[RU]

1. Способ определения чувствительности микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам, включающий: (а) добавление микробных клеток к жидкой питательной среде; (б) воздействие на микробные клетки физического или химического стимула, способного вызывать стрессовую реакцию; (в) преинкубирование микробных клеток в питательной среде; (г) добавление к жидкой питательной среде химического агента или антибиотика; (д) инкубирование микробных клеток; (е) удаление микробных клеток из инкубационной питательной среды и сбор супернатанта; (ж) экстракция белков из супернатанта с помощью спирта; (з) выделение экстрагированного белка из супернатанта, обработанного спиртом; (и) добавление к экстракту белка растворителя для растворения экстракта белка для масс-спектрометрического анализа; (к) нанесение растворенного белка вместе с растворителем для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра, высушивание смеси растворенного белка и растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложке с получением образца для масс-спектрометрии; (л) получение масс-спектра образца для масс-спектрометрии; (м) сравнение полученного масс-спектра по крайней мере с одним стандартным масс-спектром того же самого микроорганизма для определения чувствительности указанного микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является химическим стимулом и этап (б) включает добавление к жидкой питательной среде количества химического стимула, специфичного для группы микроорганизмов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (а) включает добавление примерно 10 колоний микробных клеток к 1 мл жидкой питательной среды.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды используется среда Мюллера-Хинтона.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что мутность жидкой питательной среды, в которой распределены микробные клетки, составляет 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствует приблизительно 1,5 ×10 ⁸ колониеобразующих единиц/мл.

6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют водорастворимую соль яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (в) включает преинкубацию микробных клеток в питательной среде в течение 30 мин.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (г) состоит из добавления в пробирку со средой количества антибиотика, равного пороговому уровню для данного микроорганизма, согласно данным Института клинических и лабораторных стандартов.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (д) включает инкубирование микробных клеток в течение 60 мин.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (е) включает удаление микроорганизмов центрифугированием на 10000 ×g или 15000 ×g в течение 5 мин при комнатной температуре и сбор супернатанта.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (ж) в качестве спирта используют этанол, и тем, что на этапе (ж) 400 мкл супернатанта смешивают с 900 мкл этанола, имеющего температуру -20°C, и полученную смесь инкубируют при -20°C в течение 1 ч и центрифугируют на 15000 ×g в течение 20 мин.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (и) экстракт белка промывают 70% этанолом, промытый белок растворяют в 5 мкл 70% муравьиной кислоты, к растворенному белку добавляют 5 мкл ацетонитрила, а затем центрифугируют на 15000 ×g в течение 2 мин.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (к) включает нанесение 1 мкл растворенного белка и 1 мкл растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворитель для масс-спектрометрического анализа представляет собой насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, растворенной в водном растворе 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (л) включает получение масс-спектра в диапазоне 2000-20000 m/z с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI в линейном режиме.

16. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют 5 мкл 25 мМ раствора малата натрия.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является физическим стимулом, выбранным из электрического поля, магнитного поля, изменения температуры или дозы радиоактивного облучения.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (ж) спирт имеет температуру -20°C.

19. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на стадии (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют малат натрия или аскорбат натрия.

20. Способ по п.17, отличающийся тем, что стимулом, вызывающим стрессовую реакцию, является изменение температуры.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ определения чувствительности микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам, включающий: (а) добавление микробных клеток к жидкой питательной среде; (б) воздействие на микробные клетки физического или химического стимула, способного вызывать стрессовую реакцию; (в) преинкубирование микробных клеток в питательной среде; (г) добавление к жидкой питательной среде химического агента или антибиотика; (д) инкубирование микробных клеток; (е) удаление микробных клеток из инкубационной питательной среды и сбор супернатанта; (ж) экстракция белков из супернатанта с помощью спирта; (з) выделение экстрагированного белка из супернатанта, обработанного спиртом; (и) добавление к экстракту белка растворителя для растворения экстракта белка для масс-спектрометрического анализа; (к) нанесение растворенного белка вместе с растворителем для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра, высушивание смеси растворенного белка и растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложке с получением образца для масс-спектрометрии; (л) получение масс-спектра образца для масс-спектрометрии; (м) сравнение полученного масс-спектра по крайней мере с одним стандартным масс-спектром того же самого микроорганизма для определения чувствительности указанного микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является химическим стимулом и этап (б) включает добавление к жидкой питательной среде количества химического стимула, специфичного для группы микроорганизмов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (а) включает добавление примерно 10 колоний микробных клеток к 1 мл жидкой питательной среды.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды используется среда Мюллера-Хинтона.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что мутность жидкой питательной среды, в которой распределены микробные клетки, составляет 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствует приблизительно 1,5 ×10 ⁸ колониеобразующих единиц/мл.

