EA 028491B1 20171130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/028491 Полный текст описания [**] EA201490631 20101006 Регистрационный номер и дата заявки US61/278,343 20091006 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EAB1 Код вида документа [PDF] eab21711 Номер бюллетеня [**] СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ МОЛЕКУЛЫ CTLA4Ig Название документа [8] C12N 5/07, [8] C07K 14/705, [8] C07K 19/00 Индексы МПК [US] Цзин Ин, [US] Ли Чжэнцзянь, [US] Цянь Юэмин Сведения об авторах [US] БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ КАМПАНИ Сведения о патентообладателях [US] БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ КАМПАНИ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000028491b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ культивирования клеток для получения гликозилированной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig, включающий: а) культивирование клеток СНО, которые продуцируют указанную молекулу CTLA4Ig в культуре клеток в условиях, которые обеспечивают получение белка; б) питание клеток питательной средой, содержащей дексаметазон, причем концентрация дексаметазона поддерживается в культуре клеток в пределах от 0,1 до 10 мкМ; при этом молекула CTLA4Ig представляет собой слитую молекулу мутантного внеклеточного домена антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и иммуноглобулина (Ig) и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 26/27-383 аминокислотным остаткам последовательности SEQ ID NO: 4.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Способ культивирования клеток для получения гликозилированной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig, включающий: а) культивирование клеток СНО, которые продуцируют указанную молекулу CTLA4Ig в культуре клеток в условиях, которые обеспечивают получение белка; б) питание клеток питательной средой, содержащей дексаметазон, причем концентрация дексаметазона поддерживается в культуре клеток в пределах от 0,1 до 10 мкМ; при этом молекула CTLA4Ig представляет собой слитую молекулу мутантного внеклеточного домена антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и иммуноглобулина (Ig) и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 26/27-383 аминокислотным остаткам последовательности SEQ ID NO: 4.


Евразийское 028491 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201490631
(22) Дата подачи заявки
2010.10.06
(51) Int. Cl.
C12N 5/07 (2010.01) C07K14/705 (2006.01) C07K19/00 (2006.01)
(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
ГЛИКОЗИЛИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ МОЛЕКУЛЫ CTLA4Ig
(31) 61/278,343; 12/897,857
(32) 2009.10.06; 2010.10.05
(33) US
(43) 2016.05.31
(62) 201270469; 2010.10.06 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ
КАМПАНИИ (US)
(72)
Изобретатель:
Цзин Ин, Ли Чжэнцзянь, Цянь Юэмин (US)
(74)
Представитель: Дементьев В.Н. (RU)
(56)
US-A1-20020182211 WO-A1-1992003535 XIA M. ET AL.: "Dexamethasone enhances CTLA-4 expression during T cell activation", CMLS CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, vol. 55, no. 12, September 1999 (1999-09), pages 1649-1656, XP002623479, ISSN: 1420-682X, the whole document
COUGHLAN CM. ET AL.: "The biochemical consequences of alpha2,6(N) sialyltransferase induction by dexamethasone on sialoglycoprotein expression in the rat H411e hepatoma cell line", FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 413, no. 2, 18 August 1997 (1997-08-18), pages 389-393, XP004261294, ISSN: 0014-5793, DOI: DOI:10.1016/S0014-5793(97)00923-X * abstract, page 389, right-hand column, last paragraph - page
393
VANDAMME VALERIE ET AL.: "Transcriptional induction of beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase in rat fibroblast by dexamethasone", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 211, no. 1-2, 1993, pages 135-140, XP002623480, ISSN: 0014-2956 * abstract, page 135, right-hand column, paragraph 2 - page 136, left-hand column, paragraph 2; figures 1, 2, page 138, right-hand column, paragraph 1
LIPSCOMB M.L. ET AL.: "Production of a secreted glycoprotein from an inducible promoter system in a perfusion bioreactor", BIOTECHNOLOGY PROGRESS SEPTEMBER/OCTOBER 2004, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY US, vol. 20, no. 5, September 2004 (2004-09), pages 1402-1407, XP002623481, page 1403 -page 1404, left-hand column; figures 1, 2; table 1
WO-A2-0105956
AU-A1-2004201287
LINSLEY P.S. ET AL.: "IMMUNOSUPPRESSION
IN VIVO BY A SOLUBLE FORM OF THE CTLA-4 T CELL ACTIVATION MOLECULE", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, WASHINGTON, DC;
US, vol. 257, no. 5071, 7 August 1992 (1992-08-07),
pages 792-795, XP002021688, ISSN: 0036-8075, DOI:
DOI:10.1126/SCIENCE.1496399, Reference/Note number 14 (right column second paragraph from bottom on page
974)
BORK K. ET AL.: "Increasing the sialylation
of therapeutic glycoproteins: the potential of
the sialic acid biosynthetic pathway", JOURNAL
OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION, WASHINGTON,
US, vol. 98, no. 10, 1 October 2009 (2009-10-01),
pages 3499-3508, XP002572996, ISSN: 0022-3549,
DOI:DOI:10.1002/JPS.21684 [retrieved on 2009-02-06], the whole document
QIAN YUEMING ET AL.: "Glucocorticoid Receptor-Mediated Reduction of IgG-Fusion Protein Aggregation in Chinese Hamster Ovary Cells", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 26, no. 5, September 2010 (2010-09), pages 1417-1423, XP002623482, the whole document
JING YING ET AL.: "Sialylation Enhancement of CTLA4-Ig Fusion Protein in Chinese Hamster Ovary
Cells by Dexamethasone", BIOTECHNOLOGY AND
BIOENGINEERING, vol. 107, no. 3, October 2010
(2010-10), pages 488-496, XP002623483, the whole
document
Область техники
Настоящее изобретение относится к новым способам культивирования клеток млекопитающих, которые продуцируют белковый продукт, предпочтительно гликозилированный белковый продукт. Осуществление способов культивирования клеток приводит к высокой жизнеспособности клеток и может также приводить к высокому качеству продукта и производительности, увеличению фазы роста и снижению смертности в фазе гибели.
Уровень техники
Культура клеток животных, в частности культура клеток млекопитающих, предпочтительно используется для экспрессии рекомбинантно продуцируемых, гликозилированных белков для терапевтического и/или профилактического применения. Паттерны гликозилирования рекомбинантных гликопро-теинов имеют большое значение, поскольку олигосахаридные боковые цепи гликопротеинов влияют на функцию белка, а также внутримолекулярные взаимодействия между различными участками белка. Такие внутримолекулярные взаимодействия принимают участие в конформации белка и третичной структуре гликопротеина (см., например, A. Wittwer и соавт., 1990, Biochemistry, 29:4175-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell Biol, 4:1017-1023; Goochee и соавт., 1991, Bio/Technol, 9:1347-1355; и R.B. Parekh 1991, Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). Кроме того, олигосахариды могут функционировать для нацеливания определенного полипептида к определенным структурам на основе специфических клеточных углеводных рецепторов (М.Р. Bevilacqua и соавт., 1993, J. Clin. Invest., 91:379-387; R.M. Nelson и соавт., 1993, J. Clin. Invest, 91:1157-1166; KЈ. Norgard и соавт., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072; и Y. Imai и соавт., 1993, Nature, 361-555-557).
Терминальный компонент сиаловой кислоты олигосахарида боковой цепи гликопротеина, как известно, оказывает влияние на многочисленные характеристики и свойства гликопротеина, включая абсорбцию, растворимость, термостойкость, период полураспада в сыворотке, выведение из сыворотки, а также его физическо-химическую структуру/поведение и его иммуногенность (А. Varki, 1993, Glycobiol-ogy, 3:97-100; R.B. Parekh, Id, Goochee и соавт., Id., J. Paulson и соавт., 1989, TIBS, 14:272-276; и A. Ko-bata, 1992, Em. J. Biochem., 209:483-501; E.Q. Lawson и соавт., 1983, Arch. Biochem. Biophys., 220:572575; и Е. Tsuda и соавт., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411).
Количество сиаловой кислоты в гликопротеинах зависит от двух противоположных процессов: внутриклеточных добавлений сиаловой кислоты с помощью действия сиалилтрансферазы и внеклеточное удаление сиаловой кислоты с помощью расщепления сиалидазой.
Внутриклеточное добвление сиаловой кислоты является последним этапом процесса гликозилирования, который протекает в транс-Гольджи. Данный процесс включает в себя ферментативный перенос сиаловой кислоты от нуклеотида предшественника сахара, СМР-сиаловую кислоту к доступной галактозе на развивающейся структуре гликана, которая прикреплена к вновь синтезированному белку. Возможные ограничения в процессе, которые могут привести к неполному сиалированию, включают наличие СМР-сиаловой кислоты, действие фермента сиалилтрансферазы, количество галактозы на развивающейся структуре гликана и действие фермента галактозиалтрансферазы. Значительное количество исследований было направлено на максимальное увеличение сиалирования посредством сверхэкспрессии гена и усиления ферментной активности сиалилтрансферазы и гликозилтрансферазы. Zhang и совт. (Biochim Biophys Acta 1425(3): 1998, 441-52) сообщают, что экспрессия человеческой а2,6-сиалилтрансферазы в клетках СНО с образованием тканевого активатора плазминогена (tPA) усиливает а2,6-сиалирование tPA. Weikert и соавт. (Nat Biotechnol 17(11): 1999, 1116-21) сообщают, что коэкспрессия а2,6-сиалилтрансферазы и р1,4-галактозилтрансферазы вызывает более чем 90% сиалирования TNK-tPA и TNFR-IgG. Кроме того, добавки с соответствующим количеством марганца (Mn2+), кофактора для Р1,4-галактозилтрансферазы, значительно снижают количество rHuEPO в нижней сиалированной фракции, повышают заполнение углеводных сайтов и уменьшают разветвление углеводов (Zhang и соавт. 1998) по отношению к биантенным структурам в этих низших сталированных видах (Crowell и соавт. Biotechnol
Bioeng 96(3):538-49, 2007).
Количество сиаловой кислоты в гликопротеинах также зависит от внеклеточного удаления сиало-вой кислоты путем расщепления сиалидазой. Gramer и Goochee (Biotechnol Prog 9(4):366-73, 1993) показали увеличение лактатдегидрогеназы (LDH), что означает увеличение лизиса клеток, связанное с увеличением активности внеклеточной сиалидазы в перфузионных культурах СНО. Gu и соавт. ( Biotechnol Bioeng 55(2):390-8, 1997) также показали заметную потерю терминальной сиаловой кислоты интерферо-на-у (IFN-y) совместно со снижением жизнеспособности клеток СНО и сопутствующим увеличением гибели клеток на протяжении длительного периодического культивирования.
Таким образом, важно замедлить начало гибели клеток и улучшить жизнеспособность клеток для уменьшения или предотвращения этого эффекта деградации.
Как правило, уровни экспрессии белка в системах на основе культур клеток млекопитающих значительно ниже, чем в микробных системах экспрессии, например, системах экспрессии на основе бактерий или дрожжевых грибов. Однако клетки бактерий и дрожжевых грибов ограничены в своей способности оптимальной экспрессии высокомолекулярных белковых продуктов, правильной укладки белка, имею
щего сложную пространственную структуру, и/или обеспечения необходимых посттрансляционных модификаций для созревания экспрессированного гликопротеина, тем самым влияя на иммуногенность и скорость клиренса продукта.
В результате ограничений культивирования клеток животных или млекопитающих, в частности клеток животных и млекопитающих, которые производят рекомбинантные продукты, были исследованы манипуляции различными параметрами, включая использование сосудов для культивирования большого размера; изменение основных условий культивирования, таких как температура инкубации, концентрация растворенного кислорода, рН, и т.п.; использование различных типов среды и добавок к среде; и увеличение плотности культивируемых клеток. Кроме того, усовершенствование способа культивирования клеток млекопитающих помогает в достижении способности к увеличению периода работы для увеличения концентрации конечного продукта с сохранением при этом высокого качества продукта. Важным параметром качества продукта является степень и завершенность гликозилирования структуры полипептидного продукта, содержание сиаловой кислотой широко используют в качестве показателя качества гликопротеина.
Продолжительность способов культивирования клеток, в особенности прерывистых способов, обычно ограничена оставшейся жизнеспособностью клеток, которая, как правило, снижается в ходе проведения. Поэтому желательно обеспечить максимально возможное продление высокой жизнеспособности клеток. Проблемы качества продукта также являются основанием для минимизации снижения плотности жизнеспособных клеток и поддержания высокой жизнеспособности клеток, в то время как гибель может высвобождать сиалидазы в надосадочную жидкость культуры, что может снижать содержание сиаловой кислоты экспрессированного белка. Проблемы очистки белка являются еще одним основанием для минимизации снижения плотности жизнеспособных клеток и поддержания высокой жизнеспособности клеток. Наличие клеточного дебриса и содержание мертвых клеток в культуре может негативно влиять на способность к выделению и/или очистке белкового продукта в конце периода культивирования. Поддерживание жизнеспособности клеток в течение длительного времени в культуре, таким образом, сопутствует уменьшению загрязнения культуральной среды клеточными белками и ферментами, например, клеточными протеазами и сиалидазами, которые могут привести к деградации и окончательной потери качества желаемого гликопротеина, продуцируемого клетками.
Различные параметры были исследованы для достижения высокой жизнеспособности клеток в культурах клеток. Один параметр включает разовое снижение температуры культивирования после начального культивирования при 37°С (например, Roessler и соавт., 1996, Enzyme and Microbial Technology, 18:423-427; патенты США № 5705364 и 5721121 Т. Etcheverry и соавт., 1998; патент США № 5976833 K. Furukawa и соавт., 1999; патент США № 5851800 L. Adamson и соавт.; WO 99/61650 и WO 00/65070 Genentech, Inc.; WO 00/36092 Biogen, Inc.; и патент США № 4357422 Girard и соавт.).
Другие исследованные параметры включали добавление компонентов к культуре. Ингибитор фактора роста сурамин, как было показано, предотвращает апоптоз во время экспоненциального роста клеток КСусЕ СНО (Zhangi и соавт., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325). Однако сурамин не защищает против апоптоза в фазе гибели. В результате, сурамин был способен поддерживать высокую жизнеспособность в фазе роста, но не позволял продлить продолжительность жизни культуры. Те же авторы сообщают, что для клеточной линии 111-10PF СНО сульфат декстрана и сульфат поливинила могут, подобно сурамину, увеличить 3 дневную плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность по сравнению с контрольной культурой. Однако о влиянии сульфата декстрана или сульфата поливинила в фазе гибели не сообщается. Также сообщается, что сурамин, сульфат декстрана и сульфат поливинила являются эффективными в предотвращении агрегации клеток.
Влияние дополнения среды культуры клеток насекомых дексаметазоном или N-ацетилманносарнином на комплексное гликозилирование белков, включая добавление терминальной сиаловой кислоты к N-связанным олигосахаридам, приготовленных с помощью экспрессионной векторной системы на основе бакуловируса (BEVS), описаны в патенте США № 6472175 Воусе Thompson Institute For Plant Research, Inc. (Ithaca, NY), 2002.
Белковые терапевтические средства являются по существу гетерогенными в связи с их размерами, сложностью структуры и характером биологического получения (Chirino и Mire-Sluis, Nat Biotechnol. 2004; 22:1383-1391). Даже в растворе "чистого" белка будет существовать определенный процент низкомолекулярных фрагментов, высокомолекулярных соединений и различные степени химических модификаций. Образование высокомолекулярных соединений обычно связано с агрегацией белка, которая является общей проблемой, встречающейся при производстве биопрепаратов. Как правило, наличие агрегатов считается нежелательным по причине опасения того, что агрегаты могут привести к иммуногенной реакции или могут вызывать побочные явления при введении (Cromwell и соавт, AAPS J. 2006; 8:Е572-579). Хотя некоторые типы агрегатов биопрепаратов могут действовать нормально, это остается важным для сохранения однородности в качестве продукта, поскольку однородность продукта является необходимым условием для разрешения контролирующего органа.
Агрегаты белков могут появляться с помощью нескольких механизмов и встречаться на каждом этапе в ходе способа изготовления. В культуре клеток секретируемые белки могут подвергаться воздей
ствию условий, которые неблагоприятны для стабильности белка; но чаще всего, накопление больших количеств белка может привести к внутриклеточной агрегации вследствие любых взаимодействий развернутых белковых молекул или к неспособности распознавания появляющейся цепи пептида молекулярными шаперонами, ответственными за надлежащую укладку (Cromwell и соавт., AAPS J. 2006; 8:Е572-579). В эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клеток дисульфидная связь вновь синтезированного белка формируется в окислительной среде. При нормальных условиях сульфгидрильные группы белка обратимо окисляются до протеиндисульфидов и сульфеновых кислот, но наиболее высокоокисленные структуры, такие как сульфиновые и сульфоновые кислотные формы цестеинов белка являются необратимыми (Thomas и Mallis, Exp Gerontol. 2001; 36:1519-1526). Сверхокисленные белки могут содержать неправильные дисульфидные связи или иметь смешанные дисульфидные связи с другими относящимися к ЭР белками; в любом случае, это приводит к неправильной укладке белка и агрегации. Поэтому важно для сохранения свойств контролировать окислительную среду в ЭР. В связи с этим, Cuozzo и Kaiser (Nat Cell Biol. 1999; 1:130-135) с самого начала показали, что в дрожжевых грибах глютатион буферизировал против сверхокисления ЭР и позже Chakravarthi и Bulleid (J Biol Chem. 2004; 279:39872-39879) подтвердили, что глютатион в клетках млекопитающих также необходим для регуляции формирования природных дисульфидных связей в белках, вступающих на секреторный путь.
С увеличением концентрации продукта в культуре, как можно наблюдать в способах культивирования клеток, качество продукта снижается, как установлено измерением содержания сиаловой кислоты гликоструктуры олигосахарида. Как правило, существует нижний предел допустимого содержания сиа-ловой кислоты, что установлено исследованиями выведения лекарственных веществ. Высокий избыток белка, произведенного клетками в культуре, оптимально сопровождается высоким качеством белка, который в конечном итоге восстанавливают для использования по назначению.
Рекомбинантно полученные белковые продукты, которые правильно гликозилированы, становятся все более медицински и клинически важными для использования в качестве терапевтических, лечебных и профилактических средств. Таким образом, разработка надежных способов культивирования клеток, которые экономично и эффективно достигают увеличения концентрации конечного белкового продукта, в сочетании с высоким уровнем качества продукта, такого, который определяется содержанием сиаловой кислоты, выполняет как желательную, так и необходимую задачу в уровне технике.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к новым способам получения белков, предпочтительно рекомби-нантных белковых продуктов, более предпочтительно гликопротеиновых продуктов, с помощью культур клеток животных или млекопитающих. Эти новые способы обеспечивают увеличение плотности жизнеспособных клеток на поздней фазе, жизнеспособности клеток, продуктивности и содержания сиаловой кислоты и снижение агрегации белка.
Один из аспектов данного изобретения касается добавления глюкокортикоида, в частности декса-метазона, к среде. В этом аспекте способ культивирования клеток по данному изобретению может успешно обеспечить увеличение удельной продуктивности, например, гликопротеина, в частности глико-зилированной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig, которая представляет собой слитую молекулу му-тантного внеклеточного домена антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и иммуноглобулина (Ig), а также увеличение содержания сиаловой кислоты гликопротеина, продуцируемого культурой клеток. Более конкретно, в соответствии с данным изобретением, добавление глюкокортикоида в течение периода культивирования клеток поддерживает высокую жизнеспособность клеток в культуре и может обеспечивать высокое качество и количество получаемого продукта в продолжение всего способа культивирования. Кроме того, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, добавление глюко-кортикоида в способе культивирования может позволить успешно продлить продуктивную фазу культивирования (фазу продукции). В способе продления фазы продукции титр целевого продукта увеличивается; качество продукта, которое характеризуется содержанием сиаловой кислоты, поддерживается на высоком уровне; уровень агрегации белка поддерживается на низком уровне, а жизнеспособность клеток также поддерживается на высоком уровне. Кроме того, продление фазы продукции, связанной со способами культивирования изобретения, позволяет получать продукт сверх того, который продуцируется в течение стандартной фазы продукции.
