EA 028422B1 20171130

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000028422b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение формулы (I) где R ¹ , R ² , R ³ и R ⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из C _1-4 алкокси, C _1-4 алкилкарбонилокси, бензилокси, фенилкарбонилокси, трифторметила, галогена и водорода; R ⁵ выбран из группы, состоящей из галогена, нитрила, C _1-4 алкокси, C _1-4 алкилтио, C _1-4 алкила, фенила и трифторметила; R ⁶ выбран из группы, состоящей из водорода и фтора; или его фармацевтически приемлемая соль, энантиомеры и диастереоизомеры.

2. Соединение по п.1, где R ² и R ⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, трифторметила и C _1-4 алкокси.

3. Соединение по п.2, где R ² выбран из группы, состоящей из водорода и метокси, и R ⁴ выбран из группы, состоящей из фтора, трифторметила и метокси.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где R ³ представляет собой бензилокси.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где R ⁵ представляет собой фтор.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где R ⁶ представляет собой водород или фтор.

7. Соединение по п.1, где указанное соединение выбрано из следующих соединений: (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метоксипирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фенилпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метилпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-цианопирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трифторметил)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трет-бутокси)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-ацетоксипирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(4-ацетокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(4-бензоилокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(3,4-дибензилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(3,4-дибензоилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(3-ацетокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((2S)-1-(3-пивалоилокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((S)-1-(4-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((S)-1-(3-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((S)-1-(2-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((S)-1-(4-(бензилокси)-3-(трифторметил)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; (S)-1-((S)-1-(4-(бензилокси)-3-фторбензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил; или его фармацевтически приемлемая соль, энантиомеры и диастереоизомеры.

8. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли, энантиомеров и диастереоизомеров, который включает a) взаимодействие соединения формулы (IX) где R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ и R ⁶ определены выше в формуле (I), с соединением формулы (XI) с получением соединения формулы (XII) где полимер в соединениях формул (XI) и (XII) представляет собой низший сшитый полистирол и полиэтиленгликоль - привитый полистирол; b) гидролиз соединения формулы (XII) с получением соединения формулы (XIV) и c) превращение карбоксамидной группы соединения формулы (XIV) в нитрильную группу в подходящих условиях с получением соединения формулы (I); где стадии b) и c) могут осуществляться раздельно или в одном реакторе.

9. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли, энантиомеров и диастереоизомеров, который включает взаимодействие соединения формулы (IX) где R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ и R ⁶ определены выше в формуле (I), с соединением формулы (IV)

10. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения и/или профилактики когнитивного расстройства, содержащая по меньшей мере одно соединение формулы (I) по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемую соль, энантиомеры и диастереоизомеры и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель.

11. Применение соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 для лечения и/или профилактики когнитивного расстройства.

12. Применение по п.11, где когнитивное расстройство представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.

13. Способ лечения или профилактики когнитивных расстройств у млекопитающего, где терапевтическое количество соединения по любому из пп.1-7 вводится пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

14. Способ по п.13, где когнитивное расстройство, представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.

15. Применение соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики когнитивного расстройства.

16. Применение по п.15, где когнитивное расстройство представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

4. Соединение по любому из пп.1-3, где R ³ представляет собой бензилокси.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где R ⁵ представляет собой фтор.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где R ⁶ представляет собой водород или фтор.

