EA 028550B1 20171130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/028550 Полный текст описания [**] EA201690764 20141106 Регистрационный номер и дата заявки EP13382460.7 20131114 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2014/064202 Номер международной заявки (PCT) WO2015/073281 20150521 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21711 Номер бюллетеня [**] ИНГИБИТОР ГРЕЛИН-O-АЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ Название документа [8] C07D401/06, [8] A61K 31/506, [8] A61P 3/00 Индексы МПК [US] Мартинез-Грау Мария Анджелес Сведения об авторах [US] ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ Сведения о патентообладателях [US] ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000028550b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение, имеющее формулу или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, имеющее формулу или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по любому из пп.1 или 2, имеющее формулу

4. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с активностью грелин-O-ацилтрансферазы (GOAT), содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

5. Способ снижения набора массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

6. Способ снижения повторного набора массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

7. Способ лечения ожирения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

8. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

9. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения набора массы тела.

10. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения повторного набора массы тела.

11. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения диабета 2 типа.

12. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения ожирения.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Соединение, имеющее формулу или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, имеющее формулу или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по любому из пп.1 или 2, имеющее формулу

4. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с активностью грелин-O-ацилтрансферазы (GOAT), содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

5. Способ снижения набора массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

6. Способ снижения повторного набора массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

7. Способ лечения ожирения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

8. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.

9. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения набора массы тела.

10. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения повторного набора массы тела.

11. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения диабета 2 типа.

12. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения ожирения.