В одном конкретном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ, в котором удельная продуктивность увеличена, уровень агрегации белка снижен и содержание сиаловой кислоты получаемого гликопротеина увеличено с помощью добавления глюкокортикоида. В соответствии с данным аспектом добавление глюкокортикоида поддерживает высокую жизнеспособность клеток в культуре, тем самым позволяя продлить фазу продукции, в течение которой титр продукта, предпочтительно гликозилирован-ной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig, возрастает, а качество продукта, которое характеризуется содержанием сиаловой кислоты, поддерживается на высоком уровне. Добавление глюкокортикоида может минимизировать преобладающее соотношение между титром белка и содержанием сиаловой кислоты при получении продукта во время способа культивирования клеток. Таким образом, добавление глюко-кортикоида оказывает положительный эффект на усовершенствование важного параметра качества способа культивирования, т.е. математического продукта "конечный (т.е. последний) титр" х "конечная (т.е.
последнее) сиаловая кислота" X "содержание мономера" ("конечный титр х конечная сиаловая кислота" х "конечное содержание мономера").
В одном аспекте данного изобретения глюкокортикоидное соединение добавляют к культуре во время посева или после посева, т.е. перед началом начальной фазы гибели или в течение начальной фазы роста, или в течение второй половины начальной фазы роста, или в или почти в конце начальной фазы роста. В соответствии с данным аспектом изобретения фаза роста увеличивается и/или начало фазы гибели задерживается на определенный период времени, а именно на несколько дней.
В другом предпочтительном аспекте данного изобретения, и как далее описано в данном изобретении, способ культивирования клеток для получения гликозилированной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig включает питание клеток питательной средой, содержащей дексаметазон, причем концентрация дексаметазона поддерживается в культуре клеток в пределах от 0,1 до 10 мкМ.
В другом предпочтительном аспекте данного изобретения, и как далее описано в данном изобретении, недавно разработанные способы культивирования клеток, включающие добавление глюкокортико-идного соединения, особенно подходят для получения растворимых молекул CTLA4 и растворимых му-тантных молекул CTLA4, таких как CTLA4Ig, с помощью генно-инженерных клеток-хозяев для экспрессии и получения данных белков. Предпочтительные варианты настоящего изобретения включают культивирование клеток, продуцирующих CTLA4Ig, при наличии добавленного глюкокортикоидного соединения в ходе способа культивирования для достижения больших объемов высококачественных продуктов CTLA4Ig, что определяется с помощью измерения сиаловой кислоты и/или низкой агрегации белка конечных продуктов.
Другие аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут оценены после чтения подробного описания сущности изобретения и рассмотрения чертежей/фигур.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана эспрессия р1,4-галактозилтрансферазы (1А) и а2,3-сиалилтрансферазы (1В), обычно возрастающая с концентрацией дексаметазона (DEX) в DEX обработанных клетках, как описано в примере 1. DEX был добавлен на 2-й день после посева к культурам в концентрациях от 0,1 до 10 мкМ. На пятый день после посева образцы клеток были собраны и все клеточные лизаты были приготовлены, разделены на 4-15% градиентным гелем и исследованы с антителом для каждой гликотрансферазы. Пятно затем повторно зондировали антителом бета-актина для определения соответствующей загрузки.
На фиг. 2 показано защитное воздействие DEX на клетки, приводящее к снижению активности сиа-лидазы в надосадочной жидкости культуры, как описано в примере 1. Профили жизнеспособности клеток (2А) и абсорбции исследуемой сиалидазы (2В) в ходе периода культивирования между обработкой DEX и необработанными культурами. Обработанные DEX в концентрациях от 1 мкМ производили на 2 день. Значения отражают среднюю величину и стандартное отклонение данных из пяти экспериментов.
На фиг. 3 показаны улучшения в сиалировании гликопротеина в обработанных культурах с аналогами глюкокортикоида, гидрокортизоном (HYC) и преднидозолоном (PRD), как описано в примере 1. Нормализированное общее содержание сиаловой кислоты (3А) и нормализированная фракция N-связанных сталированных видов (3В) культур, обработанных с DEX, HYC и PRD соответственно. Обработку начинали на второй день после посева в концентрации 0,1, 1 и 10 мкМ в среду для каждого соединения. Значения каждого параметра представлены как средняя величина±различие/2 (n=2).
На фиг. 4 показано, что повышение сиалирования с помощью DEX было блокировано с помощью антагониста глюкокортикоида RU-486, как описано в примере 1. Нормализированное общее содержание сиаловой кислоты (4А) и нормализированная фракция N-связанных сталированных видов (4В) в присутствии и отсутствии RU-486. RU-486 при 0 или 1 мкМ вносили в суспензию культуры клеток через 48 ч после посева. DEX 0,1, 1 и 10 мкМ затем добавляли в культуры через 24 ч. Значения каждого параметра представлены как средняя величина±различие/2 (n=2).
На фиг. 5 показано, что обработка DEX клеток СНО культур с подпиткой в 5-л биореакторах приводит к увеличению содержания сиаловой кислоты и сталированных видов фракций, как описано в примере 1. Нормализированное общее содержание сиаловой кислоты (5А) и нормализированная фракция N-связанных сталированных видов (5В) от необработанной и обработанной культур в способе культивирования. Значения каждого параметра представлены как средняя величина+среднее отклонение (n=3). Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.
На фиг. 6 показана способность DEX к улучшению сиалирования гликопротеина при 7, 10 и 20 л масштабе биореакторов, как описано в примере 1. Нормализированная общая сумма молярного соотношения сиаловой кислоты против нормализированной сиалированной фракции обработанных и необработанных DEX культур от различных периодов суммируются. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.
На фиг. 7 показан процент снижения высокомолекулярных (HVM) видов в IgG-слитых белках, продуцируемых клетками СНО, обработанными дексаметазоном (DEX), как описано в примере 2. На фиг. 7А все клетки первоначально были культивированы вместе в одной колбе в течение двух дней, а
затем разделены на две группы, причем половина из них получала одну дозу DEX в конечной концентрации 1 мкМ в основной среде. Надосадочные жидкости собирали на 10 день и очищали прежде SEC-ВЭЖХ методом для определения процента HVM видов. Точки на графике означают (+S.D.) результаты от пяти встряхиваемых колб в одном эксперименте. **Р < 0.01 по сравнению с контролем (CON). На 7B DEX при различных концентрациях добавляли к культурам клеток СНО на 2 день и собирали надосадоч-ные жидкости на 10 день. Точки на графике означают результаты, полученные от дублирующих колб. На 7С все культуры производили одновременно, но 1 мкМ DEX добавляли в различные дни, давая различное время инкубации, как указано, тогда как клетки собирали одновременно на 10 день. Точки на графике означают результаты от дублирующих колб.
На фиг. 8 показано повышение экспрессии глутатионредуктазы в клетках СНО, обработанных дек-саметазоном (DEX), как описано в примере 2. DEX при различных концентрациях добавляли к культурам клеток в день посева и образцы клеток собирали на 5 день. Полные клеточные лизаты были разделены на 4-15% градиентном геле. После определения глутатионредуктазы, одинаковые пятна были использованы для определения р-актина для сравнения загрузки образцов.
На фиг. 9 показано снижение процентного содержания видов HVM в IgG-слитых белках, инкубированных с GSH in vitro, как описано в примере 2. Восстановленный глутатион (GSH) при 0, 1 и 3 мМ конечных концентраций добавляли к трис-ацетатному буферу (рН 7.5) раствора очищенных IgG-слитых белков и смешанные GSH и белки инкубировали при 37°С в течение 1 ч перед SEC-ВЭЖХ методом. Точки на графике означают (+S.D.) четыре определения из двух экспериментов. *Р < 0.05 по сравнению с контролем (0 мМ GSH).
На фиг. 10 показано ослабление эффектов дексаметазона (DEX) в присутствии антагониста рецептора глюкокортикоида RU-486, как описано в примере 2. На фиг. 10A все клеточные лизаты приготовлены из необработанных клеток HepG-2 и СНО и разделены на 4-15% градиентном геле. Образец HepG-2 использовали в качестве контроля человеческого происхождения для цели подтверждения первичных антител. На фиг. 10В RU-486 в 1 мкМ вводили в однодневную культуру после посева (1 день) и предварительно обработанные RU-486 клетки СНО разделяли на 2 день, причем половина из них получала одну дозу DEX при конечной концентрации 0.1 мкМ в основную среду. Образцы клеток собирали на 10 день; все другие процедуры были такими же, как на фиг. 2. На фиг. 10С RU-486 при 1 мкМ вводили в культуры на 1 день, a DEX затем добавляли к RU-486-предварительно обработанным культурам в конечной концентрации любой из 0.1 или 1 мкМ на 2 день. Точки на графике означают результаты от дублирующих колб.
На фиг. 11 показано, что клеточная гибель ингибируется с помощью DEX в культурах клеток СНО в среде, не содержащей сыворотки, как описано в примере 3. Доза-зависимая кривая эффектов DEX на плотность жизнеспособных клеток (11А) и жизнеспособность (11В) с обработкой, начатой на 2 день. Кривая зависимости от времени эффекта DEX на плотность жизнеспособных клеток (11С) и жизнеспособность (11D) с 1 мкМ обрабатываемой концентрацией. Каждое значение означает данные, полученные от экспериментов, проведенных в двух повторах.
На фиг. 12 показано снижение удельной скорости роста клеток СНО, в то время как удельная продуктивность клеток повышается с помощью DEX, как описано в примере 3. Эффекты DEX на удельную скорость роста клеток СНО (12А), нормализированная волюметрическая продуктивность (12В). Обработку DEX начинали на 2 день. Значения отражают среднее значение и стандартное отклонение данных от пяти экспериментов. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.
На фиг. 13 показано, что повышенная регуляция антиапоптотического гена GILZ в DEX-обработанных клетках СНО была подтверждена с помощью qRT-ПЦР и Вестерн-блоттингом, как описано в примере 3. (13А) DEX добавляли в утроенные культуры на 2 день после посева в конечной концентрации 0 и 1 мкМ соответственно. Образцы мРНК были извлечены на 5 и 8 дни после посева. Значения каждого параметра представлены как средняя величина+среднее отклонение (n=3). (13B) DEX добавляли в утроенные культуры на 2 день после посева в конечной концентрации 0 и 1 мкМ соответственно. Образцы клеток собирали и все клеточные лизаты приготавливали на 5 и 8 дни после посева.
На фиг. 14 показано подавление гибели под влиянием дексаметазона, включая GILZ и рецептор глюкокортикоида, как описано в примере 3. Процентное повышение (по сравнению с отсутствием обработки DEX) конечной жизнеспособности (14А), кратное измерение экспрессии гена GILZ (14B) и индуцированной экспрессии белка GILZ с помощью DEX (14C) в присутствии и отсутствии RU-486. RU-486 при 0 или 1 мкМ вводили в суспензию культуры клеток через 48 ч после посева, 0, 0,1 и 1 мкМ DEX затем добавляли в культуры спустя 24 ч. Клетки собирали для жизнеспособности, qRT-ПЦР и Вестерн-блоттинг-анализа. Каждое значение, представленное на панели А, представляет собой среднее значение данных, полученных от экспериментов, проведенных в двух повторах. Каждое значение, представленное на панели В, представляет собой среднее значение и стандартное отклонение данных, полученных от экспериментов, проведенных в трех посторах.
На фиг. 15 показано, что обработка DEX клеток СНО культуры с подпиткой в 10-л биореакторах
приводит к улучшению VCD, жизнеспособности, титра и молярного соотношения сиаловой кислоты, как описано в примере 3. Плотность жизнеспособных клеток (15А), жизнеспособность (15В) и нормализированный титр (15С) профили необработанных культур и обработанных культур с DEX, начало обработки на 2 и 7 день. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение.
На фиг. 16 показаны эффекты DEX на клеточный рост клеток СНО культуры с секрецией CTLA4Ig. Доза-зависимые кривые эффекта DEX на плотность жизнеспособных клеток (16А) и жизнеспособность (16В), обработанных с DEX в конечной концентрации 0, 0,001, 0,01, 1 и 10 мкМ соответственно. Обработку начинают на второй день после посева, и каждое значение представляет собой среднюю величину данных, полученных от экспериментов, проведенных в двух повторах.
На фиг. 17 показаны влияния DEX на молярное соотношение сиаловой кислоты и уровень HMW CTLA4Ig. На фигуре показаны общее молярное соотношение сиаловой кислоты (17А) и видов HMW (17B) культур клеток, обработанных DEX в конечной концентрации 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ соответственно. Обработку начинают на второй день поле посева, и каждое значение представляет собой среднюю величину данных, полученных от экспериментов, проведенных в двух повторах. Значения, представленные на панели А, представляют собой нормализированные значения, которые являются фактическим значением, деленным на произвольное значение.
На фиг. 18 показаны возможности включения DEX в больших масштабах получения рекомбинант-ного гликопротеина, как описано в примере 5. На фигуре показана плотность жизнеспособных клеток (18А), жизнеспособность (18В), нормализированный титр (18С) и нормализированное содержание сиа-ловой кислоты (18D) получаемого рекомбинантного гликопротеина при 7 л (n=16) и 500 л (n=6) и 5000 л (n=3) масштабах соответственно. Значения отражают среднюю величину и стандартное отклонение данных от множественных экспериментов на каждом масштабе. Нормализированное значение представляет собой фактическое значение, деленное на произвольное значение. Одинаковый делитель был использован для нормализации всех масштабов.
На фиг. 19 показаны последовательность нуклеотида (SEQ ID NO: 1) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) CTLA4, имеющего сигнальный пептид, аминокислотную последовательность дикого типа внеклеточного домена CTLA4, начиная с метионина в положении +1 до аспараги-новой кислоты в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, и участок Ig.
На фиг. 20 показаны последовательность нуклеотида (SEQ ID NO: 3) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) мутантной молекулы CTLA4 (L104EA29YIg), имеющей сигнальный пептид, мутантный внеклеточный домен CTLA4, начинающийся с метионина в положении +1 и заканчивающийся аспарагиновой кислотой в положении +124, или начинающийся с аланина в положении -1 и заканчивающийся аспарагиновой кисотой в положении +124, и участок Ig.
На фиг. 21 показаны последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 5) и кодируемая полная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) человеческого рецептора CTLA4 (именуемого в данном изобретении как "дикий тип" CTLA4) слитого с сигнальным пептидом онкостатином М (положение от -26 до -2) (патенты США № 5434131 и 5844095).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым способам получения белков, предпочтительно рекомби-нантных белковых продуктов, более предпочтительно гликопротеиновых продуктов, в культуре клеток млекопитающих или животных. Данные способы обеспечивают повышение плотности жизнеспособных клеток, жизнеспособности клеток, продуктивности и содержания сиаловой кислоты и снижение агрегации белка.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения изобретение направлено на способ культивирования клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление гликокортикоидных соединений к культуре клеток.
Глюкокортикоидные соединения включают, но не ограничиваются ими, гидрокортизон (представленный от Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), преднизон (представленный от Sigma-Aldrich), преднизолон (представленный от Sigma-Aldrich), метилпреднизолон (представленный от Sigma-Aldrich), дексаметазон (представленный от Sigma-Aldrich), бетаметазон (представленный от Sigma-Aldrich), триамцинолон (представленный от Sigma-Aldrich), ацетат флудрокортизона (представленного от Sigma-Aldrich). Соединения являются общедоступными из перечисленных источников или легко получаемы с помощью средств, известных любому специалисту в данной области техники.
Предпочтительные глюкокортикоидные соединения включают, но не ограничиваются ими, гидрокортизон, преднизолон, бетаметазон и дексаметазон. Более предпочтительным является дексаметазон.
В одном из вариантов осуществления изобретения глюкокортикоидное соединение добавляют при посеве или он может быть компонентом основной среды. Посев проводится в день 0.
В одном из вариантов осуществления изобретения глюкокортикоидное соединение добавляют после посева, т.е. он не присутствует в основной среде и не присутствует при посеве. Предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют на 1 день культивирования или позже.
Согласно изобретению глюкокортикоидное соединение может быть добавлено к культуре клеток один раз, два раза, три раза или любое количество раз в течение определенного периода времени. Одно или более глюкокортикоидных соединений может быть использовано в сочетании. Т.е. любое одно добавление глюкокортикоидного соединения может включать добавление одного или более других соединений глюкокортикоидов. Подобным образом, если есть более одного добавления глюкокортикоидного соединения, различные глюкокортикоидные соединения могут быть добавлены в различных добавлениях. Дополнительные соединения и вещества, включающие глюкокортикоидные соединения, могут быть добавлены к культуре прежде, с или после добавления глюкокортикоидного соединения - во время или не во время определенного периода времени. В предпочтительном варианте существует одно, т.е. однократное, добавление глюкокортикоидного соединения. В предпочтительном варианте добавляют одно глюкокортикоидное соединение.
Согласно изобретению глюкокортикоидное соединение может быть добавлено к культуре клеток с помощью любого способа. Способы добавления глюкокортикоидного соединения включают, но не ограничиваются ими, растворение в DMSO, растворение в органическом растворителе, растворение в воде, растворение в культуральной среде, растворение в питательной среде, растворение в соответствующей среде, в виде, в котором он получен или любой его комбинации.
Предпочтительно DEX добавляют в качестве раствора, где DEX является растворенным в этаноле, который затем разбавляют водой для дальнейшего использования (например, такого как добавление DEX к питательной среде).
Согласно изобретению глюкокортикоидное соединение добавляют для доведения концентрации в культуре до подходящего уровня. В качестве неограничивающих примеров глюкокортикоидное соединение добавляют до концентрации 1 нМ-1 мМ. Предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют до концентрации 1 нМ-0,1 мкМ или 0,1-10 мкМ; более предпочтительно около 5-15 нМ или 0,5-5 мкМ; более предпочтительно около 10 нМ или 1 мкМ целевого количества.
Согласно изобретению культивирование может проводиться в течение длительного периода времени после добавления глюкокортикоидного соединения. Время проведения культивирования может быть определено любым специалистом в данной области техники на основе важных факторов, таких как количество и качество извлекаемого белка и уровень загрязняющих клеточных веществ (например, белков и ДНК) в надосадочной жидкости в результате клеточного лизиса, который осложняет восстановление представляющего интерес белка.
В конкретных воплощениях способа культивирования клеток и способа повышения жизнеспособности клеток по изобретению, глюкокортикоидное соединение добавляют после посева, а именно перед началом начальной фазы гибели. Предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют после посева, а именно в течение начальной фазы роста. Более предпочтительно глюкокортикоидное соединение добавляют в течение второй половины начальной фазы роста. Более предпочтительно глюкокорти-коидное соединение добавляют в конце или ближе к концу начальной фазы роста.
Начальная фаза роста относится к ростовой фазе, которая наблюдается при отсутствии указанного добавления глюкокортикоидного соединения. Начальная фаза гибели относится к фазе гибели, которая наблюдается при отсутствии указанного добавления глюкокортикоидного соединения.
Начальная фаза роста может заканчиваться, когда начинается начальная фаза гибели, или между начальной фазой роста и начальной фазой гибели может быть стационарная фаза любой продолжительности.
Например, в культуре клеток, в которой начальная фаза роста длится от 0 до 6 дня, а начальная фаза гибели начинается на 7 день, в конкретном варианте глюкокортикоидное соединение добавляют после посева и перед 7 днем. В конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют после посева и на 6 день. В конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют между 1 и 6 днями. В другом конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют с питательной средой на 3-6 дни. В другом конкретном варианте, глюкокортикоидное соединение добавляют примерно на 2 день, или на 2 день.
Было установлено (см. пример 3), что при осуществлении настоящего изобретения жизнеспособность культивируемых клеток продлевается. Условие, такое как добавление глюкокортикоидного соединения, является причиной продления жизнеспособности клеток, если жизнеспособность клеток в культуре выше в период присутствия условия, чем в отсутствие условия.