Евразийское 028422 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201590942
(22) Дата подачи заявки
2013.11.11
(51) Int. Cl.
C07D 403/06 (2006.01) A61K 31/401 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01)
(54) ПРОИЗВОДНЫЕ 1-[1-(БЕНЗОИЛ)ПИРРОЛИДИН-2-КАРБОНИЛ]ПИРРОЛИДИН-2-КАРБОНИТРИЛА
(31) 12382446.8
(32) 2012.11.12
(33) EP
(43) 2015.10.30
(86) PCT/EP2013/073460
(87) WO 2014/072498 2014.05.15
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
УНИВЕРСИТАТ ДЕ БАРСЕЛОНА; ФУНДАСИО ИНСТИТУТ ДЕ РЕСЕРКА БИОМЕДИКА (ИРБ БАРСЕЛОНА); ИПРОТЕОС С.Л (ES)
(72) Изобретатель:
Хиральд Льедо Эрнест, Тарраго Клуа Тереса, Прадес Косано Рохер, Ройо Грасия Соледад (ES)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-03004468
WO-A2-2004060862
(57) Изобретение относится к производным 1-[1-(бензоил)пирролидин-2-карбонил]пирролидин-2-карбонитрила формулы (I), обладающим фармакологической активностью, к способам получения таких соединений, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, и к их применению в терапии и/или в профилактике когнитивного расстройства
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к соединениям, обладающим фармакологической активностью, точнее к некоторым производным 1-[1-(бензоил)пирролидин-2-карбонил]пирролидин-2-карбонитрила, к способам получения указанных соединений, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, и к их применению в терапии и/или профилактике когнитивных расстройств.
Предпосылки создания изобретения
Пролилолигопептидаза (EC 3.4.21 0,26) (POP), также известная как пролилэндопептидаза (PREP), является сериновой протеазой, которая катализирует гидролиз пептидов на С-концевой стороне остатков L-пролина. Она широко распространена в организмах млекопитающих и может быть выделена из различных органов, в том числе из головного мозга.
Данный фермент играет важную роль в расщеплении пролинсодержащих нейропептидов, связанных с функциями обучения и памяти (Wilk S. et al., Life Sci. 1983;33:2149-57; O'Leary R.M., O'Connor В., J. Neurochem. 1995;65:953-63).
Эффекты ингибирования пролилолигопептидазы были испытаны при лечении нарушений познавательной способности, связанных с нейродегенеративными процессами. Болезнь Паркинсона вызывали у обезьян обработкой 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (МРТР), который представляет собой нейротоксин, вызывающий истощение вещества P. Последующая обработка S-17092 мощным ингибитором POP приводила к улучшению выполнения когнитивных задач (Schneider J.S. et al., Neuropsychophar-macology 2002;26(2): 176-82). Кроме того, было обнаружено, что ингибирование POP предотвращает олигомеризацию а-синуклеина в условиях ex vivo [Myohanen Т.Т. et al., Br.J. Pharmacol. 2012;166(3):1097-113]. В случае болезни Альцгеймера (AD) несколько экспериментов в условиях in vivo на животных моделях показали, что ингибирование POP приводит к нейропротективному эффекту и эффекту улучшения когнитивной функции (Kato A. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther 1997; 283 (1): 328-35; Toide K. et al., Rev. Neurosci. 1998; 9(1):17-29). Нейропротективные эффекты впервые наблюдались группой Katsube, когда в корковых и церебеллярных гепариноцитах был предотвращен возрастной апоптоз в результате обработки POP ингибитором ONO-1603 (Katsube N. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999;288(1):6-
13).
Клинические испытания ингибиторов POP в лечении нарушений познавательной способности проводились только в нескольких случаях. В фазе I клинических исследований, проводимых группой Мо-раина (Morain P. et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 2000;50(4):350-9), было установлено, что S17092, новый активный ингибитор пролилэндопептидазы для перорального введения, улучшает когнитивную функцию у здоровых пожилых людей и показывает четкую зависимость активности от дозы; кроме того, не было обнаружено никаких побочных эффектов. Более поздние исследования позволили сделать предположение о дополнительных слабых свойствах этого соединения в стабилизации настроения (Morain P. et al.,
Neuropsychobiology 2007;55(3-4):176-83).
Сообщалось, что активность пролилолигопептидазы изменялась (посмертно) при некоторых нейро-дегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона, болезнь Ха-тингтона и рассеянный склероз (MS) (Mantle D. et al., Clin. Chim. Acta 1996;249 (1-2):129-39).
Существует также множество доказательств, указывающих на роль нейровоспаления в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, MS и болезнь Паркинсона (Hirsch E.C. et al., Lancet Neurol. 2009;8(4):382-97, Philips Т. et al., Lancet Neurol. 2011;10(3):253-63). Считалось, что POP является основным ферментом, задействованным в высвобождении противовоспалительного тетрапептида Ac-SDKP из ТР4 в головном мозге (Yang F. et al., Hypertension 2004;43 (2):229-36, Nolte W.M. et al., Biochemistry 2009;48(50):11971-81). Это говорит о том, что ингибирование POP может способствовать снижению нейровоспаления, и, следовательно, ингибиторы POP могут применяться в лечении нейродегенератив-ных заболеваний с воспалительным компонентом, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсо-на, и в частности, способствовать облегчению когнитивных расстройств, связанных с этими заболеваниями.
Сенильные бляшки, распространенные в области коры головного мозга, являются типичными ней-ропатологическими признаками AD. Основным белковым компонентом этих бляшек является амилоидный р-пептид (AP). Отложение Ap вызывает дисфункцию и гибель нейронов в головном мозге. Этот пептид происходит из р-амилоидного белка-предшественника (APP). В нормальных условиях APP расщепляется а-секретазой для генерирования растворимого APPa, который препятствует образованию Ap.
Интересно, что ингибирование POP повышает уровни содержания внутриклеточного IP3, который может способствовать стимулированию продуцирования APPa, что, в свою очередь, снижает выработку
Ap.
Кроме того, были обнаружены (Rossner S. et al., Neurochem. Res. 2005;30(6-7):695-702) менее POP иммунореактивные нейроны в структурах головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, страдающих наличием Ap бляшек.
Далее, оказывается, что вещество P может подавлять нейротоксическое действие р-амилоидного белка (Kowall N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991;88(16)7247-51). Ингибиторы пролилолигопеп
тидазы ингибируют метаболизм вещества P, способствуя поддерживанию уровней содержания вещества P, которое может подавлять нейротоксическое действие р-амилоидного белка.
Исходя из описанных выше эффектов считается, что ингибиторы пролилолигопептидазы могут применяться в качестве лекарственных средства для лечения болезни Альцгеймера, способствуя облегчению когнитивных расстройств, связанных с данным заболеванием.
Пролилолигопептидаза также была ассоциирована с несколькими факторами, которые могут иметь отношение к рассеянному склерозу (MS). Например, POP задействована в регуляции микроглиальной токсичности (Klegeris A. et al., Glia 2008;56(6):675-85). В самом деле в последней публикации установлена прямая связь между POP и MS; активности POP в плазме пациентов с RR-MS были значительно снижены (Tenorio-Laranga J. et al., J. Neuroinflammation 2010; 7:23). Интересно, что указанное снижение коррелирует с тяжестью симптомов заболевания, а не с возрастом пациента. Вместо этого у здоровых людей наблюдалась обратная корреляция между POP активностью и возрастом пациента, а у пожилых контрольных пациентов уровни активности были сопоставимы с уровнями активности у пациентов с MS.
Нейропатологическим признаком болезни Паркинсона является прогрессирующая дегенерация ме-ланизированных дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции вместе с внутриклеточными включениями, известными как тельца Леви. Основным компонентом телец Леви является 140 аминокислотный белок а-синуклеин. При определенных условиях а-синуклеиновые мономеры взаимодействуют с образованием префибриллярных агрегатов или протофибрилл, которые могут образовывать цитотоксические нерастворимые фибриллы. Эти фибриллы не могут разлагаться протеасомой, и они ухудшают функцию данной внутриклеточной протеолитической системы. Это приводит к аккумулированию а-синуклеиновых протофибрилл (и других белков, которые разлагаются под действием протеасо-мы) в цитозоле (Bennett М.С., Pharmacol. Ther. 2005; 105 (3):311-31), и, как следствие, содержание а-синуклеиновых протофибрилл повышается в мозге пациентов с болезнью Паркинсона. Указанные фибриллы были ассоциированы с нейротоксичностью в клетках со сверхэкспрессией а-синуклеина и мышиных моделях (Masliah E. et al., Science 2000; 287(5456):1265-9; Gosavi N. et al., J. Biol. Chem. 2002;277(50):48984-92). Аномальное аккумулирование неправильно уложенного а-синуклеина может привести к митохондриальным изменениям, которые могут стимулировать окислительный стресс и вызывать гибель клеток (Hsu L.J. et al., Am. J. Pathol. 2000; 157(2):401-10). Кроме того, три точечные мутации (А53Т, A30P или E46K) в гене а-синуклеина, как известно, участвуют в патогенезе наследственной формы болезни Паркинсона (Polymeropoulos M.H. et al., Science 1997; 276(5321):2045-7; Zarranz J.J. et al.,
Алл. Neurol. 2004; 55 (2):164-73).
Было показано in vitro, что скорость агрегации а-синуклеина повышалась при инкубировании белка с POP клоном дикого типа свиньи, и это повышение зависит от концентрации POP (Brandt I. et al., Pep-tides 2008; 29(9):1472-8). Более того, мутированный вариант без POP активности (S544A) не ускорял скорость агрегации.
Повышенная агрегация также может быть предотвращена добавлением POP ингибиторов, что позволяет выдвинуть предположение о том, что данный эффект зависит от ферментативной активности POP. Последние данные свидетельствуют, что ингибиторы POP могут блокировать повышенную агрегацию а-синуклеина, вызванную окислительным стрессом в клетках нейробластомы SH-SY5Y человека со сверхэкспрессией а-синуклеина (Myohanen Т.Т. et al., Br. J. Pharmacol. 2012; 166(3):1097-113). POP совместно локализуется с а-синуклеином в SH-SY5Y клетках, и эта совместная локализация исчезает после инкубации с ингибиторами POP, указывая на взаимодействие между POP и а-синуклеином. 5-Дневное лечение ингибитором POP снижало количество растворимого а-синуклеина в головном мозге трансгенных мышей с A30P а-синуклеином.
Таким образом, ингибирование POP активности головного мозга может предотвратить агрегацию а-синуклеина и, таким образом, предотвратить образование цитотоксических протофибрилл, присутствующих в тельцах Леви. Следовательно, ингибиторы POP потенциально могут обладать терапевтической активностью в лечении нейродегенеративных расстройств, при которых описана ускоренная агрегация а-синуклеина.
Соединения, способные ингибировать POP, являются эффективными для предотвращения у крыс экспериментальной амнезии, индуцированной скополамином, позволяя делать вывод о том, что ингибиторы POP обладают способностью облегчения мнемонических расстройств (Yoshimoto Т. et al., J. Phar-macobiodyn 1987;10:730-5).
Эффект подострого введения розмариновой кислоты, неконкурентного ингибитора POP (с относительно высоким значением IC50, равным 63,7 мкМ), был испытан на крысах в водном лабиринте Морриса, и сообщалось об улучшении пространственной памяти (Park D.H. et al., Fitoterapia 2010; 81(6):644-8).
Было установлено, что у пациентов с биполярным расстройством наблюдаются высокие уровни активности POP в сыворотке крови. В последние годы важность POP в качестве мишени для лечения этой болезни значительно возросла, особенно вследствие ее вовлеченности в метаболизм инозитол-1,4,5-P3 (IP3). IP3 является ключевой молекулой в трансдукции сигнала в каскаде нейропептидов. Посредством связывания со специфическими рецепторами нейропептиды индуцируют увеличение IP3, который свя
зывается с рецептором на мембране эндоплазматического ретикулума и индуцирует высвобождение Ca2+, который, как полагают, играет важную роль в процессах обучения и памяти. Недавние исследования показали, что POP модулирует концентрацию IP3 (Komatsu Y.J. Neurosci 1996; 16:6342-52). Таким образом, известно, что разрушение гена POP в эукариотическом Dictyostelium discoideum вызывает резистентность к литию через повышение IP3 (Schulz I. et al., Eur J. Biochem. 2002; 269:5813-20), а также снижается протеолитическая активность POP, которая содействует повышению концентрации IP3 в клетках глиомы человека, антисмысловых для POP. Данный эффект также наблюдается, когда эти клетки обрабатывают специфическими ингибиторами POP (Williams R.S. et al., EMBO J. 1999; 18:2734-45).
Сигнальный путь IP3 вовлечен в действие нескольких лекарственных терапевтических стабилизаторов настроения (литий, карбамазепин и вальпроевая кислота), и нарушения в механизмах, которые регулируют передачу сигналов IP3, могут вызывать биполярное расстройство. Кроме того, лекарственный стабилизатор настроения, который обычно используется для лечения биполярного расстройства, вальп-роевая кислота, непосредственно ингибирует активность рекомбинантной POP (Cheng L. et al., Mol. Cell. Neurosci. 2005; 29:155-61). Итак, существуют убедительные доказательства того, что ингибиторы POP могут применяться для предотвращения и/или лечения биполярного аффективного расстройства у млекопитающих. Таким образом, получение новых ингибиторов POP представляет значительный интерес в терапии данного расстройства или заболевания.
В целом, было охарактеризовано влияние нескольких ингибиторов POP на когнитивную активность в различных познавательных задачах, и сложилось некоторое общее мнение, что ингибиторы POP обладают положительным действием на функцию обучения и памяти (Morain P. et al., CNS Drug. Rev. 2002; 8(1):31-52; Shinoda M. et al., Eur. J. Pharmacol. 1996; 305(1-3):31-8; Marighetto A. et al., Learn. Mem. 2000; 7(3):159-69; Toide K. et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 1997; 56 (3):427-34; Schneider J.S. et al., Neuropsy-chopharmacology 2002; 26(2):176-82).
Ингибиторы POP описываются в нескольких патентах и заявках на патенты: WO 2008/077978 A1, WO 2005/027934 A1, JP 2011-037874 А2, WO 2005/002624 А1, WO 2004/060862 А2, WO 03/04468 A1; DE 19603 10 А1, заявка на патент США 2006/0100253 А1 и патент США № 6159938, но лишь несколько соединений были исследованы в условиях in vivo (JTP-4819, S17092, Z-321, ONO-1603, Y-29794, ZTTA, Z-Pro-Prolinal и KYP-2047), и только первые три в указанном перечне поступили на стадию клинических испытаний и ни одно из них не поступило на рынок.
Несмотря на существование ингибиторов POP в данной области все еще имеет место потребность в обеспечении альтернативных соединений с высоким сродством к POP и хорошей способностью проникать через гематоэнцефалический барьер для достижения головного мозга, где происходит действие ингибитора при его применении для лечения когнитивных расстройств. Это является важной особенностью соединений, которые должны быть достойными кандидатами для применения в терапии когнитивных расстройств.
Краткое описание изобретения
Авторы изобретения установили, что ряд производных 1-[1-(бензоил)пирролидин-2-карбонил]пирролидин-2-карбонитрила не только способны с высокой эффективность ингибировать POP, но также могут проникать через параллельную искусственную мембрану, что является широко известным методом прогнозирования способности проникновения через гематоэнцефалический барьер. Эти два свойства делают соединения по настоящему изобретению идеальными кандидатами для применения в терапии когнитивных расстройств.
Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I)
где R1, R2, R3 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из C1-4 алкокси, C1-4 алкилкарбони-локси, бензилокси, фенилкарбонилокси, нафтилкарбонилокси, хинолинилкарбонилокси, изохинолинил-карбонилокси, трифторметила, галогена и водорода;
R5 выбран из группы, состоящей из галогена, нитрила, C1-4 алкокси, C1-4 алкилтио, C1-4 алкила, C1-4 алкилкарбонилокси, фенила, фенокси, фенилтио и трифторметила; R6 выбран из группы, состоящей из водорода, фтора и метила; или их фармацевтически приемлемой соли, изомеру, пролекарству или сольвату. Другой аспект настоящего изобретения относится к способам получения соединения формулы (I), как определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, пролекарства или сольвата.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к композиции лекарственного средства или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы (I), как опре
