EA 028515B1 20171130

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000028515b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Применение моноклонального антитела к человеческому прогастрину (hPG) для получения лекарственного средства для лечения и предотвращения рецидива рака печени.

2. Применение по п.1, где моноклональное антитело к hPG представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.

3. Применение по п.1, где моноклональное антитело к hPG представляет собой N-терминальное моноклональное антитело.

4. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG связывает эпитоп, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из DAPLG (SEQ ID NO:28), PDAPLG (SEQ ID NO:29), PRSQQPD (SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD (SEQ ID NO:31) и WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:32).

5. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG вырабатывается против иммуногена, включающего пептид, который имеет последовательность SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:25).

6. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG включает: a) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 1.3 (SEQ ID NO:1), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 2.3 (SEQ ID NO:2) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 3.3 (SEQ ID NO:3), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 1.3 (SEQ ID NO:4), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 2.3 (SEQ ID NO:5) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 3.3 (SEQ ID NO:6); b) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 1.4 (SEQ ID NO:7), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 2.4 (SEQ ID NO:8) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 3.4 (SEQ ID NO:9), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 1.4 (SEQ ID NO:10), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 2.4 (SEQ ID NO:5) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 3.4 (SEQ ID NO:11); c) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 1.16 (SEQ ID NO:39), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 2.16 (SEQ ID NO:43) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 3.16 (SEQ ID NO:47), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 1.16 (SEQ ID NO:50), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 2.16 (SEQ ID NO:53) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 3.16 (SEQ ID NO:7); или d) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 1.19 (SEQ ID NO:40), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 2.19 (SEQ ID NO:44) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 3.19 (SEQ ID NO:48), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 1.19 (SEQ ID NO:51), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 2.19 (SEQ ID NO:54) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 3.19 (SEQ ID NO:58).

7. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG конкурирует за связывание hPG с эталонным антителом, выбранным из группы: (a) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:12 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:13; (b) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:14 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:15; (c) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:61 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:65; (d) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:62 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:66.

8. Применение по п.1, где моноклональное антитело к hPG представляет собой С-терминальное моноклональное антитело.

9. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG связывает эпитоп, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из FGRR (SEQ ID NO:33), MDFGR (SEQ ID NO:34) и GWMDFGRR (SEQ ID NO:36).

10. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG вырабатывается против иммуногена, включающего пептид, который имеет последовательность QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID NO:27).

11. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG включает: a) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 1.8 (SEQ ID NO:37), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 2.8 (SEQ ID NO:41) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 3.8 (SEQ ID NO:45), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 1.8 (SEQ ID NO:49), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 2.8 (SEQ ID NO:52) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 3.8 (SEQ ID NO:55); или b) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 1.13 (SEQ ID NO:38), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 2.13 (SEQ ID NO:42) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _H CDR 3.13 (SEQ ID NO:46), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 1.13 (SEQ ID NO:50), CDR2 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 2.13 (SEQ ID NO:53) и CDR3 включает аминокислотную последовательность V _L CDR 3.13 (SEQ ID NO:56).

12. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG конкурирует за связывание hPG с эталонным антителом, выбранным из группы, включающей: (a) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:59 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:63; (b) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:60 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:64.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское ои 028515 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. С07К16/26 (2006.01)
2017.11.30
(21) Номер заявки
201300171
(22) Дата подачи заявки
2011.07.22
(54) СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ТЕРАПИИ РАКА ПЕЧЕНИ
(31) 61/367,851; 61/476,204
(32) 2010.07.26; 2011.04.15
(33) US
(43) 2013.07.30
(86) PCT/EP2011/062686
(87) WO 2012/013609 2012.02.02
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЛЕ ЛАБОРАТУАР СЕРВЬЕ; ИНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ СЕНТ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ МЕДИСАЛЬ (ИНСЕРМ); САНТР
НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ
СЬЕНТИФИК (СНРС) (FR)
(72) Изобретатель:
Уу Лейла, Дюме Анн-Софи, Жубер Доминик (FR), Олланд Фредерик (AU)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(56) CAPLIN M. ET AL.: "Expression and processing of gastrin in hepatocellular carcinoma, fibrolamellar carcinoma and cholangiocarcinoma", JOURNAL OF HEPATOLOGY, vol. 30, no. 3, 1 March 1999 (1999-03-01), pages 519-526, XP55010098, ISSN: 0168-8278, DOI: 10.1016/ S0168-8278(99)80114-7, the whole document WO-A2-2007135542
KONTUREK S.J. ET AL.: "Progastrin and its products from patients with chronic viral hepatitis and liver cirrhosis", SCANDINAVIAN JOURNAL
OF GASTROENTEROLOGY, INFORMA
HEALTHCARE, GB, vol. 38, no. 6, 1 June 2003 (2003-06-01), pages 643-647, XP009144698, ISSN: 0036-5521, the whole document
WO-A1-2011083089
(57) Изобретение обеспечивает способы лечения рака печени и предотвращения рецидива рака печени с помощью антипрогастриновых антител, способы мониторинга эффективности лечения рака печени при использовании антипрогастриновой терапии и композиции, которые применяются для этого.
1. Перекрестные ссылки на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет в соответствии с 35 USC §119(е) временной заявки № 61/367851, поданной 26 июля 2010 г., и временной заявки № 61/476204, поданной 15 апреля 2011 г., содержание которых является введенным в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности.
2. Ссылка на список последовательностей, таблицы и компьютерные программы
Настоящая заявка содержит список последовательностей, которые были представлены в ASCII формате посредством электронной подачи. Указанная ASCII копия, созданная 14 июля 2011 г., имеет название BR (005WO).txt и размер 79913 байт.
3. Область, к которой относится изобретение
Настоящее описание является направленным, среди прочего, на способы лечения субъектов с раком печени или с риском возникновения рака печени путем введения субъекту композиции, включающей антитело, специфическое для прогастрина.
4. Предпосылки создания изобретения
Рак печени представляет собой пятый по счету вид рака в мире и третью наиболее частую причину смерти от рака; Llovet и др., 2003, "Гепатоклеточная карцинома", Lancet 362: 1907-17. Наиболее общая форма рака печени представляет собой гепатоклеточную карциному, которая является также известной как HCC, и часто развивается при других сопутствующих повреждениях печени, типично при гепатите или циррозе; Thorgeirsson и др., 2002, "Молекулярный патогенез человеческой гепатоклеточной карциномы", Nature Genetics, 31: 339-346. Другие, менее типичные, формы рака печени включают гепатобла-стому и холангиокарциному. Стандартное лечение рака печени представляет собой хирургическую резекцию, если это является возможным, и химиотерапию, химиоэмболизацию или лучевую терапию в случае, если хирургия не является возможной. Хирургическое лечение не всегда является возможным по причине размера опухоли или ее расположения, прогрессирующего цирроза. Даже в случае хирургии рецидив/возврат опухоли насчитывает 70% случае в течение 5 лет после резекции; см. Llovet и др., выше. Химиотерапевтические способы лечения также оказались такими, которые имеют сниженную эффективность при раке печени, возможно, по причине повышенной способности клеток рака печени выводить химиотерапевтические агенты. Таким образом, существует значительная и настоятельная потребность в более эффективном лечении рака печени.
5. Краткое изложение сущности изобретения
Гастрит представляет собой пептидный гормон желудка, который функционирует как стимулятор секреции гастриновой кислоты. У взрослых млекопитающих он вырабатывается преимущественно G клетками гастральной полости и в варьирующей степени в верхней части тонкого кишечника и в поджелудочной железе. Со ссылкой на фиг. 1 ген гастрина транслируется в полипептид из 101 аминокислоты, который называется "препрогастрином" и содержит сигнальную последовательность (подчеркнута), которая отщепляется, образуя прогастрин ("PG"), полипептид из 80 аминокислот. Гастрин, который в основном обнаруживается в трех формах, G34, G17 и G14 (не иллюстрируется), образуется в результате процессинга прогастрина. Было продемонстрировано наличие не полностью процессированной формы гастрина, включая PG, в некоторых образцах ткани рака печени (см., например, Caplin и др., 1999, "Экспрессия и процессинг гастрина при гепатоклеточной карциноме, фиброламеллярной карциноме и холан-гиокарциноме", J. Hepatol., 30: 519-526). Было обнаружено, что подходы на основе антипрогастрина могут использоваться для мониторинга, лечения и предотвращения рака печени и/или его рецидива. Как было продемонстрировано впервые в данной заявке, количество мРНК гастрина является повышенным в стволовых клетках рака печени, а способность клеток рака печени или изолированных стволовых клеток рака печени к образованию раковых сфер или сфероидов при ростовых условиях сниженного прикрепления является значительно уменьшенной с помощью антипрогастриновых антител. Не имея намерения быть связанным с какой-либо теорией операции, можно сказать, что антипрогастриновые антитела со способностью связывать прогастрин ("PG") и нейтрализовать биологическую активность PG предполагаются как такие, которые препятствуют росту клеток рака печени, в частности клеток, инициирующих опухоль печени, или раковых стволовых клеток. В соответствии с предположением это уменьшает размер и количество клеток рака печени и предотвращает рецидив рака печени. Эти открытия обеспечивают новые средства для лечения, предотвращения и мониторинга лечения рака печени.
В соответствии с этим в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции, полезные для лечения рака печени и предотвращения рецидива рака печени у животных, включая людей. Как описывается более подробно ниже, способы лечения вовлекают введение субъекту, диагностированному с раком печени, количества антитела, которое специфически связывает прогастрин ("анти-PG антитело"), эффективного для обеспечения терапевтического преимущества. Анти-PG антитело может вводиться отдельно, в виде монотерапии, или в сочетании с, или дополнительно к другим приемам, таким как резекция опухоли, лучевая терапия, химиотерапия, терапия при использовании другого антитела и т.д. При использовании в сочетании с или дополнительно к резекции опухоли анти-PG антитело может вводиться перед и/или после удаления опухоли и может продолжаться в течение конкретного периода времени после удаления опухоли до тех пор, пока уровень прогастрина в плазме и/или сыворотке крови не будет нижеуказанного порогового уровня, или до тех пор, пока не будет достигнуто снижение
уровней прогастрина в плазме и/или сыворотке крови в течение указанного периода времени. При использовании в сочетании с или дополнительно к химиотерапии анти-PG антитело может вводиться перед химиотерапией совместно с химиотерапией или после химиотерапии. Кроме того, анти-PG антитело может вводиться в течение указанного периода времени, до тех пор, пока уровни прогастрина в плазме и/или сыворотке крови не будут ниже указанного порогового уровня, или до тех пор, пока не будет достигнуто снижение уровней прогастрина в плазме и/или сыворотке в течение указанного периода времени.
Композиции в соответствии с настоящим описанием содержат по крайней мере одно анти-PG антитело, которое специфически связывается с PG и нейтрализует его биологическую активность. Любое анти-PG антитело может использоваться в способах в соответствии с настоящей заявкой, включая, но без ограничения таковыми, поликлональные и моноклональные анти-PG антитела. Анти-PG антитела, полезные для применения в способах лечения и предотвращения, которые раскрываются в данной заявке, включают те, что описаны ниже в разделе 7.11. Предпочтительно анти-PG антитело является специфическим для PG видов, которые подвергают лечению. Например, анти-hPG антитело вводят субъекту, который представляет собой человека. Анти-PG композиции, приемлемые для применения в способах в соответствии с настоящим описанием, могут включать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель и/или разбавитель. Могут быть получены композиции различных путей введения, как описывается в данной заявке, и включают носители, наполнители и/или разбавители, приемлемые для выбранного пути введения. Для целей лечения анти-PG антитела могут быть упакованы в виде единичных доз для удобства применения. Единичные дозы могут быть упакованы в наборы, содержащие разбавитель и, необязательно, инструкции для применения.
В другом аспекте настоящая заявка обеспечивает способ мониторинга эффективности анти-PG лечения путем измерения концентрации или уровня, или PG в образце крови (сыворотке, плазме или цельной крови), полученном от индивидуума с раком печени, которого подвергают лечению с помощью ан-ти-PG композиции, и сравнение измеренного уровня PG с базовым уровнем PG. Базовый уровень может представлять собой уровень PG в образце крови, взятом в более ранний момент времени, например в начале лечения. Измерение, которое сравнивают с базовым уровнем, может быть получено от образца, взятого во время или после прохождения курса лечения. Измеренный уровень PG, который является ниже базового уровня, является показательным для эффективности лечения, а измеренный уровень PG, который является равным или выше базового уровня, является показательным для отсутствия эффективности лечения.
6. Краткое описание чертежей
Фиг. 1 дает представление об аминокислотных последовательностях человеческого препрогастрина (SEQ ID NO:100), где сигнальная пептидная последовательность является подчеркнутой, зрелого человеческого прогастрина (SEQ ID NO:20) и некоторых продуктов процессинга прогастрина, включая G34 (SEQ ID NO:102), G34-Gly (SEQ ID NO:103), G17 (SEQ ID NO:104), G17-Gly (SEQ ID NO:105) и CTFP
(SEQ ID NO:106).
Фиг. 2 дает представление о полинуклеотидных и аминокислотных последовательностях вариабельной области легкой и вариабельной области тяжелой цепей определенных типичных мышиных анти-hPG моноклональных антител. В каждом случае три CDR выделены жирным шрифтом с подчеркиванием. В частности:
фиг. 2A дает представление о полипептидной последовательности VH цепи мышиного анти-hPG MAb 3 (SEQ ID NO:12) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:16);
фиг. 2B дает представление о полипептйдной последовательности VL цепи мышиного анти-hPG MAb 3 (SEQ ID NO:13) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO: 17);
фиг. 2C дает представление о полипептидной последовательности VH цепи мышиного анти-hPG MAb 4 (SEQ ID NO:14) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO: 18);
фиг. 2D дает представление о полипептидной последовательности VL цепи мышиного анти-hPG MAb 4 (SEQ ID NO:15) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:19);
фиг. 2E дает представление о полипептидной последовательности VH цепи мышиного анти-hPG MAb 8 (SEQ ID NO:59) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (SEQ ID NO:67);
фиг. 2F дает представление о полипептидной последовательности VL цепи мышиного анти-hPG MAb 8 (SEQ ID NO:63) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:71);
фиг. 2G дает представление о полипептидной последовательности VH цепи мышиного анти-hPG MAb 13 (SEQ ID NO:60) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:68);
фиг. 2H дает представление о полипептидной последовательности VL цепи мышиного анти-hPG MAb 13 (SEQ ID NO:64) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:72);
фиг. 2I дает представление о полипептидной последовательности VH цепи мышиного анти-hPG MAb 16 (SEQ ID NO:61) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:69);
фиг. 2J дает представление о полипептидной последовательности VL цепи мышиного анти-hPG MAb 16 (SEQ ID NO:65) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:73);
фиг. 2K дает представление о полипептидной последовательности VH цепи мышиных анти-hPG
MAb 19 (SEQ ID NO:62) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:70); и
фиг. 2L дает представление о полипептидной последовательности VL цепи мышиного анти-hPG MAb 19 (SEQ ID NO:66) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (SEQ ID NO:74).
Фиг. 3 дает представление о предсказанных полипептидных последовательностях гуманизированных вариабельных тяжелых и легких цепей выбранных анти-hPG моноклональных антител, описанных в данной заявке. В каждом случае три CDR выделены жирным шрифтом с подчеркиванием. В частности:
фиг. 3A дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 3 (SEQ ID NO:21);
фиг. 3B дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 3 (SEQ ID NO:22);
фиг. 3C дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 4 (SEQ ID NO:23);
фиг. 3D дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 4 (SEQ ID NO:24);
фиг. 3E дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 8(а) (SEQ ID NO:75);
фиг. 3F дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 8(а) (SEQ ID NO:76);
фиг. 3G дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 8(b) (SEQ ID NO:77);
фиг. 3H дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 8(b) (SEQ ID NO:78);
фиг. 3I дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 8(с) (SEQ ID NO:79);
фиг. 3J дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 8(с) (SEQ ID NO:76);
фиг. 3K дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 13(а) (SEQ ID NO:80);
фиг. 3L дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 13(а) (SEQ ID NO:81);
фиг. 3М дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 13(b) (SEQ ID NO:82);
фиг. 3N дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 13(b) (SEQ ID NO:83);
фиг. 3O дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 16(а) (SEQ ID NO:84);
фиг. 3P дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 16(а) (SEQ ID NO:85);
фиг. 3Q дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 16(b) (SEQ ID NO:86);
фиг. 3R дает представление о предсказанной аминокислотной последовательность VL цепи гуманизированного MAb 16(b) (SEQ ID NO:87);
фиг. 3 S дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 16(с) (SEQ ID NO:88);
фиг. 3Т дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 16(с) (SEQ ID NO:89);
фиг. 3U дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 19(а) (SEQ ID NO:90);
фиг. 3V дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 19(а) (SEQ ID NO:91);
фиг. 3W дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 19(b) (SEQ ID NO:92);
фиг. 3Х дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 19(b) (SEQ ID NO:93);
фиг. 3Y дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VH цепи гуманизированного MAb 19(с) (SEQ ID NO:94) и
фиг. 3Z дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности VL цепи гуманизированного MAb 19(с) (SEQ ID NO:95).
Фиг. 4 дает представление о гистограмме уровней мРНК GAST в опухолях, полученных от 14 индивидуумов с раком печени (HCC), по сравнению со средним уровнем, который определяется в здоровой ткани печени.
Фиг. 5А, В дает представление о гистограмме уровней мРНК GAST в трех линиях клеток рака печени - PLC/PRF/5 (фиг. 5А), Huh-6 (фиг. 5В) и Huh-7 (фиг. 5В) - по сравнению с уровнями, которые наблюдали в клеточной линии колоректального рака, SW480, которая является известной как такая, которая имеет повышенную экспрессию GAST.
Фиг. 6А, В дает представление о гистограмме уровней мРНК GAST в Huh-6 (фиг. 6А) и Huh-7 (фиг. 6В) "боковой популяции" (SP) клеток по сравнению с уровнями, которые наблюдали в неотобранном пуле Huh-6 или Huh-7 клеток, выращенных при условиях культивирования сниженного прикрепления.
Фиг. 7 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку PLC/PRL/5 клеток, выращенных при условиях культивирования сниженного прикрепления в присутствии типичного анти-PG моноклонального антитела или контрольного антитела.
Фиг. 8 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку Huh-6 "боковой популяции" (SP) клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в присутствии доксорубицина и диметисульфоксида (ДМСО), ДМСО, взятого отдельно, типичного анти-PG поликло-нального антитела или контрольного поликлонального антитела.
Фиг. 9 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку Huh-7 "боковой популяции" клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в присутствии док-сорубицина и ДМСО, ДМСО, взятого отдельно, типичного анти-PG поликлонального антитела или контрольного поликлонального антитела.
Фиг. 10 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку Huh6 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в чистой среде ("Контроль") или с добавлением анти-hPG MAb 13 или анти-hPG MAb 19.
Фиг. 11 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку Huh-6 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления после роста при постоянных условиях прикрепления в чистой среде ("Контроль"), или с добавлением анти-hPG MAb 8 или анти-hPG
MAb 13.
Фиг. 12А, В дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку Huh7 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления. Фиг. 12А показывает клетки, выращенные в чистой среде ("Контроль"), против клеток, обработанных с помощью анти-hPG MAb 13. Фиг. 12В показывает клетки, обработанные с помощью одного из: контрольное моноклональное антитело ("Контрольное MAb "), анти-hPG MAb 13 и анти-hPG MAb 16.
Фиг. 13А, В дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку Huh7 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления после роста при постоянных условиях прикрепления при добавлении либо анти-hPG MAb 8 (фиг. 13А), либо анти-hPG MAb 16 (фиг. 13В), по сравнению с контрольным моноклональным антителом ("Контрольное MAb ").
Фиг. 14 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку Huh7 "боковой популяции" клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в чистой среде ("Контроль") или с добавлением анти-hPG MAb 8 или анти-hPG MAb 13.
Фиг. 15А-С дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку PLC/PRL/5 клеток, обработанных с помощью анти-hPG MAb 19 (фиг. 15А), анти-hPG MAb 13 (фиг. 15В) или анти-hPG MAb 8 и MAb 13 (фиг. 15С), по сравнению с контрольным моноклональным антителом ("Контрольное MAb "). Фиг. 16 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку PLC/PRL/5 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления после роста при постоянных условиях прикрепления при добавлении какого-либо одного из: контрольное моно-клональное антитело ("СТ MAb "), анти-hPG MAb 8 или анти-hPG MAb 16.
Фиг. 17 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку PLC/PRL/5 "боковой популяции" клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в чистой среде ("Контроль") или с добавлением анти-hPG MAb 13 или анти-hPG MAb 16.
7. Подробное описание
7.1. Рак печени.
Рак печени включает гепатоклеточную карциному (HCC), холангиокарциному и гепатобластому. Большинство случаев рака печени представляют собой HCC и часто возникают у индивидуумов, страдающих от других лежащих в основе патологий, включая гепатит, цирроз и/или отравление афлатокси-ном В1, что вызывает воспаление печени и хроническое повреждение и регенерацию печеночных клеток. Диагноз рака печени в настоящее время основывается на комбинации ультразвуковой эхографии, тонкоигольной пункционной биопсии и определения циркулирующих уровней определенных маркерных белков, включая, например, альфа-фетопротеин. HCC может классифицироваться на ранний, средний, прогрессирующий рак и рак последней стадии на основе размера опухоли, количества и морфологии (например, инкапсулированная или инвазивная) и функции печени.