Евразийское OD 028550 (13) Bl
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 20l7.ll.30
(21) Номер заявки 201690764
(22) Дата подачи заявки
20l4.ll.06
(51) Int. Cl. C07D 401/06 (2006.01) A61K31/506 (2006.01) A61P 3/00 (2006.01)
(54) ИНГИБИТОР ГРЕЛИН-О-АЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ
(31) 13382460.7
(32) 20l3.ll.l4
(33) EP
(43) 20l6.07.29
(86) PCT/US2014/064202
(87) WO 2015/073281 2015.05.21
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US)
(72) Изобретатель:
Мартинез-Грау Мария Анджелес (US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Гизатуллина Е.М., Глухарёва А.О., Дементьев В.Н., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(56) WO-A2-2007079239 WO-A2-2006124490
(57) В изобретении описаны новые ингибиторы GOAT композиции, которые содержат указанные соединения
их соли, а также фармацевтические
- I
Изобретение относится к соединению, применяемому для ингибирования грелин-О-ацилтрансферазы (GOAT), к фармацевтическим композициям и к способам для лечения заболеваний, связанных с активностью GOAT.
GOAT принадлежит к семейству связанных с мембраной ферментов О-ацилтрансфераз (MBOAT). GOAT превращает дезацилгрелин (также известный как неацилированный грелин или UAG) в биологически активную форму, ацилгрелин (AG), путем переноса жирной кислоты на остаток Ser3 пептида деза-цилгрелина. Было показано, что ацилгрелин увеличивает потребление пищи и увеличивает степень ожирения у людей и грызунов. Также было показано, что у человека инфузия AG подавляет секрецию инсулина, индуцированную глюкозой. Было показано, что устранение гена грелина усиливает высвобождение инсулина для предотвращения или ослабления нарушения толерантности к глюкозе у мышей ob/ob на диете с высоким содержанием жира.
Распространение ожирения и диабета наряду с варьирующей эффективностью и реакцией на существующие в настоящее время способы лечения ожирения и диабета приводит к необходимости того, чтобы пациенту становился доступен выбор других способов лечения. Считается, что ингибитор GOAT представляет собой агент, который можно применять для лечения ожирения. Кроме того, считается, что ингибитор GOAT также можно применять для снижения набора массы или для снижения повторного набора массы в качестве добавки к диете и/или к упражнениям, другим терапевтическим лекарственным агентам или процедурам, разработанным для снижения набора массы или для лечения ожирения. Аналогично, ингибитор GOAT может быть полезен при лечении диабета 2 типа, индивидуально или в комбинации с другими способами терапии диабета 2 типа.
В настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой ингибитор GOAT. В частности, в соответствии с настоящим изобретением предложено соединение формулы
или фармацевтически приемлемая соль указанного.
В настоящем изобретении дополнительно предложено соединение, которое представляет собой ингибитор GOAT формулы
В соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ. Согласно еще одному варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению и один или несколько других терапевтических агентов.
Согласно дополнительному аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложен способ снижения набора массы или снижения повторного набора массы тела или лечения диабета 2 типа или ожирения, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
В соответствии с настоящим изобретением также предложено соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии, в частности для снижения набора массы или для снижения повторного набора массы тела, или для лечения диабета 2 типа или ожирения. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением предложено применение соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения набора массы или для снижения повторного набора массы тела, или для лечения диабета 2 типа или ожирения.
Соединение согласно настоящему изобретению, как правило, эффективно в широком диапазоне дозировок. Например, суточные дозировки попадают в интервал приблизительно от 0,03 приблизительно до 150 мг/кг массы тела. В некоторых случаях уровень дозировок ниже нижнего предела вышеупомянутого интервала может быть более чем адекватным, в то время как в других случаях при поддержании благоприятного соотношения польза/риск можно применять еще большие дозировки , и, таким образом, вышеупомянутые дозировки не предназначены для какого-либо ограничения рамок изобретения. Понят
но, что фактически вводимое количество соединения будет определять врач в свете соответствующих обстоятельств, включающих патологическое состояние, которое подвергается лечению, выбранный путь введения, фактическое вводимое соединение или соединения, возраст, массу и реакцию индивидуального пациента, а также тяжесть симптомов указанного пациента.
Используемый в настоящей заявке термин "лечение" (или "лечить" или "вылечивать") относится к сдерживанию, замедлению, прекращению или реверсии прогрессирования или тяжести существующего симптома, состояния или расстройства.
Используемый в настоящей заявке термин "снижение набора массы" относится к уменьшению увеличения массы тела пациента. Используемый в настоящей заявке термин "снижение повторного набора массы" относится к уменьшению увеличения массы тела пациента, у которого происходит восстановление массы после ее уменьшения. Повторный набор массы тела может быть вызван эффектом восстановления после прекращения уменьшения массы тела, достигнутого посредством диеты, упражнений, изменения поведения или посредством одобренных терапий. Во избежание сомнений используемые в настоящей заявке термины набор массы или повторный набор массы тела относятся к набору массы или к повторному набору массы тела, которые индуцированы потреблением пищи или пищевыми привычками и не относятся к набору массы, не связанному с питанием, как,например, благодаря накапливанию жидкости, удерживанию воды, благодаря мышечной массе или из-за воспаления.
Соединение согласно настоящему изобретению может вступать в реакции с образованием фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемые соли и распространенные способы их получения хорошо известны в данной области техники.
См., например, P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, et al, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль состоят из центральной части - кора, который содержит по меньшей мере один хиральный центр
Несмотря на то что настоящее изобретение охватывает все индивидуальные энантиомеры, а также смеси энантиомеров указанных соединений, в том числе рацематы, предпочтительное соединение согласно настоящему изобретению представлено формулой
или фармацевтически приемлемой солью указанного соединения.
Соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно приготавливают в виде фармацевтических композиций, которые вводят различными путями. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005). Более предпочтительна фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению, представленное формулой
или его фармацевтически приемлемую соль и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей.
