|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Водный стабилизированный препарат этанерцепта, свободный от аргинина, содержащий 25-75 мг/мл этанерцепта; 1-30 мМ фосфата натрия; 0,5-10% (мас./об.) меглумина, где композиция имеет pH 6,0-6,6. 2. Препарат по п.1, дополнительно содержащий до 5 мас.% сахарозы. 3. Препарат по п.1 или 2, дополнительно содержащий до 100 мМ хлорида натрия. 4. Препарат по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий один или более дополнительных компонентов, выбранных из буфера, вещества, изменяющего тоничность, и эксципиента. 5. Препарат по п.3, содержащий 50 мг/мл этанерцепта, 0,5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия, 1% сахарозы и 100 мМ хлорида натрия. 6. Препарат по п.1, содержащий 50 мг/мл этанерцепта, 5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Водный стабилизированный препарат этанерцепта, свободный от аргинина, содержащий 25-75 мг/мл этанерцепта; 1-30 мМ фосфата натрия; 0,5-10% (мас./об.) меглумина, где композиция имеет pH 6,0-6,6. 2. Препарат по п.1, дополнительно содержащий до 5 мас.% сахарозы. 3. Препарат по п.1 или 2, дополнительно содержащий до 100 мМ хлорида натрия. 4. Препарат по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий один или более дополнительных компонентов, выбранных из буфера, вещества, изменяющего тоничность, и эксципиента. 5. Препарат по п.3, содержащий 50 мг/мл этанерцепта, 0,5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия, 1% сахарозы и 100 мМ хлорида натрия. 6. Препарат по п.1, содержащий 50 мг/мл этанерцепта, 5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия.
Евразийское 028520 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201490802
(22) Дата подачи заявки
2012.10.18
(51) Int. Cl. A61K39/395 (2006.01)
(54) ПРЕПАРАТЫ ЭТАНЕРЦЕПТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ МЕГЛЮМИНОМ
(31) 61/548,518; 61/669,480
(32) 2011.10.18; 2012.07.09
(33) US
(43) 2014.08.29
(86) PCT/US2012/060743
(87) WO 2013/059408 2013.04.25
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КОХЕРУС БАЙОСАЙЕНСИС, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Мэннинг Марк, Мерфи Брайан (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20030180287 US-A1-20080311119
Methods for characterization of size-exclusion chromatography media for preparative purification of DNA restriction fragments. Article [online]. Springer Link. June 1999 [retrieved on 2012-12-03]. Retrieved from the internet: URL:http://link.springer.com/ article/10.1023%2FA%3A1008932407733?LI=true, entire document
(57) Изобретение представляет водный стабилизированный препарат этанерцепта, свободный от аргинина, содержащий 25-75 мг/мл этанерцепта; 1-30 мМ фосфата натрия; 0,5-10% (мас./об.) меглумина, где композиция имеет pH 6,0-6,6. Стабилизированный препарат этанерцепта согласно настоящему изобретению пригоден для длительного хранения этанерцепта.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к водным фармацевтическим композициям, стабилизированным меглюмином для длительного хранения этанерцепта, к способам получения композиций, способам их введения и к наборам, их содержащим. Настоящее изобретение включает препараты этанерцепта, которые не требуют аргинина для стабилизации.
Предпосылки создания изобретения
Полипептиды часто должны некоторое время храниться перед их применением. Когда из хранят в течение длительного периода, полипептиды в растворе часто оказываются нестабильными (Manning et al., 1989, Pharm. Res. 6:903-918). Для продления срока их хранения разработаны дополнительные стадии обработки, такие как высушивание, например, лиофилизация. Однако лиофилизированные фармацевтические композиции менее удобны для применения.
Как правило, практически улучшить стабильность полипептидов можно, изменяя концентрацию составных элементов в препарате или добавляя эксципиенты для модифицирования препарата (см., например, патенты США № 5580856 и 6171586). Однако в результате применения добавочных компонентов полипептиды все же могут инактивироваться. Кроме того, в случае лиофилизации в результате стадии регидратации полипептид может инактивироваться, вследствие, например, агрегации или денатурации (Hora et al., 1992, Pharm. Res., 9:33-36; Liu et al., 1991, Biotechnol. Bioeng., 37:177-184). Агрегация полипептидов нежелательна, поскольку она может приводить к иммуногенности (Cleland et al., 1993, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10:307-377 и Robbins et al., 1987, Diabetes, 36:838-845). Другой способ улучшения стабильности полипептидов представляет собой применение специфических концентраций L-аргинина (патент США № 7648702).
Одним из полипептидов, которые перед применением хранят в течение срока, достигающего двух лет, является этанерцепт (Enbrel(r) (Энбрел) Immunex Corporation), который представляет собой димер-ный слитый полипептид, состоящий из лигандсвязывающей внеклеточной части человеческого рецептора фактора некроза опухолей (TNFR) с молекулярной массой 75 кДа (р75), связанный с Fc-областью человеческого IgGl. Он состоит из 934 аминокислот и имеет эффективную молекулярную массу приблизительно 150 кДа (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.). Fc-компонент этанер-цепта содержит второй константный домен тяжелой цепи (СН2) и третий константный домен тяжелой цепи (СН3) и шарнирную область, но не содержит первого константного домена тяжелой цепи (СН1) человеческого IgG1. Домен Fc может содержать только один или все из вышеописанных доменов. Эта-нерцепт обычно продуцируется посредством технологии рекомбинантных ДНК в экспрессионной системе млекопитающих в клетках яичников китайского хомячка (CHO).
Настоящее изобретение предоставляет новые стабильные жидкие препараты этанерцепта, способные храниться в течение длительного времени.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение представляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, содержащий этанерцепт и стабилизирующие ингредиенты для замедления развития нестабильности, предотвращения агрегирования и/или фрагментирования этанерцепта в препарате, причем указанные стабилизирующие ингредиенты представляют собой по меньшей мере один из следующих: (а) меглюмин; или (b) меглюмин в комбинации с сахарозой; или (с) меглюмин в комбинации с хлоридом натрия; или (d) меглюмин в комбинации с хлоридом натрия и сахарозой.
Определения различных технических терминов, используемых в нижеследующем обсуждении, даны ниже в разделе "Определения" и в остальном тексте настоящей спецификации.
Стабилизированные препараты этанерцепта согласно настоящему изобретению повышают стабильность при длительном хранении, что характеризуется по меньшей мере одним из следующих: (1) согласно SEC-анализу при М3, или Т2, или T4 содержание мономера превышает приблизительно 90%, содержание агрегатов составляет приблизительно менее 3 мас.% и содержание фрагмента 3 составляет приблизительно менее 5 мас.%; и (2) согласно HIC-анализу при М3, или Т2, или Т4 количество композиции, представленной пиком 1 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 3 мас.%, количество композиции, представленной пиком 2 на HIC-хроматограмме, превышает 80 мас.%, и количество композиции, представленной пиком 3 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 20 мас.%.
В предпочтительных аспектах стабилизированных препаратов препараты вызывают повышение стабильности при длительном хранении, что характеризуется следующим: согласно HIC-анализу при М3, или Т2, или Т4, где количество композиции, представленной пиком 2 на HIC-хроматограмме, превышает приблизительно 95 мас.% и где, если пик 3 присутствует на хроматограмме, количество композиции, представленной пиком 3 на HIC-хроматограмме, меньше или равно приблизительно 3 мас.%.
