[RU]

1. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, содержащий водорастворимое производное жирной кислоты, включающее жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, причем указанное производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку, где водорастворимый линкер включает полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ, по меньшей мере одну аминооксигруппу, присоединенную к терапевтическому белку, и вторую аминооксигруппу, присоединенную к жирной кислоте или эфиру жирной кислоты, где жирная кислота включает цепь длиной С10-С24.

2. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, который связывает сывороточный альбумин человека (HSA) in vitro или in vivo, обладает повышенным временем полужизни по сравнению с нативным терапевтическим белком и в котором жирная кислота является насыщенной жирной кислотой или ненасыщенной жирной кислотой.

3. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.2, где жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.

4. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.

5. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота присоединена к водорастворимому линкеру по группе жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из концевой карбоксильной группы и ω-группы, в которой ω-группа выбрана из группы, состоящей из гидроксила, амино-, тио- и карбоксила.

6. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.

7. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где сложный эфир жирной кислоты выбран из группы, состоящей из метилового эфира и этилового эфира.

8. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.7, где сложный эфир жирной кислоты представляет собой метиловый эфир 16-гидроксигексадекановой кислоты.

9. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.

10. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.9, где водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы

11. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством оксимной связи, где оксимная связь образована между оксимной группой водорастворимого линкера и альдегидной группой окисленного углевода в составе терапевтического белка.

12. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты выбрано из группы, состоящей из: а) натриевой соли 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)гексадекановой кислоты формулы b) метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты

13. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 α, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 β, фактора роста эндотелиальных клеток β, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора α1, рецептора глиального нейротрофического фактора α2, белка, связанного с ростом, белка α, связанного с ростом, белка β, связанного с ростом, белка γ, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора α лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора α тромбоцитарного фактора роста, рецептора β тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста α, трансформирующего фактора роста β, трансформирующего фактора роста β1, трансформирующего фактора роста β1.2, трансформирующего фактора роста β2, трансформирующего фактора роста β3, трансформирующего фактора роста β5, латентного трансформирующего фактора роста β1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста β, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, адалимумаба, деносумаба, этанерцепта, белка из таблицы.

14. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIIa.

15. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIII.

16. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FIX.

17. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий: a) окисление ω-гидроксигруппы жирной кислоты с получением альдегидной группы в составе жирной кислоты; b) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, к указанной альдегидной группе с образованием стабильной оксимной связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и c) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где ω-гидроксигруппу окисляют окислителем, выбранным из группы, состоящей из периодинанового реагента Десса-Мартина, реагента Tempo, оксалилхлорида/ДМСО, тетрапропиламмонийперрутената (ТРАР) и реагентов на основе хрома (VI) (реагента Коллинза, пиридинийхлорхромата (РСС) и бихромата пиридиния); где жирной кислотой является насыщенная жирная кислота или ненасыщенная жирная кислота.

18. Способ по п.17, в котором жирной кислотой является жирная кислота с разветвленной цепью.

19. Способ по п.17, в котором жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.

20. Способ по п.19, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.

21. Способ по п.17, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.

22. Способ по п.21, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы

23. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий: a) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с получением эфира жирной кислоты; b) активацию ω-гидроксигруппы жирной кислоты с получением мезильной группы в составе жирной кислоты со стадии а); c) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, путем замещения мезильной группы со стадии b) с образованием стабильной оксиимин-метиленовой связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и d) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где карбоксильную группу этерифицируют этерифицирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из ацетилхлорида, метанола в присутствии кислоты, этанола в присутствии кислоты, диазометана и метилиодида; где ω-гидроксигруппу активируют активирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из мезилхлорида, тозилхлорида и нозилхлорида; и где жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту.

24. Способ по п.23, в котором жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.

25. Способ по п.23, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.

26. Способ по п.25, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.

27. Способ по п.23, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.

28. Способ по п.27, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы

29. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий контакт окисленной углеводной группы терапевтического белка с производным жирной кислоты в условиях, обеспечивающих конъюгирование; причем указанную углеводную группу окисляют путем инкубирования с буфером, включающим окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO ₄ ), тетраацетата свинца (Pb(OAc) ₄ ) и перрутената калия (KRuO ₄ ); где производное жирной кислоты включает жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, включающему (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу; где между окисленной углеводной группой и активной аминооксигруппой производного жирной кислоты образуется оксимная связь; где образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, включающей анилин, о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфаниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и п-анизидин.

30. Способ по п.29, в котором терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 α, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 β, фактора роста эндотелиальных клеток β, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора α1, рецептора глиального нейротрофического фактора α2, белка, связанного с ростом, белка α, связанного с ростом, белка β, связанного с ростом, белка γ, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора α лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора α тромбоцитарного фактора роста, рецептора β тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста α, трансформирующего фактора роста β, трансформирующего фактора роста β1, трансформирующего фактора роста β1.2, трансформирующего фактора роста β2, трансформирующего фактора роста β3, трансформирующего фактора роста β5, латентного трансформирующего фактора роста β1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста β, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, адалимумаба, деносумаба, энбрела этанерцепта, белка из таблицы.

31. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIIa.

32. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIII.

33. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FIX.

34. Способ по п.17, в котором окислителем является периодинан Десса-Мартина.

(57) Реферат / Формула:

1. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, содержащий водорастворимое производное жирной кислоты, включающее жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, причем указанное производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку, где водорастворимый линкер включает полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ, по меньшей мере одну аминооксигруппу, присоединенную к терапевтическому белку, и вторую аминооксигруппу, присоединенную к жирной кислоте или эфиру жирной кислоты, где жирная кислота включает цепь длиной С10-С24.

2. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, который связывает сывороточный альбумин человека (HSA) in vitro или in vivo, обладает повышенным временем полужизни по сравнению с нативным терапевтическим белком и в котором жирная кислота является насыщенной жирной кислотой или ненасыщенной жирной кислотой.

3. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.2, где жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.

4. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.

5. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота присоединена к водорастворимому линкеру по группе жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из концевой карбоксильной группы и ω-группы, в которой ω-группа выбрана из группы, состоящей из гидроксила, амино-, тио- и карбоксила.

6. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.

7. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где сложный эфир жирной кислоты выбран из группы, состоящей из метилового эфира и этилового эфира.

8. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.7, где сложный эфир жирной кислоты представляет собой метиловый эфир 16-гидроксигексадекановой кислоты.

9. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.

10. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.9, где водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы

11. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством оксимной связи, где оксимная связь образована между оксимной группой водорастворимого линкера и альдегидной группой окисленного углевода в составе терапевтического белка.

12. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты выбрано из группы, состоящей из: а) натриевой соли 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)гексадекановой кислоты формулы b) метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты

13. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 α, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 β, фактора роста эндотелиальных клеток β, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора α1, рецептора глиального нейротрофического фактора α2, белка, связанного с ростом, белка α, связанного с ростом, белка β, связанного с ростом, белка γ, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора α лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора α тромбоцитарного фактора роста, рецептора β тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста α, трансформирующего фактора роста β, трансформирующего фактора роста β1, трансформирующего фактора роста β1.2, трансформирующего фактора роста β2, трансформирующего фактора роста β3, трансформирующего фактора роста β5, латентного трансформирующего фактора роста β1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста β, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, адалимумаба, деносумаба, этанерцепта, белка из таблицы.

14. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIIa.

15. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIII.

16. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FIX.

17. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий: a) окисление ω-гидроксигруппы жирной кислоты с получением альдегидной группы в составе жирной кислоты; b) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, к указанной альдегидной группе с образованием стабильной оксимной связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и c) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где ω-гидроксигруппу окисляют окислителем, выбранным из группы, состоящей из периодинанового реагента Десса-Мартина, реагента Tempo, оксалилхлорида/ДМСО, тетрапропиламмонийперрутената (ТРАР) и реагентов на основе хрома (VI) (реагента Коллинза, пиридинийхлорхромата (РСС) и бихромата пиридиния); где жирной кислотой является насыщенная жирная кислота или ненасыщенная жирная кислота.

18. Способ по п.17, в котором жирной кислотой является жирная кислота с разветвленной цепью.

19. Способ по п.17, в котором жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.

20. Способ по п.19, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.

21. Способ по п.17, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.

22. Способ по п.21, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы

23. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий: a) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с получением эфира жирной кислоты; b) активацию ω-гидроксигруппы жирной кислоты с получением мезильной группы в составе жирной кислоты со стадии а); c) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, путем замещения мезильной группы со стадии b) с образованием стабильной оксиимин-метиленовой связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и d) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где карбоксильную группу этерифицируют этерифицирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из ацетилхлорида, метанола в присутствии кислоты, этанола в присутствии кислоты, диазометана и метилиодида; где ω-гидроксигруппу активируют активирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из мезилхлорида, тозилхлорида и нозилхлорида; и где жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту.

24. Способ по п.23, в котором жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.

25. Способ по п.23, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.

26. Способ по п.25, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.

27. Способ по п.23, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.

28. Способ по п.27, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы

29. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий контакт окисленной углеводной группы терапевтического белка с производным жирной кислоты в условиях, обеспечивающих конъюгирование; причем указанную углеводную группу окисляют путем инкубирования с буфером, включающим окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO ₄ ), тетраацетата свинца (Pb(OAc) ₄ ) и перрутената калия (KRuO ₄ ); где производное жирной кислоты включает жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, включающему (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу; где между окисленной углеводной группой и активной аминооксигруппой производного жирной кислоты образуется оксимная связь; где образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, включающей анилин, о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфаниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и п-анизидин.

30. Способ по п.29, в котором терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 α, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2 β, фактора роста эндотелиальных клеток β, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора α1, рецептора глиального нейротрофического фактора α2, белка, связанного с ростом, белка α, связанного с ростом, белка β, связанного с ростом, белка γ, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора α лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора α тромбоцитарного фактора роста, рецептора β тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста α, трансформирующего фактора роста β, трансформирующего фактора роста β1, трансформирующего фактора роста β1.2, трансформирующего фактора роста β2, трансформирующего фактора роста β3, трансформирующего фактора роста β5, латентного трансформирующего фактора роста β1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста β, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, адалимумаба, деносумаба, энбрела этанерцепта, белка из таблицы.

31. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIIa.

32. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIII.

33. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FIX.

34. Способ по п.17, в котором окислителем является периодинан Десса-Мартина.

