EA 032076B1 20190430

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000032076b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение формулы (1) представляющее собой конъюгат карнозина формулы (2) с гиалуроновой кислотой, где конъюгация обеспечена посредством образования амидной связи между NH ₂ -группой карнозина и карбоксильной группой гиалуроновой кислоты, где гиалуроновая кислота имеет средневесовую молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от 90 до 230 кДа или от 500 до 730 кДа.

2. Соединение по п.1, где процентное содержание карбоксильных групп гиалуроновой кислоты, конъюгированных посредством образования амидной связи с карнозином, находится в диапазоне от 2 до 25%, предпочтительно от 5 до 20% и предпочтительно равняется 7% от общего содержания карбоксильных групп гиалуроновой кислоты.

3. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где гиалуроновая кислота характеризуется средневесовой молекулярной массой, находящейся в диапазоне от 180 до 210 кДа.

4. Способ получения соединения по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что карнозин ковалентно конъюгируют с гиалуроновой кислотой посредством образования амидной связи между NH ₂ -группой карнозина и карбоксильной группой активного производного гиалуроновой кислоты, представляющего собой сложный эфир 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(Н)-она, при этом карнозин защищен по карбоксильной группе посредством образования метилового сложного эфира, при этом с карбоксильной группы снимают защиту в конце реакции конъюгации.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента соединение, характеризующееся формулой (1), по любому из пп.1-3 для применения в лечении и/или предупреждении нарушений и состояний, связанных с конформацией белка, выбранных из группы, состоящей из катаракты, сухости глаз, старения кожи, ран, повреждений желудка, диабета, ослабленного иммуномодулирующего ответа, заболеваний почек, заболеваний печени, опухолевых и неврологических заболеваний, повреждений вследствие ишемии/реперфузии.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское ои 032076 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. А61К47/48 (2006.01)
2019.04.30
(21) Номер заявки 201692368
(22) Дата подачи заявки 2015.07.30
(54) ПРОИЗВОДНЫЕ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И КАРНОЗИНА
(31) MI2014A001395
(32) 2014.07.31
(33) IT
(43) 2017.04.28
(86) PCT/IB2015/055782
(87) WO 2016/016847 2016.02.04
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ШЮТО СЕБАСТЬЯНО; КОНСИГЛИО НАЦИОНАЛЬ ДЕЛЛЬ РИЧЕРЧЕ; ФИДИЯ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.П.А. (IT)
(72) Изобретатель:
Шюто Себастьяно, Греко Валентина, Риццарелли Энрико, Беллия Франческо, Ланца Валерия, Ваккаро Сузанна, Мессина Лучиано (IT)
(74) Представитель:
Носырева Е.Л. (RU)
(56) WO-A2-2012076961 EP-A1-1176154 EP-A1-1860116
(57) Настоящее изобретение относится к производному карнозина (Р-аланил-Ь-гистидина), характеризующемуся формулой (1), полученному посредством функционализации гиалуроновой кислоты с помощью карнозина.
Настоящее изобретение относится к производному карнозина (Р-аланил-Ь-гистидина), характеризующемуся формулой (1), полученному посредством функционализации гиалуроновой кислоты с помощью карнозина.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к соединению, характеризующемуся формулой
(1)
т.е. конъюгированному 3-Ы-гиалуронилу с 2-(3-аминопропанамид)-3-(1Н-имидазол-4-ил)пропано-вой кислотой или гиалуронилкарнозину, или 3-(1Н-имидазол-4-ил)-2-(3-гиалуронамидопропанамид) пропановой кислоте.
Соединение, характеризующееся формулой (1), указанное выше, представляет собой конъюгат ди-пептида карнозина, характеризующегося формулой (2)
и гиалуроновой кислоты, где конъюгация получена посредством образования амидной связи между NH2-группой карнозина, предпочтительно защищенного по карбоксильной группе, и одной или более карбоксильными группами гиалуроновой кислоты, предпочтительно активного производного гиалуроновой кислоты, еще более предпочтительно сложного эфира СОХ, характеризующегося формулой (3)
Настоящее изобретение также относится к способу получения 3^-гиалуронила, конъюгированного с 2-(3-аминопропанамид)-3-(1Н-имидазол-4-ил)пропановой кислотой (HyCar) и составов, содержащих вышеуказанное для применения в фармацевтическом производстве, косметологии и пищевых добавках, с антиоксидантной, заживляющей, хелатирующей, гастропротекторной (в качестве комплекса с Zn2+), модулирующей уровень глюкозы, иммуномодулирующей, противоопухолевой, антигенотоксической, ней-ропротекторной, антигликирующей, антифибриллогенной активностью, активностью в отношении старения центральной нервной системы, защитной активностью в отношении повреждения вследствие ишемии/реперфузии, нефропротекторной, гепатопротекторной активностью.