Таким образом, в другом варианте изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ продления жизнеспособности клеток в культуре, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором жизнеспособность клеток клеточной культуры продлевается.
Было установлено (см. пример 3), что, когда глюкокортикоидное соединение добавляют после посева и перед началом начальной фазы гибели, смертность в фазе гибели может быть снижена, менее чем смертность в фазе гибели, наблюдаемая при отсутствии глюкокортикоидного соединения.
Таким образом, в другом варианте изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток и (2) способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки
хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток после посева, то есть до начала начальной фазы гибели; при котором смертность в фазе гибели снижается. В более конкретных вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток после посева, то есть в течение начальной фазы роста; при котором смертность в фазе гибели задерживается. В более конкретных вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток во время второй половины начальной фазы роста; при котором смертность в фазе гибели снижается. В других конкретных вариантах, изобретение направлено на способ снижения смертности в фазе гибели культуры клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток в конце или примерно в конце начальной фазы роста; при котором смертность в фазе гибели задерживается.
Пример 3 также демонстрирует, что гидрокортизон (HYC), преднизолон (PRD) и дексаметазон (DEX) все показывают доза-зависимый защитный эффект клеток в обработанных культурах клеток по сравнению с необработанными культурами клеток. Однако высокие концентрации HYC и PRD необходимы для достижения одинакового уровня защитного эффекта, который в соответствии с их активностью различается (например, HYC и PRD только 5 и 20% которые действуют как DEX).
Время проведения способа культивирования клеток, в частности прерывистых способов, обычно ограничено из-за оставшейся плотности жизнеспособных клеток, которая снижается в течение фазы гибели. Более длительный период может позволить достигать более высоких титров. Проблемы качества продукта также является причиной для снижения смертности, гибель клеток может высвобождать сиали-дазы в надосадочную жидкость культуры, которая может снижать содержание сиаловой кислоты экс-прессируемого белка. Проблемы очистки белка являются еще одной причиной для задержки или торможения фазы гибели. Присутствие клеточного дебриса и содержимого погибших клеток в культуре может отрицательно отразиться на способности к выделению и/или очистке белкового продукта в конце периода культивирования.
Было установлено (см. пример 2), что добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток снижает агрегацию представляющих интерес белков.
Таким образом, в другом варианте изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения процента агрегации белков, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором процентное содержание высокомолекулярных видов снижается.
Было установлено (см. пример 1), что добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток улучшает сиалирование представляющих интерес белков с помощью увеличения общего содержания сиаловой кислоты и увеличения процентного содержания сталированных видов.
Пример 1 также демонстрирует, что гидрокортизон (HYC), преднизолон (PRD) и дексаметазон (DEX) все показали доза-зависимое улучшение сиалирования в обработанных культурах клеток по сравнению с необработанными культурами клеток. Однако высокая концентрация HYC и PRD были необходимы для достижения одинакового уровня улучшения, которая в соответствии с их активностью различается.
При этом в других вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ для увеличения процента сталированных видов, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес белок; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором процентное содержание сталированных видов увеличивается.
Таким образом, в других вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ увеличения общего содержания сиаловой кислоты, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес гликопротеин; и добавление глюкокортикоид-ного соединения к культуре клеток; при котором общее содержание сиаловой кислоты увеличилось.
При этом в других вариантах изобретение направлено на (1) способ культивирования клеток, и (2) способ снижения скорости десиалирования гликопротеинов в культуре клеток, включающий культивирование клетки-хозяина, которая экспрессирует представляющий интерес гликопротеин; и добавление глюкокортикоидного соединения к культуре клеток; при котором скорость десиалирования снижена. Способы и методики, относящиеся к очистке и исследованию гликопротеина
В способах культивирования, охватываемых настоящим изобретением, белок, продуцируемый клетками, как правило, собирали, восстанавливали, выделяли и/или очищали, или по существу очищали, желательно, в конце всего периода культивирования клеток, используя способы выделения и очистки, которые известны и практикуются в уровне техники. Предпочтительно белок, который секретируется культивированными клетками, выделяют из культуральной среды или надосадочной жидкости; однако белок может быть также получен из клетки-хозяина, например клеточного лизата, с использованием спо
собов, которые известны и практикуются в уровне техники, и которые далее описаны ниже.
Сложные углеводы, включающие гликопротеин, получаемый с помощью способа заявленного изобретения, могут быть изучены по стандартной методике, при желании, с помощью общепринятых способов исследования углеводов. Например, способы, такие как блоттинг лектина, широко известный из уровня техники, показывают количественное отношение терминальной маннозы или других Сахаров, таких как галактоза. Окончание моно-, би-, три- или тетра-антенного олигосахарида сиаловыми кислотами может быть подтверждено с помощью высвобождения сахаров от белка с использованием безводного гидразина или ферментных способов и разделением олигосахаридов ионообменной хроматографией, гель-хроматографией, или другими способами, которые известны из уровня техники.
pI гликопротеина может также быть измерена до или после обработки нейраминидазой для удаления сиаловых кислот. Повышение в pI после обработки нейроминидазой указывает на присутствие сиа-ловых кислот на гликопротеине. Углеводные структуры, как правило, встречаются на экспрессирован-ном белке как N-связанные или О-связанные углеводы. N-связанные и О-связанные углеводы различаются, главным образом, в их внутренних структурах. N-связанное гликозилирование относится к добавлению углеводной части посредством GlcNAc к остатку аспарагина в цепи белка. N-связанные углеводы все содержат общую Man1-6(Man1-3)Manp1-4GlcNAcp1-4GlcNAcP-R основную структуру, где R в данной основной структуре представляет собой остаток аспарагина. Пептидная последовательность произведенного белка будет содержать аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где X является любой аминокислотой, кроме пролина.
В отличие от этого, О-связанные углеводы характеризуются общей основной структурой, которая является GalNAc добавленной к гидроксильной группе треонина или серина. Из N-связанных и О-связанных углеводов наиболее важными являются сложные N- и О-связанные углеводы. Сложные углеводы содержат несколько антенных структур. Моно-, би-, три- и тетра-внешние структуры важны для добавления терминальных сиаловых кислот. Такие структуры внешней цепи обеспечивают дополнительные участки для конкретных сахаров и соединений, которые включают углеводы белковых продуктов.
В результате, углеводы могут быть исследованы любым способом, известным из уровня техники. Несколько способов известны из уровня техники для исследования гликозилирования и используются в контексте настоящего изобретения. Данные способы дают информацию относительно идентичности и состава олигосахарида, прикрепленного к получаемому белку. Способы для исследования углевода, пригодные по отношению к настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, лектин хроматографию; HPAEC-PAD, который использует высокий рН анионообменной хроматографии для разделения олигосахаридов на основе зарядов; ЯМР; масс-спектрометрию; ВЭЖХ; GPC; моносахаридный композиционный анализ; и последовательное ферментативное расщепление.
Кроме того, способы высвобождения олигосахаридов известны и применяются в уровне техники. Данные способы включают 1) ферментативные способы, которые обычно выполняют с использованием пептид-^гликозидазы F/эндо-р-галактозидазы; 2) способы р исключения с использованием жесткой щелочной среды для высвобождения в основном О-связанных структур; и 3) химические способы с использованием безводного гидразина для высвобождения N- и О-связанных олигосахаридов. Исследование может быть выполнено с использованием следующих этапов. 1. Диализ образца против деионизирован-ной воды для удаления солей буфера, с последующей лиофилизацией. 2. Высвобождение неповрежденных цепей олигосахарида безводным гидразином. 3. Обработка неповрежденных цепей олигосахарида безводным метанольным HCl для освобождения отдельных моносахаридов как О-метил производных. 4. N-ацетилирование любой простейшей аминогруппы. 5. Дериватизация для получения пер-О-триметилсилильных метилглюкозидов. 6. Разделение этих производных с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (GLC) на CP-SIL8 колонке. 7. Идентификация конкретных производных гликозидов с помощью времени отстаивания из GLC и масс-спектроскопии, по сравнению с известными стандартами. 8. Количественная оценка конкретных производных с помощью FID с внутренними стандартами (13-О-метил^-глюкоза).
Нейтральные и аминосахара могут быть определены с помощью высокоэффективной анионообмен-ной хроматографии в сочетании с импульсным амперометрическим детектированием (HPAE-PAD углеводная система; Dionex Corp.). Например, сахара могут быть высвобождены с помощью гидролиза в 20% (объемное содержание) трифторуксусной кислоте при 100°С в течение 6 ч. Гидролизаты затем высушивают с помощью лиофилизации или с Speed-Vac (Savant Instruments). Остатки затем растворяют в 1% растворе тригидрата ацетата натрия и исследуют на ВЭЖХ-А86 колонке (как описывал Anumula и соавт., 1991, Anal. Biochem., 195:269-280).
Альтернативно, может быть выполнен анализ иммуноблоттинга углеводов. В данной процедуре белок-связанные углеводы определяются с использованием коммерческой системы обнаружения гликана (Boehringer), которая основана на методике окислительного иммуноблоттинга, описанного Haselbeck и соавт. (1993, Glycoconjugate J., 7:63). Протокол окрашивания рекомендуется производителем, за исключением того, что белок переносится на мембрану из поливинилидендифторида вместо нитроцеллюлоз-ной мембраны и блокирующие буферы содержат 5% альбумина бычий сыворотки в 10 мМ Трис-буфере,
рН 7.4, с 0.9% натрия хлорида. Определение проводится с антидигоксигенин антителами, связанными с конъюгатом щелочного фосфата (Boehringer), 1:1000 разведенные в трис-забуференном растворе с использованием субстратов фосфатазы, хлорид 4-нитросинего тетразолия, 0.03% (вес./об.) и 5-бромо-4 хлоро-3-индол-фосфата 0.03% (вес./об.) в 100 мМ Трис-буфера, рН 9.5, содержащего 100 мМ хлорида натрия и 50 мМ хлорида магния. Полоски белка, содержащие углеводы, обычно визуализируются примерно в течение от 10 до 15 мин.
Углеводы, связанные с белком, могут быть также исследованы с помощью расщепления пептид-N-гликозидазой F. Согласно этой процедуре, остаток суспендировали в 14 мкл буфера, содержащего 0.18% SDS, 18 мМ бета-меркаптоэтанола, 90 мМ фосфата, 3.6 мМ ЭДТА, при рН 8.6 и нагревали при 100°С в течение 3 мин. После, охлажденный при комнатной температуре, образец разделяют на две равные части. Одна часть, которую не обрабатывают дальше, служит в качестве контроля. Другую часть доводят до примерно 1% NP-40 детергентом с последующим добавлением 0,2 единиц пептид^-гликозидазы F (Boehringer). Оба образца нагревают при 37°С в течение 2 ч и затем исследуют с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.
Кроме того, содержание сиаловой кислоты продукта гликопротеина оценивают общепринятыми способами. Например, сиаловая кислота может быть отдельно определена с помощью прямого колориметрического метода (Yao и соавт., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335), предпочтительно с использованием трех образцов. Другие способы определения сиаловой кислоты включают использование тиобарбиту-ровой кислоты (ТВА), как описывал Warren и соавт. (1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975). Еще один способ включает высокоэффективную хроматографию, такую как описывал НХ. Ogawa и соавт. (1993,7. Chromatography, 612:145-149).
Для иллюстрации, для восстановления гликопротеина, выделения и/или очистки, культуральную клеточную среду или клеточный лизат центрифугировали для удаления частиц клеток и клеточного деб-риса. Желаемый полипептидный продукт выделяли или очищали от загрязнений растворимых белков и полипептидов с помощью соответствующих способов очистки. Следующие процедуры обеспечивали примерные, но не ограничивающие, способы очистки для белков: разделение или фракционирование на иммуноаффинной или ионообменной колонке; осаждение этанолом; обращенно-фазовая ВЭЖХ; хроматография на смоле, такой как силикагель, или катионообменные смолы, например, DEAE; хроматофоку-сирование; SDS-PAGE; фракционирование сульфатом аммония; гель-хроматография с использованием, например, Сефадекса G-75, сефарозы; хроматография на сефарозе белка А для удаления загрязнений иммуноглобулинов; и т.п. Другие добавки, такие как ингибиторы протеиназ (например, PMSF или протеин-киназа К), могут применяться для подавления протеолитического распада в способе очистки. Специалисту в данной области будет очевидно, что способы очистки для данного представляющего интерес полипептида могут требовать изменений, которые предусматривают изменения в экспрессии рекомбинантно-го полипептида в культуре клеток. Те способы очистки, которые можно выбрать для углеводов и обогащения для сиаловой кислоты являются особенно предпочтительными, например, ионообменная мягкая гель-хроматография, или ВЭЖХ с использованием катион- или анион-обменных смол, в которых собираются более кислые фракции.
Клетки, белки и культуры клеток
В методах или способах культивирования клеток по данному изобретению, клетки могут быть содержаться в различных культуральных средах, т.е. основной культуральной среде, которые, как правило, известны. Например, способы подходят для применения к большим объемам клеток, поддерживающихся в культуральной среде, которая может быть дополнена питательными веществами и т.д. Обычно, "среда для культивирования клеток" (также называемая "культуральной средой") является термином, который понятен специалисту в данной области техники, и, как известно, относится к питательному раствору, в котором клетки, предпочтительно клетки животного или млекопитающего, растут и которая обычно обеспечивает по меньшей мере один или несколько веществ из следующих: источник энергии (обычно в виде углевода, такого как глюкоза); все незаменимые аминокислоты и, как правило, двадцать основных аминокислот, а также цистеин; витамины и/или другие органические вещества, как правило необходимые в низких концентрациях; липиды и свободные жирные кислоты, например, линолевая кислота; и микроэлементы, например, неорганические соединения или природные элементы, которые, как правило, необходимы в очень низких концентрациях, обычно в микромолярном диапазоне. Среда для культивирования клеток может также быть дополнена для содержания различных дополнительных веществ, таких как гормоны и другие факторы роста, например, инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста, сыворотка и т.п.; соли, например, кальция, магния и фосфаты, и буферы, например, HEPS; нуклеозиды и основания, например, аденозин, тимидин, оксипурин; и гидролизаты белка и ткани, например гидроли-зированный животный белок (пептон или смесь пептона, который может быть получен от животных биопродуктов, очищенного желатина или растительного материала); антибиотики, например гентами-цин; и клеточные защитные вещества, например, полиола Плюроник (Плюроник F68). Предпочтительной является питательная среда для клеток, которая не содержит сыворотки и продуктов или ингредиентов животного происхождения.
Практикующему специалисту понятно, что клетки животных или млекопитающих культивируют в
среде, подходящей для культивирования определенных клеток, и которая может быть определена специалистом в данном уровне технике без излишних экспериментов. Коммерчески доступная среда может применяться и включает, например, минимальную поддерживающую среду (MEM, Sigma, St. Louis, MO); Ham's F10 среду (Sigma); модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM, Sigma); RPMI-1640 среду (Sigma); HyClone культуральную среду для клеток (HyClone, Logan, UT); и химически-определенную (CD) среду, которая разработана для определенных типов клеток, например, CD-CHO среда (Invitrogen, Carlsbad, CA). К вышеупомянутой примерной среде могут быть добавлены описанные выше дополнительные вещества и ингредиенты, включающие дополнительные вещества в соответствующих концентрациях или количествах, при необходимости или по желанию, и которые известны и применяются в данной области техники с использованием обычных навыков.
Кроме того, условия культивирования клеток, подходящие для способов по настоящему изобретению, те которые обычно применяются и известны для периодического, подпитывающего или непрерывного культивирования клеток, с вниманием к рН, например, около 6,5 до примерно 7,5; растворенному кислороду (O2), например, около 5-90% насыщения воздухом и диокисью углерода (СОг), перемешивания и влажности, в дополнение к температуре. В качестве иллюстрирующего, но не ограничивающего, примера, подходящая среда культивирования клеток для подпитываемых способов настоящего изобретения включает модифицированную CD-CHO среду (Invitrogen, Carlsbad, CA). Питательная среда может также применяться, как например модифицированная eRDF среда (Invitrogen, Carlsbad, CA). Предпочтительной является питательная среда также содержащая глюкокортикоиды, например дексаметазон.
Клетки животных, клетки млекопитающих, культивируемые клетки, клетки-хозяева животных или млекопитающих, клетки-хозяева, рекомбинантные клетки, рекомбинантные клетки-хозяева и т.п., являются всеми теми терминами для обозначения клеток, которые могут быть культивированы в соответствии со способами по данному изобретению. Такие клетки являются, как правило, клеточными линиями, получаемыми или происходящими от млекопитающих, и способные к росту и выживанию, когда располагаются в любой монослойной культуре или суспензионной культуре в среде, содержащей подходящие питательные вещества и/или факторы роста. Факторы роста и питательные вещества, которые необходимы для роста и сохранения определенной культуры клеток, могут быть легко определены специалистом в данной области техники опытным путем, таким как описывает, например, Barnes и Sato, (1980, Cell, 22:649); в Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, NY, 1984; и в патенте США № 5721121.
Многочисленные типы клеток можно культивировать в соответствии со способами по настоящему изобретению. Клетки, как правило, клетки животных или млекопитающих, которые могут экспрессиро-вать и выделять, или которые могут быть разработаны на молекулярном уровне для экспрессии и выделения большого количества определенного белка, более предпочтительно, представляющего интерес гликопротеина, в культуральную среду. Будет понятно, что гликопротеин, продуцируемый клеткой-хозяином, может быть эндогенным или гомологичным для клетки-хозяина. В качестве альтернативы, и, предпочтительно, гликопротеин является гетерологическим, т.е. чужеродным, для клетки-хозяина, как например, человеческий гликопротеин, продуцируемый и секретируемый клеткой-хозяином яичника китайского хомячка (СНО). Также предпочтительно, гликопротеин млекопитающих, т.е. полученный изначально или происходящий от организма млекопитающего, получают с помощью способов по настоящему изобретению и, предпочтительно, секретируется клетками в культуральную среду.
Примеры гликопротеинов млекопитающих, которые могут быть предпочтительно получены с помощью способов по данному изобретению, включают, без ограничения, цитокины, рецепторы цитоки-нов, факторы роста (например, EGF, HER-2,FGF-p, TGF-a, TGF-р, PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-P); рецепторы факторов роста, включающие слитые или химерные белки. Другие неограничивающие примеры включают гормоны роста (например, человеческий гормон роста, бычий гормон роста); инсулин (например, А цепь инсулина и В цепь инсулина), проинсулин; эритропоэтин (ЕРО); колониестимули-рующий фактор (например, G-КСФ, GM-КСФ, М-КСФ); интерлейкины (например, от IL-1 до IL-12); фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор (VEGF-R); интерфероны (например, IFN-a, р, или у); фактор некроза опухоли (например, TNF-a и TNF-P) и их рецепторы, TNFR-1 и TNFR-2; тромбо-поэтин (ТРО); тромбин; натрийуретический пептид головного мозга (BNP); факторы свертывания крови (например, фактор VIII, фактор IX, фактор ван Виллебранда и т.п.); противосвертывающие факторы; тканевой активатор плазминогена (ТРА), например, урокиназа или человеческая мочевина или ТРА тканевого типа; фолликулостимулирующий гормон (FSH); лютеинизирующий гормон (LH); кальцитонин; CD белки (например, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, и т.д.); CTLA белки (например, CTLA4); Т-клеточные и В-клеточные рецепторные белки; костные морфогенетические белки (BNPs, например, ВМР-1, ВМР-2, ВМР-3, и т.д.); нейротрофические факторы, например, нейротрофический фактор мозга); нейротрофины, например, 3-6; ренин; ревматоидной фактор; RANTES; альбумин; релаксин; макрофагальный ингиби-торный протеин (например, MIP-1, MIP-2); вирусные белки или антигены; белки поверхности мембраны; белки с ионным каналом; ферменты; регуляторные белки; антитела; иммуномодулирующие белки, (например, HLA, МНС семейства В7); "хоминг" рецепторы; транспортные белки; супероксид-дисмутаза (SOD); G-белок сопряженный рецептор белков (GPCRs); мейромодуляторные белки; белки и пептиды,
связанные с болезнью Альцгеймера, (например, А-бета) и другие, известные из уровня техники. Слитые белки и полипептиды, химерные белки и полипептиды, а также фрагменты или части, или мутанты, варианты или аналоги любых вышеупомянутых белков и полипептидов также включены в состав подходящих белков, полипептидов и пептидов, которые могут быть произведены с помощью способов настоящего изобретения.