6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют водорастворимую соль яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (в) включает преинкубацию микробных клеток в питательной среде в течение 30 мин.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (г) состоит из добавления в пробирку со средой количества антибиотика, равного пороговому уровню для данного микроорганизма, согласно данным Института клинических и лабораторных стандартов.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (д) включает инкубирование микробных клеток в течение 60 мин.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (е) включает удаление микроорганизмов центрифугированием на 10000 ×g или 15000 ×g в течение 5 мин при комнатной температуре и сбор супернатанта.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (ж) в качестве спирта используют этанол, и тем, что на этапе (ж) 400 мкл супернатанта смешивают с 900 мкл этанола, имеющего температуру -20°C, и полученную смесь инкубируют при -20°C в течение 1 ч и центрифугируют на 15000 ×g в течение 20 мин.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (и) экстракт белка промывают 70% этанолом, промытый белок растворяют в 5 мкл 70% муравьиной кислоты, к растворенному белку добавляют 5 мкл ацетонитрила, а затем центрифугируют на 15000 ×g в течение 2 мин.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (к) включает нанесение 1 мкл растворенного белка и 1 мкл растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворитель для масс-спектрометрического анализа представляет собой насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, растворенной в водном растворе 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (л) включает получение масс-спектра в диапазоне 2000-20000 m/z с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI в линейном режиме.

16. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют 5 мкл 25 мМ раствора малата натрия.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является физическим стимулом, выбранным из электрического поля, магнитного поля, изменения температуры или дозы радиоактивного облучения.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (ж) спирт имеет температуру -20°C.

19. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на стадии (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют малат натрия или аскорбат натрия.

20. Способ по п.17, отличающийся тем, что стимулом, вызывающим стрессовую реакцию, является изменение температуры.

---

Евразийское ои 028467 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. C12Q1/18 (2006.01)
2017.11.30
(21) Номер заявки 201492266
(22) Дата подачи заявки
2013.06.06
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ХИМИЧЕСКИМ АГЕНТАМ
(31) 00785/12
(32) 2012.06.06
(33) CH
(43) 2015.05.29
(86) PCT/EP2013/061719
(87) WO 2013/182647 2013.12.12
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ИДМИК СА (CH)
(72) Изобретатель:
Говорун Вадим, Илина Елена (RU), Подоплелов Алексей (CH)
(74) Представитель:
Осипов К.В., Ильмер Е.Г., Пантелеев А.С., Хмара М.В., Дощечкина В.В., Новоселова С.В., Липатова И.И., Рыбаков В.М. (RU)
(56) US-A1-2008009029 EP-A1-2267459
KALASHNIKOV MAXIM ET AL.: "A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus", LAB ON A CHIP, vol. 12, no. 21, 2012, pages 4523-4532, XP002719005, abstract
(57) Изобретение относится к способу определения чувствительности микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам, заключающемуся в том, что микроорганизмы культивируют в жидкой питательной среде с химическим агентом или антибиотиком, затем среду обрабатывают таким образом, что может произойти лизис клеток и распределение фрагментов микроорганизмов по объему среды, а затем в супернатанте, не содержащем микроорганизмов, измеряют содержание белковых компонентов и сравнивают значения с контрольными или стандартными образцами. Метод включает добавление некоторого количества микробных клеток к жидкой питательной среде, в которую добавлен усиливающий агент, специфичный для определенной группы (рода или семейства) микроорганизмов. Жидкую питательную среду, содержащую микроорганизмы, преинкубируют, а затем после добавления некоторого количества антибиотика снова инкубируют. Затем клетки удаляют из инкубационной среды, получая супернатант. Белки супернатанта экстрагируют добавлением спирта с последующим выделением белков. Белковый осадок применяют для получения масс-спектра, используемого для сравнения со стандартными масс-спектрами.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам, применяемому в медицинской микробиологии, заключающемуся в том, что некоторое количество микроорганизмов инкубируют в жидкой питательной среде с некоторым количеством химического агента или антибиотика, добавленного в питательную среду. После удаления микроорганизмов из инкубационной питательной среды белки и/или пептиды из супернатанта экстрагируют, изолируют и готовят для масс-спектрометрического анализа согласно ограничительной части п. 1 формулы изобретения.