В процессе дыхания клеток вырабатывается важный и потенциально опасный побочный продукт: супероксидный радикал О2*-, который может реагировать, разрушая их, с биологическими макромолеку
лами, такими как белки, ДНК и липиды, и могут вырабатываться другие высокореактивные формы (ROS), такие как "ОН, RO2*, ROOH, RO*, Н2О2 и ONOO*, которые являются потенциально агрессивными по отношению к клеточной системе. Все аэробные организмы имеют защитные механизмы в отношении радикала О2"- , среди которых главными являются ферменты супероксиддисмутазы (SOD), которые катализируют дисмутацию О2"- до О2 и Н2О2. Перекись водорода, полученная таким образом, в свою очередь, превращается в Н2О посредством каталазы и посредством глутатионпероксидазы, таким образом предотвращая образование радикала "ОН, который будет вырабатываться в результате реакции Фентона (Fe(II)+)+H2O2-Fe(III)+"OH+-OH). При определенных патологических состояниях (воспалительных процессах, реперфузионном повреждении, сердечных приступах, болезни Альцгеймера, ALS и т.д.) ферментов SOD может быть недостаточно для устранения полученного избытка О2"- и биологические ткани в данных случаях могут подвергаться дальнейшему повреждению. В некоторых тканях позвоночных, таких как ткани мышц или головного мозга, характеризующихся более высоким уровнем окислительного метаболизма, был обнаружен высокий уровень малых молекул с антиоксидантной активностью, таких как глутатион и другие пептиды (карнозин, гомокарнозин, ансерин и т.д.), которые обладают функцией усиленной защиты от процессов окислительного стресса. Защитная активность этих пептидов по отношению к ROS была подробно описана и показана в литературе ((Biochim. Biophys. Acta 1570, 89, 2002; Mol. Cells 13, 498, 2002; Biochem. J. 967, 241, 1988).
Для карнозина, в частности, в отношении его свойств против образования свободных радикалов и против окисления в пероксиды, доклинические исследования продемонстрировали его способность предупреждения и, в некоторых случаях, лечения катаракты (Biochem. Int. 15, 1105, 1987; Biochim. Biophys. Acta 1004, 363, 1989). Была продемонстрирована противовоспалительная активность в тканях пищеварительной системы, глаз и кожи ((патентные документы US 4508728 A, DE 4316293, WO 01/52808 А). Дополнительно карнозин показал ингибирующее действие по отношению к окислению LDL человека, индуцируемое Cu(II) (Eur. J. Med. Chem. 43, 373, 2008), и была конкретно продемонстрирована его активность как акцептора радикалов по отношению к гидроксильному радикалу (Helv. Chim. Acta 85, 1633, 2002). По отношению к механизму, который обеспечивает противодействие карнозина патологическим влияниям нитрозативного стресса, было продемонстрировано, что прямое взаимодействие с оксидом азота является одним из возможных путей (J. Neurosci. Res. 85, 2239, 2007), с учетом того, что только встречающийся в природе дипептид существенно снижает количество оксида азота, высвобождающегося посредством NO-донора. Позднее была продемонстрирована эффективность карнозина в снижении активации PARP-1, а также PARP-2 после индукции окислительного стресса (Neurochem. Res. 35, 2144, 2010; Mol. Aspects Med. 32, 258, 2011). L-карнозин, с другой стороны, аналогично N-монометиларгинину (известному ингибитору iNOS) препятствует экспрессии PRAP-1 (Neurochem. Res. 38, 50, 2013).
Также интересно наблюдать то, что комплексы карнозина с Cu(II) показывают синергическую активность в отношении двух токсичных форм радикалов, О2-" и НО" (DaltonTrans. 4406, 2003). Параллельно наблюдалось, что присутствие карнозина, ансерина, гомокарнозина и других подобных пептидов улучшает всасывание цинка в кишечнике, на практике улучшая биодоступность. Данный факт является особенно примечательным при синдроме дефицита цинка и при воспалительных заболеваниях кишечника (Biomed. Res. Trace Elem. 12, 159, 2001).
Пептидное происхождение карнозина обуславливает различные ограничения в его применении, связанные с его способностью к разложению со стороны конкретных пептидаз. Для преодоления этого ограничения было предложено применение N-ацетилкарнозина (патентный документ WO 95/10294 А), который разлагается намного медленнее, чем свободный карнозин (Clin. Chim. Acta 254, 1-21, 1996). Для той же цели также применяли получение производных карнозина с циклодекстринами, а именно с соединениями, широко применяемыми в качестве носителей для лекарственных средств, за счет образования вторичного амина (патентный документ ЕР 1176154 А). В этом случае циклодекстрин стабилизирует дипептид, защищая его от гидролитической активности карнозиназы, как продемонстрировано для подобных систем (J. Am. Chem. Soc. 120, 7030, 1998), в результате обеспечивая проявление карнозином его биологической активности, которой способствует присутствие олигосахарида, устраняющего "ОН радикалы (Helv. Chim. Acta 85, 1633, 2002). На основе той же теории конъюгированное соединение карнозина с трегалозой (патентный документ ЕР 1860116 А1) было впоследствии запатентовано в качестве системы с антиоксидантной, антигликирующей и антитромбоцитарной активностями. Также в данном случае карнозин конъюгируется посредством связей с функциональными группами -ОН трегалозы, образуя вторичные амины. Связи, образованные таким образом, в определенной степени более стабильные, чем таковые, полученные посредством ионной связи, не только, по меньшей мере частично, защищают карно-зин от разложения под действием ферментов, но они обеспечивают преимущество в отношении известной способности трегалозы защищать белки от конформационных изменений под действием денатурирующих агентов.
