер ДМСО без исследуемого соединения использовали в качестве положительного контроля (полная активность Aurora А в отсутствие ингибитора). В качестве отрицательного контроля использовали полную реакционную смесь с 100 нМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для определения фонового содержания аденозин-5'-дифосфата (АДФ). Добавляли полученный раствор фермента Aurora А на планшет, содержащий исследуемые соединения и положительный и отрицательные контроли, и предварительно инкубировали смесь в течение 30 мин при 22°С. Реакцию инициировали добавлением раствора АТФ и активационной петли киназы Aurora А и продолжали в течение 30 минут при 22°С. Затем реакцию останавливали добавлением 25 мкл (1:1 об.:об.) смеси для обнаружения АДФ, содержащей метку для отслеживания АДФ в дальней красной области, антитело АДФ и буфер для оста
новки и обнаружения (Bellbrook Labs, кат. № 3003-10K). Планшеты выдерживали в темноте в течение по меньшей мере 2 часов для обеспечения возможности вытеснения метки АДФ Alexa633 (связанной с антителом АДФ2) АДФ, полученным в реакции с киназой, и определяли снижение поляризации флуоресценции (Ultra384, Tecan). В описанном выше киназном буфере использовали стандартную кривую АТФ/АДФ для определения превращения АДФ для исследуемых соединений.
Разность между средним значением положительного и отрицательного контролей принимали за 100% активность. Для получения значений IC50 применяли построение четырехпараметрической логистической кривой с помощью программного обеспечения ActivityBase(tm) (IDBS, Аламеда, штат Калифорния). Анализы показали минимальное значимое соотношение (MSR) <3.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Определили, что соединение примера 1 имеет IC50 1,12±0,15 нМ (n=4). Биохимический анализ Aurora А достиг нижнего предела аналитического обнаружения, поэтому указанная IC50 может не отражать абсолютную ингибирующую эффективность соединения in vitro; однако сам анализ является статистически обоснованным, поэтому представленные данные демонстрируют результат IC50, который указанное соединение проявляет в данном анализе. Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что пример 1 ингибирует активность киназы Aurora A in vitro.
Анализ киназы Aurora В.
В данном анализе измеряли способность исследуемых соединений ингибировать активность киназы Aurora И in vitro посредством измерения поляризации АДФ-флуоресценции TRANSCREENER в формате 96-луночного черного планшета (CORNING COSTAR 3694). Получали раствор фермента Aurora В в киназном буфере (37,5 мМ HEPES с рН 7,4, 6,25 мМ MgCl2, 0,0075% TRITON(tm) X-100 и 2,5 мМ DTT) с ферментом Aurora В (конечные концентрации 0,39 нг/мкл), 0,1 мкМ пептида INCEP (GenScript, №92480_l, конечные концентрации 0,1 мкМ), АТФ (конечная концентрация 10 мкМ) и гистона H3 (Anas-pec, №KLH08-4, конечная концентрация 5 мкМ). Исследуемые соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% ДМСО с получением 10-точечной кривой зависимости от дозы в конечных концентрациях, начинающихся с 20 мкМ. Буфер ДМСО без исследуемого соединения использовали в качестве положительного контроля (полная активность Aurora В в отсутствие ингибитора). В качестве отрицательного контроля использовали полную реакционную смесь с 100 нМ ЭДТА для определения фонового содержания АДФ. Добавляли полученный раствор фермента Aurora В на планшет, содержащий исследуемые соединения и положительный и отрицательный контроли. Предварительно инкубировали смесь в течение 30 мин при 22°С. Добавляли полученные ранее растворы АТФ и гистона H3 для инициации реакции и инкубировали планшет в течение 45 мин при 22°С. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл (1:1 об.:об.) смеси для обнаружения АДФ, содержащей метку для отслеживания АДФ в дальней красной области, антитело АДФ и буфер для остановки и обнаружения (Bellbrook Labs, кат. № 3003-10K). Планшеты выдерживали в темноте в течение по меньшей мере 2 часов для обеспечения возможности вытеснения метки АДФ Alexa633 (связанной с антителом АДФ2) АДФ, полученным в реакции с киназой, с последующим определением поляризации флуоресценции (Ultra384, Tecan). В описанном выше киназном буфере использовали стандартную кривую АТФ/АДФ для определения превращения АДФ для исследуемого соединения.