Одиночные энантиомеры или диастереомеры могут быть получены, начиная с хиральных реагентов
или с помощью стереоселективных или стереоспецифичных способов. Альтернативно, одиночные энантиомеры или диастереомеры могут быть выделены из смесей с помощью стандартных хиральных хрома-тографических методик или способов кристаллизации на любой подходящей стадии синтеза соединений согласно настоящему изобретению. Одиночные энантиомеры и диастереомеры соединений согласно настоящему изобретению представляют собой предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения.
В данной области техники хорошо известно, что агенты для лечения диабета и/или ожирения можно объединять с другими агентами для лечения диабета и/или ожирения. Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить совместно с другими эффективными способами терапии диабета или ожирения, причем одновременно или последовательно. Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль индивидуально или в комбинации с другими эффективными терапиями можно вводить одновременно или последовательно после одобренных медицинских процедур, таких как бариатрическая хирургия, например операция желудочного шунтирования или процедура регулируемого бандажирования желудка.
Настоящее изобретение также охватывает промежуточные соединения и способы, применяемые для синтеза соединения согласно настоящему изобретению.
Кроме того, промежуточные соединения, описанные в следующих схемах, могут содержать ряд защитных групп азота. Вариабельная защитная группа может быть одинаковой или разной в каждом случае в зависимости от конкретных реакционных условий и конкретных осуществляемых превращений. Условия защиты и снятия защиты хорошо известны специалисту в данной области. См. например, Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (T. Greene and P. Wuts, eds., 2d ed. 1991).
Способы получения и примеры
Следующие синтезы и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение и представляют собой типичный синтез соединения согласно настоящему изобретению. Реагенты и исходные материалы легко доступны или могут быть легко синтезированы специалистом в данной области техники. Следует понимать, что синтезы и примеры представлены исключительно для иллюстрации, а не для ограничения, и специалистом в данной области могут быть произведены различные модификации.
Конфигурация R или S соединения согласно настоящему изобретению может определяться с помощью стандартного способа, такого как рентгеноструктурный анализ и корреляция с временем удержания хиральной ВЭЖХ. Названия в следующих синтезах и примерах, как правило, присваиваются с использованием номенклатуры IUPAC в программе MDL Accelrys(r) Draw версии 4.0.NET.
Использующиеся в настоящей заявке следующие термины имеют указанные значения: "ACN" относится к ацетонитрилу; "БСА" относится к бычьему сывороточному альбумину; "ДХМ" относится к ди-хлорметану; "ДИПЭА" относится к ^^диизопропилэтиламину; "ДМФА" относится к диметилформа-миду; "ДМСО" относится к диметилсульфоксиду; "ЭДТУ" относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; "EtOAc" относится к этилацетату; "EtOH" относится к этанолу; "ФБС" оносится к фетальной бычьей сыворотке; "HRP" относится к пероксидазе хрена; "IC50" относится к концентрации агента, которая производит 50% максимального ответа; "IPA" относится к изопропанолу; "МеОН" относится к метанолу; "МТБЭ" относится к метил-трет-бутиловому эфиру; "PBS" относится к фосфатному буферному солевому раствору; "КТ" относится к комнатной температуре; "ТЭА" относится к триэтиламину; "ТФУ" относится к трифторуксусной кислоте; "TR" относится к времени удержания; "ТГФ" относится к тетра-гидрофурану; и "ТМБ" относится к 3,3',5,5'-тетраметилбензидину.
Условия ЖХ-МС (низкое рН): колонка: Phenomenex Gemini NX C18 2,1 х 50 мм 3 м; градиент: 5100% В в течение 3 мин, затем 100% В в течение 0,75 мин, температура колонки: 50°С +/-10°С; скорость потока: 1 мл/мин; растворитель А: деионизированная вода с 0,1% муравьиной кислотой; растворитель В: ACN с 0,1% муравьиной кислотой.
Синтез 1. 6-Хлор-2-метилпиримидин-4-амин
В стальной резервуар (автоклав) объемом 5 л загружали под давлением 4,6-дихлор-2-метилпиримидин (400 г, 2,45 моль) и гидроксид аммония (2,8 л) при КТ. Нагревали реакционную смесь до 90°С в течение 5 ч. Охлаждали реакционную смесь до КТ и затем фильтровали твердое вещество через воронку Бюхнера. Промывали отфильтрованный осадок водой (200 мл) и гексаном (200 мл) и затем сушили под вакуумом с получением целевого соединения в виде твердого вещества белого цвета (290 г, 82%). ЖХ-ЭС/МС m/z 144 (М+1).
Синтез 2. 6-Хлор-5-иод-2-метилпиримидин-4-амин
Объединяли 6-хлор-2-метилпиримидин-4-амин (708 г, 4,93 моль) и МеОН (7,08л) в круглодонной колбе объемом 20 л, оборудованной механической мешалкой. Охлаждали до 0-5°С. Добавляли монохлорид иода (4,806 кг, 29,6 моль), растворенного в МеОН (6 л), с использованием дополнительной воронки в течение периода времени около 1 ч. Нагревали реакционную смесь до КТ и перемешивали при КТ в течение 16 ч. Охлаждали реакционную смесь до 0-5°С и добавляли сульфит натрия (46 л, 20% водный раствор). Фильтровали полученное твердое вещество и промывали водой (2 л) с последующим промыванием с помощью гексана (3 л). Сушили твердое вещество под вакуумом с получением целевого соединения в виде твердого вещества белого цвета (1061 г, 80%). ЖХ-ЭС/МС m/z 269,9 (М+1).
Синтез 3. трет-Бутил-4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этинил]пиперидин-1 -карбоксилат
Растворяли 6-хлор-5-иод-2-метилпиримидин-4-амин (20 г, 74,22 ммоль), сложный эфир 4-этинилпиперидин-1-карбоновой кислоты и трет-бутилового спирта (18,64 г, 89,06 ммоль) и диизопропи-ламин (10,44 мл, 74,22 ммоль) в ТГФ (200 мл) в 3-горлой колбе. Поочередно удаляли и загружали колбу азотом 3 раза. Добавляли к раствору хлорид бис(трифенилфосфин)палладия(П) (2,63 г, 3,71 ммоль) и ио-дид меди(!) (0,713 г, 3,71 ммоль). Нагревали смесь от 50 до 55°С в течение 16 ч. Охлаждали смесь до КТ и добавляли еще хлорид бис(трифенилфосфин)палладия(П) (1,31 г, 1,86 ммоль), иодид меди(!) (0,356 г, 1,86 ммоль) и сложный эфир 4-этинилпиперидин-1-карбоновой кислоты и трет-бутилового спирта (1,55 г, 7,42 ммоль). Смесь нагревали до 60°С в течение 3,5 ч. Охлаждали смесь до КТ и концентрировали при пониженном давлении. Разводили вещество с использованием ДХМ (300 мл) и промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (100 мл). Сушили раствор над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Очищали осадок с использованием хроматографии на силикагеле (колонка с 800 г силикагеля), проводя элюирование с использованием градиента от 20 до 100% EtOAc в гексане. Концентрировали очищенные фракции с получением целевого соединения в виде светло-оранжевого порошка (22,6 г, 86%). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 351,2/353,1 (М+1).
Синтез 4. трет-Бутил-4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]пиперидин- 1-карбоксилат
