|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ выделения фракции нативного картофельного белка из картофельного сока, включающий следующие этапы: a) доведение рН картофельного сока до 4,0-6,5; b) приведение картофельного сока в контакт с функционализированным пористым носителем, в котором по меньшей мере 90% пор имеют диаметр от 10 до 200 нм, причем указанный носитель функционализирован гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa от 2,5 до 5, при этом указанный лиганд связан с указанным носителем через атом S или O; c) десорбция фракции картофельного белка из функционализированного пористого носителя путем элюирования. 2. Способ по п.1, дополнительно включающий этап концентрирования и/или сушки указанной фракции картофельного белка. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование проводят при рН от 5,7 до 8,9. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что фракция картофельного белка представляет собой фракцию пататина. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование проводят при значении рН выше 9 или ниже 3. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фракция картофельного белка представляет собой фракцию ингибитора протеазы. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что элюирование проводят с водным буфером. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что смешанный лиганд выбран из группы замещенных бензойных кислот, салициловых кислот, никотиновых кислот и нафтойных кислот, при этом замещение представляет собой замещение по доступному положению кольца группой (CH 2 ) n -XH, где n=0-4 и X=S. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что носитель представляет собой пористый синтетический полимер, пористый полисахарид, пористый неорганический материал или любую их комбинацию. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что гидрофобный смешанный лиганд присоединен к носителю через спейсер, который связан с носителем через атом О или S и не содержит азотсодержащих функциональных групп. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что рН картофельного сока регулируют с помощью кислоты и/или основания. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что картофельный сок подвергают предварительной обработке, включающей абсорбцию примесей на силикате слоистой структуры и/или активированном угле и/или флокуляцию.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ выделения фракции нативного картофельного белка из картофельного сока, включающий следующие этапы: a) доведение рН картофельного сока до 4,0-6,5; b) приведение картофельного сока в контакт с функционализированным пористым носителем, в котором по меньшей мере 90% пор имеют диаметр от 10 до 200 нм, причем указанный носитель функционализирован гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa от 2,5 до 5, при этом указанный лиганд связан с указанным носителем через атом S или O; c) десорбция фракции картофельного белка из функционализированного пористого носителя путем элюирования. 2. Способ по п.1, дополнительно включающий этап концентрирования и/или сушки указанной фракции картофельного белка. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование проводят при рН от 5,7 до 8,9. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что фракция картофельного белка представляет собой фракцию пататина. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование проводят при значении рН выше 9 или ниже 3. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фракция картофельного белка представляет собой фракцию ингибитора протеазы. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что элюирование проводят с водным буфером. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что смешанный лиганд выбран из группы замещенных бензойных кислот, салициловых кислот, никотиновых кислот и нафтойных кислот, при этом замещение представляет собой замещение по доступному положению кольца группой (CH 2 ) n -XH, где n=0-4 и X=S. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что носитель представляет собой пористый синтетический полимер, пористый полисахарид, пористый неорганический материал или любую их комбинацию. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что гидрофобный смешанный лиганд присоединен к носителю через спейсер, который связан с носителем через атом О или S и не содержит азотсодержащих функциональных групп. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что рН картофельного сока регулируют с помощью кислоты и/или основания. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что картофельный сок подвергают предварительной обработке, включающей абсорбцию примесей на силикате слоистой структуры и/или активированном угле и/или флокуляцию.
Евразийское 028415 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201491988
(22) Дата подачи заявки
2013.07.10
(51) Int. Cl.
A23J1/00 (2006.01) A23J3/00 (2006.01) A23J3/14 (2006.01)
(54) ИЗОЛЯТЫ КАРТОФЕЛЬНОГО БЕЛКА
(31) 12175944.3
(32) 2012.07.11
(33) EP
(43) 2015.06.30
(86) PCT/NL2013/050522
(87) WO 2014/011042 2014.01.16
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КООПЕРАТИ АВЕБЕ Ю.А. (NL)
(72) Изобретатель:
Джузеппин Марко Луиджи Федерико, Лаус Марк Кристиан, Шиппер Ян
(NL)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) WO-A1-2008069651 WO-A1-2008056977 EP-A1-1920662 WO-A1-2008069650
(57) Изобретение относится к способу получения фракции картофельного белка с применением конкретного абсорбента. В частности, изобретение относится к материалу-носителю, который содержит конкретный полимерный материал, функционализированный подходящими лигандами. При применении функционализированного носителя в соответствии с настоящим изобретением возможно получение фракции картофельного белка с более высокой эффективностью.