Неограниченные примеры клеток-хозяев животных и млекопитающих, пригодных для содержания, экспрессии и получения белков для последующего выделения и/или очистки, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), такие как СНО-K (АТСС CCL-61), DG44 (Chasin и соавт., 1986, Som. Cell Molec. Genet, 12:555-556; и Kolkekar и соавт., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909), СНО-Ю Tet-On клеточная линия (Clontech), СНО обозначенные ЕСАСС 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), СНО клон 13 (GEIMG, Genova, IT), СНО клон В (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF обозначенные ЕСАСС 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), RR-CHOK1 обозначенные ЕСАСС 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), дигидрофлатредуктаза негативных СНО клеток (QTOZ-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), и dpl2.CHO клетки (патент США № 5721121); клетки почки обезьяны CV1, преобразованные в SV40 (COS клетки, COS-7, АТСС CRL-1651); человеческие эмбриональные клетки почек (например, 293 клетки или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензии культуры, Graham и соавт., 1977, J. Gen. Virol, 36:59); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, АТСС CCL-10); клетки почки обезьяны (CVI, АТСС CCL-70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1587; VERO, АТСС CCL-81); мышиные клетки Сертоли (ТМ4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); клетки рака шейки матки человека (HELA, АТСС CCL-2); клетки почек собаки (MDCK, АТСС CCL-34); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL-75); клетки гепатомы человека (НЕР^2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL-51); клетки печени лабораторной крысы Buffalo (BRL ЗА, АТСС CRL-1442); TRI клетки (Mather, 1982, Annals NY Acad. Set, 383:44-68); MCR 5 клетки; FS4 клетки. Предпочтительными являются клетки СНО, особенно
CHO/-DHFR клетки.
Клетки, подходящие для культивирования в методах и способах по настоящему изобретению, могут содержать введенные, например, посредством трасформации, трансфекции, инфицирования или инъекции векторы экспрессии (конструкции), такие как плазмиды и т.п., которые содержат кодирующие последовательности или их части, кодирующие белки для экспрессии и продуцирования в способе культивирования. Такие векторы экспрессии содержат необходимые элементы для траскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности. Способы, которые известны и применяются специалистами в данной области техники, могут применяться для построения векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие продуцируемые белки и полипептиды, а также подходящие транскрипционные и трансляционные контрольные элементы. Такие способы включают in vitro технологии рекомбинантной ДНК, синтетические технологии и in vivo генетическую рекомбинацию. Такие технологии описаны у J. Sambrook и соавт., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. и у F.M. Ausubel и соавт., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.
Контролирующие элементы или регуляторные последовательности это те нетранслируемые участки вектора, например, энхансеры, промоторы, 5' и 3' нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для выполнения транскрипции и трансляции. Такие элементы могут различаться по своей эффективности и специфичности. В зависимости от системы векторов и применяемых клеток-хозяев, любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включающих конститутивные и индуцибельные промоторы, могут быть использованы. В системах клеток млекопитающих промоторы от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих являются предпочтительными. Конструкции для применения в системах экспрессии белка сконструированы так, чтобы они содержали по меньшей мере один промотор, последовательность энхансера (необязательна для систем экспрессии млекопитающих) и другие последовательности, которые необходимы или требуются для правильной транскрипции и регуляции экспрессии гена (например, транскрипционная инициация стоп-кодона, сайтов начала репликации, полиаденилирование последовательностей, например, гормон роста крупного рогатого скота (BGH) поли А последовательность).
Как будет понятно любому специалисту в данной области техники, выбор подходящего вектора, например, плазмиды, компонентов для правильной транскрипции, экспрессии, и выделение полученных белков в эукариотических (например, млекопитающих) системах экспрессии известны и определяются по стандартной методике и применяются специалистами в данной области техники. Экспрессия белков культивированными клетками в соответствии со способами данного изобретения может находиться под контролем промоторов, таких как вирусные промоторы, например, цитомегаловируса (CMV), вируса саркомы Рауса (RSV), глицерофосфат киназа (PGK), тримидинкиназа (TK) или промотор а-актина. Кроме того, регулирующие промоторы придают индуцибельность для конкретных соединений или молекул, например, глюкокортикоид-отвечающий элемент (GRE) на вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV) индуцируется глюкокортикоидами (V. Chandler и соавт., 1983, Cell, 32:489-499). Также, тканес-пецифические промоторы или контролирующие элементы могут быть использованы (G. Swift и соавт.,
1984, Cell, 38:639-646), если необходимо или желательно.
Конструкции экспрессии могут быть введены в клетки с помощью различных способов переноса гена, известных специалистам в данной области техники, например, обычно применяемых способов переноса гена, таких как ко-преципитация фосфата кальция, липосомальная трансфекция, микроинъекция, электропорация и инфекционная или вирусная трансдукция. Выбор способа находится в компетенции специалиста в данной области техники. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что одна или несколько конструкций, несущих последовательности ДНК для экспрессии в клетках, могут быть трансфицированы в клетки так, что продукты экспрессии впоследствии производятся в и/или получают из клеток.
В конкретном аспекте, экспрессирующие системы млекопитающих, содержащие подходящие контрольные и регуляторные последовательности, являются предпочтительными для применения в клетках млекопитающих по настоящему изобретению, экспрессирующих белок. Широко применяемые эукарио-тические контрольные последовательности для применения в векторах экспрессии млекопитающих, включают промоторы и контрольные последовательности, совместимые с клетками млекопитающих, такие как, например, промотор цитомегаловируса (CMV) (CDM8 вектор) и вируса саркомы птиц (ASV), (nLN). Другие широко используемые промоторы включают ранние и поздние промоторы от вируса обезьяны 40 (SV40) (Fiers и соавт., 1973, Nature, 273:113), или другие вирусные промоторы, такие как производные от полиомы, аденовируса 2 и вируса папилломы крупного рогатого скота. Индуцибельный промотор, такой как hMTII (Karin и соавт., 1982, Nature, 299:797-802), может также применяться.
Примеры векторов экспрессии, подходящих для эукариотических клеток-хозяев, включают, но не ограничиваются ими, векторы для клеток-хозяев млекопитающих (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2,
pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc векторы,
pCMV векторы, pSG5 векторы (Stratagene), ретровирусные векторы (например, pFB векторы (Stratagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), аденовирусные векторы; векторы аденоассоциируемого вируса, баку-ловирусные векторы, векторы дрожжевых грибов (например, pESC векторы (Stratagene)), или измененные формы любого из вышеуказанных. Векторы также могут содержать энхансерные последовательности выше или ниже участка последовательностей промотора для оптимизации экспрессии генов.
Селектируемый маркер может также применяться в рекомбинантном векторе (например, плазмиде) для обеспечения резистентности клеток, несущих (предпочтительно, имеющих стабильную интеграцию) вектор с целью их отбора в подходящей селективной среде. Ряд систем отбора может применяться, включая, но не ограничиваясь ими, тимидин киназы вируса простого герпеса (HSV TK), (Wigler и соавт., 1977, Cell, 11:223), гипоксантингуанидин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT), (Szybalska и Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202), и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy и соавт., 1980, Cell, 22:817) гены, которые могут быть применены в tk-, hgprt- или agprt- или aprt-клетках (APRT) соответственно.
Резистентность против метаболитов также может применяться в качестве основы отбора для следующих неограничивающих примеров маркерных генов: dhfr, который придает резистентность к метот-рексату (Wigler и соавт., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357; и O'Hare и соавт., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); gpt, который придает резистентность к микофеноловой кислоте (Mulligan и Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); neo, который придает резистентность к аминогликозиду G418 (Clinical Pharmacy, 12:488-505; Wu и Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol, 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21; May, 1993, 775 TECH, 11(5): 155-215); и hygro, который придает резистентность к гигромицину (Santerre и соавт., 1984, Gene, 30:147). Способы технологии рекомбинантной ДНК, общеизвестные в уровне техники, можно применять по стандартной методике для отбора желательных рекомбинантных колоний клеток и такие способы описаны, например, у Ausubel и соавт. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981. J. Mol. Biol., 150:1, которые включены посредством ссылок в полном объеме в настоящем изобретении.
Кроме того, уровни экспрессии экспрессируемой молекулы белка могут быть повышены с помощью векторной амплификации (для обзора см. Bebbington и Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987). Когда маркер в экспрессирующей векторной системе белка амплифицирован, повышение уровня присутствующего ингибитора в культуре клеток-хозяев будет увеличивать число копий маркерного гена. Поскольку амплифицированный участок связан с геном, кодирующим белок, продукция белка будет одновременно повышаться (Crouse и соавт., 1983, Mol. Cell. Biol, 3:257).
Векторы, которые содержат глутаминсинтазу (GS) или дигидрофолатредуктазу (DHFR), кодирующие нуклеиновые кислоты в качестве селектируемых маркеров, могут быть амплифицированы в присутствии средства метионинсульфоксимина или метотрексата соответственно. Преимуществом глутамин-синтазы на основе векторов является наличие клеточных линий (например, мышиной миеломной клеточной линии, NSO), которые являются глутиминсинтаза-отрицательными. Глутаминсинтазные экспрес
сионные системы могут также действовать в клетках, экспрессирующих глутаминсинтазу (например, СНО клетках) с помощью обеспечения дополнительного ингибитора для предотвращения действия эндогенного гена.
Векторы, которые экспрессируют DHFR в качестве селектируемого маркера, включают, но не ограничиваются ими, плазмиду pSV2-dhfr (Subramani и соавт., Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981)). Векторы, которые экспрессируют глутаминсинтазу в качестве селектируемого маркера, включают, но не ограничиваются ими, экспрессионный вектор рЕЕ6, описанный Stephens и Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res., 17:7110. Глутаминсинтазная экспрессионная система и ее компоненты подробно описаны в публикациях РСТ: WO 87/04462; WO 86/05807; WO 89/01036; WO 89/10404 и WO 91/06657, которые включены посредством ссылок в полном объеме в данное изобретение. Кроме того, глутаминсинтазные векторы экспрессии, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, являются коммерчески доступными от поставщиков, включая, например, Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).
В конкретном варианте последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимую молекулу CTLA4 или растворимую мутантную молекулу CTLA4, может быть введена в вектор, предназначенный для экспрессии чужеродных последовательностей в эукариотическом хозяине. Регуляторные элементы вектора могут изменяться в зависимости от конкретного эукариотического хозяина. Векторы, которые экспрессируют растворимый CTLA4 или растворимый мутантный CTLA4 в эукариотических клетках-хозяевах, могут включать энхансерные последовательности для оптимизации экспрессии белка.
Виды культур клеток
В целях понимания, а не ограничения, практикующему специалисту понятно, что культуры клеток и проведение культивирования для получения белка могут включать три основных вида; а именно, непрерывная культура, периодическая культура и культура с подпиткой. В непрерывной культуре, например, добавление свежей культуральной среды (т.е. питательной среды) обеспечивается для клеток в течение периода культивирования, в то время как старая культуральная среда удаляется ежедневно, а продукт собирают ежедневно или постоянно. В непрерывной культуре питательная среда может добавляться ежедневно и может добавляться непрерывно, т.е. в виде капания или вливания. Для непрерывного культивирования клетки могут сохраняться в культуре до тех пор, пока необходимо, при условии, что клетки сохраняются живыми и окружающие условия и условия культивирования поддерживаются.
В периодической культуре клетки изначально культивируют в среде и данная среда не удаляется, не заменяется, не дополняется, т.е. клетки не "подпитываются" новой средой, в течение или до окончания проведения культивирования.
Для культуры с подпиткой время проведения культивирования увеличено пополнением культу-ральной среды один или несколько раз в день (или постоянно) новой средой в способе выполнения, т.е. клетки "подпитывают" новой средой ("питательной средой") в способе проведения культивирования. Культуры с подпиткой могут включать различные режимы и время питания, например, ежедневно, через день, каждые два дня и т.д., несколько раз в день или реже, чем раз в день, и так далее. Кроме того, культуры с подпиткой могут быть подпитаны непрерывно питательной средой.
Целевой продукт затем собирают в конце проведения культивирования/производства. Настоящее изобретение, преимущественно, включает культуры клеток с подпиткой, в которых глюкокортикоидные соединения добавляют после посева.
Согласно настоящему изобретению, культивирование клеток может быть выполнено и гликопро-теины могут быть произведены клетками в условиях для больших и малых масштабов производства белков с использованием сосудов для культивирования и/или аппаратов для культивирования, которые обычно применяются для культивирования клеток животных или млекопитающих. Как известно специалистам в данной области, в лаборатории обычно используются чашка Петри, Т-колба и вращающаяся колба. Для культивирования в больших масштабах (например, 500, 5000 л и т.п., например, как описано в принадлежащим одному и тому же правообладателю, патенте США № 7541164, патенте США № 7332303, и заявке США порядковым номером № 12/086786, поданном 19 декабря 2006 г., содержание которых включено посредством ссылок в полном объеме в данном изобретении) могут применяться процедуры, включающие, но не ограничивающиеся ими, биореактор с кипящим слоем, половолоконные биореакторы, культивирование во вращающемся флаконе или биореакторе с механическим перемешиванием системы. Микроносители могут быть или могут не быть использованы в системах вращающегося флакона или в биореакторе с механическим перемешиванием. Системы могут быть использованы в периодическом, непрерывном или подпитываемом способе. Кроме того, аппараты или системы для культивирования могут быть или могут не быть оборудованы клеточным сепаратором с использованием фильтров, тяжести, центробежных сил и т.п.
Этапы культивирования клеток и связанные с ними параметры
Термин "посев" относится к добавлению клеток к исходной среде для начала культивирования.
"Фаза роста" культуры представляет собой фазу, в которой плотность жизнеспособных клеток в каждый момент времени выше, чем в любой предыдущий момент времени.
"Стационарная фаза" культуры представляет собой фазу, в которой плотность жизнеспособных клеток приблизительно постоянна (т.е. в пределах погрешности измерений) за определенный период времени любой продолжительности.
"Фаза гибели" культуры представляет собой фазу, которая следует за фазой роста или после фазы роста и стационарной фазы, и в которой плотность жизнеспособных клеток в каждый момент времени меньше, чем в предыдущий момент времени в процессе данной фазы.
В "связанном с ростом" способе культивирования, в таких случаях, где глюкокортикоидное соединение вызывает продление фазы роста, фаза продукции может начаться в процессе продления фазы роста.
В "не связанном с ростом" способе культивирования фаза продукции культуры клеток может быть стационарной фазой.
Предпочтительно культуральная среда дополняется ("подпитывается") в процессе фазы продукции для поддержания непрерывного производства белка, особенно в продлённой фазе продукции, и для достижения большого количества высококачественного продукта гликопротеина (что подтверждается и/или определяется высоким уровнем содержания терминальной сиаловой кислоты при извлечении белка). Подпитывание может происходить ежедневно или в соответствии с другим графиком для поддержания жизнеспособности клеток и продукции белка.
Способ культивирования по настоящему изобретению может приводить к выживаемости более жизнеспособных клеток до завершения периода культивирования. Соответственно, в некоторых вариантах, чем больше клеток, которые выжили, тем больше клеток, которые производят желаемый продукт. Это, в свою очередь, приводит к большему накоплению количества продукта по завершению способа культивирования с интенсивностью продукции белка отдельными клетками, т.е. удельной продуктивностью клеток, остающейся такой же. Удельная продуктивность клеток или специфическая интенсивность клеток, как известно из уровня техники, обычно относится к специфической интенсивности экспрессии продукта, продуцируемого клетками, или измерению клеточной массы или объема. Удельная продуктивность клеток измеряется в граммах белка, продуцируемого клетками за день, например, и может быть измерена в соответствии с интегральным методом, включающим следующие формулы:
dP/dt = qp X или
Р = qp У Xdt
где qp является константой удельной продуктивности клеток; X является количеством клеток, или клеточным объемом, или эквивалентами клеточной массы; и dP/dt является интенсивностью продукции белка. Таким образом, qp может быть получен от зависимости концентрации продукта против интеграла
во времени жизнеспособных клеток (Jo* Xdt "дни жизнеспособных клеток"). В соответствии с данной формулой, когда количество продуцируемого продукта гликопротеина наносится против дней жизнеспособности клеток, наклон является эквивалентным специфической интенсивности клеток. Жизнеспособные клетки могут быть определены с помощью различных измерений, например, биомассы, интенсивности поглощения О2, лактатдегидрогиназы (LDH), гематокринного числа или плотности (например, патент США № 5705364 Т. Etcheverry и соавт.).
Получение растворимых молекул CTLA4 и растворимых мутантных молекул CTLA4 с помощью способов культивирования по настоящему изобретению
В других вариантах осуществления настоящего изобретения способы культивирования клеток по изобретению применяются для получения растворимой молекулы CTLA4 или растворимой мутантной молекулы CTLA4, как описано ниже. Растворимая молекула CTLA4 является предпочтительно белком слияния CTLA4, предпочтительно CTLA4Ig. Более предпочтительным является CTLA4Ig, которая содержит аминокислоты -1 до 357 или +1 до 357, как описано на фиг. 19. Растворимая мутантная молекула CTLA4, предпочтительно, L104EA29YIg, которая содержит аминокислоты -1 до 357 или +1 до 357, как показано на фиг. 20. Способы культивирования клеток, включающие продление фаз продукции для получения белка, особенно подходят для получения высокого качества и больших количеств растворимых молекул CTLA4 и растворимых мутантных молекул CTLA4 с помощью их клеток-хозяев при культивировании.
В предпочтительном варианте CTLA4Ig продуцируется рекомбинантно сконструированными клетками-хозяевами. Слитый белок CTLA4Ig может рекомбинантно продуцироваться клетками СНО, транс-фицированными вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую CTLA4Ig (см. патент США № 5844095 P.S. Linsley и соавт.). Слитый белок CTLA4Ig продуцируется в значительном количестве и соответственно сиалирован при культивировании, согласно способам по данному изобретению. Изобретение обеспечивает получение высоких уровней извлекаемого белкового продукта, т.е. сиалиро
ванного белкового продукта CTLA4Ig. В другом предпочтительном варианте, растворимую мутантную молекулу CTLA4 L104EA29YIg, которая содержит аминокислоты -1 до 357 или +1 до 357, как показано на фиг. 20, получают способами культивирования клеток по настоящему изобретению.
Лигандом для CTLA4 является молекула В7. В контексте данного изобретения "лиганд" относится к молекуле, которая специфически распознает и связывает другие молекулы. Взаимодействие молекулы и ее лиганда может регулироваться продуктами способов культивирования по данному изобретению. Например, взаимодействие CTLA4 с его лигандом В7 может быть блокировано с помощью введения молекул CTLA4Ig. В качестве других примеров, взаимодействие фактора некроза опухоли (TNF) с его лиган-дом, TNF рецептором (TNFR), может быть блокировано с помощью введения этанерцепта или других TNF/TNFR блокирующих молекул.
Дикий тип CTLA4 или "не мутированный CTLA4" имеет аминокислотную последовательность природного происхождения, полная длина CTLA4, как показано на фиг. 20 (а также как описано в патентах США № 5434131, 5844095 и 5851795, включенных посредством ссылок в полном объеме в данном изобретении), или любая часть ее, которая распознает и связывает молекулу В7, или препятствует молекуле В7, так что связывание с CD28 и/или CTLA4 (например, эндогенными CD28 и/или CTLA4) блокируется. Дикий тип CTLA4 содержит особенные части, включающие, например, внеклеточный домен дикого типа CTLA4, начинающийся с метионина в положении +1 и заканчивающийся аспарагиновой кислотой в положении +124, или внеклеточный домены дикого типа CTLA4, начинающийся с аланина в положении -1 и заканчивающийся аспарагиновой кислотой в положении +124, как показано на фиг. 21.