С другой стороны, объект настоящего изобретения, соединение, характеризующееся формулой (1), получают посредством ковалентной конъюгации карнозина с гиалуроновой кислотой за счет образования амидной связи между карбоксильной группой НА и аминогруппой карнозина.
Гиалуроновая кислота представляет собой полимер, состоящий из повторяющихся дисахаридных звеньев, состоящих из глюкуроновой кислоты (P-D-глюкопирануроновой кислоты) и ацетилглюкозамина (2-ацетиламино-2-дезокси-p-D-глюкопираноза), связанных друг с другом с помощью гликозидной связи между аномерным атомом углерода первого и С-3 ацетилглюкозамином. Дисахаридные звенья, в свою очередь, связаны друг с другом с помощью гликозидных связей между аномерным углеродом ацетилг-люкозамина дисахаридного звена и С-3 остатка глюкуроновой кислоты, принадлежащего следующему дисахаридному звену, образуя линейные цепи переменной длины. Средняя молекулярная масса (MW) НА зависит от этой длины, при этом указанная MW является чрезвычайно переменной, также в зависимости от источников, из которых получена НА. В частности, НА, применяемая в настоящем изобретении, может быть получена посредством экстракции (например, из гребней петуха), посредством ферментации или посредством биосинтеза, при этом характеризуется средней MW от 90 до 230 кДа, предпочтительно от 180 до 210 кДа. Следующий диапазон средней MW, применяемый для целей настоящего изобретения, составляет от 500 до 730 кДа. В настоящем описании средняя MW означает "средневесовую MW", рассчитанную в соответствии со способом "характеристической вязкости" (Terbojevich et al., Car-bohydr Res, 1986, 363-377). Гиалуроновая кислота (НА) представляет собой встречающийся в природе биологически разлагаемый полимер, имеющий различные применения в медицине, включая молекулярные каркасы для тканевой инженерии и терапию с восстановлением вязкости синовиальной жидкости для лечения остеоартроза. Гиалуроновая кислота применяется в настоящее время в области косметологии ввиду ее защитных и увлажняющих свойств. Она представляет собой одну из главных структурных составляющих внеклеточного матрикса (ЕСМ) тканей позвоночных и она может быть обнаружена практически во всех жидкостях и тканях тела, таких как синовиальная жидкость, жидкость стекловидного тела и гиалиновый хрящ (Biomedical applications of hyaluronic acid. ACS Publications, p. 155-74, 2006; Bi-omaterials 25, 1339, 2004; Calcified Tissue Int. 7, 175, 1971; Dumitriu S., Polymeric biomaterials. New York: Marcel Dekker, 2002. ISBN:0-8247-8969-5). Этот биополимер выполняет функцию молекулярного каркаса и связан с другими молекулам матрикса, наряду с аггреканом (Garg H.G., Hales С.А., Chemistry and biology of hyaluronan. Oxford: Elsevier Science, 2004. ISBN:978-0-08-044382-9).
НА также играет определенную роль в различных биологических функциях, таких как регулирование адгезии и сократительной способности клеток, управление дифференцировкой и пролиферацией клеток, и она обеспечивает механические свойства тканей (Biomaterials 25, 1339, 2004). Было продемонстрировано, что некоторые рецепторы поверхности клетки (такие как CD44, RHAMM и ICAM-1) действуют вместе с НА, влияя на некоторые клеточные процессы, среди которых морфогенез, заживление, воспалительный процесс и метастазирование (Biomaterials 26, 359-71, 2005; Nat. Rev. Cancer 4, 528, 2004; J. Surg. Res. 147, 247, 2008; J. Cell. Sci. 103, 293, 1992). НА также отвечает за вязкоупругие свойства некоторых биологических жидкостей (синовиальной жидкости, жидкости стекловидного тела глаза) и она контролирует гидратацию ткани и транспорт воды (Vet. Med. 53, 397, 2008). Дополнительно НА была обнаружена в процессе развития эмбриона в пупочном канатике, что указывает на то, что составные материалы НА могут создавать благоприятные условия для образования и роста тканей (Acta Biomater. 6, 2407, 2010; Biomaterials 28, 1830, 2007; J. Control. Release 69,1 69, 2000; Chem. Rev. 101, 1869, 2001; Biomate-
rials 24, 4337, 2003).
Характеристики НА, включая ее консистенцию, биосовместимость и гидрофильность, делают ее идеальным увлажнителем, применяемым в косметической дерматологии и продуктах для ухода за кожей
(Vet. Med. 53, 397, 2008).
В заявке на патент WO 2012/076961 А2 заявляется соединение, содержащее гиалуроновую кислоту, образующее соль или, по меньшей мере частично, образующее соль с карнозином; целью изобретателя в данной заявке на патент было получение препаратов, в которых представлены биофармакологические свойства обоих соединений. В этом случае, однако, вследствие ионного происхождения связи, которая удерживает два активных компонента вместе, при достижении заявленным соединением биологических жидкостей, оно сразу же будет высвобождать свободный карнозин, который будет быстро разрушен под воздействием карнозиназы сыворотки. Конъюгат, характеризующийся формулой (1), объект настоящего изобретения, напротив, и как ранее рассматривалось, характеризуется наличием между карнозином и гиалуроновой кислотой ковалентной связи амидного типа, которая не является непосредственно гидро-лизуемой, таким образом карнозин в его конъюгированной форме является более устойчивым к действию карнозиназы сыворотки и соединение, характеризующееся формулой (1), поддерживает карнозин в связанном и неизменном состоянии на протяжении периода времени, достаточного для обеспечения достижения вышеуказанным карнозином участка, где он будет оказывать свое воздействие, обеспечивая технический эффект медленного высвобождения.
