|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Антитело, отличающееся тем, что связывается с А β-пептидами, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 49, 53, 57 и 61, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 50, 54, 58 и 62, и вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 51, 55, 59 и 63, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 52, 56, 60 и 64. 2. Антитело по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело. 3. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 49, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 51, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52. 4. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 55, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56. 5. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 57, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 59, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60. 6. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64. 7. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело выбрано из следующей группы:  8. Антитело по п.7, где антитело представляет собой А β 6-1-6 (DSM АСС 2924). 9. Антитело по п.7, где антитело представляет собой А β 24-2-3 (DSM АСС 2926). 10. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело. 11. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело является человеческим. 12. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое представляет собой димерное антитело или одноцепочечное антитело. 13. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое связывается с А β-пептидами. 14. Антитело по п.13, где указанные А β-пептиды выбраны из следующей группы: pGlu-A β 3-38 , pGlu-A β 3-40 , pGlu-A β 3-42 и pGlu-A β 3-x , где х обозначает целое число от 10 до 42. 15. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое является меченым. 16. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое иммобилизовано на твердой фазе. 17. Антитело по пп.7-16, которое можно получать из любой клеточной линии гибридом DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925, DSM АСС 2926. 18. Композиция для лечения, предупреждения или замедления развития амилоидоза, содержащая антитело по одному из предыдущих пунктов в терапевтически эффективном количестве и по крайней мере один терапевтически приемлемый разбавитель или носитель. 19. Композиция по п.18, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из легкого когнитивного нарушения, болезни Альцгеймера и нейродегенерации при синдроме Дауна. 20. Композиция по п.19, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа. 21. Композиция по п.20, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию. 22. Клеточная линия гибридомы, которая предназначена для продуцирования антитела по любому из пп.1-17, где указанная клеточная линия гибридомы выбрана из DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925 и DSM АСС 2926. 23. Применение антитела по одному из пп.1-17 в способе диагностики амилоид-ассоциированного заболевания или состояния. 24. Применение антитела по любому из пп.1-17 в терапевтическом способе лечения амилоид-ассоциированного заболевания или состояния. 25. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является нейродегенеративным заболеванием, выбранным из группы, включающей умеренное когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейродегенерацию, связанную с синдромом Дауна. 26. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является спорадической формой болезни Альцгеймера или семейной деменцией альцгеймеровского типа. 27. Применение по п.26, где указанная семейная деменция альцгеймеровского типа является семейной британской деменцией или семейной датской деменцией. 28. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из умеренного когнитивного нарушения, болезни Альцгеймера и нейродегенерации, связанной с синдромом Дауна. 29. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа. 30. Применение по п.29, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию. 31. Применение антитела по одному из пп.1-17 для выявления А β-пептидов. 32. Применение по п.31, где указанные А β-пептиды выбраны из следующей группы: pGlu-A β 3-38 , pGlu-A β 3-40 , pGlu-A β 3-42 и pGlu-A β 3-x , где х обозначает целое число от 10 до 42. 33. Способ диагностики in vitro ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, включающий определение в образце иммунологического связывания антитела по любому из пп.1-17 с pGlu-A β пептидом, которое включает следующие этапы: (а) приведение в контакт антитела с образцом, который, как предполагается, содержит амилоидный пептид; (б) обеспечение возможности антителу связаться с pGlu-A β пептид с образованием иммунологического комплекса; (в) выявление формирования иммунологического комплекса; и (г) корреляция присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием pGlu-A β пептида в образце, где наличие pGlu-A β пептида в образце является положительным индикатором амилоид-ассоциированного заболевания или состояния. 34. Набор для диагностики ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, содержащий антитело по одному из пп.1-17, реагенты в предварительно определенных количествах и инструкции по применению.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Антитело, отличающееся тем, что связывается с А β-пептидами, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 49, 53, 57 и 61, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 50, 54, 58 и 62, и вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 51, 55, 59 и 63, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 52, 56, 60 и 64. 2. Антитело по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело. 3. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 49, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 51, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52. 4. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 55, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56. 5. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 57, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 59, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60. 6. Антитело по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64. 7. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело выбрано из следующей группы: 8. Антитело по п.7, где антитело представляет собой А β 6-1-6 (DSM АСС 2924). 9. Антитело по п.7, где антитело представляет собой А β 24-2-3 (DSM АСС 2926). 10. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело. 11. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело является человеческим. 12. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое представляет собой димерное антитело или одноцепочечное антитело. 13. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое связывается с А β-пептидами. 14. Антитело по п.13, где указанные А β-пептиды выбраны из следующей группы: pGlu-A β 3-38 , pGlu-A β 3-40 , pGlu-A β 3-42 и pGlu-A β 3-x , где х обозначает целое число от 10 до 42. 15. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое является меченым. 16. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое иммобилизовано на твердой фазе. 17. Антитело по пп.7-16, которое можно получать из любой клеточной линии гибридом DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925, DSM АСС 2926. 18. Композиция для лечения, предупреждения или замедления развития амилоидоза, содержащая антитело по одному из предыдущих пунктов в терапевтически эффективном количестве и по крайней мере один терапевтически приемлемый разбавитель или носитель. 19. Композиция по п.18, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из легкого когнитивного нарушения, болезни Альцгеймера и нейродегенерации при синдроме Дауна. 20. Композиция по п.19, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа. 21. Композиция по п.20, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию. 22. Клеточная линия гибридомы, которая предназначена для продуцирования антитела по любому из пп.1-17, где указанная клеточная линия гибридомы выбрана из DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925 и DSM АСС 2926. 23. Применение антитела по одному из пп.1-17 в способе диагностики амилоид-ассоциированного заболевания или состояния. 24. Применение антитела по любому из пп.1-17 в терапевтическом способе лечения амилоид-ассоциированного заболевания или состояния. 25. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является нейродегенеративным заболеванием, выбранным из группы, включающей умеренное когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейродегенерацию, связанную с синдромом Дауна. 26. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является спорадической формой болезни Альцгеймера или семейной деменцией альцгеймеровского типа. 27. Применение по п.26, где указанная семейная деменция альцгеймеровского типа является семейной британской деменцией или семейной датской деменцией. 28. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из умеренного когнитивного нарушения, болезни Альцгеймера и нейродегенерации, связанной с синдромом Дауна. 29. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа. 30. Применение по п.29, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию. 31. Применение антитела по одному из пп.1-17 для выявления А β-пептидов. 32. Применение по п.31, где указанные А β-пептиды выбраны из следующей группы: pGlu-A β 3-38 , pGlu-A β 3-40 , pGlu-A β 3-42 и pGlu-A β 3-x , где х обозначает целое число от 10 до 42. 33. Способ диагностики in vitro ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, включающий определение в образце иммунологического связывания антитела по любому из пп.1-17 с pGlu-A β пептидом, которое включает следующие этапы: (а) приведение в контакт антитела с образцом, который, как предполагается, содержит амилоидный пептид; (б) обеспечение возможности антителу связаться с pGlu-A β пептид с образованием иммунологического комплекса; (в) выявление формирования иммунологического комплекса; и (г) корреляция присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием pGlu-A β пептида в образце, где наличие pGlu-A β пептида в образце является положительным индикатором амилоид-ассоциированного заболевания или состояния. 34. Набор для диагностики ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, содержащий антитело по одному из пп.1-17, реагенты в предварительно определенных количествах и инструкции по применению.
Евразийское 028427 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки
201100231
(22) Дата подачи заявки 2009.07.10
(51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01) C07K16/18 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С Ap-ПЕПТИДАМИ ИЛИ ИХ ВАРИАНТАМИ, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТО АНТИТЕЛО, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 61/082,309
(32) 2008.07.21
(33) US
(43) 2011.08.30
(86) PCT/EP2009/058803
(87) WO 2010/009987 2010.01.28
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ПРОБИОДРУГ АГ (DE)
(72) Изобретатель:
Демут Ханс-Ульрих, Шиллинг Штефан, Клайншмидт Мартин, Ганс Катрин, Райзенауер-Шаупп Анита, Рафельд Йенс-Ульрих, Кампфер Зоня
(DE)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Пивницкая Н.Н., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Комарова О.М., Белоусов Ю.В. (RU)
(56) FRENKEL D. ET AL.:
"Generation of anti-beta-amyloid antibodies viaphage display technology", VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 22, no. 19, 23 June 2004 (2004-06-23), pages 2505-2508, XP004515471, ISSN: 0264-410X, the whole document
WO-A-03070760
US-A1-2005009150 EP-A-1911765
US-B2-7381801
(57) В изобретении рассмотрены новые диагностические анализы, предназначенные для диагностирования амилоидоза, в частности болезни Альцгеймера, и родственных состояний. В
Настоящее изобретение относится к новым диагностическим анализам, предназначенным для диагностирования амилоидоза, т.е. группы заболеваний и патологий, ассоциированных с амилоидным белком, таких как болезнь Альцгеймера и родственные состояния. В частности, предложен анализ на основе антител.
Амилоидоз представляет собой не отдельное заболевание, а скорее группу разнообразных прогрессирующих болезненных процессов, которые характеризуются внеклеточными отложениями в ткани воскообразного крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. После образования амилоидных отложений они начинают препятствовать нормальному функционированию органа или системы организма. Известно по меньшей мере 15 различных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз, не имеющий известных предвестников (состояний-предшественников) заболевания, вторичный амилоидоз, сопровождающий определенное другое состояние, и наследственный амилоидоз. Вторичный амилоидоз возникает у людей, страдающих хроническим инфекционным или воспалительным заболеванием, таким как туберкулез, бактериальная инфекция, которую называют семейной средиземноморской лихорадкой, костные инфекционные заболевания (остеомиелит), ревматоидный артрит, воспаление тонкого кишечника (гранулематозный илеит), болезнь Ходжкина и проказа.
Амилоидные отложения включают такой компонент, как амилоид Р (пентагональный) (АР), глико-протеин, родственный амилоиду Р сыворотки здорового индивидуума (SAP), и сульфатированные глико-заминогликаны (GAG), комплекс углеводов соединительной ткани. Фибриллы амилоидного белка, на долю которых приходится примерно 90% амилоидного материла, содержат один из нескольких различных типов белков. Эти белки обладают способностью складываться в фибриллы, имеющие так называемую "бета-складчатую" конформацию, уникальную конфигурацию белка, при которой сайты связывания становятся доступными для красителя конго красного, что приводит к уникальным особенностям окрашивания амилоидного белка.
Многие связанные с возрастом заболевания обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобны-ми белками и характеризуются, в частности, образованием внеклеточных отложений амилоида или ами-лоидоподобного материала, которые участвуют в патогенезе, а также в развитии заболевания. Такие заболевания включают (но, не ограничиваясь только ими) неврологические нарушения, такие как легкое (умеренное) когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической формы болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), нейродегенерация, связанная с синдромом Дауна, деменция, связанная с тельцами Леви, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменций Гуама-Паркинсона. Другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, представляют собой прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанную с ВИЧ деменцию, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна.
Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, характерные для них отложения часто содержат многие сходные молекулярные компоненты. В значительной степени это может относиться к местной активации провоспалительных путей, приводя тем самым к конкурентному отложению компонентов активированного комплемента, реактантов острой фазы, иммуномодуляторов и других воспалительных медиаторов (McGeer и др., 1994).
В настоящее время накоплены данные, демонстрирующие участие модифицированных на N-конце вариантов Ар-пептидов в развитии болезни Альцгеймера. С помощью целевых биопсий продемонстрировано присутствие Ар 1-40 и Ар 1-42 не только в головном мозге пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, но также и в старческих бляшках, не пораженных заболеванием индивидуумов. Однако укороченный на N-конце и модифицированный с помощью пиро-Glu Ар N3pE-40/Ap N3pE-42 практически исключительно связан с бляшками страдающих болезнью Альцгеймера пациентов, что позволяет выбрать этот вариант Ар в качестве пригодного диагностического маркера и потенциальной мишени при разработке лекарственных средств.
В настоящее время несколько производителей поставляет в продажу наборы для ELISA, которые позволяют выявлять Ар 1-40/1-42 и Ар N3pE-40/Ap N3pE-42 при их присутствии в концентрациях, находящихся в диапазоне низких пикограммовых (пг) значений.
Морфологическим отличием головного мозга пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD), является присутствие нейрофибриллярных сплетений и отложений Ар-пептидов в неокортикальных структурах головного мозга (Selkoe D.J. и Schenk D., Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 2003, c. 545-584). Ар-пептиды высвобождаются из амилоидного белка-предшественника (АРР) после последовательного расщепления р- и у-секретазой. Расщепление у-секретазой приводит к образованию пептидов Ар 1-40 и Ар 1-42, которые отличаются их С-концами и характеризуются различной способностью к агрегации, образованию фибрилл и нейротоксичностью (Shin R.W. и др., Amyloid beta-protein (Abeta) 1-40 but not Abeta 1-42 contrib
utes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain. J. Neurosci. 17, 1997, c. 8187-8193; Iwatsubo Т. и др., Visualization of Abeta 42(43) and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron 13, 1994, c. 45-53; Iwatsubo Т., Mann D.M., Odaka A., Suzuki N. и Ihara Y., Amyloid beta protein (Abeta) deposition: Abeta 42(43) precedes Abeta 40 in Down syndrome. Ann. Neurol. 37, 1995, c. 294-299; Hardy J.A. и Higgins G.A., Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256, 1992, c. 184-185; Robner S., Ueberham U., Schliebs R., Perez-Polo J.R. и Bigl V., The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling. Prog. Neurobiol. 56, 51998, c. 41-569). Помимо имеющих вариации С-концов, широко распространены модифицированные на N-конце Ар-пептиды (Saido Т.С. и др., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 1995, c. 457-466; Russo С. и др., Presenilin-1 mutations in Alzheimer's disease. Nature 405, 2000, c. 531-532; Saido T.C., Yamao H., Iwatsubo Т. и Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 1996, c. 173-176). Вероятно, основная часть Ар-пептидов подвергается N-концевому укорочению, затрагивающему две аминокислоты, в результате чего становится доступным глутаматный остаток, который затем циклизует-ся с формированием пироглутамата (рЕ), что приводит к образованию пептидов Ар3(рЕ)-42 (Saido Т.С. и др., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 1995, c. 457-466; Saido T.C., Yamao H., Iwatsubo Т. и Kawashima, S. Amino- and car-boxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 1996, c. 173-176). В альтернативном варианте рЕ может формироваться в результате р'-расщепления с помощью ВАСЕ1, что приводит к образованию Ар Ш1(рЕ)-42 (Naslund, J. и др., Relative abundance of Alzheimer A beta amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 1994, c. 8378-8382; Liu K. и др., Characterization of Abetal 1-40/42 peptide deposition in Alzheimer's disease and young Down's syndrome brains: implication of N-terminally truncated Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 112, 2006, c. 163-174). В частности, установлено, что Ар N3(pE)-42 является основным компонентом отложений Ар при спорадической и семейной болезни Альц-геймера (FAD) (Saido Т.С. и др., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 1995, c. 457-466; Miravalle L. и др., Amino-terminally truncated Abeta peptide species are the main component of cotton wool plaques. Biochemistry 44, 2005, c. 10810-10821).
