|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий: a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, где каждый из VP2, VP6 и VP7 введен в растение, часть растения или клетку растения, где первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид из растительного полипептида; b) инкубирование растения, части растения или клетки растения, для временной экспрессии первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7; c) сбор растения, части растения или клетки растения и d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии иона кальция (Са 2+ ). 2. Способ по п.1, при котором четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, вводят в растение, часть растения или клетку растения на стадии а) и экспрессируют при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии b), причем четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP4. 3. Способ по п.1, при котором первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты вводят в растение, часть растения или клетку растения в пропорции 1:1:1. 4. Способ по п.2, при котором первую, вторую, третью и четвертую нуклеиновые кислоты вводят в растение, часть растения или клетку растения в пропорции 1:1:1:1. 5. Способ по п.1 или 2, при котором использование кодонов нуклеотидной последовательности доводят до предпочтительного использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации. 6. Способ по п.1, в котором первая, вторая и третья нуклеотидная последовательность функционально связана с энхансером трансляции. 7. Способ по п.6, в котором энхансер трансляции включает регуляторную область вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 8. Способ по п.1, при котором первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 9. Способ по п.2, при котором первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 10. Способ по п.1, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57. 11. Способ по п.2, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51. 12. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п.1 или 2, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм. 13. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п.12 для индуцирования иммунного ответа к ротавирусной инфекции у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель. 14. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий: а) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, содержащую третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растении, части растения или клетке растения; причем первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP7, причем VP7 содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид из растительного полипептида; b) инкубирование растения, части растения или клетки растения для временной экспрессии первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7; c) сбор растения, части растения или клетки растения и d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии иона кальция (Са 2+ ). 15. Способ по п.14, где растение, часть растения или клетка растения включает четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, причем четвертый ротавирусный структурный белок экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии b), причем четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP4. 16. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п.14 или 15, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм. 17. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п.16 для индуцирования иммунного ответа к ротавирусной инфекции у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель. 18. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п.17. 19. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п.13. 20. Способ по п.1 или 2, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI). 21. Способ по п.14 или 15, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI). 22. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий: a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, где каждый из VP2, VP6 и VP7 введен в растение, часть растения или клетку растения, где первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид; b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7; c) сбор растения, части растения или клетки растения и d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий: a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, где каждый из VP2, VP6 и VP7 введен в растение, часть растения или клетку растения, где первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид из растительного полипептида; b) инкубирование растения, части растения или клетки растения, для временной экспрессии первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7; c) сбор растения, части растения или клетки растения и d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии иона кальция (Са 2+ ). 2. Способ по п.1, при котором четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, вводят в растение, часть растения или клетку растения на стадии а) и экспрессируют при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии b), причем четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP4. 3. Способ по п.1, при котором первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты вводят в растение, часть растения или клетку растения в пропорции 1:1:1. 4. Способ по п.2, при котором первую, вторую, третью и четвертую нуклеиновые кислоты вводят в растение, часть растения или клетку растения в пропорции 1:1:1:1. 5. Способ по п.1 или 2, при котором использование кодонов нуклеотидной последовательности доводят до предпочтительного использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации. 6. Способ по п.1, в котором первая, вторая и третья нуклеотидная последовательность функционально связана с энхансером трансляции. 7. Способ по п.6, в котором энхансер трансляции включает регуляторную область вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 8. Способ по п.1, при котором первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 9. Способ по п.2, при котором первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 10. Способ по п.1, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57. 11. Способ по п.2, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51. 12. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п.1 или 2, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм. 13. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п.12 для индуцирования иммунного ответа к ротавирусной инфекции у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель. 14. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий: а) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, содержащую третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растении, части растения или клетке растения; причем первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP7, причем VP7 содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид из растительного полипептида; b) инкубирование растения, части растения или клетки растения для временной экспрессии первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7; c) сбор растения, части растения или клетки растения и d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии иона кальция (Са 2+ ). 15. Способ по п.14, где растение, часть растения или клетка растения включает четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, причем четвертый ротавирусный структурный белок экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии b), причем четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP4. 16. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п.14 или 15, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм. 17. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п.16 для индуцирования иммунного ответа к ротавирусной инфекции у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель. 18. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п.17. 19. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п.13. 20. Способ по п.1 или 2, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI). 21. Способ по п.14 или 15, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI). 22. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий: a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, где каждый из VP2, VP6 и VP7 введен в растение, часть растения или клетку растения, где первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид; b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7; c) сбор растения, части растения или клетки растения и d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения.
Евразийское 032089 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки
201492014
(22) Дата подачи заявки 2013.05.10
(51) Int. Cl.
C12N 7/04 (2006.01) A61K39/15 (2006.01) A61P31/14 (2006.01) A61P37/04 (2006.01)
C07K 14/14 (2006.01)
C12N15/46 (2006.01) C12N15/82 (2006.01)
C12N 7/01 (2006.01)
(54) ПОЛУЧЕНИЕ РОТАВИРУС-ПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ В РАСТЕНИЯХ
(31) 61/646,058
(32) 2012.05.11
(33) US
(43) 2015.02.27
(86) PCT/CA2013/050364
(87) WO 2013/166609 2013.11.14
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МЕДИКАГО ИНК. (CA); МИТСУБИШИ ТАНАБЕ ФАРМА КОРПОРЕЙШН (JP)
(72) Изобретатель:
Д'Ау Марк-Андре, Ландри Натали, Лавуа Пьер-Оливье (CA), Арай Масааки, Асахара Наоми (JP), Мутепфа Дэвид Леви Рутендо (GB), Хитзерот Инга Исабель, Рибики Эдвард Питер (ZA)
(74) Представитель:
Глухарёва А.О. (RU)
(56) YANG, Y. M. et al., "Immunogenicity and viruslike particle formation of rotavirus capsid proteins produced in transgenic plants", SCIENCE CHINA LIFE SCIENCES. January 2011 (01-2011), Vol. "54, No. 1, pages 82-89. ISSN: 1869-1889. See whole document.
CRAWFORD, S. E. et al., "Characterization of virus-like particles produced by the expression of rota virus capsid proteins in insect cells", JOURNAL OF VIROLOGY. September 1994 (09-1994), Vol. 68, No. 9, pages 5945-5952. ISSN: 0022-538X. See whole document.
WO-A2-2007081447
LI, J. Т. et al., "Immunogemcity of a plant-derived edible rotavirus subunit vaccine transformed
over fifty generations", VIROLOGY. 2006 (2006),
Vol. 356, pages 171-178. ISSN:0042-6822. See whole document.
(57) Предусмотрен способ получения вирусоподобных частиц (VLP) в растении. Способ предусматривает введение первой нуклеиновой кислоты в растение или часть растения. Первая нуклеиновая кислота, содержащая первую регуляторную область, активную в растении, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP2. Нуклеотидная последовательность может дополнительно содержать один или более чем один элемент амплификации и/или нацелено воздействующую на компартмент последовательность. Вторая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения. Вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP6. Не обязательно третья нуклеиновая кислота и/или четвертая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения. Третья нуклеиновая кислота содержит третью регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP4. Четвертая нуклеиновая кислота содержит четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP7. Растение или часть растения инкубируют в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновых кислот, таким образом получая VLP.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к производству ротавирусных структурных белков в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству вирусоподобных частиц, содержащих ротавирусный структурный белок в растениях.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Ротавирусная инфекция представляет собой глобальную проблему, главным образом, влияющую на детей в возрасте до пяти лет. Это приводит к тяжелому гастроэнтериту и, в худшем случае, к смерти.
Ротавирусы представляют собой представителей семейства Reoviridae вирусов (род Rotavirus), которые влияют на желудочно-кишечный тракт и дыхательную систему. Название происходит от подобного колесу внешнего вида вирионов при просмотре с помощью отрицательной контрастной электронной микроскопии (фиг. 1А; предшествующий уровень техники). Ротавирус обычно шаровидной формы и назван в честь внешних и внутренних слоев или двухслойной структуры капсида. Наружный капсид составляет около 70 нм, а внутренний капсид составляет около 55 нм в диаметре, соответственно. Двухслойный капсид ротавируса окружает сердцевину, включающую в себя внутренний белковый слой и геном. Геном ротавируса состоит из двухцепочечных сегментов РНК, кодирующих по меньшей мере 11 ротавирусных белков.
дцРНК кодирует шесть структурных белков (VP) и шесть неструктурных белков (NSP) (фиг. 1c; предшествующий уровень техники). Структурные белки содержат VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 и VP7 (фиг. 1b; предшествующий уровень техники). Три концентрических слоя образуются путем сборки VP2, VP6 и VP7, соответственно, с VP4, образующим "шипы" на поверхности вирусной структуры. NSP синтезируются в инфицированных клетках и функционируют в различных частях цикла репликации или взаимодействуют с некоторыми из хозяйских белков для влияния на патогенез или иммунный ответ на инфекцию (Greenberg and Estes, 2009).
VP2 представляет собой белок размером 102 кДа, и это наиболее распространенный белок вирусной сердцевины. Он образует внутренний - наиболее структурированный слой белка и обеспечивает остов для правильной сборки компонентов и ферментов транскрипции вирусной сердцевины (Lawton, 2000). VP1, самый большой вирусный белок размером 125 кДа, действует как РНК-зависимая полимераза для ротавируса, создавая промежуточный продукт репликации сердцевины, и ассоциирует с VP2 на своих икосаэдрических вершинах (Varani and Allain, 2002; Vende et al., 2002). VP3, белок размером 98кДа, также непосредственно связан с вирусным геномом, действуя как кэппирующий мРНК фермент, который добавляет структуру 5' кэпа к вирусным мРНК. VP1 и VP3 вместе образуют комплекс, который крепится к наружным 5-кратным вершинам капсидного слоя VP2 (Angel, 2007). VP6 представляет собой белок размером 42 кДа, который образует среднюю оболочку вирусной сердцевины, представляет собой основной белок капсида и составляет более 50% от общей массы белков вириона (Gonzalez et al., 2004; Es-tes, 1996). Он необходим для транскрипции генов и может играть определенную роль в инкапсуляции ротавирусной РНК путем заякоривания VP1 к VP2 в сердцевине, как видно у вируса катаральной лихорадки овец, другого представителя семейства Reoviridae. Он также определяет классификацию ротавиру-сов на пять групп (A-E) с группой A, наиболее часто воздействующей на людей (Palombo, 1999). VP6 в группе A ротавирусов содержит по меньшей мере четыре подгруппы (SG), которые зависят от наличия или отсутствия специфических эпитопов SG: SG I, SG II, SG и SG не-^+П). Группы B и C не содержат антиген общей группы A, но, как известно, заражают людей, в то время как группа D оказывает влияние только на животных, например, кур и коров (Thongprachum, 2010).
Два белка внешнего капсида VP7, гликопротеин (G) размером 37 кДа и чувствительный к протеазе VP4 (Р) размером 87 кДа, определяют серотипы вирусов. Эти два белка индуцируют нейтрализующие антитела реакции и, таким образом, используются для классификации серотипов ротавирусов в двойной номенклатурной системе в зависимости от комбинации антигенов G-P (например, G1 Р[8] или G2 P[4]) (Sanchez-Padilla et al., 2009). Белок VP4 димеризуется для образования 60 шипов на внешней оболочке вируса, которые непосредственно участвуют в начальных стадиях проникновения в клетки-хозяева. Белок шипов содержит сайт расщепления в аминокислотном (AA) положении 248. При заражении он расщепляется протеазой трипсином и производит VP5 (529 aa, 60 кДа) и VP8 (246 aa, 28 кДа) (Denisova et al., 1999). Этот процесс усиливает инфекционность вируса (прикрепление к клеткам и вторжение в клетку-хозяина) и стабилизирует структуру шипов (Glass, 2006).
Гликопротеин VP7 образует третий или наружный слой вируса. В настоящее время известны генотипы 27 G и 35 P (Greenberg and Estes, 2009). VP4 и VP7 представляют собой основные антигены, участвующие в нейтрализации вируса и представляют собой важные мишени для разработки вакцин (Dennehy,
2007).
В инфицированных клетках млекопитающих ротавирусы подвергаются уникальному виду морфогенеза для образования полных трехслойных вирусных частиц VP2/6/4/7 (Lopez et al., 2005). Трехслойный капсид представляет собой очень стабильный комплекс, который позволяет фекально-оральную передачу и доставку вируса в тонкий кишечник, где он инфицирует неделящиеся дифференцированные энтероциты возле кончиков ворсинок (Greenberg and Estes, 2009). Сначала интактный вирус прикрепляется к независимым от сиаловой кислоты рецепторам через 60 димерных шипов VP4 на поверхности ви
руса (Lundgren and Svensson, 2001). 60 димерных шипов VP4 на поверхности вируса позволяют вирусу прикрепиться к этим клеточным рецепторам. VP4 восприимчив к протеолитическому расщеплению трипсином, что приводит к конформационному изменению, которое предоставляет дополнительные сайты крепления на поверхности гликопротеина для взаимодействия с серией корецепторов.
Многостадийное прикрепление и процесс вхождения, однако, не совсем понятны, но вирус доставляется через плазматическую мембрану хозяина. Внешняя капсидная оболочка VP7, которая также участвует в процессе входа, удаляется в процессе, и двухслойные частицы (DLP) доставляются в цитоплазму клеток в везикулах (фиг. 2; предшествующий уровень техники). DLP выходит из везикулы и переходит в немембраносвязанные цитоплазматические включения. Ранняя транскрипция генома с помощью VP1 начинается в частицах, так что дцРНК никогда не экспонируется в цитоплазму. Репликация РНК и образование сердцевины происходит в этих не связанных с мембраной цитоплазматических включениях. Возникающие (+)РНК затем транспортируются в цитоплазму и служат матрицами для синтеза вирусных белков. VP4 производится в цитозоле и транспортируется к шероховатому эндоплазматическому ретику-луму (RER), и VP7 секретируется в RER. VP2 и VP6 производятся и собираются в цитозоле в виросомах и впоследствии почкуются в компартментах RER, получая временную мембранную оболочку в процессе (Lopez et al., 2005; Tian et al., 1996). В RER временные оболочки вирусных частиц удаляются и заменяются белковыми мономерами VP4 и VP7 с критическим участием ротавирусного гликопротеина NSP4 (Tian et al., 1996; Lopez et al., 2005; Gonzalez et al., 2000). NSP4 функционирует как внутриклеточный рецептор в мембране ER и связывается с вновь произведенными субвирусными частицами и, возможно, также с белком шипов VP4 (Tian et al., 1996). NSP4 также токсичен для людей и представляет собой возбудителя диареи. Полные, зрелые частицы затем передаются от RER через аппарат Гольджи к плазматической мембране для секреции (Lopez et al., 2005).
Было предпринято множество различных подходов для создания ротавирусной вакцины, подходящий для защиты человеческих популяций от различных серотипов ротавируса. Эти подходы включают в себя различные подходы по Дженнеру, использование живых ослабленных вирусов, использование вирусоподобных частиц, вакцин на основе нуклеиновых кислот и вирусных субъединиц в качестве имму-ногенов. В настоящее время существует две пероральные вакцины, доступные на рынке, однако, они характеризуются низкой эффективностью в некоторых развивающихся странах из-за изменчивости штаммов и наличия других патогенов.
В каждом из патентов США № 4624850, 4636385, 4704275, 4751080, 4927628, 5474773 и 5695767 описаны разнообразные ротавирусные вакцины и/или способы их получения. Общность, разделенная представителями этой группы, представляет собой то, что каждая из этих вакцин основывается на использовании целых вирусных частиц для создания окончательной вакцины ротавируса. Учитывая давнюю потребность в эффективной, поливалентной вакцине, ясно, что этот объем работы был лишь частично успешным в решении необходимости такой вакцины.
Исходя из традиционных методов создания вакцин, достижения в области молекулярной биологии дали возможность экспрессии отдельных ротавирусных белков. Crawford et al. (J Virol. 1994 September; 68(9): 5945-5952) клонировали VP2, VP4, VP6 и VP7, кодирующие основной капсидный белок, в системе экспрессии бакуловируса, и экспрессировали каждый белок в клетках насекомых. Коэкспрессия различных комбинаций основных структурных белков ротавируса приводила к образованию устойчивых вирусоподобных частиц (VLP). Коэкспрессия VP2 и одного VP6 или с VP4 приводила к получению VP2/6 или VP2/4/6 VLP, которые были похожи на двухслойные частицы ротавируса. Коэкспрессия VP2, VP6 и VP7 с или без VP4, приводила к образованию трехслойных VP2/6/7 или VP2/4/6/7 VLP, которые были похожи на нативные инфекционные частицы ротавируса. VLP поддерживали структурные и функциональные характеристики нативных частиц, что определено с помощью электронной микроскопии частиц, присутствие не-нейтрализующих и нейтрализующих эпитопов на VP4 и VP7 и активность гемагглютинации
VP2/4/6/7 VLP.
Кандидатные вакцины, полученные от вирусоподобных частиц различных белковых композиций, показали потенциал в качестве субъединичных вакцин. O'Neal et al. ("Rotavirus Virus-like Particles Administered Mucosally Induce Protective Immunity," J. Virology, 71(11):8707-8717 (1997)) показал, что VLP, содержащие VP2 и 6 или VP2, 6 и 7 при введении мышам с и без добавления холерного токсина индуцировали защитный иммунитет у иммунизированных мышей, хотя защита была более эффективной, когда VLP вводили с токсином холеры (СТ).
Сердцевиноподобные частицы (CLP) и VLP также были использованы для иммунизации коров. Fernandez, et al. ("Passive Immunity to Bovine Rotavirus in Newborn Calves Fed Colostrum Supplements From Cows Immunized with Recombinant SA11 rotavirus core-like particle (CLP) or virus-like particle (VLP) vaccines," Vaccine, 16(5):507-516 (1998)). В данном исследовании изучалась способность CLP и VLP создавать пассивный иммунитет. Это группа пришла к выводу, что VLP были более эффективными, чем CLP в индуцировании пассивного иммунитета.
Растения все чаще используются для крупномасштабного производства рекомбинантных белков. Например, в патенте США 2003/0175303 раскрыта экспрессия рекомбинантного ротавирусного структурного белка VP6, VP2, VP4 или VP7 в стабильных трансформированных растениях томата.
Saldana et al., экспрессировали VP2 и VP6 в цитоплазме растений томата с использованием промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и рекомбинантного A. tumefaciens (Saldana et al., 2006). Электронно-микроскопические исследования показали, что небольшая доля частиц собиралась в 2/6 VLP. У мышей был обнаружен защитный иммунный ответ, и это могло до некоторой степени вносить вклад в несобранные VP. Как было показано, отдельные белки вызывают иммунный ответ у мышей, как и в случае с VP8 и VP6 (Zhou et al., 2010).
Matsumura et al. (2002) были первыми, кто сообщил об экспрессии VP6 и сборке бычьего ротавиру-са А в трансгенных растениях картофеля. В их исследовании они использовали трансгенные растения картофеля, регулируемые промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и рекомбинантным Agrobacterium tumefaciens, несущим ген VP6. Белок экспрессировали, очищали и выполняли иммуноген-ные исследования. Иммунный ответ у взрослых мышей показал наличие антител VP6 в сыворотке. Тем не менее, они не показали доказательства собранных белков VP6.
Возможно, это были простые мономеры или тримеры, которые могли вызывать иммунный ответ у мышей. Работа другой группы показала сборку VP6 в Nicotiana benthamiana с использованием вектора вируса X картофеля (PVX) (O'Brien et al., 20000). Когда экспрессировали белок VP6 в растениях, было обнаружено, что он собирается только, когда слит с белковыми стержнями PVX. После того, как произошло расщепление, VP6 собираются в икосаэдрические VLP, как показано в аналогичном исследовании HIV-PVX Marusic et al. (2001). Этот результат, вероятно, предполагает, что белки ротавируса могут требовать дополнительный фактор или активацию для образования VLP.
Производство VLP представляет собой сложную задачу, так как требуются и синтез, и сборка одного или нескольких рекомбинантных белков. Это представляет собой случай VLP ротавируса, который представляет собой РНК-содержащий вирус с капсидом, образованным 1860 мономерами четырех различных белков. Для производства VLP необходима одновременная экспрессия и сборка от 2 до 3 реком-бинантных белков. Они включают 120 молекул VP2 (внутренний слой), 780 молекул VP6 (средний слой) и 780 молекулы гликопротеина VP7 (наружный слой), в конечном счете, образуя двухслойную или трехслойную частицу. Кроме того, производство большинства VLP требует одновременной экспрессии и сборки нескольких рекомбинантных белков, которые - в случае подобных ротавирусу частиц (RLP)-должны происходить в одной клетке-хозяине.
Более позднее исследование показало успешную экспрессию кодон-оптимизированного VP6 рота-вируса человека в Chenopodium amaranticolor с использованием опосредованной вирусом черного ожога свеклы (BBSV) системы экспрессии. Белок был разработан в качестве замены белка оболочки открытой рамки считывания BBSV. Пероральная иммунизация самок мышей BALB/c основанным на растениях белком VP6 индуцировала высокие титры слизистых IgA и сывороточных IgG к VP6 (Zhou et al., 2010). Группа, однако, не упоминала, собирались ли белки VP6 VLP или частицы.
VP7 ротавируса также успешно экспрессировался в растениях табака, и было показано, что он сохраняет свой нейтрализующий иммунный ответ у мышей (Yu and Langridge, 2001). Другое исследование с использованием трансгенных растений картофеля для экспрессии VP7 показало, что ген VP7 был стабильным в течение 50 поколений в трансформированных растениях. Белок VP7 из 50-го поколения индуцировал как защитные, так и нейтрализующие антитела у взрослых мышей (Li et al., 2006).
Yang с соавт. (Yang Y M, Li X, Yang H, et al., 2011) коэкспрессировали три ротавирусных белка кап-сида VP2, VP6 и VP7 группы A RV (P[8]G1) в растениях табака и изучали уровни экспрессии этих белков, а также образование ротавирус-подобных частиц и иммуногенность. VLP очищали от трансгенных растений табака и анализировали с помощью электронной микроскопии и Вестерн-блоттинга. Результаты Yang с соавт. показывают, что полученный из растений белок VP2, VP6 и VP7 самособирается в рота-вирус-подобную частицу 2/6 или 2/6/7 с диаметром 60-80 нм.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к области получения ротавирусных структурных белков в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение также относится к производству вирусоподобных частиц, содержащих ротавирусный структурный белок в растениях.
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ (A) получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, предусматривающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Кроме того четвертая нуклеиновая кислота, содержащая четвертую регуляторную область, актив
ную в растении и функционально связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, может быть введена в растение, часть растения или клетку растения на стадии а), и экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии b).
В описаном выше способе (A) первый ротавирусный структурный белок может представлять собой VP2, второй ротавирусный структурный белок может представлять собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок может представлять собой VP4 или VP7. Кроме того, четвертый ротавирусный структурный белок может представлять собой VP7 или VP4. VP4 может процессировать или расщепляться для получения VP5 и VP8. Расщепление VP4 может быть выполнено с использованием протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы или субтилизина. Протеаза может быть коэкспрессирована в растении.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ (B) получения ротавирус-подобной частицы (RLP), предусматривающий:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, в растение, часть растения или клетку растения;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Описанный выше способ (B) может дополнительно предусматривать введение (на стадии а) второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротави-русных структурных белков, и экспрессирующей вторую нуклеиновую кислоту при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии b).
Описанный выше способ (B) может дополнительно предусматривать введение (на стадии а) третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область активную в растении и функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирус-ных структурных белков, инкубированной в растении, части растения или клетке растения на стадии а), и экспрессирующей третью нуклеиновую кислоту при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии b).
Кроме того, в способе (A) или (B) дополнительная нуклеиновая кислота может быть экспрессиро-вана в растении, части растения или клетке растения, и причем дополнительная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей супрессор сайленсинга.
Использование кодонов в нуклеотидной последовательности может быть приведено к предпочтительному использованию кодонов человека, повышенному содержанию GC или их комбинации.
Ротавирусный структурный белок может содержать усеченный, нативный или ненативный сигнальный пептид. Ненативный сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид проте-индисульфидизомеразы (PDI).
Первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их сочетание могут быть функционально связаны с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
Описанный выше способ (A) или (B) может дополнительно предусматривать стадии:
c) сбора растения, части растения или клетки растения и
d) очистки RLP из растения, части растения или клетки растения.
На стадии сбора или очистки в способе (A) или (B) VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 с использованием трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
RLP может находиться в диапазоне размеров от 70-100 нм и может быть очищен в присутствии кальция.
В настоящем изобретении предусмотрен RLP, полученный описанными выше способами (A) или (B). Произведенная RLP может содержать по меньшей мере ротавирусный структурный белок VP4. VP4 может расщепляться на VP5 и VP8 с использованием протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина. Протеаза может быть коэкспрессирована в растении или добавлена во время сбора, очистки или того и другого. Кроме того RLP, полученная способом (A) или (B), может представлять собой двухслойную RLP и/или трехслойную
RLP.
Кроме того, предусмотрены нуклеотидные последовательности. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, может характеризоваться от 80 до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45. Нук-леотидная последовательность, кодирующая последовательность VP6, может характеризоваться от 80 до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46. Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность VP7, может характеризоваться от 80 до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной
последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57. И нуклео-тидная последовательность, кодирующая VP4, может характеризоваться от 80 до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51. Кроме того, VP2 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80 до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 25. VP6 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80 до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 31. VP7 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80 до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 4, 39, 43 или 59. VP4 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80 до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 36. 33. Один или несколько ротавирусных структурных белков могут представлять собой VP2, VP4, VP6 и/или VP7. VP4 может быть процессирован до VP5 и VP8. Один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть выбраны из ротавирусного штамма G9 P[6], штамм WA ротавируса А, штамма США/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А и штамма SA11 ротавируса.
В описанном выше способе (A) первая, вторая или третья последовательности нуклеиновой кислоты или их сочетание может содержать регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с одним или более чем одним энхансером вируса мозаики, с одним или более чем одним элементом амплификации и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей структурный белок ротавируса, и причем четвертая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу, может быть введена в растение, часть растения или клетку растения.
В описанном выше способе (B) первая, вторая, третья или четвертая последовательность нуклеиновой кислоты или их сочетание может содержать регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с одним или более чем одним энхансером вируса мозаики, с одним или более чем одним элементом амплификации и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей структурный белок ротавируса, и причем пятая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу, может быть введена в растение, часть растения или клетку растения.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ (C) производства ро-тавирус-подобной частицы (RLP) в растении, предусматривающий:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротави-русных структурных белков, в растение, часть растения или клетку растения;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Кроме того, вторая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения, вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регулирующую область, которая активна в растении и функционально связана со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротави-русных структурных белков, и причем вторая нуклеиновая кислота экспрессируется при инкубировании растения или части растения на стадии b).
Кроме того, третья нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения, третья нуклеиновая кислота содержит третью регулирующую область, которая активна в растении и функционально связана с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротави-русных структурных белков, и причем третья нуклеиновая кислота экспрессируется при инкубировании растения или части растения на стадии b).
Описанный выше способ (C) может дополнительно предусматривать стадию сбора растения и экстрагирования RLP.
Один или несколько ротавирусных структурных белков способа (C) могут представлять собой ро-тавирусный белок VP2, VP4 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых первой или второй нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP2 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых третьей нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP4. VP4 может расщепляться для получения VP5 и VP8.
Первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность может дополнительно кодировать, содержать или кодировать и содержать одну или более чем одну нацеливающую последовательность и/или элемент амплификации компартмента. Одна или несколько нацеливающих последовательностей и/или элементов амплификации компартмента направляет один или несколько ротавирусных структурных белков в эндоплазматический ретикулум (ER), хлоропласт, пластиду или апопласт растительной клетки.
Настоящее изобретение также предусматривает способ (D) получения ротавирус-подобной частицы (RLP), предусматривающий:
a) обеспечение растения или части растения, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую ре-гуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков;
b) инкубирование растения, части растений или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Кроме того, растение или часть растения в способе (D) может дополнительно содержать:
i) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков или,
ii) вторую и третью нуклеиновую кислоту, причем вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, и третья нуклеиновая кислота содержит третью регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков,
причем вторая или вторая и третья нуклеиновые кислоты экспрессируются при инкубации растения или части растения на стадии b).
Один или несколько структурных белков в способе (D) могут представлять собой ротавирусный белок VP2, VP4 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых первой или второй нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP2 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых третьей нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP4. VP4 может расщепляться для получения VP5 и VP8 с использованием трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина. Протеаза может быть коэкспрессирована в растении или добавлена во время сбора, очистки или того и другого.
Настоящее изобретение предусматривает RLP, полученную способами (A), способом (B), способом (C), способом (D) или их комбинацией, как описано выше. RLP может содержать один или несколько ротавирусных структурных белков, которые могут содержать специфические для растения N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
Настоящее изобретение включает в себя композицию, содержащую эффективную дозу RLP, произведенную способом (A), способом (B), способом (C), способом (D) или их комбинацией, как описано выше, для индуцирования иммунного ответа, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также включает в себя способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение описанного выше RLP субъекту. RLP может быть введена субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Настоящее изобретение также предусматривает растительное вещество, содержащее RLP, полученную способом (A), способом (B), способом (C), способом (D) или их комбинацией, как описано выше. Растительное вещество может быть использовано для индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта. Растительный материал также может быть подмешан в качестве пищевой добавки.
В описанных выше способах (способы A, B, C или D) растение или часть растения могут дополнительно вводиться с или могут дополнительно содержать другую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую супрессор сайленсинга.
Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает способ (E) производства ротавирусного структурного белка в растении, предусматривающий:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротави-русных структурных белков, в растение или часть растения;
b) инкубирование растения или части растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом один или несколько ротавирусных структурных белков.
Это краткое раскрытие настоящего изобретения не обязательно описывает все особенности настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
Эти и другие особенности настоящего изобретения станут более очевидными из следующего описания, в котором сделана ссылка на прилагаемые графические материалы, на которых:
на фиг. 1 показана структура ротавируса и распределение генов-белков. (A) Трансмиссионная электронная микроскопия ротавирусной частиц (черта представляет собой 100 нм). (B) Организация вирусных белков капсида, содержащих внутренние, средние и внешние. (C) Сегменты ротавирусной дцРНК, расположенные в соответствии с размером и функцией. ДцРНК могут быть разделены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (D). Белки в (C) обозначены сегментами дцРНК в (D). Изображения предоставлены Crawford et al., 1997 (A), Swiss Institute of Bioinformatics, 2008 (B) and Greenberg and Estes,
2009 (D).
На фиг. 2 показан вход ротавируса в клетку и репликация. Когда ротавирус входит в клетку, VP4 и VP7 теряются, образуя двухслойную частицу (DLP). Начинается транскрипция дцРНК, приводя к транс
ляции VP2, VP4, VP6 и VP7. Результирующие серцевины с репликазной активностьью производятся на вирусных фабриках (также называемых вироплазмы). Поздняя транскрипция происходит в этих результирующих серцевинах. На периферии вирусных фабрик эти сердцевины покрываются VP6, образуя незрелые DLP, которые почкуются через мембрану эндоплазматического ретикулума, приобретая переходную липидную мембрану, которая модифицируется с постоянными вирусными гликопротеинами NSP4 и VP7 ER; эти окутанные частицы также содержат VP4. По мере того как частицы движутся по направлению к внутренней части цистерн ER, переходная липидная мембрана и неструктурный белок NSP4 теряются, в то время как вирусные поверхностные белки VP4 и VP7 переставляются для образования самого внешнего вирусного белкового слоя, что дает зрелые инфекционные трехслойные частицы (смотрите Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html).
На фиг. 3 показаны векторы pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP и pTRAkc-ERH Agrobacterium. P35SS, промотор 35S CaMV с дублированным энхансером транскрипции; CHS, 5'-нетранслируемая область халкон-синтазы; pA35S, CaMV 35S сигнал полиаденилирования; SAR, каркас области прикрепления гена RB7 табака; LB и RB, левые и правые границы для интеграции Т-ДНК; ColElori, начало репликации для E. coli; RK2ori, начало репликации для Agrobacterium; bla, ген bla устойчивости к ампицилли-ну/карбенициллину; LPH, последовательность сигнального пептида из мышиной тяжелой цепи mAb24; his6, 6x последовательность тегов His; SEKDEL, сигнальная последовательность ER-удерживания; rbcs1-cTP, хлоропласт-транзитная пептидная последовательность из гена малой субъединицы Rubisco (rbcS1) из Solanum tuberosum; npt II, устойчивость к канамицину гена npt II; Pnos и pAnos, промотор и сигнал полиаденилирования гена нопалинсинтазы (Maclean et al., 2007).
На фиг. 4 показан обзор процедуры ротавирусного клонирования и инфильтрации.
На фиг. 5 показана процедура экстракции белков апопласта. (A) Иллюстрация растительной клетки и расположения апопласта. VP белки экспрессируются в цитозоле и направляются к апопласту (красная стрелка). (B) - После времени испытания лист растения пропитывают под вакуумом с PBS (1) и помещают в перфорированную спиновую колонку (2), затем центрифугируют в 2 мл пробирке Эппендорфа, чтобы собрать сок (3).
На фиг. 6 показан вестерн-блот экспрессии ротавирусного белка VP6 в компартментах клеток листьев растения в течение 7 дней. Мышиное антитело VP6 к ротавирусу (1:5000) использовали для исследования мембран. (+) и (-) обозначает экспрессию с или без супрессора сайленсинга, соответственно. Красные линии обозначают положение VP6 белков в различных проанализированных образцах (~40 кДа). Экспрессия и эффективность экстракции VP6 была лучшей в цитоплазме.
На фиг. 7 показан вестерн-блот, показывающий индивидуальную экспрессию меченых his ротави-русных белков в день 3 в цитоплазме листьев растения N. benthamiana. +ve - бактериально экспрессиро-ванный ротавирусный VP2; М - маркер молекулярного веса; VP - ротавирусный белок капсида. Инфильтрация VP7 приводила к пожелтению листьев (b).
На фиг. 8 показана экспрессия ротавирусных VP2 (а) и VP4 (b), нацелено воздействующих на различные компартменты клеток листьев растения N. benthamiana в день 3. Соответствующую сыворотку цыпленка к ротавирусу (1:2000) для VP2 и VP4 использовали для зондирования белков. сТр - хлоропла-сты; ER - эндоплазматический ретикулум; pTRAc - цитоплазма; А - апопласт; отрицательный контроль (-ve) -растения, инфильтрованные только с супрессором сайленсинга; положительный контроль (+ve) в (а) - бактериальные экспрессированные VP2, (b) - бактериальные экспрессированные VP4; (- и +) с или без супрессора сайленсинга; M - маркер молекулярного веса. Стрелки указывают положение рассматриваемых белковых полос.
На фиг. 9 показан анализ вестерн-блоттинг 3-го дня экстрактов, коэкспрессированных VP2/6/4 в цитоплазме листьев N. benthamiana. Белки исследовали со смесью сыворотки цыпленка к ротавирусу (к VP2 (1/5000) и к VP4 (1/5000)) и мышиного антитела к VP6 (1:5000). Инфильтрацию рекомбинантного Agro-bacterium проводили с супрессором сайленсинга. Отрицательный контроль (-ve) -целые растения, ин-фильтрованные только с супрессором сайленсинга; M - маркер молекулярного веса.
На фиг. 10 показаны электронные микрофотографии на 3-й день экстрагированных из цитоплазмы ротавирусных белков, окрашенных уранилацетатом. (a) Отрицательный экстракт образца белка с супрес-сором сайленсинга; (b) экстракт белка VP6; (c) экстракт белка VP2/6 и (d) экстракт белка VP2/6/4. Полосы = 200 нм. Все обнаруженные RLP составляли от 70 до 100 нм в диаметре. Стрелка в (b) указывает на оболочку/переплетение VP6. Стрелка в (с) показывает пример aRLP. Все белки экспрессировали в присутствии супрессора сайленсинга. Все захватывали с мышиным антителом к VP6 (1: 2000).
На фиг. 11 показана очистка градиентом сахарозы коэкспрессированных VP2/6 и VP2/6/4 (a). Дот-блоты очищенных с помощью градиента сахарозы VP2/6 (b) и VP2/6/4 (c). Белковые экстракты загружали на градиент сахарозы (10-60%) и ультрацентрифугировали. Фракции анализировали путем зондирования с (b) мышиным антителом к VP6 (1:5000) и (c) сывороткой цыпленка к VP2 и VP4 (1:5000).
На фиг. 12 показан анализ вестерн-блоттинг фракций VP2/6 (a), фотография окрашенного кумасси ДСН-ПААГ геля фракций VP2/6 фракций 16 и 17 (b), и анализ вестерн-блоттинг фракций 16 и 17 (c). Мышиную сыворотку к VP6 (1: 5000) и сыворотку цыпленка к VP2 (1:5000) использовали в вестерн-блоттинге (a), и только мышиную к VP6 (1:5000) в (c). Отрицательный контроль (-ve) в (a) и (c)
бактериальный экспрессированный VP4, и в (b) - растения, инфильтрованные с супрессором сайленсинга и очищенные в градиенте сахарозы; сырой - неочищенный экстракт VP2/6; положительный контроль (+ve) в (a) - бактериальный экспрессированный VP2, (b) и (c) - экспрессированный в растении VP6; VP6-SF9 -белок VP6 с известной концентрацией, экспрессированный в клетках насекомых SF9. Стрелки указывают на представляющие интерес белковые полосы.
На фиг. 13 показан анализ общего растворимого белка на фракциях градиента плотности сахарозы очищенных VP2/6. (a) - стандартная кривая IgG, (b) - показания оптической плотности фракций, снятых при 750 нм. Представляющие интерес точки: фракции от 16 до 19.
На фиг. 14 показан анализ в градиенте плотности сахарозы коэкспрессированных в цитоплазме фракций VP2/6/4. Сырые показания оптической плотности при 750 нм брали для проверки белковых пиков, ранее обнаруженных на дот-блоттинге ВБ2/6/4.
На фиг. 15 показаны трансмиссионные электронные микрофотографии очищенных в градиенте плотности сахарозы частиц VP2/6. Как (a), так и (b) показывают две различные секции, просмотренные на медной сетке. Все обнаруженные RLP были от 70 до 100 нм в диаметре. Образцы захватывали с мышиным антителом к VP6 (1:2000). Полосы представляют собой 200 нм.
На фиг. 16а показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидные последовательности VP2 ротавируса (SEQ ID NO: 13 и 14). На фиг. 16b показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) и нуклеотидные последовательности VP4 ротавируса (SEQ ID NO: 15 и 16). На фиг. 16с показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) и нуклеотидные последовательности VP6 ротавируса (SEQ ID NO: 17 и 18). На фиг. 16d показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) и нуклеотидные последовательности VP7 ротавируса (SEQ ID NO: 19 и 20).
На фиг. 17а показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP2(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 21). На фиг. 17b показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP2(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 22). На фиг. 17c показано схематическое представление конструкта 1191. Сайты рестрикционных эндонуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении.
На фиг. 18 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 23) конструкта 1191 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-P19-пластоцианин.
На фиг. 19 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2(opt) из штамма WA рота-
вируса A (SEQ ID NO: 45).
На фиг. 20 показана аминокислотная последовательность VP2 из штамма WA ротавируса A (SEQ
ID NO: 25).
На фиг. 21 показано схематическое представление конструкта номер 1710.
На фиг. 22 А показано схематическое представление конструкта 193. Сайты рестрикционных эндо-нуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении. На фиг. 22В показана нуклеотидная последовательность конструкта 193 (SEQ ID NO: 26). Конструкт 193 показан от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) + репликаза с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-P19-пластоцианин.
На фиг. 23 показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты 1710 (SEQ ID NO: 27). Экспрессионная кассета номер 1710 показана от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
На фиг. 24 показано схематическое представление конструкта номер 1711.
На фиг. 25 А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP6(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 28). На фиг. 25В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP6(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 29). На фиг. 25с показана экспрессионная кассета номер 1713 от промотора 2X35S до терминатора NOS (SEQ ID NO: 30). VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут. На фиг. 25d показана нук-леотидная последовательность, кодирующая VP6(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 46).
На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность VP6 из штамма WA ротавируса A (SEQ
ID NO: 31).
На фиг. 27 показано схематическое представление конструкта номер 1713.
На фиг. 28 показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1714 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 32). VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут. На фиг. 29 показано схематическое представление конструкта номер 1714.
На фиг. 30А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 33). На фиг. 30В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (SEQ
ID NO: 34).
На фиг. 31А показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1731 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 35). VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут. На фиг. 31В показана оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 47). На фиг. 31С показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1730 от промотора 2X35S к термина
тору NOS (SEQ ID NO: 44). VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
На фиг. 32 показана аминокислотная последовательность VP4 из штамма Rotarix ротавируса A
(SEQ ID NO: 36).
На фиг. 33А показано схематическое представление конструкта номер 1730. На фиг. 33В показано схематическое представление конструкта номер 1731.
На фиг. 34А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP7(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 37). На фиг. 34В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_ VP7(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 38). На фиг. 34С показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1733 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут (SEQ ID NO: 24). На фиг. 34D показана нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 48). На фиг. 34Е показана оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO 54).
На фиг. 35 показана аминокислотная последовательность VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 39).
На фиг. 36 показано схематическое представление конструкта номер 1733.
На фиг. 37 показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP7(opt).s2+4C (SEQ ID
NO: 40).
На фиг. 38 показано схематическое представление конструкта 1192. Сайты рестрикционных эндо-нуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении.
На фиг. 39 показана нуклеотидная последовательность конструкта 1192 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут) (SEQ ID NO: 41). Показаны 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-P19-пластоцианин.
На фиг. 40А показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1735 от
промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 42). PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-
A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут. На фиг. 40В показана нуклеотидная последовательность, кодирующая PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 49).
На фиг. 41 показана аминокислотная последовательность PDISP/VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 43).
На фиг. 42 показано схематическое представление конструкта номер 1735.
На фиг. 43А показана кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 50). На фиг. 43В показана оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 51). На фиг. 43С показана кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 52). На фиг. 43D показана оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 53).
На фиг. 44А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-TRSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (SEQ ID НП: 55). На фиг. 44В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 56). На фиг. 44С показана нуклеотидная последовательность оптимизированной кодирующей последовательности VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/ G1P1A[8] (SEQ ID NO: 57). На фиг. 44D показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1734 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO 58). VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут. На фиг. 44Е показана аминокислотная последовательность TrSp-VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 59). На фиг. 44F показано схематическое представление конструкта номер 1734.
На фиг. 45 показана очистка ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2 и VP6, с помощью центрифугирования в градиенте плотности иодиксанола. На фиг. 45А показан анализ окрашенной кумасси ДСН-ПААГ загрузки перед центрифугированием и фракций 1-10 (фракция 1 находится в нижней части пробирки). Положения ротавирусных антигенов показаны стрелками. На фиг. 45В показан анализ Вес-терн-блоттинг тех же фракций, что и в (A) с использованием кроличьего поликлонального антитела к ротавирусу. На фиг. 45С показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (A) с использованием кроличьего поликлонального антитела к VP2.
На фиг. 46 показана очистка ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP6 и VP7 с помощью центрифугирования в градиенте плотности иодиксанола. На фиг. 46А показан анализ окрашенной кумас-си ДСН-ПААГ загрузки перед центрифугированием и фракций 1-10 (фракция 1 находится в нижней части пробирки). Положения ротавирусных антигенов показаны стрелками. На фиг. 46В показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (A) с использованием кроличьего поликлонального антитела к ротавирусу. На фиг. 46С показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (A) с использованием кроличьего поликлонального антитела к VP7.
На фиг. 47 показана очистка ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP4, VP6 и VP7 с по
мощью центрифугирования в градиенте плотности иодиксанола. На фиг. 47А показан анализ окрашенной кумасси ДСН-ПААГ загрузки перед центрифугированием и фракций 1-10 (фракция 1 находится в нижней части пробирки). Положения ротавирусных антигенов показаны стрелками. На фиг. 47В показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (A) с использованием кроличьего поликлонального антитела к ротавирусу. На фиг. 47С показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (A) с использованием кроличьего поликлонального антитела к VP7.
На фиг. 48 показана оценка содержания VP4 в очищенных ротавирус-подобных частицах, содержащих VP2, VP4, VP6 и VP7, с помощью специфического анализа ELISA к VP4.
На фиг. 49 показано изображение крио-электронной микроскопии очищенных ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2 и VP6 (левая панель) и VP2, VP4, VP6 и VP7 (правая панель).
Подробное описание настоящего изобретения
Нижеследующее описание представляет собой предпочтительный вариант осуществления.
Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или несколько ротавирусных структурных белков (т. е. ротавирус-подобная частица, ротавирусная VLP или RLP), и способам получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растениях. Ротавирус-подобная частица (RLP) может, соответственно, содержать один или несколько ротавирусных структурных белков. RLP могут быть двухслойными или трехслойными.
В настоящем изобретении частично предусмотрен способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении. Способ может предусматривать введение одной или нескольких нуклеиновых кислот, содержащих регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков в растении или части растения. После чего следует инкубирование растения или части растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновых кислот, таким образом, создавая RLP.
Кроме того, в настоящем изобретении частично предусмотрен способ получения кандидатной вакцины ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении. Способ может предусматривать введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, второй нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растение, часть растения или клетку растения. После чего следует инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй или третьей нуклеиновой кислоты, таким образом, создавая RLP. RLP могут быть одно-, двух- или трехслойными.
"Ротавирусный структурный белок" может относиться ко всей или части последовательности рота-вирусного структурного белка, выделенного из ротавируса, присутствующего в любом встречающемся в природе или вариантном ротавирусном штамме или изоляте. Таким образом, термин ротавирусный структурный белок и подобные включает в себя природные варианты последовательностей ротавирус-ных структурных белков, полученных путем мутации в течение жизненного цикла вируса или произведенных в ответ на селективное давление (например, терапию лекарственными средствами, расширение тропизма или инфекционности клетки-хозяина и т. д.). Как очевидно специалисту в настоящей области техники, такие последовательности ротавирусных структурных белков и их варианты могут быть также получены с использованием рекомбинантных техник.
Кроме того, структурные белки могут включать в себя такие белки капсида, как, например, VP2 и VP6, и/или такие поверхностные белки, как, например, VP4. Структурный белок может дополнительно включать в себя, например, VP7.
Не ограничивающие примеры ротавирусного структурного белка представляют собой ротавирус-ный белок VP2, VP4, VP6 и VP7, и фрагмент VP2, VP4, VP6 и VP7. Не ограничивающие примеры VP2, VP4, VP6 и VP7 или фрагментов VP2, VP4, VP6 и VP7 белка, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя VP2 VP4 VP6 и VP7 белок из штамма G9 P[6] ро-тавируса, штамма WA ротавируса А, штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А и штамма SA11 ротавируса.