Объединяли трет-бутил-4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этинил]пиперидин-1-карбо-ксилат (4,3 г, 12,26 ммоль) и оксид платины^У) (0,139 г, 0,61 ммоль) в EtOAc (81 мл) и EtOAc (40 мл). Поочередно удаляли и загружали колбу водородом с использованием баллона с водородом и перемешивали при КТ в течение 8 ч. Тщательно отслеживали реакцию, чтобы избежать получения потенциального побочного продукта в результате удаления хлорида в молекуле. Следует заметить, что продукт более растворим в смеси растворителей, чем исходный алкин. Фильтровали смесь через диатомит, промывая с использованием МеОН. Концентрировали раствор при пониженном давлении. В колбу добавляли сили-кагель, 1-пропантиол (4 г, загрузка = 1,28 ммоль/г, SILIABOND(r) Thiol из SILICYCLE(r)) (для удаления остаточного палладия из предыдущей реакции конденсации) и EtOAc (300 мл). Перемешивали вещества при КТ 3 дня. Отфильтровывали твердые вещества и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Повторяли гидрогенизацию на полученном осадке, как указано ниже. Заряжали колбу, содержащую осадок, оксидом платины^У) (0,139 г, 0,61 ммоль), EtOAc (81 мл) и EtOAc (40 мл). Поочередно удаляли и загружали колбу водородом с использованием баллона с водородом и перемешивали при КТ в течение 8 ч. Фильтровали через диатомит, промывая с использованием МеОН, и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Повторяли гидрогенизацию на полученном осадке, как указано ниже. Заряжали колбу, содержащую осадок, оксидом платины^У) (0,139 г, 0,61 ммоль), EtOAc (81 мл) и EtOAc (40 мл). Поочередно удаляли и загружали колбу водородом с использованием баллона с водородом и перемешивали при КТ в течение 8 ч. Фильтровали через диатомит, промывая с использованием МеОН. Концен
трировали фильтрат при пониженном давлении на силикагеле (20 г). Очищали вещество с использованием хроматографии на силикагеле, проводя элюирование с использованием 70-100% EtOAc в гексане (колонка 120 г). Объединяли очищенные фракции и концентрировали при пониженном давлении. Разводили осадок с использованием ДХМ и гексана и концентрировали при пониженном давлении три раза. Помещали вещество в вакуум с получением целевого соединения в виде твердого вещества белого цвета (3,2 г, 73%). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 355,2/357,2 (М+1).
Синтез 5. Гидрохлорид 6-хлор-2-метил-5-[2-(4-пиперидил)этил]пиримидин-4-амина
Растворяли трет-бутил-4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]пиперидин-1-карбо-ксилат (29 г, 81,72 ммоль) в 1,4-диоксане (145 мл) и добавляли 4М хлороводород в 1,4-диоксане (204,2 мл, 817,1 ммоль). Перемешивали раствор в течение 18 ч при КТ. Концентрировали смесь при пониженном давлении, суспендировали в диэтиловом эфире (250 мл), фильтровали и сушили полученное твердое вещество под вакуумом с получением целевого соединения в виде неочищенного твердого вещества белого цвета (29 г). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 255,2/257,2 (М+1).
Альтернативный путь для 6-хлор-2-метил-5-[2-(4-пиперидил)этил]пиримидин-4-амин (способы получения 6-10).
Синтез 6. трет-Бутил-4-(2-метилсульфонилоксиэтил)пиперидин-1 -карбоксилат
Объединяли трет-бутил-4-(2-гидроксиэтил)пиперидин-1-карбоксилат (4,72 кг, 20,6 моль) с ДХМ (40 л) и ТЭА (3020 мл, 21,63 мол) в 50 л-реакторе в атмосфере азота. Охлаждали раствор приблизительно до 0°С и медленно добавляли метансульфохлорид (2,478 кг, 21,63 моль) в ДХМ (5 л), с поддержанием реакционной температуры ниже 10°С. После завершения добавления смесь перемешивали в течение 18 ч при 15 °С, в течение этого времени ТСХ (1:1, гексан:EtOAc) демонстрировала отсутствие остатков исходного материала. Смесь промывали водой (30 л) и давали фазам разделиться. Концентрировали органическую фазу до твердого вещества. Суспендировали твердое вещество в МТБЭ (6 л), собирали с помощью фильтрации и сушили в вакуумной печи при 50°С с получением целевого соединения в виде твердого вещества белого цвета (5,67 кг, 91%).
Синтез 7. трет-Бутил-4-(3-циано-4-этокси-4-оксобутил)пиперидин-1 -карбоксилат
Объединяли трет-бутил-4-(2-метилсульфонилоксиэтил)пиперидин-1-карбоксилат (5,26 кг, 17,1 моль), этилцианоацетат (7 кг, 62 моль), 21% этоксид натрия в EtOAc (8,25 л, 24,75 моль) и EtOAc (35 л) в 50л-реакторе в атмосфере азота. Нагревали смесь при 35-40°С в течение 18 ч, в это время ЯМР-анализ демонстрировал 20% оставшегося мезилата. Продолжали нагревать смесь при 35-40°С в течение 24 ч, в это время ЯМР-анализ демонстрировал только небольшое количество мезилата. Медленно охлаждали реакционную смесь до КТ и добавляли ледяную уксусную кислоту (1422 мл, 22,68 моль) около 30 мин. Концентрировали смесь с использованием вакуумной перегонки и затем разделяли между водой (25 л) и EtOAc (35 л). Разделяли слои и экстрагировали водную фазу с помощью EtOAc (10 л). Объединяли органические части, промывали с использованием солевого раствора (15 л) и концентрировали до получения красного масла. Очищали масло с использованием хроматографии на силикагеле (75 кг силикагеля, 65250 меш), проводя элюирование с использованием гексана (40 л) и затем с использованием 20% EtOAc/гексан с получением фракции (7,8 кг), которая представляла собой 30% этилцианоацетата/70% целевого продукта. Концентрировали материал с помощью пленочной перегонки при 100°С и в вакууме 210 мторр (28 Па), собирая нелетучую фракцию с получением целевого соединения (4,54 кг, 82%).
Синтез 8. трет-Бутил-4-[2-(4-амино-6-гидрокси-2-метилпиримидин-5-ил)этил]пиперидин-1-карбоксилат
Объединяли трет-бутил-4-(3-циано-4-этокси-4-оксобутил)пиперидин-1-карбоксилат (2,18 кг, 6,73 моль), гидрохлорид ацетамидина (1,27 кг, 13,46 моль, 95% анализ) [замечание: предварительно сушили гидрохлорид ацетамидина путем суспендирования дважды в толуоле (10 л) и затем отгоняли легкие фракции досуха под вакуумом], 21% этоксида натрия в EtOAc (6,73 л, 20,19 моль) и EtOAc (10 л) в 22л-реакторе в атмосфере азота. Нагревали реакционную смесь в колбе с обратным холодильником в течение 42 ч. Доводили рН реакционной смеси приблизительно до рН 5 с использованием ледяной уксусной кислоты (1,2 л, 20,86 моль). Удаляли EtOAc с помощью вакуумной перегонки на роторном испарителе. Суспендировали полученное твердое вещество в воде (6 л) и затем собирали твердое вещество с помощью фильтрации, промывая с дополнительным использованием воды (2 л). Сушили твердое вещество в вакуумной печи при 50°С с получением целевого соединения (1,72 кг, 76%). 1Н ЯМР (500 МГц, CD3OD) 8 4,83 (с, 3Н); 4,05 (д., 2Н), 2,75 (уш.с, 2Н), 2,39 (м., 2Н), 2,22 (с, 3Н), 1,78 (д., 2Н), 1,43 (м., 1H) 1,42 (с, 9Н), 1,4 (м., 2Н), 1,38 (м., 2Н). Повторяли процесс, по существу, как описано выше с использованием трет-бутил-4-(3-циано-4-этокси-4-оксобутил)пиперидин-1-карбоксилата (2,36 кг) с получением целевого соединения (2,01 кг, 82%).
Синтез 9. Дигидрохлорид 6-амино-2-метил-5-[2-(4-пиперидил)этил]пиримидин-4-ола