Пептиды Ар N3pE-42 существует совместно с пептидами Ар 1-40/1-42 (Saido T.C. и др., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques. Neuron 14, 1995, c. 457-466; Saido T.C., Yamao H., Iwatsubo Т. и Kawashima S., Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 1996, c. 173-176) и, как установлено в ряде исследований, они могут играть основную роль в патогенезе AD. Например, продемонстрирована нейротоксичность пептидов Ар N3pE-42 (Russo С. и др., Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides-AbetaN3(pE)-strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 2002, c. 14801489) и установлен тот факт, что рЕ-модификация укороченных на N-конце Ар-пептидов обусловливает устойчивость к расщеплению большинством аминопептидаз, а также к Ар-расщепляющими эндопепти-дазами (Russo С. и др., Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides-AbetaN3(pE)-strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 2002, c. 1480-1489; Saido T.C. Alzheimer's disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19, 1998, c. 69-75). Циклизация глутаминовой кислоты с образованием рЕ приводит к потере N-концевого заряда, что обусловливает усиленную агрегацию Ар N3pE по сравнению с немодифицированными Ар-пептидами (Не W. и Barrow C.J., The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38, 1999, c. 10871-10877; Schilling S. и др., On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro). Biochemistry 45, 2006, c. 12393-12399). Таким образом, снижение образования Ар N3pE-42 должно дестабилизировать пептиды, делая их более чувствительными к расщеплению, и это, в свою очередь, предупреждает формирование более высокомолекулярных агрегатов Ар и повышает продолжительность существования (выживаемость) нейронов.
Однако уже в течение продолжительного времени не удается выяснить, как происходит рЕ-модификация Ар-пептидов. В настоящее время установлено, что глутаминилциклаза (QC) обладает способностью катализировать образование Ар N3pE-42 в мягких кислотных условиях и что специфические ингибиторы QC предупреждают формирование Ар N3pE-42 in vitro (Schilling S., Hoffmann Т., Manhart S., Hoffmann M. и Demuth H.-U., Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett. 563, 2004, c. 191-196; Cynis H. и др., Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764, 2006, c. 1618-1625).
Деменция, связанная с тельцами Леви (LBD), представляет собой нейродегенеративное нарушение, которое может возникать у индивидуумов старше 65 лет, и которое, как правило, вызывает симптомы когнитивного (мыслительного) нарушения и патологические изменения поведения. Симптомы могут включать когнитивное нарушение, неврологические признаки, нарушение сна и неспособность к само
стоятельным действиям. Когнитивное нарушение в большинстве случаев является характерной особенностью LBD. У пациентов происходят повторяющиеся случаи замешательства, которые прогрессивно усугубляются. Флуктуации когнитивной способности часто ассоциированы со сдвигом уровня внимания и бдительности. Когнитивное нарушение и флуктуации мыслительной способности могут варьироваться в течение минут, часов или дней. Тельца Леви образуются из фосфорилированных и нефосфорилирован-ных нейрофиламентных белков; они содержат синаптический белок альфа-синуклеин, а также убикитин, который участвует в элиминации поврежденных или аномальных белков. Помимо телец Леви могут присутствовать также нейриты Леви, представляющие собой тельца включения, участвующие в клеточных процессах в нервных клетках. Амилоидные бляшки могут образовываться в головном мозге пациентов, пораженных LBD, однако, как правило, в меньшем количестве, чем у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Наличие нейрофибриллярных сплетений, представляющих собой еще один микропатологический признак AD, не является главной отличительной особенностью LBD, но они часто присутствуют в дополнение к амилоидным бляшкам.
Амиотрофический боковой склероз (ALS) характеризуется дегенерацией верхних и нижних двигательных нейронов. У некоторых пациентов с ALS может иметь место деменция или афазия (ALS-D). Де-менция наиболее часто представляет собой лобно-височную деменцию (FTD), и во многих таких случаях имеются убикитин-положительные, тау-отрицательные включения в нейронах зубчатой извилины медиальной и нижней поверхности полушария головного мозга и в поверхностных слоях лобной и височной долей головного мозга.
Миозит, связанный с тельцами включения (IBM), представляет собой калечащее заболевание, как правило, обнаруживаемое у людей старше 50 лет, при котором возникает воспаление мышечных волокон, и они начинают атрофироваться, но при этом головной мозг не нарушается, и пациенты полностью сохраняют свой интеллект. Обнаружено, что уровень двух ферментов, участвующих в производстве белка амилоида-р, повышен в мышечных клетках пациентов, страдающих этим часто встречающимся у пожилых людей прогрессирующим мышечным заболеванием, при этом повышается также уровень ами-лоида-р.
Еще одним заболеванием, обусловленным или ассоциированным с накоплением и отложением ами-лоидоподобного белка, является дегенерация желтого пятна. Дегенерация желтого пятна представляет собой обычное заболевание глаза, которое вызывает деградацию желтого пятна, т.е. центральной области сетчатки (тонкий слой ткани на задней части глаза, откуда светочувствительные клетки посылают зрительные сигналы в головной мозг). Желтое пятно опосредует острое, четкое, "неискаженное" зрение. Повреждение желтого пятна приводит к развитию слепых пятен и затуманенному или нарушенному зрению. Возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) является основной причиной ухудшения зрения в Соединенных Штатах, и у людей старше 65 лет она представляет собой основную причину медицински подтвержденной слепоты среди лиц кавказской расы. Примерно 1,8 млн американцев в возрасте 40 лет и старше имеют развитую AMD, а еще у 7,3 млн людей с умеренной AMD имеется значительный риск потери зрения. По оценкам правительства к 2020 г. 2,9 млн людей будут иметь развитую AMD. Жертвы AMD часто бывают удивлены и расстроены, когда узнают, как мало известно о причинах и методах лечения этого состояния слепоты.
Существует две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки желтого пятна медленно начинают разрушаться, диагностирована в 85% случаев дегенерации желтого пятна. Как правило, сухая AMD поражает оба глаза, хотя при этом один глаз может потерять зрение, а второй глаз может оставаться непораженным. Обычно ранними признаками сухой AMD являются друзы, которые представляют собой отложения желтого тела под сетчаткой. Риск возникновения развитой сухой AMD или влажной AMD повышается с увеличением количества или размера друз. Сухая AMD может прогрессировать и вызывать потерю зрения, не превращаясь во влажную форму заболевания; однако на ранней стадии сухая AMD может внезапно переходить во влажную форму.
Хотя на долю влажной формы приходится только 15% случаев AMD, в 90% из них она приводит к слепоте, и ее рассматривают как развитую AMD (не существует ранней или промежуточной стадии влажной AMD). Влажной AMD всегда предшествует сухая форма заболевания. При прогрессировании сухой формы у некоторых людей начинается патологический рост кровеносных сосудов позади желтого пятна. Эти сосуды являются очень хрупкими, и из них просачивается жидкость и кровь (отсюда название "влажная" дегенерация желтого пятна), приводя к быстрому повреждению желтого пятна.
Сухая форма AMD первоначально часто вызывает слегка затуманенное зрение. Затем, прежде всего, центральная часть зрительного поля может становиться затуманенной, и эта область увеличивается в размерах по мере прогрессирования заболевания. Если поражен только один глаз, то симптомы могут оставаться незамеченными. В случае влажной AMD прямые линии могут представляться волнистыми и при этом может быстро наступать потеря центрального зрения.
Для установления диагноза дегенерации желтого пятна, как правило, проводят исследование расширенного глаза (зрачка), тест на остроту зрения и обследование задней стенки глаза с использованием
процедуры, называемой фундоскопией, помогающей установлению диагноза AMD, и, если имеется предположение о наличии влажной AMD, то может быть проведена ангиография с использованием флу-оресцеина. В настоящее время отсутствуют средства лечения, позволяющие предупреждать потерю зрения, если сухая AMD достигла развитой стадии. Однако применение определенной композиции, содержащей высокую дозу антиоксидантов и цинка, может замедлять или предупреждать прогрессирование промежуточной стадии AMD, приводящее к переходу в развитую стадию. Применение Macugen(r) (инъекция пегаптаниба натрия), лазерной фотокоагуляции и фотодинамической терапии позволяет контролировать патологический рост кровеносных сосудов и кровоизлияние в желтом пятне, что является полезным для определенной группы людей с влажной AMD; однако зрение, если оно уже потеряно, не может быть восстановлено с помощью таких методов. Если зрение потеряно, то существуют средства для слабого зрения, которые могут помогать улучшать качество жизни.
Одним из самых ранних признаков связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD) является накопление внеклеточных отложений, известных как друзы, в области, находящейся между базаль-ным слоем пигментированного эпителия сетчатки (RPE) и базальной оболочкой Бруха (ВМ). Результаты современных исследований, проведенных Anderson с соавторами, подтвердили, что друзы содержат амилоид-бета (Experimental Eye Research 78, 2004, c. 243-256).
Задача, положенная в основу настоящего изобретения, заключается в создании высокочувствительного и одновременно робастного метода определения, который позволяет осуществлять количественное определение присутствия вариантов Ар, прежде всего пептидов pGlu-Aр, в биологических образцах, например, образцах жидкости или сыворотки, предпочтительно в образцах сыворотки. Это является огромной проблемой, учитывая низкий уровень присутствия Ар-пептидов в крови. Однако наличие такого метода определения явилось бы предпосылкой для изучения эффективности низкомолекулярных ингибиторов в программах скрининга лекарственных средств.
В настоящем изобретении предложены новые способы и композиции, содержащие высокоспецифические и высокоэффективные антитела, включая химерные антитела и их фрагменты, включая частично или полностью гуманизированные антитела и их фрагменты, которые обладают способностью специфически распознавать и связываться со специфическими эпитопами широкого разнообразия антигенов р-амилоида, в частности с пептидами pGlu-Ар, которые могут презентоваться антителу в моно мерной, ди-мерной, тримерной и т.д. или полимерной форме, в форме агрегата, волокон, филаментов или в конденсированной форме бляшки. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее предпочтительно применять для диагностики амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но, не ограничиваясь только ими) неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, а также другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом голландского типа, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна.
Для удовлетворения всем указанным выше требованиям наиболее предпочтительным мог бы явиться метод на основе ELISA. Решение задачи при создании изобретения начинали с применения ELISA для Ар N3pE (Ар N3pE-ELISA), поскольку для этого варианта Ар система ELISA уже поступает в продажу (набор для анализа Human Amyloid р (N3pE), фирма IBL, код № 27716), которую можно применять в качестве эталона и внутреннего контроля качества. Для "захвата" пептида Ар N3pE-40 применяли hAP(x-40) ELISA (HS) от фирмы TGC (фирма The Genetics Company, Inc., Wagistrasse 23, 8952 Шлирен, кантон Цюрих, Швейцария), что должно было облегчить и ускорить процесс разработки.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам или их вариантам, которые отличаются способностью связываться с высокой аффинностью с Ар-пептидом. В контексте настоящего изобретения высокая аффинность означает, что значение KD составляет 10-7 М или менее, предпочтительно значение KD составляет 10-8 М или менее и еще более предпочтительно значение KD составляет 10-9-10-12 М.
В частности, антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело и его выбирают из следующей группы:
Ар 5-5-6; Ар 6-1-6; Ар 17-4-3; Ар 24-2-3.
Антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, наиболее целесообразно применять в диагностическом способе выявления амилоидоза, в частности болезни Альцгеймера.
Описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1А - выявление амилоида р N3pE-40 в концентрации 10 нг/мл с использованием возрастающих концентраций антитела к pGlu-6166 (клон 12-1); 1Б - определение наиболее высокой концентрации антитела к pGlu-6166 (клон 12-1), необходимой для выявления амилоида р N3pE-40 в концентрации 10 нг/мл;
на фиг. 2 - результаты, полученные с помощью анализа методом дот-блоттинга, супернатантов индивидуальных IgG-продуцирующих клонов культуры клеток гибридомы;
на фиг. 3 - результаты, полученные с помощью PepSpot-анализа, клонов клеток гибридомы pGiu-6166 и антитела фирмы IBL к Ар N3pE;
на фиг. 4 - результаты, полученные с помощью 12% ДСН-ПААГ, антитела к pGlu-6166 (20 мкг) и супернатантов культуры клеток гибридомы;
на фиг. 5 - результаты, полученные с помощью Biacore-анализа, супернатантов культуры клеток ги-бридомы. Графически проиллюстрированы наложение установленных процессов связывания;
на фиг. 6 - сенсограммы, описывающие взаимодействие антитела к Aр N3pE (клон 6-1-6) с АррЕ3-
40;
на фиг. 7 - сенсограммы, описывающие взаимодействие антитела к Ар ШрЕ (клон 24-2-3) с АррЕ3-
40;
на фиг. 8 - результаты, полученные с помощью N3pE-ELISA, для клона 6-1-6, стандартная кривая
для АррЕ3-40;
на фиг. 9 - сенсограммы, характеризующие антитело к N3pE (клон 6-1-6);
на фиг. 10 - результаты количественной оценки АррЕ3-42 с помощью метода нейтрализации с использованием разведения 1:20 в буфере для иммуноферментного анализа (EIA-буфер), титрование рН с помощью 860 мкл 3,5 М Трис;
на фиг. 11 - окрашенные срезы головного мозга пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (AD): А - головной мозг пациента, страдающего спорадической AD (SAD), окрашенный антителом к Ар 6Е10, распознающим общий Ар; Б - головной мозг пациента, страдающего спорадической AD (SAD), окрашенный антителом к N3pE (клон 24-2-3), распознающим АррЕ3-х; В - головной мозг пациента, страдающего семейной AD (FAD), окрашенный антителом к N3pE (клон 24-2-3), распознающим
АррЕ3-х.
Подробное описание изобретения
Определения.
Понятие "антитело" в настоящем описании используется в наиболее широком смысле и, в частности, относится к моноклональным антителам, поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), образованным по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагментам антител, в том случае, если они обладают требуемой биологической активностью. Антитела могут представлять собой, например, IgM, IgG (например, IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), IgD, IgA или IgE. Однако предпочтительно антитело не представляет собой антитело в виде IgM.
Понятие "фрагменты антитела" относится к части интактного антитела, как правило, к антигенсвя-зывающей или вариабельной области интактного антитела.
