|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ определения модифицирующей активности активированной-потенцированной формы вещества, включающий: a) получение активированной-потенцированной формы исходного вещества, b) обеспечение отсутствия молекулярной формы исходного вещества в указанной активированной-потенцированной форме, c) получение молекулярной формы второго вещества, d) измерение по крайней мере одного физического, химического или биологического параметра (А) указанной молекулярной формы при помощи соответствующего аналитического метода, e) обработку указанной молекулярной формы вещества вышеуказанной активированной-потенцированной формой и f) измерение с помощью указанного аналитического метода соответствующего (по крайней мере одного) физического, химического или биологического параметра (А М ) молекулярной формы вещества, обработанной активированной-потенцированной формой вещества, при этом активность вышеуказанной активированной-потенцированной формы исходного вещества определяется по степени различия между показателями А и А М , причем указанное второе вещество представляет собой антитела к исходному веществу или рецепторы к исходному веществу; или исходное вещество представляет собой антитела к определенному антигену, а второе вещество представляет собой указанный антиген или рецептор указанного антигена. 2. Способ по п.1, далее включающий выражение активности вышеуказанной активированной-потенцированной формы в относительных единицах (X) по формуле X=С|А-А М |/А, где С - безразмерная константа пропорциональности. 3. Способ по п.1, далее включающий 1) обработку молекулярной формы третьего вещества вышеуказанной активированной-потенцированной формой исходного вещества, 2) измерение соответствующего (по крайней мере одного) физического, химического или биологического параметра (В М ) обработанной молекулярной формы данного третьего вещества с использованием вышеуказанного аналитического метода для определения его специфичности и характеризующийся тем, что последний считается обладающим специфичестью, если указанный (по крайней мере один) физический, химический или биологический параметр демонстрирует статистически значимые изменения при определении А-А М и их отсутствие для В-В М . 4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является высокоэффективная жидкостная хроматография. 5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является иммуноферментный анализ. 6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является спектроскопия ЯМР. 7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что этап обеспечения отсутствия молекулярной формы предполагает удаление молекулярной формы указанного вещества. 8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве указанного исходного вещества используются антитела. 9. Способ по п.8, характеризующийся тем, что указанные антитела являются поликлональными антителами. 10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанное исходное вещество является малой органической молекулой. 11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная активированная-потенцированная форма является жидкостью. 12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная активированная-потенцированная форма наносится на твердый носитель.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ определения модифицирующей активности активированной-потенцированной формы вещества, включающий: a) получение активированной-потенцированной формы исходного вещества, b) обеспечение отсутствия молекулярной формы исходного вещества в указанной активированной-потенцированной форме, c) получение молекулярной формы второго вещества, d) измерение по крайней мере одного физического, химического или биологического параметра (А) указанной молекулярной формы при помощи соответствующего аналитического метода, e) обработку указанной молекулярной формы вещества вышеуказанной активированной-потенцированной формой и f) измерение с помощью указанного аналитического метода соответствующего (по крайней мере одного) физического, химического или биологического параметра (А М ) молекулярной формы вещества, обработанной активированной-потенцированной формой вещества, при этом активность вышеуказанной активированной-потенцированной формы исходного вещества определяется по степени различия между показателями А и А М , причем указанное второе вещество представляет собой антитела к исходному веществу или рецепторы к исходному веществу; или исходное вещество представляет собой антитела к определенному антигену, а второе вещество представляет собой указанный антиген или рецептор указанного антигена. 2. Способ по п.1, далее включающий выражение активности вышеуказанной активированной-потенцированной формы в относительных единицах (X) по формуле X=С|А-А М |/А, где С - безразмерная константа пропорциональности. 3. Способ по п.1, далее включающий 1) обработку молекулярной формы третьего вещества вышеуказанной активированной-потенцированной формой исходного вещества, 2) измерение соответствующего (по крайней мере одного) физического, химического или биологического параметра (В М ) обработанной молекулярной формы данного третьего вещества с использованием вышеуказанного аналитического метода для определения его специфичности и характеризующийся тем, что последний считается обладающим специфичестью, если указанный (по крайней мере один) физический, химический или биологический параметр демонстрирует статистически значимые изменения при определении А-А М и их отсутствие для В-В М . 4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является высокоэффективная жидкостная хроматография. 5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является иммуноферментный анализ. 6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является спектроскопия ЯМР. 7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что этап обеспечения отсутствия молекулярной формы предполагает удаление молекулярной формы указанного вещества. 8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве указанного исходного вещества используются антитела. 9. Способ по п.8, характеризующийся тем, что указанные антитела являются поликлональными антителами. 10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанное исходное вещество является малой органической молекулой. 11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная активированная-потенцированная форма является жидкостью. 12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная активированная-потенцированная форма наносится на твердый носитель.
Евразийское 032090 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201500925
(22) Дата подачи заявки 2014.03.18
(51) Int. Cl. G01N33/68 (2006.01) G01N 33/15 (2006.01) G01N 24/08 (2006.01)
G01N 30/00 (2006.01)
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОДИФИЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА
(31) 2013111962
(32) 2013.03.18
(33) RU
(43) 2016.04.29
(86) PCT/IB2014/001183
(87) WO 2014/155206 2014.10.02 (71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец:
ЭПШТЕЙН ОЛЕГ ИЛЬИЧ (RU)
(74) Представитель:
Попов А.С. (RU)
(56) RU-C2-2195648
PAVLOV ET AL.: "Morphine and antibodies to mu-opiate receptors in ultralow doses: effect on oxygen consumption", BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 135 Suppl 7, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 137-9, XP055142829, ISSN: 0007-4888 abstract Materials and Methods; table 1
EPSTEIN ET AL.: "In vitro effects of bipathic treatment with antibodies in ultralow doses during long-term post-tetanic potentiation", BULLETIN OF
EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE,
vol. 135 Suppl 7, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 111-3, XP055142832, ISSN: 0007-4888 abstract Material and Methods; table 1
T.A. VORONINA, M.V. BELOPOLSKAYA, I.A. KHEYFETS, J.L. DUGINA, S.A. SERGEEVA,
O.I. EPSTEIN: "Study of Bipathic Effect of Haloperidol", BULLETIN OF EXPERIMENTAL
BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 145, no. 5, 1 May 2008 (2008-05-01), XP002730253, abstract page 620, column 2, paragraph 3 - page 621, column 1, paragraph 1; figure 1; table 1
(57) Предлагается способ определения модифицирующей активности лекарственного средства. Лекарственное средство - препарат, содержащий терапевтический и гомеопатический, т.е. активированный-потенцированный, компонент, в котором гомеопатический компонент оказывает физическое, химическое или биологическое влияние на терапевтический компонент и/ или на его фармакологическую эффективность. Терапевтический компонент биологически связан с исходным веществом гомеопатического компонента. Перед взаимодействием с активированной-потенцированной формой проводят аналитическое измерение не менее одного отличительного параметра терапевтической формы. Те же аналитические измерения проводят и после взаимодействия терапевтической формы с активированной-потенцированной формой. На основании этих данных подтверждают, что любое модифицированное действие вызвано присутствием молекулярной формы в активированной-потенцированной форме. Кроме того, заявленное аналитическое измерение не менее одного отличительного параметра терапевтической формы до ее взаимодействия с активированной-потенцированной формой и повторное измерение после такого взаимодействия применяются для количественного определения степени модифицирующего действия активированной-потенцированной формы в относительных безразмерных единицах активности (релиз-активность).
Для данной заявки испрашивается приоритет на основании российской заявки на патент № 2013111962, поданной 18 марта 2013 г., содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область применения
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтике. Изобретение применяется для определения модифицированного действия лекарственных средств, в особенности бипатических лекарственных средств, в которых не менее одного компонента приготовлены по надежной и воспроизводимой гомеопатической технологии.
