EA 032084B1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/032084 Полный текст описания [**] EA201200861 20101210 Регистрационный номер и дата заявки US61/285,942 20091211 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2010/059959 Номер международной заявки (PCT) WO2011/072263 20110616 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21904 Номер бюллетеня [**] АНТАГОНИСТЫ PCSK9 Название документа [8] C07K 16/40, [8] A61K 39/395, [8] A61P 3/06 Индексы МПК [US] Рю Сара, [US] Коэн Стивен Б., [US] Ли Цзунь, [US] Юве Дейвид Сведения об авторах [CH] НОВАРТИС АГ Сведения о патентообладателях [CH] НОВАРТИС АГ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000032084b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Антитело, которое связывается с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), где антитело содержит: I) гипервариабельный участок 1 (CDR1) тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7; II) гипервариабельный участок 2 (CDR2) тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; III) гипервариабельный участок 3 (CDR3) тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; IV) CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 21; V) CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24; и VI) CDR3 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 26.

2. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.

3. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.

4. Антитело по п.1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 41.

5. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

6. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

7. Антитело по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

8. Fab'-фрагмент антитела по п.1.

9. Антитело по п.1, где антитело представляет собой IgG.

10. Антитело по п.1, где антитело представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).

11. Антитело по п.1, где антитело содержит человеческие константные области.

12. Антитело по п.1, где антитело связано с белком-носителем.

13. Антитело по п.1, где антитело является ПЭГилированным.

14. Антитело, которое специфически связывается с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3, где I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7; II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10; III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21; V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24; VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

15. Композиция для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащая антитело по п.1 или 14 и физиологически совместимый эксципиент.

16. Композиция по п.15, где композиция содержит также второй агент, который снижает уровень ЛПНП-Х у индивидуума.

17. Композиция по п.16, в которой второй агент представляет собой статин.

18. Композиция по п.17, в которой статин выбран из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.

19. Композиция по п.16, в которой второй агент выбран из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.

20. Способ снижения уровня ЛПНП-Х у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве антитело по п.1 или 14.

21. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает пониженной чувствительностью или устойчивостью к терапии статинами.

22. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает интолерантностью к терапии статинами.

23. Способ по п.20, в котором у индивидуума исходный уровень ЛПНП-Х составляет по меньшей мере примерно 100 мг/дл.

24. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает семейной гиперхолестеринемией.

25. Способ по п.20, в котором общий уровень холестерина также снижается вместе с ЛПНП-Х.

26. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает триглицеридемией.

27. Способ по п.20, в котором индивидуум имеет мутацию, приводящую к усилению функции по доминантно-негативному типу гена PCSK9.

28. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает индуцируемой лекарственными средствами дислипидемией.

29. Способ по п.20, дополнительно заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве второй агент, снижающий уровень ЛПНП-Х.

30. Способ по п.29, в котором второй агент представляет собой статин.

31. Способ по п.30, в котором статин выбирают из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.

32. Способ по п.29, в котором второй агент выбирают из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.

33. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно в виде смеси.

34. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно, но вводят раздельно.

35. Способ по п.20, в котором антитело вводят внутривенно.

36. Способ по п.20, в котором антитело вводят подкожно.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Антитело, которое связывается с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), где антитело содержит: I) гипервариабельный участок 1 (CDR1) тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7; II) гипервариабельный участок 2 (CDR2) тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; III) гипервариабельный участок 3 (CDR3) тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; IV) CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 21; V) CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24; и VI) CDR3 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 26.

2. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.

3. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.

4. Антитело по п.1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 41.

5. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

6. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

7. Антитело по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.

8. Fab'-фрагмент антитела по п.1.

9. Антитело по п.1, где антитело представляет собой IgG.

10. Антитело по п.1, где антитело представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).

11. Антитело по п.1, где антитело содержит человеческие константные области.

12. Антитело по п.1, где антитело связано с белком-носителем.

13. Антитело по п.1, где антитело является ПЭГилированным.

14. Антитело, которое специфически связывается с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3, где I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7; II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10; III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21; V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24; VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

15. Композиция для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащая антитело по п.1 или 14 и физиологически совместимый эксципиент.

16. Композиция по п.15, где композиция содержит также второй агент, который снижает уровень ЛПНП-Х у индивидуума.

17. Композиция по п.16, в которой второй агент представляет собой статин.

18. Композиция по п.17, в которой статин выбран из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.

19. Композиция по п.16, в которой второй агент выбран из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.

20. Способ снижения уровня ЛПНП-Х у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве антитело по п.1 или 14.

21. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает пониженной чувствительностью или устойчивостью к терапии статинами.

22. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает интолерантностью к терапии статинами.

23. Способ по п.20, в котором у индивидуума исходный уровень ЛПНП-Х составляет по меньшей мере примерно 100 мг/дл.

24. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает семейной гиперхолестеринемией.

25. Способ по п.20, в котором общий уровень холестерина также снижается вместе с ЛПНП-Х.

26. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает триглицеридемией.

27. Способ по п.20, в котором индивидуум имеет мутацию, приводящую к усилению функции по доминантно-негативному типу гена PCSK9.

28. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает индуцируемой лекарственными средствами дислипидемией.

29. Способ по п.20, дополнительно заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве второй агент, снижающий уровень ЛПНП-Х.

30. Способ по п.29, в котором второй агент представляет собой статин.

31. Способ по п.30, в котором статин выбирают из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.

32. Способ по п.29, в котором второй агент выбирают из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.

33. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно в виде смеси.

34. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно, но вводят раздельно.

35. Способ по п.20, в котором антитело вводят внутривенно.

36. Способ по п.20, в котором антитело вводят подкожно.