Предшествующий уровень техники
В бактериологии и эпидемиологии известны способы измерения чувствительности микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам, согласно которым анализ микроорганизмов проводят известным образом с помощью масс-спектрометрии. Тестируемые химические агенты или антибиотики добавляют к питательной среде, содержащей микроорганизмы, способной оказывать влияние на рост микробов. С использованием спектрометрии можно проанализировать микробную чувствительность к химическим агентам или антибиотикам недорогим и простым способом.
В заявке US 2008/0009029 описан способ, согласно которому микроорганизмы, в частности бактерии, определяют и описывают на основе масс-спектрометрического измерения их белковых профилей с ионизацией посредством матрично-активированном лазерном осаждении. Для измерения устойчивости микроорганизмов к антибиотикам исследуют белковые профили после культивации в течение короткого промежутка времени в среде, содержащей антибиотики.
Заявка WO 2011/154517 А1 относится к способу определения устойчивости микроорганизмов, продуцирующих р-лактамазы, в частности р-лактамазы расширенного спектра. Этот документ описывает способ, согласно которому устойчивость микроорганизмов можно измерить, используя каталитический эффект р-лактамаз, продуцируемых микроорганизмами, на р-лактамные антибиотики, который обусловлен гидролитическим расщеплением р-лактамного кольца. Данный метод позволяет определить устойчивость бактерий через несколько часов после добавления к микробной суспензии подходящего субстрата - р-лактамного антибиотика или применимого производного р-лактама - путем прямого масс-спектрометрического анализа продуктов распада субстрата, вызванного р-лактамазами.
Краткое описание изобретения
Исходя из существующего уровня техники, целью настоящего изобретения является создание способа, позволяющего быстро измерить устойчивость микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам, преимущество которого состоит в возможности анализа не только бактериолитических, но и бактериостатических свойств данных химических агентов или антибиотиков.
В рамках настоящего изобретения слова "микроб" и "микроорганизм" являются взаимозаменяемыми. Аналогично, слово "микробный" относится как к микробам, там и к микроорганизмам.
Слова "клеточная суспензия" в рамках настоящего изобретения относятся к микробным клеткам в жидкой питательной среде.
Термин "стандартный масс-спектр группы микроорганизмов" в рамках настоящего изобретения относится к масс-спектру, полученному для того же микроорганизма при таких же условиях, но без воздействия стимула, вызывающего стрессовую реакцию, такого как антибиотик или химический агент.
Термин "усиливающий агент" в рамках настоящего изобретения относится к такому стимулу, вызывающему стрессовую реакцию, который является химическим стимулом.
Цель настоящего изобретения достигается с помощью способа, обладающего свойствами, перечисленными в п.1 формулы изобретения, согласно которому микроорганизмы культивируют в питательной среде, в течение определенного времени подвергают действию стимула, вызывающего стрессовую реакцию, который может быть физическим или химическим, после чего среду обрабатывают таким образом, что может произойти лизис клеток и распределение фрагментов микроорганизмов по объему среды, а затем в не содержащем микроорганизмов супернатанте измеряют содержание белковых и/или пептидных компонентов и сравнивают значения с контрольными и/или стандартными образцами.
Цель настоящего изобретения дополнительно достигается с помощью способа, обладающего свойствами, перечисленными в п.2 формулы изобретения, согласно которому микроорганизмы в течение определенного времени культивируют в питательной среде вместе с усиливающим агентом и химическим агентом или антибиотиком, затем среду обрабатывают таким образом, что может произойти лизис клеток и распределение фрагментов микроорганизмов по объему среды, а затем в не содержащем микроорганизмов супернатанте измеряют содержание белковых и/или пептидных компонентов и сравнивают значения с контрольными и/или стандартными образцами.
Способ включает добавление некоторого числа микробных клеток, т.е. клеток микроорганизмов, к жидкой питательной среде и воздействие на клетки стимула, вызывающего стрессовую реакцию, который может быть химическим (химическое вещество) или физическим, таким как электрическое поле, магнитное поле, изменение температуры или доза радиоактивного облучения.