делено выше, или его фармацевтически приемлемую соль, изомер, пролекарство или сольват и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I), как определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли, изомеру, пролекарству или сольвату для применения в качестве лекарственного средства, в частности для профилактики и/или лечения когнитивных расстройств.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или профилактики когнитивных расстройств у млекопитающего, где терапевтическое количество соединения формулы (I), как определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, пролекарства или сольвата вводят пациенту, нуждающемуся в таком лечении. В конкретном варианте осуществления изобретения расстройство представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы (I), как определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, пролекарства или сольвата для получения лекарственного средства, в частности для профилактики и/или лечения когнитивных расстройств, и более конкретно, когнитивного расстройства, связанного с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Указанные аспекты и их предпочтительные варианты осуществления дополнительно также определены в формуле изобретения.
Описание фигур
На фиг. 1 представлено графическое сравнение результатов, полученных в тесте распознавания новых объектов (NOR) для композиций PBS+наполнитель, MK-801+наполнитель и MK-801 и соединение примера 4.
На фиг. 2 представлено графическое сравнение результатов, полученных в тесте пассивного избегания для композиций PBS+наполнитель, MK-801+наполнитель и MK-801 и соединение примера 4.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего изобретения значения терминов, которые представлены далее, подробно описаны ниже.
Термин "C1-4 алкил", когда используется в данном описании в качестве группы или части группы, означает линейные или разветвленные насыщенные углеводородные радикалы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил. Алкильные радикалы могут быть необязательно замещены одним или несколькими заместителями, такими как арил, галоген, гидрокси, алкокси, карбокси, циано, карбонил, ацил, алкоксикарбонил, амино, нитро, меркапто, алкилтио и т.п. Если заместителем является арил, образуется "аралкильный" радикал, такой как бензил и фенетил.
Термин "C1-4 алкокси" означает C1-4 алкоксильный или радикал простого C1-4 алкильного эфира, где термин "C1-4 алкил" определен выше. Примеры подходящих радикалов простых алкильных эфиров включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси и трет-бутокси.
Термин "C1-4 алкилкарбонилокси" означает C1-4 алкил, связанный с -C(=O)-O-группой, где термин "C1-4 алкил" определен выше.
Термин "галоген" относится к брому, хлору, йоду или фтору.
Термины "нитрил", "циано" или "карбонитрил" относятся к группе -C^H.
Термин "C1-4 алкилкарбонил" относится к C1-4 алкилу, связанному с карбонильной -C(=O)- группой.
Термин "фенокси" означает фенилокси или радикал простого фенилового эфира.
Термин "фенилтио" означает фенил, связанный с группой простого тиоэфира -S-.
Следует отметить, что положения радикалов на любом фрагменте молекулы, используемом в определениях, могут находиться в любом положении такого фрагмента, если он является химически стабильным.
Радикалы, используемые в определениях любой переменной в данном описании, включают все возможные изомеры, если не указано иное.
Термин "соль" следует понимать как любую форму активного соединения, используемого в соответствии с настоящим изобретением, в которой указанное соединение представлено в ионной форме или является заряженным и соединено с противоионом (катионом или анионом) или находится в растворе. Это определение также включает четвертичные аммониевые соли и комплексы активной молекулы с другими молекулами и ионами, в частности комплексы, образованные в результате ионных взаимодействий. Данное определение включает, в частности, физиологически приемлемые соли; данный термин следует понимать как эквивалент термина "фармакологически приемлемые соли" или "фармацевтически приемлемые соли".
Термин "фармацевтически приемлемые соли" в контексте настоящего изобретения означает любую соль, которая приемлема физиологически (обычно это означает, что она нетоксична, особенно в виде
противоиона) при использовании соответствующим образом для лечения, то есть применяется или используется, в частности, для людей и/или млекопитающих. Такие физиологически приемлемые соли могут быть образованы катионами или основаниями и как подразумевается в контексте данного изобретения представляют собой соли, образованные по меньшей мере одним соединением, применяемым в соответствии с данным изобретением - обычно кислотой (депротонированной), таким как анион, в частности при применении для человека и/или млекопитающих. Эти физиологически приемлемые соли могут быть также образованы с анионами или кислотами, и в контексте настоящего изобретения подразумевается, что представляют собой соли, образованные по меньшей мере одним соединением, применяемым в соответствии с данным изобретением - обычно протонированным, например по азоту, таким как катион, и по меньшей мере одним физиологически приемлемым анионом, в частности, при применении для человека и/или млекопитающих. В контексте настоящего изобретения это определение включает, в частности, соль, образованную физиологически приемлемой кислотой, т.е. соль конкретного активного соединения с физиологически приемлемыми органическими или неорганическими кислотами - в особенности при применении для человека и/или млекопитающих. Примерами солей такого типа являются соли, полученные с соляной кислотой, бромисто-водородной кислотой, серной кислотой, метансульфоновой кислотой, муравьиной кислотой, уксусной кислотой, щавелевой кислотой, янтарной кислотой, яблочной кислотой, винной кислотой, миндальной кислотой, фумаровой кислотой, молочной кислотой или лимонной кислотой.
Термин "сольват" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как означающий любую форму активного соединения по настоящему изобретению, в которой указанное соединение связано нековалентной связью с другой молекулой (обычно полярного растворителя), включая, в частности, гидраты и алкоголяты, такие как, например, метилат. Предпочтительным сольватом является гидрат.
Любое соединение, которое является пролекарством соединения формулы (I), также входит в объем настоящего изобретения. Термин "пролекарство" используется в самом широком смысле и включает производные, которые превращаются в естественных условиях в соединения по настоящему изобретению. Примеры пролекарств включают, но без ограничения, производные и метаболиты соединений формулы I, которые содержат биологически гидролизуемые группы, такие как биологически гидролизуемые амиды, биологически гидролизуемые сложные эфиры, биологически гидролизуемые карбаматы, биологически гидролизуемые карбонаты, биологически гидролизуемые уреиды и биологически гидролизуе-мые фосфатные производные. Предпочтительно пролекарства соединений с карбоксильными функциональными группами представляют собой низшие алкиловые эфиры карбоновых кислот. Сложные кар-боксилатные эфиры удобно получают этерификацией любой из групп карбоновых кислот, присутствующих в молекуле. Обычно пролекарства могут быть получены с использованием хорошо известных способов, таких как способы, описанные в научной литературе: Burger "Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley), "Design and Applications of Prodrugs" (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers); Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drug design and Discovery" Tay-lor &Francis (April 2002).
Соединения по настоящему изобретению, представленные описанной выше формулой (I), могут включать энантиомеры в зависимости от наличия хиральных центров или изомеры в зависимости от наличия кратных связей (например, Z, Е). Отдельные изомеры, энантиомеры или диастереоизомеры и их смеси включены в объем настоящего изобретения.
Кроме того, любое соединение, упомянутое в данном описании, может существовать в виде тауто-меров. В частности, термин "таутомер" относится к одному из двух или нескольких структурных изомеров соединения, которые находятся в равновесии и легко переходят из одной изомерной формы в другую. Обычными таутомерными парами являются амин-имин, амид-имидокислота, кето-енол, лактам-лактим и т.д.
Если не указано иное, соединения по настоящему изобретению также включают меченные изотопами формы, т.е. соединения, которые различаются только присутствием одного или нескольких изотопно-обогащенных атомов. Например, соединения представленных структур, отличающиеся заменой по меньшей мере одного атома водорода дейтерием или тритием, или заменой по меньшей мере одного атома углерода 13C- или 14C-обогащенным углеродом, или заменой по меньшей мере одного атома азота ^^обогащенным азотом, входят в объем настоящего изобретения.
Соединения формулы (I) или их соли или сольваты находятся предпочтительно в фармацевтически приемлемой или, по существу, в чистой форме. Под фармацевтически приемлемой формой подразумевают, в частности, форму с фармацевтически приемлемым уровнем чистоты без обычных фармацевтических добавок, таких как разбавители и носители, и не содержащую веществ, которые считают токсичными при обычных уровнях дозирования. Уровень чистоты лекарственного средства предпочтительно составляет свыше 50%, более предпочтительно свыше 70%, наиболее предпочтительно свыше 90%. В предпочтительном варианте осуществления он составляет более 95% соединения формулы (I) или его солей, сольватов или пролекарств.
Как отмечалось ранее, термин "фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства" относится к любой соли, сольвату или любому другому соединению, которое при введении реципиенту спо
собно обеспечить (непосредственно или опосредованно) соединение, которое описано в данном изобретении. Однако следует представлять, что фармацевтически неприемлемые соли, сольваты и пролекарства также входят в объем настоящего изобретения, так как они могут применяться для получения фармацевтически приемлемых солей, сольватов и пролекарств. Получение солей, сольватов и пролекарств может осуществляться способами, известными в данной области.
Термины "лечить", "лечащий" и "лечение", когда используются в данном изобретении, включают ликвидацию, удаление, реверсию, облегчение, модификацию или контроль заболевания или состояния, такого как когнитивное расстройство.
Термины "предотвращение", "предотвращающий", "превентивный", "предотвращать" и "профилактика" относятся к способности соединения формулы (I) устранять, снижать до минимума или затруднять начало или развитие болезни или состояния, такого как когнитивное расстройство, до их проявления.
Таким образом, термины "лечащий", или "лечение", и/или "предотвращающий" или "предотвращение", в целом, означают, по меньшей мере, подавление или облегчение симптомов, связанных с состоянием, поражающим субъекта, где подавление и облегчение используются в широком смысле для обозначения, по меньшей мере, уменьшения значения параметра, например признака, связанного с состоянием, подлежащим лечению, таким как когнитивное расстройство. По существу, способ по настоящему изобретению также включает случаи, когда состояние полностью ингибируется, например предотвращается его проявление, или останавливается, например прекращается, так что субъект больше не испытывает данного состояния. Таким образом, способ по настоящему изобретению включает предотвращение когнитивных расстройств и менеджмент данных расстройств.
Термин "когнитивное расстройство", когда используется в данном описании, означает любое состояние, характеризующееся недостаточностью умственной деятельности, связанной с мышлением, обучением или памятью. Примеры таких расстройств включают агнозии, амнезии, афазии, апраксии, делирии, деменции и расстройство обучения.
Когнитивное расстройство может быть связано (и зачастую является связанным) с другими состояниями (то есть вызвано или имеет место при наличии других состояний), характеризующимися повреждением или потерей нейронов или других структур, участвующих в передаче сигналов между нейронами. Следовательно, когнитивные расстройства могут быть связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, кортикобазальная дегенерация, болезнь Крейтцфельда-Якоба, дегенерация лобной и височных долей, болезнь Хатингтона, рассеянный склероз, нормотензивная гидроцефалия, хронический органический мозговой синдром, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, прогрессирующий надъядерный паралич или старческое слабоумие (тип болезни Альцгеймера).
Когнитивные расстройства также могут быть связаны с другими состояниями, которые ухудшают нормальное функционирование центральной нервной системы, включая психические расстройства, такие как тревожные расстройства, диссоциативные расстройства, расстройства настроения, такие как биполярное аффективное расстройство, шизофрения и соматоформные и симулятивные расстройства.
Соединения, описанные в данном изобретении, могут применяться для лечения агнозий, амнезий, афазий, апраксий, делириев, деменций, расстройств обучения и других когнитивных расстройств.
Примеры деменций, которые можно лечить с помощью способов по изобретению, включают комплекс деменций при СПИДе, болезнь Бинсвангера, деменцию с тельцами Леви, лобно-височную демен-цию, мультиинфарктную деменцию, болезнь Пика, семантическую деменцию, старческое слабоумие и сосудистую деменцию.
Примеры расстройств обучения, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, включают синдром Аспергера, синдром дефицита внимания, синдром дефицита внимания и гиперактивности, аутизм, детское дезинтегративное расстройство и синдром Ретта.
Примеры афазии, которые можно лечить с помощью методов по изобретению, включают прогрессирующую афазию со снижением беглости речи.
Соединения, описанные в данном изобретении, также могут применяться для лечения пациента с недостаточностью умственной деятельности, которая является умеренной или, иначе, не существенно влияет на повседневную жизнь. Умеренное нарушение когнитивных функций является примером такого состояния: пациент с умеренным нарушением когнитивных функций проявляет симптомы деменций (например, затруднение речи или памяти), но тяжесть этих симптомов такова, что диагностировать демен-цию может быть нецелесообразно. Соединения, описанные в данном изобретении, могут применяться для лечения умеренного нарушения когнитивных функций и других, аналогично менее тяжелых форм когнитивных расстройств.
Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или профилактики когнитивных расстройств у млекопитающего, где терапевтическое количество соединения по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в указанном лечении.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения соединения, описанные в данном изобретении, могут применяться для лечения пациентов с когнитивным расстройством, связанным с шизофренией, биполярным аффективным расстройством, болезнью Альцгеймера или болезнью Паркинсо-на.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения в соединениях формулы (I) или их фармацевтически приемлемой соли, изомере, пролекарстве или сольвате R1 представляет собой водород; R2, R3 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из C1-4 алкокси, C1-4 алкилкарбонилокси, бензи-локси, фенилкарбонилокси, нафтилкарбонилокси, хинолинилкарбонилокси и изохинолинилкарбонилок-си; R5 выбран из группы, состоящей из галогена, нитрила, C1-4 алкокси, C1-4 алкилтио, C1-4 алкила, фенила, фенокси, фенилтио и трифторметила; и R6 выбран из группы, состоящей из водорода, фтора и метила.
В конкретном варианте осуществления изобретения R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, трифторметила и C1-4 алкокси.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения R2 выбран из группы, состоящей из водорода и метокси, R4 выбран из группы, состоящей из фтора, трифторметила и метокси.
В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения R5 представляет собой фтор.
В конкретном варианте осуществления изобретения R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из C1-4 алкокси, C1-4 алкилкарбонилокси и бензилокси.
В конкретном варианте осуществления R2 и R4 представляют собой метокси.
В другом варианте осуществления изобретения R3 представляет собой бензилокси.
В еще одном варианте осуществления изобретения R1 представляет собой водород.
В еще одном варианте осуществления изобретения R выбран из фтора, метокси, метилтио и фенила, предпочтительно представляет собой фтор.
В еще одном варианте осуществления изобретения R6 представляет собой водород или фтор.