Стабилизированный препарат этанерцепта, как описано выше, необязательно и предпочтительно не содержит аргинина или является по существу свободным от аргинина.
Препараты согласно настоящему изобретению обладают превосходной стабильностью, как определено посредством анализов SEC (эксклюзионной хроматографии) и HIC (гидрофобной хроматографии) после одного, двух или трех месяцев хранения при 5°C. Эти препараты сравнимы или превосходят коммерчески доступный препарат этанерцепта, в котором требуемым компонентом является аргинин. Соот
ветственно, настоящее изобретение дополнительно направлено на препараты стабилизированного эта-нерцепта, как описано выше, которые не содержат аргинина или являются по существу свободными от аргинина, и где композиция, оцениваемая при М3, или Т2, или Т4, вызывает повышение стабильности при длительном хранении, что удовлетворяет одному или обоим следующим критериям: (А) стабильность, сравнимая или лучшая, чем у коммерчески доступного этанерцепта, представленного на рынке под торговым наименованием Энбрел (Enbrel(r)), как измерено посредством (i) SEC-анализа количеств агрега-та(ов), мономера и фрагмента 3 в композиции (как определено в спецификации), и (ii) HIC-анализа количеств материала в композиции, соответствующих пикам 1, 2 и 3 на HIC-хроматограмме (как определено в спецификации); и (В) HIC-хроматограмма, в которой (i) пик 3 отсутствует или по существу отсутствует и (ii) пик 2 представляет приблизительно более 95 мас.% композиции; SEC-хроматограмма, по существу не содержащая никаких пиков, соответствующих агрегату(ам); и SEC-хроматограмма, на которой содержание мономера составляет по меньшей мере приблизительно 95 мас.% композиции.
В одном предпочтительном аспекте препарат согласно настоящему изобретению содержит приблизительно от 25 до 75 мг/мл этанерцепта, хлорид натрия в количестве приблизительно до 150 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мМ фосфата натрия и от приблизительно 0 до 5 мас.% сахарозы или трегалозы или их комбинации, где композиция имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,6 и где композиция характеризуется SEC-анализом, проведенным при М3, или Т2, или Т4, согласно которому содержание мономера превышает приблизительно 85 мас.%, содержание агрегата(ов) составляет приблизительно менее 3 мас.% и содержание фрагмента 3 составляет приблизительно менее 8 мас.%. Препараты, удовлетворяющие этим аналитическим критериям, не требуют аргинина для стабилизации.
В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения стабилизированный препарат этанерцепта дополнительно характеризуется посредством (а) SEC-анализа при М3, или Т2, или Т4, согласно которому содержание мономера превышает приблизительно 90% и содержание агре-гата(ов) составляет приблизительно менее 3 мас.%, и (b) HIC-анализа при М3, или Т2, или Т4, согласно которому количество композиции, представленной пиком 1 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 4 мас.%, количество композиции, представленной пиком 2 на HIC-хроматограмме, превышает приблизительно 80 мас.% и количество композиции, представленной пиком 3 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 20 мас.%, причем препараты являются свободными или по существу свободными от аргинина.
Композиции этанерцепта согласно настоящему изобретению дополнительно дают возможность предоставлять препараты, которые содержат приемлемые уровни частиц, невидимых невооруженным глазом. Соответственно, настоящее изобретение, дополнительно направлено на стабилизированные препараты этанерцепта, имеющие при М3, или Т2, или Т4 в 1 мл не более чем, в среднем, приблизительно 10000 частиц, невидимых невооруженным глазом, имеющих размер более 5 мкм.
Стабилизированная композиция этанерцепта по настоящему изобретению дополнительно характеризуется посредством (a) SEC-анализа при М3, или Т2, или Т4, согласно которому содержание мономера превышает приблизительно 90 мас.% и содержание агрегата(ов) составляет приблизительно менее 3 мас.%, и (b) HIC-анализа при М3, или Т2, или Т4, согласно которому количество композиции, представленной пиком 1 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 3 мас.%, количество композиции, представленной пиком 2 на HIC-хроматограмме, превышает 80 мас.%, и количество композиции, представленной пиком 3 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 20 мас.%, причем препараты являются свободными или по существу свободными от аргинина.
Стабильность препаратов можно, кроме того, охарактеризовать тем, что композиции, необязательно, свободные или по существу свободные от аргинина, демонстрируют результаты HIC-анализа при М3, или Т2, или Т4, согласно которым количество композиции, представленной пиком 1 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 1%, количество композиции, представленной пиком 2 на HIC-хроматограмме, превышает приблизительно 95 мас.% и количество композиции, представленной пиком 3 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 1 мас.%. Препараты, удовлетворяющие этим аналитическим критериям, не требуют аргинина для стабилизации.
Предпочтительные стабилизированные композиции согласно настоящему изобретению, предпочтительно свободные или по существу свободные от аргинина, демонстрируют результаты HIC-анализа при М3, или Т2, или Т4, согласно которым количество композиции, представленной пиком 1 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 2% или предпочтительно приблизительно менее 1%, количество композиции, представленной пиком 2 на HIC-хроматограмме, превышает приблизительно 95 мас.% и предпочтительно превышает приблизительно 97%, и количество композиции, представленной пиком 3 на HIC-хроматограмме, составляет приблизительно менее 1 мас.%, предпочтительно от 0 до 1%.
В отличие от коммерчески доступного этанерцепта, предоставляемого в препарате, содержащем аргинин, авторы настоящего изобретения неожиданно, в свете патента США № 7648702, обнаружили, что варианты осуществления препаратов этанерцепта, описанных и проиллюстрированных в настоящем документе, не требуют аргинина для длительной стабилизации, хотя при желании в них можно добавлять аргинин. Способность предоставлять препараты этанерцепта, стабилизированные без аргинина, является
потенциально значительно выгодным обстоятельством для системы здравоохранения, благодаря тому, что пациентам и учреждениям здравоохранения предоставляются альтернативные препараты этанерцеп-та, которые могут стать доступными по более низким ценам по сравнению с коммерческим препаратом этанерцепта, имеющимся в настоящее время (т.е. по сравнению с Enbrel(r)), для стабилизации которых требуется аргинин.
Термин "нестабильность", или ему подобные термины, используемый в настоящем документе, отмечает тенденцию мономера этанерцепта к подверженности разнообразным нежелательным преобразованиям при хранении. Такие преобразования включают образование олигомеров и агрегата(ов) с высокой молекулярной массой (далее в настоящем документе называемый "агрегат(ы)"), в которых множество копий, по существу, интактного мономера этанерцепта становятся необратимо ассоциированными друг с другом посредством множества нековалентных взаимодействий (например, электростатических взаимодействий). Нежелательные преобразования при хранении могут также включать разложение мономера этанерцепта на более мелкие фрагменты и/или усеченные формы. В идеальном случае препарат этанер-цепта должен до максимально возможной степени минимизировать склонность этого препарата образовывать при хранении агрегаты, неправильно свернутый белок, олигомеры и/или фрагменты этанерцепта. Важным преимуществом, которое представляет собой результат способности уменьшать образование нежелательных агрегатов или фрагментов, является уменьшение возможной токсичности и/или иммуно-генности данного лекарственного средства.