---

Евразийское 032056 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2019.04.30
(21) Номер заявки
201390940
(22) Дата подачи заявки 2011.12.16
(51) Int. Cl. A61K47/48 (2006.01) A61P 7/00 (2006.01)
(54) КОНЪЮГАТ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО БЕЛКА И ПРОИЗВОДНОГО ЖИРНОЙ
КИСЛОТЫ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО БЕЛКА И ПРОИЗВОДНОГО ЖИРНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ)
(31) 61/426,356
(32) 2010.12.22
(33) US
(43) 2014.04.30
(86) PCT/US2011/065591
(87) WO 2012/087838 2012.06.28
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД
(US); БАКСАЛТА ГМБХ (CH)
(72) Изобретатель:
Зикманн Юрген, Шайнекер Рихард, Роттенштайнер Ханспетер, Турецек Петер (AT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-2003069170 WO-A2-2005117984
EKRAMI H.M. ET AL.: "Water-soluble fatty acid derivatives as acylating agents for reversible lipidization of polypeptides", FEBS LETTERS, ELSEVI ER, AMSTERDAM, NL, vol. 371, 11 September 1995 (1995-09-11), pages 283-286, XP002244694, ISSN: 0014-5793, DOI: 10. 1016/0014-5793 (95)00910-2 abstract figure 1
WO-A1-2011101277 WO-A2-2008025856
(57) Изобретение относится к конъюгату терапевтического белка и производного жирной кислоты и способам получения такого конъюгата. Настоящее изобретение улучшает фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства белка при сведении к минимуму затрат, связанных с различными реагентами, и рисков для здоровья пациентов-реципиентов.
Область техники
Настоящее изобретение относится к материалам и способам конъюгирования водорастворимого производного жирной кислоты с белком.
Уровень техники
Описаны различные молекулы и/или соединения для конъюгирования с терапевтическими белками с целью увеличения времени полужизни конъюгированных терапевтических белков после введения пациенту (Veronese F.M. and Mero A., BioDrugs 2008; 22:315-29; Gregoriadis G. et al., Int J Pharm 2005; 300:125-30 и Shechter Y. et al.; International Journal of Peptide Research and Therapeutics 2007; vol 13:10517).
Жирные кислоты (ЖК) можно конъюгировать с терапевтическими белками с целью образования производных с увеличенным временем действия. Указанный принцип увеличения времени полужизни белка или пептида основан на том, что ЖК могут связываться с сывороточным альбумином человека (HSA; ЖК также называют альбуминсвязывающими зондами). Связывание ЖК с сывороточным альбумином человека в крови может привести к существенному увеличению времени полужизни терапевтического белка, поскольку он будет перерабатываться совместно с альбумином посредством неонатального Fc-рецептора. ЖК и их производные (например, соответствующие метиловые эфиры) демонстрируют аналогичные альбуминсвязывающие свойства (Spector A.A., J Lipid Res 1975; 16:165-79).
Одним из ярких примеров указанного принципа увеличенного времени действия является инсулин детемир (левемир, Levemir(r)) от Novo Nordisk. В инсулине детемире карбоксильная группа ЖК кова-лентно связана с е-аминогруппой остатка лизина в составе белка инсулина (см., например, США №№ 5866538, 6011007 и 6869930). Аналогичные подходы описаны другими исследовательскими группами (Shechter Y. et al., Bioconj Chem 2005; 16:913-20 и Sasson K. et al., J Control Release 2010; 142:214-20). Например, указанными группами описана высвобождаемая FMOC-система, содержащая активный сложный эфир NHS для соединения с аминогруппами белков. Однако отличие заключается в том, что в указанной концепции ЖК связана с белком через функциональную группу в со -положении, что сохраняет карбоксильную группу в интактном состоянии. Таким образом, можно получить пролекарства с пролонгированным действием, связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, но диссоциирующие со временем по мере медленного гидролиза FMOC-системы в физиологических условиях (Sasson K. et al., J
Control Release 2010; 142:214-20).
В дополнение к использованию жирных кислот можно получить конъюгаты путем образования ко-валентной связи между водорастворимым полимером и терапевтическим белком с помощью различных химических способов. ПЭГилирование полипептидных лекарственных средств защищает их в кровотоке и улучшает их фармакодинамические и фармакокинетические профили (Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003; 2:214-21). В ходе ПЭГилирования к полипептидному лекарственному средству присоединяются повторяющиеся этиленгликолевые единицы (полиэтиленгликоль (ПЭГ)). Молекулы ПЭГ обладают большим гидродинамическим объемом (в 5-10 раз превышающим размер глобулярных белков), хорошо растворимы в воде, гидратированы, нетоксичны, неиммуногенны и быстро выводятся из организма. ПЭГилирование молекул может приводить к повышенной устойчивости препаратов к ферментативному разложению, повышенному времени полужизни in vivo, пониженной частоте приема, пониженной иммуногенности, повышенной физической и термической стабильности, повышенной растворимости, повышенной стабильности в жидкостях и пониженной агрегации. Первые ПЭГилированные лекарственные средства были одобрены FDA в начале 1990-х годов. С тех пор FDA одобрило несколько ПЭ-Гилированных лекарственных средств для перорального введения, инъекций и местного применения.
Полисиаловая кислота (PSA), также известная как коломиновая кислота (СА), является природным полисахаридом. Она является гомополимером N-ацетилнейраминовой кислоты с а (2-8)-кетозидными связями и содержит на невосстанавливающем конце вицинальные диольные группы. Она отрицательно заряжена и является естественным компонентом организма человека. Ее легко получить из бактерий в больших количествах и с заранее заданными физическими характеристиками (патент США № 5846951). Поскольку PSA, продуцированная бактериями, является химически и иммунологически идентичной PSA, продуцируемой в организме человека, бактериальная PSA не является иммуногенной, даже при соединении с белками. В отличие от некоторых полимеров PSA является биоразлагаемой. Показано, что кова-лентное связывание коломиновой кислоты с каталазой и аспарагиназой повышало стабильность ферментов в присутствии протеолитических ферментов или плазмы крови. Сравнительные исследования поли-сиалилированной и немодифицированной аспарагиназы in vivo показали, что полисиалирование увеличивало время полужизни фермента (Fernandes and Gregoriadis, Int J Pharm. 2001; 217:215-24).
Присоединение производных ПЭГ к пептидам или белкам рассмотрено в работе Roberts et al. (Adv Drug Deliv Rev 2002; 54:459-76). Одним подходом для сочетания водорастворимых полимеров с терапевтическими белками является конъюгирование полимеров через углеводные остатки белка. Вицинальные гидроксильные (ОН) группы углеводов в составе белков можно легко окислить периодатом натрия (NaIO4) с образованием активных альдегидных групп (Rothfus and Smith, J Biol Chem 1963; 238:1402-10; van Lenten and Ashwell, J Biol Chem 1971; 246:1889-94). Впоследствии к альдегидным группам углевода
можно присоединить полимер с использованием реагентов, содержащих, например, активную гидразид-ную группу (Wilchek M. and Bayer E.A., Methods Enzymol 1987; 138:429-42). Более поздней технологией является использование реагентов, содержащих аминооксигруппы, реагирующие с альдегидами с образованием оксимных связей (WO 96/40662, WO 2008/025856).
Дополнительные примеры, описывающие присоединение водорастворимого полимера к терапевтическому белку, описаны в WO 06/071801, в котором сообщается об окислении углеводных остатков в составе фактора Виллебранда и последующем присоединении к ПЭГ с использованием гидразидных реакций; патентной публикации США 2009/0076237, в которой сообщается об окислении rFVIII и последующем присоединении к ПЭГ и другим водорастворимым полимерам (например, PSA, гидроксиэтил-крахмалу, декстрану) с использованием гидразидных реакций; WO 2008/025856, в котором сообщается об окислении различных факторов свертывания, например rFIX, FVIII и FVIIa, и последующем присоединении, например, к ПЭГ с использованием аминооксигрупп путем образования оксимной связи; и патенте США № 5621039, в котором сообщается об окислении FIX и последующем присоединении к ПЭГ с использованием гидразидных реакций.
Независимо от вышеуказанных материалов и способов конъюгирования белков желательна разработка новых материалов и способов, например, обеспечивающих манипуляции и получение стабильных белковых конъюгатов. Хотя жирные кислоты могут обеспечивать преимущество связывания HSA, с жирными кислотами часто трудно работать в водной среде, и они могут высвобождаться или отделяться от белкового партнера по связыванию с течением времени.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает материалы и способы конъюгирования полимеров и водорастворимых производных жирных кислот с белками, улучшающие фармакодинамические и/или фармако-кинетические свойства белка при сведении к минимуму затрат, связанных с различными реагентами, и риски для здоровья пациентов-реципиентов, если реакция конъюгирования катализируется нуклеофиль-ным катализатором. Настоящее изобретение обеспечивает материалы и способы конъюгирования водорастворимых производных жирных кислот с белками в водном растворе и получения за счет этого стабильных белковых конъюгатов, из которых не происходит высвобождения жирных кислот с течением времени.
Под объем притязаний настоящей заявки подпадают следующие объекты:
1. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, содержащий водорастворимое производное жирной кислоты, включающее жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, причем указанное производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку, где водорастворимый линкер включает полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ, по меньшей мере одну аминооксигруппу, присоединенную к терапевтическому белку, и вторую аминооксигруппу, присоединенную к жирной кислоте или эфиру жирной кислоты, где жирная кислота включает цепь длиной С10-С24.
2. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, который связывает сывороточный альбумин человека (HSA) in vitro или in vivo, обладает повышенным временем полужизни по сравнению с нативным терапевтическим белком, и в котором жирная кислота является насыщенной жирной кислотой или ненасыщенной жирной кислотой.
3. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.2, где жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.
4. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.
5. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота присоединена к водорастворимому линкеру по группе жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из концевой карбоксильной группы и со-группы, в которой со-группа выбрана из группы, состоящей из гидроксила, амино-, тио- и карбоксила.
6. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
7. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где сложный эфир жирной кислоты выбран из группы, состоящей из метилового эфира и этилового эфира.
8. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.7, где сложный эфир жирной кислоты представляет собой метиловый эфир 16-гидроксигексадекановой кислоты.
9. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
10. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.9, где водорастворимый
линкер выбран из группы, состоящей из:
a) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы
H2N"0NV^^O'^4/0"NH2
b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы
с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
d) 3,6,9,12,15,18,21 -гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
11. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством оксимной связи, где оксимная связь образована между оксимной группой водорастворимого линкера и альдегидной группой окисленного углевода в составе терапевтического белка.
12. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты выбрано из группы, состоящей из:
а) натриевой соли 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)гексадекановой кислоты формулы
b) метилового кислоты
13. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Вил-лебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консен-сусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинпо-добного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинпо-добного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинпо-добного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического бел-ка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогене-тического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогене-тического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенети-ческого белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротро-фического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса ней-трофилов 2а, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2в, фактора роста эндотели-альных клеток в, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробла-стов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора а1, рецептора глиально-го нейротрофического фактора а2, белка, связанного с ростом, белка а, связанного с ростом, белка в, связанного с ростом, белка у, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсули-ноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора а лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора
фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоци-тарного фактора роста ВВ, рецептора а тромбоцитарного фактора роста, рецептора в тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста а, трансформирующего фактора роста в, трансформирующего фактора роста в1, трансформирующего фактора роста в 1.2, трансформирующего фактора роста в2, трансформирующего фактора роста в3, трансформирующего фактора роста в5, латентного трансформирующего фактора роста в1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, в-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липо-протеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, ада-лимумаба, деносумаба, этанерцепта, белка из таблицы.
14. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIIa.
15. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIII.
16. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FIX.
17. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий:
a) окисление со-гидроксигруппы жирной кислоты с получением альдегидной группы в составе жирной кислоты;
b) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, к указанной альдегидной группе с образованием стабильной оксимной связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и
c) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка;
причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где с -гидроксигруппу окисляют окислителем, выбранным из группы, состоящей из периодинанового реагента Десса-Мартина, реагента Tempo, оксалилхлорида/ДМСО, тетрапропиламмонийперрутената (ТРАР) и реагентов на основе хрома (VI) (реагента Коллинза, пиридинийхлорхромата (РСС) и бихромата пиридиния); где жирной кислотой является насыщенная жирная кислота или ненасыщенная жирная кислота.
18. Способ по п.17, в котором жирной кислотой является жирная кислота с разветвленной цепью.
19. Способ по п.17, в котором жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, C16, С18, С20, С22 и С24.
20. Способ по п.19, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
21. Способ по п.17, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
22. Способ по п.21, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из:
a) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы
H2N"°v^V0'^/0"NH2
b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы
c) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
H2N О О О NH2 И
d) 3,6,9,12,15,18,21 -гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
23. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий:
a) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с получением эфира жирной кислоты;
b) активацию ю-гидроксигруппы жирной кислоты с получением мезильной группы в составе жирной кислоты со стадии а);
c) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, путем замещения мезильной группы со стадии b) с образованием стабильной оксиимин-метиленовой связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и
d) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка;
причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где карбоксильную группу эте-рифицируют этерифицирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из ацетилхлорида, метанола в присутствии кислоты, этанола в присутствии кислоты, диазометана и метилиодида; где ю-гидроксигруппу активируют активирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из мезилхлори-да, тозилхлорида и нозилхлорида; и где жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту.
24. Способ по п.23, в котором жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.
25. Способ по п.23, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, C16, С18, С20, С22 и С24.
26. Способ по п.25, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
27. Способ по п.23, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
28. Способ по п.27, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из:
а) 3 -оксапентан-1,5-диоксамина формулы
Ь) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы
с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
H2N-°^0^NH>
29. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий контакт окисленной углеводной группы терапевтического белка с производным жирной кислоты в условиях, обеспечивающих конъюгирование;
причем указанную углеводную группу окисляют путем инкубирования с буфером, включающим окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца ^(ОАс)^ и перрутената калия (KRuO4);
где производное жирной кислоты включает жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, включающему (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу;
где между окисленной углеводной группой и активной аминооксигруппой производного жирной кислоты образуется оксимная связь;
и где образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, включающей анилин, о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфаниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и п-анизидин.
30. Способ по п.29, в котором терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангио-генина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогене
30.
нина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогене-тического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфо-генетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенети-ческого белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетиче-ского белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофиче-ского фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2а, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2в, фактора роста эндотелиальных клеток в, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фиброб-ластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейро-трофического фактора а1, рецептора глиального нейротрофического фактора а2, белка, связанного с ростом, белка а, связанного с ростом, белка в, связанного с ростом, белка у, связанного с ростом, гепа-ринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулинопо-добного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора а лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейро-трофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора а тромбоцитарного фактора роста, рецептора в тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста а, трансформирующего фактора роста в, трансформирующего фактора роста в1, трансформирующего фактора роста в 1.2, трансформирующего фактора роста в2, трансформирующего фактора роста в3, трансформирующего фактора роста в5, латентного трансформирующего фактора роста в1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназно-го типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогона-дотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазми-ногена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, в-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирую-щего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопо-этина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, адалимумаба, деносумаба, энбрела этанерцепта, белка из таблицы.
31. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIIa.
32. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIII.
33. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FIX.
34. Способ по п.17, в котором окислителем является периодинан Десса-Мартина. Перечисленные выше объекты на практике могут иметь различные варианты осуществления, которые продемострирова-ны ниже в рамках материалов настоящей заявки.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлено водорастворимое производное жирной кислоты, включающее жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, причем указанное производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку. В еще одном варианте осуществления производное жирной кислоты связывает человеческий сывороточный альбумин (HSA) in vitro или in vivo. В еще одном варианте осуществления конъюгат "производное жирной кислоты терапевтический белок" обладает повышенным временем полужизни по сравнению с нативным терапевтическим белком. В еще одном варианте осуществления указанное выше производное жирной кислоты включает насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту. В родственном варианте осуществления жирной кислотой является насыщенная жирная кислота. В еще одном варианте осуществления жирной кислотой является жирная кислота с разветв
ленной цепью.
Рассматриваются производные жирных кислот, содержащие жирные кислоты различной длины. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором жирная кислота включает цепь длиной от C10 до С24, включая синтетические жирные кислоты с нечетным количеством атомов углерода. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С20, С22 и С24. В еще одном варианте осуществления длина цепи жирной кислоты выбрана из группы, состоящей из С14, С16 и С18. В еще одном варианте осуществления длина цепи жирной кислоты выбрана из группы, состоящей из С13, С15 и С17.
В еще одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором жирная кислота присоединена к водорастворимому линкеру по группе в составе жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из концевой карбоксильной группы и ю-группы. В еще одном варианте осуществления жирная кислота присоединена к водорастворимому линкеру по ю-группе. В еще одном варианте осуществления ю-группа выбрана из группы, состоящей из гидроксильной, амино-, тио-и карбоксильной групп.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
В еще одном варианте осуществления представлено производное жирной кислоты, в котором сложный эфир жирной кислоты выбран из группы, состоящей из метилового эфира и этилового эфира. В одном варианте осуществления сложный эфир жирной кислоты представляет собой метиловый эфир 16-гидроксигексадекановой кислоты.
В настоящем изобретении рассматриваются различные водорастворимые линкеры. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором водорастворимый линкер включает водорастворимый полимер и по меньшей мере одну функциональную группу, присоединенную к терапевтическому белку. В одном варианте осуществления функциональная группа, присоединенная к терапевтическому белку, обладает способностью придавать отрицательный или положительный заряд, тем самым обуславливая растворимость линкера в воде. В еще одном варианте осуществления функциональную группу выбирают из группы, состоящей из сульфогруппы, карбоксильной группы, гидроксильной группы, аминогруппы, амидогруппы, малеимидогруппы, аминооксигруппы и гидра-зидной группы. В одном варианте осуществления функциональная группа представляет собой аминоок-сигруппу.
В настоящем изобретении рассматриваются различные водорастворимые полимеры. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором водорастворимый полимер, являющийся неотъемлемой частью линкера, выбран из группы, состоящей из полиэти-ленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, полисиаловой кислоты (PSA), гидроксиалкилкрахмала (HAS), гидроксиэтилкрахмала (HES), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленок-сида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоил-морфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена и ангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола и ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформальдегида) (PHF) и 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС). В еще одном варианте осуществления водорастворимый полимер является ПЭГ. В данном описании также рассматриваются водорастворимые полимеры различной длины. В одном варианте осуществления представлено производное жирной кислоты, в котором длина цепи водорастворимого полимера выбрана из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
В одном варианте осуществления представлено производное жирной кислоты, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из 3 -оксапентан-1,5 -диоксиамина
H2N О NH2
3,6,9-триоксаундекан-1,11 -диоксиамина
1 О \^ \^^о
3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина
H2N О О О NH2 И
3,6,9,12,15,18,21 -гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина
H2N 0-Ъ
В еще одном варианте осуществления изобретения представлено производное жирной кислоты, в котором производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством
оксимной связи. В еще одном варианте осуществления оксимная связь образована между оксимной группой водорастворимого линкера и альдегидной группой окисленного углевода в составе терапевтического белка.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения представлено производное жирной кислоты, в котором производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством малеимидогруппы водорастворимого линкера и свободной сульфгидрильной группы в составе терапевтического белка. В еще одном варианте осуществления производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством N-гидроксисукцинимидного эфира водорастворимого линкера и свободной аминогруппы терапевтического белка.
В одном варианте осуществления изобретения представлено производное жирной кислоты, в котором производное жирной кислоты выбрано из группы, состоящей из:
а) натриевой соли 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)гексадекановой кислоты формулы
В настоящем изобретении рассматриваются различные терапевтические белки. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбо-поэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопо-этинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витро-нектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетиче-ского белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического бел-ка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфоге-нетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарно-го нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2а, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2в, фактора роста эндоте-лиальных клеток в, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора а1, рецептора глиально-го нейротрофического фактора а2, белка, связанного с ростом, белка а, связанного с ростом, белка в, связанного с ростом, белка у, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсули-ноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора а лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных
клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоци-тарного фактора роста ВВ, рецептора а тромбоцитарного фактора роста, рецептора в тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста а, трансформирующего фактора роста в, трансформирующего фактора роста в1, трансформирующего фактора роста в 1.2, трансформирующего фактора роста в2, трансформирующего фактора роста в3, трансформирующего фактора роста в5, латентного трансформирующего фактора роста в1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста в , белка III, связывающего трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, в-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липо-протеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, ху-миры (адалимумаба), Prolia (деносумаба), энбрела (этанерцепта), белка из таблицы или их биологически активного фрагмента, производного или варианта. В еще одном варианте осуществления терапевтическим белком является FVIIa. В еще одном варианте осуществления терапевтическим белком является FVIII. В еще одном варианте осуществления терапевтическим белком является FIX.
В данном описании также рассматриваются способы получения производных жирных кислот. В одном варианте осуществления представлен способ получения производного жирной кислоты, описанного в данном описании, включающий а) окисление ю-гидроксигруппы жирной кислоты с целью получения альдегидной группы в составе жирной кислоты, и b) присоединение водорастворимого линкера, включающего активную аминооксигруппу, к альдегидной группе с образованием стабильной оксимной связи, причем производное жирной кислоты растворимо в воде. В одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором ю-гидроксигруппу окисляют окислителем, выбранным из группы, состоящей из периодинана Десса-Мартина, реагента Tempo, окисления по Сверну оксалилхло-ридом/ДМСО, тетрапропиламмонийперрутената (ТРАР), реагентов на основе хрома (VI), например реагента Коллинза, пиридинийхлорхромата (РСС) и дихромата пиридиния. В еще одном варианте осуществления окислитель представляет собой периодинан Десса-Мартина.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту. В еще одном варианте осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту.
В еще одном варианте осуществления изобретения представлен указанный выше способ, в котором жирная кислота представляет собой жирную кислоту с разветвленной цепью.
Согласно еще одному варианту осуществления также представлен указанный выше способ, в котором жирная кислота включает цепь длиной от C10 до С24, включая синтетические жирные кислоты с нечетным количеством атомов углерода. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С20, С22 и С24. В еще одном варианте осуществления длина цепи жирной кислоты выбрана из группы, состоящей из С14, С16 и С18. В еще одном варианте осуществления длина цепи жирной кислоты выбрана из группы, состоящей из С13, С15 и С17.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором водорастворимый линкер включает водорастворимый полимер и по меньшей мере одну аминооксигруппу.
В настоящем изобретении для использования в указанном выше способе рассматриваются различные водорастворимые полимеры. В одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, полисиаловой кислоты (PSA), гидроксиалкилкрахмала (HAS), гидроксиэтилкрахмала (HES), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дер-матансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалки-ленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена и ангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола и ангидрида малеино-вой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформальдегида) (PHF) и 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС). В одном варианте осуществления водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ.
Кроме того, рассматриваются водорастворимые полимеры различной длины. В одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором длина цепи водорастворимого полимера выбрана из группы, состоящей из O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором водораство
римый линкер выбран из группы, состоящей из: а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы
Ь) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы
c) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
H2N О О О NH2 И
d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
нгм'Ч^о--}гМН\
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором водорастворимый линкер представляет собой 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамин формулы