В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления изобретения предпочтения, описанные выше для различных заместителей, объединены. Настоящее изобретение также относится к комбинации таких предпочтительных заместителей в приведенных выше формулах.
Конкретные индивидуальные соединения по настоящему изобретению, представленные формулой (I), включают соединения, перечисленные ниже
(S)-1- ( (2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метоксипирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фенилпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метилпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-цианопирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трифторметил)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трет-бутокси)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-ацетоксипирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(4-ацетокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(4-бензоилокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(3,4-дибензилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(3,4-дибензоилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(З-ацетокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4
дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (2S)-1-(З-пивалоилокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (S)-1-(4-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (S)-1-(3-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (S)-1-(2-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (S)-1-(4-(бензилокси)-3-(трифторметил)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1- ( (S) -1-(4-(бензилокси)-3-фторбензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
или их фармацевтически приемлемую соль, изомер, пролекарство или сольват. Соединения формулы (I), определенные выше, могут быть получены с помощью доступных методик синтеза, которые проиллюстрированы приведенными далее общими схемами
На первой стадии сложный эфир формулы (II) растворяют или суспендируют в полярном органическом растворителе (предпочтительно в протонном полярном органическом растворителе), таком как этанол (EtOH) или метанол, или в смеси полярных органических растворителей. Добавляют водный раствор основания, и гидролитическую реакцию проводят при выдерживании смеси, как правило, при кипячении с обратным холодильником, при температуре в диапазоне от комнатной температуры до температуры образования флегмы смеси растворителей до завершения гидролиза, обычно в течение периода времени от 0,5 до 4 ч, предпочтительно 1-2 ч. Раствор основания предпочтительно является неорганическим рас
твором по своей природе, таким как разбавленный раствор щелочи, например NaOH. Затем реакционную смесь оставляют для охлаждения до комнатной температуры и предпочтительно концентрируют до приблизительно 1/5 объема реакционной смеси. После этого реакционную смесь медленно добавляют к раствору кислоты, такому как раствор 1М раствор HCl, для нейтрализации при охлаждении на ледяной бане.
Если подкисление приводит к образованию осадка, твердое вещество собирают фильтрацией и промывают водой с получением продукта формулы (VII). Если осадок не образуется, полученный раствор несколько раз экстрагируют соответствующим органическим растворителем, таким как этилацетат, органическую фазу сушат и упаривают. Сырой продукт формулы (VII) очищают флэш-хроматографией.
Удаление защитной группы амина формулы (III) достигается в слабокислых условиях, таких как добавление в раствор соляной кислоты в органическом растворителе, таком как диоксан, или со смесью TFA/DCM при низкой температуре в интервале от 0°C до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1-3 ч. Далее растворитель выпаривают досуха с получением в зависимости от используемой кислоты гидрохлоридной соли или соли трифторуксусной кислоты амина формулы (VI).
Соединение формулы (IX) получают из карбоновой кислоты формулы (VII) и амина формулы (VI) в условиях реакции Шоттена-Баумана. Таким образом, хлорирующий агент, такой как оксалилхлорид, добавляют к раствору карбоновой кислоты формулы (VII) в органическом растворителе, таком как толуол. Реакционную смесь перемешивают при температуре от 50 до 80°C в течение от 1 до 2 ч для обеспечения образования хлорангидрида карбоновой кислоты формулы (VIII). После выпаривания растворителя полученный сырой продукт растворяют в органическом растворителе, таком как ТГФ, и добавляют к водному основному раствору амина формулы (VI), обычно раствору амина формулы (VI) в водном растворе NaOH, при низкой температуре, такой как 0°C. Реакционную смесь перемешивают при низкой температуре в течение от 1 до 2 ч и при комнатной температуре в течение 2 до 4 ч. Затем растворитель выпаривают, и pH оставшейся водной фракции доводят до кислотных значений (3-4) добавлением раствора HCl и экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают насыщенным раствором соли, сушат, фильтруют и упаривают. При необходимости сырой продукт очищают флэш-хроматографией.
Продукт формулы (IX) затем подвергают реакции сочетания с (Б)-пирролидин-2-карбонитрилом формулы (IV) в присутствии основания, такого как ^^диизопропилэтиламин (DIEA), и с помощью реагента сочетания, такого как карбодиимид. В частности, соединение формулы (IX) растворяют в апротон-ном органическом растворителе, таком как дихлорметан, и добавляют к карбодиимиду, например к кар-бодиимиду на твердой подложке, такому как N-циклогексилкарбодиимид, N'-метилполистирол, вместе с DIEA. Спустя 5 мин добавляют (Б)-пирролидин-2-карбонитрил формулы (IV) и DIEA. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8 до 16 ч. После этого реакционную смесь фильтруют, и полученное твердое вещество промывают апротонным органическим растворителем. Фильтрат упаривают досуха. Сырой продукт очищают с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Альтернативно, соединения формулы (I) могут быть получены как показано на схеме E и описано ниже.
Амин-функционализированную смолу, такую как амидная смола Зибера формулы (X), помещают в шприц, снабженный полиэтиленовым пористым диском. Смолу подвергают набуханию промывкой подходящими органическими растворителями, такими как дихлорметан (DCM) и диметилформамид (DMF). Когда аминогруппа смолы защищена (т.е. в случае амидной смолы Зибера), удаление защитной группы (такой как флуоренилметоксикарбонильная (Fmoc) защитная группа) достигается обработкой раствором аминного основания, например раствором пиперидина в DMF.
После удаления защитной группы из смолы Fmoc-защищенный L-пролин формулы (V) присоединяют к смоле с использованием активирующего агента, такого как триазол (т.е. TBTU), и аминного основания, такого как DIEA, в соответствующем органическом растворителе, таком как DMF. Смесь перемешивают в течение от 1 до 2 ч. После фильтрации и промывки степень связывания может контролироваться с помощью теста Кайзера, при необходимости может осуществляться повторное сочетание. Fmoc удаляют для получения продукта формулы (XI) путем обработки амина раствором основания, таким как раствор пиперидина в DMF и/или смесь пиперидинЮВи/толуол/DMF. Удаление Fmoc может оцениваться с помощью теста п-нитрофенилового эфира NF31
I Полимер I
(XI)
Продукт формулы (XI) подвергают реакции сочетания с продуктом формулы (IX) с получением продукта формулы (XII) с использованием активирующего агента, такого как PyBOP, в присутствии или в отсутствие добавки, такой как HOAt, и аминного основания, такого как DIEA, в соответствующем органическом растворителе, таком как DMF. Смесь перемешивают вручную в продолжение реакции в течение от 1 до 2 ч. Систематическое повторное сочетание осуществляется с использованием таких же количеств реагентов и такой же продолжительности реакции. Степень связывания может контролироваться с помощью теста п-нитрофенилового эфира NF31
Альтернативно, продукт формулы (XII) также может быть получен посредством постадийного сочетания продукта (XI) сначала с соединением формулы (XIII) с последующим удалением защитной группы Fmoc, а затем реакцией сочетания с соединением формулы (VII).
Продукт формулы (XII), тщательно промытый подходящим органическим растворителем, таким как DCM, и высушенный, переносят в колбу, в которую добавляют ангидрид трифторуксусной кислоты и пиридин в небольшом количестве органического растворителя. Смесь выдерживают при температуре от 20 до 40°C в течение от 8 до 16 ч. Затем реакционную смесь фильтруют, и смолу промывают тем же органическим растворителем. Фильтраты собирают, и растворитель выпаривают досуха. Полученный сырой продукт растворяют в подходящем растворителе, таком как этилацетат, и промывают насыщенным раствором NaHCO3 и 5%-ным водным раствором KHSO4. Органическую фазу сушат, фильтруют и упаривают. Сырой продукт растворяют в H2O:CH3CN и лиофилизуют с получением нитрила пептида формулы (I).
Альтернативно, пептидил-смола формулы (XII) может подвергаться обработке смесью TFA/H2O/TIS в течение 1-2 ч. После этого смолу собирают фильтрацией и промывают TFA, фильтраты собирают, и растворитель выпаривают досуха. Сырой продукт ресуспендируют в смеси H2O:CH3CN и лиофилизуют. Полученный сырой пептид-амид растворяют в подходящем органическом растворителе, таком как DCM, и подвергают превращению в нитрил, например, в присутствии пентоксида фосфора, тетрахлорида титана, тионилхлорида, смеси трифторуксусный ангидрид/пиридин или трифенилфос-фин/четыреххлористый углерод. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение от 8 до 16 ч, растворитель выпаривают, и остаток растворяют в этилацетате. Органический раствор последовательно промывают водным раствором KHSO4 и водным раствором NaHCO3. Сушка и упаривание органической фазы приводит к получению пептиднитрила формулы (I).
Сырой продукт очищают с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Когда описанные выше способы получения соединений по изобретению приводят к получению смеси стереоизомеров, эти изомеры могут разделяться обычными способами, такими как препаративная хроматография. Если присутствуют хиральные центры, соединения могут быть получены в рацемической форме, или индивидуальные энантиомеры могут быть получены либо путем энантиоспецифическо-го синтеза, либо путем разделения.
Соединения формул (II), (III), (IV) и (V), а также некоторые из соединений формулы (VII), используемые в качестве исходных продуктов, являются либо коммерчески доступными или могут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалисту в данной области техники.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способы получения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, пролекарства или сольвата.
В одном варианте осуществления изобретения способ включает следующие стадии:
a) взаимодействие соединения формулы (IX)
где R1, R2, R3, R4, R5 и R6 принимают значения, определенные выше в формуле (I), с соединением формулы (XI)
I Полимер I
(XI) W
где полимер представляет собой полимер, который является инертным в реакционных условиях метода синтеза, раскрытого в данном описании, и нерастворимым, но набухает в растворителях, используемых в данном методе синтеза, такой как низший сшитый полистирол и полиэтиленгликоль-привитый полистирол,
с получением соединения формулы (XII)
c) превращение карбоксамидной группы соединения формулы (XIV) в нитрильную группу в подходящих условиях с получением соединения формулы (I);
где стадии b) и с) могут осуществляться раздельно или в одном реакторе.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ получения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, пролекарства или сольвата включает следующие стадии:
а) взаимодействие соединения формулы (IX)
где R1, R2, R3, R4, R5 и R6 принимают значения, определенные выше в формуле (I), с соединением формулы (IV)
(XI)
где полимер представляет собой полимер, который является инертным в реакционных условиях метода синтеза, описанного в данном изобретении, и нерастворимым, но набухает в растворителях, используемых в данном описании, такой как низший сшитый полистирол и полиэтиленгликоль-привитый полистирол,
где R5 и R6 принимают значения, определенные выше в формуле (I);
b) удаление защитной группы Fmoc;
c) взаимодействие с соединением формулы (VII)
где R1, R2, R3 и R4 принимают значения, определенные выше в формуле (I);
d) гидролиз полученного продукта из несущего полимера с получением соединения формулы (I)
с соединением формулы (XIII)
где R1, R2, R3, R4, R5 и R6 принимают значения, определенные выше.
Было выявлено, что соединения общей формулы (I) применимы для лечения когнитивных расстройств, в частности когнитивных расстройств, связанных с другими заболеваниями или состояниями центральной нервной системы.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения когнитивное расстройство представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
Настоящее изобретение также предоставляет лекарственные средства или фармацевтические композиции, содержащие соединение по данному изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, производное, пролекарство или стереоизомер вместе с фармацевтически приемлемым носителем, адъю-вантом или наполнителем, для введения пациенту.
Вспомогательные материалы или добавки в фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть выбраны из носителей, наполнителей, подложек, смазывающих веществ, наполнителей, растворителей, разбавителей, красителей, вкусовых кондиционеров, таких как сахара, антиоксидан-тов, связующих веществ, клеев, дезинтегрирующих веществ, разделителей, веществ, способствующих скольжению, и/или агглютинирующих веществ. В случае суппозиториев они могут представлять собой воски или эфиры жирных кислот или консерванты, эмульгаторы и/или носители для парентерального введения. Выбор этих вспомогательных материалов и/или добавок и количеств, которые будут применяться, будет зависеть от формы применения фармацевтической композиции.
Лекарственное средство или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть представлена в любой форме, подходящей для применения в отношении людей и/или животных,
предпочтительно для людей, включая младенцев, детей и взрослых, они могут быть получены с помощью стандартных методик, известных специалистам данной области техники. Таким образом, композиция по настоящему изобретению может быть адаптирована для местного или системного применения, в частности для кожного, трансдермального, подкожного, внутримышечного, внутрисуставного, внутри-брюшинного, внутривенного, внутриартериального, внутрипузырного, внутрикостного, внутриполостно-го, интраназального, легочного, трансбуккального, сублингвального, глазного способа введения, введения в стекловидное тело, чрескожного, ректального, вагинального, перорального, эпидурального, интра-текального, внутрижелудочкового, внутримозгового, интрацеребровентрикулярного, интрацистерналь-ного, интраспинального, периспинального, внутричерепного способа введения, способа доставки с помощью иглы или катетера с применением насоса или без него или других способов применения.
В одном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции представлены в форме для перорального введения, либо твердой, либо жидкой. Подходящие лекарственные формы для пе-рорального введения могут представлять собой таблетки, пилюли, таблетки в виде капсул, гелевые колпачки, жевательные резинки, капсулы, гранулы, капли, сиропы или растворы и могут содержать обычные наполнители, известные в данной области, такие как связующие вещества, например сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант или поливинилпирролидон; наполнители, например лактозу, сахар, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин; смазывающие вещества для таблетирования, например стеарат магния; дезинтегрирующие вещества, например крахмал, поливинилпирролидон, натрия крахмалгликолят или микрокристаллическую целлюлозу; или фармацевтически приемлемые смачивающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия.
В другом варианте осуществления фармацевтические композиции представлены в форме продуктов для непарентерального интраназального введения, предпочтительно в виде продуктов для интраназаль-ного введения. Обычно интраназальное введение осуществляется с помощью назальных спреев, бутылок-пульверизаторов и пипеток в качестве устройств доставки. Для применения с помощью этих устройств фармацевтические композиции представляют собой преимущественно жидкие растворы или суспензии соединений по изобретению.