Примерами фрагментов антител являются Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты: димерные антитела ("диантиатела"); одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Понятие "моноклональное антитело" в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. входящие в популяцию индивидуальные антитела идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и представляют собой антитела к одному антигенному сайту. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), мишенью каждого моноклонального антитела является только одна детерминанта антигена. Помимо их специфичности преимуществом моноклональных антител часто является тот факт, что их синтезируют с помощью культуры гибридомы, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Прилагательное "моноклональное" свидетельствует о том, что антитело получено из практически гомогенной популяции антител, при этом не предполагается, что оно должно быть получено с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью метода на основе гибридом, впервые описанного Kohler и др., Nature, 256, 1975, с. 495, или их можно конструировать хорошо известными методами рекомбинантной ДНК. "Моноклональные антитела" можно выделять также из фаговых библиотек антител с помощью методик, описанных, например, у Clackson и др., Nature, 352, 1991, c. 624628 и у Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, c. 581-597.
Моноклональные антитела в контексте настоящего описания включают, в частности, "химерные"
антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным из конкретных видов, или принадлежит к конкретному классу или подклассу антител, а остальной участок цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученным из других видов, или принадлежит к другому классу или подклассу антител, включая фрагменты таких антител, в случае, если они обладают требуемой биологической активностью.
Гуманизированные формы антител животных кроме человека (например, мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2, или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые включают минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина животного кроме человека. Основная часть гуманизированных антител представлена человеческими иммуноглобулинами (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельного участка (CDR) реципиента заменены остатками из CDR антител из других видов кроме человека (антитело-донор), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и потенциалом. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) Fv-области человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками антител из других видов кроме человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не присутствуют ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемых последовательностях CDR- или каркасных участков.
Эти модификации осуществляют с целью дополнительного усовершенствования характеристик антитела. В целом гуманизированное антитело должно включать практически полностью по меньшей мере одну, а как правило две, вариабельных области, в которых все или практически все CDR-участки соответствуют CDR-участкам указанных иммуноглобулинов других животных кроме человека, а все или практически все FR соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно может включать также по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Дополнительные более подробные данные см. у Jones и др., Nature, 321, 1986, c. 522-525; Reichmann и др., Nature, 332, 1988, c. 323-329 и у Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, 1992, c. 593-596. Гуманизированное антитело включает антитело Primatized(tm), в котором антигенсвязывающий участок антитела выведен из антитела, полученного путем иммунизации макак представляющим интерес антигеном.
"Одноцепочечные Fv-" или "sFv''-фрагменты антител содержат VH- и ^-области антител, причем эти области находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv содержит также полипептидный линкер между VH- и ^-областями, которые позволяют sFv образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Обзор литературы, касающийся sFv, представлен у Pluckthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, c. 269-315.
Понятие "димерное антитело" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязы-вающими центрами, указанные фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), связанную с вариабельной областью легкой цепи (VD) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VD). С помощью линкера, который является слишком коротким для того, чтобы могло происходить спаривание между двумя областями на одной и той же цепи, происходит принудительное спаривание областей с комплементарными областями другой цепи и создаются два антигенсвязывающих центра. Димерные антитела более подробно описаны у Hollinger и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, c. 6444-6448.
"Выделенное антитело" представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено от и/или выделено из компонента его естественного окружения. Загрязнителями в его естественном окружении являются продукты, которые могут оказывать воздействие при диагностическом или терапевтическом применении антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие, белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело должно быть очищено до (1) более 95% в пересчете на массу антитела, что определяют методом Лоури, и наиболее предпочтительно более 99 мас.%, до (2) степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвинатора с вращающейся чашкой или до (3) гомогенного состояния по данным ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях при окрашивании кумасси бриллиантовым голубым или предпочтительно при окрашивании серебром. К выделенному антителу относится антитело, находящееся in situ в рекомбинантных клетках, если в них не присутствует ни один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело должно быть получено с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.
В контексте настоящего описания понятия "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используют взаимозаменяемо, и они все включают также потомство. Таким образом, понятие "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают, прежде всего, клетки, которые являются объектом изобретения, и выведенные из них культуры вне зависимости от количества переносов. Следует понимать также, что все потомство может не является точно идентичным по составу ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, обладающее та
кой же функцией или биологической активностью, которое отобрано в процессе скрининга для исходной трансформированной клетки. Из контекста настоящего описания должны быть очевидны варианты, для которых возможны другие определения.
Понятия "полипептид", "пептид" и "белок" в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они означают биологическую молекулу, состоящую из аминокислот, которые сцеплены пептидной связью.
В контексте настоящего описания понятия, употребляемые в единственном числе, могут предусматривать "один или несколько", и включать множество, если из контекста не следует иное.
Фраза "заболевания и нарушения, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидом или ами-лоидоподобными белками" включает (но, не ограничиваясь только ими) заболевания и нарушения, обусловленные присутствием или активностью амилоидоподобных белков в мономерном, фибриллярном или полимерном состоянии или в любом сочетании указанных трех состояний. Такие болезни и нарушения включают (но, не ограничиваясь только ими) амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна.
Понятие "амилоидоз" относится к группе заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая (но, не ограничиваясь только ими) вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая такие болезни как (но не ограничиваясь только ими) неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивной способности к запоминанию, такие, например, как легкое когнитивное нарушение (MCI), спорадическая болезнь Альцгеймера, деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, семейные деменции альцгеймеровского типа, такие как семейная британская демен-ция (FBD) и семейная датская деменция (FDD); а также другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), миозит, вызываемый тельцами включения (IBM), диабет взрослых и старческий сердечный амилоидоз; и различные глазные болезни, включая дегенерацию желтого пятна, связанную с друзами оптическую нейропатию и катаракту, связанную с отложениями бета-амилоида.
Понятие "амилоид р, Ар или р-амилоид" имеет значение, известное в данной области, и относится к белкам или пептидам амилоида р, белку-предшественнику амилоида р (АРР), а также к их модификациям, фрагментам и любым функциональным эквивалентам. В частности, под понятие "амидоид р" в контексте настоящего описания подпадает любой фрагмент, полученный протеолитическим расщеплением АРР, но прежде всего фрагменты, которые участвуют или которые ассоциированы с амилоидной патологией, включая (но, не ограничиваясь только ими) Aр1-38, Aр1-40, Aр1-42.
Аминокислотные последовательности этих Ар-пептидов представлены ниже: АВ 1-42 (SEP ID NO. П:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Qln-Lys-Leu-Val-Phe-
Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-
Val-Val-Ile-Ala
Ар 1-40 (SEP ID NO. 2):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-
Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-
Val-Val
AB 1-38 (SEP ID NO. 3):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-
Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly "pGlu-Aр" или "Ар N3pE" относится к укороченным на N-конце формам Ар, которые начинаются на остатке глутаминовой кислоты в положении 3 в аминокислотной последовательности Ар и в которых указанный остаток глутаминовой кислоты циклизован с образованием остатка пироглутаминовой кислоты. В частности, pGlu-Aр в контексте настоящего описания означает те фрагменты, которые участвуют в или которые ассоциированы с амилоидными патологиями, включая (но, не ограничиваясь только ими) pGlu-APз-з8, pGlu-АPз-40, p-Gk^^.
Ниже представлены последовательности укороченных на N-конце форм Ар, Ар3-38, Ар3-40, Ар3-42:
Ар 3-42 fSEO ID NO. 41:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-GIn-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-
Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-GIy-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-
Ile-Ala
Ap 3-40 fSEO ID NO. 5):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val AP3-38fSEQ ID NO. 6):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-
Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ue-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-GIy
В частности, в настоящем изобретении предложено следующее.
1. Антитело, отличающееся тем, что связывается с Ар-пептидами или их вариантами, предпочтительно с высокой аффинностью.
2. Антитело по п.1, где высокая аффинность означает, что значение константны диссоциации (KD) составляет 10-7 М или менее.
3. Антитело по п.1 или 2, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
4. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 49, 53, 57 и 61, или аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 50, 54, 58 и 62.
5. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 51, 55, 59 и 63, или аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 52, 56, 60 и 64.
6. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52.
7. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56.
8. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60.
9. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64.
10. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело выбрано из следующей группы:
А(3 5-5-6 (депозит JVs DSM АСС 2923)
Ар 6-1 -6 (депозит № DSM АСС 2924)
Ар 17-4-3 (депозит № DSM АСС 2925) АР 24-2-3 (депозит № DSM АСС 2926), или его функциональные варианты.
11. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой Ар6-1-6 (депозит № DSM АСС 2924).
12. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой Ар24-2-3 (депозит № DSM АСС 2926).
13. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело или фрагмент антитела, который сохраняет высокую аффинность.
14. Антитело по одному из предыдущих пунктов, предназначенное для применения с целью выявления Ар-пептида или его вариантов.
15. Антитело по п.14, где варианты выбраны из следующей группы:
11.
pGlu-Ap3"3g pGlu-Арло
р01и-Ар3.42 и
варианты pGlu-АРз.^,
где х обозначает целое число от 10 до 42; предпочтительно от 18 до 42, более предпочтительно от
30 до 42.
16. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело является человеческим.
17. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое представляет собой димерное антитело или одноцепочечное антитело, сохраняющее высокую аффинность.
18. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое связывается с эпитопом, с которым связываются антитела по п.15.
19. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое имеет гипервариабельные участки антител по п.15.
20. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое является меченым.
21. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое иммобилизовано на твердой фазе.
22. Антитело, которое можно получать из любой из клеточных линий гибридом DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925, DSM АСС 2926.
23. Композиция, содержащая антитело по одному из предыдущих пунктов.
24. Композиция по п.23, предназначенная для лечения, предупреждения или замедления развития амилоидоза.
25. Композиция по п.23 или 24, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, включающей легкое когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейро-дегенерацию при синдроме Дауна.
26. Композиция по п.23 или 24, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альц-геймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.
27. Композиция по п.26, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.
28. Клеточная линия гибридомы DSM АСС 2923.
29. Клеточная линия гибридомы DSM АСС 2924.
30. Клеточная линия гибридомы DSM АСС 2925.
31. Клеточная линия гибридомы DSM АСС 2926.
32. Применение антитела по одному из пп.1-22 или композиции по одному из пп.23-27 в диагностическом или терапевтическом методе.
33. Применение по п.32 для диагностирования связанного с амилоидом заболевания или состояния.
34. Применение по п.33, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, включающей легкое когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейродегенера-цию при синдроме Дауна.
35. Применение по п.33, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.
36. Применение по п.35, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.
37. Диагностический способ in vitro для диагностирования ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, прежде всего болезни Альцгеймера, заключающий в том, что
приводят в контакт антитело по одному из пп.1-22 с образцом из организма индивидуума, который, как предполагается, может быть поражен указанным заболеванием или состоянием, и
определяют связывание антитела с pGlu-амилоидным белком, предпочтительно pGlu-Aр-пептидом из образца.
38. Диагностический набор, содержащий антитело по одному из пп.1-22 и инструкции по применению и необязательно (а) дополнительную(ие) биологически активную(ые) субстанцию(и).
39. Диагностический набор по п.32, в котором дополнительная биологическая субстанция представляет собой ингибитор глутаминилциклазы.
40. Олигонуклеотид, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 23-48.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять для диагностирования амилоидоза.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве агентов, используемых для очистки с помощью аффинной хроматографии. Для осуществления этого процесса антитела иммобилизуют на твердой подложке, такой как смола Сефадекс (Sephadex) или фильтровальная бумага, с помощью методов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело приводят в контакт с образцом, содержащем Ар-пептид (или его фрагмент), подлежащий очистке, и затем подложку отмывают приемлемым растворителем, который может удалять практически весь материал в образце за исключением Ар -пептида, который связан с иммобилизованным антителом. И, наконец, подложку отмывают другим
приемлемым растворителем, таким как глициновый буфер с рН 5,0, который позволяет отделять Ар-пептид от антитела.
Антитела к Ар-пептиду можно применять также в диагностических анализах, предназначенных для Ар-пептида, например, выявления его присутствия в конкретных клетках, тканях или сыворотке. Таким образом, антитела можно применять для диагностирования амилоидоза, в частности, нейродегенератив-ного заболевания, выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская де-менция (FDD), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.
Для диагностического применения антитело, как правило, метят с помощью выявляемого фрагмента. Многочисленные доступные метки, можно, как правило, сгруппировать по следующим категориям:
35 14 125 3 131
(а) радиоактивные изотопы, такие как S, С, I, Н и I. Антитело можно метить радиоактивным
изотопом с помощью методов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, т. 1 и 2, под ред.
Coligen и др., 1991, изд-во Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs., и радиоактивность можно оце-
нивать с помощью сцинтилляционного счетчика;
(б) флуоресцентные метки, из которых доступными являются хелаты редкоземельных металлов
(хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин,
фикоэритрин и краситель техасский красный (Texas Red). Флуоресцентные метки можно конъюгировать
с антителом с помощью методов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, см. выше.
Флуоресценцию можно оценивать количественно с помощью флуориметра;
(в) известны различные ферментно-субстратные метки. Фермент, как правило, катализирует хими-
ческое изменение хромогенного субстрата, что можно измерять с помощью различных методов. Напри-
мер, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, что можно оценивать спектрофотомет-
рически. В другом варианте фермент может изменять флуоресцентность или хемилюминисценцию суб-
страта. Методы, предназначенные для количественной оценки изменения флуоресценции, описаны вы-
ше. В результате химической реакции хемилюминисцентный субстрат становится чувствительным к воз-
буждению электронами и может испускать свет, который можно оценивать (например, с помощью хими-
люминометра), или становится донором энергии для флуоресцентного акцептора. Примерами фермент-
ных меток являются люциферазы (например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза; US
4737456), люцеферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, такая как
пероксидаза из хрена (HRPO), щелочная фосфатаза, р-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы
сахаридов (например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), оксидазы
гетероциклических соединений (такие как уреказа и ксантиноксидаза), лактопероксидаза, микроперокси-
даза и т.п. Методы конъюгации ферментов с антителами описаны у O'Sullivan и др., Methods for the Prep-
aration of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, в Methods in Enzym., под ред. J.
Langone и Van Vunakis, изд-во Academic press, New York, 73, 1981, c. 147-166.
Примерами комбинаций фермент-субстрат являются, например:
(I) пероксидаза из хрена (HRPO) и Н-пероксидаза в качестве субстрата, где Н-пероксидаза окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (OPD) или гидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ));
(II) щелочная фосфатаза (АР) и паранитрофенилфосфат в качестве хромогенного субстрата; и
(III) р^-галактозидаза (р-D-Gal) и хромогенный субстрат (например, паранитрофенил-р-D-
галактозидаза) или флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-р^-галактозидаза.
Специалистам в данной области известны многочисленные другие комбинации фермент-субстрат.