Однако заявителем было обнаружено и продемонстрировано, что эта связь не только, как ожидалось, замедляет высвобождение карнозина, будучи гидролизуемой в меньшей степени, чем ранее описанные связи, но она, главным образом, придает соединению формулы (1) антиоксидантную активность, которая является чрезвычайно высокой. При помощи конъюгации НА и карнозина посредством амидной связи, как заявлено в настоящем документе, увеличивается биологическое воздействие карнозина в оп
ределенно более высокой степени, чем действие вследствие простой защиты от ферментативного гидролиза, и это оказалось полностью неожиданным ввиду того, что НА как таковая не проявляет антиокси-дантную активность.
Ввиду вышеуказанного присутствие гиалуроновой кислоты в конъюгате, который является объектом настоящего изобретения, синергетически усиливает действие в отношении окислительных процессов, которые ранее присутствовали в карнозине, обеспечивая в дальнейшем значительную стабильность по отношению к карнозиназе сыворотки и, в результате, придавая более высокую активность по отношению к карнозину как таковому или ацетильному производному.
Процентное содержание карбоксильных групп гиалуроновой кислоты, конъюгированной с помощью амидной связи с карнозином, находится в диапазоне от 2 до 25%, предпочтительно от 5 до 20% и еще более предпочтительно равняется 7% общего содержания карбоксильных групп НА.
Объект настоящей заявки на патент также относится к О^Щ-комплексу конъюгата, характеризующегося формулой (1).
SOD-подобная антиоксидантная активность Cu(II)-комплекса конъюгата, характеризующегося формулой (1), была фактически оценена, проверена in vitro посредством сравнения с Cu(II)-комплексом свободного карнозина и с Cu(II)-комплексом неконъюгированной гиалуроновой кислоты. Результаты показали, что активность Cu(II)-комплекса, характеризующегося формулой (1), является чрезвычайно высокой по отношению к активности соответствующих комплексов карнозина или гиалуроновой кислоты.
Объект настоящего изобретения также относится к способу получения соединения, характеризующегося формулой (1), где производное гиалуроновой кислоты ковалентно конъюгировано с карнозином, защищенным по карбоксильной группе. Соединение, характеризующееся формулой (1), в соответствии с настоящим изобретением было фактически синтезировано исходя из гиалуроновой кислоты, активированной соответствующим образом, и карнозина, защищенного по карбоксильной группе. Активное производное гиалуроновой кислоты представляет собой предпочтительно сложный эфир и еще более предпочтительно сложный эфир 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(Н)-она (НООВТ), в котором дипептид кар-нозина предпочтительно применяют в форме метилового сложного эфира.
Для этой цели можно применять другие сложные эфиры карнозина или другие активные производные гиалуроновой кислоты, эквивалентные сложному эфиру НООВТ.
Соединение, характеризующееся формулой (1), показало более сильную устойчивость к действию карнозиназы сыворотки человека по отношению к неконъюгированному карнозину.
Объект настоящего изобретения также относится к фармацевтическим, косметическим или нутри-цевтическим композициям, содержащим соединение, характеризующееся формулой (1), в качестве активного компонента. Принимая во внимание антиоксидантные, антигликирующие, антитромбоцитарные и хелатирующие свойства по отношению к переходным металлам, композиции, содержащие соединение, характеризующееся формулой (1), можно применять для лечения или предупреждения состояний, в которых образование свободных радикалов или нарушение конформации белков вследствие как гликиро-вания, так и других причин, имеет патогенное значение. Примеры этих состояний включают катаракту, сухость глаз, старение кожи, раны, повреждения желудка, диабет, ослабленный иммуномодулирующий ответ, заболевания почек, заболевания печени, опухолевые и неврологические патологии (старение центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера), повреждение вследствие ишемии/реперфузии.
Объект настоящего изобретения, таким образом, относится к фармацевтическим, косметическим или нутрицевтическим композициям, содержащим соединение, характеризующееся формулой (1), в качестве активного компонента, для применения в лечении и/или предупреждении нарушений и состояний, связанных с конформацией белка, таких как катаракта, сухость глаз, старение кожи, раны, повреждения желудка, диабет, ослабленный иммуномодулирующий ответ, заболевания почек, заболевания печени, опухолевые и неврологические заболевания, повреждение вследствие ишемии/реперфузии. Эти композиции фактически характеризуются заживляющей, гастропротекторной, предпочтительно в качестве комплекса с Zn2+, модулирующей уровень глюкозы, иммуномодулирующей, противоопухолевой, антиге-нотоксической, нейропротекторной активностью, активностью в отношении старения центральной нервной системы, защитной активностью от повреждения вследствие ишемии/реперфузии, нефропротектор-ной и гепатопротекторной активностью.