Область техники
Изобретение относится к области пищевых белков, в частности к выделению фракции картофельного белка.
Уровень техники
Свежий картофельный сок представляет собой сложную смесь растворимых и нерастворимых веществ. Он имеет высокое содержание белков и дополнительно содержит остаточный крахмал, минеральные вещества, токсичные гликоалкалоиды и мономерные и полимерные активные фенолы. Картофельный сок представляет собой побочный продукт производства картофельного крахмала и обычно считается отходами.
Картофельный сок содержит относительно высокое количество белков, до 1,5 мас.%. Их можно разделить на три группы: (i) фракция высокогомологичных кислотных гликопротеинов с высокой молекулярной массой (ВММ) 43 кДа (40-50 мас.% от всех картофельных белков), (ii) основная фракция с низкой молекулярной массой (НММ), 5-25 кДа, содержащая гликопротеины (30-40 мас.% от всех картофельных белков) и (iii) другие белки (10-20 мас.% от всех картофельных белков). Пататин представляет собой семейство гликопротеинов, обладающих липидацилгидролазной и трансферазной активностью, и преимущественно входит в состав фракции ВММ. Фракция НММ обычно содержит ингибиторы протеа-зы и другие белки, как правило, имеющие низкую молекулярную массу.
Несмотря на то что картофельный сок рассматривается как отходы, питательные качества картофельных белков выше, чем у казеина, и сравнимы с питательными качествами цельного яйца. Картофельные белки богаты лизином и теоретически являются прекрасным дополнением к бедным лизином белкам, таким как белки злаков. Несмотря на свои уникальные питательные свойства картофельный белок в настоящее время применяется только в качестве корма для животных, поскольку доступные продукты обладают рядом серьезных недостатков.
Одним из основных недостатков является то, что выделение картофельных белков в нативной форме затруднительно. Получение картофельного белка из отходов с мельниц картофельного крахмала обычно проводят в промышленном масштабе путем тепловой коагуляции, что приводит к получению денатурированного картофельного белка. Белки в денатурированной форме лишены таких желательных функциональных свойств, как эмульгирующая способность, пенообразующая способность, способность образовывать гель при нагревании, способность связывать воду и тому подобное. При этом невозможно обеспечить даже самое важное требование для их применения в пищевой промышленности, а именно растворимость в воде.
Предыдущие попытки выделить белки из картофельного сока более мягкими способами, такими как мембранная фильтрация и осаждение, оказались неэффективными при производстве в промышленном масштабе. Это обусловлено сильным засорением мембраны и соответствующим уменьшением потока и разделяющей способности. Кроме того, такие способы не позволяют разделять различные классы белков, присутствующие в картофельном соке. Например, с помощью мембранной фильтрации нельзя отделить белковый продукт с высокой молекулярной массой от полимеризованных фенольных соединений или полисахаридов, так как мембрана будет иметь тенденцию удерживать и то, и другое.
Нативные картофельные белки выделяли в промышленности ранее. В WO 2008/069650, заявитель Cooperatie Avebe U.A., предложен способ выделения изолятов нативных картофельных белков с низким содержанием гликоалкалоидов. Данный способ включает флокуляцию и последующую абсорбцию с расширенным слоем абсорбента с обеспечением абсорбции картофельных белков абсорбентом, а затем элюирование изолята нативного картофельного белка. Однако этот способ является дорогостоящим, а смешанные лиганды, применяемые при абсорбции с расширенным слоем абсорбента, относительно неустойчивы в картофельном соке.
В WO 2008/092450, заявитель Upfront Chromatography, предложен способ крупномасштабного фракционирования и выделения картофельных белков с применением лигандов и фракционирования на основе рН. Однако было обнаружено, что лиганды чувствительны к окислительным процессам в картофельном соке, а добавление сульфита хотя и уменьшает эту проблему, но полностью ее не устраняет. Относительно быстрое окислительное разложение лигандов остается проблемой. Кроме того, нет упоминаний о влиянии пористости на абсорбционную способность, так что абсорбционная способность варьируется в очень значительной степени для различных абсорбентов. По этой причине многие из лигандов, упомянутых в этой публикации, совсем не подходят для выделения картофельных белков в устойчивом режиме в экономически эффективных промышленных масштабах.