Современные способы лечения рака печени включают трансплантацию печени, хирургическое удаление, чрескожную экстирпацию, химиотерапию, включая химиоэмболизацию, лучевую терапию, лечение с использованием антител. Печеночный трансплантат, хотя и является полностью лечебным, не является доступным для большинства пациентов по причине стадии их заболевания и/или отсутствия дос
тупных органов для трансплантации. Доступность трансплантатов может также ограничиваться для пациентов, инфицированных с помощью вирусов гепатита В или С, а также пациентов, страдающих от алкоголизма. Хирургическая резекция, а также перкутанная и чрескожная экстирпация, процедуры, которые удаляют или уничтожают раковую ткань, могут иметь хорошие результаты, но не являются доступными для всех пациентов. Расположение и размер опухоли могут исключать хирургическую резекцию, как и цирроз или другое повреждение функции печени, по причине риска повреждения органа, присущего этой процедуре. Даже при резекции печение рецидивы опухоли насчитывают 70% случаев в течение 5 лет. Чрескожная экстирпация разрушает неопластические клетки и является приемлемой для индивидуумов с одной опухолью с размерами менее 3 см, которые не являются кандидатами для хирургической резекции. Для индивидуумов, у которых рак находится на более прогрессирующей стадии, или у тех, у которых повреждена функция печени, стандартные способы лечения представляют собой химиотерапию и лучевую терапию, с эмболизацией или при ее отсутствии (окклюзия артерии для того, чтобы перекрыть кровоснабжение и индуцировать гибель опухоли). Современные доступные способы лечения являются неспособными удовлетворить потребность в эффективной терапии, которая может использоваться для лечения большинства индивидуумов, подверженных раку печени.
7.2. Рецидив рака печени.
Рецидив является особенно проблематичным при раке печени. Под рецидивом рака в общем случае понимают возврат рака после лечения и после периода времени, во время которого прежний рак не определяется. Были предложены различные объяснения высокого показателя рецидивов рака печени, включая невозможность удаления всех раковых клеток во время хирургических процедур, распространение раковых клеток инструментами во время чрескожной экстирпации и устойчивость к химиотерапевтиче-ским агентам. Существует необходимость в способах терапии рака печени, которые снижают или устраняют рецидив.
7.3. Раковые стволовые клетки.
Солидные опухоли не обязательно являются гомогенными тканями. Напротив, некоторые опухоли включают множество патологических типов клеток, которые обладают отличными фенотипическими и функциональными свойствами. В соответствии с этим такие опухоли являются аналогичными патологическим органам. Клетки, содержащиеся в солидных опухолях, отличаются в отношении той степени, в которой они являются способными инициировать образование новой опухоли при трансплантации в новый сайт в том же хозяине, или новому хозяину того же вида или отличных видов. Клетки, обладающие этим свойством, являются известными как клетки, инициирующие опухоли или рак, или альтернативно, опухолевые или раковые стволовые клетки; см., например, Chiba и др., 2009, "Раковые стволовые клетки при гепатоклеточной карциноме: современный прогресс и перспектива", Cancer Letters, 286: 145-153. Такие клетки образуют опухоли при трансплантации иммунодефицитным мышам в значительно меньшем количестве, чем то количество, которое является необходимым для неотобранного пула клеток рака печени при формировании опухолей у таких мышей (1000 клеток рака печени "боковой популяции" против 1 млн неотобранных клеток рака печени); см. Chiba и др., выше. В общем случае раковые стволовые клетки определяются двумя свойствами: способностью к самовосстановлению и способностью давать начало дочерним клеткам, которые дифференцируются в нестволовые клетки. Самовосстановление представляет собой способность к клеточному делению, посредством чего одна или обе дочерние клетки остаются недифференцированными, сохраняя способность давать начало еще одной раковой стволовой клетке с подобной способностью пролиферировать в качестве родительской клетки. Это свойство позволяет раковым стволовым клеткам давать начало, в конечном счете, большому количеству клеток, которые составляют растущую опухоль. Раковые стволовые клетки также обладают способностью обеспечивать дочерние клетки, которые дифференцируют и дают начало широкому спектру более дифференцированных нестволовых клеток, или клеткам массы, опухолевые клетки обнаруживаются во многих солидных опухолях. Таким образом, при трансплантации в новое животное раковые стволовые клетки могут воссоздавать тип опухоли, от которой они происходят, даже после многократных серийных трансплантаций. Кроме того, предполагается, что раковые стволовые клетки несут генетические мутации и/или эпигенетические изменения, которые могут приводить к измененным моделям пролиферации и/или низким показателям апоптоза.
Раковые стволовые клетки могут быть идентифицированы в соответствии с рядом фенотипических характеристик, которые отличают их от массы опухолевых клеток. Во-первых, как было указано выше, стволовые клетки рака печени имеют способность инициировать образование новой опухоли при трансплантации в нового хозяина. В противовес этому, масса опухолевых клеток является либо неспособной к инициации новой опухоли, либо требует значительно большего количества клеток, чем в случае раковых стволовых клеток, для достижения инициации новой опухоли; см. Chiba и др., 2009, "Раковые стволовые клетки при гепатоклеточной карциноме: современный прогресс и перспектива", Cancer Letters, 286: 145153.
Способы, полезные для оценки, содержит ли опухоль или клеточная линия раковые стволовые клетки, являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающего примера, опухоль или ее часть, которые предполагаются как такие, которые содер
жат раковые стволовые клетки, подвергают изоляции, такой как хирургическое удаление. После этого опухолевую ткань измельчают и обрабатывают ферментами или подвергают другой обработке, эффективной для дезинтеграции опухоли, и высвобождают составляющие ее клетки. Альтернативно, когда линия клеток подвергается анализу, может быть необходимым только диссоциировать клетки с помощью ферментативной или химической обработки. Или же может быть отобрана субпопуляция клеток, отобранных на основе одного или более фенотипов, описанных в данной заявке, таких как присутствие или отсутствие маркерных белков или способность исключать некоторые красители или другие вещества. Клеточная популяция, не имеющая маркерного(ых) профиля(ей), исключения красителя или другого свойства, ассоциированного с раковыми стволовыми клетками, может быть получена в качестве контроля. После изоляции соответствующей клеточной популяции предварительно определенное количество таких клеток потом имплантируют в одну или более целевых тканей или органов реципиентного животного. В некоторых воплощениях реципиентное животное представляет собой иммунодефицитную мышь, включая, но без ограничения таковыми, "голых" мышей, мышей с тяжелым сочетанным иммунодефицитом (SCID) и диабетических мышей, которые не страдают ожирением SCID (NOD-SCID). Могут также использоваться другие виды в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники.
Клетки могут быть имплантированы подкожно или в печень. Клетки также могут имплантироваться в другие органы и ткани. В некоторых воплощениях целевая ткань или орган выбирается для воспроизведения ткани или органа происхождения опухоли при анализе. Однако в других воплощениях выбирают отличные ткани или органы, в которые пересаживают имплантированные клетки.
После имплантации, которую осуществляют при использовании методик, известных специалисту, клетки оставляют без вмешательства для определения, будет ли новая опухоль расти в сайте имплантации. Для клеток, имплантированных подкожно, опухолевый рост может определяться с помощью визуальной оценки и пальпации сайта трансплантации. Если опухоль является способной к определению, то ее размер может измеряться в течение времени при использовании штангенциркуля. Для клеток, имплантированных во внутренний орган, животное может умерщвляться в определенный момент времени после имплантации для определения, присутствует ли одна или более опухолей, и если это так, то каков размер такой(таких) опухоли(ей). Альтернативно, в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники могут использоваться неинвазивные методики для оценки опухолевого роста.
Во-вторых, раковые стволовые клетки могут также быть идентифицированы в соответствии с их моделями экспрессии или не-экспрессии определенных маркеров, в то время как клетки массы опухоли, полученные из той же опухоли, могут иметь отличные модели экспрессии маркера. В некоторых случаях отсутствие экспрессии маркера является показательным для фенотипа раковой стволовой клетки. Такие маркеры включают белки, которые экспрессируются в клетке или на поверхности клетки и могут определяться при использовании разнообразных методик, включая, но без ограничения таковыми, иммуноги-стохимию, иммунофлуоресценцию и FACS анализ. Стволовые клетки рака печени были идентифицированы с помощью маркеров поверхности клетки. Клетки рака печени, которые несут один или более поверхностных маркера, включая CD133, CD90 и CD44, как оказалось, обладают повышенными свойствами инициации опухоли, и были охарактеризованы как стволовые клетки рака печени.
В-третьих, стволовые клетки рака печени были идентифицированы по их способности выводить красители и лекарственные вещества с помощью белков-транспортеров. Инициирующие опухоль клетки рака печени были идентифицированы на основе их способности исключать краситель Hoechst 33342 при использовании ABC транспортера. Такие клетки могут быть идентифицированы путем воздействия на них флуоресцентным красителем и при использовании FACS анализа для отделения клеток, которые поглощают такие красители, от тех, которые исключают их. Эти исключающие краситель раковые клетки называются боковой популяцией (SP) клеток. SP клетки могут инициировать образование опухолей из такого количества клеток, как 1000 клеток (Chiba и др., 2006 "Боковая популяция, очищенная из клеток гепатоклеточной карциномы, которые имеют свойства, подобные таковым раковых стволовых клеток" Hepatology 44: 240-251). Другие методики для определения стволовых клеток рака печени также являются возможными и находятся в пределах знаний среднего специалиста в данной области техники.
В дополнение к способности инициировать опухоли in vivo, где клетки массы опухоли являются либо неспособными инициировать опухоль, либо имеют значительно сниженную способность осуществить это, раковые стволовые клетки также демонстрируют повышенную способность расти в виде сфероидов в среде, свободной от сыворотки, и в условиях культуры низкого прикрепления, по сравнению с клетками опухолевой массы, и могут в зависимости от типа рака образовывать так называемые сфероиды при условиях культуры низкого прикрепления. Сфероиды представляют собой компактные шарики клеток, которые формируются, поскольку некоторые клетки в культуре растут после посева в виде дезагрегированных суспензий. Образование таких сфероидов усиливается тогда, когда клетки выращивают в среде, свободной от сыворотки, обычно в присутствии специфических ростовых факторов (включая, но без ограничения, эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF)), и чашки для культуры тканей имеют поверхности, к которым клетки млекопитающих слабо прилипают. Подобно стволовым клеткам из нормальных тканей, было обнаружено, что раковые стволовые клетки
преимущественно растут в виде сфероидов при приемлемых условиях культивирования; см., например, Rappa, G., и др., Exp. Cell Res., 314: 2110 (2008); Singh, S.K., и др., Cancer Res., 63: 5821 (2003); Fang, D., и др., Cancer Res., 65: 9328 (2005). Анализы роста сфероидов при условиях культуры низкого прикрепления или в условиях роста сфероидов описываются в разделе "Примеры", представленном ниже, и также находятся в пределах знаний квалифицированного специалиста в данной области техники.
7.4. Роль раковых стволовых клеток в рецидивах рака печени.
Опухолевые клетки со свойствами раковых стволовых клеток были идентифицированы как такие, которые демонстрируют повышенную устойчивость к облучению и/или химиотерапевтическим агентам; Eyler, C.E. и J.N. Rich, J. Clin. Oncol, 26: 2839-2845 (2008). Были предложены различные молекулярные механизмы для объяснения устойчивости к облучению или химиотерапевтическим агентам. Например, сообщалось, что определенные раковые стволовые клетки могут быть способными к более легкому восстановлению своей ДНК после генотоксических инсультов, в то время как другие раковые стволовые клетки экспрессируют высокие уровни анти-апоптических белков или молекулярных насосов, эффективных для устранения химиотерапевтических агентов, поступивших в такие клетки. То, что раковые стволовые клетки пролиферируют более медленно, чем клетки-предшественники, может также объяснить сравнительную способность стволовых клеток выживать при воздействии облучения и токсических хи-миотерапевтических агентов, которые могли бы уничтожить массу опухолевых клеток; Eyler, C.E., и др., 2008, J. Clin. Oncol, 26:2839-2845. Повышенная устойчивость раковых стволовых клеток к облучению и/или химиотерапевтическим агентам не только снижает эффективность таких способов терапии, но также позволяет таким клеткам персистировать даже после того, как опухоли не являются способными к определению и терапия была успешной. У таких пациентов лечение изначально является эффективным, вызывая сокращение или исчезновение опухолей на диагностических снимках, однако опухоли появляются повторно через некоторое время после окончания лечения. Это, в свою очередь, может объяснить феномен рецидива у индивидуумов, которые ранее подвергались лечению рака печени; см. Eyler, выше. Ингибирование роста или уничтожение стволовых клеток рака печени у субъекта, который ранее подвергался лечению от рака печени, где в настоящее время не существует признаков рака печени, может, таким образом, предотвратить рецидив.
7.5. Анти-PG антитела и их влияние на стволовые клетки рака печени.
Как представлено в примерах, приведенных ниже, опухоли рака печени и HCC линии клеток проявляют повышенную экспрессию гена гастрина (GAST), который кодирует прогастрин. Эта экспрессия является даже еще более высокой в "боковой популяции" клеток - которая несет характеристики стволовых клеток рака печени - в двух различных линиях рака печени. Не имея намерения быть связанным с определенной теорией операции, предполагается, что один путь лечения рака печени, начального или рецидивирующего, заключается во введении агента, который ингибирует рост стволовых клеток рака печени, и предпочтительно ингибирует способность инициирующих образование опухоли клеток образовывать опухоли. Заявители неожиданно обнаружили, что антипрогастриновые антитела являются такими агентами. Как раскрывается в данной заявке, было неожиданно обнаружено, что рост стволовых клеток рака печени может ингибироваться путем лечения с использованием антител, которые специфически узнают человеческий прогастрин ("hPG"). На основе этих неожиданных результатов, предполагается, что введение терапевтически эффективного количества анти-hPG антител пациенту, который имеет рак, содержащий стволовые клетки рака печени, будет предоставлять терапевтическое преимущество путем, например, но не в качестве ограничения, снижения способности таких клеток осуществлять свой вклад в рак печени или его рецидив. Предполагается, что анти-PG антитела в соответствии с настоящим описанием являются эффективными для ингибирования роста стволовых клеток рака печени путем связывания с прогастрином, предотвращая, таким образом, связывание с его путативным рецептором или рецепторами, даже если они не известны, на раковых стволовых клетках. Прогастрин, который продуцируется либо самими раковыми стволовыми клетками, либо здоровыми тканями, является, таким образом, устраненным от опосредования их биологических эффектов, связанных с усилением роста таких клеток. Как следствие, предполагается, что нейтрализация PG анти-PG антителами в соответствии с настоящим описанием блокирует взаимодействие PG с его рецептором или рецепторами на таких клетках и может вызвать гибель таких клеток, возможно, в результате апоптоза, и/или остановить или замедлить деление клеток. Другие механизмы, с помощью которых анти-PG антитела препятствуют выживанию и/или росту раковых стволовых клеток, являются также возможными и не предназначены для ограничения объема изобретений, раскрытых в данной заявке. Способность анти-PG антитела нейтрализовать активность PG может быть определена при использовании анализов, которые являются известными специалисту в данной области техники, включая анализы ингибирования роста клеток in vitro, такие как те, что описываются в разделе "Примеры", приведенном ниже.
7.6. Способы лечения рака печени.
Настоящая заявка обеспечивает способы лечения рака печени у субъекта путем введения эффективного количества антипрогастринового ("анти-PG") антитела, которое обладает терапевтическим преимуществом. Способы лечения рака печени в соответствии с настоящей заявкой осуществляются путем введения одного или более анти-PG антитела, способного нейтрализовать PG, описанного подробно в разде
ле 7.11, индивидуумам с раком печени. Любое антитело, которое нейтрализует PG, может использоваться в способах в соответствии с настоящей заявкой, включая, но без ограничения таковыми, поликлональ-ные и моноклональные (например, химерные, гуманизированные, полностью человеческие, полноразмерные, Fab, одноцепочечные) анти-PG антитела. Приемлемые анти-PG антитела являются способными ингибировать рост клеток рака печени in vitro. В некоторых воплощениях анти-PG антитела являются способными к ингибированию роста сфероидов при условиях культивирования с помощью клеток рака печени со свойства инициирования опухолей, включая стволовые клетки рака печени, клетки рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток, выбранных из группы, которая состоит из CD133, CD44 и CD90, и клеток рака печени, которые являются способными экспортировать краситель
Hoechst 33342.
Субъекты, которые нуждаются в лечении рака печени, представляют собой индивидуумов, диагностированных с раком печени. Рак печени может быть впервые возникшим или представлять собой рецидив. Приемлемые субъекты включают индивидуумов с повышенной концентрацией PG в крови, индивидуумов, рак печени которых не способен к лечению другими способами, например у индивидуумов с неоперабельными опухолями или у индивидуумов, у которых другие типы терапии были неуспешными, и у индивидуумов, получающих другое лечение от рака печени, включая хирургическую резекцию, химиотерапию, химиоэмболизацию, лучевую терапию или терапию на основе антител при использовании антитела, отличного от анти-PG антитела в соответствии с настоящей заявкой. Приемлемые субъекты также включают индивидуумов, которые прежде подвергались лечению от рака печени и которые после периода ремиссии имеют рецидивирующий рак печени. Рак печени может быть на любой стадии развития. Субъект может представлять собой человека или животное, отличное от человека, включая одомашненное и неодомашненное животное.
Анти-PG лечение может назначаться в виде монотерапии или в комбинации с или дополнительно к одному или более другим способам лечения рака печени. Другие способы лечения включают, без ограничения, хирургическую резекцию и лечение с помощью второго терапевтического агента, такого, как химиотерапевтический агент, агент для облучения или антитело, как описывается в данной заявке. Комбинационное лечение, как обеспечивается в данной заявке, вовлекает введение по крайней мере двух способов лечения пациенту, один из которых представляет собой анти-PG лечение с помощью по крайней мере одного анти-PG антитела, и второй из которых представляет собой лечения при использовании терапевтического агента или процедуры.
Анти-PG лечение может сочетаться с хирургическими процедурами, такими как хирургическое удаление или чрескожная экстирпация. Анти-PG антитела могут вводиться субъектам с первичным или рецидивирующим раком печени в комбинации с хирургическим удалением или чрескожной экстирпацией поврежденной(ых) части(ей) печени. Анти-PG лечение может инициироваться перед, одновременно с, или после хирургического удаления.
Анти-PG лечение может также сочетаться с лучевой терапией. Лучевая терапия представляет собой применение излучения высоких энергий от рентгеновских лучей, гамма лучей, нейтронов, протонов и других источников для уничтожения раковых клеток и уменьшения размера опухолей. Излучение может исходить от устройства за пределами организма (дистанционная лучевая терапия), или оно может исходить от радиоактивного материала, помещенного в организм рядом с раковыми клетками (внутренняя лучевая терапия, или брахитерапия). Системная лучевая терапия использует радиоактивное вещество, такое, как радиоактивно меченное моноклональное антитело, которое мигрирует через кровь к тканям в организме. Лучевая терапия может также именоваться облучением и радиотерапией. Другие способы радиационной терапии также включают пространственную конформную лучевую терапию (3D-CRT) и лучевую терапию с модулируемой интенсивностью (IMRT). Другие способы лучевой терапии также являются возможными. Лечение на основе анти-PG антитела может также сочетаться с химиотерапетвиче-ским агентом. Химиотерапия представляет собой применение лекарственных средств на основе малых молекул, которые уничтожают (цитотоксические или цитоцидные) или предотвращают рост (цитостати-ческие) раковые клетки. Для рака печени химиотерапевтические агенты часто сочетают с эмболизацион-ным лечением, как, например, сочетание желатина для эмболизации и доксорубицина, митомицина или цисплатина в качестве химиотерапевтических агентов. Химиотерапевтические агенты включают, но без ограничения таковыми, токсины, которые также называются как цитотоксины или цитотоксические агенты, которые включают любой агент, который является разрушительным для жизнеспособности клеток, и липосомы или другие носители, содержащие химиотерапевтические соединения. Примеры приемлемых химиотерапевтических агентов включают, но без ограничения таковыми, токсины, которые также называются цитотоксинами или цитотоксическими агентами, которые включают любой агент, который является разрушительным для жизнеспособности клеток, липосомы или другие носители, содержащие химиотерапевтические соединения. Примеры приемлемых химиотерапевтических агентов включают, но без ограничения таковыми, 1-дегидротестостерон, 5-фторурацил декарбазин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин D, адриамицин, альдеслейкин, алкилирующие агенты, аллопуринол натрия, альтретамин, амифостин, анастразол, антрамицин (АМС), анти-митотические агенты, цис-дихлордиамин платина (II) (DDP) цисплатин), диаминодихлор платина, антрациклины, антибиотики, антиметаболиты,
аспарагиназу, BCG живую (интравезикальную), бетаметазон фосфат натрия и бетаметазон ацетат, бика-лутамид, блеомицин сульфат, бусульфан, лейковорин кальция, калихеамицин, капецитабин, карбопла-тин, ломустин (CCNU), кармустин (BSNU), хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, колхицин, конъюгиро-ванные эстрогены, циклофосфамид, циклотосфамид, цитарабин, цитарабин, цитохалазин В, цитоксан, дакарбазин, дактиномицин, дактиноцин (бывший актиномицин), даунорубицин HCL, даунорубицин цитрат, денилейкин дифтитокс, дексразоксан, дибромоманнитол, дигидрокси антрацин дион, доцетаксел, доластерон мезилат, доксорубицин HCL, дронабинол, L-аспарагиназу Е. coli, эметин, эпоэтин-а, L-аспарагиназу Erwinia, эстерифицированные эстрогены, эстрадиол, эстрамустин фосфат натрия, бромид этидия, этинил эстрадиол, этидронат, этопозид цитророрум фактор, этопозид фосфат, филграстим, флок-суридин, флуконазол, флударабин фосфат, фторурацил, флутамид, фолиновую кислоту, гемцитабин HCL, глюкокортикоиды, гозерелин ацетат, грамицидин D, гранисетрон HCL, гидроксимочевину, идару-бицин HCL, ифосфамид, интерферон a-2b, иринотекан HCL, летрозол, лейковорин кальция, лейпролид ацетат, левамизол HCL, лидокаин, ломустин, майтансиноид, мехлорэтамин HCL, медроксипрогестерон ацетат, мегестрол ацетат, мелфалан HCL, меркаптипурин, месна, метотрексат, метилтестостерон, митра-мицин, митомицин С, митотан, митоксантрон, нилутамид, октреотид ацетат, ондансетрон HCL, оксалип-латин, паклитаксел, памидронат динатрия, пентостатин, пилокарпин HCL, плимицин, полифепросан 20 с имплантатом кармустина, порфимер натрия, прокаин, прокарбазин HCL, пропранолол, ритуксимаб, сар-грамостин, стрептозотоцин, тамоксифен, таксол, тегафур, тенипозид, тенопозид, тестолактон, тетракаин, тиотепа хлорамбуцил, тиогуанин, тиотепа, топотекан HCL, торемифен цитрат, трастузумаб, третиноин, валрубицин, винбластин сульфат, винкристин сульфат и винорелбин тартрат.