Композиции могут быть получены стандартными способами смешивания, наполнения или таблети-рования. Повторные операции смешивания могут применяться для распределения активного агента в тех композициях, где применяются большие количества наполнителей. Такие операции являются общепринятыми в данной области. Таблетки, например, могут быть получены с помощью влажного или сухого гранулирования и необязательно могут быть покрыты оболочкой в соответствии со способами, хорошо известными в обычной фармацевтической практике, в частности энтеросолюбильным покрытием.
Фармацевтические композиции также могут быть адаптированы для парентерального введения в таких формах, как стерильные растворы, суспензии или восстанавливаемые сухие препараты, аэрозоли или спреи в подходящей стандартной лекарственной форме. В этом случае могут применяться соответствующие наполнители, такие как объемообразующие средства, буферы или поверхностно-активные вещества.
Композиция по настоящему изобретению может быть составлена для чрескожного применения в виде "депо" в растворенной форме или в виде пластырей.
Формы для кожного применения включают мази, гели, кремы, лосьоны, суспензии или эмульсии. Подходящей формой для ректального применения является суппозиторий.
Указанные препараты будут получены с использованием стандартных способов, таких как способы, которые описаны или упомянуты в Испанской и Американской фармакопеях и подобных источниках.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение формулы (I) предпочтительно применяется в терапевтически эффективных количествах. Врач определит дозировку терапевтических лекарственных средств по изобретению, которая будет наиболее подходящей, и она будет изменяться в зависимости от формы введения и конкретного выбранного соединения и, кроме того, в зависимости от пациента, получающего лечение, от его возраста, типа заболевания или состояния, подлежащего лечению. Когда композиция вводится перорально, для достижения того же эффекта потребуются количества активного ингредиента, большие по сравнения с количествами активного ингредиента, которые вводятся парентерально. Соединения могут применяться таким же образом, как и сопоставимые терапевтические средства, а уровень дозировки имеет тот же порядок, что и дозировки этих других терапевтических средств. Активные соединения обычно будут вводиться один или несколько раз в сутки, например 1, 2, 3 или 4 раза в сутки, при общих суточных дозах в интервале от 0,1 до 1000 мг/кг/сутки.
Соединения и композиции по данному изобретению могут применяться с другими лекарственными средствами для обеспечения комбинированной терапии. Другие лекарственные средства могут составлять часть той же самой композиции или предоставляться в виде отдельной композиции для введения в то же время или в разное время.
В частности, комбинация по меньшей мере одного соединения формулы (I) и по меньшей мере одного другого лекарственного средства может быть составлена для одновременного, раздельного или последовательного введения, по меньшей мере, с фармацевтически приемлемым носителем, добавкой, адъювантом или наполнителем. Поэтому подразумевается, что комбинация соединения формулы (I) и
другого лекарственного средства может быть введена:
a) в виде комбинации, которая является частью одного лекарственного препарата, причем оба средства вводятся всегда одновременно,
b) в виде комбинации двух отдельных препаратов, каждый из которых содержит одно из лекарственных средств, что позволяет их вводить одновременно, последовательно или раздельно. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) вводится независимо от другого лекарственного средства (например, в двух препаратах), но в одно и то же время. В другом конкретном варианте осуществления изобретения сначала вводится соединение формулы (I), а затем вводится другое лекарственное средство, по отдельности или последовательно. В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения сначала вводится другое лекарственное средство, а затем вводится соединение формулы (I), по отдельности или последовательно, как определено.
В контексте настоящего изобретения использовались следующие сокращения и аббревиатуры:
AcOEt Этилацетат
AcSDKP N-ацетилсериласпартиллизилпролин
AD болезнь Альцгеймера
ГЭБ гематоэнцефалический барьер
Вое трет-Бутоксикарбонил
BSA Бычий сывороточный альбумин
DBU 1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
DCM Дихлорметан
DIEA N,N'-диизопропилэтиламин
DMF Диметилформамин
ДМСО Диметилсульфоксид
DPPIV Дипептидилпептидаза IV
EtOH Этанол
Fmoc 9-фторенилметоксикарбонил
FPLC Жидкостная экспресс-хроматография белков
HOAt 1-Гидрокси-7-азабензотриазол IP3 Инозитолтрифосфат
IPTG Изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозид
LB Лизогенный бульон
MALDI-TOF Время-пролетная ионизация лазерной десорбцией с
использованием матрицы
МК-8 01 Дизоцилпин (INN)
MS Рассеянный склероз
OD Оптическая плотность
РАМРА Определение проницаемости через параллельные
искусственные мембраны
PBS Фосфатно-буферный раствор
PC Фосфатидилхолин
РЕ Фосфатидилэтаноламин
рЕТМЮ Плазмида рЕТМЮ
PI Фосфатидилиноситол
POP Пропилолигопептидаза
hPOP Пропилолигопептидаза человека
PREP Пропилэндопептидаза (POP и PREP являются
синонимами) PS Фосфатидилсерин
РуВОР Гексафторфосфат (бензотриазол-1-
илокси)трипирролидинофосфония
ОФ-ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография с
обращенной фазой
SD Стандартное отклонение
SDS-PAGE Электрофорез в полиакриламидном геле с
додецилсульфатом натрия
TBTU Тетраборат О-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-
тетраметилурония
TFA Тетрафторуксусная кислота
ТГФ Тетрагидрофуран
TIS Триизопропилсилан
Tris Трис(гидроксиметил)аминометан
т|34 Белок тимозин-бета-4
Z-G-P-AMC (Ы-бензилоксикарбонил-61у-Рго-метилсумаринил-7-амид)
Приведенные далее примеры являются иллюстративными примерами некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения и не могут рассматриваться как ограничивающие его каким-либо образом.
Примеры
Особые условия синтеза, используемые для способов получения, описанных в примерах.
Методика А. Гидролиз сложного эфира формулы (II) до карбоновой кислоты формулы (VII).
Сложный эфир формулы (II) (1 ммоль) растворяют в 95%-ном EtOH. Добавляют NaOH (3,7 ммоль), и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение приблизительно 2 ч. Затем смесь оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Реакционную смесь концентрируют до приблизительно 15-20 мл, а затем полученный раствор медленно добавляют в 1М раствор HCl с охлаждением на ледяной бане. Твердый белый осадок, который собирают фильтрацией, промывают водой и тщательно сушат перед следующей стадией синтеза. В случае, когда осадок не образуется, полученный раствор экстрагируют AcOEt (3х), органическую фазу сушат и упаривают. Сырой продукт очищают флэш-хроматографией, если это необходимо.
Методика В. Удаление защитной группы с Вос-защищенного амина формулы (III) с получением амина формулы (VI).
Вос-защищенный амин формулы (III) (1 ммоль) медленно добавляют в 4М HCl в диоксане (20 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворитель выпаривают досуха с получением гидрохлоридной соли амина формулы (VI).
Методика С. Связывание амина формулы (VI) с карбоновой кислотой формулы (VII) через образования хлорангидрида карбоновой кислоты формулы (VIII).
Оксалилхлорид (1,5 ммоль) добавляют к раствору карбоновой кислоты формулы (VII) (1 ммоль) в толуоле (5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 50°C в течение 1,5 ч с получением хлорангидрида карбоновой кислоты формулы (VIII). После выпаривания растворителя полученный сырой продукт растворяют в ТГФ и добавляют к водному NaOH раствору амина формулы (VI) (1,1 ммоль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивают при 0°C в течение 1,5 ч и при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем ТГФ выпаривают, после этого pH оставшейся водной фракции доводят до кислотных значений (3-4) добавлением 1М раствора HCl, и смесь экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают насыщенным раствором соли, сушат, фильтруют и упаривают. Сырой продукт формулы (IX) очищают флэш-хроматографией при необходимости.
Методика D. Сочетание продукта формулы (IX) с получением (8)-пирролидин-2-карбонитрила формулы (IV) в растворе.
Продукт формулы (IX) (1,2 ммоль) растворяют в DCM и добавляют к N-циклогексилкарбодиимида, N'-метилполистиролу (3 ммоль) вместе с DIEA (1 ммоль). Спустя 5 мин добавляют (8)-пирролидин-2-карбонитрил формулы (IV) (1 ммоль) и DIEA (1 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь фильтруют, и полученный твердый осадок промывают DCM. Фильтрат упаривают досуха. Сырой продукт очищают с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ.
Методика E. Общая методика синтеза на твердой фазе. Набухание/кондиционирование смолы.
Амидную смолу Зибера формулы (X) (1 экв.) забирают в шприц, снабженный полиэтиленовым пористым диском. Смолу подвергают набуханию промывкой DCM и DMF. Удаление флуоренилметокси-карбонильной (Fmoc) защитной группы осуществляют обработкой 20%-ным раствором пиперидина в DMF.
Затем Fmoc-защищенный L-пролин формулы (V) (4 экв.) присоединяют к смоле с использованием TBTU (4 экв.) и DIEA (8 экв.) в DMF. Смесь периодически перемешивают вручную в течение 90 мин. После фильтрации и промывки степень связывания контролируют с помощью теста Кайзера, при необходимости осуществляют повторное сочетание. Fmoc удаляют с получением продукта формулы (XI) обработкой 20%-ным раствором пиперидина в DMF, а затем раствором с пиперидин/DBU/толуол/DMF (20:5:5:70). Удаление Fmoc оценивают с помощью теста п-нитрофенильного эфира NF31 (см. Madder A. et al., Eur. J. Org. Chem. 1999; (11):2787-91).
Продукт формулы (IX) (2 экв.) связывают с продуктом формулы (XI) с получением продукта формулы (XII) с использованием PyBOP (2 экв.), HOAt (6 экв.) и DIEA (6 экв.) в DMF. Смесь периодически перемешивают вручную в течение всего времени реакции (90 мин). Систематически повторное сочета-
ние проводят с использованием таких же количеств реагентов и времени реакции. Степень связывания
контролируют с использованием теста п-нитрофенильного эфира NF31.
Альтернативно, продукт формулы (XIII) (4 экв.) связывают с продуктом формулы (XI) с использованием PyBOP (4 экв.), HOAt (12 экв.) и DIEA (12 экв.) в DMF. Смесь периодически перемешивают вручную в течение всей реакции (90 мин). Степень связывания контролируют с использованием теста п-нитрофенильного эфира NF31 и при необходимости проводят повторное сочетание. Группу Fmoc удаляют обработкой 20%-ным раствором пиперидина в DMF и обработкой раствором перидин/DBU/толуол/DMF (20:5:5:70). Затем вводят продукт формулы (VII) (4 экв.) с помощью PyBOP (4 экв.), HOAt (12 экв.) и DIEA (12 экв.) в DMF с получением продукта формулы (XII). Смесь периодически перемешивают вручную в течение всей реакции (90 мин). Степень связывания контролируют с использованием теста п-нитрофенильного эфира NF31, и при необходимости проводят повторное сочета-
ние.
Продукт формулы (XII), тщательно промытый DCM и высушенный, переносят в круглодонную колбу и добавляют ангидрид трифторуксусной кислоты (5 экв.) и пиридин (10 экв.) в DCM (приблизительно 2 мл/100 мг). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь фильтруют, и смолу промывают DCM. Фильтраты собирают, и растворитель выпаривают досуха. Полученный сырой продукт растворяют в AcOEt и промывают насыщенным раствором NaHCO3 и 5%-ным водным раствором KHSO4. Органическую фазу сушат, фильтруют и упаривают. Сырой продукт растворяют в смеси H2O:CH3CN (1:1) и лиофилизуют с получением пептиднитрила формулы (I).
Альтернативно, пептидил-смолу (XII) обрабатывают смесью TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5, приблизительно 2-5 мл/100 мг) в течение 1-2 ч. Затем смолу фильтруют и промывают TFA, фильтраты собирают, и растворитель выпаривают досуха. Сырой продукт повторно суспендируют в смеси H2O:CH3CN (1:1) и лиофилизуют. Полученный неочищенный пептидамид растворяют в DCM и добавляют трифторуксус-ный ангидрид (5 экв.) и пиридин (10 экв.). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение ночи, растворитель выпаривают, и остаток растворяют в AcOEt. Органический раствор промывают последовательно водным 5%-ным раствором KHSO4 и водным 10%-ным раствором NaHCO3. Сушка и упаривание органической фазы приводят к получению пептиднитрила формулы (I).
Сырой продукт очищают с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Синтез промежуточных соединений.
Промежуточное соединение 1. 4-Бензилокси-3,5-диметоксибензойная кислота
Метил-3,5-диметокси-4-гидроксибензоат (2,0 г, 9,4 ммоль), карбонат калия (3,2 г, 22,6 ммоль) и йо-дид калия (500 мг, 3,0 ммоль) загружают в круглодонную колбу. Добавляют ацетон (200 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют бензилхлорид (4,3 мл, 37,7 ммоль), и смесь кипятят с обратным холодильником при перемеши
вании в течение 8 ч. После этого реакционную смесь оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Добавляют воду, и смесь трижды экстрагируют диэтиловым эфиром, органический экстракт промывают насыщенным раствором соли, сушат и упаривают. Сырой продукт очищают флэш-хроматографией, получая 1,7 г (5,7 ммоль). После этого гидролиз метилового эфира проводят в соответствии с методикой А, описанной выше, с получением 4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты (2,4 г, 7,9 ммоль).
Промежуточное соединение 2. (28,4К)-4-Метоксипирролидин-2-карбоновая кислота
JXb
Исходя из коммерчески доступной (28,4Я)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-метоксипирролидин-2-карбоновой кислоты (221 мг, 0,5 ммоль 1) в соответствии с методикой В, описанной выше, получают продукт с количественным выходом в виде хлористо-водородной соли и используют его далее без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 3. (8)-4,4-Дифторпирролидин-2-карбоновая кислота
Исходя из коммерчески доступной (8)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбоновой кислоты (150 мг, 0,1 ммоль) в соответствии с методикой В, описанной выше, получают продукт с количественным выходом в виде хлористо-водородной соли и используют его далее без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 4. (28,48)-4-(Метилтио)пирролидин-2-карбоновая кислота
N ОН
Исходя из коммерчески доступной (28,48)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-метилтиопирролидин-2-карбоновой кислоты (310 мг, 1,93 ммоль) в соответствии с методикой В, описанной выше, получают продукт с количественным выходом в виде хлористо-водородной соли и используют его далее без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 5. (28,48)-4-Метилпирролидин-2-карбоновая кислота
Н р
Исходя из коммерчески доступной (28,48)-1-(трет-бутоксикарбонил)-4-метилпирролидин-2-карбоновой кислоты (500 мг, 2,18 ммоль) в соответствии с методикой В, описанной выше, получают продукт с количественным выходом в виде хлористо-водородной соли и используют его далее без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 6. (28,4К)-4-Ацетоксипирролидин-2-карбоновая кислота
I-NH о
Коммерчески доступный транс-Ь-гидроксипролин (500 мг, 3,81 ммоль) растворяют в 6N соляной кислоте (1 мл). Добавляют ледяную уксусную кислоту (1 мл), и полученный раствор охлаждают до 0°C на ледяной бане. Затем медленно добавляют ацетилхлорид (10 мл). Спустя несколько минут продукт получают путем осаждения посредством добавления эфира. Соединение (626 мг, 2,98 ммоль) в виде хлори-сто-водородной соли собирают фильтрацией, промывают эфиром, сушат и сразу используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
Промежуточное соединение 7. (28,4Я)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метоксипирролидин-2-карбоновоая кислота
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного соединения 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (425 мг, 0,5 ммоль 1) и промежуточного соединения 2 ((28,4Я)-4-метоксипирролидин-2-карбоновой кислоты) (1,5 ммоль). Целевой продукт получают после очистки флэш-хроматографией (428 мг, 1,0 ммоль).
Промежуточное соединение 8. (28,4Я)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фторпирролидин-2-карбоновая кислота
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного продукта 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (714 мг, 2,5 ммоль) и коммерчески доступной (28,4Я)-4-фторпирролидина-2-карбоновой кислоты (363 мг, 2,7 ммоль). Целевой продукт получают после очистки флэш-хроматографией (670 мг, 1,7 ммоль).
Промежуточное соединение 9. (28,48)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фенилпирролидин-2-карбоновая кислота