Пример структурного белка VP2, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 25. Кроме того, структурный белок VP2 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP2 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 13, 14, 25 или 45, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Пример структурного белка VP4, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 36. Кроме того, структурный белок VP4 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP4 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84,
85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Пример структурного белка VP6, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 31. Кроме того, структурный белок VP6 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP6 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 17, 18 или 46, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Пример структурного белка VP7, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 47. Кроме того, структурный белок VP7 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 43, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP7 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53 или 54, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым
процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Сходство или идентичность аминокислотной последовательности может быть вычислено с использованием программ BLASTP и TBLASTN, которые используют алгоритм 2.0 BLAST (основной инструмент поиска локального выравнивания). Техники для вычислений сходства или идентичности аминокислотных последовательностей хорошо известны специалистам в настоящей области техники, а также использование алгоритма BLAST описано в ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410) and ALT-SCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
Термин "вирусоподобная частица" (VLP) или "вирусоподобные частицы" или "VLP" относится к структурам, которые самособираются и содержат один или несколько структурных белков, таких как, например, ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, структурный белок VP2 VP4, VP6 и/или VP7. VLP, содержащие ротавирусный структурный белок, могут также называться "ро-тавирусный VLP", "ротавирус-подобная частица (RVLP)", "ротавирус-подобная частица (RLP)", "ротави-рус-подобная частица", "RVLP" или "RLP". VLP или RLP, как правило, морфологически и антигенно похожи на вирионов, полученных при инфекции, но не содержат достаточную генетическую информацию для репликации и таким образом представляют собой неинфекционные. VLP могут быть получены в подходящих клетках-хозяевах, включающих в себя клетки растения-хозяина. После экстракции из клетки-хозяина и при выделении и дальнейшей очистке в подходящих условиях, VLP могут быть очищены как интактные структуры. RLP может быть одно-, двух- или трехслойным RLP. Однослойные RLP могут быть получены путем экспрессии одного ротавирусного структурного белка, такого как VP2 или VP6. Двухслойные RLP могут быть получены путем экспрессии двух ротавирусных структурных белков, таких как например, коэкспрессия VP2 и VP6 с или без VP4. Трехслойные RLP могут быть получены путем одновременной экспрессии по меньшей мере трех ротавирусных структурных белков, например, коэкс-прессии VP2, VP6 и VP7 с или без VP4. Коэкспрессия VP4 приводит к частице с шипами, которая напоминает нативный ротавирус. VP4 могут быть процессированы или расщеплены для производства VP5 и VP8. Этот процессинг может проходить в пределах хозяина с использованием эндогенных протеаз или путем коэкспрессии подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина. Альтернативно, VP4 могут быть процессиро-ваны для получения VP5 и VP8 путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина на протяжении любой стадии процедуры экстракции RLP или после очистки RLP.
Каждый из ротавирусных структурных белков содержит различные характеристики и размер и тре
буется в различных количествах для сборки в RLP. Термин "ротавирусная VLP", "ротавирусная вирусоподобная частица (RVLP)", "ротавирусная вирусоподобная частица (RLP)", "ротавирусная вирусоподобная частица", "RVLP" или "RLP" относится к вирусоподобной частице (VLP), содержащей один или несколько ротавирусных структурных белков. Пример ротавирусных структурных белков может включать в себя без ограничения структурный белок VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6 и VP7.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения RLP в растении, причем первая нуклеиновая кислота (первая нуклеиновая кислота), кодирующая первый ротавирусный структурный белок, например белок VP2 или VP6, коэкспрессируется со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, например, белок VP6 или VP2. Кроме того, третья нуклеиновая кислота, кодирующая третий ротавирусный структурный белок, например VP4 или VP7, может быть коэкспрессирована с первой и второй нуклеиновой кислотой, так, чтобы первая, вторая и третья нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. Первая нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной и той же стадии или могут быть введены в растения последовательно. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 в хозяине путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, суб-тилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
Кроме того, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий ротавирусный структурный белок, может быть дополнительно трансформировано с четвертой нуклеиновой кислотой, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, например, белок VP7 или VP4, так что первая, вторая нуклеиновые кислоты, третья и четвертая нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 в хозяине путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, се-риновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть про-цессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химот-рипсин-подобной протеазы, субтилизина.
Кроме того, первое растение, экспрессирующее первую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, например, белок VP2 или VP6, может быть скрещено со вторым растением, экспрессирующим вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, белок VP6 или VP2, чтобы произвести потомственное растение (третье растение), которое коэкспрессирует первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие VP2 и VP6 или VP6 и VP2, соответственно. Кроме того, третье растение, экс-прессирующее первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие VP2 и VP6 или VP6 и VP2, соответственно, может быть скрещено с четвертым растений, экспрессирующим третью нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, VP4 или VP7, чтобы произвести дальнейшие потомство растения (пятое растение), которое коэкспресси-рует первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты, кодирующие VP2, VP6 и VP4 или VP7, соответственно. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 в растении с использованием протеазы хозяина или путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую про-теазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
Как описано более подробно ниже, RLP могут быть получены в растении путем экспрессии нуклеиновой кислоты (первой нуклеиновой кислоты), кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, без ограничения VP2, VP6 или VP7. Вторая нуклеиновая кислота, кодирующая второй ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP7 VP6 или VP2, может быть коэкспрессирована в растении. Кроме того, третья нуклеиновая кислота, кодирующая третий ротавирус-ный структурный белок, например, но без ограничения, VP6, VP7 или VP2, может быть коэкспрессиро-вана в растении. Нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной и той же стадии, или они могут быть введены в растение последовательно. Нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть введены в растение временным образом или на постоянной основе.
Кроме того, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый ротавирусный структурный белок, например, белок VP2, может быть трансформировано со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP6 или VP7 таким образом, что как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в
растении. Растение может быть дополнительно трансформировано с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP7 или VP6.
Альтернативно, растение, которое экспрессирует белок VP6 или VP7 (вторая нуклеиновая кислота), могут быть трансформированы с первой нуклеиновой кислотой, кодирующей белок VP2, так что как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. Растение может быть дополнительно трансформировано с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP7 или VP6.
Кроме того, растение, экспрессирующее первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй ротавирусный структурный белок, например, белок VP2 и VP6, может быть трансформировано с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, например, VP4 или VP7. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 путем коэкс-прессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения RLP в растении, который предусматривает введение одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько рота-вирусных структурных белков, функционально связанных с регуляторной областью, активной в растении, а также одну или более чем одну нацелено воздействующую на компартмент последовательность и/или элементы амплификации в растении, части растения или клетке растения. Растение, часть растения или клетку растения затем инкубировали в условиях, которые позволяют экспрессию одной или нескольких нуклеиновых кислот, тем самым производя RLP. Один или несколько ротавирусных структурных белков могут представлять собой VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6, VP7, фрагмент VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6, VP7 или их комбинацию.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена RLP, содержащая один или несколько ро-тавирусных структурных белков, например, но без ограничения, VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6, VP7 или их комбинация. RLP может быть получена с помощью одного или нескольких способов, как это предусмотрено согласно настоящему изобретению.
Возникновение RLP может быть обнаружено с использованием любого подходящего способа, например центрифугирования в градиенте плотности или гель-фильтрационной хроматографии. RLP могут быть оценены по структуре и размеру с помощью, например, электронной микроскопии либо с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
Для гель-фильтрационной хроматографии все растворимые белки могут быть экстрагированы из растительной ткани путем гомогенизации (Polytron) образца замороженного-измельченного растительного материала в экстракционном буфере и удаления нерастворимого материала центрифугированием. Осадки с ледяным ацетоном или ПЭГ могут также быть полезными. Растворимый белок определяют количественно, и экстракт пропускают через колонку SephacrylTM, например, колонку SephacrylTM S500. Blue Dextran 2000 может быть использован в качестве калибровочного стандарта. После хроматографии фракции могут быть дополнительно проанализированы при помощи иммуноблоттинга для определения белкового комплемента фракции.
Выделенная фракция может представлять собой, например, супернатант (если центрифугируют, осаждают или преципитируют) или фильтрат (если фильтруют), и обогащена белками или такими супра-структурными белками, как, например, нанотрубки, наносферы или такими частицами более высокого порядка с более высокой молекулярной массой, как однослойная (sl), двухслойная (dl) или трехслойная
(tl) RLP.
Выделенная фракция может быть дополнительно процессирована для выделения, очистки, концентрирования или их комбинации белков, супраструктурных белков или частиц более высокого порядка с помощью, например, дополнительных стадий центрифугирования, преципитации, хроматографических стадий (например, гель-фильтрационной, ионообменной, аффинной хроматографии), фильтрации с тангенциальным потоком или их комбинации. Наличие очищенных белков, супраструктурных белков или частиц более высокого порядка, таких как RLP, может быть подтверждено с помощью, например, натив-ного или ДСН-ПААГ Вестерн-анализа с использованием соответствующего антитела обнаружения, капиллярного электрофореза, электронной микроскопии или любого другого способа, который будет очевиден для специалиста в настоящей области техники.
RLP, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть очищены, частично очищены от растения, части растения или растительного материала, или могут быть введены в виде перо-ральной вакцины, с использованием способов, известных специалистам в настоящей области техники.
Очистка RLP может включать в себя центрифугирование в градиенте, например, градиенты плотности сахарозы, иодиксанола, OptiPrep(tm) или хлорида цезия (CsCl) могут быть использованы для очистки или частичной очистки RLP из трансформированной растительной биомассы. Как показано, например, на фиг. 45, ступенчатый градиент иодиксанола или непрерывный градиент иодиксанола может быть ис
пользован для очистки RLP и/или экспрессированных ротавирусных структурных белков.
Было показано, что концентрация кальция (Са2+) важна для трансформации трехслойной частицы (TLP) в двухслойную частицу (DLP) и характеризуется зависимостью от штамма (смотрите, например, Martin et al., Journal of Virology, Jan 2002, которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Полная потеря белков внешнего капсида с TLP (декапсидация TLP) происходит в наномолярном диапазоне [Са2+]. Поэтому очистка и/или экстракция RLP может быть осуществлена в присутствии кальция, и стадия центрифугирования в градиенте может быть выполнена в присутствии кальция, например, в присутствии CaCl2. Концентрация CaCl2 может составлять, например, от 1 мМ и до 1000 мМ, или характеризоваться любым значением между ними, таким как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 50, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 мМ или любым значением между ними.
Растения или фрагменты растений могут быть минимально процессированы. Под термином "минимальный процессинг" подразумевается растительное вещество, например, растение или его часть, содержащее представляющий интерес белок и/или RLP, которое частично очищено с получением растительного экстракта, гомогената, фракции гомогената растения и т. п. (т.е. минимально процессированных). Частичная очистка может включать в себя без ограничения разрушение растительных клеточных структур, тем самым создавая композицию, содержащую растворимые растительные компоненты и нерастворимые растительные компоненты, которые могут быть разделены, например, но без ограничения, с помощью центрифугирования, фильтрации или их комбинации. В связи с этим, белки, секретируемые во внеклеточном пространстве листа или других тканях, могут быть легко получены с использованием экстракции вакуумом или центрифугированием, или ткани могут быть экстрагированы под давлением при прохождении через ролики или шлифованием или тому подобного для выжимания или освобождения свободных белков от внеклеточного пространства. Минимальный процессинг может также включать в себя подготовку неочищенных экстрактов растворимых белков, так как эти препараты будут содержать незначительное загрязнение от вторичных растительных продуктов. Кроме того, минимальный процес-синг может включать в себя водную экстракцию растворимого белка из листьев, с последующей преципитацией с любой подходящей солью. Другие способы могут включать в себя крупномасштабную мацерацию и экстракцию сока для разрешения прямого использования экстракта. RLP могут быть очищены или извлечены с использованием любого подходящего способа, например механической или биохимической экстракции.
Один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть синтезированы в количестве до 2 г на килограмм массы свежего растения. Например, количество синтезированного структурного белка может составлять от 1 до 2 г на килограмм свежего веса или характеризоваться любым значением между ними, таким как 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 г на килограмм свежего веса или любым значением между ними. Например, структурный белок может быть синтезирован в количестве до 1,54 г на килограмм массы свежего растения.
Кроме того, RLP могут быть синтезированы в количестве до 1,5 г на килограмм массы свежего растения. Например, количество синтезированного RLP может составлять от 0,5 до 1,5 г на килограмм свежего веса или характеризоваться любым значением между ними, таким как 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 г на килограмм свежего веса. Например, RLP могут быть синтезированы в количестве до 1,1 г на килограмм массы свежего растения.
Размер (т. е. диаметр) определенных выше RLP может быть определен, например, с помощью техник динамического светорассеяния (DLS) или электронного микроскопа (ЭМ), и составляет, как правило, от 50 до 110 нм или любой размер между этими значениями. Например, размер структуры интактного RLP может находиться в пределах от приблизительно 70 нм до приблизительно 110 нм или характеризоваться любым размером между ними, таким как 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 нм или любым размером между ними.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нук-леотидную последовательность, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, функционально связанных с регуляторной областью, активной в растении. Нуклеотидная последовательность может быть оптимизирована, например, для использования кодонов человека или использования кодонов растений. Кроме того один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть функционально связаны с одним или более чем одним элементом амплификации. Кроме того один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть функционально связаны с одной или более чем одной нацелено воздействующей на компартмент последовательностью. Один или несколько ротавирус-ных структурных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностиью, могут представлять собой, например, VP2, VP4, VP6 или VP7. Кроме того, один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностью, могут быть, например, из любой ротавирусной группы от А до G, но более предпочтительно - от ротавируса группы А. Кроме того, один или несколько ротави-русных структурных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностью, могут быть из любого ротавирусного штамма, содержащего генотип любых комбинаций G- и P- типов от G1 до G27 и от P1 до Р34, и более предпочтительно, от G1 до G19 и от Р1 до Р27, включая в себя без ограничения G1P[8],
G2P[4], G2P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[6], G9P[8], штамм WA ротавируса А, штамм USA/Rotarix-
A41CB052A/1988/G1P1A [8] вакцины ротавируса А или штамм SA11 ротавирус.
Последовательность нуклеиновой кислоты, упоминаемая в настоящем изобретении, может быть "по существу гомологична", "по существу сходна" или "по существу идентична" последовательности или комплименту последовательности, если последовательность нуклеиновой кислоты гибридизирует с одной или более чем одной нуклеотидной последовательностью или комплиментом последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе, в строгих условиях гибридизации. Последовательности "по существу гомологичны", "по существу аналогичны", "по существу идентичны", когда по меньшей мере приблизительно 70% или от 70 до 100%, или любое значение между ними, например, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100% или любое значение между ними, нуклеотидов совпадает на протяжении определенной длины нуклеотидной последовательности, при условии, что такие гомологичные последовательности демонстрируют одно или более чем одно из свойств последовательности или кодируются описанным в настоящем документе продуктом.
Так, например, в настоящем изобретении предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или несколько ротавирусных структурных белков, которые по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или на любое значение между ними идентичны последовательностям, определенным, например, в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54. Полинуклеотид может представлять собой человеческий кодон, оптимизированный любым из известных в настоящей области техники способов.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены RLP, которые содержат ротавирусные структурные белки, которые, например, кодируются нуклеиновыми кислотами, которые по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или на любое значение между ними идентичны последовательностям, определенным, например, в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54.
Такое сходство или идентичность последовательностей могут быть определены с использованием программы сравнения нуклеотидных последовательностей, например, такое, как проводимое DNASIS (с использованием, например, но без ограничения, следующих параметров: штраф за пропуск в последовательности 5, # верхних диагоналей 5, фиксированный штраф за пропуск в последовательности 10, k строка 2, плавающий пропуск в последовательности 10 и размер окна 5). Тем не менее, другие способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники, например, алгоритмы Smith & Waterman (1981, Adv Appl Math 2: 482), Needleman & Wunsch (J. Mol Biol 48: 443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), и с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и BLAST, доступных через NIH), или с помощью ручного выравнивания и визуального осмотра (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement), или с использованием саузерн или нозерн гибридизации в строгих условиях (смотрите Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Предпочтительно, последовательности, которые по существу гомологичны, проявляют по меньшей мере приблизительно 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% сходства последовательности на протяжении определенной длины молекулы.
Пример одного из таких строгих условий гибридизации может представлять собой гибридизацию в течение ночи (приблизительно 16-20 ч) в 4xSSC при 65°C, с последующим отмыванием в 0,1xSSC при 65°C в течение часа или 2 отмываниями в 0,1xSSC при 65°C каждое в течение 20 или 30 мин. Альтернативно, иллюстративное условие строгой гибридизации может представлять собой гибридизацию в течение ночи (16-20 ч) в 50% -ном формамиде, 4xSSC при 42°C с последующим отмыванием в 0,1xSSC при 65°C в течение часа, или 2 отмываниями в 0,1 xSSC при 65°C каждое в течение 20 или 30 мин или в течение ночи (16-20 ч), или гибридизацию в водном фосфатном буфере Church (7% ДСН; 0,5 М NaPO4 буфер с pH 7,2; 10 мМ ЭДТА) при 65°C, с 2 отмываниями либо при 50°C в 0,1xSSC, 0,1% ДСН в течение 20 или 30 мин каждое, или 2 отмываниями при 65°C в 2xSSC, 0,1% ДСН в течение 20 или 30 мин каждое для уникальных областей последовательностей.
Нуклеиновая кислота, кодирующая ротавирусный структурный полипептид, может быть описана как "ротавирусная нуклеиновая кислота" или "ротавирусная нуклеотидная последовательность". Пример, который не должен рассматриваться как ограничивающий, представляет собой вирусоподобную частицу, содержащую один или несколько ротавирусных структурных белков или ротавирусных структурных полипептидов, которая может быть описана как "ротавирусная VLP", "RVLP" или "RLP".
Многие организмы отображают случайность использования определенных кодонов для кодирования вставки конкретной аминокислоты в растущую пептидную цепь. Предпочтение кодона или случайное использование кодона, различия в использовании кодонов между организмами, представляет собой вырожденность генетического кода и хорошо известно у многих организмов. Случайность использования кодона часто коррелирует с эффективностью трансляции РНК (мРНК), которая, полагают, что в свою очередь зависит, в частности, от свойств транслируемых кодонов и наличия определенных транс
портных молекул РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке представляет собой, как правило, отражение кодонов, используемых наиболее часто в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть приспособлены для оптимальной экспрессии генов в данном организме на основе оптимизации ко-донов. Процесс оптимизации нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологично экспресси-рованный белок, может стать важным шагом для повышения выхода экспрессии. Требования к оптимизации могут включать в себя стадии по улучшению способности хозяина производить чужеродный белок.
" Оптимизация кодона" определяется как модификация последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в представляющих интерес клетках путем замещения по меньшей мере одного, более одного или значительного количества кодонов нативной последовательности на кодоны, которые могут более часто или наиболее часто использоваться в генах другого организма или вида. Различные виды демонстрируют определенную случайность использования для определенных кодонов конкретной аминокислоты.
Настоящее изобретение включает в себя синтетические полинуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы в отношении кодонов, например, последовательности, которые были оптимизированы для использования кодонов человека или кодонов растений. Полинуклеотидные последовательности с оптимизированными кодонами затем могут быть экспрессированы в растениях. Более конкретно, последовательности, оптимизированные в отношении использования кодонов человека или использования кодонов растений, могут быть экспрессированы в растениях. Не желая быть связанными теорией, полагают, что последовательности, оптимизированные в отношении человеческого кодона, увеличивают содержание гуанина-цитозина (содержание GC) в последовательности и повышают экспресси-онный выход в растениях.
Существуют различные известные в настоящей области техники способы оптимизации кодонов для улучшения трансляционной кинетики трансляционно неэффективных белковых кодирующих областей. Эти техники в основном опираются на идентификацию использования кодонов у определенного организма-хозяина. Если определенный ген или последовательность должны быть экспрессированы в этом организме, кодирующая последовательность таких генов и последовательностей будет затем модифицирована таким образом, что она будет замещать кодоны представляющей интерес последовательности более часто используемыми кодонами организма-хозяина.
Ротавирусный структурный белок или полипептид могут быть экспрессированы в системе экспрессии, содержащей основанную на вирусе, ДНК или РНК систему экспрессии, например, но без ограничения, основанную на комовирусе экспрессионную кассету или основанный на геминивирусе элемент амплификации.
Описанная в настоящем документе система экспрессии может содержать экспрессионную кассету, основанную на двойном вирусе или вирусе с двойным геномом. Например, двойные вирусы могут быть из семейства Comoviridae. Рода семейства Comoviridae включают в себя Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus и Sadwavirus. Comoviruses включают в себя вирус мозаики коровьего гороха (CPMV), вирус тяжелой мозаики коровьего гороха (CPSMV), вирус мозаики тыквы (SqMV), вирус крапчатости красного клевера (RCMV), вирус крапчатости стручков (BPMV), вирус кольцевой пятнистости турнепса (TuRSV), вирус обыкновенной мозаики кормовых бобов (BBtMV), вирус пятнистости кормовых бобов (BBSV), вирус мозаики редьки (RaMV). Примеры последовательностей РНК-2 комовирусов, содержащих энхан-серные элементы, которые могут быть применимы для различных аспектов настоящего изобретения, включают в себя без ограничения: CPMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC003550), RCMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC003738), BPMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC003495), CPSMV РНК-2
(GenBank, номер доступа NC003544), SqMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC003800), TuRSV
PHK-2 (GenBank, номер доступа NC013219.1), BBtMV PHK-2 (GenBank, номер доступа GU810904),
BBSV PHK2 (GenBank, номер доступа FJ028650), RaMV (GenBank, номер доступа NC003800).
Сегменты двойного комовирусного РНК-генома, называются РНК-1 и РНК-2. РНК-1 кодирует белки, вовлеченные в репликацию, в то время как РНК-2 кодирует белки, необходимые для перемещения от клетки к клетке, и два капсидных белка. Может быть использована любая подходящая основанная на комовирусе кассета, в том числе CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV или BPMV, например, экспрессионная кассета может быть основана на CPMV.
" Экспрессионная кассета" относится к нуклеотидной последовательности, содержащей представляющую интерес нуклеиновую кислоту под контролем, и функционально (или оперативно) связанную с соответствующим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
Системы экспрессии могут также содержать элементы амплификации из геминивируса, например, элемент амплификации от вируса желтой карликовости фасоли (BeYDV). BeYDV принадлежит к роду Mastreviruses, адаптированному к двудольным растениям. BeYDV представляет собой одинарный вирус, содержащий одноцепочечную круговую ДНК генома, и может реплицировать очень большое число копий по механизму катящегося кольца. Векторные системы, полученные от BeYDV репликонов ДНК, были использованы для быстрого высокоэффективного производства белка в растениях.
Используемая в настоящем документе фраза "элементы амплификации" относится к сегменту нуклеиновой кислоты, содержащему по меньшей мере часть одного или нескольких длинных межгенных областей или длинных межгенных повторов (LIR) генома геминивируса. Используемая в настоящем документе "длинная межгенная область" или "длинный межгенный повтор" относится к области длительной межгенной области, которая содержит сайт связывания повторений, способный опосредовать иссечение и репликацию посредством белка Rep геминивируса. Согласно некоторым аспектам сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий один или несколько LIR, может дополнительно содержать короткую межгенную область или небольшую межгенную область (SIR) генома геминивируса. Используемая в настоящем документе "короткая межгенная область" или "небольшая межгенная область" относится к комплементарной цепи (короткая IR (SIR) Mastreviruses). Любой подходящий полученный из геминиви-руса элемент амплификации может быть использован в настоящем документе. Смотрите, например, WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Если в конструкте используется более чем один LIR, например, два LIR, то промотор, области CMPV-HT и последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты и терминатора разграничиваются каждой из двух LIR. Кроме того, элемент амплификации может, например, происходить из последовательности, описанной в Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, размещенной в Gen Bank под номером доступа DQ458791, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Сегменты нуклеиновой кислоты, содержащие LIR, соединяют нуклеотиды с 2401 по 2566 и с 1 по 128. Сегменты нуклеиновой кислоты, содержащие SIR, представляют собой нуклеотиды с 1154 по
1212.
Как описано в настоящем документе, совместная доставка происходящего от вируса желтой карликовости фасоли (BeYDV) вектора и поставляющего Rep/RepA вектора с помощью агроинфильтрации листьев Nicotiana benthamiana приводит к эффективной амплификации репликона и надежной продукции белка.
Основанная на комовирусе экспрессионная кассета и происходящий из гемивируса элемент амплификации могут содержаться в отдельных векторах или составные части могут быть включены в один вектор. Если используются два вектора, первый и второй векторы могут быть введены в клетку растения одновременно или по отдельности.
Вирусная репликаза может также быть включена в систему экспрессии, как описано в настоящем документе, чтобы увеличить экспрессию представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Неограничивающий пример репликазы представляет собой репликазу BeYDV (pREP110), кодирующую Rep и RepA BeYDV (C2/C1; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714, который включен в настоящий документ посредством ссылки). Другой неограничивающий пример репликазы раскрыт в Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, размещенной в Gen Bank под номером доступа DQ458791, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий ген С1:С2, представляет собой нуклеотиды с 1310 по 2400.
Термин "коэкспрессированные" означает, что две или более чем две нуклеотидные последовательности экспрессируются приблизительно в одно и то же время в растении и в пределах одной и той же ткани растения. Тем не менее, нуклеотидные последовательности не должны экспрессироваться в одно и то же время. Скорее, эти две или более нуклеотидные последовательности экспрессируются таким образом, чтобы кодируемые продукты характеризовались возможностью взаимодействовать. Две или более чем две нуклеотидные последовательности могут быть коэкспрессированы с использованием систем временной экспрессии, где две или более последовательностей вводятся в растение приблизительно в одно и то же время в условиях, при которых обе последовательности экспрессируются. Альтернативно, платформенное растение, содержащее одну из нуклеотидных последовательностей, может быть трансформировано в стабильной форме с дополнительной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, например, один или несколько ротавирусных структурных белков, введенных в платформенное растение временным образом.
Правильная укладка белка может характеризоваться важным значением для стабильности белка, образования мультимеров, образования RLP и функционирования. Укладка белка может зависеть от одного или нескольких факторов, включающих в себя без ограничения последовательность белка, относительное содержание белка, степень внутриклеточной концентрации, доступность кофакторов, которые могут связывать или быть временно связанными с уложенным, частично уложенным или развернутым белком. Кроме того, компартмент или суб-компартмент внутри растения, где экспрессируется белок, может влиять на уровни экспрессии и укладку белка.
Экспрессия одного или нескольких ротавирусных структурных белков может быть нацелена на специфический компартмент растительных клеток и/или суб-компартментов путем агроинфильтрации в трансгенных растениях. Компартмент или суб-компартменты могут представлять собой, например пластиды, эндоплазматический ретикулум (ER), хлоропласт или апопласт. Не желая быть связанными теорией, нацеленное на компартмент или суб-компартменты воздействие может увеличивать накопление
белка в нацеленом компартменте или суб-компартментах выше цитоплазматического накопления. Накопление в компартменте или суб-компартментах может защитить белок от деградации протеазами, присутствующими в цитоплазме и/или позволить ему накапливаться в более высокой концентрации, не влияя на функцию растительной клетки.
Таким образом, экспрессионная кассета или вектор могут быть адаптированы для направления вектора или ротавирусного структурного белка или полипептида, экспрессированного из вектора, в требуемый компартмент или суб-компартмент в растении.
Например, экспрессионная кассета или вектор могут быть адаптированы к пластидам-мишеням, что может приводить к тому, что экспрессированный ротавирусный структурный белок или полипептид включает в себя часть, способную взаимодействовать с тилакоидными мембранами пластид, в частности с механизмом передачи тилакоидных мембран. Это взаимодействие может приводить к тому, что рота-вирусный структурный белок или полипептид импортируется в пластиду из цитоплазмы, где он экспрес-сируется. Не желая быть связанными теорией, механизм импорта из цитоплазмы может быть важным для правильной укладки белков. Следует иметь в виду, что экспрессионная кассета или вектор могут быть сами адаптированы к пластидам-мишеням, чтобы стать трансформированными, и экспрессия ротавирус-ного структурного белка или полипептида может происходить полностью внутри пластиды.
Термин "нацеливающая последовательность" означает, что нацеливающие последовательности могут быть включены в вектор или экспрессионную кассету. Такие нацеливающие последовательности могут быть транслированы в пептид, который направляет вектор или его продукт в требуемый компартмент или суб-компартмент в растении, такой как пластида. Например, пластидные сигнальные пептиды (также называемые как "пластидные транзитные пептиды" в настоящей области техники) для нацеливания белков в пластиды известны в настоящей области техники. Не ограничивающий пример пластидного транзитного пептида, который может быть использован, представляет собой rbcs1-cTP. В качестве подходящего примера последовательности хлоропластного транзитного пептида представляет собой ген малой субъединицы Rubisco (rbcS1), например, из Solanum tuberosum.
Таким образом, ротавирусный структурный белок или полипептид может включать в себя сигнальный пептид, который представляет собой такой же как, или гетерологичный с, оставшейся частью полипептида или белка. Термин "сигнальный пептид" хорошо известен в настоящей области техники и, как правило, относится к короткой (приблизительно 5-30 аминокислот) последовательности аминокислот, найденной, как правило, на N-конце полипептида, который может направлять транслокацию вновь транслированного полипептида к конкретной органелле, или помогать в позиционировании специфических доменов полипептидной цепи по отношению к другим. В качестве неограничивающего примера, сигнальный пептид может нацеливать транслокацию белка в эндоплазматический ретикулум и/или облегчать позиционирование проксимального N-концевого домена по отношению к мембранному якорному домену растущего полипептида, чтобы помочь в расщеплении и укладывании зрелого белка, в качестве примера, который не должен рассматриваться как ограничивающий, ротавирусный структурный белок.
Сигнальный пептид (SP) может быть нативным к белку или вирусному белку, или сигнальный пептид может быть гетерологичным по отношению к первичной последовательности экспрессируемого белка или вирусного белка. Например, нативный сигнальный пептид ротавирусного структурного белка может быть использован для экспрессии ротавирусного структурного белка в системе растения.
Сигнальный пептид может быть также ненативным, например, из белка, вирусного белка или на-тивного структурного белка вируса, отличного от ротавирусного белка, или из растительного, животного или бактериального полипептида. Не ограничивающий пример сигнального пептида, который может быть использован, представляет собой таковой протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP) (нуклео-тиды 32-103 учетный номер Z11499). Кроме того, сигнальный пептид может быть полностью удален или усечен. Усечение или усеченный означает, что 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% или любое значение между ними аминокислотных остатков удалены из сигнального пептида. Предпочтительно, усеченные аминокислотные остатки непрерывны, и усечение происходят от второго метионина вперед.
В настоящем изобретении, следовательно, предусмотрен ротавирусный структурный белок, такой как, например, VP2 VP4, VP6 и/или VP7, содержащий нативный, ненативный сигнальный пептид или усеченный сигнальный пептид, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие ротавирусные структурные белки.
Один или более чем один генетический конструкт согласно настоящему изобретению может быть экспрессирован в любом подходящем растении-хозяине, которое трансформируют нуклеотидной последовательностью или конструктами, или векторами согласно настоящему изобретению. Примеры подходящих хозяев включают в себя без ограничения сельскохозяйственные культуры, включающие в себя люцерну, рапс, Brassica spp., кукурузу, Nicotiana spp., картофель, женьшень, горох, овес, рис, соевые бобы, пшеницу, ячмень, подсолнечник, хлопок и подобные.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие ротавирусные структурные белки, могут быть переданы в растения-хозяева с использованием 1, 2, 3, 4 или 5 бинарных плазмидных векторов. Таким об
разом, каждый бинарный плазмидный вектор может содержать 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидных последовательностей, кодирующих ротавирусный структурный белок.
Один или несколько генетических конструктов согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать 3' нетранслируемую область. 3' нетранслируемая область относится к той части гена, содержащего сегмент ДНК, который содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регулятор-ные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирова-ния обычно характеризуется осуществлением добавления треков полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии к каноническому виду 5' ААТААА-3', хотя вариации не редкость. Неограничивающие примеры подходящих 3' областей представляют собой 3' транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования опухоли Agrobacterium, индуцирующей (Ti) плазмидные гены, такие как ген нопа-линсинтазы (NOS), такие растительные гены, как гены запасных белков сои, малая субъединица рибуло-зы-I, ген 5-бисфосфат-карбоксилазы (ssRUBISCO; США 4962028; которая включена в настоящий документ посредством ссылки), промотор, используемый в регулировании экспрессии пластоцианина, описанный в патенте США 7125978 (который включен в настоящий документ посредством ссылки).
Один или несколько из генетических конструктов согласно настоящему изобретению также могут включать дополнительные энхансеры либо энхансеры транскрипции, либо трансляции, если это может потребоваться. Энхансеры могут быть расположены на 5' или 3' конце транскрибируемой последовательности. Области энхансеров хорошо известны специалистам в настоящей области техники и могут включать в себя инициирующий кодон ATG, прилегающие последовательности или тому подобное. Инициирующий кодон, если он присутствует, может быть в фазе с рамкой считывания ("в рамке"), кодирующей последовательности для обеспечения правильной трансляции транскрибируемой последовательности.
Конструкты согласно настоящему изобретению могут быть введены в клетки растений с использованием плазмиды Ti, плазмиды Ri, растительных вирусных векторов, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Для обзоров таких способов смотрите, например Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geier-son and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988) и Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Другие способы включают в себя прямой захват ДНК, применение липосом, электропорации, например, с использованием протопластов, микроинъекций, микроснарядов или микроигл и вакуумной инфильтрации. Смотрите, например, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lo-monossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002), патент США. № 4945050; 5036006 и 5100792, заявку на патент США № 08/438666, поданную 10 мая 1995 г., и 07/951715, поданную 25 сентября 1992 г. (все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки).
Временная экспрессия.
Не желая быть связанными теорией, концентрация белка и соотношение различных ротавирусных структурных белков может характеризоваться важным значением для эффективности сборки RLP. Поэтому множественность и время инфекции может быть важным, чтобы манипулировать концентрацией белка и общей эффективностью сборки RLP в растениях.
Конструкт согласно настоящему изобретению может быть временно экспрессирован в растении или части растения. Система временной экспрессии, основанная на эпихромосомной экспрессии рекомби-нантных Agrobacterium tumefaciens в растении, части растения или клетки растения, может быть использована для экспрессии ротавирусного структурного белка, нацелено воздействующего на различные клеточные компартменты или субкомпартменты. Система временной экспрессии позволяет высокую скорость производства. Кроме того, большие количества белка могут быть достигнуты в течение нескольких дней после инфильтрации рекомбинантного Agrobacterium в растениях (Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999). Также возможно экспрессировать длинные последовательности генов и содержать более чем один одновременно экспрессированный ген в той же клетке, что позволяет эффективную сборку мультимер-ных белков (Lombardi et al., 2009).
Нуклеотидные последовательности, кодирующие ротавирусные структурные белки, могут быть переданы в растения-хозяева в 1, 2, 3, 4 или 5 трансформированных штаммах Agrobacterium tumefaciens.
Однако на протяжении временной экспрессии пост-транскрипционный сайленсинг генов может ограничить экспрессию гетерологичных белков в растениях. Коэкспрессия супрессора сайленсинга, например, но без ограничения, Nss из вируса пятнистого увядания томатов может быть использован для противодействования специфической деградации трансгенных мРНК (Brigneti et al., 1998). Альтернативные супрессоры сайленсинга хорошо известны в настоящей области техники и могут быть использованы,
как описано в настоящем документе (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; которая включена в настоящий документ посредством ссылки), например, но без ограничения, HCPro TEV- p1/HC-Pro (вирус гравировки табака-P1/HC-Pro), BYV -р21, р19 из вируса кустистой карликовости томатов (TBSV р19), белок кап-сида вируса морщинистости томатов (TCV-СР), 2b вируса мозаики огурцов; CMV-2b), p25 вируса X картофеля (PVX-p25), p11 вируса М картофеля (PVM-p11), p11 вируса S картофеля (PVS -P11), р16 вируса костра голубики, (BScV -p16), р23 вируса тристеца цитрусовых (CTV-P23), р24 связанного со скручиванием листьев виноградной лозы вируса-2, (GLRaV-2 p24), p10 из вируса А виноградной лозы, (GVA-p10), p14 вируса В виноградной лозы (GVB-p14), p10 латентного вируса борщевика (HLV-p10) или р16 общего латентного вируса чеснока (GCLV-p16). Таким образом, супрессор сайленсинга, например HCPro, TEV- p1/HC-Pro, BYV -p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV -2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GVB-p14, HLV-p10, GCLV-p16 или GVA-p10, может быть коэкспрессиро-ван наряду с одним или несколькими ротавирусными структурными белками, например, VP2, VP4, VP6 или их комбинацией, чтобы в дальнейшем обеспечить высокие уровни производства белка в растении или части растения.
В настоящем изобретении также предусмотрены описанные выше способы, в которых дополнительная (вторая, третья, четвертая или пятая) нуклеотидная последовательность экспрессируется в растении, дополнительная (вторая, третья, четвертая или пятая) нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, функционально связанный с дополнительной (второй, третьей, четвертой или пятой) регуляторной областью, которая активна в растении. Нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, может представлять собой, например, Nss, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 или GVA-p10.
Как описано ниже, способы временной экспрессии могут быть использованы для экспрессии конструкта согласно настоящему изобретению (смотрите Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; которая включена в настоящий документ посредством ссылки). С другой стороны, может быть использован способ основанной на вакууме временной экспрессии, как описано Kapila et al., 1997, которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Эти способы могут включать в себя, например, без ограничения, способ агроинокуляции или агроинфильтрации, инфильтрации шприцом, однако, и другие временные способы также могут быть использованы, как отмечалось выше. С агроино-куляцией, агроинфильтрацией или инфильтрацией шприцом смесь Agrobacteria, содержащая нужную нуклеиновую кислоту, входит в межклеточные пространства ткани, например листьев, воздушной части растения (включающей в себя ствол, листья и цветок), другие части растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После пересечения эпидермиса Agrobacteria инфицируют и передают копии т-ДНК в клетки. т-ДНК транскрибируется эписомально и мРНК транслируется, что приводит к получению представляющего интерес белка в инфицированных клетках, однако, прохождение т-ДНК внутри ядра характеризуется временностью.
Для помощи в идентификации трансформированных растительных клеток, на конструкты согласно настоящему изобретению можно дополнительно воздействовать, чтобы включить в себя растительные селективные маркеры. Полезные селективные маркеры включают в себя ферменты, которые обеспечивают устойчивость к таким химическим веществам, как антибиотик, например, гентамицин, гигромицин, канамицин, или такие гербициды, как фосфинотрицин, глифосат, хлоросульфурон и тому подобное. Аналогичным образом, могут быть использованы ферменты, обеспечивающие получение соединения, идентифицируемого посредством изменения цвета, такие как GUS (бета-глюкуронидазы), или люминесценции, такие как люцифераза или GFP.
Кроме того, рассматриваемая часть настоящего изобретения представляет собой трансгенные растения, растительные клетки или семена, содержащие генный конструкт по настоящему изобретению. Способы регенерации целых растений из растительных клеток также известны в настоящей области техники. В общем, трансформированные растительные клетки культивируют в подходящей среде, которая может содержать селективные средства, такие как антибиотики, где используются селективные маркеры для облегчения идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллуса можно стимулировать образование побега, используя соответствующие гормоны растений в соответствии с известными способами, и переносить побеги на субстрат для выращивания растений для регенерации растений. Растения могут быть использованы для установления повторяющихся поколений либо из семян, либо с помощью вегетативных способов распространения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования тканевых культур.
Использование терминов "регуляторная область", "регуляторный элемент" или "промотор" в настоящей заявке призвано отражать часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, выше по ходу транскрипции от кодирующей белок области гена, которая может быть образована либо ДНК или РНК, либо ДНК и РНК. Когда регуляторная область активна и в функциональной связи или функционально связана с представляющим интерес геном, это может приводить к экспрессии представляющего интерес гена. Регуляторный элемент может быть способен опосредовать органную специфичность или контролировать развитие или временную активацию гена. "Регуляторная область" может включать в себя промо
торные элементы, сердцевинные промоторные элементы, проявляющие базальную активность промотора, элементы, которые индуцируются в ответ на внешний стимул, элементы, которые опосредуют промо-торную активность, такие как отрицательные регуляторные элементы или транскрипционные энхансеры. Используемая в настоящем документе "регуляторная область" может также включает в себя элементы, которые активны после транскрипции, например, регуляторные элементы, которые модулируют экспрессию генов, такие как трансляционные и транскрипционные энхансеры, трансляционные и транскрипционные репрессоры, вышележащие активирующие последовательности, а также детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из этих последних элементов могут быть расположены проксимально к кодирующей области.
В контексте настоящего раскрытия термин "регуляторный элемент" или "регуляторная область" обычно относится к последовательности ДНК, как правило, но не всегда, выше по ходу транскрипции (5') к кодирующей последовательности структурного гена, который контролирует экспрессию кодирующей области путем предоставления распознавания для РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции на конкретном участке. Тем не менее, следует понимать, что другие нуклеотидные последовательности, расположенные в пределах интронов или 3' последовательности, также могут вносить свой вклад в регуляцию экспрессии представляющей интерес кодирующей области. Пример регуляторного элемента, который обеспечивает распознавание РНК-полимеразы или других транскрипционных факторов для обеспечения инициации в конкретном сайте представляет собой промо-торный элемент. Большинство, но не все, эукариотические промоторные элементы содержат ТАТА-бокс, консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из нуклеотидных пар оснований аденозина и тимидин, как правило, расположенных приблизительно в 25 парах нуклеотидов выше по ходу транскрипции от стартового сайта транскрипции. Промоторный элемент содержит базальный про-моторный элемент, ответственный за инициацию транскрипции, а также другие регуляторные элементы (как указано выше) для модификации генной экспрессии.
Существует несколько типов регуляторных областей, включающие в себя те, которые представляют собой регулируемые, индуцируемые или конститутивные с развитием. Регуляторная область, которая с развитием регулируется или контролирует дифференциальную экспрессию гена под его контролем, активируется в определенных органах или тканях органа в определенное время в ходе развития этого органа или ткани. Тем не менее, некоторые регуляторные области, которые с развитием регулируются, могут преимущественно быть активными в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, они также могут быть активными регулируемыми в процессе развития или на базальном уровне в других органах или тканях в растении. Примеры тканеспецифичных регуляторных областей, например, смотрите специфическую регуляторную область, включают в себя промотор напина и промотора круци-ферина (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Пример, специфического для листа промотора включает в себя промотор пластоцианина (смотрите патент США 7125978, который включен в настоящий документ посредством ссылки).
Индуцируемая регуляторная область представляет собой ту, которая способна прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или нескольких последовательностей ДНК или генов в ответ на индуктор. При отсутствии индуктора последовательности ДНК или гены не будут транскрибироваться. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемой регуляторной областью для активирования транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем непосредственно или косвенно преобразуется в активную форму с помощью индуктора. Тем не менее, белковый фактор также может отсутствовать. Индуктор может представлять собой химическое вещество, такое как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или фенольное соединение или физиологический стресс, воздействующий непосредственно теплом, холодом, солью или токсичными элементами, или косвенно через действие патогена или возбудителя заболевания, такого как вирус. Растительная клетка, содержащая индуцируемую регуляторную область, может подвергаться воздействию индуктора путем внешнего применения индуктора к клетке или растению, например, путем распыления, полива, нагрева или подобными способами. Индуцируемые регуляторные элементы могут быть получены из растительных или нерастительных генов (например, Gatz, С. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; которая включена посредством ссылки). Примеры потенциальных индуцируемых промоторов включают в себя без ограничения индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С, 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48,89-108, которая включена посредством ссылки), индуцируемый стероидом промотор (Ao-yama. Т. and Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404; которая включена посредством ссылки) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G, et al., 1998, Plant 10 umal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al.,1998, Nature Biotech. 16, 177-180; которые включены посредством ссылки), индуцируемые цитокинином гены IB6 и CKI 1 (Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274,982-985; которые включены посредством ссылки) и индуцируемый ауксином элемент, DR5 (Ulmasov, Т., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; которая включена посредством ссылки).
Конститутивная регуляторная область направляет собой экспрессию гена в различных частях растения и непрерывно в течение развития растений. Примеры известных конститутивных регуляторных элементов включают в себя промоторы, связанные с транскриптом 35S CaMV (Odell et al., 1985, Nature,
313: 810-812), актином 1 риса (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актином 2 (An et al., 1996, Plant J, 10: 107-121) или tms 2 (патент США 5428147, который включен в настоящий документ посредством ссылки) и генами триозофосфатизомеразы 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), геном убикити-на 1 кукурузы (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), генами убикитина 1 и 6 Arabidopsis (Hol-torf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646) и геном фактора инициации трансляции 4А табака (Mandel et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004).
Используемый в настоящем документе термин "конститутивный" не обязательно означает, что ген под контролем конститутивной регуляторной области экспрессируется на том же уровне во всех типах клеток, а то, что ген экспрессируется в широком диапазоне типов клеток даже хотя часто наблюдается изменение в изобилии. Конститутивные регуляторные элементы могут быть соединены с другими последовательностями для дальнейшего усиления транскрипции и/или трансляции нуклеотидной последовательности, с которой они функционально связаны. Например, система CPMV-HT происходит от не-транслируемых областей вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) и демонстрирует усиленную трансляцию соответствующей кодирующей последовательности. "Нативная" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты характеризуется природным происхождением или представляет собой "дикого типа". Под "функционально связанный" подразумевается то, что конкретные последовательности, например, регуляторный элемент и представляющая интерес кодирующая область, взаимодействуют непосредственно или опосредовано для осуществления намеченной функции, такой как опосредование или модуляция генной экспрессии. Взаимодействие функционально связанных последовательностей может, например, быть опосредовано белками, которые взаимодействуют с функционально связанными последовательностями.
Произведенная в растении RLP может индуцировать ротавирусный структурный белок VP7, содержащий специфические для растения N-гликаны. Таким образом, в настоящем изобретении также предусмотрена RLP, содержащая VP7, содержащий специфические для растения N-гликаны.
Кроме того, известна модификация N-гликанов в растениях (смотрите, например, US 60/944344; который включен в настоящий документ посредством ссылки) и могут быть получены VP7 с модифицированными N-гликанами. Могут быть получены VP7, содержащие модифицированный паттерн гликозили-рования N-гликанов, например с пониженным фукозилированием, ксилозилированием или как фукози-лированием, так и ксилозилированием, или могут быть получены VP7, содержащие модифицированный паттерн гликозилирования, в котором белок не содержит фукозилирования, ксилозилирования, или обоих, и содержит повышенное галактозилирование. Кроме того, модуляция посттрансляционных модификаций, например, добавление терминальной галактозы, может приводить к понижению фукозилирования и ксилозилирования экспрессированного VP7, по сравнению с экспрессирующим VP7 растением дикого типа.
Для примера, который не следует рассматривать как ограничивающий, синтез VP7, содержащего модифицированный паттерн гликозилирования, может быть достигнут путем коэкспрессирования VP7 вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей бета-1,4-галактозилтрансферазу (GalT), например, но без ограничения, GalT млекопитающих или GalT человека, однако GalT из других источников также может быть использован. Каталитический домен GalT может быть также слит с доменом CTS (т.е. цитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом, стволовой областью) из N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GNT1), для получения гибридного фермента GNT1-GalT, и гибридный фермент может быть коэкспрессирован с VP7. VP7 также может быть коэкспрессирован вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей N-ацетилглюкозаминил трансферазу III (GnT-III), например, но без ограничения, GnT-III млекопитающих или GnT-III человека, GnT-III из других источников также может быть использована. Кроме того, также может быть использован гибридный фермент GNT1-GnT-III, содержащий CTS GNT1, слитый с GnT-III.
Таким образом, в настоящем изобретении также предусмотрены RLP, содержащие VP7, характеризующиеся наличием модифицированных N-гликанов.
Не желая быть связанными теорией, наличие растительных N-гликанов на VP7 может стимулировать иммунный ответ, способствовать связыванию VP7 с помощью антиген представляющих клеток. Стимуляция иммунного ответа с использованием N гликана растений была предложена Saint-Jore-Dupas
et al. (2007).
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.
Примеры
Пример 1. Экспрессия ротавирусных белков и производство VLP в листьях растения N. Benthamiana.