Анти-PG антитела могут также вводиться с комбинацией химиотерапевтических агентов. Типичные комбинации химиотерапевтических агентов включают 5-фторурацил (5FU) в сочетании с лейковорином (фолиновая кислота или LV); капецитабин в сочетании с урацилом (UFT) и лейковорином; тегафур в сочетании с урацилом (UFT) и лейковорином; оксалиплатин в сочетании с 5FU или в сочетании с капеци-табином; иринотекан в сочетании с капецитабином, митомицин С в сочетании с 5FU, иринотеканом или капецитабином. Другие комбинации химиотерапевтических агентов и других терапевтических агентов также являются возможными. Стандартные режимы дозирования для химиотерапевтических агентов, используемые для пациентов, которые имеют рак печени, могут использоваться в способах настоящей заявки. Как является известным в соответствующей области техники, химиотерапевтические режимы для рака печени, использующие комбинации различных химиотерапевтических агентов, были стандартизованы в клинических исследованиях; см. Llovet и др., выше, для обзора клинических исследований при использовании химиотерапевтических агентов.
Анти-PG антитела могут также использоваться в комбинации с другими антителами, включая, но без ограничения таковыми, моноклональные антитела, которые непосредственно или опосредованно уничтожают, замедляют или останавливают рост раковых клеток. Такие антитела могут функционировать с помощью множества различных механизмов. Например, некоторые антитела могут маркировать раковые клетки для атаки иммунной системой пациента посредством антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC) или других механизмов. Предполагается, что ритуксимаб (Ри-туксан(r)), который связывает CD20 антиген, находится на В клетках, и эдреколомаб, который связывает 17-1А антиген, функционирует этим путем. Другие антитела связывают и изменяют или ингибируют функцию антигенов, которые являются необходимыми раковым клеткам для выживания и/или роста. Ряд антител, как предполагается, функционирует таким образом, включая, например, цетуксимаб (Эрбитукс(r)) и панитумумаб (Вектибикс(r)), каждый из которых связывает EGF рецептор (EGFR); и бева-цизумаб (Avastin(r)), который связывается с ростовым фактором VEGF. Другие механизмы также являются возможными, а определенные антитела могут быть способными работать с помощью одного или более механизмов действия. Другие антитела могут быть конъюгированными с радиоактивными или хе-мотоксическими остатками и нацеливать их на раковые клетки, которые предпочтительно экспрессируют антигены, которые специфически узнаются антителами.
Анти-PG антитело и второй агент могут вводиться одновременно, последовательно или раздельно. Как используется в данной заявке, говорят, что анти-PG антитело и второй агент вводятся последовательно, если они вводятся пациенту в тот же день, например, во время того же визита пациента. Последовательное введение может осуществляться спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ч. В противовес этому, говорят, что анти-PG антитело и второй агент вводятся раздельно, если они вводятся пациенту в различные дни, например анти-PG антитело и второй терапевтический агент могут вводиться с интервалами в 1, 2 или 3 дня, 1, 2 недели или с месячными интервалами. В способах настоящей заявки введение анти-PG антитела в соответствии с настоящей заявкой может предшествовать введению второго агента или следовать за ним. В качестве неограничивающего примера, анти-PG антитело и второй агент могут вводиться одновременно в течение определенного периода времени, после этого на протяжении второго периода времени введение анти-PG антитела и второго агента чередуют.
7.7. Способы предотвращения рецидивов рака печени.
В другом аспекте настоящая заявка обеспечивает способ предотвращения рецидива рак печени,
включающий введение эффективного количества анти-PG антитела субъекту, который нуждается в предотвращении. Способы предотвращения рецидива рака печени в соответствии с настоящей заявка осуществляются путем введения одного или более анти-PG антитела, способного нейтрализовать PG, описанного подробно в разделе 7.11, индивидуумам с риском рецидива рака печени.
Субъекты, которые нуждаются в предотвращении рецидива рака печени, представляют собой индивидуумов, которые ранее подвергались лечению от рака печени, которые имеют риск развития рака печени, но при этом не были вновь диагностированы с раком печени. Приемлемые субъекты включают индивидуумов, которые ранее подвергались лечению от рака печени с помощью каких либо способов, включая хирургическую резекцию, химиотерапию или любой иной способ терапии.
Эффективное предотвращение рецидива рака печени включает, но без ограничения, полное и длительное отсутствие рецидива рака печени. В некоторых воплощениях эффективное предотвращение измеряется с помощью отсутствия опухолей рака печени или стволовых клеток рака печени в образцах, полученных от субъекта, который имеет риск рецидива рака печени. В некоторых воплощениях эффективное предотвращение определяется с помощью отсутствия повышения концентрации PG в крови у субъекта, имеющего риск возникновения рецидива рака печени.
Анти-PG лечение может вводиться в виде монотерапии или в комбинации с или дополнительно к одному или более другим способам лечения рака печени. Другие способы лечения включают, без ограничения, хирургическую резекцию и лечение с помощью второго терапевтического агента, такого, как химиотерапевтический агент, агент для облучения или антитело, как описывается в данной заявке. Комбинационное лечение, как обеспечивается в данной заявке, вовлекает введение по крайней мере двух способов лечения пациенту, один из которых представляет собой анти-PG лечение с помощью по крайней мере одного анти-PG антитела, а второй представляет собой лечения при использовании терапевтического агента или процедуры. Анти-PG антитело и второй агент могут вводиться одновременно, последовательно или раздельно. Как используется в данной заявке, говорят, что анти-PG антитело и второй агент вводятся последовательно, если они вводятся пациенту в тот же день, например, во время того же визита пациента. Последовательное введение может осуществляется спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ч. В противовес этому, говорят, что анти-PG антитело и второй агент вводятся раздельно, если они вводятся пациенту в различные дни, например анти-PG антитело и второй терапевтический агент могут вводиться с интервалами в 1, 2 или 3 дня, 1, 2 недели или с месячными интервалами. В способах настоящей заявки введение анти-PG антитела в соответствии с настоящей заявкой может предшествовать введению второго агента или следовать за ним. В качестве неограничивающего примера, анти-PG антитело и второй агент могут вводиться одновременно в течение определенного периода времени, после этого на протяжении второго периода времени введение анти-PG антитела и второго агента чередуют.
7.8. Фармацевтические композиции.
Анти-PG антитела, полезные в способах в соответствии с настоящей заявкой, могут быть включены в композицию. Необязательно, композиции могут включать один или более дополнительный(ых) тера-певтический(их) агент(ов), таких как второй агент, описанный выше. Композиции обычно будут поставляться как часть стерильной фармацевтической композиции, которая в норме будет включать фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция может находиться в любой приемлемой форме (в зависимости от желаемого способа введения ее пациенту). Анти-PG антитела могут вводиться индивидууму разнообразными путями, такими как пероральный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраокулярный, местный, интратекальный и интрацеребровентрикулярный. Наиболее приемлемый путь введения в любом конкретном случае будет зависеть от частного антитела, субъекта, а также природы и тяжести заболевания и физического состояния субъекта. Антитела могут быть включены в водный раствор, который вводятся путем подкожной инъекции. Фармацевтически приемлемые носители для применения в заявке могут приобретать разнообразные формы в зависимости, например, от состояния, которое подвергается лечению, и пути введения. Фармацевтические композиции могут традиционно быть представлены в виде единичных дозированных форм, содержащих предварительно определенное количество анти-PG антитела на дозу. Такая единица может содержать, например, но без ограничения, от 5 мг до 5 г, например от 10 мг до 1 г, или от 20 до 50 мг анти-PG антитела на единичную дозу. Фармацевтические композиции могут включать анти-PG антитела, способные к связыванию более одного PG эпитопа. Альтернативно, фармацевтические композиции могут включать комбинацию анти-PG антител, каждое из которых является способным к связыванию отличного PG эпитопа. Фармацевтические композиции в соответствии с данной заявкой могут быть получены для хранения в виде лиофили-зированных композиций или в виде водных растворов путем смешивания антитела, обладающего достаточной степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, которые типично используются в области техники (они все обозначаются в данной заявке как "носители"), то есть буферными агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотоническими агентами, неионными детергентами, антиоксидантами и другими вспомогательными добавками; см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд. (Osol, ред. 1980). Такие добавки должны быть нетоксическими для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.
Буферные агенты помогают поддерживать pH в интервале, который приближен к физиологическим
условиям. Они могут присутствовать при концентрации, которая колеблется в интервале от приблизительно 2 до приблизительно 50 мМ. Приемлемые буферные агенты для применения в настоящей заявке включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь цитрат мононатрия - цитрат динатрия, смесь лимонная кислота -цитрат тринатрия, смесь лимонная кислота - цитрат мононатрия и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарная кислота -сукцинат мононатрия, смесь янтарная кислота - гидроокись натрия, смесь янтарная кислота - сукцинат динатрия и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винная кислота - тартрат натрия, смесь винная кислота - тартрат калия, смесь винная кислота - гидроокись натрия и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровая кислота - фумарат мононатрия, смесь фумаровая кислота - фумарат динатрия, смесь фумарат мононатрия - фумарат динатрия и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконо-вая кислота - глюконат натрия, смесь глюконовая кислота - гидроокись натрия, смесь глюконовая кислота - глюконат калия и т.д.), оксалатный буфер (например, смесь щавелевая кислота - оксалат натрия, смесь щавелевая кислота - гидроокись натрия, смесь щавелевая кислота - оксалат калия и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочная кислота - лактат натрия, смесь молочная кислота - гидроокись натрия, смесь молочная кислота - лактат калия и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусная кислота - ацетат натрия, смесь уксусная кислота - гидроокись натрия и т.д.). Дополнительно могут использоваться фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Трис. Консерванты могут прибавляться для задержки микробного роста, при этом они могут прибавляться в количествах, которые колеблются в интервале от 0,2 до 1% (вес./об.). Приемлемые консерванты для применения в настоящей заявке включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метил парабен, пропил парабен, окта-децилдиметилбензил аммоний хлорид, галиды бензалкония (например, хлорид, бромид и иодид), хлорид гексаметония и алкил парабены, такие как метил или пропил парабен, катехол, резорцинол, циклогекса-нол и 3-пентанол. Изотонические агенты, которые иногда являются известными как "стабилизаторы", могут прибавляться для обеспечения изотоничности жидких композиций в соответствии с настоящей заявкой и включают многоатомные сахарные спирты, например трехатомные или более высокие сахарные спирты, такие как глицерин, эритритол, арабитол, ксилитол, сорбитол и маннитол. Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут варьировать по своей функции от объемо-образующего агента до добавки, которая солюбилизирует терапевтический агент или помогает предотвратить денатурацию или приклеивание к стенке контейнера. Типичные стабилизаторы могут представлять собой многоатомные сахарные спирты (перечислены выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин, и т.д., органические сахара или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахи-лоза, маннитол, сорбитол, ксилитол, рибитол, миоинозитол, галактитол, глицерол и тому подобное, включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; содержащие серу восстанавливающие агенты, такие как мочевина, глутатион, липоевая кислота, тиогликолат натрия, тиоглицерол, а-монотиоглицерол и тиосульфат натрия; полипептиды с низким молекулярным весом (например, пептиды из 10 остатков или меньше); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трисахариды, такие как раффиноза; и полисахариды, такие как дек-стран. Стабилизаторы могут присутствовать в интервале от 0,1 до 10000 вес.ч. на весовую часть активного белка.
Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как "смачивающие агенты") могут прибавляться для того, чтобы помочь солюбилизировать терапевтический агент, а также для того, чтобы защитить терапевтический белок от индуцированной перемешиванием агрегации, что также помогает композиции подвергаться сдвигу поверхности без денатурации белка. Приемлемые неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), полиолы Плюроника, моноэтеры полиоксиэтилен сорбитана (ТВИН(r)-20, ТВИН(r)-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в интервале от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,0 мг/мл, например от приблизительно 0,07 до приблизительно 0,2 мг/мл. Дополнительные разнообразные наполнители могут включать объемообразующие агенты (например, крахмал), хелатирующие агенты (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метионин, витамин Е) и сорастворители.
Анти-PG антитела могут вводиться отдельно или в виде смесей одного или более отдельных анти-PG антител, в смеси или комбинации с другими агентами, полезными для лечения рака печени. Примеры приемлемой комбинации и дополнительных способов терапии обеспечиваются выше.
7.9. Эффективные дозировки.
Анти-PG антитела в соответствии с настоящей заявкой или их композиции будут в общем случае использоваться в количестве, эффективном для достижения предполагаемого результата, например в количестве, эффективном для лечения рака печени у субъекта с раком печени, или в количестве, эффективном для предотвращения рецидива у субъекта, имеющего риск рецидива рака печени. Эффективное
количество представляет собой количество, которое обеспечивает терапевтическое преимущество. В контексте способов лечения рака печени терапевтическое преимущество означает любую тенденцию к частичному или полному лечению рака печени. Терапевтическое преимущество может быть подтверждено с помощью любого из следующих показателей, взятых отдельно или в комбинации: уменьшение размера, количества или морфологии (например, инкапсулированная против инвазивной) печеночных опухолей; устранение опухолей печени; уменьшение тяжести рака печени; индукция ремиссии рака печени; остановка или задержка обострения симптомов или признаков, ассоциированных с раком печени; повышение комфортности для пациента, уменьшение боли пациента; уменьшение и устранение количества клеток боковой популяции, клеток рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток CD133, CD44 или CD90, или стволовых клеток рака печени; снижение концентрации PG в крови у субъекта с раком печени. Размер опухоли, количество и метаболизм опухолей могут измеряться при использовании различных методик сканирования, таких как, но без ограничения таковыми, КТ, ЯМР, функциональную ЯМР, ОФЭКТ и ПЭТ, а также других способов, известных среднему специалисту в данной области техники. Полное излечение, хотя и является желательным, не требуется для существования терапевтического преимущества.
В контексте предотвращения рецидива рака печени терапевтическое преимущество означает любую тенденцию к частичному или полному повторному возникновению или повторному росту рака у субъекта в течение некоторого времени после того, как рак был определен. Терапевтическое преимущество может быть подтверждено с помощью любого из следующих методов, взятых отдельно или в комбинации: поддержание ремиссии рака печени; повышение прогнозируемой длительности жизни субъекта; отсрочка роста опухолей печени; ингибирование роста стволовых клеток рака печени, клеток боковой популяции или клеток рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток CD133, CD44 или CD90; снижение количества или устранение боковой популяции клеток, клеток рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток CD133, CD44 или CD90, или стволовых клеток рака печени.
В некоторых случаях терапевтическое преимущество может коррелировать с одной или более идентифицирующих конечных точек в соответствии со знаниями среднего специалиста в данной области техники. В качестве примера, но не в качестве ограничения, концентрации PG в плазме и/или сыворотке могут измеряться у субъекта в течение периода времени, при этом снижение уровней PG или уровня, ниже порогового значения, например ниже приблизительно 50, 40, 30, 20, 10 или 5 пМ, что является показательным для терапевтического преимущества. В других воплощениях терапевтическое преимущество композиции анти-PG антитела может определяться с помощью его способности уничтожать раковые стволовые клетки, ингибировать рост или пролиферацию стволовых раковых клеток, или повышать апоптоз стволовых раковых клеток. Как обсуждается в где-либо в данной заявке, стволовые клетки рака печени могут быть идентифицированы как такие, которые имеют одну или более фенотипические характеристики, которые ассоциируются с раковыми стволовыми клетками, включая, но без ограничения таковыми, экспрессию некоторых клеточных маркеров, способность к росту в виде сфероидов в условиях культивирования при низком прикреплении, и способность инициировать рост новой опухоли после трансплантации.
Связывание всего свободного PG не требуется для достижения терапевтической эффективности. Свободный PG означает PG, который является доступным для связывания с помощью анти-PG антитела. Более того, снижение концентрации свободного PG в опухоли системно, в частности, в жидкостях организма или где-либо в другом месте, до более ограниченной степени, может также быть эффективным. Типичные ткани и жидкости организма, в которых концентрация свободного PG может снижаться путем введения композиции анти-PG антитела, описанного в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, образцы биопсии, удаленные у пациента, асцитную жидкость, жидкость из плевральных выпотов, цереброспинальную жидкость, лимфу, кровь, плазму, сыворотку и другие. Концентрация PG в одной или более этих тканях или жидкостях организма может количественно оцениваться при использовании методики ELISA или других методик, известных среднему специалисту в данной области техники.
В соответствии со знанием среднего специалиста в данной области техники доза анти-PG антитела может быть оттитрована у пациента для того, чтобы снижать концентрацию свободного PG в ткани или жидкости организма, которые представляют интерес, в определенное время после введения по крайней мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%, или приблизительно на 5-10%, приблизительно 10-15%, приблизительно 15-20%, приблизительно 20-25%, приблизительно 25-30%, приблизительно 30-35%, приблизительно 35-40%, приблизительно 40-45%, приблизительно 45-50%, приблизительно 50-55%, приблизительно 55-60%, приблизительно 60-65%, приблизительно 65-70%, приблизительно 70-75%, приблизительно 75-80%, приблизительно 80-85%, приблизительно 85-90% или приблизительно 90-95%, или процентное снижение свободного PG колеблется между любыми из указанных выше значений. Композиции, включающие анти-PG антитела, могут вводиться индивидуумам (например, субъектам, которые представляют собой людей) в эффективных дозировках. Количество вводимого ан-ти-PG антитела будет зависеть от разнообразных факторов, включая размер и вес пациентов, которые подвергаются лечению, форму, путь и сайт введения, режим лечения (например, используется ли второй
терапевтический агент), возраст и состояние конкретного субъекта, которого подвергают лечению, чувствительность индивидуума к анти-PG антителам. Приемлемая дозировка может быть легко определена квалифицированным специалистом в данной области техники. В конечном итоге, лечащий врач будет определять приемлемые дозировки, которые используются. Эта дозировка может быть повторяемой так часто, как это является приемлемым. Если развиваются побочные эффекты, то количество и/или частота введения дозировки может изменяться или снижаться в соответствии с нормальной клинической практикой. Надлежащая дозировка и режим лечения могут устанавливаться путем мониторинга развития лечения при использовании традиционных методик, известных среднему специалисту в данной области техники. Эффективные дозировки могут оцениваться изначально из анализов in vitro. Например, начальная доза для применения у животных должна обеспечивать достижение такой концентрации анти-PG антитела в циркулирующей крови или сыворотке, которая находится на уровне или выше связывающей аффинности антитела для прогастрина, как измеряется in vitro. Расчет дозировок для достижения таких концентраций в циркулирующей крови или сыворотке с учетом биодоступности конкретного антитела находится в пределах способностей средних специалистов в области техники. Для руководства можно отослать читателя к части 1: General Principles в "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", 11-е изд., Hardman, J.G., и др., ред. McGraw-Hill Professional, и ссылкам, которые там приводятся. Начальные дозировки могут также оцениваться из данных in vivo, например из животных моделей. Животные модели, полезные для исследования эффективности соединений для лечения рака печени, являются хорошо известными в области техники и включают, но без ограничения таковыми ксенотранс-плантаты клеток гепатоклеточной карцины у мышей или других животных. Средний специалист в области техники может обычным образом адаптировать эту информацию для определения дозировок, приемлемых для введения человеку.
В специфических воплощениях внутривенная доза может быть определена для индивидуального субъекта путем измерения концентрации PG в сыворотке или плазме индивидуума несколько раз на протяжении периода времени от нескольких дней до нескольких недель перед лечением и подсчета количества анти-PG антитела, которое будет насыщающим, то есть количества, которое будет достаточным для связывания всего PG. Как будет оценено квалифицированными специалистами, количество какого-либо специфического антитела, необходимое для достижения насыщения для данной концентрации PG в плазме или сыворотке крови, будет зависеть, отчасти, от константы аффинности конкретного антитела. Способы подсчета насыщающих количеств для специфических анти-PG антител, которые представляют интерес, являются хорошо известными.
Для достижения насыщения может вводиться количество, которое является большим, чем подсчитанное насыщающее количество, например по крайней мере в 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или даже 10 раз более высокое, чем подсчитанное насыщающее количество. Для способов введения, отличных от внутривенного, количество может доводиться на основе фармакокинетики и биодоступности, что является хорошо известным в данной области техники.