Евразийское
патентное
ведомство
032084
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки 201200861
(22) Дата подачи заявки
2010.12.10
(51) Int. Cl.
C07K16/40 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) A61P3/06 (2006.01)
(54) АНТАГОНИСТЫ PCSK9
(31) 61/285,942
(32) 2009.12.11
(33) US
(43) 2013.01.30
(86) PCT/US2010/059959
(87) WO 2011/072263 2011.06.16
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АЙРМ ЛЛК (BM); НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Рю Сара, Коэн Стивен Б., Ли Цзунь, Юве Дейвид (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н., Павловский А.Н. (RU)
(56) NI YAN G. ET AL.: "A PCSK9 C-terminal Domain Binding Fab Inhibits PCSK9 Internalization and Restores LDL-uptake", CIRCULATION, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, US, vol. 120, no. 18, Suppl. 2, 1 November 2009 (2009-11-01), page S477, XP008121212, ISSN: 0009-7322 the whole document
WO-A2-2008057459
WO-A1-2009026558
WO-A1-2009100297
LI HAI ET AL.: "Recent patents on PCSK9: a new target for treating hypercholesterolemia", RECENT PATENTS ON DNA & GENE SEQUENCES NOV 2009 LNKD-
PUBMED:19601924, vol. 3, no. 3, November 2009 (2009-11), pages 201-212, XP002619049, ISSN:
1872-2156 whole document, especially page 205, paragraph 2
NI YAN G. ET AL.: "A proprotein
convertase subtilisin-1ike/kexin type 9 (PCSK9) C-terminal domain antibody antigen-binding fragment inhibits PCSK9 internalization and restores low density lipoprotein uptake.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 23 APR 2010 LNKD-PUBMED:20172854, vol. 285, no. 17, 23 April 2010 (2010-04-23), pages 12882-12891, XP002619048, ISSN: 1083-351X the whole document
WO-A1-2010068526
DUFF CHRISTOPHER J. ET AL.: "Antibody-mediated disruption of the interaction between PCSK9 and the low-density lipoprotein receptor", THE
BIOCHEMICAL JOURNAL 1 MAY 2009 LNKD-
PUBMED:19196236, vol. 419, no. 3, 1 May 2009 (2009-05-01), pages 577-584, XP002619050, ISSN: 1470-8728 whole document, especially page 578, paragraph 2; figures 2 and 4
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США 61/285942, зарегистрированной 11 декабря 2009 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, являющимся антагонистами PCSK9.
Предпосылки создания изобретения
Рецептор липопротеина низкой плотности (ЛПНПР) предупреждает развитие атеросклероза и ги-перхолестеринемии посредством клиренса липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из кровотока. ЛПНПР регулируется на посттрансляционном уровне пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9а ("PCSK9"). В последние годы опубликованы данные касательно "выключения" PCSK9 у мышей. Установлено, что у таких мышей уровни холестерина в плазме снижены примерно на 50% и они обладают повышенной чувствительностью к статинам, снижающим уровень холестерина в плазме (Rashid S. и др., Proc Nail Acad Sci 102, 2005, cc. 5374-5379). Генетические данные, полученные для человека, также подтверждают роль PCSK9 в гомеостазе ЛПНП. В последние годы были идентифицированы две мутации, которые возможно являются мутациями, приводящими к потере функции ("loss-of-function") гена PCSK9. У индивидуумов с такими мутациями уровни холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-X) в плазме снижены примерно на 40%, что обусловливает снижение примерно на 50-90% риска заболевания ишемической болезни сердца. В целом результаты указанных исследований свидетельствуют о том, что ингибитор PCSK9 может оказывать благоприятное действие в отношении снижения концентраций ЛПНП-Х в плазме, а также в отношении других болезненных состояний, опосредуемых PCSK9, и для повышения эффективности его можно вводить совместно, например, со вторым средством, применяемым для снижения уровня холестерина.
Краткое описание сущности изобретения
В настоящем изобретении предложены антитела, которые обладают способностью связываться с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) (например, имеющей последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 47) и оказывают антагонистическое действие на ее функцию, и способы применения таких антител, например, для лечения болезненных состояний, опосредуемых PCSK9.
Один из объектов изобретения относится к антителу, которое связывается с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), где антитело содержит:
I) гипервариабельный участок 1 (CDR1) тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 7;
II) гипервариабельный участок 2 (CDR2) тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 10;
III) гипервариабельный участок 3 (CDR3) тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13;
IV) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO: 21;
V) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO: 24 и
VI) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO: 26.
В одном из вариантов осуществления изобретения в антителе по изобретению аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41, в более предпочтительном варианте антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 41.
В другом варианте осуществления изобретения в антителе по изобретению аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18, в более предпочтительном варианте вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID
NO: 18.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению представляет собой IgG.
В еще одном из вариантов осуществления изобретения антитело по изобретению представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).
В следующем варианте осуществления изобретения антитело содержит человеческие константные области.
Следующий объект изобретения относится к Fab'-фрагменту антитела по изобретению. Один из объектов изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где
вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3, где:
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
Один из объектов изобретения относится к антителам и антигенсвязывающим молекулам, которые обладают способностью связываться с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9). В одном из вариантов осуществления изобретения антитело:
а) не блокирует связывание PCSK9 с рецептором липопротеинов низкой плотности (ЛПНПР) и
б) ингибирует опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающая молекула связывается по меньшей мере с одним остатком аминокислоты, который находится в одном из положений 680-692 человеческой PCSK9. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающая молекула связывается с эпитопом PCSK9, присутствующим в аминокислотной последовательности RSRHLAQASQELQ (SEQ ID NO: 49).
В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание антитела или антигенсвязывающей молекулы с человеческой PCSK9 характеризуется константой равновесия реакции диссоциации (KD), составляющей примерно 500 пМ или менее. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения связывание антитела или антигенсвязывающей молекулы с человеческой PCSK9 характеризуется константой равновесия реакции диссоциации (KD), составляющей примерно 400, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140 пМ или менее.
В некоторых вариантах осуществления изобретения время полужизни антитела или антигенсвязы-вающей молекулы in vivo составляет по меньшей мере примерно 7 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения время полужизни антитела или антигенсвязывающей молекулы in vivo составляет по меньшей мере примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающая молекула обладает in vivo понижающим уровень холестерина действием, которое продолжается по меньшей мере в течение примерно 2 недель, например в течение 2, 3, 4 недель или более. Предпочтительно время полужизни in vivo определяют в организме человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит V-сегмент человеческой тяжелой цепи,
гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (CDR3) и каркасный участок 4 тяжелой цепи (FR4), и
(б) вариабельную область легкой цепи, которая содержит V-сегмент человеческой легкой цепи,
CDR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи, где:
I) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность
SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ ID NO: 14); И
II) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность
LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит V-сегмент человеческой тяжелой цепи,
гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (CDR3) и каркасный участок 4 тяжелой цепи (FR4), и
(б) вариабельную область легкой цепи, которая содержит V-сегмент человеческой легкой цепи,
CDR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи, где:
I) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SYYYYNMDY (SEQ ID NO: 12); и
II) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность
LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит V-сегмент человеческой тяжелой цепи,
гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (CDR3) и каркасный участок 4 тяжелой цепи (FR4), и
(б) вариабельную область легкой цепи, которая содержит V-сегмент человеческой легкой цепи,
CDR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи, где:
I) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SYYYYAMDY (SEQ ID NO: 13); и
II) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность
LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и CDR3 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 28, и последовательность V-сегмента легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в SEQ ID
NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 27, и последовательность V-сегмента легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30.
В некоторых вариантах осуществления изобретения FR4 тяжелой цепи представляет собой FR4 человеческой зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения FR4 тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения FR4 легкой цепи представляет собой FR4 человеческой зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения FR4 легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения V-сегмент тяжелой цепи и V-сегмент легкой цепи каждый содержит гипервариабельный участок 1 (CDR1) и гипервариабельный участок 2 (CDR2);
где:
I) CDR1 V-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
II) CDR2 V-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;
III) CDR1 V-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;
IV) CDR2 V-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения V-сегмент тяжелой цепи и V-сегмент легкой
цепи каждый содержит гипервариабельный участок 1 (CDR1) и гипервариабельный участок 2 (CDR2);
где:
I) CDR1 V-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;
II) CDR2 V-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;
III) CDR1 V-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21;
IV) CDR2 V-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) CDR1 V-сегмента тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 7;
II) CDR2 V-сегмента тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 10;
III) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13;
IV) CDR1 V-сегмента легкой цепи содержит SEQ ID NO: 21;
V) CDR2 V-сегмента легкой цепи содержит SEQ ID NO: 24; и
VI) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 41.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID
NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой IgG. В некоторых
вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой IgG1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело имеет тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой Fab'-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой одноцепочечное антитело (scFv). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит человеческие константные области. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит константную область человеческого IgG1. В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область человеческого IgG1 подвергнута мутации с целью снижения аффинности связывания эффекторного ли-ганда, такого как Fc-рецептор (FcR), например Fc-гамма-R1, на клетке или О-компонент системы комплемента (см., например, US 5624821). В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки L234 и L235 константной области IgG1 заменены на Ala234 и Ala235. Нумерация остатков в константной области тяжелой цепи соответствует нумерации EU (см. Kabat и др., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", изд-во U.S. Dept. Health and Human Services, 1983).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело связано с белком-носителем, например альбумином.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело является ПЭГилированным.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3; где:
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 8;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 11;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 14;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 22;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 25;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3; где:
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 6;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 9;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 13;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 20;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 23;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3; где:
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 7;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 10;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 12;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 21;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 24;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3; где:
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 7;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 10;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 13;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 21;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 24;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
Следующим объектом изобретения являются композиция для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащая антитело по изобретению и физиологически совместимый эксципиент.
В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит второй агент, который снижает уровни холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент представляет собой статин. Ста-тин может быть выбран, например, из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент выбран из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, ми-метики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
Следующий объект изобретения относится к способам снижения уровня ЛПНП-Х и/или общего холестерина у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве представленное/представленную в настоящем описании антитело или антигенсвязывающую молекулу.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум обладает пониженной чувствительностью или устойчивостью к терапии на основе статинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум обладает интолерантностью к терапии на основе статинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения исходный уровень ЛПНП-Х у индивидуума составляет по меньшей мере примерно 100 мг/дл, например по меньшей мере примерно 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/дл или выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает семейной гиперхолестеринемией. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает триг-лицеридемией. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум несет мутацию, приво
дящую к усилению функции по доминантно-негативному типу ("gain-of-function") гена PCSK9. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает индуцированной лекарственными средствами дислипидемией.
В некоторых вариантах осуществления изобретения при снижении уровня ЛПНП-Х происходит снижение уровня общего холестерина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способы дополнительно заключаются в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве второй агент, обладающий эффективностью в отношении снижения уровня ЛПНП-Х.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент представляет собой статин. Ста-тин можно выбирать, например, из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ло-вастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент выбирают из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающую молекулу и второй агент применяют совместно в виде смеси.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающую молекулу и второй агент применяют совместно, но вводят раздельно.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводят подкожно.
Определения.
Понятие "антитело" относится к полипептиду из семейства иммуноглобулинов или полипептиду, который содержит фрагменты иммуноглобулина, который обладает способностью нековалентно, обратимо и специфически связывать соответствующий антиген. Примером структурной единицы антитела является тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну "легкую" (имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа), которые связаны дисульфидным мостиком. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей к, X, а, у, 8, е и |Л, а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют либо как к, либо как X. Тяжелые цепи классифицируют как у, М-, а, 8 или е, что, в свою очередь, определяет классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. N-конец каждой цепи включает вариабельную область, состоящую примерно из 100-110 или большего количества аминокислот, которая прежде всего ответственна за распознавание антигена. Понятия вариабельная область легкой цепи (VL) и вариабельная область тяжелой цепи (VH) относятся к указанным областям легких и тяжелых цепей соответственно. В контексте настоящего описания под понятие "антитело" подпадают все варианты антитела или его фрагментов, которые обладают определенной специфичностью к связыванию, например, с PCSK9. Таким образом, под указанное понятие подпадают полноразмерные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела (scFv), Fab-, Fab'-фрагменты и мультимерные версии указанных фрагментов (например, F(ab')2), которые обладают такой же специфичностью к связыванию.
Понятия "определяющие комплементарность домены" или "гипервариабельные участки" ("CDR") используются взаимозаменяемо и относятся к гипервариабельным участкам VL и VH. CDR представляют собой сайт цепей антитела, связывающий белок-мишень, который определяет специфичность в отношении белка-мишени. Существует три CDR (CDR1-3, нумерация, начинается с N-конца) в каждой человеческой VL или VH, в вариабельных областях на их долю приходится примерно 15-20%. CDR структурно комплементарны эпитопу белка-мишени и поэтому непосредственно ответственны за специфичность связывания. Оставшиеся участки в VL- или Vu-областях, так называемые каркасные участки, характеризуются меньшей вариацией аминокислотной последовательности (Kuby, Immunology, 4-е изд., глава 4, изд-во W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
Положения CDR и каркасных участков определяют с помощью различных хорошо известных в данной области обозначений, например, согласно Кэботу (Kabat), Chothia, международной базе данных ImMunoGeneTics (IMGT) (сайт во всемирной сети imgt.cines.fr.) и AbM (см., например, Johnson и др., Nucleic Acids Res., 29, 2001, cc. 205-206; Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, 1987, cc. 901-917; Chothia и др., Nature, 342, 1989, cc. 877-883; Chothia и др., J. Mol. Biol., 227, 1992, cc. 799-817; Al-Lazikani и др., J. Mol. Biol., 273, 1997, cc. 927-948). Определение антигенсвязывающих центров описано также в следующих публикациях: Ruiz и др., Nucleic Acids Res., 28, 2000, cc. 219-221 и Lefranc M.P., Nucleic Acids Res., 29, 2001, cc. 207-209; MacCallum и др., J. Mol. Biol., 262, 1996, cc. 732-745; и Martin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, cc. 9268-9272; Martin и др., Methods Enzymol., 203, 1991, cc. 121-153; и Rees и др., в: Protein Structure Prediction, под ред. Sternberg M.J.E., изд-во Oxford University Press, Oxford, 1996, cc. 141172.
Понятия "детерминанта специфичности связывания" и "BSD" используют взаимозаменяемо для обозначения минимальной состоящей из смежных или несмежных аминокислот последовательности, присутствующей в гипервариабельном участке, которая необходима для придания антителу специфичности к связыванию. Минимальная детерминанта специфичности связывания может присутствовать в последовательностях одного или нескольких CDR. В некоторых вариантах осуществления изобретения минимальные детерминанты специфичности связывания локализованы (т.е. определяются только ими) в фрагментах или полноразмерных последовательностях CDR3 тяжелых и легких цепей антитела.
Понятие "легкая цепь антитела" или "тяжелая цепь антитела" в контексте настоящего описания относится к полипептиду, содержащему VL или VH соответственно. Эндогенная VL кодируется генными сегментами V (вариабельный) и J (соединительный), а эндогенная VH кодируется V, D (разнообразие) и J. Каждая VL или VH включает CDR, а также каркасные участки. В контексте настоящего описания легкие цепи антитела и/или тяжелые цепи антитела иногда могут быть обозначены вместе как "цепи антитела". Под эти понятия подпадают цепи антитела, содержащие мутации, которые не нарушают основную структуру VL или VH, хорошо известные специалисту в данной области.
Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины или многочисленные их фрагменты с хорошо известными характеристиками, которые получают расщеплением различными пептида-зами. Так, например, пепсин расщепляет антитело за дисульфидными мостиками в шарнирной области, приводя к образованию F(ab)'2-фрагмента, димера Fab, который сам представляет собой легкую цепь, связанную с VH-CH1 дисульфидной связью. F(ab)'2 может восстанавливаться в мягких условиях, при которых происходит расщепление дисульфидного мостика в шарнирной области, что приводит к превращению димера F(ab)'2 в мономер Fab'. Мономер Fab' представляет собой в основном Fab-фрагмент с частью шарнирной области (см. Paul, Fundamental Immunology, 3-е изд., 1993). Хотя обозначение различных фрагментов антитела определяется с точки зрения расщепления интактного антитела, специалисту в данной области должно быть очевидно, что такие фрагменты можно синтезировать de novo либо химически, либо с помощью методологии рекомбинантной ДНК. Так понятие "антитело" в контексте настоящего описания включает также фрагменты антитела, полученные либо путем модификации полных антител, либо синтезированные de novo с использованием методологии рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный Fv), либо фрагменты, идентифицированные с помощью фаговых дисплейных библиотек (см., например, McCafferty и др., Nature 348, 1990, cc. 552-554).
Для получения моноклональных или поликлональных антител можно использовать любой метод, известный в данной области (см., например, Kohler и Milstein, Nature 256, 1975, cc. 495-497; Kozbor и др., Immunology Today 4, 1983, с. 72 (1983); Cole и др., в: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985, cc. 77-96). Методики получения одноцепочечных антител (US 4946778) можно адаптировать для получения антител к полипептидам, предлагаемым в настоящем изобретении. Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител можно использовать трансгенных мышей или другие организмы, такие как другие млекопитающие. В другом варианте для идентификации антител и гетеромерных Fab-фрагментов, которые специфически связываются с выбранными антигенами, можно применять основанные на использовании фагового дисплея методики (см., например, McCafferty и др., Nature 348, 1990, cc. 552-554; Marks и др., Biotechnology 10, 1992, cc. 779-783).
Методы гуманизации или приматизации нечеловеческих антител хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или несколько интродуцированных в него аминокислотных остатков из источника, представляющего собой антитело из вида животного, кроме человека. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто обозначают как импортные остатки, и их, как правило, получают из импортной вариабельной области. Гуманизацию можно осуществлять, в целом, согласно методу, описанному Winter с соавторами (см., например, Jones и др., Nature, 321, 1986, cc.522-525; Riechmann и др., Nature, 332, 1988, cc. 323-327; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, cc. 1534-1536 и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, 1992, cc. 2593-596), путем замены CDR или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, указанные гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела (US 4816567), в которых область, существенно меньшая, чем человеческая интактная вариабельная область, заменена на соответствующую последовательность из антитела видов, кроме человека. Практически гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка ("CDR") и возможно некоторые остатки каркасного участка ("FR") заменены остатками из аналогичного сайта антител грызунов.
" Химерное антитело" представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована так, что антигенсвязывающий центр (вариабельная область) связан с константной областью из антитела другого или измененного класса, обладающего другой или измененной эффекторной функцией и/или полученного из других или измененных видов, или с полностью отличной молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, с ферментом, токсином, гормоном, фактором роста и лекарственным средством; или (б) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована на вариабельную область, имеющую другую или измененную антигенную специфичность.
Антитела или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают также одну или несколько иммуноглобулиновых цепей, которые химически конъюгированы с другими белками или экспрессируются в виде слитых белков, включающих другие белки. К ним относится также биспецифи-ческое антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой созданное искусственным путем гибридное антитело, имеющее две различные пары легких/тяжелых цепей и два различных сайта связывания. К другим антигенсвязывающим фрагментам или элементам антитела, предлагаемым в изобретении, относятся бивалентное антитело в виде scFv (диабоди), биспецифические антитела в виде scFv, где молекула антитела распознает два различных эпитопа, одноцепочечные связывающие домены (dAbs) и минитела.
Различные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, можно получать путем ферментативной или химической модификации интактных антител или синтезировать de novo с помощью методологии рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный Fv) или их можно идентифицировать с использованием фаговых дисплейных библиотек (см., например, McCafferty и др., Nature 348, 1990, cc. 552-554). Например, минитела можно создавать с помощью методов, известных в данной области, описанных, например, у Vaughan и Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4, 2001, cc. 417-430. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая методы слияния с использованием гибридом или связывания Fab'-фрагментов (см., например, Songsivilai и Lach-mann, Clin. Exp. Immunol. 79, 1990, cc. 315-321; Kostelny и др., J. Immunol. 148, 1992, cc. 1547-1553). Од-ноцепочечные антитела можно идентифицировать с использованием фаговых дисплейных библиотек или рибосомных дисплейных библиотек, библиотеки перетасованных генов. Такие библиотеки можно создавать с использованием синтетических, полусинтетических или нативных и иммунокомпетентных источников.
" Химерное антитело" представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована так, что антигенсвязывающий центр (вариабельная область) связан с константной областью из антитела другого или измененного класса, обладающего другой или измененной эффекторной функцией и/или полученного из других или измененных видов, или с полностью отличной молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, с ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным средством и т.д.; или (б) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована на вариабельную область, имеющую другую или измененную антигенную специфичность. Например, как продемонстрировано в представленных ниже примерах, мышиное антитело к PCSK9 можно модифицировать путем замены его константной области на константную область человеческого иммуноглобулина. Благодаря замене на человеческую константную область химерное антитело может сохранять свою специфичность в отношении распознавания человеческой PCSK9, обладая при этом меньшей иммуногенностью для человека по сравнению с исходным мышиным антителом.
Понятие "связывающая молекула типа антитела" или "лиганд, не являющийся антителом" относится к миметикам антитела, имеющим неиммуноглобулиновые белковые каркасы, включая аднектины, авимеры, одноцепочечные полипептидные связывающие молекулы и антителоподобные связывающие пептидомиметики.
Понятие "вариабельная область" или "V-область" используют взаимозаменяемо для обозначения тяжелой или легкой цепи, содержащей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (см. фиг. 1). Эндогенная вариабельная область кодируется генами V-D-J тяжелой цепи иммуноглобулина или генами V-J легкой цепи. V-область может представлять собой встречающуюся в естественных условиях рекомбинантную или синтетическую область.
В контексте настоящего описания понятие "вариабельный сегмент" или "V-сегмент" используют взаимозаменяемо для обозначения подпоследовательности вариабельной области, включающей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 (см. фиг. 1). Эндогенный V-сегмент кодируется V-геном иммуноглобулина. V-сегмент может представлять собой встречающийся в естественных условиях рекомбинантный или синтетический сегмент.
В контексте настоящего описания понятие "J-сегмент" относится к подпоследовательности кодируемой вариабельной области, содержащей находящиеся на C-конце CDR3 и FR4. Эндогенный J-сегмент кодируется J-геном иммуноглобулина (см. фиг. 1). J-сегмент может представлять собой встречающийся в естественных условиях рекомбинантный или синтетический сегмент.
" Гуманизированное" антитело представляет собой антитело, которое сохраняет реактивность антитела организма, кроме человека, но которое обладает низкой иммуногенностью для человека. Для достижения этого можно, например, сохранять CDR-участки антитела из организма, кроме человека, и заменять оставшиеся части антитела человеческими копиями (см., например, Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, cc. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol., 44, 1988, cc. 65-92; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, cc.1534-1536; Padlan, Molec. Imraun, 28, 1991, cc. 489-498; Padlan, Molec. Immun, 31(3), 1994, cc. 169-217).
Понятие "последовательность, соответствующая последовательности человеческой зародышевой линии" относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последователь
ность человеческой вариабельной области, или к подпоследовательности, для которой характерна наибольшая идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной референс-последовательностью вариабельной области, или к подпоследовательности, сопоставимой со всеми другими оцениваемыми аминокислотными последовательностями, которые кодируются последовательностями вариабельных областей зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. Понятие "последовательность, соответствующая последовательности человеческой зародышевой линии" можно относить также к аминокислотной последовательности человеческой вариабельной области или к подпоследовательности, для которой характерна наибольшая идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной референс-последовательностью вариабельной области, или к подпоследовательности, сопоставимой со всеми другими оцениваемыми аминокислотными последовательностями вариабельных областей. Последовательность, соответствующая последовательности человеческой зародышевой линии, может представлять собой только каркасные участки, только гипервариабельные участки, каркасные и гипервариабельные участки, вариабельный сегмент (как он определен выше) или другие комбинации последовательностей или подпоследовательностей, которые входят в вариабельную область. Идентичность последовательностей можно определять методами, представленными в настоящем описании, например путем выравнивания двух последовательностей с помощью BLAST, ALIGN или другого алгоритма выравнивания, известного в данной области. Нуклеотидная или аминокислотная последовательность, соответствующая человеческой зародышевой линии, может быть идентичной по меньшей мере примерно на 90, 92, 94, 96, 98, 99% нуклеотидной или аминокислотной референс-последовательности вариабельной области. Соответствующие человеческой зародышевой линии последовательности можно определять, например, с использованием публичных международных баз данных ImMunoGeneTics (IMGT) (сайт во всемирной сети imgt.cines.fr/) и V-base (сайт во всемирной сети vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk).