Уровень техники Активированная-потенцированная форма
К лекарственным препаратам, приготовленным по гомеопатической технологии, относятся препараты, приготовленные методом гомеопатического потенцирования, также называемого активацией, путем многократного последовательного разведения в носителе (водный или водно-спиртовой растворитель) - таким образом происходит уменьшение концентрации - в сочетании со встряхиванием каждого последовательного разведения (см., например, RU 2191601 CI; RU 2192888 CI; RU 2332236 CI (английская версия ЕР 2123300) и RU 2438707 С2 (U.S. Pat. Pub. 2011/0008452). Приготовленный методом гомеопатического потенцирования лекарственный препарат содержит малые или сверхмалые дозы исходного лекарственного препарата; разведения могут достигать или превосходить 1 моль носителя на молекулу исходного лекарственного препарата в молекулярной форме, при этом общее количество молекул в моле определяется числом Авогадро (6,022х1023 моль-1). Определение термина "молекулярная форма" приводится ниже. В контексте твердой лекарственной формы роль разведения выполняет растирание. При обработке по гомеопатической технологии носитель приобретает модифицирующее действие, проявляющееся в его способности изменять физические, химические и/или биологические свойства исходного вещества при воздействии указанной активированной-потенцированной формы (RU 2161955 CI). Активированный-потенцированный носитель приобретает модифицирующее действие, способное изменять физические, химические и/или биологические свойства вещества, содержащего молекулы, структурно сходные с молекулами исходного вещества при воздействии указанной активированной-потенцированной формы.
Термин "молекулярная форма" применяется для обозначения одной или более молекул определенного химического вещества. Таким образом, молекулярная форма аспирина представляет собой одну молекулу ацетилсалициловой кислоты; 1 моль аспирина в молекулярной форме содержит 6,022х1023 молекул ацетилсалициловой кислоты и весит 180,157 г.
Термин "активированная-потенцированная форма" применяется для обозначения продукта гомеопатического потенцирования исходного раствора, содержащего вещество в молекулярной форме. Иными словами, раствор, содержащий молекулярную форму вещества, например специфичного антитела или органической молекулы, подвергают многократному последовательному разведению и многократному вертикальному встряхиванию каждого полученного раствора по гомеопатической технологии. В качестве растворителя, часто называемого носителем, преимущественно используется вода или водно-спиртовая смесь. Преимущественная концентрация молекулярной формы в исходном носителе составляет приблизительно 0,5-5,0 мг/мл. Активированную-потенцированную форму готовят из исходного раствора путем гомеопатического потенцирования, преимущественно методом равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части каждого предшествующего раствора. Таким образом, 1 часть исходного раствора смешивают с 99 частями (для сотенного разведения) носителя и подвергают внешнему воздействию. Внешнее воздействие преимущественно заключается в многократном вертикальном встряхивании (динамизации) каждого раствора. В результате получают 1-е сотенное разведение, обозначаемое С1. Для приготовления 2-го сотенного разведения (С2) 1 часть 1-го сотенного разведения С1 смешивают с 99 частями носителя. Данную операцию повторяют еще 10 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Для каждого последующего разведения до получения требуемой кратности разведения применяются отдельные емкости. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения, например, разведений С30, С50 и С200. Этот метод принят в гомеопатии (см., например, работу В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29, включенную в настоящую заявку посредством ссылки для указанных целей). С12, С30 и С200 представляют разведения основного матричного раствора (маточного раствора) антител в 10012, 10030 и 100200 раз соответственно.
Преимущественные активированные-потенцированные формы часто представляют собой смесь нескольких сотенных разведений одной молекулярной формы, например смесь разведений С12, С30 и С50 или разведений С12, С30 и С200. При использовании смеси различных гомеопатических разведений каждый компонент композиции, например С12, С30, С50, С200, готовят раздельно по вышеописанной технологии до предпоследнего разведения, т.е. до С11, С29 и С99 соответственно, затем вносят в соответствии с композицией смеси по одной части каждого компонента в одну емкость и смешивают с требуемым количеством носителя, т.е. с 97 частями для сотенного разведения.
Примеры гомеопатического потенцирования описаны в патентах США №№ 7572441 и 7582294, включенных в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки для указанных целей. Термин "активированная-потенцированная форма" и термин "сверхмалые дозы" полностью взаимозаменяемы и синонимичны друг другу.
Качественное и количественное исследование лекарственных средств
Специалистам известен, например RU 2181890 С1, способ определения биологической активности вещества. Активность представляет отношение скорости ферментного ответа на испытуемый образец до и после добавления вещества. "Оптимальную концентрацию вещества в образце" определяют in vitro. Однако этот способ не подходит для определения действия лекарственных препаратов, приготовленных по гомеопатической технологии.
Специалистам известен способ определения действия гомеопатического препарата путем приложения линейно поляризованного когерентного оптического излучения к активированному препарату в постоянном магнитном поле. Регистрацию рассеянного излучения проводят временным накоплением значений интенсивности его поляризованной компоненты в режиме оптического смещения от разных точек исследуемой среды. Анализ осуществляют при вычислении частотного спектра сверхмедленных флук-туаций интенсивности прошедшего излучения и сравнении его с эталонным образцом (см., например, RU 2112976 С1).
Кроме того, известен способ качественного определения гомеопатического лекарственного средства или активированной-потенцированной формы. Способ включает воздействие эталонным реагентом на исследуемую среду и регистрацию изменения физических и химических параметров. Используют набор известных веществ, близких или сходных по структуре и/или составу к определяемому гомеопатическому лекарственному препарату или веществу в потенцированной форме, и антител к этим известным веществам. Идентификацию гомеопатического лекарственного препарата или потенцированной формы вещества производят по тому известному веществу, реакция которого с соответствующим антителом при введении в реакционную среду гомеопатического лекарственного препарата или потенцированной формы вещества протекает с изменениями, регистрируемыми иммунохимическими методами анализа, основанными на реакции "антиген-антитело"(RU 2195648 С2).
Известные специалистам методы, однако, не позволяют проводить надежное и воспроизводимое качественное и количественное определение подлинности и действия лекарственного препарата в активированной-потенцированной форме. К ним относятся активированные препараты, приготовленные по вышеописанной гомеопатической технологии.
Сущность изобретения
Способ определения активности активированной-потенцированной формы первого вещества, включающий получение активированной-потенцированной формы первого вещества, обеспечение отсутствия молекулярной формы в веществе в активированной-потенцированной форме, получение молекулярной формы второго (терапевтического) вещества, структурно сходного с первым веществом, измерение не менее одного физического, химического или биологического параметра (А) молекулярной формы второго вещества с помощью соответствующего аналитического метода, воздействие активированной-потенцированной формы первого вещества на молекулярную форму второго вещества и измерение не менее одного физического, химического или биологического параметра (Am) молекулярной формы вещества с помощью указанного аналитического метода, в котором активность активированной-потенцированной формы вещества представляет величину разности между А и Am.
Вышеописанный метод, в котором активность активированной-потенцированной формы первого вещества выражается в относительных единицах (X) по формуле
К=С(А-АМ)/А.
Вышеописанный метод, также включающий i) воздействие активированной-потенцированной формы первого вещества на молекулярную форму третьего вещества; ii) измерение не менее одного физического, химического или биологического параметра (В) молекулярной формы третьего вещества с помощью данного аналитического метода; iii) измерение не менее одного физического, химического или биологического параметра (Вм) молекулярной формы третьего вещества, подвергнутой воздействию, с помощью данного аналитического метода для определения специфичности способа, при этом указанный способ считается специфичным, если не менее чем в одном физическом, химическом или биологическом параметре присутствуют статистически значимые изменения в случае А-Ам и отсутствуют статистически значимые изменения в случае В-Вм.