Разность между средним значением положительного и отрицательного контролей принимали за 100% активность. Для получения значений IC50 применяли построение четырехпараметрической логистической кривой с помощью программного обеспечения ActivityBase(tm) (IDBS, Аламеда, штат Калифорния). Анализы показали минимальное значимое соотношение (MSR) < 3.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Определили, что соединение примера 1 имеет IC50 1510 ± 668 нМ (n=5). Полученный результат демонстрирует, что пример 1 ингибирует активность киназы Aurora В in vitro слабее, чем он ингибирует активность киназы Aurora A in vitro.
Клеточный фенотипический мультиплексный анализ фосфо^гЮ гистона H3 и содержания ДНК.
В данном анализе измеряли митотический блок, вызванный ингибированием Aurora A. Митотиче-ский блок, вызванный ингибированием Aurora А, измеряли по повышению митотического маркера фос-фо^г10 гистона H3, увеличению содержания 4N ДНК (G2/M) и по фенотипам ингибирования клеточной пролиферации при 24-часовой обработке соединением с применением прибора Acumen Explorer(tm) (лазерного сканирующего флуоресцентного цитометра для микропланшетов (ТТР LabTech LTD, Великобритания)). Клетки Hela, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), в количестве 5000 клеток/лунку помещали на 96-луночные планшеты BD BIOCOAT(tm), покрытые поли-D-лизином (Becton Dickinson, кат. № 356640) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% CO2 в минимальной необходимой среде (MEM) (например, Gibco, кат. №31095) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (например, Gibco, кат. №16000), 1% заменимых аминокислот (например, Gibco, кат. №11140), 1% пирувата натрия (например, Gibco, кат. №11360) и 1% пенициллина-стрептомицина (например, Gibco, кат. №15140). Клетки обрабатывали добавлением исследуемых соединений к среде, введением доз в 10 точках серийных разбавлений 1:3 в диапазоне от 20 мкМ до 0,001 мкМ и с конечной концентрацией ДМСО 0,25%. Через 24 ч воздействия соединений клетки фиксировали препаратом PRE-
FER(tm) (Anatech LTD., кат. № 414) в течение 30 мин при комнатной температуре, один раз промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и пермеабилизировали 0,1% раствором TRITON(r) X100 в растворе PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Клетки дважды промывали PBS и блокировали 1% раствором альбумина бычьей сыворотки (BSA) в PBS (например, Sigma, кат. № А7030) в течение 30 мин при комнатной температуре. К клеткам добавляли первичное кроличье поликлональное антитело против фосфо^гЮ гистона H3 (Millipore, кат. № 06-570) в разбавлении 1:1000 в PBS с 1% BSA и инкубировали в течение ночи при 4°С. После двух промываний PBS клетки инкубировали с козьим антикроличьим меченным вторичным антителом IgG Alexa 488 в разбавлении 1:1000 в PBS (Invitrogen, кат. № А11008) в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительных двух промываний PBS добавляли раствор, содержащий 10 мкг/мл йодида пропидия (Invitrogen, кат. № Р3566) и 50 мкг/мл рибо-нуклеазы A (Sigma, кат. № R-6513) в PBS, для окрашивания ядер. Сканировали флуоресценцию планшетов с помощью ACUMEN EXPLORER(tm) [лазерного сканирующего флуоресцентного цитометра для микропланшетов (с аргоновым ионным лазерным возбуждением при 488 нм и обнаружением в нескольких фотоэлектронных умножителях, производства компании ТТР LabTech Ltd.) для измерения фосфо^гЮ гистона H3 и содержания ДНК. Анализ изображения основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации клеток в различных субпопуляциях. Результатом анализа является процент ингиби-рования клеточной пролиферации, процент клеток, положительных к фосфо^гЮ гистона H3, процент 2N (содержание ДНК в фазе G1 клеточного цикла или диплоидных ДНК, где N относится к одному набору хромосом, содержанию гаплоидной ДНК) и процент 4N и > 4N (фаза клеточного цикла G2/M и далее) на профилях гистограммы ДНК. Значения IC50 и ЕС50 определяли посредством построения черырех-параметрической логистической кривой для каждого значения, используя ACTIVITY BASE(tm).