Фраза "специфически (или избирательно) связывается" в контексте настоящего описания применительно к взаимодействию между антигеном, например белком, и антителом или выведенным из антитела связывающим агентом относится к реакции связывания, которая позволяет выявлять присутствие антигена в гетерологичной популяции белков и других биологических субстанций, например в биологическом образце, например в образце крови, сыворотки, плазмы или ткани. Так в определенных условиях иммунологического анализа связывание антител или связывающих агентов, которые обладают конкретной специфичностью связывания, с конкретным антигеном по меньшей мере в 2 раза превышает фоновый сигнал, и они практически не связываются в значительной степени с другими антигенами, присутствующими в образце. Для обеспечения специфического связывания антитела или связывающего агента в таких условиях может потребоваться осуществление отбора антитела или агента на основе его специфичности к конкретному белку. Этот отбор необходимо или желательно осуществлять, отделяя антитела, которые дают перекрестную реакцию, например, с молекулами PCSK9 из других видов (например, мыши) или с другими подтипами PCSK9. Целый ряд форматов иммунологического анализа можно применять для отбора антител, обладающих специфической иммунореактивностью с конкретным белком. Например, для отбора антител, обладающих специфической иммунореактивностью с конкретным белком, обычно применяют твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) (см., например, описание форматов иммунологических анализов и условия, которые можно применять для определения специфической иммунореактивности, у Harlow и Lane, Antibodies A Laboratory Manual, 1988). Как правило, при этом сигнал, полученный в результате специфической или избирательной реакции связывания, должен по меньшей мере в 2 раза превышать фоновый сигнал и более предпочтительно превышать фоновый уровень более чем в 10-100 раз.
Понятие "константа равновесия реакции диссоциации (KD, М)" относится к значению константы скорости диссоциации (kd, время-1), деленному на константу скорости ассоциации (ka, время-1, М-1). Константы равновесия реакции диссоциации можно измерять с помощью любых известных в данной области методов. Для антител, предлагаемых в настоящем изобретении, как правило, характерны значения константы равновесия реакции диссоциации, составляющие менее примерно 10-7 или 10-8М, например менее примерно 10-9 или 10-10М, в некоторых вариантах осуществления изобретения менее примерно 10-11, 10-12 или 10-13М.
В контексте настоящего описания понятие "антигенсвязывающий участок (центр)" относится к домену PCSK9-связывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, который ответствен за специфическое связывание между молекулой и PCSK9. Антигенсвязывающий участок включает по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи антитела. В каждой PCSK9-связывающей молекуле, предлагаемой в настоящем изобретении, присутствует по меньшей мере один из антигенсвязывающих участков, и каждый из анти-генсвязывающих участков может быть идентичен другим или отличен от них. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из антигенсвязывающих участков PCSK9-связывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, действует в качестве антагониста
PCSK9.
Понятие "антагонист" в контексте настоящего описания относится к агенту, который обладает способностью специфически связываться и ингибировать активность молекулы-мишени. Например, антаго
нист PCSK9 специфически связывается с PCSK9 и полностью или частично ингибирует опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР. На ингибирование опосредуемого PCSK9 расщепления ЛПНПР может оказывать влияние, но может и не оказывать влияния связывание PCSK9 с ЛПНПР. В некоторых случаях антагонист PCSK9 можно идентифицировать по его способности связываться с PCSK9 и ингибировать связывание PCSK9 с ЛПНПР. Считается, что имеет место ингибирование, если уровень опосредуемого PCSK9 расщепления ЛПНПР при ее контакте с антагонистом, предлагаемым в изобретении, ниже по меньшей мере примерно на 10%, например ниже по меньшей мере примерно на 25, 50, 75% по сравнению с опосредуемым PCSK9 расщеплением в присутствии контроля или в отсутствие антагониста, или если совсем не происходит никакого расщепления (полное ингибирование). Контроль можно не приводить в контакт с антителом или антигенсвязывающей молекулой, приводить в контакт с антителом или антигенсвязывающей молекулой, которая специфически связывается с другим антигеном или с антителом к PCSK9 или антигенсвязывающей молекулой, в отношении которых известно, что они не обладают антагонистической функцией. Понятие "антитело-антагонист" используют в ситуации, когда антагонист представляет собой обладающее ингибирующей активностью антитело.
Понятия "PCSK9" и "пропротеин-конвертаза субтилизин/кексин типа 9а" используются взаимозаменяемо для обозначения встречающейся в естественных условиях человеческой пропротеин-конвертазы, относящейся к подсемейству протеиназ K семейства секреторных субтилаз. PCSK9 синтезируется в виде растворимого зимогена, который подвергается автокаталитическому внутримолекулярному процессингу в эндоплазматическом ретикулуме и, по-видимому, функционирует в качестве пропротеин-конвертазы. PCSK9 играет роль в гомеостазе холестерина и может участвовать в дифференцировке кортикальных нейронов. Установлено, что мутации в указанном гене PCSK9 ассоциированы с определенной формой аутосомально-доминантной семейной гиперхолестеринемии (см., например, Burnett и Hooper, Clin Biochem Rev, 29(1), 2008, cc. 11-26). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности PCSK9 известны и они были опубликованы в GenBank под регистрационными номерами NM174936.2 и NP777596.2 соответственно. В контексте настоящего описания используют полипептид PCSK9, который обладает функциональной способностью связываться с ЛПНПР и стимулировать расщепление ЛПНПР. С точки зрения структуры аминокислотная последовательность PCSK9 идентична по меньшей мере примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности, депонированной в GenBank под регистрационным номером NP777596.2. С точки зрения структуры нуклеотидная последовательность PCSK9 идентична по меньшей мере примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% нуклеотидной последовательности, депонированной в GenBank под регистрационным номером
NM174936.2.
Понятие "мутация, приводящая к усилению по доминантно-негативному типу функции гена PCSK9" относится к встречающимся в естественных условиях мутациям в генах PCSK9, которые ассоциированы и/или являются причиной возникновения фенотипа семейной гиперхолестеринемии, ускоренного атеросклероза и ранней ишемической болезни сердца, например, в результате усиленного расщепления ЛПНПР и снижения уровней ЛПНПР. Аллельная частота мутаций, приводящих к усилению по доминантно-негативному типу функции гена PCSK9, является редкой (см. Burnett и Hooper, Clin Biochem Rev., 29(1), 2008, cc. 11-26). Примерами мутаций, приводящих к усилению по доминантно-негативному типу функции гена PCSK9, являются D129N, D374H, N425S и R496W (см. Fasano и др., Atherosclerosis, 203(1), 2009, cc. 166-171). Обзоры, касающиеся мутаций, приводящих к усилению по доминантно-негативному типу функции гена PCSK9 см. у Burnett и Hooper, выше; Fasano и др., выше; Abifadel и др., J Med Genet, 45(12), 2008, cc. 780-786; Abifadel и др., Hum Mutat, 30(4), 2009, cc. 520-529; и Li и др., Recent Pat DNA Gene Seq., 1 ноября 2009 г. (PMID 19601924).
Понятие "активность" полипептида, предлагаемого в изобретении, относится к структурным, регу-ляторным или биохимическим функциям полипептида, присутствующего в нативной для него клетке или ткани. Примерами активности полипептида являются как непосредственные (прямые) виды активности, так и косвенные (опосредованные) виды активности. Примерами прямых видов активности PCSK9 являются результаты непосредственного взаимодействия с полипептидом, включая связывание с ЛПНПР и опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР. Примерами опосредованных видов активности касательно PCSK9 являются изменения фенотипа или ответ клетки, ткани, органа или индивидуума, обусловленные активностью полипептида, например снижение повышенного уровня ЛПНПР в печени, снижение уровня ЛПВП-Х в плазме, снижение уровня холестерина в плазме, повышение чувствительности к статинам.
Понятие "выделенный" применительно к нуклеиновой кислоте или белку означает, что нуклеиновая кислота или белок практически свободна/свободен от других клеточных компонентов, с которыми она/он ассоциированы в ее/его естественном состоянии. Предпочтительно она/он находятся в гомогенном состоянии. Она/он могут находиться в безводной форме или в водном растворе. Степень чистоты и гомогенности, как правило, определяют с помощью методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Белок, присутствующий в препарате в наибольшем количестве по сравнению с другими видами, является практически очищенным. В частности, выделенный ген выделяют из открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белок, отличный от того, который кодирует представляющий интерес ген. Понятие "очищен- 10
ный" обозначает, что нуклеиновая кислота или белок дает практически одну полосу на электрофоретиче-ском геле. В частности, это означает, что нуклеиновая кислота или белок имеет степень чистоты, составляющую по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%.
Понятие "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам либо в одноцепочечной, либо в двух-цепочечной форме. Если специально не указано иное, то под понятие подпадают нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги, встречающиеся в естественных условиях, которые обладают такой же способностью к связыванию, что и нуклеиновая кислота, с которой проводится сравнение, и метаболизируются аналогично встречающимся в естественных условиях нуклеотидам. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность включает также ее консервативно модифицированные варианты (например, замены кодонов в рамках вырожденности генетического кода), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также специально указанную последовательность. Так замены кодонов, связанные с вырожденностью генетического кода, можно осуществлять, создавая последовательности, в которых третье положение одного или нескольких (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer и др., Nucleic Acid Res. 19, 1991, с. 5081; Ohtsuka и др., J. Biol. Chem. 260, 1985, cc. 2605-2608 и Cassol и др., 1992; Rossolini и др., Mol. Cell. Probes 8, 1994, cc. 91-98).
Понятия "полипептид", "пептид" и "белок" в контексте настоящего описания используются взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Понятие применимо к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный полученный химическим путем миметик соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также к встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам и не встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам.
Понятие "аминокислота" относится к встречающимся в естественных условиях и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично встречающимся в естественных условиях аминокислотам. Встречающиеся в естественных условиях аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые впоследствии модифицируются, например гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Понятие "аминокислотные аналоги" относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в естественных условиях аминокислота, т.е. имеют атом углерода в а-положении, который связан с атомом водорода, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и ме-тионинметилсульфоний. Такие аналоги несут модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в естественных условиях аминокислота. Понятие "аминокислотные миметики" относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично встречающейся в естественных условиях аминокислоте.
Понятие "консервативно модифицированные варианты" относится как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. Касательно конкретных нуклеотидных последовательностей понятие "консервативно модифицированные варианты" относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода любой конкретный белок кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин кодируется кодоном, кодон можно заменять на любые соответствующие известные кодоны без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются "молчащими вариациями", которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариантов. В контексте настоящего описания подразумевается, что каждая нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, включает также все возможные молчащие вариации нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, для каждой описанной последовательности подразумевается каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид.
Касательно аминокислотных последовательностей специалисту в данной области должно быть очевидно, что индивидуальные замены, делеции или добавления в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или изымают одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, приводят к получению консервативно модифицированного варианта, в котором изменение приводит к замене аминокислоты на хими
чески сходную аминокислоту. Перечень консервативных замен, обеспечивающих получение функционально аналогичных аминокислот, хорошо известен в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты (и дополнительные варианты) не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели, предлагаемые в изобретении.
Каждая из приведенных ниже 8 групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга:
1) аланин (A), глицин (G);
2) аспарагиновая кислота (D), глютаминовая кислота (E);
3) аспарагин (N), глютамин (Q);
4) аргинин (R), лизин (K);
5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);
6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);
7) серии (S), треонин (T); и
8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins (1984)).
Понятие "процент идентичности последовательностей" означает величину, определяемую путем сравнения двух оптимальным образом выровненных последовательностей в окне сравнения, где фрагмент полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может иметь вставки или делеции (т.е. бреши) по отношению к последовательности, с которой производится сравнение (референс-последовательности) (например, последовательности полипептида, предлагаемого в изобретении), которая не имеет вставок или делеций, для оптимального сравнительного анализа первичной структуры двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях встречается идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток, в результате чего получают количество совпадающих положений, деления количества совпавших положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей.
Понятия "идентичный" или процент "идентичности" в отношении двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются "практически идентичными", если две последовательности имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичность на уровне 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% в определенной области или, если она не указана конкретно, в полной последовательности) при сопоставлении и выравнивании с целью выявления максимального соответствия в окне сравнения или в предназначенной для этого области, что устанавливают с использованием одного из перечисленных ниже алгоритмов сравнения или путем сравнения вручную и визуального анализа. Изобретение относится к полипептидам или полинуклеотидам, которые являются практически идентичными полипептидам или полинуклеотидам соответственно, приведенным в настоящем описании в качестве примеров (например, к вариабельным областям, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-5, 15-19 и 40-41; вариабельным сегментам, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 27-31; к CDR, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 6-14, 20-26; FR, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 32-39; и нуклеотидным последовательностям, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 42-45). Необязательно идентичность имеет место в области длиной примерно 15, 25 или 50 нуклеотидов или более предпочтительно в области длиной от 100 до 500 или 1000 или более нуклеоти-дов или по всей длине референс-последовательности. В аминокислотных последовательностях идентичность или практическая идентичность может иметь место в области, состоящей по меньшей мере из 5, 10, 15 или 20 аминокислот, необязательно по меньшей мере примерно 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот, необязательно по меньшей мере примерно 150, 200 или 250 аминокислот или по всей длине референс-последовательности. В более коротких аминокислотных последовательностях, например аминокислотных последовательностях, состоящих из 20 или меньшего количества аминокислот, практическая идентичность может иметь место, когда один или два аминокислотных остатка консервативно заменены с использованием описанных выше консервативных замен.
При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность представляет собой референс-последовательность, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения данные о тестируемой последовательности и референс-последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности и параметры алгоритмической программы сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы, задаваемые по умолчанию, или альтернативные параметры. После этого алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает на основе параметров программы процент идентичности для тестируемых последовательностей и референс-последовательности.
В контексте настоящего описания понятие "окно сравнения" относится к сегменту, содержащему любое количество следующих непрерывно друг за другом (смежных) положений, выбранных из группы,
содержащей от 20 до 600, предпочтительно от примерно 50 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 150 положений, в которых можно сравнивать последовательность с рефе-ренс-последовательностью, имеющей такое же количество следующих друг за другом непрерывных положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, пригодные для сравнения, хорошо известны в данной области. Оптимальный сравнительный анализ последовательностей можно осуществлять, например, с использованием алгоритма локальной гомологии, который описан у Smith и Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 1970, с. 482, алгоритма сравнительного анализа гомологии, который описан у Needleman и Wunsch., J. Mol. Biol. 48, 1970, с. 443, метода поиска сходства, который описан у Pearson и Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85, 1988, c. 2444, с использованием компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, входящих в пакет программ фирмы Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, США) или путем сравнения вручную и визуального анализа (см., например, Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology (1995, приложение).
Двумя примерами алгоритмов, которые можно применять для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, могут служить алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные у Altschul и др., Nuc. Acid Res. 25, 1977, cc. 3389-3402 и у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов с помощью BLAST может быть предоставлено Национальным центром биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). В этом алгоритме сначала производится идентификация пар последовательностей с высокими баллами (HSP) путем идентификации коротких "слов" длины W в рассматриваемой последовательности, которые или совпадают, или удовлетворяют определенной положительной пороговой оценке (баллу) T при сравнении со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговой оценкой (баллом) близкого "слова" (Altschul и др., 1990). Эти исходные совпадения близких "слов" используются в качестве "затравки" для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих эти "слова" более длинных HSP. Затем выборки "слова" удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока происходит увеличение кумулятивного (накопительного) балла при сравнительном анализе. Кумулятивные баллы для нуклео-тидных последовательностей вычисляют с использованием параметров M (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда > 0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение совпадающих "слов" в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину X от своего максимального достигнутого значения, если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков или если достигается конец какой-либо последовательности. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина "слова" (W), равная 11, ожидание (E), равное 10, M=5, N=-4, при этом производится сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина "слова" (W), равная 3, ожидание (E), равное 10, и матрица баллов BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1989, c. 10915) для сравнительного анализа (B) 50, ожидание (E), равное 10, М=5, N=-4, при этом производится сравнение обеих цепей.
Алгоритм BLAST позволяет осуществлять также статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5787). Одним из критериев степени сходства, который позволяет получать алгоритм BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая характеризует вероятность, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, считается, что тестируемая нуклеотидная последовательность является сходной с референс-последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотид-ной последовательности с нуклеотидной референс-последовательностью меньше приблизительно 0,2, более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001.
Свидетельством того, что две нуклеотидные последовательности или два полипептида являются практически идентичными, служит то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, обладает перекрестной иммунологической реактивностью с антителами к полипептиду, который кодируется второй нуклеиновой кислотой, как это описано ниже. Так полипептид, как правило, является практически идентичным второму полипептиду, например, в том случае, когда два пептида различаются только консервативными заменами. Другим свидетельством того, что две нуклеотидные последовательности являются практически идентичными, служит то, что две молекулы или их комплементы гибридизуются друг с другом в строгих условиях, как это описано ниже. Еще одним свидетельством того, что две нук-леотидные последовательности являются практически идентичными, служит то, что для амплификации последовательностей можно использовать одни и те же праймеры.
Понятие "связь" в контексте настоящего описания характеризует то, каким образом антигенсвязы-вающие участки соединены с PCSK9-связывающей молекулой, предлагаемой в настоящем изобретении, под понятие подпадают все возможные пути физического соединения областей. Большинство антиген-связывающих участков часто соединяются химическими связями, такими как ковалентная связь (например, пептидная связь или дисульфидный мостик) или нековалентная связь, которая может представлять собой либо непосредственную связь (т. е. без линкера между двумя антигенсвязывающими участками), либо косвенную связь (т. е. с помощью по меньшей мере одной линкерной молекулы между двумя или большим количеством антигенсвязывающих участков).
Понятия "субъект", "пациент" и "индивидуум", которые используются взаимозаменяемо, относятся к млекопитающему, например к человеку или примату, кроме человека. Млекопитающее может представлять собой также лабораторное млекопитающее, например мышь, крысу, кролика, хомяка. В некоторых вариантах осуществления изобретения млекопитающее может представлять собой сельскохозяйственное млекопитающее (например, лошадь, овцу, корову, свинью, верблюда) или домашнее млекопитающее (например, собаку, кошку).
Понятие "терапевтически приемлемое количество" или "терапевтически эффективная доза", которые используются взаимозаменяемо, относится к количеству, достаточному для достижения требуемого результата (т.е. снижению уровня не-ЛПВП-Х в плазме, облегчению гиперхолестеринемии, атеросклероза, ишемической болезни сердца). В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтически приемлемое количество не индуцирует или не вызывает нежелательных побочных действий. Терапевтически приемлемое количество можно определять путем первоначального введения низкой дозы и последующего постепенного повышения указанной дозы вплоть до достижения требуемого действия. Применение антитела, являющегося антагонистом PCSK9, в "профилактически эффективной дозе" и "терапевтически эффективной дозе" может предупреждать возникновение или приводить к уменьшению серьезности симптомов заболевания, ассоциированного с присутствием PCSK9 (например, гиперхолестерине-мии), соответственно. Применение рассматриваемого антитела в дозах, подпадающих под указанные определения, может также стимулировать наступление или увеличивать соответственно частоту и продолжительность периодов времени, свободных от симптомов заболевания. "Профилактически эффективная доза" и "терапевтически эффективная доза" могут также предупреждать или ослаблять соответственно ухудшение состояния или недееспособность, вызываемую нарушениями и заболеваниями, которые обусловлены активностью PCSK9.
Понятие "совместное введение" относится к введению, обеспечивающему одновременное присутствие двух действующих веществ в крови индивидуума. Действующие вещества, подлежащие совместному введению, можно вводить одновременно или последовательно.
В контексте настоящего описания фраза "состоящий практически из" относится к типам или видам фармацевтических действующих веществ, применяемых в способе или включенных в композицию, а также к любым эксципиентам, которые не обладают активностью с точки зрения цели, для которой предназначены способы или композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения фраза "состоящий практически из" специально указывает на то, что исключено присутствие одного или нескольких дополнительных действующих веществ, отличных от антитела, являющегося антагонистом PCSK9, предлагаемым в изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения фраза "состоящий практически из" специально указывает на то, что исключено присутствие одного или нескольких дополнительных действующих веществ, отличных от антитела, являющегося антагонистом PCSK9, предлагаемым в изобретении, и второго предназначенного для совместного введения вещества.
Понятие "статин" относится к классу фармакологических веществ, являющихся конкурентными ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент A-(HMG-CoA) редуктазы.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO: 1) и легкой (SEQ ID NO: 15) цепи родительского мышиного моноклонального антитела NVP-LFU720. Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 2 - аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO: 2) и легкой (SEQ ID NO: 16) цепи родительского мышиного моноклонального антитела NVP-LGT209. Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 3 - аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO: 2) и легкой (SEQ ID NO: 18) цепи родительского мышиного моноклонального антитела NVP-LGT210. Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 4 - аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO: 4) и легкой (SEQ ID NO: 16) цепи родительского мышиного моноклонального антитела NVP-LGT211. Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 5А-5В - результаты анализа методом ELISA связывания NVP-LGT209 (A), NVP-LGT210 (Б) и NVP-LGT-211 (В) с несколькими различными человеческими и мышиными антигенами в сравнении с результатами, полученными для NVP-LFU720-NX-4;
на фиг. 6А-6В - результаты оценки методом ELISA связывания NVP-LGT209 (A), NVP-LGT210 (Б)
и NVP-LGT-211 (В) с Pcsk9 человека и обезьяны циномолгус (cyno Pcsk9). В качестве вторичного антитела применяли козье антимышиное антитело в разведении 1:5000. "Только 2-е" обозначает контроль, в котором применяли только вторичное антитело;
на фиг. 7 - иллюстрация того, что родительское мышиное моноклональное антитело NVP-LFU720 связывается с С-концом PCSK9 (остатки 680-692, RSRHLAQASQELQ; SEQ ID NO: 49). Humaneered(tm)-антитела LGT209, LGT210 и LGT211 конкурируют за связывание с тем же эпитопом. Мутант с C-концевой мутацией (С-концевой мутант) A685X имеет последовательность, представленную в SEQ ID
NO: 56;
на фиг. 8 - результаты биохимического анализа методом резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (TR-FRET), свидетельствующие о том, что родительское мышиное антитело NVP-LFU720 (5P20) слабо нарушало взаимодействие PCSK9 и ЛПНПР. В отличие от этого антитело 13C10 приводило к нарушению взаимодействия PCSK9-ЛПНПР, что характеризовалось по данным FRET-анализа величиной IC50, составляющей 50 нМ. Человеческую PCSK9, меченную флуорофо-ром (hPCSK9-AF), инкубировали с NVP-LFU720-AX-1 или 13C10 в буфере для анализа (20 мМ HEPES, pH 7,2, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, 0,1 об.% Твин 20, и 0,1% (мас./об.)) БСА в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого добавляли меченный европием ЛПНПР (h ЛПНПР-Eu) и осуществляли дополнительную инкубацию при комнатной температуре в течение 90 мин, в результате чего конечная концентрация hPcsk9-AF составляла 8 нМ, а конечная концентрация h ЛПНПР-Eu составляла 1 нМ. TR-FRET-сигнал (длина волны возбуждения 330 нм, длина волны испускания 665 нм) измеряли с помощью планшет-ридера (типа EnVision 2100, фирма Perkin Elmer) и рассчитывали % ингибирования в присутствии 5P20 или 13C10. Значения IC50 рассчитывали на основе графика процента ингибирования с помощью программы Prism (пакет программ GraphPad). Каждая экспериментальная точка представляла собой среднее значение ±С.К.О. (n=4 повторности на одну точку). Представлены данные, полученные по меньшей мере в двух независимых экспериментах;
на фиг. 9 - результаты, свидетельствующие о том, что Humaneered(tm)-антитела LGT209, LGT210 и LGT211 эквивалентны мышиному антителу LFU720 в отношении индукции повышения уровней ЛПНПР и поглощения ЛПНП клетками линии HepG2. Для измерения уровня ЛПНПР клетки инкубировали с PCSK9-связывающими антителами и метили с помощью антител к ЛПНПР. Для оценки поглощения ЛПНП клетки инкубировали с PCSK9-связывающими антителами, PCSK9 и DiI-ЛПНП. Флуоресценцию антител к ЛПНПР и DiI-ЛПНП измеряли с помощью проточной цитометрии. Для каждого анализа данные представлены в виде средних значений+С. К. О. по результатам повторных экспериментов. Представлены данные, полученные по трем независимым экспериментам.
Для проведения анализа поглощения ЛПНП PCSK9-связывающие антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки с дефицитом липопротеина (фирма Intracel) и 200 нМ человеческой PCSK9 (Hampton и др., PNAS, 104, (2007, cc. 14604-14609), и содержащие антитело/PCSK9/среду растворы добавляли к клеткам, находящимся в 96-луночных планшетах, и инкубировали в течение ночи. На следующий день добавляли меченный 1,1'-диокстадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлоратом ЛПНП (DiI-ЛПНП, фирма Bio-medical Technologies) и выдерживали еще в течение дополнительных 2 ч. Затем среду удаляли путем аспирации, клетки трижды отмывали ЗФР и подвергали диссоциации путем обработки смесью 0,25% трип-сина-ЭДТК. Затем клетки переносили в буфер для FACS (ЗФР, дополненный 5% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ ЭДТК и 0,2% азида натрия), центрифугировали при 1000xg в течение 10 мин, подвергали аспирации и фиксировали в 1%-ном параформальдегиде. Поглощение ЛПНП оценивали путем измерения испускаемой клетками DiI-флуоресценции (длина волны возбуждения 488 нм, длина волны испускания 575 нм) с помощью проточной цитометрии (устройство типа Becton Dickinson LSR II). Для анализа расположенных на клеточной поверхности ЛПНПР (поверхностные ЛПНПР) клетки инкубировали с бессывороточной средой, содержащей антитела, отмывали с помощью ЗФР и собирали в буфер Versine (фирма Biowhittaker, 17-771E) и буфер для FACS-анализа. Клетки переносили в новые планшеты, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин и блокировали с помощью нормального кроличьего IgG (фирма МР Biomedicals). Клетки метили с использованием меченных Alexa 647 кроличьих антител в виде IgG к h ЛПНПР (5 мкг/мл) в буфере для FACS-анализа, центрифугировали, отмывали и фиксировали в 1%-ном параформальдегида. Количество поверхностных ЛПНПР измеряли с помощью проточной цито-метрии (длина волны возбуждения 488 нм, длина волны испускания 633 нм). Значения IC50 рассчитывали с помощью программы Prism (пакет программ GraphPad);