Вышеописанный способ, в котором в качестве аналитического метода используется высокоэффективная жидкостная хроматография.
Вышеописанный способ, в котором в качестве аналитического метода используется иммунофер-ментный анализ.
Вышеописанный способ, в котором в качестве аналитического метода используется ядерно-магнитный резонанс.
Вышеописанный способ, в котором на этапе обеспечения отсутствия молекулярной формы в веществе производится удаление молекулярной формы указанного вещества.
Вышеописанный способ, в котором указанное вещество является антителом. Вышеописанный способ, в котором указанное вещество является поликлональным антителом. Вышеописанный способ, в котором указанное вещество является малой органической молекулой. Вышеописанный способ, в котором указанная активированная-потенцированная форма является жидкостью.
Вышеописанный способ, в котором указанной активированной-потенцированной формой пропитывают твердый носитель.
Вышеописанный способ, в котором второе вещество является рецептором первого вещества.
Вышеописанный способ, в котором второе вещество является антителом первого вещества.
Вышеописанный способ, в котором первое вещество является антителом к антигену, а второе вещество - рецептором указанного антигена.
Вышеописанный способ, в котором первое вещество является антителом к антигену, а второе вещество - указанным антигеном.
Вышеописанный способ, в котором первое вещество является антителом к антигену, а второе вещество - указанным антигеном.
Вышеописанный способ, в котором второе вещество является ферментом, катализируемым первым веществом.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано изменение химического сдвига ИФН-гамма I при добавлении активированного-потенцированного носителя по сравнению с плацебо.
На фиг. 2 показано изменение химического сдвига ИФН-гамма II при добавлении активированного-потенцированного носителя по сравнению с плацебо.
На фиг. 3 показано изменение химического сдвига ИФН-гамма III при добавлении активированного-потенцированного носителя по сравнению с плацебо.
На фиг. 4 показано изменение по времени ИФН-гамма-R! при 323 нм. На фиг. 4 показано изменение по времени ИФН-гамма-RZ при 323 нм.
Подробное описание изобретения
Изобретение определяется нижеследующей формулой изобретения. Определения, относящиеся к формуле изобретения, были приведены выше, дополнительные определения приводятся ниже.
Используемый в настоящем документе термин "антитело" обозначает иммуноглобулин, специфически связывающийся и таким образом комплиментарный определенной пространственной и полярной организации другой молекулы. Антитела, перечисленные в формуле изобретения, включают цельный иммуноглобулин или его фрагмент, могут быть естественными, поликлональными или моноклональны-ми, и включают различные классы и изотипы: IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3, IgM и т.д. К их фрагментам относятся Fab, Fv и F(ab')2, Fab' и т.п. Единственное число "антитело" включает множественное число "антитела".
Термин "биологически связанный" по отношению к первому веществу и второму веществу, из которых первое вещество является антителом, обозначает, что второе вещество является антигеном к первому веществу, рецептором первого вещества, фрагментом рецептора первого вещества и др. Биологически связанные вещества "структурно сходны" в терминах настоящей заявки. Одно из значений "структурного сходства" заключается в том, что вещества биологически связаны. К "структурно сходным" также относится вещество биологического или синтетического происхождения, взаимодействующее с исходным веществом, или вещество, способное взаимодействовать с молекулами того же биологического или синтетического происхождения, что и исходное вещество.
Термины "активированная-потенцированная форма" или "потенцированная форма" употребляются для обозначения продукта гомеопатического потенцирования любого исходного раствора, содержащего вещество в молекулярной форме, например антитело. Примеры гомеопатического потенцирования антител описаны в патентах США №№ 7572441 и 7582294, включенных в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки для указанных целей. Антитело находится в "активированной-потенцированной" или "потенцированной" форме при наличии трех факторов. Во-первых, "активированная-потенцированная" форма антитела является продуктом процесса приготовления, принятого в гомеопатии. Во-вторых, "активированная-потенцированная" форма антитела должна обладать биологической активностью, определяемой методами, принятыми в современной фармакологии. В-третьих, биологическую активность "активированной-потенцированной" формы антитела невозможно объяснить присутствием молекулярной формы антитела в итоговом продукте гомеопатического процесса.
Гомеопатические методы лечения человека вызывают значительные разногласия. Хотя настоящее изобретение основано на принятых в гомеопатии процессах получения "активированной-потенцированной" формы вещества, при доказательстве активности оно опирается не только на гомеопатию. При изучении молекулярных форм, состоящих из антител, изобретатель настоящей заявки неожиданно обнаружил и подробно доказал на принятых фармакологических моделях, что итоговый растворитель, полученный после многократных последовательных разведений исходной молекулярной формы вещества, определенно обладает активностью, не связанной с присутствием следов молекулярной формы
вещества в окончательном разведении. Кроме того, заявленная "активированная-потенцированная" форма антитела охватывает только растворы или твердые лекарственные формы, биологическую активность которых невозможно объяснить присутствием молекулярной формы антитела, оставшейся от исходного первоначального раствора. Иными словами, хотя предполагается, что "активированная-потенцированная" форма антитела может содержать следы исходной молекулярной формы антитела, специалист не может сколь-либо достоверно объяснить биологическую активность, наблюдаемую в принятых фармакологических моделях, оставшейся молекулярной формой антитела в связи с экстремально низкими концентрациями молекулярной формы антитела, остающимися после последовательных разведений.
Хотя изобретение не ограничивается какой-либо конкретной теорией, биологическая активность "активированной-потенцированной" формы антител в настоящем изобретении не объясняется исходной молекулярной формой антитела. Преимущественно применяется "активированная-потенцированная" форма антитела в жидком или твердом носителе, в котором концентрация молекулярной формы антитела находится ниже предела определения принятых аналитических методов: капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. В особенности преимущественно применяется "активированная-потенцированная" форма антитела в жидком или твердом носителе, в котором концентрация молекулярной формы антитела составляет менее числа Авогадро, т.е. 1 молекула молекулярной формы на 6,022х 1023 молекул носителя.
Фармацевтическая композиция изобретения расширяет арсенал препаратов, применяемых для профилактики и лечения инфекционных заболевания, в том числе бактериальных инфекций, а также острых и хронических вирусных инфекций.
Комбинированная фармацевтическая композиция в соответствии с данным аспектом изобретения может быть выполнена в жидкой или твердой лекарственной форме. Для приготовления активированного-потенцированного компонента комбинированного лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением преимущественно используется смесь трех водно-спиртовых разведений первичного
12 30 50
матричного раствора антител, разведенных соответственно в 100 , 100 и 100 раз, что соответствует сотенным гомеопатическим разведениям С12, С30 и С50, или разведенных соответственно в 10012, 10030 и 100200 раз, что соответствует сотенным гомеопатическим разведениям С12, С30 и С200. При приготовлении твердой лекарственной формы на твердый носитель наносится желаемое разведение, полученное по гомеопатической технологии. При получении твердой лекарственной формы комбинированного препарата в соответствии с изобретением массу носителя пропитывают каждым разведением. Для приготовления желаемой комбинированной лекарственной формы подходит пропитывание в любом порядке.
Если активированную-потенцированную форму, входящую в состав фармацевтической композиции, готовят из исходной молекулярной формы антитела, то применяют процесс, принятый в гомеопатии. В качестве исходных антител используют моноклональные или поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям, например, описанным в работах "Иммунологические методы" Г.Фримеля, М., "Медицина", 1987, с.9-33; "Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after"Laffly E., Sodoyer R. - 2005, vol.14, № 1, 2, p. 33-55, включенных в настоящую заявку посредством ссылки.
Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибри-домных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.
Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого, например, соответствующим животным (например, кроликам) делают серию инъекций соответствующего антигена (цитокина и рецептора). Иммунная система животных вырабатывает соответствующие антитела, которые собирают у животных по известной технологии. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител.
При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии. Полученную очищенную сыворотку с высоким содержанием антител используют в качестве исходного материала для приготовления активированной потенцированной формы антител. Преимущественная концентрация полученного исходного раствора антител в растворителе, преимущественно в воде или водно-спиртовой смеси, составляет 0,5-5,0 мг/мл.
Ниже описан примерный способ приготовления молекулярной формы, состоящей из поликлональ-ных антител к рецептору CD4. Перед взятием крови за 7-9 дней кроликам проводят 1-3 внутривенных инъекции нужного антигена для повышения уровня антител в кровотоке кроликов. После иммунизации берут небольшие пробы крови для оценки количества антител. Как правило, максимальный уровень иммунного ответа на введение растворимого антигена достигается через 40-60 дней после первой инъекции антигена. После окончания первого цикла иммунизации кроликам дают восстановить здоровье в течение 30 дней и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисы
воротки, содержащей нужные антитела, из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают на ночь в холодильник при температуре около 4°С. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость в течение 10 мин при 13000 об/мин. Надоса-дочная жидкость представляет собой необходимую антисыворотку. Полученная антисыворотка, как правило, желтого цвета. К антисыворотке добавляют 20% NaN3 (массовая концентрация) до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С или без добавления NaN3 при температуре -70°С. Для выделения из антисыворотки антител к гамма-интерферону применяют метод твердофазной абсорбции:
10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15М NaCl, добавляют 6,26 г Na2SO4, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С. Осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре. После удаления осадка раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером. Фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.
Очистку выделенных неочищенных антител производят методом аффинной хроматографии путем связывания полученных антител с антигеном CD4, прикрепленным к нерастворимой матрице хромато-графической среды, с последующим элюированием концентрированными водными растворами соли.
Полученный таким образом буферный раствор используют в качестве исходного раствора для процесса гомеопатического разведения при приготовлении активированной-потенцированной формы антител. Преимущественная концентрация исходного матричного раствора очищенных антигеном поликло-нальных кроличьих антител к рецептору CD4 составляет 0,5-5,0 мг/мл, преимущественно 2,0-3,0 мг/мл.
Фармацевтическую композицию в твердой лекарственной форме готовят преимущественно из гранул фармацевтически приемлемого носителя, предварительно насыщенного водными или водно-спиртовыми разведениями активированной-потенцированной формы антител к рецептору CD4. Твердая лекарственная форма может быть выполнена в любой известной в фармацевтике форме, в том числе в виде таблеток, капсул, пастилок и др. В качестве неактивных фармацевтических ингредиентов используют глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, изомальтозу, изомальт и другие моно-, олиго- и полисахариды, применяемые при производстве лекарственных средств, а также технологические смеси вышеуказанных фармацевтических ингредиентов с другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, например изомальтом, кросповидоном, натрия цикламатом, натрия сахарином, безводной лимонной кислотой и т.д., в том числе смазывающими веществами, разрыхлителями, связующими веществами и красителями. В качестве носителей преимущественно используются лактоза и изомальт. В состав лекарственной формы, кроме того, могут входить стандартные фармацевтические вспомогательные вещества, например микрокристаллическая целлюлоза, магния стеарат и лимонная кислота.
Для приготовления твердой лекарственной формы гранулы лактозы с размером частиц 100-300 мкм пропитывают водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы антител к рецептору CD4 в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5-1:10). Для пропитки проводят орошение до насыщения гранул лактозы в псевдоожиженном кипящем слое в установке кипящего слоя (например, "Huttlin Pilotlab"производства компании Huttlin GmbH) с последующей сушкой в потоке нагретого воздуха при температуре ниже 40°С. Расчетное количество высушенных гранул (10-34 массовых долей), насыщенных активированной-потенцированной формой антител, загружают в смеситель и смешивают с "ненасыщенной" чистой лактозой в количестве 25-45 массовых долей (для снижения стоимости, а также упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия). Затем в эту смесь добавляют стеарат магния в количестве 0,1-1 массовых долей и микрокристаллическую целлюлозу в количестве 3 -10 массовых долей. Полученную таблеточную массу равномерно перемешивают и таблетируют прямым сухим прессованием (например, в таблет-прессе Korsch-XL 400) для получения таблеток круглой формы массой 150-500 мг, преимущественно 300 мг. После таблетирования получают таблетки массой 300 мг, насыщенные водно-спиртовым раствором (3,06.0 мг/табл) активированной-потенцированной формы антител к рецептору CD4 в форме смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30 и С50 или смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30
и С200.
В лечебных целях заявленное комбинированное лекарственное средство преимущественно принимают 1-4 раза в день, преимущественно 2 раза в день, по 1-2 единицы комбинированного лекарственного средства на прием.
Технологический результат заявленного изобретения заключается в повышении надежности и воспроизводимости способов идентификации лекарственных препаратов, приготовленных по гомеопатической технологии, т.е. препаратов, не содержащих молекулярной формы в любой практически определяемой концентрации. Кроме того, заявленное изобретение повышает надежность и воспроизводимость способов определения фармакологического модифицирующего действия лекарственного препарата, т.е. активированной-потенцированной формы. Эти способы реализуются в условиях in vitro, т.е. вне орга
низма человека.
Способы достижения технологического результата изобретения имеют своей конечной целью определение степени модифицирующего действия активированной-потенцированной формы, приобретенного в процессе активации. Обработка исходного вещества, содержащего молекулярную форму, для получения лекарственного препарата, приготовленного по гомеопатической технологии, т.е. активированной-потенцированной формы, заключается в многократных последовательных разведениях носителем, при которых уменьшается концентрация исходного вещества.
Действие активированной-потенцированной формы проявляется в ее способности изменять физические, химические и/или биологические свойства терапевтической дозы другого вещества или влиять на них. Терапевтическая доза содержит молекулы, структурно сходные с молекулами исходного вещества, применяемого при приготовлении активированной-потенцированной формы. Заявленное изобретение включает определение с помощью аналитических методов изменений физических параметров терапевтической дозы после добавления к ней активированной-потенцированной формы структурно сходного вещества. Эти аналитические методы позволяют определять наличие или отсутствие активированной-потенцированной формы в терапевтической дозе. С помощью аналитических методов измеряют один или более физических параметров терапевтической дозы до и после смешивания с активированной-потенцированной формой. Степень действия терапевтической дозы до и после смешивания с активированной-потенцированной формой также измеряют с помощью аналитических методов. Изменения отличительного параметра выражают в относительных единицах.
На результат измерения отличительного параметра может повлиять присутствие в активированной-потенцированной форме молекулярной формы на определяемом уровне. Если в активированной-потенцированной форме присутствуют молекулы молекулярной формы на определяемом уровне, перед смешиванием активированной-потенцированной формы с терапевтической дозой необходимо удалить эти молекулы из активированной-потенцированной формы. Отсутствие молекулярной формы в образце для целей данного изобретения означает невозможность обнаружить эту молекулярную форму. Один из способов удаления молекулярной формы из активированной-потенцированной формы или достижения неопределяемого уровня заключается в дальнейшем разведении, например гомеопатическом сотенном разведении. Другой способ состоит в использовании молекулярного сита. Молекулярное сито - это материал с очень мелкими одинаковыми отверстиями точного размера. Эти отверстия достаточно малы, чтобы задерживать крупные молекулы и пропускать мелкие молекулы. Примеры молекулярного сита -активированный уголь и силикагель. Подобно молекулярному ситу, для удаления молекулярной формы или достижения неопределяемого уровня можно использовать любую процедуру и/или прибор, способный удерживать или замедлять молекулярную форму, пропуская носитель. Это позволяет применять процесс жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), при которой неподвижная фаза прибора ЖХВД удерживает или замедляет продвижение молекулярной формы, а подвижная фаза, содержащая активированную-потенцированную форму, проходит через прибор относительно беспрепятственно. В зависимости от параметров аффинности молекулярной формы к твердой фазе можно обеспечить полное отсутствие молекулярной формы на выходе из прибора ЖХВД как минимум в течение известного периода времени.