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрирует митотический блок с ЕС50 108±15 нМ (n=4) для повышения P-Ser10 гистона H3, ЕС50 108±27 нМ (n=4) для повышения содержания 4№ДНК и IC50 52,9±27 нМ (n=4) для ингибирования клеточной пролиферации, соответственно.
Клеточный анализ ингибирования фосфо^гЮ гистона H3 Aurora В.
В данном анализе измеряли снижение фосфо^гЮ гистона H3, вызванное ингибированием Aurora В в течение одного часа обработки исследуемым соединением. Клетки NCI-H446 из Американской коллекции типовых культур (АТСС) помещали в количестве 12000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты BD BIOCOAT(tm), покрытые поли^-лизином (Becton Dickinson, кат. № 356640), и инкубировали при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% CO2 в среде, разработанной онкологическим институтом Розуэлла Парка (RPMI) (например, Gibco, кат. № 52400) с добавлением 10% FBS (например, Gibco, кат. №16000) и 1% пенициллина-стрептомицина (например, Gibco, кат. №15140). Клетки обрабатывали добавлением исследуемых соединений к среде, введением доз в 10 точках серийных разбавлений 1:3 в диапазоне от 40 мкМ до 0,002 мкМ, с конечной концентрацией ДМСО 0,2%. Через один час воздействия исследуемых соединений клетки фиксировали 16% формальдегидом в PBS (конечная концентрация 4% из исходного 37% раствора формальдегида, Sigma, кат. № F1635) в течение 45 мин при комнатной температуре, один раз промывали PBS и пермеабилизировали холодным метанолом в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем клетки один раз промывали 0,1% TRITON(r) X100 в растворе PBS, дважды промывали PBS и блокировали 3% обезжиренным молоком в PBS (Difco, кат. № 232100) в течение 30 мин при комнатной температуре. К клеткам добавляли первичное кроличье поликлональное антитело против фосфо^гЮ гистона H3 (Millipore, кат. № 06-570) в разбавлении 1:1000 в 3% растворе обезжиренного молока в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°С. После однократного промывания 0,1% раствором TRITON(r) X100 в растворе PBS и двух промываний PBS клетки инкубировали с козьим антикроличьим меченным вторичным антителом IgG Alexa 488 в разбавлении 1: 1000 в PBS (Invitrogen, кат. № A11008) в течение одного часа при комнатной температуре. После дополнительных двух промываний PBS добавляли раствор, содержащий 10 мкг/мл йодида пропидия (Invitrogen, кат. № Р3566) и 50 мкг/мл рибонуклеазы A (Sigma, кат. № R-6513) в PBS, для окрашивания ядер. Сканировали флуоресценцию планшетов с помощью ACUMEN EXPLORER(tm) [лазерного сканирующего флуоресцентного цитометра для микропланшетов (с аргоновым ионным лазерным возбуждением при 488 нм и обнаружением в нескольких фотоэлектронных умножителях, производства компании ТТР LABTECH LTD) для измерения фосфорилирования белка гистона H3 и содержания ДНК. Анализ изображения основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации клеток в различных субпопуляциях. Результат анализа представляет собой процент клеток, положительных к фосфо^гЮ гистона H3. Значения IC50 определяли посредством построения черырехпараметрической логистической кривой для каждого значения, используя Genedata Screener(r).
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрирует значение IC50 ингибиро-вания Aurora В при 1467 ±456 нМ (n=4). Вместе с результатами клеточного анализа MSD фосфор-Thr288 Aurora А, представленного ниже, пример 1 демонстрирует селективность в отношении Aurora А по сравнению с Aurora В.
Получение клеточных лизатов и выделение гистона.