на фиг. 10 - план исследования по оценке снижающего воздействия антител, предлагаемых в настоящем изобретении, на уровень холестерина, проведенного на мышиной модели с использованием ин-фузии человеческой PCSK9. LGT209, LGT210 и LGT211 представляли собой Humaneered(tm)-антитела к PCSK9, которые связывались с высокой аффинностью с hPCSK9, и при этом их связывание с мышиной PCSK9 находилось на уровне ниже предела обнаружения. Для выяснения вопроса о том, могут ли LGT209, LGT210 или LGT211 ингибировать опосредуемое hPCSK9 повышение уровня не-ЛПВП-Х и в
то же время предупреждать опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР в печени, каждой мыши вводили путем инъекции антитела за 3 ч до имплантации осмотического мини-насоса, содержащего hPCSK9 (для осуществления непрерывной инфузии). Через 24 ч после инъекции hPCSK9 осуществляли отбор образцов плазмы и ткани печени;
на фиг. 11 - результаты, полученные на мышиной модели с использованием инфузии, которые свидетельствуют о том, что антитела LGT209, LGT210 и LGT211 приводили к накоплению человеческой PCSK9 ("hPCSK9"). В целом, опыт проводили следующим образом: уровень общей hPCSK9 измеряли с помощью ELISA с использованием МАт 7D16 для осуществления захвата. МАт 7D16 связывалось с эпи-топом на PCSK9, отличным от эпитопа, с которым связывались LGT209, LGT210 и LGT211, и его можно было применять для измерения уровня общей (свободной и связанной) PCSK9. Обнаруженное повышение уровня общей hPCSK9, по-видимому, обусловлено увеличением количества комплексов hPCSkK9/AT. Уровень свободного антитела измеряли с помощью ELISA с использованием hPCSK9 для осуществления захвата. Этот анализ позволял измерять уровень "свободного" антитела и возможно уровень комплексов Ат:PCSK9 (1:1). Мышей линии C57BL/6 обрабатывали только наполнителем, только PCSK9, PCSK9+20 мг/кг LGT210, PCSK9+20 мг/кг NVP-LGT211 или смесью мышиных неспецифических IgG (отрицательный контроль). Индивидуальные экспериментальные точки наносили на график и среднее значение отмечали горизонтальной черточкой; результаты считали статистически достоверными при p <0,05.
Уровни IgG в плазме определяли количественно с помощью метода анализа фирмы Meso Scale Discovery (MSD). Уровень свободного антитела измеряли с использованием hPCSK9 для осуществления захвата. Этот анализ позволял измерять уровень "свободного" антитела и возможно уровень комплексов Ат:PCSK9 (1:1). Для проведения MSD-анализа IgG применяли стандартные 96-луночные планшеты фирмы MSD (типа L11XA-3). В целом, опыт проводили следующим образом: планшеты сенсибилизировали в течение ночи при 4°C с использованием 25-28 мкл захватывающего антигена, а именно PCSK9-His, 1 мкг/мл в ЗФР (25-28 нг/лунку). Удаляли раствор, применявшийся для сенсибилизации, и планшеты блокировали с использованием 150 мкл/лунку 5% блокирующего буфера Blocker А фирмы MSD (R93AA-2), осуществляя встряхивание в течение 1 ч при комнатной температуре. После 3-кратной отмывки планшета с использованием 300 мкл ЗФР+0,05% Твин-20 добавляли 25 мкл разведений используемого для калибровки IgG (10 серийных разведений от 10000 до 0,0003 нг/мл с использованием Blocker А фирмы MSD), разведений неизвестного образца плазмы (10000x, Blocker А фирмы MSD) или образцов для качественного контроля и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки добавляли по 25 мкг/лунку взятого в концентрации 1 мкг/мл идентифицирующего антитела (идентифицирующее козье антимышиное меченное с помощью SULFO-TAG антитело фирмы MSD, а именно R32AC-5, разведенное с помощью 1% БСА/ЗФР/0,05% Твин 20) и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки и добавления по 150 мкл/лунку 1 x буфера Т для считывания планшет сразу считывали с помощью устройства SECTOR Imager 6000 фирмы MSD. С помощью программы для анализа данных фирмы MSD строили стандартную кривую и графики для неизвестных образцов.
Уровни IgG и hPCSK9 в плазме определяли количественно с помощью метода анализа фирмы Meso Scale Discovery (MSD). MSD-анализ hPCSK9 проводили аналогично анализу IgG, но со следующими исключениями. Планшеты сенсибилизировали с использованием 25-28 мкл захватывающего антитела (7D16.C3: 2,95 мг/мл) в концентрации 1 мкг/мл. МАт 7D16 связывается с эпитопом на PCSK9, отличным от эпитопа, с которым связываются LGT209, LGT210 и LGT211, и его можно использовать для измерения уровня общей (свободной и связанной) PCSK9. После блокирования планшетов осуществляли инкубацию 25 мкл разведений используемого для калибровки hPCSK9 (10 серийных разведений от 10000 до 0,0003 нг/мл) и разведений образца плазмы (10000x, Blocker А фирмы MSD) при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией с первичным идентифицирующим антителом (кроличье поликлональное антитело к PCSK9, а именно Ab4, лабораторный номер Rabbit ID № RB11835). Дополнительно осуществляли стадию инкубации с вторичным идентифицирующим антителом (идентифицирующее козье антимышиное меченное с помощью SULFO-TAG антитело фирмы MSD, R32AC-5) перед считыванием с помощью устройства SECTOR Imager 6000 фирмы MSD. Выявленное повышение уровня общей hPCSK9, по-видимому, обусловлено увеличением количества комплексов hPCSkK9/AT. Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPad Prism 4.02 (пакет программ GraphPad, Сан-Диего, шт. Калифорния). Для анализа различий между группами использовали односторонний дисперсионный анализ и в случае выявления общих различий применяли апостериорный критерий Ньюмена-Кеулса для оценки специфических различий между группами обработки;
на фиг. 12 - данные, полученные на мышиной модели с использованием инфузии, которые демонстрируют, что антитела LGT209, LGT210 и LGT211 обеспечивают защиту ЛПНПР в печени от опосредуемого hPCSK9 расщепления. Мышей линии C57BL/6 обрабатывали только одним наполнителем, только PCSK9, PCSK9+20 мг/кг LGT210, PCSK9+20 мг/кг NVP-LGT211 или смесью мышиных неспецифических IgG (отрицательный контроль). Представлены результаты, полученные на образцах, взятых из пече
ни индивидуальных животных.
Электрофорез в полиакриламидном геле образцов плазматических мембран осуществляли на 20-зоновом 4-12% бис-трис-геле типа Invitrogen Midi (фирма Invitrogen, WG1402BX10) с использованием в качестве подвижного буфера MOPS (фирма Invitrogen, NP0001). Приготовленные образцы выдерживали при 70°C в течение 10 мин, помещали на лед и затем с помощью многоканальной пипетки фирмы Matrix вносили на гель по 10 мкл каждого образца. Наряду с образцами вносили маркеры SeeBlue Plus2 (фирма Invitrogen, LC5925) для определения размера и ориентации геля. Гели разгоняли при постоянном напряжении 200 В до тех пор, пока фронт красителя не достигал нижней границы геля. После электрофореза гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны (фирма Invitrogen, IB3010-01) с помощью устройства iBlot (фирма Invitrogen, IB1001EU). Перенос осуществляли при 20В в течение 7 мин. После переноса мембраны блокировали с помощью Pierce Superblock T20 (фирма Pierce, 37536) в течение по меньшей мере 30 мин. Мембраны помещали в пакеты типа "seal-a-meal" и затем добавляли разведенное с помощью Superblock в соотношении 1:500 кроличье антитело к ЛПНПР, после чего инкубировали в течение ночи при 4°C при качании. Мембраны пятикратно промывали в TBS/0,05% Твин в течение 5 мин при качании, а затем к мембранам добавляли разведенное с помощью Superblock в соотношении 1:30000 вторичное козье антикроличье антитело, конъюгированное с HRP, и выдерживали в течение 1 ч. Мембраны снова пятикратно промывали TBS/0,05% Твин в течение 5 мин при встряхивании. Содержащий HRP конъюгат обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico фирмы Pierce (фирма Pierce, 37079) согласно инструкциям производителя. В целом, процедура заключалась в следующем: смешивали взятые в равных частях раствор пероксидазы и раствор, содержащий луми-нол/усилитель люминесценции, добавляли к мембранам (0,2 мл/см2) и выдерживали в течение 5 мин. Избыток раствора удаляли путем промокания, и мембраны экспонировали на рентгеновскую пленку Kodak BioMax MR (фирма Kodak, 870 1302);
на фиг. 13А-13В - данные, полученные на мышиной модели с использованием инфузии, которые демонстрируют, что антитела LGT209, LGT210 и LGT211 приводили к снижению уровней не-ЛПВП-холестерина в плазме. Предварительная инъекция антитела LGT209 обеспечивала 46%-ную защиту от опосредуемого hPCSK9 повышения уровня не-ЛПВП-холестерина. Предварительная инъекция LGT210 или LGT211 обеспечивала эквивалентную или более высокую защиту от опосредуемого hPCSK9 повышения уровня не-ЛПВП-холестерина. 13C10 представляет собой валидированное мышиное антитело к PCSK9, которое связывается с высокой аффинностью с hPCSK9, и его применяли в рассматриваемом анализе в качестве положительного контроля. Мышей линии C57BL/6 обрабатывали только одним наполнителем, только PCSK9, PCSK9+20 мг/кг LGT209, PCSK9+20 мг/кг LGT210, PCSK9+20 мг/кг NVP-LGT211, PCSK9+20 мг/кг 13C10 или смесью мышиных неспецифических IgG (отрицательный контроль). Представлены индивидуальные данные, среднее значение отмечено горизонтальной черточкой. Для количественного определения уровня общего холестерина в плазме использовали клинический анализатор фирмы Olympus (фирма Olympus America Inc., Olympus AU400). Образцы плазмы разводили в соотношении 1:3 в ddH2O, и в разведенных образцах плазмы объемом по 40 мкл количественно определяли уровень общего холестерина согласно инструкциям производителя. Для количественного определения уровней ЛПВП и не-ЛПВП в плазме получали липопротеиновые фракции холестерина с помощью устройства Spife 3000 фирмы Helena Laboratories. Все процедуры, включая приготовление образцов, приготовление геля, внесение образцов, проведение гель-электрофореза, окрашивание, отмывку и сушку, осуществляли согласно инструкциям, представленным в руководстве для оператора. Затем гель сканировали с помощью сканера Quick Scan 2000 с использованием Slit 5, и рассчитывали относительное процентное содержание липопротеиновых фракций холестерина с помощью денситометра фирмы Helena. И, наконец, рассчитывали абсолютные величины уровней ЛПВП и не-ЛПВП путем умножения процентного содержания каждой фракции на уровни общего холестерина;
на фиг. 14 - сравнение фармакокинетических профилей (ФК) антител LGT209, LGT210 и LGT211 ("молчащий" человеческий IgG1) и профиля "типичного" IgG1 (ФК). Время полужизни антител LGT209, LGT210 и LGT211 заметно больше (7-13 дней), чем время полужизни типичного IgG1 (примерно 6 дней) (например, при его определении в организме человека). Не было выявлено доказательств наличия опосредуемого мишенью смещения (TMD), это свидетельствует о том, что антитела не обладают перекрестной реактивностью с PCSK9 грызунов). Каждое тестируемое антитело вводили путем инъекции 3 самцам крыс линии Lewis в дозе, составлявшей 10 мг/кг. В моменты времени 0, 1, 6, 24 ч, 2, 4, 8 и 16 дней брали образцы крови объемом по 250 мкл, осветленную плазму разводили и анализировали методом иммунного захвата (ELISA, козий античеловеческий IgG) с целью измерения общего количества выделенных человеческих антител. Для каждого тестируемого антитела строили также стандартную кривую. Строили график зависимости количества выделенного IgG от ожидаемого количества выделенного типичного человеческого IgG в организме крыс.
Подробное описание изобретения
1. Введение.
Антитела и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, специфически связываются с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9а ("PCSK9"). Предлагаемые в на
стоящем изобретении антитела к PCSK9 и антигенсвязывающие молекулы связываются с С-концом PCSK9 и обладают неожиданной способностью оказывать интерферирующее воздействие на опосредуемое PCSK9 расщепление рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛПНПР), не оказывая при этом интерферирующего воздействия на связывание PCSK9 с ЛПНПР. В частности, антитела к PCSK9 и анти-генсвязывающие молекулы связываются с эпитопом, находящимся между остатками 680-692 PCSK9, например с эпитопом, находящимся внутри аминокислотной последовательности RSRHLAQASQELQ (SEQ ID NO: 49), которая расположена на С-конце PCSK9. Поскольку антитела и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, связываются с PCSK9, связанной с клеткой, а не только с присутствующей в кровотоке PCSK9, то они обладают сравнительно более продолжительным временем полужизни in vivo в организме пациента, например, составляющим по меньшей мере примерно 7 дней или более, и в некоторых вариантах осуществления изобретения они обеспечивают снижающее уровень ли-пидов действия в течение по меньшей мере 2 недель после введения. Антитела к PCSK9 и антигенсвязы-вающие молекулы, предлагаемые в изобретении, являются антагонистами PCSK9 в том смысле, что они препятствуют, снижают и/или ингибируют опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР, тем самым способствуя повышению поглощения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х). Антитела к PCSK9 и антигенсвязывающие молекулы можно применять для лечения индивидуумов, страдающих, например, дислипидемией, гиперхолестеринемией, триглицеридемией и другими опосредуемыми PCSK9 болезненными состояниями.
2. Общая характеристика улучшенных антител к PCSK9.
Фрагменты антител к PCSK9 можно получать с помощью любых методов, известных в данной области, включая (но, не ограничиваясь только ими) методы рекомбинантной экспрессии, химического синтеза и ферментативного расщепления тетрамеров антител, в то время как полноразмерные монокло-нальные антитела можно получать, например, с использованием гибридом или методами рекомбинации. Рекомбинантную экспрессию можно осуществлять с использованием любых пригодных клеток-хозяев, известных в данной области, например клеток-хозяев млекопитающих, бактериальных клеток-хозяев, дрожжевых клеток-хозяев, клеток-хозяев насекомых и т.д. Если константные области присутствуют в антителах к PCSK9, то при необходимости они могут быть любого типа или подтипа, и их можно выбирать с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, из видов животных, подлежащих лечению (например, человек, примат кроме человека или другое млекопитающее, например сельскохозяйственное млекопитающее (например, лошадь, овца, корова, свинья, верблюд), домашнее млекопитающее (например, собака, кошка) или грызун (например, крыса, мышь, хомячок, кролик). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 гуманизируют или создают с помощью Humaneered(tm)-технологии (Humaneered(tm)-антитела). В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область относится к изотипу IgG, например IgG1. В некоторых вариантах осуществления изобретения константную область человеческого IgG1 подвергают мутации для снижения аффинности связывания с эффекторным лигандом, таким как Fc-рецептор (FcR), например Fc-гамма R1 на поверхности клетки, или О-компонент системы комплемента (см., например, US 5624821). Антитела, содержащие такие мутации, опосредуют пониженную антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксич-ность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или вообще не опосредуют указанные виды активности. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки L234 и L235 константной области IgG1 заменяют на Ala234 и Ala235. Нумерация остатков в константной области тяжелой цепи соответствует нумерации EU (см. Kabat и др., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", изд-во U.S. Dept. Health and Human Services, 1983; см. также, например, Woodle и др., Transplantation, 68(5), 1999, cc. 608-616; Xu и др., Cell Immunol, 200(1), 2000, cc. 16-26 и Hezareh и др., J Virol,
75(24), cc. 12161-12168).
Антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают также однодоменные антигенсвязывающие единицы, имеющие каркас верблюжьего антитела. К животным из семейства верблюдовых относятся верблюды, ламы и альпаки. В организме представителей верб-людовых образуются антитела, в которых отсутствуют легкие цепи. Укладка вариабельной области тяжелой цепи (VH) происходит автономно и она функционирует в качестве независимой антигенсвязы-вающей единицы. Ее связывающаяся поверхность включает только три CDR в отличие от шести CDR в классических антигенсвязывающих молекулах (Fab-фрагменты) или одноцепочечных фрагментах вариабельных областей (scFv). Верблюжьи антитела могут обладать аффинностью к связыванию, сопоставимой с аффинностью обычных антител. Молекулы антител к PCSK9, имеющие верблюжьи каркасы, которые обладают специфичностью связывания, присущей антителам к PCSK9, приведенным в качестве примера в настоящем описании, можно получать методами, хорошо известными в данной области, например, описанными у Dumoulin и др., Nature Struct. Biol., 11, 2002, cc. 500-515; Ghahroudi и др., FEBS Letters, 414, 1997, cc. 521-526 и Bond и др., J Mol Biol., 332, 2003, cc. 643-655.
Улучшенные антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, представляют собой сконструированные человеческие антитела с последовательностями V-областей, которые практически идентичны аминокислотным последовательностям V-областей человеческой зародышевой линии, но сохраняют специфичность и аффинность референс-антитела (см. публикацию патента США № 2005/0255552 и пуб
ликацию патента США № 2006/0134098, которые обе включены в настоящее описание в качестве ссылки). Процесс улучшения заключается в получении информации о минимальных последовательностях, необходимых для определения специфичности связывания с антигеном, присутствующих в вариабельной области референс-антитела и перенос этой информации в библиотеку человеческих последовательностей генов частичных V-областей с целью создания "сфокусированной" на эпитопах библиотеки V-областей человеческих антител. Микробную систему секреции можно применять для экспрессии представителей библиотеки в виде Fab'-фрагментов антител, и библиотеку подвергать скринингу в отношении антигенсвязывающих Fab'-фрагментов, например, с помощью анализа связывания с использованием переноса колоний клеток (см., например, публикацию патента США № 2007/0020685). Позитивные клоны можно дополнительно характеризовать для идентификации клонов, обладающих самой высокой аффинностью. Полученные сконструированные человеческие Fab-фрагменты сохраняют специфичность связывания родительского референс-антитела к PCSK9, как правило, обладают эквивалентной или более высокой аффинностью к антигену по сравнению с родительским антителом и имеют V-области, последовательности которых обладают высокой степенью идентичности с последовательностями V-областей антитела человеческой зародышевой линии. Минимальная детерминанта специфичности связывания (BSD), необходимая для создания сфокусированной на эпитопы библиотеки, как правило, представляет собой последовательность в CDR3 тяжелой цепи ("CDRH3") и последовательность в CDR3 легкой цепи ("CDRL3"). BSD может содержать часть или полностью весь CDR3. BSD может состоять из смежных или несмежных аминокислотных остатков. В некоторых случаях "сфокусированную" на эпитопы библиотеку конструируют из последовательностей человеческих V-сегментов, связанных с уникальной областью CDR3-FR4 из референс-антитела, которая содержит BSD и последовательности J-сегмента человеческой зародышевой линии (публикацию патента США № 2005/0255552). В альтернативном варианте библиотеки человеческих V-сегментов можно создавать путем последовательной замены кассет, в которых сначала только часть V-сегмента референс-антитела заменяют на библиотеку человеческих последовательностей. Идентифицированные человеческие "кассеты", поддерживающие связывание в контексте оставшихся аминокислотных последовательностей референс-антитела, затем рекомбинируют при втором скрининге библиотеки с получением полностью человеческих V-сегментов (см. публикацию патента США №
2006/0134098).
В каждом случае спаренные CDR3-сегменты тяжелой и легкой цепей, CDR3-FR4-сегменты или J-сегменты, которые содержат детерминанты специфичности из референс-антитела, применяют для придания специфичности связывания, в результате чего антигенсвязывающие агенты, полученные из библиотеки, сохраняют эпитопспецифичность референс-антитела. Дополнительные предназначенные для созревания изменения можно интродуцировать в CDR3-участки каждой цепи в процессе конструирования библиотеки с целью идентификации антител с оптимальной кинетикой связывания. Полученные сконструированные человеческие антитела имеют последовательности V-сегментов, выведенные из библиотек человеческой зародышевой линии, сохраняют короткие BSD-последовательности из CDR3-участков и имеют каркасные участки 4 (FR4) человеческой зародышевой линии.
Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения антитела к PCSK9 содержат последовательность минимальной детерминанты специфичности связывания (BSD) в CDR3 тяжелых и легких цепей антитела, которые выведены из исходного антитела или моноклонального рефе-ренс-антитела. Оставшиеся последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей (CDR и FR), например, V-сегмент и J-сегмент, получают из аминокислотной последовательности соответствующей человеческой зародышевой линии и аминокислотной последовательности с созревшей аффинностью. V-сегменты можно выбирать из библиотеки человеческих V-сегментов. Другое усовершенствование последовательностей можно осуществлять, используя процедуру созревания аффинности.
В другом варианте осуществления изобретения тяжелые и легкие цепи антител к PCSK9 содержат человеческий V-сегмент из последовательности соответствующей человеческой зародышевой линии (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3), например, выбранный из библиотеки человеческих V-сегментов, и последовательность CDR3-FR4-сегмента из исходного моноклонального антитела. Последовательность CDR3-FR4-сегмента можно дополнительно усовершенствовать путем замены последовательностей сегментов на соответствующие последовательности человеческой зародышевой линии и/или путем созревания аффинности. Например, последовательность FR4 и/или CDR3, окружающую BSD, можно заменять на соответствующую последовательность человеческой зародышевой линии, и при этом сохранять BSD из CDR3 исходного моноклонального антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для V-сегмента тяжелой цепи представляет собой Vh1-02. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для J-сегмента тяжелой цепи представляет собой JH4. В некоторых вариантах осуществления изобретения J-сегмент тяжелой цепи содержит частичную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50) человеческой зародышевой линии JH4. Полноразмерный J-сегмент человеческой зародышевой линии JH4 имеет последовательность YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51). Гены вариабельной области обозначают согласно стандартной номенклатуре, принятой для генов вариабельных областей им
муноглобулинов. Современная информация о генах иммуноглобулинов доступна во всемирной сети, например в базах данных ImMunoGeneTics (IMGT), V-base и PubMed (см. также, например, Lefranc, Exp Clin Immunogenet, 18(2), 2001, cc. 100-116; Lefranc, Exp Clin Immunogenet, 18(3), 2001, cc. 161-174; Exp Clin Immunogenet, 18(4), 2001, cc. 242-254; и Giudicelli и др., Nucleic Acids Res, 33, 1 января 2005 г. (номер в базе данных): D256-61.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для V-сегмента легкой цепи представляет собой VKII L6. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для J-сегмента легкой цепи представляет собой Jk2. В некоторых вариантах осуществления изобретения J-сегмент легкой цепи содержит частичную последовательность FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 52) человеческой зародышевой линии Jk2. Полноразмерный J-сегмент человеческой зародышевой линии Jk2 имеет последовательность YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 53).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFS(D/T)MYMSWVRQAPGQGLEWMGRI DP AN( A/E/G)HTN Y( A/D)(P/Q)KF Q( А/G)RVTMTRDT SIS T A YMEL SRLT SDD T A V Y YCAR (SEQ ID NO: 28).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDP ANEHTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 27).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
(E/Q)IV(L/M)TQSPATLSVSPGERATLSC(R/S)AS(Q/S)SVSYMHWYQQKPGQAPRL LIY(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)GIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 31).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
QIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATG IPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 29).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 30).
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность
SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ ID NO: 14); И
II) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность
LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и
II) CDR3 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, которая включает CDR1, имеющий аминокислотную последовательность (D/T)MYMS (SEQ ID NO: 8); CDR2, имеющий аминокислотную последовательность RIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G) (SEQ ID NO: 11); И CDR3? имеющий аминокислотную ПОСЛедовательность SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ ID NO: 14).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область легкой цепи, которая включает CDR1, имеющий аминокислотную последовательность (R/S)AS(Q/S)SVSYMH (SEQ ID NO: 22); CDR2, имеющий аминокислотную последовательность (G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T) (SEQ ID NO: 25); и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит FR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; FR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
34; и FR4, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. Идентифицированные аминокислотные последовательности могут иметь одну или несколько аминокислотных замен (например, в результате созревания аффинности) или одну или две консервативные аминокислотные замены.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит FR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; FR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; FR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и FR4, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39. Идентифицированные аминокислотные последовательности могут иметь одну или несколько аминокислотных замен (например, в результате созревания аффинности) или одну или две консервативные аминокислотные замены.
При рассмотрении всей их длины вариабельные области антител к PCSK9, предлагаемых в настоящем изобретении, как правило, должны включать полную вариабельную область (например, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4), аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере примерно на 85%, например по меньшей мере примерно на 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности вариабельной области соответствующей человеческой зародышевой линии. Например, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антител к PCSK9 может быть идентична по меньшей мере примерно на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности Vh1-02 вариабельной области человеческой зародышевой линии. Аминокислотная последовательность легкой цепи антител к PCSK9 может быть идентична по меньшей мере примерно на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности VK3 L6 вариабельной области человеческой зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения добавление, удаление путем делеции или замену аминокислот осуществляют только в каркасных участках. В некоторых вариантах осуществления изобретения при сравнении с целью определения идентичности исключают CD3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 40, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 41 (т.е. консенсусные последовательности).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 1, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 15 (т.е. последовательностям мышиного антитела LFU720).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 2, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 16 (т.е. последовательностям антитела LGT-209).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 2, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 18 (т.е. последовательностям антитела LGT-210).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 4, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 16 (т.е. последовательностям анти
тела LGT-211).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат полипептид тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 3, и содержат полипептид легкой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 17 (т.е. последовательностям антитела LGT-209).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат полипептид тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 3, и содержат полипептид легкой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 19 (т.е. последовательностям антитела LGT-210).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9, предлагаемые в изобретении, содержат полипептид тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 5, и содержат полипептид легкой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 17 (т.е. последовательностям антитела LGT-211).
Для идентифицированных аминокислотных последовательностей, состоящих менее чем из 20 аминокислот, допустимо наличие одной или двух консервативных замен аминокислотных остатков, при этом все еще сохраняется требуемая специфичность связывания и/или антагонистическая активность.
Связывание антител к PCSK9, предлагаемых в настоящем изобретении, с PCSK9, как правило, характеризуется значением константы равновесия реакции диссоциации (KD), составляющим менее чем примерно 10-8 или 10-9М, например менее чем примерно 10-10 или 10-11М, в некоторых вариантах осуществления изобретения менее чем примерно 10-12 или 10-13М.
Антитела к PCSK9 необязательно можно подвергать мультимеризации и применять согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Антитела к PCSK9 могут представлять собой полноразмерное тетрамерное антитело (т.е. антитело, включающее две легкие цепи и две тяжелые цепи), одноце-почечное антитело (например, scFv) или молекулу, содержащую фрагменты антитела, которые образуют один или несколько антигенсвязывающих центров и определяют специфичность связывания с PCSK9, например содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей (например, Fab'-фрагмент или другие аналогичные фрагменты).
В изобретении предложены также полинуклеотиды, кодирующие представленные в настоящем описании антитела, например полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой или легкой цепи или описанные выше сегменты, которые содержат гипервариабельные участки. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность поли-нуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 55.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклео-тида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 45 (т.е. последовательностям, кодирующим антитело LGT-209).
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклео-тида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 44 (т.е. последовательностям, кодирующим антитело LGT-210).
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклео-тида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 45 (т.е. последовательностям, кодирующим антитело LGT-211).
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклео-тида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 55 (т.е. последовательностям, кодирующим мышиное антитело LFU720).
3. Анализы, которые можно применять для идентификации антител к PCSK9.