В данном описании также рассматриваются другие способы получения производных жирных кислот. В одном варианте осуществления представлен способ получения указанного выше производного жирной кислоты, включающий а) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с целью получения сложного эфира жирной кислоты; b) активацию ю-гидроксигруппы жирной кислоты путем внедрения мезильной группы в состав жирной кислоты на стадии а), и с) присоединение водорастворимого линкера, содержащего активную аминооксигруппу, путем замещения мезильной группы на стадии b), за счет чего образуется стабильная оксиамин-метиленовая связь; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде.
В одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором карбоксильную группу этерифицируют этерифицирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из ацетилхлорида, метанола в присутствии кислоты, этанола в присутствии кислоты, диазометана и метилиодида. В еще одном варианте осуществления этерифицирующий агент представляет собой ацетилхлорид.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором ю-гидроксигруппу активируют активирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из мезилхлори-да, тозилхлорида и нозилхлорида. В одном варианте осуществления активирующий агент представляет собой мезилхлорид.
Для использования в указанном выше способе рассматриваются различные жирные кислоты. В одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором жирная кислота является насыщенной жирной кислотой или ненасыщенной жирной кислотой. В еще одном варианте осуществления жирная кислота является насыщенной жирной кислотой. В еще одном варианте осуществления жирная кислота представляет собой жирную кислоту с разветвленной цепью.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором жирная кислота включает цепь длиной от C10 до С24, включая синтетические жирные кислоты с нечетным количеством атомов углерода. В одном варианте осуществления представлено указанное выше производное жирной кислоты, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С20, С22 и С24. В еще одном варианте осуществления длина цепи жирной кислоты выбрана из группы, состоящей из С14, С16 и С18. В еще одном варианте осуществления длина цепи жирной кислоты выбрана из группы, состоящей из С13, С15 и С17.
Для использования в указанном выше способе также рассматриваются различные водорастворимые полимеры. В одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором водорастворимый линкер включает водорастворимый полимер и по меньшей мере одну аминооксигруппу. В еще одном варианте осуществления водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэти-ленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, полисиаловой кислоты (PSA), гидроксиалкилкрахмала (HAS), гидроксиэтилкрахмала (HES), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленок-сида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоил-морфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена и ангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола и ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформальдегида) (PHF) и 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС). В еще одном варианте осуществления водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ.
В еще одном варианте осуществления изобретения представлен указанный выше способ, в котором
длина цепи водорастворимого полимера выбрана из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15. В еще одном варианте осуществления водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из [0050]
В настоящем изобретении также рассматриваются способы получения конъюгированных белков. В одном варианте осуществления представлен способ получения конъюгированного терапевтического белка, включающий контакт окисленной углеводной группы терапевтического белка с указанной выше жирной кислотой (или водорастворимым полимером, как описано в данном описании) в условиях, обеспечивающих конъюгирование; углеводную группу окисляют путем инкубирования с буфером, включающим окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца ^^ОАс)^ и перрутената калия (KRuO4), где между окисленной углеводной группой и активной амино-оксигруппой жирной кислоты образуется оксимная связь, и где образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбо-поэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопо-этинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопо-этинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопо-этинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витро-нектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетиче-ского белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического бел-ка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфоге-нетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарно-го нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цито-кин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2а, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2в, фактора роста эндоте-лиальных клеток в, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробла-стов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора а1, рецептора глиально-го нейротрофического фактора а2, белка, связанного с ростом, белка а, связанного с ростом, белка в, связанного с ростом, белка у, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсули-ноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора а лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоци-тарного фактора роста ВВ, рецептора а тромбоцитарного фактора роста, рецептора в тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста а, трансформирующего фактора роста в, трансформирующего фактора роста в1, трансформирующего фактора роста в 1.2, трансформирующего фактора роста в2, трансформирующего фактора роста в3,
трансформирующего фактора роста в5, латентного трансформирующего фактора роста в1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, в-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липо-протеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, ху-миры (адалимумаба), Prolia (деносумаба), энбрела (этанерцепта), белка из таблицы или их биологически активного фрагмента, производного или варианта.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором терапевтическим белком является FVIIa. В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором терапевтическим белком является FVIII. В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором терапевтическим белком является FIX.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором окислителем является периодат натрия (NaIO4). В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, дополнительно включающий очистку конъюгированного терапевтического белка.
В еще одном варианте осуществления представлен указанный выше способ, в котором производное жирной кислоты получают согласно способу, описанному в данном описании.
В настоящем изобретении рассматриваются другие способы получения производных жирных кислот. В одном варианте осуществления представлен способ получения указанного выше производного жирной кислоты, включающий а) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с целью получения сложного эфира жирной кислоты; и b) присоединение водорастворимого линкера, включающего активную малеимидную группу, к свободной сульфгидрильной (SH) группе с образованием устойчивой тиоэфирной связи; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде.
В еще одном варианте осуществления представлен способ получения указанного выше производного жирной кислоты, включающий а) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с целью получения сложного эфира жирной кислоты; b) взаимодействие жирной кислоты, полученной на стадии а), с азидным реагентом, в результате чего получают соответствующий азид жирной кислоты; с) гидрирование азида жирной кислоты, полученного на стадии b), с целью получения соответствующего амина жирной кислоты; и d) присоединение водорастворимого линкера, включающего активную NHS-группу, к свободной аминной группе, за счет чего образуется стабильная связь; причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде.
Описание чертежа
На чертеже показан синтез водорастворимого линкера 3-оксапентан-1,5-диоксиамина.
Подробное описание изобретения Фармакологические и иммунологические свойства терапевтических белков можно улучшить путем химической модификации и конъюгирования с полимерными соединениями, например жирными кислотами и производными жирных кислот, в соответствии с настоящим изобретением.
Добавление водорастворимого производного жирной кислоты, как описано в данном описании, является одним из подходов к улучшению свойств терапевтических белков, например белков свертывания крови - фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора
FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA,
PAI-1, тканевого фактора (TF) или протеазы ADAMTS 13, а также других известных белков или их биологически/терапевтически активных фрагментов. Терапевтические белки.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вышеуказанные полипептиды и полинуклеотиды представлены следующими терапевтическими белками: ферментами, антигенами, антителами, рецепторами, белками свертывания крови, факторами роста, гормонами и лигандами. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим белком является белок свертывания крови, например фактор IX (FIX), фактор VIII (FVIII), фактор VIIa (FVIIa), фактор Виллебранда (ФВ), фактор FV (FV), фактор X (FX), фактор XI (FXI), фактор XII (FXII), тромбин (FII), белок С, белок S, tPA, PAI-1, тканевый фактор (TF) или протеаза ADAMTS 13.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическим белком являются иммуноглобулины, ци-токины, например IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующий фак-тор-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), ЕРО, интерферон-альфа (IFN-альфа), консенсусный интерферон, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL
31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтин (ТРО), ангиопоэтины, например Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ан-гиопоэтин-подобные полипептиды человека ANGPTL1-7, витронектин, фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенин, активин А, активин В, активин С, костный морфогенетический белок-1, костный морфогенетический белок-2, костный морфогенетический белок-3, костный морфогенетический белок-4, костный морфогенетический белок-5, костный морфогенетический белок-6, костный морфогенетический белок-7, костный морфогенетический белок-8, костный морфогенетический белок-9, костный морфоге-нетический белок-10, костный морфогенетический белок-11, костный морфогенетический белок-12, костный морфогенетический белок-13, костный морфогенетический белок-14, костный морфогенетический белок-15, рецептор костного морфогенетического белка IA, рецептор костного морфогенетического белка IB, рецептор костного морфогенетического белка II, нейротрофический фактор головного мозга, кар-диотрофин-1, цилиарный нейротрофический фактор, рецептор цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемый фактор хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемый фактор хемотаксиса нейтрофилов 2а, цитокин-индуцируемый фактор хемотаксиса нейтрофилов 2в, фактор роста эндотелиальных клеток в, эндотелин 1, эпидермальный фактор роста, эпиген, эпирегулин, эпителиальный аттрактант нейтрофилов, фактор роста фибробластов 4, фактор роста фибробластов 5, фактор роста фибробластов 6, фактор роста фибробластов 7, фактор роста фибробластов 8, фактор роста фиб-робластов 8b, фактор роста фибробластов 8с, фактор роста фибробластов 9, фактор роста фибробластов 10, фактор роста фибробластов 11, фактор роста фибробластов 12, фактор роста фибробластов 13, фактор роста фибробластов 16, фактор роста фибробластов 17, фактор роста фибробластов 19, фактор роста фибробластов 20, фактор роста фибробластов 21, кислый фактор роста фибробластов, основный фактор роста фибробластов, рецептор глиального нейротрофического фактора а1, рецептор глиального нейро-трофического фактора а2, белок, связанный с ростом, белок а, связанный с ростом, белок в, связанный с ростом, белок у, связанный с ростом, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, гепатомный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста I, рецептор инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобный фактор роста II, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, фактор роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующий фактор, рецептор а лейкоз-ингибирующего фактора, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, ней-ропоэтин, нейротрофин-3, нейротрофин-4, онкостатин М (OSM), плацентарный фактор роста, плацентарный фактор роста 2, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарный фактор роста, А-цепь тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарный фактор роста АА, тромбоцитарный фактор роста АВ, В-цепь тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарный фактор роста ВВ, рецептор а тромбоцитарного фактора роста, рецептор в тромбоцитарного фактора роста, фактор, стимулирующий рост предшественников В-клеток, фактор стволовых клеток (SCF), рецептор фактора стволовых клеток, ФНО, включая ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующий фактор роста а, трансформирующий фактор роста в, трансформирующий фактор роста в1, трансформирующий фактор роста в1.2, трансформирующий фактор роста в2, трансформирующий фактор роста в3, трансформирующий фактор роста в5, латентный трансформирующий фактор роста в1, белок I, связывающий трансформирующий фактор роста в, белок II, связывающий трансформирующий фактор роста в, белок III, связывающий трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтин стромы тимуса (TSLP), рецептор I типа фактора некроза опухолей, рецептор II типа фактора некроза опухолей, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, фактор роста эндотелия сосудов и их химерные белки или биологически или иммунологически активные фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой альфа-, бета- и гамма-интерфероны, колониестимулирующие факторы, включая гранулоцитарный колониестимули-рующий фактор, факторы роста фибробластов, тромбоцитарные факторы роста, фосфолипаза-активирующий белок (PUP), инсулин, растительные белки, например лектины и рицины, факторы некроза опухолей и родственные аллели, растворимые формы рецепторов факторов некроза опухолей, рецепторы интерлейкинов и растворимые формы рецепторов интерлейкинов, факторы роста, например тканевые факторы роста, например ТФРа или ТФРв, и эпилермальные факторы роста, гормоны, соматомеди-ны, пигментарные гормоны, рилизинг-факторы гипоталамуса, антидиуретические гормоны, пролактин, хориогонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, тиреотропный гормон, тканевый активатор плазминогена и иммуноглобулины, например IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, галактозидазу, а-галактозидазу, в -галактозидазу, ДНКазу, фетуин, лютеинизирующий гормон, эстроген, кортикостероиды, инсулин, альбумин, липопротеины, фетопротеин, трансферрин, тромбопоэтин, урокиназу, ДНКазу, интегрины, тромбин, гемопоэтические факторы роста, лептин, гликозидазаит, химуру (адалимумаб), Prolia (деносумаб), энбрел (этанерцепт) и их фрагменты или любые гибридные белки, включающие любой из приведенных выше белков или из фрагментов. В дополнение к приведенным выше белкам в следующей таблице представлены терапевтические белки, рассматриваемые в настоящем изобретении.
Пептид, секретируемый фолликулярными дендритными клетками
Ангиотензин-превращающий фермент
Член б семейства интерлейкина-1
Херстатин
Дермокин
Антитромбин-III
Белок 2, экспрессируемый предстательной железой и яичками
Белок 28, содержащий повтор, богатый лейцином
Секретируемый белок 1, связанный с ожогами
Аполипопротеин В-100
Секреторная фосфолипаза А2 группы XIIA
Белок с С-концевой последовательностью, подобной LRRN4
Эктодисплазин-А
Аполипопротеин D
Альфа-3(V) цепь коллагена
Белок 2, содержащий Ъуб/РЪАШ-домен
Секретируемый белок 2, связанный с ожогами
Аполипопротеин Е
Белок 1, подобный альфа-2-макроглобулину
Трансмембранный белок 81
Резистин
Бета-1,4-
галактозилтрансфераза 1
Дерматопонтин
Белок 3, подобный миелиновому белку zero
Остеопонтин
Костный
морфогенетический белок 7
Белок, ассоциированный с хрящом
Гомолог белка нотума
Секретируемый белок 5, связанный с ожогами
Субъединица В подкомпонента комплемента Clq
Белок - "эфиопский еж"
УДФ-
глюкуронозилтрансфераза ЗА2
Секретируемый белок 4, связанный с ожогами
Альфа-цепь С4Ь-связывающего белка
Белок 2 внеклеточного матрикса
Протокадгерин альфа-1
Секретируемый фосфоропротеин 24
Кальретикулин
Внутренний фактор Касла
Фосфолипаза D4
Глипикан-6
Кортикостероид-связывающий глобулин
Интерлейкин-33
Ретинолдегидрогеназа 10
Секретируемый белок 3, связанный с ожогами
Карбоксипептидаза А1
Костный
морфогенетический белок 2
Лектин 14, подобный Ig, связывающему сиаловую кислоту
Хемокин 4 с С-С-мотивом
Карбоксипептидаза А2
Костный
морфогенетический белок б
Трансмембранный белок 161А
Белок меланоцитов Pmel 17
Эотаксин
Неохарактеризованный белок KIAA0564
Трансмембранный белок 161В
Секретируемый Ly-б/иРАК-связанный белок 1
Хемокин 13 с С-С-мотивом
Cerberus
Трансмембранный белок 182
Бета-микросемипротеин
Хемокин 18 с С-С-мотивом
Карбогидратсульфотранс фераза 8
Белок FAM2 4B
Глипикан-4
Хемокин 2 0 с С-С-мотивом
Аналог 3 контактин-ассоциированного белка
Трансмембранный белок 52
Член 15 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Инициирующий рецептор 2, экспрессирующийся на миелоидных клетках
Белок, подобный секреторной фосфолипазе А2 группы XIIB
Белок 4, содержащий MFS-домен
Резистин-подобный белок бета
Хемокин 2 с С-С-мотивом
Кортиколиберин
УДФ-
глюкуронозилтрансфераза 2АЗ
Член 12 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Белок ig-h3, индуцируемый трансформирующим фактором роста-бета
Белок 19, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок, ассоциированный с одонтогенными амелобластами
SPARC
Лиганд CD4 0
Белок UPF0556, C19orfl0
Нейросекреторный белок VGF
Глипикан-5
Корнеодесмозин
Хемокин 3 с С-Х-С-мотивом
Секретируемый фосфопротеин 2, 24 кДа
Гомолог белка 2 переднего градиента
Фактор комплемента D
Цистатин-М
Белок FAM150B
Гомолог 2 белка canopy
Хромогранин-А
Дефензин-5
Фактор
роста/дифференцировки 9
Глипикан-1
Альфа-1(I)-цепь коллагена
Дефензин-6
Кластерин-подобный белок 1
Белок 2, содержащий домен фактора Виллебранда А
Белок 18, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Белок 18, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок 2, содержащий трансмембранный и иммуно гло булино вый домен
Белок 1 WNT1-индуцируемого сигнального пути
Секреторный белок 1, богатый цистеином, содержащий LCCL-домен
Белок 3, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок UNQ5810/PRO19627, содержащий домен лектина С-типа
Хемокин 1 с С-С-мотивом
Альфа-4(IV)-цепь коллагена
Dickkopf-родственный белок 4
Липокалин-10, специфический для эпидидимиса
SPARC-родственный модульный кальций-связывающий белок 2
Белок, ассоциированный с
дифференцировкой
кератиноцитов
Белок 5, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок 8, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Член А семейства 11 белков с доменом лектина С-типа
Компонент комплемента С4-В
Белок 1, родственный
эпендимину
млекопитающих
Липокалин-8, специфический для эпидидимиса
Секретируемый Ly-б/uPAR-cвязaнный белок 2
Альфа-2(V)-цепь коллагена
Фибриллин-3
Основной богатый пролином пептид Р-Е
Глипикан-3
Компонент комплемента С5
Фетуин-В
Предполагаемый неохарактеризованный белок C10orf99
Секретируемый и трансмембранный белок 1
Альфа-1(VII)-цепь коллагена
Фактор роста фибробластов б
Неохарактеризованный белок C17orf77
Белок
последовательности 264, экспрессируемый яичками
Компонент комплемента С7
Фактор роста кератиноцитов
Аналог 2
арилацетамиддеацетилазы
Глипикан-2
Бета-цепь компонента комплемента С8
Фактор
роста/дифференцировки 8
Липокалин-12, специфический для эпидидимиса
Сериновая протеаза 23
Гамма-цепь компонента комплемента С8
Желудочный
ингибиторный
полипептид
Антиген 2 В-меланомы
Митохондриальный 3 9S-рибосомный белок L55
Альфа-1(XV)-цепь коллагена
Гликопротеиновый гормон бета-5
Антиген 3 В-меланомы
Гомолог ЗА белка NipSnap
Альфа-1(XVI)-цепь коллагена
Гранзим М
Гомолог 1 белка семенной плазмы крупного рогатого скота
Фибронектин
Альфа-1(XVIII)-цепь коллагена
Гастрин-высвобождающий пептид
Белок 3, подобный комплементу Clq
Нейдезин
Альфа-1(XIX)-цепь коллагена
Сериновая протеаза HTRA1
Белок UPF0565, C2orf69
Рецептор 2 фактора роста фибробластов
Олигомерный белок матрикса хряща
Интерферон альфа-4
Белок UPF0669, C6orfl20
Карбоангидраза б
С-реактивный белок
Интерферон альфа-5
Колипаза-подобный белок, C6orfl27
Белок 1, делетированный в злокачественных опухолях головного мозга
Гранулоцитарный колониест имулирующий фактор
Интерферон альфа-7
Неохарактеризованный белок C7orf69
SPARC-родственный модульный кальций-связывающий белок 1
Гранулоцитарно-макрофагальный колониест имулирующий фактор
Белок 7, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок, подобный рецептору
тромбоцитарного фактора роста
Белок А4 бета-амилоида
Белок CYR61
Член 10 надсемейства иммуноглобулинов
Хондроадгерин-подобный белок
Член б надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок, подобный рецептору 1 компонента комплемента
21-кДа белок, содержащий домен, ассоциированный с протеазой
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ6490/PRO21339
Субъединица 1 рецептора типа В гамма-аминомасляной кислоты
Фактор роста стволовых клеток; лектин С-типа, секретируемый лимф о ци т ами
Белок FAM10 8A1, содержащий абгидролазный домен
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ6493/PR021345
Про-нейрегулин-1,
мембранносвязанная
изоформа
CMP-N-ацетилнейраминат-бета-галактозамид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Белок 9, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ5815/PR019632
Гликопротеиновый гормон альфа-2
Дипептидилпептидаза 4
Рецептор интерлейкина-
Цистатин-А
Аналог 1 мембранной металлоэндопептидазы
Сиалофосфопротеин дентина
Интерлейкин-9
Ингибитор пептидазы R3HDML
Аналог А Fc-рецептора
Эндотелии-1
В-цепь бета-ингибина
Цистатин-9
Аналог хемокина 4 с С-С-мотивом
Эфрин-В1
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal 2
Член 5 семейства белков с доменом DAN
Рецептор 1, содержащий домен эпителиального дискоидина
Белок, подобный эпидермис-специфической сериновой протеазе
BMP-связывающий эндотелиальный регуляторный белок
Аналог 1 белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста
Муцин-1
Эмилин-1
Белок 2,
ассоциированный с кератиноцитами
Эпидидимальный белок 1,
связывающий
сперматозоиды
Фактор роста эндотелия сосудов А
Эндоплазмин
Субъединица альфа-1 ламинина
Элафин
Фибулин-1
Рецептор 3 эфрина типа А
Лейкоцитарный хемотаксин-2
Белок FAM55A
Рецептор пролактина
Рецептор б эфрина типа В
Желудочная
триацилглицеринлипаза
Фактор
роста/дифференцировки б
Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин типа
Белок 1, содержащий домен
гликозилтрансферазы 1
Белок 3, содержащий богатый лейцином повтор и домен гомологии кальпонина
Белок 1, содержащий домен глюкоза/фруктоза-оксидоредуктазы
Антиген CD2 0 9
Фактор свертывания крови
Белок 2, родственный панкреатической липазе
Эритропоэтин
Альфа-2(XI)-цепь коллагена
Фактор свертывания крови VIII
Альфа-маннозидаза, специфическая для эпидидимиса
Глутатионпероксидаза б
Альфа-субъединица
рецептора
гранулоцитарно-
макрофагального
колониестимулирующего
фактора
Белок 7, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок 7, содержащий домен фибронектина III типа
Неохарактеризованный белок UNQ511/PRO1026
Эластин
Фибриллин-2
Белок 5,
ассоциированный с микрофибриллами
Бета-дефензин 128
Альфа-субъединица рецептора интерлейкина-15
Альфа-2-НЗ-гликопротеин
Мюллеров ингибирующий фактор
Интерлейкин-31
Мидкин
Фактор роста фибробластов 10
Металлопротеиназа-21 матрикса
Интерлейкин-34
Интегрин альфа-7
Альфа-цепь фибриногена
Металлопротеиназа-17 матрикса
Белок 4, подобный
плазматическому
калликреину
Муцин-4
Бета-цепь фибриногена
Металлопротеиназа-2 0 матрикса
Липокалин-9, специфический для эпидидимиса
Альфа-амидирующая
пептидилглицинмоноокси-
геназа
Белок 1, ассоциированный с карциномой неба, легких и носового эпителия
Гамма-субъединица N-
ацетилглюкозамин-1-
фосфотрансферазы
кДНК FLJ60957, характеризующаяся высокой степенью сходства с
секретируемым белком 4, связанным с ожогами
Аполипопротеин A-I
Гастрин
Муль тимерин-2
Липаза М
Протеогликан 4
Альфа-цепь
гликопротеиновых
гормонов
Промотилин
CLECSF12
Член 25 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Альфа/бета-субъединицы N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазы
Белок 3 внеклеточного матрикса, родственный FRAS1
Предполагаемая неактивная секреторная фосфолипаза А2 группы IIC
Аттрактин
Гранзим А
Белок NELL1, связывающий протеинкиназу С
Сериновая протеаза MPN2
Микросемипротеин, ассоциированный с предстательной железой
Белок, подобный фактору роста гепатоцитов
Белок NELL2, связывающий протеинкиназу С
Нетрин-5
Альфа-амилаза 1
Белок 1, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Нейротрипсин
Белок 3, содержащий NHL-повтор
Нейротрофический фактор головного мозга
Белок 2, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Нейросерпин
Ольфактомедин-подобный белок 2В
Член М семейства 4 белков с доменом лектина С-типа
Белок 4, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Нидоген-2
Овохимаза-2
Рецептор
гранулоцитарного
колониестимулирующего
фактора
Член 10D надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок FAM108B1, содержащий абгидролазный домен
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ3029/PRO9830
Инсулиноподобный фактор роста II
Интерферон альфа-1/13
Нейротрофин-4
Овохимаза-1
Молекула клеточной адгезии 1, связанная с раковым эмбриональным антигеном
Белок 1, содержащий домен интерферон-индуцируемой хеликазы С
Секреторная
глутатионпероксидаза
эпидидимиса
Предполагаемый бета-1-гликопротеин 7, специфический для беременности
Член А семейства 7 белков с доменом лектина С-типа
Интерферон альфа-2
Секреторная фосфолипаза А2 группы 10
Гомолог 2 овостатина
Молекула 1, подобная CMRF35
Интерферон бета
Секреторная фосфолипаза А2 группы IID
Орексигенный нейропептид QRFP
Белок 4, подобный переносчику холина
Интерферон гамма
Лактопероксидаза
Лимфоцитарный антиген 6К
Белок А1, ассоциированный с сурфактантом легких
Инсулиноподобный фактор роста IB
Эффектор апоптоза р53, родственный РМР-22
Белок 1, экспрессируемый предстательной железой и яичками
Сперминоксидаза
Белок - "индийский еж"
Плацента-специфический белок 1
Аналог 1 предполагаемой фосфолипазы В
CMP-N-ацетилнейраминат-бета-1,4-галактозид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Белок, подобный молекуле L1 адгезии нервных клеток
Тубероинфундибулярный пептид из 39 остатков
Предполагаемый неохарактеризованный белок FLJ42147
Калликреин-8
Интерлейкин-13
Проларгин
Отогелин
Активатор плазминогена тканевого типа
Интерлейкин-2
Секретогранин-2
Рибонуклеаза 8
Пероксисомальная N(1)-
ацетилспермин/спермидин
оксидаза
Член 2А семейства
химотрипсин-подобной
эластазы
Белок 1, содержащий эндонуклеазный домен
Аналог 2 белка, взаимодействующего с комплексом ядерной поры
Вероятная
пальмитоилтрансфераза ZDHHC4
А-цепь ингибина бета
Семафорин-ЗВ
Аналог 1
проактиваторного полипептида
Белок-переносчик эфиров холестерина
Панкреатический секреторный ингибитор трипсина
гивс (гормон, индуцирующий высвобождение соматотропина)
Гомолог 2 белка spinster
А-2 альфа-цепь антигена гистосовместимости HLA I класса
Член 21 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Аналог 2 члена 4 SDR-семейства
дегидрогеназ/редуктаз
Аналог белка 2, содержащего домен фактора Виллебранда С
Альфа-1(II)-цепь коллагена
Тяжелая цепь HI ингибитора интер-альфа-трипсина
Транскобаламин-1
Уротензин-2В
Предшественник интерлейкина-1 б
Тяжелая цепь Н2 ингибитора интер-альфа-трипсина
Фактор "трилистника" 2
Тетраспанин-18
Рецептор лептина
Тяжелая цепь НЗ ингибитора интер-альфа-трипсина
Тестикан-1
Мембранный белок FAM159A UPF0514
Декорин
Простатоспецифический антиген
Сывороточная параоксоназа/лактоназа
Латерин
Фактор клеток стромы 1
Калликреин-4
Tolloid-подобный белок
Белок 7В, подобный метилтрансферазе
Тенасцин
Плазматический калликреин
Трипсин-2
Белок ТЕХ2 61
Белок 12, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Регулятор 4 кальций-активируемого хлоридного канала
Белок 1, содержащий RING-"палец" и домен SPRY
Гомолог 7
алкилированного белка репарации ДНК AlkB
Белок 13, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Аналог 1 белка,
усиливающего
бактерицидные
свойства/проницаемость
Кальций-связывающий белок 1, содержащий суперспирализованный домен
Белок б, содержащий трансмембранный домен етр2 4
Альфа-цепь гликопротеина CD8 поверхности Т-клеток
Лептин
Белок Wnt-2
ХК-родственный белок 5
Белок, совместно амплифицируемый и сверхэкспрессируемый с EGFR
Белок 4, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Эктонуклеозидтрифосфат дифосфогидролаза 8
Предполагаемый белок 7, содержащий V-набор и иммуно гло булино вый домен
Белок 16-1, связанный с аутофагией
Печеночная
триацилглицеринлипаза
Белок Wnt-8B
Член 3 семейства инсулиноподобного фактора роста
Белок 3 устойчивости рака молочной железы к эстрогенам
Белок G6C комплексного локуса лимфоцитарного антигена б
UDP-GlcNAc:betaGal-бета-1,3-N-
ацетилглюкозаминилтран сфераза 4
Аналог 1 белка, взаимодействующего с комплексом ядерной поры
Кадгерин-23
Лизофосфолипаза эозинофилов
Белок 1, содержащий домен EMI
Секретируемый фосфоропротеин 1
Моноцитарный колониест имулирующий фактор 1
Бета-субъединица лютропина
Неохарактеризованный белок C6orfl5
Альфа-5(VI)-цепь коллагена
Альфа-рецептор фолата
Белок 1, ассоциированный с микрофибриллами
Коллектин-10
Антиген 5 В-меланомы
Белок 8, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности
Нейротрофический фактор астроцитов среднего мозга
Лигаза ACSBG2 длинноцепочечных жирных кислот - СоА
Белок 10А, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Убиквитинпротеинлигаза ЕЗ LRSAM1
Белок Gla матрикса
Белок транскрипта 3,
индуцируемого
онкопротеином
Белок UPF0369, C6orf57
Молекула адгезии нервных клеток 1
72-кДа коллагеназа типа IV
Ингибитор 15 пептидаз
Предполагаемый неохарактеризованный белок C10orf31
Нейролигин-4, X-сцепленный
Стромелизин-1
Пролин-богатый кислый белок 1
Предполагаемый неохарактеризованный белок Cllorf45
Нетрин-Gl
Коллагеназа нейтрофилов
Урокортин
Неохарактеризованный белок C12orf28
Компонент PIG-T трансамидазы GPI
Мезотелин
Трипсин-ХЗ (ЕС 3.4.21.4)
Неохарактеризованный белок C17orf67
Лиганд KIT
Муцин-5АС
HHIP-подобный белок 2
Бета-дефензин 121
Белок, подобный Seizure
Муцин-б
Фракталкин
Бета-дефензин 130
Член 7 семейства SLAM
Норрин
Белок Wnt-11
Нуклеотид-связывающий белок 2 с гистидиновой триадой
Фактор некроза опухолей
Окситоцин-нейрофизин 1
Белок Wnt-7a
Апелин
Уромодулин
Фактор роста нервов-бета
Белок 1 с FCH и двойным ЭНЗ-доменами
Плацента-специфический белок 9
Член 13 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Член 18 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Белок 2, родственный гепатомному фактору роста
Белок TD26, ассоциированный с гепатоцеллюлярной карциномой
Белок CREG1
Нейротрофин-3
Альфа-субъединица интерлейкина-12
Персефин
Белок 8, содержащий ЭФР-подобный домен
Субъединица А тромбоцитарного фактора роста
Белок UPF0577 KIAA1324
Регулируемый эндокринно-
специфический белок 18
Многофункциональный белок 1,
взаимодействующий с комплексом аминоацил-тРНК-синтетазы
Фосфопантотеноилцистеинд екарбоксилаза
Белок 9, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок 8, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
ADAMTS-подобный белок 4
Ингибитор активатора плазминогена 1
Муцин-17
Костный
морфогенетический белок 8А
Фактор свертывания крови XI
Ингибитор активатора плазминогена 2
Лизосомальный белок NCU-G1
Белок WFDC13
Альфа-2-субъединица рецептора интерлейкина-22
