|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. GDF-5-родственный белок, обладающий улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и сниженной способностью стимулировать образование костной ткани, где белок обладает увеличенной аффинностью к BMP-рецептору IB (BMPR-IB) и/или сниженной аффинностью к BMP-рецептору IA (BMPR-IA), где белок получают из человеческого GDF-5-родственного белка дикого типа, в частности из GDF-5, GDF-6 или GDF-7 человека, где по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена на гидрофильную или полярную аминокислоту. 2. Белок по п.1, где белок получают путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка, относящегося к сайту связывания BMPR-IB и/или BMPR-IA в аминокислотной последовательности GDF-5-родственного белка, предпочтительно с помощью генно-инженерной технологии. 3. Белок по п.1, где гидрофильный аминокислотный остаток или полярный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, гистидина, серина и треонина. 4. Белок по п.1 или 2, где по меньшей мере одна гидрофильная или полярная аминокислота в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена гидрофобной аминокислотой. 5. Белок по п.4, где гидрофобный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из аланина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина, триптофана, тирозина, валина. 6. Белок по п.1 или 2, содержащий консервативную замену по крайней мере одной аминокислоты в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка, в частности, где гидрофобная аминокислота заменена меньшей или большей гидрофобной аминокислотой или где гидрофильная или полярная аминокислота заменена меньшей или большей гидрофильной или полярной аминокислотой. 7. Белок по любому из пп.1-6 для лечения заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным. 8. Белок по п.7 для лечения дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща, в частности возрастных дефектов хряща, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм, заболеваний, которые могут влиять на хрящ, наподобие хондродистрофии, заболевания, характеризующегося нарушением роста и последующим окостенением хряща, ахондроплазии, реберного хондрита, грыжи межпозвоночного диска и восстановления межпозвоночного диска, рецидивирующего полихондрита, восстановления дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественными наподобие хондромы или хондросаркомы. 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-6. 10. Нуклеиновая кислота по п.9 для лечения заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным. 11. Нуклеиновая кислота по п.10 для лечения дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща, в частности возрастных дефектов хряща, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм, заболеваний, которые могут влиять на хрящ, наподобие хондродистрофии, заболевания, характеризующегося нарушением роста и последующим окостенением хряща, ахондроплазии, реберного хондрита, грыжи межпозвоночного диска и восстановления межпозвоночного диска, рецидивирующего полихондрита, восстановления дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественными наподобие хондромы или хондросаркомы. 12. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.9. 13. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по любому из пп.1-6 в качестве активного агента. 15. Композиция по п.14, где белок присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9 в качестве активного агента. 17. Композиция по п.16, где нуклеиновая кислота присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.12 в качестве активного агента. 19. Композиция по п. 18, где вектор присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 20. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяин по п.13 в качестве активного агента. 21. Композиция по п. 20, где клетка-хозяин присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 22. Способ получения GDF-5-родственного белка по любому из пп.1-6, включающий в себя стадии: (i) рандомизация по крайней мере одного аминокислотного положения в области GDF-5-родственного белка, относящейся к сайту связывания с BMP-рецептором IB и/или BMP-рецептором IA, чтобы получить белковые варианты, (ii) анализ белковых вариантов, полученных в (i), в отношении их аффинности к BMP-рецептору IB и/или ВМР-рецептору IA, (iii) отбор тех белковых вариантов, которые обеспечивают увеличенную аффинность к ВМР-рецептору IB (BMPR-IB) и/или сниженную аффинность к ВМР-рецептору IA (BMPR-IA). 23. Антитело против белка по любому из пп.1-6.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. GDF-5-родственный белок, обладающий улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и сниженной способностью стимулировать образование костной ткани, где белок обладает увеличенной аффинностью к BMP-рецептору IB (BMPR-IB) и/или сниженной аффинностью к BMP-рецептору IA (BMPR-IA), где белок получают из человеческого GDF-5-родственного белка дикого типа, в частности из GDF-5, GDF-6 или GDF-7 человека, где по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена на гидрофильную или полярную аминокислоту. 2. Белок по п.1, где белок получают путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка, относящегося к сайту связывания BMPR-IB и/или BMPR-IA в аминокислотной последовательности GDF-5-родственного белка, предпочтительно с помощью генно-инженерной технологии. 3. Белок по п.1, где гидрофильный аминокислотный остаток или полярный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, гистидина, серина и треонина. 4. Белок по п.1 или 2, где по меньшей мере одна гидрофильная или полярная аминокислота в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена гидрофобной аминокислотой. 5. Белок по п.4, где гидрофобный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из аланина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина, триптофана, тирозина, валина. 6. Белок по п.1 или 2, содержащий консервативную замену по крайней мере одной аминокислоты в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка, в частности, где гидрофобная аминокислота заменена меньшей или большей гидрофобной аминокислотой или где гидрофильная или полярная аминокислота заменена меньшей или большей гидрофильной или полярной аминокислотой. 7. Белок по любому из пп.1-6 для лечения заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным. 8. Белок по п.7 для лечения дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща, в частности возрастных дефектов хряща, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм, заболеваний, которые могут влиять на хрящ, наподобие хондродистрофии, заболевания, характеризующегося нарушением роста и последующим окостенением хряща, ахондроплазии, реберного хондрита, грыжи межпозвоночного диска и восстановления межпозвоночного диска, рецидивирующего полихондрита, восстановления дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественными наподобие хондромы или хондросаркомы. 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-6. 10. Нуклеиновая кислота по п.9 для лечения заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным. 11. Нуклеиновая кислота по п.10 для лечения дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща, в частности возрастных дефектов хряща, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм, заболеваний, которые могут влиять на хрящ, наподобие хондродистрофии, заболевания, характеризующегося нарушением роста и последующим окостенением хряща, ахондроплазии, реберного хондрита, грыжи межпозвоночного диска и восстановления межпозвоночного диска, рецидивирующего полихондрита, восстановления дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественными наподобие хондромы или хондросаркомы. 12. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.9. 13. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по любому из пп.1-6 в качестве активного агента. 15. Композиция по п.14, где белок присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9 в качестве активного агента. 17. Композиция по п.16, где нуклеиновая кислота присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.12 в качестве активного агента. 19. Композиция по п. 18, где вектор присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 20. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяин по п.13 в качестве активного агента. 21. Композиция по п. 20, где клетка-хозяин присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями. 22. Способ получения GDF-5-родственного белка по любому из пп.1-6, включающий в себя стадии: (i) рандомизация по крайней мере одного аминокислотного положения в области GDF-5-родственного белка, относящейся к сайту связывания с BMP-рецептором IB и/или BMP-рецептором IA, чтобы получить белковые варианты, (ii) анализ белковых вариантов, полученных в (i), в отношении их аффинности к BMP-рецептору IB и/или ВМР-рецептору IA, (iii) отбор тех белковых вариантов, которые обеспечивают увеличенную аффинность к ВМР-рецептору IB (BMPR-IB) и/или сниженную аффинность к ВМР-рецептору IA (BMPR-IA). 23. Антитело против белка по любому из пп.1-6.
Евразийское 028554 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201491119
(22) Дата подачи заявки 2012.12.05
(51) Int. Cl. C07K14/51 (2006.01)
(54) МУТАНТ GDF-5 ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ХРЯЩЕЙ
(31) 11191973.4
(32) 2011.12.05
(33) EP
(43) 2014.12.30
(86) PCT/EP2012/074549
(87) WO 2013/083649 2013.06.13
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БИОФАРМ ГЕЗЕЛЛЬШАФТ ЦУР БИОТЕХНОЛОГИШЕН ЭНТВИКЛУНГ ФОН ФАРМАКА МБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Плегер Франк, Вагнер Флориан (DE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) SEEMANN PETRA ET AL.: "Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 115, no. 9, September 2005 (2005-09), pages 2373-2381, XP002674703, ISSN: 0021-9738 abstract;
table 1
SEEMANN PETRA ET AL.: "Mutations in
GDF5 Reveal a Key Residue Mediating BMP
Inhibition by NOGGIN", PLOS GENETICS, vol. 5,
no. 11, November 2009 (2009-11), XP002674704, abstract; table 1
SCHREUDER H. ET AL.: "Crystal structure of recombinant human growth and differentiation factor 5: Evidence for interaction of the type I and type II receptor-binding sites", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH
COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 329, no. 3, 15
April 2005 (2005-04-15), pages 1076-1086, XP004775407, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/ J.BBRC.2005.02.078 page 1081, right-hand column
EP-A1-1698691
WO-A1-2007057212
KAMIYA NOBUHIRO ET AL.: "New insights on the roles of BMP signaling in bone-A review of recent mouse genetic studies", BIOFACTORS, vol. 37, no. 2, March 2011 (2011-03), pages 75-82,
XP002674705, the whole document
DATABASE OMIM [Online] "GDF5",
XP002674706, Database accession no. 601146 the whole document
(57) Изобретение относится к GDF-5-родственным белкам, обладающим улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и сниженной способностью стимулировать образование костной ткани. Новые белки особенно полезны при лечении дефектов хряща, где образование костной ткани является нежелательным.