Антагонистические антитела можно идентифицировать путем создания антител к PCSK9 и последующего тестирования каждого антитела в отношении его способности снижать или ингибировать опосредуемые PCSK9 действия, например связывание с ЛПНПР, стимулирование расщепления ЛПНПР. Анализы можно осуществлять in vitro или in vivo. Предпочтительными антителами являются антитела, которые связываются с PCSK9, не препятствуют связыванию PCSK9 с ЛПНПР и снижают или ингиби-руют опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР.
Связывание антител или антигенсвязывающих молекул с PCSK9 можно определять с помощью любого метода, известного в данной области, включая (но, не ограничиваясь только ими) ELISA, Biacore-анализ и Вестерн-блотинг.
Опосредуемое PCSK9 расщепление ЛПНПР также можно измерять с помощью любого известного в данной области метода. В одном из вариантов осуществления изобретения способность антитела к PCSK9 или антигенсвязывающей молекулы ингибировать расщепление ЛПНПР определяют на мышиной модели с использованием инфузии. Антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы вводят мыши путем внутривенной инфузии (например, со скоростью 3 мкг/ч) и определяют уровни ЛПНПР в препаратах мембран клеток печени в сравнении с уровнями ЛПНПР в препаратах мембран клеток печени, взятых из организма мыши, которой вводили путем внутривенной инфузии контрольное антитело (например, антитело, которое связывается с неродственным антигеном). Следует ожидать, что у мышей, которым вводили антагонистические антитела к PCSK9, должны быть обнаружены значимо более высокие уровни ЛПНПР, например по меньшей мере на 10, 20, 50, 80, 100% выше, чем у мышей, которым вводили контрольное антитело.
Обладающие антагонистической активностью антитела к PCSK9 можно тестировать также с точки зрения их терапевтической эффективности в отношении снижения уровней ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме. Для этой цели антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы вводят путем внутривенной инфузии (например, со скоростью 3 мкг/ч) млекопитающему (например, мыши, крысе, примату кроме человека, человеку) и определяют уровни ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме по сравнению с уровнями ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме в организме того же млекопитающего до обработки или в организме млекопитающего, которому вводили путем внутривенной инфузии контрольное антитело (например, антитело, которое связывается с неродственным антигеном). Следует ожидать, что у млекопитающего, которому вводили обладающие антагонистической активностью антитела к PCSK9, должны быть обнаружены значимо более низкие уровни ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме, например более низкие по меньшей мере на 10, 20, 50, 80, 100%, по сравнению с млекопитающим до обработки или млекопитающим, которому вводили контрольное антитело.
4. Композиции, содержащие антитела к PCSK9.
Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим предлагаемые в изобретении моноклональные антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, приготовленным в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции дополнительно могут включать другие терапевтические средства, которые можно применять для лечения или предупреждения данного нарушения. Фармацевтические носители усиливают или стабилизируют композицию или облегчают приготовление композиции.
Фармацевтически приемлемые носители включают растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты, придающие изотонич-ность, и замедляющие абсорбцию агенты и т. п., которые являются физиологически совместимыми.
Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить различными известными в данной области методами. Путь и/или метод введения варьируется в зависимости от требуемых результатов. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшин-ное или подкожное введение или введение в область, близкую к мишени. Фармацевтически приемлемый носитель должен быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, интраназального введения, введения путем ингаляции, спинального или эпидермального введения (на
пример, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения на действующее вещество, т.е. антитело, биспецифическую или мультиспецифическую молекулу, можно наносить покрытие из материала, защищающего соединение от воздействия кислот и других факторов окружающей среды, которые могут инактивировать соединение.
Антитела, индивидуально или в комбинации с другими пригодными компонентами, можно включать в состав аэрозольных препаратов (т.е. их можно "распылять") для введения посредством ингаляции. Аэрозольные препараты можно помещать в пригодные находящиеся под давлением пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения композиция является стерильной и текучей. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применяемых для нанесения покрытий материалов, таких как лецитин, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий, и с помощью поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно следует включать придающие изотоничность агенты, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит или сорбит, или хлорид натрия. Можно получать предназначенные для инъекции композиции с пролонгированной абсорбцией, например, путем включения в композицию агента, который замедляет абсорбцию, такого как моностеарат алюминия или желатин.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно получать согласно методам, хорошо известным и общепринятым в данной области (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, изд-во Mack Publishing Co., 21-е изд., под ред. Lippincott Williams и Wilkins, изд-во University of the Sciences in Philadelphia, 2005; и Martindale: The Complete Drug Reference, под ред. Sweetman, изд-во Pharmaceutical Press., London, 2005, и Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31-е изд., изд-во Amer Pharmaceutical Assn, 1996, и Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, под ред. J.R. Robinson, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Фармацевтические композиции предпочтительно изготавливают в условиях, соответствующих требованиям надлежащей производственной практики (GMP). Как правило, применяют антитело к PCSK9 в терапевтически эффективной дозе или в эффективной дозе в составе фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении. Антитела к PCSK9 приготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области. Схему приема лекарственного средства регулируют для получения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). При определении терапевтически или профилактически эффективной дозы можно сначала вводить низкую дозу и затем ступенчато повышать ее до достижения требуемого ответа при условии наличия минимальных побочных действиях или при их отсутствии. Например, можно применять однократную болюсную инъекцию, можно вводить несколько разделенных доз в течение определенного промежутка времени или дозу можно пропорционально понижать или повышать в зависимости от конкретной терапевтической ситуации. Наиболее целесообразно приготавливать композиции для парентерального введения в виде стандартных доз лекарственного средства, что облегчает их применение и однородность доз. Под стандартной дозой лекарственного средства в контексте настоящего описания понимают физически дискретные единицы, предназначенные для введения стандартных доз индивидууму, подлежащему лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество действующего вещества, которое согласно расчету должно обладать желаемым терапевтическим действием, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, можно варьировать таким образом, чтобы получать количество действующего вещества, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента, при использовании конкретной композиции и пути введения, и они не должны быть токсичными для пациента. Выбранный уровень доз зависит от различных фармакокинетических факторов, включая активность применяемых конкретных композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выделения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни подлежащего лечению пациента и аналогичных факторов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармакологические композиции содержат смесь, включающую антитело к PCSK9 или антигенсвязывающую молекулу и второе фармакологическое средство. Например, композиции могут содержать предлагаемое/предлагаемую в изобретении антитело к PCSK9 или антигенсвязывающую молекулу и средство, в отношении которого известно, что оно оказывает благоприятное действие, заключающееся в снижении уровней холестерина, включая ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и общий холестерин, и/или повышении уровня ЛПВП-Х.
Примерами средств, пригодных для включения в смеси в качестве второго компонента в сочетании с предлагаемым/предлагаемой в настоящем изобретении антагонистическим антителом к PCSK9 или антигенсвязывающей молекулой, являются (но, не ограничиваясь только ими) ингибитор HMG-CoA-редуктазы (т.е. статин), фибраты (например, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрат, ципрофибрат, без
афибрат), ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот (например, холестирамин, колестипол, колесвелам), ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке (IBAT), миметики тиреоидного гормона (например, соединение KB2115), ингибитор микросо-мального белка-переносчика триглицеридов (МТР), двойной агонист активируемого пероксисомальным пролифератором рецептора (PPAR) типа альфа и гамма, ингибитор ацил-СоА:диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), ингибитор ацил-СоА:холестеринацилтрансферазы (АСАТ), ингибитор белка, подобного белку Нимана Пика типа 1 (NPC1-L1) (например, эзетиниб), аго-нист, белков G5 или G8 АТФ-связывающей кассеты (ABC), ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100. Снижающие уровень липидов средства известны в данной области и описаны, например, у Goodman и Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11-е изд., под ред. Brunton, Lazo и Parker, изд-во McGraw-Hill, 2006; 2009 Physicians' Desk Reference (PDR), например, 63-е изд., 2008, под ред. Thomson PDR.
Другие снижающие уровень липидов средства, которые можно применять в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, описаны и/или обобщены, например, в следующих публикациях: Chang и др., Curr Opin Drug Disco Devel, 5(4), 2002, cc. 562-570; Sudhop и др., Drugs, 62(16), 2002, cc. 2333-2347; Bays и Stein, Expert Opin Pharmacother, 4(11), 2003, cc. 1901-1938; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl, Mar(134), 2003, cc. 45-50; Tomoda и Omura, Pharmacol Ther, 115(3), 2007, cc. 375-389; Tenenbaum и др., Adv Cardiol, 45, 2008, cc. 127-153; Tomkin, Diabetes Care, 31(2), 2008, cc. 241-248; Lee и др., J Microbiol Biotechnol, 18(11), 2008, cc. 1785-1788; Oh и др., Arch Pharm Res, 32(1), 2009, cc. 43-47; Birch и др., J Med Chem, 52(6), 2009, cc. 1558-1568; и Baxter и Webb, Nature Reviews Drug Discovery, 8, 2009, cc. 308320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси со статином. Примерами статинов являются (но, не ограничиваясь только ими) аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, росувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси с фармакологическим средством, которое индуцирует гиперхолестеринемию или триглицеридемию. Например, второе фармакологическое средство может представлять собой ингибитор протеазы, например саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфи-навир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, дарунавир, абакавир-ламивудин-зидовудин (тризивир). В некоторых вариантах осуществления изобретения второе фармакологическое средство представляет собой такролимус.
5. Способ применения антител к PCSK9.
а) Состояния индивидуума, подлежащего лечению антителами к PCSK9.
Обладающие антагонистической активностью антитела к PCSK9 и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения любого болезненного состояния, опосредуемого активностью или сверхактивностью PCSK9.
Например, введение обладающих антагонистической активностью антител к PCSK9 и антигенсвя-зывающих молекул, предлагаемых в изобретении, может оказывать благоприятное действие на индивидуумов, которые страдают или имеют риск развития дислипидемии или гиперхолестеринемии любого происхождения или этиологии. Например, индивидуум может страдать семейной или генетически наследуемой гомозиготной или гетерозиготной гиперхолестеринемией, для которой характерно наличие функционально активного гена ЛПНПР. Сведения о генетических мутациях, ассоциированных с и/или являющихся причиной семейной или генетически наследуемой гиперхолестеринемией, обобщены, например, у Burnett и Hooper, Clin Biochem Rev, 29(1), 2008, cc. 11-26. Индивидуум может иметь также другие болезненные состояния или отклонение в поведении, которое вносит вклад или повышает риск развития дислипидемии или гиперхолестеринемии. Например, индивидуум может быть тучным или страдать диабетом или метаболическим синдромом. Индивидуум может быть курильщиком, вести малоподвижный образ жизни или употреблять пищу с высоким содержанием холестерина.
Направленное воздействие на PCSK9 можно применять для снижения, реверсии, ингибирования или предупреждения дислипидемии, гиперхолестеринемии и возникающей после приема пищи тригли-церидемии (см., например, Le May и др., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 29(5), 2009, cc. 684-690; Seidah, Expert Opin Ther Targets, 13(1), 2009, cc. 19-28 и Poirier и др., J Biol. Chem., PMID 19635789, 2009). Таким образом, введение предлагаемых в настоящем изобретении обладающих антагонистической активностью антител к PCSK9 и антигенсвязывающих молекул можно применять для снижения, реверсии, ингибиро-вания или предупреждения дислипидемии, гиперхолестеринемии и возникающей после приема пищи триглицеридемии у индивидуума, нуждающегося в этом.
Предлагаемые в настоящем изобретении обладающие антагонистической активностью антитела к PCSK9 и антигенсвязывающие молекулы можно применять для снижения или уменьшения уровней холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом. Индивидуум может постоянно иметь повышенные уровни ЛПНП-Х. В некоторых вариантах осуществления изо- 25
бретения индивидуум имеет уровни ЛПНП-Х в плазме, существенно превышающие 80 мг/дл, например составляющие более 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/дл или более. Предлагаемые в настоящем изобретении обладающие антагонистической активностью антитела к PCSK9 и антигенсвя-зывающие молекулы можно применять также для снижения или уменьшения уровней холестерина не липопротеинов высокой плотности (не-ЛПВП-Х), или общего холестерина у индивидуума, нуждающегося в этом.
Индивидуум может уже принимать другое фармакологическое средство для снижения уровня холестерина и он может обладать устойчивостью или интолерантностью к указанному средству. Например, индивидуум может уже проходить курс терапевтического лечения статином, который может оказаться неэффективным для данного индивидуума с точки зрения снижения уровней ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х или общего холестерина до приемлемых уровней. Индивидуум может обладать также интолерантностью к введению статина. Совместное введение предлагаемых в настоящем изобретении обладающих антагонистической активностью антител к PCSK9 и антигенсвязывающих молекул с вторым средством, которое можно применять для снижения уровней ЛПНП-Х или не-ЛПВП-Х и/или повышения уровня ЛПВП-Х, может повышать эффективность и переносимость второго средства, например, может позволять снижать дозы второго средства, предназначенного для введения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум несет мутацию, приводящую к усилению функции по доминантно-негативному типу гена PCSK9, например мутацию, которая приводит к аномальному усилению расщепления ЛПНПР.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум принимает фармакологическое средство, которое индуцирует у него дислипидемию или гиперхолестеринемию, т. е. индивидуум обладает индуцируемой лекарственным средством дислипидемией или гиперхолестеринемией. Например, индивидуум может проходить курс терапевтического лечения ингибиторами протеаз, например, с целью лечения ВИЧ-инфекции. Другим фармакологическим средством, в отношении которого известно, что оно повышает уровни триглицеридов в плазме, является такролимус, иммуносупрессорное лекарственное средство, которое вводят пациентам, подвергнутым трансплантации. Было установлено, что циклоспорин вызывает существенное повышение уровней ЛПНП (см., например, Ballantyne и др., 78(5), 1996, cc. 532-5). Установлено, что дислипидемия ассоциирована также с введением антипсихотических лекарственных средств второго поколения (таких, например, как арипипразол, клозапин, оланзапин, кветиа-пин, рисперидон и зипрасидон) (см., например, Henderson, J Clin Psychiatry, 69(2), 2008, е04 и Brooks и др., Curr Psychiatry Rep, 11(1), 2009, cc. 33-40).
б) Введение антител к PCSK9.
Лечащий врач или ветеринар может сначала использовать антитела, предлагаемые в изобретении, которые входят в фармацевтическую композицию, в более низких дозах, чем дозы, требуемые для достижения соответствующего терапевтического действия, и постепенно повышать дозу до достижения требуемого действия. В целом, эффективные дозы композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, варьируют в зависимости от ряда различных факторов, включая конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, пути введения, место действия, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие применяемые медикаментозные средства и то, является ли лечение профилактически или терапевтическим. Предназначенную для введения дозу необходимо титровать для оптимизации безопасности и эффективности. Введение антитела осуществляют в дозах, составляющих примерно от 0,0001 до 100 мг/кг и более предпочтительно от 0,01 до 5 мг/кг веса тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 или 10 мг/кг веса тела или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг. Схема приема лекарственного средства может предусматривать ежедневное, еженедельное введение, введение каждые две недели, один раз в месяц или чаще или реже, если это необходимо или желательно. Например, схема приема лекарственного средства может предусматривать введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вводят полинуклеотид, кодирующий антитело к PCSK9 или антигенсвязывающую молекулу, предлагаемое/предлагаемую в изобретение. В тех вариантах осуществления изобретения, в которых агент представляет собой нуклеиновую кислоту, как правило, дозы могут составлять от примерно 0,1 вплоть до включительно примерно 100 мг/кг веса тела, предпочтительно от примерно 1 до примерно 50 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления изобретения дозы составляют примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мг/кг веса тела.
Антитело можно вводить в виде одной дозы или в виде разделенных доз. Антитело, как правило, вводят многократно. Можно использовать, например, следующие интервалы между каждым введением доз: еженедельно, каждые две недели, ежемесячно, каждые три месяца или ежегодно, если это необходимо или желательно. Интервалы могут также быть нерегулярными в зависимости от измеренных в крови пациента уровней антитела к PCSK9. В некоторых вариантах способа дозу регулируют с целью достижения концентрации антитела в плазме, составляющей примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых вариантах способа -концентрации, составляющей примерно 25-300 мкг/мл. В альтернативном варианте антитело можно вводить в виде формы с замедленным высвобождением, в этом случае требуется меньшая частота введения. Доза и частота введения варьируются в зависимости от времени полужизни антитела в
организме пациента. В целом, гуманизированные антитела обладают более длительным временем полужизни, чем химерные антитела и антитела из организмов кроме человека. Доза и частота введения может варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При применении в профилактических целях вводят относительно низкую дозу с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают прием лекарственного средства в течение всей оставшейся жизни. При терапевтическом применении иногда требуется использование относительно высокой дозы с введением через относительно короткие интервалы времени вплоть до снижения скорости развития заболевания или прекращения его развития и предпочтительно до частичного или полного облегчения симптомов заболевания у пациента. После этого пациента можно переводить на профилактический режим применения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PCSK9 или антигенсвязывающий агент вводят в том случае, когда уровни ЛПНП-Х в плазме пациента поднимаются выше установленного порогового уровня, например составляют по меньшей мере примерно 80 мг/дл, например по меньшей мере примерно 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/дл или выше.
в) Совместное введение с вторым агентом.
Обладающее антагонистической активностью антитело к PCSK9 можно применять в комбинации с агентами, в отношении которых известно, что они оказывают благоприятное действие с точки зрения снижения уровня холестерина, включая ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и общий холестерин, и/или повышения
уровня ЛПВП-Х.
Действующие вещества можно вводить вместе в виде смеси с обладающим антагонистической активностью антителом к PCSK9 или каждый агент можно вводить по отдельности. Агент, представляющий собой антитело, и другое действующее вещество можно (но это не является необходимым) вводить совместно.
Примерами вторых агентов, которые можно использовать для совместного введения с предлагаемым/предлагаемой в настоящем изобретении антагонистическим антителом к PCSK9 или антигенсвязы-вающей молекулой, являются (но, не ограничиваясь только ими) ингибитор HMG-CoA редуктазы (т.е. статин), фибраты (например, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрат, ципрофибрат, безафибрат), ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот (например, холестира-мин, колестипол, колесвелам), ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке (IBAT), ми-метики тиреоидного гормона (например, соединение KB2115), ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), двойной агонист активируемого пероксисомальным пролифератором рецептора (PPAR) типа альфа и гамма, ингибитор ацил-СоА:диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), ингибитор ацил-СоА: холестеринацилтрансферазы (АСАТ), ингибитор белка, подобного белку Нимана Пика типа 1 (NPC1-L1) (например, эзетиниб), агонист, белков G5 или G8 АТФ-связывающей кассеты (ABC), ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является
ароВ100.
Другие пригодные для применения снижающие уровень липидов средства описаны и/или обобщены, например, в следующих публикациях: Chang и др., Curr Opin Drug Disco Devel, 5(4), 2002, cc. 562570; Sudhop и др., Drugs, 62(16), 2002, cc. 2333-2347; Bays и Stein, Expert Opin Pharmacother, 4(11), 2003, cc. 1901-1938; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl, Mar(134), 2003, cc. 45-50; Tomoda и Omura, Pharmacol Ther, 115(3), 2007, cc. 375-389; Tenenbaum и др., Adv Cardiol, 45, 2008, cc. 127-153; Tomkin, Diabetes Care, 31(2), 2008, cc. 241-248; Lee и др., J Microbiol Biotechnol, 18(11), 2008, cc. 1785-1788; Oh и др., Arch Pharm Res, 32(1), 2009, cc. 43-47; Birch и др., J Med Chem., 52(6), 2009, cc. 1558-1568 и Baxter и Webb, Nature Reviews Drug Discovery, 8, 2009, cc. 308-320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси со статином. Примерами статинов являются (но, не ограничиваясь только ими) аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, росувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси с фармакологическим средством, которое индуцирует гиперхолестеринемию или триглицеридемию. Например, второе фармакологическое средство может представлять собой ингибитор протеазы, например саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфи-навир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, дарунавир, абакавир-ламивудин-зидовудин (тризивир). В некоторых вариантах осуществления изобретения второе фармакологическое средство представляет собой такролимус.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, вводят совместно с нуклеиновой кислотой-ингибитором (например, siPHK, miPHK, антисмысловой последовательностью, рибозимом), специфической мишенью которой является PCSK9 или ароВ100.
6. Наборы.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно включать в состав
набора. В конкретных вариантах осуществления изобретения набор, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит представленное/представленную в настоящем описании антагонистическое антитело к PCSK9 или антигенсвязывающую молекулу, предлагаемое/предлагаемую в изобретении. Антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы могут присутствовать в одинаковых или различных дозах.
В некоторых вариантах осуществления изобретения наборы содержат одно или несколько вторых фармакологических средств, указанных в настоящем описании. Второе фармакологическое средство может присутствовать в той же самой препаративной форме или в препаративных формах, отличных от тех, которые содержат антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы. Дозы первого и второго средств независимо друг от друга могут быть одинаковыми или различными.
В некоторых вариантах осуществления изобретения наборы содержат обладающее антагонистической активностью антитело к PCSK9 и одно или несколько средств, в отношении которых известно, что они оказывают благоприятное действие с точки зрения снижения уровней холестерина, включая ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и общего холестерина, и/или повышения уровня ЛПВП-Х.
Примерами вторых агентов, которые можно включать в наборы с предлагаемым/предлагаемой в настоящем изобретении обладающим антагонистической активностью антителом к PCSK9 или антигенсвя-зывающей молекулой, являются (но, не ограничиваясь только ими) ингибитор HMG-CoA редуктазы (т.е. статин), фибраты (например, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрат, ципрофибрат, безафибрат), ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот (например, холестира-мин, колестипол, колесвелам), ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке (IBAT), ми-метики тиреоидного гормона (например, соединение KB2115), ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), двойной агонист активируемого пероксисомальным пролифератором рецептора (PPAR) типа альфа и гамма, ингибитор ацил-СоА:диацилглицеролацилтрансферазы (DGAT), ингибитор ацил-СоА: холестеринацилтрансферазы (АСАТ), ингибитор белка, подобного белку Нимана Пика типа 1 (NPC1-L1) (например, эзетиниб), агонист, белков G5 или G8 АТФ-связывающей кассеты (ABC), ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является
ароВ100.
Дополнительные пригодные для включения в наборы снижающие уровень липидов средства описаны и/или обобщены, например, в следующих публикациях: Chang и др., Curr Opin Drug Disco Devel, 5(4), 2002, cc. 562-570; Sudhop и др., Drugs, 62(16), 2002, cc. 2333-2347; Bays и Stein, Expert Opin Pharmacother, 4(11), 2003, cc. 1901-1938; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl, Mar(134), 2003, cc. 45-50; Tomoda и Omura, Pharmacol Ther, 115(3), 2007, cc. 375-389; Tenenbaum и др., Adv Cardiol, 45, 2008, cc. 127-153; Tomkin, Diabetes Care, 31(2), 2008, cc. 241-248; Lee и др., J Microbiol Biotechnol, 18(11), 2008, cc. 1785-1788; Oh и др., Arch Pharm Res, 32(1), 2009, cc. 43-47; Birch и др., J Med Chem, 52(6), 2009, cc. 1558-1568 и Baxter и Webb, Nature Reviews Drug Discovery, 8, 2009, cc. 308-320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 антитела или антигенсвязы-вающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают в наборы вместе со статином. Примерами статинов являются (но, не ограничиваясь только ими) аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловаста-тин, мевастатин, питавастатин, правастатин, росувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают в наборы вместе с фармакологическим средством, которое индуцирует гиперхолестеринемию или триглицеридемию. Например, второе фармакологическое средство может представлять собой ингибитор протеазы, например саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, дарунавир, абакавир-ламивудин-зидовудин (тризивир). В некоторых вариантах осуществления изобретения второе фармакологическое средство представляет собой такролимус.
Примеры
Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации изобретения, но они не ограничивают объем заявленного изобретения.
Пример 1. Создание и идентификация антагониста PCSK9 NVPLFU720. Краткое изложение.
Были проведены исследования с целью создания функционального обладающего антагонистической активностью антитела к PCSK9. Был идентифицирован целый ряд гибридом, которые секретирова-ли антитело, обладающее способностью связываться с несущей His-метку версией белка. Антитела, полученные с использованием гибридом, оценивали с точки зрения их функциональной антагонистической активности по их способности ингибировать опосредуемое PCSK9 расщепление рецептора ЛПНП на клетках линии HepG2, в результате которого повышается способность указанных клеток поглощать холестерин ЛПНП. Было идентифицировано обладающее выраженной функциональной способностью мышиное моноклональное антитело к человеческой PCSK9 в виде IgG1-каппа, которое обозначили как
NVP-LFU720 (LFU720).
Методы.
Антиген и другие белки.
Создавали стабильно экспрессирующую клеточную линию, которая секретировала человеческий белок PCSK9, путем трансфекции клеток HEK293 Freestyle(tm) (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния). В целом метод заключался в следующем: клетки, которые культивировали в среде Freestyle(tm) (фирма Invitrogen), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, в виде прикрепленной культуры в колбах типа BioCoat (фирма Becton Dickinson) трансфектировали с использованием реагента для транс-фекции Lipofectamine 2000(tm) и рекомбинантной плазмиды, несущей сигнальную последовательность меллитина, зрелую кДНК PCSK9 (ак 31-692) и метку his6 (SEQ ID NO: 57) на С-конце последовательности (клонирование осуществлялось E.Hampton, GNF, NPL 010051). Через 48 ч после трансфекции начинали отбор позитивных трансфектантов, для чего в среду для культивирования добавляли 100 мкг/мл зеоцина. Через четыре недели было выявлено четыре стабильных клеточных пула клеток, продуцирующих PCSK9. Пул 4, оказавшийся наиболее эффективным продуцентом, адаптировали к условиям суспензионного культивирования в бессывороточной среде Freestyle(tm), и затем масштаб производства увеличивали до крупномасштабного производства с использованием биореактора типа Wave(tm), позволяющего получать продукт в объеме, составляющем 10-20 л.
В течение определенного периода времени осуществляли несколько циклов производства, получая рекомбинантный белок с выходом от 12 до 30 мг/л. Собирали клеточные супернатанты и концентрировали путем фильтрации в поперечном потоке. Полученный концентрат вносили на NiNTA His-Bind Super-flow-колонку объемом 25 мл (уравновешенную с помощью смеси 50 мМ Трис/300 мМ NaCl/1 мМ CaCl2/2 мМ Р-меркаптоэтанол, pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. После исходной промывки с использованием смеси 50 мМ Трис/300 мМ NaCl/20 мМ имидазол, pH 7,4, осуществляли элюцию связанного продукта с использованием смеси 50 мМ Трис/300 мМ NaCl/250 мМ имидазол, pH 7,4. Полученный элюат подвергали диализу в противотоке ЗФР, pH 7,3, стерилизовали фильтрацией и разделяли на аликвоты. Образец анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации с целью определения степени оли-гомеризации. На ЖХВР-хроматограмме, полученной для очищенного белка, видны два пика, на долю основного пика приходилось 85%. Анализ с помощью ЖХВР-ESI-MC позволил установить, что масса полноразмерного белка составляла 58176,0 Да, что находилось в соответствии с ожидаемой массой белка меллитин-hsPcsk9, ак31-692-His, в котором все остатки цистеина окислены. Часть белков в образце была дополнительно N-гликозилирована. Представлявший собой примесь белок, масса которого составляла примерно 13 кДа, наиболее вероятно представлял собой свободный пре-домен белка. Соответствующие гомологи Pcsk9 мыши и обезьяны циномолгус получали путем крупномасштабной кратковременной экспрессии также с использованием клеток HEK293 Freestyle, которые культивировали в бессывороточной среде Freestyle в виде суспензионной культуры. Freestyle-клетки трансфектировали рекомбинантными плазмидами, несущими кДНК Pcsk9 мыши с нативной лидерной последовательностью и 1ш6-меткой (SEQ ID NO: 57) на С-конце и Pcsk9 обезьяны циномолгус (cyno Pcsk9) с лидерной последовательностью CD33 и С-концевой 1ш6-меткой (SEQ ID NO: 57), с использованием полиэтиленимина в качестве носителя плазмидной ДНК в соотношении 1:3 (ДНК:ПЭИ, мкг/мл). Циклы производства осуществляли в биореакторах типа Wave(tm) объемом 10 л; очистку и характеризацию белка проводили согласно протоколам, аналогичным тем, которые описаны выше для человеческого белка Pcsk9. Выход мышиного белка Pcsk9 составлял от 0,7 до 2,7 мг/л культуры, выход белка cyno Pcsk9 составлял 3,1 мг/л.