Препарат этанерцепта согласно настоящему изобретению необязательно и предпочтительно является свободным или по существу свободным от аргинина. Термин "по существу свободный от аргинина" должен означать, что аргинин, даже если он присутствует, не влияет на стабилизацию мономера этанер-цепта в препарате в такой степени, что квалифицированный специалист в данной области техники не сможет сделать вывод о том, что его присутствие благоприятно или необходимо для стабилизации.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего описания, хотя в нем возможны некоторые вариации и модификации без отклонения от сущности и объема новых концепций настоящего раскрытия.
Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и нижеследующее подробное описание, представляют собой только разъясняющие примеры, не ограничивающие настоящее изобретение, заявленное в его формуле.
Подробное описание изобретения
В данном разделе подробно описаны различные варианты осуществления настоящего изобретения. При использовании в англоязычном варианте настоящего описания и во всех пунктах формулы изобретения значения артиклей "a", "an" и "the" включают и ссылки на грамматическое множественное число, если контекст явным образом не указывает иное. Кроме того, при использовании в англоязычном варианте настоящего описания и во всех пунктах формулы изобретения значение предлога "in" включает как "in", так и "on", если контекст ясным образом не указывает иное. Некоторые термины, использованные в настоящей спецификации, ниже дополнительно определены более конкретно.
Определения
Термины, используемые в настоящей спецификации, как правило, имеют свои обычные значения, принятые в данной области техники, как в контексте настоящего изобретения, так и том в конкретном контексте, где используют каждый термин. Некоторые термины, использованные для описания настоящего изобретения, обсуждаются ниже или в иных местах данной спецификации в качестве дополнительных руководящих указаний, предоставляемых практическому специалисту, изучающему описание настоящего изобретения. Для некоторых терминов даны синонимы.
Использование одного или более синонимов не исключает применения других синонимов. Использование примеров в любом разделе настоящей спецификации, включая примеры любых терминов, обсуждаемых в настоящем документе, является только иллюстративным и никак не ограничивает объем и сущность настоящего изобретения или любого приведенного термина. Настоящее изобретение не ограничивается теми разнообразными вариантами его осуществления, которые даны в настоящей спецификации.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют тот же смысл, что обычно понимает специалист с обычной квалификацией в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта справедливым будет признан настоящий документ, включая определения.
Как правило, термины "около", "примерно" или "приблизительно" означают в пределах 20%, в пределах 10%, в пределах 5, 4, 3, 2 или 1% указанного значения или диапазона. Указываемые численные величины являются приблизительными, это означает, что можно подразумевать термины "около", "примерно" или "приблизительно", если они не даны явным образом.
Термины "этанерцепт", или "мономер этанерцепта", или "мономер" являются синонимами "Энбре-ла" (Enbrel(r)). Они относятся к полипептиду, который представляет собой димерный слитый полипептид, состоящий из лигандсвязывающей внеклеточной части человеческого рецептора фактора некроза опухо
лей (TNFR) с молекулярной массой 75 кДа (р75), связанной с Fc-областью человеческого IgG1. Он состоит из 934 аминокислот и имеет эффективную молекулярную массу приблизительно 150 кДа. Для целей настоящего изобретения термин "этанерцепт" также охватывает этанерцепт с небольшими модификациями в аминокислотной структуре (включая делеции, добавления и/или замещения аминокислот), которые не оказывают существенного влияния на функцию, эффективность или авидность этанерцепта. Термин "этанерцепт" охватывает все формы и препараты Enbrel(r), включая, но не ограничиваясь ими, концентрированные препараты, готовые для применения инъекционные препараты, препараты, восстанавливаемые с водой, спиртом и/или другими ингредиентами и др.
Термин "сахар" относится к моносахаридам, дисахаридам и полисахаридам. Примеры сахаров включают, но не ограничиваются ими, сахарозу, трегалозу, декстрозу и др.
Термин "меглюмин" относится к соединению с химической формулой H3NHCH2(CHOH)4CH2OH, также известному как 1-дезокси-1-метиламиносорбит, ^метил^-глюкамин и 1-дезокси-1-метиламино-D-глюцитол.
Термины "маннозилглицерат", "маннозиллактат", "маннозилгликолят" и "диглицеринфосфат" хорошо известны в данной области техники и имеют свои общепринятые значения. Следующие ссылочные материалы описывают эти соединения в некоторых подробностях: Faria et al., Carbohydrate Res. 2008, 343:3025-3033; Borges et al., Extremophiles, 2002, 6:209-216; Faria et al., ChemBioChem, 2003, 4:734-741; Sawangwan et al., Biotechnol. J. 2010, 5:187-191 и Pais et al., J. Mol. Biol. 2009, 394:237-250. Настоящий патент включает посредством ссылки описания этих соединений, содержащиеся в этих ссылочных материалах.
Термин "полиол" относится к спирту, содержащему множественные гидроксильные группы. Примеры полиолов включают, но не ограничиваются ими, маннит, сорбит и др.
Подразумевается, что термин "длительное хранение" означает, что фармацевтическую композицию можно хранить в течение трех месяцев или более, в течение шести месяцев или более и предпочтительно в течение одного года или более. Также подразумевается, что "длительное хранение" означает, что фармацевтическую композицию хранят либо в виде жидкости при 2-8°C, либо в замороженном состоянии, например, при -20°C или при более низкой температуре. Кроме того, предполагается, что композицию можно замораживать и оттаивать более одного раза.
Подразумевается, что термин "стабильный" или "стабилизированный", использованный в отношении длительного хранения, означает, что этанерцепт, содержащийся в фармацевтической композиции, теряет не более 20%, или более предпочтительно 15%, или еще более предпочтительно 10% и наиболее предпочтительно 5% своей активности относительно активности композиции в начале хранения.
Термин "млекопитающее" включает, но не ограничивается этим, человека.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному веществу или эксципиенту любого традиционного типа. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и является совместимым с другими ингредиентами препарата.
Термин "композиция" относится к смеси, которая обычно содержит носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, который является традиционным в данной области техники и который подходит для введения субъекту с терапевтическими, диагностическими или профилактическими целями. Она может включать клеточную культуру, в клетках или в среде которой присутствует полипептид или полинуклеотид. Например, композиции для перорального введения могут образовывать растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, препараты с замедленным высвобождением, ополаскиватели для полости рта или порошки.
Термины "фармацевтическая композиция" и "препарат" используются взаимозаменяемо.
Термин "лечение" относится к любому введению или применению лекарственных средств при заболевании млекопитающего и включает подавление развития заболевания, его прекращение, облегчение заболевания, например вызывая обратное развитие, или восстанавливая утраченные, недостающие или дефектные функции, или стимулируя неэффективный процесс. Данный термин включает получение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта, охватывая любое лечение патологического состояния или расстройства у млекопитающего. Эффект может быть профилактическим в смысле полного или частичного предупреждения расстройства или его симптома и/или терапевтическим в смысле частичного или полного излечения расстройства и/или неблагоприятного состояния, характерного для данного расстройства. Он включает (1) предотвращение возникновения расстройства или его рецидива у субъекта, который может быть предрасположенным к данному расстройству, но пока еще остается бессимптомным, (2) торможение развития расстройства, например приостановление его развития, (3) остановку или окончательное устранение расстройства или, по меньшей мере, ассоциированных с ним симптомов, так что пациент более не страдает от расстройства или его симптомов, например вызывая обратное развитие расстройства или его симптомов, например, восстанавливая или исправляя утраченные, недостающие или дефектные функции или стимулируя неэффективный процесс, или (4) облегчая, смягчая или улучшая состояние при расстройстве или при симптомах, ассоциированных с ним, при
чем термин "улучшение состояния" используется в широком смысле для указания, по меньшей мере, на уменьшение величины некоторого параметра, такого как воспаление, боль и/или размер опухоли.