Эффективная доза анти-PG антитела в соответствии с заявкой может колебаться от приблизительно 0,001 до приблизительно 75 мг/кг на единичное (например, болюсное) введение, множественное введение или беспрерывное (например, инфузия) введение, или для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мкг/мл на одно введение, множественное введения или непрерывное введение, или может представлять любой эффективный интервал или значение в этих пределах в зависимости от состояния, которое подвергается лечению, способа введения и возраста, веса и состояния субъекта. В некоторых воплощениях каждая доза будет колебаться от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мг/кг; от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,75 мг/кг; от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мг/кг; от приблизительно 1 до приблизительно 2 мг/кг; от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 мг/кг; от приблизительно 2 до приблизительно 3 мг/кг; от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,5 мг/кг; от приблизительно 3 до приблизительно 4 мг/кг; от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5 мг/кг; от приблизительно 4 до приблизительно 5 мг/кг; от приблизительно 5 до приблизительно 7 мг/кг; от приблизительно 6 до приблизительно 8 мг/кг; от приблизительно 7 до приблизительно 9 мг/кг; от приблизительно 8 до приблизительно 10 мг/кг; от приблизительно 10 до приблизительно 15 мг/кг; от приблизительно 12,5 до приблизительно 17,5 мг/кг; от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг; от приблизительно 17,5 до приблизительно 22,5 мг/кг; от приблизительно 20 до приблизительно 25 мг/кг; от приблизительно 22,5 до приблизительно 27,5 мг/кг; от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг; от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг; от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг; от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг; от приблизительно 45 до приблизительно 55 мг/кг; от приблизительно 50 до приблизительно 60 мг/кг; от приблизительно 55 до приблизительно 65 мг/кг; от приблизительно 60 до приблизительно 70 мг/кг; от приблизительно 65 до приблизительно 75 мг/кг. Другие интервалы дозировок также являются возможными.
Количество, частота и длительность введений будут зависеть от разнообразных факторов, таких как возраст, вес и состояние заболевания пациента. Анти-PG лечение является показанным у субъектов с раком печени, включая HCC и гепатобластому, либо первичную, либо рецидивирующую. Лечение назначается на любой стадии рака печени и, в частности, у индивидуумов, для которых трансплантация или
хирургическое удаление не является доступным или является противопоказанным. Режим лечения для введения может продолжаться в течение 1 дня или более, 2 дней или более, 3 дней или более, 4 дней или более, 5 дней или более, 6 дней или более, 1 недели или более, от 2 недель до неопределенного времени, в течение от 2 недель до 6 месяцев, от 3 месяцев до 5 лет, от 6 месяцев до 1 года или 2 лет, от 8 месяцев до 18 месяцев, или подобных периодов времени. Необязательно режим лечения обеспечивается для повторяемого введения, например, один раз в день, два раза в день, через день, один раз в три дня, один раз в пять дней, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц. Повторяемое введение может осуществлять при той же дозе или при отличной дозе. Введение может повторяться один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или более. Терапевтически эффективное количество анти-PG антитела может вводиться в виде единичной дозы или на протяжении курса терапевтического режима, например в течение курса длительностью 1, 2, 3 недели, 1, 3, 6 месяцев, 1 год или дольше.
7.10. Способы мониторинга эффективности лечения.
Настоящая заявка также обеспечивает способы мониторинга субъекта, которого подвергают лечению с помощью анти-PG антитела, для определения, является лечение эффективным. Уровень PG может измеряться у пациента, который получает анти-PG лечение, и использоваться в качестве показателя, является ли лечение эффективным на основе того, что измеренный уровень является выше или ниже базового уровня PG; см., например, временную заявку США под номером 61/293557, которая называется "Прогастрин и патологии печени", поданную 8 января 2010 г., и патентную заявку США под номером 12/984507 под названием "Прогастрин и патологии печени", поданную 4 января 2011 г., содержание каждой из них является введенной в данную заявку в качестве ссылки. Эта информация может использоваться медицинским персоналом для решения вопроса о том, стоит ли продолжать введение анти-PG антитела или следует модифицировать лечение. Эти способы могут использоваться для мониторинга анти-PG лечения, отдельно или в комбинации с другими способами лечения, как описано выше.
Для целей мониторинга эффективности лечения уровни PG в крови, плазме или сыворотке могут измеряться в указанные моменты времени. Снижение концентрации в течение времени и/или в том случае, когда измеренный уровень ниже порогового значения в определенный момент времени, является показательным для эффективности. Пороговое значение может быть таким, как обсуждалось выше, или может представлять собой специфическое для субъекта значение, полученное от субъекта, который подвергается лечению, перед началом терапии, или в ранний момент времени во время проведения цикла терапии.
Не имея намерения быть связанным с определенной теорией операции, предполагается, что количество и/или размер опухолей у пациента снижаются в результате осуществления цикла терапии, когда общее количество PG, который вырабатывается опухолями, также снижается. В противовес этому, отсутствие существенного изменения или повышение уровней PG после завершения цикла терапии, могут свидетельствовать о том, что терапия не является эффективной. Эта информация может использоваться медицинским персоналом для решения, необходимо ли начинать новый цикл терапии.
Уровни PG могут измеряться при использовании методик, известных среднему специалисту в данной области техники, таких как, но без ограничения таковыми, RIA и ELISA. Анти-hPG антитела, полезные для измерения уровней PG человеческих субъектов, описываются в следующем разделе. Примеры анализов для измерения уровней PG описываются во временной патентной заявке США под номером No. 61/293557, см. выше, примеры 1, 2.
В специфическом воплощении уровни PG могут измеряться при использовании сэндвич ELISA с одним анти-PG антителом, нацеленным на N-терминальный конец прогастрина, и вторым анти-PG антителом, нацеленным на С-терминальный конец прогастрина. Типичные N- и С-терминальные анти-PG антитела, полезные для такого сэндвич-анализа, описываются в разделе, приведенном ниже. В таком анализе готовят поверхность, такую, как ячейки в планшете на 96 ячеек, с которой связывается известное количество первого, "иммобилизованного" N-терминального или С-терминального анти-PG антитела. Исследуемый образец потом применяют к поверхности и выдерживают в течение периода инкубации. Поверхность потом промывают для удаления несвязанного антигена и применяют раствор, содержащий второе "идентифицирующее" анти-PG антитело, где идентифицирующее антитело связывает отличный эпитоп PG (например, иммобилизованное антитело представляет собой С-терминальное анти-PG антитело, а N-терминальное анти-PG антитело используют как идентифицирующее антитело, и наоборот). Уровни PG потом измеряют либо непосредственно (если, например, идентифицирующее антитело является конъюгированным со способной к определению меткой) или опосредованно (с помощью меченного вторичного антитела, которое связывает идентифицирующее анти-PG антитело). Для этого анализа антитела могут использоваться в избытке, так, что весь PG связывается и количественно оценивается. Специфический сэндвич-анализ для измерения уровней PG в плазме и/или сыворотке крови обеспечивается в примере 1.
Могут быть проведены многочисленные измерения при различных интервалах, после чего строится график для определения, существует ли определенная тенденция. В некоторых воплощениях зависимое от времени снижение концентрации PG крови свидетельствует о том, что лечение рака печени является
эффективным. В неограничивающем примере уровни PG могут определяться при еженедельных, месячных или ежегодных интервалах тогда, когда пациент получает анти-PG антитела. Другие интервалы также являются возможными.
В воплощении, вовлекающем цикл терапии при использовании анти-PG антитела, одно или более измерений могут также осуществляться в процессе курса терапии так, что может оцениваться влияние антител на уровни PG. В других таких воплощениях, где у пациента присутствуют остаточные анти-PG антитела во время взятия образцов, данные могут демонстрировать снижение уровней PG благодаря секвестрации PG антителом, за которым следует повышение, поскольку этот эффект снижается, после этого происходит последующее снижение, если лечение было эффективным. В других воплощениях измерения после осуществления терапии могут осуществляться после того, как произведена оценка того, что анти-PG антитела были выведены у пациента, так, что связывание PG таким антителом не оказывает влияния на точность определения концентрации PG.
В некоторых воплощениях способов уровень PG в одной или более жидкостях организма, таких как цельная кровь, плазма, сыворотка пациента, получающего лечение на основе анти-PG антитела, может измеряться и потом сравниваться с базовым уровнем. Типично, уровень PG представляет собой концентрацию PG в образце, выраженную в молярных количествах (М) или в молях/литр (моль/л). Уровень PG выше базового уровня является показательным для отсутствия эффективности лечения. В противовес этому, уровень PG, который равен или ниже базового уровня является показательным для эффективности лечения.
Могут использоваться различные базовые уровни, против которых сравниваются уровни PG, которые определяются у пациента. Базовый уровень может представлять собой одно значение или интервал значений. Базовый уровень может основываться на одном или более измерений, полученных от пациента, или основываться на измерениях PG в образцах от популяции индивидуумов. В некоторых воплощениях способов базовая линия представляет собой уровень PG одного и того же пациента, взятый при одном или более интервалах, например, перед началом анти-PG лечения, во время курса лечения или после того, как лечение закончено. В некоторых воплощениях базовая линия может представлять собой средний уровень PG в популяции индивидуумов с характеристиками, подобными тем, которые существуют у индивидуума, подвергающегося мониторингу. Такие характеристики могут включать, но не обязательно ограничены таковыми, как пол, возраст, тип и стадия рака печени, историю хирургических вмешательств, анти-PG лечение или другие способы лечения. В некоторых воплощениях базовая линия представляет собой специфический уровень PG, такой как приблизительно 50, приблизительно 40, приблизительно 30, приблизительно 20, приблизительно 10, приблизительно 5, приблизительно 2, приблизительно 1 пМ или даже ниже. В некоторых воплощениях базовая линия представляет собой интервал.
В других воплощениях базовая линия может быть получена средних уровней PG в популяции пациентов с характеристиками, подобными тем, которые существуют у пациента, подвергающегося мониторингу. Такие характеристики могут включать, но не обязательно ограничены таковыми, как пол, возраст, первичный тип рака, применение определенных способов лечения, любую комбинацию перечисленных выше и другие лечения. В других воплощениях при мониторинге определенного пациента может использоваться более одной базовой линии. Например, могут использоваться как присущая пациенту базовая линия, так и базовая линия, полученная из популяции. В некоторых воплощениях, в которых средняя концентрация PG у пациента с раком, который ранее подвергался лечению, находиться в пределах нормального интервала для релевантной популяции, с которой сравнивается пациент и остается стабильной, пациент будет оцениваться как такой, который не имеет рецидива и, таким образом, не требует нового лечения. В противовес этому, если концентрация PG повышается в течение периода у пациента, который ранее подвергался лечению, и в некоторых воплощениях превышает пороговое значение, полученное из данных популяции, может считаться как такой, который, возможно, имеет рецидив, и, таким образом является кандидатом для нового лечения от рецидива рака.
Поскольку потребление пищи обычно повышает синтез и секрецию гастрина, оно может также вызвать краткосрочное повышение уровней PG в крови, что может препятствовать точному измерению уровней PG у пациентов, которые подвергаются мониторингу. Для того чтобы избежать этого эффекта, в частности, тогда, когда определяют концентрацию PG в образцах крови, образцы могут быть взяты от пациента натощак или по прошествии достаточного времени после приема для того, чтобы временные влияния на концентрацию PG исчезли.
7.11. Анти-PG антитела.
Антитела, полезные в способах, раскрытых в данной заявке, являются такими, которые специфически связывают прогастрин по сравнению с другими продуктами прогастринового гена. Ссылаясь на фиг. 1, ген гастрина транслируется с образованием полипептида из 101 аминокислоты, который называется пре-прогастрином, содержащий сигнальную последовательность (подчеркнута), которая отщепляется с образованием прогастрина, полипептида из 80 аминокислот. Прогастрин, в свою очередь, расщепляется с образованием продукта из 34 аминокислот, соответствующей последовательности остатков 38-71 прога-стрина, который потом удлиняется на своем карбокситерминальном конце с помощью остатка глицина, образуя удлиненный глицином G34 ("G34-Gly") продукт. Побочный продукт этого расщепления пред
ставляет собой пептид, состоящий из 6 аминокислот, называемый С-терминальным фланкирующим пептидом, или CTFP, который соответствует последовательности остатков 75-80 прогастрина. G34-Gly потом дополнительно расщепляется с образованием полипептида из 17 остатков, соответствующего последовательности остатков 55-71 прогастрина и обозначается как G17-Gly. Удаление С-терминальных глицинов G34-Gly и G17-Gly, после чего осуществляется С-терминальное амидирование, обеспечивает G34 и G17 соответственно, которые оба являются С-терминально амидированными.
Как используется в данной заявке, антитело является "высоко специфическим для" hPG или "высоко специфически связывает" hPG, если оно связывается с полноразмерным прогастрином, но не связывается вообще с CTFP, амидированным гастрином или с удлиненным глицином гастрином, и является "специфическим для" hPG или "специфически связывает" hPG, если оно демонстрирует, по крайней мере, приблизительно в 5 раз большее связывание hPG, чем CTFP и других продуктов гастринового гена, как измеряется в стандартных анализах связывания. Специфический анализ ELISA, который может использоваться для оценки специфичности конкретного анти-hPG антитела, обеспечивается в примере 2.
Такие высоко специфические и/или специфические анти-hPG антитела (в данной заявке называются как "анти-hPG антитела") могут быть поликлональными ("анти-hPG PAb") или моноклональными ("анти-hPG MAb "), хотя для терапевтических применений и, в некоторых случаях, диагностических или других in vitro применений, моноклональные антитела являются предпочтительными.
Эпитоп, который связывается анти-hPG антителом, не является критическим. Полезные анти-hPG антитела могут связывать N-терминальный участок hPG, С-терминальный участок hPG или другой участок hPG. Недавно было продемонстрировано, что, по крайней мере, для моноклональных анти-hPG антител, выбор антигена, который используется для того, чтобы вызвать образование анти-hPG антител, может быть важным (см. международную заявку PCT/ЕР2010/006329, поданную 15 октября 2010 г., и заявку США № 12/906041, поданную 15 октября 2010 г., раскрытие которых и, в частности, раскрытые анти-hPG антитела являются введенными в данную заявку в качестве ссылки; далее упоминаются как '329 и '041 заявки соответственно). Как раскрывается в заявках '329 и '041, не все антигены, которые имеют происхождение от hPG, стимулируют образование моноклональных антител, которые, в частности, связывают hPG при физиологических условиях. Действительно, некоторые антигены, которые успешно использовались для получения поликлональных анти-hPG антител, таких как полноразмерный рекомбинантный hPG (см., например, WO 08/076454, которая относится к Singh) и пептид, соответствующий последним десяти аминокислотам на С-терминальном конце hPG (см. WO 07/135542, которая относится к Hollande и др.), были неуспешными для получения моноклональных антителах. Как указывается в '329 и '041 заявках, антигенные N-терминальные и С-терминальные последовательности в пределах hPG последовательности были идентифицированы как такие, которые могут использоваться для получения моноклональных антител, которые, в частности, связывают hPG. Интересно отметить, что необходимая антигенная последовательность не является ограниченной участками hPG последовательности, которые являются уникальными для нее. Пептидные антигены, имеющие участки последовательности наряду с другими продуктами гастринового гена, например G17, G34 и CTFP, обеспечивают получение моноклональных антител, которые не только связывают hPG, но связывают его специфически.
Анти-hPG антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую N-терминальному участку hPG, и/или такие, которые связывают N-терминальный участок hPG, называются в данной заявке "N-терминальными анти-PG антителами". Специфический типичный антигенный участок hPG, который может использоваться для конструирования иммуногена, приемлемого для получения как поликлональных, так и моноклональных антител, специфических для hPG, соответствует остаткам 1-14 hPG: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:25). Типичные им-муногены, полезные для получения N-терминальных анти-hPG антител, а также последовательности CDR и VH и VL N-терминальных анти-hPG моноклональных антител, полученные при использовании этих типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 1А, приведенной ниже, и в разделе "Примеры".
В табл. 1А все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной N-"С ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали при использовании С-терминального линкера одного остатка аминогексаноевой кислоты (Ahx), после которого следует остаток цистеина (Cys), который потом конъюгируют с носителем, представленным либо бычьим сывороточным альбумином ("BSA"), либо гемоцианином лимфы улитки ("KLH"), через линкер-ный остаток Cys.
Анти-hPG антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую С-терминальному участку hPG, и/или такие, которые связывают С-терминальный участок hPG, называются в данной заявке "С-терминальными анти-PG антителами." Специфический типичный антигенный участок hPG, который может использоваться для конструирования иммуногена, полезного для получения как поликлональных, так и моноклональных С-терминальных анти-hPG антител, соответствует остаткам 55-80 hPG: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID NO:27). Типичные иммуногены, включая этот антиген, полезные для получения С-терминальных анти-hPG антител, а также последовательностей CDR и VH и VL С-терминальных анти-hPG моноклональных антител, полученные при использовании этих типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 1В, приведенной ниже, и в разделе "Примеры".
В табл. 1В все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной N-"С ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали при использовании N-терминального линкера Ahx-Ahx-Cys, который потом конъюгируют с носителем, представленным либо гемоцианином лимфы улитки ("KLH"), либо токсином дифтерии, через линкерный остаток Cys.
Специфические эпитопы, связанные с типичными анти-hPG моноклональными антителами MAb 1-MAb 23, которые обеспечиваются в табл. 1А и 1В, картировали при использовании SPOT методики и аланинового сканирования, как описывается у Laune и др., 2002, J. Immunol. Methods, 267: 53-70 и Laune, 1997, J. Biol. Chem., 272: 30937-30944 соответственно (см. также пример 6 заявки '329). В методике SPOT пептидные последовательности из 15 аминокислот, охватывающие путативный эпитоп, получали и переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые потом подвергали зондированию с исследуемым антителом для определения минимальной последовательности эпитопа, которая узнается этим антителом. Аланиновое сканирование использовали для определения остатков в пределах эпитопа, которые являются критическими для связывания антитела. Каждый остаток в пределах путативного эпитопа подвергали мутации, один за другим, до аланина, и содержащие аланин пептиды потом зондировали с исследуемым антителом. Для N-терминальных анти-hPG моноклональных антител MAb 1-4 и 15-20, эпитопы включали, по крайней мере, следующие последовательности: DAPLG (SEQ ID NO:28), PDAPLG (SEQ ID NO:29), PRSQQPD (SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD (SEQ ID NO:31) или WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:32), как показано в табл. 2А, приведенной ниже.
Эксперименты по картированию эпитопов выявили, что анти-hPG MAb 2 и MAb 4 связывают тот же эпитоп; анти-hPG MAb 1 и MAb 3 связывают приблизительно тот же эпитоп; MAb 17, MAb 18, MAb 19 и MAb 20 связывают приблизительно тот же эпитоп; MAb 15 и MAb 16 связывают приблизительно тот же эпитоп; анти-hPG MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 9 и MAb 12 связывают тот же эпитоп и связывают приблизительно тот же эпитоп, что и анти-hPG MAb 10; и анти-hPG MAb 11 и MAb 14 связывают приблизительно тот же эпитоп.
Специфические воплощения N-терминальных анти-PG антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки 10-14 hPG (SEQ ID NO:28), остатки 9-14 hPG (SEQ ID NO:29), остатки 4-10 hPG (SEQ ID NO:30), остатки 2-10 -hPG (SEQ ID NO:31) или остатки 2-14 hPG (SEQ ID NO:32).
Специфические воплощения С-терминальных анти-PG антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки 71-74 hPG (SEQ ID NO:33), остатки 69-73 hPG (SEQ ID NO:34), остатки 76-80 hPG (SEQ ID NO:35), или остатки 67-74 hPG (SEQ ID NO:36). N-терминальные и С-терминальные анти-hPG антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, в дополнение к тем, которые обеспечиваются в табл. 1А и 1В, могут быть идентифицированы в конкурентных анализах связывания с типичными MAb 1-23, или с другими эталонными антителами, которые связывают N- или С-терминальные эпитопы, как будет описано более подробно в разделе, приведенном ниже.
Как также описано в заявках '329 и '041, не все анти-hPG антитела, даже те, которые демонстрируют высокую степень специфичности и аффинности для hPG, нейтрализуют биологическую активность hPG. Например, несмотря на то, что анти-hPG MAb 14 связывает hPG со значением KD приблизительно 6 пМ, оно не ингибировало, по крайней мере, при исследуемых концентрациях, рост клеток колоректального рака в анализе in vitro, в то время как другие анти-hPG моноклональные антитела демонстрировали значительную ингибиторную активность (см., например, пример 7 заявки '329). В то время как оба как не-нейтрализующее, так и нейтрализующее антитело, которые, в частности, связывают hPG, являются полезными для диагностических способов и способов мониторинга, описанных в данной заявке, анти-hPG антитела, полезные для терапевтических способов, будут демонстрировать нейтрализующую активность.
Как используется в данной заявке, "нейтрализующее анти-hPG антитело" представляет собой анти-hPG антитело, которое обеспечивает статистически значимое снижение количества живых Huh7 клеток в исследуемом образце, обработанном с помощью анти-hPG антитела, по сравнению с контрольным образцом, обработанным с помощью неспецифического антитела. Специфический анализ для оценки способности какого-либо конкретного анти-hPG антитела нейтрализовать hPG описывается в примере 3. Те анти-hPG антитела, которые демонстрируют, по крайней мере, приблизительно 50% снижение количества живых клеток в этом анализе, предполагаются как особенно полезные в лечении рака печени, несмотря на то, что анти-hPG антитела, демонстрирующие более низкие уровни нейтрализующей активности, например статистически значимое снижение 40, 30, 20, 15 или даже 10% количества живых клеток в этом анализе, предполагаются как такие, которые обеспечивают терапевтические преимущества.