Создание гибридом.
Иммунизация мышей и получение гибридом.
Очищенный белок Pcsk9 разводили в соотношении 1:1 неполным адъювантом Фрейнда перед осуществлением иммунизации трансгенных мышей линии Bcl-2 (штамм C57BL/6-Tgn (bcl-2) 22 wehi). Мышей иммунизировали с помощью процедуры, которую называют повторной иммунизацией в нескольких сайтах (Repetitive Immunization at Multiple Sites, RIMMS). В целом метод заключался в следующем: мышам вводили 1-3 мкг антигена путем инъекции в 8 определенных сайтов, расположенных вблизи периферических лимфатических узлов (PLN). Эту процедуру повторяли 6 раз в течение 12-дневного периода. В день 12 отбирали образцы крови и определяли с помощью ELISA титр антитела в сыворотке. В день 15 удаляли объединенные PLN из мышей с высоким титром. Для сбора лимфоцитов PLN дважды отмывали чистой средой DMEM и затем подвергали диссоциации, пропуская через сито с размером отверстий 0,22 мкм (фирма Falcon, № 352350). Полученные лимфоциты дополнительно отмывали два раза перед осуществлением слияния. Клетки миеломы линии NSO/Bcl-2 смешивали с лимфоцитами в соотношении 2,5:1 (лимфоциты:NSO-клетки). Смесь клеток центрифугировали, и затем к клеточному дебрису добавляли по каплям в течение 1 мин 1 мл ПЭГ 1500. Через 30 с медленно добавляли 1 мл среды DMEM и спустя 1 мин добавляли 19 мл среды DMEM в течение 5 мин. Слитые клетки пеллетировали, ресуспендировали с плотностью 2х105 клеток/мл в среде HAT (DMEM+20% FBS, Pen/Strep/Glu, 1xNEAA, 1xHAT, 0,5xHFCS) и выдерживали при 37°C в течение 1 ч. Затем клетки высевали в 384-луночные планшеты из расчета 60 мкл/лунку.
Скрининг гибридом, секретирующих функциональные антитела к Pcsk9.
Через 10 дней после слияния осуществляли скрининг гибридом на планшетах в присутствии Pcsk9-специфического антитела. Для осуществления скрининга методом ELISA 384-луночные планшеты типа
Maxisorp (фирма Nunc, № 464718) сенсибилизировали с помощью 50 мкл белка Pcsk9 (разведенного до концентрации 15 нг/лунку в ЗФР) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Оставшийся белок удаляли путем аспирации, и лунки блокировали с использованием 1% БСА в ЗФР. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре лунки четыре раза отмывали с помощью ЗФР+0,05% Твин (ЗФРТ). 15 мкл супернатанта гибридом переносили на планшеты для ELISA. 15 мкл мышиной сыворотки, взятой в момент удаления PLN, разводили в соотношении 1:1000 в ЗФР и добавляли в качестве положительного контроля. Во все лунки на планшетах для ELISA добавляли по 50 мкл вторичного антитела (козье антимышиное антитело в виде IgG, конъюгированное с HRP (фирма Jackson Immuno Research, № 115-035071), разведенное в соотношении 1:5000 в ЗФР). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч планшеты отмывали восемь раз с помощью ЗФРТ. Добавляли 25 мкл ТМВ (фирма KPL, № 50-76-05), и после инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре осуществляли считывание планшетов при длине волны поглощения 605 нм. Клетки из положительных лунок размножали на 24-луночных планшетах в среде НТ (DMEM+20% FBS, Pen/Strep/Glu, 1xNEAA, 1хНТ, 0,5xHFCS). Очистка антитела.
Супернатант, содержащий LFU720, очищали с помощью хроматографии на белке G (фирма Upstate, № 16-266 (Биллерика, шт. Массачусетс)). Перед внесением супернатанта смолу уравновешивали с использованием ЗФР, взятого в объеме, равном 10 объемам колонки. После связывания образца колонку промывали ЗФР, взятым в объеме, равном 10 объемам колонки, и затем осуществляли элюцию антитела с использованием 0,1 М глицина, pH 2,0, в объеме, равном 5 объемам колонки. Вышедшие из колонки фракции сразу нейтрализовали с использованием Трис-HCl, pH 9,0, в объеме, равном 1/10 объема колонки. Измеряли ОП280 фракций, позитивные фракции объединяли и подвергали в течение ночи диализу в противотоке ЗФР, pH 7,2.
Кинетические характеристики связывания и Biacore-анализ.
Определение кинетических параметров связывания осуществляли методом поверхностного плаз-монного резонанса с использованием оптического биосенсора Biacore S51. Эта технология позволяет определять без использования метки микроскопические константы связывания (ассоциации) (ka) и диссоциации (kd) лиганда с рецептором. Поэтому указанная технология наиболее пригодна для характериза-ции взаимодействий антитело-антиген.
Изучение связывания Pcsk9 с LFU720 (2 мкг/мл) проводили, осуществляя захват мышиного антитела кроличьим антителом к мышиному Fcy (фирма Biacore, №BR-1005-14), которое предварительно иммобилизовали на сенсорном чипе (сертифицированном) Biacore Series S СМ-5 (фирма Biacore, № BR-1005-30). Ковалентное связывание захватывающего антитела к Fcy осуществляли с использованием "набора для аминного сочетания" (фирма Biacore, каталожный номер BR-1000-50). Захватывающее антитело (кроличье антимышиное антитело) присоединяли к покрытой декстраном, активированным EDC (этил-3-[1-диметиламинопропил]карбодиимид), поверхности с использованием 50 мкг/мл раствора антитела к Fcy в 10 мМ ацетате натрия, pH 5 (фирма Biacore, № BR-1003-51) при скорости потока 10 мкл/мин. Белок Pcsk9 в диапазоне концентраций от 0,5 мкМ до 7,8 нМ (2-кратные серийные разведения) в ЗФР плюс 100 мМ NaCl, 0,005% Р20 (фирма Biacore, № BR-1000-54) пропускали по поверхности чипа с иммобилизованным LFU720. Полученные сенсограммы анализировали с помощью программного обеспечения Biacore S51 Evaluation. Осуществляли глобальную аппроксимацию результатов, полученных для всех концентраций, с использованием модели связывания 1:1 по Лэнгмюру.
TR-FRET-анализ.
TR-FRET-анализ осуществляли в 384-луночных белых неглубоких планшетах (фирма Perkin Elmer, № 6008280). hPcsk9-AF (10,7 нМ) инкубировали с серийными разведениями немеченого белка hPcsk9, пептидом EGF-A или антителом NVP-LFU720-AX-1 в течение 30 мин при комнатной температуре в 15 мкл буфера для анализа (20 мМ HEPES, pH 7,2, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, 0,1 об.% Твин 20 и 0,1 мас./об.% БСА). После этого добавляли 5 мкл h ЛПНПР-Eu (4 нМ) в буфере для анализа к предварительно инкубированному комплексу hPcsk9 и NVP-LFU720-AX-1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин. Конечные концентрации указанных меченых белков составляли 8 нМ для hPcsk9-AF и 1 нМ для h ЛПНПР-Eu. TR-FRET-сигнал измеряли с помощью ридера для нескольких меток EnVision 2100 (фирмы Perkin Elmer) при длине волны возбуждения 330 нм и длине волны испускания 665 нм. Данные превращали в стандартизованные величины с использованием следующей формулы: (величина, измеренная при 665 нм,x10000)/(величина, измеренная при 615 нм). Процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле: 100-[(стандартизованная величина для обработанного образца/средняя стандартизованная величина для
необработанных образцов^ 100]. Графики зависимости процента ингибирования от дозы строили с помощью программы Prism, версия 5, с использованием формулы
Y=Bottom+(Тор-Bottom)/(1+10л((LogIC50-X)xHillSlope))(программное обеспечение GraphPad Prism). Анализ оборачиваемости ЛПНПР.
Клетки линии HepG2 обрабатывали трипсином и высевали из расчета 6x104 клеток/лунку в 100 мкл
культуральной среды в плоскодонные 96-луночные планшеты (фирма Corning, № 3595), предварительно сенсибилизированные 1 об.% коллагена), затем инкубировали в течение 24 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. В целом, клетки обрабатывали 100 мкл бессывороточной среды, содержащей либо белок hPcsk9, либо пептид EGF-A и/или антитело NVP-LFU720-АХ-1. После обработки среду отбрасывали, и клетки отмывали с использованием 100 мкл ЗФР. Для сбора клеток добавляли 100 мкл Versine (фирма Biowhittaker, № 17-771Е) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2, после чего добавляли 100 мкл буфера для FACS. Клетки переносили в 96-луночные планшеты с V-образным дном (фирма Corning, каталожный номер 3894) и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин для пеллетирования клеток. Для того чтобы блокировать сайты неспецифического связывания на клетках, в каждую лунку добавляли по 50 мкл (100 мкг/мл) нормального кроличьего IgG^^^ МР biomedicals, № 55944) и мышиного IgG (фирма Sigma, № I5381) в буфере для FACS и инкубировали в течение 30 мин на льду. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин, и удаляли буфер путем стряхивания с планшета. Для мечения клеток в каждую лунку добавляли по 10 мкл меченного с помощью Alexa 647 кроличьего антитела к h ЛПНПР в виде IgG (5 мкг/мл) и 10 мкл меченного с помощью фикоэритрина (PE) мышиного антитела к трансферрину-R в виде IgG (2 мкг/мл) (CD71, фирма Bec-ton Dickinson Biosciences, № 624048) в буфере для FACS и инкубировали в течение 60 мин на льду. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин, и удаляли буфер путем стряхивания с планшета. Несвязанные антитела удаляли путем двукратной отмывки клеток с использованием 200 мкл/лунку буфера для FACS. Клетки фиксировали в 1% параформальдегида в ЗФР, жизнеспособные клетки выделяли с помощью дискриминационного окна (5000) и анализировали с использованием проточного цитометра BD LSR II и программного обеспечения FACSDIVA (фирма Becton Dickinson). Медианные величины PE-флуоресценции измеряли при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 575 нм. Медианные величины Alexa 647-флуоресценции измеряли при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 633 нм. Поликлональное кроличье антитело 583 в виде IgG к h ЛПНПР было создано на заказ на фирме Covance (Денвер, шт. Пенсильвания, США) для обнаружения методом FACS h ЛПНПР, присутствующего на поверхности клеток линии HepG2. Кроличье антитело 583 в виде IgG к h ЛПНПР характеризовалось примерно в 7 раз большим "окном" для обнаружения h ЛПНПР на поверхности клеток линии HepG2 по сравнению с нормальным кроличьем IgG. Для определения специфичности антитела 583 в виде IgG к h ЛПНПР в отношении ЛПНПР, присутствующих на поверхности клеток линии HepG2, проводили эксперимент с использованием белка h ЛПНПР в качестве конкурента для связывания с указанным IgG. Было выявлено зависящее от дозы уменьшение средней флуоресценции антитела 583 в виде IgG к h ЛПНПР в среде по сравнению с флуоресценцией от клеток линии HepG2 при увеличении концентраций белка h ЛПНПР. Это свидетельствует о том, что антитело 583 в виде IgG к h ЛПНПР специфически распознает ЛПНПР, присутствующие на поверхности клеток линии HepG2, по данным FACS-анализа. В последующих исследованиях использовали непосредственно меченное с помощью Alexa 647 антитело в виде IgG к h ЛПНПР-583 для количественной оценки методом FACS ЛПНПР, присутствующих на поверхности клеток линии HepG2. Поглощение ЛПНП-Х.
Клетки линии HepG2 обрабатывали трипсином и высевали из расчета 6x104 клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды в плоскодонные 96-луночные планшеты (фирма Corning, № 3595, которые предварительно сенсибилизировали 1 об.% коллагена), затем инкубировали в течение 24 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. Если не указано иное, то клетки обрабатывали 100 мкл бессывороточной среды, содержащей либо белок hPcsk9, либо пептид EGF-A и/или антитело NVP-LFU720-AX-1. После обработки в каждую лунку вносили по 20 мкл (30 мкг/мл) меченного с помощью 3,3'-диоктадецилиндолинкарбоцианина липопротеина низкой плотности (DiI-ЛПНП) (фирма Intracell, каталожный номер RP-077-175) в бессывороточной среде и инкубировали в течение 2 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. Среду удаляли путем стряхивания с планшетов, и лунки отмывали 100 мкл за-буференного фосфатом физиологического раствора (ЗФР без кальция или магния, фирма Invitrogen, № 14190-144). ЗФР удаляли путем стряхивания с планшетов и в каждую лунку добавляли по 100 мкл смеси 0,25% трипсина-ЭДТК и инкубировали в течение 5 мин при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. В каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера для FACS (ЗФР, дополненный 5% FBS, 2мМ ЭДТК и 0,2% азида натрия), и клетки пеллетировали путем центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин. Среду отбрасывали путем стряхивания с планшетов, и клетки фиксировали путем добавления 50 мкл/лунку 1% параформальдегида (фирма Electron Microscopy Sciences, № 15710) в ЗФР. Жизнеспособные клетки выделяли с помощью дискриминационного окна и анализировали с помощью проточного цитометра BD LSR II и программного обеспечения FACSDIVA (фирма Becton Dickinson). Медианную величину DiI-ЛПНП-флуоресценции измеряли при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 575 нм, при этом анализировали 5000 клеток. Столбиковые диаграммы строили с помощью программы Microsoft Excel 2002 (фирма Microsoft Corporation). Процент активации рассчитывали согласно следующей формуле: % активации=[1-(X-^A)]x100, где X обозначает среднюю величину флуоресценции от лунки, содержащей образец, и A обозначает среднюю величину флуоресценции от лунки, обработанной только
hPcsk9.
Строили график зависимости процента активации от обработки для того, чтобы на основе кривых дозовой зависимости определять величины EC50 с использованием уравнения Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10Л((LogEC50-X)xHillSlope)) и программы GraphPad Prism, версия 5 (пакет программ Graph-Pad Software).
Результаты.
Создание моноклонального антитела к человеческому белку Pcsk9.
Собирали В-клетки из первичных лимфатических узлов животных, иммунизированных белком Pcsk9. Гибридомы создавали посредством стандартного опосредуемого ПЭГ слияния. Образовавшийся в результате слияния продукт анализировали с помощью ELISA, идентифицировали политивные в отношении связывания с человеческим Pcsk9 клоны и размножали, получая супернатанты. Было идентифицировано несколько позитивных по результатам ELISA клонов, которые затем сортировали с помощью функциональных анализов. Клон, который был идентифицирован в качестве наиболее перспективного кандидата, был обозначен как LFU720. Помимо указанного наиболее перспективного кандидата, т.е. LFU720, было идентифицировано несколько других клонов, которые не обладали способностью блокировать взаимодействие между Pcsk9 и ЛПНПР (по данным FRET-анализа), но которые после связывания с Pcsk9 могли блокировать способность Pcsk9 опосредовать расщепление ЛПНПР (по результатам оценки поглощения ЛПНП-Х), к ним относились клоны 21D6, 5А4-С1 и 13F1. Было установлено, что клон 21D6 также обладал способностью блокировать опосредуемое Pcsk9 расщепление ЛПНПР in vivo.
Скрининг LFU720 в отношении специфичности связывания с Pcsk9.
Изучали специфичность LFU720 путем оценки методом ELISA его способности к связыванию с рядом других белков. Связывание LFU720 с тремя другими несущими HIS-метку белками сравнивали с его связыванием с Pcsk9-HIS. Полученные результаты свидетельствовали о том, что связывание с Pcsk9 является специфическим и что антитело не связывается с HIS-меткой.
Оценка связывания LFU720 с Pcsk9 обезьяны циномолгус.
Оценивали связывание LFU720 с гомологом Pcsk9 из организма обезьяны циномолгус. Для этого анализа применяли супернатанты клеток, экспрессирующих несущий HIS-метку Pcsk9 обезьяны цино-молгус, а также планшет с иммобилизованным Ni, что позволило избежать необходимости осуществлять очистку материала. Человеческий Pcsk9 разводили и также иммобилизовали посредством его HIS-метки. Было установлено, что LFU720 обладал способностью связываться как с Pcsk9 человека, так и Pcsk9 обезьяны циномолгус. Клон 5P20 по данным ELISA не обладал также способностью связываться с человеческим ЛПНПР или мышиным Pcsk9.
Кинетические характеристики связывания LFU720.
Мышиное антитело LFU720, которое распознает человеческий белок Pcsk9, анализировали в отношении его аффинности связывания с помощью метода на основе оптического биосенсора (фирма Biacore). Было установлено, что LFU720 связывался с рекомбинантным человеческим Pcsk9 с высокой аффинностью, величина аффинности находилась в субнаномолярном диапазоне концентраций (KD=200
пМ).
Скрининг LFU720 в отношении способности блокировать взаимодействие Pcsk9/ЛПНПР.
Для решения вопроса о том, может ли антитело к hPcsk9 NVP-LFU720 нарушать взаимодействие между мечеными белками hPcsk9-AF и h ЛПНПР-Eu, применяли TR-FRET-анализ. Проводили оценку немеченого белка hPcsk9 или пептида EGF-A для демонстрации того, что анализ позволяет обнаруживать нарушение TR-FRET-сигнала, создаваемого в результате взаимодействия меченых белков h ЛПНПР-Eu и hPcsk9-AF. Было установлено, что немеченый hPcsk9, применяемый в возрастающих концентрациях, конкурировал с hPcsk9-AF за связывание с h ЛПНПР-Eu, что приводило к уменьшению TR-FRET-сигнала. Пептид EGF-A нарушал взаимодействие между h ЛПНПР-Eu и hPcsk9-AF, что характеризовалось величиной IC50 2,5 мкМ. В отличие от этого антитело NVP-LFU720 лишь незначительно снижало TR-FRET-сигнал, генерируемый в результате взаимодействия между hPcsk9-Eu и h ЛПНПР-AF, что характеризовалось величиной IC50, превышающей 1000 нМ, и для него был характерен U-образный ответ при низких концентрациях антитела.
Скрининг LFU720 в отношении ингибирования опосредуемого Pcsk9 расщепления ЛПНПР.
Было продемонстрировано, что связывание Pcsk9 с ЛПНПР приводило к расщеплению ЛПНПР, и это было подтверждено с использованием клеток линии HepG2 и рекомбинантного человеческого белка Pcsk9. Было установлено, что антитело LFU720 обладало способностью связываться с Pcsk9 и блокировать его воздействие. Антитело NVP-LFU720 ингибировало обработанные экзогенным hPcsk9 клетки линии HepG2 и приводило к увеличению количества находящихся на клеточной поверхности ЛПНПР.
Скрининг LFU720 в отношении ингибирования Pcsk9 и восстановления поглощения ЛПНП.
Ингибирование опосредуемого Pcsk9 расщепления ЛПНПР должно приводить к восстановлению способности клеток линии HepG2 интернализировать ЛПНП-Х. Было установлено, что антитело NVP-LFU720 предупреждало опосредуемое Pcsk9 расщепление ЛПНПР на клетках линии HepG2, обработанных экзогенным hPcsk9, и приводило к повышению поглощения DiI-ЛПНП, что характеризовалось величиной EC50, составлявшей 99 нМ.
Пример 2. Создание обладающих антагонистической активностью антител к PCSK9 NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP-LGT211. Введение.
В данном примере описано создание человеческих антител NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP LGT211 путем придания методами генной инженерии обладающему антагонистической активностью мышиному моноклональному антителу к PCSK9 NVP-LFU720 большей гомологии с последовательностью антитела человеческой зародышевой линии. Антитела NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP LGT211 сохраняли специфичность в отношении эпитопа, аффинность и перекрестную реактивность к PCSK9 макака циномолгус, характерную для родительского мышиного антитела, а именно NVP-LFU720. Последовательности антител NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP LGT211 обладали намного более высокой степенью гомологии с последовательностью человеческой зародышевой линии, чем исходное мышиное антитело, и следовательно человеческая иммунная система должна обладать большей толерантностью к ним.
Мышиное моноклональное антитело LFU720 подвергали модификации с использованием Humaneered(tm)-технологии (в результате чего создавали Humaneered(tm)-антитело) для придания его белковой последовательности большего сходства с последовательностью человеческой зародышевой линии и снижения ее иммуногенности. Humaneered(tm)-технология была разработана фирмой KaloBios, Южный Сан-Франциско (см. web-сайт kalobios.com в сети Интернет). Применение Humaneered(tm)-технологии к антителам позволяет создавать человеческие антитела, последовательности V-области которых обладают более высокой степенью гомологии с последовательностью человеческой зародышевой линии, сохраняя при этом специфичность и аффинность, характерные для родительского или референс-антитела (публикации патентов США 2005/0255552 и 2006/0134098). При осуществлении этого процесса сначала идентифицируют минимальные детерминанты специфического связывания с антигеном (Binding Specificity Determinant, BSD) в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей референс-Fab-фрагмента (как правило, они представляют собой участки последовательности, расположенные в CDR3 тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи). Поскольку при конструировании всех библиотек с применением Humaneering(tm)-процесса указанные BSD тяжелой и легкой цепей сохраняются, то каждая библиотека является "эпитоп-сфокусированной", и в результате конечные полностью Humaneered(tm)-антитела сохраняют специфичность в отношении эпитопа, характерную для исходного мышиного антитела.
Затем создавали библиотеки полноразмерных цепей (в которых вариабельная область легкой или тяжелой цепи целиком заменена на библиотеку соответствующих человеческих последовательностей) и/или кассетные библиотеки (в которых часть вариабельной области тяжелой или легкой цепи мышиного Fab-фрагмента заменена на библиотеку соответствующих человеческих последовательностей). Для экспрессии представителей библиотеки, представляющих собой Fab-фрагменты антитела, применяли бактериальную систему экспрессии, и осуществляли скрининг библиотеки для выявления Fab-фрагментов, которые связываются с антигеном, применяя метод анализа связывания с использованием переноса колоний (Colony-Lift Binding Assay, CLBA). Осуществляли дополнительную характеризацию позитивных клонов для идентификации клонов, обладающих наиболее высокой аффинностью. Затем идентифицированные человеческие кассеты, которые сохраняли способность к связыванию, определяемую оставшимися частями мышиных последовательностей, объединяли для проведения конечного скрининга библиотеки с целью создания полностью человеческих V-областей.
Полученные Humaneered(tm)-Fab-фрагменты, которые имели последовательности V-сегментов, выведенные из человеческих библиотек, сохраняли короткие BSD-последовательности, идентифицированные в CDR3-участках, и имели каркасные участки 4 человеческой зародышевой линии. Указанные Fab-фрагменты превращали в полноразмерные IgG путем клонирования вариабельных областей тяжелой и легкой цепей в векторах, предназначенных для экспрессии IgG. Полноразмерные Humaneered(tm)-антитела сохраняли специфичность связывания, присущую родительскому мышиному антителу, как правило, обладали эквивалентной или более высокой по сравнению с родительским антителом аффинностью к антигену и имели последовательности V-областей, обладающие на белковом уровне более высокой степенью идентичности с генами антител человеческой зародышевой линии.
Методы.
Клонирование мышиных V-областей.
Амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР ДНК V-области мышиного моноклонального антитела NVP-LFU720 из РНК, выделенной из клеточной линии гибридомы с применением стандартных методов. В качестве праймеров, которые успешно применяли для ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи из кДНК гибридомы, использовали Vh14 (5'-CTTCCTGATGGCAGTGGTT-3'; SEQ ID NO: 58) (Chardes Т. и др., FEBS Letters; 1999, 452(3) c. 386-394) и HCconstant (5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3'; SEQ ID NO: 59). В качестве праймеров, которые успешно применяли для ПЦР-амплификации вариабельной области легкой (каппа) цепи из кДНК гибридомы, использовали Vk4/5 (5'-TCAGCTTCYTGCTAATCAGTG-3'; SEQ ID NO: 60) (Chardes T. и др., 1999, выше) и LCconstant (5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'; SEQ ID NO: 61). Амплифицированные
вариабельные области тяжелой и легкой цепей подвергали секвенированию. Затем применяли ПЦР для амплификации V-генов и интродукции распознаваемых рестриктазами сайтов, необходимых для клонирования в векторах фирмы KaloBios: Vh в KB1292-His (модифицированная версия KB 1292, которая кодирует С-концевой гибкий линкер и метку 6-His (SEQ ID NO: 57) аминокислотной последовательности AAGASHHHHHH (SEQ ID NO: 62) на Сш) в сайтах Ncol (5') и Nhel (3'); Vk в KB1296 в сайтах Ncol (5') и BsiWI (3'). Затем указанные отдельные векторы для тяжелой и легкой цепей объединяли с получением одного дицистронного экспрессионного вектора фирмы KaloBios для экспрессии Fab-фрагмента посредством расщепления с помощью BssHII и ClaI и последующего встраивания путем лигирования. С использованием указанного вектора осуществляли экспрессию Fab-фрагментов в E. coli. Полученный Fab-фрагмент тестировали в отношении его способности к связыванию с антигеном PCSK9 и его обозначили как референс-Fab-фрагмент SR032. Очистка Fab-фрагментов.
Экспрессию Fab-фрагментов осуществляли путем секреции из E. coli с использованием экспресси-онных векторов фирмы KaloBios. Клетки выращивали в 2xYT-среде до достижения ОП600 ~0,6. Экспрессию индуцировали путем добавления изопропилтиогалактозида (ИПТГ) до достижения концентрации 100 мкМ и встряхивания в течение 4 ч при 33°C. Полученный в результате сборки Fab-фрагмент выделяли из периплазматических фракций посредством осмотического лизиса и очистки с помощью аффинной хроматографии с использованием Ni-NTA-колонок (HisTrap HP-колонки; фирма GE Healthcare, № 175247-01) согласно стандартным методам. Fab-фрагменты элюировали с использованием буфера, содержащего 500 мМ имидазол, и подвергали тщательному диализу в противотоке ЗФР, pH 7,4, без кальция и магния.
Создание библиотеки.
В качестве первого этапа создания библиотеки конструировали "эпитопсфокусированные" библиотеки полноразмерных человеческих V-областей путем ПЦР-амплификации последовательностей человеческих V-сегментов из KaloBios-библиотеки. Для получения указанных библиотек полноразмерных цепей уникальные CDR3-FR4-участки, содержащие BSD, и последовательности J-сегмента человеческой зародышевой линии из оптимизированного референс-Fab-фрагмента SR038 присоединяли к библиотекам человеческих V-сегментов с помощью перекрывающейся ПЦР. Эти библиотеки полноразмерных V-областей не подвергали непосредственному скринингу; вместо этого их использовали в качестве матриц для конструирования промежуточных Vh- и Vk-библиотек. KaloBios-библиотеки человеческих V-сегментов, используемые для создания библиотек полноразмерных цепей, отбирали таким образом, чтобы они обладали максимальным сходством с исходными мышиными Vh и Vk в CDR-участках. Последовательности CDR исходной мышиной Vh антитела NVP-LFU720 наиболее близки к последовательностям CDR Vh1-02 человеческой зародышевой линии, поэтому для получения библиотеки полноразмерной Vh использовали смесь двух KaloBios-библиотек, которые содержали представителей подгруппы Vh1 (KB 1410 и КВ1411). Аналогично этому, поскольку последовательности CDR Vk NVP-LFU720 оказались наиболее сходными с последовательностями CDR Vk3 L6 человеческой зародышевой линии, то для получения библиотеки полноразмерной Vk использовали смесь двух KaloBios-библиотек человеческих V-сегментов, которые содержали представителей подгруппы Vk3 (KB1423 и KB 1424). Затем указанные библиотеки полноразмерных Vh и Vk использовали в качестве матриц для конструирования кассетных библиотек, в которых только часть родительского мышиного V-сегмента заменяли на библиотеку человеческих последовательностей. С помощью мостиковой ПЦР конструировали кассеты двух типов: кассеты типа "front-end", содержащие человеческие последовательности в FR1, CDR1 и первой части FR2, амплифицировали из смеси библиотек Vh1 (KB1410 и KB1411) или смеси библиотек Vk3 (KB1423 и KB1424), описанных выше, используя их в качестве матриц. Кассеты типа "middle", содержащие человеческие последовательности в последней части FR2, CDR2 и FR3, амплифицировали, используя описанные выше библиотеки полноразмерных человеческих Vh- или Vk-областей в качестве матриц. Vh-кассеты содержали перекрывающиеся общие последовательности в FR2 в аминокислотных положениях 45-49 (нумерация по Кэботу); Vk-кассеты содержали перекрывающиеся общие последовательности в FR2 в аминокислотных положениях 35-39 (нумерация по Кэботу). Таким путем с помощью ПЦР конструировали библиотеки человеческих кассет типа "front-end" и "middle" для человеческих изотипов V-области тяжелой цепи 1 и V-области легкой каппа-цепи 3. Каждую библиотеку Vh-кассет клонировали в векторе KB1292-His в NcoI (5') и KpnI (3'); каждую библиотеку Vk-кассет клонировали в векторе КВ1296-В (модифицированная версия KaloBios-вектора KB1296, содержащая "молчащий" сайт HindIII, добавленный в FR4) в NcoI (5') и HindIII (3'). Затем полученные библиотеки Vh- или Vk-плазмид объединяли с комплементарной цепью из оптимизированного референс-Fab-фрагмента SR038 (например, Vh-библиотеку типа "front-end" объединяли с вектором, несущим оптимизированную референс-Vk-кассету) путем расщепления с помощью BssHII и ClaI и последующего встраивания путем лигирования с получением библиотек дицистронных векторов, экспрессирующих полноразмерные Fab-фрагменты.
Общая процедура ELISA.
Для всех анализов, проводимых методом ELISA, использовали рекомбинантный человеческий антиген PCSK9-His6 или антиген PCSK9-His6 макака циномолгус. Как правило, антиген PCSK9-His6, раз
веденный в ЗФР, pH 7,4, связывали в количестве 300 нг/лунку с поверхностью 96-луночного титрацион-ного микропланшета путем инкубации в течение ночи при 4°C. Планшет блокировали с помощью 3%-ного раствора БСА в ЗФР в течение 1 ч при 37°C и затем однократно отмывали с помощью ЗФРТ. После этого в каждую лунку добавляли содержащую Fab-фрагмент индуцированную клеточную среду или разведенный очищенный Fab-фрагмент (50 мкл). После инкубации в течение 1 ч при 37°C планшет трижды отмывали с помощью ЗФРТ. В каждую лунку добавляли конъюгат антитело к человеческой каппа-цепи-HRP (фирма Sigma, № A7164), разведенный в соотношении 1:5000 в ЗФР (50 мкл), и планшет инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Планшет трижды отмывали с помощью ЗФРТ, затем добавляли 100 мкл субстрата SureBlue TMB (фирма KPL, № 52-00-03), и планшет инкубировали в течение примерно 10 мин при комнатной температуре. Планшет считывали при длине волны 650 нм с помощью спектрофотометра.
Для оценки специфичности методом ELISA очищенных человеческих и мышиных IgG 384-луночный планшет сенсибилизировали с использованием панели очищенных человеческих и мышиных антигенов из расчета 88 нг/лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшет блокировали и отмывали согласно описанной выше процедуре, после чего в каждую лунку добавляли по 22 мкл очищенного мышиного или человеческого антитела к PCSK9, разведенного до концентрации 2 мкг/мл в ЗФР. Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°C, затем отмывали с помощью ЗФРТ. Антитело к мышиной Fc-области (фирма Jackson ImmunoResearch Labs, № 115-035-071) или антитело к человеческой каппа-цепи (фирма Sigma, № A7164), конъютированное с HRP, разводили в соотношении 1:5000 в ЗФР (25 мкл) и добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем отмывали и проявляли согласно описанной выше процедуре.
Анализ связывания с использованием переноса колоний (CLBA).
Скрининг библиотек Humaneered(tm)-Fab-фрагментов осуществляли практически следуя методу, описанному в публикациях патентов США 2005/0255552 и 2006/0134098, с использованием нитроцеллю-лозных фильтров, сенсибилизированных PCSK9-His6 в концентрации 6 мкг/мл. Fab-фрагменты, связанные с сенсибилизированным антигеном фильтром, обнаруживали с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой антитела к человеческой легкой каппа-цепи (фирма Sigma, каталожный номер A3813), разбавленного в соотношении 1:5000 в ЗФРТ, и блоты проявляли с использованием хемилюми-несцентного субстрата DuoLux для щелочной фосфатазы (фирма Vector Laboratories, № SK-6605).
Создание биотинилированного рекомбинантного белка PCSK9 и измерения аффинности.
Белок PCSK9, несущий С-концевую Avi-метку (для сайт-направленного биотинилирования) и His6-метку (SEQ ID NO: 57) (PCSK9-Avi-His6), создавали путем встраивания сайта рестрикции EcoRI между геном, кодирующим PCSK9, и His6- (SEQ ID NO: 57) меткой в плазмиде pRS5a/PCSK9; которая экспрес-сировала аминокислоты 31-692 PCSK9, регистрационный номер Uniprot Q8NBP7, с С-концевой His6-(SEQ ID NO: 57) меткой). Олигонуклеотиды, кодирующие Avi-метку (аминокислотная последовательность:
GGGLNDIFEAQKIEWHE; SEQ ID NO: 63) и фланкированные выступающими сайтами EcoRI, фосфорилировали с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (фирма Invitrogen), отжигали и затем встраивали путем лигирования в плазмиду pRS5a/PCSK9 с использованием нового встроенного сайта EcoRI. Клоны, содержащие Avi-метку, подтверждали путем анализа последовательности. Экспрессию PCSK9-Avi-His6 осуществляли в экспрессионной системе 293 Freestyle (фирма Invitrogen), и секретиро-ванный рекомбинантный белок очищали с использованием смолы Ni-NTA (фирма QIAGEN). После очистки белок PCSK9-Avi-His6 подвергали диализу в противотоке 10 мМ Трис, pH 8,0, 50 мМ NaCl. Белок биотинилировали in vitro с использованием биотин-протеинлигазы (фирма Avidity) согласно протоколу производителя. После завершения продукт реакции подвергали диализу в противотоке ЗФР, pH 7,2, и наличие биотинилирования проверяли методом Вестерн-блоттинга, осуществляя зондирование конъюги-рованным с HRP стрептавидином.
Кинетические характеристики связывания IgG- и Fab-фрагментов анализировали методом уравновешивающего титрования раствора (Solution Equilibrium Titration, "SET"). В целом метод заключался в следующем: серийные разведения hPCSK9 добавляли к IgG или Fab в концентрации 60 пМ и инкубировали в течение ночи. 96-луночный титрационный микропланшет типа Standard Bind (фирма Meso Scale Discovery) сенсибилизировали с помощью 1 мкг/мл hPCSK9 и инкубировали в течение ночи, отмывали с помощью ЗФР/0,05 мас./об.% Твин 20, блокировали с помощью ЗФР/5 мас./об.% БСА и снова отмывали. Препарат антитело-антиген вносили на сенсибилизированный с помощью PCSK9 планшет типа Standard Bind и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После осуществления трех дополнительных стадий отмывки добавляли меченное с помощью Sulfo-Tag козье античеловеческое идентифицирующее антитело (R32AJ-5, фирма Meso Scale Discovery) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной отмывки планшета добавляли буфер Read (фирма Meso Scale Discovery), и измеряли электрохемилюминесцентные сигналы (ECL-сигналы) с помощью устройства Sector Imager 6000 (фирма Meso Scale Discovery). Результаты измерений ECL обрабатывали с помощью программы excel add-in XLfit 4.3.2 (фирма ID Business Solutions) с использованием аппроксимирующей модели, пригодной для антител, которая описана у Piehler и др., J Immunol Methods 201, 1997, cc. 189-206. Было уста
новлено, что имела место высокая аффинность связывания человеческого белка PCSK9 антителами LGT209, LGT210 и LGT211 в растворе, это характеризовалось рассчитанными для каждого антитела величинами KD, составлявшими 150-190 пМ. Получение и очистка антител.
Полностью Humaneered(tm)-антитела NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP-LGT211 (IgG1 с "молчащей" каппа-цепью) создавали путем котрансфекции указанными ниже векторами 293 Freestyle-клеток с использованием реагента для трансфекции, 293 фектина (фирма Invitrogen, каталожный номер 51-0031), согласно протоколу производителя:
LGT-209 - pJG04 (Vh)+pJG10 (Vk),
LGT-210 - pJG04 (Vh)+pJG01 (Vk),
LGT-211 - pSR74 (Vh)+pJG10 (Vk).
Антитело очищали из супернатанта 293 Freestyle-клеток с использованием HiTrap Protein A HP-колонки, 5 мл (фирма GE Healthcare, каталожный номер 17-0403-03). Элюцию антитела осуществляли с использованием буфера для элюции IgG (фирма Pierce, № 21004), и буфер заменяли на ЗФР путем диализа. Аффинную хроматографию на белке А осуществляли с использованием системы для жидкостной хроматографии AKTAFPLC (фирма GE Healthcare).
Анализ конкуренции за связывание с эпитопом.
Анализ конкуренции между исходным мышиным антителом NVP-LFU720 и его Humaneered(tm)-производным NVP-LGT209 за связывание с эпитопом на PCSK9 проводили с использованием системы ForteBio Octet QK и стрептавидиновых биосенсоров с высокой связывающей способностью, сенсибилизированных биотинилированным PCSK9-Avi-His6. Затем три различных антитела связывали с отдельными сенсибилизированными PCSK9 сенсорами до достижения насыщения: мышиное LFU720, полностью человеческое LGT209 или контрольное мышиное антитело 7D16 (которое, как известно, распознает эпитоп, отличный от эпитопа, распознаваемого антителом LFU720). Затем все сенсоры погружали в лунки, содержащие мышиное антитело LFU720 для определения того, обладает ли первое антитело способностью блокировать связывание LFU720.
Результаты.
Мышиная аминокислотная последовательность V-области и аминокислотная референс-последовательность V-области.
Полученные с помощью ОТ-ПЦР продукты из клеток гибридомы, экспрессирующих NVP-LFU720, подвергали секвенированию, и с использованием масс-спектрометра типа ThermoElectron LTQ-Orbitrap было установлено, что на белковом уровне они в основном (на 95% или более) имели правильную последовательность. Затем вариабельные области тяжелых и легких цепей LFU720 клонировали в KaloBios-векторах для получения референс-Fab-фрагмента SR032. Первую аминокислоту в Vk NVP-LFU720, которая представляла собой глутамин (Q), оказалось необходимым заменить на глутаминовую кислоту (E) для того, чтобы иметь возможность осуществлять клонирование в KaloBios-векторах для получения ре-ференс-Fab-фрагмента SR032; поэтому в первом положении Vk-последовательности Vk SR032 присутствовала глутаминовая кислота. Fab-фрагмент SR032 имел интактные мышиные V-области из NVP-LFU720, слитые с человеческими константными областями, и его очищали из E. coli. При проведении анализа связывания антигена PCSK9-His6 методом ELISA с использованием разведений было установлено, что кривые связывания, полученные для клонированного референс-Fab-фрагмента SR032, зависели от концентрации Fab-фрагмента. Помимо референс-Fab-фрагмента (SR032) конструировали оптимизированный референс-Fab-фрагмент, а именно SR038. При создании SR038 несколько аминокислотных остатков в каркасной области SR032 были изменены на остатки человеческой зародышевой линии.
Аффинный анализ референс-Fab-фрагмента и оптимизированного референс-Fab-фрагмента.
Остатки человеческой зародышевой линии, встроенные в FR1 и FR3 оптимизированного референс-Fab-фрагмента SR038, представляли собой остатки, которые определялись ПЦР-праймерами, применяемыми для амплификации спектра человеческих V-сегментов, и поэтому они присутствовали во всех представителях Humaneered(tm)-библиотек V-области. Оптимизированный референс-Fab-фрагмент создавали для того, чтобы оценить изменяют ли замены на остатки человеческой зародышевой линии способность к связыванию Fab. Путем анализа методом ELISA с использованием разведений очищенных Fab-фрагментов было установлено, что аффинности SR032 и SR038 к рекомбинантному антигену PCSK9 оказались идентичными, это свидетельствовало о том, что аминокислотные замены в SR038 являются допустимыми.
Создание библиотеки и отбор полностью Humaneered(tm) -Fab-фрагментов.
Создавали подгруппу библиотек кассет тяжелых и легких цепей типа "front-end" и "middle", включающих только Vh1 или Vk3, и осуществляли их скрининг с помощью CLBA. В случае Vh были идентифицированы с помощью анализа связывания с использованием переноса колоний кассеты типа "front-end", которые сохраняли связывание с антигеном PCSK9, но не были идентифицированы содержащие Vh кассеты типа "middle". В случае Vk методом переноса колоний были идентифицированы кассеты как "front-end''-типа, так и "middle''-типа, и, кроме того, были идентифицированы несколько полноразмерных
клонов Vk (это было обусловлено "загрязнением" содержащей Vk "front-end"-библиотеки клонами Vk с полноразмерной цепью). Многие обладающие способностью к связыванию клоны из каждой библиотеки были повторно подтверждены с помощью анализа методом ELISA с использованием содержащих Fab-фрагменты клеточных супернатантов, и несколько Fab-фрагментов из каждой библиотеки очищали из периплазматических фракций и ранжировали по уровню аффинности с помощью Forte-анализа.
Поскольку не было выявлено ни одной содержащей V-область тяжелой цепи кассеты типа "middle", сохраняющей связывание с PCSK9, то были созданы две мутагенные библиотеки, которые кодировали либо родительский мышиный остаток, либо наиболее близкий остаток человеческой зародышевой линии во всех положениях в CDR2 или FR3 тяжелой цепи. Таким путем была создана сконструированная человеческая библиотека кассет типа "middle", ее подвергали скринингу и идентифицировали антигенсвязы-вающие клоны. Затем объединяли индивидуальные клоны из содержащих Vh кассет типа "middle", которые после замены на остатки человеческой зародышевой линии сохраняли способность к связыванию, получая одну конечную кассету типа "middle", и в контексте оптимизированного референс-Fab-фрагмента подтверждали аффинность связывания Fab, содержащего эту кассету, как и в случае оптимизированного референс-Fab-фрагмента, с помощью Forte-анализа.
В созданных библиотеках были успешно идентифицированы с помощью CLBA человеческие кассеты типа "front-end" и "middle" как тяжелых, так и легких цепей, которые сохраняли способность к связыванию с антигеном PCSK9. Все эти обладающие способностью к связыванию клоны подтверждали с помощью ELISA, после чего Fab-фрагменты очищали и ранжировались помощью системы ForteBio Octet. Кассеты тяжелых и легких цепей с высоким рангом объединяли в одну конечную библиотеку с помощью мостиковой ПЦР, и из этой библиотеки с помощью CLBA отбирали полностью Humaneered(tm)-Fab-фрагменты, которые сохраняли способность к связыванию с PCSK9. Параллельно с этим объединяли вместе все характеризующиеся наиболее высоким рангом кассеты или цепи (наилучшую Vh-кассету типа "front-end", сконструированную Vh-кассету типа "middle" и наилучшую полноразмерную цепь) с получением одного Fab-фрагмента SR066, который, как предполагалось, должен сохранять высокую аффинность к связыванию.
Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей родительского мышиного МАт NVP-LFU720 и Humaneered(tm)-антител NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP-LGT211 представлены на фиг. 1-4 соответственно.
Тестирование аффинности полностью Humaneered(tm)-Fab-фрагментов к антигену PCSK9 с помощью ForteBio Octet-анализа.
Humaneered(tm)-Fab-фрагмент SR066 и три Fab-фрагмента, выделенные из конечной комбинаторной библиотеки (№ 1-2, № 3-2 и № 4-2), экспрессировали и очищали. Затем сравнивали кинетические характеристики связывания указанных четырех человеческих Fab-фрагментов с кинетическими характеристиками оптимизированного референс-Fab-фрагмента SR038 с использованием системы ForteBio Octet (результаты в численном виде обобщены в табл. 1).
Таблица 1
Аффинность полностью Нитапеегес1(tm)-РаЬ-фрагментов к PCSK9
Fab
SR038
1,39ЕЗ
5Д2Е-4
3,69Е-7
SR066
3,25ЕЗ
1,08Е-3
3,ЗЗЕ-7
№ 1-2
6,91ЕЗ
2Д6Е-3
ЗДЗЕ-7
№3-2
5,92ЕЗ
1,46Е-3
2,47Е-7
№4-2
***
***
***
*** - для Fab-фрагмента № 4-2 выявленный уровень связывания оказался слишком малым для того, чтобы получить достоверные кинетические характеристики.
Определение концентрации белка для указанных Fab-фрагментов оказалось трудной задачей; по существу, данные о скорости диссоциации (kd) намного более достоверны, чем данные о скорости ассоциации (ka) и величины KD (от концентрации не зависели только скорости диссоциации). По-видимому, для всех четырех протестированных Humaneered(tm)-Fab-фрагментов скорости диссоциации были в 3-4 раза "хуже" (т.е. диссоциация происходила быстрее) по сравнению с оптимизированным референс-Fab-фрагментом. Вероятно, что такое снижение аффинности обусловлено присутствием в этих клонах тяжелых цепей "front-end"-типа, поскольку все обладающие способностью к связыванию Fab-фрагменты, выбранные из исходной библиотеки кассет тяжелых цепей типа "front-end", по-видимому, характеризуются "худшими" по сравнению с оптимизированным референс-Fab-фрагментом скоростями диссоциации (данные не представлены). Поскольку тяжелая цепь в кассетах типа "front-end" содержит CDR1, то изменения, внесенные в этот CDR в кассетах Vh "front-end"-типа, могли являться возможной причиной снижения аффинности конечных Humaneered(tm)-Fab-фрагментов. Среди полностью Humaneered(tm)-Fab-фрагментов SR066 характеризовался наилучшей скоростью диссоциации (табл. 1), при этом между последовательностями CDR1 тяжелой цепи SR066 и мышиной референс-последовательности имелись три различия. Для проверки идеи о том, что эти изменения, внесенные в CDRH1, ответственны за снижение аффинности, наблюдаемое для всех предлагаемых в настоящем изобретении Humaneered(tm)-Fab
фрагментов, при создании изобретения одновременно проводили обратные замены двух остатков в CDRH1 SR066 на остатки исходной мышиной последовательности и осуществляли экспрессию и очистку полученных измененных Fab-фрагментов для осуществления Forte-анализа кинетических характеристик.
Один Fab-фрагмент с двумя одновременно проведенными заменами в CDRH1 (SR079) (табл. 2) обладал существенно улучшенными кинетическими характеристиками по сравнению с SR066 (результаты в численном виде обобщены в табл. 3). Фактически было установлено, что Fab-фрагмент SR079 обладал скоростью диссоциации, эквивалентной скорости диссоциации оптимизированного (мышиного) рефе-ренс-Fab-фрагмента SR038.
Таблица 2
Последовательность CDRH1 варианта Fab-фрагмента SR079 с измененным CDRH1*
В CDRH2 Humaneered(tm)-Fab-фрагментов SR066, № 1-2, № 3-2 и № 4-2 присутствует аминокислотная последовательность "Asn-Gly" ("NG"), происходящая из исходного мышиного антитела. Известно, что эта последовательность может подвергаться деаминированию, это свойство является нежелательным при производстве антител. Поэтому одновременно с усилиями по улучшению аффинности Hu-maneered(tm)-Fab-фрагмента SR066 создавали две мутагенные библиотеки на основе SR066, в которых аминокислотные остатки "N" или "G" заменяли на любые возможные аминокислоты, за исключением исходной аминокислоты (например, в "библиотеке с удаленным остатком N" остаток "N" заменяли на любую аминокислоту, за исключением "N"). Затем клеточные супернатанты, содержащие Fab-фрагменты из этой библиотеки, подвергали скринингу с помощью ELISA для идентификации клонов, которые не содержали последовательность "NG", но все еще сохраняли уровень способности к связыванию, присущий SR066 (который был ниже уровня, характерного для оптимизированного референс-Fab-фрагмента SR038). "Библиотека с удаленным остатком N" не позволила получить никаких Fab-фрагментов, обладающих такой же способностью к связыванию, что и SR066, однако "библиотека с удаленной G" позволила выявить обладающие достаточной способностью к связыванию Fab-фрагменты, которые имели целый ряд других замен в положении, в котором присутствовал остаток "G". Из них были отобраны Fab-фрагменты, которые имели замены "NG" на "NE", "NA" и "NM", для очистки и проведения Forte-анализа кинетических характеристик, в результате чего было установлено, что они имели кинетические характеристики, сходные с характеристиками родительского Fab-фрагмента SR066.
Конструирование клона 7472 человеческого IgG с целью повышения аффинности.
Конструирование Vk.
Для создания полностью человеческого IgG амплифицировали участок последовательности Vh SR079 (модифицированная версия SR066, обладающая повышенной аффинностью), простирающийся вплоть до CDRH2, и сшивали с помощью мостиковой ПЦР с последовательностью клона из "библиотеки с удаленным остатком G" (который содержал "NE" в CDRH2), начинающейся от CDRH2 и захватывающей большую часть FR4. Эту последовательность Vh клонировали в pRS5a-hIgG1 LALA+KpnI (клонирующий вектор, несущий "молчащий" IgG1, который был модифицирован путем добавления сайта KpnI в FR4 без нарушения аминокислотной последовательности Vh) в Nrul (5') и KpnI (3') с получением pSR074. Участок Vk (начинающийся от FR1 и частично захватывающий FR4) из SR066 амплифицирова-ли и клонировали в pRS5a-hkappa в AgeI и BsiWI с получением pSR072. Эти векторы проверяли путем секвенирования и использовали для котрансфекции клеток линии 293 Freestyle. Полученный IgG (обозначен как "7472") очищали из содержащей антитело клеточной среды. Неожиданно было установлено, что антитело 7472 характеризовалось по данным Biacore-анализа существенно более медленной скоростью ассоциации по сравнению с родительским мышиным антителом LFU720 (данные не приведены). Путем замены каждой человеческой цепи на комплементарную родительскую мышиную цепь было установлено, что обнаруженный недостаток, касающийся скорости ассоциации, был обусловлен проблемой, связанной с человеческой легкой цепью. С целью "спасения" аффинности были внесены изменения в человеческую легкую цепь, содержащуюся в pSR072 (табл. 4): первые четыре остатка легкой цепи были заменены снова на остатки мышиной последовательности и остатки во второй половине CDR1 заменены снова на остатки мышиной последовательности. Полученную легкую цепь клонировали в pRS5a
В табл. 4 представлены выровненные участки последовательностей легких цепей человеческого антитела 7472, родительского мышиного антитела LFU720 и легкой цепи, кодируемой pJG10. Этот участок идентичен участку легкой цепи, кодируемой pJG01. Кодирующие легкую цепь векторы использовали для экспрессии конечных Humaneered(tm)^^!^^ NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP-LGT-211.
Созревание аффинности CDRH3.
Параллельно с модификациями легкой цепи конструировали библиотеку Fab-фрагментов для созревания аффинности CDR3 тяжелой цепи pSR074. При создании этой библиотеки остатки в CDR3 заменяли по одному на любую другую аминокислоту, за исключением исходного остатка. Созданную таким путем библиотеку подвергали скринингу с помощью CLBA, обладающие способностью связываться клоны проверяли с помощью ELISA, и полученные в результате Fab-фрагменты очищали и тестировали с помощью интерферометрии для слоев биологических субстанций (метод Bio-Layer Interferometry) с целью определения того, обладают ли они улучшенными кинетическими характеристиками связывания по сравнению с родительским человеческим Fab-фрагментом.
Была идентифицирована одна замена в CDRH3, которая существенно повышала аффинность: замена А на N (табл. 5). Затем эту замену осуществляли в контексте плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь IgG, pSR074; полученную новую конструкцию обозначили как pJG04. Конечное Humaneered(tm)-антитело NVP-LGT209 (LGT209) получали путем котрансфекции с использованием pJG04 (Hc) и pJG10 и последующей очистки. Конечное Humaneered(tm)-антитело NVP-LGT210 (LGT210) получали путем котрансфекции с использованием pJG04 (Hc) и pJG01 и последующей очистки. Указанную замену не вносили в антитело NVP-LGT211 (LGT211).
Таблица 5
Замены, сделанные в CDR3 тяжелой цепи IgG 7472
Последовательность CDRH3
SEO ID NO:
7472
CARSYYYYAMDY
LFU720
CARSYYYYAMDY
pJG04
CARSYYYYNMDY
В табл. 5 представлены выровненные последовательности CDR3 тяжелой цепи человеческого антитела 7472, родительского мышиного антитела LFU720 и тяжелой цепи, кодируемой pJG04 (вектор тяжелой цепи, который использовали для экспрессии конечных Humaneered(tm)^^!^^! NVP-LGT209 и NVP-LGT210). Замена А на N подчеркнута.
Анализ кинетических характеристик связывания NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP-LGT211 с использованием системы уравновешивающего титрования раствора (SET).
С помощью SET-анализа было установлено, что аффинность связывания антител NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP-LGT211 с человеческим PCSK9 характеризовалась величиной KD, составлявшей 150-190 пМ, как указано в табл. 6. Это свидетельствует о том, что имеет место высокоаффинное взаимодействие между антителами и PCSK9 в растворе.
Анализ антигенной специфичности NVP-LGT209 с помощью ELISA.
Для тестирования того, сохраняется ли антигенная специфичность, присущая родительскому мышиному антителу LFU720, у конечных Humaneered(tm)-IgG, a именно LGT209, LGT210 LGT211, оценивали путем анализа методом ELISA связывание антител с панелью человеческих и мышиных антигенов (а также с человеческим белком PCSK9). Результаты этого анализа (фиг. 5А-5В) свидетельствуют о том, что LGT209, LGT210 LGT211 сохраняют высокую специфичность в отношении PCSK9, сходную со специфичностью мышиного антитела LFU720.
Оценка связывания антител с белком Pcsk9 человека и макака крабоеда методом ELISA.
Оценивали специфичность связывания антител LGT209, LGT210 и LGT211 с Pcsk9 человека и ма
кака крабоеда (cyno Pcsk9). Результаты этого анализа, проведенного методом ELISA, продемонстрировали, что аналогично родительскому мышиному антителу LFU720 Humaneered(tm)-антитела LGT209, LGT210 и LGT211 обладали сходной способностью связываться как с Pcsk9 человека, так и с cyno Pcsk9 (фиг. 6А-6В).
Анализ конкуренции за связывание с эпитопом с помощью метода на основе технологии BioLayer Interferometry.
Для тестирования того, сохраняют ли конечные Humaneered(tm)^^!^^^ LGT209, LGT210 и LGT211 специфичность в отношении эпитопа, присущую родительскому мышиному антителу NVP-LFU720, был разработан метод конкурентного анализа с использованием системы Octet фирмы ForteBio. Было установлено, что Humaneered(tm)-антитела LGT209, LGT210 и LGT211 блокировали связывание родительского мышиного антитела NVP-LFU720, это свидетельствовало о том, что Humaneered(tm)-антитела сохраняли специфичность в отношении эпитопа, присущую исходному мышиному антителу. Сходные результаты были получены и в том случае, когда изменяли порядок внесения антител, а именно когда сначала осуществляли связывание NVP-LFU720, а затем вносили Humaneered(tm)-антитело.
Аминокислотные последовательности Humaneered(tm)-антител LGT209, LGT210 и LGT211 и процент их идентичности с последовательностью человеческой зародышевой линии.
Аминокислотные последовательности вариабельных областей конечных Humaneered(tm)-IgG, а именно LGT209, LGT210 и LGT211, представлены на фиг 2-4 соответственно; CDR-участки подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Нуклеотидные последовательности включены в перечень последовательностей.
Процент идентичности последовательностей антител LGT209, LGT210 и LGT211 с последовательностями человеческой зародышевой линии определяли путем выравнивания аминокислотных последовательностей Vh и Vk с одной из последовательностей человеческой зародышевой линии (Vh1 1-02 и Vk3 A27 соответственно, табл. 7). При расчете для каждой цепи исключали остатки, присутствующие в
CDRH3 и CDRL3.
Таблица 7
Процент идентичности последовательностей антител LGT209, LGT210 и LGT211 с последовательностями человеческой зародышевой линии
Vh по отношению к Vhl 1-02 Vk по отношению к Vk3 А27
89% 91%
Дополнительная информация касательно функциональной характеризации гуманизированных (Hu-maneered(tm)) антител представлена в описаниях фиг. 8-14.
Пример 3. Анализ мутаций обладающих антагонистической активностью антител к PCSK9 NVP-LGT209. NVP-LGT210 и NVP-LGT211.
Варианты обладающих антагонистической активностью антител к PCSK9 NVP-LGT209, NVP-LGT210 и NVP LGT211 оценивали в отношении их способности связываться с PCSK9. Результаты можно обобщить следующим образом:
Касательно CDR1 тяжелой цепи TMYMS (SEQ ID NO: 66): только клоны, которые содержат исходные остатки мышиной последовательности (выделены жирным шрифтом), сохраняют кинетические характеристики связывания, присущие мышиному Ат (по данным анализа методом Biolayer Interferometry). Следовательно, указанные остатки в CDR1 тяжелой цепи имеют значение для связывания.
Касательно CDR2 тяжелой цепи RIDPANEHTNYAQKFQG (SEQ ID N0: 74): остатки, выделенные жирным шрифтом, не были изменены в обладающих способностью к связыванию антителах, выделенных (путем скрининга с помощью ELISA) из библиотеки, кодирующей либо исходный (мышиный) остаток, либо соответствующий остаток в наиболее близкой последовательности человеческой зародышевой линии в каждом положении. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания. В положении, в котором находится подчеркнутый остаток Glu, допустимы консервативные замены, например, в этом положении может присутствовать А, Е или D, что было определено с помощью ELISA и подтверждено методом Biolayer Interferometry.
Касательно CDR3 тяжелой цепи SYYYY(A/N)MDY (SEQ ID NO: 75): остатки, выделенные жирным шрифтом, не были изменены в клонах, выделенных из библиотеки для созревания аффинности, кодирующей все возможные аминокислоты (за исключением исходной ак) в каждом положении. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания. В положениях, в которых находятся подчеркнутые остатки Ala или Asn, допустимы консервативные замены, например в этих положениях могут присутствовать А, N или Q, что было определено с помощью Biacore-анализа. В положении, в котором находится подчеркнутый остаток Tyr, например, допустимы консервативные замены, например в этом положении может присутствовать A, F, S, V или Y, что было определено с помощью Biacore-анализа.
Касательно FR1 легкой цепи (E/Q_)IV(M/L)TQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 76): в подчеркнутых положениях 1 и 4 допустимы консервативные замены, что было определено с помощью Biacore-анализа.
Например, аминокислота в положении 1 может представлять собой A, D, Е, N или Q. Аминокислота в положении 4 может представлять собой V, I, L или M. Аминокислоты QIVL в положениях 1-4 (SEQ ID NO: 69) (которые присутствуют в Vk мышиного родительского LFU720, LGT209 и LGT211) обеспечивают улучшенные характеристики связывания по сравнению с аминокислотами EIVM в положениях 1-4 (SEQ ID NO: 67) (которые присутствуют в Vk LGT210), что было определено с помощью Biacore-анализа.
Касательно CDR1 легкой цепи RASQSVSYMH (SEQ ID NO: 71): разделение выделенных остатков оказывает влияние на связывание, поскольку человеческий клон, несущий 2 дополнительные встроенные аминокислоты в этом положении CDR1 Lc, обладал более низкой аффинностью. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания.
Касательно CDR3 легкой цепи LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26): замены в указанных положениях на аминокислотные остатки человеческой зародышевой линии недопустимы, что определено с помощью ELISA. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания.
Следует иметь в виду, что представленные в настоящем описании примеры и варианты осуществления изобретения даны только с целью иллюстрации, и что специалисты в данной области могут предложить на основе указанного описания различные модификации или изменения, которые следует рассматривать как соответствующие сущности и подпадающие под сферу действия настоящей заявки и подпадающие под объем изобретения, определяемый прилагаемой формулой изобретения. Все публикации, патенты, заявки на патент, зарегистрированные в базах данных о последовательностях, которые процитированы в настоящем описании, полностью и для всех целей включены в настоящее описание в качестве ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> АЙРМ ЛЛК
Новартис АГ
<120> Антагонисты PCSK9
<130> 021288-006410PC
<140> WO еще не назначен <141> Еще не назначен
<150> US 61/285,942 <151> 2009-12-11
<160> 76
<170> FastSEQ для Windows, версия 4.0
<210> 1 <211> 118 <212> PRT
<213> Mus musculus
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2 <211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи Vh (FR1-FR4)синтетического моно-клонального антитела к PCSK9 pJG04(клоны LGT-209 и LGT-210)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 3 <211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Vh тяжелой цепи, включающей константную цепь IgG1,синтетического мо-ноклонального антитела к PCSK9 pJG04(клоны LGT-209 и LGT-210)
<220>
<221> Вариант <222> (235)...(236)
<223> Xaa = Ala или Leu
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи Vh (FR1-FR4)синтетического клонального антитела к PCSK9 pSR74(клон LGT-211)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
моно-
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> <211> <212>
448 PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Vh тяжелой цепи, включающей константную цепь IgG1,синтетического мо-ноклонального антитела к PCSK9 pSR74(клон LGT-211)
<220>
<221> Вариант <222> (235)...(236)
<223> Xaa = Ala или Leu
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 6 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) тяжелой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к PCSK9 LFU720
<400> 6
Asp Met Tyr Met Ser 1 5
<210> 7 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) тяжелой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 моноклонального антитела к PCSK9
<400> 7
Thr Met Tyr Met Ser 1 5
<210> 8 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) нального антитела к PCSK9 консенсусной тяжелой цепи монокло-
<220>
<221> Вариант <222>
<223> Xaa = Asp или Thr
<400> 8
Xaa Met Tyr Met Ser
1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 2(CDR2) тяжелой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к PCSK9 LFU270
<400> 9
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Thr Asn Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 10 <211> 17 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 2(CDR2) тяжелой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 10
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 11 <211> 17 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 2(CDR2) консенсусной тяжелой цепи синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант <222> (7)...(7)
<223> Xaa = Ala, Glu или Gly <220>
<221> Вариант <222> (12)...(12)
<223> Xaa = Ala или Asp
<220>
<221> Вариант <222> (13)...(13)
<223> Xaa = Pro или Gln
<220>
<221> Вариант <222> (17)...(17)
<223> Xaa = Ala или Gly
<400> 11
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Xaa His Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe Gln
1 5 10 15
Xaa
<210> 12 <211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 3(CDR3) Vh тяжелой цепи синтетического мо-ноклонального антитела к PCSK9 pJG04(клоны LGT-209 и LGT-210)
<400> 12
Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr 1 5
<210> 13 <211> 9 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 3(CDR3) Vh тяжелой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к PCSK9 LFU270 и моноклонального антитела к
PCSK9 pSR74 ( клон LGT-211) <400> 13
Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5
<210> 14 <211> 9 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 3(CDR3) консенсусной тяжелой цепи синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант <222> (6)...(6) <223> Xaa = Ala или Asn
<220>
<221> Вариант
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = Ala, Phe, Ser, Val или Tyr
<400> 14
Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Met Asp Xaa 1 5
<210> 15 <211> 106 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи (FR1-FR4) мышиного моноклонального
антитела к PCSK9 LFU720
<400> 15
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ser Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 16 <211> 106 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи Vk (FR1-FR4) синтетического монокло-
нального антитела к PCSK9 pJG10 ( клоны LGT-209 и LGT-211) <400> 16
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 17 <211> 213 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Vk легкой цепи, включающей константную область каппа-цепи, синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG10( клоны LGT-209 и LGT-211)
<400> 17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 18 <211> 106 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи Vk (FR1-FR4) синтетического монокло-нального антитела к PCSK9 pJG01( клон LGT-210)
<400> 18
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 19 <211> 213 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Vk легкой цепи, включающей константную область каппа-цепи, синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG01( клон LGT-210)
<400> 19
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 20 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1)легкой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к PCSK9 LFU720
<400> 20
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 21 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) легкой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 22 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) консенсусной легкой цепи синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Arg или Ser
<220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Gln или Ser
<400> 22
Xaa Ala Ser Xaa Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 23 <211> 7 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 2(CDR2) легкой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к PCSK9 LFU720
<400> 23
Leu Thr Phe Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 24 <211> 7 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) легкой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 24