Дозы и пути введения зависят от условий, которые главным образом определяются клиническими экспертами, однако при этом обычно находятся в диапазоне от 100 до 5000 мг/сутки per os и от 0,1 до 10 вес.% для составов для местного или системного применения (т.е. в виде инъекций).
Возможные примеры составов включают капсулы, таблетки, гранулы, порошки, растворы, мази, гели, глазные капли и любой другой состав, известный эксперту в области составов.
Возможные пути введения очевидно связаны с заболеванием, подлежащим лечению, и для иллюстративных целей могут включать пероральное, местное, осуществляемое на определенном участке, внутримышечное, интрадермальное, внутриглазное, внутри- или периартикулярное, инфузионное и т.д.
Пример, который иллюстрирует настоящее изобретение, представлен далее.
Если не указано иное, применяли коммерчески доступные реагенты, обработанные следующим об
разом, при необходимости безводный метанол (SIGMA, MeOH), применяемый для синтеза метилового сложного эфира карнозина, перед применением выдерживали в течение 24 ч на молекулярных ситах с размером пор 4 А.
Метиловый сложный эфир карнозина (Car-ОМе) синтезировали, обрабатывая карнозин (Sigma) соляной кислотой в метаноле при 0°С. Ацетилхлорид применяли в качестве источника HCl.
^-ЯМР спектр регистрировали на контрольно-измерительном приборе Varian при 500 МГц (Inova 500), с применением HOD частоты в качестве образца.
Целью экспериментов было определение молекулярно-массового распределения (MWD) и определение характеристической вязкости конъюгированного HyCar осуществляли на хроматографической системе CPG/SEC, оснащенной тройным детектором Malvern (ViscoteckTDmax).
Измерения флуоресценции осуществляли на спектрофотометре SHIMADZU RF-5301 PC, в свою очередь измерения абсорбции в УФ-видимой части спектра осуществляли на спектрофотометре SHIMADZU UV-1800 или Beckman DU 650.
SOD-подобную активность Cu(II)-комплекса конъюгированного HyCar и, в том числе, Cu(II)-комплекса карнозина или НА, определяли с помощью теста Фридовича (Anal. Biochem. АА, 276, 1971).
Для приготовления указанных Cu(II)-комплексов применяли нитрат меди в водном растворе в следующих концентрациях: [L] = [Cu(II)] = 10-6-10-7; фактически известно специалисту в данной области, что карнозин легко образует хелаты с переходными металлами (Free Red Res. Commun.; 1991, 12-13 pt. 1, 179-185). Все применяемые химические продукты были приобретены у Sigma.
HPLC анализ олигосахаридов, полученных следующим ферментативным перевариванием HyCar или свободной гиалуроновой кислоты с тестикулярной гиалуронидазой быка, проводили на хроматогра-фической системе Agilent 1200 с УФ-детектором, с применением колонки Supelcosil LC-SAX1 (25x4,6 см; Supelco) и при считывании хроматографического профиля при длине волны 214 нм. Элюирование: скорость потока 1,2 мл/мин; изократический 50 мМ NaCl (рН 4) на протяжении 5 мин, затем программировали для 1,2 М NaCl (pH 4) за 60 мин.
Пример.
Синтез 3^-гиалуронила, конъюгированного с 2-(3-амино1фопанамид)-3-(Ш-имидазол-4-ил)пропа-новой кислотой (HyCar).
В типичной процедуре синтеза 1 г гиалуроната натрия (195 кДа) добавляли при перемешивании к 20 мл холодного тетрагидрофурана (THF) при 5°С. Следующие продукты добавляли последовательно к образующейся в результате суспензии: 20 мл раствора H2O/THF (1:1 об./об.), содержащего 0,5 ммоль НООВТ, 10 мл раствора H2O/THF (1:1 об./об.), содержащего 0,2 ммоль трис[2-(2-метоксиэтокси)этил] амина, и 5 мл раствора метанола, содержащего 0,125 ммоль метилового сложного эфира L-карнозина. Через 30 мин при 5°С 10 мл раствора гидрохлорида №(3-диметиламино1гоопил)-№-этилкарбодиимида (EDC HCl; 0,25 ммоль) добавляли к смеси и всю реакционную массу оставляли в условиях непрерывного перемешивания при 5°С на протяжении 20 ч. Спустя данный промежуток времени реакционную смесь обрабатывали 100 мл раствора 0,1н. NaOH и оставляли в покое при 5°С на протяжении следующих 3,5 ч. На этой стадии рН смеси доводили до 7,0 с помощью 2н. HCl и конъюгат осаждали посредством добавления 800 мл ацетона. Продукт, представляющий интерес, удаляли из супернатанта посредством центрифугирования и впоследствии подвергали диализу против воды на протяжении 60 ч. Конъюгат затем извлекали и лиофилизировали (выход 70%).