Таким образом, по-прежнему существует потребность в улучшенном способе выделения фракции нативного картофельного белка. Настоящее изобретение относится к обнаружению того факта, что каждый фактор, выбранный из природы лигандов, применяемых в абсорбенте, средств связывания лигандов с этим абсорбентом, а также пористости абсорбента оказывает сильное влияние на эффективность абсорбции картофельных белков. Таким образом, предложен оптимизированный способ выделения фракции нативного картофельного белка.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу выделения фракции нативного картофельного белка. В
частности, предложен способ фракционирования картофельных белков по изоэлектрической точке, позволяющий выделить две фракции, а именно фракцию с высокой молекулярной массой и фракцию с низкой молекулярной массой. Указанные фракции можно получать без примесей, и, таким образом, не требуется последующая очистка для удаления окрашенных соединений.
Описание графических материалов
Фиг. 1. Структурные формулы лигандов Streamline Direct CST1 (CST1), функционализированного 4-меркаптобензойной кислотой Sepabead HFA (HFA MBA) и 4-меркаптобензойной кислотой Sepabead ЕР (ЕР МВА). Носитель (support carrier) представлен в виде круга с заливкой.
Фиг. 2. Окраска функционализированного носителя в ускоренном испытании на загрязнение после инкубации 3x24 ч с нестабилизированным картофельным плодовым соком (не содержащим сульфита) а) с кислотными лигандами 1-12 и b) с лигандами Streamline Direct CST1 и Sepabead HFA с 4МВА.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу выделения фракции нативного картофельного белка из картофельного сока, включающему а) доведение рН картофельного сока до 4,0-6,5; b) приведение картофельного сока в контакт с пористым функционализированным носителем (support carrier), в котором по меньшей мере 90% пор имеют диаметр пор между 10 и 200 нм, и причем указанный носитель функцио-нализирован гидрофобными смешанными лигандами, имеющими значение pKa 2,5-5, предпочтительно 4-5, при этом лиганд соединен с носителем через атом S или О, предпочтительно тиоэфирной группы; с) десорбцию фракции картофельного белка с указанного функционализированного носителя путем элюи-рования и d) необязательно, концентрирование и/или сушку фракции картофельного белка.
Для настоящего изобретения под картофельным соком следует понимать жидкость любого вида, полученную из картофеля, содержащую значительное количество нативных картофельных белков, включая, среди прочего, картофельный плодовый сок (КПС), который обычно получают в качестве побочного продукта при производстве крахмала, а также разбавленный КПС, известный также как картофельная плодовая вода (КПВ). Таким образом, его можно применять в той форме, в которой он обычно считается потоком отходов, например, от производства картофельного крахмала или от переработки потребительского картофеля, как в разбавленном, так и в частично обработанном виде.
Картофельный сок также может быть обеднен конкретной фракцией картофельных белков, такой как, например, получают в результате применения способа согласно настоящему изобретению. Например, картофельный сок, который был освобожден или частично освобожден от фракции ингибиторов протеазы, обозначаемой также как фракция с низкой молекулярной массой (НММ), называют картофельным соком, обедненным НММ или частично обедненным НММ. Кроме того, картофельный сок, который был освобожден или частично освобожден от фракции пататина, обозначаемой также как фракция с высокой молекулярной массой (ВММ), называют картофельным соком, обедненным ВММ или частично обедненным ВММ. Их также рассматривают в качестве картофельного сока для применения в способе согласно настоящему изобретению.
Функциональные группы в настоящем документе определены как группы, которые придают молекуле значительную химическую реакционную способность, что приводит к изменению молекулы или рассматриваемой группы. Такая химическая реакционная способность главным образом определяется реакционной способностью в восстановительной водной среде, такой как в картофельном соке, как таковые весьма устойчивые группы, такие как ароматические кольца, не замещенные группой, активирующей ароматическое кольцо настолько, чтобы этого было достаточно для значительного изменения группы в такой среде (неактивированные ароматические кольца), не рассматриваются в качестве функциональных групп в объеме настоящего изобретения. Таким образом, фенильные кольца и гетероциклы, такие как неактивированные пиридин-производные, в объеме настоящего изобретения не рассматриваются в качестве функциональных групп.
При использовании в настоящем документе термин "связующая группа" обозначает атом или группу атомов, посредством которых лиганд соединен с носителем. Она образуется с помощью химической реакции соединения лиганда либо со спейсером, либо с носителем, либо соединения спейсера с носителем.