В следующем анализе использовали ротавирусные белки капсида от штамма ротавируса G9 P[6], и оценивали, образовывались ли ротавирус-подобные частицы в различных компартментах клеток листьев табака N. benthamiana. Исследовали коэкспрессию VP2 и VP6, а также различные комбинации VP2, VP6, VP7 и VP4 в листьях растений табака.
Материалы и способы.
Конструирование плазмид.
Оптимизированные растительными кодонами ротавирусные кДНК для VP2, VP4, VP6 и VP7 поставлялись Geneart, Germany. ДНК плазмиды трансформировали в DH5-0 химически компетентные клетки E.coli (E. cloni(tm), Lucigen) в соответствии с инструкциями производителя. В настоящем исследовании использовали новые бинарные векторы Agrobacterium pTRAc (цитоплазматические), pTRAkc-rbcs1-CTP (нацелено воздействующие на хлоропласт) и pTRAkc-эр (нацелено воздействующие на эндо-плазматический ретикулум), поставляемые Rainer Fischer (Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, IME, Germany). Дополнительный вектор, pTRAkc-(апопласта) получали из модификации pTRAkc-РГР с помощью расщепления рестриктазой (RE) в сайтах NcoI и XhoI в сайте множественного клонирования (фиг. 3). Это устраняет гистидиновый тег и последовательность KDEL, которая сохраняет белки в ER. Белки вместо этого направляют к апопласту.
кДНК VP2, VP4 и VP6 расщепляли рестриктазами (RE) с NcoI/XhoI, в то время как VP7 разрезали с AflIII/XhoI. Ферменты рестрикции AflIII, NcoI и MluI характеризуются наличием совместимых липких концов. Для прямого клонирования ДНК в pTRAc, pTRAkc-rbcs-cTP и pTRAkc-A, каждый из векторов расщепляли RE в сайтах AflIII/XhoI, MluI/XhoI и NcoI/XhoI, соответственно. Клонирование ДНК в векторах проводилось в соответствии со стандартным протоколом с последующей трансформацией в химически компетентные клетки E.coli DH5-0 (E. cloni(tm), Lucigen). Отдельные рекомбинантные колонии проверяли с помощью ПЦР колоний. Для клонирования в pTRAkc-ERH, сайт фермента рестрикции NotI добавляли для замещения стоп-кодона каждой из четырех ротавирусных кДНК с помощью ПЦР-амплификации. кДНК амплифицировали с использованием праймеров, как описано в табл. 1. Условия реакции ПЦР включали в себя денатурацию при 95°C в течение 5 мин, после чего пять циклов денатурации при 95°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 1 мин и элонгацию при 72°C в течение 1,5 мин. Следующие 20 циклов выполняли следующим образом: 95°C в течение 30 с, 57°C в течение 1 мин, 72°C в течение 1,5 мин и 72°C в течение 5 мин. Амплифицированные фрагменты затем клонировали в pGEM-T-Easy (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.
Трансформацию проводили в химически компетентных клетках DH5-0 E.coli (E. cloni(tm), Lucigen). ПЦР колонии затем проводили на выбранных колониях, как это было сделано для других трех конструктов.
ДНК pGEM-VP из положительных колоний секвенировали для проверки верности ПЦР. ДНК расщепляли с NcoI/NotI и соответствующий фрагмент ДНК, клонировали в pTRAkc-ERH в сайты NcoI и NotI для образования pTRAkc-ERH-VP. Трансформацию затем проводили в клетках DH5-0 E.coli, как выполняли ранее. Способ колоний ПЦР проводили также для проверки ротавирусной ДНК в отдельных колониях.
Трансформация Agrobacterium.
Штамм GV3101 Agrobacterium tumefaciens был предоставлен профессором Rainer Fischer (Fraun-hofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Aachen, Germany) и сделан электрокомпетентным, как описано ранее (Shen and Forde, 1989). Триста нанограмм выделенных ротавирусных PTRA-VP конструктов смешивали с 100 мкл электрокомпетентных GV3101 клеток в 0,1 см кювете для электро-порации (BioRadTM), затем электропорировали в GenePulser (BioRad) при следующих настройках: 1,8 кВ, 25 mkF и 200 XX Инкубирование проводили в течение 1 ч при 27°C в 900 мкл LB перед высевом на планшеты, содержащие LA 50 мкг/мл карбенициллина (carb), 30 мкг/мл канамицина (кап) и 50 мкг/мл рифампицина (rif). Планшеты инкубировали при 27°C в течение 3 дней. Для проверки положительных трансформантов, ДНК плазмиду выделяли из рекомбинантных колоний Agrobacterium и обратно-трансформировали в компетентные клетки DH5-0 E.coli. Затем их отбирали на 100 мкг/мл ампициллина (amp) LA. Способ колоний ПЦР и расщепление рестриктазами по кДНК осуществляли, чтобы проверить успешных трансформантов.
Запасы в глицерине соответствующего рекомбинантного Agrobacterium выполняли и хранили при
-70°C.
Инфильтрация рекомбинантного Agrobacterium.
Используемый в настоящем исследовании LBA 4404 A. tumefeciens (pBIN-H3) получали из Marcel Prins (Laboratory of Virology, Wageningen University, Binnenhaven, Netherlands). Он содержит суперссор сайленсинга NSs, найденный в вирусе пятнистого увядания томатов (TSWV). Рекомбинантный Agrobac-terium (pTRA-VPs) из запасов в глицерине выращивали при 27°C в течение ночи в LB с 50 мкг/мл carb, 30
мкг/мл кап и 50 мкг/мл rif. Рекомбинантный Agrobacterium и LBA4404 (pBIN-NSs) затем каждый иноку-лировали в индукционной среде (LB, 10 мМ 2-(№морфолино)этансульфоновой кислоты MES, 2 мМ MgSO4, 20 мкМ ацетосирингон, 50 мкг/мл carb, 30 мкг/мл кап и 50 мкг/мл rif, и pH 5,6).
Культуры инкубировали при 27°C в течение ночи. Клетки Agrobacterium собирали центрифугированием при 4000 оборотах в минуту в течение 5 мин при 4°C, а затем ресуспендировали в 2 мл среды инфильтрации (10 мМ MES, 10 мМ MgCl2, 3% сахароза, pH 5,6, 200 мкМ ацетосирингон и стерильную вода). Проверяли оптическую плотность (OD600) клеток и разбавляли средой инфильтрации для получения OD600 0,25. Для каждого конструкта PTRA-VP LBA4404 смешивали с рекомбинантными Agrobacte-rium до конечного OD600 0,5. Для исследования коэкспрессии каждый конструкт добавляли до общей OD600 0,5, например; VP2 - 0,25 и VP6 - 0,25, пока OD600 для смеси составила 0,5. Ацетосирингон, использованный в индукционной и инфильтрационной среде, помогает в активации генов vir в Agrobacte-rium.
Поврежденные растительные клетки выпускают фенольные соединения, которые обнаруживаются генами Vir А и G Vir в Agrobacterium, впоследствии приводя к индукции экспрессии белка в клетках-хозяевах (Zupan, J. et al., 2000). Затем клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы позволить ацетосирингону индуцировать гены vir. Растения дикого типа N. benthamiana возрастом 3 недели подвергали инфильтрации с рекомбинантной Agrobacterium, экспрессирующей белки VP. Это включало в себ или вакуум-инфильтрацию целых растений, или инъекцию рекомбинантной Agrobacte-rium (PTRA-VP) в абаксиальные воздушные пространства на нижней стороне листьев растений. Реком-бинантную агробактерию подвергали инфильтарации с или без супрессора сайленсинга LBA 4404 (pBIN-
NSS).
Первоначально, 2 мл суспензии среды инфильтрации Agrobacterium вводили в каждое растение с использованием шприца на конструкт. Одно растение использовали на конструкт в течение семидневного периода. Также проводили коэкспрессию ротавирусных белков, в которых VP2, VP6 и VP4 одновременно экспрессировались в цитоплазме листьев растений N. benthamiana. Исследуемые комбинации представляли собой VP2/6 и VP2/6/4. Белок "шип" VP4 может связываться с VP6, и, таким образом, существует возможность, что они могли бы добавлять к структурам RLP. Были попытки клонирования VP7, но вопросы токсичности к клеткам-хозяевам оказались проблемой. Рекомбинантный VP7 Agrobac-terium уничтожал клетки листьев в течение суток после инфильтрации. Чтобы избежать это испытывали несколько способов, такие как инфильтрация растений при низкой температуре 17°C и инфильтрация через 3 дня и/или 5 дней периода исследований. Таким образом, VP7 был опущен в исследованиях ко-экспрессии из-за его токсичной природы в растениях табака.
Экстракция белка.
Собирали целые листья или два листовых диска на конструкт и измельчали в жидком азоте. Вещество измельченного листа ресуспендировали в стерильном PBS, содержащем полный ингибитор протеа-зы (без ЭДТА; Roche). Затем смесь центрифугировали в течение 5 мин при 13000 оборотах в минуту, и гранулы (вещество листа растения) выбрасывали. 100 мкл каждого конструкта затем смешивали с 5Х ДСН-ПААГ загрузочного буфера и кипятили в течение 2 мин при 95°C, подготавливая для дальнейшего анализа на ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Остальные образцы хранили при -20°C для последующего использования. На фиг. 4 показан обзор процедуры клонирования и инфильтрации для ротавирусной
кДНК.
Экстракции белков апопласта.
Дополнительную процедуру экстракции проводили на pTRAkc-A, конструктах апопласта. Апопласт представляет собой свободное диффузионное пространство между плазматической мембраной и клеточными стенками растительных клеток (фиг. 5А). Белки, экспрессированные в цитоплазме, содержат последовательность экспорта, которая нацеливает их на апопласт, следовательно, они накапливаются в нем. В последующей процедуре экстракции целые листья от каждого дня экстракции подвергали либо вакуум-инфильтрации, либо инъекционной инфильтрации со стерильным PBS, содержащим полный ингибиторов протеазы. Для вакуумной инфильтрации отдельные листья растений суспендировали в PBS и помещали под вакуум при 100 мбар в течение 10 мин в вакуумной камере. Листья затем перекатывали и осторожно помещали в спиновые колонки (по аналогии со спиновыми колонками Qiagen) с отверстием в нижней части (фиг. 5b2). Отверстия позволяют легко проходить текучей жидкости из листьев, не позволяя проходить твердому веществу листа. Спиновые колонки помещали в пробирки Эппендорфа объемом 2 мл и центрифугирование проводили при 4000 оборотах в минуту в течение 15 мин (фиг. 5b3). Фильтрат собирали и добавляли краситель загружаемого белка для гелей ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга к 100 мкл каждого образца фильтрата.
Вестерн-блоты и окрашивание кумасси.
Вестерн-блоты и окрашенные кумасси синим ДСН-ПААГ использовали, как описано выше. Мышиное антитело к VP6 ротавируса (US Biologicals) (1:5000), антитело к мышиному тегу гистидина (Sigma(r)) (1:2000), сыворотки цыпленка к VP2 и к VP4 (1:2000) использовали для исследования каждого из соответствующих белков в вестерн-блоттинге. Окрашенные кумасси синим гели ДСН-ПААГ использовали для количественной оценки белков путем сканирования плотности полос с использованием Syngene
Gel Documentation System.
Электронная микроскопия.
Для определения, собираются ли экспрессированные белки в RLP, проводили трансмиссионную электронную микроскопию (TEM) иммуно-захваченных частиц на 3-й день экспрессии экспрессирован-ных в цитоплазме VP6, VP2/6 и VP2/6/4, все в присутствии супрессора сайленсинга Nss. Углеродно/медные сетки, обработанные в тлеющем разряде, размещали на 20 мкл мышиного антитела к VP6 ро-тавируса (1:5000) в течение 5 мин, а затем промывали три раза стерильной дистиллированной водой. Сетки затем помещали на 10 мкл белковых экстрактов и оставляли на 2 мин, а затем промывали три раза снова стерильной дистиллированной водой. Наконец, сетки размещали на 20 мкл 2% уранилацетата в течение 1 мин перед просмотром под TEM (Zeiss 912 OMEGA Energy Filter Transmission Electron Microscope, University of Cape Town).
Для выделенных из градиентов сахарозы образцов, сахароза сначала должна быть удалена с помощью диализа до иммунно-захвата на медных сетках. Если не удалить, кристаллы сахарозы ингибируют окончательный просмотр образцов под TEM, поскольку она образует кристаллы на сетках, нарушая структуру связанного углерода и материала. Фракции сахарозы помещали в 10 000 МВт диализные кассеты и подвергали диализу в стерильном PBS, содержащем 0,4 М NaCl в течение 4 ч перед заменой буфера и оставляли на ночь при 4°C при перемешивании. Поскольку объем увеличивается с диализом, образцы белка требуют концентрирования. Образцы подвергали вакуумной сушке вымораживанием в течение 3 часов и ресуспендировали в 2 мл стерильного PBS, готовые для дальнейшего анализа.
Очистка RLP в градиенте сахарозы.
Белковые растительные экстракты первоначально фильтровали через мираклос для удаления твердого растительного вещества. Градиенты сахарозы от 10 до 60% сахарозы создавали в 40 мл пробирках, каждая путем создания шести слоев по 5 мл сахарозы, растворенной в стерильном PBS (pH 7,4). Очищенные образцы белка в объемах от 5 до 10 мл затем загружали в верхнюю часть каждой градиентной колонки.
Ультрацентрифугирование при 150000 g (бакет-ротор SWTi28, Beckman Coulter) проводили при 4°C в течение 1 ч 30 мин. В конце центрифугирования 2 мл фракции собирали со дна каждой колонки с помощью пункции пробирки. Дот блоты затем выполняли для определения фракциий с представляющими интерес белками. Для каждой фракции 1 мкл образца наносили в виде сетки на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем блокировали блокирующим буфером BSA. Вестерн-блоттинг затем выполняли как обычно. Белки изучали с мышиным антителом к VP6 (1:5000) для VP6 или сывороткой цыпленка к VP2 и VP4 (1:5000) для двух других белков.
Анализ всех растворимых белков.
Все растворимые белки (TSP) определяли по анализу Бредфорда. Его выполняли для сравнения содержания накопленных в цитоплазме белков, коэкспрессированных VP2/6. Белок IgG (маточный раствор 1,43 мг/мл) использовали в сериях разведений в качестве стандарта. 5 мкл стандарта и каждый образец добавляли на чистый сухой планшет для микротитрования. Реагенты А и В для определения всего растворимого белка добавляли в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad Dc Protein Assay). Все эксперименты проводили в трех повторениях. Оптическую плотность регистрировали при 750 нм с использованием микропланшетного ридера (Bio-tek PowerWave XS).
Результаты.
Экспрессия VP6 в клеточных компартментах листьях растений.
VP6 экспрессировали и нацеливали на все клеточные компартменты (фиг. 6; (линия отмечает VP6, при ~42 кДа)), с и без супрессора сайленсинга. В цитоплазме белок экспрессировали с первого дня периода исследований с увеличением накопления белка в цитоплазме на протяжении недельного исследования (фиг. 6а). В ER накопление белка было отчетливо видно только на 3-й день (фиг. 6b). Белок пробегал в полосе более высокого размера (приблизительно 11 кДа и более), чем другие белки. Это может быть результатом добавленного к С-концевой части, а также к сайту расщепления (относится к вектору последовательности pProEx) белка тега гистидина 6.
Накопление белка в хлоропластах происходило между 1 и 3 днями (фиг. 6 "хлоропласты"). Супрес-сор сайленсинга оказывал влияние на белки, поскольку никаких белков не было обнаружено в его отсутствие. Не было экспрессии белка в дни 5 и 7. Апопласт, так же, как и ER, характеризовался наилучшим накоплением белка между 3 и 5 дням периода испытания (фиг. 6 "апопласт") и его отсутствием в 1 и 7 день. Супрессор сайленсинга характеризовался положительным эффектом, особенно на 3-й день, приводя к более высокому содержанию белков, по сравнению с тем, когда он был исключен. Также видно, что две полосы видны на отметке ~40 кДа, вероятно, в результате отщепления сигнального тега от белка
VP6.
ER, хлоропласты и апопласт все проявляли самую высокую экспрессию белка на 3-й день с самым сильным накоплением белка в присутствии супрессора сайленсинга. Цитоплазма была лучшей с точки зрения накопления белка, как это показано высокой и повышающейся экспрессией белка в течение всего периода исследования.
Экспрессия меченых гистидином ротавирусных белков в цитоплазме.
Четыре ротавирусные VPs клонировали в дополнительный вектор, pTRAc-HT. Этот вектор включает в себя тег 6-гистидин к белкам, нацеленных на цитоплазму, и делает обнаружение легким с использованием антитела к гистидиновому тегу, если антитела к представляющим интерес белкам недоступны. В случае авторов настоящего изобретения только VP6 характеризуется наличием коммерчески доступного антитела и, следовательно, авторы настоящего изобретения попробовали эту процедуру для раннего выявления всех белков в ожидании сыворотки. Цитоплазма также хорошо работала для экспрессии VP6 и мотивировала авторов настоящего изобретения попробовать использовать другие белки.
Результаты вестерн-блоттинга экстрактов на 3-й день из 7-дневного периода исследования показали успешную экспрессию VP2, VP4 и VP6 (фиг. 7а). Для того, чтобы получить экспрессию VP7 в растениях, были опробованы различные способы. Тем не менее, инфильтрованные с VP7 растения проявляли пожелтение листьев с 1-го дня и продолжали слабеть в течение периода исследования (фиг. 7b). Экспрессию белка не обнаружили в этих условиях даже после 1-го дня инфильтрации, когда растение еще выглядело достаточно хорошо.
Экспрессия VP2 и VP4 в растениях.
VP2 и VP4 подвергали инфильтрации в листья растения N. benthamiana и нацеливали на ER, хлоропласт, цитоплазму и апопласт. Авторы настоящего изобретения были не в состоянии экспрессировать нацеленный на вектор апопласта VP2, поскольку они не могли получить никаких позитивных клонов в E.coli. Тем не менее, белок успешно экспрессировали и нацеливали на все 3 другие компартмента (фиг. 8а). Сыворотку цыпленка к VP2 и к VP4 (1:2000) использовали в вестерн-блоттинге экстрактов. Полосы VP2 и VP4 были видны чуть ниже метки 100 кДа (полосы белка, указанные стрелкой), как показано на фиг. 8а и 8b, соответственно. Экспрессия оказалась лучшей в цитоплазме и ER для VP2, в то время как для VP4 - в цитоплазме и апопласте. Супрессор сайленсинга не оказывал значительного влияния на экспрессию белков. Он лишь немного повышал экспрессию в конструкте ER VP2 и не так сильно в остальных, как видно из вестерн-блота. Конструкты VP4 все экспрессировались в присутствии супрессора сай-ленсинга.
Коэкспрессия VP2/6 и VP2/6/4 в цитоплазме.
Цитоплазма оказалась лучшей для экспрессии ротавирусного белка капсида и проявила самую высокую эффективность экстракции. Поэтому все дальнейшие работы по экспрессии осуществляли с белками, нацелено воздействующими на цитоплазму.
Как было показано, VP2 и VP6 образуют RLP с защитными иммуногенными реакциями у мышей и, следовательно, исследовали коэкспрессию VP2/6 и VP2/6/4 в цитоплазме. Экстракты 3-го дня коэкспрес-сированных VP2/6/4 обнаруживали с помощью вестерн-блоттинга с сывороткой к VP2 и VP4 (1/5000) и мышиным антителом к VP6 (1:5000) (фиг. 9). Экспрессия VP6 была очень высокой, как определено ранее, но экспрессия VP2 и VP4 была очень низкой, как видно из очень слабой полосы на метке 100 кДа. Это, возможно, было обусловлено коэкспрессией, в результате которой больше ресурсов клеток-хозяев использовалось при гиперэкспрессии VP6, оставляя меньше для VP2 и/или VP4. Также было не легко определить, представляют ли собой обнаруженная полоса VP2 и VP4 или любой из этих 2 белков. Очень заметная полоса, проходящая над 130 кДа, может представлять собой димеризованные белки VP6. Полоса, видимая на метке 55 кДа, скорее всего, представляет собой обильный растительный фермент Rubisco.
Анализ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии на экспрессированные в цитоплазме VP6, а также на коэкспрессированные VP2/6 и VP2/6/4, проводили для проверки белковых частиц и собранных RLP (фиг. 10). Также определяли, действительно ли VP2 и/или VP4 успешно коэкспрессиру-ются. VP6 при экспрессии отдельно собирался для образования оболочки белка, как указано стрелкой на фиг. 10b. При добавлении VP2 частицы собирались для образования RLP (фиг. 10с). VP2 выступает в качестве поддерживающего белка, что позволяет другим белкам собираться и в конечном итоге образовывать полную структуру ротавируса. VP6 как таковой связывался с VP2, но было все также не легко определить структуры VP4 в коэкспрессированном VP2/6/4. Электронная микрофотография на фиг. 10d может представлять собой чисто собранные частицы VP2/6. Было показано, однако, что VP4 связывается с VP6 во время сборки белка, и это происходит до связывания VP7. Вполне вероятно, что эти структуры VP4 не стабильны и могут разрушать структуру RLP в ходе процедур подготовки к электронной микроскопии.
Очистка VP2/6 и VP2/6/4 в градиенте сахарозы.
VP2/6 и VP2/6/4 очищали на градиенте сахарозы в интервале от 10 до 60% сахарозы (фиг. 11 а). 2 мл фракции собирали со дна каждой пробирки и исследовали с помощью мышиного антитела к VP6 и/или сыворотки цыпленка к VP2 и VP4 для определения того, какие фракции содержат белки. Для VP2/6, белки были найдены во фракциях 16 и 17, поскольку они были положительными на VP6 белок на блоте (фиг. 11b). Блот-анализ VP2/6/4 с сывороткой цыпленка к VP2 и VP4 показал положительные результаты на всех фракциях. Это может быть следствием высокого содержания обнаруженного фонового белка в сыворотке цыпленка. Тем не менее, интенсивность дотов была самой высокой во фракциях 17 и 18, как показано на фиг. 11 с, возможно из-за более высокой концентрации представляющих интерес белков в этих фракциях.
Соединяя эти результаты вместе (фиг. 11b и 11 с), ротавирусные белки были в фракциях в диапазоне
от 16 до 20.
Вестерн-блоттинг и окраска фракций кумасси.
Вестерн-блоттинг и ДСН-ПААГ коэкспрессированных VP2/6 выполняли для проверки наличия белков VP2 и VP6 во фракциях от 13 до 20. Вестерн-блоттинг для белка VP6, проводимый с мышиным антителом к VP6, был положительным во фракциях от 16 вплоть до 20 (фиг. 12а, нижняя стрелка и фиг. 12с). Белок VP2, проанализированный с сывороткой цыпленка к VP2, был обнаружен во фракциях от 17 до 20 (фиг. 12а, верхняя стрелка). В прошлых исследованиях коэкспрессии было показано, что VP2 экс-прессируется меньше, чем VP6, и это также показано в настоящем изобретении на фиг. 12а, на которой полосы белка VP2 характеризуются более низкой интенсивностью, по сравнению с VP6.
Фракции 16 и 17 коэкспрессированных VP2/6, как было определено ранее с помощью дот блотов как содержащие белок VP6 (фиг. 11b), подвергали электрофорезу на ДСН-ПААГ геле. Белок известной концентрации, клетку насекомого SF9, экспрессирующую VP6 (0,91 мкг/мкл), включали таким образом, чтобы определить концентрацию VP2/6 неочищенных белков (фиг. 11b и с). Это выполняли путем сканирования плотности полосы неочищенного белка (линия, помеченная неочищ.), с использованием Syn-gene Gel Documentation System и, следовательно, позволило авторам настоящего изобретения определить количество VP2/6 на килограмм листьев исходного растения. Выход белка установили на уровне приблизительно 1,54 г/кг сырого веса (FW). 1,1 мг очищенного RLP получали из 1 г растительного материала
(1,1 г/кг).
Анализ всего растворимого белка VP2/6.
Весть растворимый белок (TSP) определяли в коэкспрессированных VP2/6 фракциях для определения относительных количеств белка VP2/6 (фиг. 13). Концентрации белка рассчитывали как 0,538 мг/мл и 1,012 мг/мл для фракций 17 и 18, соответственно, с использованием стандарта IgG (фиг. 13а). Полосы белка, соответствующие VP2/6 в этих фракциях, рассчитывали путем сканирования плотности на Syn-gene Gel Documentation System, и определяли как приблизительно 0,108 мг/мл и 0,202 мг/мл, соответственно.
Таким образом, TSP для VP2/6 в фракциях 17 и 18 оба составляли приблизительно 20% TSP. Большинство RLP в колонке сахарозы было определено, как находящиеся между 15 и 25% сахарозы, соответствуя фракциям с 15 до приблизительно 20, где граф отмечал внезапный пик, а затем спад. Различия в плотности различных материалов в экстракте позволило авторам настоящего изобретения отделить и таким образом очистить представляющие интерес белки. Гели ДСН-ПААГ, окрашенные кумасси синим, показали только одну заметную полосу, указывающую на то, что белки относительно чистые (фиг. 12b).
TEM очищенных VP2/6.
Очищенные фракции VP2/6 объединяли вместе и диализовали в PBS с высоким содержанием соли для удаления сахарозы перед просмотром на трансмиссионном электронном микроскопе. TEM выполняли для определения чистоты и проверки того, остаются ли RLP интактными после процедуры очистки. Как видно на фиг. 15, большинство из фонового материала, который в основном состоял из продуктов клетки-хозяина (фиг. 10b, с и d), удаляли, оставляя за RLP. Большинство из RLP оставались нетронутыми, но некоторые, казалось, потеряли форму, вероятно, в результате деформации из-за условий на сетке ЕМ.
Предварительный анализ экспрессии ротавирусных структурных белков в листьях N. benthamiana.
Этот предварительный анализ фокусировался на экспрессии ротавирусных структурных белков VP2 (SEQ ID NO: 1), VP4 (SEQ ID NO: 2), VP6 (SEQ ID NO: 3) и VP7 (SEQ ID NO: 4) в листьях N. ben-thamiana в качестве системы экспрессии хозяина. Штамм выбранного в настоящем документе ротавируса представлял собой штамм G9 P[6], который циркулирует преимущественно в Южной Африке и других регионах к югу от Сахары. Вакцина RLP, нацеленно воздействующая на этот штамм, поможет в облегчении бремени заболеваний в странах Африки южнее Сахары.
В настоящем анализе использовали систему опосредованной Agrobacterium временной экспрессии. Временная экспрессия, в отличие от трансгенной экспрессии, позволяет быстро экспрессировать белки в относительно короткий промежуток времени без интеграции ротавирусных генов белков капсида в хромосоме хозяина. Большинство белков экспрессировались и накапливались в заметных количествах к 3-му дню инфильтрации рекомбинантного Agrobacterium в листья N. Benthamiana. Как показано ниже, наблюдалась удачная экспрессия нескольких ротавирусных структурных белков, включающая в себя VP2, VP4 и VP6 в клеточных компартментах листьев растений, как указано в табл. 2.
Таблица 2. Экспрессия ротавирусных белков VP в различных клеточных компартментах листьев
Клеточный компартмент листа
Белок капсида
Апопласт
Хлоропласт
Цитоплазма
VP2
VP4
VP6
VP7
0 = нет экспрессии;
1 = экспрессировался.
Экспрессия гликопротеина VP7 не наблюдалась, возможно, из-за его токсического эффекта на клетки растений. Стоит отметить, что для этого предварительного исследования использовали VP7, содержащий его родной сигнальный пептид. Также пытались осуществить инфильтрацию на 3-й день во время испытаний коэкспрессии. Это была попытка посмотреть, экспрессировался ли белок и вскоре после собирался с VP2 и VP6 для образования RLP. Токсическая природа рекомбинантного VP7, как отмечено в настоящем исследовании, была описана ранее (Williams et al., 1995; McCorquodale, 1987; Arias et
al., 1986).
О прошлых исследованиях экспрессии VP7 в трансгенных растениях картофеля сообщалось (Li et al., 2006; Choi et al., 2005; Wu et al., 2003). Choi с соавт. (2005) использовали обезьяний ротавирусный VP7 и Li et. al. and Wu с соавт. (Li et al., 2006; Wu et al., 2003) использовали VP7 G1 группы А человека. В описанных в настоящем документе результатах использовался VP7 G9 ротавируса человека.
VP2 экспрессировали и нацеливали на все компартменты, кроме апопласта, так как авторы настоящего изобретения были не в состоянии клонировать соответствующую кДНК, и временные ограничения давали возможность авторам настоящего изобретения только нескольких попыток, прежде чем приступить к другим конструктам. Уровни экспрессии VP2, как было отмечено, быть довольно низкими во всех компартментах. В прошлом исследовании, цитируемом Saldana с соавт. 2006, был сделан вывод о том, что VP2, содержащий свою оптимизированную последовательность для экспрессии в растении, было невозможно экспрессировать, несмотря на обнаружения мРНК в растительных клетках. Им, однако, удалось экспрессировать его в клетках растения томата с использованием синтетической ДНК. Причина трудностей в экспрессии VP2, скорее всего, заключается в результате неправильной трансляции мРНК или в том, что мРНК содержит некоторые мотивы последовательности, которые дестабилизируют растительные клетки (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002). Доказательство низких уровней экспрессии VP2, по сравнению с VP6, было замечено в исследованиях экспрессии как на клетках растений, так и на клетках насекомых такими авторами, как Мепа с соавт. (2006), Saldana с соавт. (2006), Vieira с соавт. (2005) и Labbe с соавт. (1991).
Белок внешнего капсида, VP4, который образует шипы на поверхности структуры вириона, экс-прессировали и нацеливали на накопление в цитоплазме, ER и апопласте. Никакого накопления белка не было обнаружено в хлоропластах. Как наблюдалось для VP2, уровни экспрессии белка для VP4 были ниже, чем обнаруженные для VP6 на вестерн-блотах. Белок содержит сайт расщепления трипсином, который приводит к образованию двух белков, VP5 и VP8. Возможно, местный трипсин в листьях N. ben-thamiana расщепляет некоторые из белков, как только они производятся, приводя к более низким уровням концентрации накопленного, неповрежденного VP4 в указанных компартментах. Было показано, что белок представляет собой важный нейтрализующий антиген, но было несколько попыток клонировать целый белок для разработки вакцины (Khodabandehloo et al., 2009; Mahajan et al., 1995; Nishikawa et al., 1989). Однако, были некоторые исследования в системе экспрессии клеток насекомых и дрожжей, показывающие экспрессию либо VP5, либо VP8 субъединиц VP4 (Andres et al., 2006; Favacho et al., 2006; Ko-vacs-Nolan et al., 2001). На сегодняшний день, настоящее исследование представляет собой первое исследование, показывающее экспрессию целого белка в растительной системе экспрессии.
VP6 экспрессировался во всех компартментах со сверхэкспрессией, наблюдаемой в цитоплазме с накоплением белка, наблюдаемым с 1-го дня до 7-го дня в этом компартменте. Это противоречит некоторой литературе, которая предполагает, что активность протеазы и сайленсинг генов уменьшают или препятствуют накоплению чужеродного белка в цитоплазме (Fischer et al., 2004). Кроме того, при правильных условиях pH, VP6, как известно, самостоятельно собирается в трубчатые или спиральные частицы, очень похожие на частицы, наблюдаемые в исследовании авторов настоящего изобретения (фиг. 9В) (Estes et al., 1987). VP6 составляет приблизительно 50% вирусной сердцевины и, следовательно, представляет собой основной антиген в разработке ротавирусной вакцины. Достигнутый выше результат позволил авторам настоящего изобретения дополнительно исследовать коэкспрессию VP2, VP6 и VP4 в цитоплазме.
При коэкспрессии в цитоплазме, VP2 и VP6 собирались с образованием RLP. Наблюдался очень высокий выход белка из системы временной экспрессии, составляющий от 1,27 до 1,54 г/кг FW. При очистке на колонке сахарозы количество сохраненных VP составляло 1,1 г/кг FW. Этот выход сравним с полученным для производства антитела, IgG, с использованием системы временной экспрессии в N. ben-thamiana, с выходом до 1,5 г/кг FW (Vezina et al., 2009). Saldana с соавт. (2006) до сих пор представляли собой единственную группу, известную тем, что они успешно выполнили коэкспрессию ротавирусных VP2 и VP6 в трансгенных растениях томата и до уровней, составляющих приблизительно 1% общего растворимого белка. Сборка VP2/6 в системе экспрессии клеток насекомых хорошо описана (Vieira et al., 2005; O'Brien et al., 2000). Также было показано, что эти VP2/6 RLP обеспечивают защитный иммунитет против ротавирусной инфекции (Zhou et al., 2011, Saldana et al., 2006). Таким образом, RLP VP2/6, произведенные авторами настоящего изобретения в растительной системе экспрессии, представляют собой подходящих кандидатов для разработки вакцины ротавирусных субъединиц.
Также коэкспрессировали и обнаруживали VP2/6/4. Первый пик, обнаруживаемый (фиг. 14, фракция 16) в прочтении абсорбции общего белка коэкспрессированных белков, может представлять собой собранный VP2/6/4, но при рассмотрении этой фракции под TEM, никаких RLP выявлено не было. Наблюдаемый пик белка может представлять собой результат накопления мономеров VP4 или его соответствующих субъединиц VP5 и VP8. Второй пик (фракция 18), при исследовании под TEM, показал структуры RLP, очень похожие на увиденные в образце VP2/6. Тем не менее, Crawford с соавт. ранее сообщали, что VP4 не может быть виден под TEM и что частицы VP2/6/4 и VP2/6/4/7 характеризуются одинаковой структурой и диаметром под TEM (Crawford, 1994). Авторы настоящего изобретения сделали такое же наблюдение для RLP VP2/6/7, RLP VP2/6/4/7 и RLP VP2/6, которые все выглядят похожими под регулярным TEM.
Пример 2. Конструкты.
A-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP2 (opt)/NOS (конструкт номер 1710). Оптимизированную последовательность, кодирующую VP2 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP2 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP2(opt).s1+3c (фиг. 17А, SEQ ID NO: 21) и IF-WA_VP2(opt).s1-4r (фиг. 17В, SEQ ID NO: 22) с использованием оптимизированной последовательности гена VP2 (фиг. 19, SEQ ID NO: 45) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP2 (GenBank, номер доступа САА33074) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17С) расщепляли рест-риктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion.
Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов, в основанной на CPMV-НТ экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательности с левой к правой границе т-ДНК представлены на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1710 (фиг. 23, SEQ ID NO: 27). Аминокислотная последовательность VP2 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 20 (SEQ ID NO: 25). Представление плазмиды 1710 представлено на фиг. 21.
B-2X35 S/CPMV-HT/RVA (WA) VP2(opt)/NOS в BeYDV(m)+система амплификации репликаз (кон-трукт номер 1711).
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP2 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую BeYDV(m)+систему амплификации ре-пликазы в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP2 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP2(opt).s1+3с (фиг. 17А, SEQ ID NO: 21) и IF-WA_VP2(opt).s1-4r (фиг. 17В, SEQ ID NO: 22) с использованием оптимизированной последовательности гена VP2 (фиг. 19, SEQ ID NO: 45) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP2 (GenBank, номер доступа САА33074) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 193 (фиг. 22A) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессион-ной кассете в системе амплификации BeYDV(m). Он также включает генный конструкт для коэкспрес-сии супрессора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 22В (SEQ ID NO: 26). Полученному конструкту был дан номер 1711 (фиг. 23, SEQ ID NO: 27).
Аминокислотная последовательность VP2 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 20 (SEQ ID NO: 25). Представление плазмиды 1711 представлено на фиг. 24.
C-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (конструкт номер 1713).
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP6 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS, содержащую экспрессионную кассету Plas-to_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP6 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP6(opt).s1+3с (фиг. 25а, SEQ ID NO: 28) и IF-WA_VP6(opt).s1-4r (фиг. 25b, SEQ ID NO: 29) с использованием оптимизированной последовательности гена VP6 (фиг. 46) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP6 (GenBank, номер доступа ААА47311) об- 29
ратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17с) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессион-ной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1713 (фиг. 25с, SEQ ID NO: 30). Аминокислотная последовательность VP6 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 26 (SEQ ID NO: 31). Представление плазмиды 1713 представлено на фиг. 27.
D-2X3 5 S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS в BeYDV(m)+система амплификации репликазы (конструкт номер 1714).
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP6 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую BeYDV(m)+систему амплификации ре-пликазы в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP6 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP6(opt).s1+3c (фиг. 25a, SEQ ID NO: 28) и IF-WA_VP6(opt).s1-4r (фиг. 25b, SEQ ID NO: 29) с использованием оптимизированной последовательности гена VP6 (SEQ ID NO: 46) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP6 (GenBank, номер доступа CAA47311) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 193 (фиг. 22A) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете в системе амплификации BeYDV(m). Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрес-сора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 22В (SEQ ID NO: 26). Полученному конструкту был дан номер 1714 (фиг. 28, SEQ ID NO: 32). Аминокислотная последовательность VP6 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 26 (SEQ ID NO: 31). Представление плазмиды 1714 представлено на фиг. 29. C-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (конструкт номер 1730). Оптимизированную последовательность, кодирующую VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую BeYDV(m)+систему амплификации репликазы, в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP4 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (фиг. 30А, SEQ ID NO: 33) и IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (фиг. 30В, SEQ ID NO: 34) с использованием оптимизированной последовательности гена VP4 (SEQ ID NO: 47) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP4 (GenBank, номер доступа АЕХ30660) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фиг. 18, SEQ ID NO: 23) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на (фиг. 18, SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1730 (фиг. 31С, SEQ ID NO: 50). Аминокислотная последовательность VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/ G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 32 (SEQ ID NO: 36). Представление плазмиды 1730 представлено на фиг. 33А.
E-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS в BeYDV(m)+система амплификации репликаз (кон-трукт номер 1731).
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/ 1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP4 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (фиг. 30А, SEQ ID NO: 33) и IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (фиг. 30В,
SEQ ID NO: 34) с использованием оптимизированной последовательности гена VP4 (фиг. 31В, SEQ ID NO: 47) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP4 (GenBank, номер доступа АЕХ30660) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрес-сионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 193 (фиг. 22А) расщепляли ре-стриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "InFusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете в системе амплификации BeYDV(m). Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 22В (SEQ ID NO: 26). Полученному конструкту был дан номер 1731 (фиг. 31, SEQ ID NO: 35). Аминокислотная последовательность VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 32 (SEQ ID NO: 36). Представление плазмиды 1731 представлено на
фиг. 33В.
F-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (конструкт номер 1733). Оптимизированную последовательность, кодирующую VP7 с нативным сигнальным пептидом из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP7 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP7(opt).s1+3c (фиг. 34А, SEQ ID NO: 37) и IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (фиг. 34В, SEQ ID NO: 38) с использованием оптимизированной последовательности гена VP7 (SEQ ID NO: 54) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP7 (GenBank, номер доступа АЕХ30682) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования InFusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17А) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-НТ экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность слева направо границ Т-ДНК представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1733 (фиг. 34С, SEQ ID NO: 24). Аминокислотная последовательность VP7 с нативным сигнальным пептидом из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 35 (SEQ ID NO: 39). Представление плазмиды 1733 представлено на фиг. 36. D-2X35S/CPMV-HT/TRSP-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (конструкт номер 1734). Оптимизированную последовательность, кодирующую VP7 с усеченной версией нативного сигнального пептида из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP7 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (фиг. 44А, SEQ ID NO: 55) и IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (фиг. 44В, SEQ ID NO: 56) с использованием оптимизированной последовательности гена VP7 (относящегося к нуклеотидам 88-891 из фиг. 44С, SEQ ID NO: 57) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP7 (GenBank, номер доступа АЕХ30682) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17С) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плаз-миду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-НТ экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе Т-ДНК представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1734 (фиг. 44D, SEQ ID NO: 58). Аминокислотная последовательность VP7 с усеченным нативным сигнальным пептидом из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 44Е (SEQ ID NO: 59). Представление плазмиды 1734 представлено на фиг. 44F.
G-2X3 5 S/CPMV-HT/PDISP/RVA(WA) VP7(opt)/NOS в BeYDV(m)+система амплификации репликаз (контрукт номер 1735).
Последовательность, кодирующую VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакци
ны ротавируса А клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP7 последовательность без его сигнального пептида дикого типа, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c (фиг. 37 А, SEQ ID NO: 40) и IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (фиг. 34В, SEQ ID NO: 38) с использованием оптимизированной последовательности гена VP7 (фиг. 54). Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP7 (GenBank, номер доступа АЕХ30682) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в рамку с сигнальным пептидом PDI люцерны в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1192 (фиг. 38) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1192 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в рамке с сигнальным пептидом PDI люцерны в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессо-ра TBSV P19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой до правой границы т-ДНК представлена на фиг. 39 (SEQ ID NO: 41). Полученному конструкту был дан номер 1735 (фиг. 40, SEQ ID NO: 42). Аминокислотная последовательность PDISP/VP7 с из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/ G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 41 (SEQ ID NO: 43). Представление плазмиды 1735 представлено на фиг. 42.
*Оптимизированные последовательности модифицировали в отношении преимущественного использования предпочтительных кодонов человека и увеличения содержания GC.
Таблица 4. Описание собранного и исследованного конструкта для производства RLP
SEQ ID
Система
Система
Сигна-
Антиген (ш гамм) '
гена,
Номер
амплифика-
льный
использ.
конст-
эксрсссии
ции
пептид1
для
рукта
ПЦР
CPMV нт
RVA(WA) VP2
SEQ ID
1710
[оптимизированный]
NO: 45
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
RVA(WA) VP2
SEQ ID
1711
[оптимизированный]
NO: 45
CPMV нт
RVA(WA) VP6
SEQ ID
1713
[оптимизированный]
NO: 46
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
RVA(WA) VP6
SEQ ID
1714
[оптимизированный]
NO: 46
CPMV нт
RVA(Pvtx) VP4
SEQ ID
1730
[оптимизированный]
NO: 47
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
RVA(Rtx) VP4
SEQ ID
1731
[оптимизированный]
NO: 47
CPMV нт
WtSp
RVA(Rtx) VP7
SEQ ID
1733
[оптимизированный]
NO: 54
CPMV нт
TrSp
RVA(Rtx) VP7
SEQ ID
1734
[оптимизированный]
NO: 54
CPMV нт
SpPDI
RVA(Rtx) VP7
SEQ ID
1735
[оптимизированный]
NO: 54
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
WtSp
RVA(Rtx) VP7
SEQ ID
1736
[оптимизированный]
NO: 54
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
TrSp
RVA(Rtx) VP7
SEQ ID
1737
[оптимизированный]
NO: 54
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
SpPDI
RVA(Rtx) VP7
SEQ ID
1738
[оптимизированный]
NO: 54
CPMV нт
RVA(SAll) VP4
SEQ ID
1760
NO: 50
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
RVA(SAll) VP4
SEQ ID
1761
NO: 50
CPMV нт
RVA(SAll) VP4
SEQ ID
1770
[оптимизированный]
NO: 51
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
RVA(SAll) VP4
SEQ ID
1771
[оптимизированный]
NO: 51
CPMV нт
WtSp
RVA(SAll) VP7
SEQ ID
1763
NO: 53
CPMV нт
TrSp
RVA(SAll) VP7
SEQ ID
1764
NO: 53
CPMV нт
SpPDI
RVA(SAll) VP7
SEQ ID
1765
NO: 53
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
WtSp
RVA(SAll) VP7
SEQ ID
1766
NO: 53
CPMV нт
BeYDV(m)+rep
TrSp
RVA(SAll) VP7
SEQ ID
1767
NO: 53
twtSp: сигнальный пептид дикого типа, SpPDI: сигнальный пептид растительного происхождения, клонированная форма гена протеиндисульфидизомеразы люцерны, TrSp: усеченный сигнальный пептид дикого типа, TrSp начинается со 2-го метионина в WtSp (M30).
*[оптимизированный] означает, что последовательность была оптимизирована в отношении использования кодонов, содержания GC и структуры РНК.
Пример 3. Сборка генных конструктов и трансформация Agrobacterium.
Все плазмиды, включающие в себя плазмиды 1710, 1713, 1730 и 1734, использовали для трансформации Agrobacterium tumefaciens (AGL1; АТСС, Manassas, VA 20108, USA), путем электропорации (Mat-tanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747), альтернативно, может быть использован тепловой шок с использованием подготовленных с CaCl2 компетентных клеток (XU et al., 2008, Plant Methods 4). Целостность плазмид в созданных штаммах A. tumefaciens подтверждали с помощью рестрикционного картирования. Трансформированный с данной бинарной плазмидой штамм A. tumefaciens называют AGL1/мномер плазмиды". Например, штамм А. tumefaciens, трансформированный с конструктом номер 1710, называется "AGL1/1710".
Подготовка биомассы растений, посевного материала, агроинфильтрация и сбор Растения Nicotiana benthamiana выращивали из семян на платформах, наполненных коммерческой торфяной подложкой. Растения оставляли расти в теплице при 16/8 фотопериоде и температурном режиме 25°C день^^ ночь. Через три недели после посева, отдельные проростки пикировали, пересаживали в горшки и оставляли расти в теплице в течение трех дополнительных недель при тех же условиях окружающей среды.
Трансфицированые каждым конструктом Agrobacteria выращивали в среде LB с растительным происхождением и с добавлением 10 мМ 2-^-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) и 50 мкг/мл ка-намицина pH5.6, пока они не достигали OD600 между 0,6 и 2,5. Суспензию Agrobacterium смешивали до достижения соответствующего соотношения для каждого конструкта и приводили к 2.5Х OD600 с ин-фильтрационной средой (10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES pH 5,6). Суспензию A. tumefaciens хранили в течение ночи при 4°C. В день инфильтрации серии культур разводили средой инфильтрации в 2,5 объемах суспензии и давали нагреться до использования. Целые растения N. benthamiana помещали вверх дном в бактериальную суспензию в герметичный резервуар из нержавеющей стали под вакуумом 20-40 Торр в течение 2 мин. После инфильтрации, растения возвращали в теплицу на 3-12-дневный инкубационный период до сбора. Собранную биомассу замораживали (-80°C) до использования для очистки частиц.
Экстракция и очистка ротавирус-подобных частиц.
Белки экстрагировали из замороженной биомассы путем механической экстракции в блендере с 3 объемами буфера для экстракции (TNC: 10 мМ Трис, pH 7,4, 140 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2). Суспензию фильтровали через большое отверстие с нейлоновым фильтром для удаления крупных примесей и центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин при 4°C. Супернатант собирали и центрифугировали снова при 5000 g в течение 30 мин (4°C) для удаления дополнительных примесей. Супернатант подвергали глубокой фильтрации и ультра-фильтрации, и фильтрат центрифугировали при 75000 g в течение 20 мин (4°C) для концентрирования ротавирус-подобных частиц. Содержащий частицы осадок ресуспендирова-ли в 1/12 объема TNC и нерастворимый удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Су-пернатант фильтровали на Miracloth перед загрузкой на градиенты плотности иодиксанола.
Центрифугирование в градиенте плотности проводили следующим образом. Подготавливали пробирки, содержащие пошаговые градиенты от 5 до 45% иодиксанола, и покрывали отфильтрованными экстрактами, содержащими ротавирус-подобные частицы. Градиенты центрифугировали при 120000 g в течение 4 ч (4°C). После центрифугирования 1 мл фракции собирали со дна до верха и анализировали с помощью окраски кумасси ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Чтобы удалить иодиксанол для фракций, выбранных для дальнейшего анализа, выбранные фракции центрифугировали при 75000 g в течение 20 мин (4°C) и осажденные частицы ресуспендировали в свежем буфере TNC.
ДСН-ПААГ и иммуноблоттинг.
Концентрации белка определяли с помощью белкового анализа ВСА (Pierce Biochemicals, Rockport IL). Белки разделяли с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях и окрашивали кумасси синим. Окрашенные гели сканировали, и анализ денситометрии осуществляли с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH).