Кроме того, если в модифицированном растворителе присутствуют молекулы исходного вещества, их можно удалить известными методами. В частности, молекулы белка, взятого в качестве исходного вещества, можно удалить, например, путем нагревания модифицированного растворителя до достижения денатурации белка с последующей фильтрацией. В качестве альтернативы используется способ обессо-ливания, при котором белок осаждается высокими концентрациями нейтральных солей щелочей и редкоземельных металлов с последующей фильтрацией. К другим возможным способам относится электродиализ, деионизация с помощью ионообменных смол; обратный осмос; ультрафильтрация (молекулярная фильтрация) с предварительной фильтрацией через крупнопористый фильтр или без нее. Дополнительные примеры, применяемые в отрасли, можно найти в работах В.М. Steward. The production of high-purity water in the clinical laboratory, Laboratory Medicine, vol. 31(11), pp. 605-611 (2000); J. Grimm, D. Bessarabov, R. Sanderson, Review of electro-assisted method for water purification, Desalination, vol. 115 (3), pp. 285-294 (1998); I.A. Koznacheev, et al., Water purification of organic infusions in a reverse flow filtration combustion reactor, International Journal of Heat and Mass Transfer, vol. 54. pp. 932-937 (1998); Labconco Corporation, A Guide to Laboratory Water Purification, An Industry Service Publication, http://bioresearchonline.com. Все вышеупомянутые публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки для указанных целей.
Заявленный способ может быть осуществлен различными методами количественного и качественного определения, что обеспечивает высокую чувствительность и воспроизводимость анализов на наличие и действие активированной-потенцированной формы. К количественным и качественным методам относится хроматография с масс-спектрометрией, газожидкостная хроматография (ГЖХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ЯМР-спектроскопия, иммуноферментный анализ (ИФА).
Принцип хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами. Одна фаза в хроматографии неподвижна (сорбент), а другая подвижна (элюент). Отличительной особенностью ВЭЖХ является исполь
зование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3-5 мкм; сейчас до 1,8 мкм). Качественный анализ методом ВЭЖХ основан на оценке времени удерживания хроматографиче-ского пика. Количественный анализ основан на оценке площади пика.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия) - метод исследования, использующий магнитные свойства атомных ядер. ЯМР позволяет определять физико-химические свойства атомов или состоящих из них молекул. Он основан на явлении ядерного магнитного резонанса и позволяет получить подробную информацию о структуре, динамических процессах, состоянии реакции и химическом окружении молекул. Внутримолекулярное магнитное поле вокруг атома в молекуле меняет частоту резонанса, что дает подробную информацию об электронной структуре молекулы. Программное обеспечение позволяет проанализировать интенсивность сигнала пиков, которая в условиях оптимальной релаксации коррелирует с количеством протонов данного вида. Для анализа интенсивности сигналов применяется интегрирование -математический процесс расчета площади под кривой, размер сигнала зависит от этой площади.
Иммуноферментный анализ (ИФА) - биохимический метод исследования, в котором определяют присутствие или концентрацию макромолекулы в растворе с помощью антитела или иммуноглобулина. Макромолекула, определяемая в ходе иммуноферментного анализа, часто называется "аналитом". В идеальном случае антитело связывается с аналитом и только с ним. После связывания с аналитом антитело испускает сигнал, указывающий на присутствие одной молекулы аналита. Этот сигнал может представлять немедленное спонтанное высвобождение фотона света после связывания или высвобождение фотона света антителами, связанными с аналитом, после возникновения определенного "стимулирующего" сигнала. Аналогичным образом реакция антител, связанных с аналитом, на последующие этапы ИФА отличается от реакции несвязанных антител, что позволяет, например, удалить несвязанные антитела и оценить оставшееся количество связанных антител. Кроме того, антитела могут связываться с пьезоэлектрическим кристаллом, подвергающимся эластичной деформации при приложении к нему электрического тока. Переменный электрический ток (А.С.) возбуждает в кристалле постоянную волну характерной частоты. Частота сильно зависит от эластических свойств кристалла, на которые влияет связанное с кристаллом вещество. Связывание целевого аналита с антителом приводит к изменению частоты резонанса, что дает сигнал связывания. Для реализации заявленного способа применяются биологические и другие методы (см., например, Золотов Ю.А. (редактор), Начало аналитической химии (в 2-х т.), учебник для университетов, 3-е изд. (2004); Васильев В.П., Аналитическая химия (1989); Отто М., Современные методы аналитической химии, (2003).
Применяя сочетание аналитических методов для определения молекул исходного вещества в активированном-потенцированном носителе и измеряя аналитическими методами не менее одного отличительного параметра исходного вещества до и после его взаимодействия с активированным-потенцированным носителем, мы доказываем (утверждаем), что, во-первых, модифицирующее действие носителя не может быть объяснено присутствием молекул исходного вещества, и физические, химические и/или биологические свойства носителя отличаются от физических, химических и/или биологических свойств исходного вещества; во-вторых, активированный-потенцированный носитель получают из исходного вещества, при этом получение активированной-потенцированной формы обеспечивается самой операцией, применяемой при технологической обработке исходного вещества и представляющей многократное последовательное уменьшение концентрации последнего с помощью носителя. Наконец, на основании данных in vitro доказывается аутентичность и подлинность лекарственного препарата, приготовленного с применением активированного-потенцированного носителя. Это означает, что активированную-потенцированную форму получают из молекулярной формы в терапевтической концентрации путем многократного последовательного уменьшения концентрации молекулярной формы с помощью носителя. Кроме того, заявленное аналитическое измерение не менее одного отличительного параметра терапевтической формы перед взаимодействием с активированной-потенцированной формой и затем повторно после такого взаимодействия применяется для количественного определения степени модифицирующего действия активированной-потенцированной форме в относительных безразмерных единицах активности (релиз-активность).
Степень модифицирующего действия, свойственную активированной-потенцированной форме, определяют исходя из количественных изменений отличительного параметра, выраженных в относительных единицах активности (релиз-активность) по формуле (1)
Х = С|А-АМ|/А (1)
X - число единиц активности (ЕА);
С - безразмерная константа пропорциональности, зависящая от аналитических методов, применяемых при измерении отличительного параметра, отражающего изначальные физические, химические и/или биологические свойства исходного вещества, и от значения отличительного параметра. В частности, например, С=101?, где k - это интеграл из последовательности 1, 2, 3 и т.д.
А - значение отличительного параметра исходного вещества до взаимодействия с активированной-потенцированной формой (технологически обработанным носителем);
АМ - значение того же отличительного параметра исходного вещества после взаимодействия с акти
вированной-потенцированной формой (технологически обработанным носителем).