При использовании в настоящем документе термин "главная цепь" обозначает цепь атомов, которая соединяет лиганд с носителем, включая связующую группу (связующие группы). Более конкретно, это самая короткая цепь атомов, которая линейно соединяет лиганд с носителем.
Фракция картофельных белков с высокой молекулярной массой (ВММ) или фракция, богатая пата-тином, представляет наибольший коммерческий интерес, так как эту фракцию труднее получить в чистой и нативной форме, чем фракцию с низкой молекулярной массой (НММ), которая богата ингибиторами протеазы. Кроме того, это самая гомогенная фракция картофельных белков. По этой причине настоящее изобретение сфокусировано на выделении белков фракции ВММ в нативной форме, которая преимущественно включает термо- и кислотолабильный пататин. Это достигается посредством сопутствующего выделения фракции НММ картофельных белков. Поскольку оба продукта в чистой и нативной форме экономически интересны до тех пор, пока эффективность выделения высока, то следует понимать, что настоящее открытие также относится к выделенной фракции НММ картофельного белка.
Сырой картофельный сок представляет собой картофельный сок, который не подвергался какой-либо очистке и который можно применять как есть, или который подвергали сначала неинвазивной предварительной обработке, которая не влияет на содержание и характер картофельных белков, содержащихся в соке. Такая обработка может представлять собой, например, изменение рН, осветление или удаление цвета, например, сделанное путем центрифугирования, фильтрации, флокуляции и/или абсорбции. В частности, существуют различные способы для предварительной очистки картофельного сока, которые имеют своей целью удаление, например, нежелательных примесей, таких как, например, глико-алкалоиды, (поли)фенолы, пектины, липиды, жирные кислоты и/или проантоцианидины и их окрашенные производные, такие как эпикатехины и антоцианы. Способы удаления одного или более из этих загрязняющих веществ, в частности гликоалкалоидов, описаны в находящейся на рассмотрении заявке WO 2008/056977, в которой предложена абсорбция загрязняющих веществ из технологического потока картофельного сока при контакте со слоистым силикатом. Кроме того, в WO 2008/069651 описана абсорбция загрязняющих веществ из водного раствора овощного технологического потока при контакте с активированным углем. Способ, включающий предварительную обработку картофельного сока перед применением способа согласно настоящему изобретению, может быть особенно выгоден при применении предварительной обработки, включающей процесс флокуляции, например, с ионами двухвалентных металлов, такими как кальциевые или магниевые соли.
Изоэлектрическая точка (ИЭТ) белка представляет собой значение рН, при котором в аминокислотах присутствует столько же положительного заряда, сколько и отрицательного. По этой причине белок в ИЭТ имеет чистый нейтральный заряд. Когда белок подвергают воздействию рН ниже его ИЭТ, белок имеет чистый положительный заряд, а когда белок подвергают воздействию рН выше его ИЭТ, белок имеет чистый отрицательный заряд. ИЭТ можно определять с помощью стандартных процедур, таких как изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ).
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения с применением функционализи-рованного носителя, описанного в настоящем документе, белки можно фракционировать по изоэлектри-ческой точке и одновременно по молекулярной массе. Это позволяет производить отделение фракции картофельных белков, таких как, например, фракция пататина или фракция ингибиторов протеазы. Особый аспект настоящего изобретения состоит в том, что одна или более фракций картофельного белка могут быть связаны на функционализированном носителе и фракционированы с получением одной или более фракций нативного картофельного белка. Картофельные белки связываются с лигандами на функ-ционализированном носителе, представленном в настоящем описании, без чрезмерного сопутствующего связывания окрашенных компонентов картофельного сока, и функционализированный носитель является устойчивым к повреждению и/или разложению компонентами картофельного сока.
Способ согласно настоящему изобретению можно реализовывать в двух различных вариантах, которые также называются селективной абсорбцией и селективным элюированием. Благодаря данным двум различным вариантам применения настоящего изобретения его можно применять для получения всех картофельных белков, присутствующих в картофельном соке в виде смеси, содержащей фракции НММ и ВММ. Кроме того, изобретение можно применять для фракционирования картофельных белков из картофельного сока с получением фракции ВММ и/или НММ. Элюирование предпочтительно осуществляют водным буфером.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фракцию картофельного белка получают путем селективной абсорбции. В этом варианте реализации на этапе а) данного изобретения регулируют рН картофельного сока в диапазоне от 4,0 до 6,5, предпочтительно 6,0. Впоследствии на этапе b) картофельный сок приводят в контакт с функционализированным носителем, в котором по меньшей мере 90% пор имеют диаметр от 10 до 200 нм, и причем указанный носитель функционализирован гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa 2,5-5, предпочтительно 4-5, при этом лиганд соединен с носителем через атом S или О, предпочтительно тиоэфирной группы.