В соответствии с этим в некоторых воплощениях, например терапевтических воплощениях, полезные анти-hPG антитела являются нейтрализующими. Как раскрыто в заявках '329' и '041', способность анти-hPG моноклонального антитела быть нейтрализующим не является зависимой от эпитопа, как N-терминальные, так и С-терминальные анти-hPG моноклональные антитела демонстрируют нейтрализующую активность в анализа с клетками колоректального рака, несущими мутацию в гене АРС. Таким образом, в некоторых специфических воплощениях нейтрализующие анти-hPG антитела представляют собой N-терминальные нейтрализующие анти-hPG антитела. В других воплощениях нейтрализующие анти-hPG антитела представляют собой С-терминальные нейтрализующие анти-hPG антитела.
Аффинность какого-либо специфического анти-hPG антитела не является критической. Однако при некоторых применениях антитела, демонстрирующие аффинности, по крайней мере, приблизительно 1 мкМ, могут быть предпочтительными. Для терапевтических применений аффинность по крайней мере
приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,1, 0,01, 0,001 нМ или даже больше, может быть желательной. Измеренные аффинности анти-hPG моноклональных антител, идентифицированных в табл. 1А и 1В, колеблются в интервале от 10-6 до 10-12 М, как показано в табл. 3, приведенной ниже.
Анти-PG моноклональное антитело, обладающее аффинностью, особенно приемлемой для конкретного желаемого применения, может быть легко выбрано из них, или получено, или сконструировано при использовании различных иммуногенов, последовательностей участка, определяющего комплемен-тарность (CDR), последовательностей вариабельной тяжелой (VH) и вариабельной легкой (VL) цепи анти-hPG антител, описанных в данной заявке. Аффинность какого-либо конкретного анти-PG моноклональ-ного антитела может быть определена при использовании методик, хорошо известных в данной области техники или описанных в данной заявке, таких как, например, анализы ELISA, изотермальная титраци-онная калориметрия (ITC), BIAcor, или анализы флуоресцентной поляризации. Специфический анализ обеспечивается в примере 4.
Как указано в табл. 1А и 1В, были идентифицированы некоторые N-терминальные и С-терминальные моноклональные анти-hPG антитела. Все эти антитела являются специфическими для hPG, как измеряется с помощью анализа, описанного в примере 2, и все они, за исключением MAb 14, демонстрируют нейтрализующую активность в анализах с клетками колоректального рака. Все эти антитела при проведении исследований с клетками рака печени (MAbs 3, 8, 13, 16 и 19) демонстрировали нейтрализующую активность. Несколько гибридом, полезных для получения антител, были задепониро-ваны 6 октября 2010 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) (CNCM, Institut Pasteur, 25 гае du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France) в соответствии с Будапештским договором. Наименования гибридом, которые продуцируют анти-hPG MAb 1-23, и регистрационные номера этих задепонированных гибридом, присвоенные коллекцией, обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Кроме того, для некоторых из этих антител были определены их вариабельные тяжелые цепи (VH), участки, определяющие комплементарность вариабельных легких цепей (VL) и VH CDR. Эти аминокислотные последовательности и сокращенное наименование, которое используется для ссылки на них в заявке, также обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Кратко, мышиные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данной заявке как mVH и mVL, после чего приводится номер соответствующего монокло-нального антитела, например mVH-3 и mVL-3 для вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепей анти-hPG MAb 3 соответственно. Подобно этому, человеческие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данной заявке как hVH и hVL, после чего приводится номер соответствующего мо-ноклонального антитела. Три CDR вариабельной тяжелой цепи и три CDR вариабельной легкой цепи обозначаются как VH CDR 1, 2 или 3 и VL CDR 1, 2 или 3 соответственно, после чего следует номер специфического анти-hPG моноклонального антитела. Например, VH CDR 1 MAb 3 обозначается как VH CDR 1.3 и VL CDR 1 MAb 3 обозначается как VL CDR 1.3. VH CDR 2 MAb 3 обозначается как VH CDR 2.3, и VL CDR 2 MAb 3 обозначается как VL CDR 2.3.
Предполагается, что соответствующие CDR и/или VH и VL цепи анти-hPG моноклональных антител, которые связывают приблизительно одинаковые эпитопы, могут быть взаимно заменены с получе
нием анти-hPG моноклональных антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке. Например, как указано выше, типичные анти-hPG моноклональные антитела MAb 5 и MAb 6 связывают один и тот же эпитоп. Анти-hPG моноклональное антитело может быть сконструировано так, что включает в своей VL цепи различные комбинации VL CDR этих двух антител, и/или в своей VH цепи включает различные комбинации VH CDR этих двух антител. В качестве специфического неограничивающего примера для иллюстрации различных возможных комбинаций, такое антитело может включать в своей VL цепи CDR 1 и 2 MAb 5 (VL CDR 1.5 и VLCDR 2.5 соответственно) и CDR 3 MAb 6 (VL CDR 3.6), и в своей VH цепи, CDR 1 MAb 6 (VH CDR 1.6) и CDR 2 и 3 MAb 5 (VH CDR 2.5 и VH CDR 3.5 соответственно). Аминокислотные последовательности CDR антител (которые являются также известными как гипервариабельные участки), вырабатываемых гибридомами, которые были задепонированы, могут быть получены при использовании традиционных средств.
Как является известным в области техники, аминокислотное положение/очерченный границами гипервариабельный участок антитела может варьировать в зависимости от контекста и различных определений, известных в уровне техники. Некоторые положения в рамках вариабельного домена могут рассматриваться как гибрид гипервариабельных положений в том, что эти положения могут подразумеваться как такие, которые находятся в рамках гипервариабельного участка в соответствии с одним набором критериев, в то время как подразумеваются как такие, которые находятся за пределами гипервариабельного участка в соответствии с другим набором критериев. Одно или более из этих положений может также обнаруживаться в удлиненных гипервариабельных участках. Анти-PG антитела, описанные в данной заявке, могут содержать модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Вариабельные домены нативных тяжелой и легкой цепей каждый включает четыре FR участка, главным образом, путем приобретения р-складчатой конфигурации, связанной тремя CDR, которые образуют петлю, соединяющую, а, в некоторых случаях, формирующую, часть р-складчатой структуры. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с CDR из других цепей с помощью FR участков в таком порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и с CDR и осуществляют свой вклад в образование сайта целевого связывания антитела (см. Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Как используется в данной заявке, нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина осуществляется в соответствии с системой нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина Kabat и др., если не указано другое. Со ссылкой на табл. 1 А, специфические воплощения N-терминальных анти-hPG антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, следующие:
(a) антитела, имеющие VL CDRs, которые соответствуют по последовательности VL CDRs MAb 1, MAb 2, MAb 3, MAb 4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 или MAb 20, и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VH CDRs MAb 1, MAb 2, MAb 3, MAb 4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 или MAb 20;
(b) антитела, имеющие VL CDRs и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VL и VH CDRs MAb 1, MAb 2, MAb 3, MAb 4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 или MAb 20;
(c) антитела, в которых:
(i) VL CDR 1 является выбранным из QSIVHSNGNTY ("VL CDR 1.3"; SEQ ID NO:4), QSLVHSSGVTY ("VL CDR 1.4"; SEQ ID NO:10), QSLLDSDGKTY ("VL CDR 1.16"; SEQ ID NO:50) и SQHRTYT ("VL CDR 1.19"; SEQ ID NO:51);
(ii) VL CDR 2 является выбранным из KVS ("VL CDR 2.3" или "VL CDR 2.4"; SEQ ID NO:5), LVS ("VL CDR 2.16"; SEQ ID NO:53) и VKKDGSH ("VL CDR 2.19"; SEQ ID NO:54);
(iii) VL CDR 3 является выбранным из FQGSHVPFT ("VL CDR 3.3"; SEQ ID NO:6), SQSTHVPPT ("VL CDR 3.4"; SEQ ID NO:11), WQGTHSPYT ("VL CDR 3.16"; SEQ ID NO:57) и GVGDAIKGQSVFV ("VL CDR 3.19"; SEQ ID NO:58);
(iv) VH CDR 1 является выбранным из GYIFTSYW ("VH CDR 1.3"; SEQ ID NO:1), GYTFSSSW ("VH CDR 1.4"; SEQ ID NO:7), GYTFTSYY ("VH CDR 1.16"; SEQ ID NO:39) и GYSITSDYA ("VH CDR 1.19";
SEQ ID NO:40);
(v) VH CDR 2 является выбранным из FYPGNSDS ("VH CDR 2.3"; SEQ ID NO:2), FLPGSGST ("VH
CDR 2.4"; SEQ ID NO:8), INPSNGGT ("VH CDR 2.16"; SEQ ID NO:43) и ISFSGYT ("VH CDR 2.19"; SEQ
ID NO:44); и
(vi) VH CDR 3 является выбранным из TRRDSPQY ("VH CDR 3.3"; SEQ ID NO:3), ATDGNYDWFAY
("VH CDR 3.4" SEQ ID NO:9), TRGGYYPFDY ("VH CDR 3.16"; SEQ ID NO:47) и REVNYGDSYHFDY
("VH CDR 3.19"; SEQ ID NO:48);
(d) антитела, имеющие VL, который соответствует по последовательности VL MAb 1, MAb 2, MAb 3, MAb 4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 или MAb 20, и VH, который соответствует по последовательности VH MAb 1, MAb 2, MAb 3, MAb 4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 или MAb
20; и
(e) антитела, имеющие VL и VH, которые соответствуют по последовательности VL и VH MAb 1, MAb 2, MAb 3, MAb 4, MAb 15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 или MAb 20.
(e)
Со ссылкой на табл. 2В специфические воплощения С-терминальных анти-hPG антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, следующие:
(a) антитела, имеющие VL CDRs, которые соответствуют по последовательности VL CDRs MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 8, MAb 9, MAb 10, MAb 11, MAb 12, MAb 13, MAb 14, MAb 21, MAb 22 или MAb 23, и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VH CDRs MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 8, MAb 9, MAb 10, MAb 11, MAb 12, MAb 13, MAb 14, MAb 21, MAb 22 или MAb 23;
(b) антитела, имеющие VL CDRs и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VL и VH CDRs MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 8, MAb 9, MAb 10, MAb 11, MAb 12, MAb 13, MAb 14, MAb 21,
MAb 22 или MAb 23;
(c) антитела, в которых:
(i) VL CDR 1 является выбранным из KSLRHTKGITF ("VL CDR 1.8"; SEQ ID NO:49) и QSLLDSDGKTY ("VL CDR 1.13"; SEQ ID NO:50);
(ii) VL CDR 2 является выбранным из QMS ("VL CDR 2.8"; SEQ ID NO:52) и LVS ("VL CDR 2.13";
SEQ ID NO:53);
(iii) VL CDR 3 является выбранным из AQNLELPLT ("VL CDR 3.8"; SEQ ID NO:55) и WQGTHFPQT ("VL CDR 3.13"; SEQ ID NO:56);
(iv) VH CDR 1 является выбранным из GFTFTTYA ("VH CDR 1.8"; SEQ ID NO:37) и GFIFSSYG ("VH CDR 1.13"; SEQ ID NO:38);
(v) VH CDR 2 является выбранным из ISSGGTYT ("VH CDR 2.8"; SEQ ID NO:41) и INTFGDRT ("VH CDR 2.13"; SEQ ID NO:42); и
(vi) VH CDR 3 является выбранным из ATQGNYSLDF ("VH CDR 3.8"; SEQ ID NO:45) и RGTGTY
("VH CDR 3.13"; SEQ ID NO:46);
(d) антитела, имеющие VL, который соответствует по последовательности VL MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 8, MAb 9, MAb 10, MAb 11, MAb 12, MAb 13, MAb 14, MAb 21, MAb 22 или MAb 23, и VH, который соответствует по последовательности VH MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 8, MAb 9, MAb 10, MAb 11, MAb 12, MAb 13, MAb 14, MAb 21, MAb 22 или MAb 23; и
(e) антитела, имеющие VL и VH, которые соответствуют по последовательности VL и VH, которые соответствуют по последовательности VL и VH MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 8, MAb 9, MAb 10, MAb 11, MAb 12, MAb 13, MAb 14, MAb 21, MAb 22 или MAb 23.
Как будет оценено квалифицированными специалистами в данной области техники, анти-hPG антитела, полезные в диагностических способах, могут иметь любое происхождение, включая, например, от млекопитающего (например, человека, примата, грызуна, козы или кролика), от животного, отличного от млекопитающего, или могут быть химерными по своей природе (иметь происхождение от более чем одного вида). Антитела, приемлемые для терапевтических применений у животных, включая людей, предпочтительно имеют происхождение от тех же видов, для лечения которых они предназначаются, или были модифицированы или сконструированы для того, чтобы быть неиммуногенными или иметь сниженную иммуногенность у животного, которого подвергают лечению. Специфический класс анти-hPG антител, полезных для терапевтических применений у людей, представляет собой класс гуманизированных антител, которые обсуждаются более подробно ниже. Анти-hPG антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, могут также быть или иметь происхождение от любого изотипа, включая, например, IgA (например, IgA1 или IgA2), IgD, IgE, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) или IgM. Анти-hPG антитела, предназначенные для терапевтических применений, предпочтительно являются такими IgG изотипа.
В некоторых воплощениях анти-hPG антитела, полезные для терапевтических способов, описанных в данной заявке, являются гуманизированными. В общем случае, гуманизированные антитела включают существенно все или по крайней мере один и типично два вариабельных домена, в которых все или существенно все CDR участки соответствуют таковым не-человеческого иммуноглобулина, и все или существенно все каркасные участки являются таковыми с консенсусными последовательностями человеческого иммуноглобулина, и могут обозначаться как "CDR-привитые." Гуманизированное антитело может также включать по крайней мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), типично такие с консенсусной последовательностью человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антител, включая способы конструирования гуманизированных антител, являются хорошо известными в области техники; см., например, Lefranc и др., 2003, Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77; Lefranc и др., 2009, Nucl. Acids Res., 37: D1006-1012; befranc, 2008, Mol. Biotechnol., 40: 101-111; Riechmann и др., 1988, Nature 332:323-7; патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, которые относятся к Queen и др., ЕР239400; PCT публикация WO 91/09967; патент США № 5225539; ЕР592106; ЕР519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Smdnicka и др., 1994, Prot. Eng., 7:805-814; Roguska и др., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973 и патент США № 5565332, раскрытие которых является введенным в данную заявку в своей целостности.
Гуманизированные варианты антител, имеющих CDR последовательности, соответствующую CDR анти-hPG антител, не принадлежащих человеку, включая в качестве примера и без ограничения, различные N-терминальные анти-hPG моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 1А, и раз
личные С-терминальные анти-hPG моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 1В, могут быть получены при использовании этих хорошо известных способов. Прогнозируемые последовательности для гуманизированных VL и VH цепей выбранных анти-hPG антител обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Специфические примеры гуманизированных антител включают антитела, включающие:
(a) какие-либо три VL CDRs и какие-либо три VH CDRs, раскрытые в данной заявке;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 22;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:23, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 24;
(d) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:75, 77 и 79, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:76 и 78;
(e) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:80 и 82 и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:81
и 83;
(f) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:84, 86 и 88 и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:85, 86 и 89; и
(g) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:90, 92 и 94, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:91, 93 и 95. Как будет признано квалифицированными специалистами, анти-hPG антитела, обладающие свойствами специфического связывания, такими как способность к связыванию специфического эпитопа, представляющего интерес, могут быть легко получены при использовании различных антигенов и иммуногенов, описанных в данной заявке, и будут подвергаться анализу на их способность конкурировать за связывание hPG с эталонным антителом, которое представляет интерес. Любое из анти-hPG антител, описанных в данной заявке, может использоваться как эталонное антитело в таком конкурентном анализе. Специфический анализ, полезный для оценки способности антитела конкурировать за связывание hPG с биотинилированным эталонным анти-hPG антителом, которое представляет интерес, обеспечивается в примере 5.
При проведении исследования конкуренции антитела между эталонным анти-hPG антителом и любым исследуемым антителом (вне зависимости от видов или изотипа), следует сначала пометить эталонное антитело с помощью метки, которая определяется либо непосредственно, например, с помощью радиоизотопа или флуорофора, или опосредованно, например, с помощью биотина (является способной к определению посредством связывания с флуоресцентно-меченным стрептавидином) или фермента (ферментативной реакции), для того, чтобы позволить осуществить последующую идентификацию. В этом случае меченное эталонное анти-hPG антитело (в фиксированных или повышающихся концентрациях) инкубируют с помощью известного количества hPG, образующего комплекс hPG: меченное анти-hPG антитело. Немеченное исследуемое антитело потом присоединяют к комплексу. Измеряют интенсивность комплексной метки. Если исследуемое антитело конкурирует с меченным эталонным анти-hPG антителом за hPG путем связывания с перекрывающимся эпитопом, то интенсивность комплексной метки будет снижаться по сравнению с контрольным экспериментом, который осуществляют при отсутствии исследуемого антитела.
Многочисленные способы для осуществления анализов конкурентного связывания являются известными и могут быть адаптированы для получения результатов, сравнимых с такими для анализа, описанного выше и в примере 5. Считается, что антитело конкурирует за связывание hPG с этапонным анти-hPG антителом, и таким образом считается таким, которое связывает приблизительно тот же или перекрывающийся эпитоп hPG, что и эталонное анти-hPG антитело, если оно снижает связывание эталонного анти-hPG антитела с hPG в конкурентном анализе связывания, и, в частности, конкурентном анализе связывания примера 5 по крайней мере на 50%, при концентрации исследуемого антитела в интервале 0,01100 мкг/мл (например, 0,01, 0,08, 0,4, 2, 10, 50 или 100 мкг/мл или другая концентрация в пределах указанного интервала), несмотря на то, что более высокие уровни снижения, например 60, 70, 80, 90 или даже 100%, могут быть желательными.
Средние специалисты в данной области техники смогут оценить, что в некоторых случаях, например, в диагностических случаях и в случае мониторинга, может быть желательным метить анти-PG антитела. Такие метки являются полезными для определения и количественной оценки. Приемлемые метки являются хорошо известными в области техники, и могут быть "непосредственными" в том, что они не- 23
посредственно наблюдаются или определяются (например, флуорофоры или радиоизотопы) или "опосредованными" в том, что они взаимодействуют с чем-либо еще, что обеспечивает получение наблюдаемого или определяемого сигнала (например, фермент, который воздействует на субстрат с образованием определяемого сигнала, или связывающая молекула, такая, как биотин, который связывает меченную стрептавидином молекулу). Многочисленные системы для мечения, а также средства для мечения антител с помощью них, которые являются известными в области техники, предполагаются для применения в данной заявке.
Несмотря на то что различные анти-hPG антитела, полезные в способах, описанных в данной заявке, были представлены с помощью антитела полной длины, квалифицированные специалисты смогут оценить, что связывающие фрагменты, или суррогатные сконструированные антитела или такие, которые имеют происхождение от антитела полной длины или связывающих фрагментов, могут также использоваться. Приемлемые фрагменты, суррогаты и тому подобное включают, но без ограничения таковыми, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, vIgG, scFv фрагменты и сурротела. Если не указано другое, то термин "антитело", как используется в данной заявке, является предназначенным для включения всех форм молекул антитела и "антителоподобных" суррогатных молекул, включая одноцепочечные антитела, сурротела и связывающие фрагменты. Антитела, имеющие структуры, типичные для существующих в природе антител, обозначаются в данной заявке как "нативные антитела".
Способы получения анти-PG антител.
Анти-PG антитела, полезные в способах, описанных в данной заявке, могут быть получены при использовании стандартных, хорошо известных способов. Для экспрессии анти-PG антител, полезных в способах, описанных в данной заявке, ДНК, которые кодируют частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, встраивают в экспрессионные векторы так, что гены являются оперативно связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В этом контексте термин "оперативно связанный" является предназначенным для понимания того, что ген антитела является лигированным в вектор, так, что последовательности контроля транскрипции и трансляции в пределах вектора служат для его предписанной функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой для экспрессии хозяйской клеткой. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы или, более типично, оба гена встраивают в один и тот же экспресси-онный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор с помощью стандартных способов (например, путем лигирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигирования тупых концов в случае, если отсутствуют сайты рестрикции). Перед встраиванием последовательностей легкой или тяжелой цепей анти-PG антитела экспрессионный вектор может уже нести последовательности константного участка антитела. Например, один подход для превращения последовательностей VH и VL анти-PG антитела в полноразмерные гены антитела заключается во встраивании их в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константные участки тяжелых цепей и константные участки легких цепей соответственно так, что VH сегмент является оперативно связанным с CH сегментом(ами) в пределах вектора, a VL сегмент является оперативно связанным с CL сегментом в пределах вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из хозяйской клетки. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор, так, что сигнальный пептид является связанным в рамке с аминотерминальным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный пептид (то есть сигнальный пептид из белка, отличного от иммуноглобулина).
В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессионные векторы в соответствии с описанием несут последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в хозяйской клетке. Термин "регуляторная последовательность" является предназначенным для включения промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналов полиаденилирова-ния), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности являются описанными, например, у Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Квалифицированные специалисты в данной области техники смогут оценить то, что конструирование экспрессионного вектора, включая выбор регуля-торных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор хозяйской клетки, которую подвергают трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Приемлемые регуляторные последовательности для экспрессии в хозяйской клетке млекопитающего включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни белковой экспрессии в хозяйских клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), обезьяньего вируса 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовирусов, (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Для дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, см., например, патент США № 5168062, который относится к Stinski, патент США № 4510245, который относится к Bell и др., и патент США № 4968615, который относится к Schaffner и др.