Настоящее изобретение относится к GDF-5-родственным белкам, обладающим улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и сниженной способностью стимулировать образование костной ткани. Новые белки особенно полезны при лечении дефектов хряща, при котором образование костной ткани является нежелательным.
Синовиальные суставы являются существенными для биомеханической функции скелета. Неправильная функция, наблюдаемая при заболевании артритом, непосредственно приводит к серьезной потере качества жизни. Поэтому биология суставов находилась в течение многих лет в фокусе обширных исследований, приводящих к пониманию анатомии и гистологии суставов, а также биомеханических свойств и ролей суставного хряща и других компонентов в функционировании и поддержании суставов.
GDF-5 (Hotten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652) представляет собой морфо-ген, который, как было показано, стимулирует клеточную пролиферацию, дифференцировку и/или образование тканей в нескольких тканях. Белок также известен как морфогенетический белок МР52, морфо-генетический белок-14 костей (ВМР-14) или хрящепроизводный морфогенетический белок-1 (CDMP-1). GDF-5 демонстрирует хондрогенную активность, и наследственные GDF-5-мутации вызывают дефекты суставов пальцев, запястья и лодыжек у мышей и людей (Storm et al., 1994; Thomas et al., 1997). Экспрессия GDF-5, что самое удивительное, ограничивается лишь теми областями, где должны развиваться суставы, и она является одним из ранних маркеров образования суставов (Storm and Kingsley, 1999). ВМР-рецепторный сигналлинг требуется для послеродового поддержания суставного хряща (Rountree, 2004, PLoS Biol. 2004 November, 2(11)).
GDF-5 является близкородственным с GDF-6 и GDF-7. Эти три белка образуют отдельную подгруппу надсемейства TGF-p, демонстрирующую поэтому сопоставимые биологические свойства и необычайно высокую степень идентичности последовательности аминокислот (см., например, Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330). Все члены семейства первоначально синтезируются в виде больших белков-предшественников, которые впоследствии подвергаются протеолитическому расщеплению по кластеру основных остатков примерно на расстоянии в 0-140 аминокислот от С-конца, освобождая при этом части С-концевого зрелого белка от N-концевого продомена. Зрелые полипептиды структурно связаны и содержат консервативный биологически активный домен, содержащий шесть или семь канонических остатков цистеина, который отвечает за характеристический трехмерный мотив "цистинового узла" этих белков. Белки, родственные нативному GDF-5, представляют собой гомодимерные молекулы и действуют в основном через взаимодействие со специфическими рецепторными комплексами, которые состоят из серин/треонин рецепторных киназ типа I и типа II. Рецепторные киназы последовательно активируют белки Smad, которые затем передают сигналы в ядро для регулирования экспрессии генов-мишеней.
Уже не раз было продемонстрировано, что члены подгруппы GDF-5/-6/-7 являются, прежде всего, важными индукторами и регуляторами костной и хрящевой ткани (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. 85A, 1544-1552; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130). GDF-5 и родственные белки связываются с и олигомеризируют два типа мембрансвязанных серин-треонин киназных рецепторов, обозначенных как тип I и II. После связывания лиганда эти комплексы передают сигналам при помощи фосфорилиро-ванных членов SMAD-семейства транскрипционных факторов, которые при активации входят в ядро и регулируют транскрипцию реагирующих генов (Massague, 1996). Недавние эксперименты имели результатом два разных рецептора типа I при структурировании скелета, BMPR-IA и BMPR-IB. Оба рецептора экспрессируются в динамических структурах во время нормального развития. В некоторых структурах конечностей, например в суставных камерах и надхрящнице, наблюдается перекрывающаяся экспрессия BMPR-IA и BMPR-IB (Mishina et al., 1995; Zou et al, 1997; Baur et al, 2000). Что касается профиля экспрессии BMPR-IA и BMPR-IB, трансдукция GDF-5-сигнала должна осуществляться путем взаимодействия как с BMPR-IA, так и с BMPR-IB (Chang et al., 1994; Zou et al., 1997). Нулевые мутации в гене bmpr-1b дают жизнеспособных мышей с дефектами образования костей и суставов, наиболее приближенных к тем, которые наблюдаются у мышей с отсутствием GDF-5 (Storm and Kingsley, 1996; Yi et al, 2000), в то время как мыши bmpr-1a, как известно, умирают на ранней стадии эмбриогенеза (Mishina et al, 1995). При этом условный нокаут BMPR-IA под контролем драйвера GDF-5-Cre снимает эмбриональную летальность и дает жизнеспособных мышей с нормально сформированными суставами. Однако после рождения суставной хрящ в суставах стирается в процессе, напоминающем остеоартроз, что указывает на важность этого рецептора для гомеостаза и восстановления хряща (Rountree et al., 2004).
Активность белков дикого типа семейства GDF-5-родственных белков, как правило, приводит к образованию хрящевой и костной ткани. При этом существуют различные медицинские состояния, при которых предпочтительно образование хрящей, однако образование костной ткани является нежелательным. Например, очевидно, что в случае дефектов хряща образование хрящей является желательным, в то время как окостенения следует избегать.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является конкретное использование эффекта стимулирования образования хряща GDF-5-родственными белками и выключение эффекта стимулирования образования костной ткани. Удивительно, но оказалось, что можно предоставить варианты GDF-5-родственных белков, обладающих улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и
сниженной способностью стимулировать образование костной ткани. Это может быть достигнуто путем изменения GDF-5-родственных белков таких, что они обладают увеличенной аффинностью к BMPR-IB и/или сниженной аффинностью к BMPR-IA. GDF-5 дикого типа связывает BMPR-IB in vitro с примерно в 40-120 раз более высокой аффинностью (KD~8-27 пМ) по сравнению с BMPR-IA (KD~1-1,1 нМ). Было обнаружено, что путем изменения аффинности связывания GDF-5-родственных белков, такой, что аффинность для BMPR-IB увеличивается, в то время как аффинность для BMPR-IA уменьшается, образование хрящей облегчается при уменьшении образования костной ткани. Это может быть достигнуто путем определенных замен одного или более аминокислотных остатков, относящихся к участку связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA аминокислотной последовательности GDF-5 родственного белка. Аффинность связывания GDF-5-родственных белков, обладающих конкретными заменами, сравнивают с аффинностью связывания GDF-5-родственного белка дикого типа человека, в частности GDF-5 дикого типа человека.
Во избежание недоразумений и двусмысленностей некоторые часто используемые термины в настоящем документе определяются и иллюстрируются следующим образом.
Термин "домен цистин-узел", используемый в настоящем документе, означает хорошо известную и консервативную цистеин-богатую аминокислотную область, которая присутствует в зрелых частях белков надсемейства TGF-бета, таких как, например, GDF-5 человека, и образует трехмерную белковую структуру, известную как цистин-узел. В этом домене важно соответствующее расположение остатков цистеина друг к другу, и допускаются только небольшие вариации, чтобы не было потери биологической активности. Показано, что домен цистин-узел сам по себе достаточен для биологической функции белка (Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). Консенсусные последовательности для доменов цистин-узел хорошо известны в рассматриваемой области. В соответствии с определением, приведенным в настоящем документе, домен цистин-узла белка начинается с первого остатка цистеина, участвующего в цистин-узле соответствующего белка, и заканчивается остатком, который следует за последним цистеином, участвующим в цистин-узле соответствующего белка. Например, домен цистин-узла белка-предшественника GDF-5 человека (SEQ ID NO:2) состоит из аминокислот 400-501 (см. также фиг. 1). Термин "GDF-5 родственный белок", используемый в настоящем документе, означает любой природный или искусственно созданный белок, который является близкородственным фактору 5 роста и дифференциации человека (hGDF-5). Общей чертой всех GFD-5-родственных белков является наличие домена цистин-узла с идентичностью аминокислот по крайней мере 60% с 102 а.к. доменом цистин-узла GDF-5 человека (аминокислоты 400-501 SEQ ID NO:2), что достаточно для биологической функции белка. Термин "GDF-5 родственные белки" включает в себя белки, относящиеся к группе белков GDF-5, GDF-6 и GDF-7 из видов позвоночных или млекопитающих, а также рекомбинантных вариантов этого, при условии, что эти белки демонстрируют вышеописанный процент идентичности с доменом цистин-узла GDF-5 человека. Предельное значение 60% хорошо подходит для отдельных членов GDF-5/-6/-7 группы белков, а также вариантов других белков, таких, как более отдаленно родственные GDF и BMP. Сравнение 102 а.к. домена цистин-узла GDF-5 человека, GDF-6 человека и GDF-7 человека (см. фиг. 2) выявляет высокий уровень аминокислотной идентичности между этими белками. GDF-6 человека имеет 87 (85%) и GDF-7 человека имеет 83 (81%) идентичных остатка с доменом цистин-узла GDF-5 человека. Соответствующие домены молекул GDF-5/-6/-7 из других видов позвоночных и млекопитающих, которые были идентифицированы до настоящего времени, также демонстрируют очень высокие проценты идентичности по крайней мере в 75% (от 79 до 99%) по сравнению с GDF-5 человека. В отличие от этого GDF и BMP, не принадлежащие к подгруппе GDF-5/-6/-7, обладали гораздо более низкими значениями идентичности, ниже 60%.