Объединяли трет-бутил-4-[2-(4-амино-6-гидрокси-2-метилпиримидин-5-ил)этил]пиперидин-1-карбоксилат (3,73 кг, 11,09 моль) и изопропанол в 50 л-реакторе в атмосфере азота. Добавляли 12N хлороводородную кислоту (3,05 л, 36,6 моль) с перемешиванием в течение около 3 ч. Нагревали смесь при 50°С в течение 16 ч с образованием густого осадка. В это время ЯМР-анализ демонстрировал отсутствие оставшихся ВОС-групп. Охлаждали реакционную смесь до 20-25°С, разводя с использованием ТГФ (12 Л). Собирали твердое вещество с помощью фильтрации. Фильтрация протекала медленно и могла занять около 24 ч до ее завершения. Промывали с использованием IPA (2 х 10 л). Сушили вещество в вакуумной печи при 50°С с получением целевого соединения (3,117 кг, 91%).
Синтез 10. Дигидрохлорид 6-хлор-2-метил-5-[2-(4-пиперидил)этил]пиримидин-4-амина
Объединяли дигидрохлорид 6-амино-2-метил-5-[2-(4-пиперидил)этил]пиримидин-4-ола (3,167 кг, 10,2 моль) и оксихлорид фосфора (30 л, 300 моль) в атмосфере азота в 50 л-реакторе, которую выпускали через щелочной (10% NaOH) скруббер. К перемешиваемой суспензии добавляли 85% фосфорную кислоту (1 л, 8,5 моль). Медленно нагревали смесь с использованием температуры 75°С в рубашке реактора. Приблизительно при 55°С, когда происходит выделение газов, охлаждали скруббер на ледяной бане. Когда выделение газов замедлялось, нагревали смесь при 90-95°С в течение 50 ч, в это время ТСХ и ЯМР-анализ демонстрировали завершение реакции. Удаляли массу избыточного оксихлорида фосфора с помощью вакуумной перегонки (22 дюйма Hg (74,3 кПа) и 60°С внутренняя температура) для извлечения 20 л в дистилляте. Охлаждали смесь до 20-25°С и затем разводили с использованием толуола (10 л). Дополнительно охлаждали смесь до < 15°С и медленно гасили с использованием воды (1 л), поддерживая температуру < 30°С. После добавления толуола смесь становилась очень густой и трудной для перемешивания, при этом фаза продукта остается на дне реактора в виде вязкого полутвердого вещества. Поднимали лопасти мешалки для достижения смешивания. Добавляли EtOAc (10 л) к смеси и перемешивали в течение приблизительно 18 ч при 25°С. В этот момент вязкое полутвердое вещество еще не полностью растворено, но размягчено, поэтому им можно манипулировать. Интенсивно перемешивали в течение следующих 4-5 ч до полного растворения. Охлаждали полученную суспензию до 5-10°С и собирали твердое вещество с помощью фильтрации, промывая с использованием МТБЭ (8 л) с получением влаж
ного продукта (приблизительно 6 кг).
Перекристаллизовывали сырой продукт путем растворения влажного осадка в МеОН (35 л) при 40°С. Концентрировали раствор с помощью вакуумной перегонки, удаляя 15 л растворителя. Добавляли IPA (35 л) и концентрировали суспензию с помощью вакуумной перегонки для удаления 13 л растворителя. Охлаждали суспензию до 5-10°С и затем фильтровали твердые вещества, промывая с помощью IPA (2 л) и затем с помощью МТБЭ (8 л). Сушили твердые вещества в вакуумной печи при 55°С с получением целевого соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета (2,77 кг, 82%). Аналитический расчет для C12H21Cl3N4: С, 43,98; Н, 6,46; Cl, 32,46; N, 17,1. Обнаружили: С, 43,63; Н, 6,53; Cl, 32,16; N,
16,86.
Синтез 11. трет-Бутил-№[(1 S)-2-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-
пиперидил] -1 -метил-2-оксоэтил] карбамат
В каждую из двух круглодонных колб добавляли гидрохлорид 6-хлор-2-метил-5-[2-(4-пиперидил)этил]пиримидин-4-амина (12,5 г, 42,92 ммоль), диизопропилэтиламин (22,46 мл, 128,7 ммоль) и ДМФ (100 мл). Охлаждали две смеси в холодной водяной бане и перемешивали в течение 5 мин. Добавляли в каждую из смесей [диметиламино(триазоло[4,5-Ь]пиридин-3-илокси)метилен]диметиламмония гексафторфосфат (17,95 г, 47,21 ммоль) и (2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)пропановую кислоту (8,93 г, 47,21 ммоль) в одной части. Перемешивали смесь при КТ в течение 90 мин. Разливали смеси в отдельные делительные воронки вместе с водой (300 мл) и EtOAc (400 мл), встряхивали и разделяли. Экстрагировали водные слои с помощью EtOAc (3 х 300 мл), промывали соответствующие органические слои водой (4 х 250 мл), насыщенным водным раствором NaCl (200 мл) и сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Очищали объединенный материал посредством хроматографии на силикагеле, проводя элюирование с использованием градиента от 70 до 100% EtOAc в гексане. Объединяли и концентрировали очищенные фракции при пониженном давлении. Разводили осадок с использованием EtOAc (500 мл) и промывали насыщенным водным раствором NH4Cl (100 мл), насыщенным водным раствором NaHCO3 (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (100 мл). Сушили органические слои над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением целевого соединения в виде твердого вещества белого цвета (28 г, 76%). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 426,2/428,2 (М+1).
Синтез 12. (2S)-2-Амино-1-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-
пиперидил]пропан-1-он
Растворяли трет-бутил-N-[(1S)-2-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пипери-дил]-1-метил-2-оксоэтил]карбамат (15,78 г, 37,05 ммоль) в ДХМ (185 мл), добавляли ТФУ (185 мл) по каплям около 3 мин и перемешивали в течение ночи. Анализировали реакционную смесь с помощью ЖХ-МС (низкое рН) для демонстрации полного превращения. Медленно добавляли МеОН (400 мл) благодаря экзотермическому смешиванию. Предварительно промывали три колонки SCX (50 г) водой (20 мл) и затем МеОН (20 мл). Делили реакционную смесь на три равные части и загружали в равных количествах на колонки SCX. Промывали каждую колонку водой (40 мл) и МеОН (40 мл), собирая смыва в вакуумную колбу. Элюировали целевое вещество из колонок SCX с использованием 2N аммония в Ме-ОН (60 мл) в чистую пробирку. Объединяли растворы, содержащие продукты, концентрировали при пониженном давлении, кипятили с ДХМ-гексан (1:1), три раза и помещали в вакуум с получением целевого соединения в виде белой пенки (10,29 г, 84%). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 326,2/328,2 (М+1).
Синтез 13. Гидрохлорид (2S)-2-амино-1-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил] пропан-1-она
Добавляли трет-бутил-К-[(18)-2-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пипери-дил]-1-метил-2-оксоэтил]карбамат (28,75 г, 67,49 ммоль) к 1,4-диоксану (143,7 мл). Затем добавляли 4М хлороводород в 1,4-диоксане (168,7 мл, 674,9 ммоль) и перемешивали в течение 10 мин. Добавляли МеОН (20 мл) и перемешивали смесь в течение 3 ч с интенсивным встряхиванием. Концентрировали смесь
при пониженном давлении, разводили твердые вещества с использованием диэтилового эфира (200 мл),
и перемешивали в течение ночи. Фильтровали вещество, промывая его диэтиловым эфиром (2 х 25 мл). Сушили вещество посредством отсасывающей системы в течение 15 мин, затем помещали в вакуум на 1 ч при 45°С с получением целевого соединения в виде неочищенного белого порошка (27,7 г). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 326,1/328,2 (М+1).
Синтез 14. Дигидрохлорид (28)-2-амино-1-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил]пропан-1 -она