Энхансер 1 проколлаген С-эндопептидазы
Альфа-3-субъединица пролил-4-гидроксилазы
Белок Wnt-8a
Гомолог
деформированного эпидермального ауторегуляторного фактора 1
Белок 2, содержащий трансмембранный и убиквитиноподобный домен
Пептидилпролил-цис-транс-изомераза SDCCAG10
Белок ENSP00000270642, содержащий Ig-подобный домен
Простагландин-Н2-Б-изомераза
Протеиндисульфидизо-мераза
Ингибитор 16 пептидаз
Белок 15, содержащий абгидролазный домен
Альфа-1-антитрипсин
Фактор пигментного эпителия
Белок 4, родственный рецептору полиовируса
Рибонуклеаза-подобный белок 9
Альфа-1-антихимотрипсин
Пепсин А
Член 15 семейства 22 переносчиков растворенных веществ
Неохарактеризованный белок C2orf66
Ацил-СоА-связыв ающий белок
Гастриксин
GPI-инозитдеацилаза
Неохарактеризованный белок C17orf99
Фактор комплемента В
Белок "sonic hedgehog"
Трансмембранный белок 43
Белок FAM150A
Бета-субъединица хориогонадотропина
Пептидorликан-распознающий белок I-альфа
Ангиопоэтин-связанный белок 2
Белок, подобный плацента-специфическому белку 1
Коровый белок верзикана
Бигликан
Ангиопоэтин-связанный белок б
Неохарактеризованный белок C18orf20
Рецептор эпидермального фактора роста
Пролактин-индуцируемый белок
Арилсульфатаза К
Бета-дефензин 110
Дисульфид-тиоловый антипортер 2 Ecto-NOX
Тромбоцитарный фактор 4
Аугурин
Нейритин-подобный белок
Гиалуронидаза-1
Плазминоген
Сериновая протеаза 4, специфическая для головного мозга
Белок 1 с С-концом, богатым гистидином
Белок-антагонист рецептора интерлейкина-
Сывороточная параоксоназа/ арилэстераза 1
DBH-подобный монооксигеназный белок
Член А семейства 2 белков с доменом лектина С-типа
Бета-субъединица рецептора интерлейкина-
Щелочная фосфатаза плацентарного типа
Неохарактеризованный белок Clorf56
Белок 70, содержащий повтор, богатый лейцином
Аналог 1 рецептора интерлейкина-1
Пептидилпролил-цис-транс-изомераза В
Церебеллин-3
Серпин А13
Инсулин
Протеогликан костного мозга
Церебеллин-4
Белок 17, содержащий домен BTB/POZ
Гликоделин
Основной богатый пролином белок 1 слюны
Колипаза-подобный белок, C6orfl26
Неохарактеризованный белок C12orf53
Белок, связанный с паратгормоном
Белок С, ассоциированный с сурфактантом легких
Неохарактеризованный белок Cllorf83
Член А семейства 9 белков с доменом лектина С-типа
Hyp им
Паратиреоидный гормон
Неохарактеризованный белок C16orf89
Белок 4, подобный комплементу Clq
Альфа-2-субъединица пролил-4-гидроксилазы
Сывороточный компонент Р амилоида
Карбоксипептидаза-подобный белок Х2
Молекула 4, подобная CMRF35
Антиген CD2 7 6
Секретогранин-1
Цистатин-9-подобный белок
Белок FAM151B
Белок 1 с ЭФР-подобным доменом, богатый цистеином
Коровый белок протеогликана гепарансульфата, специфический для базальной мембраны
Член 13 SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
Белок FAM10 8A2/A3, содержащий абгидролазный домен
Белок 1, содержащий домен CUB и sushi
Антилейкопротеиназа
Бета-дефензин 123
Остеокрин
Фиколин-2
Стабилин-1
Бета-дефензин 132
Трансмембранная сериновая протеаза 11Е2
Белок 5, подобный Fc-рецептору
Внеклеточная супероксиддисмутаза [Си-Zn]
Цитокин-подобный белок
Трансмембранный белок 14Е
Белок GPR8 9
Соматотропин
Dickkopf-родственный белок 2
Трансмембранный белок 207
Соединительная молекула адгезии А
Серпин В5
Dickkopf-подобный белок 1
ТОММ20-подобный белок 1
Белок 8А, содержащий богатый лейцином повтор
Спондин-1
Секреторный белок ЕЗ-бета эпидидимиса
Неохарактеризованный белок C3orf41
Фосфатаза множественных инозитфосфатов 1
Белок 3 поддержания структуры хромосом
Белок 3, содержащий ЭФР-подобный повтор и домен, подобный дискоидину I
Андроген-регулируемый белок ЗА подчелюстной железы
Нейропилин-1
Синтаксин-1А
Белок FAM55D
Антиген 1 В-меланомы
Плексин-А4
Тетранектин
Фактор роста фибробластов 17
Неактивная карбоксилэстераза 4
Плексин-В1
Трансформирующий фактор роста бета-1
Фактор роста фибробластов 22
Белок 1, содержащий домен four-jointed box
Периостин
Тиреоглобулин
Белок 2, связывающий фактор роста фибробластов
Белок HSN2
Белок RIC-3
Ингибитор
металлопротеиназ 1
Фактор
роста/дифференцировки
Гуманин
SLIT и NTRK-подобный белок 2
Ингибитор
металлопротеиназ 2
GLIPRl-подобный белок
Киелин/хордин-подобный
белок
Фактор 1,
модифицирующий
сульфатазу
Ингибитор
металлопротеиназ 3
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal б
Белок UPF0624, C6orfl86
Фактор 2,
модифицирующий
сульфатазу
Активатор плазминогена урокиназного типа
Интерлейкин-17В
Предполагаемый нейрофибромин 1-подобный белок 4/6
Трансмембранная сериновая протеаза б
Лактотрансферрин
Интерлейкин-17С
Пероксидазин-подобный белок
Лимфотоксин-альфа
Трипсин-1
Интерлейкин-17D
SCO-спондин
Член 10В надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Андроген-регулируемый белок ЗВ подчелюстной железы
Белок 3 связи гиалуронана и протеогликана
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ9165/PRO28630
Поверхностный рецептор урокиназного активатора плазминогена
Член 1А надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Гомолог белка 1 внешнего слоя желточной мембраны
Член 3 семейства регуляторов кальций-активируемого хлоридного канала
Ингибитор 1 активации Т-клеток, содержащий домен V-набора
Рецептор 1 фактора роста эндотелия сосудов
Вариант 1 бета-
субъединицы
хориогонадотропина
Вероятная сериновая протеаза
UNQ9391/PR034284
Глюкагон
Белок, связывающий витамин D
Лизоцим-подобный белок
Неохарактеризованный белок C4orf26
Ы-ацетилмурамоил-Ъ-аланинамидаза
Витронектин
Металлопротеиназа-28 матрикса
Неохарактеризованный белок C4orf40
Сульфгидрилоксидаза 1
Фактор Виллебранда
Нефронектин
Неохарактеризованный белок C5orf55
Член 4 SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
Белок G5c комплексного локуса лимфоцитарного антигена б
Белок 12, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Предполагаемый макрофаг-ст имулирующий белок MSTP9
Интерлейкин-18-связывающий белок
Цинк-альфа-2-гликопротеин
Ольфактомедин-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C15orf61
Аналог IRRE-подобного белка 2
Неохарактеризованный белок C14orf93
Ольфактомедин-подобный белок 2А
Химотрипсиноген В2
Миелоидный-ассоциированный маркер дифференцировки
Ретиносхизин
Сериновая протеаза 27
Бета-дефензин 108А
Хордин
Альфа-1,3-
маннозилтрансфераза ALG2
Член 2 семейства ЗА секретоглобина
Бета-дефензин 111
1-ацил-sn-глицерин-3-фосфатацилтрансфераза гамма
Изоформа CRA b члена А семейства 11 белков с доменом лектина С-типа
Белок 2, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Предполагаемый белок б, содержащий V-набор и иммуно гло булино вый домен
Рецептор, специфичный к конечным продуктам усиленного гликозилирования
Белок 7, содержащий MFS-домен
Белок 28, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Аналог 3 ингибитора сериновых протеаз типа Kazal 5
Белок 4 семейства NLR, содержащий CARD-домен
Трансмембранный белок нейронов 1, содержащий богатый лейцином повтор
Аналог 2 белка,
усиливающего
бактерицидные
свойства/проницаемость
Предполагаемый аналог 2 ингибитора сериновых протеаз типа Kazal 5
Пронейрегулин-2, мембранносвязанная изоформа
Субъединица 11 подкомплекса митохондриальной NADH-дегидрогеназы [убихинон] 1 бета
Фосфодиэстераза ЗЬ, подобная кислой сфингомиелиназе
Член 7С SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
Антиген НА, ассоциированный со спермой
Мембранный белок UPF0546, Clorf91
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal 7
Бета-дефензин 131
Гомолог ооцит-секретируемого белка 1
Карбоангидраза-родственный белок 10
Нейрексофилин-4
Бета-дефензин 134
Сывороточный альбумин
Холецистокинин
Белок Wnt-9b
Бета-дефензин 136
Кохлин
Коданин-1
Гомолог В белка 16 зимогенных гранул
Бета-дефензин 116
Ингибитор
плазматической протеазы С1
Неохарактеризованный белок C6orf89
Семафорин-ЗО
Белок FAM132A
Альфа-субъединица рецептора интерлейкина-
Хондроитинсульфат-глюкуронилтрансфераза
Аполипопротеин Ъ4
Белок FAM132B
Тяжелая цепь Н5 ингибитора интер-альфа-трипсина
Белок 1, содержащий домен хитиназы
Трансмембранная сериновая протеаза 11D
Бета-дефензин 115
Тромбоцитарный фактор роста D
Трансмембранный белок C9orf7
Скрепи-реактивный белок 1
Бета-дефензин 114
Белок S100-A7
Молекула 9, подобная CMRF35
Предполагаемый аннексин-А2-подобный белок
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal 9
Лектин 10, подобный Ig, связывающему сиаловую кислоту
Цитохром Р450 2S1
Костный
морфогенетический белок 10
Липаза N
Аналог антигена
тубулоинтерстициального
нефрита
Гомолог 3 белка Crumbs
Секретогранин-3
Белок 3, родственный панкреатической липазе
Член 13В надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Член 7 SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
Белок 4, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок, экспрессируемый яичками, предстательной железой и плацентой
Лигаза 5
длинноцепочечных жирных кислот - СоА
Белок ENED
Неохарактеризованный белок Clorf54
Нейромедин-S
Клаудин-14
Белок 4, родственный фактору комплемента Н
Карбоксипептидаза Аб
Нейропептид S
Белок 20, содержащий повтор, богатый лейцином
Член 3 LGI-семейства белков, содержащих повтор, богатый лейцином
Хемокин 19 с С-С-мотивом
Пентраксин-подобный белок нейронов, C16orf38
Член 7 семейства интерлейкина-1
Глиомедин
Хемокин 2 5 с С-С-мотивом
Отолин-1
Белок G5b комплексного локуса лимфоцитарного антигена 6
Белок 5, содержащий домен
глицерофосфодиэфирфосфо-диэстеразы
Член 2В семейства
химотрипсин-подобной
эластазы
Белок, подобный железо/цинксодержащей пурпурной кислой фосфатазе
Ацетилхолинэстераза
Вероятный рецептор 113, сопряженный с G-белком
Белок CEI
Гомолог 1 овостатина
Амелогенин, Х-изоформа
Вероятный рецептор 114, сопряженный с G-белком
Неохарактеризованный белок C6orfl
Плазминоген-родственный белок А
Ангиогенин
Глицерин-3-
фосфатацилтрансфераза 4
Неохарактеризованный белок C7orf34
Полисераза-3
Рецептор 2
сибиреязвенного токсина
Гремлин-1
Белок 3,
ассоциированный с кератиноцитами
Предполагаемый пептид YY-2
Аннексии А2
Член 17 подсемейства К калиевых каналов
Неохарактеризованный белок C9orf47
Предполагаемый пептид YY-3
Аполипопротеин C-III
Белок 2, содержащий KDEL-мотив
Альфа-1(VIII)-цепь коллагена
Рибонуклеаза-подобный белок 10
Аполипопротеин L1
Лайилин
Неохарактеризованный белок C18orf54
Рибонуклеаза-подобный белок 12
Субъединица А подкомпонента комплемента Clq
Белок 8В, содержащий богатый лейцином повтор
Аналог 1 цистатина
Рибонуклеаза-подобный белок 13
Субъединица С подкомпонента комплемента Clq
Белок 8D, содержащий богатый лейцином повтор
Белок 2, содержащий С2-домен
Серпин АН
Кальцитонин
Лектин б, подобный Ig, связывающему сиаловую кислоту
DDRGK-доменсодержащий белок 1
Ингибитор 4 протеаз типа Кунитца
Нуклеотидаза 1, активируемая растворимым кальцием
Бета-1-гликопротеин 2, специфический для беременности
Белок FAM55C
Метеорин-подобный белок
Хемокин 15 с С-С-мотивом
Белок 1, содержащий Ъуб/РЪАШ-домен
Альфа-1(XXVI)-цепь коллагена
Предполагаемая сериновая протеаза 2 яичек
Антиген CD97
Белок 5, содержащий Ъуб/РЪАШ-домен
Белок FAM19A2
Бета-дефензин 112
Контактин-4
Гомолог N-концевого домена MLN64
Белок FAM5B
Неохарактеризованный белок FLJ37543
Комплемент С2
Фактор ингибирования миграции макрофагов
Фактор роста фибробластов 5
Белок FAM2 4A
Альфа-б(IV)-цепь коллагена
2-ацилглицерин-О-ацилтрансфераза 3
Вероятная сериновая протеаза HTRA3
Секретируемый белок 4, связанный с ожогами
Альфа-2(VI)-цепь коллагена
Гомолог 1
митохондриального
переносчика
Член 8 семейства интерлейкина-1
Белок 2, подобный комплементу Clq
Альфа-1(XI)-цепь коллагена
Аполипопротеин L6
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal 4
Предполагаемый неохарактеризованный белок C17orf69
Гомолог 1 Crumbs
Протокадгерин альфа-6
Отоспиралин
Предполагаемый цистатин-13
Цистатин-С
Протокадгерин гамма-А12
Антимикробный пептид 2, экспрессируемый в печени
Бета-дефензин 109
Дефензин 1 нейтрофилов
Потенциалзависимый протонный канал 1
Гомолог 1 лизилоксидазы
Бета-дефензин 113
Эндотелин-3
Полностью транс-ретинол-13,14-редуктаза
Гомолог 2 лизилоксидазы
Бета-дефензин 135
Fc-рецептор эпсилон-иммуноглобулина с низким сродством
Регуляторный белок динамики микротрубочек 2
Белок 4,
ассоциированный с карциномой неба, легких и носового эпителия
Белок LOC136242, содержащий домен пептидазы S1
Рецептор 3 фактора роста фибробластов
К-спондин-4
Лизоцим д-подобный белок 2
Фактор
роста/дифференцировки 7
Рецептор 4 фактора роста фибробластов
Транспортный белок длинноцепочечных жирных кислот 3
Эндомуцин
Гомолог IgA-индуцирующего белка
Белок б, специфический для остановки роста
Белок транспорта везикул SEC22c
Нейропептид В
Предполагаемый липокалин-1-подобный белок 1
Рецептор гормона роста
Клаудин-1
Кинезин-подобный белок KIF7
Предполагаемая сериновая протеаза 29
Бифункциональная УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза/N-ацетилманнозаминкиназа
Белок 3, содержащий повторы, богатые лейцином, и
иммуноглобулин-подобные домены
Лейкоцит-ассоциированный иммуноглобулино-подобный рецептор 2
Предполагаемый белок LOC619207 фагоцитарного рецептора, содержащий домен, богатый цистеином
Член 8 надсемейства иммуноглобулинов
Член 9 семейства SLAM
Кальций-зависимая фосфолипаза А2
Секретоглобин-подобный белок
Альфа-цепь рецептора интерлейкина-4
Транстиретин
Белок-адаптер
проапоптотической
каспазы
Предполагаемый
стереоцилин-подобный
белок
Калликреин-14
Серии/треониновая протеинкиназа 32В
Интегрин-бета-подобный белок 1
Член 2 семейства инсулиноподобного фактора роста
Калликреин-б
Субъединица В тромбоцитарного фактора роста
Tolloid-подобный белок
KIR2DL4
Бета-3-субъединица ламинина
Ноггин
Ингибитор 3 протеаз типа Кунитца
Предполагаемый аналог 1 цинк-альфа-2-гликопротеина
Лейцилцистиниламинопепт идаза
Триптаза альфа-1
Белок ТМЕМ155
Член 4 семейства инсулиноподобного фактора роста
Сериновая протеаза 1 маннан-связывающего лектина
Белок 14, содержащий
тридцатичетырехчленный
повтор
Просалюзин
Неохарактеризованный белок C2orf72
Сериновая протеаза 2 маннан-связывающего лектина
Белок ХТРЗ-
трансактивируемого гена
Белок amnionless
Белок, подобный фактору инициации репликации
Липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов
Пальмитоилтрансфераза ZDHHC15
Белок WFDC10B
Белок 3, экспрессируемый предстательной железой и яичками
Нейропептид Y
Белок 3 вителлинового слоя, связывающий сперматозоиды
Белок 8, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Антиген 4 В-меланомы
Коровый белок агрекана
Белок 39, содержащий повтор, богатый лейцином
Белок Wnt-5b
Предполагаемый неохарактеризованный белок Clorfl91
Белок В,
ассоциированный с сурфактантом легких
Панкреатическая триацилглицеринлипаза
Белок Wnt-7b
Аналог бета-дефензина 108В
Белок 1, родственный рецептору полиовируса
Трансмембранный белок 139
Белок 2, связывающий вителлиновый слой
Неохарактеризованный белок FLJ90687
Ренин
Фактор ингибирования лейкоза
Аналог белка 5, связывающего ЭНЗ-домен
Секретируемый белок 2, связанный с ожогами
Панкреатическая рибонуклеаза
Галектин-1
Молекула адгезии адипоцитов
Основной богатый пролином пептид IB-1
Семеногелин-1
Хемокин 21 с С-С-мотивом
Неохарактеризованный белок C12orf59
Фактор роста фибробластов 16
Сигнальная молекула активации лимфоцитов
Аналог антигена CD5
Аполипопротеин-А1-связывающий белок
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal 8
Ингибитор пути тканевого фактора
Карбогидратсульфо-трансфераза 9
Клаудин-17
Неохарактеризованный белок KIAA0495
Ушерин
Липополисахарид-связывающий белок
Неактивная каспаза-12
Аналог 2 основного белка тромбоцитов
Фактор роста фибробластов 23
Белок двигательных нейронов 1, богатый цистеином
Неохарактеризованный белок C7orf58
Серпин ЕЗ
Альфа-субъединица интерлейкина-2 3
Фактор роста соединительной ткани
Альфа-1(XXVIII)-цепь коллагена
CRl-рецептор
Секреторный белок Е1 эпидидимиса
Гомолог белка закрытых глаз
Белок 4 матрикса дентина
Секретируемый фосфоропротеин 1
ADAMTS-подобный белок 1
Муцин-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C16orf48
Стресс-индуцируемый секретируемый белок 1
Хемокин-подобный фактор
Фактор роста фибробластов 19
Карбоксилэстераза 3
Белок Wnt
Белок 7, содержащий ЭФР-подобный домен
Фоллистатин-родственный белок 3
Белок FAM2 0B
Белок Wnt (Фрагмент)
Тектоник-1
Белок, взаимодействующий с белками hedgehog
ГТФаза 3 с GPN-петлей
Предполагаемая сериновая протеаза LOC138652
Трансмембранный белок 25
Рецептор В интерлейкина-
Белок 1В, содержащий GRAM домен
ТОМ1
UDP-GalNAc:бета-1,3-N-
ацетилгалактозаминил-трансфераза 1
Регулятор ионного транспорта 5, содержащий FXYD-домен
Белок класса U биосинтеза якорного компонента фосфатидилинозит-гликана
Предполагаемый неохарактеризованный белок FLJ46089
Интерлейкин-15(IL-15)
Эндотелиальная липаза
Альфа-субъединица интерлейкина-2 7
Предполагаемый неохарактеризованный белок Clorfl34
Белок 11, содержащий несколько ЭФР-подобных доменов
ЭФР-содержащий фибулин-подобный белок 2 внеклеточного матрикса
Пронейрегулин-4, мембранносвязанная изоформа
UDP-GlcNAc:betaGal-бета-1,3-N-ацетилглюкозаминил-трансфераза 9
Муцин- и кадгерин-подобный белок
Отораплин
Белок нейронов 3, содержащий богатый лейцином повтор
Неохарактеризованный белок Cllorf44
Рибонуклеаза 4
Секреторная фосфолипаза А2 группы 3
Белок 2, регулируемый рецептором NMDA
Неохарактеризованный белок C12orf73
SH2-доменсодержащий белок ЗС
Фосфолипаза А2 группы XV
NADH-цитохром Ь5-редуктаза 1
Предполагаемый аналог 2 цистатина-9
CMP-N-ацетилнейраминат-бета-галактозамид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Член 14 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Белок 1, содержащий домен болезни Паркинсона 7
Предполагаемый белок FAM10 8A5, содержащий абгидролазный домен
Трансмембранный белок 9
Плексин-А2
FK50 б-связывающий белок 11
Бета-дефензин 133
Белок 2, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Папилин
Член В семейства 12 белков с доменом лектина С-типа
Фиброзин-1
Рецептор аденозина A3
Прокинетицин-1
Член F5 семейства 35 переносчиков растворенных веществ
Вероятный дельта-рецептор фолата
Субъединица АРН-1А гамма-секретазы
Рибонуклеаза 7
Лектин 12, подобный Ig, связывающему сиаловую кислоту
RPE-спондин
Базигин
Ингибитор 1 протеаз типа Кунитца
Белок FAM19A3
NPIP-подобный белок ENSP00000346774
Белок 7, содержащий IAP-повтор бакуловируса
Спондин-2
Белок 82, содержащий WD-повтор
Предполагаемый прионный белок, специфический для яичек
Калуменин
Тестикан-2
Белок 1, связывающий энхансер адипоцитов
Белок 1, богатый пролином
Альфа-S1-казеин
Неактивная сериновая протеаза PAMR1
ADAMTS-подобный белок
Предполагаемый неохарактеризованный белок FP248
Циклин-Ы
Торсин-2А
Белок 80, содержащий суперспирализованный домен
Белок UPF0670, C8orf55
Фактор комплемента Н
Вазогибин-1
Дисульфид-тиоловый антипортер 1 Ecto-NOX
Предполагаемый аналог 2 цинк-альфа-2-гликопротеина
Хорионический соматомаммотропин
Вазорин
Регулятор роста нейронов 1
Белок SPARC
Рецептор вируса Коксаки и аденовируса
Ксилозилтрансфераза 1
Интерфоторецепторный матриксный протеогликан 1
Отопетрин-1
Член 2 семейства
эктонуклеотидпирофос-
фатазы/фосфодиэстеразы
Член б семейства
эктонуклеотидпирофос-
фатазы/фосфодиэстеразы
кДНК FLJ36603 fis, клон TRACH2015180, характеризующаяся высокой степенью сходства с
секретируемым белком 2, связанным с ожогами
кДНК FLJ55667, характеризующаяся высокой степенью сходства с
секретируемым кислым белком, богатым цистеином
EROl-подобный белок альфа
Онкостатин-М
Липаза Н
Липаза К
Фактор свертывания крови IX
Дерлин-1
Муцин-19 (MUC-19)
Член С семейства 18 белков с доменом лектина С-типа
Рецептор III-B Fc-области гамма-иммуноглобулина с низким сродством
Предшественник Env-полипротеина провируса HERV-FRD 6р2 4.1
Белок гена-кандидата 2 подверженности псориазу 1
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ6125/PRO20090
Фиколин-3
Простазин
Интегральный мембранный белок 2А
Компонент комплемента СЗ
Белок 2, подобный Fc-рецептору
Трансмембранная сериновая протеаза НЕ
Белок транспорта везикул SFT2B
Альфа-2(IV)-цепь коллагена
Трансмембранный белок FLRT3, содержащий богатый лейцином повтор
Альфа-цепь антигена гистосовместимости HLA I класса Cw-16
Белок ЗА, содержащий домен фактора Виллебранда А
Неохарактеризованный белок UNQ6126/PRO20091
Гельсолин
WNT-ингибиторный фактор
Гомолог белка shisa-2
Серпин-подобный белок HMSD
Гранулизин
Натрийуретический пептид типа С
Субъединица 3 комплекса сигнальной пептидазы
Белок 4, экспрессируемый предстательной железой и яичками
Трансмембранный гликопротеин NMB
Ангиопоэтин-2
Белок 2, подобный сиаломуцину CD164
Альфа-1(XXII)-цепь коллагена
Гранулины
Дезоксирибонуклеаза гамма
Кадгерин-1б
Предполагаемый неохарактеризованный белок C13orf28
Гепараназа
Карбоксипептидаза А5
Кадгерин-19
Цистатин-S
С-область мю-цепи Ig
Хемокин 14 с С-С-мотивом
Церебеллин-2
R-cnoHflHH-l
Интерлейкин-1 альфа
Интерлейкин-5
Трансмембранный белок C3orfl
C8orf2
Рецептор А интерлейкина-31
Интерлейкин-10
Белок 1
экваториального сегмента сперматозоида
Одорант-связывающий белок 2а
Соединительная молекула адгезии В
Хемокин 2 с С-Х-С-мотивом
Неохарактеризованный белок C6orf72
Опиорфин
Липокалин-1
Хемокин 5 с С-Х-С-мотивом
Неохарактеризованный белок Cllorf24
Белок почек, регулируемый андрогенами
Рецептор б, сопряженный с G-белком и содержащий повтор, богатый лейцином
Белок б, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Член 2 семейства ацил-СоА-синтетазы (митохондриальный)
Предполагаемый
неохарактеризованный
белок
UNQ58 3 0/PRO19 650/PRO198 16
Белок 1, связывающий латентный
трансформирующий фактор роста бета
Полипептид N-ацетилгалактозамин-трансфераза 1
Вероятный белок-транспортер УДФ-углеводов SLC35A5
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ6975/PR021958
Матрилин-3
Фибулин-2
Член А семейства 1 белков с доменом лектина С-типа
Тахикинин-3
Белок 1, подобный миелиновому белку zero
Фиколин-1
Член А семейства 3 белков с доменом лектина С-типа
Секретируемый фосфоропротеин 1
Нейробичин-подобный белок 2
Цитокин SL
Член Е семейства 4 белков с доменом лектина С-типа
Склеростин
Никастрин
Фоллистатин
Член G семейства 4 белков с доменом лектина С-типа
ADAMTS-подобный белок 2
Митохондриальная АДФ-рибозопирофосфатаза
FRAS1-родственный белок 1 внеклеточного матрикса
Вероятная катион-транспортная АТФаза 13А4
Белок LOC284297 фагоцитарного рецептора, содержащий домен, богатый цистеином
Протокадгерин-15
Энамелин
Белок UPF0480, C15orf24
Триптаза бета-1
Фактор роста плаценты
Белок 1 связи гиалуронана и протеогликана
Белок 4 вителлинового слоя, связывающий сперматозоиды
Триптаза дельта
Протеин-0-связанная манноза-бета-1,2-N-ацетилглюкозаминилтранс фераза 1
Член 3 подсемейства А иммуноглобулиноподобных рецепторов лейкоцитов
Резидентный белок эндоплазматического ретикулума ERp2 7
Предполагаемый белок 9 критической области синдрома кошачьего глаза
Вероятная гидролаза PNKD
Интерлейкин-17 F
Трансмембранный белок C16orf54
Белок 1, содержащий домен плексина
Плейотропин
Акцессорный белок рецептора интерлейкина-1
Цитохром Р450 4F12
Гомолог MC51L-53L-54L (Фрагмент)
Рецептор полиовируса
Ингибитор сериновых протеаз типа Kazal 5
Цитохром Р450 4X1
COBW-подобный плацентарный белок (Фрагмент)
Рецептор ретикулона-4
Калликреин-15
Цитохром Р450 4Z1
Фактор 2, подобный рецептору цитокинов
Сывороточный белок А амилоида
Интерферон альфа-14
Белок CREG2
Бета-дефензин 103
Глобулин, связывающий половые гормоны
Бета-1-гликопротеин 4, специфический для беременности
Член 9 подсемейства В гомологов DnaJ
Бета-дефензин 106
Член 6 семейства SLAM
Коллагеназа 3
Дипептидаза 3
Гиалуронидаза-3
Белок, ассоциированный с мембраной сарколеммы
Металлопротеиназа-1б матрикса
Мембранный белок FAM17 4A
Альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 8
Белок 1, содержащий домены sushi, фактора Виллебранда типа А, ЭФР и пентраксина
Полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза
Белок 15, содержащий домен тиоредоксина
Белок, содержащий домен гликозилтрансферазы 54
Тироксин-связывающий глобулин
Прокинетицин-2
Белок FAM19A4
Хордин-подобный белок 1
Белок 1, содержащий трансмембранный и суперспирализованный домен
Белок 3, связывающий латентный
трансформирующий фактор роста бета
Аденозинмонофосфатпрот еинтрансфераза FICD
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ9370/PRO34162
Трансмембранная сериновая протеаза 3
Соматолиберин
Аналог
пренилцистеиноксидазы
Рецептор нетрина UNC5B
Член ЮС надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок 1, содержащий домен тромбоспондина типа 1
Аналог белка, взаимодействующего с фитаноил-СоА-гидроксилазой
Белок секретируемой формы рецептора фактора роста фибробластов FGFR-1 (Фрагмент)
Член 11В надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Ангиогенный фактор 1 с доменами G-patch и FHA
Регулятор ионного транспорта 4, содержащий FXYD-домен
Неохарактеризованный белок ENSP00000244321
Серотрансферрин
Рецептор ТФР-бета типа III
Фактор
роста/дифференцировки
ЕСЕ2
Триптаза бета-2
Бета-субъединица тиреотропина
Церебральный нейротрофический фактор дофамина
ЕРАб
Белок YIPF5
Неохарактеризованный белок C19orf36
ГТФаза 2 с GPN-петлей
Предполагаемый растворимый рецептор 1 интерлейкина 18
Белок В/С, ассоциированный с мембранным белком, ассоциированным с везикулами
Белок 2, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Трансмембранный белок, индуцируемый гормоном роста
Предполагаемый белок FAM10 8A6, содержащий абгидролазный домен
кДНК, FLJ96669, характеризующаяся высокой степенью сходства с
секретируемым кислым белком, богатым цистеином
(остеонектином) (SPARC) Homo sapiens, мРНК
Член 5 семейства
эктонуклеотидпирофос-
фатазы/фосфодиэстеразы
Белок 2, содержащий домен
глицерофосфодиэфир-фосфодиэстеразы
Предполагаемый белок ENSP00000303034, подобный белку, содержащему V-набор и иммуно гло булино вый домен
кДНК, FLJ77519, характеризующаяся высокой степенью сходства с
секретируемым белком Homo sapiens, связанным с ожогами, мРНК
Белок 2, подобный полипептид-N-ацетилгалактозаминил-трансферазе
Белок 1, содержащий домены WAP, Kazal, иммуноглобулина, Кунитца и NTR
Вариант 4 транскрипта антигена созревания В-клеток (член 17 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей)
Антиген CD6 дифференцировки Т-клеток
Белок гомолога 1 Slit
Белок 1, содержащий KDEL-мотив
Белок UPF0672, C3orf58
Пикачурин
Вариант гормона роста
Адипофилин
Метилтиорибозо-1-фосфатизомераза
Фибриноген-подобный белок 1
Ангиопоэтин-связанный белок 3
Лактаза-подобный белок
17-бета-
гидроксистероиддегидро-геназа 13
Интерлейкин-32
Ангиопоэтин-связанный белок 7
Хондромодулин-1
Аминопептидаза В
Матрилин-4
Экто-АДФ-
рибозилтрансфераза 5
Альфа-б(VI)-цепь коллагена
Дермцидин
Антиген 11В, ассоциированный со спермой
Карбоангидраза-родственный белок 11
Белок 33, содержащий повтор, богатый лейцином
Метеорин
Фактор свертывания крови XII
Вероятная рибонуклеаза
MANSС-доменсодержащий белок 1
Белок 7А, подобный метилтрансферазе
Гепсидин
Вероятная
карбоксипептидаза XI
Липокалин-15
NL3
Клото
Белок FAM3D
Арилсульфатаза I
N-ацетилтрансфераза 15
Серглицин
Хемокин 14 с С-Х-С-мотивом
Белок-кандидат 2 развития мезодермы
Эфрин-А4
Томорегулин-2
Бета-дефензин 127
Dickkopf-родственный белок 1
Белок Plunc
Хордин-подобный белок 2
Бета-дефензин 129
Подокан
Калликреин-11
Член 6В надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Секреторный белок 2, богатый цистеином, содержащий LCCL-домен
Белок 1, содержащий домен фибронектина III типа
Вариант сплайсинга х секретируемого белка 1, индуцируемого WNT1 (Фрагмент)
Трансмембранный белок UPF0414, C20orf30
Фактор роста фибробластов 21
Нейротримин
Член 10 семейства интерлейкина-1
Член С семейства 4 белков с доменом лектина С-типа
Плазматическая альфа-L-фукозидаза
Обонятельный рецептор 10W1
PLA2G2D
Белок UPF0317,
C14orfl59,
митохондриальный
Гастрокин-1
Белок PARM-1
Протеогликан 3
Нетрин-С2
Гастрокин-2
PDZ-доменсодержащий белок 2
Инсулиноподобный пептид INSL5
Металлоредуктаза STEAP2
Глутатионпероксидаза 7
Проэпирегулин
Ольфактомедин-подобный белок 3
Sushi-доменсодержащий белок 4
HHIP-подобный белок 1
Аналог 1 белка 1 поликистоза почек
Внеклеточный гликопротеин лакритин
Белок YIF1B
Интерферон каппа
WLPL514
Ретинолдегидрогеназа 13
Аполипопротеин М
Аполипопротеин C-I
Металлопротеиназа-2 б матрикса
Дефензин 3 нейтрофилов
Бета-цепь С4Ь-связывающего белка
Энхансер 2 проколлаген С-эндопептидазы
RELT-подобный белок 2
GLGQ5807
Бета-цепь гликопротеина CD8 поверхности Т-клеток
Фактор 1 определения левой и правой сторон
Член ЕЗ семейства 35 переносчиков растворенных веществ
TUFT 1
Аналог 1 хемокина 3 с С-С-мотивом
Член 4 LGI-семейства белков, содержащих повтор, богатый лейцином
Транспортер цинка ZIP9
DRLV82 0 0
Фактор роста фибробластов 8
Abraxas-субъединица комплекса BRCA1-A
Ноэлин-2
IDLW5808
Коровый белок 2 4 сиаломуцина
Белок 2, содержащий домен лейциновой "молнии"
Seizure б-подобный белок 2
UBAP2
Лиганд 2 фактора 1 запрограммированной гибели клеток
Нейрексофилин-3
Семафорин-ЗА
Clq/ФНО-родственный белок 8
Секретируемый и трансмембранный белок 1
Остеомодулин
Семафорин-4С
KIR2DL4 (Фрагмент)
Белок б, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок 1, содержащий домен ингибитора сериновых протеаз типа Kazal
Белок 14А, содержащий абгидролазный домен
Вариант 2 транскрипта надсемейства 2 хемокин-подобных факторов
Аналог 3 рецептора муциноподобного гормона, содержащего ЭФР-подобный модуль
Белок 3, ассоциированный с мембраной акросомы сперматозоида
Белок 3 6, содержащий домен анкиринового повтора
Трансмембранный белок 1, ассоциированный с кератиноцитами
Ноэлин-3
Член 1 семейства ЗА секретоглобина
Белок shisa-4
GKGM353
Одорант-связывающий белок 2Ь
Цукусин
Нейромедин-U
MATL2963
Уротензин-2
Клаудин-2 (SP82)
Гомолог nodal
NINP6167
Витрин
Белок 2, родственный фактору комплемента Н
Синаптогирин-2
Аналог РОМ121
Белок 3 сигнального пути, индуцируемого WNT1
Белок надсемейства иммуно гло булино в, содержащих богатый лейцином повтор
Белок 2, подобный белку 2,
ассоциированному с ингибитором 1 ангиогенеза, специфическим для головного мозга
RTFV9368 (фактор 1 SLE-зависимой стимуляции)
кДНК FLJ75759, характеризующаяся высокой степенью сходства с фоллистатин-подобным белком 3 (секретируемым гликопротеином) (FSTL3) Homo sapiens, мРНК
Белок 1,
взаимодействующий с рецептором подо, содержащим богатый лейцином повтор и иммуноглобулиноподобный домен
Белок 104, содержащий
суперспирализованный
домен
Белок 4,
взаимодействующий с рецептором подо, содержащим богатый лейцином повтор и иммуноглобулиноподобный домен
Ангиотензинпревращающий фермент 2
Аналог IRRE-подобного белка 3
Член 20 семейства 4 L6 трансмембранных белков
KCNQ2
Адипонектин
Переносчик сигнала гемопоэтических клеток
Трансмембранный белок 107
ELCV5929
Ангиопоэтин-связанный белок 4
Бета-субъединица фоллитропина
Трансмембранный белок 143
KWM310 6
Аполипопротеин A-V
Белок 3 ингибиторной активности меланомы
Трансмембранный белок 178
ISPF6484
Аспорин
Белок 4, содержащий повтор, богатый лейцином
Трансмембранный белок 205
LKHP9428
Бактерицидный белок, ув еличив ающий проницаемость клеточной мембраны
Транспортер цинка 5
Трансмембранный белок 41А
VNFT9373
CUB-доменсодержащий белок 1
Белок нейронов 1, содержащий богатый лейцином повтор
Трансмембранный белок 5 0А
АСАН3104
Белок 1 промежуточного слоя хряща
Апикальный эндосомный гликопротеин
Трансмембранный белок 50В
RVLA194 4
Бета-Ala-His-дипептидаза
Белок сывороточного амилоида А-4
Интерлейкин-2 8В
Wpep3002
Альфа-1(V)-цепь коллагена
Пробетацеллюлин
Пентраксин-2 нейронов
ZDHHC11
Альфа-1(XXV)-цепь коллагена
Бета-1,4-
галактозилтрансфераза 7
Коллектрин
AGLW2 5 60
Эстрадиол-17-бета-дегидрогеназа 11
гидроксибутиратдегидро-геназа 2 типа
Трансмембранный белок 92
TSSP3028
член 10 подсемейства С гомологов DnaJ
С1GALT1-специфичный шаперон 1
Трансмембранный белок 95
RFVG5814
Белок 6, содержащий ЭФР-подобный домен
Бета-казеин
Трансмембранный белок 9В
SHSS3124
Цепь А фактора свертывания крови XIII
Каппа-казеин
Вероятная карбоксипептидаза PM2 0D1
ММР19
Глюкозо-б-фосфатизомераза
Трансмембранный белок C2orfl8
Тетраспанин-12
GSQS6193
Аппетит-регулирующий гормон
Каталитическая цепь карбоксипептидазы N
Тетраспанин-13
VGPW2 52 3
Бета-субъединица интерлейкина-12
Антиген CD32 0
Тетраспанин-15
LMNE64 8 7
Интерлейкин-22
Хондроитинсульфатсинтаза
Трансмембранный белок UPF0513
ALLA24 87
Интелектин-1
Хондроитинсульфатсинтаза
Митохондриальный разобщающий белок 4
GALI187 0
Глиома-инактивируемый белок 1, богатый лейцином