При осуществлении заявленного способа применяются различные методы количественного и качественного определения, что обеспечивает высокую чувствительность и воспроизводимость анализа сверхмалых концентраций вещества: спектрометрия, в частности масс-спектрометрия, хроматография с масс-спектрометрией (газожидкостная хроматография (ГЖХ)) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), состоящие в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами. Одна фаза в хроматографии неподвижна (сорбент), а другая подвижна (элюент). Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3-5 мкм; сейчас до 1,8 мкм). Качественный анализ методом ВЭЖХ основан на оценке времени удерживания хроматографического пика. Количественный анализ основан на оценке площади пика.
Другая технология, применяемая при осуществлении заявленного способа, - спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия), использующая магнитные свойства атомных ядер. ЯМР позволяет определять физико-химические свойства атомов или молекул, в которых они находятся. Он основан на явлении резонансного поглощения или излучения электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, на частоте v (так называемая частота ЯМР), обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер, при котором отличительным параметром является так называемый химический сдвиг. Кроме того, к упомянутым технологиям относится иммуноферментный анализ (ИФА), применение пьезоэлектрического иммуносенсора, аналитический сигнал от которого представляет разность частот резонанса пьезоэлектрического резонатора (Af), возникающую из-за увеличения или уменьшения массы покрытого рецепторами слоя вследствие образования и разрушения иммунных комплексов на его поверхности. Для реализации заявленного способа также применяются биологические и другие методы (например, см. Золотов Ю.А. (редактор), Начала аналитической химии (в 2-х т.), учебник для университетов, 3-е изд., исправленное и дополненное: издательство Высшая школа (2004); Васильев В.П., Аналитическая химия (1989); Отто, М., Современные методы аналитической химии, (2003).
Кроме того, если в модифицированном растворителе присутствуют молекулы исходного вещества, их можно удалить известными методами. В частности, молекулы белка, взятого в качестве исходного вещества, можно удалить, например, путем нагревания модифицированного растворителя до достижения денатурации белка с последующей фильтрацией. В качестве альтернативы используется способ обессо-ливания, при котором белок осаждается высокими концентрациями нейтральных солей щелочей и редкоземельных металлов с последующей фильтрацией. К другим возможным способам относится электродиализ, деионизация с помощью ионообменных смол; обратный осмос; ультрафильтрация (молекулярная фильтрация) с предварительной фильтрацией через крупнопористый фильтр или без нее. Дополнительные примеры, применяемые в отрасли, можно найти в работах В.М. Steward, The production of high-purity water in the clinical laboratory, Laboratory Medicine, vol. 31(11), pp. 605- 611 (2000); J. Grimm, D. Bes-sarabov, R. Sanderson, Review of electro-assisted method for water purification, Desalination, vol. 115 (3), pp. 285-294 (1998); I.A. Koznacheev, et al., Water purification of organic infusions in a reverse flow filtration combustion reactor, International Journal of Heat and Mass Transfer, vol. 54, pp. 932-937 (1998); Labconco Corporation, A Guide to Laboratory Water Purification, An Industry Service Publication. Доступно на сайте http://bioresearchonline.com. Все вышеупомянутые публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки для указанных целей.
Применяя сочетание аналитических методов для определения молекул исходного вещества в активированном-потенцированном носителе и измеряя аналитическими методами не менее одного отличительного параметра исходного вещества до и после его взаимодействия с активированным-потенцированным носителем, мы доказываем (утверждаем), что, во-первых, модифицирующее действие носителя не может быть объяснено присутствием молекул исходного вещества и физические, химические и/или биологические свойства носителя отличаются от физических, химических и/или биологических свойств исходного вещества; во-вторых, активированный-потенцированный носитель получают из исходного вещества, при этом получение активированной-потенцированной формы обеспечивается самой операцией, применяемой при технологической обработке исходного вещества и представляющей многократное последовательное уменьшение концентрации последнего с помощью носителя. Наконец, на основании данных in vitro доказывается аутентичность и подлинность лекарственного препарата, приготовленного с применением активированного-потенцированного носителя.
Кроме того, заявленное аналитическое измерение не менее одного отличительного параметра терапевтического вещества перед взаимодействием с активированной-потенцированной формы и затем повторно после такого взаимодействия применяется для количественного определения степени модифицирующего действия активированной-потенцированной форме в относительных безразмерных единицах активности (релиз-активность).
Для определения степени модифицирующего действия носителя последовательно проводят следующие операции:
a) приготовление носителя с модифицирующим действием, потенцированного в ходе технологиче
ской обработки (воздействия) исходного вещества путем многократного последовательного уменьшения концентрации с применением указанного носителя, при котором последний не содержит молекулярной формы исходного вещества;
b) исследование специфичности вещества, присутствующего в растворе, полученном на этапе а), в которое входит:
i) воздействие носителем, указанным на этапе а), на молекулярную форму терапевтического вещества;
ii. преимущественно воздействие носителем, указанным на этапе а), на молекулярную форму друго-
го вещества и/или растворителя;
iii. аналитическое измерение не менее одного физико-химического и/или биологического отличи-
тельного параметра молекулярной формы терапевтического вещества (А) и комбинации, указанной в п.
b) i) (АМ), при котором носитель так изменяет объем эффекта, что это приводит к изменению физико-
химических и/или биологических свойств терапевтического вещества, считается специфичным для этого
вещества, если изменение отличительного параметра при осуществлении п. b) i) обладает статистической
значимостью (и не обладает статистической значимостью при осуществлении п. b) ii));
c) определение модифицирующего действия носителя в относительных единицах согласно уравнению (1)
Определения X, С, А и АМ даны ранее, а С преимущественно равно 100 или 1000.
Примеры
Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими объем изобретения. Пример 1.
Цель примера 1 - определить степень модифицирующего действия активированной-потенцированной формы антител (AT) кролика к гамма-интерферону (ИФН-гамма) человека. Активированную-потенцированную форму AT кролика к ИФН-гамма человека готовили из маточного раствора AT кролика к ИФН-гамма человека путем многократных последовательных разведений с уменьшением концентрации исходного вещества в сочетании с многократным промежуточным встряхиванием. Растворителем, т.е. носителем, служил водно-спиртовой раствор. Молекулярную форму разводили в 10012, 10030 и 1005 частях носителя, т.е. готовили сотенные гомеопатические разведения С12, С30 и С50. Для определения изменения физических, химических и/или биологических свойств исходного вещества, т.е. AT кролика к ИФН-гамма человека, под действием активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма человека применяли спектроскопию и спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия).
Как сказано выше, одни и те же атомные ядра в различном молекулярном окружении испускают различные ЯМР-сигналы. Отличие такого сигнала от сигнала стандартного вещества дает возможность определить так называемый химический сдвиг, вызванный составом изучаемого вещества. Он использовался в качестве отличительного параметра, отражающего информацию о молекулярной формуле вещества.
Для определения конформационных изменений в ИФН-гамма к ИФН-гамма добавляли вещество, содержащее молекулы, структурно сходные с AT кролика к ИФН-гамма, и подвергнутое воздействию активированного-потенцированного носителя (иногда сокращаемого до "АП"), и проводили ЯМР-спектроскопию. В качестве плацебо использовали релиз-активные разведения очищенной воды.
Для приготовления испытуемых образцов активированную-потенцированную форму AT к ИФН-гамма или плацебо смешивали с раствором AT к ИФН-гамма в отношении 2:1 так, что итоговая концентрация AT к ИФН-гамма во всех образцах составляла 0,8 мг/мл.
ЯМР-эксперименты проводили при температуре 25°С на спектрометре Bruker Avance 900 MHz, оборудованном криозондом размером 5 мм с тройным резонансом и градиентом по оси z. АП или плацебо добавляли к 50 мкМ ИФН-гамма, меченного 15N, в растворе 180 мкл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0), содержащего 20 мМ NaCl и 10% D2O. Для получения спектров использовали стандартную последовательность импульсов HSQC с 2048 сканами в протонном измерении и 34 сканами в азотном измерении с задержкой Dl 1 с. Для получения данных использовали программное обеспечение Topspin версии 3.0. Для обработки и анализа спектров использовали программное обеспечение NMRView и Sparky. Наблюдаемые каркасные резонансы определяли с помощью ранее опубликованных данных ЯМР ИФН-гамма, полученных в сходных условиях.