Ниже представлена методика получения надосадочных растворов клеточного лизата для применения в следующем твердофазном иммуноферментном анализе ингибирования фосфорилирования Aurora А компании Meso Scale Discovery (MSD). Лизат клеток Н446 мелкоклеточного рака легких (SCLC) получали в соответствии с описанием производителя MSD (http: //www, meso-scale.com/CatalogSvstemWeb/ Documents/Phospho Aurora A Thr288 WCL.pdf). используя лизисный буфер (Tris 25 мМ с рН 7,5; лейпеп-тин 10 мкг/мл; трипсин-химотрипсин 10 мкг/мл; тозил-фенилаланил-хлорметил-кетон (TPCK) 10 мкг/мл; апротинин 10 мкг/мл; р-глицерофосфат 60 мМ; Triton X-100 1%; пирофосфат натрия (Na2H2P2O7) 2,5 мМ; NaCl 150 мМ; ЭДТА 15 мМ; этиленгликольтетрауксусную кислоту (ЭГТК) 5 мМ; гидрохлорид метилового эфира №альфа-4-тозил^-аргинина (TAME) 2 мМ; гексагидрат динатриевой соли 4-нитрофенилфосфата (PNPP) 15 мМ; бензамидин 5 мМ; ванадат натрия 1 мМ; фторид натрия 10 мМ; фе-нилметансульфонилфторид (PMSF) 50 мкг/мл; DTT 1 мМ; окадаиковую кислоту 1 мкМ; микроцистин 1 мкМ). Концентрацию белка в надосадочном растворе измеряли с помощью белкового анализа Biorad DC (№500-0111, BioRad) и использовали 25 мкл клеточного лизата с концентрацией 1 мг/мл для анализа MSD фосфор-Thr288 Aurora A.
Клеточный анализ MSD фосфор-Thr288 Aurora A.
Цель данного анализа заключается в измерении ингибирующей активности в отношении киназы Aurora А в клеточной культуре. Анализ проводили, используя 96-луночные планшеты для иммунофер-ментного твердофазного анализа компании Meso Scale Discovery (MSD) (набор для цельноклеточного лизата №K150 JCD, Meso Scale Discovery, штат Мэриленд).
Планшет для фосфо-Aurora A Singleplex MULTI-SPOT(r) блокировали добавлением 150 мкл/лунку блокирующего раствора А (конечная концентрация 3% BSA). Встряхивали планшет при комнатной температуре в течение 1 часа и промывали буфером MSD TrisWash три раза. В планшет для фосфо-Aurora A MULTI-SPOT(r) добавляли 25 мкл клеточных лизатов с концентрацией 1 мг/мл. Инкубировали смесь в течение еще 3 часов при комнатной температуре и три раза промывали смесь буфером MSD TrisWash. Детекторное антитело (фосфо-Т288 анти-Aurora A SULFO-TAGTM) разбавляли 50х в буфере для разбавления антитела с 1% BSA (1 часть 3% BSA с 2 частями промывочного буфера MSD; 0,02% блокатора DR) и добавляли на планшет 25 мкл/лунку, встряхивая в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет 3 раза промывали буфером MSD TrisWash, затем на планшет добавляли 150 мкл/лунку 2Х буфера считывания MSD Read Buffer T и считывали планшеты на приборе MSD SECTORTM Imager 6000. Процент ингибирования определяли как
[(100-(значение MSD-максимальное ингибирующее значение MSD)/(минимальное ингибирующее значение MSD - максимальное ингибирующее значение MSD)]x100.
"Максимум" и "минимум" определяли с помощью 2 мкМ раствора соединения положительного контроля, алисертиба, против отрицательного контроля, содержащего только ДМСО.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрирует ингибирование Aurora А в клетке в течение 1 часа обработки соединением с IC50 1,4±1,1 нМ (n=2). Полученные данные указывают на то, что пример 1 демонстрирует ингибирующую активность в отношении киназы Aurora А в клеточной культуре.
Получение лизата опухолевого белка и выделение гистона.