Молекула 7, подобная CMRF35
Полисераза-2
FRSS1829
Лимфоцитарный антиген 96
Гомолог 3 белка canopy
Вероятная
пальмитоилтрансфераза ZDHHC24
MRSS6228
Матрилизин
Короткоцепочечная дегидрогеназа/редуктаза
Белок 1 вителлинового слоя, связывающий сперматозоиды
GRPR5811
Муцин-2 0
Дельта-подобный белок 4
Белок 2 вителлинового слоя, связывающий сперматозоиды
AVLL58 09
Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин типа
Рецептор, родственный эпидермальному фактору роста, подобный белкам дельта и Notch
Субъединица 7 консервативного олигомерного комплекса Гольджи
С-концевой экзон CR1 СЗЬ/С4Ь рецептора SCR9 (или 16); SCR = короткий консенсусный повтор
Пептидогликан-распознающий белок
Долихолкиназа
Белок 2 рецептора адипонектина
PIKR2786
Интерферон-индуцируемый 17-кДа белок
Аналог 1 эндотелин-превращающего фермента
Бета С-цепь ингибина
Аналог 3 SlOO-кальций-связывающего белка А7
Белок Wnt-4
Интегральный мембранный белок 2В
Брорин
GTWW5826 (белок LP5085)
Аналог фактора воспаления аллотрансплантата 1
Белок 5, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Семафорин-ЗС
KTIS8219 (HCG2020043)
Х-сцепленный белок 3, содержащий повтор armadillo
Молекула адгезии, селективная для эндотелиальных клеток
Гепарансульфатглюкозам ин-З-О-
сульфотрансфераза 2
Белок 4 связи гиалуронана и протеогликана
Хондроитинсульфат-N-l-ацетилгалактозаминил-трансфераза
Белок 1, содержащий домены сигнального пептида, CUB и ЭФР-подобный домен
Аналог 1
перекрывающегося транскрипта рецептора лептина
Микроновел
Хитотриозидаза-1
Белок 3, родственный фактору комплемента Н
SPARC-подобный белок 1
SAMK3000
Белок 1, содержащий домен клаудина
Прорелаксин HI
Фибулин-7
VFLL3057
Эрлин-2
Фоллистатин-родственный белок 1
Гомолог 1 белка HEG
CVWG58 37
Белок 8, содержащий домен
гликозилтрансферазы 1
Глобозид-альфа-1,3-N-ацетилгалактозаминилтран сфераза 1
Белок 1, содержащий домен фибриногена С
VGSA58 4 0
Белок 1 мембраны комплекса Гольджи
Гамма-глутамилгидролаза
Член А фосфолипазы А1
GHPS3125
Вероятный рецептор 125, сопряженный с G-белком
Кадгерин-2 4
Основной богатый пролином белок 2 слюны
GRTR3118
Альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 0
Глицерин-3-
фосфатацилтрансфераза 3
Белок б,
ассоциированный со сперматогенезом
РАМР6501
Галектин-7
Рецептор 56, сопряженный с G-белком
Белок SRPX2, содержащий повтор sushi
ЪТЪЪ9335
Лиганд 4 NKG2D
Гиалуронан-связывающий белок 2
Гомолог 1 белка
перекрученной
гаструляции
VCEW9374
Оксидаза L-аминокислот
Гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор роста
Торсин-1В
АНРА9419
Пролил-З-гидроксилаза 1
Гликопротеин, богатый гистидином
Белок Wnt-5a
MDHV18 87
GPI-
этаноламинфосфаттранс-фераза 2
Карбогидратсульфотранс-фераза 14
Акрозин-связывающий белок
HSAL58 3 6
GPI-
этаноламинфосфаттранс-фераза 3
Бета-цепь рецептора интерлейкина-2 0
Член В семейства 18 белков с доменом лектина С-типа
LHLC1946
Кальций-связывающий митохондриальный белок-переносчик SCaMC-2 (Малый кальций-связывающий
митохондриальный белок-переносчик 2)
Член 3 семейства
эктонуклеотидпирофос-
фатазы/фосфодиэстеразы
Трансмембранный белок 4А, ассоциированный с лизосомами
Белок 3,
ассоциированный с карциномой неба, легких и носового эпителия (лиганд-связывающий белок RYA3)
Белок А2, ассоциированный с сурфактантом легких
Белок 7, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Семафорин-ЗЕ
LPPA6 01
Фактор сплайсинга 16, богатый
аргинином/серином
Каллистатин
Амелобластин
PINK1
Альфа-N-
ацетилгалактозамин-альфа-2,б-сиалилтрансфераза 6
Белок ЗВ, содержащий домен фибронектина III типа
Белок 5, содержащий MFS-домен
SERH2790
Рецептор, родственный IL-1 одиночного Ig
Рецептор ингибиторного фактора лейкоза
Ангиопоэтин-1
FLFF9364
Тектоник-3
Гомолог В Lin-7
Ангиопоэтин-4
Апелин
Член 11 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Трансмембранный белок 1, родственный тиоредоксину
Белок 9, содержащий несколько ЭФР-подобных доменов
GLSH6409
Член 19 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок 32, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Фосфодиэстераза За, подобная кислой сфингомиелиназе
SFVP2550
Пальмитоилтрансфераза ZDHHC9
Белок 3, содержащий Ъуб/РЪАШ-домен
ADAMTS-подобный белок
RRLF9220
Фибулин-5
Член А семейства 14 белков с доменом лектина С-типа
Спексин
PTML5838
Белок Z-зависимый ингибитор протеаз
Гомолог белка cornichon
Предполагаемый трипсин-6
VLGN1945
Альфа-2-макроглобулин
Белок FAM151A
Белок-протоонкоген Wnt-1
AVPC194 8
Агути-связанный белок
ГК50 6-связывающий белок 14
Костный
морфогенетический белок ЗЬ
AWQG2 4 91
Панкреатическая альфа-амилаза
Нейрофилин- и толлоид-подобный белок 2
Костный
морфогенетический белок 5
PSVL6168
Натрийуретические пептиды В
Протокадгерин бета-13
Костный
морфогенетический белок 8В
LCII3035
Предсердный
натрийуретический
фактор
Пренилцистеиноксидаза 1
Белок FAM2 6D
PPRR6495
Нейтральная церамидаза
Пефлин
Clq-родственный фактор
RLSC6348
Бета-2-микроглобулин
Аналог 1 пептидилпролил-цис-транс-изомеразы
Белок 1, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
CSRP2BP
Костный
морфогенетический белок
Антиген стволовых клеток предстательной железы
Церебеллин-1
GLLV3 0 61
Биотинидаза
Гомолог 2 белка patched
Карбоксипептидаза 0
GWSI6489
Белок М130 фагоцитарного рецептора, богатый цистеином, типа 1
Хитобиозилфосфодолихол-бета-маннозилтрансфераза
Белок 2, подобный миелиновому белку zero (эпителиальный V-подобный антиген 1)
кДНК FLJ53955, характеризующаяся высокой степенью сходства с
секретируемым белком 4, связанным с ожогами
Карбоксипептидаза В2
Гомолог 1 белка SEL-1
Белок 1, подобный сериновой протеазе 1
PPIF
Карбоксипептидаза Z
ProSAAS
Белок 70, содержащий суперспирализованный домен
VSSW1971
Хемокин 5 с С-С-мотивом
Лектин 9, подобный Ig, связывающему сиаловую кислоту
Хемокин 2 8 с С-С-мотивом
KLIA6249
Хемокин 7 с С-С-мотивом
SLIT и NTRK-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C4orf29
ALLW1950
Хемокин 8 с С-С-мотивом
Статгерин
CUB-доменсодержащий белок 2
GVEI466
Гликопротеин CD59
Тестизин
Белок Trem-подобного транскрипта 4
ESFI5812
Фактор комплемента I
Белок 5, подобный трансмембранному каналу
Неохарактеризованный белок C6orf58
GNNC2 9 99
Кластерин
Трансмембранная сериновая протеаза 4
Хондроадгерин
AAGG6488
Альфа-2(I)-цепь коллагена
Супрессор метастазов KiSS-1
Белок 2 промежуточного слоя хряща
HHSL751
Альфа-1(III)-цепь коллагена
Островковый амилоидный полипептид
Неохарактеризованный белок C10orf25
Бета-дефензин 108В
Альфа-1(IV)-цепь коллагена
Белок Trem-подобного транскрипта 2
Истмин-1
Бета-дефензин 118
Альфа-3(IV)-цепь коллагена
Белок 12, содержащий домен тиоредоксина
Цистатин-8
Бета-дефензин 124
Альфа-5(IV)-цепь коллагена
Фактор роста эндотелия сосудов В
Кардиотрофин-1 (СТ-1)
Бета-дефензин 125
Альфа-3(VI)-цепь коллагена
Фактор роста эндотелия сосудов С
Химотрипсиноген В
Бета-дефензин 12 6
Компонент комплемента Сб
Ретикулокалбин-3
Хемокин 9 с С-Х-С-мотивом
Аналог 2
дезоксирибонуклеазы 1
Альфа-1(IX)-цепь коллагена
Фибриллин-1
Хемокин 13 с С-Х-С-мотивом
Станниокальцин-2
Альфа-1(X)-цепь коллагена
Белок FAM3A
Эмилин-3
Молекула 1, специфическая для эндотелиальных клеток
Альфа-1(XVII)-цепь коллагена
Белок G7c
Секретагогин
Карбоксилэстераза 7
Альфа-1(XXI)-цепь коллагена
Нейрофилин- и толлоид-подобный белок 1
Секреторный белок ЕЗ-альфа эпидидимиса
Гомолог белка NOV
Альфа-субъединица коатомера
Бета-1-гликопротеин 11, специфический для беременности
Эпификан
Белок UPF0528, FAM172A
Рецептор комплемента 1 типа
Серпин В4
Белок FAM5C
Бета-субъединица интерлейкина-27
Цистатин-SN
ADAM DEC1
Фактор роста фибробластов 20
Белок FAM3C
Дезоксирибонуклеаза-1
АДФ-зависимая глюкокиназа
Белок 3, связывающий фактор роста фибробластов
Белок 1, подобный фактору 2 клеток стромы
Белок 1 внеклеточного матрикса
Альфа-амилаза 2В
Трансмембранный белок 204
Член А1 подсемейства 1 бутирофилина
Рецептор III-A Fc-области гамма-иммуноглобулина с низким сродством
UDP-GlcNAc:betaGal-6eTa-1,3-N-
ацетилглюкозаминилтранс-фераза 3
Фосфатидилэтаноламин-связывающий белок 4
Трансмембранный белок 2, ассоциированный с кератиноцитами
Альфа-фетопротеин
Пептид 2, связанный с геном кальцитонина
Фактор свертывания крови V
Fc-рецептор иммуноглобулина альфа
Гепаринсвязывающий фактор роста 2
Карбоксипептидаза Е
Фактор свертывания VII
Эмилин-2
Гамма-цепь фибриногена
Кардиотрофин-подобный фактор цитокина 1
Про-МСН
Рецептор 10 эфрина типа
Фактор
роста/дифференцировки 5
Альфа-2(VIII)-цепь коллагена
Гамма-рецептор фолата
Аналог 2 экзостозина
Нейротрофический фактор линии глиальных клеток
Гомолог 2 crumbs
Муцин-7
Фоллистатин-родственный белок 4
Белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Кислый фосфопротеин 1 матрикса дентина
Галанин-подобный пептид
Фоллистатин-родственный белок 5
Инсулиноподобный фактор роста IA
Молекула клеточной адгезии синдрома Дауна
Гемицентин-1
Трансмембранный белок 66
область С гамма-1-цепи иммуноглобулина
Член 1 надсемейства иммуноглобулинов
Интерлейкин-б
Фактор
роста/дифференцировки 2
Область С гамма-2-цепи иммуноглобулина
Интерлейкин-4
Фактор 1
эмбрионального
роста/дифференцировки
Рецептор альфа-4 семейства GDNF
Область С гамма-3-цепи иммуноглобулина
Альфа-субъединица рецептора интерлейкина-б
Интерлейкин-8
Область С гамма-4-цепи иммуноглобулина
Аналог 3 инсулина
Интерлейкин-24
Гремлин-2
Лимфоцитарный антиген 86
Тяжелая цепь ингибитора интер-альфа-трипсина
Ладинин-1
Стромелизин-2
Бета Е-цепь ингибина
Белок UPF0378, KIAA0100
Липаза I
Вероятный рецептор 171, сопряженный с G-белком
Белок 1С, содержащий GRAM домен
Кининоген-1
Белок 1, родственный панкреатической липазе
Паппализин-2
Интерферон альфа-10
Субъединица альфа-2 ламинина
Альфа-2-гликопротеин, богатый лейцином
Гликопротеин 4, ассоциированный с микрофибриллами
Интерферон альфа-16
Субъединица альфа-4 ламинина
Белок 5, ассоциированный с ремоделированием матрикса
Нейромедин-В
Интерферон альфа-6
Бета-1-субъединица ламинина
Нетрин-4
Мимекан
Член 21 надсемейства иммуноглобулинов
Протеинлизиноксидаза б
Рецептор фактора роста гепатоцитов
Металлопротеиназа-19 матрикса
Агрин
Муль тимерин-1
Хемокин 22 с С-С-мотивом
Интерлейкин-11
Пролактин
Вазопрессин-нейрофизин 2-копептин
Никталопии
Интерлейкин-17А
Келч-подобный белок 11
Нидоген-1
Остеокальцин
Интерлейкин-18
Белок Wnt-16
Фосфолипаза А2
Основной богатый пролином белок 3 слюны
Интерлейкин-2 6
Пропердин
Перфорин-1
Бета-1-гликопротеин 10, специфический для беременности
Интерлейкин-2 8А
Калликреин-13
Фосфатидилинозитгликан-специфическая фосфолипаза D
Трансмембранный белок FLRT2, содержащий богатый лейцином повтор
Белок 3, содержащий трансмембранный домен етр2 4
1-ацил-sn-глицерин-3-фосфатацилтрансфераза дельта
Фиброцистин
R-спондин-З
Интерлейкин-2 9
Калликреин-9
Белок транспорта фосфолипидов
Сиалоадгезин
Инсулиноподобный пептид INSL6
Витамин К-зависимый белок S
Кислая фосфатаза предстательной железы
Трипсин-3
Белок Wnt-2b
Бутирофилин-подобный белок 8
Витамин К-зависимый белок Z
Дипептидаза 2
Бета-1-гликопротеин 1, специфический для беременности
Бета-4-субъединица ламинина
Кислый богатый пролином фосфопротеин 1/2 слюны
Белок 1, содержащий коллаген- и кальций-связывающий домен ЭФР
Белок 4,
ассоциированный с мембраной акросомы сперматозоида
Рецептор гиалуроновой кислоты эндотелия лимфатических сосудов 1
Белок зоны беременности
Белок, подобный гену 1, специфическому для зародышевых клеток
Гамма-3-субъединица ламинина
Цистатин-SA
Прорелаксин Н2
Белок 31, содержащий повтор, богатый лейцином
Гомолог 3 лизилоксидазы
Трансмембранный белок 59
Семафорин-4Б
Аполипопротеин 0
Нейротензин/нейромедин N
Аполипопротеин(а)-подобный белок 2
Белок гомолога 2 Slit
Дистрогликан
МАМ доменсодержащий белок 2
Лизоцим-подобный белок
Альфа-текторин
Дефензин 4 нейтрофилов
Белок 2,
ассоциированный с микрофибриллами
Лизоцим-подобный белок
Тенасцин-Х
Амфотерин-индуцируемый белок 3
Белок 2 ингибиторной активности меланомы
Рилин
Фактор "трилистника" 3
Субъединица АРН-1В гамма-секретазы
Металлопротеиназа-24 матрикса
Ретинол-связывающий белок 4
Белок 1 рецептора трансферрина
Аполипопротеин С-IV
Металлопротеиназа-25 матрикса
Карбоангидраза 14
Предшественник трансформирующего фактора роста альфа
Арилсульфатаза G
Нетрин-1
Антиген
тубулоинтерстициального нефрита
Трансформирующий фактор роста бета-2
Фактор активации глии
Нетрин-3
Нейропептид W
Член б надсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Белок 18, содержащий домен рекрутинга каспазы
Альфа-N-
ацетилгалактозамин-альфа-2,6-сиалилтрансфераза 1
Альфа-1,3-
маннозилгликопротеин-4-бета-N-
ацетилглюкозаминил-трансфераза В
Член 1В надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Гепарансульфатглюкозамин
-3-0-сульфотрансфераза
ЗА1
Альфа-N-
ацетилгалактозамин-альфа-2,6-сиалилтрансфераза 3
Белок 5, содержащий трансмембранный домен етр2 4
Член 5 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Эктофермент, разрушающий рилизинг-гормон тиреотропина
Белок-регулятор роста
меланомного
происхождения
Белок 3, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Тромбопоэтин
Гуанилин
FMRFaMHfl-poflCTBeHHbie пептиды
Подокан-подобный белок
Пептиды VIР
Белок 3, подобный переносчику холина
Отоконин-90
Бета-1-гликопротеин 5, специфический для беременности
Кислая хитиназа млекопитающих
17-бета-
гидроксистероиддегидроге наза 14
Нейртурин
Кератокан
Секреторный белок 2, богатый цистеином
Полипептид 1, подобный иммуноглобулину лямбда
Нейрексофилин-1
Секреторная фосфолипаза А2 группы НЕ
Гаптоглобин-родственный белок
Член 14 подсемейства В гомологов DnaJ
Нейрексофилин-2
Фактор 2 определения левой и правой сторон
Хемокин 2 6 с С-С-мотивом
Белок 8, содержащий только F-box
Вариант
тромбоцитарного фактора 4
Лиганд 2 NKG2D
Коллектин-11
Фибролейкин
Ноцицептин
Металлоэластаза макрофагов
Белок 2 с ЭФР-подобным доменом, богатый цистеином
Метионин-R-
сульфоксидредуктаза ВЗ, митохондриальная
Белок 1, содержащий V-набор и
трансмембранный домен
Инициирующий рецептор 1, экспрессирующийся на миелоидных клетках
Хемокин 16 с С-Х-С-мотивом
Член 2 LGI-семейства белков, содержащих повтор, богатый лейцином
Белок 4, богатый пролином
Фактор 1, подобный рецептору цитокинов
Белок 1, связывающий фактор роста фибробластов
Белок транспорта везикул GOT1B
Рилизинг-пептид пролактина
Секретин
Член 5 семейства интерлейкина-1
Интегральный мембранный белок GPR177
Сериновая протеаза 33
Фактор клеток стромы 2
Член 9 семейства интерлейкина-1
Вероятный рецептор 78, сопряженный с G-белком
Бета-1-гликопротеин 8, специфический для беременности
Лизоцим-подобный белок
Калликреин-5
Член 2 семейства НЕРАСАМ
Ретбиндин
Серпин А9
Матрилин-2
Альфа-субъединица рецептора интерлейкина-27
FMRFaMMfl-poflCTBeHHbie пептиды
Белок 1, содержащий домен склеростина
Рецептор 1
гликопротеина клеточной поверхности CD200
Проэнкефалин-А
Рибонуклеаза Кб
Лизокардиофилинацил-трансфераза 1
Фосфатаза
лизофосфатидной кислоты б типа
Интегрин альфа-10
Рибонуклеаза Т2
Плазматическая
глутаматкарбокси-
пептидаза
Фактор обмена нуклеотидов SIL1
KTEL-мотивсодержащий белок 1
Репетин
Белок гомолога 3 Slit
Белок 4, содержащий домен тромбоспондина 1 типа
Член 5 подсемейства А иммуноглобулиноподобных рецепторов лейкоцитов
Белок, подобный субкомпоненту комплемента С1г
Белок 8, содержащий домен альфа-2-макроглобулина, подобного СЗ и PZP
Белок 2 сигнального пути, индуцируемого WNT1
Белок 3, содержащий богатый лейцином повтор и домен фибронектина III типа
Неохарактеризованная
гликозилтрансфераза
AER61
Белок 2, реагирующий на рецептор ретиноевой кислоты
Бромодоменсодержащий белок 9
Утероглобин
Семафорин-36
Кислый белок 1 хряща
CD99 антиген-подобный белок 2
Лиганд нетрина-Gl
Член 1 семейства 1С секретоглобина
Станниокальцин-1
Неохарактеризованный белок Clorfl59
Паннексин-1
Член 1 семейства 1D секретоглобина
Бета-текторин
Карбогидратсульфотрансф ераза 12
Протокадгерин-12
Член 2 семейства 1D секретоглобина
Фактор 3
постприсоединения GPI к белкам
Вероятная
серинкарбоксипептидаза CPVL
Протокадгерин альфа-10
Серпин А12
Белок гена 1, специфического для зародышевых клеток
Муцин-ЗА
Протокадгерин бета-10
Серпин 12
Рецептор интерлейкина-21
Белок 1, содержащий аналог домена CUB и вителлинового слоя
Трансмембранный белок 1, ассоциированный с остеопетрозом
Белок, содержащий домены фактора Виллебранда С и ЭФР
Белок 4, содержащий V-набор и
иммуно гло булино вый домен
Полипептид-N-ацетилгалактозамин-трансфераза 14
Бета-галактозид-альфа-2,б-сиалилтрансфераза 1
Белок 15, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок группы В фагоцитарных рецепторов, содержащих домен, богатый цистеином
Галектин-9
Компонент PIG-S GPI-трансамидазы
Бета-2-субъединица натриевого канала
Протиреолиберин
Белок 17, содержащий повтор, богатый лейцином
Трансмембранный белок 3, богатый пролином
Ингибитор металлопротеиназ 4
Семафорин-4А
Белок нейронов 2, содержащий богатый лейцином повтор
Сульфгидрилоксидаза 2
Т-клеточный иммуномодулирующий белок
Бифункциональная гепарансульфат-N-дезацетилаза/N-сульфотрансфераза 3
Белок 16, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок 10, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Член 27 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Туфтелин
ЗН2-доменсодержащий белок ЗА
Лимфопоэтин стромы тимуса
Toll-подобный рецептор
Митохондриальный белок-переносчик головного мозга
SНС-превращающий белок 4
Трансмембранный белок 130
Белок 3, содержащий домены сигнального пептида, CUB и ЭФР-подобный домен
Белок 23, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Уникальный белок, ассоциированный с матриксом хряща
Белок 16, содержащий домен тиоредоксина
14-3-3 белок сигма
Трансдуцин бета-подобный белок 2
Урокортин-2
Альфа-2-антиплазмин
Альфа-1-кислый гликопротеин 1
Белок 10, содержащий домен tudor
Урокортин-3
Белок 3, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Альфа-1-кислый гликопротеин 2
Член 3 надсемейства 9 трансмембранных белков
Белок АМВР
Белок WFDC9
Белок 1, содержащий домен фактора Виллебранда А
Белок, содержащий домены фактора Виллебранда D и ЭФР
Аналог белка 9, родственного комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок 14, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок 9, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Белок 17, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок 88, связанный с ингибированием роста и дифференцировкой
Белок, ассоциированный с плазматической мембраной адипоцитов
Ангиотензиноген
Белок 2, подобный трансмембранному каналу
Белок Wnt-10a
Гомолог пероксидазина
Аполипопротеин А-II (Аро-АН) (АроА-Н)
Бета-1-гликопротеин 3, специфический для беременности
Белок Wnt-3a
Гомолог белка
прогрессирующего
анкилоза
Аполипопротеин А-IV Apo-AIV) (ApoA-IV)
Теномодулин
Белок-протоонкоген Wnt-3
Хитиназа-3-подобный белок 1
Аполипопротеин С-II (Аро-СН) (АроС-Н)
Тетраспанин-6
Белок Wnt-6
Белок UPF0672, СХоггЗб
Бета-2-гликопротеин 1
Белок 5, содержащий домен тиоредоксина
Белок Wnt-9a
Арилсульфатаза J
Апоптоз-связанный белок
Фактор роста эндотелия сосудов D
Цитокин SCM-1 бета
Кортистатин
Бета-секретаза 2
Бета-1-гликопротеин 9, специфический для беременности
Мембранный белок 16 зимогенных гранул
Церулоплазмин
Тканевая трансфераза системы групп крови АВО
Семафорин-ЗБ
Белок 1, связывающий вителлиновый слой
Ангиопоэтин-связанный белок 5
Катепсин L2
Белок 2, подобный кислой фосфатазе
Гомолог белка 3 переднего градиента
Белок 12 6, содержащий
суперспирализованный
домен
Хемокин 3 с С-С-мотивом
Аналог аполипопротеина 0
Амелотин
Антиген CD177
Член В семейства 1 белков с доменом лектина С-типа
Бета-дефензин 119
Неохарактеризованный белок C5orf46
Гомолог 4 белка canopy
Регулятор 1 кальций-активируемого хлоридного канала
Белок 12, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Неохарактеризованная протеинкиназа 1, содержащая aarF-домен
Белок C4orf31, содержащий домен фибронектина III типа
Химаза
Белок FAM131A
Драксин
Белок FAM18 0A
Альфа-1(VI)-цепь коллагена
Белок FAM3B
Фактор роста фибробластов 18
Основной белок тромбоцитов
Альфа-цепь компонента комплемента С8
Бета-галактозидаза-1-подобный белок
Хемокин 11 с С-Х-С-мотивом
Интерферон эпсилон
Компонент комплемента С9
Лизоцим g-подобный белок
Белок 6, содержащий Ъуб/РЪАШ-домен
Интелектин-2
Белок 2, содержащий домен глюкоза/фруктоза-оксидоредуктазы
Белок, подобный тяжелой цепи Н5 ингибитора интер-альфа-трипсина
Член 1 семейства химотрипсин-подобной эластазы
Альфа-1,3-маннозил-гликопротеин-4-бета-Ы-ацетилглюкозаминилтранс фераза А
Член 11 подсемейства В гомологов DnaJ
Белок 5, ассоциированный с акросомой сперматозоида
Рецептор эритропоэтина
Фосфогликопротеин внеклеточного матрикса
Член 7 семейства
эктонуклеотидпирофосфат
азы/фосфодиэстеразы
Белок 2,
взаимодействующий с рецептором подо, содержащим богатый лейцином повтор и иммуноглобулиноподобный домен
Белок 2
гликозилфосфатидилиноз итного якоря, содержащий МАМ-домен
кДНК FHJ77863, характеризующаяся высокой степенью сходства с секретируемым и трансмембранным белком 1 (SECTM1) Homo sapiens, мРНК
Аминопептидаза эндоплазматического ретикулума 1
Белок 2, ассоциированный с сурфактантом
Металлопротеиназа-27 матрикса
Липокалин-6, специфический для эпидидимиса
Рецепторная
тирозинпротеинкиназа
егЬВ-3
Белок 1 рецептора адипонектина
Неактивная сериновая протеаза 35
Афамин
Резидентный белок эндоплазматического ретикулума ERp4 4
Белок б, содержащий несколько ЭФР-подобных доменов
Белок 134, содержащий
суперспирализованный
домен
Вероятная катион-транспортная АТФаза 13А5
IgGFc-связывающий белок
Нейроэндокринный белок 7В2
Супрабазин
Глутатионпероксидаза 3
Белок 1, родственный фактору комплемента Н
Альфа-1В-гликопротеин
Член 4 семейства 1D секретоглобина
Клаудин-18
Полипептид-N-ацетилгалактозаминтранс фераза 2
Белок 2, содержащий домены WAP, Kazal, иммуноглобулина, Кунитца и NTR
Белок 2А, содержащий V-набор и
трансмембранный домен
Предполагаемый белок KIR3DP1, подобный иммуноглобулиноподобном у рецептору киллеров
Гемопексин
Аналог 1
арилацетамиддеацетилазы
ADM
Рецептор секреторной фосфолипазы А2
Активатор фактора роста гепатоцитов
Гистатин-3
Неохарактеризованный белок C2orf82
Гаптоглобин
Белок гена, родственного главному комплексу
гистосовместимости I класса
Пронейрегулин-3,
мембранносвязанная
изоформа
Член 1 семейства инсулиноподобного фактора роста
Молекула клеточной адгезии 20, связанная с раковым эмбриональным антигеном
Белок б, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Агути-сигнальный белок
Кадгерин-подобный белок 2 9
Костный
морфогенетический белок
Область С дельта-цепи иммуноглобулина
Клаудин-8
Костный
морфогенетический белок 15
Антиген 2 стромы костного мозга
Интерлейкин-1 бета
Белок UPF0454, C12orf49
Плазматический ингибитор сериновых протеаз
Цитохром Р450 20А1
Белок 10, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности
Белок 5В1, содержащий домен фактора Виллебранда А
Молекула клеточной адгезии 21, связанная с раковым эмбриональным антигеном
Аналог 3 белка, усиливающего бактерицидные свойства/проницаемость
Соединительная молекула адгезии С
Кадгерин-б
Альфа-лактальбумин
Гомолог 2 белка dpy-19
Неохарактеризованный белок KIAA0319
Антимикробный пептид кателицидин
Белок когезии сестринских хроматид DCC1
Секреторная фосфолипаза А2 группы IIF
Субъединица альфа-5 ламинина
Субъединица гамма-1 ламинина
Галектин-3-связывающий белок
Карбоксипептидаза В
Белок 4, содержащий домен фибронектина III типа
Член 7В SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
Белок 1, содержащий домен тяжелой цепи динеина
Белок 8, содержащий домен
гликозилтрансферазы 2
Липопротеинлипаза
Хемокин 16 с С-С-мотивом
Хемокин 17 с С-С-мотивом
Белок FAM19A1
Интерстициальная коллагеназа
Хемокин 2 4 с С-С-мотивом
Редуктаза 1 жирных ацил-СоА
Аналог альфа-рецептора семейства GDNF
Матриксная металлопротеиназа 9
Белок C7orf27, содержащий повтор HEAT
Гомолог фактора инициации зачатка передних конечностей
Вероятно,
глутатионпероксидаза 8
Муцин-1 б
Альфа-2(IX)-цепь коллагена
Рецептор полимерного иммуноглобулина
Цистатин-D
Муцин-2
Альфа-3(IX)-цепь коллагена
Прион-подобный белок doppel
Цистатин-F
Муцин-5В
Колипаза
Хемокин 6 с С-Х-С-мотивом
Ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов
Миоцилин
Альфа-1(XXVII)-цепь коллагена
Хемокин 10 с С-Х-С-мотивом
Белок плазмы А, ассоциированный с беременностью
Рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1
Субъединица 2 карбоксипептидазы N
Бета-дефензин 1
Член 12 семейства 22 переносчиков растворенных веществ
Белок гена 1, сверхэкспрессируемого в опухоли предстательной железы
Трансмембранный белок нейронов 4, содержащий богатый лейцином повтор
Белок 2 связи гиалуронана и протеогликана
Аналог 1 хорионического соматомаммотропина
Серии/треониновая протеинкиназа 2, взаимодействующая с рецептором
Белок 1, содержащий повтор тройной спирали коллагена
Белок 30, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Регуляторный белок динамики микротрубочек
Равновесный транспортер нуклеозидов 3
Эндотелин-2
Супрессор гомолога fused
Ретинолдегидрогеназа 14
Селенопротеин Р
Фибромодулин
Рецептор бета фолата
Галанин
Белок D,
ассоциированный с сурфактантом легких
Аналог В Fc-рецептора
Внеклеточная сульфатаза Sulf-2
Транскобаламин-2
Гомолог белка гена 6, стимулируемого ретиноевой кислотой
Белок Clorfl24, содержащий домен цинкового пальца RAD18
Член 14 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок 1, содержащий домен катехол-О-метилтрансферазы
Фактор "трилистника" 1
Фактор
роста/дифференцировки 15
Артемин
Трипептидилпептидаза 1
Ингибитор 2 пути тканевого фактора
Глиальный нексин
Альфа-1(XII)-цепь коллагена
Белок Trem-подобного транскрипта 1
Протромбин
Прогонадолиберин-1
Альфа-1(XIV)-цепь коллагена
Активатор 2В гуанилатциклазы
Toll-подобный рецептор
Гранзим К
Бета-дефензин 2
Индуцибельный Т-клеточный костимулятор
Молекула межклеточной адгезии 4
Интерферон альфа-17
Интерлейкин-21
Интерлейкин-19
Интерферон альфа-21
Интерлейкин-3
Истмин-2
Интерферон альфа-8
Интерлейкин-7
Белок, подобный N-концевому домену гомолога 2 Notch
Аналог IRRE-подобного белка 1
Интерферон омега-1
Альфа-цепь ингибина
Субъединица бета-2 ламинина
Калликреин-10
Ранний инсулиноподобный пептид плаценты
Субъединица альфа-3 ламинина
Нейропилин-2
Белок 4, связывающий латентный
трансформирующий фактор роста бета
Белок 1, содержащий домены ЭФР, латрофилина и семь трансмембранных доменов
Член SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз на Х-хромосоме
ЭФР-содержащий фибулин-подобный белок 1 внеклеточного матрикса
Парный
иммуноглобулиноподобный рецептор альфа 2 типа
Белок 1, содержащий домены фибронектина 3 типа и анкиринового повтора
Регулятор ионного транспорта 6, содержащий FXYD-домен
Рецепторная тирозинпротеинфос-фатаза каппа
Белок 3 альфа
регенерирующих
островков
Гомолог 4 лизилоксидазы
Фактор 2 встраивания серина
Белок 4 регенерирующих островков
ЕЗ-
убиквитинпротеинлигаза RNF5
Люмикан
Стромелизин-3
Тахикинин-4
Протахикинин-1
Адропин
Секретируемый фосфоропротеин 1
Металлопротеиназа-23 матрикса
Секретируемый белок 1, связанный с ожогами, изоформа CRA а
Трансмембранный белок FLRT1, содержащий богатый лейцином повтор
Белок LACTB, подобный серин-бета-лактамазе, митохондриальный
Белок 5, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок В, родственный плазминогену
Нуклеобиндин-2
Галектин-3
Оптицин
Вероятная
пальмитоилтрансфераза ZDHHC1б
Фосфолипаза А2
Прогормон
поджелудочной железы
Предшественник
малого/секретируемого
гликопротеина
Ангиопоэтин-связанный белок 1
Проэнкефалин-В
Бета-1-гликопротеин б, специфический для беременности
Пентраксин-родственный белок РТХЗ
Белок UPF0510, C19orf63
Пептидогликан-распознающий белок I-бета
Dickkopf-родственный белок 3
Карбоксилэстераза 8
Белок М160 фагоцитарного рецептора, богатый цистеином, типа 1
Белок 2 надсемейства иммуноглобулинов, содержащих богатый лейцином повтор
Член 11 SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
Трансмембранный белок 4, родственный тиоредоксину
Аналог 2 альфа-маннозидазы, усиливающей разложение ER
Белок 2, содержащий V-набор и
иммуноглобулиновый домен
Белок 3 гамма
регенерирующих
островков
Белок 2, содержащий MFS-домен
Бета-галактозидаза-1-подобный белок 2
Пептид YY
Белок 43, содержащий домен RING-"палец"
Калликреин-12
Рецептор Е интерлейкина-17
Ретинол-связывающий белок 3
Семеногелин-2
Коровый белок бревикана
Интерлейкин-2 0
Атерин
Муцин-15
Поримин
Интерлейкин-25
Гомолог белка транслокации SEC63
Сиалопротеин 2 костей
Торсин-1А
PDZ-доменсодержащий белок 11
Трансформирующий фактор роста бета-3
Лимфотактин
Хемокин 2 3 с С-С-мотивом
Релаксин-3
Белок Wnt-10В
Рост-рег улирующий белок альфа
Тестикан-3
Ретиноид-индуцируемая серинкарбоксипептидаза
Реналаза
К-спондин-2
Основной богатый пролином белок 4 слюны
Белок 2,
ассоциированный с карциномой неба, легких и носового эпителия
Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин 4 типа
Белок 3, содержащий трансмембранный и суперспирализованный домен
Член 18 надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок 5, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Карбоксипептидаза А4
Хемокин 1, совместно регулируемый с ФРЭС
Белок "брат CDO"
Тромбоцитарный фактор роста С
Ольфактомедин-4
ADM2
Бета-1,4-
галактозилтрансфераза 4
Белок 33, содержащий домен дезинтегрина и металлопротеиназы
Кислая лабильная цепь комплекса белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста
Белок 1, подобный
гидроксистероид-11-
бета-дегидрогеназе
Член 9 SDR-семейства дегидрогеназ/редуктаз
BSD-доменсодержащий белок 1
Амелогенин, Y-изоформа
Дельта-подобный белок
Эппин
Молекула клеточной адгезии 3
Арилсульфатаза F
Эфрин-А1
Отоанкорин
СОС45-родственный белок
Вариант 2 бета-
субъединицы
хориогонадотропина
Аналог 1 рецептора фактора роста фибробластов
Тенасцин-R
Хондролектин
Бета-дефензин 104
Рецептор альфа-3 семейства GDNF
Фактор роста
Диацилглицерин-0-ацилтрансфераза 2
Бета-дефензин 105
Рецепторов тромбоцитов Gi24
Белок ТSPEAR
3-кетостероидредуктаза
Бета-дефензин 107
Прогонадолиберин-2
Гефестин
Рецептор С интерлейкина-17
Белок WFDC11
Калликреин-7
Бутирофилин-подобный белок 3
Рецептор D интерлейкина-17
Белок б, содержащий коровый домен кислого белка молочной сыворотки с четырьмя дисульфидными связями
Аполипопротеин F
Бутирофилин-подобный белок 9
Субъединица 1 комплекса интегратора
Эпиген
Белок CASC4
Субъединица гамма-2 ламинина
Аналог соединительной молекулы адгезии
Белок FAM19A5
VIP3б-подобный белок
Белок DMBRlb
ЕЗ-
убиквитинпротеинлигаза LNX
Клаудин-б
Белок-транспортер магния 1
Муцин-21
Трансмембранный белок нейронов 3, содержащий богатый лейцином повтор
Молекула клеточной адгезии 19, связанная с раковым эмбриональным антигеном
Амилорид-чувствительная аминоксидаза [медьсодержащая]
Маннозилолигосахарид-1,2-альфа-маннозидаза эндоплазматического ретикулума
Бета-субъединица метионинаденозилтрансфе разы 2
Белок 1, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Белок-модулятор аутофагии 2, регулируемый повреждением ДНК
Основной гликопротеин GP2 мембраны секреторных гранул поджелудочной железы
Подокаликсин-подобный белок 2
Белок COQ10 А, митохондриальный
Трансмембранный белок C17orf87
Семафорин-4В
Проминин-2
Неохарактеризованный белок C19orf41
Белок 5, родственный фактору комплемента Н
Семафорин-5В
Белок 2, содержащий домен плексина
Неохарактеризованный белок C21orf63
ГК50б-связыв ающий белок 7
Эпсилон-саркогликан
Гомолог 4 roundabout
Гомолог 2 белка дельта
Фактор 1 встраивания серина
Гуанилат-связывающий белок 5
Лактозилцерамид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Белок транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином
Белок 1, содержащий трансмембранный и убиквитиноподобный домен
Эктонуклеозидтрифосфатд ифосфогидролаза б
Член 2 семейства SID1 трансмембранных белков
Белок 1, подобный партнеру по связыванию липомы HMGIC
Аналог белка ERGIC-53
Серпин ВЗ
Sushi-доменсодержащий белок 1
Белок 18, содержащий повтор, богатый лейцином
Toll-подобный рецептор 10
Гомолог В белка RMD5
Серии/треонин-протеинкиназа ТА02
Белок 25, содержащий повтор, богатый лейцином
Toll-подобный рецептор
Член 5 класса А фагоцитарных рецепторов
Трансмембранная сериновая протеаза 2
Белок ЗВ, содержащий богатый лейцином повтор
Селенопротеин Т
Семафорин-6В
Декарбоксилаза 1 УДФ-глюкуроновой кислоты
Белок 3, содержащий повтор, богатый лейцином
Лектин 11, подобный Ig, связывающему сиаловую кислоту