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr 1 5
<210> 25 <211> 7 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 2(CDR2) консенсусной легкой цепи синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Gly или Leu
<220>
<221> Вариант
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Thr или Val
<220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Asn или Arg
<220>
<221> Вариант
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Leu или Arg
<220>
<221> Вариант
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Ser или Thr
<400> 25
Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ala Xaa
1 5
<210> 26 <211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 3(CDR3) легкой цепи синтетического мышиного
моноклонального антитела к PCSK9 LFU720 и клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211
мышиного моноклонального антитела к PCSK9
<400> 26
Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
1 5
<210> 27
<211> 98
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сегмент вариабельной области тяжелой цепи(FR1-FR3)клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 28 <211> 98 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сегмент вариабельной области консенсусной тяжелой цепи(FR1-FR3) синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (31)...(31)
<223> Xaa = Asp или Thr
<220>
<221> Вариант
<222> (56)...(56)
<223> Xaa = Ala, Glu или Gly
<220>
<221> Вариант
<222> (61)...(61)
<223> Xaa = Ala или Asp
<220>
<221> Вариант
<222> (62)...(62)
<223> Xaa = Pro или Gln
<220>
<221> Вариант
<222> (66)...(66)
<223> Xaa = Ala или Gly
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Xaa Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Xaa His Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe
50 55 60
Gln Xaa Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 29 <211> 87 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сегмент вариабельной области Vk легкой цепи(FR1-FR3) синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG10(клоны LGT-209 и LGT-211)
<400> 29
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
<210> 30 <211> 87 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сегмент вариабельной области Vk легкой цепи(FR1-FR3)синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG01 ( клон LGT-210)
<400> 30
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Val Phe Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
<210> 31 <211> 87 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сегмент консенсусной вариабельной области Vk легкой цепи(FR1-
FR3) синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG01( клоны LGT-209,
LGT-210 и LGT-211) <220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Leu или Met
<220>
<221> Вариант
<222> (24)...(24)
<223> Xaa = Arg или Ser
<220>
<221> Вариант
<222> (27)...(27)
<223> Xaa = Gln или Ser
<220>
<221> Вариант
<222> (49)...(49)
<223> Xaa = Gly или Leu
<220>
<221> Вариант
<222> (50)...(50) <223> Xaa = Thr или Val
<220>
<221> Вариант
<222> (52)...(52)
<223> Xaa = Asn или Arg
<220>
<221> Вариант
<222> (53)...(53)
<223> Xaa = Leu или Arg
<220>
<221> Вариант
<222> (55)...(55) <223> Xaa = Ser или Thr
<400> 31
Glx Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Xaa Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ala Xaa Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
<210> 32 <211> 30 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 1(FR1) тяжелой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 33 <211> 14 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 2(FR2) тяжелой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 33
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 34 <211> 32 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 3(FR3) тяжелой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 34
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
210> 35 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 4(FR4) тяжелой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 35
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 36 <211> 22 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 1(FR1) легкой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Leu или Met
<400> 36
Glx Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro
1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser 20
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 10 15
<210> 37 <211> 15 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 2(FR2) легкой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 37
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 38 <211> 32 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 3(FR3) легкой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 38
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 39 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Каркасный участок 4(FR4) легкой цепи клонов LGT-209, LGT-210 и LGT-211 синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 39
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 40 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область консенсусной тяжелой цепи (FR1-FR4) синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (31)...(31)
<223> Xaa = Asp или Thr
<220>
<221> Вариант
<222> (56)...(56)
<223> Xaa = Ala, Glu или Gly
<220>
<221> Вариант
<222> (61)...(61)
<223> Xaa = Ala или Asp
<220>
<221> Вариант
<222> (62)...(62)
<223> Xaa = Pro или Gln
<220>
<221> Вариант
<222> (66)...(66)
<223> Xaa = Ala или Gly
<220>
<221> Вариант
<222> (104)...(104)
<223> Xaa = Ala или Asn
<220>
<221> Вариант
<222> (107)...(107)
<223> Xaa = Ala, Phe, Ser, Val или Tyr
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Xaa Met
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Xaa His Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe
50 55 60
Gln Xaa Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Met Asp Xaa Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 41 <211> 106 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область консенсусной легкой цепи (FR1-FR4) синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Leu или Met
<220>
<221> Вариант
<222> (24)...(24)
<223> Xaa = Arg или Ser
<220>
<221> Вариант
<222> (27)...(27)
<223> Xaa = Gln или Ser
<220>
<221> Вариант
<222> (49)...(49)
<223> Xaa = Gly или Leu
<220>
<221> Вариант
<222> (50)...(50) <223> Xaa = Thr или Val
<220>
<221> Вариант
<222> (52)...(52)
<223> Xaa = Asn или Arg
<220>
<221> Вариант
<222> (53)...(53)
<223> Xaa = Leu или Arg
<220>
<221> Вариант <222> (55)...(55)
<223> Xaa = Ser или Thr
<400> 41
Glx Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Xaa Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ala Xaa Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 42 <211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG04
( клоны LGT-209 и LGT-210) <400> 42
caggttcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcagc actatgtata tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcgatcctg ccaatgagca cactaactat 180 gcccagaagt tccaggggag ggtgactatg acaagggaca catccatcag cacagcctac 240 atggagctca gcaggctgac gtctgacgac actgccgtct attactgtgc tagaagttac 300 tattactata acatggacta ctggggtcaa ggtaccctgg tgaccgtcag ctca 354
<210> 43 <211> 354 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pSR74
( клон LGT-211)
tggtgcagtc cttctggata ggcttgagtg tccaggggag gcaggctgac ctatggacta
tggggctgag caccttcagc gatgggaagg ggtgactatg gtctgacgac ctggggtcaa
gtgaagaagc actatgtata atcgatcctg acaagggaca actgccgtct ggtaccctgg
ctggggcctc agtgaaggtc 60 tgtcttgggt gcgacaggcc 120 ccaatgagca cactaactat 180 catccatcag cacagcctac 240 attactgtgc tagaagttac 300 tgaccgtcag ctca 354
<210> 44 <211> 318 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG01
( клон LGT-210)
<400> 44
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc caggctccca ggctcctcat atatggtgtt ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc gattttgcag tgtactactg cctacagtgg acgaagcttg aaattaaa ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 tatatgcatt ggtaccagca gaagccaggc 120 ttcagaaggg ccactggcat cccagacagg 180 actctcacca tcggcagact ggagcctgaa 240 agtagtgacc cacccacgtt tggccaaggt 300
318
<210> 45 <211> 318 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь синтетического моноклонального антитела к PCSK9 pJG10
( клоны LGT-209 и LGT-211)
<400> 45
cagattgttc tcacccagtc tccagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc caggctccca ggctcctcat atatggtgtt ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc gattttgcag tgtactactg cctacagtgg acgaagcttg aaattaaa ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 tatatgcatt ggtaccagca gaagccaggc 120 ttcagaaggg ccactggcat cccagacagg 180 actctcacca tcggcagact ggagcctgaa 240 agtagtgacc cacccacgtt tggccaaggt 300
318
<210> 46 <211> 13 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп синтетического моноклонального антитела к PCSK9
<400> 46
Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln
1 5 10
<210> 47 <211> 692 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Препропротеин человеческой пропротеин-конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) (синонимы: пропротеин-конвертаза 9 (PC9), нейтральная апоп-
тоз-регулируемая конвертаза 1 (NARC1, NARC-1), FH3, HCHOLA3, LDLCQ1)
<220>
<221> SIGNAL <222> (1)...(30)
<223> Сигнальный пептид
<220>
<221> PROPEP <222> (31)...(692)
<223> Пропротеин
<220>
<221> CHAIN
<222> (153)...(692)
<223> Зрелый белок
<400> 47
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
-30 -25 -20 -15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
-10 -5 1
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
5 10 15
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
20 25 30
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
35 40 45 50
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
55 60 65
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
70 75 80
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
85 90 95
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
100 105 110
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
115 120 125 130
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
135 140 145
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
150 155 160
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
165 170 175
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
180 185 190
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
195 200 205 210
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
215 220 225
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
230 235 240
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
245 250 255
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
260 265 270
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
275 280 285 290
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
295 300 305
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
310 315 320
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
325 330 335
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
340 345 350
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
355 360 365 370
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
375 380 385
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
390 395 400
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
405 410 415
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
420 425 430
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
435 440 445 450
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
455 460 465
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
470 475 480
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
485 490 495
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
500 505 510
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
515 520 525 530
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
535 540 545
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
550 555 560
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
565 570 575
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
580 585 590
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
595 600 605 610
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
615 620 625
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
630 635 640
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
645 650 655
Gln Glu Leu Gln 660
<210> 48 <211> 3636 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (292)...(2370)
<223> Препропротеин человеческой пропротеин-конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) ( синонимы: пропротеин-конвертаза 9 (PC9), нейтральная апоп-
тоз-регулируемая конвертаза 1 (NARC1, NARC-1), FH3, HCHOLA3, LDLCQ1)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (292)...(381)
<223> Сигнальный пептид
<220>
<221> misc_structure
<222> (382)...(2367)
<223> Пропротеин
<220>
<221> mat_peptide
<222> (538)...(2367)
<223> Зрелый белок
<400> 48
cagcgacgtc gaggcgctca tggttgcagg cctggaggag tgagccaggc agtgagactg cagcggctcc cagctcccag ccaggattcc cttcagctcc tgcacagtcc tccccaccgc gcacggcctc taggtctcct cgccaggaca gtcagctcca ggcggtcctg gtggccgctg ggtcccgcgg gcgcccgtgc gcaggaggac cgggcgccgc cgttcagttc agggtctgag 60 gctcgggcgg gccgggacgc gtcgttgcag 120 gcgcgcccct tcacgcgccc tgctcctgaa 180 aaggctcaag gcgccgccgg cgtggaccgc 240 gcaacctctc ccctggccct catgggcacc 300 ccactgctgc tgctgctgct gctgctcctg 360 gaggacggcg actacgagga gctggtgcta 420
gccttgcgtt ccgaggagga cggcctggcc gaagcacccg agcacggaac cacagccacc 480 ttccaccgct gcgccaagga tccgtggagg ttgcctggca cctacgtggt ggtgctgaag 540 gaggagaccc acctctcgca gtcagagcgc actgcccgcc gcctgcaggc ccaggctgcc 600 cgccggggat acctcaccaa gatcctgcat gtcttccatg gccttcttcc tggcttcctg 660 gtgaagatga gtggcgacct gctggagctg gccttgaagt tgccccatgt cgactacatc 720 gaggaggact cctctgtctt tgcccagagc atcccgtgga acctggagcg gattacccct 780 ccacggtacc gggcggatga ataccagccc cccgacggag gcagcctggt ggaggtgtat 840 ctcctagaca ccagcataca gagtgaccac cgggaaatcg agggcagggt catggtcacc 900 gacttcgaga atgtgcccga ggaggacggg acccgcttcc acagacaggc cagcaagtgt 960 gacagtcatg gcacccacct ggcaggggtg gtcagcggcc gggatgccgg cgtggccaag 1020 ggtgccagca tgcgcagcct gcgcgtgctc aactgccaag ggaagggcac ggttagcggc 1080 accctcatag gcctggagtt tattcggaaa agccagctgg tccagcctgt ggggccactg 1140 gtggtgctgc tgcccctggc gggtgggtac agccgcgtcc tcaacgccgc ctgccagcgc 1200 ctggcgaggg ctggggtcgt gctggtcacc gctgccggca acttccggga cgatgcctgc 1260 ctctactccc cagcctcagc tcccgaggtc atcacagttg gggccaccaa tgcccaagac 1320 cagccggtga ccctggggac tttggggacc aactttggcc gctgtgtgga cctctttgcc 1380 ccaggggagg acatcattgg tgcctccagc gactgcagca cctgctttgt gtcacagagt 1440 gggacatcac aggctgctgc ccacgtggct ggcattgcag ccatgatgct gtctgccgag 1500 ccggagctca ccctggccga gttgaggcag agactgatcc acttctctgc caaagatgtc 1560 atcaatgagg cctggttccc tgaggaccag cgggtactga cccccaacct ggtggccgcc 1620 ctgcccccca gcacccatgg ggcaggttgg cagctgtttt gcaggactgt atggtcagca 1680 cactcggggc ctacacggat ggccacagcc gtcgcccgct gcgccccaga tgaggagctg 1740 ctgagctgct ccagtttctc caggagtggg aagcggcggg gcgagcgcat ggaggcccaa 1800 gggggcaagc tggtctgccg ggcccacaac gcttttgggg gtgagggtgt ctacgccatt 1860 gccaggtgct gcctgctacc ccaggccaac tgcagcgtcc acacagctcc accagctgag 1920 gccagcatgg ggacccgtgt ccactgccac caacagggcc acgtcctcac aggctgcagc 1980 tcccactggg aggtggagga ccttggcacc cacaagccgc ctgtgctgag gccacgaggt 2040 cagcccaacc agtgcgtggg ccacagggag gccagcatcc acgcttcctg ctgccatgcc 2100 ccaggtctgg aatgcaaagt caaggagcat ggaatcccgg cccctcagga gcaggtgacc 2160 gtggcctgcg aggagggctg gaccctgact ggctgcagtg ccctccctgg gacctcccac 2220 gtcctggggg cctacgccgt agacaacacg tgtgtagtca ggagccggga cgtcagcact 2280 acaggcagca ccagcgaagg ggccgtgaca gccgttgcca tctgctgccg gagccggcac 2340 ctggcgcagg cctcccagga gctccagtga cagccccatc ccaggatggg tgtctgggga 2400 gggtcaaggg ctggggctga gctttaaaat ggttccgact tgtccctctc tcagccctcc 2460 atggcctggc acgaggggat ggggatgctt ccgcctttcc ggggctgctg gcctggccct 2520 tgagtggggc agcctccttg cctggaactc actcactctg ggtgcctcct ccccaggtgg 2580 aggtgccagg aagctccctc cctcactgtg gggcatttca ccattcaaac aggtcgagct 2640 gtgctcgggt gctgccagct gctcccaatg tgccgatgtc cgtgggcaga atgactttta 2700 ttgagctctt gttccgtgcc aggcattcaa tcctcaggtc tccaccaagg aggcaggatt 2760 cttcccatgg ataggggagg gggcggtagg ggctgcaggg acaaacatcg ttggggggtg 2820 agtgtgaaag gtgctgatgg ccctcatctc cagctaactg tggagaagcc cctgggggct 2880 ccctgattaa tggaggctta gctttctgga tggcatctag ccagaggctg gagacaggtg 2940 cgcccctggt ggtcacaggc tgtgccttgg tttcctgagc cacctttact ctgctctatg 3000 ccaggctgtg ctagcaacac ccaaaggtgg cctgcgggga gccatcacct aggactgact 3060 cggcagtgtg cagtggtgca tgcactgtct cagccaaccc gctccactac ccggcagggt 3120 acacattcgc acccctactt cacagaggaa gaaacctgga accagagggg gcgtgcctgc 3180 caagctcaca cagcaggaac tgagccagaa acgcagattg ggctggctct gaagccaagc 3240 ctcttcttac ttcacccggc tgggctcctc atttttacgg gtaacagtga ggctgggaag 3300 gggaacacag accaggaagc tcggtgagtg atggcagaac gatgcctgca ggcatggaac 3360 tttttccgtt atcacccagg cctgattcac tggcctggcg gagatgcttc taaggcatgg 3420 tcgggggaga gggccaacaa ctgtccctcc ttgagcacca gccccaccca agcaagcaga 3480 catttatctt ttgggtctgt cctctctgtt gcctttttac agccaacttt tctagacctg 3540 ttttgctttt gtaacttgaa gatatttatt ctgggttttg tagcattttt attaatatgg 3600 tgacttttta aaataaaaac aaacaaacgt tgtcct 3636
<210> 49 <211> 13 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> С-концевой эпитоп, остатки 680-692, для синтетического антитела к
PCSK9
<400> 49
Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln
1 5 10
<210> 50 <211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая частичная последовательность человеческой зародышевой линии JH4, входящая в J-сегмент тяжелой цепи антитела к PCSK9
<400> 50
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 51 <211> 15 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Cинтетический полноразмерный J-сегмент из человеческой зародышевой линии JH4
<400> 51
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 52 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая частичная последовательность человеческой зародышевой линии Jk2, входящая в J-сегмент легкой цепи антитела к PCSK9
<400> 52
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 53 <211> 12 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Cинтетический полноразмерный J-сегмент из человеческой зародышевой линии Jk2
<400> 53
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 54
<211> 354
<212> ДНК <213> Mus musculus
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к PCSK9 LFU27 0
<400> 54
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttatgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacatcaaa gacatgtata tgagctgggt gaggcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg atcgatcctg cgaatggtca tactaactat 180 gacccgaagt tccaggccaa ggccactata acaacagaca catcctccaa aacagcctac 240 ctgcatctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaagttac 300 tattactatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ttca 354
<210> 55 <211> 318 <212> ДНК
<213> Mus musculus
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи мышиного моноклонального антитела к
PCSK9 LFU270 <400> 55
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca gactctggat ttatttaaca ttcaacttgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctctcaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg tctacagtgg agtagtgacc cacccacgtt cggctcgggg 300 acaaagttgg aaataaaa 318
<210> 56 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический C-концевой мутант PCSK9 A685X
<400> 56
Arg Ser Arg His Leu
1 5
<210> 57 <211> 6 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая C-концевая his6-метка, 6-His-метка, HIS-метка
<400> 57
His His His His His His
1 5
<210> 58 <211> 19 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер V-H14 для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи
<400> 58
cttcctgatg gcagtggtt 19
<210> 59 <211> 39 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер HCconstant для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи
<400> 59
gcgtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> 60 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер Vkappa4/5 для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области легкой цепи
<400> 60
tcagcttcyt gctaatcagt g 21
<210> 61 <211> 29 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер LCconstant для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области легкой цепи
<400> 61
gcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg 29
<210> 62 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический C-концевой гибкий линкер и 6-His-метка
<400> 62
Ala Ala Gly Ala Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 63 <211> 17 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Синтетическая Avi-метка для сайтнаправленного биотинилирования
<400> 63
Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His
1 5 10 15
Glu
<210> 64 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический CDRH1 клона SR066 (Humaneered )
<400> 64
Thr Tyr Tyr Met Asn
1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический CDRH1 клона SR038 (мышиный)
<400> 65
Asp Met Tyr Met Ser
1 5
<210> 66 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический CDRH1 клона SR079 (Humaneered )
<400> 66
Thr Met Tyr Met Ser 1 5
<210> 67 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-конец легкой цепи (LC) синтетического клона 7472
<400> 67 Glu Ile Val Met 1
<210> 68 <211> 12 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 легкой цепи (LC) синтетического клона 7472
<400> 68
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser His Val Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-конец легкой цепи (LC) синтетического клона LFU720 и pJG10
<400> 69
Gln Ile Val Leu
<210> 70 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) легкой цепи (LC) синтетического
клона LFU720
<400> 70
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 71 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(CDR1) легкой цепи (LC) синтетического клона pJG10
<400> 71
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 72 <211> 12 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи (CDRH3) синтетического клона 7472 и LFU720
<400> 72
Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 73 <211> 12 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи (CDRH3)синтетического клона pJG04
<400> 73
Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 74 <211> 17 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи синтетического антитела к PCSK9
<400> 74
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 75 <211> 9 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи синтетического антитела к PCSK9
<221> Вариант
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Ala или Asn
<400> 75
Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Met Asp Tyr 1 5
<210> 76 <211> 23 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FR1 легкой цепи синтетического антитела к PCSK9
<220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Met или Leu
<400> 76
Glx Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, которое связывается с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), где антитело содержит:
I) гипервариабельный участок 1 (CDR1) тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7;
II) гипервариабельный участок 2 (CDR2) тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10;
III) гипервариабельный участок 3 (CDR3) тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13;
IV) CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 21;
V) CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24; и
VI) CDR3 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 26.
2. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.
3. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в SEQ ID NO: 41.
4. Антитело по п.1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 41.
5. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.
6. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.
7. Антитело по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.
8. Fab'-фрагмент антитела по п.1.
9. Антитело по п.1, где антитело представляет собой IgG.
10. Антитело по п.1, где антитело представляет собой одноцепочечное антитело (scFv).
11. Антитело по п.1, где антитело содержит человеческие константные области.
12. Антитело по п.1, где антитело связано с белком-носителем.
13. Антитело по п.1, где антитело является ПЭГилированным.
14. Антитело, которое специфически связывается с PCSK9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (CDR): CDR1, CDR2 и CDR3, где
I) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7;
II) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10;
III) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13;
IV) CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21;
V) CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24;
VI) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 26.
15. Композиция для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащая антитело по п.1 или 14 и физиологически совместимый экс-ципиент.
15.
16. Композиция по п.15, где композиция содержит также второй агент, который снижает уровень ЛПНП-Х у индивидуума.
17. Композиция по п.16, в которой второй агент представляет собой статин.
18. Композиция по п.17, в которой статин выбран из группы, включающей аторвастатин, цериваста-тин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
19. Композиция по п.16, в которой второй агент выбран из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилгли-церолацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
20. Способ снижения уровня ЛПНП-Х у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве антитело по п.1 или 14.
21. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает пониженной чувствительностью или устойчивостью к терапии статинами.
22. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает интолерантностью к терапии статинами.
23. Способ по п.20, в котором у индивидуума исходный уровень ЛПНП-Х составляет по меньшей мере примерно 100 мг/дл.
24. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает семейной гиперхолестеринемией.
25. Способ по п.20, в котором общий уровень холестерина также снижается вместе с ЛПНП-Х.
26. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает триглицеридемией.
27. Способ по п.20, в котором индивидуум имеет мутацию, приводящую к усилению функции по доминантно-негативному типу гена PCSK9.
28. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает индуцируемой лекарственными средствами дислипидемией.
29. Способ по п.20, дополнительно заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве второй агент, снижающий уровень ЛПНП-Х.
30. Способ по п.29, в котором второй агент представляет собой статин.
31. Способ по п.30, в котором статин выбирают из группы, включающей аторвастатин, цериваста-тин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
32. Способ по п.29, в котором второй агент выбирают из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилгли-церолацилтрансферазы (DGAT), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является PCSK9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
33. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно в виде смеси.
34. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно, но вводят раздельно.
35. Способ по п.20, в котором антитело вводят внутривенно.
36. Способ по п.20, в котором антитело вводят подкожно.
Последовательности вариабельных областей родительского мышиного МАт LFU720
Вариабельная область тяжелой цепи LFU720
ЕУдЬ008САЕШКРОА5УК1^СТА5ОГЫ1КШЩ8\УУКдКРВ0СЬЕ\У1О?ЮРМ GHTNYDPKFOAKATITTDTSSKTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARSYYYYAMDYWGQ GTSVTVSS
Вариабельная область легкой цепи LFU720
OIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYOOKPGSSPRLWIYLTFNLA SGVPARFSGSGSGTSYSLSISSMEAEDAATYYCLOWSSDPPTFGSGTKLEIK
Фиг. 1
Последовательности вариабельных областей AT NVP-LGT209 pJG04 (Vh) + pJG10(Vk)
Vh pJG04
0VQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVR0APGOGLEWMGRIDPA NEHTNYAOKFOGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARSYYYYNMDYW GQGTLVTVSS
VkpJGlO
QIVLTOSPATLSVSPGERATLSCRASOSVSYMHWYOQKPGOAPRLLIYGVFRRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYCLQWSSDPPTFGQGTKLEIK
Фиг. 2
Последовательности вариабельных областей ATNVP-LGT210 pJG04 (Vh) + pJG01 (Vk)
Vh pJG04
OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVROAPGOGLEWMGRIDPA NEHTNYAOKFOGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARSYYYYNMDYW GQGTLVTVSS
Vk pJGOl
EIVMTOSPATLSVSroERATLSCRASOSVSYMHWYOOKPGOAPRLLIYGVFRRATG IPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYCLQWSSDPPTFGQGTKLEIK
Фиг. 3
Последовательности вариабельных областей AT NVP-LGT211 pSR74 (Vh) + pJGlO (Vk)
Vh pSR074
OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVROAPGOGLEWMGRIDPA NEHTNYAOKFOGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARSYYYYAMDYW GQGTLVTVSS
Vk pJGlO
QIVLTOSPATLSVSroERATLSCRASOSVSYMHWYOOKPGOAPRLLIYGVFRRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYCLOWSSDPPTFGQGTKLEIK
Фиг. 4
I i
л о
§11
~ 4 %
J CO. j5 И J3 q
Фиг. 5A
в* B~ ¦" е- Ш* ш в в в ш
aZ о
Фиг. 5Б
ILFU720
1LGT210
2.5
1.5
|LFU720
ILGT211
0,5
I§ Ii illiltiliii Шт
Os (N - rn
? § I
Mi 30- §
2.5" 2,0-US-ID. М-
ДИ Pcsk9his человека
Г jPcsk9his обезьяны циномолгус
концентрация антитела (нг/мл)
Фиг. 6Б
К &гдпитич &кЭя
(2) 5Р20 не связывается с С-концевыми мутантами (Co-IP]
(i)DXMS
Эксперимент 1
-оснтрсть Эксперимент ?
(4) DRD играет важную роль в функциональной способности PcskS к расщеплению ЛПНПР
PNA5 105:13045(2005)
Фиг. 7
5Р20
(не нарушает взаимодействие PCSK9 и ЛПНПР по данным FRET-анализа)
13С10
(нарушает взаимодействие РС5К9иЛПНПР по данным FRET-анализа)
IC50> ЮООнМ
100-1 80 ^60-
I 40-| 20-
s 0-20-
-I 1 1 1-
•10 12 3
Log концентрации (нМ) mlgG 5Р20
100-
к ю
ас s
-20
IC50 = 50нМ
1 1 1 1-1
0 12 3 4
Log концентрации (нМ) mlgG 1310
Фиг. 8
ли пи ело
- Повышение
Поиоше-
S уровня
II ние
JII11IIII'
ЛПНП
LGT209
480 ± 64
255 + 25
LGT210
480 ± 48
259 +22
LGT211
430 + 60
230+17
NVP-LFU720
520+28
294 + 62
Имплантация осмотического мини-
Антитело насоса с hPcsk9
(i.p.)
* мыши линии C57BL/6J дикого типа (возрастом 9 недель)
- Alzet: 2001D (8 мкл/ч, 0,2 мл) не-ЛПНП-Х (Helena)
¦ i.v. инфузия с использованием ¦ общий холестерин (Olympus)
мини-насоса, имплантированного s.c. hPcsk9 (ELISA)
с помощью катетера в яремную вену антитело (ELISA)
Ф> [|пы KO.I-BO мышей
ЗФР (l р ) + ЗФР (3 мкг/ч iv) 7
ЗФР (1 р.) + hPcsk9 (3 мкг/ч i.v ) 7
mlgG (20 mpk i p.)-1 hPcsk9 (3 мкг/ч i v.) 5
LGT209 (20 mpk i.p.)+hPcsk9 (3 мкг/ч i.v.) J
LGT210 (20 mpk i p )+hPcsk9 (3 мкг/ч I v ) 5
LGT211 (20 mpk i.p.)' hlJcsk9 (3 мкг/ч i.v.) ]
Фиг. 10
Общий Pcsk9 человека Ат-кандидат
"свободный" CSP
наполн. наполн. мг/кг наполн. наполн. " " " мг/кг
i.p. i.p. 20 20 20 ip. ip
Tv°m LGT210 LGT211 rrigG Tv°"H 1ДТ210 LGT211 mlgG
PCSK9
PCSK9 (3 мкг/ч; i.v.)
(3 мкг/ч; i.v.)
Фиг. 11
Анализ методом Вестерн-блоттинга ЛПНПР в препаратах мембран клеток печени
hPcsk9 (3 мкг/ч, i.v.)
hPcsk9 (3 мкг/ч, i.v.)
LGT210
LGT211
mlgG
Фиг. 12
не-ЛПВП-Х (07-176-Pcsk9-C57-19)
не-ЛПВП-Х (07-176-Pcsk9-C57-20)
не-ЛПВП-Х (07-176-Pcsk9-C57-21)
р <0,005
-ж 0 ш
1 1
2 25
в-1 о
PCSK9 (3 мкг/ч; i.v.)
20 20 а LGT210 LGT211 mlgG
PCSK9 (3 мкг/ч; i.v.)
наполн. отриц.
контроль LGI510 L8T211 Lm}
PCSK9 (3 мкг/ч; i.v.)
иiс к) iic-JIIIBll-X;
нс-ЛПВП-Х I не-ЛПВП-Х
LGT209 -4Щр <Ш) ¦ -44%(р <й < LGT210 ¦ -97%(р <0.001) - 39% (n.s.) LGT211 - -81%{р <Ш) -44%(р <0.(
Фиг. 13
ФК-профиль "типичного" мАт в виде IgG в организме крыс с не-TMD (сплошная линия), на график наложены экспериментальные данные
время (в днях)
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032084
032084
- 1 -
- 1 -
032084
032084
- 1 -
- 1 -
032084
032084
- 1 -
- 1 -
032084
032084
- 1 -
- 1 -
032084
032084
- 4 -
- 3 -
032084
032084
- 9 -
032084
032084
- 12 -
- 12 -
032084
032084
- 24 -
032084
032084
- 27 -
- 27 -
032084
032084
- 44 -
- 44 -
032084
032084
- 44 -
- 44 -
032084
032084
- 56 -
- 56 -
032084
032084
- 56 -
- 56 -
032084
032084
- 61 -
- 61 -
032084
032084
- 62 -
- 62 -
<220>
032084
032084
- 67 -
- 66 -
<220>
032084
032084
- 67 -
- 66 -
032084
032084
- 69 -
- 69 -
032084
032084
- 70 -
- 70 -
032084
032084
- 72 -
- 72 -
032084
032084
- 73 -
- 73 -
032084
032084
- 73 -
- 73 -
032084
032084
- 74 -
- 74 -
032084
032084
- 74 -
- 74 -
032084
032084
- 74 -
- 74 -
032084
032084
- 74 -
- 74 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 75 -
- 75 -
032084
032084
- 76 -
- 76 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -
032084
032084
- 77 -
- 77 -