Изменение химического сдвига ИФН-гамма при добавлении АП и плацебо показано на фиг. 1, где
в верхнем ряду 15N-1H-HSQC сигналы спектров ИФН-гамма в фосфатном буфере (рН 6,0) в отсутствие АП AT к ИФН-гамма имеют сферическую форму, а в присутствии АП AT к ИФН-гамма имеют овальную форму, спектр в полном размере (от 6,5 до 9,5 ч./млн) обозначен I, а участки с сильно искаженными сигналами увеличены в масштабе и обозначены II и III;
в нижнем ряду 15N-1H-HSQC сигналы спектров ИФН-гамма в фосфатном буфере (рН 6,0) в отсутствие плацебо имеют сферическую форму, а в присутствии плацебо имеют овальную форму, спектр в пол
ном размере (от 6,5 до 9,5 ч./млн) обозначен I, а участки с сильно искаженными сигналами увеличены в масштабе и обозначены II и III.
Только добавление к ИФН-гамма активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма вызывало выраженные изменения химического сдвига в общем спектре. На фоне добавления АП AT к ИФН-гамма к 50 мкМ ИФН-гамма наблюдались изменения химического сдвига в остатках А9, Е39, Е40, D42, Q47, 150, F82, F83, S85, А1 19 и Е120. Помимо этого сигналы, соответствующие остаткам 145 и VI17, и большое количество незарегистрированных пиков либо исчезли, либо полностью изменили положение. Кроме того, наблюдался гетерогенный сигнал в диапазоне 7-8,5 ppm в измерении Р, что доказывает образование новых конформаций ИФН-гамма. Добавление к ИФН-гамма активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма также вызывало расширение спектра HSQC, что указывает на общие молекулярные изменения в присутствии РА разведений AT к ИФН-гамма. Добавление АП AT к рецептору ИФН-гамма, а также добавление плацебо не влияло на конформацию ИФН-гамма (эти данные не отражены на фигуре).
Образец
Число связанных пиков ИФН-гамма перед добавлением соответствующих испытуемых образцов
Число связанных пиков ИФН-гамма, положение которых в общем спектре не изменилось после добавления соответствующих испытуемых образцов
Модифицирующее действие вещества в ЕАпряС = 100
ИФН-гамма + АП AT к ИФН-гамма
128
117
8,6
ИФН-гамма + АП AT к рецептору ИФН-гамма
128
128
ИФН-гамма + АП воды
128
128
Результаты исследования показали, что только добавление активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма влияло на конформацию ИФН-гамма. При подстановке в формулу (1) С=100, А=128 и Ам=113 получаем Х=100|128-113|/128. Таким образом, X=8,6 ЕА.
Результаты, полученные в примере 1, подтверждают следующие выводы:
1. Вследствие технологии приготовления гомеопатических разведений С12, С30, С50 активированная-потенцированная форма, содержащая смесь этих трех гомеопатических разведений, априори не содержит молекул исходного вещества.
2. Изменения физических и химических свойств ИФН-гамма, структурно сходного с молекулами AT к ИФН-гамма, под действием активированной-потенцированной формы достоверно доказывают, что указанная активированная-потенцированная форма приготовлена на основе исходного вещества ИФН-гамма.
3. Изменения физических и химических свойств ИФН-гамма под действием вышеуказанной активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма значимо подтверждают степень модифицирующего действия активированной-потенцированной формы и позволяют выразить модифицирующее действие активированной-потенцированной формы носителя, обнаруженное методом ЯМР-спектроскопии, в безразмерных единицах активности как X=8,6 ЕА.
Пример 2.
Пример 2 включает цистеиновую дериватизацию. Изменение конформации ИФН-гамма-R! и ИФН-гамма^2 в присутствии активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма исследовали с помощью биофизических зондов. Простой и очень специфичный метод внедрения биофизических зондов -цистеиновый мутагенез с последующей реакцией с реагентами для дериватизации, несущими исследуемую функциональную группу, с целью зондирования ее окружения. Свободная сульфгидрильная группа цистеина отвечает за химическую дериватизацию с различными реагентами, которые затем можно описать различными спектроскопическими методами. В этом случае исследуется доступность цистеина путем измерения поглощения. Таким образом, скорость реакции между цистеинами на ИФН-гамма, ИФН-гамма-R! и ИФН-гамма-RZ с реагентом для цистеиновой дериватизации служит количественным индикатором конформации.
Исследование конформации дикого типа ИФН-гамма-R! и ИФН-гамма-RZ начинается с 1-го этапа, который состоит в приготовлении 500 мкл раствора ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма^2, элюированного из стреп-колонки, при этом окончательная концентрация полученного ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма^2 соответствует максимальной концентрации, полученной при элюировании. Готовят раствор в буфере (2 мМ фосфата натрия и 0,05% DM при рН 6). Контрольное испытание включает приготовление 500 мкл буферного раствора (2 мМ фосфата натрия и 0,05% DM при рН 6). На 2-м этапе получают спектр поглощения. На 3-м этапе во все кюветы добавляют 4-PDS из 10 мМ маточного раствора до получения окончательной концентрации 25 мкМ и тщательно перемешивают. На 4-м этапе каждые 10 мин регистрируют спектр поглощения до насыщения пика поглощения при 323 нм. Для получения разности спектров вычи
тали спектр поглощения одного белка в присутствии и в отсутствие 4-PDS, чтобы рассчитать изменение поглощения при 323 нм. Количество цистеинов, вступивших в реакцию с 4-PDS на молекулу ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма-RZ, не определяли из-за неизвестности количеств присутствующих в растворе ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма^.
Теперь возможно исследовать влияние ИФН-гамма на конформацию рецептора. 1-й этап заключается в исследовании образца, которое начинается с приготовления 400 мкл (ФСБ+0,05% DM+70 мкМ нонапептид+25 мкМ 4-PDS)+50 мкл ИФН-гамма^1 или ИФН-гамма-R2+50 мкл ИФН-гамма (окончательная концентрация 0,04 мкг/мкл), и в контрольном испытании, в котором готовят 450 мкл (ФСБ+0,05% DM+70 мкМ нонапептид+25 мкМ 4-PDS)+50 мкл ИФН-гамма (окончательная концентрация 0,04 мкг/мкл). На 2-м этапе получают спектр поглощения. На 3-м этапе во все кюветы добавляют 4-PDS из 10 мМ маточного раствора до получения окончательной концентрации 25 мкМ и тщательно перемешивают. На 4-м этапе каждые 10 мин регистрируют спектр поглощения до насыщения пика поглощения при 323 нм.
Для получения разности спектров вычитали спектр поглощения одного белка в присутствии и в отсутствие 4-PDS, чтобы рассчитать изменение поглощения при 323 нм. Количество цистеинов, вступивших в реакцию с 4-PDS на молекулу ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма-R2, не определяли из-за неизвестности количеств присутствующих в растворе ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма^2.