В случае, если в качестве стимула, вызывающего стрессовую реакцию, используют химический
стимул (усиливающий агент), способ включает добавление некоторого числа микробных клеток, т.е. клеток микроорганизмов, к жидкой питательной среде, в которую добавлен усиливающий агент, специфичный для определенной группы (рода или семейства) микроорганизмов, а также для определенного химического агента или антибиотика.
Микробные клетки или клетки микроорганизмов могут быть, например, получены из материала, собранного для медицинского анализа, такого как кровь, моча, слизь или слюна, или из образца почвы или воды и/или могут быть культивированы традиционными бактериологическими методами.
В случае если в качестве стимула, вызывающего стрессовую реакцию, используют химический стимул (усиливающий агент), то микроорганизмы преинкубируют при установленной температуре в течение установленного периода времени в присутствии химического стимула, вызывающего стрессовую реакцию, т.е. усиливающего агента. После добавления к питательной среде некоторого количества антибиотика микроорганизмы снова инкубируют при установленной температуре в течение установленного промежутка времени. Затем путем удаления клеток из инкубационной среды получают супернатант. Белки супернатанта экстрагируют путем добавления спирта с последующим выделением экстрагированных белков с помощью, например, осаждения центрифугированием. К экстрагированному белку, т.е. к осадку, добавляют некоторое количество растворителя для масс-спектрометрического анализа, затем некоторое количество раствора наносят на подложку масс-спектрометра и сушат, в результате чего получают образец для масс-спектрометрии. Затем получают масс-спектр образца и сравнивают значения со значениями по крайней мере одного стандартного масс-спектра.
Настоящее изобретение включает способ определения чувствительности микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам, таким как производные пенициллина (пенамы) (например, ампициллин), цефалоспорины (цефемы) (например, цефтриаксон, цефиксим) или карбапенемы (например, ими-пенем, меропенем), согласно которому от 1 до 100 колоний микроорганизмов, предпочтительно от 5 до 50, наиболее предпочтительно около 10 колоний микроорганизмов добавляют в жидкую питательную среду, получая клеточную суспензию.
Микроорганизмы, используемые для данного способа, включают грамотрицательные бактерии, в частности семейство бактерий Enterobacteriaceae (Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, Serratia, Citrobacter и др.), Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter ssp, однако любые другие группы микроорганизмов могут быть использованы в зависимости от тестируемого химического агента или антибиотика. В качестве жидкой среды используется среда Мюллера-Хинтона, которую можно заменить любой другой жидкой питательной средой в зависимости от группы микроорганизмов. Мутность жидкой питательной среды, в которой распределены микроорганизмы, составляет от 0,3 до 0,7, более точно от 0,4 до 0,6, предпочтительно 0,5 по стандарту мутности МакФарланда, что соответствует приблизительно 1,5 х108 колониеобразующих единиц/мл.
Для тестирования чувствительности микроорганизмов по описанному в данном документе способу в качестве усиливающего агента могут быть использованы любые химические агенты, вызывающие стрессовую реакцию, способные вызвать реакцию у тестируемого микроорганизма. Например, в качестве усиливающих могут быть использованы агенты, вызывающие осмотический, метаболический, окислительный, солевой стресс или стресс, обусловленный изменением рН (в кислую или основную сторону), у определенной группы (рода или семейства) микроорганизмов в определенных концентрациях.
Примером усиливающих агентов, вызывающих окислительный стресс, являются усиливающие агенты, вызывающие образование активных форм кислорода в самих микроорганизмах или в жидкой питательной среде.
В частности, для тестирования чувствительности бактерии семейства Enterobacteriaceae к р -лактамным антибиотикам в качестве усиливающего агента используют водорастворимые соли яблочной или аскорбиновой кислот, такие как малат натрия или аскорбат натрия; для тестирования чувствительности бактерий других семейств к другим химическим агентам данные вещества заменяют другими.
К жидкой питательной среде добавляют определенное количество предпочтительно водорастворимой соли яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты, такой как малат натрия или аскорбат натрия; количество и концентрацию можно регулировать при использовании других усиливающих агентов в зависимости от других семейств микроорганизмов. В случае если в качестве усиливающего агента используют водорастворимую соль яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты, усиливающий агент добавляют к жидкой питательной среде в таком количестве, чтобы получить конечную концентрацию усиливающего агента от примерно 0,025 до 0,125 мМ, в частности от примерно 0,1 до 0,15 мМ.