Ниже представлена методика получения лизатов ксенотрансплантатной опухоли и экстракта гисто-на, используемых в следующих in vivo анализах направленного ингибирования (IVTI). Образцы опухоли охлаждали в жидком азоте и помещали на листы фольги, и измельчали с помощью ступки и пестика, охлаждая в контейнере с сухим льдом. Образцы опухолевой ткани измельчали пестиком, и растертые в порошок опухолевые ткани переносили в пробирку, содержащую гранулы лизирующей матрицы D (№6913-500; Biomedicals MP, Lysing Maxtrix D) и 0,6 мл лизисного буфера (Tris 25 мМ, рН 7,5; лейпеп-тин 10 мкг/мл; трипсин-химотрипсин 10 мкг/мл; TPCK 10 мкг/мл; апротинин 10 мкг/мл; р-глицерофосфат 60 мМ; Triton Х-100 1%; пирофосфат натрия (Na2H2P2O7) 2,5 мМ; NaCl 150 мМ; ЭДТА 15 мМ; ЭГТК 5 мМ; гидрохлорид метилового эфира №альфа-4-тозил^-аргинина (TAME) 2 мМ; PNPP 15 мМ; бензамидин 5 мМ; ванадат натрия 1 мМ; фторид натрия 10 мМ; PMSF 50 мкг/мл; DTT 1 мМ; ока-даиковая кислота 1 мкМ; микроцистин 1 мкМ) с целой не содержащей ЭДТА таблеткой (№1873580; Roche). Пробирки энергично встряхивали в течение 30 с со скоростью 6,0 в Bio101 fastPrep (№Bio 101; Thermo Seweant). Опухолевый лизат получали в соответствии со спецификацией производителя MSD (http://www.meso-scale.com/CatalogSystemWeb/Documents/Phospho_Aurora_A_Thr288_WCL.pdf). Концентрацию белка в надосадочном растворе определяли с помощью белкового анализа Biorad DC (№5000111).
Использовали набор для полной экстракции гистона (№ОР-0006; EpiQuik) для полного извлечения гистона из осадка опухолевой ткани, полученного на описанной выше стадии центрифугирования, в соответствии со спецификацией производителя (http://www.epigentek.com/docs/OP-0006.pdf). Концентрацию белка измеряли с помощью белкового анализа Biorad DC (№500-0111; BioRad), и 25 мкл раствора с концентрацией белка экстракта гистона 0,25 мг/мл использовали для IVTI анализов фосфо^гЮ гистона
H3.
Анализ MSD направленного ингибирования фосфор-Thr288 Aurora A in vivo (IVTI).
Цель данного анализа заключается в измерении ингибирования киназы Aurora A in vivo с применением образцов ксенотрансплантатной опухоли. Анализ проводили в формате 96-луночного планшета для твердофазного иммуноферментного анализа компании Meso Scale Discovery (MSD). В планшет для фос-фо-Aurora A Singleplex MULTI-SPOT(r) (набор для цельноклеточного лизата K150 JCD; Meso Scale Discovery, штат Мэриленд) добавляли 150 мкл/лунку блокирующего раствора А (конечная концентрация 3% BSA). Встряхивали планшет при комнатной температуре в течение 1 ч и промывали буфером TrisWash три раза. Опухолевые лизаты разбавляли по описанному выше протоколу получения опухолевого лизата до 1 мг/мл и добавляли 25 мкл/лунку на планшет MSD для фосфо-Aurora MULTI-SPOT(r). Инкубировали смесь в течение еще 3 ч при комнатной температуре и 3 раза промывали буфером TrisWash. Детекторное антитело фосфо-Т288 анти-Aurora A SULFO-TAGTM в буфере для разбавления антитела с 1% BSA (антитело, разбавленное 50х в буфере с 1 частью 3% BSA и 2 частями промывочного буфера; 0,02% блока-тора D-R) добавляли на планшет в количестве 25 мкл/лунку и встряхивали планшет в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет 3 раза промывали буфером TrisWash, добавляли на планшет 150 мкл/лунку 2Х буфера считывания Read Buffer T, а затем сразу считывали на приборе MSD SECTORTM Imager 6000. Процентное ингибирование определяли как [100-(среднее значение MSD в группе, обработанной соединением/среднее значение MSD в группе, обработанной носителем)] x 100.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрирует TED50 2,13 мг/кг в модели ксенотрансплантата Н446 на бестимусных мышах (предельная эффективная доза) в исследовании зависимости эффекта от дозы через 3 часа после введения дозы. Полученные данные показывают, что пример 1 демонстрирует ингибирование киназы Aurora A in vivo в образцах ксенотрансплантатной опухоли с указанной TED.
Анализ MSD направленного ингибирования фосфо^гЮ гистона H3 Aurora В in vivo (IVTI).