Дополнительно к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экс-прессионные векторы могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в хозяйских клетках (например, источники репликации) и гены селективного маркерного гена. Ген селективного маркерного гена способствует селекции хозяйских клеток, в которые этот вектор был введен (см., например, патент США №№ 4399216, 4634665 и 5179017, которые все относятся к Axel и др.). Например, типично ген селективного маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким, как G418, пуромицин, бластицидин, гигромицин или метотрексат, хозяйской клетке, в которую был введен вектор. Приемлемые гены селективного маркера включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в DHFR" хозяйских клетках с селекции/амплификацией при использовании метотрексата) и ген neo (для G418 селекции). Для экспрессии тяжелых и легких цепей экспрессионный(ые) вектор(ы), кодирующие тяжелые и легкие цепи, трансфи-цировали в хозяйскую клетку с помощью стандартных методик. Различные формы термина "трансфек-ция" является предназначенным для того, чтобы охватывать широкое разнообразие методик, которые обычно используются для введения экзогенной ДНК в прокариотические или эукариотические хозяйские клетки, например электропорация, липофекция, преципитация, опосредованная фосфатом кальция, DE-AE-декстраном и тому подобное. Является возможным экспрессировать антитела, описанные в данной заявке, либо в прокариотических, либо в эукариотических хозяйских клетках. В некоторых воплощениях экспрессию антитела осуществляют в эукариотических клетках, например хозяйских клетках млекопитающего, для оптимальной секреции правильно собранного и иммунологически активного антитела. Типичные хозяйские клетки млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител в соответствии с описанием включают клетки яичника китайского хомячка (СНО клетки) (включая DHFRCHO клетки, описанные у Urlaub и Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220, которые используются с DHFR селективным маркером, например, так как описано у Kaufman и Sharp, 1982, Mol. Biol., 159: 601621), миеломные NS0 клетки, COS клетки, 293 клетки и SP2/0 клетки. Когда рекомбинантные экспресси-онные векторы, содержащие гены антитела, вводят в хозяйские клетки млекопитающих, антитела получают путем культивирования хозяйских клеток в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить осуществить экспрессию антитела в хозяйских клетках или секрецию антитела в культураль-ную среду, в которой выращивают хозяйские клетки. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды при использовании стандартных способов очистки белка. Хозяйские клетки могут также использоваться для получения частей интактного антитела, таких как Fab фрагменты или scFv молекулы. Является понятным, что вариации указанной выше процедуры находятся в пределах настоящей заявки. Например, является желательным трансфицировать хозяйскую клетку с помощью ДНК, кодирующей либо тяжелую цепь, либо легкую цепь (или обе) анти-PG антитела, описанного в данной заявке. Методика ре-комбинантной ДНК может также использоваться для удаления некоторой части или всей ДНК, кодирующей какую-либо одну из них, либо обе легкую и тяжелую цепи, которые не являются необходимыми для связывания с PG. Молекулы, которые экспрессируются из таких укороченных молекул ДНК, также являются полезными в способах, описанных в данной заявке.
Для рекомбинантной экспрессии анти-PG антитела хозяйская клетка может быть совместно тран-фицирована с помощью двух экспрессионных векторов, где первый вектор кодирует полипептид, имеющий происхождение тяжелой цепи, а второй вектор кодирует полипептид, имеющий происхождение легкой цепи. Типично, каждый из этих двух векторов содержит отдельный селективный маркер. Альтернативно, может использоваться один вектор, который кодирует полипептиды как тяжелой, так и легкой цепи.
Анти-PG антитела могут также быть получены с помощью химического синтеза (например, при использовании способов, описанных в Solid Phase Peptide Synthesis, 2-е изд., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, 111.). Вариантные антитела также могут быть получены при использовании бесклеточных методик (см., например, Chu и др., 2001, Biochemia No. 2 (Roche Molecular Biologicals)).
После того как анти-PG антитело получено с помощью рекомбинантной экспрессии или при использовании методов синтеза, оно может быть очищено с помощью любого способа, известного в области техники для очистки молекулы иммуноглобулина, например с помощью хроматографии (например, ионообменной хроматографии, аффинной, в частности, при использовании аффинности для PG после селекции с использованием белка А или белка G, и эксклюзионной колоночной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости, или с помощью стандартной методики для очистки белка. Кроме того, анти-PG антитела или их связывающие фрагменты могут быть слиты с гетерологич-ными полипептидными последовательностями, описанными в данной заявке или иным образом известными в области техники для того, чтобы способствовать очистке.
Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения изобретения.
Примеры
Пример 1. Количественная оценка уровней PG в плазме или сыворотке крови.
Уровни PG в плазме или сыворотке крови могут быть традиционно определены при использовании следующего анализа. Планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью 0,5-10 мкг/мл С-терминального анти-hPG антитела, например кроличьего С-терминального анти-hPG поликлонального антитела или С-терминального анти-hPG антитела, описанного в данной заявке, и потом инкубировали в течение ночи. Планшеты трижды промывали в смеси PBS-Твин (0,05%) и блокировали при использовании 2% (вес./об.) обезжиренного сухого молока в PBS-Твин (0,05%). Отдельно готовили исследуемые образцы, контрольные образцы (чистый образец или негативный по PG образец крови или сыворотки), и от приблизительно 5 пМ (0,5х10-11 М) до приблизительно 0,1 нМ (1х10-10М) эталонного стандартного hPG (лиофилизиро-ванный hPG, разведенный в негативной по PG плазме или сыворотке) в приемлемом разбавителе (например, PBS-Твин 0,05%). Образцы инкубировали на покрытых планшетах в течение 2-4 ч при 37°C или, альтернативно, от 12 до 16 ч при 21°C. После инкубации планшеты трижды промывали с помощью PBS-Твин (0,05%) и инкубировали с 0,001-0,1 мкг/мл N-терминального анти-hPG антитела или N-терминального анти-hPG моноклонального антитела, описанного в данной заявке, слитого с пероксида-зой хрена (HRP) (см. Nakane и др., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091) в течение 30 мин при 21°C. Планшеты трижды промывали в PBS-Твин (0,05%) и прибавляли субстрат HRP в течение 15 мин при 21°C. Реакцию останавливали путем прибавления 100 мкл 0,5 М серной кислоты и осуществляли измерения оптической плотности при 405 нМ. Уровни hPG исследуемого образца определяли путем сравнения со стандартной кривой, построенной из измерений, полученных с эталонным стандартом hPG.
Пример 2. Анализ ELISA для оценки специфичности анти-hPG антитела.
Специфичность анти-hPG антител может быть традиционно определена при использовании ELISA анализов, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек инкубировали в течение ночи при 4°C с приемле-мой(ыми) концентрацией(ями) исследуемого полипептида (например, 25 и 50 нг рекомбинантного человеческого PG и 50 и 250 нг CTFP или других продуктов, имеющих происхождение от гена гастрина) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), после чего ячейки трижды промывали промывочным раствором (PBS и 0,1% Твин-20) и потом инкубировали в течение 2 ч при 22°C с 100 мкл блокирующего раствора (PBS, 0,1% Твин-20, 0,1% бычьего сывороточного альбумина или гидролизата казеина) на ячейку. После блокирования ячейки трижды промывали и прибавляли антитело, которое подвергается анализу (исследуемое антитело). 100 мкл исследуемого антитела (при концентрации от 0,3 до 1 нг/мл) в PBS и 0,1% Твин-20 прибавляли к каждой ячейке. Потом планшеты инкубировали в течение 2 ч при 22°C, после чего раствор исследуемого антитела отбрасывали и заменяли, после этапа промывания (3x100 мкл промывочного раствора, как указано выше) с помощью блокирующего раствора, содержащего вторичное антитело, прибавляли козье анти-мышиное IgG (Fc) антитело, слитое с пероксидазой хрена. Через 1 ч инкубации со вторичным антителом 100 мкл раствора субстрата (например, Fast OPD или О-фенилендиамин дигидрохлорид, доступный от Sigma-Aldrich Co., приготовленный в соответствии с инструкциями производителя) прибавляли к каждой ячейке и инкубировали в темноте в течение 20 мин при 22°C. Реакцию останавливали путем прибавления 50 мкл 4N серной кислоты и определяли количество катализированного субстрата путем измерения оптической плотности при (O.D.) 492 нм. Превращение субстрата является пропорциональным количеству первичного (исследуемого) антитела, связанного с антигеном. Эксперименты проводили в двукратной повторности, и измерения OD выстраивали как функцию концентрации антигена. Исследованные антитела считали высоко специфическими для PG, если измеренное значение O.D. составляло от 0,2 до 1,5 для hPG и не существовало статистически значимого сигнала, выше фона с CTFP или каким-либо другим пептидом, имеющим происхождение от гена гастрина, где фон представлял собой среднее значение сигнала от контрольных ячеек, содержащих только PBS
Пример 3. Анализ для оценки нейтрализующей активности анти-hPG антитела.
Специфический тест для оценки, является ли специфическое анти-hPG антитело нейтрализующим, может быть осуществлен так, как описано ниже. Huh7 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки с ультранизким прикреплением (500 клеток/ячейка) в свободную от сыворотки среду M11. Клетки выращивали при 37°C и ежедневно два раза в день в течение 7 дней обрабатывали исследуемым анти-hPG антителом или контрольным, неспецифическим моноклональным антителом, при концентрациях антитела приблизительно 5 мкг/мл. В конце эксперимента делают микрофотографии, подсчитывают количество сфер на ячейку и определяют среднее и процентильное распределение. Исследуемое антитело определяют как нейтрализующее в этом анализе, если количество сфероидов, образовавшихся Huh7 клетками в условиях культуры низкого прикрепления, демонстрирует статистически значимое снижение по крайней мере 20% по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного антитела, при использовании критерия Стьюдента для одной выборки при анализе одного анти-hPG антитела или однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Бонферрони, когда подвергаются анализу многочисленные антитела (с отличием, которое считается значимым тогда, когда р <0,05).
Пример 4. Анализ для оценки аффинности анти-hPG антитела.
Константы аффинности анти-hPG антител могут измеряться при использовании методики Proteon (BioRad) в соответствии с Nahshol и др. (2008) Analytical Biochemistry 383: 52-60, которая является введенной в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности. Кратко, для мышиных анти-PG антител анти-мышиное IgG антитело (50 мкг/мл) сначала наносили на сенсорный чип, убеждаясь, что определяемый чипом сигнал после введения антитела находится в интервале от 10000 до 11500 единиц ответа (RU). Потом вводили мышиное анти-hPG антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело) (при типичной концентрации 30 мкг/мл). Если исследуемое антитело связывается достаточно, то будет наблюдаться дополнительный сигнал по крайней мере 500 RU. Процесс связывания между исследуемым антителом и hPG потом осуществляли путем введения варьирующих концентраций hPG, например, 200, 100, 50, 25 и 12,5 нМ, и определения уровня ассоциации. Типично, несколько каналов были доступными для исследуемого множества антител параллельно в одном эксперименте, делая возможным анализ связывания единственного исследуемого антитела при различных концентрациях hPG параллельно. Один канал будет заполняться мышиным моноклональным антителом, которое не является специфическим для hPG, в качестве контрольного для неспецифического связывания, а другие каналы будет заполняться буфером для разведения, взятым отдельно в качестве базовой линии для фонового сигнала. В общем случае никакого связывания не определяют в канале, в который вводится неспецифическое мышиное антитело. Антитела, которые демонстрируют высокий уровень ассоциации в анализе, что может приводить к насыщению захваченного моноклонального антитела hPG, могут анализироваться против более низких концентраций hPG (50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 нМ), позволяя осуществлять более точное измерение. Константы аффинности (KD) подсчитывают как соотношение между константой диссоциации (kd) и константой ассоциации (ka). Экспериментальные значения могут быть подтверждены путем анализа статистически релевантного подобия между экспериментальными кривыми на основе измерений связывания и теоретических профилей.
Константы аффинности не-мышиных анти-hPG антител могут быть оценены в подобном формате при использовании IgG, специфических для видов происхождения анти-hPG исследуемого антитела.
Пример 5. Анализ для оценки конкурентного связывания с эталонным анти-hPG антителом.
Специфический анализ для оценки, конкурирует ли антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело), за связывание hPG с биотинилированным эталонным анти-hPG антителом, может осуществляться так, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью иммобилизованного анти-hPG антитела (поликлональное или моноклональное антитело, узнающее N- или C-терминальный участок hPG, который отличается от эпитопа, который узнается биотинилированным эталонным анти-hPG антителом), при концентрации, которая является выбранной в пределах интервала 1-10 мкг/мл, в течение ночи при 4°C (от 0,1 до 1 мкг/ячейка). После блокирования с помощью блокирующего буфера (0,1% Твин-20, 0,1% BSA в PBS) в течение 2 ч при 22°C, прибавляли рекомбинантный hPG при концентрации, которая колеблется от 10 пМ до 1 нМ (от 10 до 1000 пг/ячейка), и инкубировали в течение 2 ч при 22°C. После этого прибавляли биотинилированное эталонное анти-hPG антитело (или смесь, содержащую биотинилированное эталонное анти-hPG антитело), вместе с повышающимися концентрациями немеченного исследуемого антитела и инкубировали в течение 1 ч при 22°C. После промывания для удаления несвязанного антитела определение связанного меченного эталонного анти-hPG антитела осуществляли путем инкубации смеси с 50 нг/мл страптавидин-HRP в течение 1 ч при 22°C, после чего проводили инкубацию с хемилюминисцентным субстратом для пероксидазы хрена в течение 5 мин при 22°C и потом осуществляли количественную оценку относительных световых единиц (RLU) в люмино-метре. Анализы осуществляли в двукратной повторности.
Антитела, которые конкурируют с эталонным анти-hPG антителом, ингибируют связывание эталонного антитела с hPG. Антитело, которое связывается существенно с тем же эпитопом или с перекрывающимся эпитопом, что и эталонное антитело, существенно снижает (например, по крайней мере на 50%) количество связанного эталонного анти-hPG антитела, как становится очевидным с помощью снижения наблюдаемых RLU.
Высокое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным hPG без исследуемого антитела. Низкое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным hPG в присутствии избыточных концентраций немеченного эталонного антитела (немеченное эталонное антитело, таким образом, конкурирует с меченым антителом за связывание с hPG). Способность исследуемого антитела конкурировать с эталонным анти-hPG антителом потом определяют путем инкубации меченного эталонного антитела с ре-комбинантным hPG в присутствии повышающихся концентраций немеченого исследуемого антитела. В тестовом анализе значительное снижение наблюдаемых уровней RLU в присутствии исследуемого антитела свидетельствует о том, что исследуемое антитело узнает существенно тот же эпитоп, что и эталонное анти-hPG антитело. Ингибирование связывания может выражаться как ингибирование константы, или Ki, которая подсчитывается в соответствии со следующей формулой:
K = IC50/[1 + (концентрация эталонного анти-hPG Ab/KD эталонного я(tm)-1(tm) Ab)],
где"Ю5о" представляет собой концентрацию исследуемого антитела, которая обеспечивает 50% снижение связывания эталонного антитела, а KD эталонного и(tm)-1^ Ab представляет собой константу диссоциации эталонного анти-hPG антитела, меру его аффинности для hPG. Полезные исследуемые антитела, которые конкурируют с эталонным анти-hPG антителом (например, одним из анти-hPG антител, описанных в данной заявке), будут типично иметь значения Ki, которые колеблются от 10 пМ до 100 нМ при условиях проведения анализа, описанных в данной заявке.
Пример 6. Гепатоклеточные карциномы из опухолей рака печени демонстрируют повышенные уровни экспрессии гена GAST.
Этот пример описывает наблюдения того, что образцы опухоли печени, полученные от пациентов с гепатоклеточной карциномой (HCC), экспрессируют повышенные уровни гена GAST по сравнению с нормальной тканью.
A. Способы.
Первичные опухоли печени и нормальные ткани контроля хирургически удаляли у 14 пациентов. РНК получали как из образцов опухоли, так и здоровой ткани печени, и целостность мРНК контролировали с помощью устройства Agilent Bioanalyser. Экспрессию мРНК GAST измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и нормализовали при использовании экспрессии HPRT мРНК. Для ОТ-ПЦР общую РНК из HCC образцов экстрагировали при использовании набора FastRNA Pro Green (MP BioMed) в соответствии с прописью производителя. РНК подвергали обратной транскрипции при использовании Superscript II RT (Invitrogen) в присутствии ран-домного праймера (R &D Systems). ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли при использовании набора Quantifast SYBR Green PCR (Qiagen) и Eppendorf Mastercycler ер realplex (Eppendorf). Праймеры для амплификации генов GAST и HPRT получали от Sigma Life Science. Каждую ПЦР амплификацию осуществляли в трех ячейках при использовании следующих условий: 5 мин при 95°C, после чего проводили 45 двухтемпературных циклов (10 с при 95°C и 30 с при 60°C).
B. Результаты.
Как показано на фиг. 4, экспрессия мРНК GAST повышалась в образцах HCC опухолей по сравнению с нормальной тканью печени у 10 из 14 субъектов с раком печени. В образцах, где экспрессия мРНК GAST повышалась, экспрессия колебалась от 2 до 2800-кратной по сравнению с нормальной тканью.
Пример 7. Линии клеток рака печени, выращенные при условиях культивирования сниженного прикрепления, демонстрируют повышенные уровни экспрессии гена GAST.
Этот пример описывает наблюдение, что линии клеток рака печени, выращенные при условиях культивирования сниженного прикрепления, экспрессируют повышенные уровни гена GAST по сравнению с линией клеток колоректального рака.
A. Способы.
Две клеточные линии гепатоклеточной карциномы, Huh7 и PLC/PRF/5, линию клеток гепатобла-стомы, Huh6, и линию клеток колоректального рака, SW480, каждую высевали во флаконы для выращивания при условиях низкого прикрепления в M11 среду, и выращивали до достижения образования сфер. Сферы потом подвергали обработке для экстракции РНК. ОТ-ПЦР осуществляли так, как описано в примере 1, за исключением того, что общую РНК экстрагировали при использовании набора QIAGEN Rne-asy Mini в соответствии с прописью производителя. Уровни экспрессии мРНК GAST из линий клеток рака печени потом нормализовали по отношению к экспрессии в SW480 клетках, что служило в качестве позитивного контроля.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 5А, 5В, все исследуемые линии клеток печени, Huh6, Huh7 и PLC/PRF/5, экс-прессировали повышенные уровни мРНК GAST по сравнению с линией клеток SW480 колоректальной опухоли при выращивании в условиях культивирования сниженного прикрепления. Результаты выражали по отношению к уровням экспрессии гена гастрина в SW480 клетках.
Пример 8. Клетки боковой популяции, изолированные из линий клеток рака печени и выращенные при условиях культивирования сниженного прикрепления, демонстрируют повышенные уровни экспрессии гена GAST.
Этот пример описывает наблюдение, что исключающие краситель клетки "боковой популяции" из двух линий клеток рака печени, Huh6 и Huh7, экспрессируют повышенные уровни мРНК GAST по сравнению с общей популяцией таких клеток (то есть боковая популяция и не-боковая популяция), выращенных при условиях культивирования сниженного прикрепления.
А. Способы.
Исключающие краситель клетки "боковой популяции" из линий клеток рака печени Huh6 и Huh7 изолировали из общей популяции таких клеток при использовании FACS. В частности, клетки разобщали с помощью обработки трипсином и ЭДТА. Потом клетки инкубировали в 1 мл окрашивающей среды (DMEM, 2% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ ЭДТА) в течение 10 мин при 37°C. К негативному контрольному образцу прибавляли 1 мкл 50 мМ раствора верапамила (заключительная концентрация 50 мкМ). Контрольный и исследуемый образцы потом инкубировали в течение 10 мин при 37°C. Потом прибавляли раствор красителя к исследуемым образцам (2,5 мкл 2 мг/мл Hoechst 33342; заключительная
концентрация красителя 5 мкг/мл), после чего осуществляли осторожное перемешивание. Потом все образцы инкубировали в течение 50 мин при 37°C при регулярном осторожном перемешивании. После инкубации на льду в течение 5-10 мин образцы инкубировали в течение 5 мин при 1000 об./мин. Потом ре-суспендировали осадки клеток в 1 мл разведения 1:40 раствора иодида пропидия с концентрацией 25 мкг/мл в M11 среде. Агрегированные клетки удаляли путем фильтрования через сито в пробирку на 5 мл. Потом образцы помещали на лед для осуществления цитометрии при использовании FACSAria цитомет-ра с сигнальной детекцией при 450 и 488 нм. Потом РНК очищали, и уровни экспрессии мРНК GAST количественно оценивали так, как описано в примерах 6 и 7, потом их сравнивали с уровнями экспрессии гена GAST из Huh6 и Huh7 клеток, выращенный в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления, и из SW480 клеток колоректального рака. Уровни экспрессии мРНК GAST из линии клеток рака печени потом нормализовали по отношению к экспрессии в SW480 клетках, которые служили в качестве позитивного контроля. В. Результаты.
Как показано на фиг. 6, исключающая краситель "боковая популяция" Huh6 и Huh7 клеток экспрес-сирует повышенные уровни мРНК GAST по сравнению с общей популяцией таких клеток, выращенных в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления (фиг. 6А и 6В соответственно). Боковая популяция Huh7 клеток экспрессировала больше мРНК гастрина по сравнению с боковой популяцией Huh6 клеток. Результаты выражали по отношению к уровням экспрессии гена гастрина в SW480 клетках.