Дикий тип CTLA природного происхождения представляет собой белок клеточной поверхности, имеющий N-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и С-концевой цитоплазматический домен. Внеклеточный домен связывает молекулу-мишень, такую как молекулу В7. В клетках дикий тип CTLA4 белка природного происхождения представляет собой транслированный незрелый полипептид, который включает сигнальный пептид на амино- или N-терминальном конце. Незрелый полипептид претерпевает пост-трансляционную обработку, в том числе отщепление и удаление сигнального пептида с образованием CTLA4 продукта расщепления, имеющего вновь образованный N-терминальный конец в незрелом виде. Специалисту в данной области техники будет понятно, что может происходить посттрансляционная обработка, которая отделяет одну или несколько аминокислот от вновь образованного N-терминального конца продукта расщепления CTLA4. Зрелый белок CTLA4 может начинаться с метио-нина в положении +1 или аланина в положении -1. Зрелая форма молекулы CTLA4 включает внеклеточный домен или любую его часть, которая связывает В7.
Мутантная молекула CTLA4, в контексте данного изобретения, относится к молекуле, содержащей CTLA4 дикого типа, как показано на фиг. 21, или любой ее части или ее производному, которое имеют мутацию или множественные мутации в последовательности CTLA4 дикого типа, предпочтительно, во внеклеточном домене CTLA4 дикого типа, и связывают В7. Мутантная молекула CTLA4 имеет последовательность, которая схожа, но не идентична, последовательности молекулы CTLA4 дикого типа, но все же связывает В7. Мутации могут включать одну или несколько замен аминокислотных остатков на аминокислоты, имеющие консервативные (например, лейцин используется вместо изолейцина) или неконсервативные (например, глицин заменен на триптофан) структуры или химические свойства, аминокислотные делеции, добавления, сдвиги рамки или усечения.
Мутантные молекулы CTLA4 могут включать молекулы №-011^4 в ней или прикрепленные к ним, т.е. мутантные белки слияния CTLA4. Мутантные молекулы могут быть растворимыми (т.е. циркулирующими) или они могут быть связаны с поверхностью клетки (мембраносвязанные). Мутантные молекулы CTLA4 включают L104EA29Yig и те, которые описаны в заявке США с порядковым номером 60/214065 и 60/287576; в WO 01/92337 А2; в патентах США 6090914, 5844095, 7094874 и 5773253; и как описано у R.J. Peach и соавт., 1994, J. Exp Med, 180:2049-2058. Мутантные молекулы CTLA4 могут быть получены синтетически или рекомбинантно.
CTLA4Ig представляет собой растворимый слитый белок, включающий внеклеточный домен CTLA4 дикого типа, или его часть, которая связывает В7, присоединенный к молекуле иммуноглобулина (Ig) или ее части. Внеклеточный домен CTLA4 или его часть присоединен к фрагменту Ig, включающему целую или часть молекулы иммуноглобулина, предпочтительно, целую или часть иммуноглобулина, содержащего константную область, такую как целую или часть IgCу1(IgC-гамма1), IgCy2 (IgC-гамма2), IgCy3 (IgC-гамма3), IgCy4 (IgC-гамма4), IgC|a (IgC-мю), IgCa1 (IgC-альфа!), IgCa2 (IgC-альфа2), IgC5 (IgC-дельта) or IgCe (IgC-эпсилон), что делает слитые молекулы растворимыми. Фрагмент Ig может включать шарнир, СН2 и СН3 домены, или СН1, шарнир, СН2 и СН3 домены вышеуказанных константных областей или другие константные области. Предпочтительно фрагмент Ig является человеческим или обезьяньим и включает в себя шарнир, СН2 и СН3 домены. Более предпочтительно фрагмент Ig включает в себя шарнир, СН2 и СН3 домены человеческого IgCy1, или состоит из шарнира, СН2 и СН3 доменов человеческого IgCy1. Во фрагменте Ig CTLA4Ig, константная область Ig или его часть могут быть мутированы, тем самым приводя к снижению его эффекторных функций (см., например, патенты США № 5637481, 5844095 и 5434131). В контексте данного изобретения термины фрагмент Ig, констант
ная область Ig, IgC (константный) домен, IgC-y1 (IgC-гамма!), IgC-y2 (IgC-гамма2), IgC-y3 (IgC-гамма3), IgC-y4 (IgC-гамма4), IgC-ц (IgC-мю), IgC-a1 (IgC-альфа1), IgC-a2 (IgC-альфа2), IgC-5 (IgC-дельта) or IgC-e (IgC-эпсилон), включают как нативные последовательности, так и последовательности, которые мутировали, такие как, например, последовательности, имеющие мутации в константной области, которые снижают эффекторную функцию.
Конкретный вариант осуществления изобретения относится к CTLA4, включающей внеклеточный домен CTLA4 дикого типа, начиная с метионина в положении +1 и заканчивая аспарагиновой кислотой в позиции +124, или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124; соединение аминокислотного остатка глутамина в позиции +125; и часть иммуноглобулина, содержащая глутаминовую кислоту в положении +126 посредством лизина в положении +357, как показано на фиг. 19. ДНК, кодирующая данный CTLA4Ig, была внесена 31 мая 1991 года в Американскую коллекцию типовых культур (АТТС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, в соответствии с положением Будапешского договора, и имеет, согласно АТТС, номер доступа АТТС 68629; P. Linsley и соавт., 1994, Immunity 1:793-80. Клеточная линия СНО, экспрессирующая CTLA4Ig, была внесена 31 мая 1991 г. в АТТС под идентификационным номером CRL-10762. Растворимые молекулы CTLA4Ig, полученные в соответствии со способами, описанными в данном изобретении, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Фиг. 19 и 20 включают иллюстрацию последовательности сигнального (лидерного) пептида. Обычно, молекулы не включают последовательность сигнального пептида.
L104EA29YIg представляет собой слитый белок, который является растворимой мутантной молекулой CTLA4, содержащей внеклеточный домен CTLA4 дикого типа с аминокислотными заменами А29Н (аминокислотный остаток тирозина заменен на аланин в положении 29) и L104E (аминокислотный остаток глутаминовой кислоты заменен на лейцин в положении +104), присоединенный к концевому участку Ig. На фиг. 20 показана L104EA29YIg. Аминокислотная последовательность L104EA29YIg включает аланин в положении аминокислоты -1 до лизина в положении аминокислоты +357, как показано на фиг. 20. Кроме того, аминокислотная последовательность L104EA29YIg включает метионин в положении аминокислоты +1 до лизина в положении аминокислоты +357, как показано на фиг. 20. L104EA29YIg включает соединение аминокислотного остатка глутамина в положении +125 и части Ig, содержащей глутаминовую кислоту в положении +126 посредством лизина в положении +357. ДНК, кодирующая L104EA29YIg, была внесена 20 июня 2000 г. в коллекцию типовых культур (АТТС) в соотве-ствии с положением Будапешского договора, и имеет, согласно АТТС, номер доступа РТА-2104. 104EA29Y-Ig описан в совместно рассматриваемых заявках на патент США с порядковыми номерами 09/579927, 60/287576 и 60/214065 и в WO/01/923337 A2, которые включены посредством ссылок в полном объеме в данное изобретение. Растворимые молекулы L104EA29YIg, производимые с помощью способов культивирования по настоящему изобретению, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Обычно, молекулы, производимые в соответствии с настоящим изобретением, не содержат последовательность сигнального пептида.
В контексте данного изобретения термин "растворимая" относится к любой молекуле или ее фрагменту, не связанной или не присоединенной к клетке, т.е. циркулирующей. Например, CTLA4 может быть получена растворимой с помощью прикрепления фрагмента Ig к внеклеточному домену CTLA4. Кроме того, молекулы, такие как CTLA4, могут быть приведены в растворимое состояние посредством удаления трансмембранного домена. Как правило, растворимые молекулы, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, не включают сигнальную (или лидерную) последовательность.
Растворимые молекулы CTLA4 относятся к не клеточно-поверхностно-связанным (т.е. циркулирующим) молекулам, содержащим CTLA4 дикого типа или любую часть или производные, которые связывают В7, включая, но не ограничиваясь ими, растворимые белки слияния CTLA4; растворимые белки слияния CTLA4, такие как белки слияния CTLA4Ig (например, АТТС 68629), в которых внеклеточный домен CTLA4 слит с фрагментом Ig, который представляет собой целую или часть молекулы Ig, предпочтительно целую или часть константной области Ig, такой как целая или часть IgC-y1 (IgC-гамма!), IgC-y2 (IgC-гамма2), IgC-y3 (IgC-гамма3), IgC-y4 (IgC-гамма4), IgC-ц (IgC-мю), IgC-a1 (IgC-альфа1), IgC-a2 (IgC-альфа2), IgC-5 (IgC-дельта) or IgC-e (IgC-эпсилон), делая слитые молекулы растворимыми; растворимые слитые белки CTLA4, в которых внеклеточный домен слит или присоединен к части биологически активного или химически активного белка, такому как продукт гена Е7 папилломовируса (CTLA4-E7), меланома-ассоциированный антиген р97 (CTLA4-p97) или env белок HIV (CTLA4-env gp120), как описано в патенте США № 5844095, включенном в данное изобретение посредством ссылки в полном объеме; гибридные (химерные) слитые белки, такие как CD28/CTLA4Ig, как описано в патенте США № 5434131, включенном в данное изобретение посредством ссылки в полном объеме; молекулы CTLA4 с удаленным трансмембранным доменом для приведения белка в растворимое состояние (См., например, М.К. Oaks и соавт., 2000, Cellular Immunology, 201:144-153, включенный в данном изобретении посредством ссылки в полном объеме); растворимая мутантная молекула CTLA4 L104EA29YIg.
Растворимая молекула CTLA4 может также быть растворимой мутантной молекулой. Растворимые
молекулы CTLA4, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Сигнальный пептид может быть любой последовательностью, которая позволяет секрецию молекулы, включая сигнальный пептид из онкостатина М (Malik и соавт., 1989, Molec. Cell. Biol., 9:2847-2853), или CD5 (N.H. Jones и соавт., 1986, Nature, 323:346-349), или сигнальный пептид из любого внеклеточного белка. Растворимая молекула CTLA4, получаемая с помощью способов культивирования по настоящему изобретению, может включать сигнальный пептид онкостатина М, связанный N-терминальным концом внеклеточного домена CTLA4. Как правило, в настоящем изобретении молекулы не включают последовательность сигнального пептида.
"Слитый белок CTLA4", в контексте данной заявки, относится к молекуле, содержащей внеклеточный домен CTLA4 дикого типа или его часть, которая связывает В7, слитой с фрагментом не принадлежащим CTLA4, что приводит к растворимой молекуле CTLA4, таким как фрагмент Ig. Например, слитый белок CTLA4 может включать внеклеточный домен CTLA4, слитый с целой или частью константной областью Ig. Примеры константных доменов Ig (или их частей), которые могут быть слиты с CTLA4, включают все, но не ограничиваются вышеперечисленными. Белок слияния CTLA4 может также быть мутантной молекулой CTLA4.
В контексте данного изобретения "фрагмент не принадлежащий CTLA4" относится к молекуле или ее части, которая не связывает CD80 и/или CD86 и не препятствует связыванию CTLA4 с его лигандом. Примеры включают, но не ограничиваются ими, фрагмент Ig, который является целым или частью молекулы, часть биологически активного или химически активного белка, такого как продукт гена Е-7 папил-ломовируса (CTLA4-E7), меланома-ассоциированный антиген р97 (CTLA4-p97) или env белок HIV (CTLA4-env gp120) (как описано в патенте США порядкового номера № 5844095, включенном в данном изобретении посредством ссылки в полном объеме). Примеры фрагментов Ig включают полностью или часть константного домена иммуноглобулина, такого как IgCy1 (IgC-гамма1), IgC-y2 (IgC-гамма2), IgC-y3 (ДО-гамма3), IgC-y4 (IgC-гамма4), IgC-ц (IgC-мю), IgC-a1 (IgC-альфа^, IgC-a2 (IgC-альфа2), IgC-5 (IgC-дельта) or IgC-e (IgC-эпсилон). Фрагмент Ig может включать шарнир, СН2 и СН3 домены, или СН1, шарнир, СН2 и СН3 домены вышеуказанных константных областей или других константных областей. Предпочтительно фрагмент Ig является человеческим или обезьяньим и включает шарнир, СН2 и СН3 домены. Более предпочтительно фрагмент Ig включает шарнир, СН2 и СН3 домены человеческого IgCy1, или представляет собой шарнир, СН2 и СН3 домены человеческого IgCy1. В фрагменте Ig константная область Ig или ее часть могут быть мутированы для снижения его эффекторной функции (см., например, патенты США № 5637481, 5844095 и 5434131).
Внеклеточный домен CTLA4 относится к любой части CTLA4 дикого типа, которая распознает и связывает В7. Например, внеклеточный домен CTLA4 включает метионин в положении +1 до аспараги-новой кислоты в положении +124 (фиг. 21). Например, внеклеточный домен CTLA4 включает аланин в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 21).
В контексте данного изобретения термин "мутация" относится к изменению в нуклеотидной или аминокислотной последовательности молекулы дикого типа, например, изменение в ДНК и/или аминокислотных последовательностях внеклеточного домена CTLA4 дикого типа. Мутация в ДНК может изменить кодон, приводящий к изменению в кодирующей аминокислотной последовательности. Изменение ДНК может включать замены, делеции, вставки, альтернативный сплайсинг или усечения. Аминокислотное изменение может включать замены, делеции, вставки, добавления, усечения или обработку или ошибки расщепления белка. Кроме того, мутации в последовательности нуклеотида могут привести к молчащей мутации в аминокислотной последовательности, как это понимают в уровне техники. Также понятно, что некоторые нуклеотидные кодоны кодируют одну и ту же аминокислоту. Примеры включают нуклеотидные кодоны CGU, CGG, CGC и CGA, которые кодируют аминокислоты аргинина (R); или кодоны GAU и GAC, которые кодируют аминокислоты аспарагиновой кислоты (D).
Таким образом, белок может кодироваться одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, которые различаются по их конкретной нуклеотидной последовательности, но тем не менее кодируют молекулы белка, имеющие идентичные последовательности. Мутантная молекула может иметь одну или более чем одну мутацию. Для руководства аминокислотная кодирующая последовательность выглядит следующим образом:
Аминокислота
Обозначение
Единичое буквенное обозначение
Кодоны
Алании
Ala
GCU, GCC, GCA, GCG
Цистеин
Cys
UGU, UGC
Аспарагиновая кислота
Asp
GAU, GAC
Глутаминовая кислота
Glu
GAA, GAG
Фенилаланин
Phe
UUU, UUC
Глицин
Gly
GGU, GGC, GGA, GGG
Гистидин
His
CAU, CAC
Изолейцин
AUU, AUC, AUA
Лизин
Lys
AAA, AAG
Лейцин
Leu
UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Метионин
Met
AUG
Аспарагин
Asn
AAU, AAC
Пролин
Pro
CCU, CCC, CCA, CCG
Глутамин
Gin
CAA, CAG
Аргинин
Arg
CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Серии
Ser
UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
Траонин
Thr
ACU, ACC, АСА, ACG
Валин
Val
GUU, GUC, GUA, GUG
Триптофан
Tip
UGG
Тирозин
Tyr
UAU, UAC
В контексте данного изобретения "фрагмент или часть" представляет собой любую часть или сегмент молекулы. Для CTLA 4 или CD28, фрагмент или часть является, предпочтительно, внеклеточным доменом CTLA4 или CD28, или его часть или сегмент, который распознает и связывает В7 или препятствует В7 так, что это блокирует связывание с CD28 и/или CTLA4. Также, в контексте данного изобретения, "соответствующий" означает идентичность обмена последовательности.
В контексте данного изобретения "производное" представляет собой молекулу, в которой доля сходства последовательности и активности его исходной молекулы. Например, производное CTLA4 включает растворимую молекулу CTLA4, обладающую аминокислотной последовательностью по меньшей мере 70% похожей на внеклеточный домен CTLA4 дикого типа и которая распознает и связывает В7, например, CTLA4Ig или растворимая мутантная молекула CTLA4 L104EA29YIg. Производное означает любое изменение в аминокислотной последовательности и/или химическом качестве аминокислоты, например, аминокислотные аналоги.
В контексте данного изобретения к "регуляции иммунных ответов" относится активирование, стимулирование, повышающая регуляция, ингибирование, блокирование, снижение, ослабление, понижающая регуляция или изменение иммунного ответа. Различные заболевания, например, аутоиммунные заболевания, можно лечить с помощью регулирования иммунного ответа, например, с помощью регулирования функциональных CTLA4 и/или CD28- позитивных клеточных взаимодействий с В7- позитивными клетками. Например, способ регуляции иммунного ответа включает контактирование В7-позитивных клеток с растворимой молекулой CTLA4, такой как те, которые получены в соответствии с настоящим изобретением, для формирования растворимых CTLA4/B7 комплексов, где растворимая молекула CTLA4 препятствует взаимодействию эндогенной CTLA4 и/или CD28 молекуле с молекулой В7. К "блокированию" или "ингибированию" рецептора, сигнала или молекулы, как изложено в настоящем изобретении, относится препятствование активации рецептора, сигнала или молекулы, как определено с помощью принятых в данной области техники тестов. Блокирование или ингибирование может быть частичным или общим.
В контексте данного изобретения "блокирование взаимодействия В7" относится к препятствованию
связывания В7 с его лигандами, такими как CD28 и/или CTLA4, тем самым мешающими взаимодействию Т-клеток и В-позитивных клеток. Примеры агентов, которые блокируют взаимодействия В7 включают, но не ограничиваются ими, молекулы, такие как антитела (или их часть), которые распознают и связываются с любыми CTLA4, CD28 или В7 молекулами (например, В7-1, В7-2); растворимые формы (или их часть) молекул, таких как растворимый CTLA4; фрагмент пептида или другие малые молекулы, предназначенные для вмешательства в клеточный сигнал посредством CTLA4/CD28/B7-опосредованного воздействия. В предпочтительном варианте блокирующий агент представляет собой растворимую молекулу CTLA4, такую как CTLA4Ig (ATCC 68629) или L104EA29YIg (ATCC PTA-2104); растворимую молекулу CD28, такую как CD28Ig (ATCC 68628); растворимую молекулу В7, такую как B7-Ig (ATCC
68627); моноклональное антитело анти-В7 (например, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226,
ATCC HB-301, ATCC HB-11341 и моноклональное антитело, как описано в патенте США № 6113898 или у Yokochi и соавт., 1982, J. Immunol, 128(2): 823-827); моноклональное антитело анти-CTLA4 (например, ATCC HB-304, и моноклональные антитела, как описано в противопоставленном материале 82-83); и/или моноклональное антитело анти-CD28 (например ATCC HB 11944 и MAb 9.3, как описано у Hansen и соавт., 1980, Immunogenetics, 10: 247-260, или Martin и соавт., 1984, J. Clin. Immunol, 4(1): 18-22). Блокирование взаимодействий В7 можно было определить с помощью принятых в данной области техники тестов, таких как определение снижения симптомов, связанных с иммунным заболеванием (например, ревматического заболевания), с помощью определения снижения взаимодействий Т-клеток/В7-клеток, или с помощью определения снижения взаимодействия В7 с CTLA4/CD28. Блокирование может быть частичным или общим.
В контексте данного изобретения эффективное количество молекул относится к количеству, которое блокирует взаимодействие молекулы с ее лигандом. Например, эффективное количество молекул, которое блокирует взаимодействие В7 с CTLA4 и/или CD28, представляет собой количество молекул, которое при связывании с В7 молекулами на В7-позитивных клетках, ингибирует В7 молекулы от связывания эндогенных лигандов, таких как CTLA4 и CD28. Кроме того, эффективное количество молекул, которые блокируют взаимодействие В7 с CTLA4 и/или CD28, является количество молекул, которое при связывании с молекулами CTLA4 и/или CD28 на Т-клетках, ингибирует В7 молекулы от связывания эндогенных лигандов, таких как CTLA4 и CD28. Ингибирование или блокирование может быть частичным или полным.