Определение положений соответствующих аминокислот в соответствующих последовательностях аминокислот, а также расчет процентов идентичности может быть легко выполнен с помощью известных алгоритмов выравнивания и при необходимости компьютерных программ, использующих эти алгоритмы. Например, идентичности аминокислот в этой патентной заявке (т.е. фиг. 2) рассчитывали путем выравнивания последовательностей с помощью бесплатной программы ClustalX (версия 1.81) с параметрами по умолчанию и последующим подсчетом идентичных остатков вручную. Настройки по умолчанию для попарного выравнивания (медленноточно) представляют собой: параметр открытия пробела 10.00; параметр расширения пробела 0.10; матрица белковых масс: Gonnet 250. Программа ClustalX подробно описана в Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. and Higgins D.G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882. ClustalX представляет собой интерфейс Windows для программы множественного выравнивания последовательностей ClustalW, т.е. может быть получена из различных источников, т.е. при помощи анонимного ftp с ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk или через загрузку со следующей веб-страницей: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/. Программа ClustalW и алгоритм также подробно описаны в Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680. Особенно предпочтительные GDF-5-родственные белки проявляют аминокислотную идентичность по крайней мере в 70, 80,
90 или 95% с 102 а.к. доменом цистин-узла GDF-5 человека.
Неограничивающими примерами GDF-5-родственных белков позвоночных и млекопитающих являются предшественники и зрелые белки GDF-5 человека (раскрыт как МР52 в WO 95/04819 и как GDF-5 человека в Hotten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), рекомбинантный человеческий (rh) GDF-5/MP52 (WO 96/33215), MP52 Arg (WO 97/06254); HMW человеческие МР52 (WO 97/04095), CDMP-1 (WO 96/14335), мышиный (Mus musculus) GDF-5 (US 5801,014), кроличий (Orycto-lagus cuniculus) GDF-5 (Sanyal et al. 2000, Mol. Biotechnol. 16, 203-210), куриный (Gallus gallus) GDF-5 (номер поступления NCBI NP 989669), GDF-5 африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) (номер поступления NCBI AAT99303), мономерный GDF-5 (WO 01/11041 и WO 99/61611), человеческий GDF-6/BMP-13 (US 5658882), мышиный GDF-6 (номер поступления NCBI NP 038554), GDF-6/CDMP-2 (WO 96/14335), человеческий GDF-7/BMP-12 (US 5658882), мышиный GDF-7 (номер поступления NCBI AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (WO 96/143335). Охвачены изобретением также GDF-5-родственные белки, имеющие дополнительные мутации, такие как замены, вставки и делеции, при условии, что эти дополнительные мутации не полностью устраняют биологическую активность белка.
Настоящее изобретение основывается на находке авторов изобретения, что при помощи определенных модификаций в области аминокислотной последовательности GDF-5-родственного белка, которая участвует в связывании с BMPR-IB и/или BMPR-IA, можно изменить белок таким образом, что тот будет обладать улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и пониженной способностью стимулировать образование костной ткани.
Выяснилось, что белки с повышенной аффинностью к BMPR-IB и/или белки с уменьшенной аффинностью к BMPR-IA обладают лучшей способностью стимулировать образование хрящей при уменьшенном образовании костной ткани. Эти свойства особенно выражены в белках, показывающих как повышенную аффинность к BMPR-IB, так и сниженную аффинность к BMPR-IA.
GDF-5-родственные белки по настоящему изобретению можно получить путем химического модифицирования или генно-инженерной технологии рекомбинантных белков, являющейся предпочтительной. Белки могут быть получены путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка, относящегося к сайту связывания BMPR-IB и/или BMPR-IA в аминокислотной последовательности GDF-5-родственного белка. В частности, замена одного, двух, трех или более аминокислотных остатков, относящихся к сайту связывания BMPR-IB и/или BMPR-IA в аминокислотной последовательности GDF-5-родственного белка, является предпочтительной.
Вышеуказанная модификация может быть введена в любой из известных GDF-5-родственных белков, как определено выше. В отношении аспекта терапевтического использования белка предпочтительно получение белка из GDF-5-родственного белка человека, например из GDF-5-родственного белка дикого типа человека, такого как GDF-5, GDF-6 или GDF-7. При этом белки по изобретению могут быть также получены из GDF-5-родственных белков, имеющих дополнительные мутации, например замены, вставки или делеции, при условии, что эти дополнительные мутации не полностью устраняют биологическую активность белка. GDF-5 родственные белки, как определено в настоящем документе, включают домен цистин-узла с аминокислотной идентичностью по крайней мере 60%, предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно как минимум 80%, более предпочтительно как минимум 90% и наиболее предпочтительно как минимум 95% с 102 а.к. доменом цистин-узла GDF-5 человека. GDF-5 родственные белки по настоящему изобретению предпочтительно включают замену одной или нескольких аминокислот по сравнению с диким типом в области, которая участвует в связывании с BMPR-IB, и/или области, участвующей в связывании с BMPR-IA. Области GDF-5-родственных белков, которые участвуют в связывании с BMPR-IA и/или BMPR-IB, хорошо известны в рассматриваемой области или могут быть легко определены с использованием способов, которые находятся в пределах известного уровня техники. В отношении полноразмерной последовательности аминокислот GDF-5 дикого типа особенно предпочтительно заменять одну или несколько из следующих аминокислот (однобуквенный код) любой другой аминокислотой:
R 399;
любой из аминокислот от F 409 до W 417, предпочтительно М 412, G 413, W 414, и/или W 417; любой из аминокислот от Е 434 до М 456, предпочтительно F 435, Р 436, L 437, R438, S 439, Н 440, Р 443, N 445, V 448, I 449, L 452, М 453, S 455 и/или М 456;
S 475; I 476; F 478;
любой из аминокислот от K 488 до М 493, предпочтительно K 488, Y 490 и/или D 492. Предпочтительно аминокислота R 399 заменяется V, L, I, M, F, Y, W, Е или D. Предпочтительно аминокислота М 412 заменяется V, L, I, F, Y, W, Н, K и R. Предпочтительно аминокислота W 414 заменяется R, K, F, Y, Н, Е и D. Предпочтительно аминокислота W 417 заменяется R, K, F, Y, Н, Е и D. Предпочтительно аминокислота F 435 заменяется V, L, I, M, Р, Y, W, Н, K и R. Предпочтительно аминокислота Р 436 заменяется V, L, I, M, F, Y или W.
Предпочтительно аминокислота L 437 заменяется D или Е.
Предпочтительно аминокислота R 438 заменяется K, D, H, N, М, Е, Q, S, T, Y или W. Предпочтительно аминокислота S 439 заменяется K, D, Е, Н, R, M, T, N, Q, Y или W. Предпочтительно аминокислота Н 440 заменяется V, I, M, F, Y, W, Е или D. Предпочтительно аминокислота Р 443 заменяется V, L, I, M, F, Y, W или S. Предпочтительно аминокислота N 445 заменяется D, Q, H, F, L, R, K, М, S, Y или W. Предпочтительно аминокислота V 448 заменяется F, L, I, M, Р, Y или W. Предпочтительно аминокислота I 449 заменяется F, L, V, М, Р, Y или W. Предпочтительно аминокислота L 452 заменяется F, I, V, М, Р, Y или W. Предпочтительно аминокислота М 456 заменяется F, I, L, Р, Y, W, S, T, N, Q, K или D. Предпочтительно аминокислота S 475 заменяется М, Т, N, Q, Y или W. Предпочтительно аминокислота K 488 заменяется R, M, S, Т, N, Q, Y или W. Предпочтительно аминокислота Y 490 заменяется Е, Н, K, R, Q, F, T, M, S, N, Q или W. Предпочтительно аминокислота D 492 заменяется G, E, M, S, Т, N, Q, Y, W, Н, K и R. Предпочтительно аминокислота I 476 заменяется G, А, V, L, М, F, Y или W. Предпочтительно аминокислота F 478 заменяется G, А, V, L, I, Y или W.