Для иммуноблоттинга подвергнутые электрофорезу белки переносили на мембраны из поливини
лиденфторида (ПВДФ) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). До иммуноблоттинга мембраны блокировали 5% снятым латексом и 0,1% Твин-20 в Трис-солевом буфере (TBS-T) на протяжении 16-18 ч при 4°C.
Иммуноблоттинг проводили путем инкубирования с соответствующим антителом (табл. 5) в 2 мкг/мл в 2% снятом латексе в TBS-Tween 20 0,1%. Вторичные антитела, используемые для обнаружения хемилюминесценции представляли собой указанные в табл. 5, разбавляли, как указано в 2% снятом латексе в 0,1% TBS-Tween 20. Иммунореактивные комплексы обнаруживали с помощью хемилюминесценции с использованием люминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгации фермента пероксидазы хрена антител IgG человека проводили с использованием набора конъюгации активированной пероксидазы EZ-Link Plus(r) (Pierce, Rockford, IL).
Таблица 5. Условия электрофореза, антитела и разведения для иммуноблоттинга
Фермент-связанный иммуносорбентный анализ к VP4 (ELISA). 96-луночные планшеты для микротитрования с U-дном покрывали мышиными моноклональными антителами к VP4 (любезно предоставленные профессором Koki Taniguchi), разведенными 1:100000 в 10 мМ PBS pH 7,4 (фосфатно-солевой буфер), 150 мМ NaCl в течение 16-18 ч при 4°C. После инкубации планшеты промывали три раза 10 мМ PBS pH 7,4, 1 М NaCl, содержащим 0,1% Твин-20 и блокировали 5% БСА в 10 мМ PBS pH 7,4, 150 мМ NaCl, содержащим 0,1% Твин-20 в течение 1 ч при 37°C. После стадии блокирования планшеты трижды промывали 10 мМ PBS pH 7,4, 1 М NaCl, содержащим 0,1% Твин-20. Образцы добавляли, и планшеты инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°C. Планшет затем промывали 3 раза 10 мМ PBS pH 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, содержащим 0,1% Tween-20. Для всех остальных стадий промывки, промывочный буфер остается тем же и в ходе третьей промывки планшеты инкубировали 10 мин при комнатной температуре перед полным удалением моющего раствора. Добавляли поликлональное антитело кролика против ротавируса (любезно предоставленное профессором Koki Taniguchi), разведенный 1:10000 с 3% БСА в 10 мМ PBS pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, содержащим 0,1% Твин-20, и планшеты инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°C. Затем планшеты промывали 3 раза и добавляли конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против кроличьего антитела (111-035-144, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), разведенное 1:5000 с 3% БСА в 10 мМ PBS pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2 , 0,5 мМ MgCl2, содержащим 0,1% Твин-20, и планшеты инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°C. Планшеты промывали 3 раза. После заключительных промывок планшеты инкубировали с субстратом пероксидазы ТМВ SureBlue (KPL, Gaithersburg, MD) в течение 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением IN HCl и значения А450 измеряли с использованием планшет-ридера Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Получение ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2 и VP6.
Ротавирус-подобные частицы, содержащие VP2 и VP6, получали с помощью временной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Растения подвергали агро-инфильтрации с инокулятом Agrobacteria, содержащим смесь AGL1/1710 и 1713/AGL1 в пропорции 1:1 и инкубировали в течение 7 дней до сбора. Ротави-рус-подобные частицы очищали от биомассы, используя методологию, описанную в разделе Материалы и способы. После центрифугирования осветленных экстрактов на градиенте плотности иодиксанола пер
вые десять фракции из нижней части пробирки анализированы с помощью окрашенного кумасси ДСН-ПААГ. Как показано на фиг. 45А, ротавирусные антигены (VP2 и VP6) в основном обнаруживали во фракциях 2 и 3 градиента плотности, где концентрация иодиксанола составляет приблизительно 35%, концентрация, в которой ожидалось обнаружение ротавирус-подобных частиц. В этих фракциях было обнаружено очень незначительное загрязнение растительными белками. Вестерн-блоттинг фракций с гипериммунной кроличьей сывороткой к ротавирусу и поликлональными кроличьими антителами к VP2 подтвердил идентичность VP2 и VP6 в градиенте плотности фракций (фиг. 45В и 45С). Фракции 2 и 3 объединяли и удаляли иодиксанол высокоскоростным центрифугированием и ресуспендированием, и очищенные частицы направляли на крио-электронный микроскопический анализ (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) для подтверждения сборки VP2 и VP6 в частицы, напоминающие ротавирусную частицу. Как показано на фиг. 49 (левая панель) изображения cryoEM частиц VP2/VP6 подтверждало правильную сборку антигенов в ротавирус-подобные частицы.
Получение ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP6 и VP7.
Ротавирус-подобные частицы, содержащие VP2, VP6 и VP7, получали с помощью временной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Растения подвергали агро-инфильтрации с инокулятом Agrobacteria, содержащим смесь AGL1/1710, AGL1/1713, AGL1/1734 в пропорции 1:1:1 и инкубировали в течение 7 дней до сбора. Ротавирус-подобные частицы очищали от биомассы, используя методологию, описанную в разделе Материалы и способы. После центрифугирования осветленных экстрактов на градиенте плотности иодиксанола первые десять фракции из нижней части пробирки анализированы с помощью окрашенного кумасси ДСН-ПААГ. Как показано на фиг. 46А, ротавирусные антигены (VP2, VP6 и VP7) в основном обнаруживали во фракциях 2 и 3 градиента плотности, где концентрация иодиксанола составляет приблизительно 35%, концентрация, в которой ожидалось обнаружение ротавирус-подобных частиц. В этих фракциях было обнаружено очень незначительное загрязнение растительными белками. Вес-терн-блоттинг фракций с гипериммунной кроличьей сывороткой к ротавирусу и поликлональными кроличьими антителами к VP7 подтвердил идентичность VP6 и VP7 в градиенте плотности фракций (фиг.
46В и 46С).
Получение ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP4, VP6 и VP7.
Ротавирус-подобные частицы, содержащие VP2, VP4, VP6 и VP7, получали с помощью временной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Растения подвергали агро-инфильтрации с инокулятом Agrobacteria, содержащим смесь AGL1/1710, AGL1/1730, AGL1/1713, AGL1/1734 в пропорции 1:1:1:1 и инкубировали в течение 7 дней до сбора. Ротавирус-подобные частицы очищали от биомассы, используя методологию, описанную в разделе Материалы и способы. После центрифугирования осветленных экстрактов на градиенте плотности иодиксанола первые десять фракции из нижней части пробирки анализированы с помощью окрашенного кумасси ДСН-ПААГ. Как показано на фигуре 47А, 3 из 4 ротавирусных антигенов (VP2, VP6 и VP7) были видны и, главным образом, были обнаружены во фракци 3 градиента плотности, где концентрация иодиксанола составляет приблизительно 35%, концентрация, в которой ожидалось обнаружение ротавирус-подобных частиц. В этих фракциях было обнаружено очень незначительное загрязнение растительными белками. Ожидалось, отсутствие детектируемого уровня VP4 в окрашенном кумасси геле, так как VP4 не могут наблюдаться, когда тот же анализ выполняется на очищенном человеческом ротавирусном вирионе. Вестерн-блоттинг фракций с гипериммунной кроличьей сывороткой к ротавирусу и поликлональными кроличьими антителами к VP7 подтвердил идентичность VP6 и VP7 в градиенте плотности фракций (фиг. 47В и 47С). Иодиксанол удаляли из фракции 3 с помощью высокоскоростного центрифугирования и ресуспендирования и очищенные частицы анализировали с помощью ELISA для подтверждения наличия VP4. Представленные на фиг. 48 результаты наглядно показывают, что анализ ELISA специфически распознает VP4 как частицы отрицательного контроля, содержащие VP2/VP6 и VP7 только на уровне фонового сигнала. В противоположность этому, анализ 3-х различных лотов очищенных частиц, содержащих антигены VP2, VP4, VP6 и VP7, показал сильные и единые сигналы при анализе в тех же условиях. Очищенные RLP VP2/VP4/VP6/VP7 направляли на крио-электронный микроскопический анализ (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) для подтверждения сборки четырех антигенов в частицы, напоминающие ротавирусную частицу. Как показано на фиг. 49 (справа) изображения cryoEM частиц VP2/VP4/VP6/VP7 подтверждало правильную сборку антигенов в ротавирус-подобные частицы.
В табл. 6 перечислены последовательности, представленные в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.
Экспрессионная кассета номер 1733 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
Фигура 34С
Аминокислотная последовательность VP2 из штамма WA ротавируса А
Фигура 20
Конструкт 193 от левой до правой границы тДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS в ВеУВУ(т)+систему амплификации репликазы с экспрессионной кассетой
- run
mil mjMiujja ^амлсл^мл! а 1иш^1ицийшш-г 17-1иш^1ицийШ1н
Фигура 22В
Экспрессионная кассета номер 1710 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 23
Праймер IF-WA_VP6(opt).sl+3c
Фигура 25а
Праймер IF-WA_VP6(opt).sl-4r
Фигура 25Ь
Экспрессионная кассета номер 1713 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 25с
Аминокислотная последовательность VP6 из штамма WA ротавируса А
Фигура 26
Экспрессионная кассета номер 1714 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 28
Праймер IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c
Фигура ЗОА
Праймер IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r
Фигура ЗОВ
Экспрессионная кассета номер 1731 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 31А
Аминокислотная последовательность VP4 из штамма Rotarix ротавирус А
Фигура 32
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c
Фигура 34А
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
Фигура 34В
Аминокислотная последовательность VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса
Фигура 35
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c
Фигура 37А
Конструкт 1192 от левой до правой границы тДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р 19-пластоцианин
Фигура 39
Экспрессионная кассета номер 1735 от промотора 2X35S к терминатору NOS. PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
Фигура 40А
Аминокислотная последовательность PDISP/VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса
Экспрессионная кассета номер 1730 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP4(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
Фигура 31С
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2(opt) из штамма WA ротавируса А
Фигура 19
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6(opt) из штамма WA ротавируса А
Фигура 25 d
Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
Фигура 31В
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Фигура 34D
Нуклеотидная последовательность, кодирующая PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotanx-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Фигура 40В
Кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43А
Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43В
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43С
Кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43D
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
Фигура 34Е
Праймер IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).sl+3c
Фигура 44А
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
Фигура 44В
Нуклеотидная последовательность оптимизированной кодирующей последовательности VP7 ротавируса А из штамма RV A/Vaccine/US A/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
Фигура 44С
Экспрессионная кассета номер 1734 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
Фигура 44D
Аминокислотная последовательность TrSp-VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса
Фигура 44Е
Ссылки
Yang Y M, Li X, Yang H, et al. Immunogenicity and virus-like particle formation of
rotavirus capsid produced in transgenic plants. Sci China Life Sci, 2011, 54: 82-89
Angel, J., Franco, M.A. and Greenberg, H.B. (2007). Rotavirus vaccines: recent
developments and future considerations. Nature reviews: Microbiology 5, 529-539
Araujo, I.T., Ferreira, M.S.R. and Failho, A.M. (2001). Rotavirus genotypes [4]G9, P[6]G9, and P[8]G9 in hospitalized children with acute gastroenteritis in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol 39 1999-2001.
Arias, C.F., Ballado, T. and Plebafiski, M. (1986). Synthesis of the outer-capsid glycoprotein of the simian rotavirus SA11 in Escherichia coli. Gene 47, 211-219
Au K.S., Mattion N.M., Estes M.K., (1993). A Subviral Particle Binding Domain on the Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NS28. Virology 194, 665-67
Balen B, Krsnik-Rasol M, (2007). N-glycosylation of recombinant therapeutic glycoproteins in plant systems. Food Technology and Biotechnology 45 1-10.
Bardor, M., Faveeuw, C, Fitchette, AC, Gilbert,D., Galas, L., Trottein, F., Faye, L. and Lerouge P. (2003). Immunoreactivity in mammals of two typical plant glycoepitopes, core alpha (l,3)-fucose and core xylose. Glycobiology 13 427-434
Berois, M., Sapin, C, Erk, I., Poncet, D. and Cohen, J. (2003). Rotavirus Nonstructural Protein NSP5 Interacts with Major Core Protein VP2. Journal of virology 77, 1757
Bertolotti-Ciarlet, A., Ciarlet, M., Crawford, S.E., Conner, ME. and Estes, M.K. (2003). Immunogenicity and protective efficacy of rotavirus 2/6-virus-like particles produced by a dual baculovirus expression vector and administered intramuscularly, intranasally, or orally to mice. Vaccine 21, 3885-3900
Chen, J.Z., Settembre, E.C., Aoki, A.T., Zhang, X., Bellamy, A.R., Dormitzer, P.R., Harrison, S.C. and Grigorieff, N. (2009). Molecular interactions in rotavirus assembly and uncoating seen by high-resolution cryo-EM. PNAS 106, 10644-10648
Crawford, S.E., Estes, M.K., Ciarlet, M., Barone, C, O'Neal, СМ., Cohen, J. and Conner, M.E. (1999). Heterotypic protection and induction of a broad heterotypic neutralization response by rotavirus-like particles. Journal of Virology 73, 4813- 4822
Crawford, S.E., Labbe, M., Cohen, J., Burroughs, M.H., Zhou, Y.J. and Estes, M.K. (1994). Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells. Journal of virology 68, 5945-5952
Denisova, E.R., Dowling, W., LaMonica, R., Shaw, R, Scarlata, S., Ruggeri, F. and Mackow, E.R. (1999). Rotavirus Capsid Protein VP5* Permeabilizes Membranes. Journal of Virology 73 3147-3153
Dennehy, P.H. (2007). Rotavirus vaccines - An update. Vaccine 25, 3137-3141
Estes M.K (1996). Rotavirus and their replication. Fields Virology 2, 1625-1655 Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F. and Burrone, O.R. (1999). Two nonstructural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. J Gen Virol 80 333-9.
Favacho, A.R., Kurtenbach, E., Sardi, S.I. and Gouvea, V.S. (2006). Cloning, expression, and purification of recombinant bovine rotavirus hemagglutinin, VP8*, in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 46, 196-203
Gentsch, J.R., Laird, A.R., Bielfelt, В., Griffin, D.D., Banyai, K, Ramachandran, M., Jain, V., Cunliffe, N.A., Nakagomi, O., Kirkwood, CD., Fischer, Т.К., Parashar, U.D., Bresee, J.S., Jiang, B. and Glass, R.I. (2005). Serotype Diversity and Reassortment between Human and Animal Rotavirus Strains: Implications for Rotavirus Vaccine Programs J Infect Dis. 192 , S146-59
Glass, R.I., Parashar, U.D., Bresee, J.S., Turcios, R., Fischer, Т.К., Widdowson, MA., Jiang, B. amd Gentsch, J.R. (2006). Rotavirus vaccines: current prospects and future challenges. Lancet 368, 323-32
Gonzalez, A.M., Nguyen, TV., Azevedo, M.S. P., Jeong, K, Agarib, F., Iosef C, Chang, K, Lovgren-Bengtsson, K, Morein, B. and Saif, L.J. (2004). Antibody responses to human rotavirus (HRV) in gnotobiotic pigs following a new prime/boost vaccine strategy using oral attenuated HRV priming and intranasal VP2/6 rotavirus-like particle (VLP) boosting with ISCOM. Clinical & Experimental Immunology 135 361-372
Gonzalez, R.A., Espinosa, R., Romero, P., Lopez, S. and Arias C.F. (2000). Relative localization of viroplasmic and endoplasmic reticulum-resident rotavirus proteins in infected cells. Archives of Virology 145, 1963-1973
Greenberg, H.B. and Estes, M.K. (2009). Rotaviruses: From Pathogenesis to Vaccination. Gastroenterology 136, 1939-1951
Hoshino, Y., Jones, R.W. and Kapikian, A.Z. (1998). Serotypic characterization of outer capsid spike protein VP4 of vervet monkey rotavirus SA11 strain. Archives of Virology 143, 1233-1244
Istrate, C, Hinkula, J., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J., Svensson, L. and Johansen, К (2008). Parenteral administration of RF 8-2/6/7 rotavirus-like particles in a one-dose regimen induce protective immunity in mice. Vaccine 26, 4594-4601
Khodabandehloo, M., Shamsi, S.M., Shahrabadi, Keyvani, H. and Bambai, B. (2009). Cloning and Expression of Simian Rotavirus Spike Protein (VP4) in Insect Cells by Baculovirus Expression System. Iranian Biomedical Journal 13 9-18
Kim, Y., Nielsen, P.R., Hodgins, D., Chang, КО. and Saif, L.J. (2002). Lactogenic antibody responses in cows vaccinated with recombinant bovine rotavirus-like particles (VLPs) of two serotypes or inactivated bovine rotavirus vaccines. Vaccine 20, 1248-1258
Kovacs-Nolan J., Erika Sasaki, Dongwan Yoo, Yoshinori Mine, Cloning and Expression of Human Rotavirus Spike Protein, VP8*, in Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications, 282, 1183-1188
Lawton, J.A., Estes, M.K. and Venkataram, P.B.V. (2000). Mechanism of genome transcription in segmented dsRNA viruses. Advances in Virus Research 55, 185-214
Lopez, Т., Camacho M., Zayas M., Najera R., Sanchez R., Arias C. F. and Lopez S. (2005). Silencing the Morphogenesis of Rotavirus. Journal of Virology 79, 184-92
Lundgren, O. and Svensson, L. (2001). Pathogenesis of Rotavirus diarrhoea. Microbes and Infection 3 1145-1156
Madore, H.P., Estes, M.K, Zarley, CD., Ни, В., Parsons, S., Digravio, D., Greiner, S., Smith, R, Jiang, В., Corsaro, В., Barniak, V., Crawford, S. and Conner, M E. (1999). Biochemical and immunologic comparison of virus-like particles for a rotavirus subunit vaccine. Vaccine 17, 2461-2471
Marusic, C, Rizza, P., Lattanzi, L., Mancini, C, Spada, M., Belardelli, F., Benvenuto, E. and Capone, I. (2001). Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology 75, 8434-8439.
Matsumura, Т., Itchoda, N. and Tsunemitsu, H. (2002). Production of immunogenic VP6 protein of bovine group A rotavirus in transgenic potato plants. Archives of Virology 147, 1263-1270
Mena, J.A., Ramirez, O.T. and Palomares, L.A. (2006). Intracellular distribution of rotavirus structural proteins and virus-like particles expressed in the insect cellbaculovirus system. Journal of Biotechnology 122, 443-452
Meyer, J.C., Bergmann, C.C. and Bellamy, A.R. (1989). Interaction of rotavirus cores with the nonstructural glycoprotein NS28. Virology 171, 98-107
Molinari, P., Peralta, A. and Taboga, O. (2008). Production of rotavirus-like particles in Spodoptera frugiperda larvae. Journal of Virological Methods 147, 364-367
Nilsson, M., von Bonsdorff C.H., Weclewicz, K, Cohen, J. and Svensson, L. (1998). Assembly of viroplasm and virus-like particles of rotavirus by a Semliki Forest virus replicon. Virology 242, 255-265
Nishikawa, К., Fukuhara, N., Liprandi, F., Green, K., Kapikian, A., Chanock, R. and Gorziglia, M. (1989). VP4 protein of porcine rotavirus strain OSU expressed by a baculovirus recombinant induces neutralizing antibodies. Virology 173, 631-637
O'Brien, G.J., Bryant, C.J., Voogd, C, Greenberg, H.B., Gardner, R.C. and Bellamy, A.R. (2000). Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rods and also assembles into virus-like particles. Virology 270, 444-453
Palombo, E.A. (1999). Genetic and antigenic diversity of human rotaviruses: potential impact on the success of candidate vaccines. FEMS Microbiology Letters 181, 1-8
Palomares, L.A. and Ramirez, O.T. (2009). Challenges for the production of viruslike particles in insect cells: The case of rotavirus-like particles. BiochemicalEngineering Journal 45(3), 158-167
Peralta, A., Molinari, P. and Taboga, O. (2009). Chimeric recombinant rotavirus-like particles as a vehicle for the display of heterologous epitopes. Virology Journal 6, 192
Ramachandran, M., Kirkwood, CD., Unicomb, L., Cunliffe, N.A., Ward, R.L., Bhan, M.K., Clark, H.F., Glass, R.I. and Gentsch, J.R. (2000). Molecular characterization of serotype G9 rotavirus strains from a global collection. Virology 278, 436-444
Ribes, J.M., Ortego, J., Ceriani, J., Montava, R., Enjuanes, L. and Buesa, J. (2011). Transmissible gastroenteritis virus (TGEV)-based vectors with engineered murine tropism express the rotavirus VP7 protein and immunize mice against rotavirus. Virology 410 107118
Rodriguez-Limas, W.A., Tyo, K.E.J., Nielsen, J., Ramirez, O.T. and Palomares, L.A. (2011). Molecular and process design for rotavirus-like particle production in Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact. 10, 33
Saldana, S., Esquivel Guadarrama, F., Olivera Flores Tde, J., Arias, N, Lopez, S., Arias, C, Ruiz-Medrano, R., Mason, H., Мог, Т., Richter, L., Amtzen, C.J. and Gomez Lim, M.A. (2006). Production of rotavirus-like particles in tomato (Lycopersicon esculentum L.) fruit by expression of capsid proteins VP2 and VP6 and immunological studies. Viral Immunology 19, 42-53
Sanchez-Padilla, E., Grais, R.F., Guerin, P.J., Steele, A.D., Burny, M.E. and Luquero, F.J. (2009). Burden of disease and circulating serotypes of rotavirus infection in sub-Saharan Africa: systematic review and meta-analysis. Lancet Infectious Diseases 9, 567-576.
Steele, A.D., Ivanoff, B. and African Rotavirus Network (2003). Rotavirus strains circulating in Africa during 1996-1999: emergence of G9 strains and P[6] strains. Vaccine 21, 361-367
Tian, P., Ball, J.M., Zeng, C.Q.Y. and Estes, M.K. (1996). The Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NSP4 Possesses Membrane Destabilization Activity. Journal of Vriology 70, 6973-6981
Thongprachum, A., Chaimongkol, N, Khamrin, P., Pantip, C, Mizuguchi, M., Ushijima, H. and Maneekarn, N. (2010). A novel multiplex RT-PCR for identification of VP6 subgroups of human and porcine rotaviruses, Journal of Virological Methods, 168, 191196
Trabelsi, A., Peenze, I., Pager, C, Jeddi, M. and Steele, D. (2000). Distribution of Rotavirus VP7 Serotypes and VP4 Genotypes Circulating in Sousse, Tunisia, from 1995 to 1999: Emergence of Natural Human Reassortants. Journal of Clinical Microbiology 38, 3415-3419
Varani, G. and Allain, F.H-T. (2002). How a rotavirus hijacks the human protein synthesis machinery. Nature Structural Biology 9, 158 - 160.
Vende, P., Taraporewala, Z.F. and Patton, J.T. (2002). RNA-Binding Activity of the Rotavirus Phosphoprotein NSP5 Includes Affinity for Double-Stranded RNA. Journal of Virology 76, 5291-5299.
Vesikari, Т., Karvonen, A., Korhonen, Т., Espo, M., Lebacq, E., Forster, J., Zepp, F., Delem, A. and De Vos, B. (2004). Safety and immunogenicity of RJX4414 live attenuated human rotavirus vaccine in adults, toddlers and previously uninfected infants. Vaccine 22, 2836-2842
Vezina, L.-P., Faye, L., Lerouge, P., D'Aoust, M.-A., Marquet-Blouin, E., Burel, C, Lavoie, P.-O., Bardor, M. and Gomord, V. (2009), Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal 7, 442-455.
Zhou, В., Zhang, Y., Wang, X., Dong, J., Wang, В., Han, C, Yu, J., Li, D. (2010). Oral administration of plant-based rotavirus VP6 induces antigen-specific IgAs, IgGs and passive protection in mice. Vaccine 28, 6021-6027
Zhou, H, Guo, L., Wang, M., Qu, J., Zhao, Z., Wang, J. and Hung, T. (2011). Prime
immunization with rotavirus VLP 2/6 followed by boosting with an adenovirus expressing
VP6 induces protective immunization against rotavirus in mice. Virology Journal 8, 3 Все цитаты включены в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение было описано применительно к одному или нескольким вариантам осуществления. Тем не менее, специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что довольно много вариаций и модификаций может быть сделано без отступления от сущности и объема изобретения, как определено в формуле изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Медикаго Инк.
Митсубиши Танабе Фарма Корпорейшн
<120> ПОЛУЧЕНИЕ РОТАВИРУС-ПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ В РАСТЕНИЯХ
<130> V84653WO
<150> US 61/646,058
<151> 2012-05-11
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 884
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
Gly Arg Val Arg Ser Met Ala Tyr Arg Lys Arg Gly Ala Arg Arg Glu
1 5 10 15
Ala Asn Leu Asn Asn Asn Asp Arg Met Gln Glu Lys Ile Asp Glu Lys
20 25 30
Gln Asp Ser Asn Lys Ile Gln Leu Ser Asp Lys Val Leu Ser Lys Lys
35 40 45
Glu Glu Ile Val Thr Asp Ser His Glu Glu Val Lys Val Thr Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Lys Ser Thr Lys Glu Glu Ser Lys Gln Leu Leu Glu Val Leu
65 70 75 80
Lys Thr Lys Glu Glu His Gln Lys Glu Ile Gln Tyr Glu Ile Leu Gln
85 90 95
Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Pro Lys Glu Thr Ile Leu Arg Lys Leu
100 105 110
Glu Asp Ile Gln Pro Glu Leu Ala Lys Lys Gln Thr Lys Leu Phe Arg
115 120 125
Ile Phe Glu Pro Lys Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala Asn Gly Glu Arg
130 135 140
Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Lys Asp Thr Leu Pro
145 150 155 160
Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn Leu Tyr Asp Gln
165 170 175
Val Leu Thr Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Met Ala Val
180 185 190
Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val Asp Ser Glu Thr
195 200 205
Ala Ser Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu Thr Glu Gly Ala
210 215 220
Val Arg Arg Phe Ile Ala Glu Met Arg Gln Arg Val Gln Ala Asp Arg
225 230 235 240
Asn Val Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile Asp Tyr Ala Phe
245 250 255
Asn Glu Tyr Phe Leu Gln His Gln Leu Val Glu Pro Leu Asn Asn Asp
260 265 270
Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn Asp Val Asn Tyr
275 280 285
Ile Leu Asn Met Asp Arg Asn Leu Pro Ser Thr Ala Arg Tyr Ile Arg
290 295 300
Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu His Asp Asn Phe Glu Ser
305 310 315 320
Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu Ala Arg Ser Val
325 330 335
Val Pro Asp Leu Lys Glu Leu Val Ser Thr Glu Ala Gln Ile Gln Lys
340 345 350
Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu Thr Ile Gln Ser Glu Thr
355 360 365
Gln Phe Leu Thr Gly Ile Asn Ser Gln Ala Ala Asn Asp Cys Phe Lys
370 375 380
Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg Thr Met Ser Leu Asp Phe
385 390 395 400
Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser Gly Met Trp Leu Leu Thr
405 410 415
Val Val Pro Asn Asp Met Phe Ile Arg Glu Ser Leu Val Ala Cys Gln
420 425 430
Leu Ala Ile Val Asn Thr Ile Ile Tyr Pro Ala Phe Gly Met Gln Arg
435 440 445
Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr Pro Phe Gln Ile Ala Glu
450 455 460
Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn Trp Leu His Phe Val Asn
465 470 475 480
Asn Asn Gln Phe Arg Gln Ala Val Ile Asp Gly Val Leu Asn Gln Val
485 490 495
Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly His Val Ile Asn Gln Leu Met Glu
500 505 510
Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe Pro Thr Met Pro Ile Asp
515 520 525
Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu Leu Leu Ser Asn Arg Leu
530 535 540
Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Asn Tyr Glu Thr
545 550 555 560
Leu Met Ala Cys Ile Thr Met Asn Met Gln His Val Gln Thr Leu Thr
565 570 575
Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Ser Leu Cys Met Leu Ile
580 585 590
Gly Asn Ala Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln Thr Leu Phe His Tyr Tyr
595 600 605
Asn Val Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr Asn Glu Arg Ile Asn Asp
610 615 620
Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg Leu Asn Leu Tyr Gln Lys
625 630 635 640
Lys Met Lys Ala Ile Val Glu Asp Phe Leu Lys Arg Leu Tyr Ile Phe
645 650 655
Asp Val Ser Arg Val Pro Asp Asp Gln Met Tyr Arg Leu Arg Asp Arg
660 665 670
Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Ile Arg Arg Leu Asp Ile Phe Asn Leu
675 680 685
Ile Leu Met Asn Met Asp Gln Ile Glu Arg Ala Ser Asp Lys Ile Ala
690 695 700
Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met His Leu Glu Arg Asp Glu
705 710 715 720
Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn Leu Glu Gly Phe Gln Gln
725 730 735
Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Ser Gly Asp Tyr Ala Gln Ile Thr
740 745 750
Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala Leu Val Gly Ala Leu Pro
755 760 765
Phe Ile Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu Ile Ala Lys Leu Asp Ala
770 775 780
Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg Lys Val Asp Thr Leu Lys
785 790 795 800
Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser Asn Asp Phe Tyr Leu Val
805 810 815
Ala Asn Tyr Asp Trp Val Pro Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Lys Gln
820 825 830
Val Pro Gln Gln Phe Asp Phe Arg Asn Ser Met His Met Leu Thr Ser
835 840 845
Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala
850 855 860
Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala Phe Asp Asn Met Arg Ile
865 870 875 880
Met Asn Glu Leu
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
Gly Arg Val Arg Ser Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asn Ser Tyr Thr Val Glu Leu Ser Asp Glu Ile Asn Thr Ile Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Ser Gln Asn Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr
35 40 45
Asn Tyr Ala Pro Val Thr Trp Ser His Gly Glu Val Asn Asp Ser Thr
50 55 60
Thr Ile Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Asn Phe Lys
65 70 75 80
Pro Pro Asn Asp Tyr Trp Ile Leu Leu Asn Pro Thr Asn Gln Gln Val
85 90 95
Val Leu Glu Gly Thr Asn Lys Thr Asp Ile Trp Val Ala Leu Leu Leu
100 105 110
Val Glu Pro Asn Val Thr Asn Gln Ser Arg Gln Tyr Thr Leu Phe Gly
115 120 125
Glu Thr Lys Gln Ile Thr Val Glu Leu Pro Thr Asp Phe Ser Val Ser
130 135 140
Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val Asp Tyr Trp
145 150 155 160
Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg Ser Leu Ala
165 170 175
Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Ser Gly Gly Asn Tyr Asn Phe Gln
180 185 190
Ile Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Ser Gly Gly Ala Val Ser Leu
195 200 205
His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp Phe Val Ser
210 215 220
Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Glu Glu Pro Pro
225 230 235 240
Phe Ser Ile Leu Arg Thr Arg Val Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Pro Ala
245 250 255
Phe Asn Pro Asn Asn Gly His Glu Tyr Tyr Glu Ile Ala Gly Arg Phe
260 265 270
Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Ser Asn Asp Asp Tyr Gln Thr Pro Ile
275 280 285
Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln Leu Gly Asp
290 295 300
Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala Met Thr Gln
305 310 315 320
Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser Met Phe Ser
325 330 335
Asn Tyr Gly Ile Thr Arg Ser Gln Ala Leu Asp Leu Ile Arg Ser Asp
340 345 350
Pro Arg Val Leu Arg Asp Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Lys
355 360 365
Asn Arg Ile Glu Gln Leu Ile Leu Gln Cys Arg Leu
370 375 380
<210> 3
<211> 402
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 3
Gly Arg Val Arg Ser Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu
1 5 10 15
Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val
20 25 30
Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly
35 40 45
Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp
50 55 60
Asn Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala
65 70 75 80
Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe
85 90 95
Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn
100 105 110
Gly Ile Ala Pro Gln Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys
115 120 125
Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp
130 135 140
Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro
145 150 155 160
Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro
165 170 175
Ala His Asp Asn Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu
180 185 190
Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala
195 200 205
Asn Thr Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr
210 215 220
Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro
225 230 235 240
Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro
245 250 255
Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly
260 265 270
Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg
275 280 285
Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn
290 295 300
Met Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu
305 310 315 320
His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Lys Ile Glu Ser Ala Val Cys
325 330 335
Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr
340 345 350
Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro
355 360 365
Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu
370 375 380
Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu
385 390 395 400
Val Lys
<210> 4
<211> 331
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 4
Gly Arg Val Arg Cys Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Phe Leu Ile Ser Ile Val Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Leu Thr
20 25 30
Ser Ala Met Asp Phe Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Leu Ile Val Ile
35 40 45
Ala Ser Pro Phe Val Lys Thr Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile
50 55 60
Thr Gly Ser Met Asp Thr Ala Tyr Ala Asn Ser Ser Gln Gln Glu Thr
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr
85 90 95
Gln Ile Gly Asp Thr Glu Trp Lys Asp Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu
100 105 110
Thr Lys Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Thr Asp
115 120 125
Ile Ala Ser Phe Ser Ile Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Val
130 135 140
Val Leu Met Lys Tyr Asp Ser Thr Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu
145 150 155 160
Ala Asp Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr
165 170 175
Leu Tyr Tyr Tyr Gln Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met
180 185 190
Gly Gln Ser Cys Thr Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu
195 200 205
Gly Ile Gly Cys Ile Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Glu Val Ala
210 215 220
Thr Ser Glu Lys Leu Val Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His
225 230 235 240
Lys Leu Asp Val Thr Thr Asn Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys
245 250 255
Leu Gly Pro Arg Glu Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Ser Asp
260 265 270
Val Leu Asp Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg
275 280 285
Met Met Arg Val Asn Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Val
290 295 300
Val Asp Tyr Ile Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Ser Leu Asn Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325 330
<210> 5 <211> 22 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer VP2F
<400> 5
ttccatggct taccgtaaaa gg
<210> 6 <211> 32 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer VP2R <400> 6
atgcggccgc aagctcgttc ataatcctca tg 32
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer VP4F
<400> 7
ttccatggct tccctcatct ac 22
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer VP4R
<400> 8
atgcggccgc aagacggcac tggagaatga g 31
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer VP6F
<400> 9
ttccatggat gtgctctact c 21
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer VP6R
<400> 10
atgcggccgc cttcacgagc atggaacg 28
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> Primer VP7F <400> 11
gtacatgtac ggaatcgagt ac
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer VP7R <400> 12
atgcggccgc cacacggtag tagaaagcag
<210> 13
<211> 2700
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 13
ggtaccgaat tcggacgcgt tcgttccatg gctaacctca acaacaacga taggatgcaa aagatccagc tctccgataa ggtgctctcc gaagaggtga aggtgacaga tgagcttaag cttgaggtgc tcaagacaaa agaggaacac aagactatcc caactttcga gccaaaagag ccagagcttg ctaagaagca gactaagctc atctaccgtg ctaacggtga aagggaactt gatactctcc cagacggtga ttacgatgtg gtgctcactg agatgccaga ttacctcctc tccagggatg ctggaaaggt ggtggattcc caggatgaag agactgaggg tgctgtgagg caggctgata ggaacgtggt gaactaccca aacgagtact tccttcagca ccagcttgtg tacatcccag agaggattag gaacgacgtt ccatccactg ctcgttacat caggccaaac aacttcgagt ccctctggga tacaatcact gtgccagatc tcaaagaact cgtgtccact ctccagcttg aggctctcac tatccagtcc caggctgcta acgattgctt caagactctc
gcttaccgta aaaggggtgc gagaagatcg atgagaagca aagaaagaag agatcgttac aagtccacaa aagaagagtc cagaaagaga tccagtacga actatcctca ggaagcttga ttcaggatct tcgagccaaa aggaacaggt ggtactggaa agagagtact tcctcaacct ctcaaggata tggctgtgga gagactgctt ccatctgtga cgtttcattg ctgagatgag tccatcctcc acccaatcga gagccactca acaacgatat aactacatcc tcaacatgga ctcctccagg ataggctcaa acttccaact acattctcgc gaggctcaga tccagaagat gagactcagt tcctcactgg attgctgcta tgctctccca 31
taggcgtgaa 60
ggattccaac 120
tgattcccac 180
caagcagctc 240
gatcctccaa 300
ggatatccag 360
gcagctccca 420
gctcaagaag 480
ctacgatcag 540
gaacaagaac 600
tgctatcttc 660
gcagagggtt 720
ttacgctttc 780
catcttcaac 840
taggaacctc 900
cctccacgat 960
tcgttccgtg 1020
gtcccaggat 1080
tatcaactcc 1140
gaggactatg 1200
tccctcgatt tcgtgactac taactatatg tccctcatct ccggaatgtg gctcttgact 1260
gtggtgccaa acgatatgtt catccgtgag tcccttgtgg cttgccagct cgctatcgtg 1320
aacactatca tctacccagc tttcggaatg caaaggatgc actaccgtaa cggtgatcca 1380
cagactccat tccagatcgc agagcagcag atccagaact tccaggtggc aaactggctc 1440
cacttcgtga acaacaacca gttcaggcag gctgtgatcg atggtgtgtt gaaccaggtg 1500
ctcaacgata acatccgtaa cggtcacgtg atcaaccagc tcatggaagc tctcatgcaa 1560
ctctccaggc agcagttccc aactatgcct atcgattaca agcgttccat ccagagggga 1620
atcctcctcc tttccaacag gcttggacag ctcgtggatc tcactaggct cctcgcttac 1680
aactacgaga ctctcatggc ttgcatcact atgaacatgc agcacgttca gactctcact 1740
actgagaagc tccagctcac ttccgtgact tccctctgca tgctcatcgg aaacgctact 1800
gtgatcccat ccccacagac actcttccac tactacaacg tgaacgtgaa cttccactcc 1860
aactacaacg agaggatcaa cgatgctgtg gctatcatca ctgctgctaa caggcttaac 1920
ctctaccaaa agaagatgaa ggctatcgtt gaggatttcc tcaagaggct ctacatcttc 1980
gatgtgtcca gggtgccaga tgatcagatg taccgtctta gggataggct taggctcctc 2040
ccagtggaga tcagaaggct cgatatcttc aacctcatcc ttatgaacat ggatcagatc 2100
gagagggctt ccgataagat cgctcagggt gttattatcg cttaccgtga tatgcacctt 2160
gagagggatg agatgtacgg atacgtgaac attgctagga accttgaggg attccagcag 2220
atcaaccttg aagagcttat gcgttccggt gattacgctc agatcactaa catgctcctc 2280
aacaaccagc cagtggctct tgttggtgct ctcccattca tcactgattc ctccgtgatc 2340
tccctcattg ctaagttgga tgctactgtg ttcgctcaga tcgtgaagct caggaaagtg 2400
gatactctca agccaatcct ctacaagatc aactccgatt ccaacgattt ctacctcgtg 2460
gctaactacg attgggtgcc aacttccact acaaaggtgt acaagcaggt gccacagcag 2520
ttcgatttcc gtaactccat gcacatgctc acttccaacc tcactttcac tgtgtactcc 2580
gatctcctcg ctttcgtgtc cgctgatact gtggagccta tcaacgctgt ggctttcgat 2640
aacatgagga ttatgaacga gctttgatga ctcgagggat cctctagaga attcgagctc 2700
<210> 14 <211> 2700 <212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 14
ccatggctta agcctgcgca agcaaggtac cgaatggcat tttccccacg atccgcactt 60
cgattggagt tgttgttgct atcctacgtt ctcttctagc tactcttcgt cctaaggttg 120
ttctaggtcg agaggctatt ccacgagagg ttctttcttc tctagcaatg actaagggtg 180
cttctccact tccactgtct actcgaattc ttcaggtgtt ttcttctcag gttcgtcgag 240
gaactccacg agttctgttt tctccttgtg gtctttctct aggtcatgct ctaggaggtt 300
ttctgatagg gttgaaagct cggttttctc tgataggagt ccttcgaact cctataggtc 360
ggtctcgaac gattcttcgt ctgattcgag aagtcctaga agctcggttt cgtcgagggt 420
tagatggcac gattgccact ttcccttgaa tccttgtcca ccatgacctt cgagttcttc 480
ctatgagagg gtctgccact aatgctacac tctctcatga aggagttgga gatgctagtc 540
cacgagtgac tctacggtct aatggaggag gagttcctat accgacacct cttgttcttg 600
aggtccctac gacctttcca ccacctaagg ctctgacgaa ggtagacact acgatagaag 660
gtcctacttc tctgactccc acgacactcc gcaaagtaac gactctactc cgtctcccaa 720
gtccgactat ccttgcacca cttgatgggt aggtaggagg tgggttagct aatgcgaaag 780
ttgctcatga aggaagtcgt ggtcgaacac ctcggtgagt tgttgctata gtagaagttg 840
atgtagggtc tctcctaatc cttgctgcaa ttgatgtagg agttgtacct atccttggag 900
ggtaggtgac gagcaatgta gtccggtttg gaggaggtcc tatccgagtt ggaggtgcta 960
ttgaagctca gggagaccct atgttagtga tgaaggttga tgtaagagcg agcaaggcac 1020
cacggtctag agtttcttga gcacaggtga ctccgagtct aggtcttcta cagggtccta 1080
gaggtcgaac tccgagagtg ataggtcagg ctctgagtca aggagtgacc atagttgagg 1140
gtccgacgat tgctaacgaa gttctgagag taacgacgat acgagagggt ctcctgatac 1200
agggagctaa agcactgatg attgatatac agggagtaga ggccttacac cgagaactga 1260
caccacggtt tgctatacaa gtaggcactc agggaacacc gaacggtcga gcgatagcac 1320
ttgtgatagt agatgggtcg aaagccttac gtttcctacg tgatggcatt gccactaggt 1380
gtctgaggta aggtctagcg tctcgtcgtc taggtcttga aggtccaccg tttgaccgag 1440
gtgaagcact tgttgttggt caagtccgtc cgacactagc taccacacaa cttggtccac 1500
gagttgctat tgtaggcatt gccagtgcac tagttggtcg agtaccttcg agagtacgtt 1560
gagaggtccg tcgtcaaggg ttgatacgga tagctaatgt tcgcaaggta ggtctcccct 1620
taggaggagg aaaggttgtc cgaacctgtc gagcacctag agtgatccga ggagcgaatg 1680
ttgatgctct gagagtaccg aacgtagtga tacttgtacg tcgtgcaagt ctgagagtga 1740
tgactcttcg aggtcgagtg aaggcactga agggagacgt acgagtagcc tttgcgatga 1800
cactagggta ggggtgtctg tgagaaggtg atgatgttgc acttgcactt gaaggtgagg 1860
ttgatgttgc tctcctagtt gctacgacac cgatagtagt gacgacgatt gtccgaattg 1920
gagatggttt tcttctactt ccgatagcaa ctcctaaagg agttctccga gatgtagaag 1980
ctacacaggt cccacggtct actagtctac atggcagaat ccctatccga atccgaggag 2040
ggtcacctct agtcttccga gctatagaag ttggagtagg aatacttgta cctagtctag 2100
ctctcccgaa ggctattcta gcgagtccca caataatagc gaatggcact atacgtggaa 2160
ctctccctac tctacatgcc tatgcacttg taacgatcct tggaactccc taaggtcgtc 2220
tagttggaac ttctcgaata cgcaaggcca ctaatgcgag tctagtgatt gtacgaggag 2280
ttgttggtcg gtcaccgaga acaaccacga gagggtaagt agtgactaag gaggcactag 2340
agggagtaac gattcaacct acgatgacac aagcgagtct agcacttcga gtcctttcac 2400
ctatgagagt tcggttagga gatgttctag ttgaggctaa ggttgctaaa gatggagcac 2460
cgattgatgc taacccacgg ttgaaggtga tgtttccaca tgttcgtcca cggtgtcgtc 2520
aagctaaagg cattgaggta cgtgtacgag tgaaggttgg agtgaaagtg acacatgagg 2580
ctagaggagc gaaagcacag gcgactatga cacctcggat agttgcgaca ccgaaagcta 2640
ttgtactcct aatacttgct cgaaactact gagctcccta ggagatctct taagctcgag 2700
<210> 15 <211> 2388 <212> DNA
<213> Rotavirus
<400> 15
ggtaccgaat tcggacgcgt tcgttccatg gcttccctca tctaccgtca gttgctcact 60
aactcctaca ctgtggagct ttccgatgag atcaacacta tcggttccga gaagtcccag 120
aacgtgacta tcaacccagg accattcgct cagactaact acgctccagt gacttggtca 180
cacggtgaag tgaacgattc cactactatc gagccagtgc tcgatggacc ataccagcca 240