Нагревали IPA (154 мл) до 50°С и медленно добавляли ацетилхлорид (19,3 мл, 271 ммоль) из-за экзотермической реакции. Перемешивали реакционную смесь при 50°С в течение 10 мин и добавляли трет-бутил К-[(18)-2-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил]-1-метил-2-оксо-этил]карбамат (21 г, 45,3 ммоль). Перемешивали реакционную смесь в течение 2 ч, отслеживая процесс посредством ЖХ-МС (низкое рН). Охлаждали реакционную смесь до КТ и добавляли диэтиловый эфир (386 мл). Перемешивали суспензию в течение 15 мин. Отфильтровывали твердые вещества, быстро промывая диэтиловым эфиром (2 х 50 мл), поскольку вещество гигроскопично. Фильтровали вещество и сушили посредством фильтрации в течение 1 мин, затем в вакуумном сушильном шкафу при 50°С в течение ночи с получением целевого соединения в виде порошка белого цвета (18,4 г). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 326,1/328,2 (М+1). Противоионный анализ с помощью ионной хроматографии совместим с гидрохлоридной солью.
Пример 1. К-[(18)-2-[4-[2-(4-Амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил]-1-метил-2-оксоэтил ] циклопропанкарбоксамид
Добавляли гидрохлорид 1-гидрокси-7-азабензотриазол (281 мг, 2,03 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (430 мг, 2,21 ммоль) к суспензии циклопропанкарбоновой кислоты (161 мкл, 2,03 ммоль), (2в)-2-амино-1-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил]пропан-1-он (600 мг, 1,84 ммоль) в безводном ТГФ (12 мл). Затем добавляли ТЭА (770 мкл, 5,52 ммоль) и перемешивали полученную смесь при КТ в течение 12 ч. Разводили реакционную смесь с помощью EtOAc (10 мл), фильтровали над диамитом и концентрировали фильтрат в вакууме. Очищали полученный осадок с помощью ВЭЖХ хроматографии с обращенной фазой соответственно массе (Agilent(r) 1200 ЖХ-МС и МСД масс-спектрометр, 75 х 30 мм Phenomenex Gemini-NX(r), 5 ц размер частиц, колонка с ограничителем 10 х 20 мм, 12-46% ACN в 10 мМ водного раствора бикарбоната аммония, рН 10, градиент около 9 мин) с получением целевого соединения в виде бесцветного стекла (572 мг, 78%). ЖХ-ЭСМС m/z (35Cl/37Cl) 394,2/396,2 (М+Н).
Альтернативная методика с использованием 1-пропанфосфонового ангидрида.
Обрабатывали смесь соли дигидрохлорида (28)-2-амино-1-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метилпиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил]пропан-1-она (107,4 г, 183,15 ммоль) в ДХМ (584 мл) с ДИ-
ПЭА (диизопропилэтиламин) (128 мл, 732,59 ммоль). Охлаждали реакционную смесь до 0°С на ледяной бане и добавляли циклопропанкарбоновую кислоту (21,8 мл, 274,72 ммоль). Затем добавляли раствор 1-пропанфосфонового ангидирида (50% раствор в EtOAc, 174,8 г, 274,72 ммоль), за которым следовало дополнительное добавление ДИПЭА (40 мл) для придания реакционной смеси основности. Перемешивали при КТ в течение ночи. Промывали реакционную смесь водой (1 л) и разделяли слои. Сушили органическую часть над MgSO4 и концентрировали в вакууме с получением неочищенного продукта в виде пенки грязно-белого цвета. Очищали вещество с помощью хроматографии на силикагеле (800 г, 0-10% МеОН в EtOAc). Соответствующие фракции объединяли с другой партией продукта (51 г), полученного с помощью, по существу, такой же процедуры с использованием соли дигидрохлорида (28)-2-амино-1-[4-[2-(4-амино-6-хлор-2-метил-пиримидин-5-ил)этил]-1-пиперидил]пропан-1-она (77,9 г, 150,42 ммоль). Объединенные лоты концентрировали в вакууме с получением твердого вещества белого цвета (114 г). Продукт начинал кристаллизоваться во время концентрирования. Вещество истирали в порошок с использованием горячего EtOAc (200 мл), охлаждали и фильтровали с получением целевого соединения (111 г, 84%). ЖХ-ЭС/МС m/z (35Cl/37Cl) 394,0/396 (М+1). Хиральный анализ (OD-H колонка, 25% MeOH/iPrNH2, 5 мл/мин, 100 бар, 35°С, 220 нм) > 99,9% э.и.; TR = 1,15 мин.
GOAT представляет собой основной фермент, который превращает UAG в AG. Обзорные статьи о роли GOAT и грелина см.: Kristy M. Heppner et al., The ghrelin O-acyltransferase-ghrelin system: a novel regulator of glucose metabolism, Current Opinion in Endocrinology, Diabetes & Obesity 2011, 18:50-55; Phillip A. Cole et al., Glucose and Weight Control in Mice with a Designed Ghrelin OAcyltransferase Inhibitor, Science. 2010 December 17; 330(6011): 1689-1692. doi: 10.1126/science. 1196154, Matthias H. Tschop et al., Gastric O-acyl transferase activates hunger signal to the brain, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 April 29; 105(17): 6213-6214, and Jesus Gutierrez et al., Ghrelin octanoylation mediated by an orphan lipid transferase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2008 April 29, 105 (17): 6320-6325.
Роль GOAT поддерживается фенотипами, наблюдаемыми у мышей, лишенных гена GOAT. Таким образом, ожидается, что ингибирование GOAT уменьшает циркуляцию AG и повышает циркуляцию UAG. Следовательно, отношение AG к суммарному грелину (UAG + AG) уменьшается после обработки ингибитором GOAT.
In vitro бесклеточный ферментативный анализ GOAT человека.
Ген GOAT человека (регистрационный номер: NM 001100916) субклонировали в бакуловирусный вектор экспрессии pAN51. Концентрат бакуловируса получали согласно протоколу "Bac-to-Bac", предоставленному поставщиком, Invitrogen, Калифорния, США. Пять миллилитров бакуловирусного концентрата с GOAT человека добавляли к 500 мл клеток Sf9 в среде HyQ SFX-Insect(tm) (номер SH30278.02 в каталоге HyClone) с плотностью 1 х 106 клеток на миллилитр в колбе Эрленмейера объемом 2 л. Колбу с клетками Sf9, инфицированными геном GOAT человека, ставили на планшетный шейкер при 120 об/мин при 28°С в течение 48 ч. Через 48 ч инкубации клетки центрифугировали при 1000xg в течение 10 мин при 4°С. Клеточные осадки собирали и хранили при -80°С в морозилке до момента следующего процес-сирования.
Получение микросомной мембраны для ферментативного анализа с использованием фермента GOAT.
Один грамм осадка суспендировали в 9 мл охлажденного гомогенизирующего буфера (50 мМ Tris-HCl, 250 мМ сахароза, доводили рН до 7,5 и стерильно фильтровали через фильтр Millipore 0,2 мкм). Клеточную суспензию переносили в гомогенизатор Даунса. Клеточные осадки гомогенизировали за 40 ходов на льду. Гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин в бакет-роторе Beckman при 4°С в течение 10 мин для удаления неразрушенных клеток. Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали при 40000 xg в течение 1 ч при 4°С. Полученный мембранный осадок суспендировали в гомогенизирующем буфере с использованием гомогенизатора Даунса и хранили при -20°С в морозилке для применения в анализе. Для продолжительного хранения мембранного препарата фермента GOAT человека суспендированную мембрану хранили в морозильнике на -80°С.
Протокол ферментативного анализа GOAT человека.