Соответствующие положения в аминокислотной последовательности различных GDF-5-родственных белков легко могут быть получены из вышеприведенной информации, касающейся GDF-5 дикого типа.
В соответствии с первым вариантом осуществления по крайней мере одна гидрофобная аминокислота в участке связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена на гидрофильную или полярную аминокислоту. Примерами гидрофильных или полярных аминокислотных остатков являются аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, гистидин, серин и треонин.
В соответствии со вторым вариантом осуществления по крайней мере одна гидрофильная или полярная аминокислота в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA у GDF-5-родственного белка заменена на гидрофобную аминокислоту. Примерами гидрофобных аминокислот являются аланин, лейцин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления белок по настоящему изобретению содержит консервативную замену по крайней мере одной аминокислоты в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA у GDF-5-родственного белка. Это означает, что характер аминокислоты, которая была первоначально, сохраняется. Соответственно гидрофильная или полярная аминокислота заменяется другой гидрофильной или полярной аминокислотой или гидрофобная аминокислота заменяется другой гидрофобной аминокислотой.
Предпочтительно консервативную замену выбирают таким образом, что аминокислота заменяется на другую аминокислоту, имеющую отличное стерическое требование. В соответствии с этим аспектом изобретения гидрофобную аминокислоту можно заменить меньшей или большей гидрофобной аминокислотой или гидрофильную или полярную аминокислоту можно заменить меньшей или большей гидрофильной или полярной аминокислотой.
Аминокислотные замены в GDF-5-родственных белках можно разделить на 4 группы в зависимости от характера аминокислот:
I. Основные аминокислотные остатки (R, K, Н), замененные на
a) гидрофобные (V, L, I, M, P, F, Y, W),
b) кислые (Е, D),
c) основные аминокислотные остатки, которые не идентичны I (R, K, Н),
d) полярные (S, T, N, Q).
II. Кислые аминокислотные остатки (D), замененные на
a) гидрофобные (М, Y, W, G),
b) кислые (Е),
c) основные (R, K, Н),
d) полярные (S, T, N, Q).
III. Гидрофобные аминокислотные остатки (М, V, L, I, P, F, Y, W, А), замененные на
a) гидрофобные аминокислотные остатки, которые не идентичны III (M, V, L, I, P, F, Y, W, G, А),
b) кислые (Е, D),
c) основные (R, K, Н),
d) полярные (S, T, N, Q) d) малые (А).
IV. Полярные аминокислотные остатки (S, T, N), замененные на
a) гидрофобные (М, V, L, I, P, F, Y, W),
b) кислые (Е, D),
c) основные (R, K, Н),
d) полярные аминокислотные остатки, которые не идентичны IV (S, T, N, Q).
В предпочтительном варианте осуществления GDF-5-родственный белок по настоящему изобретению содержит последовательность, которая соответствует одной из следующих последовательностей
аминокислот: а)
ZCX1X2KX3LHVX4ZZZZZZZZZX7lAPLX8YEAX9HCX10GX11CZZZZZZZZZZZZZ
ZZZZZZZZZZX13PXi4X15X16PXi7X18CCVPX19X2oLX2iPIZILX22X23DX24X25NNW YZZZZZZWEX27CGCR
или b)
ZCXiX2KX3LHVX4FX5X6ZZZDDZX7lAPLX8YEAX9HCXioGXiiCXi2ZZZZZZLEZTZH AZZQTZZNZZXi3PXi4Xi5Xi6PXi7Xi8CCVPXi9X2oLX2iPIZILX22X23DX24X25NNWYZX26Z ZZMWEX27CGCR
и где
каждый X обозначает любую аминокислоту, каждый Z обозначает любую аминокислоту.
Эти генерические последовательности были составлены из сравнения доменов цистин-узла последовательностей GDF-5, GDF-6 и GDF-7 позвоночных. Положения, которые не сохраняются в выровненных белках, обозначаются как "X" в генерических последовательностях. Положения, которые были видоизменены в соответствии с настоящим изобретением, обозначены Z.
В более предпочтительном варианте осуществления GDF-5-родственный белок по изобретению содержит последовательность, которая соответствует одному из вышеуказанных генерических последовательностей аминокислот, и где
XI обозначает аспарагин (N) или серин (S),
Х2 обозначает аргинин (R) или лизин (K),
Х3 обозначает аланин (А), глутамин (Q), пролин (Р) или серин (S), Х4 обозначает аргинин (R) или лизин (K),
Х5 обозначает аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е), Х6 обозначает лейцин (L) или метионин (М), Х7 обозначает изолейцин (I) или валин (V),
Х8 обозначает аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е), Х9 обозначает гистидин (Н), фенилаланин (F) или тирозин (Y), Х10 обозначает аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е),
XII обозначает лейцин (L), метионин (М) или валин (V),
X12 обозначает аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е),
X13 обозначает аланин (А), аспарагин (N) или аспарагиновую кислоту (D),
X14 обозначает аргинин (R), аспарагин (N), аспарагиновую кислотуф), глутаминовую кислоту (Е), глицин (G) или серин (S),
X15 обозначает аланин (А), аспарагин (N), серин (S) или треонин (Т), X16 обозначает аланин (А), метионин (м) или треонин (Т), X17 обозначает аланин (А) или пролин (Р), X18 обозначает серин (S) или треонин (Т), X19 обозначает аланин (А), серин (S) или треонин (Т), Х20 обозначает аргинин (R) или лизин (K), X21 обозначает серин (S) или треонин (Т), Х22 обозначает фенилаланин (F) или тирозин (Y), Х23 обозначает изолейцин (I) или треонин (Т), Х24 обозначает аланин (А) или серин (S), Х25 обозначает аланин (А) или глицин (G), Х26 обозначает глутаминовую кислоту (Е) или глутамин (Q), Х27 обозначает аланин (А), глутамин (Q), серин (S) или треонин (Т) и каждый Z обозначает любую аминокислоту.
В определенном варианте осуществления GDF-5-родственный белок по изобретению является производным от GDF-5 дикого типа. В соответствии с этим определенным аспектом GDF-5-родственный белок содержит последовательность, которая соответствует одной из следующих генерических аминокислотных последовательностей а)
ZCSRKALHVNZZZZZZZZZIIAPLEYEAFHCEGLCZZZZZZZZZZZZZZZZZZ
ZZZZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNWYZZZZZZWESCGCR
ZCSRKALHVNFKDZZZDDZIIAPLEYEAFHCEGLCEZZZZZZLEZTZHAZZQTZZNZZ
DPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNWYZQZZZMWESCGCR
где каждый Z обозначает любую аминокислоту.
Примером белка, как описано выше, является вариант GDF-5 человека, в котором остаток трипто
фана в положении 414 заменен на аргинин (W414R). В отношении зрелой последовательности GDF-5 (SEQ ID NO:4) это соответствует замене в положении 33.
Удивительно, но оказалось, что этот вариант белка обладает значительно сниженной аффинностью к BMPR-IA. В отличие от этого аффинность к BMPR-IB практически не затронута. Также предпочтительными являются другие варианты GDF-5-родственных белков, содержащих аминокислотные замены, отличные от W414R.
Пример указанных вариантов GDF-5-родственных белков представляет собой вариант GDF-5 человека, в котором остаток изолейцина в положении 449 заменен на валин (I449V). В отношении зрелой последовательности GDF-5 (SEQ ID NO:4) это соответствует замене в положении 68. Указанный вариант белка обладает уменьшенной аффинностью к BMPR-IA и повышенной аффинностью к BMPR-IB. Еще один типичный вариант GDF-5-родственных белков содержит аминокислотную замену R399E. В отношении зрелой последовательности GDF-5 (SEQ ID NO:4) это соответствует замене в положении 18. Указанный вариант белка обладает уменьшенной аффинностью к BMPR-IA. Еще одним типичным вариантом GDF-5 человека является вариант, у которого остаток серина в положении 439 заменен на глутами-новую кислоту (S439E). В отношении зрелой последовательности GDF-5 (SEQ ID NO:4) это соответствует замене в положении 58. Указанный вариант белка обладает уменьшенной аффинностью к BMPR-IA.
Еще одним типичным вариантом GDF-5 человека является вариант, в котором остаток аргинина в положении 399 заменен метионином (R399M). В отношении зрелой последовательности GDF-5 (SEQ ID NO:4) это соответствует замене в положении 18. Указанный вариант белка обладает существенно увеличенной аффинностью к BMPR-IB.