В случае если в качестве стимула, вызывающего стрессовую реакцию, используют физический стимул, такой как электрическое поле, магнитное поле, изменение температуры или доза радиоактивного облучения, способ состоит в добавлении к жидкой среде некоторого количества микробных клеток, т.е. клеток микроорганизмов, с последующим воздействием на клетки физического стимула в определенном количестве. В случае использования дозы радиоактивного облучения, электрического или магнитного поля интенсивность и длительность воздействия должны быть постоянными, в то время как в случае использования температурного воздействия величина изменения температуры и длительность воздействия
в значительной степени зависят от группы микроорганизмов.
Микробные клетки, используемые для получения клеточной суспензии, могут быть получены из материала, собранного для медицинского анализа, такого как кровь, моча, слизь или слюна, или из образца почвы или воды, и/или могут быть культивированы традиционными бактериологическими методами.
В случае если микроорганизмы, используемые для данного способа, относятся к грамотрицатель-ным бактериям, в частности к семейству Enterobactriaceae, клеточную суспензию преинкубируют при условиях, стандартных для культивации клеток, а именно при 37°C, что может отличаться от температуры, необходимой для культивации других типов микроорганизмов. Предпочтительно инкубацию проводят в орбитальном встряхивателе с контролируемой температурой, например, при 280 об/мин.
К клеточной суспензии добавляют химический агент или антибиотик в концентрации, равной пороговому уровню, согласно данным Института клинических и лабораторных стандартов, затем клеточную суспензию инкубируют при условиях, стандартных для культивации клеток, а именно при 37°C, что также может отличаться от температуры, необходимой для культивации других типов микроорганизмов.
Например, пороговая концентрация составляет 16 мг/л для ампициллина и цефтриаксона и 2 мг/л для меропенема.
Микроорганизмы осаждают центрифугированием или любым другим методом осаждения, затем собирают супернатант. Белки супернатанта экстрагируют добавлением спирта, предпочтительно имеющего температуру -20°C, предпочтительно добавлением к супернатанту этанола способом, известным из уровня техники. Экстрагированные белки осаждают центрифугированием или любым другим методом осаждения, затем собирают осадок, т.е. осадок экстрагированных белков.
Перед осаждением микроорганизмов возможно добавление поверхностно-активного вещества, такого как, например, сорбитан моноолеат.
При подготовке образца для масс-спектрометрии полученный осадок промывают спиртом, предпочтительно этанолом, растворяют в кислоте, предпочтительно в муравьиной кислоте, затем добавляют цианид, предпочтительно ацетонитрил и проводят центрифугирование. Раствор полученного осадка смешивают с растворителем для масс-спектрометрического анализа, наносят на подложку масс-спектрометра и сушат, получая образец для масс-спектрометрии.
Масс-спектр белкового набора подложки масс-спектрометра получают с использованием время-пролетного масс-спектрометра MALDI в линейном режиме. Полученный масс-спектр затем сравнивают со стандартными масс-спектрами или другими образцами.
Другие варианты реализации описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
Краткое описание фигур
Далее следует описание предпочтительных вариантов реализации изобретения на основе фигур, которые приведены исключительно для объяснения и не должны рассматриваться как ограничения. На фигурах показано следующее:
фиг. 1 представляет собой структурную схему процесса, отражающую этапы иллюстративного процесса определения чувствительности микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам, проводимого в соответствии с принципами изобретения;
на фиг. 2 изображены масс-спектры, полученные для супернатантов, собранных при тестировании штамма Escherichia coli, чувствительного к ампициллину и цефтриаксону: (верхний) - масс-спектр су-пернатанта контрольного образца; (посередине) - спектр супернатанта опытного образца после обработки ампициллином концентрации 8 мг/л; (нижний) - спектр супернатанта опытного образца после обработки цефтриаксоном концентрации 8 мг/л. Колонии неустойчивого штамма Escherichia coli были убиты, чем обусловлен характерный белковый профиль;
на фиг. 3 изображены масс-спектры, полученные для супернатантов, собранных при тестировании штамма Escherichia coli, устойчивого к ампициллину и цефтриаксону: (верхний) - масс-спектр суперна-танта контрольного образца; (посередине) - спектр супернатанта опытного образца после обработки ампициллином концентрации 8 мг/л; (нижний) - спектр супернатанта опытного образца после обработки цефтриаксоном концентрации 8 мг/л;
на фиг. 4 изображены масс-спектры, полученные для супернатантов, собранных при тестировании штамма Citrobacter ssp, чувствительного к ампициллину и цефтриаксону: (верхний) - масс-спектр супер-натанта контрольного образца; (посередине) - спектр супернатанта опытного образца после обработки ампициллином концентрации 8 мг/л; (нижний) - спектр супернатанта опытного образца после обработки цефтриаксоном концентрации 8 мг/л. Колонии неустойчивого штамма Citrobacter ssp были убиты, чем обусловлен характерный белковый профиль.