Трансмембранный белок 108
Неохарактеризованный белок C10orf58
Белок 4, содержащий Ъуб/РЪАШ-домен
Сортирующий нексин-2 4
Sushi-доменсодержащий белок 3
Трансмембранный белок 2, родственный тиоредоксину
Субъединица 1 комплекса витамин К-эпоксидредуктазы
Белок 1, родственный комплементу Clq и фактору некроза опухолей
Белок 2, связывающий латентный
трансформирующий фактор роста бета
CMP-N-ацетилнейраминат-бета-галактозамид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Белок 20, содержащий мотивы дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондином
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ6494/PR021346
Предполагаемый неохарактеризованный белок UNQ6190/PRO20217
Предполагаемый неохарактеризованный белок ENSP00000380674
Предполагаемый неохарактеризованный белок ENSP00000381830
Вариант
предшественника секретируемого и трансмембранного белка
Вариант предшественника секретируемого и трансмембранного белка
Трансмембранный белок 119
Белок 1 критической области синдрома кошачьего глаза
Член А семейства 18 белков с доменом лектина С-типа
Альфа-1(XX)-цепь коллагена
Трансмембранный белок 98
Белок 101,
экспрессируемый яичками
Секреторный белок 3, богатый цистеином
Рецептор нетрина UNC5D
Предшественник белка 3 В-лимфоцитов
Ксилозилтрансфераза 2
Комплемент С4-А
Муцин-13
Предполагаемый неохарактеризованный белок C14orfl44
Белок FAM2 0A
Предполагаемый неохарактеризованный белок PR02829
АТФ-зависимая металлопротеаза YMElhl
Мембраносвязанная протеаза сайта-1 фактора транскрипции
Белок 1, содержащий трансмембранный и иммуноглобулиновый домен
Регулятор 2 кальций-активируемого хлоридного канала
Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин 5 типа
Фиколин (содержащий
домен
Предполагаемый белок
коллагена/фибриногена)
KIR3DX1, подобный
3 (антиген Hakata)
иммуноглобулиноподобному
Супрессоров
(NL3) (Фиколин
рецептору киллеров (член
туморогенности
(содержащий домен
12 кластера
нейробластомы 1
коллагена/фибриногена)
лейкоцитарных
3 (антиген Hakata),
рецепторов)
изоформа CRA Ь)
Не следует считать, что терапевтические белки, представленные в данном описании, являются единственно возможными. Напротив, как видно из представленного в данном описании описания, способы по изобретению применимы к любому белку, присоединение к которому водорастворимого производного жирной кислоты в соответствии с изобретением является желательным. Например, терапевтические белки описаны в US 2007/0026485, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.
Белки свертывания крови.
В одном аспекте исходным материалом по настоящему изобретению является белок свертывания крови, который может происходить из плазмы человека или продуцироваться с помощью технологии рекомбинантной инженерии, как описано в патентах США №№ 4757006; 733873; 5198349, 5250421, 5919766 и ЕР 306968.
Терапевтические полипептиды, например белки свертывания крови, в том числе фактор IX (FIX), фактор VIII (FVIII), фактор VIIa (FVIIa), фактор Виллебранда (ФВ), фактор FV (FV), фактор X (FX), фактор XI (FXI), фактор XII (FXII), тромбин (FII), белок С, белок S, tPA, PAI-1, тканевой фактор (TF) и протеаза ADAMTS 13, быстро разрушаются протеолитическими ферментами и нейтрализуются антителами. Это снижает время их полужизни и время циркуляции, тем самым ограничивая их терапевтическую эффективность. Для достижения и поддержания желаемого терапевтического или профилактического эффекта указанных белков свертывания необходимы относительно высокие дозы и частое введение. Как следствие, затрудненность адекватного регулирования дозы и необходимость частого внутривенного введения накладывают ограничения на образ жизни пациента.
Как описано в данном описании, белки свертывания крови включают фактор IX (FIX), фактор VIII (FVIII), фактор VIIa (FVIIa), фактор Виллебранда (ФВ), фактор FV (FV), фактор X (FX), фактор XI, фактор XII (FXII), тромбин (FII), белок С, белок S, tPA, PAI-1, тканевой фактор (TF) и протеазу ADAMTS 13, рассматриваемые изобретением, но не ограничиваются ими. Как используется в данном описании, термин "белок свертывания крови" относится к любому белку из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF) и протеазы ADAMTS 13, который проявляет биологическую активность, связанную с определенным нативным белком свертывания крови.
Каскад свертывания крови разделен на три сегмента: внутренний, внешний и общий пути (Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004; 11:272-7). Каскад включает ряд ферментов (зимогенос) сериновых протеаз и кофакторы белков. При необходимости неактивный предшественник-зимоген преобразуется в активную форму, которая затем преобразует следующий фермент в каскаде.
Внутренний путь требует факторов свертывания крови VIII, IX, X, XI и XII. Инициирование внутреннего пути происходит, когда прекалликреин, высокомолекулярный кининоген, фактор XI (FXI) и фактор XII (FXII) подвергаются воздействию отрицательно заряженной поверхности. Также необходимы ионы кальция и фосфолипиды, выделяющиеся из тромбоцитов.
Внешний путь инициируется при повреждении просвета кровеносных сосудов. Мембранный гли-копротеин - тканевый фактор высвобождается и затем связывается с циркулирующим фактором VII (FVII), а также небольшими существующими количествами его активированной формы FVIIa. Это связывание облегчает полное преобразование FVII в FVIIa, и затем в присутствии кальция и фосфолипидов преобразование фактора IX (FIX) в фактор IXa (FIXa) и фактора X (FX) в фактор Ха (FXa). Связывание FVIIa с тканевым фактором повышает протеолитическую активность, сближая сайты связывания фактора FVII для субстрата (FIX и FX) и вызывая конформационные изменения, что повышает ферментативную активность FVIIa.
Активация FX является общей точкой двух указанных путей. Наряду с фосфолипидом и кальцием факторы Va (FVa) и Ха преобразуют протромбин в тромбин (протромбиназный комплекс), который затем расщепляет фибриноген с образованием мономеров фибрина. Указанные мономеры полимеризуются с образованием нитей фибрина. Фактор XIIIa (FXIIIa) ковалентно связывает указанные нити друг с другом, образуя жесткую сеть.
Преобразование FVII в FVIIa также катализируется рядом протеаз, включая тромбин, FIXa, FXa, фактор XIa (FXIa) и фактор XIIa (FXIIa). При ингибировании ранней фазы каскада мишенью ингибитора пути тканевого фактора является комплекс FVIIa/тканевого фактора/продукта FXa.
Фактор VIIa.
FVII (также известный как стабильный фактор или проконвертин) представляет собой витамин К-зависимый сериновый протеазный гликопротеин с ключевой ролью в гемостазе и свертывании (Eigenbrot, Curr Protein Pept Sci. 2002; 3:287-99).
FVII синтезируется в печени и секретируется в виде одноцепочечного гликопротеина массой 48 кДа. FVII обладает общей со всеми витамин К-зависимыми сериновыми протеазными гликопротеинами структурой белковых доменов, состоящей из N-концевого домена гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (Gla), содержащего 9-12 остатков, ответственных за взаимодействие белка с липидными мембранами, С-концевого домена сериновой протеазы (каталитического домена) и двух ЭФР-подобных доменов, содержащих сайт связывания ионов кальция, обеспечивающий взаимодействие с тканевым фактором. Гамма-глутамилкарбоксилаза катализирует карбоксилирование остатков Gla в N-концевой части молекулы. Действие указанной карбоксилазы зависит от восстановленной формы витамина К, которая окисляется до эпоксидной формы. Для преобразования эпоксидной формы витамина К обратно в восстановленную форму требуется витамин К-эпоксидредуктаза.
Основная часть FVII циркулирует в плазме в форме зимогена, и активация этой формы приводит к расщеплению пептидной связи между аргинином 152 и изолейцином 153. Полученный активированный FVIIa состоит из Мг^-производной легкой цепи (20 кДа) и полученной из СООН-конца тяжелой цепи (30 кДа), соединенных одиночной дисульфидной связью (от Cys 135 к Cys 262). Легкая цепь содержит мем-бранно-связанный Gla-домен, в то время как тяжелая цепь содержит каталитический домен.
Концентрация FVII в плазме определяется генетическими и экологическими факторами и составляет приблизительно 0,5 мг/мл (Pinotti et al., Blood. 2000; 95:3423-8). Различные генотипы FVII могут привести к различающимся в несколько раз средним уровням фактора FVII. Уровни FVII в плазме повышены во время беременности у здоровых женщин, а также увеличиваются с возрастом и повышены у женщин и у лиц с гипертриглицеридемией. FVII обладает самым коротким временем полужизни среди всех факторов свертывания (3-6 ч). Средняя концентрация FVIIa в плазме составляет 3,6 нг/мл у здоровых людей, и время полужизни FVIIa в кровотоке является относительно длительным (2,5 ч) по сравнению с другими факторами свертывания.
Наследственная недостаточность фактора FVII является редким аутосомно-рецессивным расстройством свертываемости с оцениваемой частотой 1 случай на 500000 лиц в общей популяции (Acharya et al., J Thromb Haemost. 2004; 2248-56). Приобретенная недостаточность фактора FVII за счет ингибиторов также встречается очень редко. Сообщается о случаях недостаточности, возникающих в связи с лекарственными препаратами, например цефалоспоринами, пенициллинами и пероральными антикоагулянтами. Кроме того, сообщается о приобретенной недостаточности FVII, возникающей спонтанно или в сочетании с другими состояниями, например миеломой, сепсисом, апластической анемией, интерлейкином-2 и антитимоцитарной глобулиновой терапией.
Эталонные полинуклеотидные и полипептидные последовательности включают, например, последовательности номер доступа J02933 для геномной последовательности, М13232 для кДНК (Hagen и др., PNAS, 1986, 83: 2412-6) и Р08709 для полипептидной последовательности (полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Описаны различные полиморфизмы FVII, например, см. Sabater-Lleal et al. (Hum Genet. 2006; 118:741-51) (полностью включены в настоящее описание посредством ссылки).
Фактор IX.
FIX представляет собой витамин К-зависимый белок плазмы, участвующий во внутреннем пути свертывания крови путем преобразования FX в его активную форму в присутствии ионов кальция, фос-фолипидов и FVIIIa. Преобладающей каталитической способностью FIX является способность выступать в качестве сериновой протеазы со специфичностью к определенной связи аргинин-изолейцин в составе FX. Активация FIX происходит за счет FXIa, вызывающего удаление активационного пептида из FIX с получением активированной молекулы FIX, включающей две цепи, удерживаемые одной или более ди-сульфидными связями. Дефекты в FIX являются причиной рецессивной Х-сцепленной гемофилии В.
Гемофилия А и В являются наследственными заболеваниями, характеризующимися недостаточностью полипептидов FVIII и FIX соответственно. Основная причина недостаточности часто обусловлена мутациями в генах FVIII и FIX, оба из которых расположены на Х-хромосоме. Традиционная терапия гемофилии часто включает внутривенное введение объединенной плазмы или частично очищенных белков свертывания здоровых людей. Указанные препараты могут быть загрязнены патогенными агентами или вирусами, например инфекционными прионами, ВИЧ, парвовирусом, гепатитом А и гепатитом С. Таким образом, существует настоятельная необходимость в терапевтических средствах, не требующих использования сыворотки человека.
Уровень снижения активности FIX прямо пропорционален степени тяжести гемофилии В. Современное лечение гемофилии В состоит из замещения отсутствующего белка плазматическим или реком-бинантным FIX (так называемое замещение FIX, или заместительное лечение, или терапия).
Полинуклеотидные и полипептидные последовательности FIX находятся, например, в Uni-ProtKB/Swiss-Prot, номер доступа Р00740, и в патенте США № 6531298.
Фактор VIII.
Фактор свертывания крови VIII (FVIII) циркулирует в плазме в очень низкой концентрации и неко-валентно связан с фактором Виллебранда (ФВ). Во время гемостаза FVIII отделяется от ФВ и действует как кофактор активации FX, опосредованной активированным фактором IX (FIXa), увеличивая скорость
активации в присутствии кальция и фосфолипидов или клеточных мембран.
FVIII синтезируется в виде одноцепочечного предшественника массой приблизительно 270-330 кДа с доменной структурой А1-А2-В-A3-С1-С2. При выделении из плазмы (например, "полученный из плазмы" или "плазматический") фактор FVIII состоит из тяжелой цепи (А1-А2-В) и легкой цепи ^3-0^2). Молекулярная масса легкой цепи 80 кДа, в то время как в связи с протеолизом в пределах домена В масса тяжелой цепи находится в диапазоне 90-220 кДа.
FVIII также синтезируют в виде рекомбинантного белка для терапевтического применения при расстройствах свертываемости. Разработаны различные анализы in vitro для определения потенциальной эффективности рекомбинантного фактора FVIII (rFVIII) в качестве терапевтического средства. Указанные анализы имитируют действие эндогенного FVIII in vivo. Обработка фактора FVIII тромбином in vitro приводит к быстрому возрастанию и последующему снижению его прокоагулянтной активности согласно анализам in vitro. Указанная активация и инактивация совпадает со специфическим ограниченным протеолизом как тяжелой, так и легкой цепи, изменяющим доступность различных связывающих эпито-пов фактора FVIII, например, позволяющим фактору FVIII диссоциировать от ФВ и связываться с поверхностью фосфолипидов, или изменяющим связывающую способность по отношению к определенным моноклональным антителам.
Отсутствие или дисфункция фактора FVIII связаны с наиболее частым расстройством свертываемости - гемофилией А. Предпочтительным способом лечения гемофилии А является заместительная терапия производными плазмы или концентратами rFVIII. Больные с тяжелой формой гемофилии А с уровнем фактора FVIII ниже 1%, как правило, подвергаются профилактической терапии с целью сохранения уровня фактора FVIII выше 1% между получением доз. Принимая во внимание среднее время полужизни различных продуктов фактора FVIII в кровотоке, этот результат обычно может достигаться путем введения FVIII 2-3 раза в неделю.
Эталонные полинуклеотидные и полипептидные последовательности включают, например, Uni-ProtKB/Swiss-Prot Р00451 (FA8HUMAN); Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar G.H. et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312 (5992) :337-42 (1984); Thompson A.R. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003; 29:11-29 (2002).
Фактор Виллебранда.
Фактор Виллебранда (ФВ) является гликопротеином, циркулирующим в плазме в виде набора мультимеров, размер которых варьирует приблизительно от 500 до 20000 кДа. Мультимерные формы ФВ состоят из 250-кДа полипептидных субъединиц, соединенных дисульфидными связями. ФВ опосредует начальную адгезии тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда. Только крупные мульти-меры проявляют гемостатическую активность. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы ФВ, и формы ФВ, обладающие низкой молекулярной массой (низкомолекулярный ФВ), возникают в результате протеолитического расщепления. Мультимеры, обладающие большой молекулярной массой, хранятся в тельцах Вейбела-Паллада эндотелиальных клеток и высвобождаются после стимуляции.
ФВ синтезируется эндотелиальными клетками и мегакариоцитами в виде препро-ФВ, в значительной степени состоящего из повторяющихся доменов. После отщепления сигнального пептида про-ФВ димеризуется за счет дисульфидных связей в С-концевой области. Димеры служат протомерами для мультимеризации, обуславливаемой дисульфидными связями между свободными концами. После сборки мультимеров следует протеолитическое удаление пропептидной последовательности (Leyte et al., Bio-chem. J. 274 (1991), 257-261).
Первичный продукт трансляции, предсказанный на основе клонированной кДНК ФВ, является полипептидом-предшественником из 2813 остатков (препро-ФВ). Препро-ФВ состоит из 22-аминокислотного сигнального пептида и 741-аминокислотного пропептида, а зрелый ФВ включает 2050 аминокислот (Ruggeri Z.A. and Ware J., FASEB J., 308-316 (1993)).
Дефекты в ФВ являются причиной болезни Виллебранда (БВ), характеризующейся более или менее выраженными кровотечениями. БВ 3 типа является наиболее тяжелой формой, при которой ФВ полностью отсутствует, а БВ 1 типа относится к количественной потере ФВ, и ее фенотип может быть очень мягким. БВ 2 типа относится к качественным дефектам ФВ и может являться столь же тяжелой, как и БВ 3 типа. БВ 2 типа имеет множество субформ, причем некоторые из них связаны с утратой или снижением уровня высокомолекулярных мультимеров. Болезнь Виллебранда типа 2а (БВ-2А) характеризуется утратой как промежуточных, так и крупных мультимеров. БВ-2В характеризуется утратой высокомолекулярных мультимеров. В данной области техники известны другие заболевания и расстройства, связанные с
ФВ.
Полинуклеотидные и аминокислотные последовательности препро-ФВ доступны в GenBank под номерами доступа NM 000552 и NP 000543 соответственно.
В данной области техники, например, в Mann K.G., Thromb Haemost, 1999; 82:165-74, описаны другие белки свертывания крови согласно настоящему изобретению.
А. Полипептиды.
В одном аспекте исходным материалом по настоящему изобретению является белок или полипептид. Как описано в данном описании, термин "терапевтический белок" относится к любой молекуле терапевтического белка, проявляющей биологическую активность, ассоциированную с терапевтическим белком. В одном варианте осуществления изобретения молекулы терапевтического белка представляют собой полноразмерный белок.
Рассматриваются молекулы терапевтического белка, включающие полноразмерные белки, предшественники полноразмерных белков, биологически активные субъединицы или фрагменты полноразмерных белков, а также биологически активные производные и варианты любой из указанных форм терапевтических белков. Таким образом, терапевтические белки включают белки, которые (1) обладают аминокислотной последовательностью, характеризующейся более приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% или большей идентичностью аминокислотной последовательности в области, содержащей по меньшей мере приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400 или более аминокислот, полипептиду, кодируемому эталонной нуклеотидной или аминокислотной последовательностью, описанной в данном описании, и/или (2) специфически связываются с антителами, например поликлональными или моноклональными антителами, полученными против иммуногена, включающего эталонную аминокислотную последовательность, описанную в данном описании, его иммуногенного фрагмента и/или его консервативно модифицированного варианта.
В соответствии с настоящим изобретением термин "рекомбинантный терапевтический белок" включает любой терапевтический белок, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления указанный термин охватывает белки, описанные в данном описании.
Как используется в данном описании, "эндогенный терапевтический белок" включает терапевтический белок, происходящий от млекопитающего, предположительно являющегося получателем лечения. Указанный термин также включает терапевтический белок, транскрибируемый с трансгена или любой другой чужеродной ДНК, присутствующей в организме указанного млекопитающего. Как используется в данном описании, "экзогенный терапевтический белок" включает белок свертывания крови, не происходящий от млекопитающего, предположительно являющегося получателем лечения.
Как используется в данном описании, "белок свертывания крови плазматического происхождения" или "плазматический" включает все формы белка крови, полученные из млекопитающих, обладающие свойством участвовать в пути свертывания крови.
Как используется в данном описании, "биологически активное производное" или "биологически активный вариант" включает любое производное или вариант молекулы, обладающий практически такими же функциональными и/или биологическими свойствами, как и указанная молекула, например связывающими свойствами, и/или структурной основой, например пептидным каркасом или простейшей единицей полимера.
"Аналог", "вариант" или "производное" является соединением, в значительной степени аналогичным по структуре и аналогичным по биологической активности, хотя и в некоторых случаях до определенной степени отличающимся от природной молекулы. Например, вариант полипептида относится к полипептиду, обладающему общей в значительной степени аналогичной структурой и аналогичной биологической активностью по сравнению с эталонным полипептидом. Варианты или аналоги отличаются по составу аминокислотных последовательностей от природного полипептида, производным которого является аналог, за счет одной или более мутаций, включающих (1) делецию одного или более аминокислотных остатков на одном или более концах полипептида и/или в одной или более внутренних областях последовательности природного полипептида (например, фрагментах), (2) инсерцию или добавление одной или более аминокислот на одном или более концах (обычно "добавление" или "слияние") полипептида и/или в одной или нескольких внутренних областях (обычно "инсерция") последовательности природной полипептида или (3) замены одной или более аминокислот другими аминокислотами в последовательности природного полипептида. Например, "производное" относится к полипептиду, обладающему аналогичной или, по существу, аналогичной структурой по сравнению с эталонным полипептидом, который модифицировали, например, химически.
В различных вариантах осуществления сконструированы аналоги, варианты и производные с целью обеспечения, например, конъюгирования другой молекулы с аналогом, вариантом или производным белка, за счет чего образуется конъюгированный белок согласно настоящему изобретению.
Варианты или аналоги полипептидов включают варианты инсерций, в которых к аминокислотной последовательности терапевтического белка по изобретению добавляют один или более аминокислотных остатков. Инсерции могут располагаться на любом или обоих концах белка и/или во внутренних областях аминокислотной последовательности терапевтического белка. Варианты инсерции, содержащие дополнительные остатки на одном или обоих концах, включают, например, гибридные белки и белки, со
держащие аминокислотные маркеры или другие аминокислотные метки. В одном аспекте молекула белка свертывания крови необязательно содержит N-концевой Met, особенно если указанная молекула ре-комбинантно экспрессируется в бактериальной клетке, например Е. coli.
В вариантах делеций удаляют один или более аминокислотных остатков из полипептида терапевтического белка, как описано в данном описании. Делеции могут иметь место на одном или обоих концах полипептида терапевтического белка и/или сопровождаться удалением одного или более остатков в пределах аминокислотной последовательности терапевтического белка. Варианты делеций, таким образом, включают фрагменты полипептидной последовательности терапевтического белка.
В вариантах замен один или более аминокислотных остатков полипептида терапевтического белка удаляют и заменяют альтернативными остатками. В одном аспекте указанные замены являются консервативными по природе, и консервативные замены этого типа хорошо известны в данной области техники. Альтернативно, изобретение также охватывает замены, являющиеся неконсервативными. Примеры консервативных замен описаны в Lehninger [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77] и непосредственно приведены ниже.
Консервативные замены I
ХАРАКТЕРИСТИКИ БОКОВОЙ ЦЕПИ АМИНОКИСЛОТА
Неполярные (гидрофобные):
A. Алифатические A L I V Р
B. Ароматические F W
C. Серосодержащие М
D. Пограничные G Незаряженные полярные:
A. Гидроксильные STY
B. Амиды N Q
C. Сульфгидрильные С
D. Пограничные G
Положительно заряженные (основные) К R Н
Отрицательно заряженные (кислые) D Е
Альтернативно, иллюстративными консервативными заменами являются непосредственно приведенные ниже.
Консервативные замены II
В. Полинуклеотиды.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтический белок по изобретению, включают, но без ограничения, например, гены, пре-мРНК, мРНК, кДНК, полиморфные варианты, аллели, синтетические и природные мутанты.
Полинуклеотиды, кодирующие терапевтический белок по настоящему изобретению также включа
ют, но без ограничения, полинуклеотиды, которые (1) специфически гибридизуются в жестких условиях гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей эталонную аминокислотную последовательность, как описано в данном описании, и ее консервативно модифицированные варианты; (2) характеризуются нуклеотидной последовательностью, обладающей более чем приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более высокой идентичностью нуклеотидной последовательности в области, содержащей по меньшей мере приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 500, приблизительно 1000 или более нуклеотидов (вплоть до полноразмерной последовательности зрелого белка из 1218 нуклеотидов), эталонной нуклеотидной последовательности, как описано в данном описании. Примеры "жестких условий гибридизации" включают гибридизацию при 42°C в 50% формамиде, 5Х SSC, 20 мМ Na-PO4, pH 6,8 и отмывку в 1X SSC при 55°C в течение 30 мин. Следует понимать, что в зависимости от длины и содержания GC-нуклеотидов в гибридизуемых последовательностях можно модифицировать указанные примеры условий. Формулы, стандартно используемые в данной области техники, подходят для определения соответствующих условий гибридизации (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) §§
9.47-9.51).
"Природные" полинуклеотидные или полипептидные последовательности, как правило, получены от млекопитающего, включая примата, например человека; грызуна, например крысы, мыши, хомяка; коровы, свиньи, лошади, овцы или любого млекопитающего, но, не ограничиваясь ими. Нуклеиновые кислоты и белки по настоящему изобретению могут являться рекомбинантными молекулами (например, гетерологичными и кодирующими последовательность дикого типа или ее вариант или являться не встречающимися в природе).
С. Получение терапевтических белков.
Получение терапевтического белка включает любой способ, известный в данной области техники для (1) получения рекомбинантной ДНК с помощью генной инженерии, (2) внедрения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки, например, но без ограничений, трансфекцию, электропорацию или микроинъекцию, (3) культивирования указанных трансформированных клеток, (4) экспрессии терапевтического белка, например, конститутивно или при индукции, и (5) выделения указанного белка свертывания крови, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток, с целью получения очищенного терапевтического белка.
В других аспектах терапевтический белок получают путем экспрессии в подходящей прокариоти-ческой или эукариотической системе-хозяине, характеризующейся продукцией фармакологически приемлемой молекулы белка свертывания крови. Примерами эукариотических клеток являются клетки млекопитающих, например СНО, COS, HEK293, BHK, SK-Hep и HepG2.
Для получения терапевтического белка используют широкое разнообразие векторов, выбранных из эукариотических и прокариотических экспрессирующих векторов. Примеры векторов для экспрессии в прокариотах включают плазмиды, например, но без ограничения, pRSET, pET и pBAD, где промоторы, используемые в прокариотических экспрессирующих векторах, включают один или более, но без ограничения, lac, trc, trp, recA или araBAD. Примеры векторов для экспрессии в эукариотах включают (1) для экспрессии в дрожжах - такие векторы, как, но без ограничения, pAO, pPIC, pYES или рМЕТ, использующие такие промоторы, как, но без ограничения, AOX1, GAP, GAL1 или AUG1; (2) для экспрессии в клетках насекомых - такие векторы, как, но без ограничения, рМТ, рАс5, pIB, pMIB или рВАС, использующие такие промоторы, как, но без ограничения, РН, p10, МТ, Ас5, OpIE2, gp64 или polh, и (3) для экспрессии в клетках млекопитающих - такие векторы, как, но без ограничения, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 или pBPV, и векторы, происходящие в одном аспекте от вирусных систем, например, но без ограничения, вируса осповакцины, аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса или ретровирусов, использующие такие промоторы, как, но без ограничения, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и промотор р-актина.
В различных вариантах осуществления изобретения терапевтические белки модифицируют путем конъюгирования водорастворимых производных жирных кислот и водорастворимых линкеров с одним или более углеводов в составе терапевтического белка. Таким образом, в одном варианте осуществления терапевтическим белком является гликопротеин и выделен из клетки-хозяина, обеспечивающей гликози-лирование (т.е. белок гликозилирован in vivo, а затем выделен в виде гликопротеина). В различных вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой или нет гликопротеин и является глико-зилированным in vitro после выделения из клетки-хозяина. Способы гликозилирования in vitro хорошо известны в данной области техники (см., например, Meynial-Salles I and Combes D, Journal of Biotechnology 1996, 46:1-14;/ Sola R.J. and Griebenow K., BioDrugs 2010, 24:9-21). Конечно, специалист в данной области техники может (1) очистить терапевтический белок, (2) модифицировать терапевтический белок с целью обеспечения, необязательно, сайт-специфического гликозилирования in vitro (например, путем делеции/инсерции/замены аминокислот), а также (3) гликозилировать модифицированный белок in vitro в соответствии с методиками, известными в данной области техники.
D. Введение
В одном варианте осуществления конъюгированный терапевтический белок по настоящему изобретению можно вводить путем инъекции, например внутривенной, внутримышечной или внутрибрюшин-ной инъекции.
Для введения композиций, содержащих конъюгированный терапевтический белок по настоящему изобретению, человеку или экспериментальным животным композиции в одном аспекте содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей. Термины "фармацевтически" или "фармакологически приемлемый" относятся к молекулярным структурам и композициям, которые являются стабильными, ингибируют разрушение белков, такое как агрегация и расщепление продуктов, и, кроме того, не вызывают аллергических или других побочных реакций при введении посредством путей, хорошо известных в данной области техники, как описано ниже. "Фармацевтически приемлемые носители" включают любые клинически пригодные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., включая агенты, описанные выше.
Как используется в данном описании, термин "эффективное количество" включает дозы, пригодные для лечения заболевания или расстройства, или облегчения симптомов заболевания или расстройства. В одном варианте осуществления "эффективное количество" включает дозу, пригодную для лечения млекопитающего, страдающего нарушением свертываемости крови, как описано в данном описании.
Композиции можно вводить перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляции, вагинально, ректально или путем внутричерепной инъекции. Термин "парентеральный", как используется в данном описании, включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, интрацистер-нальную инъекцию или методики вливания. Наряду с этим рассматривается введение путем внутривенной, внутридермальной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретро-бульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в определенной области. Как правило, композиции практически не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.