Готовили тестируемые соединения в ДМСО с получением 0,2 мМ концентрированных растворов. Проводили серийные разведения концентрированного раствора в ДМСО с получением кривой с десятью точками разведения с конечными концентрациями соединения в интервале от 10 мкМ до 0,5 нМ в 96-луночном круглодонном планшете. Готовили растворы фермента и субстрата в аналитическом буфере (0,02% Tween(tm)-20 в 50 мМ Tris, рН 7,5/250 мМ сахароза/1 мг/мл БСА/10 мМ ЭДТУ). Добавляли разведенное соединение (1 мкл) в каждую лунку ряда А-N соответствующего 384-луночного планшета со слабым связыванием с белком. Добавляли к соединениям смесь субстрата GOAT человека (10 мкл), состоящую из дезацилгрелинбиотина человека (СРС Scientific Inc., 6 мкМ конечная конц.), октаноил-СоА (Sigma, 60 мкМ конечная конц.) и AG-специфичное антитело (WO 2006/091381)(1 мкг/мл конечная конц.). Для инициации реакции добавляли ферментный препарат GOAT-His/sf9, который готовили в аналитическом буфере (9 мкл), к каждой лунке планшета, содержащего субстрат и тестируемые соединения, с получением конечной концентрации 0,01 мкг/мл. Инкубировали смесь в течение 1 ч при КТ на мягко вра
щающемся осцилляторе. Добавляли 4М гидрохлорид гуанидина (20 мкл) во все лунки, смешивали и инкубировали в течение 3 ч для остановки реакции.
Готовили тИФА-планшеты (STREPTAVIDIN SPECTRAPLATE(tm) 384, Perkin Elmer) путем блокирования с использованием 2% термоинактивированной ФБС (фетальная бычья сыворотка) в блокирующем буфере PBS (40 мкл) (Invitrogen) в течение 3 ч. Аспирировали блокирующий буфер из тИФА-планшета и добавляли блокирующий буфер (23 мкл) в столбцы 1-24, ряды A-N. Резервировали ряды О и Р для стандартной кривой ацилгрелина. Добавляли реакционную смесь (2 мкл) в тИФА-планшеты. Готовили стандартную кривую из 10 точек (биотин-меченный октаноилгрелин) с помощью серийного 2х разведения в блокирующем буфере, содержащем 0,2М гидрохлорид гуанидина, начиная с 2,5 пМ. Инкубировали реакционную смесь или биотин-меченный AG-стандарт в тИФА-планшете в течение ночи при 4°С. На следующий день промывали планшет 3 х с помощью промывочного буфера (0,1% Tween(tm)-20/ PBS, 100 мкл на лунку на каждый промывочный цикл). Добавляли AG-специфичное антитело (WO 2006/091381) (25 мкл раствора 0,5 мкг/мл в блокирующем буфере) в каждую лунку и инкубировали при КТ в течение 1 ч. Промывали планшет 3х с использованием промывочного буфера аналогично предыдущей стадии. Добавляли белок G-HRP (25 мкл)(Southern Biotech), разведенный 3000х в блокирующем буфере и инкубировали 1 ч при КТ. Промывали последний 3х с использованием промывочного буфера как в предыдущих стадиях. Добавляли реагент ТМБ (25 мкл) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) в каждую лунку и давали проявиться в течение 20 мин и останавливали реакцию с помощью 1М фосфорной кислоты (25 мкл на лунку). Считывали планшеты при 450 нм с использованием ридера планшетов Envision Multilabel. Уровень AG рассчитывали по отношению к подобранной стандартной кривой и рассчитывали процент инги-бирования. 10-точечную кривую ингибирования строили и подбирали с использованием логистического уравнения с четырьмя параметрами с получением значений IC50 с использованием Activity Base (версия 7.3.2.1).
Согласно протоколу, описанному выше, соединение примера 1 демонстрировало IC50 приблизительно 192 нМ ± 73, (n = 5). Указанные данныепоказывают, что соединение из примера 1 ингибирует ферментную активность очищенного GOAT in vitro.
Сравнение изменения отношения AG к суммарному грелину в группе обработки соединением и в группе обработки пустым носителем отражает степень ингибирования фермента GOAT in vivo, благодаря динамичному процессированию UAG в AG с помощью фермента GOAT. В in vivo фармакодинамиче-ских исследованиях настоящей заявки уровень AG и UAG в плазме и в желудке в группах обработки пустым носителем и соединением измеряли с помощью тИФА специфично к этим двум аналитам. Суммарный уровень грелина каждого образца рассчитывали в виде суммы AG и UAG с помощью этих тИФА. Отношение AG к суммарному грелину определяется с помощью уровня AG в каждом образце, деленного на уровень суммарного грелина в этом же образце. Уровень AG, UAG и отношение AG к суммарному грелину в группе обработки пустым носителем рассчитывали и принимали за 100%. Относительное изменение этих параметров в группе обработки соединением затем рассчитывали для определения эффективности тестируемого соединения.
In vivo дозозависимое 3-дневное введение ингибитора GOAT дважды в день.
Животные и обработка.
Самцов мышей C57BL/6 получали из Harlan (Индианаполис, Индиана) в возрасте 9 недель. Мышей размещали индивидуально в терморегулируемые (24°С) помещения с циклом день/ночь 12 ч (свет включали в 22:00 ч) и давали им свободный доступ к стандартному корму для грызунов (диета 2014, Harlan) и к воде. Как правило, использовали мышей, когда они достигали возраста 10-13 недель к моменту исследования. В день 0 эксперимента мышей случайным образом распределяли по группам обработки (№7/группа) так, чтобы каждая группа имела сходную среднюю массу тела. В день 1 и 2 обрабатывали мышей пустым носителем (1% гидроксиэтилцеллюлоза, 0,25% Tween 80, 0,05% противовспениватель) или тестируемым соединением, приготовленным в носителе в виде суспензии в различных дозировках, с помощью перорального искусственного питания в 7 утра и в 7 вечера. В день 3, животных не кормили, переносили их в чистые клетки и вводили пустой носитель или тестируемое соединение снова в 8 утра с помощью перорального искусственного питания. В тот же день в 1 ч дня животных умерщвляли путем обезглавливания для забора крови. Подробности забора крови и обработок плазмы см. в разделе "Забор крови и выделение Грелина из плазмы" ниже.
Забор крови.
Собирали приблизительно 600 мкл крови в предварительно взвешенную пробирку с ЭДТУ, содержащую 600 мкл (определенного как Уконсерванта) свежеприготовленного консерванта (4 мМ PEFABLOC(r) [4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида гидрохлорид], 72 мМ NaCl, 58 мМ NaF, 0,032N хлороводородная кислота, рН 3) и немедленно смешивали. Взвешивали пробирку снова и держали ее на льду. Для аккуратного определения точного объема крови каждого образца с использованием данной процедуры забора крови, массу крови каждой мыши рассчитывали с использованием следующего уравнения: Масса крови = (Масса пробирки, содержащей кровь + консервант) - (Масса пробирки,
содержащей консервант)
Объем крови (Укрови) = (Масса крови) / 1,06 Заметим, что плотность крови грызуна предполагается равной 1,06 г/мл.
В течение 15 мин после забора крови образцы центрифугировали при 5000 об/мин при 4°С в течение 8 мин. Удаляли плазму (650 мкл) в стеклянную пробирку объемом 5 мл, содержащую 1N хлороводородную кислоту (65мкл), смешивали и держали на льду.
Экстракция Грелина с помощью колонки SEP-PAK(r).
AG и UAG экстрагировали из плазмы с использованием колонки SEP-PAK(r)_C18 для удаления препятствий перед осуществлением тИФА. Твердофазную экстракцию пептидов AG и UAG с помощью колонок SEP-PAK(r)_C18 можно осуществлять на вакуумном коллекторе (Waters Corp) или с использованием перистальтического насоса. Образец процедуры экстракции с колонки SEP-PAK(r) независимо применяется к образцу плазмы, полученному от каждой индивидуальной мыши. Общий протокол экстракции описан ниже.