Термин "заболевание" относится к любому состоянию, инфекции, расстройству или синдрому, который требует медицинского вмешательства или для которого желательно медицинское вмешательство. Такое медицинское вмешательство может включать лечение, постановку диагноза и/или профилактическое мероприятие.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое, когда его вводят живому субъекту, обеспечивает достижение желательного эффекта у живого субъекта. Например, эффективное количество полипептида согласно настоящему изобретению для введения живому субъекту представляет собой количество, которое предупреждает и/или лечит заболевание, опосредуемое интег-рином алф3. Точное количество будет зависеть от цели лечения и будет установлено квалифицированным специалистом в данной области техники с использованием известных технологий. Как известно в данной области, для выбора между системной или локальной доставкой может потребоваться учет возраста, массы тела, общего состояние здоровья, пола, режима питания, времени введения, взаимодействия с другими лекарственными средствами и тяжести патологического состояния, что можно осуществить на основании обычных экспериментов, выполняемых специалистами в данной области.
Термин "T1" относится к моменту времени, когда препарат этанерцепта хранили в течение приблизительно одной недели при 40°C.
Термин "Т2" относится к моменту времени, когда препарат этанерцепта хранили в течение приблизительно двух недель при 40°C.
Термин "Т4" относится к моменту времени, когда препарат этанерцепта хранили в течение приблизительно четырех недель при 40°C.
Термин "М3" относится, в собирательном смысле, к трем моментам времени, и в частности, к аналитическому результату, наблюдаемому для препарата этанерцепта после хранения в течение приблизительно одного, приблизительно двух или приблизительно трех месяцев при температуре хранения 5°C. Например, в настоящем документе ссылку на анализ, проведенный при М3, следует понимать как означающую то, что такой анализ выполнен в момент времени, когда препарат этанерцепта находился на хранении в течение периода, выбранного из приблизительно одного, приблизительно двух или приблизительно трех месяцев. Таким образом, в настоящем документе заявление о том, что препарат этанерцеп-та является причиной получения некоторого аналитического значения или результата измерения при М3, является истинным, если значение наблюдали в момент времени, соответствующий по меньшей мере одному из следующих сроков хранения: приблизительно одному месяцу, приблизительно двум месяцам или приблизительно трем месяцам хранения при 5°C.
Термины "пик 1", "пик 2" и "пик 3", когда они используются в настоящем документе при обсуждении результатов HIC-хроматографии, относятся к тем же самым пикам 1, 2 и 3, которые обсуждают в
патенте США 7294481.
Варианты осуществления настоящего изобретения
Когда фармацевтические композиции, содержащие этанерцепт (Enbrel(r)), включая водные и лиофи-лизованные препараты этанерцепта, хранят на долгосрочной основе, активность этанерцепта может быть утрачена или уменьшена вследствие нестабильности мономера этанерцепта, обусловленной агрегированием и/или химическим разложением, включая образование фрагментов. В связи с этим настоящее изобретение предоставляет несколько вариантов осуществления водных препаратов этанерцепта, которые дают возможность для стабильного длительного хранения, так что этанерцепт будет стабильным в течение всего срока хранения как в жидком, так и в замороженном состоянии. Предоставляемые препараты включают, но не ограничиваются ими, препараты, которые не содержат аргинина и не требуют никаких дополнительных стадий, таких как регидратация.
Эти варианты осуществления настоящего изобретения более подробно объясняются ниже.
Этанерцепт.
Все композиции согласно настоящему изобретению содержат этанерцепт (Enbrel(r)). Как объясняется в разделе "Предпосылки создания изобретения", этанерцепт представляет собой димерный слитый полипептид, состоящий из лигандсвязывающей внеклеточной части человеческого рецептора фактора некроза опухолей (TNFR) с молекулярной массой 75 кДа (р75), связанной с Fc-областью человеческого IgG1. Этанерцепт состоит из 934 аминокислот. Fc-компонент этанерцепта содержит второй константный домен тяжелой цепи (СН2) и третий константный домен тяжелой цепи (СН3) и шарнирную область человеческого IgGl. Домен Fc может содержать только один или все из вышеописанных доменов.
Этанерцепт, подходящий для хранения в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, можно продуцировать в живых клетках-хозяевах, которые экспрессируют этанерцепт, таких как гибридомы в случае антител, или клетках-хозяевах, получаемых генно-инженерным путем для продуцирования полипептида, в случае гибридных полипептидов или антител. В данной области техники хорошо известны способы продуцирования полипептидов в генно-инженерных клетках. См., например, Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Такие способы вклю
чают введение нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид и обеспечивают его экспрессию в живых клетках-хозяевах. Эти клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки, грибковые клетки или, предпочтительно, животные клетки, вытапливаемые в культуре. Бактериальные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, клетки Escherichia coli. Примеры подходящих штаммов E.coli включают НВ101, DH5.alpha, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 и любой штамм E.coli, который не расщепляет экзогенную ДНК. Применимые грибковые клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, клетки Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Aspergillus. Примерами линий животных клеток, которые можно использовать, являются CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3Т3 и W138. Применяя способы, хорошо известные квалифицированным специалистам в данной области техники, можно создавать новые линии животных клеток (например, посредством трансформации, вирусной инфекции и/или селекции). Клетки-хозяева могут, необязательно, секретировать этанерцепт в среду.
Очистку экспрессированного этанерцепта можно проводить любым стандартным способом. Когда этанерцепт продуцируют внутриклеточно, корпускулярные остатки разрушенных клеток удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Когда этанерцепт секретируется в среду, суперна-танты из такой системы экспрессии можно сначала концентрировать, используя стандартные фильтры, применяемые для концентрирования полипептидов. Для ингибирования протеолиза можно добавлять ингибиторы протеаз, а для предотвращения роста микроорганизмов можно включать антибиотики.
Этанерцепт можно очищать, используя, например, хроматографию на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ и аффинную хроматографию и любую комбинацию известных или еще не открытых технических приемов, включая, но не ограничиваясь ими, хроматографию на белке А, фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ, хроматографию на силикагеле, хроматографию на гепарине SEPHAROSET(r), хроматографию на анионообменных или ка-тионообменных смолах (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония.
Этанерцепт, стабилизированный эксципиентом, представляющим собой ионное производное полиола.
Настоящее изобретение предоставляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, свободный от аргинина, содержащий 25-75 мг/мл этанерцепта; 1-30 мМ фосфата натрия; 0,5-10% (мас./об.) меглумина, где композиция имеет pH 6,0-6,6. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, дополнительно содержащий до 5 мас.% сахарозы.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, дополнительно содержащий до 5 мас.% сахарозы и до 100 мМ хлорида натрия.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, дополнительно содержащий до 5 мас.%, сахарозы, до 100 мМ хлорида натрия и дополнительно содержащий один или более дополнительных компонентов, выбранных из буфера, вещества, изменяющего тоничность, и эксципиента.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, который содержит 50 мг/мл этанерцепта, 0,5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия, 1% сахарозы и 100 мМ хлорида натрия.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет собой водный стабилизированный препарат этанерцепта, который содержит 50 мг/мл этанерцепта, 5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия.