Цель данного анализа заключается в измерении ингибирующей активности in vivo в отношении ки-назы Aurora В в образцах ксенотрансплантатной опухоли посредством определения ингибирования фос-фо^г10 гистона H3, поскольку он является непосредственно следующим киназным субстратом Aurora В. Анализ проводили в формате 96-луночного планшета для твердофазного иммуноферментного анализа компании Meso Scale Discovery (MSD). Блокирующий раствор А (конечная концентрация 3% BSA) добавляли на 4-ячеечный планшет для гистона H3 MULTI-SPOT(r) (набор для цельноклеточного лизата кат.
К150 EWD-3 JCD, Meso Scale Discovery, штат Мэриленд) в количестве 150 мкл/лунку и встряхивали планшет при комнатной температуре в течение 1 ч. После 3-кратного промывания буфером MSD TrisWash гистоновый экстракт разбавляли до 0,25 мг/мл по описанному выше протоколу получения опухолевого лизата и добавляли на планшет MSD в количестве 25 мкл/лунку. Инкубировали смесь в течение еще 3 часов при комнатной температуре, 3 раза промывали буфером MSD TrisWash. Детекторное антитело SULFO-TAG анти-гистон H3 фосфо^гЮ разбавляли 50х в 3 мл буфера для разбавления антитела с 1% BSA (1 мл 3% BSA с 2 мл промывочного буфера MSD; 0,01% блокатора D-M) и добавляли на планшет в количестве 25 мкл/лунку, и встряхивали планшет при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшет 3 раза промывали буфером MSD TrisWash. На планшет добавляли 150 мкл/лунку 2Х буфера считывания MSD Read Buffer Т. Сразу считывали планшет на приборе MSD SECTORTM Imager 6000. Процентное ингибирование определяли как [100-(среднее значение MSD в группе, обработанной соединением/среднее значение MSD в группе, обработанной носителем)] x 100.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 не приводит к ингибированию фосфо-Ser10 гистона H3 более 50% в анализе зависимости эффекта от дозы в концентрации 30 мг/кг через 3 ч после введения дозы, а также в исследовании зависимости от времени в дозе 50 мг/кг через 1 ч после введения дозы. Полученный результат позволяет предположить, что пример 1 не ингибирует Aurora В in vivo в образах ксенотрансплантатой опухоли в указанных дозах.
Эффективность против роста опухоли в модели ксенотрансплантата SCLC NCI-H446 на бестимус-ных мышах.
Цель данного анализа заключается в измерении in vivo ингибирования роста опухоли в моделях ксенотрансплантата SCLC NCI-H446 и SCLC NCI-H69 на бестимусных мышах. Все in vivo исследования проводили в соответствии протоколами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Для ксенотрансплантатных моделей, клетки мелкоклеточного рака легких человека NCI-H446 и клетки мелкоклеточного рака легких человека NCI-H69 сохраняли в соответствии с рекомендациями поставщика. Клетки собирали, промывали и повторно суспендировали в 1:1 смеси не содержащей сыворотки среды и Matrigel (354234, Becton Dickinson). Затем клетки имплантировали самкам бестимус
ных "голых" мышей (Harlan Laboratories) посредством подкожного введения в заднюю боковую область в количестве 5х106 клеток/мышь. Объем опухоли оценивали с помощью формулы: v= 1xw2x0,536, где 1 = наибольший измеренный диаметр, и w = наименьший перпендикулярный диаметр. Данные анализировали с помощью программного обеспечения SAS (SAS Institutes Inc, Кэрри, штат Северная Каролина).
По достижении объема опухоли 150 мм3 у бестимусных мышей, животных случайным образом разделяли на группы по объему опухоли и вводили исследуемое соединение в виде состава, используя в качестве носителя 20% гидроксипропил-бета-циклодекстрин (HPBCD)/25 мМ фосфатно-солевой буферный раствор с рН 8, с конечным рН, доведенным до рН 9 с помощью 1н. NaOH. В группах с носителем и в экспериментальных группах использовали по десять животных. В каждой выбранной точке времени экспериментальные группы сравнивали с контрольной группой, которой вводили носитель. Объемы опухоли указаны как средние значения вместе со стандартными ошибками для каждой экспериментальной группы.