actaacttca agccaccaaa cgattactgg attctcctca acccaactaa ccagcaggtg 300
gtgcttgagg gaactaacaa gactgatatc tgggtggcac tccttcttgt ggagccaaac 360
gtgactaacc agtccaggca gtacactctc ttcggagaga ctaagcagat cactgtggag 420
aacaacacta acaagtggaa gttcttcgag atgttcaggt ccaacgtgaa cgctgagttc 480
cagcacaaga ggactctcac ttccgataca aagctcgctg gttttatgaa gttctacaac 540
tctgtgtgga ctttccacgg tgaaactcca cacgctacta ctgattactc ctccacttcc 600
aacctttccg aggtggagac tgtgatccac gtggagttct acatcatccc aaggtcccaa 660
gagtctaagt gctccgagta catcaacact ggactcccac caatgcaaaa cactaggaac 720
atcgtgccag tggctttgtc ctctcgttcc gtgacttacc agagggctca ggtgaacgag 780
gatatcatca tctccaagac ttccctctgg aaagagatgc agtacaacag ggatattatc 840
atcaggttca agttcaacaa ctccatcgtg aagctcggag gactcggata caagtggagt 900
gagatctcct tcaaggctgc taactaccag tactcctacc tcagggatgg tgaacaggtg 960
acagctcaca ctacttgctc cgtgaacggt gttaacaact tctcctacaa cggtggttcc 1020
ctcccaactg atttctccgt gtcccgttac gaggtgatca aagagaactc ctacgtttac 1080
gtggattact gggatgattc ccaggctttc aggaacatgg tgtatgttag atccctcgct 1140
gctaacctca actccgtgaa gtgctccggt ggaaactaca acttccagat cccagtggga 1200
gcttggccag tgatgtctgg tggagctgtg tctctccact tcgctggtgt tacactctcc 1260
actcagttca ctgatttcgt gtccctcaac tccctcaggt tcaggttctc cctcactgtg 1320
gaagagccac cattctccat cctcaggact agggtgtccg gactttacgg actcccagct 1380
ttcaacccaa acaacggaca cgagtactac gagatcgctg gacgtttctc ccttatctcc 1440
ctcgtgccat ccaacgatga ttaccagact ccaattatga actccgtgac tgtgaggcag 1500
gatcttgaga ggcagctcgg agatctcagg gaagagttca actccctctc ccaagagatc 1560
gctatgactc agctcatcga tctcgctctc ctcccactcg atatgttctc catgttctct 1620
ggtatcaagt ccactatcga tgtggctaag tctatggtga ctaaggtgat gaagaagttc 1680
aagaagtccg gactcgctac ttccatctcc gagcttactg gatctctctc caacgctgct 1740
tcttctgtgt ctaggtcctc ctccatcagg tccaacatct cctccatctc agtgtggact 1800
gatgtgtccg agcagatcgc tggatcttcc gattccgtgc gtaacatctc cactcagact 1860
tccgctatct ccaagaggct taggctcaga gagatcacta ctcagactga gggaatgaac 1920
ttcgatgata tctccgctgc tgtgctcaag actaagatcg ataggtccac tcacatctcc 1980
ccagatactc tcccagatat catcactgag tcctccgaga agttcatccc aaagcgtgct 2040
taccgtgttc tcaaggatga tgaggtgatg gaagctgatg tggatggaaa gttcttcgct 2100
tacaaagtgg gaactttcga agaggtgcca ttcgatgtgg ataagttcgt ggatctcgtg 2160
actgattccc cagtgatctc cgctatcatc gatttcaaga ctctcaagaa cctcaacgat 2220
aactacggaa tcactaggtc ccaggctctc gatctcatcc gttccgatcc aagggtgctc 2280
agggatttca tcaaccagaa caacccaatc atcaagaaca ggatcgagca gctcattctc 2340
cagtgccgtc tttgatgact cgagggatcc tctagagaat tcgagctc 2388
<210> 16 <211> 2388
<212> DNA <213> Rotavirus
<400> 16
ccatggctta agcctgcgca agcaaggtac cgaagggagt agatggcagt caacgagtga 60
ttgaggatgt gacacctcga aaggctactc tagttgtgat agccaaggct cttcagggtc 120
ttgcactgat agttgggtcc tggtaagcga gtctgattga tgcgaggtca ctgaaccagt 180
gtgccacttc acttgctaag gtgatgatag ctcggtcacg agctacctgg tatggtcggt 240
tgattgaagt tcggtggttt gctaatgacc taagaggagt tgggttgatt ggtcgtccac 300
cacgaactcc cttgattgtt ctgactatag acccaccgtg aggaagaaca cctcggtttg 360
cactgattgg tcaggtccgt catgtgagag aagcctctct gattcgtcta gtgacacctc 420
ttgttgtgat tgttcacctt caagaagctc tacaagtcca ggttgcactt gcgactcaag 480
gtcgtgttct cctgagagtg aaggctatgt ttcgagcgac caaaatactt caagatgttg 540
agacacacct gaaaggtgcc actttgaggt gtgcgatgat gactaatgag gaggtgaagg 600
ttggaaaggc tccacctctg acactaggtg cacctcaaga tgtagtaggg ttccagggtt 660
ctcagattca cgaggctcat gtagttgtga cctgagggtg gttacgtttt gtgatccttg 720
tagcacggtc accgaaacag gagagcaagg cactgaatgg tctcccgagt ccacttgctc 780
ctatagtagt agaggttctg aagggagacc tttctctacg tcatgttgtc cctataatag 840
tagtccaagt tcaagttgtt gaggtagcac ttcgagcctc ctgagcctat gttcacctca 900
ctctagagga agttccgacg attgatggtc atgaggatgg agtccctacc acttgtccac 960
tgtcgagtgt gatgaacgag gcacttgcca caattgttga agaggatgtt gccaccaagg 1020
gagggttgac taaagaggca cagggcaatg ctccactagt ttctcttgag gatgcaaatg 1080
cacctaatga ccctactaag ggtccgaaag tccttgtacc acatacaatc tagggagcga 1140
cgattggagt tgaggcactt cacgaggcca cctttgatgt tgaaggtcta gggtcaccct 1200
cgaaccggtc actacagacc acctcgacac agagaggtga agcgaccaca atgtgagagg 1260
tgagtcaagt gactaaagca cagggagttg agggagtcca agtccaagag ggagtgacac 1320
cttctcggtg gtaagaggta ggagtcctga tcccacaggc ctgaaatgcc tgagggtcga 1380
aagttgggtt tgttgcctgt gctcatgatg ctctagcgac ctgcaaagag ggaatagagg 1440
gagcacggta ggttgctact aatggtctga ggttaatact tgaggcactg acactccgtc 1500
ctagaactct ccgtcgagcc tctagagtcc cttctcaagt tgagggagag ggttctctag 1560
cgatactgag tcgagtagct agagcgagag gagggtgagc tatacaagag gtacaagaga 1620
ccatagttca ggtgatagct acaccgattc agataccact gattccacta cttcttcaag 1680
ttcttcaggc ctgagcgatg aaggtagagg ctcgaatgac ctagagagag gttgcgacga 1740
agaagacaca gatccaggag gaggtagtcc aggttgtaga ggaggtagag tcacacctga 1800
ctacacaggc tcgtctagcg acctagaagg ctaaggcacg cattgtagag gtgagtctga 1860
aggcgataga ggttctccga atccgagtct ctctagtgat gagtctgact cccttacttg 1920
aagctactat agaggcgacg acacgagttc tgattctagc tatccaggtg agtgtagagg 1980
ggtctatgag agggtctata gtagtgactc aggaggctct tcaagtaggg tttcgcacga 2040
atggcacaag agttcctact actccactac cttcgactac acctaccttt caagaagcga 2100
atgtttcacc cttgaaagct tctccacggt aagctacacc tattcaagca cctagagcac 2160
tgactaaggg gtcactagag gcgatagtag ctaaagttct gagagttctt ggagttgcta 2220
ttgatgcctt agtgatccag ggtccgagag ctagagtagg caaggctagg ttcccacgag
2280
tccctaaagt agttggtctt gttgggttag tagttcttgt cctagctcgt cgagtaagag
2340
gtcacggcag aaactactga gctccctagg agatctctta agctcgag
2388
<210> 17 <211> 1254 <212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 17
ggtaccgaat tcggacgcgt tcgttccatg gatgtgctct actccctctc caagactctc 60
aaggatgcta gggataagat cgtggaggga actctctact ccaacgtttc cgatctcatc 120
cagcagttca accagatgat catcactatg aacggaaacg agttccagac tggtggaatc 180
ggaaacctcc caatcaggaa ctggaacttc gatttcggac tcctcggaac tactctcctc 240
aacctcgatg ctaactacgt ggagactgct aggaacacta tcgattactt cgttgatttc 300
gtggataatg tgtgcatgga tgagatggtt cgtgagtccc agaggaacgg aattgctcca 360
cagtccgatt ccctcaggaa gctctccggt atcaagttca agaggatcaa cttcgataac 420
tcctccgagt acatcgagaa ctggaacctc cagaacagaa ggcagaggac tggattcact 480
ttccacaagc caaacatctt cccatactcc gcttccttca ctctcaacag gtcccagcca 540
gctcacgata acctcatggg aactatgtgg ctcaacgctg gttctgagat ccaggtggca 600
ggattcgatt actcctgcgc tatcaacgct ccagctaaca ctcagcagtt cgagcacatc 660
gttcagctca gaagggtgct cactactgct actatcactc tcctcccaga tgctgagagg 720
ttctccttcc caagggtgat caactccgct gatggtgcta ctacttggta cttcaaccca 780
gtgatcctca ggccaaacaa cgtggaggtg gagttccttc tcaacggaca gatcatcaac 840
acttaccagg ctcgtttcgg aactatcgtg gctaggaact tcgatacaat caggctctcc 900
ttccagctta tgaggccacc aaacatgact ccatccgtgg ctgcactctt cccaaacgca 960
cagccattcg agcaccacgc tactgtggga ctcactctca agatcgagtc cgctgtgtgc 1020
gagtctgtgc tcgctgatgc ttccgagact atgctcgcta acgtgacttc tgtgaggcaa 1080
gagtacgcta tcccagtggg accagtgttt ccaccaggaa tgaactggac tgatctcatc 1140
actaactact ccccatccag agaggataac ctccagaggg tgttcactgt ggcttccatc 1200
cgttccatgc tcgtgaagtg atgactcgag ggatcctcta gagaattcga gctc 1254
<210> 18 <211> 1254 <212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400>
ccatggctta agcctgcgca agcaaggtac ctacacgaga tgagggagag gttctgagag 60
ttcctacgat ccctattcta gcacctccct tgagagatga ggttgcaaag gctagagtag 120
gtcgtcaagt tggtctacta gtagtgatac ttgcctttgc tcaaggtctg accaccttag 180
cctttggagg gttagtcctt gaccttgaag ctaaagcctg aggagccttg atgagaggag 240
ttggagctac gattgatgca cctctgacga tccttgtgat agctaatgaa gcaactaaag 300
cacctattac acacgtacct actctaccaa gcactcaggg tctccttgcc ttaacgaggt 360
gtcaggctaa gggagtcctt cgagaggcca tagttcaagt tctcctagtt gaagctattg 420
aggaggctca tgtagctctt gaccttggag gtcttgtctt ccgtctcctg acctaagtga 480
aaggtgttcg gtttgtagaa gggtatgagg cgaaggaagt gagagttgtc cagggtcggt 540
cgagtgctat tggagtaccc ttgatacacc gagttgcgac caagactcta ggtccaccgt 600
cctaagctaa tgaggacgcg atagttgcga ggtcgattgt gagtcgtcaa gctcgtgtag 660
caagtcgagt cttcccacga gtgatgacga tgatagtgag aggagggtct acgactctcc 720
aagaggaagg gttcccacta gttgaggcga ctaccacgat gatgaaccat gaagttgggt 780
cactaggagt ccggtttgtt gcacctccac ctcaaggaag agttgcctgt ctagtagttg 840
tgaatggtcc gagcaaagcc ttgatagcac cgatccttga agctatgtta gtccgagagg 900
aaggtcgaat actccggtgg tttgtactga ggtaggcacc gacgtgagaa gggtttgcgt 960
gtcggtaagc tcgtggtgcg atgacaccct gagtgagagt tctagctcag gcgacacacg 1020
ctcagacacg agcgactacg aaggctctga tacgagcgat tgcactgaag acactccgtt 1080
ctcatgcgat agggtcaccc tggtcacaaa ggtggtcctt acttgacctg actagagtag 1140
tgattgatga ggggtaggtc tctcctattg gaggtctccc acaagtgaca ccgaaggtag 1200
gcaaggtacg agcacttcac tactgagctc cctaggagat ctcttaagct cgag 1254
<210> 19 <211> 1041 <212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 19
ggtaccgaat tcggacgcgt tcgttgcatg tacggaatcg agtacactac tatcctcact 60
ttcctcatct ccatcgtgct cctcaactac atcctcaagt ccctcacttc cgctatggat 120
ttcatcatct accgtttcct cctcctcatc gtgatcgctt ccccattcgt taagactcag 180
aactacggta tcaacctccc aatcactgga tctatggata ctgcttacgc taactcctcc 240
cagcaagaga ctttcctcac ttccacactc tgcctctact acccaactga ggcatccaca 300
cagatcggag atacagagtg gaaggatact ctctcccagc tcttcctcac taagggatgg 360
ccaactggtt ccgtgtactt caaagagtac actgatatcg cttccttctc catcgatcca 420
cagctctact gcgattacaa cgtggtgctt atgaagtacg attccactct tgagcttgat 480
atgtccgagc ttgctgatct catcctcaac gagtggctct gcaacccaat ggatatcact 540
ctctactact accagcagac tgatgaggct aacaagtgga tctctatggg acagtcctgc 600
actatcaaag tgtgcccact caacactcag actctcggaa tcggatgcat cactactaac 660
actgctactt tcgaggaagt ggctacttcc gagaagctcg tgatcactga tgtggtggat 720
ggtgttaacc acaagctcga tgtgactact aacacatgca caatcaggaa ctgcaagaag 780
ctcggaccaa gggaaaacgt ggctatcatc caagtgggag gttccgatgt gctcgatatc 840
actgctgatc caactactgc tccacagact gagaggatga tgagggtgaa ctggaagaag 900
tggtggcagg ttttctacac tgtggtggat tacatcaacc agatcgttca ggtgatgtcc 960
aagaggtccc gttctctcaa ctccgctgct ttctactacc gtgtgtgatg actcgaggga 1020
tcctctagag aattcgagct c 1041
<210> 20 <211> 1041 <212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 20
ccatggctta agcctgcgca agcaacgtac atgccttagc tcatgtgatg ataggagtga 60
aaggagtaga ggtagcacga ggagttgatg taggagttca gggagtgaag gcgataccta 120
aagtagtaga tggcaaagga ggaggagtag cactagcgaa ggggtaagca attctgagtc 180
ttgatgccat agttggaggg ttagtgacct agatacctat gacgaatgcg attgaggagg 240
gtcgttctct gaaaggagtg aaggtgtgag acggagatga tgggttgact ccgtaggtgt 300
gtctagcctc tatgtctcac cttcctatga gagagggtcg agaaggagtg attccctacc 360
ggttgaccaa ggcacatgaa gtttctcatg tgactatagc gaaggaagag gtagctaggt 420
gtcgagatga cgctaatgtt gcaccacgaa tacttcatgc taaggtgaga actcgaacta 480
tacaggctcg aacgactaga gtaggagttg ctcaccgaga cgttgggtta cctatagtga 540
gagatgatga tggtcgtctg actactccga ttgttcacct agagataccc tgtcaggacg 600
tgatagtttc acacgggtga gttgtgagtc tgagagcctt agcctacgta gtgatgattg 660
tgacgatgaa agctccttca ccgatgaagg ctcttcgagc actagtgact acaccaccta 720
ccacaattgg tgttcgagct acactgatga ttgtgtacgt gttagtcctt gacgttcttc 780
gagcctggtt cccttttgca ccgatagtag gttcaccctc caaggctaca cgagctatag 840
tgacgactag gttgatgacg aggtgtctga ctctcctact actcccactt gaccttcttc 900
accaccgtcc aaaagatgtg acaccaccta atgtagttgg tctagcaagt ccactacagg 960
ttctccaggg caagagagtt gaggcgacga aagatgatgg cacacactac tgagctccct 1020
aggagatctc ttaagctcga g 1041
<210> 21
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-WA_VP2(opt).s1+3c
<400> 21
aaatttgtcg ggcccatggc ataccggaag agaggagcaa agcgcgaa 48
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-WA_VP2(opt).s1-4r
<400> 22
actaaagaaa ataggccttt aaagctcgtt cattattcgc atattgtcga 50
<210> 23
<211> 4903
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Construct 1191 <400> 23
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260
aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460
ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520
tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580
cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640
aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700
tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 27 60
cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820
tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880
tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940
ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000
ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt 3060
tcactgaagc gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg 3120
tgtacttgtc ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct 3180
gttcagcccc atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct 3240
acttctgctt gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt 3300
tctataagaa atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga 3360
gaaagattgt taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggcccgcg gatggcgaaa 3420
aacgttgcga ttttcggctt attgttttct cttcttgtgt tggttccttc tcagatcttc 3480
gcctgcaggc tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc 3540
tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga 3600
gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc 3660
tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg 3720
gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc agcagcacca aggtggacaa 3780
gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc 3840
atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa 3900
ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt 3960
tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc cgggaggagc agttcaacag 4020
cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag gactggctca atggcaagga 4080
gcgatcgctc accatcacca tcaccatcac catcaccatt aaaggcctat tttctttagt 4140
ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt ctgtgctcag 4200
agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca ggtcgtccct 4260
tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa agaccgggaa 4320
ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 4380
gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 4440
agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 4500
gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 4560
ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatct ctagagtctc aagcttggcg 4620
cgcccacgtg actagtggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg
4680
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg
4740
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga
4800
gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg
4860
acaggatata ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt tta
4903
<210> 24 <211> 2721
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1733
<400> 24
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatgtac ggcatcgagt atacaacaat tttaattttc ctgatttcca tcattctgtt 1320
aaactacatc cttaagtccg tgaccagaat tatggattat attatctatc gtagcctcct 1380
catctacgtg gccctttttg ccctgaccag ggcccagaac tatggcctga acttaccaat 1440
caccggttca atggataccg tttacgctaa ttccactcaa gaggggatat ttctgacaag 1500
taccctgtgc ctgtattatc caacagaagc ctctacccag atcaatgatg gggagtggaa 1560
ggatagtctc tcacagatgt tcctaaccaa gggctggccc accggttccg tctacttcaa 1620
ggaatactct agtattgtcg acttctcagt tgacccccag ctttattgcg actacaacct 1680
ggtacttatg aaatacgacc agaacctgga gctggatatg tccgagctgg ctgacctgat 1740
cctcaatgag tggctgtgca accccatgga catcacatta tattactacc agcagtctgg 1800
agaatccaac aagtggatca gtatgggctc aagttgcacc gtgaaggtgt gtcccttgaa 1860
cacccaaatg ctgggcattg gttgtcagac aactaatgtg gattcgtttg aaatggtagc 1920
cgaaaacgag aagctggcta tagtggacgt agtcgatggg attaaccaca agatcaatct 1980
gactaccacc acttgtacca tcagaaactg taaaaagctc ggcccccggg agaacgtcgc 2040
cgtgatccag gtggggggga gcaatgtgct cgacattact gccgacccta ccaccaatcc 2100
acagacggaa cggatgatga gagtcaactg gaagaaatgg tggcaggtct tttataccat 2160
tgtggactac attaaccaga ttgtgcaagt catgagtaaa cggtccagat ccctgaactc 2220
agcagccttc tattatcgcg tttagaggcc tattttcttt agtttgaatt tactgttatt 2280
cggtgtgcat ttctatgttt ggtgagcggt tttctgtgct cagagtgtgt ttattttatg 2340
taatttaatt tctttgtgag ctcctgttta gcaggtcgtc ccttcagcaa ggacacaaaa 2400
agattttaat tttattaaaa aaaaaaaaaa aaaagaccgg gaattcgata tcaagcttat 2460
cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 2520
ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 2580
atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 2640
atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 2700
gtgtcatcta tgttactaga t 2721
<210> 25 <211> 890 <212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 25
Met Ala Tyr Arg Lys Arg Gly Ala Lys Arg Glu Asn Leu Pro Gln Gln
1 5 10 15
Asn Glu Arg Leu Gln Glu Lys Glu Ile Glu Lys Asp Val Asp Val Thr
20 25 30
Met Glu Asn Lys Asn Asn Asn Arg Lys Gln Gln Leu Ser Asp Lys Val
35 40 45
Leu Ser Gln Lys Glu Glu Ile Ile Thr Asp Ala Gln Asp Asp Ile Lys
50 55 60
Ile Ala Gly Glu Ile Lys Lys Ser Ser Lys Glu Glu Ser Lys Gln Leu
65 70 75 80
Leu Glu Ile Leu Lys Thr Lys Glu Asp His Gln Lys Glu Ile Gln Tyr
85 90 95
Glu Ile Leu Gln Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Ser Lys Glu Ser Ile
100 105 110
Leu Lys Lys Leu Glu Asp Ile Arg Pro Glu Gln Ala Lys Lys Gln Met
115 120 125
Lys Leu Phe Arg Ile Phe Glu Pro Lys Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala
130 135 140
Asn Gly Glu Lys Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn
165 170 175
Leu Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys
180 185 190
Asp Met Ala Val Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val
195 200 205
Asp Ser Glu Thr Ala Asn Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu
210 215 220
Thr Glu Gly Val Val Arg Arg Phe Ile Ala Asp Met Arg Gln Gln Val
225 230 235 240
Gln Ala Asp Arg Asn Ile Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile
245 250 255
Asp His Ala Phe Asn Glu Tyr Phe Leu Asn His Gln Leu Val Glu Pro
260 265 270
Leu Asn Asn Glu Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn
275 280 285
Asp Val Asn Tyr Ile Leu Asn Met Asp Met Asn Leu Pro Ser Thr Ala
290 295 300
Arg Tyr Ile Arg Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu His Asp
305 310 315 320
Asn Phe Glu Ser Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu
325 330 335
Ala Arg Ser Val Val Pro Asp Leu Lys Glu Lys Glu Leu Val Ser Thr
340 345 350
Glu Ala Gln Ile Gln Lys Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu
355 360 365
Thr Ile Gln Ser Glu Thr Gln Phe Leu Ala Gly Ile Asn Ser Gln Ala
370 375 380
Ala Asn Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg
385 390 395 400
Thr Met Ser Leu Asp Phe Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser
405 410 415
Gly Met Trp Leu Leu Thr Val Ile Pro Asn Asp Met Phe Leu Arg Glu
420 425 430
Ser Leu Val Ala Cys Glu Leu Ala Ile Ile Asn Thr Ile Val Tyr Pro
435 440 445
Ala Phe Gly Met Gln Arg Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr
450 455 460
Pro Phe Gln Ile Ala Glu Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn
465 470 475 480
Trp Leu His Phe Ile Asn Asn Asn Arg Phe Arg Gln Val Val Ile Asp
485 490 495
Gly Val Leu Asn Gln Thr Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Gln Val
500 505 510
Ile Asn Gln Leu Met Glu Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe
515 520 525
Pro Thr Met Pro Val Asp Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu
530 535 540
Leu Leu Ser Asn Arg Leu Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val
545 550 555 560
Ser Tyr Asn Tyr Glu Thr Leu Met Ala Cys Val Thr Met Asn Met Gln
565 570 575
His Val Gln Thr Leu Thr Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr
580 585 590
Ser Leu Cys Met Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln
595 600 605
Thr Leu Phe His Tyr Tyr Asn Ile Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr
610 615 620
Asn Glu Arg Ile Asn Asp Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg
625 630 635 640
Leu Asn Leu Tyr Gln Lys Lys Met Lys Ser Ile Val Glu Asp Phe Leu
645 650 655
Lys Arg Leu Gln Ile Phe Asp Val Pro Arg Val Pro Asp Asp Gln Met
660 665 670
Tyr Arg Leu Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Arg Arg Arg
675 680 685
Leu Asp Ile Phe Asn Leu Ile Leu Met Asn Met Glu Gln Ile Glu Arg
690 695 700
Ala Ser Asp Lys Ile Ala Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met
705 710 715 720
Gln Leu Glu Arg Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn
725 730 735
Leu Asp Gly Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Thr Gly
740 745 750
Asp Tyr Gly Gln Ile Thr Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala
755 760 765
Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu
770 775 780
Ile Ala Lys Leu Asp Ala Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg
785 790 795 800
Lys Val Asp Thr Leu Lys Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser
805 810 815
Asn Asp Phe Tyr Leu Val Ala Asn Tyr Asp Trp Ile Pro Thr Ser Thr
820 825 830
Thr Lys Val Tyr Lys Gln Val Pro Gln Pro Phe Asp Phe Arg Ala Ser
835 840 845
Met His Met Leu Thr Ser Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu
850 855 860
Leu Ser Phe Val Ser Ala Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala
865 870 875 880
Phe Asp Asn Met Arg Ile Met Asn Glu Leu 885 890
<210> 26
<211> 6745
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Construct 193 <400> 26
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260
aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaga cgcgttgttg ttgtgactcc gaggggttgc 2160
ctcaaactct atcttataac cggcgtggag gcatggaggc aggggtattt tggtcatttt 2220
aatagatagt ggaaaatgac gtggaattta cttaaagacg aagtctttgc gacaaggggg 2280
ggcccacgcc gaatttaata ttaccggcgt ggccccccct tatcgcgagt gctttagcac 2340
gagcggtcca gatttaaagt agaaaatttc ccgcccacta gggttaaagg tgttcacact 2400
ataaaagcat atacgatgtg atggtatttg gtcgacaagc ttgcatgccg gtcaacatgg 2460
tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 2520
gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 2580
cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 2640
atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 2700
atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 2760
agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata 2820
tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 2880
ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 2940
aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 3000
atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 3060
aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 3120
taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 3180
catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga acgtggggaa 3240
acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa cttctctctt 3300
gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac cagtacaacg 3360
ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc ggcgccatta 3420
aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa gcttgctgga 3480
ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg gcgggtgcaa 3540
tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct tcttcttgct 3600
gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg tggttttcga 3660
acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg gcccgcggat 3720
ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca 3780
gatcttcgcc tgcaggctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc 3840
ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt 3900
tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct 3960
tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca 4020
gcacctggcc cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg 4080
tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag 4140
aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga 4200
ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca 4260
gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt 4320
tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg 4380
gcaaggagcg atcgctcacc atcaccatca ccatcaccat caccattaaa ggcctatttt 4440
ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 4500
tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 4560
cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 4620
ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 4680
ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 4740
tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 4800
atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 4860
aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatctcta gagtctcaag 4920
cttggcgcgc cataaaatga ttattttatg aatatatttc attgtgcaag tagatagaaa 4980
ttacatatgt tacataacac acgaaataaa caaaaaaaga caatccaaaa acaaacaccc 5040
caaaaaaaat aatcacttta gataaactcg tatgaggaga ggcacgttca gtgactcgac 5100
gattcccgag caaaaaaagt ctccccgtca cacatatagt gggtgacgca attatcttta 5160
aagtaatcct tctgttgact tgtcattgat aacatccagt cttcgtcagg attgcaaaga 5220
attatagaag ggatcccacc ttttattttc ttcttttttc catatttagg gttgacagtg 5280
aaatcagact ggcaacctat taattgcttc cacaatggga cgaacttgaa ggggatgtcg 5340
tcgatgatat tataggtggc gtgttcatcg tagttggtga aatcgatggt accgttccaa 5400
tagttgtgtc gtccgagact tctagcccag gtggtctttc cggtacgagt tggtccgcag 5460
atgtagaggc tggggtgtcg gattccattc cttccattgt cctggttaaa tcggccatcc 5520
attcaaggtc agattgagct tgttggtatg agacaggatg tatgtaagta taagcgtcta 5580
tgcttacatg gtatagatgg gtttccctcc aggagtgtag atcttcgtgg cagcgaagat 5640
ctgattctgt gaagggcgac acatacggtt caggttgtgg agggaataat ttgttggctg 5700
aatattccag ccattgaagt tttgttgccc attcatgagg gaattcttcc ttgatcatgt 5760
caagatattc ctccttagac gttgcagtct ggataatagt tctccatcgt gcgtcagatt 5820
tgcgaggaga gaccttatga tctcggaaat ctcctctggt tttaatatct ccgtcctttg 5880
atatgtaatc aaggacttgt ttagagtttc tagctggctg gatattaggg tgatttcctt 5940
caaaatcgaa aaaagaagga tccctaatac aaggtttttt atcaagctgg agaagagcat 6000
gatagtgggt agtgccatct tgatgaagct cagaagcaac accaaggaag aaaataagaa 6060
aaggtgtgag tttctcccag agaaactgga ataaatcatc tctttgagat gagcacttgg 6120
gataggtaag gaaaacatat ttagattgga gtctgaagtt cttactagca gaaggcatgt 6180
tgttgtgact ccgaggggtt gcctcaaact ctatcttata accggcgtgg aggcatggag 6240
gcaggggtat tttggtcatt ttaatagata gtggaaaatg acgtggaatt tacttaaaga 6300
cgaagtcttt gcgacaaggg ggggcccacg ccgaatttaa tattaccggc gtggcccccc 6360
cttatcgcga gtgctttagc acgagcggtc cagatttaaa gtagaaaatt tcccgcccac 6420
tagggttaaa ggtgttcaca ctataaaagc atatacgatg tgatggtatt tgactagtgg
6480
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc
6540
gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc
6600
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc
6660
agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg
6720
taaacctaag agaaaagagc gttta
6745
<210> 27 <211> 4413
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1710
<400> 27
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggca taccggaaga gaggagcaaa gcgcgaaaac ctgccgcaac agaacgagag 1320
actgcaagaa aaagagatag agaaagatgt cgacgtaaca atggaaaaca agaataacaa 1380
taggaaacaa cagctgtccg acaaagttct gtcccagaag gaggaaatta tcactgacgc 1440
ccaggacgat attaaaattg ccggagaaat aaagaagagc tcgaaagaag aatctaaaca 1500
gctgctcgaa attctgaaaa caaaagaaga ccatcagaaa gagattcaat atgaaatttt 1560
gcaaaaaaca atacctacat ttgagtccaa agaaagtatc ctcaagaagc ttgaagacat 1620
aagaccggag caggcaaaaa aacagatgaa actctttcgc attttcgagc caaaacagct 1680
ccctatatat cgcgccaatg gcgagaagga gctacgcaac cggtggtact ggaagttgaa 1740
aaaagacacc ctgccagatg gagattatga cgtccgggag tatttcctca atctctatga 1800
tcagatcctc atcgaaatgc cggactatct gctcctcaag gacatggccg tggagaacaa 1860
aaatagcaga gacgccggca aagttgtcga ctctgagact gccaatattt gtgatgccat 1920
cttccaggat gaggagaccg agggagtcgt ccgtagattc atcgctgata tgcggcaaca 1980
ggtccaggct gatcgtaaca ttgtcaatta cccttccatc cttcacccta ttgatcatgc 2040
attcaatgag tattttctta accaccagtt ggtggagccg ctgaacaatg agataatctt 2100
caattacata ccagagagga taaggaatga cgtgaattac atcctgaaca tggatatgaa 2160
tctgccatct acagccaggt atatcaggcc aaacttgttg caggatagac tgaatcttca 2220
cgataatttt gagtccctgt gggataccat cacaacatcc aactacattc tggccaggtc 2280
cgtcgttccc gatttgaagg agaaggagct ggtctccacc gaagcacaga tccagaaaat 2340
gagccaggac ctgcagctgg aggccctcac tattcagagc gagacacagt ttttagccgg 2400
gattaacagt caggctgcca atgattgttt caagaccctc atagccgcca tgctgtctca 2460
aagaaccatg tctttggact ttgtgaccac gaactatatg agcctaatct ccggaatgtg 2520
gctacttaca gtgattccca acgatatgtt cctccgggag tcactagtgg cctgtgagct 2580
ggcgatcatc aacaccatcg tgtatccagc attcggaatg cagagaatgc attaccggaa 2640
tggcgaccct cagacaccct tccagatcgc agaacagcag atccagaatt tccaggtggc 2700
gaactggctc cattttatta acaataacag attcaggcaa gttgtgattg atggagttct 2760
gaatcagact ctgaacgaca atatacggaa tggacaggtc atcaaccagc tgatggaagc 2820
attgatgcaa ctcagcagac agcagttccc cacgatgcct gtggattaca aacggagcat 2880
ccaacggggc attctgcttc tctccaatag gctggggcag cttgtcgact taacccgact 2940
ggtctcctat aactacgaga cgctaatggc ttgtgtgacc atgaacatgc agcacgtgca 3000
aaccctgaca actgagaagt tgcagctcac ttctgtgact tcgctttgta tgttaattgg 3060
taacacaacc gtgattccgt ccccacagac actgttccac tactacaaca tcaacgtgaa 3120
tttccactcc aattataatg agcggatcaa cgacgccgtc gccataatta ccgcagcaaa 3180
taggctgaat ctttatcaga aaaaaatgaa gtccatagtg gaagactttc tgaaacggct 3240
ccagattttc gacgtaccac gagtgcctga cgaccaaatg tacaggctga gggatcgcct 3300
tcggctctta cccgttgaac ggagacggct tgacatattc aacttgatcc tgatgaatat 3360
ggagcagatc gaacgcgctt ctgataagat tgctcagggg gttatcatcg cataccgaga 3420
tatgcagctg gaacgcgacg agatgtacgg atatgttaat attgcacgga atcttgatgg 3480
ctaccagcaa attaacttgg aggaactcat gcgcaccggt gattacggac aaattacgaa 3540
catgcttctc aacaatcaac ccgttgccct tgtgggtgca ttgcccttcg ttacggactc 3600
atccgtgatc agtctaatcg ccaagctcga cgcaaccgtc ttcgctcaga tagtgaagct 3660
caggaaagtt gacacactga agcccatact gtacaaaata aactcggatt ccaatgactt 3720
ttaccttgtg gccaactacg actggatccc cacaagtaca actaaggtct acaaacaggt 3780
gccacaacca ttcgacttta gagccagcat gcacatgctg acttctaacc ttacgtttac 3840
cgtctactct gacctactgt catttgtttc agcggacacg gtagagccca ttaacgcagt 3900
cgcattcgac aatatgcgaa taatgaacga gctttaaagg cctattttct ttagtttgaa 3960
tttactgtta ttcggtgtgc atttctatgt ttggtgagcg gttttctgtg ctcagagtgt 4020
gtttatttta tgtaatttaa tttctttgtg agctcctgtt tagcaggtcg tcccttcagc 4080
aaggacacaa aaagatttta attttattaa aaaaaaaaaa aaaaaagacc gggaattcga 4140
tatcaagctt atcgacctgc agatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg 4200
aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat 4260
gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc 4320
ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa 4380
ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gat 4413
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-WA_VP6(opt).s1+3c
<400> 28
aaatttgtcg ggcccatgga ggtcctttat agtctctcca aaacgctga 49
<210> 29 <211> 52 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-WA_VP6(opt).s1-4r <400> 29
actaaagaaa ataggcctct acttgatcaa catactccgg atagaggcca ca 52
<210> 30 <211> 2934 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1713
<400> 30
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggag gtcctttata gtctctccaa aacgctgaag gacgctaggg acaagatcgt 1320
ggagggtaca ctttatagca atgtcagcga cctaatacag cagtttaatc aaatgatcgt 1380
tacaatgaat gggaatgatt tccaaactgg cggtattggt aatctgcccg tgaggaactg 1440
gacattcgat ttcggcctgc tgggcacgac tctccttaat ctcgatgcaa attatgtaga 1500
aaacgccaga acgattatcg agtactttat cgatttcatt gataacgttt gtatggatga 1560
gatggcccgc gagtcacaac ggaacggagt tgctccacag tccgaggccc ttcggaaact 162 0
cgccggcatt aagttcaagc gtattaattt cgacaactcc tccgaatata tagagaactg 1680
gaacttgcag aatcgtcgac agagaaccgg cttcgtgttc cataaaccta atatctttcc 1740
gtatagcgcc tcattcaccc tgaataggag tcagcccatg cacgacaacc tcatgggtac 1800
aatgtggctg aatgcgggga gtgaaataca ggtcgccggg ttcgattact cctgtgccat 1860
taatgcaccc gcaaacatcc agcagttcga acatatcgtg caactaagac gggctctcac 1920
gaccgcgaca attacactcc tgcccgacgc cgagcgcttc tcctttcccc gcgtaatcaa 1980
ctcagctgat ggcgccacca cttggttctt caaccctgtt atattgcgcc ctaacaacgt 2040
agaggtggag tttctcttaa acggacagat catcaatacc taccaagcca ggttcggcac 2100
gattattgca agaaatttcg acgctatcag gctgctcttc caactgatga ggccccccaa 2160
tatgactccc gctgtgaacg ctttgtttcc gcaggctcag cctttccagc accacgccac 2220
cgtcggcttg actcttcgaa tagagagcgc ggtctgcgaa tcagtgctgg cagacgccaa 2280
cgagacgctg ctggcaaacg ttaccgccgt gcggcaagag tatgccatcc cagtagggcc 2340
tgtgtttcca cccggcatga actggactga actaattact aactatagcc catccagaga 2400
agacaacttg cagcgggtct tcactgtggc ctctatccgg agtatgttga tcaagtagag 2460
gcctattttc tttagtttga atttactgtt attcggtgtg catttctatg tttggtgagc 2520
ggttttctgt gctcagagtg tgtttatttt atgtaattta atttctttgt gagctcctgt 2580
ttagcaggtc gtcccttcag caaggacaca aaaagatttt aattttatta aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaagac cgggaattcg atatcaagct tatcgacctg cagatcgttc aaacatttgg 2700
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2760
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2820
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2880
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agat 2934
<210> 31 <211> 397 <212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 31
Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Val Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn
65 70 75 80
Ala Arg Thr Ile Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys
85 90 95
Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Val Ala Pro Gln
100 105 110
Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ala Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn
115 120 125
Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
130 135 140
Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Met His Asp Asn Leu
165 170 175
Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe
195 200 205
Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser
225 230 235 240
Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Phe Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro
245 250 255
Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr
260 265 270
Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Ala Ile
275 280 285
Arg Leu Leu Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
290 295 300
Asn Ala Leu Phe Pro Gln Ala Gln Pro Phe Gln His His Ala Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala
325 330 335
Asp Ala Asn Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu
340 345 350
Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr
355 360 365
Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg
370 375 380
Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys
385 390 395
<210> 32
<211> 2934
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1714
<400> 32
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggag gtcctttata gtctctccaa aacgctgaag gacgctaggg acaagatcgt 1320
ggagggtaca ctttatagca atgtcagcga cctaatacag cagtttaatc aaatgatcgt 1380
tacaatgaat gggaatgatt tccaaactgg cggtattggt aatctgcccg tgaggaactg 1440
gacattcgat ttcggcctgc tgggcacgac tctccttaat ctcgatgcaa attatgtaga 1500
aaacgccaga acgattatcg agtactttat cgatttcatt gataacgttt gtatggatga 1560
gatggcccgc gagtcacaac ggaacggagt tgctccacag tccgaggccc ttcggaaact 1620
cgccggcatt aagttcaagc gtattaattt cgacaactcc tccgaatata tagagaactg 1680
gaacttgcag aatcgtcgac agagaaccgg cttcgtgttc cataaaccta atatctttcc 1740
gtatagcgcc tcattcaccc tgaataggag tcagcccatg cacgacaacc tcatgggtac 1800
aatgtggctg aatgcgggga gtgaaataca ggtcgccggg ttcgattact cctgtgccat 1860
taatgcaccc gcaaacatcc agcagttcga acatatcgtg caactaagac gggctctcac 1920
gaccgcgaca attacactcc tgcccgacgc cgagcgcttc tcctttcccc gcgtaatcaa 1980
ctcagctgat ggcgccacca cttggttctt caaccctgtt atattgcgcc ctaacaacgt 2040
agaggtggag tttctcttaa acggacagat catcaatacc taccaagcca ggttcggcac 2100
gattattgca agaaatttcg acgctatcag gctgctcttc caactgatga ggccccccaa 2160
tatgactccc gctgtgaacg ctttgtttcc gcaggctcag cctttccagc accacgccac 2220
cgtcggcttg actcttcgaa tagagagcgc ggtctgcgaa tcagtgctgg cagacgccaa 2280
cgagacgctg ctggcaaacg ttaccgccgt gcggcaagag tatgccatcc cagtagggcc 2340
tgtgtttcca cccggcatga actggactga actaattact aactatagcc catccagaga 2400
agacaacttg cagcgggtct tcactgtggc ctctatccgg agtatgttga tcaagtagag 2460
gcctattttc tttagtttga atttactgtt attcggtgtg catttctatg tttggtgagc 2520
ggttttctgt gctcagagtg tgtttatttt atgtaattta atttctttgt gagctcctgt 2580
ttagcaggtc gtcccttcag caaggacaca aaaagatttt aattttatta aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaagac cgggaattcg atatcaagct tatcgacctg cagatcgttc aaacatttgg 2700
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2760
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2820
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2880
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agat 2934
<210> 33
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c
<400> 33
aaatttgtcg ggcccatggc tagcctgatc tacagacaac tcttgaccaa ttc 53
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r
<400> 34
actaaagaaa ataggccttc agagtttaca ttgcaggatt aattgctcaa tccta 55
<210> 35
<211> 4068
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1731
<400> 35
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggct agcctgatct acagacaact cttgaccaat tcatattctg tggatcttca 1320
tgacgaaatc gagcagattg ggtccgagaa gacccagaac gtgaccatca accctggacc 1380
ttttgctcag acccgctatg cccctgtgaa ttgggatcac ggagaaatca acgacagtac 1440
gaccgtcgaa cccattctgg acgggccata ccaacccacc accttcaccc cacctaatga 1500
ttattggatt ttaatcaact ccaacacaaa cggagtggtc tacgagtcca ctaataactc 1560
cgatttttgg accgccgttg tagccatcga gccacacgtc aatcctgtcg atcgccagta 1620
tatgatattc ggcgagtcca aacagtttaa cgtttccaat gacagcaaca aatggaagtt 1680
tctggagatg tttcgcagct cctctcagaa cgaattctat aatagacgga cccttacctc 1740
cgatacacga ctcgtgggta tttttaagta cggcggcagg gtgtggacat ttcacggtga 1800
aacccctcga gcaaccactg actccagtag cactgcaaac ctgaacaata tatctattac 1860
catccacagc gaattctaca taatcccaag atctcaggaa agtaagtgta acgaatatat 1920
caacaacgga ctccccccaa ttcagaatac acggaacgtg gtgcctctcc cactcagttc 1980
tcggtctatc cagtataaga gagcacaagt gaatgaggac attattgtga gcaagactag 2040
cctttggaaa gaaatgcagt acaacagaga cattatcatc cggtttaagt ttgggaactc 2100
tatcgtgaag atgggcggcc tggggtacaa atggtcagaa atctcatata aagccgccaa 2160
ctatcagtat aactacttga gagacggcga gcaggtaacc gcccacacaa catgctctgt 2220
caacggcgtt aataacttta gctacaacgg aggcttcctt cccaccgact tcggtatcag 2280
ccggtatgaa gtcatcaagg aaaattctta tgtgtacgta gattactggg atgatagcaa 2340
agcgttccgc aacatggtgt atgttaggag cctggctgct aatctcaatt ctgtgaagtg 2400
tactggtgga tcatattatt tctcaattcc cgtgggggct tggccagtca tgaatggcgg 2460
ggcagtctcc ctccattttg ctggcgtgac gttgagcact cagtttaccg atttcgtgtc 2520
tctgaactcc ctgaggttcc ggttttccct tactgtcgac gagcccccat tcagcattct 2580
gcgtacaaga actgtcaacc tctacgggtt acctgccgcg aatccaaaca acggcaatga 2640
atactatgaa atttcgggcc gcttctcttt gataagtctg gtaccaacta atgacgacta 2700
tcagacaccc atcatgaaca gcgtgactgt cagacaggac ctggaaagac aacttacaga 2760
tctgcgggaa gaattcaatt ctctcagtca ggagattgca atggcccaat tgatagatct 2820
tgccctactg cctctcgata tgtttagtat gttctccggc atcaaatcaa ctatagatct 2880
gacaaagagc atggctactt ctgtgatgaa gaagttcagg aaatcaaaac ttgccacgag 2940
catatcagaa atgacgaact ctctgagtga tgcagcatca tcagcgtcac gcaacgtttc 3000
cattcggtcg aatctcagcg ccatcagcaa ctggacaaac gtgtccaacg acgtcagcaa 3060
cgtgaccaac tccttgaacg atatttctac ccagacgtca acgatcagta agaaactccg 3120
cttgaaagaa atgatcaccc agactgaggg aatgtctttc gacgacattt ccgccgccgt 3180
gctaaaaacc aaaatcgata tgtctactca gatcggcaag aacactctgc cggatatcgt 3240
aaccgaagcc tccgaaaagt ttatccctaa gcgcagctac agaatattga aagatgacga 3300
ggtcatggag atcaacacag aagggaagtt cttcgcttat aagatcaaca cctttgacga 3360
ggttccgttt gacgtcaata agtttgcaga gctcgtgaca gatagtccag tgatttctgc 3420
catcattgac tttaagactt tgaagaacct gaacgacaac tatggaataa cacggaccga 3480
agcgttgaac ctcattaagt ccaatcccaa tatgttgcgc aatttcatta accagaacaa 3540
tccaatcata agaaatagga ttgagcaatt aatcctgcaa tgtaaactct gaaggcctat 3600
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 3660
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 3720
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 3840
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 3900
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 3960
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 4020
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 4068
<210> 36 <211> 775 <212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 36
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser Val
1 5 10 15
Asp Leu His Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn
20 25 30
Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val
35 40 45
Asn Trp Asp His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Ile
50 55 60
Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Thr Pro Pro Asn Asp Tyr
65 70 75 80
Trp Ile Leu Ile Asn Ser Asn Thr Asn Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr
85 90 95
Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Val Ala Ile Glu Pro His Val
100 105 110
Asn Pro Val Asp Arg Gln Tyr Met Ile Phe Gly Glu Ser Lys Gln Phe
115 120 125
Asn Val Ser Asn Asp Ser Asn Lys Trp Lys Phe Leu Glu Met Phe Arg
130 135 140
Ser Ser Ser Gln Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp
145 150 155 160
Thr Arg Leu Val Gly Ile Phe Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe
165 170 175
His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Asn
180 185 190
Leu Asn Asn Ile Ser Ile Thr Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro
195 200 205
Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro
210 215 220
Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Pro Leu Ser Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ile Gln Tyr Lys Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Ile Val Ser
245 250 255
Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile
260 265 270
Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Ile Val Lys Met Gly Gly Leu Gly Tyr
275 280 285
Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn
305 310 315 320
Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Phe Leu Pro Thr Asp Phe
325 330 335
Gly Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val
340 345 350
Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg
355 360 365
Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Thr Gly Gly Ser Tyr
370 375 380
Tyr Phe Ser Ile Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Asn Gly Gly Ala
385 390 395 400
Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp
405 410 415
Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp
420 425 430
Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg Thr Arg Thr Val Asn Leu Tyr Gly
435 440 445
Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Ile Ser
450 455 460
Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Thr Asn Asp Asp Tyr Gln
465 470 475 480
Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln
485 490 495
Leu Thr Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala
500 505 510
Met Ala Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser
515 520 525
Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Leu Thr Lys Ser Met Ala
530 535 540
Thr Ser Val Met Lys Lys Phe Arg Lys Ser Lys Leu Ala Thr Ser Ile
545 550 555 560
Ser Glu Met Thr Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ala Ser Arg
565 570 575
Asn Val Ser Ile Arg Ser Asn Leu Ser Ala Ile Ser Asn Trp Thr Asn
580 585 590
Val Ser Asn Asp Val Ser Asn Val Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ile Ser