Меглюмин широко применяют в качестве низкомолекулярного эксципиента. Авторы настоящего изобретения в настоящее время неожиданно обнаружили, что меглюмин также способен стабилизировать водные фармацевтические композиции, содержащие крупные белки, такие как этанерцепт.
Полагают, что меглюмин ослабляет склонность этанерцепта к ассоциированию в нежелательные троичные или четвертичные комплексы, и поэтому он уменьшает агрегирование этанерцепта. Уменьшение агрегирования, как полагают, продолжается в течение длительного времени, например два года или более. Не связываясь с какой бы то ни было конкретной теорией, полагают, что указанные ионные производные полиолов, включая меглюмин, способны стабилизировать водные фармацевтические композиции, содержащие этанерцепт, посредством трех разных механизмов. Во-первых, они могут действовать как исключенное растворенное вещество, таким же образом, как маннит, сахароза и сорбит, которые повышают конформационную стабильность. Во-вторых, заряженные растворенные вещества могут изменять коллоидную стабильность, тем самым уменьшая склонность к самоассоциированию, благодаря чему замедляется агрегирование.
В-третьих, эти ионные производные полиолов, будучи заряженными около нейтрального pH, могут действовать как всаливающие средства, как это делает аргинин, способные ресолюбилизировать агрегаты. Стабилизирующие эффекты меглюмина не ограничены уменьшением агрегатов, они могут относиться и к другим аспектам стабилизирования мономера этанерцепта в препарате, содержащем мономер.
Дополнительные компоненты предоставляемой фармацевтической композиции.
Препараты согласно настоящему изобретению могут также включать буферы, вещества, изменяющие тоничность, эксципиенты, фармацевтически приемлемые носители и другие неактивные ингредиенты, обычно применяемые в фармацевтических композициях. Для простоты изложения их более полное обсуждение дается ниже.
Буферы поддерживают pH в желательном диапазоне. К подходящим буферам относятся гистидин, фосфат калия, цитрат натрия или калия, малеиновая кислота, ацетат аммония, трис-(гидроксиметил)аминометан (Трис), различные формы ацетата и диэтаноламина. Концентрация буфера в препарате предпочтительно составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1 М и более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 200 мМ. Буферы хорошо известны в данной области техники, их производят известными способами, и они доступны у коммерческих поставщиков.
Примерами подходящих буферов являются фосфат, гистидин, цитрат, малеат, тартрат, сукцинат, ацетат, трис-(гидроксиметил)аминометан (Трис), бикарбонат.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения буфером является фосфат натрия.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения pH фармацевтической композиции находится на физиологических уровнях или около них. В частности, предпочтительно pH предоставляемой композиции составляет от приблизительно 5,8 до приблизительно 8,4 и еще более предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 7,4.
Специалисту с обычной квалификацией в данной области техники будет понятно, что pH можно регулировать так, как это необходимо для максимальной стабильности и растворимости этанерцепта в конкретном препарате. В частности, препараты этанерцепта при значениях pH за пределами физиологических диапазонов, но еще переносимых пациентом, также входят в объем настоящего изобретения.
Вещество, изменяющее тоничность, представляет собой молекулу, которая влияет на осмоляль-ность раствора. Осмоляльность фармацевтической композиции предпочтительно регулируют так, чтобы сделать максимальной стабильность активного ингредиента и/или чтобы сделать минимальным дискомфорт, ощущаемый пациентом после введения препарата. Как правило, предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция была изотоничной сыворотке, т.е. имела бы такую же или сходную осмоляль-ность, которую достигают, добавляя вещество, изменяющее тоничность.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения осмоляльность предоставляемых препаратов составляет от приблизительно 180 до приблизительно 420 мосмоль. Однако следует понимать, что осмоляльность может быть выше или ниже в зависимости от конкретных условий.
Примеры подходящих веществ, изменяющих тоничность, для изменения осмоляльности включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты (не включая аргинин) (например, цистеин, гистидин и глицин), соли (например, хлорид натрия, хлорид калия и цитрат натрия) и/или сахариды (например, сахароза, глюкоза и маннит).
Предпочтительными веществами, изменяющими тоничность, являются глицин, аланин, хлорид натрия, хлорид калия и сульфат натрия.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация вещества, изменяющего тоничность, в препарате предпочтительно составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1 М, более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 200 мМ. Вещества, изменяющие тоничность, хорошо известны в данной области техники, и их производят хорошо известными способами, и они доступны у коммерческих поставщиков.
В фармацевтическую композицию можно также добавлять эксципиенты, называемые также химическими добавками, совместно растворяемыми веществами, сорастворителями, которые стабилизируют полипептид в растворе (а также в высушенных или замороженных формах). Эксципиенты хорошо известны в данной области техники, и их производят известными способами, и они доступны у коммерческих поставщиков.
Примеры подходящих эксципиентов включают, но не ограничиваются ими, сахара/полиолы, такие как сахароза, лактоза, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтоза, инозит, трегалоза, глюкоза; полимеры, такие как сывороточный альбумин (бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий SA или ре-комбинантный НА), декстран, поливиниловый спирт (PVA), гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлоза (НЕС); неводные растворители, такие как многоатомные спирты (например, PEG и глицерин) и диметилформамид (DMF); аминокислоты, такие как пролин, L-серин, натриевая соль глутаминовой кислоты, аланин, глицин, гидрохлорид лизина, саркозин и гамма-аминомасляная кислота; поверхностно-активные средства, такие как Tween(r)-80 (полисорбат 80), Tween(r)-20 (полисорбат 20), SDS, полисорбат, полоксамеры; и прочие экс-ципиенты, такие как фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, N-оксид триметиламина, бетаин, ионы металлов (например, цинка, кальция и магния), CHAPS, монолау-рат, 2-О-бета-манноглицерат, или любую комбинацию вышеуказанных веществ.
Предпочтительными эксципиентами являются сахароза, лактоза, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтоза, инозит, трегалоза, глюкоза, бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий сывороточ
ный альбумин (HSA), рекомбинантный альбумин, декстран, PVA, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлоза (HEC), поли-этиленгликоль, этиленгликоль, глицерин, аланин, глицин, гидрохлорид лизина, саркозин, SDS, полисор-бат 20, полисорбат 80, полоксамер 188, N-оксид триметиламина, бетаин, ионы цинка, ионы кальция, ионы магния, CHAPS, монолаурат сахарозы и 2-О-бета-манноглицерат.
Концентрации одного или более эксципиентов в препарате согласно настоящему изобретению составляют предпочтительно приблизительно от 0,001 до 5 мас.%, более предпочтительно приблизительно от 0,1 до 2 мас.%.
Способы лечения
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ лечения млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, где млекопитающее имеет заболевание или расстройство, которые можно благоприятным образом лечить этанерцептом.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения этанерцепт является полученным из того же вида млекопитающего, что и млекопитающее, которое лечат указанной композицией.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное млекопитающее является человеком.