Соединение, входящее в границы объема настоящего изобретения, испытывали в указанном анализе, по существу, так, как описано выше. Соединение примера 1 демонстрирует значительную эффективность против роста опухоли в модели ксенотрансплантата мелкоклеточного рака легких NCI-H446 на бестимусных мышах и в модели ксенотрансплантата мелкоклеточного рака легких NCI-H69 на бести-мусных мышах.
Таблица 4. Ингибирование роста ксенотрансплантатной опухоли SCLC H446 in vivo
при лечении по примеру 1
Схема введения доз
Средний объем
опухоли (мм3)
СО объема опухоли (мм3)
значение
Дельта Т/С (%)
Регрессия
(%)
носитель
698,61
319,434
Пример 1 30 мг/кг; BID (два раза в сутки)х21
106,19
22,729
< 001*
-45,8
Пример 1 50 мг/кг; ВГОх21
31,62
4,340
< 001*
-83,9
Анализ объема опухоли основан на Log 10 и обобщенной ковариационной структуре авторегрессии 1-го порядка.
*:3начимое (р < 0,05); НП: не применимо.
Дельта Т/С (%) рассчитывали на 30 день, когда объем опухоли в экспериментальной группе был равен или превышал исходный объем опухоли (16 день).
Формула: 100х(Т-Т0)/(С-С0), где Т и С представляют собой средние конечные значения объема опухоли в экспериментальных или контрольных группах, соответственно. Т0 и С0 представляют собой средние исходные объемы опухоли в указанных группах.
Регрессию (%) рассчитывали, если конечный объем был меньше исходного значения. Формула: 100х(Т-Т0)/Т0, где Т0 представляют собой средний исходный объем опухоли в экспериментальных группах.
Таблица 5. Ингибирование роста ксенотрансплантатной опухоли SCLC H69 in vivo
при лечении по примеру 1
Схема введения доз
Средний объем
опухоли (мм3)
СО объема опухоли (мм3)
значение
Дельта Т/С (%)
Регрессия
(%)
носитель
687,61
95,175
Пример 1 30 мг/кг; ВШх14
73,35
9,269
< 001*
-63,6
Пример 1 50 мг/кг; ВШх14
72,32
8,035
< 001*
-63,1
Анализ объема опухоли основан на Log 10 и обобщенной ковариационной структуре авторегрессии 1-гопорядка.
*:3начимое (р < 0,05); НП: не применимо.
Дельта Т/С (%) рассчитывали на 30 день, когда объем опухоли в экспериментальной группе был равен или превышал исходный объем опухоли (16 день).
Формула: 100х(Т-Т0)/(С-С0), где Т и С представляют собой средние конечные значения объема опухоли в экспериментальных или контрольных группах, соответственно. Т0 и С0 представляют собой средние исходные объемы опухоли в указанных группах.
Регрессию (%) рассчитывали, если конечный объем был меньше исходного значения. Формула: 100х (Т-Т0)/Т0, где Т0 представляют собой средний исходный объем опухоли в экспериментальных группах.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из
(2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил] метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
(2S,4S)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1H-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил] метил] -2-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты
или их фармацевтически приемлемой соли.
2. Соединение по п.1, представляющее собой (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту
или ее фармацевтически приемлемую соль.
3. Соединение по п.2, представляющее собой (2R,4R)-1-[(3-хлор-2-фторфенил)метил]-4-[[3-фтор-6-[(5-метил-1Н-пиразол-3-ил)амино]-2-пиридил]метил]-2-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту
4. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или соль по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
5. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для ингибирования активности киназы Aurora A.
6. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для лечения рака.
7. Применение по п.6, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легких, рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака предстательной железы, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака шейки матки, рака головы и шеи, рака пищевода, рака яичников, немелкоклеточного рака легких и неходжкинской лимфомы.
8. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой мелкоклеточный рак легких.
9. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак предстательной железы.
10. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы.
11. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак шейки матки.
12. Применение по п.7, отличающееся тем, что рак представляет собой рак головы и шеи.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032102
- 1 -
032102
- 1 -
032102
- 1 -
032102
- 1 -
032102
- 1 -
032102
- 1 -
032102
- 1 -
032102
- 4 -