Предпочтительно GDF-5-родственные белки по настоящему изобретению присутствуют в качестве "изолированных" белков. Это означает, что белок по настоящему изобретению в существенной степени отделен от других белков и пептидных молекул, которые присутствуют в природном источнике изолированного белка (например, другие полипептиды белков из природного источника). Например, рекомби-нантный экспрессированный пептид считается изолированным. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения GDF-5-родственный белок представляет собой рекомбинантный белок. Далее, пептид также считается изолированным, если он был изменен из-за вмешательства человека или экспрессирован в организме, который не является его природным источником. Кроме того, "изолированный" белок свободен от некоторого другого клеточного материала, с которым он природно ассоциирован, или среды для культивирования клеток при продуцировании с использованием рекомбинант-ных технологий или химических веществ-прекурсоров или других химических агентов, в случае синтеза химическим путем. Специально исключенными из определения термина "изолированный" белок являются неочищенные смеси или композиции.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота имеет последовательность такую, что достигается замена одного или более аминокислотных остатков, относящихся к сайту связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA соответствующего GDF-5-родственного белка дикого типа. Триплеты оснований, кодирующие эти аминокислоты, и вырожденность генетического кода, как правило, известны. Нуклеиновая кислота может представлять собой последовательность ДНК и/или последовательность РНК при условии, что белок в соответствии с изобретением может быть получен с этой нуклеиновой кислоты при экспрессии в подходящей системе. Нуклеиновые кислоты изобретения могут быть полностью или частично синтетические. Нуклеиновые кислоты содержат одноцепочечные и/или полностью или частично двуцепочечные полинуклеотидные последовательности. Нуклеиновые кислоты могут быть произведены с помощью любых средств, включая геномные препараты, препараты кДНК, синтез in vitro, ПЦР, ПЦР в реальном времени и/или транскрипция in vitro или in vivo.
Особенно предпочтительными являются "изолированные" нуклеиновые кислоты, которые в существенной степени отделены от молекул нуклеиновых кислот, которые присутствуют в естественном источнике нуклеиновой кислоты (например, последовательности, кодирующие другие полипептиды). Предпочтительно "изолированная" нуклеиновая кислота не содержит, по крайней мере, некоторые из последовательностей, которые природно фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в своем природном репликоне. Например, клонированная нуклеиновая кислота считается изолированной. Нуклеиновая кислота также считается изолированной, если она была изменена из-за вмешательства человека или помещена в локус или положение, которое не является ее природным положением или если ее вводят в клетку. Кроме того, изолированная нуклеиновая кислота может не содержать что-то из другого клеточного материала, с которым она природно ассоциирована, или питательной среды при производстве по рекомбинантной технологии, или химических веществ-прекурсоров, или других химикатов при синтезировании химическим путем.
В предпочтительном способе нуклеиновые кислоты по изобретению можно подготовить путем синтеза всего гена или путем сайт-направленного мутагенеза нуклеиновой кислоты, кодирующей GDF-5-родственный белок дикого типа или модифицированные GDF-5-родственные белки. Можно использовать способы, включающие в себя матричное направленное лигирование, рекурсивный ПЦР, кассетный мутагенез, сайт-направленный мутагенез или иные способы, которые хорошо известны в рассматривае
мой области.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут включать дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, которые могут добавлять дополнительные функции изолированным нуклеиновым кислотам по изобретению. Например, такие дополнительные последовательности нуклеиновых кислот могут включать последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют правильно экспрессировать белок по изобретению, и могут включать в себя промоторные последовательности, ре-гуляторные последовательности, стоп-сигналы, участки начала репликации и прочее. Специалистам известно о таких функциональных последовательностях нуклеиновых кислот и о том, как организовать их, чтобы получить молекулу нуклеиновой кислоты с заданными свойствами.
Экспрессионные векторы являются дополнительным предметом рассмотрения по настоящему изобретению, где нуклеиновая кислота встраивается в соответствующую векторную систему, векторная система, выбранная в соответствии с желаемой экспрессией белка. Векторная система может представлять собой эукариотическую векторную систему, но предпочтительно является прокариотической векторной системой, с помощью которой белки можно продуцировать особенно легко и чисто. Подходящий экс-прессионный вектор, например, представлен в документе WO 96/33215. Экспрессионный вектор может также быть вирусным вектором, который может использоваться, например, в подходах генной терапии.
Клетки-хозяева и трансгенные организмы также являются предметом рассмотрения по настоящему изобретению. Клетки-хозяева и трансгенные организмы характеризуются тем, что они содержат нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением, и что они могут использовать информацию, содержащуюся в нуклеиновых кислотах и в векторе экспрессии соответственно для экспрессии белков в соответствии с изобретением. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансгенным организмам или клеткам, транзиентно или стабильно трансформированным или трансфициро-ванным по крайней мере одной нуклеиновой кислотой или по крайней мере одним вектором, кодирующим белок по изобретению, или потомству таких трансгенных организмов или клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам, клеточным культурам, тканям и/или частям трансгенных организмов по изобретению. Подразумевается, что для целей настоящего изобретения термин "трансгенный организм" включает в себя не только организм, в который нуклеиновая кислота по изобретению была транзиентно или стабильно введена, но также относится к потомству таких организмов независимо от расстояния поколения, при условии, что эти организмы по-прежнему содержат нуклеиновую кислоту по изобретению и экспрессируют белок по изобретению.
Предпочтительно трансгенный организм или клетка является прокариотического или эукариотиче-ского происхождения.
Предпочтительно трансгенный организм представляет собой микроорганизм. Предпочтительные микроорганизмы представляют собой бактерии, дрожжи, водоросли и грибки. Подходящие клетки-хозяева предпочтительно представляют собой прокариотические клетки, в частности штаммы Е. coli. Особенно полезными клетками-хозяевами выступают ответчики Е. coli W3110, как показано, например, в WO 96/33215. В предпочтительном варианте осуществления клетки-хозяева предпочтительно человеческого происхождения также могут быть полезны для трансплантации пациентам, которые нуждаются в этом.
Подготовка трансформированного организма или трансформированной клетки требует введения соответствующей ДНК в соответствующий организм-хозяин или клетку. Множество способов доступно для этого процесса, который называется трансформацией. Так, путем примера ДНК можно вводить непосредственно с помощью микроинъекции или путем бомбардировки микрочастицами или наночастицами с ДНК-покрытием. Химически можно также получить клетки с нарушенной проницаемостью мембраны, например с помощью полиэтиленгликоля, так что ДНК может войти в клетку путем диффузии. С помощью слияния протопластов ДНК также может быть трансформирована с другими ДНК-содержащими единицами, такими как мини-клетки, клетки, лизосомы или липосомы. Другой подходящий способ введения ДНК представляет собой электропорацию, при котором клетки при помощи электрического импульса становятся обратимо проницаемыми.
Другим предметом рассмотрения по настоящему изобретению является способ получения белка, имеющего улучшенную способность стимулировать образование хрящей и сниженную способность стимулировать образование костной ткани, включающий в себя следующие стадии:
(i) рандомизация по крайней мере одного аминокислотного положения в области GDF-5-родственного белка, относящейся к сайту связывания BMPR-IB и/или BMPR-IA, с целью получения белковых вариантов,
(ii) анализ белковых вариантов, полученных в (i), в плане их аффинности к BMPR-IB и/или BMPR-
IA,
(iii) выбор тех белковых вариантов, которые обеспечивают увеличенную аффинность к BMPR-IB и/или сниженную аффинность к BMPR-IA.
Области GDF-5-родственного белка, участвующие в связывании с BMPR-IA или BMPR-IB, известны в рассматриваемой области. В стадии (i) по крайней мере одно аминокислотное положение в одной из или в обеих этих областях является случайным. Предпочтительно рандомизировать по крайней мере два,
три или более аминокислотных положений. Аминокислоты, присутствующие в последовательности GDF-5-родственного белка дикого типа, заменяются на другие аминокислоты путем химической модификации или предпочтительно с помощью технологии генетической инженерии. Способы получения рандомизированных белковых вариантов стадии (i) охватывают синтетический de novo синтез белков и/или экспрессию белков с нуклеиновых кислот, кодирующих это. В определенном предпочтительном способе белковые варианты стадии (i) подготавливают путем экспрессии с помощью соответствующих нуклеиновых кислот.
Предпочтительно белковые варианты получают для всех других возможных аминокислотах в соответствующем положении. При этом также возможно осуществлять только конкретные замены одной или нескольких аминокислот на другие аминокислоты. Например, гидрофильные аминокислоты могут быть заменены гидрофобными аминокислотами. Кроме того, гидрофобные аминокислоты могут быть заменены гидрофильными аминокислотами. Также возможна консервативная замена, при которой гидрофильный или гидрофобный характер сохраняется. Путем замены предпочтительно осуществляется обмен на аминокислоту с другим стерическим требованием.