1Н ЯМР (D2O, 500 МГц) (ppm): 8,66 (синглет; Н-2 имидазольного кольца), 7,34 (синглет; Н-5 имида-зольного кольца), 4,61-4,52 (широкий мультиплет; Н-6 остатков глюкуроновой кислоты, Н-1 остатков N-ацетилглюкозамина и Н-2 цепи пропановой кислоты), 3,90-3,23 (широкий мультиплет; Н-2, Н-3, Н-4 и Н-5 остатков глюкуроновой кислоты, Н-2, Н-3, Н-4, Н-5, 2Н-6 остатков N-ацетилглюкозамина и С-3 метилена пропанамидной группы), 3,17 (мультиплет; 2Н-3 цепи пропановой кислоты, 2,44 (мультиплет; метилен С-2 пропанамидной группы), 2,06 (широкий синглет СН3 остатков N-ацетилглюкозамина). 1Н ЯМР спектр конъюгированного HyCar с главными распределениями показан на фиг. 1, которая показывает резонансы, применяемые для вычисления процентного содержания карбоксильных групп, связанных амидным мостиком с карнозиновыми звеньями (% загрузки).
Количество карнозина, присутствующего в конъюгате, определяли из соотношения между значением интегрирования сигнала при 2,06 ppm (по отношению к ацетильным группам НА) и значением интегрирования сигнала при 2,44 ppm (по отношению к С-3 пропанамидной группы) или одного из Н-2 или Н-5 сигналов имидазольного кольца (при 8,66 и 7,34 ppm соответственно).
Следуя процедуре синтеза, описанной выше, было доказано, что процентное содержание карбоксильных групп, присутствующих в полисахаридном звене конъюгата, которые образуют амидную связь с карнозином, равняется 7%. Модифицируя надлежащим образом стехиометрические отношения между НА и другими реагентами, были получены значения конъюгации не более 25%.
Характеристическая вязкость и молекулярно-массовое распределение конъюгата HyCar.
Параметры, указанные выше, определяли с помощью эксклюзионной хроматографии, которую проводили на хроматографической системе GPCmax VE 2001 (Malvern), оснащенной двумя колонками TSK-
GEL GMPWXL (7,8 мм IDx30 см; Viscotek-TOSOH BIOSCIENCE), установленными последовательно. Систему объединяли с системой трех детекторов, размещенных последовательно, и содержащей рефрактометрический детектор, детектор рассеянного света и дифференциальный вискозиметр с четырьмя капиллярами. Образец элюировали с применением водного раствора 0,1М нитрата натрия, содержащего 0,5 г/л азида натрия со скоростью потока 0,6 мл/мин, при 40°С. Применяли программное обеспечение Om-nisec 4.1 для сбора и анализа данных.
На фиг. 2 показана типичная хроматограмма, полученная для HyCar (загрузка 7%), которая указывает хроматографическое поведение образца HyCar (7% загрузка) на колонке TSK-GEL GMPWXL. Определение с помощью тройного детектора осуществляли на Viscotek TDA 302 (Malvern).
Физические параметры, относящиеся к характеристической вязкости и молекулярной массе (MW), определенные при разных концентрациях конъюгата гиалуроновой кислоты-карнозина, сравненные с соответствующими данными для гиалуроновой кислоты, определенные с помощью эксклюзионной хроматографии, объединенной с тройным детектором, указаны в табл. 1 ниже.
Таблица 1
Образец
Теоретическая конц (мг/мл)
Обнаруженная конц. (мг/мл)
Молекулярная масса (MW)
Характеристическая вязкость (дл/г)
НА 190 кДа (D)
0,5 мг/мл
0,513
190713
5,2
НА 190 кДа (Е)
0,25 мг/мл
0,261
192830
5,2
НА 190 кДа (F)
0,1 мг/мл
0,109
194713
5,3
НуСаг (7%) 190 кДа
0,5 мг/мл
0,420
196758
4,8
НуСаг (7%) 190 кДа
0,25 мг/мл
0,205
200258
4,8
НуСаг (7%) 190 кДа
0,1 мг/мл
0,081
204370
4,9
На фиг. 3 показан в качестве примера график Марка-Хаувинка (log вязкости по отношению к log молекулярной массы, MW) для конъюгата гиалуроновой кислоты-карнозина (загрузка 7%) по сравнению с таковым для неконъюгированной гиалуроновой кислоты: более конкретно, график был получен для раствора (0,5 мг/мл) HyCar (7% загрузка) по сравнению с раствором при той же концентрации, соответствующей неконъюгированной гиалуроновой кислоты.
Результаты показали, что характеристическая вязкость конъюгата HyCar только незначительно ниже, чем таковая для неконъюгированной гиалуроновой кислоты, характеризующейся такой же MW, с учетом того, что средневесовая молекулярная масса конъюгата является когерентно более высокой, чем таковая для исходного полисахарида. Это означает, что конъюгация не изменяет физико-химические характеристики НА, от которых зависит ее реологическое поведение. Это является очень важным, особенно на стадии составления продукта, когда необходимо предварительно установить реологические параметры конечного продукта (вязкость, однородность и т.д.).
SOD-подобная антиоксидантная активность.