Все растворы, используемые для всего протокола экстракции с колонок SEP-PAK(r), должны содержаться на льду. Увлажняли колонки SEP-PAK(r) (WAT054960, Waters Corp., Милфорд, Массачусетс) с помощью 99,9% ACN/0.1% ТФУ (1 мл раствора 100 мл ACN/0,1 мл ТФУ). Применяли давление для доведения скорости потока приблизительно до 1 мл/мин для удаления жидкости со дна колонки, но не давая при этом колонке высохнуть в какой-то момент. После удаления жидкости из колонки давление останавливали. Уравновешивали колонки с помощью 3% ACN/0,1% ТФУ (1 мл из 97 мл воды, 3 мл ACN, 0,1 мл ТФУ). Применяли давление для доведения скорости потока приблизительно до 1 мл/мин для удаления жидкости со дна колонки, но не давая при этом колонке высохнуть. Разводили приблизительно 650 мкл подкисленной плазмы (определяли как Улазмы, добавленный к колонке) до 1,4 мл ледяной 0,1% ТФУ. Загружали всю разведенную подкисленную плазму из предыдущей стадии на колонки. Применяли давление для доведения скорости потока приблизительно до 0,5 мл/мин, чтобы дать возможность образцу пройти через колонку, а пептидам грелина абсорбироваться на смоле колонки. Не давали колонки высыхать. Промывали с помощью 3% ACN/0,1% ТФУ (0,9 мл из 97 мл воды, 3 мл ACN, 0,1 мл ТФУ). Применяли давление для доведения скорости потока приблизительно до 1 мл/мин для удаления жидкости со дна колонки, но не давая при этом колонке высохнуть. Повторяли промывку еще два раза. Элюировали с использованием 60% ACN/0,1% ТФУ (1 мл из 40 мл воды, 60 мл ACN, 0,1 мл ТФУ). Помещали пробирку для сбора образца внизу каждой колонки, применяли давление для доведения скорости потока приблизительно до 0,5 мл/мин, чтобы протолкнуть жидкость через колонку и собрать элюат в пробирку для сбора образца. Немедленно замораживали образцы на сухом льду. Лиофилизировали образцы на "speed-vac" (Модель# SC110A, Savant) и хранили при -20°С до момента осуществления анализа тИФА.
Анализ тИФА для Грелина.
Наносили на 96-луночные планшеты MULTI-ARRAY(r) MSD(r) (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд, каталожный # L15XA-3) покрытие в виде 100 мкл 1 мкг/мл антитела (WO 2005/026211 и WO 2006/019577), которое распознает средний домен обеих форм грелина: ацилированной и не ацилирован-ной, в PBS (Invitrogen). Простукивали бока планшета, чтобы гарантировать нанесения покрытия на лунки, герметично закрывали с помощью приспособления для заклеивания планшетов и инкубировали в течение ночи при КТ. Удаляли содержимое и добавляли Блокатор(tm) Казеин в PBS (25 мкл) (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, каталожный #37528) в каждую лунку. Повторно герметично закрывали планшеты и помещали их на шейкер при КТ на 1 ч.
Восстанавливали лиофилизированные законсервированные образцы плазмы, полученные из экстракции с колонок SEP-PAK(r) C18 Блокаторе(tm) Казеин в PBS (400 мкл к каждому образцу, данный объем определяли как Увосстановления), хорошо перемешивали с помощью вортекс-миксера и инкубировали на льду в течение 45-60 мин. Удаляли содержимое из планшетов и добавляли восстановленные образцы плазмы по 25 мкл в каждую лунку. Готовили стандартные кривые ацилгрелина и не ацилированного грелина, начиная с 8000 пг/мл и осуществляя серийные разведения 1:4 для 8 суммарных концентраций. Добавляли приготовленные стандарты в дубликатах в блокированные планшеты по 25 мкл в каждую лунку. Герметично закрывали планшеты и инкубировали при КТ на шейкере для планшетов в течение 2 ч.
Удаляли содержимое планшетов и промывали три раза с использованием PBS, включающего 0,1% Tween(tm) 20 (150 мкл)(PBS-T). Ацилгрелин-специфичное антитело (WO 2006/091381) или антитело, специфичное к не ацилированному грелину (WO 2006/055347), меченное с помощью MSD SULFO-TAG (Meso Scale Discovery), разводили до концентрации 0,05 мкг/мл в 0,2 х Блокаторе Казеин, содержащем 0,05% Tween(tm) 20, и называли его раствором вторичного антитела. Удаляли конечную промывку и добавляли раствор вторичного антитела (25 мкл в каждую лунку), которое специфично распознает AG или UAG. Планшеты повторно герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при КТ на шейкере для планшетов перед конечной промывкой 3 х снова с использованием PBS-T (150 мкл/на лунку1).
Удаляли конечный промывочный раствор и заменяли его на буфер ридера 1х MSD Read Buffer (150 мкл/на лунку). Считывали электролюминисцентный сигнал, генерированный путем активации связанной метки MSD SULFO-TAG(tm) с электродами на планшете с использованием анализатора изображений MSD(r) SECTOR(r) Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Рассчитывали концентрации ацилгрелина и не
ацилированного грелина на основе соответствующей стандартной кривой, генерированной программой MSD(r). Определяли фактическую концентрацию в плазме для каждого образца путем умножения измеренного уровня ацилгрелина или не ацилированного грелина на фактор разведения. Фактор разведения для каждого образца плазмы рассчитывали с использованием следующего уравнения:
Результаты.
Введение соединения примера 1 в течение 3 дней уменьшало уровень AG в плазме на -1, 5, 45 и 48%, и повышало уровень UAG в 2,24, 2,82, 2,53 и в 2,89 раз, соответственно, при 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг (результаты приведены в таблице ниже). Введение в количестве 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг приводит к уменьшению на 39, 54, 71 и 77%, соответственно, уровня AG по отношению к суммарному содержанию грелина по сравнению с контрольными животными в группе, которую обрабатывали носителем. Эти результаты демонстрируют, что соединение примера 1 подавляет выработку AG и повышает уровень UAG в кровотоке, как показано in vivo на GOAT-нокаутной мыши.
Обработка
(% контроля)
UAG
(% контроля носителя)
AG/Суммарный-грелин (% контроля носителя)
Носитель
100
100
100
0,3 мг/кг
101±25
224±35
61±4
1 мг/кг
95±18
282±45
46±11
3 мг/кг
55±6
253±31
29±4
10 мг/кг
52±10
289±44
23±4
или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение по п.1, имеющее формулу
или его фармацевтически приемлемая соль. 3. Соединение по любому из пп.1 или 2, имеющее формулу
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение, имеющее формулу
4. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных с активностью грелин-O-ацилтрансферазы (GOAT), содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
5. Способ снижения набора массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.
6. Способ снижения повторного набора массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.
7. Способ лечения ожирения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.
8. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли.
9. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения набора массы тела.
10. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для снижения повторного набора массы тела.
11. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения диабета 2 типа.
12. Применение соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли при получении лекарственного средства для лечения ожирения.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028550
- 1 -
028550
- 1 -
028550
- 1 -
028550
- 1 -
028550
- 1 -
028550
- 1 -
028550
- 1 -
028550
- 4 -