Множество белковых вариантов, полученных на стадии (i), затем анализируют с учетом их аффинности к BMPR-IB и/или BMPR-IA. Это можно проводить способом, который известен и обычен в технической области. Способы оценки белково-рецепторных взаимодействий представляют собой обычную практику.
На стадии (iii) отбирают те белковые варианты, которые обеспечивают увеличенную аффинность к BMPR-IB и/или сниженную аффинность к BMPR-IA. С удивлением было установлено, что эти конкретные белки имеют улучшенную способность стимулировать образование хрящей и сниженную способность стимулировать образование костной ткани.
Другой предмет рассмотрения по настоящему изобретению относится к антителу против GDF-5-родственных белков по изобретению. Эти антитела специфичны для заявленных рекомбинантных GDF-5-родственных белков. Предпочтительно они специфичны для областей GDF-5-родственных белков, содержащих один или более аминокислотных замен, описанные в настоящем документе. Предпочтительно антитела являются специфическими для области рекомбинантного белка, полученного от GDF-5-родственного белка, относящиеся к сайту связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA. Эти антитела в соответствии с настоящим изобретением можно образовать с помощью тех фрагментов белков по изобретению, как описано выше, в качестве иммуногенов для создания антител с помощью известных способов. Антитела могут быть поликлональными и моноклональными, и они могут представлять собой антитела любых изотипов. Включают также фрагменты антител, такие как Fab-фрагменты или Fab2-фрагменты. Антитела могут также быть гуманизированными антителами или генерическими антителами и др.
Антитела по настоящему изобретению являются, среди прочего, подходящими в качестве аналитического инструмента. Они могут быть использованы для исследования абсорбции и распределения белка в соответствии с изобретением в организме. Кроме того, вышеописанные антитела подходят для изучения кинетики высвобождения.
Далее, предметом рассмотрения по настоящему приложению является фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный GDF-5-родственный белок, или нуклеиновую кислоту, или вектор, или клетку-хозяин в соответствии с изобретением. В принципе подходят любые фармацевтические композиции, которые уже были опубликованы в контексте GDF-5 родственных белков. Экспрессионный вектор или клетка-хозяин может рассматриваться предпочтительным в качестве активного вещества в фармацевтической композиции. Также комбинации белка в соответствии с изобретением с другими белками могут использоваться в предпочтительных фармацевтических композициях. Разумеется, изобретение также включает в себя фармацевтические композиции, содержащие другие вещества, как, например, фармакологически приемлемые добавки или носители. Состав может включать в себя антиоксиданты, консерванты, красители, вкусовые и эмульсирующие агенты, суспендирующие агенты, растворители, наполнители, наполняющие агенты, буферы, средства доставки, вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты. Например, подходящим носителем или средством доставки может быть вода для инъекций, физиологический солевой раствор или физиологический раствор, смешанный с подходящим белком-носителем, например сывороточным альбумином. Предпочтительным антиоксидантом для подготовки композиции по настоящему изобретению является аскорбиновая кислота.
Растворитель или разбавитель фармацевтической композиции может быть либо водным или неводным и может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители, которые способны изменять и/или поддерживать рН, осмолярность, вязкость, прозрачность, размер, стерильность, стабильность, скорость растворения или запах состава. Подобным образом и другие компоненты могут быть включены в фармацевтическую композицию в соответствии с изобретением, чтобы модифицировать и/или поддерживать скорость высвобождения фармацевтически эффективного вещества. Такие модифицирующие компоненты представляют собой вещества, обычно используемые в рассматриваемой области, чтобы сформулировать дозы для парентерального введения либо в единичной, или мультидозовой форме.
Наконец, составленная фармацевтическая композиция, подготовленная в соответствии с настоящим изобретением, может храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии,
твердого или обезвоженного или лиофилизированного порошка. Эти составы могут храниться либо в готовом для использования виде или в виде, например, лиофилизированного порошка, который требует разведения перед введением. Вышеописанные и другие подходящие фармацевтические составы известны в рассматриваемой области и описаны, например, в Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712). Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo фармацевтически эффективного компонента.
Другие эффективные формы введения включают парентеральную с замедленным высвобождением, т.е. составы с замедлением, ингаляционные аэрозоли или пероральные активные составы. Например, состав с медленным высвобождением может включать белки, связанные с или включенные в твердые препараты полимерных соединений (например, молочная кислота, полигликолевая кислота и др.) или липо-сомы.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением также может быть составлена для парентерального применения, например путем инфузии или инъекции, а также может включать составы замедленного высвобождения или составы с устойчивой циркуляцией. Такие парентерально вводимые лечебные составы, как правило, существуют в виде апирогенных, парентерально приемлемых водных растворов, содержащих фармацевтически эффективный компонент(ы) в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе.
Фармацевтическая композиция может содержать матричный материал, например, в тех случаях, когда предполагается регенерация хряща. Для белка, нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки-хозяина полезно, когда они применяются в и/или на биосовместимом матричном материале. Матричный материал, как используется в настоящем документе, означает, что носитель или матрицу, действующую в качестве остова для клеточного привлечения, присоединения, пролиферации и дифференци-ровки и/или в качестве потенциального устройства доставки и хранения рекомбинантных GDF-5-родственных белков по изобретению. В отличие от твердых матриц носители состоят из аморфных материалов, не имеющих никакой определенной поверхности и не имеющих определенной формы, а именно алкилцеллюлоза, поверхностно-активные вещества плуроник, желатины, полиэтиленгликоли, декстрины, растительные масла, сахара и другие жидкие и вязкие вещества.
Типичные матричные материалы представляют собой такие, как описанные, например, в документе WO 98/21972. Эти матричные материалы пригодны для белков в соответствии с изобретением. Матричный материал можно будет пересаживать пациенту, например, хирургическим путем, причем белок или ДНК, кодирующая белок, может медленно высвобождаться из матричного материала и затем сохранять эффективность в течение длительного периода времени. Все виды матричных материалов полезны в соответствии с настоящим изобретением при условии, что они биосовместимы и выбраны для предназначенной области или показания применения. Матричный материал может представлять собой природный материал, модифицированный природный материал, а также синтетический материал. Охватываются все уже известные матрицы для морфогенетических белков. Внеклеточный матрикс включает примеры различных коллагенов, как, например, I, II, V, IX, X, XI и XIII типов, далее протеогликаны и глюкозаминг-ликаны, как, например, хондроитинсульфаты, бигликаны, декорины и/или гиалуроновая кислота или не-коллагеновые белки, как например, остеопонтин, ламинин, фибронектин, витронектин и белок хрящевого матрикса. Все упомянутые природные материалы могут также использоваться в искусственно измененных формах. В качестве неограничивающего списка полезных носителей и матриц (см. также Kirker-
Head, 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92).
Другой предмет рассмотрения по настоящему изобретению относится к липосомальным составам, включающим рекомбинантный GDF-5-родственный белок в соответствии с изобретением. Липосомы, используемые в указанных составах, хорошо известны специалистам в рассматриваемой области. В частности, предпочтительные липосомальные составы раскрыты в WO 2008/049588. Более предпочтительные липосомальные составы приведены на с. 9-13 документа WO 2008/049588.
Кроме того, GDF-5-родственные белки по изобретению можно применять в сочетании с другими фармакологически активными веществами. Указанные фармакологически активные вещества могут представлять собой, например, болеутоляющие средства, такие как локально эффективные болеутоляющие средства или другие вещества, оказывающие положительный эффект на течение заболеваний, при которых желательно образование хрящей, наподобие ингибиторов протеаз. Это лишь примеры возможных добавок, а специалист в рассматриваемой области может легко добавить и другие наполнители, используемые в фармацевтических препаратах, или которые в целом считаются безопасными.
Благодаря своей усиленной способности стимулировать образование хрящей рекомбинантные GDF-5-родственные белки по настоящему изобретению особенно подходят для применения в комплексной терапии заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным. Таким образом, еще одним аспектом настоящего изобретения является использование настоящих белков, нуклеиновых кислот, векторов или клеток-хозяев при лечении этих заболеваний. В частности, настоящие белки, нуклеиновые кислоты, векторы или клетки-хозяева используют при лечении дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща,
при определенных возрастных дефектах хрящей, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм,
заболеваниях, которые могут повлиять на хрящ, как хондродистрофии, заболевания, характеризующиеся нарушением роста и последующим окостенением хрящей, ахондроплазия, реберный хондрит, грыжа межпозвоночного диска и восстановление спинного диска, рецидивирующий полихондрит,
восстановление дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественные наподобие хондромы или хондросаркомы.