Заболевания или расстройства, которые можно лечить предоставляемыми композициями, включают, но не ограничиваются этим, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спон-дилоартрит, болезнь Вегенера (гранулематоз), болезнь Крона (или воспалительное заболевание кишечника), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), гепатит C, эндометриоз, астму, кахексию, псориаз и атопический дерматит. Дополнительные заболевания или расстройства, которые можно лечить композициями согласно настоящему изобретению, включают заболевания, описанные в WO 00/62790, WO 01/62272, заявке на патент США № 2001/0021380 и в патенте США № 7648702 В2, соответствующие части которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
Предоставляемые фармацевтические композиции можно вводить субъекту, нуждающемуся в лечении, посредством системной инъекции, такой как внутривенная инъекция, или посредством инъекции или нанесением в соответствующее место, например посредством прямой инъекции или прямого нанесения в соответствующее место, когда место открыто при хирургической операции; или посредством местного применения.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ лечения и/или предупреждения ревматоидного артрита, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества одной из предоставляемых композиций этанерцепта.
Терапевтически эффективное количество этанерцепта в предоставляемых композициях будет зависеть от конкретного состояния, нуждающегося в лечении, тяжести состояния, предшествующей терапии и клинического анамнеза пациента и реакции на терапевтическое средство. Соответствующую дозу можно отрегулировать в соответствии с заключением лечащего врача, так чтобы ее можно было вводить пациенту однократно или в виде серийного курса.
В одном варианте осуществления количество этанерцепта, эффективное для дозы, вводимой взрослому, составляет приблизительно 1-500 мг/м2, или приблизительно 1-200 мг/м2, или приблизительно 1-40 мг/м2, или приблизительно 5-25 мг/м2.
В качестве альтернативы можно вводить фиксированную дозу, количество которой может быть в диапазоне 2-500 мг/доза, 2-100 мг/доза или приблизительно 10-80 мг/доза.
Если дозу нужно вводить более одного раза в неделю, то типичная доза находится в том же диапазоне, что и вышеописанные диапазоны доз, или в диапазоне более низких доз, и предпочтительно ее вводят два или более раз в неделю, причем диапазон дозы составляет 25-100 мг/доза.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения доза, приемлемая для введения посредством инъекции, содержит 80-100 мг/доза или в качестве альтернативы 80 мг/доза.
Дозу можно вводить один раз в неделю, один раз в две недели или с интервалом в несколько недель (например, от 2 до 8 недель).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения этанерцепт вводят посредством единичной подкожной (SC) инъекции раствора с концентрацией 25-75 мг/мл.
В некоторых случаях улучшение состояния пациента будет достигнуто посредством введения дозы, составляющей до приблизительно 100 мг фармацевтической композиции, от одного до трех раз в неделю в течение по меньшей мере трех недель. Достижение желаемой степени улучшения состояния может потребовать лечения в течение более длительных периодов. При неизлечимых хронических состояниях режим может продолжаться неопределенно долго. Для педиатрических пациентов (в возрасте 4-17 лет) подходящий режим может включать введение дозы этанерцепта от 0,4 до 5 мг/кг один или более раз в неделю.
В другом варианте осуществления фармацевтические препараты согласно настоящему изобретению могут быть получены в виде нерасфасованной массы, устанавливая при этом более высокий уровень компонентов фармацевтической композиции, чем требуется для введения в организм, и соответствую
щим образом разбавляя их перед введением.
Фармацевтические композиции можно вводить в виде монотерапевтического средства или, если необходимо, в комбинации с дополнительными терапевтическими средствами. В частности, в одном варианте осуществления предоставляемые способы лечения и/или предупреждения применяют в комбинации с введением терапевтически эффективного количества другого активного вещества. Другое активное вещество можно вводить до, во время или после введения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Другое активное вещество можно вводить либо в виде части предоставляемой композиции, либо в качестве альтернативы в виде отдельного препарата.
Введение предоставляемых фармацевтических композиций может быть выполнено разнообразными путями, включая парентеральное, пероральное, буккальное, сублингвальное, интраназальное, ректальное, внутрибрюшинное, внутрикожное, чрескожное, подкожное, внутривенное, внутриартериальное, внутрисердечное, внутрижелудочковое, внутричерепное, интратрахеальное введение, внутримышечную инъекцию, инъекцию в стекловидное тело и местное применение.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению особенно подходят для парентерального введения, т.е. подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрибрюшинного, интраце-реброспинального, внутрисуставного, интрасиновиального, интравитреального и/или интратекального. Парентеральное введение может быть в виде болюсной инъекции или в виде непрерывной инфузии. Фармацевтические композиции для инъекции могут быть представлены в виде стандартных лекарственных форм, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. В дополнение к этому, недавно был разработан ряд новых приемов доставки лекарственных средств, и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению подходят для введения с использованием этих новых способов (например, Inject-ease(r), Genject(r), ручки-инжекторы, такие как GenPen(r), и безыгольные устройства, такие как MediJector(r) и BioJector(r)). Композицию согласно настоящему изобретению можно также адаптировать для способов введения, которые еще только будут разработаны. См. также Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.
Предоставляемые фармацевтические композиции также могут быть составлены в виде препарата-депо. Такие долгодействующие препараты можно вводить посредством имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или посредством внутримышечной инъекции. Так, например, препараты можно модифицировать подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или изготовить их в виде слаборастворимых производных, например в виде слаборастворимой соли.
Фармацевтические композиции можно, если желательно, представить во флаконе, упаковке или в устройстве типа диспенсера, которые могут содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное устройство в виде диспенсера может содержать шприц, имеющий единичную дозу жидкого препарата, готового для инъекции. Вместе с этим шприцем может быть инструкция по введению.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на предоставление набора или контейнера, которые содержат водную фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Концентрация полипептида в водной фармацевтической композиции может варьировать в очень широком диапазоне, но обычно в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 20000 мкг/мл водного препарата. Вместе с этим набором может быть инструкция по применению.
Настоящее изобретение более конкретно описано в нижеследующих примерах, которые предназначены только для иллюстрации, поскольку квалифицированным специалистам в данной области техники будут очевидны их многочисленные модификации и вариации.
Примеры
Пример 1.
Этанерцепт, стабилизированный меглюмином.
Препараты этанерцепта, стабилизированные меглюмином, могут быть получены или протестированы, используя процедуры, в общем виде описанные ниже.
Каждый твердый компонент препарата отвешивают в количестве, требующемся для данного объема буфера для препарата. Эти компоненты соединяют в стакане или в сосуде, способном вместить и дающем возможность измерить данный объем буфера для препарата. В стакан добавляют объем деионизиро-ванной воды, равный приблизительно трем четвертям целевого буфера для препарата, и затем растворяют компоненты. Значение pH буфера доводят до требуемого значения pH препарата, используя 1 М гид-роксид натрия и/или 1 М хлористо-водородную кислоту. Затем конечный объем буфера для препарата доводят до желаемого объема, добавляя деионизированную воду. Белковый раствор этанерцепта помещают в ячейку для диализа (такую как Thermo Scientific Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit 10000 MWCO), где в течение 12 ч при 4°C осуществляют его контакт с требуемым буфером для препарата. Отношение объема буфера для препарата к объему раствора белка должно составлять не менее 1000:1.