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного продукта 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (700 мг, 2,4 ммоль) и коммерчески доступной (28,48)-4-фенилпирролидин-2-карбоновой кислоты (608 мг, 2,7 ммоль). Целевой продукт получают после очистки флэш-хроматографией (700 мг, 1,5 ммоль).
Промежуточное соединение 10. (8)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4,4-
дифторпирролидин-2-карбоновая кислота
о °V-°H
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного продукта 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (260 мг, 0,9 ммоль) и промежуточного соединения 3 ((8)-4,4-дифторпирролидин-2-карбоновой кислоты (1,0 ммоль). Целевой продукт получают после очистки флэш-хроматографией (366 мг, 0,9 ммоль).
Промежуточное соединение 11. (28,48)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбоновая кислота
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного продукта 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (505 мг, 0,75 ммоль 1) и промежуточного соединения 4 ((28,48)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбоновой кислоты) (1,93 ммоль). Очистка флэш-хроматографией приводит к получению целевого продукта (537 мг, 1,24 ммоль).
Промежуточное соединение 12. (28,48)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метилпирролидин-2-карбоновая кислота
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного со- 18
единения 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (384 мг, 0,33 ммоль 1) и промежуточного соединения 5 ((28,48)-4-метилпирролидин-2-карбоновой кислоты) (1,47 ммоль). Целевой продукт получают после очистки флэш-хроматографией (342 мг, 0,85 ммоль).
Промежуточное соединение 13. (28,4Я)-1-(4-(Бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-ацетоксипирролидин-2-карбоновая кислота
Осуществляют получение в соответствии с методикой C, описанной выше, из промежуточного продукта 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (400 мг, 0,39 ммоль 1) и промежуточного соединения 6 ((28,4Я)-4-ацетоксипирролидин-2-карбоновой кислоты) (1,53 ммоль). Целевой продукт получают после очистки флэш-хроматографией (342 мг, 0,85 ммоль).
Промежуточное соединение 14. 4-Ацетокси-3,5-диметоксибензойная кислота
4-Гидрокси-3,5-диметоксибензойную кислоту (300 мг, 1,51 ммоль) растворяют в пиридине (732 мкл, 9,08 ммоль) при 0°C. К раствору по каплям с перемешиванием добавляют уксусный ангидрид (214 мкл, 2,27 ммоль). Смесь выдерживают на ледяной бане в течение 2 ч, после чего выливают в ледяную воду. Смесь экстрагируют DCM (3х), органическую фазу промывают 1N раствором HCl (3х), водой и насыщенным раствором соли, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают с получением 4-ацетокси-3,5-диметоксибензойной кислоты (266 мг, 0,10 ммоль 1).
Промежуточное соединение 15. 4-Бензоилокси-3,5-диметоксибензойная кислота
4-Гидрокси-3,5-диметоксибензойную кислоту (300 мг, 1,51 ммоль) растворяют в воде (6 мл) и затем последовательно добавляют изопропанол (2,5 мл) и карбонат калия (523 мг, 3,78 ммоль). Смесь выдерживают в атмосфере аргона и охлаждают до 0°C. Затем к смеси при энергичном перемешивании по каплям добавляют бензоилхлорид (185 мкл, 1,59 ммоль). В результате добавления образуется густой белый осадок. Смесь перемешивают в течение дополнительных 20 мин, после чего гасят добавлением 6М HCl, давая возможность реакционной смеси остыть. Твердое вещество собирают фильтрацией, промывают холодной водой и сушат с получением 4-бензоилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты в виде твердого белого вещества (401 мг, 1,33 ммоль).
Промежуточное соединение 16. 3,4-Дибензилокси-5-метоксибензойная кислота
Метил-3,4-дигидрокси-5-метоксибензоат (300 мг, 1,51 ммоль), карбонат калия (1,0 г, 7,3 ммоль) и йодид калия (161 мг, 0,97 ммоль) загружают в круглодонную колбу. К смеси добавляют ацетон (60 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют бензилхлорид (1,39 мл, 12,1 ммоль), и смесь кипятят с обратным холодильником при
перемешивании в течение 8 ч. После этого реакционную смесь оставляют охлаждаться до комнатной
температуры. Добавляют воду, и смесь трижды экстрагируют диэтиловым эфиром, органический экс-
тракт промывают насыщенным раствором соли, сушат и упаривают. Сырой продукт очищают флэш-
хроматографией, получая 377 мг (1,0 ммоль) очищенного продукта. После этого гидролиз полученного метилового эфира проводят в соответствии с методикой А, описанной выше, с получением 3,4-дибензилокси-5-метоксибензойной кислоты (144 мг, 0,4 ммоль).
Промежуточное соединение 17. 3,4-Дибензоилокси-5-метоксибензойная кислота
3,4-Дигидрокси-5-метоксибензойную кислоту (300 мг, 1,63 ммоль) растворяют в воде (6 мл), затем последовательно добавляют изопропанол (2,5 мл) и карбонат калия (1,13 г, 8,15 ммоль). Смесь выдерживают в атмосфере аргона и охлаждают до 0°C. Затем при энергичном перемешивании к смеси по каплям добавляют бензоилхлорид (388 мкл, 3,34 ммоль). Смесь перемешивают в течение дополнительных 20 мин, после чего гасят добавлением 6М HCl, и смеси дают охладиться. Затем смесь разбавляют AcOEt, и фазы разделяют. Органическую фазу последовательно промывают 1М раствором HCl и насыщенным раствором соли, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают. Очистка сырого продукта флэш-хроматографией приводит к получению 3,4-дибензоилокси-5-метоксибензойной кислоты в виде твердого белого вещества (548 мг, 1,40 ммоль).
Промежуточное соединение 18. 3-Ацетокси-4,5-диметоксибензойная кислота
3-Гидрокси-4,5-диметоксибензойную кислоту (300 мг, 1,51 ммоль) растворяют в пиридине (732 мкл, 9,08 ммоль) при 0°C. К раствору при перемешивании добавляют уксусный ангидрид (214 мкл, 2,27 ммоль). Смесь выдерживают на ледяной бане в течение 2 ч, после чего смесь выливают в ледяную воду. Смесь экстрагируют DCM (3х), органическую фазу промывают 1N раствором HCl (3х), водой (2х) и насыщенным раствором соли (2х), сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают с получением 3-ацетокси-4,5-диметоксибензойной кислоты (277 мг, 1,15 ммоль).
Промежуточное соединение 19. 3-Пивалоилокси-4,5-диметоксибензойная кислота
Раствор 3-гидрокси-4,5-диметоксибензойной кислоты (300 мг, 1,51 ммоль) и пиридина (244 мкл, 3,02 ммоль) в хлороформе (2 мл) перемешивают в течение 30 мин. К реакционной смеси по каплям добавляют раствор пивалоилхлорида (196 мкл, 1,59 ммоль) в хлороформе (2 мл) при комнатной температуре, и реакционную смесь перемешивают до завершения реакции в соответствии с ТСХ (примерно 3 ч). Затем реакционную смесь разбавляют DCM, добавляют 1М раствор HCl, и фазы разделяют. Органическую фазу последовательно промывают 1М раствором HCl (2х), водой и насыщенным раствором соли, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают. Очистка флэш-хроматографией приводит к получению 4-пивалоилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты (321 мг, 1,14 ммоль).
Промежуточное соединение 20. 4-Бензилокси-З-трифторметилбензойная кислота
4-Гидрокси-3-трифторметилбензойную кислоту (1,0 г, 4,9 ммоль) и карбонат калия (0,6 г, 11,6 ммоль) загружают в круглодонную колбу. К смеси добавляют DMF (10 мл), и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем к реакционной смеси добавляют бензил-хлорид (2,2 мл, 19,4 ммоль), и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4 ч. После этого реакционную смесь оставляют охлаждаться до комнатной температуры. К смеси добавляют воду, и смесь трижды экстрагируют этилацетатом (3х50 мл), органический экстракт промывают насыщенным раствором соли, сушат и упаривают. Сырой продукт очищают флэш-хроматографией, получая 1,3 г (3,4 ммоль) продукта. Затем проводят гидролиз бензилового эфира в соответствии с методикой А, описанной выше, с получением 4-бензилокси-3-трифторметилбензойной кислоты (320 мг, 1,1 ммоль). Промежуточное соединение 21. 4-Бензилокси-3-фторбензойная кислота
4-Гидрокси-3-фторбензойную кислоту (1,0 г, 6,4 ммоль), карбонат калия (2,7 г, 19,2 ммоль) и йодид калия (532 мг, 3,2 ммоль) загружают в круглодонную колбу. К смеси добавляют ацетон (140 мл), и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к смеси добавляют бензилбромид (3,8 мл, 32,0 ммоль), и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12 ч. После этого реакционную смесь оставляют охлаждаться до комнатной температуры. К смеси до
бавляют воду, и смесь трижды экстрагируют этилацетатом (3х50 мл), органический экстракт промывают насыщенным раствором соли, сушат и упаривают. Сырой продукт очищают флэш-хроматографией, получая 1,2 г (3,5 ммоль) продукта. Затем проводят гидролиз бензилового эфира в соответствии с методикой А, описанной выше, с получением 4-бензилокси-3-фторметилбензойной кислоты (612 мг, 2,5 ммоль).
Пример 1. (S)-1 -((2S,4R)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метоксипирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный ^)-пирролидин-2-карбонитрил (58 мг, 0,4 ммоль) и промежуточное соединение 7 ((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метоксипирролидин-2-карбоновую кислоту) (220 мг, 0,5 ммоль) подвергают реакции сочетания в соответствии с методикой D, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 10 мг (0,02 ммоль) конечного продукта.
Пример 2. (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фторпирролидина-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Исходя из коммерчески доступной амидной смолы Зибера (500 мг, 0,30 ммоль, 1 экв.), коммерчески доступного Fmoc-защищенного L-пролина (Fmoc-L-Pro-OH) (400 мг, 1,2 ммоль) и промежуточного соединения 8 ((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фторпирролидина-2-карбоновой кислоты) (239 мг, 0,60 ммоль) в соответствии с методикой E, описанной выше, получают сырой продукт. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 80 мг (0,17 ммоль) конечного продукта.
Пример 3. (S)-1 -((2S,4S)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фенилпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Исходя из коммерчески доступной амидной смолы Зибера (500 мг, 0,38 ммоль, 1 экв.), коммерчески доступного Fmoc-защищенного L-пролина (Fmoc-L-Pro-OH) (516 мг, 1,53 ммоль) и промежуточного соединения 9 ((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фенилпирролидин-2-карбоновой кислоты) (351 мг, 0,76 ммоль) в соответствии с методикой E, описанной выше, получают сырой продукт. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 16 мг (0,03 ммоль) конечного продукта.
Пример 4. (S)-1 -((2S)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Исходя из коммерчески доступной амидной смолы Зибера (250 мг, 0,19 ммоль, 1 экв.), коммерчески доступного Fmoc-защищенного L-пролина (Fmoc-L-Pro-OH) (258 мг, 0,77 ммоль) и промежуточного соединения 10 ((S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбоновой кислоты) (161 мг, 0,38 ммоль) в соответствии с методикой E, описанной выше, получают сырой продукт. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 18 мг (0,036 ммоль) конечного продукта.
Пример 5. (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Исходя из коммерчески доступной амидной смолы Зибера (50 0 мг, 0,38 ммоль, 1 экв.), коммерчески доступного Fmoc-защищенного L-пролина (Fmoc-L-Pro-OH) (516 мг, 1,53 ммоль) и промежуточного соединения 11 ((2S,4S)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбоновой кислоты) (330 мг, 0,76 ммоль) в соответствии с методикой E, описанной выше, получают сырой продукт. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 22 мг (0,043 ммоль) конечного продукта.
Пример 6. (S)-1 -((2S,4S)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метилпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Исходя из коммерчески доступной амидной смолы Зибера (300 мг, 0,18 ммоль, 1 экв.), коммерчески доступного Fmoc-защищенного L-пролина (Fmoc-L-Pro-OH) (247 мг, 0,73 ммоль) и промежуточного соединения 12 ((2S,4S)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метилпирролидин-2-карбоновой кислоты) (146 мг, 0,37 ммоль) в соответствии с методикой E, описанной выше, получают сырой продукт. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 10 мг (0,02 ммоль) конечного продукта.
Пример 7. (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-цианопирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (516 мг, 1,53 ммоль) и Вос-транс-4-циано^-пролин (368 мг, 1,53 ммоль) последовательно подвергают реакции сочетания с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (500 мг, 0,38 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. После выделения дипептида из смолы промежуточное соединение 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойную кислоту) (145 мг, 0,5 ммоль) подвергают реакции сочетания с полученным нитрилдипептидом в соответствии с методикой C, описанной выше, через образование хлорангидрида карбоновой кислоты. Очистка сырого продукта с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 11 мг (0,03 ммоль) конечного продукта.
Пример 8. (S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трифторметил)-пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,40 ммоль), (2S,4S)-Fmoc-4-трифторметил-пирролидин-2-карбоновую кислоту (162 мг, 0,40 ммоль) и промежуточное соединение 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойную кислоту) (115 мг, 0,40 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,10 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 13 мг (0,045 ммоль) конечного продукта.
Пример 9. (S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трет-бутокси)пирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,40 ммоль), Fmoc-4-трет-бутокси-L-пролин (164 мг, 0,40 ммоль) и промежуточное соединение 1 (4-бензилокси-3,5-диметоксибензойной кислоты) (115 мг, 0,4 0 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,10 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой Е, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 22 мг (0,076 ммоль) конечного продукта.
Пример 10. (S)-1 -((2S,4R)-1 -(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-ацетоксипирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Исходя из коммерчески доступной амидной смолы Зибера (165 мг, 0,10 ммоль, 1 экв.), коммерчески доступного Fmoc-защищенного L-пролина (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,40 ммоль) и промежуточного соединения 13 ((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-ацетоксипирролидин-2-карбоновой кислоты) (90 мг, 0,20 ммоль), в соответствии с методикой E, описанной выше, получают сырой продукт. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 6,2 мг (0,012 ммоль) конечного продукта.
Пример 11. (S)-1-((2S)-1-(4-ацетокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-
карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,40 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор-L-пролин (149 мг, 0,40 ммоль) и промежуточное соединение 14 (4-ацетокси-3,5-диметоксибензойную кислоту) (96 мг, 0,40 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,10 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 25 мг (0,054 ммоль) конечного продукта.
Пример 12. (S)-1 -((2S)-1 -(4-бензоилокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенные L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,4 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор^-пролин (149 мг, 0,4 ммоль) и промежуточное соединение 15 (4-бензоилокси-3,5-диметоксибензойную кислоту) (121 мг, 0,4 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,1 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 26 мг (0,051 ммоль) конечного продукта.
Пример 13. (S)-1 -((2S)-1 -(3,4-дибензилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,4 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор^-пролин (149 мг, 0,4 ммоль) и промежуточное соединение 16 (3,4-дибензилокси-5-метоксибензойную кислоту) (146 мг, 0,4 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,1 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 24 мг (0,041 ммоль) конечного продукта.
Пример 14. (S)-1 -((2S)-1 -(3,4-дибензоилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,4 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор^-пролин (149 мг, 0,4 ммоль) и промежуточное соединение 17 (3,4-дибензоилокси-5-метоксибензойную кислоту) (157 мг, 0,4 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,1 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 31 мг (0,052 ммоль) конечного продукта.
Пример 15. (S)-1 -((2S)-1 -(3-ацетокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-
карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,4 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор^-пролин (149 мг, 0,4 ммоль) и промежуточное соединение 18 (3-ацетокси-4,5-диметоксибензойную кислоту) (96 мг, 0,4 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,1 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 22 мг (0,048 ммоль) конечного продукта.