Другим вариантом осуществления по настоящему изобретению является способ лечения заболеваний, при которых образование хрящей желательно, а образование костной ткани является нежелательным, включающий стадию введения белка, нуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина, в соответствии с изобретением, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
В настоящем документе термин "лечение" относится к обращению, смягчению или ингибированию прогрессирования заболевания, расстройства или состояния или одного или более симптомов такого заболевания, расстройства или состояния, к которому этот термин применяется. Как используемые в настоящем документе, лечение может также относиться к снижению вероятности или частоты возникновения заболевания, расстройства или состояния у млекопитающего, по сравнению с непрошедшей лечение контрольной популяцией или по сравнению с тем же млекопитающим до начала лечения. Например, как используется в настоящем документе, лечение может относиться к предотвращению заболевания, расстройства или состояния и может включать отсрочку или предотвращение наступления заболевания, расстройства или состояния, или отсрочку или предотвращение симптомов, связанных с заболеванием, расстройством или состоянием. Как используется в настоящем документе, лечение может относиться также к снижению степени тяжести заболевания, расстройства или состояния, или симптомов, связанных с таким заболеванием, расстройством или состоянием перед страданием млекопитающего от болезни, расстройства или состояния. Такое предупреждение или уменьшение тяжести заболевания, расстройства или состояния перед страданием относится к введению состава по настоящему изобретению, как описано в настоящем документе, субъекту, который в момент введения не страдает от болезни, расстройства или состояния. Как используется в настоящем документе, лечение может также относиться к предупреждению рецидива заболевания, расстройства или состояния или одного или более симптомов, связанных с таким заболеванием, расстройством или состоянием.
Следующие примеры вместе с фигурами и протоколами последовательностей предназначены для дальнейшей иллюстрации изобретения.
SEQ ID NO:1 показывает последовательность ДНК, и SEQ ID NO:2 показывает белковую последовательность предшественника GDF-5 человека.
SEQ ID NO:3 показывает последовательность ДНК, и SEQ ID NO:4 показывает белковую последовательность зрелого мономерного GDF-5 человека.
Фигуры.
Фиг. 1 демонстрирует дополнительные особенности предшественника белка GDF-5 человека в соответствии с SEQ ID NO:2:
а.к. 001-381 препродомен (жирным шрифтом),
а.к. 001-027 сигнальный пептид (жирным шрифтом и подчеркиванием),
а.к. 382-501 часть зрелого белка,
а.к. 400-501 домен цистин-узла (подчеркнуто).
Фиг. 2 демонстрирует сравнение 102 а.к. доменов цистин-узла GDF-5 человека (SEQ ID NO:2), GDF-6 человека (последовательность 26 из патента США № 5658882) и GDF-7 человека (последовательность 2 из патента США № 5658882). Аминокислотные остатки, которые являются идентичными у всех трех молекул, выделены жирным шрифтом.
Фиг. 3 демонстрирует результаты анализа со щелочной фосфатазой (ALP) мутанта W414R реком-бинантного GDF-5 человека (как описано в примере 2).
Фиг. 4 демонстрирует результаты анализа со щелочной фосфатазой (ALP) мутанта I449V рекомби-нантного GDF-5 человека (как описано в примере 3).
Фиг. 5 демонстрирует результаты анализа со щелочной фосфатазой (ALP) мутанта R399E рекомби-нантного GDF-5 человека (как описано в примере 3).
Фиг. 6 демонстрирует результаты анализа со щелочной фосфатазой (ALP) мутанта S439E рекомби-нантного GDF-5 человека (как описано в примере 3).
Фиг. 7 демонстрирует результаты анализа со щелочной фосфатазой (ALP) мутанта R399M реком-бинантного GDF-5 человека (как описано в примере 3).
Фиг. 8 демонстрирует результаты анализа со щелочной фосфатазой (ALP) мутанта W414R реком-бинантного GDF-5 человека (как описано в примере 3).
Пример 1. Создание, экспрессия и очистка GDF-родственных белков.
ДНК, кодирующие зрелые части белков GDF-5 человека, GDF-6 человека и GDF-7 человека, были изолированы из клеток-предшественников Роб-С26 костной ткани человека (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) при помощи RT-PCR и затем лизировали в прокариотические плазмидные векто
ры. В целях идентификации функционально важных аминокислотных остатков в зрелых частях GDF-5, -6 и -7 различные точечные мутации были введены в эти последовательности с помощью сайт-направленного мутагенеза. Все отдельные мутации были созданы с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChangeTM с ДНК-полимеразой PfuTurboTm и эндонуклеазой DPN 1 от Stratagene в соответствии с инструкцией производителя.
Используя бактериальный штамм W31 10ВР, трансформированный плазмидами и стимулированный ИПТГ, белки были экспрессированы в телах включения. Эти тела включения были изолированы с помощью буфера для гомогенизации (25 мМ Трис-HCl рН 7,3, 10 мМ ЭДТК NaOH рН 8, 8М мочевина) и промывочного буфера (1М мочевина, 20 мМ Tris HCl, рН 8,3, 10 мМ ЭДТК NaOH, рН 8,0) в соответствии со стандартными процедурами. Дальнейшая очистка проводилась на колонке для обращенно-фазовой хроматографии Aquapore Octyl (Applied Biosys, (CV=7,8 мл) 100x10, 20мкм, № 186470) с градиентом от 100% элюента А (0,1% ТФУ, ВЭЖХ Н2О) до 100% элюента В (0,1% ТФУ, 90% CH3N, ВЭЖХ Н2О) в течение 104 мин (скорость протока 3 мл/мин). После вестерн-блот-контроля фракции, содержащие мутант-ный белок, были объединены и лиофилизированы.
Мутантные белки растворяли в буфере (6М гуанидин-HCl, 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 3 мМ DTT, рН 8,0), концентрация белка была точно доведена до 2,6 мг/мл и рН был скорректирован между 8 и 9. Через 2 ч инкубации при комнатной температуре добавляли рефолдинг-буфер (1М NaCl, 50 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ GSSG, 2 мМ GSH, 33 мМ Chaps, pH 9,5) при осторожном взбалтывании для достижения конечной концентрации 0,16 мг/мл.
Раствор затем инкубировали в течение 48 ч при 22°С, и рефолдинг останавливали путем изменения рН до 3-4 добавлением 18% HCl. После центрифугирования не свернутый мономер отделяли от димер-ной формы путем проведения второго RP-HPLC при тех же условиях. Фракции, содержащие димеризо-ванный белок, объединяли, лиофилизировали и хранили при температуре -70°С.
Пример 2. Определение биологической активности различных вариантов GDF-родственных белков in vitro при помощи ALP-анализа.
2,0x105 клеток С2С12-1Ь (клеточная линия, стабильно сверхэкспрессирующая рецептор BMPR-IB) и клетки С2С12 инкубировали в течение 3-4 дней в 20 мл среды для культивирования клеток (alpha-MEM, пенициллин/стрептомицин, 2 мМ L-глютамина, 10% FCS) при 37°С, 5% СО2, H^-насыщенном. Клетки затем промывали PBS (буферизованный фосфатом солевой раствор), обрабатывали трипсином и ресус-пендировали в культуральной среде до плотности 3x104 клеток/мл. 150 мкл переносили в каждую лунку 96-луночного культурального планшета и инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% СО2, H2O-насыщенном. После промывки средние лунки заполняли 120 мкл новой культуральной средой. Добавляли 40 мкл различных разведений мутантного белка или белка дикого типа (растворенного в 10 мМ HCl и разведенного по крайней мере в 250 раз в среде), а затем инкубировали еще в течение 72 ч при 37°С, 5% СО2, Н2О-насыщенном. После промывки PBS добавляли 150 мкл раствора для лизиса (0,2% Nonidet P40, 0,2г MgCl2x6Н2О, доведенного до 1000 мл водой), и затем инкубировали 15-18 ч при 37°С, 5% СО2, H2O-насыщенном. 50 мкл из каждой лунки затем переносили в новый 96-луночный планшет. 50 мкл раствор субстрата (2,5х-кратный диэтаноламиновый субстратный буфер+148 г/л PNPP (натрия р-нитрофенилфосфат)), затем добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 4 мин при 37°С, 5% СО2, H2O-насыщенном. ALP-реакцию затем останавливали при помощи 100 мкл 30 г/л NaOH и, наконец, определяли оптическую плотность при помощи автоматического ридера для микропланшетов при 405 нм с учетом вычета пустого значения.
В качестве примера результаты (среднее значение из 2-х независимых экспериментов) в отношении hGDF-5-мутанта W414R для клеток С2С12-1Ь показаны на фиг. 3. Пять различных концентраций белка (14, 44,5, 133,2, 400 и 1200 нг/мл) использовали в этом анализе. Мутантный белок W414R проявлял биологическую активность в клетках, где был сверхэкспрессирован рецептор BMPR-IB (клетки С2С12-Ш), что указывает на то, что сайт связывания с BMPR-IB у W414R является функционально активным. Белок дикого типа (rhGDF-5) служил контролем в тест-системе.