Этап b) этого варианта приводит к селективной абсорбции фракции НММ картофельного белка, и, как следствие, картофельный сок после контакта с функционализированным носителем обедняется фракцией НММ картофельного белка. Так получают картофельный сок, обеднененный НММ. На этапе с) в этом варианте реализации настоящего изобретения фракцию НММ картофельного белка десорбируют с указанного функционализированого носителя с помощью кислотного элюирования при значении рН ниже 3 (кислотное элюирование) или при значении рН выше 9 (щелочное элюирование). Кислотное элюи-рование в конечном итоге приводит к получению белкового продукта лучшего качества в отношении цвета, запаха и вкуса.
В другом варианте реализации настоящего изобретения как картофельные белки ВММ, так и картофельные белки НММ, если они присутствуют, сначала абсорбируют на функционализированный носитель в виде смеси белков, содержащей ВММ и НММ фракции картофельного белка, если они присутствует. Таким образом, способ относится к абсорбции общей фракции картофельного белка. В этом варианте реализации картофельный сок может быть сырым или предварительно обработанным так, как описано выше, в этом случае абсорбируется как фракция ВММ, так и фракция НММ картофельных белков. Кроме того, удобно применять картофельный сок, обедненный НММ, такой как полученный после се
лективной абсорбции фракции НММ картофельного белка, и в этом случае, по существу, присутствует только фракция ВММ картофельных белков. В этом случае этот вариант влечет за собой селективную абсорбцию фракции ВММ картофельного белка из картофельного сока, обедненного НММ.
Этот вариант настоящего изобретения включает на этапе а) стадию регулирования рН, на которой рН картофельного сока доводят до значения между 4,0 и 6,5, предпочтительно до значения 5,2. Впоследствии на этапе b) картофельный сок приводят в контакт с функционализированным носителем, в котором по меньшей мере 90% пор имеют диаметр пор между 10 и 200 нм, и причем указанный носитель функ-ционализирован гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa 2,5-5, предпочтительно 45, при этом лиганд соединен с носителем через атом S или О, предпочтительно тиоэфирной группы. В этом варианте реализации настоящего изобретения этап b) приводит к абсорбции как фракции ВММ, так и фракции НММ картофельных белков, если таковые присутствуют. На стадии с) картофельные белки, присутствующие в картофельном соке, могут быть элюированы в виде одной белковой фракции, содержащей как фракцию ВММ, так и фракцию НММ, путем кислотного элюирования или щелочного элюи-рования при рН <3 или рН> 9. Кроме того, в этом случае с помощью кислотного элюирования получают белковые продукты высокого качества в отношении цвета, запаха и вкуса.
В качестве альтернативы данному варианту настоящего изобретения на этапе с) можно выполнить селективное элюирование. В этом случае на стадии с) выполняют десорбцию фракции картофельного белка из функционализированного носителя при помощи первого селективного элюирования фракции ВММ картофельного белка при значении рН 5,7-6,3, предпочтительно при значении 6,0. Впоследствии селективное элюирование фракции НММ картофельного белка, если она присутствует, может происходить при значении рН ниже 3 при помощи кислотного элюирования или при значении рН 9 при помощи щелочного элюирования, как описано выше. При применении в этом варианте реализации настоящего изобретения картофельного сока, обедненного НММ, можно применять элюирование при более высоком значении рН, например при рН 5,7-8,9, предпочтительно 8,0, что повышает эффективность элюирования фракции ВММ.
В целом, на этапе а) настоящего изобретения рН картофельного сока доводят до значения 4,0-6,5, предпочтительно до 5,2 для абсорбции функционализированным носителем всех фракций картофельного белка, присутствующих в картофельном соке, и для последующего элюирования фракции картофельного белка. Альтернативно, рН картофельного сока доводят до значения 4,0-6,5, предпочтительно до 6,0 для селективной абсорбции фракции НММ картофельного белка.