В некоторых случаях метку конъюгируют с антителом опосредовано. Специалисту в данной области известны пути достижения этой цели. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, и любую метку из указанных выше трех широких категорий можно конъюгировать с авидином, и наоборот. Биотин связывается избирательно с авидином и в результате метку можно конъюгировать с антителом указанным опосредованным образом. В другом варианте для осуществления опосредованной конъюгации метки с антителом антитело конъюгируют с небольшим гаптеном (например, дигоксином) и одну из меток указанных выше различных типов конъюгируют с антителом к гаптену (например, антителом к дигоксину). Таким путем осуществляют опосредованную конъюгацию метки с антителом.
В другом варианте осуществления изобретения не требуется метить антитело к Ар и его присутствие можно выявлять с помощью меченого антитела, с которым связывается антитело к Ар
Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в любом известном методе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы на основе иммунопреципитации (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, изд-во CRC Press, Inc., 1987, c. 147-158).
Конкурентные анализы связывания основаны на способности меченого стандарта конкурировать с анализируемым тестируемым образцом за связывание с присутствующим в ограниченным количестве антителом. Количество Ар-пептида в тестируемом образце обратно пропорционально количеству стан
дарта, которое связывается с антителами. Для облегчения определения количества связанного стандарта антитела, как правило, не солюбилизируют до или после конкурентного связывания, в результате стандартное и анализируемое антитело, связанное с антителами, можно легко отделять от оставшегося несвязанным стандартного и анализируемого антитела.
Сэндвич-анализы предусматривают применение двух антител, каждое из которых обладает способностью связываться с различной иммуногенной областью или эпитопом белка, который требуется выявлять. При осуществлении сэндвич-анализа тестируемый анализируемый образец связывают с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке, а затем второе антитело связывают с анализируемым образцом, получая тем самым нерастворимый состоящий из трех частей комплекс. Само второе антитело можно метить выявляемым фрагментом (прямые сэндвич-анализы) или его можно оценивать с помощью антитела к иммуноглобулину, которое метят выявляемым фрагментом (непрямой сэндвич-анализ). Например, одним из предпочтительных типов сэндвич-анализа является ELISA, в котором выявляемый фрагмент представляет собой фермент.
Для осуществления иммуногистохимии образец опухоли может быть свежеполученным или замороженным, или может быть залит в парафин и фиксирован с помощью консерванта, такого, например, как формалин.
Диагностические наборы.
Для удобства антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может входить в состав набора, например, его можно упаковывать в сочетании с реагентами в предварительно определенных количествах вместе с инструкцией по осуществлению диагностического анализа. Если антитело метят с помощью фермента, но в состав набора должны входить субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, предшественник субстрата, дающего выявляемый хромофор или флуорофор). Кроме того, в него могут входить другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться в широких пределах для получения концентраций в растворе реагентов, в значительной степени оптимизированных для требуемой чувствительности анализа. В частности, реагенты могут находиться в виде сухих порошков, как правило, лиофилизированных, включая эксципиенты, которые при растворении должны привести к образованию раствора реагента с соответствующей концентрацией.
Диагностический набор, предлагаемый в изобретении, может содержать дополнительную биологически активную субстанцию, описанную ниже. Наиболее предпочтительными для применения в составе диагностического набора являются ингибиторы глутаминилциклазы.
Диагностический набор, предлагаемый в изобретении, наиболее предпочтительно применять для выявления и диагностирования ассоциированных с амилоидом заболеваний и состояний, в частности, нейродегенеративных заболеваний, выбранных из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.
Настоящее изобретение относится, в частности, к антителам, которые отличаются тем, что они связываются с Ар -пептидом с высокой аффинностью. Настоящее изобретение относится также к антителам, которые отличаются тем, что они связываются с Ар-пептидами или их вариантами с высокой аффинностью. Указанная высокая аффинность в контексте настоящего описания означает аффинность, характеризующуюся значением KD, составляющим 10-7 М или менее, предпочтительно значением KD, составляющим 10-8 М или менее, и еще более предпочтительно значением KD, составляющим 10-9-10-12 М. Таким образом, связывание антител, предлагаемых в изобретении, с Ар-пептидом характеризуется более высокой аффинностью, чем аффинность известных антител. В частности, антитела предпочтительно представляют собой моноклональные антитела и их выбирают из следующей группы:
АР 5-5-6 (депозит № DSM АСС 2923)
АР 6-1-6 (депозит № DSM АСС 2924)
АР ] 7-4-3 (депозит № DSM АСС 2925) АР 24-2-3 (депозит № DSM АСС 2926). Антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, наиболее предпочтительно применяют в диагностическом способе, предназначенном для выявления амилоидоза, в частности, нейродегенеративного заболевания, выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альц-геймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альц-геймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения антитело может представлять собой гуманизированное или химерное антитело или человеческое антитело.
Кроме того, выбранное из вышеуказанной группы, антитело может представлять собой также
функциональный вариант антител из указанной группы.
В контексте настоящего изобретения вариант p-Glu-Aр-пептида представляет собой, в частности, pGlu-Aр3-38, pGlu-Aр3-40, pGlu-Aр3-42.
Другими вариантами Ар-пептидов являются все варианты pGlu-Ар^, для которых установлено, что они накапливаются в головном мозге в результате болезни Альцгеймера или являются предвестниками болезни Альцгеймера. X обозначает целое число от 10 до 42, например, в вышеуказанном pGlu-Aр3-42, "42" соответствует целому числу "х".
В контексте настоящего изобретения "функциональный вариант" антитела, предлагаемого в изобретении, представляет собой антитело, которое сохраняет способность к связыванию, в частности, способность к связыванию с высокой аффинностью с пептидом pGlu-Ар^ или его функциональным вариантом. Особенности указанных функциональных вариантов известны в данной области и они включают вышеуказанные характеристики, которые описаны при определении антител и их фрагментов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела, как он определен выше.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой антитело, которое связывается с эпитопом, который связывается с антителами, указанными выше, в частности антителом 5-5-6, антителом 6-1-6, антителом 17-4-3 и антителом
24-2-3.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой антитело, которое имеет гипервариабельные участки (CDR) указанных выше антител. Предпочтительно антитело может быть меченым; возможные метки представляют собой метки, которые указаны выше, и все они известны, в частности, специалистам в области диагностических применений антител.
Предпочтительно антитело иммобилизовано на твердой фазе.
Настоящее изобретение относится также к антителу, которое можно получать с помощью клеточной линии гибридомы 6-1-6 (DSM АСС 2924).
Настоящее изобретение относится также к композиции, которая содержит указанное выше антитело. В частности, композиция представляет собой композицию для диагностического применения, прежде всего для диагностирования нейродегенеративного заболевания, выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера; в частности для выявления Ар-пептида или его варианта в биологическом образце.
В другом варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении и описанное выше, или его фрагмент характеризуются аффинностью к связыванию с Ар-олигомером, волокном, фибриллой или филаментом, превышающим по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 15 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, но особенно предпочтительно по меньшей мере в 25, аффинность к связыванию с Ар-мономером.
Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело или его фрагмент или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, как они описаны выше, где антитело обладает высокой способностью к связыванию с агрегированным Ар, включая Ар-бляшки, в организме млекопитающего, в частности в головном мозге человека, но предпочтительно не обладает никакой заметной перекрестной реактивностью с амилоидным белком-предшественником (АРР).
Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело или его фрагмент или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, как они описаны выше, где антитело обладает высокой способностью к связыванию с растворимым полимерным амилоидом, в частности амилоидом р (Ар), включая мономеры Ар, в организме млекопитающего, в частности в головном мозге человека, но предпочтительно не обладает никакой заметной перекрестной реактивностью с амилоидным белком-предшественником (АРР).
Настоящее изобретение относится также к гуманизированным формам антител, описанных выше, композициям, содержащим гуманизированные антитела, и к применению композиций для лечения ами-лоидоза, прежде всего для лечения нейродегенеративного заболевания у млекопитающего, в частности у человека. Указанное нейродегенеративное заболевание прежде всего представляет собой заболевание, выбранное из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), и ней-родегенерацию при синдроме Дауна. Предпочтительно нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
В настоящем изобретении предложены также следующие клеточные линии гибридом 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3 и 24-2-3.
Настоящее изобретение относится также к применению антитела или композиции, содержащей антитело, как они все описаны выше, для применения в диагностическом способе in vitro. В частности, этот диагностический способ предназначен для диагностирования нейродегенеративного заболевания выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), и ней-родегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера; прежде всего путем выявления Ар-пептида или его вариантов в биологическом образце.
Предпочтительно образец представляет собой образец сыворотки.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения образец представляет собой образец жидкости (ликвора) или спинномозговой жидкости (СМЖ).
Конкретным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является следующий способ:
Диагностический способ in vitro или in situ, предназначенный для диагностирования ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, предпочтительно болезни Альцгеймера, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых
приводят в контакт антитело, предлагаемое в изобретении, с образцом, предпочтительно выбранным из образца сыворотки, ликвора или СМЖ, наиболее предпочтительно с образцом сыворотки; или специфической частью тела или областью тела индивидуума, который, как ожидается, может быть поражен указанным состоянием или заболеванием; и
определяют связывание антитела с pGlu-амилоидным белком, предпочтительно с пептидом pGlu-Aр в образце.
Более конкретно изобретение относится также к способу диагностирования ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, предпочтительно болезни Альцгеймера, заключающемуся в том, что выявляют иммуноспецифическое связывание антитела или его активного фрагмента с pGlu-амилоидным белком, предпочтительно пептидом pGlu-Aр, в образце или in situ, включающему стадии, на которых:
(а) приводят в контакт образец или специфическую часть организма или область организма, кото-
рая, как ожидается, может содержать амилоидный белок, с антителом, прежде всего с моноклональным
антителом, предлагаемым в изобретении, более предпочтительно с химерным антителом или его фраг-
ментом, либо с гуманизированным антителом или его фрагментом, предлагаемым в изобретении и опи-
санным выше, и/или его функциональным фрагментом, где антитело связывается с пептидом pGlu-AP;
(б) дают возможность антителу и/или его функциональному фрагменту связаться с пептидом pGlu-
Aр с образованием иммунологического комплекса;
(в) выявляют образование иммунологического комплекса; и
(г) устанавливают корреляцию между присутствием или отсутствием иммунологического комплек-
са и присутствием или отсутствием пептида pGlu-Ар в образце или специфической части или области
организма индивидуума.
Кроме того, в изобретении предложен способ определения степени загрузки амилоидогенными бляшками ткани и/или общей воды организма, заключающийся в том, что:
а) получают образец, репрезентативный для изучаемой ткани и/или общей воды организма;
б) оценивают присутствие в образце амилоидного белка с помощью антитела, прежде всего моно-
клонального антитела, предлагаемого в изобретении, или химерного антитела или его фрагмента, или
гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и/или
его функционального фрагмента;
в) определяют количество антитела, связанного с белком; и
г) рассчитывают загрузку бляшками ткани и/или общей воды организма.
В частности, изобретение относится к способу определения степени загрузки амилоидогенными бляшками ткани и/или общей воды организма, в котором образование иммунологического комплекса на стадии в) определяют таким образом, что присутствие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с присутствием или отсутствием амилоидного белка, в частности пептидов pGlu-Aр.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении и описанное/описанный выше, включая любое функционально эквивалентное антитело или его производное или его функциональный фрагмент, в терапевтически эффективном количестве, в частности, композиция, которая представляет собой фармацевтическую композицию, необязательно содержащую дополнительный фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления изобретения композиция содержит антитело в терапевтически
эффективном количестве.
Кроме того, под объем изобретения подпадает смесь, содержащая антитело, прежде всего монокло-нальное антитело, предлагаемое в изобретении, или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагментом, предлагаемое/предлагаемый в изобретении и описанное/описанный выше, включая любое функционально эквивалентное антитело или его производное или его функциональный фрагмент, в терапевтически эффективном количестве, и необязательно дополнительную биологически активную субстанцию и/или фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель и/или эксципиент.
В частности, изобретение относится к смеси, в которой дополнительная биологически активная субстанция представляет собой соединение, применяемое для лечения амилоидоза, т.е. группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с амилоидом или амилоидоподобным белком, таким как Ар-белок, с которым связаны нейродегенеративные заболевания, выбранные из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгей-мера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская де-менция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.
В следующем варианте осуществления изобретения другая биологически активная субстанция или соединение может представлять собой также терапевтическое средство, которое можно применять для лечения амилоидоза, обусловленного амилоидом р, или можно применять для медикаментозного лечения других неврологических нарушений.
Другая биологически активная субстанция или соединение может проявлять биологические действие посредством такого же или сходного механизма, что и антитело, предлагаемое в изобретении, или посредством неродственного механизма действия или сочетанием нескольких родственных и/или неродственных механизмов действия.
Как правило, другая биологически активная субстанция или соединение может представлять собой энхансеры нейронной трансмиссии, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетил-холинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, транквилизаторы на основе бензодиа-зепинов, усилители синтеза, накопления или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптическо-го рецептора ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-А или -В, антагонисты рецептора N-метил-D-аспартатглутамата (NMDA), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антиок-сиданты и антагонисты серотонергического рецептора.
Более конкретно, изобретение относится к смеси, которая содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей соединения против окислительного стресса, антиапоптозные соединения, хелаторы металлов, ингибиторы репарации ДНК, такие как пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновую кислоту (3APS), 1,3-пропандисульфонат (1,3PDS), активаторы а-секретаз, ингибиторы р- и у-секретаз, тау-белки, нейромедиатор, разрушители р-складчатой конформации, аттрак-танты для клеточных компонентов, участвующих в клиренсе/истощении амилоида бета, ингибиторы укороченного на N-конце амилоида бета, включая пироглутаматированный амилоид бета 3-42, такие как ингибиторы глутаминилциклазы, противовоспалительные молекулы или ингибиторы холинэстеразы (ChEI), такие как такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, агонисты M1 и другие лекарственные средства, включая любое модифицирующее амилоид или тау-белок лекарственное средство и пищевые добавки, и пищевые добавки в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, и/или эксципиент.
Изобретение относится также к смеси, в которой соединение представляет собой ингибитор холи-нэстеразы (ChEI), прежде всего, к смеси, в которой соединение представляет собой соединение, выбранное из группы" включающей такрин, ривастигмин, донепезил, галантамин, ниацин и мемантин.
В следующем варианте осуществления изобретения смеси, предлагаемые в изобретении, могут содержать ниацин или мемантин в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, и/или эксципиент.
В следующем варианте осуществления изобретения смеси, предлагаемые в изобретении, могут содержать ингибитор глутаминилциклазы в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, и/или эксципиент.