Однократное или многократные введения композиций можно осуществлять, используя уровень дозы и схемы, выбираемые лечащим врачом. Дозировка, соответствующая профилактике или лечению заболевания, зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, как описано выше, тяжести и течения заболевания, введения лекарственного средства в профилактических или терапевтических целях, предыдущей терапии, истории болезни пациента и его реакции на лекарственное средство и решения лечащего врача.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество конъюгированного терапевтического белка, как определено в данном описании. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, соль, буфер или эксципиент. Фармацевтическую композицию можно использовать для лечения определенных выше расстройств свертываемости крови. Фармацевтическая композиция по изобретению может представлять собой раствор или лиофилизированный продукт. Растворы фармацевтической композиции можно подвергать любому подходящему процессу лиофилизации. В дополнительном аспекте изобретение включает наборы, включающие композицию по изобретению, упакованную таким образом, который облегчает ее использование для введения субъектам. В одном варианте осуществления такой набор включает соединение или композицию, описанную в данном описании (например, композицию, содержащую конъюгированный терапевтический белок), упакованную в контейнер, например герметичную бутыль или сосуд, с этикеткой, прикрепленной к контейнеру или включенной в упаковку, описывающей применение соединения или композиции при практической реализации способа. В одном варианте осуществления набор содержит первый контейнер, содержащий композицию, содержащую конъю-гированный терапевтический белок, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый раствор для восстановления композиции, содержащейся в первом контейнере. В одном аспекте соединение или композиция упакована в виде дозированной формы. Указанный набор может дополнительно включать устройство, пригодное для введения композиции в соответствии с определенным способом введения. Предпочтительно набор содержит этикетку, описывающую использование композиции терапевтического белка или пептида.
Жирные кислоты, производные жирных кислот и конъюгаты белок-производное жирной кислоты.
В одном аспекте молекула-производное терапевтического белка (т.е. конъюгированный терапевтический белок), представленная в данном описании, связана с водорастворимым производным жирной кислоты. Как используется в данном описании, "водорастворимое производное жирной кислоты" включает жирную кислоту (т.е. карбоновую кислоту), конъюгированную с водорастворимым линкером (например, аминооксилинкером), как описано в данном описании. Такие производные жирных кислот согласно изобретению являются стабильными (т.е. не отсоединяются от белка), водорастворимыми и способными связываться с сывороточным альбумином человека.
А. Жирные кислоты.
Жирные кислоты (т.е. ЖК) включают насыщенные жирные кислоты, ненасыщенные жирные кисло
ты, жирные кислоты с разветвленной цепью (Mukheriji et al., Prog Lipid Res 2003; 42:359-76) и их производные, способные связывать сывороточный альбумин человека в соответствии с настоящим изобретением, но не ограничиваются ими.
В качестве примера жирные кислоты имеют следующую общую структуру:
насыщенные ЖК: общая структура
H3C^PI^0H о
этиловый эфир насыщенной ЖК: общая структура
метиловый эфир насыщенной ЖК: общая структура
Жирные кислоты в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения также включают различные альтернативные структуры (например, метиловый или этиловый эфиры) или другие структуры, например структуры, содержащие концевые группы в со-положении (например, гид-роксильные, амино-, тио- и карбоксильные группы).
В одном варианте осуществления жирная кислота является природной жирной кислотой. В различных вариантах осуществления жирной кислотой является короткоцепочечная жирная кислота (например, содержащая менее шести атомов углерода), среднецепочечная жирная кислота (например, содержащая 612 атомов углерода), длинноцепочечная жирная кислота (например, содержащей более 12 атомов углерода) или жирная кислота с очень длинной цепью (например, содержащая более 22 атомов углерода). В еще одном варианте осуществления жирная кислота содержит от 4 до 28 атомов углерода. В одном варианте осуществления жирная кислота находится в цис-конфигурации. В еще одном варианте осуществления жирная кислота находится в трансконфигурации.
В одном варианте осуществления жирной кислотой является насыщенная жирная кислота длиной от 12 до 20 атомов углерода. В данной области техники известны такие жирные кислоты, например С12 (додекановая кислота, лауриновая кислота), С14 (тетрадекановая кислота, миристиновая кислота), С16 (гексадекановая кислота, пальмитиновая кислота), С18 (октадекановая кислота, стеариновая кислота) и С20 (эйкозановая кислота, арахидиновая кислота). Примерами ненасыщенных жирных кислот являются миристолеиновая кислота (С14:1), пальмитолеиновая кислота (С16:1), олеиновая кислота (С18:1), лино-левая кислота (С18:2) и арахидоновая кислота (С20:4). Большинство жирных кислот коммерчески доступны и могут быть получены с помощью различных химических способов (Recent Developments in the Synthesis of Fatty Acid Derivatives, Editors: Knothe G. and Derksen J.T.B., AOCS Press 1999, ISBN 1-89399700-6).
В различных вариантах осуществления настоящего изобретения жирная кислота включает 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 или 50 атомов углерода. В. Производные жирных кислот.
Настоящее изобретение обеспечивает получение нового класса активированных производных жирных кислот (производных ЖК), способных связывать сывороточный альбумин человека. Производные ЖК содержат водорастворимый спейсер или линкер, обеспечивающий манипуляции с производными ЖК в водном растворе (т.е. производные жирных кислот согласно настоящему изобретению являются водорастворимыми, в отличие от соответствующих жирных кислот, от которых они происходят). В одном варианте осуществления производные ЖК содержат активную аминооксигруппу, обеспечивающую присоединение производного ЖК к окисленной углеводной группе (преимущественно N-гликанам) терапевтических белков с образованием стабильных оксимных связей. Как используется в данном описании, "стабильная" связь означает, что образуется ковалентная связь, являющаяся "неотсоединяемой" или не-гидролизуемой.
Химическая модификация через углеводы может являться предпочтительным вариантом для коагулирующих белков, например FVIII, FIX и FVIIa, с целью образования конъюгатов с высокой остаточной активностью.
Например, но без ограничения, следующая стратегия представляет собой один вариант осуществления согласно настоящему изобретению для получения водорастворимого производного ЖК, содержащего активную аминооксигруппу.
Стратегия 1.
со-Гидроксигруппу производного ЖК (например, 16-гидроксигексадекановой кислоты) подвергают окислению периодинаном Десса-Мартина с целью получения альдегидной группы. На следующей стадии к указанной альдегидной группе присоединяют диаминооксилинкер, содержащий цепь водорастворимого ПЭГ (например, 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамин), с образованием стабильной оксимной
связи. Следующая схема представляет собой один пример согласно стратегии 1: Стадия 1.
16-гидроксистеариновую кислоту селективно окисляют реагентом Десса-Мартина с получением 16-оксостеариновой кислоты. Неочищенный продукт очищают хроматографией, используя силикагель в качестве разделяющего агента
Стадия 2.
16-оксогруппу натриевой соли 16-оксостеариновой кислоты подвергают взаимодействию с 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамином. Неочищенный продукт очищают хроматографией, используя сили-кагель в качестве разделяющего агента
В качестве еще одного альтернативного варианта осуществления используют следующую стратегию для получения водорастворимых производных ЖК, содержащих активную аминооксогруппу. Стратегия 2.
Карбоксильную группу со-гидроксижирной кислоты (например, 16-гидроксигексадекановой кислоты) этерифицируют ацетилхлоридом. со-гидроксигруппу указанного метилэфирного производного активируют мезилхлоридом с целью внедрения лучшей уходящей группы. Затем указанную мезимную группу подвергают взаимодействию с диаминооксилинкером, содержащим цепь водорастворимого ПЭГ (например, 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамин), с образованием стабильной аминооксиметиленовой связи. Необязательно указанный метиловый эфир можно гидролизовать в щелочном растворе с образованием свободной карбоксильной группы. Следующая схема представляет собой один пример согласно стратегии 2:
Стадия 1.
Ацетилхлорид
Карбоксильную группу 16-гидроксигексадекановой кислоты блокируют путем образования метилового эфира, используя ацетилхлорид в качестве метилирующего реагента
Стадия 2.
16-гидроксигруппу метилового эфира 16-гидроксигексадекановой кислоты активируют путем мещения гидроксильной группы мезилом, являющимся лучшей уходящей группой
за-
Стадия 3.
16-мезильную группу метилового эфира 16-метилсульфонилгексадекановой кислоты замещают одной аминооксигруппой бифункционального 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина. Неочищенный продукт очищают хроматографией, используя силикагель в качестве разделяющего агента
Настоящее изобретение также рассматривает дополнительные стратегии. Настоящее изобретение, например, не ограничивается аминооксихимией для присоединения к альдегидным группам окисленных углеводных остатков. Как описано в данном описании, также рассматривается использование других химических способов, включающих гидразиды для присоединения к альдегидным группам, NHS-эфиры
для присоединения к аминогруппам и малеимиды для присоединения к свободным SH-группам терапевтических белков, но, не ограничиваясь ими.
Например, метиловый эфир жирной кислоты, полученный, как описано выше, подвергают взаимодействию с коммерчески доступной MAL-ПЭГ-СООН (mal-ron^-COOH/IRIS Biotech GmbH, Марк-тредвиц, Германия), как описано в данном описании. В рамках еще одного примера сложный эфир жирной кислоты с реакционноспособной аминогруппой подвергают взаимодействию с коммерчески доступным №К-ПЭГ-№К (NHS-dPEG(4)-NHS/IRIS Biotech GmbH, Марктредвиц, Германия), как описано в данном описании.
Водорастворимые линкеры включают водорастворимые полимеры (например, ПЭГ), но не ограничиваются ими. Линкер может состоять из любой химической структуры, содержащей одну или более функциональных групп, повышающих его растворимость в воде. Указанные функциональные группы могут обладать способностью образовывать отрицательный или положительный заряд, тем самым придавая линкеру растворимость в воде. В одном варианте осуществления указанная функциональная группа включает сульфо- или карбоксильную группу, но не ограничивается ими. Кроме того, можно использовать любую полярную функциональную группу, повышающую растворимость линкера в воде. Примерами являются гидроксильная, амино-, амидо-, малеимидо-, аминоокси- и гидразидная группы, а также сложные эфиры N-гидроксисукцинимида (NHS) и сульфо-№г!Б-эфиры.
В различных вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полиэтиленгликоль (ПЭГ), разветвленный ПЭГ, полисиаловую кислоту (PSA), гидроксиалкилкрахмал (HAS), гидроксиэтил-крахмал (HES), углевод, полисахариды, пуллулан, хитозан, гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматансульфат, крахмал, декстран, карбоксиметилдекстран, полиалкиленоксид (ПАО), полиалкиленг-ликоль (ПАГ), полипропиленгликоль (ППГ), полиоксазолин, полиакрилоилморфолин, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, полифосфазен, полиоксазолин, сополимер полиэтилена и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер полистирола и ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформальдегид) (PHF) и 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфат (МРС), но не ограничивается ими.
В одном варианте осуществления водорастворимым полимером является ПЭГ. В различных вариантах осуществления изобретения водорастворимый полимер включает цепь длиной приблизительно от 3 до 25 атомов кислорода. Например, в различных вариантах осуществления согласно настоящему изобретению водорастворимый полимер включает 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 или 25 атомов кислорода.
С. Конъюгаты белок-производные жирных кислот.
Системы аминооксилинкеров (т.е. системы, в которых водорастворимое производное жирной кислоты содержит аминооксилинкер) рассматриваются в настоящем изобретении. Например, в одном варианте осуществления изобретения для получения белковых конъюгатов используют взаимодействие гид-роксиламина или производных гидроксиламина с альдегидами (например, в составе углеводной группы после окисления периодатом натрия) с целью образования оксимной группы. Например, гликопротеин (например, терапевтический белок в соответствии с настоящим изобретением) сначала окисляют окислителем, например периодатом натрия (NaIO4) (Rothfus J.A. et Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; и Van Lenten L and Ashwell G., J Biol Chem 1971, 246, 1889-94). Окисление гликопротеинов периодатом основано на классической реакции Malaprade, описанной в 1928 г., окислении вицинальных диолов пе-риодатом с образованием активной альдегидной группы (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). Дополнительными примерами таких окислителей являются тетраацетат свинца (Pb(OAc)4), ацетат марганца (MnO^b), ацетат кобальта (0)(ОАс)2), ацетат таллия (TlOAc), сульфат церия (Ce(SO4)2) (США № 4367309) или перрутенат калия (KRuO4) (Marko et al., J Am Chem Soc 1997, 119, 12661-2). Под термином "окислитель" подразумевают слабое окисляющее соединение, способное окислять вицинальные диолы в углеводах, тем самым образуя активные альдегидные группы в условиях физиологической реакции.
Второй стадией является присоединение полимера (например, производного жирной кислоты), содержащего аминооксигруппу, к окисленной углеводной группе с образованием оксимной связи. В одном варианте осуществления изобретения данную стадию можно осуществить в присутствии каталитических количеств нуклеофильного катализатора анилина или производного анилина (Dirksen A. et Dawson Р.Е., Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y. et al., Nature Methods 2009; 6:207-9). Анилиновый катализ значительно ускоряет лигирование оксима, позволяя использовать очень низкие концентрации реагентов. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения оксимную связь стабилизируют восстановлением с NaCNBH3 с образованием алкоксиаминной связи. Дополнительные катализаторы описаны ниже. В еще одном варианте осуществления данную стадию осуществляют в присутствии м-толуидина.
В одном варианте осуществления изобретения стадии реакций с целью присоединения водорастворимого линкера (например, производного жирной кислоты) к белку осуществляют раздельно и последовательно (т.е. исходные материалы (например, терапевтические белки, водорастворимый линкер и т.д.), реагенты (например, окислители, анилин и т.д.) и продукты реакции (например, окисленный углевод в составе терапевтического белка, активированный водорастворимый аминооксилинкер и т.д.) разделяют
между отдельными стадиями реакции). В еще одном варианте осуществления исходные материалы и реагенты, необходимые для завершения реакции конъюгирования по настоящему изобретению, осуществляют в одном сосуде. В одном варианте осуществления нативный белок смешивают с аминооксиполи-мерным реагентом. Затем добавляют окислитель и выполняют реакцию конъюгирования.
Дополнительную информацию об аминоокситехнологии можно найти в следующих ссылках, каждая из которых полностью включена: ЕР 1681303 А1 (HAS илированный эритропротеин); WO 2005/014024 (конъюгаты полимера и белка, соединенные оксимной линкерной группой); WO 96/40662 (аминооксисодержащие линкерные соединения и из применение в конъюгатах); WO 2008/025856 (модифицированные белки); Peri F. et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J. and Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A. et al., Vaccine 2006, 24(6), 716-29 и Heredia K.L. et al., Macromolecules 2007, 40(14), 4772-9.
Присоединение водорастворимого линкера можно осуществить путем непосредственного присоединения к белку, например, через свободную сульфгидрильную группу или свободную аминогруппу в составе белка или через линкерную молекулу, описанную в данном описании. В одном аспекте конъюги-рование выполняют путем прямого присоединения (или присоединение с помощью линкерных систем) водорастворимого линкера к терапевтическому белку с образованием стабильных связей.
Так в различных вариантах осуществления изобретения разработаны производные жирных кислот, описанные в данном описании, с целью обеспечения конъюгирования с терапевтическим белком. Например, разработаны производные жирных кислот, включающие различные концевые реакционноспо-собные группы, как описано в данном описании.
В некоторых аспектах терапевтический белок конъюгируют с водорастворимым производным жирной кислоты с помощью любого из разнообразных химических способов (Roberts J.M. et al., Advan Drug Delivery Rev 2002; 54:459-76). Например, в одном варианте осуществления терапевтический белок модифицируют путем конъюгирования производных жирных кислот со свободными аминогруппами белка с использованием сложных эфиров N-гидроксисукцинимида (NHS). В еще одном варианте осуществления водорастворимое производное жирной кислоты присоединяют к свободным SH-группам, используя химические способы на основе малеимида. В еще одном варианте осуществления водорастворимое производное жирной кислоты присоединяют путем использования взаимодействия с гидразидом или аминоок-сигруппой к углеводным группам терапевтического белка после предварительного окисления.
В одном варианте осуществления изобретения терапевтический белок модифицируют по остаткам лизина путем использования водорастворимых производных жирных кислот, содержащих активный сложный эфир N-гидроксисукцинимида (NHS). Указанное производное подвергают взаимодействию с остатками лизина терапевтического белка в мягких условиях, образуя стабильную амидную связь.
В еще одном варианте осуществления изобретения рассматривается присоединение через пептидную связь между карбоксильной группой в составе белка или производного жирной кислоты и аминогруппой белка или производного жирной кислоты или сложноэфирную связь между карбоксильной группой белка или производного жирной кислоты и гидроксильной группой терапевтического белка или производного жирной кислоты. Еще одна связь, с помощью которой терапевтический белок ковалентно связывается с производным жирной кислоты, является связь через основание Шиффа, например между свободной аминогруппой в составе белка, подвергаемой взаимодействию с альдегидной группой, образованной на конце жирной кислоты. Полученное основание Шиффа в одном аспекте стабилизируют путем специфического восстановления с помощью NaCNBH3 с образованием вторичного амина. Альтернативным подходом является создание концевых свободных аминогрупп в составе производного жирной кислоты путем восстановительного аминирования с помощью NH4Cl после предварительного окисления. Для соединения двух аминогрупп или двух гидроксильных групп можно использовать бифункциональные реагенты. Например, производное жирной кислоты, содержащее аминогруппу, присоединяют к аминогруппам белков с помощью таких реагентов, как BS3 (бис-(сульфосукцинимидил)суберат/Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс, США). Кроме того, используют гетеробифункциональные перекрестно сшивающие реагенты, например сульфо-EMCS ^-е-малеимидка1фоилокси)сульфосукцинимидный эфир/Pierce), например, для связи аминных и тиольных групп.
В рамках еще одного подхода получают производное жирной кислоты с активной гидразидной группой и присоединяют его к углеводной группе белка после предварительного окисления и получения альдегидных функциональных групп.
Как описано выше, свободная аминогруппа терапевтического белка вступает во взаимодействие с 1-карбоксильной группой производного жирной кислоты с образованием пептидильной связи, или между 1-карбоксильной группой и гидроксильной или другой подходящей активной группой в составе белка образуется сложноэфирная связь.
В различных вариантах осуществления терапевтический белок связан или ассоциирован с производным жирной кислоты в стехиометрических количествах (например, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10 и т.д.). В различных вариантах осуществления к белку присоединены 1-6, 7-12 или 13-20 производных жирных кислот. В других вариантах осуществления к белку присоединены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более производных жирных кислот.
В различных вариантах осуществления терапевтический белок модифицирован с целью внедрения сайтов гликозилирования (т.е. сайтов, отличающихся от нативных сайтов гликозилирования). Такую модификацию можно осуществить, используя стандартные молекулярно-биологические методики, известные в данной области техники. Кроме того, терапевтические белки до конъюгирования с водорастворимым линкером через один или более углеводных остатков можно гликозилировать in vivo или in vitro. Указанные сайты гликозилирования могут служить в качестве мишеней для конъюгирования белков с водорастворимыми линкерами (патентные заявки США №№ 20090028822, 2009/0093399, 2009/0081188, 2007/0254836, 2006/0111279 и DeFrees S. et al., Glycobiology, 2006, 16, 9, 833-43).
В одном варианте осуществления конъюгированный белок сохраняет полную функциональную активность нативных терапевтических белковых продуктов и обеспечивает увеличенное время полужизни in vivo по сравнению с нативными терапевтическими белковыми продуктами. В еще одном варианте осуществления конъюгированный белок сохраняет по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140 или 150% биологической активности по сравнению с нативным белком.
В родственном аспекте биологическую активность конъюгированного белка и нативного белка свертывания крови определяют по соотношениям хромогенной активности и антигенного значения фактора свертывания крови (фактор свертывания кров^Ошфактор свертывания крови:Ag).
В еще одном варианте осуществления изобретения время полужизни конъюгированного белка уменьшается или увеличивается в 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению со временем полужизни нативного терапевтического белка in vivo.
Нуклеофильные катализаторы.
Как описано в данном описании, конъюгирование водорастворимых производных жирных кислот с терапевтическими белками можно катализировать анилином. Анилин является сильным катализатором водных реакций альдегидов и кетонов с аминами с образованием стабильных иминов, например гидра-зонов и оксимов. На следующей диаграмме приведено сравнение некатализируемой и анилин-катализируемой реакции оксимного лигирования (по материалам Kohler J.J., ChemBioChem 2009; 10:2147-50):
В то же время, учитывая многочисленные риски для здоровья, связанные с анилином, желательны альтернативные катализаторы. Настоящее изобретение обеспечивает производные анилина в качестве альтернативных катализаторов оксимного лигирования. Такие производные анилина включают о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфаниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и п-анизидин, но, не ограничиваясь ими. На следующей диаграмме приведено сравнение некатализируемой и м-толуидин-катализируемой реакции оксимного лигирования (PCT/US 2011/45873):
В одном варианте осуществления изобретения для катализа реакций конъюгирования, описанных в данном описании, используют м-толуидин (также известный как метатолуидин, метаметиланилин, 3-метиланилин или 3-амино-1-метилбензол). М-толуидин и анилин обладают сходными физическими свойствами и, по существу, одинаковым значением рКа (м-толуидин: рКа 4,73, анилин: рКа 4,63).
Нуклеофильные катализаторы по изобретению можно использовать для оксимного лигирования (например, используя аминоокси-связь) или образования гидразона (например, используя гидразидные реакции). В различных вариантах осуществления изобретения нуклеофильный катализатор вводят в реакцию конъюгирования в концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В одном варианте осуществления нуклеофильный катализатор представлен в концентрации от 1 до 10 мМ. В различных вариантах осуществления изобретения диапазон рН реакции конъюгирования составляет от 4,0 до 7,0, от 4,5 до 7,0, от 5,0 до 6,5, от 5,0 до 6,5. В различных вариантах осуществления рН реакции конъюгирования составляет 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 и 7,5. В одном варианте осуществления рН составляет от 5,5 до 6,5.
Очистка конъюгированных белков.
В различных вариантах осуществления желательна очистка белков, инкубированных с окислите-
лем, и/или терапевтического белка, конъюгированного с водорастворимым производным жирной кисло-
ты согласно изобретению. В данной области техники известны многочисленные методики очистки, включающие, но без ограничения, хроматографические способы, способы фильтрации и способы осаждения (см., например, Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology, vol 463 (edited by Burgess R.R. and Deutscher M.P.), 2nd edition, Academic Press 2009).
Следующие примеры не предназначены для ограничения и являются только примерами конкретных
вариантов осуществления изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение гомобифункционального линкера NH2[ОСН2СН2]2ONH2. Гомобифункциональный линкер NH2[OCH2CH2]2ONH2
3-Оксапентан-1,5-диоксиамин, содержащий две активные аминооксигруппы, синтезировали в соответствии с Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) в двустадийной органической реакции, используя модифицированный синтез первичных аминов по Gabriel (фиг. 1). На первой стадии одну молекулу 2,2-дихлордиэтилового эфира подвергали взаимодействию с двумя молекулами эндо-№гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в ДМФ. Желаемый гомобифункциональный продукт получали из полу-
ченного промежуточного соединения путем гидразинолиза в этаноле.
3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамин, содержащий две активные аминооксигруппы, синтезировали в соответствии с Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) в двустадийной органической реакции, используя модифицированный синтез первичных аминов по Gabriel. На первой стадии одну молекулу дихлорида гексаэтиленгликоля подвергали взаимодействию с двумя молекулами эндо-N
гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в ДМФ. Желаемый гомобифункциональный продукт получали из полученного промежуточного соединения путем гидразинолиза в этаноле. Пример 3 Получение гомобифункционального линкера NH2[OCH2CH2]40NH2
/О, /\ /\ .О. /\ /\ .О. /\ .о^
H2N О О О NH2
Гомобифункциональный линкер NH2[OCH2CH2]4ONH2 (3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, синтезировали в соответствии с Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) в двустадийной органической реакции, используя модифицированный синтез первичных аминов по Gabriel: На первой стадии одну молекулу бис-(2-(2-хлорэтокси)этилового) эфира подвергали взаимодействию с двумя молекулами эндо-^гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в ДМФ. Конечный гомобифункциональный продукт получали из полученного промежуточного соединения путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 4. Получение натриевой соли 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)-гексадекановой кислоты.
Жирно-кислотный аминооксилинкер натриевую соль 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)это-кси)этоксиимино)гексадекановой кислоты синтезировали в соответствии с Halligan and Nair (Arkivoc 2006 (ii) 101-106) и Hubbs and Heathcock (J Am Chem Soc, 2003; 125:12836-43) в двустадийной реакции.
Промежуточное соединение 1. Натриевая соль 16-оксогексадекановой кислоты
Na+ СГ^М^О
К охлажденному раствору (0°C) 16-гидроксигексадекановой кислоты (800 мг, 2,9 ммоль) в дихлор-метане (10 мл) и тетрагидрофуране (20 мл) добавляли периодинан Десса-Мартина (1636 мг, 3,7 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали в течение 3,5 ч при температуре 0°C и 2,5 ч при комнатной температуре в атмосфере Ar. Затем добавляли 15%-ный раствор тиосульфата натрия в насыщенном растворе бикарбоната натрия, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Промежуточное соединение 1 экстрагировали диэтиловым эфиром, после сушки над сульфатом натрия органический слой выпаривали досуха и очищали колоночной хроматографией, используя силикагель в качестве разделяющего агента и смесь растворителей толуол/этилацетат. Выход: 34% (белое твердое вещество).
Продукт: натриевая соль 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)-гексадекановой кислоты
К раствору 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина (146 мг, 0,65 ммоль) в безводном тетрагидро-фуране (3 мл) добавляли промежуточное соединение 1 (19,1 мг, 0,07 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре в атмосфере Ar. Затем смесь выпаривали досуха и очищали колоночной хроматографией, используя силикагель в качестве разделяющего агента и смесь растворителей дихлорметан/метанол/основание Хунига. Выход: 71% (белое твердое вещество).
Масс-спектрометрия (ESI): m/z=477,3529 для [М+2Н]+
Пример 5. Получение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)-этоксиамино)гексадекановой кислоты.
Аминооксилинкер на основе метилового эфира жирной кислоты 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты синтезировали в соответствии с Hang et al. (J Am Chem Soc 2007; 129:2744-5) в трехстадийной реакции.
Промежуточное соединение 1. Метиловый эфир 16-гидроксигексадекановой кислоты
К охлажденному (0°C) раствору 16-гидроксигексадекановой кислоты (3000 мг, 10,79 ммоль) в безводном метаноле (27 мл) по каплям добавляли ацетилхлорид (3,837 мл, 53,96 ммоль) при 0°C в течение 2 мин, затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 ч в атмосфере Ar. Затем смесь выпаривали досуха, остаток растворяли в дихлорметане (100 мл), промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (2x50 мл) и насыщенным раствором NaCl (1x50 мл). После сушки над сульфатом натрия собранный органический слой выпаривали досуха и сушили в вакууме при комнатной температуре. Выход: 92% (белое твердое вещество).
Промежуточное соединение 2. Метиловый эфир 16-метилсульфонилгексадекановой кислоты
К охлажденному раствору (0°C) промежуточного соединения 1 (2807 мг, 9,80 ммоль) в дихлормета-не (40 мл) добавляли триэтиламин (1,502 мл, 10,78 ммоль), затем по каплям добавляли предварительно
охлажденный раствор (0°C) мезилхлорида (0,834 мл, 10,78 ммоль) в дихлорметане (5 мл) в течение 10 мин при 0°C. Смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°C и в течение 2,75 ч при комнатной температуре. Затем смесь разбавляли дихлорметаном (150 мл), промывали водой (1x100 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл) и насыщенным раствором NaCl (1x100 мл). После сушки над сульфатом натрия собранный органический слой выпаривали досуха и сушили в вакууме при комнатной температуре. Выход: 95% (бело-бледно-желтое твердое вещество).
Продукт: метиловый эфир 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)-гексадекановой кислоты
К раствору 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина (517 мг, 2,30 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (22 мл) по каплям добавляли раствор промежуточного соединения 2 (70 мг, 0,19 ммоль) в безводном ^№диметилформамиде (7 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере Ar; смесь перемешивали в течение 2 дней при различных температурах (комнатной температуре, 50°C, 80°C) до завершения реакции. Затем смесь выпаривали досуха, неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией, используя силикагель в качестве разделяющего агента и смесь растворителей ди-хлорметан/метанол. Выход: 31% (бесцветное частично затвердевшее белое масло).
Масс-спектрометрия (ESI): m/z=493,3824 для [М+Н]+.
Пример 6. Присоединение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)-этоксиамино)гексадекановой кислоты к углеводной группе фактора свертывания VIII.
ЖК-rFVIII получали, используя двустадийную методику. На первой стадии rFVIII окисляли NaIO4 и очищали анионообменной хроматографией (АОХ). Затем окисленный rFVIII модифицировали ЖК-аминоксиреагентом.