Исследование влияния активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма на конформа-цию рецептора начинается с 1-го этапа, который состоит в подтверждении ИФН-гамма^1 или ИФН-гамма^ путем приготовления 400 мкл (ФСБ+0,05% DM+70 мкМ нонапептид+25 мкМ 4-PDS)+50 мкл ИФН-гамма-Ш+50 мкл активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма. В качестве контроля готовят 450 мкл (ФСБ+0,05% DM+70 мкМ нонапептид+25 мкМ 4-PDS)+50 мкл активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма и 450 мкл (ФСБ+0,05 % DM+70 мкМ нонапептид+25 мкМ 4-PDS)+50 мкл ИФН-гамма-RL На 2-м этапе компоненты из пробирки Эппендорф перемешивают и затем переносят в кювету. На 3-м этапе получают спектр поглощения. На 4-м этапе во все кюветы добавляют 4-PDS из 10 мМ маточного раствора до получения окончательной концентрации 25 мкМ и тщательно перемешивают. На 5-м этапе каждые 10 мин регистрируют спектр поглощения до насыщения пика поглощения при 323 нм.
Для получения разности спектров вычитали спектр поглощения одного белка в присутствии и в отсутствие 4-PDS, чтобы рассчитать изменение поглощения при 323 нм. Количество цистеинов, вступивших в реакцию с 4-PDS на молекулу ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма-R2, не определяли из-за неизвестности количеств присутствующих в растворе ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма^2.
Результаты представлены на фиг. 4 и 5. Продолжительность изменения при 323 нм для ИФН-гамма-R1 (фиг. 4), ИФН-гамма-R2 (фиг. 5). Каждые 10 мин регистрируют спектр поглощения до насыщения пика поглощения при 323 нм. Для получения разности спектров вычитают спектр поглощения одного белка ИФН-гамма-Цис, ИФН-гамма-R^ ИФН-гамма^2, либо ИФН-гамма, ИФН-гамма^1-Цис, ИФН-гамма^2, либо ИФН-гамма, ИФН-гамма-R^ ИФН-гамма-R2-Цис в присутствии и в отсутствие 4-PDS, чтобы рассчитать изменение поглощения при 323 нм. ATI - активированная-потенцированная форма AT к ИФН-гамма.
Таким образом, доказано, что активированная-потенцированная форма AT к ИФН-гамма вызывает конформационные изменения рецепторного комплекса, о чем свидетельствуют структурные изменения конформационных маркеров, прикрепленных к цистеинам в цитоплазматическом домене ИФН-гамма^1 и ИФН-гамма-R2, очищенных в растворенных в поверхностно-активных мицеллах. Конформационные изменения в рецепторах наблюдались даже в отсутствие ИФН-гамма. что указывает на прямое влияние активированной-потенцированной формы AT к ИФН-гамма на рецепторы.
Пример 3.
Пример 3 включает количественное определение фермента ЦОГ-1. В примере 3 исследуется влияние предварительной инкубации активированной-потенцированной формы диклофенака с ферментом циклооксигеназа 1 типа (ЦОГ-1) на способность диклофенака ингибировать специфическую активность фермента ЦОГ-1. В качестве плацебо использовали активированную-потенцированную форму дистиллированной воды.
Два испытуемых образца (активированная-потенцированная форма диклофенака и плацебо) предварительно инкубировали со смесью ферментов при комнатной температуре (КТ) в течение 1 ч. После этого диклофенак в концентрации 10-7 М (IC50) добавляли к предварительно инкубированному ферменту, проводили вторую предварительную инкубацию в течение 5 мин при КТ и измеряли оптическую плотность (ОП) на планшетном анализаторе Perkin Elmer Victor 2 при длине волны 590 нм (см. таблицу).
План эксперимента
Количество повторностей лунок - 3
Количество повторностей лучок
Испытуемый образец
Контроль № 1
Этап 1.
130 мкл ферментного мастер-микса (буфер,
гем, фермент - ЦОГ-1)
20 мкл испытуемого образца
Этап 1.
130 мкл ферментного мастер-микса (буфер,
гем, фермент - ЦОГ-1)
20 мкл контрольного образца
Этап 2. Инкубация при КТ в течение 1 часа.
Этап 3. В лунку добавляют 20 мкл диклофенака (10" М, ICso)
Этап 4. Инкубация при КТ в течение 5 минут.
Этап 5. Добавляют 20 мкл колориметрического субстрата ТМФД (N^.N/N'-тетраметрил-р-фенилендиамин), выдержанного на льду
Этап 6. Запускают реакцию путем добавления 10 мкл арахидоновой кислоты,
выдержанной на льду (окончательная концентрация 50 мкМ)
Этап 7. Инкубируют в течение 3 мин при КТ и считывают при длине волны 590 нм
(планшетный анализатор Perkin Elmer Victor 2)
Доказано, что предварительная инкубация источника фермента (ЦОГ-1) с активированной-потенцированной формой диклофенака в течение 1 ч перед добавлением диклофенака и его последующая инкубация в течение 5 мин приводит к повышению ингибирующей активности диклофенака по сравнению с плацебо: 78% по сравнению с 34%.
Приведенное описание, примеры и иллюстрации представляют предпочтительный вариант осуществления изобретения и в качестве такового отражают предмет изобретения. Объем изобретения полностью охватывает другие варианты осуществления, очевидные для специалистов, и соответственно объем изобретения ограничивается только заявленной формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения модифицирующей активности активированной-потенцированной формы вещества, включающий:
a) получение активированной-потенцированной формы исходного вещества,
b) обеспечение отсутствия молекулярной формы исходного вещества в указанной активированной-потенцированной форме,
c) получение молекулярной формы второго вещества,
d) измерение по крайней мере одного физического, химического или биологического параметра (А) указанной молекулярной формы при помощи соответствующего аналитического метода,
e) обработку указанной молекулярной формы вещества вышеуказанной активированной-
потенцированной формой и
f) измерение с помощью указанного аналитического метода соответствующего (по крайней мере
одного) физического, химического или биологического параметра (АМ) молекулярной формы вещества,
обработанной активированной-потенцированной формой вещества,
при этом активность вышеуказанной активированной-потенцированной формы исходного вещества определяется по степени различия между показателями А и АМ, причем указанное второе вещество представляет собой антитела к исходному веществу или рецепторы к исходному веществу; или исходное вещество представляет собой антитела к определенному антигену, а второе вещество представляет собой указанный антиген или рецептор указанного антигена.
2. Способ по п.1, далее включающий выражение активности вышеуказанной активированной-потенцированной формы в относительных единицах (X) по формуле Х=С|А-АМ|/А, где С - безразмерная константа пропорциональности.
3. Способ по п.1, далее включающий 1) обработку молекулярной формы третьего вещества вышеуказанной активированной-потенцированной формой исходного вещества, 2) измерение соответствующего (по крайней мере одного) физического, химического или биологического параметра (ВМ) обработанной молекулярной формы данного третьего вещества с использованием вышеуказанного аналитического метода для определения его специфичности и характеризующийся тем, что последний считается обладающим специфичестью, если указанный (по крайней мере один) физический, химический или биологический параметр демонстрирует статистически значимые изменения при определении А-АМ и их отсутствие для В-ВМ.
4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является высокоэффективная жидкостная хроматография.
5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является имму-ноферментный анализ.
6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным аналитическим методом является спектроскопия ЯМР.
7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что этап обеспечения отсутствия молекулярной формы
предполагает удаление молекулярной формы указанного вещества.
8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве указанного исходного вещества используются антитела.
9. Способ по п.8, характеризующийся тем, что указанные антитела являются поликлональными антителами.
10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанное исходное вещество является малой органической молекулой.
11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная активированная-потенцированная форма является жидкостью.
12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная активированная-потенцированная форма наносится на твердый носитель.
8.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032090
- 1 -
(19)
032090
- 1 -
(19)
032090
- 1 -
(19)
032090
- 4 -
(19)
032090
- 12 -
032090
- 12 -
032090
- 12 -
032090
- 12 -
032090
- 14 -
|