Предпочтительными ингибиторами глутаминилциклазы являются соединения, описанные в WO 2005/075436, в частности в примерах 1-141 на c. 31-40. Синтез соединений, указанных в примерах 1-141, описан на cc, 40-48 WO 2005/075436. Описание WO 2005/075436, касающееся соединений, представленных в примерах 1-141, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/055945, в частности в примерах 1-473 на c. 46-155. Синтез соединений, указанных в примерах 1-473, описан на c. 156-192 WO 2008/055945. Описание WO 2008/055945, касающееся соединений, представленных в примерах 1473, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее
описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/055947, в частности в примерах 1-345 на c. 53-118. Синтез соединений, указанных в примерах 1-345, описан на c. 119-133 WO 2008/055947. Описание WO 2008/055947, касающееся соединений, представленных в примерах 1345, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/055950, в частности в примерах 1-212 на c. 57-120. Синтез соединений, указанных в примерах 1-212, описан на c. 121-128 WO 2008/055950. Описание WO 2008/055950, касающееся соединений, представленных в примерах 1212, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/065141, в частности в примерах 1-25 на c. 56-59. Синтез соединений, указанных в примерах 1-25, описан на c. 60-67 WO 2008/065141. Описание WO 2008/065141, касающееся соединений, представленных в примерах 1-25, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/110523, в частности в примерах 1-27 на c. 55-59. Синтез соединений, указанных в примерах 1-27, описан на c. 59-71 WO 2008/110523. Описание WO 2008/110523, касающееся соединений, представленных в примерах 1-27, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/128981, в частности в примерах 1-18 на c. 62-65. Синтез соединений, указанных в примерах 1-18, описан на c. 65-74 WO 2008/128981. Описание WO 2008/128981, касающееся соединений, представленных в примерах 1-18, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/128982, в частности в примерах 1-44 на c. 61-67. Синтез соединений, указанных в примерах 1-44, описан на c. 68-83 WO 2008/128982. Описание WO 2008/128982, касающееся соединений, представленных в примерах 1-44, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/128983, в частности в примерах 1-30 на c. 64-68. Синтез соединений, указанных в примерах 1-30, описан на c. 68-80 WO 2008/128983. Описание WO 2008/128983, касающееся соединений, представленных в примерах 1-30, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/128984, в частности в примерах 1-36 на c. 63-69. Синтез соединений, указанных в примерах 1-36, описан на c. 69-81 WO 2008/128984. Описание WO 2008/128984, касающееся соединений, представленных в примерах 1-36, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки,
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/128985, в частности в примерах 1-71 на c. 66-76. Синтез соединений, указанных в примерах 1-71, описан на c. 76-98 WO 2008/128985. Описание WO 2008/128985, касающееся соединений, представленных в примерах 1-71, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в WO 2008/128986, в частности в примерах 1-7 на c. 65-66. Синтез соединений, указанных в примерах 1-7, описан на c. 66-73 WO 2008/128986. Описание WO 2008/128986, касающееся соединений, представленных в примерах 1-7, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Еще одним вариантом осуществления изобретения являются смеси, которые содержат "атипичные антипсихотические средства", такие, например, как клозапин, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, предназначенные для лечения позитивных или негативных психотических симптомов, включая галлюцинации, бред, нарушения мышления (проявляющиеся в выраженной непоследовательности действий, психическом расстройстве, расстройстве ассоциативного мышления) и эксцентричное или неорганизованное поведение, а также ангедонию, пониженную эмоциональную реакцию, апатию и отказ от общества, в сочетании с антителом, прежде всего моноклональным антителом, предлагаемым в изобретении, но предпочтительно с химерным антителом или его фрагментом или гуманизированным антителом или его фрагментом, предлагаемым в изобретении и описанными выше, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, и/или эксципиент.
В конкретном варианте осуществления изобретения композиции и смеси, предлагаемые в изобрете
нии и описанные выше, содержат антитело и биологически активную субстанцию соответственно в терапевтически эффективном количестве.
Другие соединения, которые можно применять в смесях в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, описаны в WO 2008/065141 (см. прежде всего c. 37/38), включая ингибиторы PEP (c. 43/44), LiCl, ингибиторы дипептидиламинопептидаз, предпочтительно ингибиторы DP IV или DP IV-подобных ферментов (см. c. 48/49); ингибиторы ацетилхолинэстеразы (AChE) (см. с. 47), энхансеры PIMT (протеинизоаспартаткарбоксиметилтрансфераза), ингибиторы бета-секретаз (см. с. 41), ингибиторы гамма-секретаз (см. пп.41/42), ингибиторы нейтральной эндопептидазы, ингибиторы фосфодиэстера-зы-4 (PDE-4) (см. c. 42/43), ингибиторы TNF-альфа, антагонисты мускаринового М1-рецептора 9 (см. с. 46), антагонисты NMDA-рецептора 9 (см. c. 47/48), ингибиторы сигма-1-рецептора, антагонисты гис-тамина Н3 (см. с. 43), иммуномодуляторы, иммунодепрессанты, антагонисты МСР-1 или средство, выбранное из группы, включающей антегрен (натализумаб), неурелан (фампридин-SR), кампат (алемтузу-маб), IR 208, NBI 5788/MSP 771 (типлимотид), паклитаксел, Anergix.MS (AG 284), SH636, дифферин (CD 271, адапален), BAY 361677 (интерлейкин-4), ингибиторы матриксной металлопротеиназы (например, ВВ 76163), интерферон-тау (трофобластин) и SAIK-MS; антитела к бета-амилоиду (см. с. 44), ингибиторы цистеиновой протеазы (см. с. 44); антагонисты МСР-1 (см. c. 44/45), ингибиторы отложения амилоидного белка (см. с. 42) и ингибиторы синтеза бета-амилоида (см. с. 42), указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Другим вариантом осуществления изобретения является смесь, содержащая антитело, прежде всего моноклональное антитело, предлагаемое в изобретении, или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении и описанное/описанный выше, и/или биологически активную субстанцию в терапевтически эффективном количестве.
Изобретение относится также к применению антитела, прежде всего моноклонального антитела, предлагаемого в изобретении, но предпочтительно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и/или его функционального фрагмента и/или фармацевтической композиции или смеси, содержащей указанное антитело, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или облегчения воздействий амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, а также других заболеваний, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ демен-ция, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и других заболеваний, включая дегенерацию желтого пятна.
Настоящее изобретение относится также к способу получения антитела, прежде всего монокло-нального антитела, предлагаемого в изобретении, но более предпочтительно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и/или его функционального фрагмента, и/или фармацевтической композиции, или смеси, содержащей указанное антитело и/или его функциональный фрагмент, предпочтительно в терапевтически эффективном количестве, для использования в способе предупреждения, лечения или облегчения воздействий амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская де-менция (FDD), нейродегенерация при синдроме Дауна; деменция, связанная с тельцами Леви, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменций Гуама-Паркинсона, а также других заболеваний, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподоб-ными белками, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейц-фельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и других заболеваний, включая дегенерацию желтого пятна, заключающемуся в том, что приготавливают препарат антитела, прежде всего моноклонального антитела, предлагаемого в изобретении, но более предпочтительно химерного антитела или его фрагмента или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении, в виде фармацевтически приемлемой формы.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ предупреждения, лечения или облегчения воздействий амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (MCI), бо
лезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных де-менций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), нейродегенерация при синдроме Дауна; деменция, связанная с тельцами Леви, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменций Гуама-Паркинсона, а также других заболеваний, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподоб-ными белками, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейц-фельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли, и других заболеваний, включая дегенерацию желтого пятна, заключающийся в том, что вводят антитело и/или его функциональный фрагмент, но предпочтительно гуманизированное антитело и/или его функциональный фрагмент, или композицию или смесь, содержащую указанное антитело и/или его функциональный фрагмент, животному или человеку, пораженному указанным нарушением, при этом антитело вводят в терапевтически эффективном количестве.
Еще одним объектом изобретения является способ лечения амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), нейродегенерация при синдроме Дауна; прежде всего заболевания или состояния, отличающегося потерей когнитивной способности к запоминанию, заключающийся в том, что вводят животному, прежде всего млекопитающему или человеку, антитело, прежде всего фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении и представленную в настоящем описании.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ сохранения или повышения когнитивной способности к запоминанию, но прежде всего восстановления когнитивной способности к запоминанию у животного, прежде всего млекопитающего или человека, который страдает нарушением памяти, заключающийся в том, что вводят животному, прежде всего млекопитающему или человеку, антитело, предпочтительно фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении и описанную выше.
Следующим объектом изобретения является терапевтическая композиция и способ получения композиции, а также способ лечения амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (MCI), болезнь Альцгеймера (AD), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (SAD) или семейных деменций альцгеймеровского типа (FAD), таких как семейная британская деменция (FBD) и семейная датская деменция (FDD), нейродегенерация при синдроме Дауна; прежде всего заболевания или состояния, отличающегося потерей когнитивной способности к запоминанию, с использованием антитела, предлагаемого в изобретении и описанного выше.
В частности, изобретение относится к лечению животного, прежде всего млекопитающего или человека, который страдает ассоциированным с амилоидом состоянием, отличающимся потерей когнитивной способности к запоминанию, что приводит к сохранению когнитивной способности к запоминанию.
Примеры
1. Материал и методы. 1.1. Получение антител. Мыши.
Для получения гибридом использовали самок мышей линии BALB/C (фирма Charles River) 8-недельного возраста.
Клеточная линия миеломы.
Для создания гибридом использовали клеточную линию миеломы SP2/0-Ag14 из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур. Антиген.
Использовали пептид pGlu-6166 (последовательность pGlu-FRHDSGC, SEQ ID NO: 65). Стратегия.
Для создания иммуногена пептид сшивали с бычьим тиреоглобулином (БТГ, фирма SIGMA) через малеимидные группы, присутствующие в трех различных линкерах. Применяли три линкера различной длины, таких как сложный №[е-малеимидока1гооилокси]сущинимидный эфир (EMCS), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси(6-амидокапроат) (LCSMCC) и сложный N-[b-малеимидопропилокси]сукцинимидный эфир (BMPS).
Для выявления созданных антител этот же пептид конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином (БСА, фирма SIGMA) через малеимидную группу из сукцинимидил-6-[(Ь-малеимидопропионамидо)гексаноата] (SMPH).
Методы.
Конъюгация пептида с целью иммунизации.
Конъюгацию осуществляли с помощью двух стадий через SH-группы из остатков цистеина пептида.
1. Малеилирование белка-носителя.
Добавляли от 2 до 5 мг соответствующего линкера (50 мг/мл в N-метилпирролидоне, NMP) к 2 мл раствора белка-носителя (10 мг/мл в 0,1 мМ NaHCO3, pH 8,0). Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Затем реакционную смесь обессоливали с помощью колонки Sephadex G-50 (1,5х 14 см), которую уравновешивали 50 мМ фосфатом натрия, 250 мМ NaCl, рН 6,8.
2. Сочетание малеилированного БТГ с пептидом.
250 мкл раствора пептида (10 мг/мл в дважды дистиллированной воде) смешивали с 2 мл раствора, содержащего малеилированные белки-носители (2,5 мг/мл) в 50 мМ фосфате натрия, 250 мл NaCl, рН 6,8, и инкубировали в течение 2 ч при 4°С и еще в течение 4 ч при КТ. Непрореагировавшие малеимид-ные группы блокировали, добавляя 2-меркаптоэтанол вплоть до достижения концентрации 10 мМ, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Образовавшийся конъюгат подвергали диализу в противотоке 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,5 при 4°С (3-кратный обмен буфера, номинально отсекаемая
ММ 10000).
Конъюгация пептида для осуществления ELISA.
Конъюгацию осуществляли с помощью двух стадий через SH-группы из остатков цистеина пептида.
1. Малеилирование белка-носителя.
2 мг SMPH (50 мг/мл в N-метилпирролидоне, NMP) добавляли к 2 мл раствора белка-носителя (БСА, 10 мг/мл в 0,1 мМ NaHCO3, pH 8,0). Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Затем реакционную смесь обессоливали с помощью колонки Sephadex G-50 (1,5x14 см), которую уравновешивали 50 мМ фосфатом натрия, 250 мМ NaCl, pH 6,8.
2. Сочетание малеилированного БТГ с пептидом.
100 мкл раствора пептида (10 мг/мл в 50 мМ фосфате натрия, 250 мМ NaCl, pH 6,8) смешивали с 1 мл раствора, содержащего малеилированные белки-носители (2,5 мг/мл) в 50 мМ фосфате натрия, 250 мл NaCl, pH 6,8, и инкубировали в течение 2 ч при 4°С и еще в течение 4 ч при КТ. Непрореагировавшие малеимидные группы блокировали, добавляя 2-меркаптоэтанол вплоть до достижения концентрации 10 мМ, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Образовавшийся конъюгат подвергали диализу в противотоке 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,5 при 4°С (3-кратный обмен буфера, номинально отсекаемая ММ 10000).
Иммунизация.
Пять мышей иммунизировали внутрибрюшинно в течение 39 дней. Для иммунизации использовали эмульсию типа вода-в-масле, состоящую из равных частей раствора антигена (состоящего из равных частей трех различных конъюгаюв пептид-БТГ) и полного или неполного адъюванта Фрейнда.
Слияние.
Трех иммунизированных мышей умерщвляли путем инкубации с использованием СО2. Селезенки изымали и гомогенизировали в стерильных условиях. Спленоциты и клетки миеломы линии SP2/0 отмывали несколько раз в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM, фирма SIGMA) и осуществляли слияние, применяя соотношение 2,3 спленоцита на 1 клетку линии SP2/0, с использованием полиэтиленгликоля 3350 (1 мл, 50% (мас./об.)). Дальнейшую обработку слитых гибридом осуществляли согласно стандартным методикам.
ELISA.
Для скрининга супернатанта клеточной культуры применяли IgG- ELISA. Опыт проводили в 96-луночных титрационных микропланшетах из полистирола (фирма Greiner, каталожный № 655061). Планшеты сенсибилизировали пептидом БСА-pGlu-6166. По 100 мкл неразведенного супернатанта клеточной культуры добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при КТ. В качестве отрицательного контроля использовали супернатант ЭР2/0-клеток. Супернатант спленоцитов использовали в качестве положительного контроля.
Позитивные клетки выявляли с помощью козьего антитела к мышиному IgG, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Оптическую плотность (ОП) определяли с помощью ридера для микропланшетов Dynex Opsys MR при 405 нм.
Селекция стабильных продуцирующих антитела клеток гибридом.
Клетки из позитивных лунок переносили в 24-луночные планшеты и культивировали в течение нескольких дней. Клетки вновь переносили и оценивали в отношении связывания БСА-pGlu-6199 и перекрестной реактивности с помощью ELISA. Позитивные лунки применяли для криоконсервации клеточных линий гибридом.
Клонирование посредством конечного разведения.
Осуществляли две последовательные стадии клонирования для отделения продуцирующих антите
ла клеток от непродуцирующих клеток и для гарантии того, что отобранные клетки являются монокло-нальными. Обе стадии клонирования осуществляли с помощью метода конечного разведения. Криоконсервация.
Отобранные гибридомы подвергали криоконсервации с использованием ДМСО и стандартных методов.