Пример 9. PLC/PRL/5 клетки гепатоклеточной карциномы, выращенные в условиях роста сфероидов, образуют меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-PG антитела.
Этот пример демонстрирует влияние на рост в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления PLC/PRL/5 клеток рака печени, обработанных с помощью анти-hPG моноклональных антител.
A. Способы.
PLC/PRL/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки для ультранизкого прикрепления (220 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки выращивали в течение 10 дней при 37°C с ежедневным прибавлением контрольного или анти-hPG MAb 3 моноклонального антитела (1 мкг/мл). В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 7, обработка с помощью анти-hPG моноклональных антител PLC/PRF/5 клеток существенно снижала количество сфероидов, которые сформировались во время роста при условиях культивирования низкого прикрепления по сравнению с контрольным моноклональным антителом.
Пример 10. Клетки боковой популяции клеток, очищенные из Huh6 линии клеток гепатобластомы, выращенной при условиях роста сфероидов, формировали меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-PG антитела.
Этот пример демонстрирует влияние на рост в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления исключающей краситель боковой популяции Huh6 клеток рака печени, обработанных с помощью анти-hPG поликлоналных антител.
A. Способы.
Исключающую краситель боковую популяцию клеток Huh6 изолировали так, как описано выше. Потом боковую популяцию клеток высевали в планшеты на 96 ячеек низкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в среде M11 и выращивали в течение 13 дней при температуре 37°C в присутствии контрольных или антипрогастриновых поликлональных антител (1 мкг/мл), 5 нМ доксорубицина (химиотерапев-тический агент, который используется при некоторых способах терапии рака печени), или ДМСО (носитель для доксорубицина) (15 ячеек на вариант). Состав среды M11 был следующим: DMEM/F12-глутамакс (каталожный номер 31331, Invitrogen); 20 нг/мл EGF (R &D systems); 10 нг/мл FGF (R &D systems); 20 мкг/мл инсулина (Sigma); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, Gibco); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 8, обработка с помощью анти-hPG поликлональных антител боковой популяции клеток, очищенных из Huh6 линии клеток, существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления, по сравнению с контрольными антителами, доксорубицином и ДМСО контролем.
Пример 11. Боковая популяция клеток, очищенных из Huh7 гепатоклеточной линии клеток, выращенных при условиях роста сфероидов, формирует меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-hPG антитела.
Этот пример демонстрирует влияние обработки с помощью анти-hPG поликлональных антител на рост в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления исключающей краситель боковой популяции Huh7 клеток рака печени.
A. Способы.
Исключающую краситель боковую популяцию клеток Huh7 изолировали так, как описано в примере 8. Потом боковую популяцию клеток высевали в планшеты на 96 ячеек низкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в среде M11 и выращивали в течение 9 дней при 37°C в присутствии контрольных или антипрогастриновых поликлональных антител (1 мкг/мл), 5 нМ доксорубицина (химиотерапевтический агент, который используется при некоторых способах терапии рака печени), или ДМСО (носитель для доксорубицина) (15 ячеек на вариант). Состав среды M11 был следующим: DMEM/F12-глутамакс (каталожный номер 31331, Invitrogen); 20 нг/мл EGF (R &D systems); 10 нг/мл FGF (R &D systems); 20 мкг/мл инсулина (Sigma); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, Gibco); 2 мкг/мл ципрофлок-сацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 9, обработка с помощью анти-hPG поликлональных антител боковой популяции клеток, очищенных из Huh7 линии клеток, существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления, по сравнению с контрольными антителами и ДМСО контролем. Наблюдали, что доксорубицин также снижал количество сфероидов, которые формируются в культуре.
Пример 12. Huh6 клетки гепатобластомы формируют меньшее количество сфероидов при ростовых условиях сниженного прикрепления при обработке с помощью анти-hPG моноклональных антитела.
Этот пример показывает влияние обработки с помощью анти-hPG моноклональных антител на рост Huh6 сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления.
A. Способы.
Клетки Huh-6 гепатобластомы высевали в планшеты на 96 ячеек для ультранизкого прикрепления (85 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки обрабатывали два раза в день в течение 7 дней при 37°C с помощью носителя (PBS, контроль) или с помощью анти-hPG MAb 13 или MAb 19 моноклональных антител (3 мкг/мл). В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфероидов на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 10, обработка Huh6 клеток с помощью анти-hPG моноклональных антител существенно снижает количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления, по сравнению с необработанными контрольными клетками.
Пример 13. Huh6 клетки, предварительно обработанные с помощью анти-hPG моноклональных антител, формируют меньшее количество сфероидов при выращивании при условиях культивирования низкого прикрепления.
Этот пример демонстрирует ингибиторный эффект предварительной обработки с помощью анти-hPG моноклональных антител на последующую способность Huh6 клеток гепатобластомы расти в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления.
A. Способы.
100000 Huh6 клеток гепатобластомы/ячейка сначала высевали в планшеты на 6 ячеек в DMEM с 10% FCS, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение 48 ч в DMEM в присутствии 10 мкг/мл антипрогастринового моноклонального антитела MAb 8 или MAb 13 или контрольного монокло-нального антитела (PCX63Ag8, АТСС, Ref TIB-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 500 клеток/ячейка высаживали в шесть ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки M11 среды, содержащей bFGF и EGF, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер. Фотографии делали в конце 5-дневного периода "вымывания", во время которого клетки Huh-6 для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде M11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфер.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 11, способность клеток Huh6 гепатобластомы расти в виде сфероидов в планшетах низкого прикрепления была значительным образом сниженной с помощью предшествующей 48-часовой обработки с помощью моноклонального антитела против прогастрина.
Пример 14. Huh7 клетки гепатоклеточной карциномы, выращенные при условиях роста сфероидов, формируют меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-PG моноклонального антитела.
Этот пример показывает влияние анти-hPG моноклональных антител на формирование сфероидов Huh7 клеток при культивировании их в условиях низкого прикрепления.
A. Способы.
В первом эксперименте Huh7 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки для ультранизкого прикрепления (500 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки обрабатывали два раза в день в течение 7 дней выращивания при 37°C с помощью носителя (PBS, контроль) или с помощью 3 мкг/мл анти-hPG MAb 13 моноклонального антитела (анти-hPG MAb 13). В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
Во втором эксперименте Huh7 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки для ультранизкого прикрепления (500 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки обрабатывали два раза в день в течение 7 дней выращивания при 37°C с помощью 6 мкг/мл одного из следующих: контрольное моноклональное антитело (контроль MAb, (P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9), анти-hPG MAb 13, или анти-hPG MAb 16 моноклональ-ных антител. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
В первом эксперименте, показанном на фиг. 12А, обработка Huh7 клеток с помощью анти-hPG мо-ноклонального антитела MAb 13 существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления по сравнению с необработанными контрольными клетками. В втором эксперименте, показанном на фиг. 12В, обработка Huh7 клеток с помощью анти-hPG моноклонального антитела MAb 13 или антитела MAb 16 существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного моноклонального антитела.
Пример 15. Huh7 клетки, предварительно обработанные с помощью анти-hPG моноклональных антител, формируют меньшее количество сфероидов при выращивании при условиях культивирования низкого прикрепления.
Этот пример демонстрирует ингибиторный эффект предварительной обработки с помощью анти-прогастринового моноклонального антитеал на способность Huh7 клеток гепатоклеточной карциномы формировать сфероиды при условиях культивирования низкого прикрепления.
А. Способы.
В одном эксперименте 75000 Huh7 клеток гепатоклеточной карциномы/ячейка сначала высевали в планшеты на 6 ячеек в среде МЕМа с 10% FCS, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение 60 ч в МЕМа + 0,5% паннексина Н в присутствии 10 мкг/мл антипрогастринового моноклональ-ного антитела MAb 8 или контрольного моноклонального антитела (P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 500 клеток/ячейка высаживали в восемь ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки M11 среды, содержащей bFGF и EGF, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер. Фотографии делали в конце 5-дневного периода "вымывания", во время которого клетки Huh-7 для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде М11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфероидов.
Во втором эксперименте 75000 Huh7 клеток гепатоклеточной карциномы/ячейка сначала высевали в планшеты на 6 ячеек в среде МЕМа с 10% FCS, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение 60 ч в МЕМа + 0,5% паннексина Н в присутствии 10 мкг/мл антипрогастринового моноклональ-ного антитела MAb 16 или контрольного моноклонального антитела (P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 500 клеток/ячейка высаживали в восемь ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки M11 среды, содержащей bFGF и EGF, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер. Фотографии делали в конце 5-дневного периода "вымывания", во время которого клетки Huh-7 для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде M11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфероидов.
В. Результаты.
Результаты являются представленными на фиг. 13А, В. Как показано на фиг. 13А, способность Huh7 клеток к выращиванию в виде сфероидов в планшетах низкого прикрепления была значительно снижена с помощью 48-часовой предварительной обработки при использовании анти-hPG MAb 8. Как показано на фиг. 13В, способность Huh7 клеток расти в виде сфероидов в планшетах низкого прикрепления была значительно снижена с помощью 48-часовой предварительной обработки с помощью анти-hPG анти-hPG MAb 16.
Пример 16. "Боковая популяция" клеток Huh7 гепатоклеточной карциномы формирует меньшее количество сфероидов в условиях культивирования низкого прикрепления при обработке с помощью анти-PG антитела.
Этот пример показывает влияние обработки с помощью анти-hPG моноклональных антител на рост сфероидов в условиях культивирования низкого прикрепления исключающих краситель клеток "боковой популяции" из линии клеток Huh7 рака печени.
A. Способы.
Исключающую краситель боковую популяцию клеток Huh7 изолировали так, как описано в примере 8. Потом клетки боковой популяции высевали в планшеты на 24 ячейки с ультранизким прикреплением (1000 клеток/ячейка) в среде M11 и выращивали в течение 7 дней при 37°C в присутствии контрольной среды или антипрогастриновых моноклональных антител MAb 8 или MAb 13 (6 мкг/мл) (8 ячеек на вариант). Состав среды M11 был следующим: DMEM/F12-глутамакс (каталожный номер 31331 Invitrogen); 20 нг/мл EGF (R &D systems); 10 нг/мл FGF (R &D systems); 20 мкг/мл инсулина (Sigma); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, Gibco); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентами-цина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 14, обработка с помощью анти-hPG моноклональных антител боковой популяции клеток, очищенных из Huh7 линии клеток, существенно снижала количество сфероидов, которые формируются в процессе культивирования в условиях низкого прикрепления по сравнению с клетками, выращенными в контрольной среде.
Пример 17. PLC/PRL/5 клетки гепатоклеточной карциномы, обработанные с помощью анти-PG антитела, формируют меньшее количество сфероидов при ростовых условиях сниженного прикрепления.
Этот пример показывает влияние анти-hPG моноклональных антител на образование сфероидов PLC/PRL/5 клеток при условиях культивирования низкого прикрепления.
A. Способы.
В одном эксперименте PLC/PRL/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 96 ячеек ультранизкого прикрепления (35 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл ген-тамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки выращивали в течение 8 дней при 37°C при добавлении либо контрольного моноклонального антитела (контроль MAb, P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9), либо анти-hPG MAb 19 моноклонального антитела. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
В другом эксперименте PLC/PRL/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки ультранизкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки два раза в день ежедневного в течение 7 при выращивании при температуре 37°C обрабатывали либо контрольным MAb, либо анти-hPG MAb 13 монокло-нальным антителом. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
В дополнительном эксперименте PLC/PRL/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки ультранизкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде M11 (DMEM/F12 с 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлокса-цина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки два раза в день ежедневного в течение 7 при выращивании при температуре 37°C обрабатывали при использовании 6 мкг/мл одного из следующих: контрольное MAb, анти-hPG MAb 8 или анти-hPG MAb 13 моноклональное антитело. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Результаты являются представленными на фиг. 15А-С. Как показано на фиг. 15А, обработка с помощью анти-hPG MAb 19 значительно снижала количество сфероидов, которые образуются PLC/PRL/5 клетками в процессе роста при культивировании в условиях низкого прикрепления по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного MAb. Как показано на фиг. 15В, обработка с помощью анти-hPG MAb 13 значительно снижала количество сфероидов, которые образуются PLC/PRL/5 клетками в процессе роста в условиях культивирования низкого прикрепления по сравнению с клетками, обрабо
танными с помощью контрольного MAb. Как показано на фиг. 15С, обработка с помощью анти-hPG MAb 8 или MAb 13 значительно снижала количество сфероидов, которые образуются PLC/PRL/5 клетками в процессе роста в условиях культивирования низкого прикрепления по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного MAb.
Пример 18. PLC/PRF/S клетки, предварительно обработанные с помощью анти-hPG моноклональ-ных антител, формируют меньшее количество сфероидов при выращивании в условиях культивирования низкого прикрепления.
Этот пример показывает ингибиторный эффект предварительной обработки с помощью анти-hPG моноклональных антител на способность клеток гепатоклеточной карциномы формировать сфероиды в условиях культивирования низкого прикрепления.
A. Способы.
50000 PLC/PRF/5 клеток гепатоклеточной карциномы/ячейка сначала высевали в планшеты на 6 ячеек в ЕМЕМ с 10% FCS, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение 72 ч в ЕМЕМ + 0,5% паннексин Н в присутствии 10 мкг/мл анти-hPG MAb 8, анти-hPG MAb 16 или контрольного моноклонального антитела (контроль MAb, P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 200 клеток/ячейка высаживали в шесть ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки M11 среды, содержащей bFGF и EGF, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер.
Фотографии делали в конце 5-дневного периода "вымывания", во время которого клетки PLC/PRF/5 клеток для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде M11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфероидов.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 16, способность PLC/PRF/5 клеток гепатоклеточной карциномы к формированию сфероидов в планшетах низкого прикрепления значительно снижалась путем предварительной 72-часовой обработки при использовании двух различных моноклональных антител против прогастрина по сравнению с контрольным MAb.
Пример 19. "Боковая популяция" клеток PLC/PRL/5 гепатоклеточной карциномы формирует меньшее количество сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления в случае обработки с помощью анти-PG антитела.
Этот пример показывает влияние анти-hPG моноклональных антител на образование сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления для исключающей краситель "боковой популяции" клеток, изолированных из PLC/PRL/5 клеток рака печени.
A. Способы.
Исключающую краситель боковую популяцию клеток PLC/PRL/5 изолировали так, как описано в примере 8. Потом клетки боковой популяции высевали в планшеты на 24 ячейки с ультранизким прикреплением (400 клеток/ячейка) в среде M11 и выращивали в течение 7 дней при 37°C в присутствии контрольной среды или антипрогастриновых моноклональных антител MAb 13 (6 мкг/мл) или MAb 16 (10 мкг/мл) (6 ячеек на вариант). Состав среды M11 был следующим: DMEM/F12-глутамакс (каталожный номер 31331 Invitrogen); 20 нг/мл EGF (R &D systems); 10 нг/мл FGF (R &D systems); 20 мкг/мл инсулина (Sigma); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, Gibco); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.
B. Результаты.
Как показано на фиг. 17, обработка "боковой популяции" клеток, изолированных из PLC/PRL/5 линии клеток, с помощью анти-hPG моноклональных антител существенно снижала количество сфероидов, которые образуются при условиях культивирования низкого прикрепления, по сравнению с клетками, выращенными в среде, взятой отдельно.
Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, приведенные в данной заявке, являются введенными в качестве ссылки в своей целостности для всех целей до такой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка и другой документ были индивидуально указаны для включения в качестве ссылки для всех целей.
Несмотря на то что различные специфические воплощения были проиллюстрированы и описаны, будет понятным, что могут быть внесены различные изменения без отступления от духа и объема данно-го(ых) изобретения(ий).
Перечень последовательностей
<110> BIOREALITES, S.A.S.
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
<400> 3
Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gin Tyr 1 5
<210> 4 <211> 11 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 4
Gin Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 15 10
<210> 5
<211> 3
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 5 Lys Val Ser
<210> 6 <211> 9 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 6
Phe Gin Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5
<210> 7
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 7
Gly Туг Thr Phe Ser Ser Ser Trp 1 5
<210> 8 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 8
Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr 1 5
<210> 9 <211> 11 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 9
Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr 15 10
<210> 10 <211> 11 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 10
Gin Ser Leu Val His Ser Ser Gly Val Thr Tyr 15 10
<210> 11 <211> 9 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 11
Ser Gin Ser Thr His Val Pro Pro Thr 1 5
<210> 12 <211> 115 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 12
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr lie Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Gly Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Arg Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gin Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 13 <211> 112 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 13
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 15
Asp Leu Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Val Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 16
gag gtt сад etc сад сад tct ддд act gtg ctg дса адд cct ддд get
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
15 10 15
tec gtg aag atg tec tgc aag get tct ggc tac ate ttt acc age tac
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr lie Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tgg gta cac tgg gtt aaa сад адд cct gga сад ggt eta gaa tgg att
Trp Val His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
144
ggt ggt ttt tat cct gga aat agt gat tct agg tac aac сад aaa ttc Gly Gly Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Arg Tyr Asn Gin Lys Phe
192
aag ggc aag gcc аса ctg act gca gtc аса tec gec agt act gec tac
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gac etc age age ctg аса aat gag gac tct gcg gtc tat ttc tgt
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
аса aga aga gat agt ccc cag tac tgg ggc caa ggc acc act etc аса
Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gin Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
336
gtc tec tea Val Ser Ser 115
345
<210> 17 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220> <221> CDS <222> (1).
(336)
<400> 17
gat gtt ttg atg acc caa act cca etc tec ctg cct gtc agt ctt gga
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
gat caa gcc tec ate tct tgc aga tct agt cag age att gta cat agt
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser
20 25 30
aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
144
cca aag etc ctg ate tac aaa gtt tec aac cga ttt tct ggg gtc cca
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg аса gat ttc аса etc aag ate
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
240
age aga ctg gag get gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly
85 90 95
288
tea cat gtt ccg ttc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
100 105 110
336
<210> 18 <211> 354 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 18
cag gtt сад ttg сад сад tct gga get gag ctg atg aag cca ggg gcc
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
15 10 15
tea gtg aag ata tec tgc aag get act ggc tac аса ttc agt age tec
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
tgg ata gag tgg tta aaa cag agg cct gga cat ggc ctt gag tgg att
Trp lie Glu Trp Leu Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
144
gga gag ttt tta cct gga agt ggt agt аса gac tac aat gag aag ttc
Gly Glu Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
192
aag ggc aag gcc аса ttc act gca gac аса tec tec gac аса gcc tac
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
240
atg eta etc age age ctg аса tct gag gac tct gcc gtc tat tac tgt
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
288
gca act gat ggt aat tat gac tgg ttt get tac tgg ggc caa ggg act
Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
336
ctg gtc act gtc tct gca Leu Val Thr Val Ser Ala 115
354
<210> 19 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 19
gat ctt gtg atg acc caa act cca etc tec ctg cct gtc agt ctt gga
Asp Leu Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
gat caa gcc tec ate tct tgc aga tct agt cag age ctt gta cac agt
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
agt gga gtc acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct
Ser Gly Val Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
144
cca aag etc ctg ate tac aaa gtt tec aac cga ttt tct ggg gtc cca
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg аса gat ttc аса etc aag ate
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
240
age aga gtg gag get gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser
85 90 95
288
аса cat gtt cct ccc acg ttc ggc teg ggg аса aag ttg gaa ata aaa
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
100 105 110
336
<210> 20
<211> 80
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 20
Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gin Gin Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly
15 10 15
Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gin Gin Gly Pro Ala
20 25 30
Ser His His Arg Arg Gin Leu Gly Pro Gin Gly Pro Pro His Leu Val
35 40 45
Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gin Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn
65 70 75 80
<210> 21 <211> 115 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 23 <211> 118 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 23
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly He Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 24 <211> 112 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<213> Homo sapiens <400> 27
Gin Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp
15 10 15
Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 20 25
<210> 28
<211> 5
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 28
Asp Ala Pro Leu Gly 1 5
<210> 29
<211> 6
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 29
Pro Asp Ala Pro Leu Gly 1 5
<210> 30
<211> 7
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 30
Pro Arg Ser Gin Gin Pro Asp 1 5
<210> 31 <211> 9 <212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 31
Trp Lys Pro Arg Ser Gin Gin Pro Asp 1 5
<210> 32
<211> 13
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 32
Trp Lys Pro Arg Ser Gin Gin Pro Asp Ala Pro Leu Gly
1 5 10
<210> 33 <211> 4
Gly Phe He Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5
<210> 39 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 39
Gly Туг Thr Phe Thr Ser Туг Туг 1 5
<210> 40 <211> 9 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 40
Gly Туг Ser Не Thr Ser Asp Туг Ala
<210> 41 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 41
Не Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr 1 5
<210> 42 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 42
Не Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr 1 5
<210> 43 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 43
Не Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5
<210> 44 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 44
Не Ser Phe Ser Gly Tyr Thr 1 5
<210> 45 <211> 10 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 45
Ala Thr Gin Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe 15 10
<210> 46 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 46
Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr 1 5
<210> 47 <211> 10 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 47
Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr 15 10
<210> 48
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 48
Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr 15 10
<210> 49 <211> 11 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 49
Lys Ser Leu Arg His Thr Lys Gly He Thr Phe 15 10
<210> 50
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 50
Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 15 10
<210> 51 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 51
Ser Gin His Arg Thr Tyr Thr 1 5
<210> 52 <211> 3 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 52 Gin Met Ser 1
<210> 53 <211> 3 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 53 Leu Val Ser
<210> 54
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 54
Val Lys Lys Asp Gly Ser His
1 5
<210> 55 <211> 9 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"
<400> 55
Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr 1 5
<210> 56
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид"
<400> 56
Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Gin Thr 1 5
<210> 57
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид"
<400> 57
Trp Gin Gly Thr His Ser Pro Tyr Thr 1 5
<210> 58
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид"
<400> 58
Gly Val Gly Asp Ala He Lys Gly Gin Ser Val Phe Val 15 10
<210> 59
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид"
<400> 59
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 64 <211> 112 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание""Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 64
Asp Val Val Leu Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr He Gly
15 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 65 <211> 112 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 65
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr He Gly
15 10 15
Arg Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
<211> 351 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(351;
<400> 67
gaa gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
tec ctg aaa etc tec tgt gca gcc tct gga ttc act ttc act acc tat
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
gcc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
144
gca acc att agt agt ggt ggt act tac acc tac tat cca gac agt gtg
Ala Thr He Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
192
aag ggt cga ttc acc ate tec aga gac aat gcc aag aac gcc eta tac
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
240
ctg caa atg age agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
288
gca аса cag ggg aat tac tct ttg gac ttc tgg ggc caa ggc acc tct
Ala Thr Gin Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Ser
100 105 110
336
etc аса gtc tec tea Leu Thr Val Ser Ser 115
351
<210> 68 <211> 342 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220> <221> CDS <222> (1) .