Дополнительные результаты биологической активности других мутантов hGDF-5 для клеточных линий С2С12 и С2С12-1Ь приведены в таблице.
Пример 3. Определение биологической активности различных вариантов GDF-родственных белков in vitro при помощи ALP-анализа.
5х105 клеток ATDC-5-клеток и 5х105 клеток МСНТ1/26 инкубировали в течение 3-4 дней в 20 мл среды для культивирования клеток (alpha-MEM, пенициллин/стрептомицин, 2 мМ L-глютамина, 10% FCS, для МСНТ1/26; DMEM/F12 (1:1), 5% FCS) при 37°С, 5% CO2, HO-насыщенном. Клетки затем промывали PBS (буферизованный фосфатом солевой раствор), обрабатывали трипсином и ресуспендирова-ли в культуральной среде до плотности 3х104 клеток/мл. 150 мкл переносили в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% CO2, Н2О-насыщенном. После промывки средой лунки заполняли 120 мкл новой питательной средой для МСНТ1/26 и 120 мкл тест-средой для ATDC-5 (DMEM/F12 (1:1), 0,5% FCS) плюс добавляли 40 мкл различных разведений мутантного белка или белка дикого типа (растворенного в 10 мМ HCl и разведенного по крайней мере в 250 раз в
среде), а затем еще одна стадия инкубации в течение 72 ч при 37°С, 5% CO2, H^-насыщенном. После промывки PBS добавляли 150 мкл раствора для лизиса (раствора для лизиса МСНТ1/26: 0,2% Nonidet P40, 1 мМ MgCl2; раствора для лизиса ATDC-5: 100 мМ Na-глицин, 1% Nonidet P40, 1 мМ MgCl2), с последующей инкубацией в течение 1 ч для ATDC-5 и 15-18 ч для МСНТ1/26: 37°С, 5% CO2, H2O-насыщенном. 50 мкл из каждой лунки затем переносили в новый 96-луночный планшет. 50 мкл раствор субстрата (2,5-кратный диэтаноламиновый субстратный буфер+148 г/л PNPP (натрия р-нитрофенил-фосфат)) затем добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение еще 60 мин при 37°С, 5% CO2, H^-насыщенном. ALP-реакцию затем останавливали при помощи 100 мкл 30 г/л NaOH и, наконец, определяли оптическую плотность при помощи автоматического ридера для микропланшетов при 405 нм с учетом вычета пустого значения.
Типичные результаты (средние значения 2 независимых экспериментов) для hGDF-5-мутантов I449V, R399E, S439E, R399M, W414R показаны на фиг. 4-8 соответственно. Пять различных концентраций белка (14,8, 44,5, 133,2, 400, 1200 нг/мл) использовали в этом анализе. По сравнению с белком GDF-5 дикого типа мутантные белки имеют более высокую биологическую активность на клетках ATDC-5 по сравнению с клетками МСНТ1/26 в этой тест-системе.
Пример 4. Определение аффинности GDF-5-родственных белков при помощи системы Biacore.
Систему BiacoreT100 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB) использовали для всех биосенсорных экспериментов. Около 200 резонансных единиц (RU) Fc-слитых белковых рецепторных эктодо-менов BMPR-IB, BMPR-IA или BMPR-II было иммобилизовано на белок G CM5 биосенсорных чипах. Сенсограммы взаимодействия записывали при скорости потока 60 мкл/мин при 30°С в 10 мМ HEPES (рН 7,4), 300 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА, 0,005% Tween 20. Эксперименты проводились в двух повторностях с использованием концентраций лиганда от 0,05 до 100 нМ. Все наблюдаемые аффинности связывания были получены с помощью BIAevaluation v. 2.2.4 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St.Giles, GB). Аффинности взаимодействия лиганда и рецептора I типа были получены путем аппроксимации кинетических данных модели связывании Ленгмюра 1:1 (KD (kin)). Из-за слишком быстрой кинетики связывания (свыше 106 М-1 s-1 (для коп) и 10-2 s-1 (для koff)) наблюдаемые аффинности связывания для взаимодействия лиганд:BMPR-II были определены по дозовой зависимости равновесного связывании (KD (eq)).
Результаты определения аффинности при помощи системы Biacore для различных вариантов GDF-5 человека приведены в таблице.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. GDF-5-родственный белок, обладающий улучшенной способностью стимулировать образование хрящей и сниженной способностью стимулировать образование костной ткани, где белок обладает увеличенной аффинностью к BMP-рецептору IB (BMPR-IB) и/или сниженной аффинностью к BMP-рецептору IA (BMPR-IA),
где белок получают из человеческого GDF-5-родственного белка дикого типа, в частности из GDF-5, GDF-6 или GDF-7 человека, где по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена на гидрофильную или полярную аминокислоту.
2. Белок по п.1, где белок получают путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка, относящегося к сайту связывания BMPR-IB и/или BMPR-IA в аминокислотной последовательности GDF-5-родственного белка, предпочтительно с помощью генно-инженерной технологии.
3. Белок по п.1, где гидрофильный аминокислотный остаток или полярный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, гистидина, серина и треонина.
4. Белок по п.1 или 2, где по меньшей мере одна гидрофильная или полярная аминокислота в сайте
связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка заменена гидрофобной аминокислотой.
5. Белок по п.4, где гидрофобный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из алани-на, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина, триптофана, тирозина, валина.
6. Белок по п.1 или 2, содержащий консервативную замену по крайней мере одной аминокислоты в сайте связывания с BMPR-IB и/или BMPR-IA GDF-5-родственного белка, в частности, где гидрофобная аминокислота заменена меньшей или большей гидрофобной аминокислотой или где гидрофильная или полярная аминокислота заменена меньшей или большей гидрофильной или полярной аминокислотой.
7. Белок по любому из пп.1-6 для лечения заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным.
8. Белок по п.7 для лечения дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща,
в частности возрастных дефектов хряща, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм,
заболеваний, которые могут влиять на хрящ, наподобие хондродистрофии, заболевания, характеризующегося нарушением роста и последующим окостенением хряща, ахондроплазии, реберного хондрита, грыжи межпозвоночного диска и восстановления межпозвоночного диска, рецидивирующего полихонд-рита,
восстановления дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественными наподобие хондромы или хондросаркомы.
9. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-6.
10. Нуклеиновая кислота по п.9 для лечения заболеваний, при которых желательно образование хрящей, а образование костной ткани является нежелательным.
11. Нуклеиновая кислота по п.10 для лечения дефектов хряща или для лечения травматического разрыва или отрыва хряща,
в частности возрастных дефектов хряща, например, вследствие износа, остеоартрита, ревматоидного артрита, спортивных травм,
заболеваний, которые могут влиять на хрящ, наподобие хондродистрофии, заболевания, характеризующегося нарушением роста и последующим окостенением хряща, ахондроплазии, реберного хондрита, грыжи межпозвоночного диска и восстановления межпозвоночного диска, рецидивирующего полихонд-рита,
восстановления дефектов хряща, связанных с опухолями как доброкачественными, так и злокачественными наподобие хондромы или хондросаркомы.
12. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.9.
13. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9.
14. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по любому из пп.1-6 в качестве активного агента.
15. Композиция по п.14, где белок присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9 в качестве активного агента.
17. Композиция по п.16, где нуклеиновая кислота присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями.
18. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.12 в качестве активного агента.
19. Композиция по п. 18, где вектор присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяин по п.13 в качестве активного агента.
21. Композиция по п. 20, где клетка-хозяин присутствует в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками или носителями.
22. Способ получения GDF-5-родственного белка по любому из пп.1-6, включающий в себя стадии:
(i) рандомизация по крайней мере одного аминокислотного положения в области GDF-5-родственного белка, относящейся к сайту связывания с BMP-рецептором IB и/или BMP-рецептором IA, чтобы получить белковые варианты,
(ii) анализ белковых вариантов, полученных в (i), в отношении их аффинности к BMP-рецептору IB и/или ВМР-рецептору IA,
(iii) отбор тех белковых вариантов, которые обеспечивают увеличенную аффинность к ВМР-
рецептору IB (BMPR-IB) и/или сниженную аффинность к ВМР-рецептору IA (BMPR-IA).
23. Антитело против белка по любому из пп.1-6.
23.
23.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028554
- 1 -
(19)
028554
- 1 -
(19)
028554
- 1 -
(19)
028554
- 4 -
(19)
028554
- 14 -
|