1.2. ELISA-анализы.
Иммобилизацию Ар N3pE-40 осуществляли с использованием hAp (х-40)-ELISA (HS) фирмы TGC (фирма The GENETICS Company; Швейцария), в целом согласно инструкциям производителя.
Создавали биотинилированные идентифицирующие антитела к Ар N3pE (pGlu-6166). При необходимости конъюгированное с HRP-антитело к Ар N3pE фирмы IBL использовали в качестве положительного контроля (доступно только в сочетании с набором для ELISA Human Amyloid р (N3pE) фирмы IBL). Синтезировали соответствующие пептиды Ар N3pE-40 (аликвоты массой 50 мкг в гексафторизопропа-ноле (ГФИП) хранили при -80°С). Непосредственно перед применением ГФИП выпаривали и пептид разводили с помощью 100 мМ Трис/HCl, рН 10,4 до концентрации 1 мкг/мкл. Этот маточный раствор разводили дополнительно с использованием растворителя для антител фирмы TGC. Последующие иммобилизацию и идентификацию осуществляли согласно инструкциям производителя.
1.3. PepSpot(tm)-анализ.
Специфичность и биологическую целостность антител к Ар N3pE и супернатантов клеточных культур осуществляли с использованием технологии PepSpot(tm) фирмы JPT Peptide Technologies GmbH, Volmerstrasse 5 (UTZ), 12489 Берлин, Германия.
Соответствующие мембраны для осуществления PepSpot(tm) получали от фирмы JPT. Принцип этого метода разработан и описан ранее у Kramer и др., Cell 91, 1997, с. 799-809.
Для анализа мембраны блокировали в течение 2 ч с помощью TBST-M (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,005% Твин 20 + 5% обезжиренного молока) при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С на качающейся платформе с суперна-тантами индивидуальных клеточных культур, разведенными равными объемами TBST-M. Для определения сигнала применяли вторичное антимышиное антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, согласно стандартным процедурам.
1.4. Анализ методом дот-блоттинга.
Осуществляли обычный протокол дот-блоттинга для получения информации о чувствительности антитела к Ар N3pE и супернатантов клеточных культур к соответствующему нативному пептиду. Для этой цели пептид Ар N3pE-40 в понижающихся концентрациях (1000-8 нг) наносили точками на небольшие кусочки нитроцеллюлозной мембраны и затем осуществляли экспериментальную процедуру, описанную для PepSpot(tm)-мембран.
1.5. ДСН-ПААГ.
Содержащие 12% ДСН полиакриламидные гели подготавливали согласно стандартным протоколам. 15 мкл супернатантов клеточных культур и 10 мкг биотинилированного антитела разделяли на 12% ДСН-полиакриламидном геле. Электрофорез осуществляли в течение 2 ч при постоянном напряжении 100 В.
1.6. BIACORE-анализ.
Пептид Ар N3pE-40 (положительный контроль) и пептид Ар N3E-40 (отрицательный контроль) сшивали с чипом СМ5 фирмы Biacore. Немодифицированные чипы применяли для определения контрольных значений. Оценивали ассоциацию и диссоциацию биотинилированного антитела, разведенного до концентрации от 20 до 1 мкг/мл растворителем фирмы TGC, что позволяло далее определять соответствующее значение KD. Таким путем определяли также характеристики связывания супернатантов индивидуальных клеточных культур.
1.6.1. Аффинность Ар ШрЕ-специфических антител клона 6-1-6 и 24-2-3.
Очищенное антитело клона 6-1-6 разводили в буфере HBS-EP (фирма Biacore) до 100, 50, 30, 20, 15, 10, 7, 4, 2, 1 нМ. Аффинность определяли с помощью системы Biacore 3000 с использованием чипа СМ5, на котором иммобилизовывали АррЕ3-40. Система работала при скорости потока 30 мкл/мин. Оцененные основные эффекты и неспецифическое связывание с поверхностью чипа корректировали путем вычитания сигнала в проточной ячейке 4, в которой иммобилизовывали Ар рЕ3-40, и сигнала в незагруженной проточной ячейке 3. Ассоциацию (10 мин) определяли путем инъекции 300 мкл каждой концентрации. Диссоциацию определяли в течение 10 мин. Оставшиеся молекулы антитела удаляли путем инъекции 5 мкл 0,1 М HCl. Для каждой концентрации антитела оценивали ассоциацию и диссоциацию. Определение скорости ассоциации и диссоциации и константы диссоциации осуществляли путем глобального одновременного подбора фазы ассоциации и диссоциации для всех изученных концентраций антител с использованием модели "Bivalent analyte".
1.7. Секвенирование вариабельных областей антител. Культивирование клеток гибридом.
Клетки гибридом вьфащивали в среде D-MEM (+ L-глутамин, + Na-пируват, 4,5 г/л глюкозы, фирма Gibco), дополненной 15% FBS, 1% MEM-NEA (заменимые аминокислоты, фирма Gibco), 50 мкг/мл ген-тамицина (фирма Gibco) и 50 мкМ р-меркаптоэтанолом, при 37°С и 5% СО2. Пересев осуществляли после культивирования в течение 3-4 дней в зависимости от клеточной плотности. Клетки высевали в концентрации 0,5х106 клеток/мл, расщепление имело место при клеточной плотности 2-5х106 клеток/мл.
Синтез кДНК и обратная транскрипция.
Общую РНК выделяли из 2х 106 клеток согласно руководству к набору для выделения РНК Nucleo-spinRNA (фирма Macherey-Nagel). 100 нг РНК применяли для синтеза кДНК с использованием праймера олиго(дТ)15 (фирма Promega) и обратной транскриптазы Superscript III (фирма Invitrogen).
ПЦР-амплификация вариабельных областей тяжелых и легких цепей.
Вариабельные области тяжелых цепей амплифицировали на основе кДНК-матрицы с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Phusion(tm) (фирма NEW ENGLAND BioLabs) с помощью праймера MHCG1 (в случае клонов 5-5-6 и 6-1-6) и MHCG2b (клоны 17-4-3 и 24-2-3) в сочетании с праймерами MHV1-12. Для амплификации вариабельных областей легких цепей применяли праймер МКС в сочетании с праймерами MKV1-MKV11. Последовательности праймеров представлены в табл. 1.
Клонирование ПЦР-продуктов в pJET1.2.
Вариабельные области тяжелых и легких цепей, амплифицированные с помощью ПЦР, клонировали в векторе pJET1.2/c "тупым концом" согласно протоколу для набора для ПЦР-клонирования Clone-JET(tm)(фирма Fermentas). Для секвенирования использовали секвенирующие праймеры pJET1.2.
Таблица 1
Праймерные последовательности для ПЦР-амплификации вариабельных областей
тяжелых и легких цепей
Название
Последовательность
SEQ ID NO
MKV1
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG
MKV2
ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG
MKV3
ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG
MKV4
ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG
MKVS
ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC
MKV6
ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG
MKV7
ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG
MKV8
ATCTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG
MKV9
ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG
MKVI0
ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT
MKVU
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC
МКС
ACTGGATGGTGGGAAGATGG
MHV 1
ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC
MHV2
ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT
MHV3
ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT
MHV4
ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT
MHV5
ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT
MHV6
ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC
MHV7
ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT
MHV8
ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG
MHV9
ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG
MHV10
ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG
MHV11
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG
MHVI2
ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG
MHCG1
CAGTGGATAGACAGATGGGGG
MHCG2b
CAGTGGATAGACTGATGGGGG
1.8. Применение клона антитела 6-1-6 для осуществления N3pE-ELISA.
96-луночный планшет типа Maxisorb (фирма Nunc) сенсибилизировали иммобилизованным антителом путем инкубации, используя 100 мкл на лунку (2 мкг/мл) антитела к Ар 4G8, разведенного в D-ЗФР, в течение ночи при 4°С. Планшет запечатывали. Раствор для сенсибилизации удаляли и поверхность планшета блокировали, используя по 200 мкл на лунку не содержащего белка блокатора для ELISA фирмы PIERCE (Protein-free ELISA-Blocker) (без Твин-20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшет отмывали 6 раз TBS+0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. Применяемый в качестве стандарта пептид АррЕ3-40 разводили с помощью не содержащего белка блокатора для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20) до концентрации 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 пг/мл. По 100 мкл каждой концентрации и 100 мкл буфера для разведения (контроль) вносили в планшет с помощью пипетки. Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Затем
планшет отмывали 6 раз с помощью TBS + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку добавляли пипеткой по 100 мкл раствора конъюгата идентифицирующее антитело-фермент, который содержал 1 мкг/мл Ар ШрЕ-специфического антитела (клон 6-16) и 2 мкг/мл конъюгата стрептавидин-HRP (фирма Sigma), входящего в набор, включающий не содержащий белка блокатор для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20). Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью TBS + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку вносили пипеткой по 100 мкл раствора субстрата SureBlue (KPL) и планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали, добавляя в лунку по 100 мкл 1 М H2SO4. Абсорбцию измеряли с помощью устройства TECAN Sunrise при 450 нм с поправкой на абсорбцию при 540 нм.
1.9. Изучение перекрестной реактивности с помощью ELISA и резонанса поверхностного плазмона
(SPR). ELISA.
96-луночный планшет типа Maxisorb (фирма Nunc) сенсибилизировали иммобилизованным антителом путем инкубации, используя по 100 мкл на лунку (2 мкг/мл) антитела к Ар 4G8, разведенного в D-ЗФР, в течение ночи при 4°С. Планшет запечатывали. Раствор для сенсибилизации удаляли и поверхность планшета блокировали, используя по 200 мкл на лунку не содержащего белка блокатора для ELISA фирмы PIERCE (без Твин -20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшет отмывали 6 раз TBS+0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. Применяемый в качестве стандарта пептид АррЕ3-40 и другие Ар-пептиды (2-40, 3-40, 4-40, 1-42, 3-42 и рЕ11-40) разводили с помощью не содержащего белка блокатора для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20) до концентрации 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 пг/мл. По 100 мкл каждой концентрации и 100 мкл буфера для разведения (контроль) вносили в планшет с помощью пипетки. Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью TBS + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку добавляли пипеткой по 100 мкл раствора конъюгата идентифицирующее антитело-фермент, который содержал 1 мкг/мл ApN3pE-специфического антитела (клон 6-1-6) и 2 мкг/мл конъюгата стрептавидин-HRP (фирма Sigma), входящего в набор, включающий не содержащий белка блокатор для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20). Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью TBS + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку вносили пипеткой 100 мкл раствора субстрата SureBlue (фирма KPL) и планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали, добавляя в лунку по 100 мкл 1 М H2SO4. Абсорбцию измеряли с помощью устройства TECAN Sunrise при 450 нм с поправкой на абсорбцию при 540 нм.
SPR.
Помимо изучения в отношении Ар различных видов оценивали также перекрестную реактивность с другим pGlu-пептидом, который встречается в организме человека. Это осуществляли с помощью резонанса поверхностного плазмона. На поверхности СМ5-чипа иммобилизовывали следующие пептиды или их N-концевые области: МСР1, МСР2, "большой" гастрин, гонадолиберин, нейротензин, орексин А, фибронектин, коллаген типа 1 и TRH. В качестве положительного контроля анализировали также связывание с АррЕ3-40. Антитело к N3pE (клоны 6-1-6 и 24-2-3) разводили в HBS-EP (фирма Biacore) до концентрации 25 мкг/мл. Связывание исследовали с помощью системы Biacore 3000 с использованием нескольких СМ5-чипов, на поверхности которых иммобилизовывали соответствующие пептиды (проточные ячейки 2, 3 и 4). Система работала прии скорости потока 20 мкл/мин. Оцененные основные эффекты и неспецифическое связывание с поверхностью чипа корректировали путем вычитания сигнала в проточных ячейках 2, 3 и 4, в которых иммобилизовывали тестируемый пептид, и сигнала в незагруженной проточной ячейке 1. Ассоциацию (9 мин) определяли путем инъекции 180 мкл антител клонов 6-1-6 и 242-3 соответственно. Диссоциацию определяли в течение 9 мин. Оставшиеся молекулы антитела удаляли путем инъекции 5 мкл 0,1 М HCl. Для каждого варианта взаимодействия антитела с различными пептидами оценивали ассоциацию и диссоциацию. Перекрестную реактивность определяли, оценивая фазу ассоциации с позиций скорости и концевого сигнала. Значения для всех pGlu-пептидов сравнивали с сигналом, характерным для АррЕ3-40.
1.10. Оптимизация и валидация N3pE-ELISA для анализа головного мозга.
Разработанный при создании настоящего изобретения метод анализа N3pE-ELISA можно применять для определения концентрации АррЕ3-42 в головном мозге трансгенных мышей. В целом определяли содержание АррЕ3-42 индивидуально в полушарии и мозговом стволе. Головной мозг мышей гомогенизировали в 500 млк 2%-ного раствора ДСН с ингибитором протеаз с помощью гомогенизатора типа Precelly (фирма Peqlab) с использованием керамических гранул. Суспензию гранул отбирали с помощью пипетки и переносили в центрифужную пробирку. Гранулы вновь отмывали с помощью 250 мкл 2%-ного раствора ДСН с ингибитором протеаз и раствор переносили в центрифужную пробирку. 750 мкг ДСН-суспензии головного мозга облучали ультразвуком на раскрошенном льду в течение 20 с. Образец центрифугировали в течение 1 ч при 4°С при 75000xg. Затем супернатант удаляли, разделяли на аликвоты и
хранили до осуществления ELISA при -80°С. Оставшийся нерастворенный в ДСН дебрис смешивали с 150 мкл 70%-ной муравьиной кислоты и облучали ультразвуком на раскрошенном льду в течение 20 с. Немедленно после обработки ультразвуком раствор нейтрализовали с помощью 2850 мкл 1 М Трис, что соответствует старому методу, или 2850 мкл EIA-буфера (ЗФР+10 мг/мл БСА + 0,05 % Твин-20) + 860 мкл 3,5 М Трис для нейтрализации, что соответствует новому методу. Фракции образцов, содержащие муравьиную кислоту, хранили до осуществления ELISA при -80°С. N3pE-ELISA осуществляли согласно следующему протоколу:
96-луночный планшет типа Maxisorb (фирма Nunc) сенсибилизировали иммобилизованным антителом путем инкубации, используя по 100 мкл на лунку (2 мкг/мл) антитела к Ар 4G8, разведенного в D-ЗФР, в течение ночи при 4°С. Планшет запечатывали. Раствор для сенсибилизации удаляли и поверхность планшета блокировали, используя по 200 мкл на лунку не содержащего белка блокатора для ELISA фирмы PIERCE (без Твин -20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшет отмывали 6 раз TBS+0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. Применяемый в качестве стандарта пептид АррЕ3-42 разводили с помощью не содержащего белка блокатора для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20) (старый метод) или EIA-буфера (новый метод) до концентрации 1029,2, 514,6, 257,3, 128,65, 64,32, 31,16, 16,08 пг/мл. По 100 мкл каждой концентрации и 100 мкл буфера для разведения (контроль) вносили в планшет с помощью пипетки. Образцы с ДСН подвергали оттаиванию, разводили в соотношении 1:25 и 1:100 соответственно с использованием не содержащего белка блокато-ра для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20) (старый метод) или EIA-буфера (новый метод) и вносили с помощью пипетки в планшет для ELISA. Образцы, содержащие муравьиную кислоту (старый метод: муравьиная кислота/Трис; новый метод: муравьиная кислота/EIA-буфер/Трис), подвергали оттаиванию и вносили с помощью пипетки в неразбавленном виде в планшет для ELISA. Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью TBS + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку добавляли пипеткой по 100 мкл раствора конъюгата идентифицирующее антитело-фермент, который содержал 1 мкг/мл ApPN3pE-специфического антитела (клон 6-1-6) и 2 мкг/мл конъюгата стрептавидин-HRP (фирма Sigma), входящего в набор, включающий не содержащий белка блокатор для ELISA фирмы PIERCE (с Твин-20). Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью TBS + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку вносили пипеткой 100 мкл раствора субстрата SureBlue (фирма KPL) и планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали, добавляя в лунку по 100 мкл 1 М H2SO4. Абсорбцию измеряли с помощью устройства TECAN Sunrise при 450 нм с поправкой на абсорбцию при 540 нм.