Пример 16. (S)-1 -((2S)-1 -(3-пивалоилокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (135 мг, 0,4 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор^-пролин (149 мг, 0,4 ммоль) и промежуточное соединение 19 (3-пивалоилокси-4,5-диметоксибензойную кислоту) (113 мг, 0,4 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (165 мг, 0,1 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой Е, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 19 мг (0,040 ммоль) конечного продукта.
Пример 17. (S)-1 -((S)-1 -(4-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (150 мг, 0,45 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор-L-пролин (166 мг, 0,45 ммоль) и 4-бензилоксибензойную кислоту (101 мг, 0,45 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (200 мг, 0,15 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 17 мг (0,038 ммоль) конечного продукта.
Пример 18. (S)-1-((S)-1-(3-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (150 мг, 0,45 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор-L-пролин (166 мг, 0,45 ммоль) и 3-бензилоксибензойную кислоту (101 мг, 0,45 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (200 мг, 0,15 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой Е, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 8 мг (0,018 ммоль) конечного продукта.
Пример 19. (S)-1 -((S)-1 -(2-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (150 мг, 0,45 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор-L-пролин (166 мг, 0,4 5 ммоль) и 2-бензилоксибензойную кислоту (101 мг, 0,45 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (200 мг, 0,15 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 5 мг (0,011 ммоль) конечного продукта.
Пример 20. (S)-1 -((S)-1 -(4-(бензилокси)-3 -(трифторметил)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (150 мг, 0,45 ммоль), Fmoc-4,4-дифтор-L-пролин (166 мг, 0,45 ммоль) и промежуточное соединение 20 (4-бензилокси-3-трифторметилбензойную кислоту) (132 мг, 0,45 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (200 мг, 0,15 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой Е, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 32 мг (0,061 ммоль) конечного продукта.
Пример 21. (S)-1-((S)-1 -(4-(бензилокси)-3 -фторбензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-
Коммерчески доступный Fmoc-защищенный L-пролин (Fmoc-L-Pro-OH) (150 мг, 0,45 ммоль),
карбонил)пирролидин-2-карбонитрил
Fmoc-4,4-дифтор-L-пролин (166 мг, 0,45 ммоль) и промежуточное соединение 21 (4-бензилокси-3-фторбензойную кислоту) (109 мг, 0,45 ммоль) последовательно связывают с коммерчески доступной амидной смолой Зибера (200 мг, 0,15 ммоль, 1 экв.) посредством постадийной реакции сочетания в соответствии с методикой E, описанной выше. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ приводит к получению 14 мг (0,030 ммоль) конечного продукта. Фармакологические данные.
Определение ингибирующего действия новых соединений в отношении активности (человеческой) пролилолигопептидазы.
Экспрессия и очистка пролилолигопептидазы (pop).
POP получают экспрессией в E.coli и аффинной очисткой с использованием His концевого слияния в соответствии с методикой, описанной в литературе (Tarrago Т. et al., Chem. Bio. Chem. 2006;7:827-33) и кратко изложенной ниже:
hPOP экспрессия.
Компетентные клетки E.coli BL21 трансформируют pETM10 hPOP. Для индуцирования экспрессии прекультуру LB среды (50 мл), содержащую канамицин (50 мкг мл), инокулируют одной колонией и выращивают в течение ночи при 37°C. На следующий день две культуры LB среды (500 мл) инокулируют ночной культурой (10 мл). Инокулированные культуры выращивают при 37°C и 220 об/мин до OD595 1/2 (2,5-3 ч). Затем добавляют IPTG (конечная концентрация 1 мМ), и индуцирование проводят в течение ночи при 25°C. Клетки собирают (3500 g, 15 мин, 4°C), клеточный осадок суспендируют в суспензионном буфере (50 мл) [Tris-HCl, pH 8 (50 мМ), NaCl, (300 мМ), имидазол (1 мМ)] и подвергают обработке ультразвуком, используя четыре цикла (каждый из которых состоит из ультразвуковой обработки в течение 15 с и перерыва в течение 15 с) при интенсивности 50% и 0,5 имп., оставляя образец на льду. После обработки ультразвуком образец центрифугируют (40000 g, 30 мин, 4°C), и супернатант используют непосредственно для очистки POP. Очистку проводят в системе AKTA explorer FPLC. Супернатант вносят при скорости потока 1 мл/мин в колонку HiTrapQuelating (5 мл), предварительно уравновешенную 5 колоночными объемами суспензионного буфера. Колонку промывают суспензионным буфером до тех пор, пока поглощение при 280 нм не вернется на базисный уровень. Затем колонку промывают 5 объемами буфера для промывки (50 мМ Tris-HCl, pH 8, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол). Элюирование проводят 4 объемами буфера для элюирования (50 мМ Tris-HCl, pH 8, 300 мМ NaCl, 500 мМ имидазол). Фракции (4 мл) собирают в течение всего элюирования. POP активность проверяют во всех фракциях, и фракции с положительной активностью анализируют с помощью SDS-PAGE и окрашивают красителем Biosafe Co-massie Stain G-250. Фракции с положительной активностью собирают и обессоливают с использованием обессоливающей колонки HiPrep 26/10 с Tris-HCl (50 мМ, pH 8) в качестве буфера. Рекомбинантную hPOP количественно определяют с использованием анализа Bio-Rad белка и BSA в качестве стандарта. Приготавливают аликвоты рекомбинантного фермента, немедленно замораживают их в жидком азоте и хранят при -80°C.
Анализы ингибирования POP.
POP активность определяют в соответствии с методом, описанным в публикации Toide et al. (Toide K et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995; 274:1370-8), с использованием Z-G-P-AMC (N-бензилоксикарбонил-Gly-Pro-метилкумаринил-7-амид) в качестве подложки для POP. Реакции проводят в 96-луночных микротитрационных планшетах, что позволяет одновременно контролировать множество реакций. Для каждой реакции буфер активности (134 мкл, 100 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 8,0) предварительно инкубируют в течение 15 мин при 37°C с hPOP (в интервале от 20 до 60 нм в зависимости от активности партии hPOP) и соответствующим раствором нового соединения (3 мкл). Исходный раствор нового соединения получают в ДМСО (100 мм), и разбавления получают из исходного раствора в ДМСО. Альтернативно, реакции проводят с использованием другого буфера активности (141 мкл, 100 мМ Tris-ацетат, 10 мМ BSA, 1 мМ DTT, pH 7,3), предварительно инкубируя с hPOP (10 нМ) и соответствующим раствором нового соединения (3 мкл) (условия b).
После предварительной инкубации добавляют Z-G-P-AMC (10 мкл, 3 мМ в 40%-ном 1,4-диоксане) (3 мкл, 1,5 мм в 40%-ном 1,4-диоксане, в условиях B), и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°C. Реакцию останавливают добавлением ацетата натрия (150 мкл, 1М, pH 4) и флуориметрически определяют образование AMC. Длины волн возбуждения и излучения равны 360/40 и 485/20 нм соответственно.
Для каждого соединения оценку проводят при нескольких концентрациях (в интервале от 25 пМ до 400 мкМ). Ингибиторную активность в отношении пролилолигопептидазы рассчитывают в соответствии с уравнением 1. Для каждого нового соединения измеряют флуоресценцию в присутствии (a) и в отсутствие (b) hPOP. Максимальную флуоресценцию (0% ингибирующей активности) получают из образца hPOP в отсутствие ингибирующих соединений. Для оценки ингибиторной активности новых соединений строят кривые активности в зависимости от логарифма концентрации соединения, корректируя их к сиг-моидальной кривой с использованием программного обеспечения GraphPad Prism, и из полученной кривой определяют значение IC50, которая равна концентрации соединения, необходимой для 50% ингиби-рования активности POP
где a соответствует интенсивности флуоресценции в присутствии смеси субстрат+тестируемое со-единение+hPOP;
b соответствует интенсивности флуоресценции в присутствии смеси субстрат+тестируемое соединение;
c соответствует интенсивности флуоресценции в присутствии смеси субстрат+hPOP; d соответствует интенсивности флуоресценции в присутствии субстрата.
Новые соединения проявляют высокую ингибирующую активность в отношении пролилолигопеп-тидазы человека. Результаты приведены в табл. 1.
Таблица 1
Ингибирование пролилолигопептидазы человека
Соединение (пример №)
1С50 (нМ)
63, 8
11,4
60, 4
10, 6
339, 0
138,5
48,7
20,3
175, 9
72, 0
13,1 (*)
7,3
176, 5
8,3
668, 1
327, 3
352
111
336
5600
2140
287, 3 (*)
135, 8
487, 3 (*)
16, 8
255,4(*)
34, 2
4,5(*)
0, 02
(*) Измерено в условиях b.
Ингибиторная активность в отношении родственных пролинспецифических протеаз.
В данном анализе определяют ингибиторное действие новых соединений в отношении дипептидил-пептидазы IV (DPPIV). Испытания проводят в соответствии с описанной выше методикой определения ингибирующей активностью в отношении пролилолигопептидазы с использованием G-P-AMC (H-Gly-Pro-метилкумаринил-Т-амид) в качестве подложки. После предварительного инкубирования DPPIV с буфером активности и соответствующим раствором соединения добавляют G-P-AMC (10 мкл, 750 мкМ в 40%-ном 1,4-диоксане), и реакционную смесь инкубируют в течение 20 мин при 37°C. Реакцию останавливают добавлением ацетата натрия (150 мкл, 1М, pH 4) и флуориметрически определяют образование AMC. Для каждого соединения измерения проводят при нескольких концентрациях (в диапазоне от 100 до 400 мкМ). Ингибиторную активность в отношении DPPIV рассчитывают в соответствии с уравнением 1. Ни одно из новых соединений не показывает ингибиторной активности в отношении дипептидилпеп-тидазы IV (значения IC50 более 400 мкМ), и, следовательно, данные соединения являются специфическими ингибиторами POP.
Кроме того, ингибиторную активность новых соединений определяют в отношении белка активации фибробластов (FAP). Испытание проводят аналогично с методикой, описанной выше для определения ингибирующей активности в отношении POP. Z-G-P-AMC используют в качестве подложки в конечной концентрации 100 мкМ. В анализах используют буфер, включающий 50 мМ Tris, 1M NaCl, 1 мг/мл BSA, pH 7,5. Рекомбинантный человеческий FAP используют в исходной концентрации 2 мкг/мл в буфере активности, что приводит к конечной концентрации 0,1 мкг/мл в анализе. Для каждого нового соединения приготавливают исходные растворы в ДМСО при 20 мМ и их разбавляют. После предварительной инкубации FAP с буфером активности и соответствующим раствором нового соединения при 37°C в течение 15 мин добавляют подложку (50 мкл, 100 мкМ в буфере активности), и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°C. Реакцию останавливают добавлением ацетата натрия (150 мкл, 1М, pH
4), и флуориметрически количественно определяют образование AMC. Для каждого соединения измерения проводят при нескольких концентрациях (в диапазоне от 100 до 400 мкМ). Ингибиторную активность в отношении FAP рассчитывают в соответствии с уравнением 1. Ни одно из новых соединений не проявляет ингибиторной активности в отношении FAP (значения IC50 превышают 400 мкМ), и, следовательно, данные соединения являются специфическими ингибиторами POP. Определение свойств проницаемости соединений.
Определение проницаемости через параллельные искусственные мембраны (РАМРА).
Для определения способности соединений проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) проводят анализ проницаемости через параллельные искусственные мембраны (РАМРА), описанный в публикации Kansy M. et al., J. Med. Chem. 1998; 47(7):1007-10, посредством пассивной диффузии (Di L. et al., Eur. J. Med. Chem. 2003; 38(3):223-32). Эффективную проницаемость (Pe) соединений определяют при начальной концентрации 200 мкМ. Буферный раствор приготавливают из коммерческого концентрированного раствора в соответствии с инструкцией производителя. Значение pH доводят до 7,4 с помощью 0,5М раствора NaOH. Исходный раствор нового соединения получают в ДМСО и разбавляют буферным раствором до конечной концентрации 200 мкМ (содержание 0,5% ДМСО). РАМРА "сэндвич" разделяют, и каждую донорную лунку заполняют 200 мкл раствора соединения. Акцепторный планшет помещают в донорский планшет, обеспечивая контактирование нижней стороны мембраны с буфером. 4 мкл смеси фосфолипидов (20 мг/мл) в додекане добавляют на фильтр каждой лунки, и 200 мкл буферного раствора добавляют в каждую акцепторную лунку. Планшет закрывают и инкубируют при комнатной температуре в атмосфере с насыщенной влажностью в течение 4 ч при орбитальном перемешивании со скоростью 100 об/мин. Спустя 4 ч содержание акцепторных и донорных отделений анализируют с помощью ВЭЖХ. 150 мкл из каждой лунки донорного планшета и 150 мкл из каждой лунки акцепторного планшета переносят в ВЭЖХ-флаконы, впрыскивая каждый образец в хроматографическую Ci8 колонку (150 ммх4,6
ммх5 мкм, 100 А) с обращенной фазой (100 мкл/впрыск из акцепторных лунок, 10 мкл/впрыск из донорских лунок и для t0 в качестве исходных условий). Перемещение также подтверждают MALDI-TOF спектрометрией.
Используемая фосфолипидная смесь представляет собой полярный липидный экстракт мозга свиней от Avanti polar lipids следующего состава: 12,6% фосфатидилхолина (PC), 33,1% фосфатидилэтано-ламина (РЕ), 18,5% фосфатидилсерина (PS), 4,1% фосфатидилинозитола (PI), 0,8% фосфатидной кислоты и 30,9% других соединений.
Эффективную проницаемость (Pe) спустя 4 ч рассчитывают с использованием уравнения 2, и процент переноса рассчитывают с использованием уравнения 3
Ре= xlog
С (t)
ТО = -44x100 (Уравнение 3)
где
t представляет собой время (час);
CA(t) представляет собой концентрацию соединения в акцепторной лунке в момент времени t; и CD(t0) представляет собой концентрацию соединения в донорной лунке при t0.
Исходя из индикативных значений Pe, представленных в табл. 2, новые соединения показывают хорошую проницаемость через ГЭБ (табл. 3).
Влияние новых соединение на функцию обучения и памяти в исследовании на животной модели с нарушением когнитивных функций.
Новые соединения оценивают на их эффективность в качестве соединений, улучшающих когнитивные функции, в фармакологической модели нарушений когнитивных функций. Влияние новых соединений оценивают на грызунах (мышах или крысах), необработанных и обработанных MK-801. MK-801 представляет собой неконкурентный антагонист рецептора №метил^-аспартата (NMDA), который ухудшает деятельность животных в различных парадигмах обучения и памяти (Castellano С. et al., Curr. Drug Targets 2001; 2:273-83.; Riedel G. et al., Behav. Brain Res. 2003; 140:1-47). MK-801 также оказывает различное воздействие на поведение грызунов, включая недостаточность обработки сенсорной информации, гипермотильность, стереотипию и атаксию. Поведенческий фенотип, вызванный введением MK-801, широко используется в качестве животной модели когнитивных нарушений (Bardgett M.E. et al., Brain Res. Bull. 2003; 60: 131-42; Van der Staay F.J. et al., Behav. Brain Res. 2011; 220:215-29; Mutlu O. et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 2011; 99:557-65).
Для определения способности испытываемых соединений воздействовать в качестве усилителя когнитивных функций их способность восстанавливать нормальное когнитивное поведение анализируют с помощью широко известных тестов, таких как тест распознавания новых объектов (Dere E. et al., Neurosci. Biobehav. Rev. 2007; 31:673-704; Boess F.G. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007; 321:716-25); тест пассивного или ингибиторного избегания (Sarter M. et al., Psychopharmacology (Berl) 1992; 107:144-59); водный лабиринт Морриса (D'Hooge R. et al., Brain Res. Rev. 2001; 36:60-90) и задача альтернации (чередования) выбора в T-лабиринте (Boess F.G. et al., Neuropharmacology 2004; 47:1081-92; Spowart-Manning L. et al., Behav. Brain Res. 2004; 151:37-46).
В качестве типичного примера оценки новых ингибиторов POP описана методика каждого из поведенческих тестов, а также результаты, полученные в тесте распознавания нового объекта и тесте пассивного избегания.
Задача распознавания нового объекта.