rFVIII (45 мг исходного материала) окисляли NaIO4 (конечная концентрация 200 мкМ). После инкубирования в течение 30 мин (22°C) реакцию окисления останавливали добавлением 1М водного раствора L-цистеина (конечная концентрация: 10 мМ). Окисленный rFVIII очищали анионообменной хроматографией на EMD ТМАЕ(М). Затем 25 мкл 10% (мас./об.) раствора метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты (полученного в соответствии с примером 3) в ДМСО добавляли к элюату (концентрация белка 2 мг/мл) и осуществляли реакцию сочетания в течение 18 ч при 4°C. Затем конъюгат ЖК-rFVIII дополнительно очищали гидрофобной хроматографией на фенилсефарозе 4 FF. Наконец, элюат концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией, используя 30-кДа мембрану (MILLIPORE).
Пример 7. Присоединение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)-этоксиамино)гексадекановой кислоты к углеводной группе фактора свертывания IX.
10 мг rFIX растворяли в реакционном буфере (20 мМ L-гистидина, 5 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl, pH 6,0) до конечной концентрации 2,5 мг/мл. К полученному раствору добавляли 5 мМ водный раствор NaIO4 с получением конечной концентрации 100 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 4°C при осторожном перемешивании в темноте. Затем смесь загружали в предварительно уравновешенные колонки для обессоливания PD-10 для удаления избытка NaIO4. К указанной смеси добавляли 8 мкл 10% (мас./об.) раствора метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)это-ксиамино)гексадекановой кислоты (полученного согласно примеру 3) в ДМСО и осуществляли реакцию сочетания при рН 6,0 в течение 18 ч при 4°C. Затем конъюгат дополнительно очищали ионообменной хроматографией на Q-сефарозе FF. Наконец, элюат концентрировали ультрафильтраци-ей/диафильтрацией, используя устройства Vivaspin.
Пример 8. Присоединение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)-этоксиамино)гексадекановой кислоты к углеводной группе фактора свертывания VIIa.
10 мг rFVIIa растворяли в реакционном буфере ((50 мМ Hepes, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) с получением конечной концентрации 2,0 мг/мл. К полученному раствору добавляли 5 мМ водный раствор NaIO4 с получением конечной концентрации 50 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 4°C при осторожном перемешивании в темноте. Затем смесь загружали в предварительно уравновешенные колонки для обессоливания PD-10 для удаления избытка NaIO4. К указанной смеси добавляли 8 мкл 10% (мас./об.) раствора метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты (полученного согласно примеру 3) в ДМСО и осуществляли реакцию сочетания при рН 6,0 в течение 18 ч при 4°C. Затем конъюгат дополнительно очищали ионообменной хроматографией на Q-сефарозе FF. Наконец, элюат концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией, используя устройства Vivaspin.
Пример 9. Присоединение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)-этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты к углеводной группе фактора свертывания VIII.
10 мг rFVIII растворяли в Hepes-буфере (50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) с получением концентрации белка 2 мг/мл. Затем к раствору FVIII добавляли 10 мкл 10% (мас./об.) раствора метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой ки
слоты (полученного в соответствии с примером 3) в ДМСО. Затем получали водный раствор нуклео-фильного катализатора м-толуидина (50 мМ) и добавляли его к смеси в течение 15 мин с получением конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляли 40 мМ водный раствор периодата натрия с получением концентрации 400 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 120 мин в темноте при температуре 22°C при осторожном перемешивании.
Затем реакцию останавливали добавлением водного раствора L- цистеина (1М) с получением конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубированием в течение 60 мин. Затем реакционную смесь загружали в ионообменную колонку, заполненную Q-сефарозой FF (1,6x8 см). Колонку промывали уравновешивающим буфером (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4) в количестве 20 об. колонки и элюировали конъюгат ЖК-rFVIII буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 0,5М NaCl, рН 7,4). Наконец, продукт подвергали ультрафильтрации/диафильтрации на устройствах Vivaspin, используя Hepes-буфер, 7,4 (20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,4) в качестве буфера для диафильтрации.
Пример 10. Присоединение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)-этоксиамино)гексадекановой кислоты к углеводной группе фактора свертывания IX.
7 мг rFIX растворяли в His-буфере (20 мМ His, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,0) с получением концентрации белка 2 мг/мл. Затем к раствору FIX добавляли 7 мкл 10% (мас./об.) раствора метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты (полученного в соответствии с примером 3) в ДМСО. Затем получали водный раствор нуклеофильного катализатора м-толуидина (50 мМ) и добавляли его к смеси в течение 15 мин с получением конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляли 40 мМ водный раствор периодата натрия с получением концентрации 250 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 120 мин в темноте при температуре 22°C при осторожном перемешивании. Затем реакцию останавливали добавлением L-цистеина (конечная концентрация: 5 мМ) в течение 30 мин при комнатной температуре.
Конъюгат ЖК-rFIX очищали анионнообменной хроматографией. Реакционную смесь разбавляли 10 мл буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) и наносили на 5-мл колонку HiTrap Q FF (GE Healthcare, Фэрфилд, штат Коннектикут, США), уравновешенную буфером А. Колонку промывали, используя этот же буфер в количестве 5 об. колонки. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Фракции, содержавшие конъюгат, концентрировали ультрафильтраци-ей/диафильтрацией, используя 10-кДа мембрану из регенерированной целлюлозы. Конечную стадию диафильтрации выполняли против 20 мМ Hepes-буфера, рН 7,2, содержавшего 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCb.
Пример 11. Присоединение метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)-этоксиамино)гексадекановой кислоты к углеводной группе фактора свертывания VIIa.
10 мг rFVIIa растворяли в Hepes-буфере ((50 мМ Hepes, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0). Затем к раствору FVIIa добавляли 10 мкл 10% (мас./об.) раствора метилового эфира 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиамино)гексадекановой кислоты (полученного в соответствии с примером 3) в ДМСО. Затем получали водный раствор нуклеофильного катализатора м-толуидина (50 мМ) и добавляли его к смеси в течение 15 мин с получением конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляли 40 мМ водный раствор периодата натрия с получением концентрации 250 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 120 мин в темноте при температуре 22°C при осторожном перемешивании. Затем реакцию останавливали добавлением L-цистеина (конечная концентрация: 5 мМ) в течение 30 мин при комнатной температуре. Конъюгат ЖК-rFVIIa очищали анионнообменной хроматографией. Реакционную смесь разбавляли 10 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 7,4) и наносили на 5-мл колонку HiTrap Q FF (GE Healthcare, Фэрфилд, штат Коннектикут, США), уравновешенную буфером А. Колонку промывали, используя этот же буфер в количестве 5 об. колонки. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Фракции, содержавшие конъюгат, концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией, используя 10-кДа мембрану из регенерированной целлюлозы. Конечную стадию диафильтрации выполняли против 20 мМ Hepes-буфера, рН 7,2, содержавшего 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl2.
Пример 12. Присоединение производного ЖК, содержащего активную аминооксигруппу, к окисленной углеводной группе в присутствии нуклеофильного катализатора.
Настоящее изобретение также обеспечивает присоединение производного ЖК, содержащего активную аминооксигруппу, к окисленному терапевтическому белку (например, белкам, изложенным в таблице в данном описании).
Для сочетания производного ЖК, содержащего аминооксигруппу, углеводные группы (преимущественно N-гликаны) терапевтического белка (например, ЕРО, Г-КСФ или инсулина; см. табл., концентрация: 0,5-3 мг/мл) сначала окисляли NaIO4 (концентрация: 200 мкМ). Затем реакцию останавливали добавлением L-цистеина (конечная концентрация: 5 мМ), и разделяли реагенты ультрафильтраци-ей/диафильтрацией. После диафильтрации добавляли ЖК-аминоокси-реагент (т.е. производное ЖК) в 25-М избытке, и осуществляли реакцию сочетания при рН 6,0 в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании в присутствии нуклеофильного катализатора м-толуидина (концентрация: 10 мМ). Затем реакционную смесь загружали в ионообменную (IEX) колонку. Колонку промывали
буфером для промывки в количестве > 5 объемов колонки, и элюировали конъюгат линейным градиентом NaCl. Наконец, фракции, содержавшие конъюгат, подвергали ультрафильтрации/диафильтрации.
Пример 13. Присоединение производного ЖК, содержащего активную аминооксигруппу, к окисленной углеводной группе в присутствии нуклеофильного катализатора.
Для сочетания производного ЖК, содержащего аминооксигруппу, к углеводной группе терапевтического белка указанный белок (например, ЕРО, ГКСФ или инсулина; см. таблицу; концентрация: 0,5-3 мг/мл) инкубировали при рН 6,0 с NaIO4 (концентрация: 300 мкМ) в течение 1 ч при комнатной температуре в присутствии нуклеофильного катализатора м-толуидина (концентрация: 10 мМ). Затем реакцию останавливали добавлением L-цистеина (конечная концентрация: 5 мМ), и загружали реакционную смесь на ионообменную (IEX) колонку. Колонку промывали буфером для промывки в количестве > 5 об. колонки, и элюировали конъюгат линейным градиентом NaCl.
Наконец, фракции, содержавшие конъюгат, подвергали ультрафильтрации/диафильтрации.
Пример 14. Присоединение производного ЖК, содержащего активную аминооксигруппу, к окисленному белку свертывания крови в присутствии нуклеофильного катализатора.
Присоединение производного ЖК, содержащего активную аминооксигруппу, к окисленному белку свертывания крови (например, FIX, FVIII и FVIIa, как описано в вышеприведенных примерах) можно осуществить в присутствии нуклеофильного катализатора, например м-толуидина в диапазоне концентраций 2-20 мМ.
Пример 15. Получение водорастворимого линкера на основе MAL-жирной кислоты. Линкер на основе жирной кислоты, содержащий цепь водорастворимого ПЭГ в оо-положении и активную MAL-группу, получали в ходе двустадийного синтеза.
Стадия 1. Получение метилового эфира 16-гидроксигексадекановой кислоты
Коммерчески доступную 16-гидроксигександекановую кислоту этерифицировали ацетилхлоридом в метаноле в течение 5 ч при комнатной температуре согласно примеру 3, получая соответствующий метиловый эфир (Hang et al., Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells, JACS 2007; 129:2744-5).
Стадия 2. Получение линкера на основе MAL-жирной кислоты
Метиловый эфир 16-гидроксигександекановой кислоты подвергали взаимодействию с коммерчески доступной MAL-ПЭГ-СООН (mal-ПЭГ(12)-COOH/IRIS Biotech GmbH, Марктредвиц, Германия), используя реакцию Мицунобу в ТГФ при комнатной температуре в течение ночи (Toyokuni et al., Synthesis of a New Heterobifunctional Linker, N-[4-(Aminooxy)butyl]-maleimide, for Facile Access to a Thiol-Reactive 18F-Labeling Agent, Bioconjugate Chem 2003; 14:1253-9).
Пример 16. Получение водорастворимого линкера на основе NHS-жирной кислоты.
Линкер на основе жирной кислоты, содержащий цепь водорастворимого ПЭГ в о -положении и концевой активный NHS-эфир, получали, используя четырехстадийный синтез.
Стадия 1. Получение метилового эфира 16-бромгексадекановой кислоты
Коммерчески доступную 16-бромгексадекановую кислоту этерифицировали метанолом и каталитическим количеством концентрированной серной кислоты в течение ночи при температуре кипения с получением соответствующего метилового эфира (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem Eur J 2010; 16:306682).
Стадия 2. Получение метилового эфира 16-азидгексадекановой кислоты
Метиловый эфир 16-бромгексадекановой кислоты подвергали взаимодействию с азидом натрия в ацетонитриле в течение четырех дней при температуре кипения с получением соответствующего азида (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem. Eur. J. 2010; 16:3066-82).
Стадия 3. Получение метилового эфира 16-аминогексадекановой кислоты
Метиловый эфир 16-азидгексадекановой кислоты подвергали каталитическому гидрированию в присутствии палладия/активированного угля в метаноле при 3 бар в течение трех часов с получением соответствующего амина (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Ra-cemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem. Eur. J. 2010; 16:3066-82).
Стадия 4. Получение линкера на основе NHS-жирной кислоты
Метиловый эфир 16-аминогександекановой кислоты подвергали взаимодействию с коммерчески доступным №К-ПЭГ-№К (NHS-dPEG (4)-NHS/IRIS Biotech GmbH, Марктредвиц, Германия) в 1,4-диоксане при комнатной температуре в течение трех дней с получением линкера на основе NHS-жирной кислоты (Cline et al., The Aminolysis of N-Hydroxysuccinimide Esters. A Structure-Reactivity Study, JACS 1987; 109:3087-91).
Пример 17. Оценка аналитических характеристик конъюгатов белок-ЖК.
Альбуминсвязывающие свойства образцов ЖК-rFVIII, rFIX или FVIIa, полученных в соответствии с примерами, описанными в данном описании, проверяли in vitro с помощью систем твердофазного имму-ноферментного анализа (твердофазного ИФА). 96-луночный планшет покрывали поликлональными антителами против сывороточного альбумина человека (HSA). Следующей стадией являлось блокирование планшета для твердофазного ИФА PBS-желатиновым буфером. Затем с антителом связывали HSA с последующим связыванием образца ЖК-белок, разведенного до различных концентраций. Наконец, образец HSA-белок обнаруживали с помощью антител против факторов VIII, FIX или FVIIa, меченных пе-роксидазой. Пероксидазную активность обнаруживали, используя тетраметилбензидин (ТМБ) в качестве субстрата. Интенсивность развившегося окрашивания измеряли на ридере для твердофазного ИФА при 450 нм. Связывание образца ЖК-белок с HSA оценивали путем нанесения на график различных концентраций образца по оси х и соответствующих им величин поглощения по оси у.
Пример 18. Получение водорастворимого линкера на основе пегилированной жирной кислоты, содержащего аминооксигруппу.
Линкер на основе жирной кислоты, содержащий цепь водорастворимого ПЭГ с аминооксигруппой в о-положении, присоединенную к карбоксильной группе жирной кислоты, получали в ходе трехстадий-ного синтеза, используя 3-оксапентан-1,5-диоксиамин, как описано в примере 1.
Стадия 1. Получение К-(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-оксапентан-1,5-диоксиамина
3-Оксапентан-1,5-диоксиамин подвергали взаимодействию с 9-флуоренилметилхлорформиатом в 1,4-диоксане при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор выпаривали при пониженном давлении, и неочищенный продукт очищали, используя хроматографию на силикагеле со смесью дихлорме-тан/метанол 20/1 (об./об.) в качестве растворителя, с получением чистого моно-FMOC-блокированного диоксиамина (Boturyn et al., Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA, Tetrahedron 1997; vol.53, № 15, 5485-92).
Стадия 2. Получение (2-(2-(N-(9-флуоренилметоксикарбонил)аминоокси)этокси)этокси)амида гек-садекановой кислоты
^(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-оксапентан-1,5-диоксиамин подвергали взаимодействию с коммерчески доступным N-гидроксисукцинимидным эфиром пальмитиновой кислоты в ТГФ при комнатной температуре в течение ночи с получением конъюгата моно-FMOC-блокированной аминоокси-жирной кислоты (Jong et al., Synthesis of ceramides using N-hydroxysuccinimide esters, Journal of Lipid Research 1972; vol.13, 819-22).
Стадия 3. Получение (2-(2-аминооксиэтокси)этокси)амида гексадекановой кислоты
Конъюгат моно-FMOC-блокированной аминооксижирной кислоты подвергали взаимодействию с пиперидином в дихлорметане при комнатной температуре с получением линкера на основе деблокированной аминооксижирной кислоты в качестве конечного продукта (Boturyn et al., Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA, Tetrahedron 1997; vol.53, № 15, 5485-92).
Пример 19. Присоединение линкера на основе MAL-жирной кислоты к A1PI.
Линкер на основе жирной кислоты, содержащий MAL-группу, получали, как описано в примере 15, путем взаимодействия метилового эфира 16-гидроксигексадекановой кислоты с коммерчески доступной MAL-ПЭГ-СООН (mal-ПЭГ(12)-COOH/IRIS Biotech GmbH, Марктредвиц, Германия), используя реакцию Мицунобу. Указанный линкер присоединяли к свободной SH-группе A1PI.
10 мг очищенного A1PI (концентрация: 1 мг/мл) растворяли в реакционном буфере (20 мМ фосфата, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0), и к раствору A1PI добавляли 10 мкл 5% (мас./об.) раствора линкера на основе MAL-жирной кислоты в ДМСО. Реакцию модификации проводили в течение 2 ч при комнатной температуре с последующей стадией гашения с использованием L-цистеина (конечная концентрация 10 мМ). После добавления L-цистеина реакционную смесь инкубировали при осторожном встряхивании в течение дополнительного часа при той же температуре. Модифицированный A1PI разбавляли уравновешивающим буфером (25 мМ фосфата, рН 6,5) для коррекции проводимости раствора до значений <4,5 мСм/см и наносили на предварительно упакованную HiTrap Q FF (GE-Healthcare) с объемом колонки (CV) 5 мл. Затем колонку уравновешивали 10 CV уравновешивающего буфера (скорость потока: 2 мл/мин). Наконец, ПЭГ-A^I элюировали линейным градиентом буфера для элюирования (25 мМ Na2HPO4, 1M NaCl, рН 6,5).
Пример 20. Присоединение линкера на основе NHS-жирной кислоты к фактору свертывания VIII.
Линкер на основе жирной кислоты, содержащий NHS-группу, получали, как описано в примере 16, путем взаимодействия метилового эфира 16-гидроксигексадекановой кислоты с коммерчески доступным №К-ПЭГ-№К (NHS-dPEG(4)-NHS (IRIS Biotech GmbH, Марктредвиц, Германия). Указанный линкер присоединяли к свободным аминогруппам остатков лизина фактора свертывания VIII.
10 мг rFVIII растворяли в Hepes-буфере (50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) с получением концентрации белка 2 мг/мл. Затем 10 мкл 10% (мас./об.) раствора линкера на основе NHS-жирной кислоты в ДМСО добавляли к раствору FVIII. Реакционную смесь инкубировали в течение 120 мин в темноте при температуре 22°C при осторожном перемешивании. Затем реакцию останавливали добавлением водного раствора глицина (1М) с получением конечной концентрации в реакционной смеси 20 мМ. Смесь инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании и затем наносили на ионообменную колонку, заполненную Q-сефарозой FF (1,6x8 см). Колонку промывали уравновешивающим буфером (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4) в количестве 20 об. колонки и элюировали конъюгат ЖК-rFVIII буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 0,5М NaCl, рН 7,4). Наконец, продукт подвергали ультрафильтрации/диафильтрации на устройствах Vivaspin, используя Hepes-буфер, 7,4 (20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,4) в качестве буфера для диафильтрации.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, содержащий водорастворимое производное жирной кислоты, включающее жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, причем указанное производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку, где водорастворимый линкер включает полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ, по меньшей мере одну аминооксигруппу, присоединенную к терапевтическому белку, и вторую аминооксигруппу, присоединенную к жирной кислоте или эфиру жирной кислоты, где жирная кислота включает цепь длиной С10-С24.
2. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, который связывает сывороточный альбумин человека (HSA) in vitro или in vivo, обладает повышенным временем полужизни по сравнению с нативным терапевтическим белком и в котором жирная кислота является насыщенной жирной кислотой или ненасыщенной жирной кислотой.
3. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.2, где жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.
4. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.
5. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота присоединена к водорастворимому линкеру по группе жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из концевой карбоксильной группы и со -группы, в которой со -группа выбрана из группы, состоящей из гидроксила, амино-, тио- и карбоксила.
6. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
7. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где сложный эфир жирной кислоты выбран из группы, состоящей из метилового эфира и этилового эфира.
1.
8. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.7, где сложный эфир жирной кислоты представляет собой метиловый эфир 16-гидроксигексадекановой кислоты.
9. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
10. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.9, где водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из:
а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы
H2N
b) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы
NH2
с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
d) 3,6,9,12,15,18,21 -гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
11. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты стабильно присоединено к терапевтическому белку посредством оксимной связи, где оксимная связь образована между оксимной группой водорастворимого линкера и альдегидной группой окисленного углевода в составе терапевтического белка.
12. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где производное жирной кислоты выбрано из группы, состоящей из:
а) натриевой соли 16-(2-(2-(2-(2-аминооксиэтокси)этокси)этокси)этоксиимино)гексадекановой кислоты формулы
Nao: L-Л ^\ Л ^-ч. ^о.
кислоты
13. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, где терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX), фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консен-сусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинпо-добного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинпо-добного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического бел-ка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогене-тического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора костного морфогене-тического белка IA, рецептора костного морфогенетического белка IB, рецептора костного морфогенети-ческого белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротро-фического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2а, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2р, фактора роста эндотели-альных клеток в, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробла
стов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора а1, рецептора глиально-го нейротрофического фактора а2, белка, связанного с ростом, белка а, связанного с ростом, белка в, связанного с ростом, белка у, связанного с ростом, гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора а лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора а тромбоцитарного фактора роста, рецептора в тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста а, трансформирующего фактора роста в, трансформирующего фактора роста в1, трансформирующего фактора роста в 12, трансформирующего фактора роста в2, трансформирующего фактора роста в3, трансформирующего фактора роста в5, латентного трансформирующего фактора роста в1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназного типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, в-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липо-протеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, ада-лимумаба, деносумаба, этанерцепта, белка из таблицы.
14. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIIa.
15. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FVIII.
16. Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.13, где терапевтическим белком является FIX.
17. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий:
a) окисление о-гидроксигруппы жирной кислоты с получением альдегидной группы в составе жирной кислоты;
b) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, к указанной альдегидной группе с образованием стабильной оксимной связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и
c) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка;
причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где о-гидроксигруппу окисляют окислителем, выбранным из группы, состоящей из периодинанового реагента Десса-Мартина, реагента Tempo, оксалилхлорида/ДМСО, тетрапропиламмонийперрутената (ТРАР) и реагентов на основе хрома (VI) (реагента Коллинза, пиридинийхлорхромата (РСС) и бихромата пиридиния); где жирной кислотой является насыщенная жирная кислота или ненасыщенная жирная кислота.
18. Способ по п.17, в котором жирной кислотой является жирная кислота с разветвленной цепью.
19. Способ по п.17, в котором жирная кислота включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.
20. Способ по п.19, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
21. Способ по п.17, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
22. Способ по п.21, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из:
а) 3-оксапентан-1,5-диоксамина формулы
-О. Л ,Л .О,
H2N О NH8
b) 3,6,9-триоксаундекан-!, 11-диоксиамина формулы
с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
23. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий:
a) этерификацию карбоксильной группы жирной кислоты с получением эфира жирной кислоты;
b) активацию со-гидроксигруппы жирной кислоты с получением мезильной группы в составе жирной кислоты со стадии а);
c) присоединение водорастворимого линкера, включающего (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу, путем замещения мезильной группы со стадии b) с образованием стабильной оксиимин-метиленовой связи, таким образом получая производное жирной кислоты; и
d) конъюгирование производного жирной кислоты с окисленной углеводной группой терапевтического белка;
причем указанное производное жирной кислоты растворимо в воде; где карбоксильную группу эте-рифицируют этерифицирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из ацетилхлорида, метанола в присутствии кислоты, этанола в присутствии кислоты, диазометана и метилиодида; где с -гидроксигруппу активируют активирующим агентом, выбранным из группы, состоящей из мезилхлори-да, тозилхлорида и нозилхлорида; и где жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту.
24. Способ по п.23, в котором жирная кислота является жирной кислотой с разветвленной цепью.
25. Способ по п.23, в котором жирная кислота включает цепь, выбранную из группы, состоящей из C10, С12, С14, С16, С18, С20, С22 и С24.
26. Способ по п.25, в котором жирная кислота представляет собой 16-гидроксигексадекановую кислоту.
27. Способ по п.23, в котором ПЭГ включает цепь длиной, выбранной из группы, состоящей из O3, O5, O7, O9, O11, O13 и O15.
28. Способ по п.27, в котором водорастворимый линкер выбран из группы, состоящей из:
а) 3 -оксапентан-1,5 -диоксамина формулы
Ь) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина формулы
c) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамина формулы
d) 3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1,23-диоксиамина формулы
-NHL
29. Способ получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты по п.1, включающий контакт окисленной углеводной группы терапевтического белка с производным жирной кислоты в условиях, обеспечивающих конъюгирование;
причем указанную углеводную группу окисляют путем инкубирования с буфером, включающим окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца (Pb(OAc)4) и перрутената калия (KRuO4);
где производное жирной кислоты включает жирную кислоту или эфир жирной кислоты, присоединенные к водорастворимому линкеру, включающему (i) полиэтиленгликоль (ПЭГ) или разветвленный ПЭГ и (ii) активную аминооксигруппу;
где между окисленной углеводной группой и активной аминооксигруппой производного жирной кислоты образуется оксимная связь;
где образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, включающей анилин, о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфаниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и п-анизидин.
30. Способ по п.29, в котором терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из фактора IX (FIX),
30.
фактора VIII (FVIII), фактора VIIa (FVIIa), фактора Виллебранда (ФВ), фактора FV (FV), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1-альфа, IL-1-бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимули-рующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, SCF, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32-альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтин-подобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтин-подобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангио-генина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфоге-нетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетическо-го белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного мор-фогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфоге-нетического белка-15, рецептора костного морфогенетического белка IA, рецептора костного морфоге-нетического белка IB, рецептора костного морфогенетического белка II, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного ней-ротрофического фактора, cripto, cryptic, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 1, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2а, цитокин-индуцируемого фактора хемотаксиса нейтрофилов 2в, фактора роста эндотелиальных клеток в, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фиброб-ластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора глиального нейротрофического фактора а1, рецептора глиального нейротрофического фактора а2, белка, связанного с ростом, белка а, связанного с ростом, белка в, связанного с ростом, белка у, связанного с ростом, гепа-ринсвязывающего эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулинопо-добного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, лейкоз-ингибирующего фактора, рецептора а лейкоз-ингибирующего фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейро-трофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, А-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, В-цепи тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора а тромбоцитарного фактора роста, рецептора в тромбоцитарного фактора роста, фактора, стимулирующего рост предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста а, трансформирующего фактора роста в, трансформирующего фактора роста в1, трансформирующего фактора роста в 12, трансформирующего фактора роста в2, трансформирующего фактора роста в3, трансформирующего фактора роста в5, латентного трансформирующего фактора роста в1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста в, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста в, лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазминогена урокиназно-го типа, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хориогона-дотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазми-ногена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, в-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирую-щего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопо-этина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, адалимумаба, деносумаба, энбрела этанерцепта, белка из таблицы.
31. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIIa.
32. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FVIII.
33. Способ по п.30, в котором терапевтическим белком является FIX.
34. Способ по п.17, в котором окислителем является периодинан Десса-Мартина.
31.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
032056
- 1 -
(19)
032056
- 1 -
(19)
032056
- 1 -
(19)
032056
- 4 -
(19)
032056
- 14 -
032056
- 32 -
032056
- 51 -
032056
- 51 -
032056
- 55 -