(342)
<400> 68
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg cag cct gga ggg
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
tec ctg aaa etc tec tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt age tat
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe He Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
ggc atg tct tgg gtt cgc cag tct cca gac agg agg ctg gag ttg gtc
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ser Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
144
gca agt att aat act ttt ggt gat aga acc tat tat cca gac agt gtg
Ala Ser He Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
192
aag ggc cga ttc acc ate tec aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
240
ctg caa atg acc agt ctg aag tct gag gac аса gcc att tat tac tgt
Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys
85 90 95
288
gca aga ggg acc gga acc tac tgg ggc caa ggc acc act etc аса gtc
Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
336
tec tea Ser Ser
342
<210> 69 <211> 351 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220> <221> CDS <222> (1).
(351:
<400> 69
cag gtc caa ctg сад сад tct ддд get gaa ctg gtg aag cct ggg get
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
15 10 15
tea gtg aag ttg tec tgc aag get tct ggc tac acc ttc acc age tac
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tat atg tac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
144
gga gag att aat cct age aat ggt ggt act aac ttc aat gag aag ttc
Gly Glu He Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
192
aag age aag gcc аса ctg act gta gac aaa tec tec age аса gca tac
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg caa etc age age ctg аса tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
аса aga ggc ggt tac tac ccc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act
Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
336
etc аса gtc tec tea Leu Thr Val Ser Ser 115
351
<210> 70 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание3"Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220> <221> CDS <222> (1).
(363)
<400> 70
gat gtg cag ctt cag gag teg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag
Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin
15 10 15
tct ctg tec etc аса tgc act gtc act ggc tac tea ate acc agt gat
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser He Thr Ser Asp
20 25 30
tat gcc tgg aat tgg ate egg cag ttt cca gga aac aaa ctg gag tgg
Tyr Ala Trp Asn Trp He Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
144
atg ggc tac ata age ttc agt ggt tac act agt tac aac cca tct etc
Met Gly Tyr lie Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
192
aaa agt cga ate tct gtc act egg gac аса tec agg aac caa ttc ttc
Lys Ser Arg He Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gin Phe Phe
65 70 75 80
240
etc cag ttg act tct gtg act act gag gac аса gcc аса tat tac tgt
Leu Gin Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
288
gca aga gag gtc aac tat ggg gac tec tac cac ttt gac tac tgg ggc
Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
336
caa ggc acc att gtc аса gtc tec tea Gin Gly Thr He Val Thr Val Ser Ser
363
115
120
<210> 71 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 71
gac att gtg atg acg cag get gca tec tct aat cca gtc act ctt gga
Asp He Val Met Thr Gin Ala Ala Ser Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
15 10 15
аса tec get tec ate tec tgc agg tct agt aag agt etc cga cat act
Thr Ser Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr
20 25 30
aaa ggc ate act ttt ttg tat tgg tat ctg cag aag cca ggc cag tct
Lys Gly He Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
144
cct cag etc ctg att tat cag atg tec aac ctt gcc tea gga gtc cca
Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc agt age agt ggg tea gga act gat ttc аса ctg aga ate
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg He
65 70 75 80
240
age aga gtg gag get gag gat ttg ggt gtt tat tac tgt get caa aat
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn
85 90 95
288
eta gaa ctt ccg etc acg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa
Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
336
<210> 72 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 72
gat gtt gtg ctg acc cag act cca etc act ttg teg gtt acc att gga
Asp Val Val Leu Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr He Gly
15 10 15
caa cca gcc tec ate tec tgc aag tea agt cag age etc tta gat agt
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
gat gga aag аса tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
144
cca aag cgc eta ate tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct
Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc act ggc agt gga tea ggg аса gat ttc аса ctg aaa ate
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
240
age aga gtg gag get gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly
85 90 95
288
аса cat ttt cct cag acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
336
<210> 73
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 73
gat gtt gtg atg асе cag act cca etc act ttg teg gtt acc att ggg
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr He Gly
15 10 15
cgc cca gcc tec ate tct tgc aag tea agt cag age etc tta gac agt
Arg Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
gat gga aag аса tat ttg tat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
144
cca aag cgc eta ate tat ctg gtg tct gag ctg gac tct gga gtc cct
Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ate act ggc agt ggg teg ggg аса gat ttc аса ctg aag ate
Asp Arg He Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
240
age aga gtg gag get gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa gga
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly
85 90 95
аса cat tct ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa
Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 74 <211> 345 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание3"Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 74
caa ctt gcg etc act cag tea tct tea gcc tct ttc tec ctg gga gcc
Gin Leu Ala Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala
15 10 15
tea gca aaa eta acg tgc act ttg agt agt caa cac aga acg tac acc
Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Arg Thr Tyr Thr
20 25 30
att gaa tgg tat cag caa cag tea etc aag cct cct aag tat gtg atg
He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Ser Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met
35 40 45
144
gag gtt aag aaa gat gga age cac age аса ggt cat ggg att cct gat
Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly His Gly He Pro Asp
50 55 60
192
cgc ttc tct gga tec agt tct ggt get gat cgc tac etc age att tec
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser He Ser
65 70 75 80
240
aac ate cag cct gaa gat gaa gca ata tac ate tgt ggt gtg ggt gat
Asn He Gin Pro Glu Asp Glu Ala He Tyr He Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
288
gca att aag gga caa tct gtg ttt gtt ttc ggc ggt ggc acc aag gtc
Ala He Lys Gly Gin Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
336
act gtc eta Thr Val Leu 115
345
<210> 75 <211> 117 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 75
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser He Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gin Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 76 <211> 112 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 76
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr
20 25 30
Lys Gly He Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> /примечание3"Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"
<400> 89
Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
15 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly
85 90 95
Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 90
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид"
<400> 90
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin
15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser He Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
He Gly Tyr He Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение моноклонального антитела к человеческому прогастрину (hPG) для получения лекарственного средства для лечения и предотвращения рецидива рака печени.
2. Применение по п.1, где моноклональное антитело к hPG представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
3. Применение по п.1, где моноклональное антитело к hPG представляет собой N-терминальное мо-ноклональное антитело.
4. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG связывает эпитоп, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из DAPLG (SEQ ID N0:28), PDAPLG (SEQ ID N0:29), PRSQQPD (SEQ ID N0:30), WKPRSQQPD (SEQ ID N0:31) и WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID N0:32).
5. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG вырабатывается против иммуногена, включающего пептид, который имеет последовательность SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID
N0:25).
6. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG включает:
a) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VH CDR 1.3 (SEQ ID N0:1), CDR2 включает аминокислотную последовательность VH CDR 2.3 (SEQ ID N0:2) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VH CDR 3.3 (SEQ ID N0:3), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VL CDR 1.3 (SEQ ID N0:4), CDR2 включает аминокислотную последовательность VL CDR 2.3 (SEQ ID N0:5) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VL CDR 3.3 (SEQ ID N0:6);
b) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VH CDR 1.4 (SEQ ID N0:7), CDR2 включает аминокислотную последовательность VH CDR 2.4 (SEQ ID N0:8) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VH CDR 3.4 (SEQ ID N0:9), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VL CDR 1.4 (SEQ ID N0:10), CDR2 включает аминокислотную последовательность VL CDR 2.4 (SEQ ID N0:5) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VL CDR 3.4 (SEQ ID N0:11);
c) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VH CDR 1.16 (SEQ ID N0:39), CDR2 включает аминокислотную последовательность VH CDR 2.16 (SEQ ID N0:43) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VH CDR 3.16 (SEQ ID N0:47), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VL CDR 1.16 (SEQ ID N0:50), CDR2 включает аминокислотную последовательность VL CDR 2.16 (SEQ ID N0:53) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VL CDR 3.16 (SEQ ID N0:7); или
d) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VH CDR 1.19 (SEQ ID N0:40), CDR2 включает аминокислотную последовательность VH CDR 2.19 (SEQ ID N0:44) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VH CDR 3.19 (SEQ ID N0:48), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VL CDR 1.19 (SEQ ID N0:51), CDR2 включает аминокислотную последовательность VL CDR 2.19 (SEQ ID N0:54) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VL CDR 3.19 (SEQ ID
N0:58).
7. Применение по п.3, где N-терминальное моноклональное антитело к hPG конкурирует за связывание hPG с эталонным антителом, выбранным из группы:
(a) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:12 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:13;
(b) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:14 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:15;
(c) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:61 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:65;
(d) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:62 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:66.
8. Применение по п.1, где моноклональное антитело к hPG представляет собой С-терминальное мо-ноклональное антитело.
9. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG связывает эпитоп, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из FGRR (SEQ ID N0:33), MDFGR (SEQ ID N0:34) и GWMDFGRR (SEQ ID N0:36).
10. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG вырабатывается против иммуногена, включающего пептид, который имеет последовательность QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID N0:27).
11. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG включает:
10.
a) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VH CDR 1.8 (SEQ ID N0:37), CDR2 включает аминокислотную последовательность VH CDR 2.8 (SEQ ID N0:41) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VH CDR 3.8 (SEQ ID N0:45), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VL CDR 1.8 (SEQ ID N0:49), CDR2 включает аминокислотную последовательность VL CDR 2.8 (SEQ ID N0:52) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VL CDR 3.8 (SEQ ID N0:55); или
b) вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VH CDR 1.13 (SEQ ID N0:38), CDR2 включает аминокислотную последовательность VH CDR 2.13 (SEQ ID N0:42) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VH CDR 3.13 (SEQ ID N0:46), и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 включает аминокислотную последовательность VL CDR 1.13 (SEQ ID N0:50), CDR2 включает аминокислотную последовательность VL CDR 2.13 (SEQ ID N0:53) и CDR3 включает аминокислотную последовательность VL CDR 3.13 (SEQ ID
N0:56).
12. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к hPG конкурирует за связывание hPG с эталонным антителом, выбранным из группы, включающей:
(a) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:59 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:63;
(b) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:60 и последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:64.
mVH МАЬЗ
gag gtt cag etc cag cag tct ggg act gtg ctg gca agg cct ggg get 48
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
15 10 15
tec gtg aag atg tec tgc aag get tct ggc tac ate ttt acc age tac 96
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr He Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tgg gta cac tgg gtt aaa cag agg cct gga cag ggt eta gaa tgg att 144
Trp Val His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
ggt ggt ttt tat cct gga aat agt gat tct agg tac aac cag aaa ttc 192 Gly Gly Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Arg Tyr Asn Gin Lys Phe
aag ggc aag gcc аса ctg act gca gtc аса tec gcc agt act gcc tac 240
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gac etc age age ctg аса aat gag gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
аса aga aga gat agt ccc cag tac tgg ggc caa ggc acc act etc аса 336
Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gin Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
gtc tec tea Val Ser Ser 115
Фиг. 2А
mVL МАЬЗ
gat gtt ttg atg acc caa act cca etc tec ctg cct gtc agt ctt gga
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
gat caa gcc tec ate tct tgc aga tct agt cag age att gta cat agt Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser
20 25 30
aat gga aac acc tat tta Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 40 45
cca aag etc ctg ate tac aaa gtt tec aac cga ttt tct ggg gtc cca 192
Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys:Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg аса gat ttc аса etc aag ate 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
age aga ctg gag get gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly
85 90 95
tea cat gtt ccg ttc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 2В
mVH MAb4
cag gtt cag ttg cag cag tct gga get gag ctg atg aag cca ggg gcc 48
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
15 10 15
tea gtg aag ata tec tgc aag get act ggc tac аса ttc agt age tec 96 Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
tgg ata gag tgg tta aaa cag agg cct gga cat ggc ctt gag tgg att 14 4
Trp He Glu Trp Leu Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
gga gag ttt tta cct gga agt ggt agt аса gac tac aat gag aag ttc 192 Gly Glu Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
aag ggc aag gcc аса ttc act gca gac аса tec tec gac аса gcc tac 240
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg eta etc age age ctg аса tct gag gac tct gcc gtc tat tac tgt 288
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca act gat ggt aat tat gac tgg ttt get tac tgg ggc caa ggg act 336 Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc act gtc tct gca Leu Val Thr Val Ser Ala 115
Фиг. 2С
mVL МАЬ4
gat ctt gtg atg acc caa act cca etc tec ctg cct gtc agt ctt gga
Asp Leu Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
gat caa gcc tec ate tct tgc aga tct agt cag age ctt gta cac agt 96 Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
agt gga gtc acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144
Ser Gly Val Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
cca aag etc ctg ate tac aaa gtt tec aac cga ttt tct ggg gtc cca 192
Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg аса gat ttc аса etc aag ate 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
age aga gtg gag get gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser
85 90 95
аса cat gtt cct ccc acg ttc ggc teg ggg аса aag ttg gaa ata aaa 336 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 2D
mVH MAb8
gaa gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
tec ctg aaa etc tec tgt gca gcc tct gga ttc act ttc act acc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20 - 25 30
gcc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
144
gca acc att agt agt ggt ggt act tac acc tac tat cca gac agt gtg 192 Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
aag ggt cga ttc acc ate tec aga gac aat gcc aag aac gcc eta tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg age agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca аса cag ggg aat tac tct ttg gac ttc tgg ggc caa ggc acc tct 336 Ala Thr Gin Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Ser
100 105 110
etc аса gtc tec tea Leu Thr Val Ser Ser 115
351
Фиг. 2Е
mVL МАЬ8
gac att gtg atg acg cag get gca tec tct aat cca gtc act ctt gga 48
Asp He Val Met Thr Gin Ala Ala Ser Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
15 10 15
аса tec get tec ate tec tgc agg tct agt aag agt etc cga cat act 96 Thr Ser Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr
20 25 30
aaa ggc ate act ttt ttg tat tgg tat ctg cag aag cca ggc cag tct 144
Lys Gly lie Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
cct cag etc ctg att tat cag atg tec aac ctt gcc tea gga gtc cca 192 Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt age agt ggg tea gga act gat ttc аса ctg aga ate 240
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg He
65 70 75 80
age aga gtg gag get gag gat ttg ggt gtt tat tac tgt get caa aat 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn
85 90 95
eta gaa ctt ccg etc acg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa 336 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Фиг. 2F
mVH MAb 13
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg cag cct gga ggg 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
tec ctg aaa etc tec tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt age tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
ggc atg tct tgg gtt cgc cag tct cca gac agg agg ctg gag ttg gtc 144
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ser Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
gca agt att aat act ttt ggt gat aga acc tat tat cca gac agt gtg 192 Ala Ser lie Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc ate tec aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg acc agt ctg aag tct gag gac аса gcc att tat tac tgt 288
Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga ggg acc gga acc tac tgg ggc caa ggc acc act etc аса gtc 336 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
tec tea Ser Ser
342
Фиг. 2G
mVL MAb 13
gat gtt gtg ctg acc cag act cca etc act ttg teg gtt acc att gga
Asp Val Val Leu Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr He Gly
15 10 15
caa cca gcc tec ate tec tgc aag tea agt cag age etc tta gat agt Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
gat gga aag аса tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
cca aag cgc eta ate tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192
Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc act ggc agt gga tea ggg аса gat ttc аса ctg aaa ate 240
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
age aga gtg gag get gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly
85 90 95
аса cat ttt cct cag acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa 336 Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 2Н
mVH MAb 16
cag gtc caa ctg cag cag tct ggg get gaa ctg gtg aag cct ggg get 48
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
15 10 15
tea gtg aag ttg tec tgc aag get tct ggc tac acc ttc acc age tac Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tat atg tac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
gga gag att aat cct age aat ggt ggt act aac ttc aat gag aag ttc 192 Gly Glu lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
aag age aag gcc аса ctg act gta gac aaa tec tec age аса gca tac 240
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg caa etc age age ctg аса tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
аса aga ggc ggt tac tac ccc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
etc аса gtc tec tea Leu Thr Val Ser Ser 115
351
Фиг. 2I
mVL MAb 16
gat gtt gtg atg acc cag act cca etc act ttg teg gtt acc att ggg
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr He Gly
15 10 15
cgc cca gcc tec ate tct tgc aag tea agt cag age etc tta gac agt
Arg Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
gat gga aag аса tat ttg tat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
cca aag cgc eta ate tat ctg gtg tct gag ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ate act ggc agt ggg teg ggg аса gat ttc аса ctg aag ate 240
Asp Arg He Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
age aga gtg gag get gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa gga 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly
85 90 95
аса cat tct ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336
Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 2J
mVH MAb 19
gat gtg cag ctt cag gag teg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag
Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin
15 10 15
tct ctg tec etc аса tgc act gtc act ggc tac tea ate acc agt gat Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp
20 25 30
tat gcc tgg aat tgg ate egg cag ttt cca gga aac aaa ctg gag tgg 144
Tyr Ala Trp Asn Trp He Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
atg ggc tac ata age ttc agt ggt tac act agt tac aac cca tct etc 192 Met Gly Tyr lie Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
aaa agt cga ate tct gtc act egg gac аса tec agg aac caa ttc ttc 240
Lys Ser Arg He Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gin Phe Phe
65 70 75 80
etc cag ttg act tct gtg act act gag gac аса gcc аса tat tac tgt 288
Leu Gin Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga gag gtc aac tat ggg gac tec tac cac ttt gac tac tgg ggc 336 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
caa ggc acc att gtc аса gtc tec tea Gin Gly Thr He Val Thr Val Ser Ser 115 120
Фиг. 2K
363
mVL MAb 19
caa ctt gcg etc act cag tea tct tea gcc tct ttc tec ctg gga gcc 48
Gin Leu Ala Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala
15 10 15
tea gca aaa eta acg tgc act ttg agt agt caa cac aga acg tac acc 96 Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Arg Thr Tyr Thr
20 25 30
att gaa tgg tat cag caa cag tea etc aag cct cct aag tat gtg atg 144
He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Ser Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met
35 40 45
gag gtt aag aaa gat gga age cac age аса ggt cat ggg att cct gat 192 Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly His Gly He Pro Asp
50 55 60
cgc ttc tct gga tec agt tct ggt get gat cgc tac etc age att tec 240
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser He Ser
65 70 75 80
aac ate cag cct gaa gat gaa gca ata tac ate tgt ggt gtg ggt gat 288
Asn He Gin Pro Glu Asp Glu Ala He Tyr He Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
gca att aag gga caa tct gtg ttt gtt ttc ggc ggt ggc acc aag gtc 336 Ala lie Lys Gly Gin Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
act gtc eta Thr Val Leu 115
345
Фиг. 2L
Фиг. 3С
Фиг. 3Е
Фиг. 3G
Фиг. 3Н
Фиг. 3J
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 3L
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 3N
Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Фиг. 3P
Фиг. 3S
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Фиг. 3U
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Фиг. 3W
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Фиг. 3Y
Фиг. 13В
*р <0,0267, двусторонний критерий Стьюдента
Фиг. 15В
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028515
028515
- 1 -
- 1 -
028515
028515
- 2 -
- 1 -
028515
028515
- 4 -
- 3 -
028515
028515
- 22 -
028515
028515
- 25 -
- 25 -
028515
028515
- 34 -
- 34 -
028515
028515
- 35 -
- 35 -
028515
288
028515
- 39 -
- 40 -
028515
288
028515
- 39 -
- 40 -
028515
288
028515
- 39 -
- 40 -
028515
288
028515
- 39 -
- 40 -
028515
288
028515
- 39 -
- 40 -
028515
028515
- 42 -
- 42 -
028515
028515
- 43 -
- 43 -
028515
028515
- 46 -
- 46 -
028515
028515
- 47 -
- 47 -
028515
028515
- 58 -
- 58 -
028515
028515
- 58 -
- 58 -
028515
028515
- 59 -
- 59 -
028515
028515
- 59 -
- 59 -
028515
028515
- 59 -
- 59 -
288
028515
288
028515
- 60 -
- 60 -
288
028515
288
028515
- 60 -
- 60 -
288
028515
288
028515
- 60 -
- 60 -
028515
028515
- 61 -
- 61 -
028515
028515
- 61 -
- 61 -
028515
028515
- 62 -
- 62 -
336
028515
336
028515
- 63 -
- 63 -
028515
028515
- 64 -
- 64 -
028515
028515
- 81 -
- 81 -
028515
028515
- 83 -
- 83 -
028515
028515
- 85 -
- 84 -
028515
028515
- 87 -
- 87 -
028515
028515
- 88 -
- 88 -
028515
028515
- 88 -
- 88 -
028515
028515
- 89 -
- 89 -
028515
028515
- 98 -
- 98 -
028515
028515
- 99 -
- 99 -
028515
028515
- 100 -
- 100 -
028515
028515
- 101 -
- 101 -
028515
028515
- 102 -
- 102 -