Для клинических протоколов желательно, чтобы фрагмент Ig белка слияния, такого как CTLA4 или мутантный CTLA4Ig, не вызывал вредного иммунного ответа у субъекта. Предпочтительным фрагментом является целая или часть константой области Ig, включая константную область Ig человека или низшего примата. Примеры подходящих областей Ig включают IgCy1 (IgC-гамма1), IgCy2 (IgC-гамма2), IgCy3 (IgC-гамма3), IgCy4 (IgC-гамма4), IgC|a (IgC-мю), IgCa1 (IgC-альфа1), IgCa2 (IgC-альфа2), IgC5 (IgC-дельта) или IgCe (IgC-эпсилон), включающие шарнир, СН2 и СН3 домены, или СН1, шарнир, СН2 и СН3 домены, которые участвуют в эффекторных функциях, таких как связывание с рецепторами Fc, комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) или антителозависимая клеточно-опосредованная цито-токсичность (ADCC). Фрагмент Ig может иметь одну или несколько мутаций в них (например, в СН2 домене для снижения эффекторных функций, таких как CDC или ADCC), где мутация изменяет способность Ig связывать свой лиганд путем повышения или снижения способности Ig к связыванию с рецепторами Fc. Например, мутации во фрагменте Ig могут включать изменения в частично или полностью его остатках цистеина в петле домена. Например, цистеины в положениях +130, +136 и +139 заменены на серин. Фрагмент Ig может также включать пролин в положении +148, замененный на серин. Кроме того, мутации во фрагменте Ig могут включать в себя имеющие лейцин в положении +144 заменен на фенила-ланин; лейцин в положении +145 заменен на глутаминовую кислоту; или глицин в положении +147 заменен на аланин.
Примеры
В следующих примерах изложены конкретные аспекты изобретения для пояснения изобретения и представлено описание настоящих способов для специалистов в данной области техники. Примеры не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение, Примеры только приводят конкретные методологии и пояснения, которые являются полезными для понимания и применения изобретения и его различных аспектах.
Примеры 1-5, как указано ниже, описывают эксперименты, относящиеся к способам культивирования клеток, включающих добавление глюкокортикоидов в способе проведения культивирования. Пример 1.
В данном исследовании были исследованы внутриклеточные эффекты дексаметазона (DEX) на процесс гликозилирования клеток СНО и внеклеточные эффекты, связанные с активностью сиалидазы. В данной работе впервые показано, что DEX способен улучшать сиалирование рекомбинантного слитого гликопротеина, продуцируемого СНО. Суммарный эффект DEX в обеспечении улучшенного сиалирова-ния был исследован в культивируемых встряхиваемых колбах, затем успешно подтверждён в контролируемых биореакторах, и привел к повышению содержания сиаловой кислоты, а также снижению процен-
та десиалирования в культурах с подпиткой. Клеточная линия и среда.
Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была первоначально субклонирована от DG44 первичных клеток и культивировалась в собственной безбелковой ростовой среде. Экспериментальные встряхимаемые колбы.
Эксперименты проводили в 250-мл встряхиваемых колбах (VWR international) с исходными объемами 100 мл и первичной плотностью клеток 6х105 клеток/мл. Культуры размещали на шейкере платформы (VWR international) при 150 об/мин и поддерживали при 37°С и 6% CO2 в течение десяти дней. Культуры отбирали ежедневно и рН доводили по мере необходимости, используя 1М углекислого натрия и подпиткой с глюкозой и глутамином каждые два дня для поддержания их на надлежащем уровне. Плотность клеток и жизнеспособность измеряли в рабочем порядке, используя автоматизированный счетчик клеток Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Germany). рН культуры и концентрации для глюкозы и глутамина измеряли автономно, используя Bioprofile Analyzer 400 (Nova Biomedical Corporation,
Waltham, MA).
Работа биореактора.
Биореакторные эксперименты проводили в 5-л биореакторах (Sartorius AG, Goettingen, Germany) с начальным рабочим объемом 1,5 л. Перемешивание, рН и растворенный кислород контролировали при 150 об/мин, 7,05 и 50% воздуха насыщения соответственно. Температуру изначально контролировали при 37°С, но было смещение на более низкую температуру в способе культивирования для продления жизнеспособности культуры. Биореакторы работали в режиме периодических культур с подпиткой и подпитывались каждый день, начиная с 3 дня собственной питательной средой для поддержания необходимых концентраций глюкозы и других питательных веществ. Образцы брали во время способа культивирования клеток и анализировали на плотность клеток, жизнеспособность клеток, субстратов и метаболитов.
Вестерн-блоттинг а2,3-сиалтрансферазы (a2,3-ST) и р1,4-галактозилтрансферазы (P1,4-GT).
Приблизительно 107 клеток СНО промывали в 1X фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), ли-зировали 1 мл Laemmli буфером для образца (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), затем денатурировали при 90°С в течение 5 мин. Весь клеточный лизат отделяли на 4-15% SDS-полиакриламидным гелем, пропускали в 0,4 мкм нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), и исследовали первичные и вторичные антитела. Первичные антитела были поликлональными антителами кролика против a2,3-ST человека и поликлональными антителами кролика против p1,4-GT человека (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Вторичные антитела были антикроличьи антитела, конъюгированные с перокси-дазой хрена (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Мембраны были сняты и повторно зондированы антителом с p-актином (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) и антимышиными вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Иммунологический анализ проводили с использованием усиленной хемилюминесценцией системы обнаружения Вестрн-блоттинга (GE Healthcare) и визуализировали с системой визуализации VersaDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Измерение активности сиалидазы в надосадочной жидкости.
Активность сиалидазы была исследована с использованием Amplex Red Neuraminidase (Sialidase) Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Кратко, нейроминидаза в образце использовалась для десиалирова-ния фетуина. Данное исследование использовало Amplex Red для обнаружения Н2О2, производимого окислением десиалированных остатков галактозы на фетуине с помощью галактозоксидазы. Н2О2 в присутствии HRP реагирует стехиометрически с реагентом Amplex Red для производства красного флюоресцирующего продукта окисления, резоруфина 5, который затем исследуется либо флюорометрически или спектрофотометрически. В каждом исследовании, 50 мкл рабочего раствора (100 мкМ Amplex Red, 0.2 Ед./мл HRP, 4 Ед./мл галактозоксидазы и 500 мкг/мл фетуина) добавляли в каждую лунку микропланшета, содержащую 50 мкл разбавленной надосадочной жидкости культуры клеток. После 30 мин инкубации при 37°С, образцы исследовали на поглощение при 560 нм, с использованием планшет-
ридера.
Анализ сиаловой кислоты.
Молярное отношение сиаловой кислоты к рекомбинантному белку рассчитывалось с помощью определения концентраций сиаловой кислоты и рекомбинантного белка. Сиаловая кислота (SA), включающая N-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac) и N-гликолилнейраменовую кислоту (Neu5Gc), высвобождалась путем кислотного гидролиза. Производные затем разделяли путем обратно-фазовой ВЭЖХ для определения содержания сиаловой кислоты. Концентрации белка определяли путем УФ-поглощения при
280 нм.
Содержание сиаловой кислоты отражается как молярное отношение, которое является суммой молей Neu5Ac и Neu5Gc на моль рекомбинантного гликопротеина. Содержания сиаловой кислоты отражаются как нормализированные значения, которые являются фактическим значением, деленным на произвольное значение. Одинаковый делитель использовали для нормализации всех данных содержания сиа-ловой кислоты в исследованиях, описанных в данном изобретении.
Измерение N-связанных олигосахаридов.
Анионобменная хроматография высокого рН с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD) была использована для профилирования N-связанных олигосахаридов (Basa и Spellman 1990; Townsend и Hardy 1991) для предоставления информации о сайт-специфическом N-связанном гли-козилировании. N-связанные олигосахариды отщеплялись от белка и разделялись на HPAEC-PAD на четыре домена, на основе количества присутствующей сиаловой кислоты. Домен I представляет асиало виды. Домены II, III и IV представляют собой сталированные виды и представляют моносиалированные, дисиалированные и три- и тетра-сиалированные виды соответственно. Фракция N-связанных сталированных видов представлена как процент N-связанных сталированных видов в общих N-связанных видов олигосахаридов, которые включают оба асиало и сталированные виды. Фракции N-сиалированных видов представлены как нормализированное значения, которые являются фактическими значениями, деленными на произвольное значение. Одинаковый делитель использовали для нормализирования всех данных фракции N-сиалированных видов в исследованиях, описанных в данном изобретении.
Измерение О-связанных олигосахаридов.
О-связанное гликозилирование характеризуется масс-анализом в неизменном виде образца для сравнения и очищенными Белком-А образцами белка слияния (ссылка). Образцы разводили в 100 мМ Трис, 25 мМ NaCl, рН 7,6 и инкубировали с PNG-азой F всю ночь для ферментативного удаления всех N-связанных олигосахаридов. Образцы были затем введены для масс-анализа в неизменном виде после смешивания с внутренними стандартами инсулина. Содержание О-связанной сиаловой кислоты представлено как молярное отношение, которое представляет собой моли О-связанной сиаловой кислоты на моль рекомбинантного гликопротеина.
Результаты.
Дексаметазон повышает содержание сиаловой кислоты и процент сиалированных видов в N-связанных олигосахаридах.
DG44 клеточную линию СНО, экспрессирующую слитый гликопротеин, обрабатывали различными уровнями DEX для определения любого воздействия DEX на содержание сиаловой кислоты и процент различных сиалированных видов. Данные исследования осуществляли в двух повторах 250 мл встряхиваемых колбах, используя условия культивирования, как описано выше. На второй день после посева, добавляли DEX к культурам клеток СНО в конечных концентрациях, начинающихся с 0,01 до 10 мкМ DEX. Культуры собирали на 10 день и слитые белки очищали с использованием белка А колонки и анализировали общее содержание сиаловой кислоты, содержание О-связанной сиаловой кислоты и N-связанного профиля. Сиалирование повышается в DEX-обработанной культуре в зависимости от концентрации (табл. 1).
Таблица 1
DEX обработк а (мкМ)
Процент увеличен ия SA (%)
Процент увеличен ия N-связанно й асиало-(%)
Процент
увеличен
ия N-
связанно
й-Моно-
(%)
Процент
увеличения
связанной-Ди- (%)
Процент
увеличения
связанной-Три и Тетра- (%)
Процент увеличения
связанной SA (%)
0,01
9,3
-8,6
6,6
13,9
4,5
0,0
13,0
-9,6
7,3
13,9
13,6
0,5
1,0
13,0
-10,0
4,3
19,4
15,9
0,9
20,4
-15,6
7,3
24,3
20,5
0,0
Концентрации DEX от 0,01 до 10 мкМ приводят к от 9,3 до 20,4% увеличения содержания сиаловой кислоты, с максимальным эффектом при 10 мкМ. По сравнению с контролем, хроматограммы N-связанного олигосахарида для культуры, обработанной DEX, показывают повышение моносиалирован-ных, дисиалированных и три-, а также тетра-сталированных фракций на величину от 4,3 до 7,3%, от 13,9 до 24,3% и от 4,5 до 20,5% соответственно. Напротив, было от 8,5 до 15,6% снижение по сравнению с контролем в асиало-фракциях в распределениях олигосахарида для DEX-обработанных культур. N-связанные хроматограммы также показывали максимальный эффект при 10 мкМ DEX. Эти результаты указывают на сиалирование в обработанных DEX культурах. Однако существенных изменений не наблюдалось в молярных отношениях О-связанной сиаловой кислоты от обработанных DEX образцов.
DEX способствует экспрессии p 1,4-галактозилтрансферазы (p1,4-GT) и а2,3-сиалилтрансферазы (a2,3-ST).
Вестерн-блоттинг использовали для выяснения возможных механизмов действия DEX на сиалирование путем исследования экспрессии двух ферментов, p1,4-GT и a2,3-ST, которые участвуют в путях добавления сиаловой кислоты. В данных экспериментах DEX добавляли на второй день после посева в
культуры в концентрациях от 0,1 до 10 мкМ и клетки собирали для вестерн-блоттинга через три дня. Белок домашнего хозяйства p-актин использовали для сравнения образца загрузки. Как показано на фиг. 1А и 1В, уровни экспрессии p1,4-GT и a2,3-ST повышаются в основном в культурах, обработанных DEX, по сравнению с культурами, не обработанными DEX. Интенсивность экспрессии для обоих ферментов обычно повышается с концентрацией DEX. Данные результаты показывают, что DEX способен стимулировать экспрессию сиалилтрансфераз p1,4-GT и a2,3-ST в клетках СНО.
Клеточный защитный эффект DEX приводит к снижению активности сиалидазы в надосадочной жидкости культуры клеток.
В примере 3 обработка DEX показывала увеличение экспрессии антиапоптического белка GILZ, приводящее к повышению жизнеспособности культур клеток СНО. Чтобы определить, является ли улучшение жизнеспособности клеток связанным с DEX, можно уменьшить деструктивное действие сиа-лидаз на рекомбинантный слитый белок, изучение встряхиваемых колб было инициировано для сравнения жизнеспособности клеток и профилей активности сиалидазы надосадочной жидкости от культур клеток в присутствии или отсутствии 1 мкМ DEX. Как показано на фиг. 2А и Фиг. 2В, повышение активности сиалидазы было связано со снижением жизнеспособности клеток как в DEX-обработанных, так и в необработанных культурах клеток. Жизнеспособность клеток снизилась от 98,0+0,1% на 4 день до 85,0+2,7% на 10 день в обработанных DEX культурах клеток в сравнении с жизнеспособностью на 10 день, составляющей 70,2+4,6% для контроля. Значение измерения абсорбции активности сиалидазы увеличилось от 0,006+0,002 на 4 день, до 0,024+0,003 на 10 день в обработанных DEX культурах клеток в сравнении со значением на 10 день 0,047+0,004 в контроле. Таким образом, скорость, при которой в обеих культурах клеток ухудшалась жизнеспособность клеток, а также повышалась активность сиалидазы, была значительно медленнее в DEX-обработанных культурах. Данные результаты показывают, что DEX способен ингибировать высвобождение сиалидазы посредством его клеточного защитного действия.
Сравнение дексаметазона с другими двумя глюкокортикоидами, гидрокортизоном и преднизоло-
ном.
Добавление глюкокортикоидных соединений, гидрокортизона (HYC) и преднизолона (PRD) также оценивали для определения, распространим ли эффект DEX на повышение сиалирования в клетках СНО на другие глюкокортикоидные соединения, DEX, HYP и PRD добавляли в культуральную среду клеток на второй день после посева в конечной концентрации 0, 0,1, 1 и 10 мкМ. На фиг. 3А и 3В показано нормализированное общее содержание сиаловой кислоты и нормализированная фракция N-связанных сталированных видов после 10-дневного культивирования при различных условиях глюкокортикоидов. Общее содержание сиаловой кислоты при концентрациях глюкокортикоидов в пределах от 0,1 до 10 мкМ, где от 12,4+0,4 до 14,0+0,5 для DEX, от 11,2+0,1 до 13,0+0,2 для HYC и от 11,8+0,2 до 13,4+0,8 для PRD, по сравнению с 10,2+0,2 для контроля. Фракция N-связанных сталированных видов при концентрациях глюкокортикоидов в пределах от 0,1 до 10 мкМ, где от 85,6+1,6 до 88,8+0,9 для DEX, от 79,8+1,6 до 89,6+0,1 для HYC и от 83,7+0,1 до 89,0+0,2 для PRD по сравнению с 77,1+0,7 для контроля. Таким образом, подобно DEX, оба HYC и PRD также показали повышение в сиалировании и максимальное действие наблюдалось при 10 мкМ для всех трех глюкокортикоидных соединений в исследуемом диапазоне концентраций. Однако, высокие концентрации HYC и PRD необходимы для достижения такого же уровня относительно повышения сиалирования, как DEX.
Механизм повышения сиалирования дексаметазоном включает глюкокортикоидный рецептор.
Для определения, было ли улучшение сиалирования от добавления DEX опосредовано глюкокорти-коидным рецептором (GR), антагонист GR мифепристон (RU-486) добавляли к культуральной среде клеток перед обработкой DEX. В частности, 1 мкМ RU-486 был добавлен 48 ч после посева и DEX в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкМ был затем добавлен спустя 24 ч. DEX также добавляли к культурам без RU-486 в качестве контроля. В условиях в присутствии или отсутствии RU-486, нормализированное общее содержание сиаловой кислоты и нормализированная фракция N-связанных сталированных видов индуцированы DEX, как показано на фиг. 4А и 4В соответственно. Способность DEX к увеличению продукта сиалирования была значительно снижена в присутствии 1 мкМ RU-486 и была наиболее выражена при условии 0,1 мкМ DEX. Общее содержание сиаловой кислоты и фракции N-связанных сталированных видов при условии 0,1 мкМ DEX снижается с 15,1+0,1 и 92,2+2,0 (без RU-486) до 12,7+0,1 и 81,5+0,8 (с 1 мкМ RU-486) соответственно. Данные результаты показывают, что механизм, посредством которого DEX повышает сиалирование, был GR-зависимым, так как RU-486 конкурирует с DEX в лиганд-связывании домена GR (Raux-Demay и соавт. 1990).
Применимость DEX при культивировании в подпитываемом биореакторе.
Влияние DEX на повышение сиалирования белков слияния, находящихся во встряхиваемой колбе, было затем протестировано в подпитываемых культурах с использованием контролируемых 5-л биореакторов. Биореакторы работали, как описано в разделе способы. Более высокое общее содержание сиало-вой кислоты (фиг. 5А) и фракции N-связанных сталированных видов (фиг. 5В) наблюдалось в культурах с добавлением шарика 1 мкМ DEX. Общее содержание сиаловой кислоты с DEX составило 16,5+0,1 по сравнению с 14,2+0,1 для контроля (16,2% повышения). Подобным образом, фракция N-связанных ста
лированных видов с DEX составила 90,2+1,3 по сравнению с 77,9+1,6 для контроля (15,8% повышение). В соответствии с наблюдением во встряхиваемой колбе исследований активности сиалидазы (фиг. 3А и 3В), общие содержания сиаловой кислоты снижаются в промежутке с 8 по 14 день с 17,9+0,1 до 16,5+0,1 (-7,8%) с DEX по сравнению с 16,3+0,1 до 14,2+0,1 (-12,9%) для контроля. Кроме того, процентное содержание сиалированной фракции в промежутке с 8 по 14 день понижается от 97,7+0,9 до 90,2+1,3 (-7,7%) с DEX по сравнению с 91,3+0,9 до 77,9+1,6 (-14,7%) для контроля.
Увеличение в сиалировании гликопротеина с помощью DEX было в дальнейшем подтверждено в биореакторах различных масштабов. Нормализированное конечное содержание сиаловой кислоты и нормализированное процентное содержание сталированных фракций от различных выполнений приведены на фиг. 6. В этих различных выполнениях, условие DEX включает выполнения с добавлением DEX в виде шарика или включенного в питательную среду. В соответствии с фиг. 6 DEX показывает значительное улучшение сиалирования с увеличением конечного содержания сиаловой кислоты (р-значение < 0,001 t -критерием) и конечной фракцией сталированных видов (р-значение < 0,0011 -критерием).
Заключение.
Добавление дексаметазона к культуре СНО, продуцирующей рекомбинантный слитый гликопроте-ин, приводит к повышению сиалирования. Данное исследование было первым для того, чтобы показать, что дексаметазон способен увеличивать экспрессию гликозилтрансферазы a2,3-ST и p1,4-GT и, что эффект дексаметазона был опосредован через глюкокортикоидные рецепторы. Общий эффект дексаметазо-на в улучшении сиалирования включает как внутриклеточные эффекты посредством гликозилтрансфе-раз, так и внутриклеточные эффекты посредством продления жизнеспособности культуры, которая снижается в присутствии высвобожденных сиалидаз в надосадочной жидкости культуры клеток посредством клеточного лизиса. Дексаметазон оказался подходящим способом для улучшения сиалирования.
Пример 2.
Клеточная линия и среда.
Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была первоначально субклонирована из DG44 родительских клеток и культивирована в безбелковой собственно питательной среде. Клетки-хозяины были генетически модифицированы для выделения IgG-белка слияния под контролем промотора CMV.
Экспериментальные встряхиваемые колбы.
Эксперименты проводились в 250-мл встряхиваемых колбах (VWR international) с начальным объемом 100 мл и начальной плотностью клеток 6х105 клеток/мл. Встряхиваемые колбы помещали на платформу шейкера (VWR international) при 150 об/мин скорости вращения. Клетки культивировали при стандартных условиях, увлажнение при 37°С и 6% СО2, в течение десяти дней с ежедневным регулированием значения рН, используя 1М карбоната натрия, и подпитывали глюкозой и глутамином каждые два дня для сохранения их определенного уровня. Плотность клеток, жизнеспособность клеток и субстраты/метаболиты автономно анализировали с помощью автоматизированной системы подсчета клеток Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Germany) и Bioprofile Analyzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA). Надосадочную жидкость, собранную от каждой культуры, собирали для SEC исследования.
Гель-хроматография (SEC).
SEC исследование производили в соответствии с ранее опубликованными способом (Perico и соавт., 2008) с некоторыми изменениями. Кратко, очистку Белком-А образцов проводили на ВЭЖХ системе Agilent 1100 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) на Tosoh Bioscience TSK-Gel G3000 SWx1 колонке (7,8 IDx30 см, 5 мкм частиц). Подвижная фаза содержит 1хфосфатно-солевой буферный раствор (PBS) при рН 7,4, расход жидкости был 9,5 мл/мин, а температура колонки котролировалась при 25°С. Сигнал контролировали по поглощению при длине волны 280 нм.
Вестерн-блоттинг глутатионредуктазы и глюкокортикоидного рецептора.
После промывания 1xPBS, приблизительно 107 клеток СНО лизировали с 1 мл Laemmli буфера для образца (Bio-Rad Laboratories) и денатурировали при 90°С в течение 5 мин. Весь клеточный лизат отделяли на 4-15% SDS-полиакриламидном геле, наносили на 0,45 мкм нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad Laboratories), и исследовали с первичными антителами и вторичными антителами. Первичным антителом для определения глутатионредуктазы было моноклональное антитело, вырабатываемое против аминокислот 391-510, расположенных вблизи С-конца глутатионредуктазы человеческого происхождения (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Хотя изначально китайский хомячок не был указан производителем для обнаружения глутатионредуктазы с использованием данных антител, предварительный эксперимент показал, что имеется только одна полоска, обнаруженная в лизатах от обоих клеток СНО и клеток HL60 человеческого происхождения с идентичным молекулярным размером на пятне. Первичное антитело, используемое для обнаружения глюкокортикоидного рецептора, было античеловеческим мо-ноклональным антителом (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Вторичное антитело было антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Мембраны были сняты и повторно зондированы антителом с p-актином (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, СА) и антимышиными вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Иммунодетек
цию проводили системой обнаружения вестерн-блоттинга с повышенной хемилюминесценцией (GE Healthcare) и визуализировали с системой визуализации VersaDoc (Bio-Rad Laboratories). Результаты.
Дексаметазон (DEX) снижает агрегацию продуцируемых СНО IgG-слитых белков в широком диапазоне концентраций.
На фиг. 7 показано значительное снижение процентного содержания высокомолекулярных (HMW) видов в IgG-слитых белков после обработки клеток СНО DEX в конечной концентрации 1 мкМ в культу-ральной среде. Основными компонентами HMW видов были димеры и тримеры, формируемые кова-лентно или нековалентно, и категорически рассматриваемые как белковые агрегаты. Учитывая, что 15% снижение агрегации белка было обнаружено в условиях культивирования, которые были оптимизированы, улучшение было практически важно для производственного процесса. Для определения доза-зависимой кривой и зависимости от времени для эффектов DEX на агрегацию белка, авторы настоящего изобретения культивировали клетки либо при различных концентрациях DEX, либо при той же концентрации (1 мкМ), но с различным временем инкубации. Как показано на фиг. 7С, DEX в зависимости от времени снижается скорость агрегации белка, что соответствует предыдущим наблюдениям зависимости от времени DEX на улучшение жизнеспособности клеток и профили гликозилирования белка (табл. 1 и фиг. 11). Однако, зависимое от концентрации влияние DEX на снижение уровня агрегации белка не было очевидно (фиг. 7В), что позволяет предположить, что антиагрегационный эффект был связан не только с улучшением жизнеспособности клеток, так как предыдущие результаты авторов настоящего изобртения показали, что жизнеспособность клеток СНО была повышена при концентрации DEX от 0,01 мкМ до 10 мкМ в культуральной среде.
Дексаметазон активирует экспрессию глутатионредуктазы в клетках СНО.
Вестерн-блоттинг производился для обнаружения экспрессии глутатионредуктазы в целом клеточном лизате, приготовленном из клеток СНО, обработанных различными концентрациями DEX. Как показано на фиг. 8, DEX повышает экспрессию глутатионредуктазы, которая может быть увидена даже, когда препарат был при 1 нМ. Обнаружение p-актина используется для сравнения образца загрузки для исключения возможности того, что расширение полоски глутатионредуктазы было обусловлено совпадением повышения образца загрузки.
GSH снижают агрегацию очищенного IgG-белка слияния in vitro.
Для определения, может ли сам GSH влиять на агрегацию белка путем прямого взаимодействия с белками, авторы настоящего изобретения провели исследование in vitro путем добавления GSH к IgG-белками слияния, очищенным Белком-А, которые восстанавливали в трис-ацетатном буфере, и анализировали профили SEC. Как показано на фиг. 9, процентное содержание высокомолекулярных видов был значительно снижено с уменьшением скорости 15,3 и 27,3% в присутствии 1 и 3 мМ GSH соответственно. Данные наглядно демонстрируют, что GSH может напрямую ингибировать агрегацию IgG-белков слияния.
Эффекты дексаметазона являются опосредованными через глюкокортикоидные рецепторы.
DEX представляет собой сильнодействующий глюкокортикоид с широким фармакологическим действием. Для определения, был ли ингибирующий эффект DEX на агрегацию IgG-слитого белка специфически опосредован через активацию глюкокортикоидных рецепторов, сначала подтвердили, что существует эндогенная экспрессия глюкокортикоидных рецепторов (GR) в используемой клеточной линии, которая представлена на фиг. 10А. Поскольку антитело, используемое в Вестерн-блоттинге, было индуцировано против консервативной области человеческого GR, весь образец клеточного лизата клеток HepG-2 был также загружен как образец человеческого происхождения с целью проверки антитела. Хотя антитело может обнаруживать оба GRa и GRP, данный анализ показывает только одну группу. Это может быть вызвано тем, что молекулярные массы этих двух изоформ (95 кДа против 90 кДа) были слишком близки, чтобы их разделить на 5-15% градиентном геле или, более вероятно потому, что в образцах была представлена только одна изоформа.
Так как было обнаружено, что DEX активирует экспрессию глутатионредуктазы в клетках СНО (см. фиг. 8), дальнейшая оценка была направлена на то, чтобы определить, был ли этот эффект вызван активацией GR рецепторов. RU-486 представляет собой антагонист GR и широко используется как обрабатывающий препарат во многих GR связанных исследованиях. Предварительный эксперимент авторов изобретения показывает, что RU-486 не действует на жизнеспособность клеток СНО и метаболические параметры, если его концентрация не превышает 1 мкМ; при 10 мкМ наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток и скорости роста клеток. В последующих экспериментах, RU-486 был поэтому использован при 1 мкМ или более низких концентрациях и вводился в культуру до обработки клеток СНО, за день до добавления DEX. На фиг. 10 показано, что в присутствии 1 мкМ RU-486 активация эффекта DEX на экспрессию глутатионредуктазы была ослаблена, подтверждая участие GR.
В заключении, процентное содержание HMW видов в IgG-слитых белках, продуцируемых клетками СНО, обработаными 1 мкМ DEX и его сочетанием с разлиными концентрациями RU-486, было определено. В соответствии с результатами на фиг. 7В процентное содержание HMW видов было снижено примерно на 17%, тогда как культура клеток была обработана только 1 мкМ DEX, и этот эффект был посте
пенно уменьшен с повышением концентраций RU-486 (фиг. 10С). При условии, что использовали одинаковую концентрацию DEX и RU-486, скорость ингибирования HMW видов составляна приблизительно половину скорости, полученной с одним DEX, указывая на то, что DEX в качестве агониста и RU-486 в качестве антагониста имели подобное сходство для конкурирования друг с другом в отношении GR в клетках СНО. Таким образом, принятые все три части данных на фиг. 9 тесно связаны, результаты наглядно демонстрируют, что ингибирование агрегации IgG-слитого белка было опосредовано через GR. Вывод.
В качестве недорогого, но сильнодействующего глюкокортикоида и с его полезной триадой, улучшающей жизнеспособность клеток, как описано в примере 3, и гликозилирование, как описано в примере 1, и ингибирование агрегации белка, как описано здесь, дексаметазон может обеспечить простой, бюджетный и эффективный способ для общего улучшения способа культивирования клеток.
Пример 3.
Данное исследование впервые показало, что дексаметазон способен предупреждать апоптоз клеток СНО в бессывороточных условиях в зависимости от концентрации и времени. DEX индуцирует экспрессию гена GILZ (индуцируемая глюкокортикоидами лейциновая "молния") в клетках СНО. DEX успешно применяли при культивировании СНО в 10-л биореакторе для улучшения жизнеспособности клеток и производительности Fc-слитого белка и содержания сиаловой кислоты. Данное исследование показало применимость DEX в промышленном культивировании клеток для улучшения продуктивности рекомби-нантного белка и гликозилирования.
Клеточная линия и среда.
Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была субклонирована из родительских клеток DG44 и культивирована в собственной химически определенной ростовой среде. Эксперименты во встряхиваемых колбах.
Эксперименты проводили в 250-мл встряхиваемых колбах (VWR international) с начальными объемами 10 мл и начальной плотностью клеток 6х 105 клеток/мл. Культуры помещали на платформу шейкера (VWR international) при 150 об/мин и поддерживали при 37°С и 6% СО2 в течение десяти дней. Культуры отбирали ежедневно и рН регулировали, используя 1 М карбоната натрия, и подпитывали глюкозой и глутаминов каждые два дня до того, чтобы сохранить их на определенном уровене. Плотность и жизнеспособность клеток измеряли автономно Bioprofile Analyzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham,
MA).
Работа биореактора.
Биореакторные эксперименты проводили в 10-л биореакторах (Sartorius Stedim Biotech, France) с начальным рабочим объемом 5л. Перемешивание, рН и растворенный кислород находились под контролем при значениях 150 об/мин, 7,05, и 50% насыщение воздухом соответственно. Температуру изначально контролировали при 37°С и смещали на более низкую температуру в течение культивирования для продления жизнеспособности культуры. Биореакторы были работающими в режиме периодической подпитки, их подпитывали ежедневно, начиная с 3 дня собственной питательной средой для сохранения достаточных концентраций глюкозы и других питательных веществ. Пробы были взяты в течение способа культивирования клеток и анализированы на плотность клеток, жизнеспособность клеток, субстратов и метаболитов.
qRT-ПЦР анализ.
Анализ количественной RT-ПЦР реальном времени с TaqMan(r) 5'-нуклеазой был проведен для под-твержения повышенной с помощью DEX регуляции GILZ. Общую РНК, очищенную из каждой утроенной культуры с добавлением или без добавления 1 мкМ DEX, использовали набор RNeasy(r) midi, как описано выше. Очищенная РНК была обработана RNasefree DNaseI (Qiagen), a затем применялась в качестве матрицы для синтеза первичной к ДНК, используя набор RT2 First Strand Kit (SA Biosciences, Frederick, MD). Экспрессию GILZ количественно определяли, изпользуя GILZ специфический TaqMan MGB зонд (6-FAM-AGAGGACTTCACGTGT) и праймеры (прямой: 5 -CCTCCCTCATCTGTCCACTGA-3 и обратный: 5-TGGTGGGTTTGGCATTCAA-3). 20 нг к ДНК было амплифицировано с использованием 900 нМ праймеров и 250 нМ зонда в 1х TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Реакции проводили в трех повторах на Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System с применением универсальных параметров цикла (20 с при 95°С, 40 циклов по 3 с при 95°С, 30 с при 60°С). Параллельные реакции были поставлены на той же пластине анализирующей p-актин в каждой пробе в качестве эндогенного контроля. Пороговый цикл каждого гена был нормализирован против прогового цикла "гена домашнего хозяйства" p-актина. Нормализированные изменения в экспрессии гена по отношению к контролю рассчитывали с использованием способа дельта-дельта порогового цикла (Livak и
Schmittgen, 2001).
Вестерн-блоттинг GILZ.
Приблизительно 107 клеток СНО промывали в 1X фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), ли-зировали с 1 мл Laemmli буфере для образца (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), а затем денатурировали при 90°С в течение 5 мин. Весь лизат клеток отделяли на 4-15% SDS-полиакриламидном геле, про
пускали через 0,45-мкм нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad Laboratories), и исследовали с первичными мышиными моноклональными антителами, направленными на GILZ (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), с последующей конъюгацией с пероксидазой хрена (HRP) антимышиных вторичных антител (Santa Cruz Biotechnology). Мембраны были сняты и повторно зондированы антителом с Р-актином (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) и антимышиными вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Иммунологический анализ производили с системой обнаружения Вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (GE Healthcare UK Limited Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) и визуализировали с системой визуализации VersaDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Измерение титра.
Титр определяли путем аффинной хроматографии с использованием насоса ВЭЖХ и УФ детектирования (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) и Applied Biosystems Poros A/20 колоки с белком А (100х4.6 мм). Элюированный белок был количественно определен с использованием 10-уровневой стандартной кривой.
Результаты.
Действие дексаметазона на рост клеток СНО.
Глюкокортикоид дексаметазон (DEX) добавляли во встяхиваемые колбы к культурам в конечной концентрации от 0,01 до 10 мкМ через два дня после посева для определения действия глюкокортикои-дов на жизнеспособность клеток СНО и возможность продления периода культивирования клеток. Профиль плотности жизнеспособных клеток (VCD) в исследовании влияния величины дозы (фиг. 11А) показал повышение ингибирования роста клеток, происходящее в первый день после обработка DEX в зава-сисмости от дозы. Пик VCD достиг 8,5х106 клеток/мл в не обработанной контрольной культуре, тогда как пик VCD был 6,5х106 клеток/мл в культурах, обработанных 10 мкМ DEX. Жизнеспособность клеток снижалась стремительно после 6 дня (фиг. 11В), а процент жизнеспособности на 10 день составил только 42,1%. В отличие от этого, конечная жизнеспособность клеток при 0,01 и 10 мкМ DEX составила 53,1 и 64,0% соответственно. Потеря жизнеспособности начинается на 6 день улучшаться в зависимости от концентрации DEX в обработанных культурах, с максимальным действием при 10 мкМ (фиг. 11А и 11В).
Исследование в зависимости от времени для добавления DEX затем проводили на культурах во встряхиваемых колбах, в которые DEX добавляли в конечной концентрации 1 мкМ и добавляли в период между днем посева по шестой день после посева. Как показано на Фигурах ПС и 11D, конечная VCD и жизнеспособность клеток увеличивается во всех DEX-обработанных культурах, и оба VCD и жизнеспособность клеток улучшаются в зависимости от времени более раннего добавления DEX. Жизнеспособность не обработанных культур клеток СНО снизилась на 50% на 10 день, при этом культуры, в которых DEX добавляли на 0, 2, 4 и 6 дни, была 63, 68, 72 и 74% соответственно.
DEX снижает удельную скорость роста клеток, но увеличивает удельную продуктивность клеток.
Удельная скорость роста, нормализированная объемная производительность и нормализированная удельная продуктивность клеток была количественно определена и сравнена между DEX-обработанными и не обработанными клетками. Данные сравнения удельной скорости роста клеток и профилей нормализированной производительности с добавлением или без добавления 1 мкМ DEX показаны на фиг. 12 А и 12В (n=5). DEX добавляли на 2 день, в результате чего приблизительно на 30% снижалась удельная скорость роста с DEX по сравнению с контролем на день после добавления DEX. Однако, данное действие задержки роста снижается со временем культивирования. В конце периода культивирования скорость гибели клеток замедляется в культурах обработанных DEX клеток. Кроме того, ранняя задержка роста клеток, вызванная DEX, не влияет на объемную производительность (6,5 для всех культур); однако, культуры, обработанные DEX, имеют значительно более высокую продуктивность, чем не обработанные клетки, с максимальной удельной продуктивностью (7,0+0,6)х10-9.
Повышение экспрессии GILZ с помощью DEX подтверждено qRY-ПРЦ и Вестерн-блоттингом.
GILZ был анализирован с использованием qRT-ПЦР для проверки профелей экспрессии гена, полученных путем исследования микрочипа. Образцы РНК от 5 и 8 дней для обработанных DEX и не обработанных утроенных культур применялись в количественном анализе TaqMan(r) qPCR. Паралелльные реакции были поставлены на той же пластине, анализирующей p-актин в каждой пробе в качестве эндогенного контроля. Как показано на фиг. 13А, нормализированный профиль экспрессии изменений GILZ, полученный qRT-ПЦР на 5 день и 8 день образцов, составил 7,66+1,08 и 10,48+2,16 соответственно.
Лизаты клеток от культур на 5 день, обработанных и не обработанных 1мкМ DEX анализировали с помощью Вестергн-блоттинга для проверки любой сверхэкспрессии GILZ в обработанных DEX культурах. Пятно было также повторно зондировано с антителом бета-атина в качестве контроля для определения эквивалентной загрузки геля. Как показано на фиг. 13В, экспрессия белка GILZ значительно повышается в обработанных DEX образцах по сравнению с не обработанными образцами. Кроме того, кратное изменение GILZ, вызванное DEX, немного выше в образцах 8 дня, чем образцах 5 дня, что соответствует результатам qRT-ПЦР.
Сравнение дексаметазона с другими двумя глюкокортикоидами, гидрокортизоном и преднизоло-
ном.
Эксперименты во встряхимаемых колбах затем проверяли, действительно ли защитное действие DEX на жизнеспособность клеток СНО ограничивается DEX, или может быть распространена на другие глюкокортикоидные соединения, такие как гидрокортизин (HYC) и преднизолон (PRD). DEX, HYC и PRD (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) добавляли через два дня после посева в конечных концентрациях 0, 0,1, 1 и 10 мкМ для каждого из этих трех соединений. Пик VCD. Конечная VCD и конечная жизнеспособность культивированных клеток представлены в табл. 2.
Таблица 2
Концентрация
обработки
(мкМ)
Пик VCD
(хЮ6
клетки/мл)
Конечная VCD
(хЮ6
клетки/мл)
Жизнеспосо бность(%)
Дексаметазон (DEX)
7,99
7,64
72,3
9,02
8,40
75,8
7,49
7,38
82,3
Гидрокортизон (HYC)
10,06
7,86
60,1
9,51
8,15
65,1
8,44
7,80
75,5
Преднизолон (PRD)
8,99
8,26
69,4
9,25
8,79
76,8
8,05
8,27
77,5
Контроль
Нет данных
8,69
7,56
56,6
Подобно DEX, HYC (60,1-75,5% конечная жизнеспособность) и PRD (69,4-75,5% конечная жизнеспособность) таже показывают защитное воздействие на клетки в зависимости от дозы. Жизнеспособность на 10 день составила 56,6% для контроля по сравнению с жизнеспособностьями на 10 день с концентрациями 0,1 и 10 мкМ для DEX, составившими 72,3 и 82,3%; для HYC - 60,1 и 75,5%; и для PRD -69,4 и 77,5% соответственно. Таким образом, все три глюкокортикоидных соединения продлевают жизнеспособность культуре с максимальным действием при 10 мкм для всех трех глюкокортикоидных соединений.
Подавление гибели под влиянием дексаметазона включает GILZ и глюкокортикоидный рецептор.