Предпочтительные варианты реализации
Фиг. 1 демонстрирует предпочтительный вариант реализации предлагаемого настоящим изобретением способа определения чувствительности микроорганизмов к химическим агентам или антибиотикам.
На первом этапе 10 приблизительно десять колоний микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae добавляют к 1 мл жидкой питательной среды Мюллера-Хинтона. Мутность жидкой питательной среды, в которой распределены микроорганизмы, составляет 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствует приблизительно 1,5 х108 колониеобразующих единиц/мл.
На втором этапе 20 к жидкой питательной среде в качестве усиливающего агента, действующего на бактерии семейства Enterobacteriaceae, добавляют 5 мкл водорастворимой соли яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты концентрации 5-25 мМ, чаще всего 25 мМ, например малат натрия. Усиливающий агент также можно добавить к жидкой питательной среде в твердой форме.
На третьем этапе 30 микроорганизмы преинкубируют в питательной среде при 37°C в течение 30 мин.
На четвертом этапе 40 к жидкой питательной среде добавляют некоторое количество химического агента или антибиотика, равное пороговому уровню для данной группы микроорганизмов, согласно данным Института клинических и лабораторных стандартов.
На пятом этапе 50 микроорганизмы инкубируют в питательной среде при 37°C в течение 60 мин.
На шестом этапе 60 микроорганизмы удаляют из питательной среды центрифугированием на 10000xg или 15000xg в течение 5 мин при комнатной температуре. Оставшийся супернатант собирают в отдельную пробирку.
На седьмом этапе 70 все белки супернатанта экстрагируют добавлением 400 мкл супернатанта к 900 мкл этанола при -20°C с последующей инкубацией при -20°C в течение 1 ча.
На восьмом этапе 80 экстрагированные белки центрифугируют на 15000xg в течение 20 мин, добиваясь осаждения белков, после чего полученный осадок промывают 70% этанолом.
На девятом этапе 90 к раствору экстрагированного белка добавляют растворитель, содержащий 5 мкл 70% муравьиной кислоты и 5 мкл ацетонитрила, затем полученный раствор центрифугируют на 15000xg в течение 2 мин.
На десятом этапе 100 1 мкл раствора экстрагированного белка вместе с 1 мкл растворителя для масс-спектрометрического анализа, состоящего из насыщенного раствора а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в смеси с 50% ацетонитрилом и 2,5% трифторуксусной кислотой, наносят на подложку масс-спектрометра и сушат, получая образец для масс-спектрометрии.
На одиннадцатом этапе 110 получают масс-спектр образца в диапазоне 2000-20000 m/z, используя времяпролетный масс-спектрометр MALDI в линейном режиме.
На двенадцатом этапе 120 полученный масс-спектр образца сравнивают по крайней мере с одним стандартным масс-спектром или масс-спектром контрольного образца.
На фиг. 2 изображены масс-спектры, полученные для супернатантов, собранных при тестировании штамма Escherichia coli, чувствительного к ампициллину и цефтриаксону. Верхний спектр А показывает интенсивность сигнала в условных единицах (у.е.) при соответствующем отношении массы к заряду (m/z) в Да/е для спектра супернатанта контрольного образца (сигнал приблизительно на 1500 Да/е на всех трех спектрах обозначает начало измерения). Второй спектр В, содержащий множество пиков помимо первого на 1500 Да/е, получен для супернатанта опытного образца, обработанного ампициллином концентрации 8 мг/л. Нижний спектр С получен для супернатанта опытного образца, обработанного це-фтриаксоном концентрации 8 мг/л. В обоих случаях колонии неустойчивого штамма Eschehchia coli были убиты, поэтому как спектр В, так и спектр С содержат сигналы всех белков и пептидов, поступающих в жидкую питательную среду при гибели бактериальных клеток.