595 600 605
Thr Gln Thr Ser Thr Ile Ser Lys Lys Leu Arg Leu Lys Glu Met Ile
610 615 620
Thr Gln Thr Glu Gly Met Ser Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu
625 630 635 640
Lys Thr Lys Ile Asp Met Ser Thr Gln Ile Gly Lys Asn Thr Leu Pro
645 650 655
Asp Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Lys Arg Ser Tyr
660 665 670
Arg Ile Leu Lys Asp Asp Glu Val Met Glu Ile Asn Thr Glu Gly Lys
675 680 685
Phe Phe Ala Tyr Lys Ile Asn Thr Phe Asp Glu Val Pro Phe Asp Val
690 695 700
Asn Lys Phe Ala Glu Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile
705 710 715 720
Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile Thr
725 730 735
Arg Thr Glu Ala Leu Asn Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asn Met Leu Arg
740 745 750
Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln
755 760 765
Leu Ile Leu Gln Cys Lys Leu
770 775
<210> 37
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-Rtx_VP7(opt).s1+3c
<400> 37
aaatttgtcg ggcccatgta cggcatcgag tatacaacaa ttttaatttt c 51
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r
<400> 38
actaaagaaa ataggcctct aaacgcgata atagaaggct gctgagttca ggga 54
<210> 39
<211> 326
<212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 39
Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Ile Phe Leu Ile Ser Ile
1 5 10 15
Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Ile Met Asp Tyr
20 25 30
Ile Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ala Leu Phe Ala Leu Thr
35 40 45
Arg Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp
50 55 60
Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly Ile Phe Leu Thr Ser Thr
65 70 75 80
Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Asn Asp Gly
85 90 95
Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro
100 105 110
Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val Asp Phe Ser
115 120 125
Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Leu Val Leu Met Lys Tyr
130 135 140
Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu
145 150 155 160
Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln
165 170 175
Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser Ser Cys Thr
180 185 190
Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met Leu Gly Ile Gly Cys Gln
195 200 205
Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val Ala Glu Asn Glu Lys Leu
210 215 220
Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn His Lys Ile Asn Leu Thr
225 230 235 240
Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu
245 250 255
Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Val Leu Asp Ile Thr
260 265 270
Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn
275 280 285
Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn
290 295 300
Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c
<400> 40
tctcagatct tcgcccagaa ctatggcctg aacttaccaa tcaccggttc aatggatacc 60
<210> 41 <211> 4897 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Construct 1192 <400> 41
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260
aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460
ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520
tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580
cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640
aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700
tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 2760
cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820
tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880
tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940
ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000
ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt 3060
tcactgaagc gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg 3120
tgtacttgtc ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct 3180
gttcagcccc atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct 3240
acttctgctt gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt 3300
tctataagaa atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga 3360
gaaagattgt taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggcccatg gcgaaaaacg 3420
ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt tccttctcag atcttcgccg 3480
cggctcctca gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc 3540
ccaaactaac tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt 3600
gacagtgacc tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct 3660
gcagtctgac ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag 3720
cgagaccgtc acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat 3780
tgtgcccagg gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt 3840
cttcatcttc cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac 3900
gtgtgttgtg gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga 3960
tgatgtggag gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt 4020
ccgctcagtc agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagcgatc 4080
gctcaccatc accatcacca tcaccatcac cattaaaggc ctattttctt tagtttgaat 4140
ttactgttat tcggtgtgca tttctatgtt tggtgagcgg ttttctgtgc tcagagtgtg 4200
tttattttat gtaatttaat ttctttgtga gctcctgttt agcaggtcgt cccttcagca 4260
aggacacaaa aagattttaa ttttattaaa aaaaaaaaaa aaaaagaccg ggaattcgat 4320
atcaagctta tcgacctgca gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 4380
atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 4440
taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 4500
cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 4560
tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atctctagag tctcaagctt ggcgcgccca 4620
cgtgactagt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 4680
cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 4740
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgc tagagcagct 4800
tgagcttgga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg tttgacagga 4860
tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgttta 4897
<210> 42 <211> 2643 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1735
<400> 42
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggcg aaaaacgttg cgattttcgg cttattgttt tctcttcttg tgttggttcc 1320
ttctcagatc ttcgcccaga actatggcct gaacttacca atcaccggtt caatggatac 1380
cgtttacgct aattccactc aagaggggat atttctgaca agtaccctgt gcctgtatta 1440
tccaacagaa gcctctaccc agatcaatga tggggagtgg aaggatagtc tctcacagat 1500
gttcctaacc aagggctggc ccaccggttc cgtctacttc aaggaatact ctagtattgt 1560
cgacttctca gttgaccccc agctttattg cgactacaac ctggtactta tgaaatacga 1620
ccagaacctg gagctggata tgtccgagct ggctgacctg atcctcaatg agtggctgtg 1680
caaccccatg gacatcacat tatattacta ccagcagtct ggagaatcca acaagtggat 1740
cagtatgggc tcaagttgca ccgtgaaggt gtgtcccttg aacacccaaa tgctgggcat 1800
tggttgtcag acaactaatg tggattcgtt tgaaatggta gccgaaaacg agaagctggc 1860
tatagtggac gtagtcgatg ggattaacca caagatcaat ctgactacca ccacttgtac 1920
catcagaaac tgtaaaaagc tcggcccccg ggagaacgtc gccgtgatcc aggtgggggg 1980
gagcaatgtg ctcgacatta ctgccgaccc taccaccaat ccacagacgg aacggatgat 2040
gagagtcaac tggaagaaat ggtggcaggt cttttatacc attgtggact acattaacca 2100
gattgtgcaa gtcatgagta aacggtccag atccctgaac tcagcagcct tctattatcg 2160
cgtttagagg cctattttct ttagtttgaa tttactgtta ttcggtgtgc atttctatgt 2220
ttggtgagcg gttttctgtg ctcagagtgt gtttatttta tgtaatttaa tttctttgtg 2280
agctcctgtt tagcaggtcg tcccttcagc aaggacacaa aaagatttta attttattaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaagacc gggaattcga tatcaagctt atcgacctgc agatcgttca 2400
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 2460
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 2520
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 2580
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 2640
gat 2643
<210> 43 <211> 300 <212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 43
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro
20 25 30
Ile Thr Gly Ser Met Asp Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly
35 40 45
Ile Phe Leu Thr Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser
50 55 60
Thr Gln Ile Asn Asp Gly Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe
65 70 75 80
Leu Thr Lys Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser
85 90 95
Ser Ile Val Asp Phe Ser Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn
100 105 110
Leu Val Leu Met Lys Tyr Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu
115 120 125
Leu Ala Asp Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile
130 135 140
Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser
145 150 155 160
Met Gly Ser Ser Cys Thr Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met
165 170 175
Leu Gly Ile Gly Cys Gln Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val
180 185 190
Ala Glu Asn Glu Lys Leu Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn
195 200 205
His Lys Ile Asn Leu Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys
210 215 220
Lys Leu Gly Pro Arg Glu Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser
225 230 235 240
Asn Val Leu Asp Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu
245 250 255
Arg Met Met Arg Val Asn Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr
260 265 270
Ile Val Asp Tyr Ile Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser
275 280 285
Arg Ser Leu Asn Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val
290 295 300
<210> 44
<211> 4068
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220> <223>
Expression cassette number 1730
<400> 44
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggct agcctgatct acagacaact cttgaccaat tcatattctg tggatcttca 1320
tgacgaaatc gagcagattg ggtccgagaa gacccagaac gtgaccatca accctggacc 1380
ttttgctcag acccgctatg cccctgtgaa ttgggatcac ggagaaatca acgacagtac 1440
gaccgtcgaa cccattctgg acgggccata ccaacccacc accttcaccc cacctaatga 1500
ttattggatt ttaatcaact ccaacacaaa cggagtggtc tacgagtcca ctaataactc 1560
cgatttttgg accgccgttg tagccatcga gccacacgtc aatcctgtcg atcgccagta 1620
tatgatattc ggcgagtcca aacagtttaa cgtttccaat gacagcaaca aatggaagtt 1680
tctggagatg tttcgcagct cctctcagaa cgaattctat aatagacgga cccttacctc 1740
cgatacacga ctcgtgggta tttttaagta cggcggcagg gtgtggacat ttcacggtga 1800
aacccctcga gcaaccactg actccagtag cactgcaaac ctgaacaata tatctattac 1860
catccacagc gaattctaca taatcccaag atctcaggaa agtaagtgta acgaatatat 1920
caacaacgga ctccccccaa ttcagaatac acggaacgtg gtgcctctcc cactcagttc 1980
tcggtctatc cagtataaga gagcacaagt gaatgaggac attattgtga gcaagactag 2040
cctttggaaa gaaatgcagt acaacagaga cattatcatc cggtttaagt ttgggaactc 2100
tatcgtgaag atgggcggcc tggggtacaa atggtcagaa atctcatata aagccgccaa 2160
ctatcagtat aactacttga gagacggcga gcaggtaacc gcccacacaa catgctctgt 2220
caacggcgtt aataacttta gctacaacgg aggcttcctt cccaccgact tcggtatcag 2280
ccggtatgaa gtcatcaagg aaaattctta tgtgtacgta gattactggg atgatagcaa 2340
agcgttccgc aacatggtgt atgttaggag cctggctgct aatctcaatt ctgtgaagtg 2400
tactggtgga tcatattatt tctcaattcc cgtgggggct tggccagtca tgaatggcgg 2460
ggcagtctcc ctccattttg ctggcgtgac gttgagcact cagtttaccg atttcgtgtc 2520
tctgaactcc ctgaggttcc ggttttccct tactgtcgac gagcccccat tcagcattct 2580
gcgtacaaga actgtcaacc tctacgggtt acctgccgcg aatccaaaca acggcaatga 2640
atactatgaa atttcgggcc gcttctcttt gataagtctg gtaccaacta atgacgacta 2700
tcagacaccc atcatgaaca gcgtgactgt cagacaggac ctggaaagac aacttacaga 2760
tctgcgggaa gaattcaatt ctctcagtca ggagattgca atggcccaat tgatagatct 2820
tgccctactg cctctcgata tgtttagtat gttctccggc atcaaatcaa ctatagatct 2880
gacaaagagc atggctactt ctgtgatgaa gaagttcagg aaatcaaaac ttgccacgag 2940
catatcagaa atgacgaact ctctgagtga tgcagcatca tcagcgtcac gcaacgtttc 3000
cattcggtcg aatctcagcg ccatcagcaa ctggacaaac gtgtccaacg acgtcagcaa 3060
cgtgaccaac tccttgaacg atatttctac ccagacgtca acgatcagta agaaactccg 3120
cttgaaagaa atgatcaccc agactgaggg aatgtctttc gacgacattt ccgccgccgt 3180
gctaaaaacc aaaatcgata tgtctactca gatcggcaag aacactctgc cggatatcgt 3240
aaccgaagcc tccgaaaagt ttatccctaa gcgcagctac agaatattga aagatgacga 3300
ggtcatggag atcaacacag aagggaagtt cttcgcttat aagatcaaca cctttgacga 3360
ggttccgttt gacgtcaata agtttgcaga gctcgtgaca gatagtccag tgatttctgc 3420
catcattgac tttaagactt tgaagaacct gaacgacaac tatggaataa cacggaccga 3480
agcgttgaac ctcattaagt ccaatcccaa tatgttgcgc aatttcatta accagaacaa 3540
tccaatcata agaaatagga ttgagcaatt aatcctgcaa tgtaaactct gaaggcctat 3600
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 3660
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 3720
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 3840
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 3900
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 3960
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 4020
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 4068
<210> 45 <211> 2673
<212> DNA <213> Rotavirus
<400> 45
atggcatacc ggaagagagg agcaaagcgc gaaaacctgc cgcaacagaa cgagagactg 60
caagaaaaag agatagagaa agatgtcgac gtaacaatgg aaaacaagaa taacaatagg 120
aaacaacagc tgtccgacaa agttctgtcc cagaaggagg aaattatcac tgacgcccag 180
gacgatatta aaattgccgg agaaataaag aagagctcga aagaagaatc taaacagctg 240
ctcgaaattc tgaaaacaaa agaagaccat cagaaagaga ttcaatatga aattttgcaa 300
aaaacaatac ctacatttga gtccaaagaa agtatcctca agaagcttga agacataaga 360
ccggagcagg caaaaaaaca gatgaaactc tttcgcattt tcgagccaaa acagctccct 420
atatatcgcg ccaatggcga gaaggagcta cgcaaccggt ggtactggaa gttgaaaaaa 480
gacaccctgc cagatggaga ttatgacgtc cgggagtatt tcctcaatct ctatgatcag 540
atcctcatcg aaatgccgga ctatctgctc ctcaaggaca tggccgtgga gaacaaaaat 600
agcagagacg ccggcaaagt tgtcgactct gagactgcca atatttgtga tgccatcttc 660
caggatgagg agaccgaggg agtcgtccgt agattcatcg ctgatatgcg gcaacaggtc 720
caggctgatc gtaacattgt caattaccct tccatccttc accctattga tcatgcattc 780
aatgagtatt ttcttaacca ccagttggtg gagccgctga acaatgagat aatcttcaat 840
tacataccag agaggataag gaatgacgtg aattacatcc tgaacatgga tatgaatctg 900
ccatctacag ccaggtatat caggccaaac ttgttgcagg atagactgaa tcttcacgat 960
aattttgagt ccctgtggga taccatcaca acatccaact acattctggc caggtccgtc 1020
gttcccgatt tgaaggagaa ggagctggtc tccaccgaag cacagatcca gaaaatgagc 1080
caggacctgc agctggaggc cctcactatt cagagcgaga cacagttttt agccgggatt 1140
aacagtcagg ctgccaatga ttgtttcaag accctcatag ccgccatgct gtctcaaaga 1200
accatgtctt tggactttgt gaccacgaac tatatgagcc taatctccgg aatgtggcta 1260
cttacagtga ttcccaacga tatgttcctc cgggagtcac tagtggcctg tgagctggcg 1320
atcatcaaca ccatcgtgta tccagcattc ggaatgcaga gaatgcatta ccggaatggc 1380
gaccctcaga cacccttcca gatcgcagaa cagcagatcc agaatttcca ggtggcgaac 1440
tggctccatt ttattaacaa taacagattc aggcaagttg tgattgatgg agttctgaat 1500
cagactctga acgacaatat acggaatgga caggtcatca accagctgat ggaagcattg 1560
atgcaactca gcagacagca gttccccacg atgcctgtgg attacaaacg gagcatccaa 1620
cggggcattc tgcttctctc caataggctg gggcagcttg tcgacttaac ccgactggtc 1680
tcctataact acgagacgct aatggcttgt gtgaccatga acatgcagca cgtgcaaacc 1740
ctgacaactg agaagttgca gctcacttct gtgacttcgc tttgtatgtt aattggtaac 1800
acaaccgtga ttccgtcccc acagacactg ttccactact acaacatcaa cgtgaatttc 1860
cactccaatt ataatgagcg gatcaacgac gccgtcgcca taattaccgc agcaaatagg 1920
ctgaatcttt atcagaaaaa aatgaagtcc atagtggaag actttctgaa acggctccag 1980
attttcgacg taccacgagt gcctgacgac caaatgtaca ggctgaggga tcgccttcgg 2040
ctcttacccg ttgaacggag acggcttgac atattcaact tgatcctgat gaatatggag 2100
cagatcgaac gcgcttctga taagattgct cagggggtta tcatcgcata ccgagatatg 2160
cagctggaac gcgacgagat gtacggatat gttaatattg cacggaatct tgatggctac 2220
cagcaaatta acttggagga actcatgcgc accggtgatt acggacaaat tacgaacatg 2280
cttctcaaca atcaacccgt tgcccttgtg ggtgcattgc ccttcgttac ggactcatcc 2340
gtgatcagtc taatcgccaa gctcgacgca accgtcttcg ctcagatagt gaagctcagg 2400
aaagttgaca cactgaagcc catactgtac aaaataaact cggattccaa tgacttttac 2460
cttgtggcca actacgactg gatccccaca agtacaacta aggtctacaa acaggtgcca 2520
caaccattcg actttagagc cagcatgcac atgctgactt ctaaccttac gtttaccgtc 2580
tactctgacc tactgtcatt tgtttcagcg gacacggtag agcccattaa cgcagtcgca 2640
ttcgacaata tgcgaataat gaacgagctt taa 2673
<210> 46 <211> 1194 <212> DNA
<213> Rotavirus
<400> 46
atggaggtcc tttatagtct ctccaaaacg ctgaaggacg ctagggacaa gatcgtggag 60
ggtacacttt atagcaatgt cagcgaccta atacagcagt ttaatcaaat gatcgttaca 120
atgaatggga atgatttcca aactggcggt attggtaatc tgcccgtgag gaactggaca 180
ttcgatttcg gcctgctggg cacgactctc cttaatctcg atgcaaatta tgtagaaaac 240
gccagaacga ttatcgagta ctttatcgat ttcattgata acgtttgtat ggatgagatg 300
gcccgcgagt cacaacggaa cggagttgct ccacagtccg aggcccttcg gaaactcgcc 360
ggcattaagt tcaagcgtat taatttcgac aactcctccg aatatataga gaactggaac 420
ttgcagaatc gtcgacagag aaccggcttc gtgttccata aacctaatat ctttccgtat 480
agcgcctcat tcaccctgaa taggagtcag cccatgcacg acaacctcat gggtacaatg 540
tggctgaatg cggggagtga aatacaggtc gccgggttcg attactcctg tgccattaat 600
gcacccgcaa acatccagca gttcgaacat atcgtgcaac taagacgggc tctcacgacc 660
gcgacaatta cactcctgcc cgacgccgag cgcttctcct ttccccgcgt aatcaactca 720
gctgatggcg ccaccacttg gttcttcaac cctgttatat tgcgccctaa caacgtagag 780
gtggagtttc tcttaaacgg acagatcatc aatacctacc aagccaggtt cggcacgatt 840
attgcaagaa atttcgacgc tatcaggctg ctcttccaac tgatgaggcc ccccaatatg 900
actcccgctg tgaacgcttt gtttccgcag gctcagcctt tccagcacca cgccaccgtc 960
ggcttgactc ttcgaataga gagcgcggtc tgcgaatcag tgctggcaga cgccaacgag 1020
acgctgctgg caaacgttac cgccgtgcgg caagagtatg ccatcccagt agggcctgtg 1080
tttccacccg gcatgaactg gactgaacta attactaact atagcccatc cagagaagac 1140
aacttgcagc gggtcttcac tgtggcctct atccggagta tgttgatcaa gtag 1194
<210> 47 <211> 2328 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Optimized coding sequence of Rotavirus A VP4 from strain RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
<400> 47
atggctagcc tgatctacag acaactcttg accaattcat attctgtgga tcttcatgac 60
gaaatcgagc agattgggtc cgagaagacc cagaacgtga ccatcaaccc tggacctttt 120
gctcagaccc gctatgcccc tgtgaattgg gatcacggag aaatcaacga cagtacgacc 180
gtcgaaccca ttctggacgg gccataccaa cccaccacct tcaccccacc taatgattat 240
tggattttaa tcaactccaa cacaaacgga gtggtctacg agtccactaa taactccgat 300
ttttggaccg ccgttgtagc catcgagcca cacgtcaatc ctgtcgatcg ccagtatatg 360
atattcggcg agtccaaaca gtttaacgtt tccaatgaca gcaacaaatg gaagtttctg 420
gagatgtttc gcagctcctc tcagaacgaa ttctataata gacggaccct tacctccgat 480
acacgactcg tgggtatttt taagtacggc ggcagggtgt ggacatttca cggtgaaacc 540
cctcgagcaa ccactgactc cagtagcact gcaaacctga acaatatatc tattaccatc 600
cacagcgaat tctacataat cccaagatct caggaaagta agtgtaacga atatatcaac 660
aacggactcc ccccaattca gaatacacgg aacgtggtgc ctctcccact cagttctcgg 720
tctatccagt ataagagagc acaagtgaat gaggacatta ttgtgagcaa gactagcctt 780
tggaaagaaa tgcagtacaa cagagacatt atcatccggt ttaagtttgg gaactctatc 840
gtgaagatgg gcggcctggg gtacaaatgg tcagaaatct catataaagc cgccaactat 900
cagtataact acttgagaga cggcgagcag gtaaccgccc acacaacatg ctctgtcaac 960
ggcgttaata actttagcta caacggaggc ttccttccca ccgacttcgg tatcagccgg 1020
tatgaagtca tcaaggaaaa ttcttatgtg tacgtagatt actgggatga tagcaaagcg 1080
ttccgcaaca tggtgtatgt taggagcctg gctgctaatc tcaattctgt gaagtgtact 1140
ggtggatcat attatttctc aattcccgtg ggggcttggc cagtcatgaa tggcggggca 1200
gtctccctcc attttgctgg cgtgacgttg agcactcagt ttaccgattt cgtgtctctg 1260
aactccctga ggttccggtt ttcccttact gtcgacgagc ccccattcag cattctgcgt 1320
acaagaactg tcaacctcta cgggttacct gccgcgaatc caaacaacgg caatgaatac 1380
tatgaaattt cgggccgctt ctctttgata agtctggtac caactaatga cgactatcag 1440
acacccatca tgaacagcgt gactgtcaga caggacctgg aaagacaact tacagatctg 1500
cgggaagaat tcaattctct cagtcaggag attgcaatgg cccaattgat agatcttgcc 1560
ctactgcctc tcgatatgtt tagtatgttc tccggcatca aatcaactat agatctgaca 1620
aagagcatgg ctacttctgt gatgaagaag ttcaggaaat caaaacttgc cacgagcata 1680
tcagaaatga cgaactctct gagtgatgca gcatcatcag cgtcacgcaa cgtttccatt 1740
cggtcgaatc tcagcgccat cagcaactgg acaaacgtgt ccaacgacgt cagcaacgtg 1800
accaactcct tgaacgatat ttctacccag acgtcaacga tcagtaagaa actccgcttg 1860
aaagaaatga tcacccagac tgagggaatg tctttcgacg acatttccgc cgccgtgcta 1920
aaaaccaaaa tcgatatgtc tactcagatc ggcaagaaca ctctgccgga tatcgtaacc 1980
gaagcctccg aaaagtttat ccctaagcgc agctacagaa tattgaaaga tgacgaggtc 2040
atggagatca acacagaagg gaagttcttc gcttataaga tcaacacctt tgacgaggtt 2100
ccgtttgacg tcaataagtt tgcagagctc gtgacagata gtccagtgat ttctgccatc 2160
attgacttta agactttgaa gaacctgaac gacaactatg gaataacacg gaccgaagcg 2220
ttgaacctca ttaagtccaa tcccaatatg ttgcgcaatt tcattaacca gaacaatcca 2280
atcataagaa ataggattga gcaattaatc ctgcaatgta aactctga 2328
<210> 48 <211> 981 <212> DNA
<213> Rotavirus
<400> 48
atgtacggca tcgagtatac aacaatttta attttcctga tttccatcat tctgttaaac 60
tacatcctta agtccgtgac cagaattatg gattatatta tctatcgtag cctcctcatc 120
tacgtggccc tttttgccct gaccagggcc cagaactatg gcctgaactt accaatcacc 180
ggttcaatgg ataccgttta cgctaattcc actcaagagg ggatatttct gacaagtacc 240
ctgtgcctgt attatccaac agaagcctct acccagatca atgatgggga gtggaaggat 300
agtctctcac agatgttcct aaccaagggc tggcccaccg gttccgtcta cttcaaggaa 360
tactctagta ttgtcgactt ctcagttgac ccccagcttt attgcgacta caacctggta 420
cttatgaaat acgaccagaa cctggagctg gatatgtccg agctggctga cctgatcctc 480
aatgagtggc tgtgcaaccc catggacatc acattatatt actaccagca gtctggagaa 540
tccaacaagt ggatcagtat gggctcaagt tgcaccgtga aggtgtgtcc cttgaacacc 600
caaatgctgg gcattggttg tcagacaact aatgtggatt cgtttgaaat ggtagccgaa 660
aacgagaagc tggctatagt ggacgtagtc gatgggatta accacaagat caatctgact 720
accaccactt gtaccatcag aaactgtaaa aagctcggcc cccgggagaa cgtcgccgtg 780
atccaggtgg gggggagcaa tgtgctcgac attactgccg accctaccac caatccacag 840
acggaacgga tgatgagagt caactggaag aaatggtggc aggtctttta taccattgtg 900
gactacatta accagattgt gcaagtcatg agtaaacggt ccagatccct gaactcagca 960
gccttctatt atcgcgttta g 981
<210> 49 <211> 903 <212> DNA
<213> Rotavirus
<400> 49
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cccagaacta tggcctgaac ttaccaatca ccggttcaat ggataccgtt 120
tacgctaatt ccactcaaga ggggatattt ctgacaagta ccctgtgcct gtattatcca 180
acagaagcct ctacccagat caatgatggg gagtggaagg atagtctctc acagatgttc 240
ctaaccaagg gctggcccac cggttccgtc tacttcaagg aatactctag tattgtcgac 300
ttctcagttg acccccagct ttattgcgac tacaacctgg tacttatgaa atacgaccag 360
aacctggagc tggatatgtc cgagctggct gacctgatcc tcaatgagtg gctgtgcaac 420
cccatggaca tcacattata ttactaccag cagtctggag aatccaacaa gtggatcagt 480
atgggctcaa gttgcaccgt gaaggtgtgt cccttgaaca cccaaatgct gggcattggt 540
tgtcagacaa ctaatgtgga ttcgtttgaa atggtagccg aaaacgagaa gctggctata 600
gtggacgtag tcgatgggat taaccacaag atcaatctga ctaccaccac ttgtaccatc 660
agaaactgta aaaagctcgg cccccgggag aacgtcgccg tgatccaggt gggggggagc 720
aatgtgctcg acattactgc cgaccctacc accaatccac agacggaacg gatgatgaga
780
gtcaactgga agaaatggtg gcaggtcttt tataccattg tggactacat taaccagatt
840
gtgcaagtca tgagtaaacg gtccagatcc ctgaactcag cagccttcta ttatcgcgtt
900
tag
903
<210> 50 <211> 2331 <212> DNA
<213> Rotavirus
<400> 50
atggcttcgc tcatttatag acaattgctc acgaattctt atacagtaga tttatccgat 60
gagatacaag agattggatc aactaaatca caaaatgtca caattaatcc tggaccattt 120
gcgcaaacag gttatgctcc agttaactgg ggacctggag aaattaatga ttctacgaca 180
gttgaaccat tgctggatgg gccttatcaa ccaacgacat tcaatccacc agtcgattat 240
tggatgttac tggctccaac gacacctggc gtaattgttg aaggtacaaa taatacagat 300
agatggttag ccacaatttt aatcgagcca aatgttcagt ctgaaaatag aacttacact 360
atatttggta ttcaagaaca attaacggta tccaatactt cacaagacca gtggaaattt 420
attgatgtcg taaaaacaac tgcaaatgga agtataggac aatatggacc attactatcc 480
agtccgaaat tatatgcagt tatgaagcat aatgaaaaat tatatacata tgaaggacag 540
acacctaacg ctaggacagc acattattca acaacgaatt atgattctgt taatatgact 600
gctttttgtg acttttatat aattcctaga tctgaagagt ctaaatgtac ggaatacatt 660
aataatggat taccaccaat acaaaatact agaaatgttg taccattatc gttgactgct 720
agagatgtaa tacactatag agctcaagct aatgaagata ttgtgatatc caagacatca 780
ttgtggaaag aaatgcaata taatagagat ataactatta gatttaaatt tgcaaataca 840
attataaaat caggagggct gggatataag tggtcagaaa tatcatttaa gccagcgaat 900
tatcaataca catatactcg tgatggtgaa gaagttaccg cacatactac ttgttcagtg 960
aatggcgtta atgacttcag ttttaatgga ggatatttac caactgattt tgttgtatct 1020
aaatttgaag taattaaaga gaattcatac gtctatatcg attactggga tgattcacaa 1080
gcatttcgta acgtggtgta tgtccgatcg ttagcagcaa acttgaattc agttatgtgt 1140
actggaggca gctataattt tagtctacca gttggacaat ggcctgtttt aactggggga 1200
gcagtttctt tacattcagc tggtgtaaca ctatctactc aatttacaga tttcgtatca 1260
ttaaattcat taagatttag atttagacta gctgtcgaag aaccacactt taaactgact 1320
agaactagat tagatagatt gtatggtctg cctgctgcag atccaaataa tggtaaagaa 1380
tattatgaaa ttgctggacg attttcactt atatcattag tgccatcaaa tgatgactat 1440
cagactccta tagcaaactc agttactgta cgacaagatt tagaaaggca gttaggagaa 1500
ctaagagaag agtttaacgc tttgtctcaa gaaattgcaa tgtcgcagtt aatcgattta 1560
gcgcttctac cattagatat gttctcaatg ttttctggca ttaaaagtac tattgatgct 1620
gcaaaatcaa tggctactaa tgttatgaaa aaattcaaaa agtcaggatt agcgaattca 1680
gtttcaacac tgacagattc tttatcagac gcagcatcat caatatcaag aggttcatct 1740
atacgttcga ttggatcttc agcatcagca tggacggatg tatcaacaca aataactgat 1800
atatcgtcat cagtaagttc agtttcgaca caaacgtcaa ctatcagtag aagattgaga 1860
ctaaaggaaa tggcaacaca aactgagggt atgaattttg atgatatatc agcggctgtt 1920
ttgaagacta agatagataa atcgactcaa atatcaccaa acacaatacc tgacattgtt 1980
actgaagcat cggaaaaatt cataccaaat agggcttacc gtgttataaa caacgatgat 2040
gtgtttgaag ctggaattga tggaaaattt tttgcttata aagtggatac atttgaggaa 2100
ataccatttg atgtacaaaa attcgctgac ttagttacag attctccagt aatatccgct 2160
ataattgatt ttaaaacact taaaaatttg aacgataatt acggcattac taagcaacaa 2220
gcatttaatc ttttaagatc tgacccaaga gttttacgtg aattcattaa tcaggacaat 2280
cctataatta gaaatagaat tgaacaactg attatgcaat gcaggttgtg a 2331
<210> 51 <211> 2331 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Optimized coding sequence of Rotavirus A VP4 from strain
RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2 <400> 51
atggcttcat tgatatatcg ccagttgctg actaatagct atactgtgga tttgtcagac 60
gaaatccagg aaataggatc cacaaagagt cagaacgtga ccataaaccc cggaccgttc 120
gcccagactg ggtatgcccc cgtaaactgg ggccccggcg agattaacga cagcaccacc 180
gtggagccac tgctggatgg accctaccaa cccactactt ttaatcctcc agtggactac 240
tggatgttgt tggctcccac gacacctggt gtaattgtag agggcaccaa caataccgat 300
cgctggctgg cgacaatact gatagaaccc aacgtgcagt ccgagaacag aacctatacc 360
attttcggca tccaggaaca gctaaccgtg agcaatacga gccaggacca gtggaagttt 420
atcgatgtag tgaaaactac ggccaatgga tctatcgggc aatacgggcc gctgctgtcc 480
tcacctaagc tctacgccgt gatgaaacat aatgagaaac tgtacactta cgagggccaa 540
acccccaatg ccagaactgc ccactacagt acaaccaact atgactcggt gaacatgaca 600
gcgttctgtg atttttatat tattccaaga tcagaagaat ccaagtgtac tgagtacatc 660
aacaatggac ttccacccat ccagaacact cgaaatgtcg tcccactgtc tctaactgct 720
cgggatgtga tccactatcg cgcccaagct aatgaggata tagtcatttc aaagacgagc 780
ttatggaagg aaatgcagta taacagagac atcacaatca ggttcaagtt cgccaatact 840
attattaagt ccgggggact ggggtacaaa tggagtgaga tcagttttaa gcccgctaac 900
tatcagtaca cctatactcg cgacggcgaa gaggtaaccg cccacacaac ttgctcggtt 960
aatggcgtga acgattttag cttcaacggg ggctacctgc ctactgattt cgtggtgagc 1020
aagtttgaag tcatcaagga aaattcctac gtgtatattg actactggga tgatagccag 1080
gccttccgaa atgttgtgta tgttagatca ctggccgcaa accttaattc agtcatgtgc 1140
acaggaggtt cttacaattt tagtcttccc gtcgggcagt ggccagtgct cacagggggc 1200
gctgtgagct tgcattccgc cggagtcacc ttgagtactc agttcacaga ctttgtgtct 1260
ctgaatagcc taaggttcag gtttagactt gcagtagaag agcctcactt taagctcact 1320
cgtacgaggc tggatcggct gtacggcctg ccggccgctg atcccaataa cggcaaggaa 1380
tattacgaga tagccgggag attttcgctg atcagtctgg tgccgtcaaa cgatgattac 1440
cagaccccaa ttgccaacag tgtcactgtc aggcaagatc tggagagaca acttggcgag 1500
ctgagagagg agttcaacgc cctgtctcaa gagatcgcaa tgtctcagct cattgacctg 1560
gccctgttac ccctcgacat gttctcaatg ttctccggca taaaatccac tatcgacgct 1620
gcaaagtcca tggccacaaa tgtgatgaag aagtttaaga agagcggtct ggcaaatagc 1680
gtgtctacgc tgaccgatag tttgtcggat gccgccagtt ccattagccg tggatccagc 1740
attaggtcca ttggctcttc cgcctctgct tggactgacg tgagtacaca gataactgac 1800
atttcctctt ctgtctccag tgtgagcaca caaacttcca cgatatcaag acgactgagg 1860
ctcaaagaga tggcaacgca aacggaaggt atgaattttg atgacatcag cgccgcagtt 1920
ttgaagacaa agatcgataa aagcactcaa attagcccca atacgatccc tgacattgtg 1980
actgaggcat ctgaaaagtt cattcccaac cgtgcttatc gggtcattaa caatgatgat 2040
gtcttcgagg ccggcatcga tggcaagttt tttgcttata aagtggatac cttcgaggag 2100
attcctttcg atgtacagaa gtttgctgac ctcgtaacgg atagcccagt gataagcgcc 2160
attatagact tcaaaacatt gaaaaatttg aacgataatt atggtattac caagcagcag 2220
gcttttaact tgttaagatc tgaccctcgc gtgctcagag agtttattaa ccaggacaac 2280
cccatcatca gaaacaggat cgagcagctg attatgcagt gtcgcctgta a 2331
<210> 52 <211> 981
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> Coding sequence of Rotavirus A VP7 from strain RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/19 58/G3P5B[2]
<400> 52
atgtatggta ttgaatatac cacagttcta acctttctga tatcgattat tctactaaat 60
tacatactta aatcattaac tagaataatg gactttataa tttatagatt tctttttata 120
attgtgatat tgtcaccatt tctcagagca caaaattatg gtattaatct tccaatcaca 180
ggctccatgg acactgcata cgctaattca acgcaagaag aaacattcct cacttctaca 240
ctttgcctat attatccgac tgaggctgcg actgaaataa acgataattc atggaaagac 300
acactgtcac aactatttct tacgaaaggg tggccaactg gatccgtata ttttaaagaa 360
tatactaaca ttgcatcgtt ttctgttgat ccgcagttgt attgtgatta taacgtagta 420
ctaatgaaat atgacgcgac gttgcaattg gatatgtcag aacttgcgga tctaatatta 480
aacgaatggt tgtgtaatcc aatggatatt actctgtatt attatcagca aactgacgaa 540
gcgaataaat ggatatcaat gggctcatca tgtacaatta aagtatgtcc acttaataca 600
caaactcttg gaattggatg cttgacaact gatgctacaa cttttgaaga agttgcgaca 660
gctgaaaagt tggtaattac tgacgtggtt gatggcgtta atcataagct ggatgtcaca 720
acagcaacgt gtactattag aaactgtaag aaattgggac caagagaaaa cgtagccgtt 780
atacaagttg gtggttctga catcctcgat ataactgctg atccaactac tgcaccacag 840
acagaacgga tgatgcgaat taactggaaa aaatggtggc aagtttttta tactgtagta 900
gactatgtag atcagataat acaagttatg tccaaaagat caagatcact aaattcagca 960
gcattttatt acagagtgta g 981
<210> 53 <211> 981 <212> DNA
<213> Rotavirus
<400> 53
atgtacggaa tcgagtatac caccgttctg acatttctta ttagtattat cctcttgaac 60
tatattctga agtcacttac ccggataatg gattttatta tatataggtt tctgttcatc 120
attgtaattc tgagcccttt cctgagggcc cagaattacg gcataaacct accaatcacc 180
ggttctatgg ataccgctta tgctaactct acacaagagg agacattcct cacatcaacc 240
ctatgcctgt actatccgac tgaagcagcc acagagataa acgataactc ttggaaagat 300
acattgagcc agctcttcct gactaaggga tggcccaccg gatcggtcta ctttaaggag 360
tacacaaaca tcgcaagttt cagcgtggat ccccagctgt attgtgatta taacgttgtg 420
ctgatgaaat acgacgcaac cctccagctt gacatgagcg agttggcaga cctaatcctc 480
aatgagtggc tgtgtaaccc aatggatata acactgtact attatcagca gaccgatgaa 540
gcaaacaaat ggatttcaat gggaagcagc tgtaccatca aagtttgtcc tctcaacacc
600
caaactctcg gcatagggtg tctgaccaca gacgctacta cctttgaaga agttgcgacc
660
gcggaaaagc tggttatcac agatgtggta gatggcgtta accacaaatt ggacgtaacc
720
acagcaacat gcacaattag gaactgcaag aagctaggac ccagggaaaa cgtagccgtc
780
atccaagtgg gcggcagtga catcctagac atcaccgcag acccaacaac agcaccacaa
840
accgagagga tgatgcgcat taattggaag aaatggtggc aggtgtttta cactgtcgtt
900
gactatgtgg accagatcat tcaggtgatg agcaagcgga gtcgctcatt gaatagtgct
960
gccttttatt acagagtcta a
981
<210> 54 <211> 981 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Optimized coding sequence of Rotavirus A VP7
<400> 54
atgtacggca tcgagtatac aacaatttta attttcctga tttccatcat tctgttaaac 60
tacatcctta agtccgtgac cagaattatg gattatatta tctatcgtag cctcctcatc 120
tacgtggccc tttttgccct gaccagggcc cagaactatg gcctgaactt accaatcacc 180
ggttcaatgg ataccgttta cgctaattcc actcaagagg ggatatttct gacaagtacc 240
ctgtgcctgt attatccaac agaagcctct acccagatca atgatgggga gtggaaggat 300
agtctctcac agatgttcct aaccaagggc tggcccaccg gttccgtcta cttcaaggaa 360
tactctagta ttgtcgactt ctcagttgac ccccagcttt attgcgacta caacctggta 420
cttatgaaat acgaccagaa cctggagctg gatatgtccg agctggctga cctgatcctc 480
aatgagtggc tgtgcaaccc catggacatc acattatatt actaccagca gtctggagaa 540
tccaacaagt ggatcagtat gggctcaagt tgcaccgtga aggtgtgtcc cttgaacacc 600
caaatgctgg gcattggttg tcagacaact aatgtggatt cgtttgaaat ggtagccgaa 660
aacgagaagc tggctatagt ggacgtagtc gatgggatta accacaagat caatctgact 720
accaccactt gtaccatcag aaactgtaaa aagctcggcc cccgggagaa cgtcgccgtg 780
atccaggtgg gggggagcaa tgtgctcgac attactgccg accctaccac caatccacag 840
acggaacgga tgatgagagt caactggaag aaatggtggc aggtctttta taccattgtg 900
gactacatta accagattgt gcaagtcatg agtaaacggt ccagatccct gaactcagca 960
gccttctatt atcgcgttta g 981
<210>
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c
<400> 55
aaatttgtcg ggcccatgga ttatattatc tatcgtagcc tcctcatcta 50
<210> 56
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r
<400> 56
actaaagaaa ataggcctct aaacgcgata atagaaggct gctgagttca ggga 54
<210> 57
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Optimized coding sequence of Rotavirus A VP7 from strain
RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] <400> 57
atgtacggca tcgagtatac aacaatttta attttcctga tttccatcat tctgttaaac 60
tacatcctta agtccgtgac cagaattatg gattatatta tctatcgtag cctcctcatc 120
tacgtggccc tttttgccct gaccagggcc cagaactatg gcctgaactt accaatcacc 180
ggttcaatgg ataccgttta cgctaattcc actcaagagg ggatatttct gacaagtacc 240
ctgtgcctgt attatccaac agaagcctct acccagatca atgatgggga gtggaaggat 300
agtctctcac agatgttcct aaccaagggc tggcccaccg gttccgtcta cttcaaggaa 360
tactctagta ttgtcgactt ctcagttgac ccccagcttt attgcgacta caacctggta 420
cttatgaaat acgaccagaa cctggagctg gatatgtccg agctggctga cctgatcctc 480
aatgagtggc tgtgcaaccc catggacatc acattatatt actaccagca gtctggagaa 540
tccaacaagt ggatcagtat gggctcaagt tgcaccgtga aggtgtgtcc cttgaacacc 600
caaatgctgg gcattggttg tcagacaact aatgtggatt cgtttgaaat ggtagccgaa 660
aacgagaagc tggctatagt ggacgtagtc gatgggatta accacaagat caatctgact 720
accaccactt gtaccatcag aaactgtaaa aagctcggcc cccgggagaa cgtcgccgtg 780
atccaggtgg gggggagcaa tgtgctcgac attactgccg accctaccac caatccacag 840
acggaacgga tgatgagagt caactggaag aaatggtggc aggtctttta taccattgtg 900
gactacatta accagattgt gcaagtcatg agtaaacggt ccagatccct gaactcagca 960
gccttctatt atcgcgttta g 981
<210> 58 <211> 2634 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Expression cassette number 1734
<400> 58
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggat tatattatct atcgtagcct cctcatctac gtggcccttt ttgccctgac 1320
cagggcccag aactatggcc tgaacttacc aatcaccggt tcaatggata ccgtttacgc 1380
taattccact caagagggga tatttctgac aagtaccctg tgcctgtatt atccaacaga 1440
agcctctacc cagatcaatg atggggagtg gaaggatagt ctctcacaga tgttcctaac 1500
caagggctgg cccaccggtt ccgtctactt caaggaatac tctagtattg tcgacttctc 1560
agttgacccc cagctttatt gcgactacaa cctggtactt atgaaatacg accagaacct 1620
ggagctggat atgtccgagc tggctgacct gatcctcaat gagtggctgt gcaaccccat 1680
ggacatcaca ttatattact accagcagtc tggagaatcc aacaagtgga tcagtatggg 1740
ctcaagttgc accgtgaagg tgtgtccctt gaacacccaa atgctgggca ttggttgtca 1800
gacaactaat gtggattcgt ttgaaatggt agccgaaaac gagaagctgg ctatagtgga 1860
cgtagtcgat gggattaacc acaagatcaa tctgactacc accacttgta ccatcagaaa 1920
ctgtaaaaag ctcggccccc gggagaacgt cgccgtgatc caggtggggg ggagcaatgt 1980
gctcgacatt actgccgacc ctaccaccaa tccacagacg gaacggatga tgagagtcaa 2040
ctggaagaaa tggtggcagg tcttttatac cattgtggac tacattaacc agattgtgca 2100
agtcatgagt aaacggtcca gatccctgaa ctcagcagcc ttctattatc gcgtttagag 2160
gcctattttc tttagtttga atttactgtt attcggtgtg catttctatg tttggtgagc 2220
ggttttctgt gctcagagtg tgtttatttt atgtaattta atttctttgt gagctcctgt 2280
ttagcaggtc gtcccttcag caaggacaca aaaagatttt aattttatta aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaagac cgggaattcg atatcaagct tatcgacctg cagatcgttc aaacatttgg 2400
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2460
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2520
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2580
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agat 2634
<210> 59 <211> 297 <212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 59
Met Asp Tyr Ile Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ala Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Thr Arg Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro Ile Thr Gly
20 25 30
Ser Met Asp Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly Ile Phe Leu
35 40 45
Thr Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile
50 55 60
Asn Asp Gly Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val
85 90 95
Asp Phe Ser Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Leu Val Leu
100 105 110
Met Lys Tyr Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp
115 120 125
Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr
130 135 140
Tyr Tyr Gln Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser
145 150 155 160
Ser Cys Thr Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met Leu Gly Ile
165 170 175
Gly Cys Gln Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val Ala Glu Asn
180 185 190
Glu Lys Leu Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn His Lys Ile
195 200 205
Asn Leu Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly
210 215 220
Pro Arg Glu Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu Arg Met Met
245 250 255
Arg Val Asn Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp
260 265 270
Tyr Ile Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu
275 280 285
Asn Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 290 295
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регулятор-ную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, где каждый из VP2, VP6 и VP7 введен в растение, часть растения или клетку растения, где первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид из растительного полипептида;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения, для временной экспрессии первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7;
c) сбор растения, части растения или клетки растения и
d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии иона кальция (Са2+).
2. Способ по п.1, при котором четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регулятор-ную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, вводят в растение, часть растения или клетку растения на стадии а) и экспрессируют при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии b), причем четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP4.
3. Способ по п.1, при котором первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты вводят в растение, часть растения или клетку растения в пропорции 1:1:1.
4. Способ по п.2, при котором первую, вторую, третью и четвертую нуклеиновые кислоты вводят в растение, часть растения или клетку растения в пропорции 1:1:1:1.
5. Способ по п.1 или 2, при котором использование кодонов нуклеотидной последовательности доводят до предпочтительного использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации.
6. Способ по п.1, в котором первая, вторая и третья нуклеотидная последовательность функционально связана с энхансером трансляции.
7. Способ по п.6, в котором энхансер трансляции включает регуляторную область вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
8. Способ по п.1, при котором первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
9. Способ по п.2, при котором первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего
гороха (CPMV).
10. Способ по п.1, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57.
11. Способ по п.2, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, на 80-100% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или
51.
12. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п.1 или 2, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм.
13. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п.12 для индуцирования иммунного ответа к ротавирусной инфекции у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий:
12.
a) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, содержащую третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растении, части растения или клетке растения;
причем первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP7, причем VP7 содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид из растительного полипептида;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения для временной экспрессии первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7;
c) сбор растения, части растения или клетки растения и
d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии иона кальция (Са2+).
15. Способ по п.14, где растение, часть растения или клетка растения включает четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, причем четвертый ротавирусный структурный белок экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии b), причем четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP4.
16. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п.14 или 15, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм.
17. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п.16 для индуцирования иммунного ответа к ротавирусной инфекции у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель.
18. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п.17.
19. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п.13.
20. Способ по п.1 или 2, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI).
21. Способ по п.14 или 15, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI).
22. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регулятор-ную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, выбранный из одного из VP2, VP6 и VP7, где каждый из VP2, VP6 и VP7 введен в растение, часть растения или клетку растения, где первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, содержит усеченный нативный сигнальный пептид или ненативный сигнальный пептид;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP, где RLP содержит VP2, VP6 и VP7;
c) сбор растения, части растения или клетки растения и
d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения.
Средний Внутренний Средний Внутренний капсид кипсид капсид - капсид
Сегмент 1 Сегмент 2 Сегмент 3 Сегмент 4 Сегмент 5 Сегмент 6 Сегмент 7 Сегмент 8 Сегмент 9 Сегмент К) Сегмент 1 1
,.1Ж
сегмент дцРНК
Белок
VP1 VP? VPS VP4
Фиг. 1
-¦ Г- . ", NSP3
Антагонист OciilllOUKil
.gi интерферона l,5^l^l1,1l11."1
/ Дппамип ивпепмып
Tp;in
ЭПДОЦИТО)
I > < i:i i '.III-A I;I
mis VP4
II - -
Транскрипция
/ Сборки
HI 1ЧОН
Фиг. 2
pTRAc
В^ЗЬр
цитоплазма
хлоропласт
J1' pTRAkc-ERH/A f" ' 'Z
ER/апопласт
Фиг. 3
Ротавирусная кДНК
^Трансформация в Е. coli
Трансформация в Agrobacterium
Экстракция - 2 листовых диска 7-дневный
или целое растение исследования
Фиг. 4
период
Ai роппфплы рация рокомоинат ны\ Agi o bacterium путем инъекции или вакуума
-клеточная стенка -клеточная мембрана
-апопласт "цитозоль
Белки, экспрессированные в, цитозоле, направляются к апопласту
Белки сохраняются и
^1 накапливаются в апопласте
Фиг. 5
День
1 3_
1 ~1
День
1 3 5 7
кДа
70 55 ¦ 40|"
кДа
7." Ь5 4-
Цитоплазма
День
кДа
кДа
70 55
40!.
Хлоропласты
70 55 40
^ mi & т
¦\iioii.iaci
М +ve 2
6 7
(а)
кДа
1зо': юо ¦
70 55
40,:
Фиг. 7
кДа
130 100
.у? -fyA + - ¦" . ¦
VP2
М +> /е ле сТр ER oTR^c А VP4
Фиг. 8
a D Фиг. 15
Ротавирусный VP2
Название гена: 9P6_VP2 Длина гена: 2700 п.н.