Диализную ячейку и белковый раствор, содержащийся в ней, затем помещают во второй (равный по объему) буфер для препарата на дополнительные 12 ч при 4°C. Белковый раствор, получаемый в резуль
тате этого, удаляют из диализной ячейки и с помощью ультрафиолетовой спектроскопии определяют концентрацию белка. Концентрацию белка доводят до требуемого уровня, используя центрифугирование (например, в центрифужных концентраторах Amicon Ultra 10000 MWCO Centrifugal Concentrators) и/или разбавляя буфером для препарата.
Композиции можно испытывать на долгосрочную стабильность посредством эксклюзионной хроматографии (SEC), денатурирующей SEC (dSEC), гидрофобной хроматографии (HIC), электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), а также испытывать на связывание и биологическую активность в различные моменты времени. Биологическую активность можно измерять любым из хорошо известных аналитических способов.
Например, технология эксклюзионной хроматографии описана в публикации Hawe et al., Pharm. Res. 2011, 28: 2302 и/или van Marrschalkerweerd et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2011, 78:213. Аналогично, технологии денатурирующей эксклюзионной хроматографии, гидрофобной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия также хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области техники.
Полагают, что композиция будет стабильной в течение двух лет или более.
Пример 2.
Получение этанерцепта. Стадия 1. Выращивание клеток.
Применяя способ, известный в данной области техники, и используя клон клеток CHO, экспресси-рующих слитый белок этанерцепт, осуществляют выращивание клеток, необходимое для получения числа клеток, достаточного для инокулирования производственного биореактора. Продукт этого процесса экспрессии (собранная клеточная культуральная жидкость) представляет собой смесь этанерцепта, обладающего правильной пространственной конфигурацией, а также этанерцепта с неправильной пространственной конфигурацией и/или агрегированного этанерцепта, вместе с дополнительными загрязнениями. В собранной клеточной культуральной жидкости, содержащей такую белковую смесь, детергентами инактивируют вирусы.
Стадия 2. Аффинная хроматография.
Аффинную хроматографию проводят с собранной клеточной культурой, полученной на вышеописанной стадии 1, традиционным способом, применяя обычную аффинную колонку с белком А. Выход продукта составляет приблизительно 85%. Полученный продукт представляет собой сложную белковую смесь, содержащую этанерцепт с правильной пространственной конфигурацией, этанерцепт с неправильной пространственной конфигурацией и/или агрегаты этанерцепта с правильной и/или неправильной конфигурацией или белковые фрагменты. Продукт, полученный на этой стадии очистки после аффинной колонки с белком А, доводят до pH 3,5 и затем в нем инактивируют вирусы. После инактивации вирусов этот продукт доводят до pH 5,5, дополнительно осветляют известным образом, используя капсульный фильтр, полученный коммерческим путем.
Стадия 3А. Катионообменная хроматография смешанного типа.
Для очистки продукта, полученного на вышеописанной стадии 2, используют упакованную хрома-тографическую колонку GE Healthcare Capto MMC объемом 31,8 л (диаметр 45 см х высота слоя 20 см). Перед использованием колонку уравновешивают двумя колоночными объемами (КО) 25 мМ раствора ацетата (pH 5,5), дезинфицируют двумя КО 0,1н. раствора NaOH с 1 М NaCl и нейтрализуют двумя КО 25 мМ раствора ацетата с 0,7 М NaCl (pH 5,5). Затем колонку уравновешивают с 8-10 КО 25 мМ раствора ацетата (pH 5,5), до тех пор пока вытекающий раствор не будет иметь pH 5,5 и 3,5 мСм/см. Материал, собранный с белка A на вышеописанной стадии 2, разбавляют до <6 мСм/см водой для инъекций (WFI) и наносят на колонку, загружая до 15 г/л среды для каждого цикла. Колонка работает при линейной скорости 200 см/ч, давая время пребывания 6 мин. После загрузки колонку промывают двумя КО 25 мМ раствора ацетата (pH 5,5). Затем продукт элюируют, используя 8,5 КО раствора с градиентом от 15 до 85% 25 мМ раствора ацетата (pH 5,5) до 25 мМ раствора ацетата, 0,7 М NaCl (pH 5,5). Сбор продукта начинают при 0,15 ед. оптической плотности (OD) (A280, длина пути 1,0 см) и заканчивают при 50% максимума пика. Объем элюата составляет приблизительно 5 КО. Остатки продукта и примеси смывают с колонки двумя КО 10 мМ раствора Триса, 1 М NaCl, pH 8,0, и отбрасывают. Продукт, полученный с колонки смешанного типа, фильтруют, используя капсульный фильтр Millipore Opticap XL10, 0,22 мкм Durapore (0,69 м2). Выход продукта, полученного на этой стадии соответствует приблизительно 70% материала, снятого с белка А на стадии 2.
Стадия 3В. Анионообменная хроматография смешанного типа.
Для дальнейшей очистки продукта, полученного на вышеописанной стадии 3А, используют упакованную хроматографическую колонку GE Healthcare Capto Adhere объемом 27,0 л (диаметр 45 см х высота слоя 17 см). Перед использованием колонку уравновешивают двумя КО 25 мМ раствора Триса с pH 8,0 и дезинфицируют двумя КО 0,1н. раствора NaOH, 1 М NaCl, нейтрализуют и уравновешивают двумя КО 25 мМ раствора Триса с pH 8,0. Перед загрузкой продукта колонку уравновешивают тремя КО 10 мМ раствора Триса с pH 8,0. Материал, собранный с Capto MMC на вышеописанной стадии 3A, доводят до pH 8,1 с помощью приблизительно 0,045 кг 1 М раствора Триса с pH 8,3 на 1 кг собранного материала. Продукт с вышеописанной стадии 3А разбавляют на линии водой для инъекций в соотношении 1:3,8, доводя его проводимость до 12,0 мСм/см и pH 8,0. Полученный материал затем наносят на колонку, загружая до 15 г/л среды. Колонка работает при линейной скорости 170 см/ч, давая время пребывания 6 мин. После загрузки колонку промывают двумя КО 25 мМ раствора Триса (pH 8,0). Затем продукт элюируют, используя 10 КО раствора с градиентом (от 20 до 90%) 25 мМ раствора Триса (pH 8,0) до 10 мМ раствора Триса, 1 М NaCl (pH 8,0). Сбор продукта начинают при 0,15 ед. оптической плотности (А280, длина пути 1,0 см) и заканчивают при 25% максимума пика. Объем элюата составляет 4-6 КО. Элюированный продукт фильтруют, используя коммерчески доступный капсульный фильтр, а затем известным образом отфильтровывают вирусы и подвергают фильтрованию тангенциальным потоком. Общий выход продукта со стадии 3В (включая конечные стадии вирусной фильтрации и фильтрования тангенциальным потоком) составлял приблизительно 68%. Выход продукта, измеренный до проведения стадий фильтрования, составлял приблизительно 75%. Данные HIC получены с фракциями, элюированными на этой стадии.
Анализ.