Задача распознавания нового объекта (NOR) основана на природном предпочтении грызунов новых объектов (Ennaceur A. et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59). Она является релевантным тестом без вознаграждения для изучения недостаточности визуального обучения и памяти. Кратко, методика NOT теста включает три испытания: привыкание, тренинг и сохранение в памяти приобретенной информации. Каждое животное в течение 10 мин приучают к круглой арене диаметром 40 см в отсутствии объектов (сеанс привыкания). На следующий день животное помещают на 10 мин в круглую арену для тренинга, и два идентичных объекта (предмета) размещают в симметричном положении. Эту стадию выполняют в течение двух дней подряд. На третий день один из объектов заменяют на иной. Объект, не используемый в тренинге, используют в качестве нового предмета в испытании сохранения приобретенной информации. После этого животным дают возможность свободного исследования объектов в течение 10 мин, а время, потраченное на изучение каждого объекта, записывают. Ожидается, что животное потратит больше времени на изучение нового объекта, и это является признаком неизмененной памяти распознавания. Показатель распознавания рассчитывают следующим образом: время, затраченное на изучение нового предмета, за вычетом времени, затраченного на старый предмет, делят на общее время исследования обоих предметов, и результат умножают на 100. Считается, что больший показатель распознавания соответствует большему сохранению данных в памяти.
Соответствующий испытываемый POP ингибитор, свежерастворенный в 5%-ном растворе Tween 80
в PBS, вводят подкожно (s.c.) в дозе 5 мг/кг в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела животного. Спустя 15 мин MK-801, растворенный в PBS буфере, вводят интраперитонеально (i.p.) в дозе 0,2 мг/кг в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела животного. Контрольной группе вводят i.p. MK-801 и s.c. такой же объем наполнителя (PBS с 5% Tween 80). Другой контрольной группе вводят i.p. PBS и такой же объем наполнителя s.c. Дозы лекарственных средств выбирают в соответствии с поведенческими и нейрохимическими исследованиями, показывая, что эти лекарственные средства обладают предполагаемым действием.
Животным вводят два лекарственных средства ежедневно в течение всего периода тренинга, а также перед сеансом тестирования.
Результаты, полученные при введении соединения примера 4 в качестве типичного соединения по изобретению, представлены на фиг. 1.
Как продемонстрировано посредством соединения примера 4, соединения по изобретению способны восстанавливать MK-801-индуцированное ухудшение памяти в NOR-тесте.
Тест пассивного избегания.
Для оценки испытания с использованием задания пассивного избегания используют бокс с двумя отсеками одинакового размера, один из которых является темным, другой светлым. Два отсека разделены опущенной дверью, которая может подниматься. В данном тесте используется устройство, соответствующее стандартным методикам. Проводят один шоковый сеанс и сеанс оценки с интервалом 24 ч. В шоковом сеансе грызуна помещают в светлый отсек. После периода аккомодации продолжительностью 20 с опущенную дверь в другой отсек поднимают и опускают как только грызун входит в темный отсек. После этого грызуну наносят слабые удары по ногам. Грызуна удаляют из устройства через 60 с после прекращения введения ударов и помещают обратно в его домашнюю клетку. В сеансе оценки измеряют время, которое тратит животное для входа в темный отсек (в секундах), в качестве показателя сохранения памяти об ударе, полученном в темном отсеке во время предыдущего сеанса. Второй сеанс оценки проводят через неделю после первого шокового сеанса. Соответствующее испытываемое соединение вводят подкожно за 35 мин до шокового сеанса, а затем спустя 15 мин i.p. вводят MK-801 или PBS в случае контрольной группы, в одинаковых дозах и объемах, как описано в тесте распознавания нового объекта. Животные, получавшие только MK-801, показывают небольшое сохранение памяти шокового сеанса, в то время как животные, которые дополнительно получают ингибитор POP, показывают больший латентный период входа в темный отсек, что говорит о лучшем сохранении данных в памяти.
Результаты, полученные при введении соединения примера 4 в качестве типичного соединения по изобретению, представлены на фиг. 2.
Как продемонстрировано посредством соединения примера 4, соединения по изобретению способны восстановить ухудшение памяти, вызванное MK-801 в тесте пассивного избегания.
Водный лабиринт (тест аварийного выхода Морриса).
Действия животных в тесте Морриса (выход из воды) оценивают в соответствии со стандартными для данного испытания методиками и размерами в резервуаре, заполненном водопроводной водой, окрашенной латексом, при температуре приблизительно 22°C. Платформа аварийного выхода состоит из серого полиэтиленового цилиндра, погруженного на 1,5 см ниже поверхности воды. Соответствующий оцениваемый POP ингибитор вводят s.c. за 35 мин до сеанса тренировки и испытания с последующим введением через 15 мин i.p. МК-801 или PBS в случае контроля в одинаковой дозе и объеме, как описано в тесте распознавания предмера. Животным вводят два соединения каждый день в течение сеанса тренировки, а также в сеансах оценки.
Грызуны получают по две серии тренировочных сеансов в течение трех дней подряд с интервалом в два дня между двумя сериями. Каждый сеанс тренинга состоит из двух серий по три испытания, которые проводятся подряд. Исследование начинают размещением грызуна в бассейне в направлении к стенке резервуара. Используют четыре стартовых позиции (север, восток, юг, запад) в рандомизированном порядке. Платформа аварийного выхода остается в одном и том же квадранте. Исследование прекращают, как только животное забирается на платформу аварийного выхода или спустя 60 с, в зависимости от того, какое событие происходит первым. После того как грызуны достигают платформы аварийного выхода, их оставляют на платформе 30 с, чтобы дать возможность животным ассоциировать платформу аварийного выхода с определенным положением в резервуаре. После этого животное забирают с платформы и начинают следующее испытание. Если животное не находит платформу в течение 60 с, экспериментатор размещает его на платформе и оставляет на 30 с. Во время первого сеанса тренинга для обозначения положения платформы помещают визуальную подсказку. Эту подсказку удаляют в следующих сеансах. В процессе тренинговых сеансов записывают время задержки достижения платформы.
На следующий день после завершения второй серии тренинговых сеансов проводят оценку: платформу удаляют и в течение 60 с определяют время, которое грызун проводит в квадранте бассейна, где была расположена платформа во время тренинговых сеансов (целевой квадрант). В пробном испытании всех животных выпускают из одного и того же исходного положения, противоположного целевому квадранту. Животные, обработанные MK-801, не способны эффективно обучаться и вспоминать, где находилась платформа, что показано большими расстояниями, которые проплывают животные, и более длительным латентным периодом достижения аварийного выхода, а также временем, проводимым живот
ными в целевом квадранте, которое является примерно средним по сравнению со временем, проводимым ими на других квадрантах. Животные, обработанные МК-801 и соответствующим ингибитором POP, показывают лучшую эффективность в тесте, запоминая положение платформы (что отражается более высоким процентом времени, проведенным в целевом квадранте), показывая таким образом, что действие MK-801 эффективно реверсируется. Животных оставляют отдыхать в течение недели и после этого обучают в течение 4 дополнительных дней. На пятый день платформу удаляют, и проводят второе испытание.
Задача альтернации T-лабиринта.
Рабочую память тестируют с помощью задачи альтернации входа в T-лабиринт. Эксперименты проводят в T-образном лабиринте, изготовленном из дерева и окрашенном в черный цвет, в соответствии со стандартными размерами и методикой. Боковые проходы отделяются от главного прохода подвижными дверями. За неделю до начала привития навыков всех животных частично ограничивают в пище и оставляют в таком состоянии до конца эксперимента для сохранения массы тела животных на уровне 85% от их массы тела при свободном доступе к корму. Видеокамеру располагают над T-образном лабиринтом на высоте ~1 м для видеозаписи тестовой сессии. T-лабиринт очищают между внесением разных животных, но не между различными испытаниями одного животного. Полный эксперимент состоит из трех частей: привитие навыков, тренинг и тестирование. Во время периода привития навыков всех животных помещают в T-образный лабиринт, пока они не съедят два куска пищи или не пройдет 90 с. Это повторяют три раза в день в течение 5 дней. Во время тренинга всех животных подвергают испытанию шесть раз в день. Каждое испытание состоит из двух прогонов: принудительного прогона и свободного пробега. При принудительном прогоне грызунов вынуждают получить кусок пищи из одного целевого рукава T-образного лабиринта, вход в другой целевой рукав блокируют дверью. Животных помещают обратно в исходный рукав и задерживают на 10 с. В начале свободного пробега животным позволяют выбрать рукав. Если животные выбирают рукав, противоположный тому, в который их загоняли во время принудительного прогона, они получают пищевое вознаграждение. Если животные выбирают рукав, в который их загоняли, они не получают никакого пищевого вознаграждения. Интервал между испытаниями составляет 5 мин. Период обучения заканчивают после того, как контрольные животные делают > 70% правильных вариантов в течение 2 дней подряд. Животным требуется 7-12 дней для достижения этого критерия. Животные, которые не достают этого критерия в течение 14 дней, исключаются из исследования. После этого грызунов испытывают с 10- или 40-секундными интервалами задержки. Животных испытывают с тремя 10-секундными задержками и тремя 40-секундными задержками в течение дня тестирования. Для тестирования лекарственного средства грызунов испытывают шесть раз с 10-секундной задержкой спустя 15 мин после воздействия лекарственного средства. Последовательность задержек и расположений принудительного получения корма (влево или вправо) каждый день рандоми-зируют, пока одна и та же задержка или одно и то же расположение рукава принудительного прогона не используется три раза подряд. Целевые входы определяют как размещение всех четырех лап в рукаве.
Соответствующий испытываемый POP ингибитор вводят s.c. за 35 мин до сеанса испытания, а затем через 15 мин i.p. вводят инъекцию MK-801 или PBS в случае контроля в тех же дозах и объеме, которые описаны в тесте распознавания объекта.
Контрольные животные показывают кривые обучения с почти случайным уровнем поведения (примерно 50% правильных входов в рукав) между 1 и 4 днями тренинга, постепенное улучшение в промежутке между 11 и 14 днями тренинга до достижения "плато" 70% правильных входов в рукав. Поведение остается стабильным при испытаниях с 10- и 40-секундными задержками. Животные, обработанные MK-801, не могут эффективно научиться чередованию и показывают поведение ниже случайного уровня в испытаниях с задержками. Животные, обработанные MK-801 и соответствующим POP ингибитором, показывают лучшую производительность в данном испытании с кривыми обучения, аналогичными кривым контрольных животных, и сохранения памяти в испытаниях с задержками, показывая таким образом, что действие MK-801 эффективно реверсируется.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение формулы (I)
(I)
где R1, R2, R3 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из C1-4 алкокси, C1-4 алкилкарбонилокси, бензилокси, фенилкарбонилокси, трифторметила, галогена и водорода;
R5 выбран из группы, состоящей из галогена, нитрила, C1-4 алкокси, C1-4 алкилтио, C1-4 алкила, фе
нила и трифторметила;
R6 выбран из группы, состоящей из водорода и фтора;
или его фармацевтически приемлемая соль, энантиомеры и диастереоизомеры.
2. Соединение по п.1, где R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, трифторметила и C1-4 алкокси.
3. Соединение по п.2, где R2 выбран из группы, состоящей из водорода и метокси, и R4 выбран из группы, состоящей из фтора, трифторметила и метокси.
4. Соединение по любому из пп.1-3, где R3 представляет собой бензилокси.
5. Соединение по любому из пп.1-4, где R5 представляет собой фтор.
6. Соединение по любому из пп.1-5, где R6 представляет собой водород или фтор.
7. Соединение по п.1, где указанное соединение выбрано из следующих соединений:
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метоксипирролидин-2-карбонил)пирро-
лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фторпирролидин-2-карбонил)пирроли-дин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-фенилпирролидин-2-карбонил)пирроли-дин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(метилтио)пирролидин-2-карбонил)пир-ролидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-метилпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-цианопирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трифторметил)пирролидин-2-карбо-нил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-(трет-бутокси)пирролидин-2-карбо-нил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(бензилокси)-3,5-диметоксибензоил)-4-ацетоксипирролидин-2-карбонил)пир-ролидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(4-ацетокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(4-бензоилокси-3,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(3,4-дибензилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(3,4-дибензоилокси-5-метоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(3-ацетокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((2S)-1-(3-пивалоилокси-4,5-диметоксибензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((S)-1-(4-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонит-
рил;
(S)-1-((S)-1-(3-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонит-
рил;
(S)-1-((S)-1-(2-(бензилокси)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонит-
рил;
(S)-1-((S)-1-(4-(бензилокси)-3-(трифторметил)бензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирро-лидин-2-карбонитрил;
(S)-1-((S)-1-(4-(бензилокси)-3-фторбензоил)-4,4-дифторпирролидин-2-карбонил)пирролидин-2-карбонитрил;
или его фармацевтически приемлемая соль, энантиомеры и диастереоизомеры.
8. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 или его фармацевтически при-
емлемой соли, энантиомеров и диастереоизомеров, который включает
a) взаимодействие соединения формулы (IX)
(XI)
с получением соединения формулы (XII)
где R1, R2, R3, R4, R5 и R6 определены выше в формуле (I), с соединением формулы (XI)
где полимер в соединениях формул (XI) и (XII) представляет собой низший сшитый полистирол и полиэтиленгликоль - привитый полистирол;
b) гидролиз соединения формулы (XII) с получением соединения формулы (XIV)
c) превращение карбоксамидной группы соединения формулы (XIV) в нитрильную группу в подходящих условиях с получением соединения формулы (I);
где стадии b) и c) могут осуществляться раздельно или в одном реакторе.
9. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли, энантиомеров и диастереоизомеров, который включает взаимодействие соединения формулы (IX)
где R1, R2, R3, R4, R5 и R6 определены выше в формуле (I), с соединением формулы (IV)
10. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения и/или профилактики когнитивного расстройства, содержащая по меньшей мере одно соединение формулы (I) по любому из пп.1-7 или
его фармацевтически приемлемую соль, энантиомеры и диастереоизомеры и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
11. Применение соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 для лечения и/или профилактики когнитивного расстройства.
12. Применение по п.11, где когнитивное расстройство представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
13. Способ лечения или профилактики когнитивных расстройств у млекопитающего, где терапевтическое количество соединения по любому из пп.1-7 вводится пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
14. Способ по п.13, где когнитивное расстройство, представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
15. Применение соединения формулы (I) по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики когнитивного расстройства.
16. Применение по п.15, где когнитивное расстройство представляет собой когнитивное расстройство, связанное с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного аффективного расстройства, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
028422
028422
- 1 -
- 1 -
(19)
028422
028422
- 1 -
- 1 -
(19)
028422
028422
- 1 -
- 1 -
(19)
028422
028422
- 1 -
- 1 -
(19)
028422
028422
- 4 -
- 3 -
028422
028422
- 15 -
028422
028422
028422
028422
- 19 -
- 19 -
028422
028422
028422
028422
- 24 -
028422
028422
- 27 -
- 27 -
028422
028422
- 33 -
- 33 -
028422
028422
- 33 -
- 33 -