Для определения того, было ли повышение жизнеспособности из-за добавления дексаметазона опосредовано GILZ и глюкокортикоидным рецептором (GR), антагонист GR мифепристон (RU-486) добавляли к культуральной среде клеток перед обработкой DEX. В условиях с содержанием или без содержания RU-486, процентное увеличение конечной жизнеспособности клеток, индуцированной DEX, показано на фиг. 14А. Способность DEX улучшать жизнеспособность клеток была значительно снижена в присутствии 1 мкМ RU-486. Процентное увеличение жизнеспособности клеток, индуцированное 0,1 и 1 мкМ DEX, снижается от 30,5 и 32,6% (без содержания RU-486) до 4,7 и 5,7% (с содержанием 1 мкМ RU-486) соответственно. В то же время анализ qRT-ПЦР (фиг. 14В) показывает, что в присутствии 1 мкМ RU-486, регуляция действия DEX на экспрессию GILZ значительно ослаблена. Кратность изменения, вызванная 0,1 и 1 мкМ DEX, снижается от 9,0+1,9 и 11,3+3,0 (без добавления RU-486) до 1,8+0,9 и 2,3+1,0 (с добавлением 1 мкМ RU-486) соответственно. Анализ Вестерн-блоттинга (фиг. 14С) далее подтвердил значительное снижение сверхэкспрессии белка GILZ в присутствии 1 мкМ RU-486. Данные результаты показывают, что механизм, через который DEX повышает жизнеспособность, вовлекает GILZ и является GR-зависимым, поскольку RU-486 конкурирует с DEX за лигандсвязывающий участок GR.
Применение дексаметазона при подпитываемом культивировании в 10-л биореакторе.
Подпитываемое культивирование в 10-л биореакторах проводили для определения того, может ли быть эффект DEX, наблюдаемый во встряхиваемых колбах, масштабирован на биореакторы. Общая задача DEX была в подавлении гибели клеток, продлении срока жизни культуры клеток и, как следствие, повышение продукции гликопротеина для процесса в биореакторах. В данном исследовании были использованы три биореактора с использованием одинаковых условий, описанных выше; 1 мкМ DEX добавляют к двум биореакторам на 2 день или на 7 день соответственно. В отличие от встряхиваемых колб, время выполнения в биореакторе продлили до 14 дней, температура культуры клеток была сдвинута в сторону более низкой температуры в конце экспоненциальной фазы культивирования и собственная пи
тательная среда была использована взамен подпитки только глюкозой и глутамином.
Биореакторы с добавленным DEX либо на 2 день или 7 день достигают максимальной плотности клеток, составляющей приблизительно 8,3х106 клеток/мл на 8 день, по сравнению с 7,8х106 клеток/мл без добавления DEX (фиг. 15А). Добавление DEX снижает скорость гибели клеток в биореакторах. Жизнеспособность клеток составляла 94% жизнеспособности при всех условиях на 6 день (фиг. 15В). К 14 дню процент жизнеспособности снизился до 29% без добавления DEX, по сравнению с 55% и 39% с добавлением DEX на 2 день и 7 день соответственно. Конечная VCD на 14 день с добавлением DEX на 2 или 7 день составила 4,1 и 3,5х106 клеток/мл, соответственно, по сравнению с 2,8х106 клеток/мл без добавления DEX. Нормализированные титры белка составили приблизительно 5,5 на 7 день до максимального VCD (фиг. 15С). Впоследствие, продукция белка в течение стационарной фазы и фазы гибели культур была на высоком уровне в биореакторах с добавлением DEX. На 14 день собранные нормализированные титры составили 12,5 в обоих биореаторах с добавленным DEX, по сравнению с 10,5 без добавления DEX, повышение составило 20%.
Вывод.
Достижения авторов изобретения по средней оптимизации привели к неожиданному обнаружению того, что глюкокортикоиды могут значительно ослаблять снижение жизнеспособности клеток в подпитываемых культивируемых клетках СНО. В механизм исследования данного феномена вовлечена повышенная регуляция антиапоптического гена GILZ, определенная посредством qRT-ПЦР и анализом Вес-терн-блоттинга. Исследуя действия аналогов и антагониста DEX на рост клеток СНО, была определена роль GILZ и глюкокортикоидного рецептора в посредничестве действия DEX. Эксперименты в подпитываемых биореаторах показали, что данные аналоги глюкокортикоидов являются эффективными, целесообразными и экономичными химическими веществами для ослабления снижения жизнеспособности в клеточных культурах.
Пример 4.
В данном исследовании действие дексаметазона (DEX) на рост клеток СНО, сиалирование белка и агрегацию были изучены на другой клеточной линии СНО с отличительной секрецией гликопротеина
(CTLA4Ig).
Клеточная линия и среда.
Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была изначально субклонирована от родительских клеток DG44 и культивирована в собственной химически-определенной ростовой среде. Эксперименты во встряхиваемых колбах.
Эксперименты проводили в 250-мл встряхиваемых колбах (VWR international) с начальными объемами 100 мл и начальной плотностью клеток 6х105 клеток/мл. Культуры помещали на платформу шей-кера (VWR international) при 150 об/мин при 37°С и 6% СО2 в течение десяти дней. Культуры отбирали ежедневно и рН регулировали при необходимости, используя 1М карбоната натрия, и подпитывали глюкозой и глутамином каждые два дня для поддержания их на соответствующем уровне. Глюкокортикоид дексаметазон (DEX) добавляли в конечной концентрации в пределах 0,001-10 мкМ на 2 день. Плотность и жизнеспособность клеток измеряли автономно, с использованием автоматизированного счетчика клеток Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Germany). pH культуры и концентрации для глюкозы и глутамина были измерены автономно, с использованием Bioprofile Analyzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA). Надосадочные жидкости от полученных культур были собраны для анализа содержания сиаловой кислоты и уровня HMW.
Анализ содержания сиаловой кислоты и HMW.
Исследование содержания сиаловой кислоты и HMW проводили, как указано в предыдущих примерах.
Результаты.
Действие дексаметазона на рост клеток СНО.
Глюкокортикоид дексаметазон (DEX) добавляли к культурам во встряхиваемых колбах в конечной концентрации от 0,001 до 10 мкМ через два дня после посева для определения действий DEX на жизнеспособность клеток СНО и возможность продления периода культивирования клеток. Профиль плотности жизнеспособных клеток (VCD) в исследовании влияния величины дозы (фиг. 16А) показывает повышение ингибирования роста клеток, возникающее после обработки DEX, хотя зависимость от концентрации не очевидна в исследуемом диапазоне. Пик VCD достигает 13,9х 106 клеток/мл в не обработанном контроле клеток, в то время как пик VCD колебался от 10,6х106 до 12,7х106 клеток/мл в культурах, обработанных от 0,001 до 10 мкМ DEX. Жизнеспособность клеток для необработанных культур снижалась стремительно после 6 дня (фиг. 16В) и процент жизнеспособности на 10 день был только 64,5%. В отличие от этого, конечная жизнеспособность клеток с 0,001 мкМ и 10 мкМ DEX составила 75,5 и 82,3% соответственно.
Дексаметазон повышает сиалирование и снижает HMW уровень гликопротеина CTLA4Ig. Кроме роста клеток, действия DEX на содеражание сиаловой кислоты и уровень HMW были также определены. По сравнению с необработанными культурами, процентное содержание сиаловой кислоты
повышается (фиг. 17А), а процентное содержание видов HMW снижается (фиг. 17В), вызванные различными концентрациями DEX, как показано на фиг. 17. Очевидно, что DEX способен увеличивать сиали-рование и снижать HMW виды гликопротеина, что указывает на улучшение качества белка, даже при концентрации 0,001 мкМ. Зависимость от концентрации DEX на содержание сиаловой кислоты и HMW видов не очевидно, как концентрация DEX выше 0,01 мкМ.
Данные результаты показывают, что действия DEX на улучшение жизнеспособности клеток, улучшение сиалирования гликопротеина и снижение агрегации не ограничены ни одной переходной одноклеточной формой или составом среды.
Пример 5.
В данном исследовании практическая возможность применения DEX в культуральной среде клеток для масштабного производства рекомбинантного гликопротеина показана в размере 500 и 5000 л биореакторов.
Клеточная линия и среда.
Клеточная линия СНО, используемая в данном исследовании, была субклонирована из родительских клеток DG44 и культивирована в собственной ростовой среде. Работа биореатора.
Эксперименты в биореаторах проводили в 7-, 500- и 5000-л биореакторах с начальным рабочим объемом около 3, 300 и 3000 л соответственно. Все биореаторы начинали работу при 37°С и переходили к снижению температуры, когда клетки вступали в фазу продукции для того, чтобы продлить период культивирования клеток. рН и растворенный кислород поддерживали при 7,05 и 50% насыщения воздуха. Скорость перемешивания для размеров 7, 500 и 5000 л составляла 180, 75 и 60 об/мин соответственно. Все эксперименты в биореакторах проводили в подпитываемом режиме с ежедневным питанием безбелковой средой для поддержания определенного уровня глюкозы и других питательных веществ. Дексаме-тазон включают в питательную среду на всех производственных масштабах с целью повышения жизнеспособности клеток и сиалирования белка. Образцы были взяты во время способа культивирования клеток и анализированы на плотность клеток, жизнеспособность клеток, субстраты и метаболиты.
Исследование титра, содержания сиаловой кислоты и HMW проводили, как описано в ггоедыдущих примерах.
Результаты.
На фиг. 18А и 18В представлена производительность биореактора относительно роста и жизнеспособности клеток. Рост клеток посредством увеличения объема от 7 л до 5000 л наблюдался в похожих пиках плотности жизнеспособных клеток в пределах от 12 до 13х106 клеток/мл с погрешностью, представляющей стандартное отклонение выполнений определенных масштабов, частично совпадающих в каждой точке. Плотность клеток достигает максимума на 7 день в масштабе 5000 л и на 8 день для масштабов 7 и 500 л. На 14 день средняя величина жизнеспособности культур клеток составляла 88, 84 и 91% в 7, 500 и 5000 л масштабах биореатора соответственно. На фиг. 18С и 18D преставлена продуктивность и профили сиаловой кислоты для 7-, 500- и 5000-л биореакторов. Титры на 14 день (сообщенное и нормализованное значение) составляли 13,2, 11,6 и 13,6 для 7-, 500- и 5000-л реакторов соответственно. Пик уровней сиаловой кислоты (сообщенное и нормализированное значение) составлял 16,0, 18,0 и 19,0 при возрастающих масштабах. Сиаловая кислота уменьшилась приблизительно 2,6 единиц к концу проведения для всех масштабов.
Вывод.
В целом включение дексаметазона в питательную среду эффективно во всех масштабах, что указывает на практическую применимость дексаметахона в качестве добавки к питательной среде для получения в промышленных масштабах.
Способ культивирования клеток для получения гликозилированной рекомбинантной молекулы CTLA4Ig, включающий:
а) культивирование клеток СНО, которые продуцируют указанную молекулу CTLA4Ig в культуре
клеток в условиях, которые обеспечивают получение белка;
б) питание клеток питательной средой, содержащей дексаметазон, причем концентрация дексамета-
зона поддерживается в культуре клеток в пределах от 0,1 до 10 мкМ;
при этом молекула CTLA4Ig представляет собой слитую молекулу мутантного внеклеточного домена антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и иммуноглобулина (Ig) и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 26/27-383 аминокислотным остаткам последовательности SEQ ID NO: 4.
ATCGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTOGTCCTTQCACTCCTGTTTCCA -19
MJ.0--V--L--b--T--Q-R-T -L--b--S--b--V--L--A--L--L--F -P-- -7
AGCATGGCGAOCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTaCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGA +4 2
S--M--A--S--M--A--M--H--V--A--Q--P--A--V--V--b--A.--S--S--R-- +14
GGC ATCGCTAGCTTTGTQTGTGAGTATGCATCrCCAGGCAAAG CCACTGAGGTCCGGGTG +102
GT-I--A--S--F--V--C--E--Y-.-A--S--P--G--K--A--T--E--V--R--V-- +34'
AeAGTQCITCGQCAGGCTGACAGCCAGGTGaCTGAAGTCTGTGCGGCAACC'TACATGATG +162
T7-V--b--R--Q--A-D--S--Q--V--T--B--V-C--k--A--T--Y--M--M-- ' +54
GGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCAGGGGCACCTCCAGTGGAAATCAA +2 22 G;-H--E..L--T--F--b--D--D--S--I--C--T--G--T--S--a--a--H--Q-- +74
GTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACA'f CTOCAAGGTG +28 2
V--N--L--T--I--Q^-G--L--R--A--M--D--T--G--l4--,r--I--C--K--V-- + 94
GAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGOCATAGGCAACGGA?.CCCAGATTTATGTA + 3 42 Er-L-.M--Y-~P--P--P--Y--Y--L--G--I--G--N--G--T--Q--I--Y--V-- +1J.4
ATTGATCCAGAACGCTGCCCAaATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCAC +402 Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки.P--C--P--D--S--D--Q--E--P--K--S--S--D--K--T--H- +134
ACATCCCCACCGTCCCCAOCACCTGAACTCCTGGGTGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC +462 •E--S--P--P--S--P--A--P--B--L--I,--G--G--S--S--V--P--b--F--P-- +154
CCAAAACCCAAGGACAGGCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG +522
P--K--P--K--D--T - L--M--I--S--R--T--P--B--V--T--C--V--V--V-- +174
GACGTGAGCCAGGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACXGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG + 582
D--V--S--H--E--D--P--B--V--K--P--H--W--Y--V--D--G--V--B--V-- +19 4
CATAATGCCAAGACAAAGCCQCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGC +642
H--N--A--K--T--K--P--R--E--E--Q--Y--H--S--T--Y--R--V--V--S-- +214
GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACrraGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAQGTCrCC +7 02
V--L--T--V--L--H--Q--D--W--b--N--G--K--E--Y--K--C--K--V--S-- +2 3 4
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA +762
N--K--A--b~-P--A--P~-l--E--K--T--I--S--K--A--K--G--Q--P--R-- +254
GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAQGTCAQC +822
E--P--Q--V--Y--T--L--P--P--S--R--D--B--L--T--K--H--Q--V--S- - +274
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT +BB2
L--T--C--L--V--K--G--P--Y--P--S--D--I--A--V--E--W--E--S--N-- +2 94
aGGCAGCCGGAGAACAACTACaAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC +942
Q.-Q.-P--B--M--N--Y--K--T--T--P--P--V--I.--D--S--D--G-:S--F-- +314
ITCCTCTACAGCAAQCTCACCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC A +100 2
F..L..V-.S__K--L--T--V--D--K--S--R--W--Q--Q--G--N--V--F--S~- +3 34
TGGXCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT + 1062
C--S--V--M--H--E--A--L--H--K--K--Y--T--C!--K--S--L--S--L--a-- +354
CCGGGTAAATGA P--G--K--*
Фиг. 19
ATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCXGCTCAGTC1 COGTCCTTGCACTCCTGTTTCCA -19
Mi-G--V--b-L--T--Q--R--T--L--b--S--L--V--L--A--L--L--I'--P-- -7
AGCATGGCGAGCATGaCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTG'IGGTACTGGCCAGCAaCCGA + 42
S - M--A--S-M--A--M--H--V--A-Q--P--A--V--V--L--A--S--S--R-- +14
GGCATCGCTAGCTTXGTGTGTGAGTATGCAXCTCCAGGCAAAIATACTGAGGTCCGGGTG +102
G- - I-~A~~S~-V--C--B--Y--A--S--P--G--K--Y--T--E--V--R--V-- +3 4
ACAGTGCTTCGG CAGGCTGACAGCCAGCTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATG +16 2
T--V--L--R--Q--A--D--S--Q--V--T--E--V--C--A--A--T--Y--M--M-- +S4
асвААТеАаТТОАССТТССГАСА'ГСА1ТССАТС10САтеО &САССТССА0ТСеАААТСАА +222
Q;--N--E--L--T--F--L--D--D--9--I--C--T--G--T- -S--S--G--N--Q-- +74
GTGAACCTCACXATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAQGTC +282
VI--N- -L--T--I--Q- - G--L--R--A--M--D--T--G--I/--Y--I--C--K--V-- +94
QAGCTCATGTACCCACCaCCATACTACGAGQGC ATAGGCAACGGAACCCAGAXTTATGTA +342
E--L--M--Y--P--P--P---Y--T--E--G--I--G--H--G--T--Q--I.--Y--V-- +114
ATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCAC +402
f_.D--P--E--P--C--P--D--S--D--Q--B--P--K--S -S--D--K-T--H-- +134
ACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC +4 62
X--S--P--P--S--P--A--P--E--L--L--G--G--S--S--V--F--L--P--P-- +154
GCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAXCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG +522.
P--K--P--K--D--T--L--M--I--S--R--T--P--E--V--T--C--V--V--V-- +174
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACXGGTACC-XGGACOGCGTGGAGG'rG +582
P--V--S--H--B--D--P--E--V.-K--F--M--W--Y--V--D--G--V--E--V-- +194
CAIAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC +612
H--N--A--K--T--K--P--R--E--E--Q--Y--U--B--T--Y--R--V--V--S-- +214
GTCCTCACCQTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAATGGCAAnGAGTACAAGTGCAAGQTCTCC +702
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAXCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA +762
W._X--A--I.--P--A--P--I--E -K--T--I--S--K--A--K--G--Q--P--R-- +2 54
GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGC + В 2 2
B.-P..Q.-V--Y--T--L--P--P--S--R--D--E--L--T--K--W--Q--V--S-- +27 4
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCATT +882
¦L--T--C--L--V--K--G--F--Y--P -S--D--I--A--V--E--4--E--S--N-- +294
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGXGCTGGACTCCGACGGCXCCTTC +942
'G_.Q.-p.-E--H--N--"r--K--T--T--P--P--V--L--D--S--D--G--S--F-- +314
TTCCTCTACB,GCAAGCXCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA +10 02
jr__L--Y--S--K--L--T--V--D--K--S--R--H--Q--Q--G--"--V--F--S-- +3 3 4
XGCTCCGTGATGCATGAGGOTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT +1062
C--S--V--H--H--E--A--L--K--H--n--Y--T--0--K--S--L--S--L--S-- +3 54
CCGGGXAAATGA P--G--K--*
Фиг. 20
Сигнальный пептид онкостатина М
hGVLLTQRTLbSbVL
ATG GGT GTA СТО СТС АСА С AG AGG ACQ СТО СТО AGT CTG GTC СТТ 45
: -1+1
"ALLPPSMAS IIAMHVA
ОСА СТС СТЙ ТТТ ССА ЗЧОС АТС GCG AGC А'ГО <ЗСА ATG САС GTG GCC 90
Q.PAVVLASSRGIASP
CAG ССТ GCT GTG GTA CTG GCC AGС AGС CGA GGC АТС GCC AGC ТТТ 135
VCBYASPGKATBVRV
'GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG OTC CGG GTG 18 0
flVLRQADSQVTEVCA
АСА GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC TGT GCG 22 5
'A T Y M M G M E IJ T F L D D 8
;GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG АСС ТТС СТА GAT GAT TCC 270
'iCTGTSSGNQVNLTI
АТС TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT САА GTG AAC CTC ACT АТС 315
QGLRAMDTGLYX CKV
CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC. АТС TGC AAG GTG 360
Участок гликозилирования
ELMYPPPYYLGIGWG
GAG CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA 405
:T I g 1 Y V I В 1? В ?> С P D S D AGC CAG ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC
FLLWILAAVSSGLFF TTC CTC CTC TGG АТС CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG ТТТ TTT
YS FLLTAVSLSKMLK TAT AGC TTT CTC CTC AGA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG СТА AAG
KRSPbTTGVYVKMPP
AAA AGA AGC ССТ CTT АСА АСА GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA
TEPECEKQFQPYFIP АСА GAG CCA GAA TGT GAA AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC
'IS " ' '
АТС AAT
Фиг. 21
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028491
- 1 -
(19)
028491
- 1 -
(19)
028491
- 1 -
(19)
028491
- 4 -
028491
- 31 -
028491
- 41 -
028491
- 42 -
028491
- 46 -
028491
- 47 -
028491
- 51 -
028491
- 53 -