Конечный профильтрованный продукт, полученный в этом примере, как было найдено, имеет более приблизительно 90 мас.% этанерцепта с правильной пространственной конфигурацией, как определено посредством HIC, менее 5 мас.% форм этанерцепта с неправильной пространственной конфигурацией, как определено посредством HIC, приблизительно менее 3 мас.% расщепленного материала по данным HIC-анализа (полагают, что это фрагменты этанерцепта, в которых отсечен участок TNFR), и общее количество этанерцепта с правильной и неправильной пространственной конфигурацией превышает 95 мас.%, как определено посредством эксклюзионной хроматографии.
Анализ препаратов этанерцепта.
A. Термостабильность при хранении.
После диализа и концентрирования образцы препаратов этанерцепта, примеры которых описаны выше, стерильно фильтровали в боксе биологической безопасности. Используя стерилизованные пипетки и автоклавированные наконечники пипеток, образцы препаратов этанерцепта переносили в помеченные и автоклавированные лиофилизационные флаконы объемом 1 мл. Флаконы закупоривали стерильными пробками из бутилкаучука и обжимали алюминиевыми колпачками. Все флаконы затем переносили в термостатируемые шкафы. Образцы подвергали двум режимам проверки термической стабильности: (1) две недели при 40°C и (2) четыре недели при 25°C. Во всем тексте настоящей спецификации эти два температурных режима обозначены как "Т2" и "Т4" соответственно.
B. Эксклюзионная хроматография (SEC).
Препараты этанерцепта, раскрытые в настоящем документе, анализировали, применяя хорошо известную технологию эксклюзионной хроматографии (SEC), метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, в котором анализируемые компоненты разделяют по размеру (см. Rogner, M. (2000). Size Exclusion Chromatography. Protein Liquid Chromatography. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier. 61:89-145). Чтобы оценить термостабильность образцов этанерцепта, описанных выше, эти образцы исследовали способом SEC, основываясь на литературных данных (van Maarschalkerweerd, A., G.J. Wolbink, et al. (2011). "Comparison of analytical methods to detect instability of etanercept during thermal stress testing", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 78 (2): 213-221). Готовили буфер подвижной фазы, содержащий 50 мМ моногидрата однозамещенного фосфата натрия и 150 мМ аргинина. Значение pH доводили до 6,5, добавляя 1 М HCl. Все разделения проводили, используя предохранительную колонку Tosoh TSK-Gel SWxl размером 6 мм х 4 см (кат. № 8543), линейно присоединенную к колонке Tosoh TSK-Gel G4000 SWxl размером 7,8 мм х 30 см (кат. № 8542). Для проведения разделения колонки при комнатной температуре 23°C уравновешивали с подвижной фазой при скорости потока 0,5 мл/мин. Используя автосэмплер, на колонку инъецировали 5 мкл препарата этанерцепта с концентрацией 50 мг/мл. Разделение осуществлялось в течение 30 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. В течение этого времени элюент с колонки мониторировали при длине волны 280 нм.
C. Интегрирование хроматограмм эксклюзионной хроматографии.
Все процедуры интегрирования проводили, используя программное обеспечение Chromeleon (Dionex). Перед интегрированием из всех хроматограмм вычитали SEC-хроматограмму для буфера, не содержащего этанерцепта. Все интегрирование проводили в интервале времени удерживания от 12 до 26 мин. Для определения пика использовали несколько параметров. Минимум площади детектируемого пика был установлен при 0,05 mAu-мин. Двухмерную чувствительность для детектирования пика устанавливали при 0,01 mAu и 75 с. Плечи пиков добавляли вручную, используя инструмент ручного интегрирования. Ручную доводку всех детектированных пиков осуществляли в две стадии. Во-первых, базовые линии пиков (нижние границы пиков) выравнивали по горизонтали. Во-вторых, положения базовых линий пиков по вертикали смещали к уровню базовой линии хроматограммы. Базовую линию хромато-граммы определяли как величину сигнала в отсутствие анализируемого вещества. Сигнал в отсутствие анализируемого вещества определяли как оптическую плотность (в mAu), зарегистрированную при времени удерживания 12 мин.
D. SEC-фракции препаратов этанерцепта.
При SEC-анализе препаратов этанерцепта, описанных выше, были идентифицированы и изучены три SEC-хроматографические фракции. Проанализированные фракции были следующими, в порядке элюирования с SEC-колонки: (1) фракция с большой молекулярной массой, представляющая собой агрегаты интактного слитого белка этанерцепта TNFR:FC, вероятно образованные посредством нековалент-ного электростатического взаимного притяжения молекул интактного этанерцепта (далее в настоящем документе упоминаются как "агрегат(ы)" "содержание агрегата(ов)"); (2) фракция мономера, представляющая собой интактный слитый белок этанерцепта TNFR:FC (далее в настоящем документе упоминается просто как "мономер" или "содержание мономера"); (3) фракция, по-видимому, представляющая собой один фрагмент или популяцию фрагментов молекулы этанерцепта, в которых одна часть слитого белка TNFR:молекула отщеплена от мономера с утратой участка Fab-фрагмента слитого белка в шарнирной части молекулы. Наиболее многочисленные виды фрагментов или расщепленных форм, измеряемые посредством SEC, обозначены как фрагмент 3. При проведении SEC-анализа элюирование агрегатов наблюдается первым, за ними следует мономер, после него фрагмент 3.
Нижеследующие таблицы показывают относительные количества агрегатов, мономера и фрагмента 3, определенные посредством SEC-анализа, как описано выше. Количества, указанные в табл. даны в мас.%, в таблицах обозначено: t0 - препарат, содержавшийся при 5°C и проанализированный не позднее 24 ч после изготовления; t1 - препарат, хранившийся в течение одной недели при 40°C; t2 - препарат, хранившийся в течение двух недель при 40°C.
ТаблицаI
HIC-анализ препаратов этанерцепта.
HIC-хроматографию можно проводить по методике, известной в данной области техники и в общем виде описанной в патенте США 7294481, включенном в настоящий документ посредством ссылки. Образцы оценивали при t0 (не позднее 24 ч после изготовления при 5°C) и еще раз либо после двух недель хранения при 25°C (t2), либо после 4 недель хранения при 25°C. Из анализа настоящей спецификации и практики применения настоящего изобретения, раскрытой в настоящем документе, квалифицированным специалистам в данной области будут очевидны и другие варианты его осуществления. Настоящая спецификация и примеры предназначены только для рассмотрения в качестве иллюстраций, и истинный объем и сущность настоящего изобретения указаны в нижеследующих пунктах формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Водный стабилизированный препарат этанерцепта, свободный от аргинина, содержащий 25-75 мг/мл этанерцепта; 1-30 мМ фосфата натрия; 0,5-10% (мас./об.) меглумина, где композиция имеет pH 6,06,6.
2. Препарат по п.1, дополнительно содержащий до 5 мас.% сахарозы.
3. Препарат по п.1 или 2, дополнительно содержащий до 100 мМ хлорида натрия.
4. Препарат по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий один или более дополнительных компонентов, выбранных из буфера, вещества, изменяющего тоничность, и эксципиента.
5. Препарат по п.3, содержащий 50 мг/мл этанерцепта, 0,5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия, 1% сахарозы и 100 мМ хлорида натрия.
6. Препарат по п.1, содержащий 50 мг/мл этанерцепта, 5 мас.% меглюмина, от 10 до 30 мМ фосфата натрия.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028520
- 1 -
(19)
028520
- 1 -
(19)
028520
- 4 -
(19)
|