SOD-подобную активность Cu(II)-комплекса конъюгата HyCar определяли с применением непрямого метода Фридовича (Anal. Biochem. АА, 276, 1971). Супероксидный анион вырабатывали фермента-тивно с использованием системы ксантин-ксантиноксидаза с последующим спектрофотометрическим наблюдением восстановления нитросинего тетразолия (NBT) при 560 нм. Реакционная смесь содержала цитохром с (30 мкМ) или NBT (250 мкМ), ксантин (50 мкМ), в фосфатном буфере (10 мМ) при рН 7,4. Достаточное количество ксантиноксидазы добавляли к 2 мл этой смеси для того, чтобы получить 0,024 ДА мин-1. Это соответствует скорости образования О2"-, равной 1,1 мкМ мин-1. Скорость восстановления хромогенной молекулы измеряли в присутствии и в отсутствие рассматриваемого комплекса на протяжении 600 с. Все измерения осуществляли при 25±0,2°С с применением кювет, характеризующихся оптической длиной пути 1 см, с термостатической регуляцией и магнитным перемешиванием. Для того чтобы исключить возможное ингибирование активности ксантиноксидазы, получение мочевой кислоты со стороны ксантиноксидазы спектрофотометрически сопровождали при 295 нм в отдельных экспериментах.
Значения I50 (т.е. концентрация, которая приводит к 50% ингибированию восстановления NBT) для рассматриваемых комплексов с металлами, определенные при рН 7,4, указаны на фиг. 4 и в табл. 2 ниже.
Таблица 2
Комплекс
1}0мкМ
SOD
0,014 (±0,003)
Cu/HyCar (7%)
0,21 (±0,04)
Cu/Car
0,8 (±0,16)
СиУНА
1,0 (±0,2)
Таким образом, в табл. 2 показаны SOD-подобные активности Cu(II)-комплексов HyCar, Car и НА, выраженные как концентрации, способные к ингибированию 50% восстановления NBT (I50).
Более конкретно, на фиг. 4 показаны SOD-подобные активности Cu(II)-комплексов (Cu-HyCar) и неконъюгированной НА (Cu-НА), определенные с помощью непрямого метода, предложенного Фридо-вичем, в соответствии с функциональными инструкциями, описанными выше. Очевидно, что чем меньше количество продукта, который применяют для получения значения I50, тем выше его антиоксидантная активность. Исходя из анализа данных, становится очевидным, что конъюгат Cu/HyCar характеризуется антиоксидантной активностью приблизительно в 4 раза выше, чем таковая для Cu/Car. Исходя из того, что комплекс Cu/НА, как ожидалось, характеризуется очень низкой антиоксидантной активностью, результат, полученный с Cu/HyCar, является удивительным и неожиданным и он демонстрирует синергизм вследствие конкретного типа конъюгации НА/карнозина с помощью амидной связи, как описано в настоящем документе.
Ферментативный гидролиз со стороны карнозиназы сыворотки человека.
Зависимую от времени стабильность HyCar по отношению к карнозиназе сыворотки человека, сравниваемую со стабильностью смеси карнозина + НА или карнозина отдельно, определяли посредством инкубирования каждого из этих веществ (900 мкМ) при 37°С в 50 мМ трис/HCl (рН 8,0) с вышеуказанным ферментом (CN1), очищенным с помощью культуральной среды клеток HeLa, стабильно транс-фицированных, как указывалось ранее (Antioxid. Redox Signal., 11, 2759, 2009). Параллельный эксперимент осуществляли в качестве отрицательного контроля, в котором гиалуроновую кислоту отдельно подвергали действию ферментов. Ход реакции сопровождался сбором при разных временных интервалах 50 мкл аликвот смеси в общем на протяжении 5 ч, и, после освобождения от белков с помощью трихлорук-сусной кислоты (ТСА) производили флуорометрическое определение количества гистидина в конечном растворе после осуществления реакции с ортофталевым альдегидом (ОРА; Fluka) в соответствии с ранее описанной процедурой (Clin. Chim. Acta, 1982, 123, 221). Результаты показаны на фиг. 5.
Более конкретно, на фиг. 5 показана стабильность со временем HyCar (•), которую подвергали действию карнозиназы сыворотки человека, в сравнении со стабильностью карнозина (ш\ карнозина + НА (А) и НА отдельно (*) (последнюю использовали как отрицательный контроль для эксперимента). Высвобожденный гистидин определяли спектрофотометрически в качестве ОРА-производного.
Ферментативный гидролиз со стороны тестикулярной гиалуронидазы быка.
Стабильность HyCar конъюгата по отношению к гиалуронидазе (тестикулярная гиалуронидаза быка, Sigma) оценивали посредством инкубирования вышеуказанного (250 мкл, 20 мг/мл) на протяжении 2 ч при 37°С в буфере (100 мМ ацетат натрия, 150 мМ NaCl, pH 5,2) с 1500 звеньями фермента. Спустя данный промежуток времени гидролизат анализировали посредством HPLC на анионнообменной колонке при условиях эксперимента, описанных в пункте [0024] и ранее приведенного в литературе (Anal. Chem., 2007, 6390-6397). В качестве параллельного эксперимента, свободную гиалуроновую кислоту использовали в качестве субстрата для подобного фермента при таких же условиях эксперимента. В обоих случаях получали одинаковый хроматографический профиль, характеризующийся присутствием продуктов разложения, главным образом состоящих из тетрамерных и гексамерных глицидных звеньев.
Библиографические ссылки, упоминаемые в описании.