На фиг. 3 изображены масс-спектры, полученные для супернатантов, собранных при тестировании штамма Escherichia coli, устойчивого к ампициллину и цефтриаксону. Верхний спектр А получен для супернатанта контрольного образца, второй спектр В получен для супернатанта опытного образца, обработанного ампициллином концентрации 8 мг/л, нижний спектр С получен для супернатанта опытного образца, обработанного цефтриаксоном концентрации 8 мг/л. Все три спектра содержат сигнал приблизительно на 1500 Да/е, обозначающий начало измерения, и не содержат других заметных сигналов.
На фиг. 4 изображены масс-спектры, полученные для супернатантов, собранных при тестировании штамма Citrobacter ssp, чувствительного к ампициллину и цефтриаксону. Как и до этого, верхний спектр А получен для супернатанта контрольного образца, второй спектр В получен для супернатанта опытного образца, обработанного ампициллином концентрации 8 мг/л, нижний спектр С получен для супернатанта опытного образца, обработанного цефтриаксоном концентрации 8 мг/л. В обоих случаях колонии неустойчивого штамма Citrobacter ssp были убиты, поэтому как спектр В, так и спектр С содержат сигналы всех белков и пептидов, поступающих в жидкую питательную среду при гибели бактериальных клеток.
100 - этап процесса 10, 110 - этап процесса 11, 120 - этап процесса 12.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения чувствительности микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам, включающий:
(а) добавление микробных клеток к жидкой питательной среде;
(б) воздействие на микробные клетки физического или химического стимула, способного вызывать
стрессовую реакцию;
(в) преинкубирование микробных клеток в питательной среде;
(г) добавление к жидкой питательной среде химического агента или антибиотика;
(д) инкубирование микробных клеток;
(е) удаление микробных клеток из инкубационной питательной среды и сбор супернатанта;
(ж) экстракция белков из супернатанта с помощью спирта;
(з) выделение экстрагированного белка из супернатанта, обработанного спиртом;
(и) добавление к экстракту белка растворителя для растворения экстракта белка для масс-
спектрометрического анализа;
(к) нанесение растворенного белка вместе с растворителем для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра, высушивание смеси растворенного белка и растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложке с получением образца для масс-спектрометрии;
(л) получение масс-спектра образца для масс-спектрометрии;
(м) сравнение полученного масс-спектра по крайней мере с одним стандартным масс-спектром того же самого микроорганизма для определения чувствительности указанного микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является химическим стимулом и этап (б) включает добавление к жидкой питательной среде количества химического стимула, специфичного для группы микроорганизмов.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (а) включает добавление примерно 10 колоний микробных клеток к 1 мл жидкой питательной среды.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды используется среда Мюллера-Хинтона.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что мутность жидкой питательной среды, в которой распределены микробные клетки, составляет 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствует приблизительно 1,5х108 колониеобразующих единиц/мл.
6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют водорастворимую соль яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (в) включает преинкубацию микробных клеток в питательной среде в течение 30 мин.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (г) состоит из добавления в пробирку со средой количества антибиотика, равного пороговому уровню для данного микроорганизма, согласно данным Института клинических и лабораторных стандартов.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (д) включает инкубирование микробных клеток в течение 60 мин.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (е) включает удаление микроорганизмов центрифугированием на 10000xg или 15000xg в течение 5 мин при комнатной температуре и сбор супернатанта.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (ж) в качестве спирта используют этанол, и тем, что на этапе (ж) 400 мкл супернатанта смешивают с 900 мкл этанола, имеющего температуру -20°C, и полученную смесь инкубируют при -20°C в течение 1 ч и центрифугируют на 15000xg в течение 20 мин.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (и) экстракт белка промывают 70% этанолом,
промытый белок растворяют в 5 мкл 70% муравьиной кислоты, к растворенному белку добавляют 5 мкл ацетонитрила, а затем центрифугируют на 15000xg в течение 2 мин.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (к) включает нанесение 1 мкл растворенного белка и 1 мкл растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворитель для масс-спектрометрического анализа представляет собой насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, растворенной в водном растворе 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (л) включает получение масс-спектра в диапазоне 2000-20000 m/z с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI в линейном режиме.
16. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют 5 мкл 25 мМ раствора малата натрия.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является физическим стимулом, выбранным из электрического поля, магнитного поля, изменения температуры или дозы радиоактивного облучения.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (ж) спирт имеет температуру -20°C.
19. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на стадии (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют малат натрия или аскорбат натрия.
20. Способ по п.17, отличающийся тем, что стимулом, вызывающим стрессовую реакцию, является изменение температуры.
13.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028467
- 1 -
028467
- 1 -
028467
- 4 -
028467