1.11. Применение клонов антител к N3pE для иммуногистохимии.
Фиксированные формалином и залитые в парафин срезы человеческого головного мозга (кора) обрабатывали следующим образом.
1. Удаление парафина и регидратация срезов (прикрепленных к предметным стеклам):
а) инкубируют предметные стекла в Histoclear (агент для очистки) или ксилоле в течение 3 мин,
б) удаляют очищающий раствор,
в) инкубируют предметные стекла вновь в Histoclear или ксилоле в течение 3 мин,
г) инкубируют предметные стекла в Histoclear или ксилоле в соотношении 1:1 с 100% этаноле в те-
чение 3 мин,
д) инкубируют предметные стекла в 100% этаноле в течение 3 мин, удаляют раствор,
е) инкубируют предметные стекла вновь в 100% этаноле в течение 3 мин,
ж) инкубируют предметные стекла в 95% этаноле в течение 3 мин,
з) инкубируют предметные стекла в 70% этаноле в течение 3 мин, и) инкубируют предметные стек-
ла в 50% этаноле в течение 3 мин,
к) инкубируют предметные стекла в дистиллированной воде в течение 3 мин.
2. "Гашение" эндогенной пероксидазной активности.
Инкубируют предметные стекла в 99 мл метанола + 1 мл 30% пероксида водорода в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Отмывают предметные стекла водой: 2х 5 мин.
4. Удаляют воду в индивидуальных предметных стеклах и помещают предметные стекла на подставку для предметных стекол в увлажняющей камере для предупреждения высыхания срезов. Наносят на срез 88%-ный раствор муравьиной кислоты при комнатной температуре в течение 10 мин в вытяжном шкафу. Смывают несколько раз водой и дают стряхнуться воде в заполненной водой чашке для окрашивания в течение 10 мин.
5. Блокируют в 10%-ном растворе лошадиной сыворотки в течение 20 мин при комнатной температуре.
6. Стряхивают (или отсасывают) блокирующий раствор и обрабатывают первичным антителом (антитело к N3pE, клон 6 или 24) в течение ночи при 4°С.
3.
7. Отмывают предметные стекла по отдельности TBS в течение 10 мин для того, чтобы избежать трения предметных стекол друг о друга.
8. Добавляют биотинилированное вторичное антитело (козье антимышиное антитело фирмы Vector Laboratories): 9 мл TBS, 1 мл козьей сыворотки, 45 мкл вторичного антитела). Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
9. Отмывают предметные стекла по отдельности в TBS в течение 10 мин для того, чтобы избежать трения предметных стекол друг о друга.
10. Добавляют ABC-раствор (10 мл TBS, 100 мкл лошадиной сыворотки, 90 мкл компонента А, 90 мкл компонента В). Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
11. Отмывают предметные стекла 50 мМ Трис: 2x10 мин.
12. Цветная реакция: инкубируют среды с раствором ДАБ (диаминобензидин) (20 мг ДАБ фирмы Sigma в 100 мл 50 мМ Трис, фильтруют и добавляют 33 мкл 33% пероксида водорода). Для выявления цветной реакции применяют микроскоп. Продукт реакции имеет коричневый цвет. Прекращают реакцию, помещая предметные стекла в чашки для окрашивания, содержащие воду.
13. Отмывают предметные стекла водой в течение 10 мин.
14. Осуществляют контрастное окрашивание гематоксилином, отмывают водой.
15. Дегидратация и очистка: осуществляют стадию 1 в обратном порядке (например, вода, этанолы различной крепости вплоть до 100%, Histoclear).
16. Покрывают пермаунтом (фирма Fisher Scientific). Сушат предметные стекла на воздухе. Чистят предметные стекла бритвенным лезвием и этанолом.
2. Результаты.
2.1. Получение антител.
Выделяли 6 клонов, которые стабильно продуцируют антитела к пептиду pGlu-6166-БСА; клоны 18-12, 5-5-6, 6-1-6, 12-1-8, 17-4-3 и 24-2-3. Эти клоны подвергали дополнительной характеризации.
2.2. Определение требуемой концентрации антител.
Интенсивность сигналов в анализах ELISA коррелирует не только с концентрацией анализируемого соединения/Ар-варианта, но также в значительной степени зависит от концентрации применяемого антитела. Поскольку Ар-варианты присутствуют в образцах сыворотки лишь в низких концентрациях, необходимо определять концентрации антител, которые могут выявлять низкие концентрации соответствующих вариантов Ар. Поступающие в продажу наборы для Ap-ELISA характеризуются конкретным пределом обнаружения Ар в диапазоне пикограммовых концентраций. На стандартных кривых наиболее высокая концентрация, как правило, составляет 500 пг/мл. Общая информация, касающаяся концентрации применяемого антитела, как правило, отсутствует в сводках данных/инструкциях по применению, однако исходя из дополнительной информации, которую можно почерпнуть из обычной литературы, можно предположить, что антитело применяют в концентрации 1 мкг/мл.
В первых сериях экспериментов не удалось выявить Ар N3pE-40 в концентрации 500 пг/мл с помощью соответствующего антитела к pGlu-6166 (клон 12-1), конъюгированного с биотином. Фактически требовались относительно высокие концентрации Ар N3pE (10 нг/мл) для получения сигнала при применении антитела в концентрации 1 мкг/мл (см. фиг. 1А: средний столбик). Интенсивность этого сигнала резко возрастала при повышении концентрации антитела до 10 мкг/мл (см. фиг. 1А: левый столбик). При применении антитела в концентрации вплоть до 20 мкг/мл интенсивность сигнала можно было дополнительно повышать (см. фиг. 1Б). При концентрации, превышающей указанную концентрацию, не удалось дополнительно увеличить интенсивность сигнала. Таким образом, антитело в концентрации 20 мкг/мл использовали для определения предела обнаружения для антитела к pGlu-6166.
2.3. Анализ методом дот-блоттинга.
Ар ШрЕ-х-специфическое антитело к pGlu-6166 выбирали с помощью процесса скрининга, поскольку исходный клеточный клон (обозначенный как 12-1-8) характеризовался сильным связыванием с пептидом, применяемым для иммунизации, и очень низкой перекрестной реактивностью (см. табл. 2).
Таблица 2
Результаты скрининга, демонстрирующие уровень сигналов при ELISA-анализах, которые были обнаружены в супернатантах нескольких клеточных клонов гибридом
Клон
ШрЕ-БСА
HJODAE-БСА
N3E-BCA
NllE-БСА
N11рЕ-БСА
1-8-12
1,787
0,012
0,142
0,011
0,005
5-5-6
1,649
0,015
0,126
0,004
0,006
6-1-6
1,377
0,013
0,125
0,007
0,014
12-1-8
2,123
0,005
0,009
0,001
0,005
17-4-3
1,915
0,007
0,320
0,003
0,004
24-2-3
1,768
0,014
0,218
0,003
0,002
Положительный контроль
1,824
1,227
1,596
1,243
1,346
Отрицательный контроль
0,045
0,005
0,008
0,001
0,003
До настоящего времени в исследование не включали стадию скрининга с использованием полноразмерного нативного пептида Ар N3pE-40. Поэтому подвергали скринингу пул доступных клеточных клонов гибридом pGlu6166, экспрессирующих антитела, которые могли обладать более высокой аффинностью к нативному пептиду Ар N3pE-40.
Как видно из фиг. 2, удалось идентифицировать клеточные клоны, которые действительно обладали более высокой чувствительностью к полноразмерному пептиду Ар N3pE-40. В то время как антитело к pGlu-6166 (клон 12-1) могло обнаруживать только 1 мкг пептида, клоны 6-1-6 и 24-2-3 давали также сигналы при использовании пептида в количестве, составляющем всего лишь 8 нг. Следовательно клоны 61-6 и 24-2-3 оказались в 125 более чувствительными. При использовании этих клонов может оказаться возможным достигать предела обнаружения, составляющего 8 пг/мл пептида Ар N3pE-40 при применении соответствующего ELISA.
2.4. PepSpot-анализ.
Затем специфичность оценивали с помощью PepSpot-анализа с целью сравнения биоитинилирован-ных Ар ШрЕ-х-специфических антител к pGlu-6166 с клеточными клонами гибридом. В табл. 3 перечислены все пептиды, которым соответствовали пятна на PepSpot-мембране. Как видно из фиг. 3, клоны 6-1-6 и 24-2-3 антитела к pGlu-6166 не индуцировали более значительного перекрестного сигнала, чем клон 12-1 антитела к pGlu-6166. Все изученные клоны распознавали в наибольшей степени пятно № 6 -пятно, специфическое для Ар N3pE-x (pEFRHD т.е. SEQ ID NO: 12), далее в порядке снижения интенсивности сигнала следовали пятна № 5 (EFRHD ... SEQ ID NO: 11) и № 7 (FRHD SEQ ID NO: 13). Слабый сигнал обнаружен также для пятна № 4 (AEFRHD SEQ ID NO: 10).
Таблица 3
Последовательности Ар-пептидов, нанесенные в виде пятен на PepSpot(tm)-мембраны (фирма JPT Peptide Technologies GmbH), и выявляемые клеточными клонами гибридом pGlu-6166
Биологическую целостность антитела к Aр-N3pE и супернатантов клеточных культур гибридом грубо определяли с помощью анализа методом ДСН-ПААГ (более подробно см. в разделе "Материл и методы", выше).
Как видно из фиг. 4, все внесенные в гель образцы характеризовались отчетливыми полосами без пятен, что свидетельствует о целостности антитела к pGlu-6166 (клон 12-1) и супернатантов клеточных клонов гибридом.
2.6. BIACORE-анализ.
С помощью анализа метолом дот-блоттинга обнаружены существенные различия в чувствительности в отношении пептида Ар N3pE-40 супернатантов клеточных клонов гибридом по сравнению с био-тинилированным антителом к pGlu-6166. Однако с помощью указанного метода оценивали только ко
нечный результат. С другой стороны, Biacore-анализ позволяет осуществлять в зависимости от времени мониторинг связывания данного антитела. Для того, чтобы определить, является ли слабое связывания антитела к pGlu-6166 (клона 12-1) результатом низкой ассоциации с пептидом Ар N3pE-40, осуществляли Biacore-анализ, описанный выше в разделе "Материл и методы".
Мониторинг процесса связывания антитела к pGlu-6166 при его применении в возрастающих концентрациях позволил рассчитать значение KD, составляющее 30 нМ. Сравнение супернатанта клеточного клона гибридомы 12-1 с супернатантом клеточного клона гибридомы 6-1-6 продемонстрировало значительные различия в характеристиках связывания. Ассоциация клона 6-1-6 оказалась примерно в 5 раз выше по сравнению с уровнем, обнаруженным для клона 12-1. Однако более значительные различия обнаружены в характеристиках диссоциации. В то время как для клона 6-1-6 характерно затрудненное отделение посредством диссоциации от пептида Ар N3pE-40, клон 12-1 легко отмывался в течение нескольких минут. Таким образом, слабое связывание клона 12-1 с большой вероятностью является результатом обнаруженной "офф-скорости" (скорость диссоциации). Это предположение дополнительно подтверждено данными, полученными для клона 24-3-2, для которого получены наиболее предпочтительные результаты при анализе методом дот-блоттинга, демонстрирующие очень слабую ассоциацию с пептидом Ар N3pE-40, но в отличие от клона 12-1, выявлено отсутствие заметной скорости диссоциации (см. фиг. 5).
2.6.1. Аффинность Ар ШрЕ-специфического антитела клона 6-1-6 и клона 24-2-3.
Для клона 6-1-6 антитела к N3pE рассчитывали скорость ассоциации, скорость диссоциации и константу диссоциации путем глобального подбора всех сенсограмм, представленных на фиг. 6.
Установлено, что значение скорости ассоциации составляет 1,67х105 М-1-с-1, скорость диссоциации составляет 2,63х 10-4 с-1, константа диссоциации составляет 1,57 нМ.
Для клона 24-2-3 антитела к N3pE значения скорости ассоциации, скорости диссоциации и константы диссоциации, рассчитанные путем глобального подбора всех сенсограмм, представлены на фиг. 7.
Установлено, что значение скорости ассоциации составляет 3,25х103 М-1-с-1, скорость диссоциации составляет 3,29х 10-4 с-1, константа диссоциации составляет 101 нМ.
2.7. Секвенирование вариабельных областей антител.
Идентифицированы следующие последовательности.
2.7.1. Клон 5-5-6.
Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 49) ATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAACGGT
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT
ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGGAAAAACCTATTTGAATTGG
TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAATGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC
TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC
AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCA
TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA
TCCATCTTCCCACCAT
Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 50)
MVSSAQFLFLLVLWIQETNGDVVMTQTPLTLSVT1GQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNW
LLQRPGQSPMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLK1SRVEAEDLGVYYCVQGTHFP
FTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPP Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 51)
ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGG A ACTGCAGGTGTCCACTCTGAG GTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCC TGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTATACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCAT GGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAGTGGTGTTACTAGGTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTAATTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATG G AGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGG ACTCTGCAGTCTATTATTGTACA AGAGAGGCTA AA CGGGAGTGGGACGAG ACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA ACGACACCCCCATCTGTCTA
Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 52)
MGWSGVFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSH GKNLEWIGL1NPYSGVTRYNQKFKGKATLIVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAK
REWDETYWGQGTLVTVSAAKTTPPSV
2.7.2. Клон 6-1-6.
Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 53)
ATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTOTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAACGGT GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCA1TGGACAACCAGCCTCT ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGACGGAAAAACCTATTTGAATTOO TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAATGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCA TTCACG7TCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATCCAG Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 54)
MVSTAQFLFLLVLWIQETNGDVVMTQTPLTLSVTtGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNW
LLQRPGQSPMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLK1SRVEAEDLGVYYCVQGTHFP
FTFGSGTKLE1KRADAAPTVS1FPPS
Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 55) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTATCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGT
CCAGCTGCAACACTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCA
AGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAG
AACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGTTACTAGGTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCAAGGCCACATTAATTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTC
AGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGAGAGGCTAAACGGGAGTGGG
ACGAGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCC
ATCTGTCTATCCACTG Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEO ID NO: 56)
MGWSGVF1FLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASMK1SCKASGYSFTGYTMNWVKQSH
GKNLEWIGLiNPYNGVTRYNQKFKGKATLIVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAK REWDETYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPL 2.7.3. Клон 17-4-3.
Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 57) ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGGTGTTCTGGATTCCTGTTTCCAGCAGTGATGTT
GTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC
AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAA
GCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAG
ACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGC
TGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAG
GCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCC
AGT
Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 58)
MKLPVRLLVLVFWIPVSSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSDGNTYLHWY
LQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPP TFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS
Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 59) ATGGACTTTGGGCTCAGCTTACTTATTTTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAG GTG AAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGАААСТСТСС TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTACGGAATGGCGTGGGTTCGACAGGCTCCA GGGAAGGGGCCTGAGTGGGTAGCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCTACTATGCA GACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTG GAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTACTACTGTGCAAGGTATGACTAC GATAATATCTTGGACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCC
TCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTG Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 60)
MDFGLSLL1FVLILKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAP GKGPEWVAFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARYDY
DNILDYVMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPL 2.7.4. Клон 24-2-3.
Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 61) ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTCTGGATTCAGG AAACCAAGGGTGATGTTGTGCT
GACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAAGTC AAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTGAATTGGTTATTACAGAGGCCAG GCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATGTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGG TTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGG ATTTGGGAGTTTATTATTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA AAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 62)
MKLPVRLLVLWIQETKGDVVLTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLM WLLQ
RPGQSPKRLIYVVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPFTF
GSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS
Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 63) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGAAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTG
CAGCAGTCTGOGGCTGAGCTGOTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTA
TATATTCAATAACTACTGGATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGTCAGGGTCTTGAGTGGATTGGAC
AG ATI TATCCTGG AGATGGTGATACTAACTACAATGGGAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGC A
GACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTT
CTGTGCAAGAGAGGGATATATTGTTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAA
CGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG
Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 64)
MGWSGVFLFLLSVTEGVHSQVQLQQSGAELVRPGSSVK1SCKASGY1PNNYW1NWVKQRP
GQGLEWIGQ1YPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGY
IVYWGQGTLVTVSAAKTTPPS VYPL
2.8. Применение клона 6-1-6 антитела для осуществления N3pE-ELISA.
Оценивали конечный протокол N3pE-ELISA в отношении предела количественного определения (LOQ) и отношение сигнала к шуму (S/N). Стандартная кривая для ELISA представлена на фиг. 8.
Форма стандартной кривой очень хорошо соответствует экспериментальным точкам прежде всего в диапазоне низких концентраций и свидетельствует о практически линейной зависимости абсорбции. На основе этой стандартной кривой установлено, что LOQ составляет 3,125 пг/мл при этом S/N = 1,3.
2.9. Исследование перекрестной реактивности с помощью анализов ELISA и SPR.
ELISA.
Перекрестную реактивность с другими вариантами Ар определяли с помощью разработанного при создании изобретения N3pE-ELISA. Необработанные данные представлены в табл. 4.
Таблица 4
Зависимость абсорбции от концентрации была обнаружена только для АррЕ3-40. Для всех изученных вариантов Ар за исключением Ар3-40 обнаружена перекрестная реактивность ниже 1%. Сигнал (скорректированный относительно контроля), полученный для концентрации 800 пг/мл, составлял примерно 2,7% от сигнала, характерного для АррЕ3-40. Это является очень хорошим результатом с учетом того, что N-конец обоих пептидов имеет одинаковые аминокислоты за исключением первой аминокислоты, она является циклизованной в случае АррЕ3-40. В целом установлено, что Ар N3pE-специфическое антитело (клон 6), которое создавали для применения в ELISA, обладает очень высокой специфичностью
в отношении N-конца Ар-пептидов, начинающегося с pGlu в положении 3.
SPR.
Перекрестную реактивность клонов 6-1-6 и 24-2-3 с другими не-Ар pGlu-пептидами анализировали с помощью резонанса поверхностного плазмона. Вместо АррЕ3-40, для которого обнаружена типичная сенсограмма связывания, для всех изученных пептидов pGlu не было обнаружено практически никакого взаимодействия с клонами 6-1-6 и 24-2-3 соответственно (см. также фиг. 9 (представлены данные только для клона 6-1-6). Сенсограммы для пептидов pGlu сравнивали с сенсограммой для АррЕ3-40. Установленная перекрестная реактивность во всех случаях составляли менее 1%. Обобщенные данные для всех проанализированных пептидов представлены в табл. 5.
Таблица 5
Установленная перекрестная реактивность клонов 6-1-6 и 24-2-3 с другими пептидами pGlu
Пептиды pGlu
перекрестная реактивность (%)
МСР-1
<1
МСР-2
<1
"Большой гастрин"
<1
гонадолиберин
<1
нейротензин
<1
орексин А
<1
фибронектин
<1
коллаген 1
<1
TRH
<1
Все эксперименты подтвердили тот факт, что клоны 6-1-6 и 24-2-3 антитела к N3pE являются специфическими в отношении N-концевого эпитопа АррЕ3-х. Ими не распознавались ни другие pGlu-N-концы, ни другие варианты Ар-пептида, которые не несли на N-конце остаток рЕ.
2.10. Оптимизация и валидация N3pE-ELlSA для анализа головного мозга.
Анализировали концентрацию АррЕ3-42 в мозговом стволе мышей в зависимости от применяемого метода. Образцы получали из организма трансгенных мышей (tg), у которых в головном мозге происходит сверхэкспрессия человеческого APQ3-42, который циклизуется с помощью QC с образованием АррЕ3-42. Осуществляли сравнение образцов из гетерозиготных трансгенных мышей (tg het) и гомозиготных трансгенных мышей (tg hom) и из нетрансгенных мышей дикого типа (wt). Для получения образцов использовали мышей, которых создавали согласно методу, описанному в WO 2009034158.
Во всех дополнительных экспериментах образцы и стандарты разводили в EIA-буфере. На следующей стадии оптимизировали метод нейтрализации для анализа фракции образцов в муравьиной кислоте, т.е. нейтрализацию осуществляли согласно N3pE-ELISA. Разработанный при создании настоящего изобретения метод N3pE-ELISA давал хорошие результаты, он позволял выявлять значительные уровни человеческого АррЕ3-42 в головном мозге мышей линии tg hom, существенно более низкие уровни человеческого АррЕ3-42 в головном мозге мышей линии tg het и отсутствие человеческого АррЕ3-42 в головном мозге wt-мышей (см. фиг. 10).
При осуществлении ELISA, предлагаемого в настоящем изобретении, получают сигналы высокого уровня и в результате очень хорошее значение LOQ, и поэтому этот метод можно применять для анализа образцов, находящихся в муравьиной кислоте, прежде всего образцов головного мозга, находящихся в муравьиной кислоте.
2.11. Применение клонов антител к N3pE для иммуногистохимии.
С помощью антител к N3pE, предлагаемых в настоящем изобретении, окрашивали АррЕ3-хв срезах головного мозга пациентов, страдающих поздней стадией спорадической болезни Альцгеймера (SAD) и семейными деменциями альцгеймеровского типа (FAD), т.е. пациентов, которые имели мутацию в гене пресенилина 1 (PS1). Окрашенные срезы головного мозга представлены на фиг. 11. Из фиг. 11 видно, что антитела к N3pE, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для иммуногистохимии. Антитела специфически идентифицируют pGIu-Aр в головном мозге страдающих SAD и FAD пациентов. Для антител к N3pE не обнаружены фоновые сигналы на изображениях, что свидетельствует о специфическом связывании, что продемонстрировано с помощью анализов ELISA и SPR.
Депонирование.
Создавали моноклональные антитела, специфически распознающие Ар N3pE-x. В настоящее время все клеточные линии гибридомы 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3 и 24-2-3, экспрессирующие моноклональные антитела, депонированы согласно Будапештскому договору и находятся в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), Брауншвейг, Германия, дата депонирования 17 июля 2008 г., под соответствующими регистрационными номерами
(клон 5-5-6) : DSM АСС2923 (клон 6-1-6) : DSM АСС2924 (клон 17-4-3) : DSM АСС2925
(клон 24-2-3) : DSM АСС2926.
Можно подтверждать специфичность указанных антител в отношении соответствующих им последовательностей-мишеней. Для Ар N3pE-x идентифицированы обладающие высокой аффинностью клоны антител, которые дают сильные сигналы при осуществлении ELISA с ожидаемым уровнем обнаружения в диапазоне низких пикограммовых концентраций.
Заключение.
Основной задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и робаст-ного способа, который позволяет осуществлять количественное определение вариантов Ар в биологических образцах.
Предпочтительно предложен способ на основе ELISA. Решение задачи начинали с применения Ар N3pE-ELISA, поскольку система ELISA для этого варианта Ар уже поступает в продажу (фирма IBL). Эту систему применяли в качестве эталона и внутреннего контроля качества.
Исследовали применимость антитела к pGlu-6166 для осуществления выбранного анализа ELISA. Для получения четко измеряемых сигналов необходимо применять антитела в высоких концентрациях (20 мкг/мл). Удалось идентифицировать клоны антител, обладающих высокой аффинностью к Ар N3pE-x. При использовании этих клонов может быть достигнут предел обнаружения, расположенный в диапазоне низких пикограммовых концентраций (3-8 пг/мл).
Leu 145
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1) . . (1)
<223> Пирролидонкарбоновая кислота
<400> 65
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Cys 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, отличающееся тем, что связывается с Ар-пептидами, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 49, 53, 57 и 61, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 50, 54, 58 и 62, и вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 51, 55, 59 и 63, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 52, 56, 60 и 64.
2. Антитело по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
3. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 49, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 51, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52.
4. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 55, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56.
5. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 57, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 59, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60.
6. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64.
7. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело выбрано из следующей группы:
Ар 5-5-6 (DSM АСС 2923),
Ар 6-1-6 (DSM АСС 2924),
Ар 17-4-3 (DSM АСС 2925), и
Ар 24-2-3 (DSM АСС 2926).
8. Антитело по п.7, где антитело представляет собой Ар 6-1-6 (DSM АСС 2924).
9. Антитело по п.7, где антитело представляет собой Ар 24-2-3 (DSM АСС 2926).
10. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело.
11. Антитело по одному из ггоедыдущих пунктов, где антитело является человеческим.
12. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое представляет собой димерное антитело или одноцепочечное антитело.
13. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое связывается с Ар-пептидами.
14. Антитело по п.13, где указанные Ар-пептиды выбраны из следующей группы: pGlu-AP3-38,
рОш-Ар3_40, pGlu-Ар^ и pGlu^-x,
где х обозначает целое число от 10 до 42.
15. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое является меченым.
16. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое иммобилизовано на твердой фазе.
17. Антитело по пп.7-16, которое можно получать из любой клеточной линии гибридом DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925, DSM АСС 2926.
18. Композиция для лечения, предупреждения или замедления развития амилоидоза, содержащая антитело по одному из предыдущих пунктов в терапевтически эффективном количестве и по крайней мере один терапевтически приемлемый разбавитель или носитель.
19. Композиция по п.18, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из легкого когнитивного нарушения, болезни Альцгеймера и нейродеге-нерации при синдроме Дауна.
20. Композиция по п.19, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.
21. Композиция по п.20, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.
22. Клеточная линия гибридомы, которая предназначена для продуцирования антитела по любому из пп.1-17, где указанная клеточная линия гибридомы выбрана из DSM АСС 2923, DSM АСС 2924, DSM АСС 2925 и DSM АСС 2926.
23. Применение антитела по одному из пп.1-17 в способе диагностики амилоид-ассоциированного заболевания или состояния.
24. Применение антитела по любому из пп.1-17 в терапевтическом способе лечения амилоид-ассоциированного заболевания или состояния.
25. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является нейродегенеративным заболеванием, выбранным из группы, включающей умеренное когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейро-дегенерацию, связанную с синдромом Дауна.
26. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является спорадической формой болезни Альц-геймера или семейной деменцией альцгеймеровского типа.
27. Применение по п.26, где указанная семейная деменция альцгеймеровского типа является семейной британской деменцией или семейной датской деменцией.
28. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из умеренного когнитивного нарушения, болезни Альцгейме-ра и нейродегенерации, связанной с синдромом Дауна.
29. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.
30. Применение по п.29, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.
31. Применение антитела по одному из пп.1-17 для выявления Ар-пептидов.
32. Применение по п.31, где указанные Ар-пептиды выбраны из следующей группы:
pGlu-APз-з8,
pGlu-APз-40, pGlu-Ар^ и pGlu-APз-x,
где х обозначает целое число от 10 до 42.
33. Способ диагностики in vitro ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, вклю-
чающий определение в образце иммунологического связывания антитела по любому из пп.1-17 с pGlu-
Aр пептидом, которое включает следующие этапы:
(а) приведение в контакт антитела с образцом, который, как предполагается, содержит амилоидный
пептид;
(б) обеспечение возможности антителу связаться с pGlu-Aр пептид с образованием иммунологиче-
ского комплекса;
(в) выявление формирования иммунологического комплекса; и
(г) корреляция присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или от-
сутствием pGlu-Ap пептида в образце,
где наличие pGlu-Ap пептида в образце является положительным индикатором амилоид-ассоциированного заболевания или состояния.
Фиг. 2 - 58 -
34. Набор для диагностики ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, содержащий антитело по одному из пп.1-17, реагенты в предварительно определенных количествах и инструкции по применению.
клон pGlu6166
клон 1-8-12
клон 5-5-6
клон 6-1-6
1 ООО нг
200 нг
40 нг
8 нг
К. J
"*• *•
клон 12-1-8
клон 12-1
клон 17-4-3
клон 24-2-3
время (с)
N3pE-ELISA: стандартная кривая 0-200 пг/мл
Т 1 ! ¦ 1 ' 1 ' 1-
О 50 100 150 200
А(ЗрЕЗ (пг/мл)
Фиг. 8
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028427
028427
- 1 -
- 1 -
(19)
028427
028427
- 1 -
- 1 -
(19)
028427
028427
- 4 -
- 3 -
(19)
028427
028427
- 26 -
- 26 -
028427
028427
- 57 -
028427
028427
- 59 -
028427
028427
- 60 -
- 60 -
|