В следующем списке указаны библиографические ссылки, упомянутые заявителем, приведенные только для удобства читателя. Указанное не должно рассматриваться как часть настоящего патентного документа. Еще в случае составления с наивысшей степенью осторожности не исключены возможные ошибки или упущения. Следовательно, в этом отношении не предполагается никакой ответственности.
Патенты, упоминаемые в описании.
US 4508728 А; DE 4316293; WO 0152808 А; WO 9510294 А; ЕР 1176154 А; ЕР 1860116 А1; WO 2012/076961 А2.
Непатентная литература, указанная в описании.
Biochim. Biophys. Acta, 2002, vol. 1570, 89; Molecules and Cells, 2002, vol. 13, 498;
Biochem. J., 1988, vol. 967, 241; Biochem. Int., 1987, vol. 15, 1105;
Biochim. Biophys. Acta, 1989, vol. 1004, 363; Eur. J. Med. Chem., 2008, vol. 43, 373; Helv. Chim. Acta, 2002, vol. 85, 1633; J. Neurosci. Res. 2007, vol. 85, 2239; Neurochem. Res., 2010, vol. 35, 2144; Mol. Aspects Med., 2011, vol. 32, 258; Neurochem. Res., 2013, vol. 38, 50; Dalton Trans., 2003, 4406; Biomed. Res. Trace Elem., 2001, vol. 12, 159;
Clinical Chim. Acta, 1996, vol. 254, 1; J. Am. Chem. Soc, 1998, vol. 120, 7030;
Biomedical applications of hyaluronic acid. ACS Publications, 2006, p. 155-74;
Biomaterials, 2004, vol. 25, 1339;
Calcified Tissue Int., 1971, vol. 7, 175;
Dumitriu S., Polymeric biomaterials. New York: Marcel Dekker, 2002. ISBN: 0-8247-8969-5; Garg H.G., Hales CA., Chemistry and biology of hyaluronan. Oxford: Elsevier Science, 2004. ISBN: 9780-08-044382-9;
Biomaterials, 2005, vol. 26, 359; Nat. Rev. Cancer, 2004, vol. 4, 528;
J. Surg. Res., 2008, vol. 147, 247; J. Cell Sci., 1992, vol. 103, 293;
Vet. Med., 2008, vol. 53, 397;
Acta Biomater., 2010, vol. 6, 2407;
Biomaterials, 2007, vol. 28, 1830; J. Control. Release, 2000, vol. 69, 169;
Chem. Rev., 2001, vol. 101, 1869; Biomaterials, 2003, vol. 24, 4337; Int. J. Tissue React., 2002, vol. 24, 65;
Acta Biomater., 2013, vol. 9, 7081; Anal. Biochem., 1971, vol. 44, 276; Clin. Chim. Acta, 1982, vol. 123, 221;
Anal. Chem., 2007, 6390-6397;
Free Red Res. Commun, 1991, 12-13 pt.1, 179-185.
(2),
с гиалуроновой кислотой, где конъюгация обеспечена посредством образования амидной связи между №г[2-группой карнозина и карбоксильной группой гиалуроновой кислоты, где гиалуроновая кислота
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
имеет средневесовую молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от 90 до 230 кДа или от 500 до 730 кДа.
2. Соединение по п.1, где процентное содержание карбоксильных групп гиалуроновой кислоты, конъюгированных посредством образования амидной связи с карнозином, находится в диапазоне от 2 до 25%, предпочтительно от 5 до 20% и предпочтительно равняется 7% от общего содержания карбоксильных групп гиалуроновой кислоты.
3. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где гиалуроновая кислота характеризуется средневесовой молекулярной массой, находящейся в диапазоне от 180 до 210 кДа.
4. Способ получения соединения по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что карнозин ковалентно конъюгируют с гиалуроновой кислотой посредством образования амидной связи между ЮТ2-группой карнозина и карбоксильной группой активного производного гиалуроновой кислоты, представляющего собой сложный эфир 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(Н)-она, при этом карнозин защищен по карбоксильной группе посредством образования метилового сложного эфира, при этом с карбоксильной группы снимают защиту в конце реакции конъюгации.
5. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента соединение, характеризующееся формулой (1), по любому из пп.1-3 для применения в лечении и/или предупреждении нарушений и состояний, связанных с конформацией белка, выбранных из группы, состоящей из катаракты, сухости глаз, старения кожи, ран, повреждений желудка, диабета, ослабленного иммуномодулирую-щего ответа, заболеваний почек, заболеваний печени, опухолевых и неврологических заболеваний, повреждений вследствие ишемии/реперфузии.
2.
Объем удерживания (мл)
16-07-2012" 16-40 08_A_-_CcniugatoJ1 vdt ШШЙ,", ЩА*(tm)**(tm)
------- Pacctffliwc света под прямым yt .т> "
.i..ii1.-J.uilll....i,l..jii..j" Рассеян не свала над малым Внскозичстр - И*
Фиг. 2
Ixig молекулярной массы
Наложение J рафиков lug \арак1ернс1ической вшкосш в ивисимост (II log молекулярной массы
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032076
- 1 -
032076
- 1 -
032076
- 1 -
032076
- 4 -
032076
- 10 -