Оптимизирован для экспрессии в: Nicotiana tabacum
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTCCATGGCTTACCGTAAAAGGGGTGCTAGGCGTGAA
I + + + + + +
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAAGGTACCGAATGGCATTTTCCCCACGATCCGCACTT
SEQ ID N0:1 G R V R S M A Y R К R G A R R E
GCTAACCTCAACAACAACGATAGGATGCAAGAGAAGATCGATGAGAAGCAGGATTCCAAC
61 + + + + + +
CGATTGGAGTTGTTGTTGCTATCCTACGTTCTCTTCTAGCTACTCTTCGTCCTAAGGTTG
A N L N N N D R_M_Q E К I D E К Q D S_N_
AAGATCCAGCTCTCCGATAAGGTGCTCTCCAAGAAAGAAGAGATCGTTACTGATTCCCAC
121 + + + + + +
TTCTAGGTCGAGAGGCTATTCCACGAGAGGTTCTTTCTTCTCTAGCAATGACTAAGGGTG
К I Q L S D K_V_L S К К E E I_V_T D S H
GAAGAGGTGAAGGTGACAGATGAGCTTAAGAAGTCCACAAAAGAAGAGTCCAAGCAGCTC
181 + + + + + +
CTTCTCCACTTCCACTGTCTACTCGAATTCTTCAGGTGTTTTCTTCTCAGGTTCGTCGAG
E E V К V T D E L К К S T К E E S К Q L
CTTGAGGTGCTCAAGACAAAAGAGGAACACCAGAAAGAGATCCAGTACGAGATCCTCCAA
241 + + + + + +
GAACTCCACGAGTTCTGTTTTCTCCTTGTGGTCTTTCTCTAGGTCATGCTCTAGGAGGTT
L E V L К T К E E H Q К E I Q Y E I L Q
AAGACTATCCCAACTTTCGAGCCAAAAGAGACTATCCTCAGGAAGCTTGAGGATATCCAG
301 + + + + + +
TTCTGATAGGGTTGAAAGCTCGGTTTTCTCTGATAGGAGTCCTTCGAACTCCTATAGGTC
К T I P T F E P К E T I L R К L E D I Q
CCAGAGCTTGCTAAGAAGCAGACTAAGCTCTTCAGGATCTTCGAGCCAAAGCAGCTCCCA
361 + + + + + +
GGTCTCGAACGATTCTTCGTCTGATTCGAGAAGTCCTAGAAGCTCGGTTTCGTCGAGGGT
P E L А К К Q T_K_L F R I F E P К Q L P
ATCTACCGTGCTAACGGTGAAAGGGAACTTAGGAACAGGTGGTACTGGAAGCTCAAGAAG
421 + + + + + +
TAGATGGCACGATTGCCACTTTCCCTTGAATCCTTGTCCACCATGACCTTCGAGTTCTTC
I Y RAN G E R E L R N R W Y W К L K_K_
GATACTCTCCCAGACGGTGATTACGATGTGAGAGAGTACTTCCTCAACCTCTACGATCAG
481 + + + + + +
CTATGAGAGGGTCTGCCACTAATGCTACACTCTCTCATGAAGGAGTTGGAGATGCTAGTC
D T L P D G D Y D_V_R_E Y F L N L Y D Q
GTGCTCACTGAGATGCCAGATTACCTCCTCCTCAAGGATATGGCTGTGGAGAACAAGAAC
541 + + + + + +
CACGAGTGACTCTACGGTCTAATGGAGGAGGAGTTCCTATACCGACACCTCTTGTTCTTG
V L T E_M_P D Y L L L К D_M_A_V_E N К N
TCCAGGGATGCTGGAAAGGTGGTGGATTCCGAGACTGCTTCCATCTGTGATGCTATCTTC
AGGTCCCTACGACCTTTCCACCACCTAAGGCTCTGACGAAGGTAGACACTACGATAGAAG
S R D A G К V V D S E T_A_S I С DAI F
CAGGATGAAGAGACTGAGGGTGCTGTGAGGCGTTTCATTGCTGAGATGAGGCAGAGGGTT
GTCCTACTTCTCTGACTCCCACGACACTCCGCAAAGTAACGACTCTACTCCGTCTCCCAA
Q D E E T E G A V R R F I_A_E_M_R Q R V
CAGGCTGATAGGAACGTGGTGAACTACCCATCCATCCTCCACCCAATCGATTACGCTTTC
GTCCGACTATCCTTGCACCACTTGATGGGTAGGTAGGAGGTGGGTTAGCTAATGCGAAAG
QADRNVVNY P S I L H P I D Y A F
AACGAGTACTTCCTTCAGCACCAGCTTGTGGAGCCACTCAACAACGATATCATCTTCAAC
TTGCTCATGAAGGAAGTCGTGGTCGAACACCTCGGTGAGTTGTTGCTATAGTAGAAGTTG
N E Y F L Q H Q L_V_E P L N N D I I F N
CTCTACCAAAAGAAGATGAAGGCTATCGTTGAGGATTTCCTCAAGAGGCTCTACATCTTC
1921 + + + + + +
GAGATGGTTTTCTTCTACTTCCGATAGCAACTCCTAAAGGAGTTCTCCGAGATGTAGAAG
L Y Q К K_M_K_A_I_V_E D F L К R L Y I F
GATGTGTCCAGGGTGCCAGATGATCAGATGTACCGTCTTAGGGATAGGCTTAGGCTCCTC
1981 + + + + + +
CTACACAGGTCCCACGGTCTACTAGTCTACATGGCAGAATCCCTATCCGAATCCGAGGAG
D_V_S R_V_P D D Q M Y R L R D R L R L L
CCAGTGGAGATCAGAAGGCTCGATATCTTCAACCTCATCCTTATGAACATGGATCAGATC
2041 + + + + + +
GGTCACCTCTAGTCTTCCGAGCTATAGAAGTTGGAGTAGGAATACTTGTACCTAGTCTAG
P_V_E I R R L D I F N L I L M N M D Q I
GAGAGGGCTTCCGATAAGATCGCTCAGGGTGTTATTATCGCTTACCGTGATATGCACCTT
2101 + + + + + +
CTCTCCCGAAGGCTATTCTAGCGAGTCCCACAATAATAGCGAATGGCACTATACGTGGAA
ERASDKIA Q G VI IAYRDMHL
GAGAGGGATGAGATGTACGGATACGTGAACATTGCTAGGAACCTTGAGGGATTCCAGCAG
2161 + + + + + +
CTCTCCCTACTCTACATGCCTATGCACTTGTAACGATCCTTGGAACTCCCTAAGGTCGTC
ERDEMYGYVNIARNLEGF Q Q
ATCAACCTTGAAGAGCTTATGCGTTCCGGTGATTACGCTCAGATCACTAACATGCTCCTC
2221 + + + + + +
TAGTTGGAACTTCTCGAATACGCAAGGCCACTAATGCGAGTCTAGTGATTGTACGAGGAG
I N L E E L_M_R_S G D Y_A_Q I T N_M_L L
AACAACCAGCCAGTGGCTCTTGTTGGTGCTCTCCCATTCATCACTGATTCCTCCGTGATC
2281 + + + + + +
TTGTTGGTCGGTCACCGAGAACAACCACGAGAGGGTAAGTAGTGACTAAGGAGGCACTAG
N N Q P_V_A_L_V_G_A_L P F I T D S S_V_I
TCCCTCATTGCTAAGTTGGATGCTACTGTGTTCGCTCAGATCGTGAAGCTCAGGAAAGTG
2341 + + + + + +
AGGGAGTAACGATTCAACCTACGATGACACAAGCGAGTCTAGCACTTCGAGTCCTTTCAC
S L I А К L D A T V F А О I V К L R К V
GATACTCTCAAGCCAATCCTCTACAAGATCAACTCCGATTCCAACGATTTCTACCTCGTG
2401 + + + + + +
CTATGAGAGTTCGGTTAGGAGATGTTCTAGTTGAGGCTAAGGTTGCTAAAGATGGAGCAC
D T L К P I L Y К I N S D S N D F Y L V
GCTAACTACGATTGGGTGCCAACTTCCACTACAAAGGTGTACAAGCAGGTGCCACAGCAG
2461 + + + + + +
CGATTGATGCTAACCCACGGTTGAAGGTGATGTTTCCACATGTTCGTCCACGGTGTCGTC
A N Y D_W_V_P T S T T К V Y К О V P Q Q
TTCGATTTCCGTAACTCCATGCACATGCTCACTTCCAACCTCACTTTCACTGTGTACTCC
2521 + + + + + +
AAGCTAAAGGCATTGAGGTACGTGTACGAGTGAAGGTTGGAGTGAAAGTGACACATGAGG
F D F R N S M H M L T S N L T F T_V_Y S
GATCTCCTCGCTTTCGTGTCCGCTGATACTGTGGAGCCTATCAACGCTGTGGCTTTCGAT
2581 + + + + + +
CTAGAGGAGCGAAAGCACAGGCGACTATGACACCTCGGATAGTTGCGACACCGAAAGCTA DLLAFVSADTVEP I N A V A F D
AACATGAGGATTATGAACGAGCTTTGATGACTCGAGGGATCCTCTAGAGAA
41 + + + + +-
TTGTACTCCTAATACTTGCTCGAAACTACTGAGCTCCCTAGGAGATCTCTT
N M R I M N E L * * SEQ ID NO: 1
TTCGAGCTC SEQ ID NO: 13
AAGCTCGAG SEQ ID NO: 14
Фиг. 16А
TACCGTGTTCTCAAGGATGATGAGGTGATGGAAGCTGATGTGGATGGAAAGTTCTTCGCT
2041 + + + + + +
ATGGCACAAGAGTTCCTACTACTCCACTACCTTCGACTACACCTACCTTTCAAGAAGCGA
Y R V L К D D EVMEADVD G К F F A
TACAAAGTGGGAACTTTCGAAGAGGTGCCATTCGATGTGGATAAGTTCGTGGATCTCGTG
ATGTTTCACCCTTGAAAGCTTCTCCACGGTAAGCTACACCTATTCAAGCACCTAGAGCAC
Y K_V_G T F E E_V_P F D_V_D К F_V_D L_V_
ACTGATTCCCCAGTGATCTCCGCTATCATCGATTTCAAGACTCTCAAGAACCTCAACGAT
2161 + + + + + +
TGACTAAGGGGTCACTAGAGGCGATAGTAGCTAAAGTTCTGAGAGTTCTTGGAGTTGCTA TDSPVISAIIDFKTLKNLND
AACTACGGAATCACTAGGTCCCAGGCTCTCGATCTCATCCGTTCCGATCCAAGGGTGCTC
TTGATGCCTTAGTGATCCAGGGTCCGAGAGCTAGAGTAGGCAAGGCTAGGTTCCCACGAG
N Y G I T R S О A L D L I R S D P R V L
AGGGATTTCATCAACCAGAACAACCCAATCATCAAGAACAGGATCGAGCAGCTCATTCTC
TCCCTAAAGTAGTTGGTCTTGTTGGGTTAGTAGTTCTTGTCCTAGCTCGTCGAGTAAGAG
R D F I N Q N N P I I К N R I E Q L I L
CAGTGCCGTCTTTGATGACTCGAGGGATCCTCTAGAGAATTCGAGCTC SEQ ID NO: 15
GTCACGGCAGAAACTACTGAGCTCCCTAGGAGATCTCTTAAGCTCGAG SEQ ID NO: 16
Q С R L * * SEQ ID NO: 2
Фиг. 16В
Ротавирусный VP6
Название G9P6_VP6 гена:
Длина гена: 1254 п.н.
Оптимизирован для Nicotiana tabacum
экспрессии в:
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTCCATGGATGTGCTCTACTCCCTCTCCAAGACTCTC
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAAGGTACCTACACGAGATGAGGGAGAGGTTCTGAGAG
G R_V_R S_M_D_V_L Y S L S К T L
AAGGATGCTAGGGATAAGATCGTGGAGGGAACTCTCTACTCCAACGTTTCCGATCTCATC
61 + + + + + +
TTCCTACGATCCCTATTCTAGCACCTCCCTTGAGAGATGAGGTTGCAAAGGCTAGAGTAG
К PAR D К I_V_E G T L Y S_N_V_S D L I
CAGCAGTTCAACCAGATGATCATCACTATGAACGGAAACGAGTTCCAGACTGGTGGAATC
121 + + + + + +
GTCGTCAAGTTGGTCTACTAGTAGTGATACTTGCCTTTGCTCAAGGTCTGACCACCTTAG
Q Q F N Q M I I T_M_N G_N_E F Q T G G I
GGAAACCTCCCAATCAGGAACTGGAACTTCGATTTCGGACTCCTCGGAACTACTCTCCTC
181 + + + + + +
CCTTTGGAGGGTTAGTCCTTGACCTTGAAGCTAAAGCCTGAGGAGCCTTGATGAGAGGAG
G N L P I R N W N F D F G L L G T T L L
AACCTCGATGCTAACTACGTGGAGACTGCTAGGAACACTATCGATTACTTCGTTGATTTC
TTGGAGCTACGATTGATGCACCTCTGACGATCCTTGTGATAGCTAATGAAGCAACTAAAG
N L DAN Y_V_E TAR N T I D Y F_V_D F
GTGGATAATGTGTGCATGGATGAGATGGTTCGTGAGTCCCAGAGGAACGGAATTGCTCCA
301 + + + + + +
CACCTATTACACACGTACCTACTCTACCAAGCACTCAGGGTCTCCTTGCCTTAACGAGGT
V D N V С M D E M V R E S Q R N G I A P
CAGTCCGATTCCCTCAGGAAGCTCTCCGGTATCAAGTTCAAGAGGATCAACTTCGATAAC
361 + + + + + +
GTCAGGCTAAGGGAGTCCTTCGAGAGGCCATAGTTCAAGTTCTCCTAGTTGAAGCTATTG
Q S D S L R К L S G I К F К R I_N_F D N
TCCTCCGAGTACATCGAGAACTGGAACCTCCAGAACAGAAGGCAGAGGACTGGATTCACT
AGGAGGCTCATGTAGCTCTTGACCTTGGAGGTCTTGTCTTCCGTCTCCTGACCTAAGTGA
S S E Y I E N W N L Q N R R Q R T G F T
TTCCACAAGCCAAACATCTTCCCATACTCCGCTTCCTTCACTCTCAACAGGTCCCAGCCA
AAGGTGTTCGGTTTGTAGAAGGGTATGAGGCGAAGGAAGTGAGAGTTGTCCAGGGTCGGT
F H К P N I F P Y S A S F T L N R S Q P
GCTCACGATAACCTCATGGGAACTATGTGGCTCAACGCTGGTTCTGAGATCCAGGTGGCA
CGAGTGCTATTGGAGTACCCTTGATACACCGAGTTGCGACCAAGACTCTAGGTCCACCGT
A H D N L_M_G T_M_W_L N_A_G S E I OVA
GGATTCGATTACTCCTGCGCTATCAACGCTCCAGCTAACACTCAGCAGTTCGAGCACATC
CCTAAGCTAATGAGGACGCGATAGTTGCGAGGTCGATTGTGAGTCGTCAAGCTCGTGTAG
G F D Y S С A I N A P A N T Q Q F E H I
GTTCAGCTCAGAAGGGTGCTCACTACTGCTACTATCACTCTCCTCCCAGATGCTGAGAGG
CAAGTCGAGTCTTCCCACGAGTGATGACGATGATAGTGAGAGGAGGGTCTACGACTCTCC
V Q L R R V L T TAT I T L L P D A E R
TTCTCCTTCCCAAGGGTGATCAACTCCGCTGATGGTGCTACTACTTGGTACTTCAACCCA
AAGAGGAAGGGTTCCCACTAGTTGAGGCGACTACCACGATGATGAACCATGAAGTTGGGT
F S F P R_V_I_N_S_A_D G_A_T T_W_Y F N P
GTGATCCTCAGGCCAAACAACGTGGAGGTGGAGTTCCTTCTCAACGGACAGATCATCAAC
CACTAGGAGTCCGGTTTGTTGCACCTCCACCTCAAGGAAGAGTTGCCTGTCTAGTAGTTG
V I LRPNNVEVE F L L_N_G Q I I N
ACTTACCAGGCTCGTTTCGGAACTATCGTGGCTAGGAACTTCGATACAATCAGGCTCTCC
TGAATGGTCCGAGCAAAGCCTTGATAGCACCGATCCTTGAAGCTATGTTAGTCCGAGAGG
T Y QAR F G T I_V_A_R_N_F D T I R L S
TTCCAGCTTATGAGGCCACCAAACATGACTCCATCCGTGGCTGCACTCTTCCCAAACGCA
AAGGTCGAATACTCCGGTGGTTTGTACTGAGGTAGGCACCGACGTGAGAAGGGTTTGCGT
F Q L M R P P N M T P S V A A L F P N A
CAGCCATTCGAGCACCACGCTACTGTGGGACTCACTCTCAAGATCGAGTCCGCTGTGTGC
GTCGGTAAGCTCGTGGTGCGATGACACCCTGAGTGAGAGTTCTAGCTCAGGCGACACACG
Q P F E H H A T V G L T L К I E S A V С
GAGTCTGTGCTCGCTGATGCTTCCGAGACTATGCTCGCTAACGTGACTTCTGTGAGGCAA
CTCAGACACGAGCGACTACGAAGGCTCTGATACGAGCGATTGCACTGAAGACACTCCGTT
E S V L A D A S E T_M_L_A_N_V_T S V R Q
GAGTACGCTATCCCAGTGGGACCAGTGTTTCCACCAGGAATGAACTGGACTGATCTCATC
CTCATGCGATAGGGTCACCCTGGTCACAAAGGTGGTCCTTACTTGACCTGACTAGAGTAG
E Y A I P V G P_V_F P P G M N W T D L I
ACTAACTACTCCCCATCCAGAGAGGATAACCTCCAGAGGGTGTTCACTGTGGCTTCCATC
TGATTGATGAGGGGTAGGTCTCTCCTATTGGAGGTCTCCCACAAGTGACACCGAAGGTAG
T N Y S P S R E D N L Q R V F T V A S I
CGTTCCATGCTCGTGAAGTGATGACTCGAGGGATCCTCTAGAGAA
1201 + + + +
GCAAGGTACGAGCACTTCACTACTGAGCTCCCTAGGAGATCTCTT
R S M L V К * * SEQ ID NO: 3
TTCGAGCTC SEQ ID NO: 17 AAGCTCGAG SEQ ID NO: 18
Фиг. 16С
Ротавирусный VP 7
Название гена: G9P6_VP7 Длина гена: 1041 п.н.
Оптимизирован для экспрессии в: Nicotiana tabacum
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTGCATGTACGGAATCGAGTACACТАСТАТССТСАСТ
1 + + + + + +
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAACGTACATGCCTTAGCTCATGTGATGATAGGAGTGA SEQ ID N0:4 G RVRCMY G I Е Y Т Т I L Т
TTCCTCATCTCCATCGTGCTCCTCAACTACATCCTCAAGTCCCTCACTTCCGCTATGGAT
б1 + + + + + +
AAGGAGTAGAGGTAGCACGAGGAGTTGATGTAGGAGTTCAGGGAGTGAAGGCGATACCTA FLISIVLLNYILKSLTSAMD
ТТСАТCATCTACCGTTТССТССTCCTCATCGTGATCGCTTCCCCATTCGTTAAGACTCAG
121 + + + + + +
AAGTAGTAGATGGCAAAGGAGGAGGAGTAGCACTAGCGAAGGGGTAAGCAATTCTGAGTC
F I I Y R F L L L I_V_I_A_S Р F_V_K Т Q
AACTACGGTATCAACCTCCCAATCACTGGATCTATGGATACTGCTTACGCTAACTCCTCC
181 + + + + + +
TTGATGCCATAGTTGGAGGGTTAGTGACCTAGATACCTATGACGAATGCGATTGAGGAGG NYGINLPITGSMDTAYANSS
CAGCAAGAGACTTTCCTCACTTCCACACTCTGCCTCTACTACCCAACTGAGGCATCCACA
241 + + + + + +
GTCGTTCTCTGAAAGGAGTGAAGGTGTGAGACGGAGATGATGGGTTGACTCCGTAGGTGT
Q О. Е Т F L Т S Т L С L Y Y Р Т E_A_S Т
CAGATCGGAGATACAGAGTGGAAGGATACTCTCTCCCAGCTCTTCCTCACTAAGGGATGG
301 + + + + + +
GTCTAGCCTCTATGTCTCACCTTCCTATGAGAGAGGGTCGAGAAGGAGTGATTCCCTACC
Q I G D Т Е W К D Т L S Q L F L Т К G_W_
CCAACTGGTTCCGTGTACTTCAAAGAGTACACTGATATCGCTTCCTTCTCCATCGATCCA
361 + + + + + +
GGTTGACCAAGGCACATGAAGTTTCTCATGTGACTATAGCGAAGGAAGAGGTAGCTAGGT
Р Т G S V Y F К Е Y Т D I A S F S I D Р
CAGCTCTACTGCGATTACAACGTGGTGCTTATGAAGTACGATTCCACTCTTGAGCTTGAT
421 + + + + + +
GTCGAGATGACGCTAATGTTGCACCACGAATACTTCATGCTAAGGTGAGAACTCGAACТА
0 L Y С D Y N_V_V_L_M_K Y D S Т L Е L D
ATGTCCGAGCTTGCTGATCTCATCCTCAACGAGTGGCTCTGCAACCCAATGGATATCACT
481 + + + + + +
TACAGGCTCGAACGACTAGAGTAGGAGTTGCTCACCGAGACGTTGGGTTACCTATAGTGA MSELADLILNEWLCNPMDIT
CTCTACTACTACCAGCAGACTGATGAGGCTAACAAGTGGATCTCTATGGGACAGTCCTGC
541 + + + + + +
GAGATGATGATGGTCGTCTGACTACTCCGATTGTTCACCTAGAGATACCCTGTCAGGACG
L Y Y Y Q Q Т D E_A_N К W I S_M_G Q S С
ACTATCAAAGTGTGCCCACTCAACACTCAGACTCTCGGAATCGGATGCATCACTACTAAC
601 + + + + + +
TGATAGTTTCACACGGGTGAGTTGTGAGTCTGAGAGCCTTAGCCTACGTAGTGATGATTG
Т I КУС Р L N Т Q Т L G I G С I Т Т N
ACTGCTACTTTCGAGGAAGTGGCTACTTCCGAGAAGCTCGTGATCACTGATGTGGTGGAT
661 + + + + + +
TGACGATGAAAGCTCCTTCACCGATGAAGGCTCTTCGAGCACTAGTGACTACACCACCTA TATFEEVATSEKLVITDVVD
GGTGTTAACCACAAGCTCGATGTGACTACTAACACATGCACAATCAGGAACTGCAAGAAG
721 + + + + + +
CCACAATTGGTGTTCGAGCTACACTGATGATTGTGTACGTGTTAGTCCTTGACGTTCTTC
G V N Н К L DVT Т N Т С Т I R N С К К
CTCGGACCAAGGGAAAACGTGGCTATCATCCAAGTGGGAGGTTCCGATGTGCTCGATATC
781 + + + + + +
GAGCCTGGTTCCCTTTTGCACCGATAGTAGGTTCACCCTCCAAGGCTACACGAGCTATAG
L G Р R Е N У А I I Q У G G S D У L D I
ACTGCTGATCCAACTACTGCTCCACAGACTGAGAGGATGATGAGGGTGAACTGGAAGAAG
841 + + + + + +
TGACGACTAGGTTGATGACGAGGTGTCTGACTCTCCTACTACTCCCACTTGACCTTCTTC
T_A_D Р Т Т_А_Р Q Т Е R_M_M_R_V_N_W_K_K_
TGGTGGCAGGTTTTCTACACTGTGGTGGATTACATCAACCAGATCGTTCAGGTGATGTCC
901 + + + + + +
ACCACCGTCCAAAAGATGTGACACCACCTAATGTAGTTGGTCTAGCAAGTCCACTACAGG
W W 0 V F Y T_V_V_D Y I N Q I V Q V М S
AAGAGGTCCCGTTCTCTCAACTCCGCTGCTTTCTACTACCGTGTGTGATGACTCGAGGGA
TTCTCCAGGGCAAGAGAGTTGAGGCGACGAAAGATGATGGCACACACTACTGAGCTCCCT
К R S R S L N S A A F Y Y R V * * SEQ ID N0: 4
TCCTCTAGAGAATTCGAGCTC SEQ ID NO: 19
1021 + +-
AGGAGATCTCTTAAGCTCGAG SEQ ID NO: 2 0
Фиг. 16D
A-2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (конструкт номер 1710)
Фиг. 17
IF-WA_VP2(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGCATACCGGAAGAGAGGAGCAAAGCGCGAA Фиг. 17A. SEOIDNO: 21
IF-WA_VP2(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTTTAAAGCTCGTTCATTATTCGCATATTGTCGA Фиг. 17B. SEQ ID NO: 22
V'-n •jf'H'inT ДНК I
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTA
ATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATAAA
AGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTA
TTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTG
CAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGA
GGGAGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTAC
AAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGA
CGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAA
AATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGT
TGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGA
GTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAA
AAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATCCCCGTAGGAGGATA
ACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACA
TCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACATCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCAC
CCATTCTATAAAAAATCACACTTTGTGAGTCTACACTTTGATTCCCTTCAAACACATACAAAGAGAAGAG
ACTAATTAATTAATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAAC
AAGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTCCTGACGAAAG
TCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAATCAAGATAATCCCCTTGGTTTC
AAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAGATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCA
CTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGGGAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGA
CCAGATCGGATGTACCTATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACT
CTTCAGCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCGAAGTGG
AAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAAAGCGAGTAAGTTAAAA
TGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAATTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAAT
CGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGAGATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTC
AGAATCAGAATGTTTCCTCCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGA
ACAACTAAAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTCAAGTT
CAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTAACGTTATTAACTACTA
ATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAGGAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTG
TCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCTAGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCG
TTGGGAATTACTAGCGCGTGTCGACAAGCTTGCATGCCGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCT
ACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAA
TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGA
AGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGT
GGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA
AAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGAT
ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGA
TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCC
ATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCC
CACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTG
ATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG
AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCG
AACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGC
GATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAG
ATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCT
TGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTC
GGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTG
ATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAG
ATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCGCGGATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCG
GCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCCTGCAGGCTCCTCAGCCAAAACGACA
CCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCT
GGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCAC
ACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTG
GCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGT
GCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCC
CAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAA
GGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCC
CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCA
ATGGCAAGGAGCGATCGCTCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTT
TGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTT
TATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTT
AATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTT
CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTT
CTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTAT
GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAA
ATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTCTAGAGTCTCAAGCTTGGCGCGCCCACGTGACTAG
TGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGC
AGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTG
CGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA
AACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA
Фиг. 18. SEQ ID NO: 23. Конструкт 1191 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-
пластоцианин.
ATGGCATACCGGAAGAGAGGAGCAAAGCGCGAAAACCTGCCGCAACAGAACGAGAGACTG СAAGAAAAAGAGATAGAGAAAGAT GT С GAC GTAACAAT GGAAAACAAGAATAACAATAGG AAACAACAGСTGTССGACAAAGTTСTGTСССAGAAGGAGGAAATTATСACTGACGСССAG GAC GATAT TAAAAT T GC С GGAGAAATAAAGAAGAGC T С GAAAGAAGAAT С TAAACAGC T G С T С GAAATT С T GAAAACAAAAGAAGAC СAT СAGAAAGAGAT T СAATAT GAAAT T T T GCAA AAAACAATACCTACATTTGAGTCCAAAGAAAGTATCCTCAAGAAGCTTGAAGACATAAGA CCGGAGCAGGCAAAAAAACAGATGAAACTCTTTCGCATTTTCGAGCCAAAACAGCTCCCT ATATATCGCGCCAATGGCGAGAAGGAGCTACGCAACCGGTGGTACTGGAAGTTGAAAAAA GACACCCTGCCAGATGGAGATTATGACGTCCGGGAGTATTTCCTCAATCTCTATGATCAG ATCCTCATCGAAATGCCGGACTATCTGCTCCTCAAGGACATGGCCGTGGAGAACAAAAAT AGCAGAGACGCCGGCAAAGTTGTCGACTCTGAGACTGCCAATATTTGTGATGCCATCTTC CAGGATGAGGAGACCGAGGGAGTCGTCCGTAGATTCATCGCTGATATGCGGCAACAGGTC CAGGCTGATCGTAACATTGTCAATTACCCTTCCATCCTTCACCCTATTGATCATGCATTC AATGAGTATTTTCTTAACCACCAGTTGGTGGAGCCGCTGAACAATGAGATAATCTTCAAT TACATAC СAGAGAGGATAAGGAAT GAC G T GAAT TACAT С С T GAACAT GGATAT GAAT С T G CCATCTACAGCCAGGTATATCAGGCCAAACTTGTTGCAGGATAGACTGAATCTTCACGAT AATTTTGAGTCCCTGTGGGATACCATCACAACATCCAACTACATTCTGGCCAGGTCCGTC GTTCCCGATTTGAAGGAGAAGGAGCTGGTCTCCACCGAAGCACAGATCCAGAAAATGAGC CAGGACCTGCAGCTGGAGGCCCTCACTATTCAGAGCGAGACACAGTTTTTAGCCGGGATT AACAGTCAGGCTGCCAATGATTGTTTCAAGACCCTCATAGCCGCCATGCTGTCTCAAAGA ACCATGTCTTTGGACTTTGTGACCACGAACTATATGAGCCTAATCTCCGGAATGTGGCTA CTTACAGTGATTCCCAACGATATGTTCCTCCGGGAGTCACTAGTGGCCTGTGAGCTGGCG
GAC CCTCAGACACCCTTC СAGAT С G СAGAACAG СAGAT ССAGAAT TTCCAGGTGGC GAAC TGGCTCCATTTTATTAACAATAACAGATTCAGGCAAGTTGTGATTGATGGAGTTCTGAAT CAGACTС T GAAC GACAATATAC G GAAT G GACAGGT СAT СAAC СAGC T GAT G GAAG CAT T G ATGCAACTCAGCAGACAGCAGTTCCCCACGATGCCTGTGGATTACAAACGGAGCATCCAA CGGGGCATTCTGCTTCTCTCCAATAGGCTGGGGCAGCTTGTCGACTTAACCCGACTGGTC TCCTATAACTACGAGACGCTAATGGCTTGTGTGACCATGAACATGCAGCACGTGCAAACC CTGACAACTGAGAAGTTGCAGCTCACTTCTGTGACTTCGCTTTGTATGTTAATTGGTAAC ACAAC С GTGATTCCGTCCC СACAGACAC TGTTCCACTAC TACAACAT СAAC G TGAAT T T С CACTCCAATTATAATGAGCGGATCAACGACGCCGTCGCCATAATTACCGCAGCAAATAGG СTGAATСTTTATСAGAAAAAAATGAAGTССATAGTGGAAGACTTTСTGAAACGGСTССAG ATTTTCGACGTACCACGAGTGCCTGACGACCAAATGTACAGGCTGAGGGATCGCCTTCGG CTCTTACCCGTTGAACGGAGACGGCTTGACATATTCAACTTGATCCTGATGAATATGGAG CAGATCGAACGCGCTTCTGATAAGATTGCTCAGGGGGTTATCATCGCATACCGAGATATG CAGCTGGAACGCGACGAGATGTACGGATATGTTAATATTGCACGGAATCTTGATGGCTAC CAGCAAATTAACTTGGAGGAACTCATGCGCACCGGTGATTACGGACAAATTACGAACATG CTTCTCAACAATCAACCCGTTGCCCTTGTGGGTGCATTGCCCTTCGTTACGGACTCATCC GTGATCAGTCTAATCGCCAAGCTCGACGCAACCGTCTTCGCTCAGATAGTGAAGCTCAGG AAAG T T GAC AC AC T GAAG С С С AT AC T GT AC AAAAT AAAC T С GGAT T С С AAT GAC T T T T AC CTTGTGGCCAACTACGACTGGATCCCCACAAGTACAACTAAGGTCTACAAACAGGTGCCA CAACCATTCGACTTTAGAGCCAGCATGCACATGCTGACTTCTAACCTTACGTTTACCGTC TACTCTGACCTACTGTCATTTGTTTCAGCGGACACGGTAGAGCCCATTAACGCAGTCGCA TTCGACAATATGC GAATAAT GAAC GAG С T T TAA
Фиг. 19. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ ID
NO: 45).
MAYRKRGAKRENLPQQNERLQEKEIEKDVDVTMENKNNNRKQQLSDKVLSQKEEIITDAQDDIKIAGEIKKSS KEESKQLLEILKTKbDHQKEIQYEILQKTIPTFESKESILKKLEDIRPEQAKKQMKLFRIFEPKQLPIYRANGEKE LRNRWYWKLKKDTLPDGDYDWEYFLNLYDQILIEMPDYLLLKDMAVENKNSRDAGKVVDSETANICDAIF QDEETEGVWPJTADMRQQVQADRNIWYPSILHPro
MDMNLPSTARYIPJ^NLLQDRLNLHDNFESLWDTITTSNYILARSVWDLKEKbLVSTEAQIQKMSQDLQLEAL
TIQSETQFLAGINSQAANDCЖTLIAAMLSQRTMSLDFVTTNYMSLISGMWLLTVГPNDMFLRESLVACELAII
NTIVYPAFGMQRMHYRNGDPQTPFQIAEQQIQNFQVANWLHFINNNRFRQWIDGVLNQTLNDNIRNGQVIN
QLMEALMQLSRQQFTTMPVDYKJ4SIQRGILLLSNRLGQLVDLTRLVSYNYETLMACVTMNMQHVQTLTTEK
LQLTSVTSLCMLIGNTTVIPSPQTLFHYYNINVNFHSNYNERINDAVAIITAAmLNLYQKICMKSIVEDFLKRLQ
IFDWRWDDQMYRLRDRLRLLPVERRRLDIFT4LILMNMEQIERASDKIAQGVIIAYRDMQLERDEMYGYVNI
ARNLDGYQQINLEELMRTGDYGQITNMLLNNQPVALVGALPFVTDSSVISLIAKLDATVFAQIVKLRKVDTLK
PIL YKIN SD SNDF YL VAN YD WIPT ЭТЖ VYKQVPQPFDFR A SMHMLT SNLTFT VY SDLL SF VS ADT VEPIN A VA
FDNMRIMNEL
Фиг. 20. SEQ ID NO: 25. Аминокислотная последовательность VP2 из штамма WA ротавируса А.
Фиг. 21. Схематическое представление конструкта номер 1710. B-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP2(opt)/NOS в систему амплификации БеУБУ(ш)+репликаза (конструкт
номер 1711).
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTA
ATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATAAA
AGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTA
TTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTG
CAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGA
GGGAGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTAC
AAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGA
CGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAA
AATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGT
TGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGA
GTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAA
AAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATCCCCGTAGGAGGATA
ACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACA
TCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACATCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCAC
CCATTCTATAAAAAATCACACTTTGTGAGTCTACACTTTGATTCCCTTCAAACACATACAAAGAGAAGAG
ACTAATTAATTAATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAAC
AAGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTCCTGACGAAAG
TCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAATCAAGATAATCCCCTTGGTTTC
AAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAGATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCA
CTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGGGAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGA
CCAGATCGGATGTACCTATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACT
CTTCAGCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCGAAGTGG
AAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAAAGCGAGTAAGTTAAAA
TGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAATTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAAT
CGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGAGATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTC
AGAATCAGAATGTTTCCTCCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGA
ACAACTAAAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTCAAGTT
CAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTAACGTTATTAACTACTA
ATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAGGAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTG
TCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCTAGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCG
TTGGGAATTACTAGCGCGTGTCGAGACGCGTTGTTGTTGTGACTCCGAGGGGTTGCCTCAAACTCTATCTT
ATAACCGGCGTGGAGGCATGGAGGCAGGGGTATTTTGGTCATTTTAATAGATAGTGGAAAATGACGTGG
AATTTACTTAAAGACGAAGTCTTTGCGACAAGGGGGGGCCCACGCCGAATTTAATATTACCGGCGTGGCC
CCCCCTTATCGCGAGTGCTTTAGCACGAGCGGTCCAGATTTAAAGTAGAAAATTTCCCGCCCACTAGGGT
TAAAGGTGTTCACACTATAAAAGCATATACGATGTGATGGTATTTGGTCGACAAGCTTGCATGCCGGTCA
ACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGG
CAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA
CTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGC
CATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGA
AAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACAC
ACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAA
AGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGG
AAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTG
CCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCA
CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCC
TTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTT
GATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAA
ACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACG
TTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGT
ACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATAC
ATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTG
CCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTT
TTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCG
CGGATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTC
GCCTGCAGGCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAA
ACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGA
ACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGC
AGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCA
GCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCC
AGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGG
TCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGT
GGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGA
ACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGCGATCGCTCACCATCACCATCACCATCACC
ATCACCATTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAG
CGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCG
TCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCG
ATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTG
CCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGC
ATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAA
ACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTCTAGAG
TCTCAAGCTTGGCGCGCCATAAAATGATTATTTTATGAATATATTTCATTGTGCAAGTAGATAGAAATTAC
ATATGTTACATAACACACGAAATAAACAAAAAAAGACAATCCAAAAACAAACACCCCAAAAAAAATAA
TCACTTTAGATAAACTCGTATGAGGAGAGGCACGTTCAGTGACTCGACGATTCCCGAGCAAAAAAAGTCT
CCCCGTCACACATATAGTGGGTGACGCAATTATCTTTAAAGTAATCCTTCTGTTGACTTGTCATTGATAAC
ATCCAGTCTTCGTCAGGATTGCAAAGAATTATAGAAGGGATCCCACCTTTTATTTTCTTCTTTTTTCCATAT
TTAGGGTTGACAGTGAAATCAGACTGGCAACCTATTAATTGCTTCCACAATGGGACGAACTTGAAGGGGA
TGTCGTCGATGATATTATAGGTGGCGTGTTCATCGTAGTTGGTGAAATCGATGGTACCGTTCCAATAGTTG
TGTCGTCCGAGACTTCTAGCCCAGGTGGTCTTTCCGGTACGAGTTGGTCCGCAGATGTAGAGGCTGGGGT
GTCGGATTCCATTCCTTCCATTGTCCTGGTTAAATCGGCCATCCATTCAAGGTCAGATTGAGCTTGTTGGT
ATGAGACAGGATGTATGTAAGTATAAGCGTCTATGCTTACATGGTATAGATGGGTTTCCCTCCAGGAGTG
TAGATCTTCGTGGCAGCGAAGATCTGATTCTGTGAAGGGCGACACATACGGTTCAGGTTGTGGAGGGAAT
AATTTGTTGGCTGAATATTCCAGCCATTGAAGTTTTGTTGCCCATTCATGAGGGAATTCTTCCTTGATCAT
GTCAAGATATTCCTCCTTAGACGTTGCAGTCTGGATAATAGTTCTCCATCGTGCGTCAGATTTGCGAGGAG
AGACCTTATGATCTCGGAAATCTCCTCTGGTTTTAATATCTCCGTCCTTTGATATGTAATCAAGGACTTGT
TTAGAGTTTCTAGCTGGCTGGATATTAGGGTGATTTCCTTCAAAATCGAAAAAAGAAGGATCCCTAATAC
AAGGTTTTTTATCAAGCTGGAGAAGAGCATGATAGTGGGTAGTGCCATCTTGATGAAGCTCAGAAGCAAC
ACCAAGGAAGAAAATAAGAAAAGGTGTGAGTTTCTCCCAGAGAAACTGGAATAAATCATCTCTTTGAGA
TGAGCACTTGGGATAGGTAAGGAAAACATATTTAGATTGGAGTCTGAAGTTCTTACTAGCAGAAGGCATG
TTGTTGTGACTCCGAGGGGTTGCCTCAAACTCTATCTTATAACCGGCGTGGAGGCATGGAGGCAGGGGTA
TTTTGGTCATTTTAATAGATAGTGGAAAATGACGTGGAATTTACTTAAAGACGAAGTCTTTGCGACAAGG
GGGGGCCCACGCCGAATTTAATATTACCGGCGTGGCCCCCCCTTATCGCGAGTGCTTTAGCACGAGCGGT
CCAGATTTAAAGTAGAAAATTTCCCGCCCACTAGGGTTAAAGGTGTTCACACTATAAAAGCATATACGAT
GTGATGGTATTTGACTAGTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGAT
CGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCG
TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAG
CGTTTA
Фиг. 22В. SEQ ID NO: 26. Конструкт 193 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) + репликаза с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCATACCGGAAGAGAGGAGCAAAGCGCGAAAACCTGCCGCAACAGAACGAGAGACTGCAAGAA
AAAGAGATAGAGAAAGATGTCGACGTAACAATGGAAAACAAGAATAACAATAGGAAACAACAGCTGTC
CGACAAAGTTCTGTCCCAGAAGGAGGAAATTATCACTGACGCCCAGGACGATATTAAAATTGCCGGAGA
AATAAAGAAGAGCTCGAAAGAAGAATCTAAACAGCTGCTCGAAATTCTGAAAACAAAAGAAGACCATC
AGAAAGAGATTCAATATGAAATTTTGCAAAAAACAATACCTACATTTGAGTCCAAAGAAAGTATCCTCA
AGAAGCTTGAAGACATAAGACCGGAGCAGGCAAAAAAACAGATGAAACTCTTTCGCATTTTCGAGCCAA
AACAGCTCCCTATATATCGCGCCAATGGCGAGAAGGAGCTACGCAACCGGTGGTACTGGAAGTTGAAAA
AAGACACCCTGCCAGATGGAGATTATGACGTCCGGGAGTATTTCCTCAATCTCTATGATCAGATCCTCAT
CGAAATGCCGGACTATCTGCTCCTCAAGGACATGGCCGTGGAGAACAAAAATAGCAGAGACGCCGGCAA
AGTTGTCGACTCTGAGACTGCCAATATTTGTGATGCCATCTTCCAGGATGAGGAGACCGAGGGAGTCGTC
CGTAGATTCATCGCTGATATGCGGCAACAGGTCCAGGCTGATCGTAACATTGTCAATTACCCTTCCATCCT
TCACCCTATTGATCATGCATTCAATGAGTATTTTCTTAACCACCAGTTGGTGGAGCCGCTGAACAATGAG
ATAATCTTCAATTACATACCAGAGAGGATAAGGAATGACGTGAATTACATCCTGAACATGGATATGAATC
TGCCATCTACAGCCAGGTATATCAGGCCAAACTTGTTGCAGGATAGACTGAATCTTCACGATAATTTTGA
GTCCCTGTGGGATACCATCACAACATCCAACTACATTCTGGCCAGGTCCGTCGTTCCCGATTTGAAGGAG
AAGGAGCTGGTCTCCACCGAAGCACAGATCCAGAAAATGAGCCAGGACCTGCAGCTGGAGGCCCTCACT
ATTCAGAGCGAGACACAGTTTTTAGCCGGGATTAACAGTCAGGCTGCCAATGATTGTTTCAAGACCCTCA
TAGCCGCCATGCTGTCTCAAAGAACCATGTCTTTGGACTTTGTGACCACGAACTATATGAGCCTAATCTCC
GGAATGTGGCTACTTACAGTGATTCCCAACGATATGTTCCTCCGGGAGTCACTAGTGGCCTGTGAGCTGG
CGATCATCAACACCATCGTGTATCCAGCATTCGGAATGCAGAGAATGCATTACCGGAATGGCGACCCTCA
GACACCCTTCCAGATCGCAGAACAGCAGATCCAGAATTTCCAGGTGGCGAACTGGCTCCATTTTATTAAC
AATAACAGATTCAGGCAAGTTGTGATTGATGGAGTTCTGAATCAGACTCTGAACGACAATATACGGAATG
GACAGGTCATCAACCAGCTGATGGAAGCATTGATGCAACTCAGCAGACAGCAGTTCCCCACGATGCCTGT
GGATTACAAACGGAGCATCCAACGGGGCATTCTGCTTCTCTCCAATAGGCTGGGGCAGCTTGTCGACTTA
ACCCGACTGGTCTCCTATAACTACGAGACGCTAATGGCTTGTGTGACCATGAACATGCAGCACGTGCAAA
CCCTGACAACTGAGAAGTTGCAGCTCACTTCTGTGACTTCGCTTTGTATGTTAATTGGTAACACAACCGTG
ATTCCGTCCCCACAGACACTGTTCCACTACTACAACATCAACGTGAATTTCCACTCCAATTATAATGAGCG
GATCAACGACGCCGTCGCCATAATTACCGCAGCAAATAGGCTGAATCTTTATCAGAAAAAAATGAAGTC
CATAGTGGAAGACTTTCTGAAACGGCTCCAGATTTTCGACGTACCACGAGTGCCTGACGACCAAATGTAC
AGGCTGAGGGATCGCCTTCGGCTCTTACCCGTTGAACGGAGACGGCTTGACATATTCAACTTGATCCTGA
TGAATATGGAGCAGATCGAACGCGCTTCTGATAAGATTGCTCAGGGGGTTATCATCGCATACCGAGATAT
GCAGCTGGAACGCGACGAGATGTACGGATATGTTAATATTGCACGGAATCTTGATGGCTACCAGCAAATT
AACTTGGAGGAACTCATGCGCACCGGTGATTACGGACAAATTACGAACATGCTTCTCAACAATCAACCCG
TTGCCCTTGTGGGTGCATTGCCCTTCGTTACGGACTCATCCGTGATCAGTCTAATCGCCAAGCTCGACGCA
ACCGTCTTCGCTCAGATAGTGAAGCTCAGGAAAGTTGACACACTGAAGCCCATACTGTACAAAATAAACT
CGGATTCCAATGACTTTTACCTTGTGGCCAACTACGACTGGATCCCCACAAGTACAACTAAGGTCTACAA
ACAGGTGCCACAACCATTCGACTTTAGAGCCAGCATGCACATGCTGACTTCTAACCTTACGTTTACCGTCT
ACTCTGACCTACTGTCATTTGTTTCAGCGGACACGGTAGAGCCCATTAACGCAGTCGCATTCGACAATAT
GCGAATAATGAACGAGCTTTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCT
ATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTG
TTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAG
ACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGA
TTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAAT TAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAAT ACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACT AGAT
Фиг. 23. SEQ ID NO: 27. Экспрессионная кассета номер 1710 от промотора 2X35S к терминатору NOS.
VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
IF-WA_VP6(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGA Фиг. 25а. SEQ ID NO: 28
IF-WA_VP6(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTCTACTTGATCAACATACTCCGGATAGAGGCCACA Фиг. 25b. SEQ ID NO: 29
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGAAGGACGCTAGGGACAAGATCGTGGAGGGTACACT
TTATAGCAATGTCAGCGACCTAATACAGCAGTTTAATCAAATGATCGTTACAATGAATGGGAATGATTTC
CAAACTGGCGGTATTGGTAATCTGCCCGTGAGGAACTGGACATTCGATTTCGGCCTGCTGGGCACGACTC
TCCTTAATCTCGATGCAAATTATGTAGAAAACGCCAGAACGATTATCGAGTACTTTATCGATTTCATTGAT
AACGTTTGTATGGATGAGATGGCCCGCGAGTCACAACGGAACGGAGTTGCTCCACAGTCCGAGGCCCTTC
GGAAACTCGCCGGCATTAAGTTCAAGCGTATTAATTTCGACAACTCCTCCGAATATATAGAGAACTGGAA
CTTGCAGAATCGTCGACAGAGAACCGGCTTCGTGTTCCATAAACCTAATATCTTTCCGTATAGCGCCTCAT
TCACCCTGAATAGGAGTCAGCCCATGCACGACAACCTCATGGGTACAATGTGGCTGAATGCGGGGAGTG
AAATACAGGTCGCCGGGTTCGATTACTCCTGTGCCATTAATGCACCCGCAAACATCCAGCAGTTCGAACA
TATCGTGCAACTAAGACGGGCTCTCACGACCGCGACAATTACACTCCTGCCCGACGCCGAGCGCTTCTCC
TTTCCCCGCGTAATCAACTCAGCTGATGGCGCCACCACTTGGTTCTTCAACCCTGTTATATTGCGCCCTAA
CAACGTAGAGGTGGAGTTTCTCTTAAACGGACAGATCATCAATACCTACCAAGCCAGGTTCGGCACGATT
ATTGCAAGAAATTTCGACGCTATCAGGCTGCTCTTCCAACTGATGAGGCCCCCCAATATGACTCCCGCTG
TGAACGCTTTGTTTCCGCAGGCTCAGCCTTTCCAGCACCACGCCACCGTCGGCTTGACTCTTCGAATAGAG
AGCGCGGTCTGCGAATCAGTGCTGGCAGACGCCAACGAGACGCTGCTGGCAAACGTTACCGCCGTGCGG
CAAGAGTATGCCATCCCAGTAGGGCCTGTGTTTCCACCCGGCATGAACTGGACTGAACTAATTACTAACT
ATAGCCCATCCAGAGAAGACAACTTGCAGCGGGTCTTCACTGTGGCCTCTATCCGGAGTATGTTGATCAA
GTAGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTT
CTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTC
AGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAA
GCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCT
TGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGT
TATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAAT
ATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Фиг. 25c. SEQ ID NO: 30. Экспрессионная кассета номер 1713 от промотора 2X35S до терминатора NOS.
VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
ATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGAAGGACGCTAGGGACAAGATCGTGGAG GGTACACTTTATAGCAATGTCAGCGACCTAATACAGCAGTTTAATCAAATGATCGTTACA ATGAATGGGAATGATTTCCAAACTGGCGGTATTGGTAATCTGCCCGTGAGGAACTGGACA TTCGATTTCGGCCTGCTGGGCACGACTCTCCTTAATCTCGATGCAAATTATGTAGAAAAC GCCAGAACGATTATCGAGTACTTTATCGATTTCATTGATAACGTTTGTATGGATGAGATG GCCCGCGAGTCACAACGGAACGGAGTTGCTCCACAGTCCGAGGCCCTTCGGAAACTCGCC GGCATTAAGTTCAAGCGTATTAATTTCGACAACTCCTCCGAATATATAGAGAACTGGAAC TTGCAGAATCGTCGACAGAGAACCGGCTTCGTGTTCCATAAACCTAATATCTTTCCGTAT AGCGCCTCATTCACCCTGAATAGGAGTCAGCCCATGCACGACAACCTCATGGGTACAATG TGGCTGAATGCGGGGAGTGAAATACAGGTCGCCGGGTTCGATTACTCCTGTGCCATTAAT GCACCCGCAAACATCCAGCAGTTCGAACATATCGTGCAACTAAGACGGGCTCTCACGACC GCGACAATTACACTCCTGCCCGACGCCGAGCGCTTCTCCTTTCCCCGCGTAATCAACTCA GCTGATGGCGCCACCACTTGGTTCTTCAACCCTGTTATATTGCGCCCTAACAACGTAGAG GTGGAGTTTCTCTTAAACGGACAGATCATCAATACCTACCAAGCCAGGTTCGGCACGATT ATTGCAAGAAATTTCGACGCTATCAGGCTGCTCTTCCAACTGATGAGGCCCCCCAATATG ACTCCCGCTGTGAACGCTTTGTTTCCGCAGGCTCAGCCTTTCCAGCACCACGCCACCGTC GGCTTGACTCTTCGAATAGAGAGCGCGGTCTGCGAATCAGTGCTGGCAGACGCCAACGAG ACGCTGCTGGCAAACGTTACCGCCGTGCGGCAAGAGTATGCCATCCCAGTAGGGCCTGTG TTTССACССGGСATGAACTGGACTGAACTAATTACTAACTATAGСССATССAGAGAAGAC AACTTGCAGCGGGTCTTCACTGTGGCCTCTATCCGGAGTATGTTGATCAAGTAG
Фиг. 25d. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ
ID NO: 46).
MEVLYSLSKTLKI)ARDKIVEGTLYSN^
LDANYVENARTIffiYFIDFmNVCMDEMARESQRNGVAPQSEALRKLAGIKFKJliNFDNSSEYIENWNLQNRRQ
RTGFWHKPNIFPYSASFTLNRSQPMHDNLMGTMWLNAGSEIQVAGFI)YSCAINAPANIQQFEHIVQLRRALT
TATITLLPDAERFSFPRVmSADGATTWrTNPVILRPNNVEVEFLLNGQIINTYQARFGTIIARNFDAmLLFQLM
RPPNMTPAVNALFPQAQPFQHHATVGLTL
TELITNYSPSREDNLQRVFTVASIRSMLIK
Фиг. 26. SEQ ID NO: 31. Аминокислотная последовательность VP6 из штамма WA ротавируса А.
Правая граница Т-ДНК
Фиг. 27. Схематическое представление конструкта номер 1713. D-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS в систему амплификации BeYDV(m)+репликаза (конструкт
номер 1714).
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAA AAAT ATCAAA GAT ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGAAGGACGCTAGGGACAAGATCGTGGAGGGTACACT
TTATAGCAATGTCAGCGACCTAATACAGCAGTTTAATCAAATGATCGTTACAATGAATGGGAATGATTTC
CAAACTGGCGGTATTGGTAATCTGCCCGTGAGGAACTGGACATTCGATTTCGGCCTGCTGGGCACGACTC
TCCTTAATCTCGATGCAAATTATGTAGAAAACGCCAGAACGATTATCGAGTACTTTATCGATTTCATTGAT
AACGTTTGTATGGATGAGATGGCCCGCGAGTCACAACGGAACGGAGTTGCTCCACAGTCCGAGGCCCTTC
GGAAACTCGCCGGCATTAAGTTCAAGCGTATTAATTTCGACAACTCCTCCGAATATATAGAGAACTGGAA
CTTGCAGAATCGTCGACAGAGAACCGGCTTCGTGTTCCATAAACCTAATATCTTTCCGTATAGCGCCTCAT
TCACCCTGAATAGGAGTCAGCCCATGCACGACAACCTCATGGGTACAATGTGGCTGAATGCGGGGAGTG
AAATACAGGTCGCCGGGTTCGATTACTCCTGTGCCATTAATGCACCCGCAAACATCCAGCAGTTCGAACA
TATCGTGCAACTAAGACGGGCTCTCACGACCGCGACAATTACACTCCTGCCCGACGCCGAGCGCTTCTCC
TTTCCCCGCGTAATCAACTCAGCTGATGGCGCCACCACTTGGTTCTTCAACCCTGTTATATTGCGCCCTAA
CAACGTAGAGGTGGAGTTTCTCTTAAACGGACAGATCATCAATACCTACCAAGCCAGGTTCGGCACGATT
ATTGCAAGAAATTTCGACGCTATCAGGCTGCTCTTCCAACTGATGAGGCCCCCCAATATGACTCCCGCTG
TGAACGCTTTGTTTCCGCAGGCTCAGCCTTTCCAGCACCACGCCACCGTCGGCTTGACTCTTCGAATAGAG
AGCGCGGTCTGCGAATCAGTGCTGGCAGACGCCAACGAGACGCTGCTGGCAAACGTTACCGCCGTGCGG
CAAGAGTATGCCATCCCAGTAGGGCCTGTGTTTCCACCCGGCATGAACTGGACTGAACTAATTACTAACT
ATAGCCCATCCAGAGAAGACAACTTGCAGCGGGTCTTCACTGTGGCCTCTATCCGGAGTATGTTGATCAA
GTAGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTT
CTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTC
AGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAA
GCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCT
TGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGT
TATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAAT
ATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Фиг. 28. SEQ ID NO: 32. Экспрессионная кассета номер 1714 от промотора 2X35S к терминатору NOS.
VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
E-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (конструкт номер 1731). IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTC
Фиг. 30А. SEQ ID NO: 33.
IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTTCAGAGTTTACATTGCAGGATTAATTGCTCAATC СТА
Фиг. 30В. SEQ ID NO: 34.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTCATATTCTGTGGATCTTCATGACGAAATCGA
GCAGATTGGGTCCGAGAAGACCCAGAACGTGACCATCAACCCTGGACCTTTTGCTCAGACCCGCTATGCC
CCTGTGAATTGGGATCACGGAGAAATCAACGACAGTACGACCGTCGAACCCATTCTGGACGGGCCATAC
CAACCCACCACCTTCACCCCACCTAATGATTATTGGATTTTAATCAACTCCAACACAAACGGAGTGGTCT
ACGAGTCCACTAATAACTCCGATTTTTGGACCGCCGTTGTAGCCATCGAGCCACACGTCAATCCTGTCGA
TCGCCAGTATATGATATTCGGCGAGTCCAAACAGTTTAACGTTTCCAATGACAGCAACAAATGGAAGTTT
CTGGAGATGTTTCGCAGCTCCTCTCAGAACGAATTCTATAATAGACGGACCCTTACCTCCGATACACGAC
TCGTGGGTATTTTTAAGTACGGCGGCAGGGTGTGGACATTTCACGGTGAAACCCCTCGAGCAACCACTGA
CTCCAGTAGCACTGCAAACCTGAACAATATATCTATTACCATCCACAGCGAATTCTACATAATCCCAAGA
TCTCAGGAAAGTAAGTGTAACGAATATATCAACAACGGACTCCCCCCAATTCAGAATACACGGAACGTG
GTGCCTCTCCCACTCAGTTCTCGGTCTATCCAGTATAAGAGAGCACAAGTGAATGAGGACATTATTGTGA
GCAAGACTAGCCTTTGGAAAGAAATGCAGTACAACAGAGACATTATCATCCGGTTTAAGTTTGGGAACTC
TATCGTGAAGATGGGCGGCCTGGGGTACAAATGGTCAGAAATCTCATATAAAGCCGCCAACTATCAGTAT
AACTACTTGAGAGACGGCGAGCAGGTAACCGCCCACACAACATGCTCTGTCAACGGCGTTAATAACTTTA
GCTACAACGGAGGCTTCCTTCCCACCGACTTCGGTATCAGCCGGTATGAAGTCATCAAGGAAAATTCTTA
TGTGTACGTAGATTACTGGGATGATAGCAAAGCGTTCCGCAACATGGTGTATGTTAGGAGCCTGGCTGCT
AATCTCAATTCTGTGAAGTGTACTGGTGGATCATATTATTTCTCAATTCCCGTGGGGGCTTGGCCAGTCAT
GAATGGCGGGGCAGTCTCCCTCCATTTTGCTGGCGTGACGTTGAGCACTCAGTTTACCGATTTCGTGTCTC
TGAACTCCCTGAGGTTCCGGTTTTCCCTTACTGTCGACGAGCCCCCATTCAGCATTCTGCGTACAAGAACT
GTCAACCTCTACGGGTTACCTGCCGCGAATCCAAACAACGGCAATGAATACTATGAAATTTCGGGCCGCT
TCTCTTTGATAAGTCTGGTACCAACTAATGACGACTATCAGACACCCATCATGAACAGCGTGACTGTCAG
ACAGGACCTGGAAAGACAACTTACAGATCTGCGGGAAGAATTCAATTCTCTCAGTCAGGAGATTGCAAT
GGCCCAATTGATAGATCTTGCCCTACTGCCTCTCGATATGTTTAGTATGTTCTCCGGCATCAAATCAACTA
TAGATCTGACAAAGAGCATGGCTACTTCTGTGATGAAGAAGTTCAGGAAATCAAAACTTGCCACGAGCA
TATCAGAAATGACGAACTCTCTGAGTGATGCAGCATCATCAGCGTCACGCAACGTTTCCATTCGGTCGAA
TCTCAGCGCCATCAGCAACTGGACAAACGTGTCCAACGACGTCAGCAACGTGACCAACTCCTTGAACGAT
ATTTCTACCCAGACGTCAACGATCAGTAAGAAACTCCGCTTGAAAGAAATGATCACCCAGACTGAGGGA
ATGTCTTTCGACGACATTTCCGCCGCCGTGCTAAAAACCAAAATCGATATGTCTACTCAGATCGGCAAGA
ACACTCTGCCGGATATCGTAACCGAAGCCTCCGAAAAGTTTATCCCTAAGCGCAGCTACAGAATATTGAA
AGATGACGAGGTCATGGAGATCAACACAGAAGGGAAGTTCTTCGCTTATAAGATCAACACCTTTGACGA
GGTTCCGTTTGACGTCAATAAGTTTGCAGAGCTCGTGACAGATAGTCCAGTGATTTCTGCCATCATTGACT
TTAAGACTTTGAAGAACCTGAACGACAACTATGGAATAACACGGACCGAAGCGTTGAACCTCATTAAGT
CCAATCCCAATATGTTGCGCAATTTCATTAACCAGAACAATCCAATCATAAGAAATAGGATTGAGCAATT
AATCCTGCAATGTAAACTCTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTA
TGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGT
TTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGA
CCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGAT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT
AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATA
CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA
GAT
Фиг. 31А. SEQ ID NO: 35. Экспрессионная кассета номер 1731 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
ATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTCATATTCTGTGGATCTTCATGACGAAATCGAGC
AGATTGGGTCCGAGAAGACCCAGAACGTGACCATCAACCCTGGACCTTTTGCTCAGACCCGCTATGCCCC
TGTGAATTGGGATCACGGAGAAATCAACGACAGTACGACCGTCGAACCCATTCTGGACGGGCCATACCA
ACCCACCACCTTCACCCCACCTAATGATTATTGGATTTTAATCAACTCCAACACAAACGGAGTGGTCTAC
GAGTCCACTAATAACTCCGATTTTTGGACCGCCGTTGTAGCCATCGAGCCACACGTCAATCCTGTCGATC
GCCAGTATATGATATTCGGCGAGTCCAAACAGTTTAACGTTTCCAATGACAGCAACAAATGGAAGTTTCT
GGAGATGTTTCGCAGCTCCTCTCAGAACGAATTCTATAATAGACGGACCCTTACCTCCGATACACGACTC
GTGGGTATTTTTAAGTACGGCGGCAGGGTGTGGACATTTCACGGTGAAACCCCTCGAGCAACCACTGACT
CCAGTAGCACTGCAAACCTGAACAATATATCTATTACCATCCACAGCGAATTCTACATAATCCCAAGATC
TCAGGAAAGTAAGTGTAACGAATATATCAACAACGGACTCCCCCCAATTCAGAATACACGGAACGTGGT
GCCTCTCCCACTCAGTTCTCGGTCTATCCAGTATAAGAGAGCACAAGTGAATGAGGACATTATTGTGAGC
AAGACTAGCCTTTGGAAAGAAATGCAGTACAACAGAGACATTATCATCCGGTTTAAGTTTGGGAACTCTA
TCGTGAAGATGGGCGGCCTGGGGTACAAATGGTCAGAAATCTCATATAAAGCCGCCAACTATCAGTATA
ACTACTTGAGAGACGGCGAGCAGGTAACCGCCCACACAACATGCTCTGTCAACGGCGTTAATAACTTTAG
CTACAACGGAGGCTTCCTTCCCACCGACTTCGGTATCAGCCGGTATGAAGTCATCAAGGAAAATTCTTAT
GTGTACGTAGATTACTGGGATGATAGCAAAGCGTTCCGCAACATGGTGTATGTTAGGAGCCTGGCTGCTA
ATCTCAATTCTGTGAAGTGTACTGGTGGATCATATTATTTCTCAATTCCCGTGGGGGCTTGGCCAGTCATG
AATGGCGGGGCAGTCTCCCTCCATTTTGCTGGCGTGACGTTGAGCACTCAGTTTACCGATTTCGTGTCTCT
GAACTCCCTGAGGTTCCGGTTTTCCCTTACTGTCGACGAGCCCCCATTCAGCATTCTGCGTACAAGAACTG
TCAACCTCTACGGGTTACCTGCCGCGAATCCAAACAACGGCAATGAATACTATGAAATTTCGGGCCGCTT
CTCTTTGATAAGTCTGGTACCAACTAATGACGACTATCAGACACCCATCATGAACAGCGTGACTGTCAGA
CAGGACCTGGAAAGACAACTTACAGATCTGCGGGAAGAATTCAATTCTCTCAGTCAGGAGATTGCAATG
GCCCAATTGATAGATCTTGCCCTACTGCCTCTCGATATGTTTAGTATGTTCTCCGGCATCAAATCAACTAT
AGATCTGACAAAGAGCATGGCTACTTCTGTGATGAAGAAGTTCAGGAAATCAAAACTTGCCACGAGCAT
ATCAGAAATGACGAACTCTCTGAGTGATGCAGCATCATCAGCGTCACGCAACGTTTCCATTCGGTCGAAT
CTCAGCGCCATCAGCAACTGGACAAACGTGTCCAACGACGTCAGCAACGTGACCAACTCCTTGAACGAT
ATTTCTACCCAGACGTCAACGATCAGTAAGAAACTCCGCTTGAAAGAAATGATCACCCAGACTGAGGGA
ATGTCTTTCGACGACATTTCCGCCGCCGTGCTAAAAACCAAAATCGATATGTCTACTCAGATCGGCAAGA
ACACTCTGCCGGATATCGTAACCGAAGCCTCCGAAAAGTTTATCCCTAAGCGCAGCTACAGAATATTGAA
AGATGACGAGGTCATGGAGATCAACACAGAAGGGAAGTTCTTCGCTTATAAGATCAACACCTTTGACGA
GGTTCCGTTTGACGTCAATAAGTTTGCAGAGCTCGTGACAGATAGTCCAGTGATTTCTGCCATCATTGACT
TTAAGACTTTGAAGAACCTGAACGACAACTATGGAATAACACGGACCGAAGCGTTGAACCTCATTAAGT
CCAATCCCAATATGTTGCGCAATTTCATTAACCAGAACAATCCAATCATAAGAAATAGGATTGAGCAATT
AATCCTGCAATGTAAACTCTGA
Фиг. 31В. Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 47).
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTCATATTCTGTGGATCTTCATGACGAAATCGA
GCAGATTGGGTCCGAGAAGACCCAGAACGTGACCATCAACCCTGGACCTTTTGCTCAGACCCGCTATGCC
CCTGTGAATTGGGATCACGGAGAAATCAACGACAGTACGACCGTCGAACCCATTCTGGACGGGCCATAC
CAACCCACCACCTTCACCCCACCTAATGATTATTGGATTTTAATCAACTCCAACACAAACGGAGTGGTCT
ACGAGTCCACTAATAACTCCGATTTTTGGACCGCCGTTGTAGCCATCGAGCCACACGTCAATCCTGTCGA
TCGCCAGTATATGATATTCGGCGAGTCCAAACAGTTTAACGTTTCCAATGACAGCAACAAATGGAAGTTT
CTGGAGATGTTTCGCAGCTCCTCTCAGAACGAATTCTATAATAGACGGACCCTTACCTCCGATACACGAC
TCGTGGGTATTTTTAAGTACGGCGGCAGGGTGTGGACATTTCACGGTGAAACCCCTCGAGCAACCACTGA
CTCCAGTAGCACTGCAAACCTGAACAATATATCTATTACCATCCACAGCGAATTCTACATAATCCCAAGA
TCTCAGGAAAGTAAGTGTAACGAATATATCAACAACGGACTCCCCCCAATTCAGAATACACGGAACGTG
GTGCCTCTCCCACTCAGTTCTCGGTCTATCCAGTATAAGAGAGCACAAGTGAATGAGGACATTATTGTGA
GCAAGACTAGCCTTTGGAAAGAAATGCAGTACAACAGAGACATTATCATCCGGTTTAAGTTTGGGAACTC
TATCGTGAAGATGGGCGGCCTGGGGTACAAATGGTCAGAAATCTCATATAAAGCCGCCAACTATCAGTAT
AACTACTTGAGAGACGGCGAGCAGGTAACCGCCCACACAACATGCTCTGTCAACGGCGTTAATAACTTTA
GCTACAACGGAGGCTTCCTTCCCACCGACTTCGGTATCAGCCGGTATGAAGTCATCAAGGAAAATTCTTA
TGTGTACGTAGATTACTGGGATGATAGCAAAGCGTTCCGCAACATGGTGTATGTTAGGAGCCTGGCTGCT
AATCTCAATTCTGTGAAGTGTACTGGTGGATCATATTATTTCTCAATTCCCGTGGGGGCTTGGCCAGTCAT
GAATGGCGGGGCAGTCTCCCTCCATTTTGCTGGCGTGACGTTGAGCACTCAGTTTACCGATTTCGTGTCTC
TGAACTCCCTGAGGTTCCGGTTTTCCCTTACTGTCGACGAGCCCCCATTCAGCATTCTGCGTACAAGAACT
GTCAACCTCTACGGGTTACCTGCCGCGAATCCAAACAACGGCAATGAATACTATGAAATTTCGGGCCGCT
TCTCTTTGATAAGTCTGGTACCAACTAATGACGACTATCAGACACCCATCATGAACAGCGTGACTGTCAG
ACAGGACCTGGAAAGACAACTTACAGATCTGCGGGAAGAATTCAATTCTCTCAGTCAGGAGATTGCAAT
GGCCCAATTGATAGATCTTGCCCTACTGCCTCTCGATATGTTTAGTATGTTCTCCGGCATCAAATCAACTA
TAGATCTGACAAAGAGCATGGCTACTTCTGTGATGAAGAAGTTCAGGAAATCAAAACTTGCCACGAGCA
TATCAGAAATGACGAACTCTCTGAGTGATGCAGCATCATCAGCGTCACGCAACGTTTCCATTCGGTCGAA
TCTCAGCGCCATCAGCAACTGGACAAACGTGTCCAACGACGTCAGCAACGTGACCAACTCCTTGAACGAT
ATTTCTACCCAGACGTCAACGATCAGTAAGAAACTCCGCTTGAAAGAAATGATCACCCAGACTGAGGGA
ATGTCTTTCGACGACATTTCCGCCGCCGTGCTAAAAACCAAAATCGATATGTCTACTCAGATCGGCAAGA
ACACTCTGCCGGATATCGTAACCGAAGCCTCCGAAAAGTTTATCCCTAAGCGCAGCTACAGAATATTGAA
AGATGACGAGGTCATGGAGATCAACACAGAAGGGAAGTTCTTCGCTTATAAGATCAACACCTTTGACGA
GGTTCCGTTTGACGTCAATAAGTTTGCAGAGCTCGTGACAGATAGTCCAGTGATTTCTGCCATCATTGACT
TTAAGACTTTGAAGAACCTGAACGACAACTATGGAATAACACGGACCGAAGCGTTGAACCTCATTAAGT
CCAATCCCAATATGTTGCGCAATTTCATTAACCAGAACAATCCAATCATAAGAAATAGGATTGAGCAATT
AATCCTGCAATGTAAACTCTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTA
TGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGT
TTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGA
CCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGAT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT
AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATA
CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA
GAT
Фиг. 31 С. (SEQ ID NO: 44). Экспрессионная кассета номер 1730 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
MASLIYRQLLTNSYSVDLHDEffiQIGSEKTQNVTINPGPFAQTRYAPVNWDHGEINDSTTVEPILDGPYQPTTFT
PPNDYWILINSNTOGVVYESTNNSDFWTAVVAIEPHWPVDRQYMIFGESKQFNVSNDSNKWKFLEMFRSSS
QNEFYNRRTLTSDTRLVGIFKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISITKSEFYIIPRSQESKCNEYINNGL
PPIQNTRNVWLPLSSRSIQYKRAQWEDIIVSKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGNSIVKMGGLGYKWSEISYKAA
NYQYNYLRDGEQWAHTTCSWGWNFSWGGFLPTDFGISRYEVIKENSYWVDYWDDSKAFRNMVYVRS
LAANLNSVKCTGGSYYFSIPVGAWPVMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPPFSILRTRT
VNLYGLPAANPNNGNEYYEISGRFSLISLVPTNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLTDLREEFNSLSQEIAMAQLI
DLALLPLDMFSMFSGIKSTIDLmSMATSVMKKFRKSKLATSISEMTNSLSDAASSASRNVSIRSNLSAISNWTN
VSNDVSNVTOSLNDISTQTSTISKKLRLKEMITQTEGMSroDISAAVLKTKIDMSTQIGKNTLPDIVTEASEKFIP
KRSYRILKDDEVMEINTEGKFFAYKINTroEWFDW
KSNPNMLRNFINQNNPIIRNRIEQLILQCKL
Фиг. 32. SEQ ID NO: 36. Аминокислотная последовательность VP4 из штамма Rotarix ротавируса А.
IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTC Фиг. 34А. SEQ ID NO: 37.
IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTCTAAACGCGATAATAGAAGGCTGCTGAGTTCAGG GA
Фиг. 34В. SEQ ID NO: 38.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAA AAAT ATCAAA GAT ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTTAAACTACATCCTT
AAGTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTACGTGGCCCTTTTTGCCCT
GACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCC
ACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCA
ATGATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTA
CTTCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTAC
TTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCT
GTGCAACCCCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATG
GGCTCAAGTTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTA
ATGTGGATTCGTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTA
ACCACAAGATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGA
ACGTCGCCGTGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACA
GACGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATT
AACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTT
AGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCT
GTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAG
CAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGC
TTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTG
CGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTA
TTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAA AAC AAAAT AT
AGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Фиг. 34С. SEQ ID NO: 24. Экспрессионная кассета номер 1733 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
ATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTTAAACTACATCCTTAA
CCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCAC
TCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAAT
GATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACT
TCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTT
ATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGT
GCAACCCCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGG
CTCAAGTTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAAT
GTGGATTCGTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAAC
CACAAGATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAAC
GTCGCCGTGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGA
CGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTAA
CCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTTAG
Фиг. 34D. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 48).
AT G T AC GGC AT С G AGT AT AC AAC AAT T T T AAT Т Т Т С С T GAT Т Т С С AT С AT Т С T GT T AAAC TACATCCTTAAGTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATC TACGTGGCCCTTTTTGCCCTGACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACC GGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACC CTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGAGTGGAAGGAT AGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAA TACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTA CTTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTC AATGAGTGGCTGTGCAACCCCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAA TCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACC CAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTCGTTTGAAATGGTAGCCGAA AACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAGATCAATCTGACT ACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCGTG АТСCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAG ACGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTG GACTACATTAACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCA GCCTTCTATTATCGCGTTTAG
Фиг. 34Е. Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO 54).
MYGIEYTTILIFLISIILLNYILKSVTOIN(c)YIIYRSLLIYVALFALTRAQNYGLNLPITGSMDTWANSTQEGIFLT STLCLYYPTEASTQINDGEWKDSLSQM^
DM SEL ADLILNEWL CNPMDITL Y YYQQS GE SNK WISM G S S CT VK VCPLNTQML GIGCQTTN VD SFEM VAENE
KLAIVT^VVJDGINHKINLTTTTCTIRNCKKLGPRENVAV1QVGGSNVLDITADPTT№
W YTI VD YINQIVQVMSKR SR SLN S A AFYYR V
Фиг. 35. SEQ ID NO: 39. Аминокислотная последовательность VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А.
IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c
TCTCAGATCTTCGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAAT GGATACC
Фиг. 37. SEQ ID NO: 40.
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTA
ATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATAAA
AGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTA
TTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTG
CAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGA
GGGAGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTAC
AAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGA
CGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAA
AATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGT
TGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGA
GTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAA
AAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATCCCCGTAGGAGGATA
ACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACA
TCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACATCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCAC
Г^Г\ А ТТГ'Т ATAAAAAA T1/"* А А Г'ТТТГ ТГ1 А Г'ТГ'Т А A /^TTT/-* A ""РТ1 /"* /"* /~* ""РТ1 /"* А А Л/^Л/^ЛТЛ/^Л А Л /"* A /"* A A /"* A
^ ^ / \ 1 1 ^ / \ ^ / \ ^ I I I U I VJ/WJ I ^ I 1 \K_.J\ ^ 111 VJ/\ 1 1 ^ ^_Л_ 1 1 ^_ 1 \ 1 \1 \ V^,1 \ ^_ 1 \ 1 1 \V^,1\ 1 \1 \KJ1\KJ1\1 \KJ1 \\J
ACTAATTAATTAATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAAC
AAGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTCCTGACGAAAG
TCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAATCAAGATAATCCCCTTGGTTTC
AAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAGATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCA
CTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGGGAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGA
CCAGATCGGATGTACCTATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACT
CTTCAGCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCGAAGTGG
AAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAAAGCGAGTAAGTTAAAA
TGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAATTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAAT
CGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGAGATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTC
AGAATCAGAATGTTTCCTCCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGA
ACAACTAAAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTCAAGTT
CAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTAACGTTATTAACTACTA
ATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAGGAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTG
TCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCTAGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCG
TTGGGAATTACTAGCGCGTGTCGACAAGCTTGCATGCCGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCT
ACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAA
TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGA
AGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGT
GGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA
AAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGAT
ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGA
TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCC
ATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCC
CACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTG
ATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG
AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCG
AACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGC
GATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAG
ATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCT
TGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTC
GGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTG
ATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAG
ATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTT
ATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCCGCGGCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCA
TCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAA
GGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTC
CCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAG
CGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAG
GGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGC
CCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGA
TCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAG
GAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCA
AGGAGCGATCGCTCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATT
TACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTA
ATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTT
ATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACA
TTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTG
AATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAG
AGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATC
GCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTCTAGAGTCTCAAGCTTGGCGCGCCCACGTGACTAGTGGCA
CTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCAC
ATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAG
CCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTAT
CAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA
Фиг. 39. SEQ ID NO: 41. Конструкт 1192 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-P19-
пластоцианин.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCG
CCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGA
GGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGG
GAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGG
AATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAA
TACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACC
CCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAG
TTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGAT
TCGTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAG
ATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCG
TGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGACGGAAC
GGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTAACCAGAT
TGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTTAGAGGCCT
ATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAG
AGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACA
CAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGAC
CTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATT
ATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAG
ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCA
AACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTT ACTA GAT
Фиг. 40А. SEQ ID NO: 42. Экспрессионная кассета номер 1735 от промотора 2X35S к терминатору NOS. PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCC
CAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGG
GGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGA
GTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAA
TACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAATA
CGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACCCC
ATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTT
GCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTC
GTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAGAT
CAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCGTG
ATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGACGGAACGG
ATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTAACCAGATTG
TGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTTAG
Фиг. 40В. Нуклеотидная последовательность, кодирующая PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 49).
MAKNVAIFGLLFSLLVLWSQIFAQNYGLNLPITGSMDTWANSTQEGIFLTSTLCLYYPTEASTQINDGEWKD
SLSQMFLmGWPTGSVYFKEYSSIVDFSVDPQLYCDYNLVLMKYDQNLELDMSELADLILNEWLCNPMDITL
YYYQQSGESNKMSMGSSCTVKVCPLNTQMLGIGCQTTNVDSFEMVAENEKLAIVDVVDGINHKINLTTTTC
TIRNCKKLGPRENVAVIQVGGSNVLDITADPTTNPQ
LNSAAFYYRV
Фиг. 41. SEQ ID NO: 43. Аминокислотная последовательность PDISP/VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А.
ATGGCTTCGCTCATTTATAGACAATTGCTCACGAATTCTTATACAGTAGATTTATCCGATGAGAT ACAAGAGATTGGATCAACTAAATCACAAAATGTCACAATTAATCCTGGACCATTTGCGCAAACAG GTTATGCTCCAGTTAACTGGGGACCTGGAGAAATTAATGATTCTACGACAGTTGAACCATTGCTG GATGGGCCTTATCAACCAACGACATTCAATCCACCAGTCGATTATTGGATGTTACTGGCTCCAAC GACACCTGGCGTAATTGTTGAAGGTACAAATAATACAGATAGATGGTTAGCCACAATTTTAATCG AGCCAAATGTTCAGTCTGAAAATAGAACTTACACTATATTTGGTATTCAAGAACAATTAACGGTA TCCAATACTTCACAAGACCAGTGGAAATTTATTGATGTCGTAAAAACAACTGCAAATGGAAGTAT AGGACAATATGGACCATTACTATCCAGTCCGAAATTATATGCAGTTATGAAGCATAATGAAAAAT TATATACATATGAAGGACAGACACCTAACGCTAGGACAGCACATTATTCAACAACGAATTATGAT TCTGTTAATATGACTGCTTTTTGTGACTTTTATATAATTCCTAGATCTGAAGAGTCTAAATGTAC GGAATACATTAATAATGGATTACCACCAATACAAAATACTAGAAATGTTGTACCATTATCGTTGA CTGCTAGAGATGTAATACACTATAGAGCTCAAGCTAATGAAGATATTGTGATATCCAAGACATCA TTGTGGAAAGAAATGCAATATAATAGAGATATAACTATTAGATTTAAATTTGCAAATACAATTAT AAAATCAGGAGGGCTGGGATATAAGTGGTCAGAAATATCATTTAAGCCAGCGAATTATCAATACA CATATACTCGTGATGGTGAAGAAGTTACCGCACATACTACTTGTTCAGTGAATGGCGTTAATGAC TTCAGTTTTAATGGAGGATATTTACCAACTGATTTTGTTGTATCTAAATTTGAAGTAATTAAAGA GAATTCATACGTCTATATCGATTACTGGGATGATTCACAAGCATTTCGTAACGTGGTGTATGTCC GATCGTTAGCAGCAAACTTGAATTCAGTTATGTGTACTGGAGGCAGCTATAATTTTAGTCTACCA GTTGGACAATGGCCTGTTTTAACTGGGGGAGCAGTTTCTTTACATTCAGCTGGTGTAACACTATC TACTCAATTTACAGATTTCGTATCATTAAATTCATTAAGATTTAGATTTAGACTAGCTGTCGAAG AACCACACTTTAAACTGACTAGAACTAGATTAGATAGATTGTATGGTCTGCCTGCTGCAGATCCA AATAATGGTAAAGAATATTATGAAATTGCTGGACGATTTTCACTTATATCATTAGTGCCATCAAA TGATGACTATCAGACTCCTATAGCAAACTCAGTTACTGTACGACAAGATTTAGAAAGGCAGTTAG GAGAACTAAGAGAAGAGTTTAACGCTTTGTCTCAAGAAATTGCAATGTCGCAGTTAATCGATTTA GCGCTTCTACCATTAGATATGTTCTCAATGTTTTCTGGCATTAAAAGTACTATTGATGCTGCAAA ATCAATGGCTACTAATGTTATGAAAAAATTCAAAAAGTCAGGATTAGCGAATTCAGTTTCAACAC TGACAGATTCTTTATCAGACGCAGCATCATCAATATCAAGAGGTTCATCTATACGTTCGATTGGA TCTTCAGCATCAGCATGGACGGATGTATCAACACAAATAACTGATATATCGTCATCAGTAAGTTC AGTTTCGACACAAACGTCAACTATCAGTAGAAGATTGAGACTAAAGGAAATGGCAACACAAACTG AGGGTATGAATTTTGATGATATATCAGCGGCTGTTTTGAAGACTAAGATAGATAAATCGACTCAA ATATCACCAAACACAATACCTGACATTGTTACTGAAGCATCGGAAAAATTCATACCAAATAGGGC TTACCGTGTTATAAACAACGATGATGTGTTTGAAGCTGGAATTGATGGAAAATTTTTTGCTTATA AAGTGGATACATTTGAGGAAATACCATTTGATGTACAAAAATTCGCTGACTTAGTTACAGATTCT CCAGTAATATCCGCTATAATTGATTTTAAAACACTTAAAAATTTGAACGATAATTACGGCATTAC TAAGCAACAAGCATTTAATCTTTTAAGATCTGACCCAAGAGTTTTACGTGAATTCATTAATCAGG ACAATCCTATAATTAGAAATAGAATTGAACAACTGATTATGCAATGCAGGTTGTGA
Фиг. 43А. Кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-
H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 50).
ATGGCTTCATTGATATATCGCCAGTTGCTGACTAATAGCTATACTGTGGATTTGTCAGACGAAAT CCAGGAAATAGGATCCACAAAGAGTCAGAACGTGACCATAAACCCCGGACCGTTCGCCCAGACTG GGTATGCCCCCGTAAACTGGGGCCCCGGCGAGATTAACGACAGCACCACCGTGGAGCCACTGCTG GATGGACCCTACCAACCCACTACTTTTAATCCTCCAGTGGACTACTGGATGTTGTTGGCTCCCAC GACACCTGGTGTAATTGTAGAGGGCACCAACAATACCGATCGCTGGCTGGCGACAATACTGATAG AACCCAACGTGCAGTCCGAGAACAGAACCTATACCATTTTCGGCATCCAGGAACAGCTAACCGTG AGCAATACGAGCCAGGACCAGTGGAAGTTTATCGATGTAGTGAAAACTACGGCCAATGGATCTAT CGGGCAATACGGGCCGCTGCTGTCCTCACCTAAGCTCTACGCCGTGATGAAACATAATGAGAAAC TGTACACTTACGAGGGCCAAACCCCCAATGCCAGAACTGCCCACTACAGTACAACCAACTATGAC TCGGTGAACATGACAGCGTTCTGTGATTTTTATATTATTCCAAGATCAGAAGAATCCAAGTGTAC TGAGTACATCAACAATGGACTTCCACCCATCCAGAACACTCGAAATGTCGTCCCACTGTCTCTAA CTGCTCGGGATGTGATCCACTATCGCGCCCAAGCTAATGAGGATATAGTCATTTCAAAGACGAGC TTATGGAAGGAAATGCAGTATAACAGAGACATCACAATCAGGTTCAAGTTCGCCAATACTATTAT TAAGTCCGGGGGACTGGGGTACAAATGGAGTGAGATCAGTTTTAAGCCCGCTAACTATCAGTACA CCTATACTCGCGACGGCGAAGAGGTAACCGCCCACACAACTTGCTCGGTTAATGGCGTGAACGAT TTTAGCTTCAACGGGGGCTACCTGCCTACTGATTTCGTGGTGAGCAAGTTTGAAGTCATCAAGGA AAATTCCTACGTGTATATTGACTACTGGGATGATAGCCAGGCCTTCCGAAATGTTGTGTATGTTA GATCACTGGCCGCAAACCTTAATTCAGTCATGTGCACAGGAGGTTCTTACAATTTTAGTCTTCCC GTCGGGCAGTGGCCAGTGCTCACAGGGGGCGCTGTGAGCTTGCATTCCGCCGGAGTCACCTTGAG TACTCAGTTCACAGACTTTGTGTCTCTGAATAGCCTAAGGTTCAGGTTTAGACTTGCAGTAGAAG AGCCTCACTTTAAGCTCACTCGTACGAGGCTGGATCGGCTGTACGGCCTGCCGGCCGCTGATCCC AATAACGGCAAGGAATATTACGAGATAGCCGGGAGATTTTCGCTGATCAGTCTGGTGCCGTCAAA CGATGATTACCAGACCCCAATTGCCAACAGTGTCACTGTCAGGCAAGATCTGGAGAGACAACTTG GCGAGCTGAGAGAGGAGTTCAACGCCCTGTCTCAAGAGATCGCAATGTCTCAGCTCATTGACCTG GCCCTGTTACCCCTCGACATGTTCTCAATGTTCTCCGGCATAAAATCCACTATCGACGCTGCAAA GTCCATGGCCACAAATGTGATGAAGAAGTTTAAGAAGAGCGGTCTGGCAAATAGCGTGTCTACGC TGACCGATAGTTTGTCGGATGCCGCCAGTTCCATTAGCCGTGGATCCAGCATTAGGTCCATTGGC TCTTCCGCCTCTGCTTGGACTGACGTGAGTACACAGATAACTGACATTTCCTCTTCTGTCTCCAG TGTGAGCACACAAACTTCCACGATATCAAGACGACTGAGGCTCAAAGAGATGGCAACGCAAACGG AAGGTATGAATTTTGATGACATCAGCGCCGCAGTTTTGAAGACAAAGATCGATAAAAGCACTCAA ATTAGCCCCAATACGATCCCTGACATTGTGACTGAGGCATCTGAAAAGTTCATTCCCAACCGTGC TTATCGGGTCATTAACAATGATGATGTCTTCGAGGCCGGCATCGATGGCAAGTTTTTTGCTTATA AAGTGGATACCTTCGAGGAGATTCCTTTCGATGTACAGAAGTTTGCTGACCTCGTAACGGATAGC CCAGTGATAAGCGCCATTATAGACTTCAAAACATTGAAAAATTTGAACGATAATTATGGTATTAC CAAGCAGCAGGCTTTTAACTTGTTAAGATCTGACCCTCGCGTGCTCAGAGAGTTTATTAACCAGG ACAACCCCATCATCAGAAACAGGATCGAGCAGCTGATTATGCAGTGTCGCCTGTAA
Фиг. 43В. Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 51).
ATGTATGGTATTGAATATACCACAGTTCTAACCTTTCTGATATCGATTATTCTACTAA
ATTACATACTTAAATCATTAACTAGAATAATGGACTTTATAATTTATAGATTTCTTTTT
ATAATTGTGATATTGTCACCATTTCTCAGAGCACAAAATTATGGTATTAATCTTCCAA
TCACAGGCTCCATGGACACTGCATACGCTAATTCAACGCAAGAAGAAACATTCCTCA
CTTCTACACTTTGCCTATATTATCCGACTGAGGCTGCGACTGAAATAAACGATAATTC
ATGGAAAGACACACTGTCACAACTATTTCTTACGAAAGGGTGGCCAACTGGATCCGT
ATATTTTAAAGAATATACTAACATTGCATCGTTTTCTGTTGATCCGCAGTTGTATTGT
GATTATAACGTAGTACTAATGAAATATGACGCGACGTTGCAATTGGATATGTCAGAA
CTTGCGGATCTAATATTAAACGAATGGTTGTGTAATCCAATGGATATTACTCTGTATT
ATTATCAGCAAACTGACGAAGCGAATAAATGGATATCAATGGGCTCATCATGTACAA
TTAAAGTATGTCCACTTAATACACAAACTCTTGGAATTGGATGCTTGACAACTGATGC
TACAACTTTTGAAGAAGTTGCGACAGCTGAAAAGTTGGTAATTACTGACGTGGTTGA
TGGCGTTAATCATAAGCTGGATGTCACAACAGCAACGTGTACTATTAGAAACTGTAA
GAAATTGGGACCAAGAGAAAACGTAGCCGTTATACAAGTTGGTGGTTCTGACATCCT
CGATATAACTGCTGATCCAACTACTGCACCACAGACAGAACGGATGATGCGAATTAA
CTGGAAAAAATGGTGGCAAGTTTTTTATACTGTAGTAGACTATGTAGATCAGATAAT
ACAAGTTATGTCCAAAAGATCAAGATCACTAAATTCAGCAGCATTTTATTACAGAGT
GTAG
Фиг. 43С. Кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-
H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 52).
ATGTACGGAATCGAGTATACCACCGTTCTGACATTTCTTATTAGTATTATCCTCTTGA
ACTATATTCTGAAGTCACTTACCCGGATAATGGATTTTATTATATATAGGTTTCTGTT
CATCATTGTAATTCTGAGCCCTTTCCTGAGGGCCCAGAATTACGGCATAAACCTACCA
ATCACCGGTTCTATGGATACCGCTTATGCTAACTCTACACAAGAGGAGACATTCCTC
ACATCAACCCTATGCCTGTACTATCCGACTGAAGCAGCCACAGAGATAAACGATAAC
TCTTGGAAAGATACATTGAGCCAGCTCTTCCTGACTAAGGGATGGCCCACCGGATCG
GTCTACTTTAAGGAGTACACAAACATCGCAAGTTTCAGCGTGGATCCCCAGCTGTAT
TGTGATTATAACGTTGTGCTGATGAAATACGACGCAACCCTCCAGCTTGACATGAGC
GAGTTGGCAGACCTAATCCTCAATGAGTGGCTGTGTAACCCAATGGATATAACACTG
TACTATTATCAGCAGACCGATGAAGCAAACAAATGGATTTCAATGGGAAGCAGCTGT
ACCATCAAAGTTTGTCCTCTCAACACCCAAACTCTCGGCATAGGGTGTCTGACCACA
GACGCTACTACCTTTGAAGAAGTTGCGACCGCGGAAAAGCTGGTTATCACAGATGTG
GTAGATGGCGTTAACCACAAATTGGACGTAACCACAGCAACATGCACAATTAGGAA
CTGCAAGAAGCTAGGACCCAGGGAAAACGTAGCCGTCATCCAAGTGGGCGGCAGTG
ACATCCTAGACATCACCGCAGACCCAACAACAGCACCACAAACCGAGAGGATGATG
CGCATTAATTGGAAGAAATGGTGGCAGGTGTTTTACACTGTCGTTGACTATGTGGAC
CAGATCATTCAGGTGATGAGCAAGCGGAGTCGCTCATTGAATAGTGCTGCCTTTTATT
ACAGAGTCTAA
Фиг. 43D. Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 53).
D-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(Opt)/NOS (конструкт номер 1734). IF-TrSP+Rtx_VP7(opt) .s 1+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTA
Фиг. 44А. (SEQ ID NO: 55).
IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTCTAAACGCGATAATAGAAGGCTGCTGAGTTCAGGGA
Фиг. 44В. (SEQ ID NO: 56).
ATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTTAAACTACAT CCTTAAGTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTACGTGGCCC TTTTTGCCCTGACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACC GTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAAC AGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCA AGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGAC CCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATAT GTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACCCCATGGACATCACATTATATT ACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTTGCACCGTGAAGGTG TGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTCGTTTGAAAT GGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAGATCAATC TGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCGTG ATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGACGGA ACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTA ACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGC GTTTAG
Фиг. 44С. (SEQ ID NO: 57). Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8].
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGA CCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCC CAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCAT TGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCC ACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGAT GTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAA GACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTG CCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATC ATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC CCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG ATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT CTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGA ACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCT CTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACG TTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAA CGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTT CAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGC TTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATC TAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTC TGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTAC GTGGCCCTTTTTGCCCTGACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAAT GGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATT
ATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTC CTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTC AGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGC TGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACCCCATGGACATCACA TTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTTGCACCGT GAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTCGT TTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAG ATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGT CGCCGTGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCAC AGACGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGAC TACATTAACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTA TTATCGCGTTTAGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATG TTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCT CCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAA AAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATA AAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATT ACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATT AGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAA ATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Фиг. 44D. (SEQ ID NO: 58). Экспрессионная кассета номер 1734 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
MDYIIYRSLLIYVALFALTRAQNYGLNLPITGSMDTVYANSTQEGIFLTSTLCLYYPTEASTQIN DGEWKDSLSQMFLTKGWPTGSVYFKEYSSIVDFSVDPQLYCDYNLVLMKYDQNLELDMSELADLI LNEWLCNPMDITLYYYQQSGESNKWISMGSSCTVKVCPLNTQMLGIGCQTTNVDSFEMVAENEKL AIVDVVDGINHKINLTTTTCTIRNCKKLGPRENVAVIQVGGSNVLDITADPTTNPQTERMMRVNW KKWWQVFYTIVDYINQIVQVMSKRSRSLNSAAFYYRV
Фиг. 44Е. SEQ ID NO: 59. Аминокислотная последовательность TrSp-VP7 ротавируса А из штамма
USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
кДа г ft 1Ю - ш _j
75 -I
< VP*
if.1l ж*:-'.
в "Hliil
VP2/VP6 RLPs
Фиг. 45
кДа |ggЈ2gafcgЈ|
VP2/VP6 /VP7 RLPs Фиг. 46
M.V &
кДа 3 s^gggy
A "_
IS -
4- ,P7
VP2/VP4/VP6 /VP7 RLPs
Фиг. 47
VP2/VP6 VP2/VP6/VP4/VP7
Фиг. 49
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032089
032089
- 1 -
- 1 -
(19)
032089
032089
- 1 -
- 1 -
(19)
032089
032089
- 1 -
- 1 -
(19)
032089
032089
- 4 -
- 3 -
032089
032089
- 28 -
032089
032089
- 31 -
- 31 -
032089
032089
- 36 -
- 36 -
032089
032089
- 43 -
- 43 -
032089
032089
- 44 -
- 44 -
032089
032089
- 52 -
- 52 -
032089
032089
- 53 -
<220>
- 53 -
<220>
032089
032089
- 54 -
- 54 -
032089
032089
- 55 -
- 55 -
032089
032089
- 60 -
- 60 -
032089
032089
- 61 -
- 61 -
032089
032089
- 65 -
032089
032089
- 68 -
- 68 -
032089
032089
- 71 -
- 71 -
032089
032089
- 74 -
032089
032089
- 77 -
- 77 -
032089
032089
- 80 -
- 80 -
032089
032089
- 81 -
- 81 -
032089
032089
- 86 -
- 86 -
032089
032089
- 89 -
- 89 -
032089
032089
- 90 -
- 90 -
032089
032089
- 91 -
- 91 -
032089
032089
- 96 -
- 96 -
032089
032089
- 97 -
- 97 -
032089
032089
- 101 -
102 ¦
032089
032089
104
104
032089
032089
- 105 -
- 105 -
032089
<220>
032089
- 107 -
- 106 -
032089
<220>
032089
- 107 -
- 108 -
032089
032089
- 109 -
- 109 -
032089
032089
- 112 -
- 112 -
032089
032089
- 113 -
- 113 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 115 -
- 115 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 116 -
- 116 -
032089
032089
- 129 -
- 129 -
032089
032089
131
- 130 -
032089
032089
- 133 -
- 133 -
032089
032089
- 138 -
- 138 -
032089
032089
- 139 -
- 139 -
032089
032089
- 147 -
- 147 -
032089
032089
- 148 -
- 148 -
|