Доведение значения рН картофельного сока до 4,0-6,5 можно производить с помощью различных кислот и/или оснований, известных в данной области техники, в концентрированной или разбавленной форме либо в сочетании с получением буфера. Следовательно, можно применять различные типы сильных кислот, такие как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота. Кроме того, можно применять слабые кислоты, такие как фосфорная кислота, муравьиная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота. Кроме того, возможно, что предварительная обработка картофельного сока приведет к тому, что будет необходимо приведение к более высокому значению рН. В этом случае предпочтительными являются сильные основания, например гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция. Предпочтительные слабые основания представляют собой, например, натриевые и калиевые карбонаты, фосфаты, ацетаты, цитраты, (би)сульфиты. В случаях, когда применяют буферы, применяют комбинации вышеупомянутых или других слабых кислот и слабых оснований, известных в данной области техники, для регулировки рН картофельного сока до требуемого значения.
В целом, предпочтительно применяют сильные кислоты и/или основания для регулировки значения рН, наиболее предпочтительно соляную кислоту и/или гидроксид натрия. Другая, более предпочтительная, кислота для регулировки значения рН представляет собой муравьиную кислоту, особенно когда желательно более низкое содержание хлорида.
На этапе b) настоящего изобретения картофельный сок приводят в контакт с функционализирован-ным носителем (support carrier). Указанный носитель может иметь различные виды или формы, при условии, что он обеспечивает достаточный контакт с картофельным соком, необходимый для проведения абсорбции. Носитель может иметь любую форму, такую как сферическая, овальная, каплевидная или эллиптическая, включая, среди прочего, зерно, частицу или решетку, но для специалистов в данной области техники возможны и другие формы. Предпочтительно носитель является, по существу, сферическим и представлен в форме частиц. Предпочтительные частицы или зерна имеют радиус зерна 50-150 мкм. Такой размер зерен обеспечивает хороший баланс между абсорбирующей способностью, которая выше для гранул меньшего размера, и чувствительность к параметрам способа, таким как давление, а также стоимость.
Важным аспектом носителя является то, что он представляет собой пористый материал. Однако его поры могут быть заполнены или покрыты гидрогелем. В частности, носитель должен содержать поры, по меньшей мере 90%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% из которых имеют нижний предел диаметра пор 10 нм и верхний предел диаметр пор 200 нм. Таким образом, под диаметром пор между 10 и 200 нм понимают, что по меньшей мере 90%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%
всех пор имеет диаметр пор между 10 и 200 нм. Предпочтительно поры имеют нижний предел диаметра пор 20 нм и верхний предел диаметра пор 150 нм, предпочтительно 100 нм, а еще более предпочтительно поры имеют нижний предел диаметра пор 30 нм и верхний предел диаметра пор 100 нм, предпочтительно 75 нм. Диаметр пор обычно определяют с помощью ртутной порометрии, которая представляет собой хорошо известный способ в данной области техники.
Кроме того, пористый материал в этом отношении представляет собой материал, в котором пористость, определенная как общий объем пор всех пор с диаметром менее 150 нм, составляет значение между 0,5 и 1,5 мл/г. Предпочтительно пористость составляет 0,7-1,1 мл/г. Для целей настоящего изобретения пористость также определяется способом ртутной порометрии.
Для целей настоящего изобретения диаметр пор и пористость носителя имеют большое значение. Тем не менее, носитель может быть закреплен на подходящем ядре, так что указанный носитель покрывает все или почти все ядро. В качестве альтернативы носитель может быть описан как материал ядра, по существу, покрытый покрытием из пористого материала. Такие ядра можно применять по разным причинам, например для уменьшения количества требуемого пористого материала или для изменения плотности или веса частицы. Ядро может состоять из любого материала, обеспечивающего достижение этих целей, в том числе из полимерного или металлического материала, а также неорганического материала, такого как оксиды металлов. Предпочтительно в качестве материала ядра применяют карбид вольфрама (WC), железо или магнетит. Соотношение ядра и носителя может быть любым, при условии, что в целом частица удовлетворяет критериям достаточной пористости и сохраняет возможность быть функционали-зированной с помощью подходящего лиганда, как описано ниже. Функционализированный носитель в соответствии с настоящим изобретением получают путем реакции подходящих лигандов с носителем, тем самым получая функционализированный носитель для использования в настоящем изобретении.
Необходимым условием для достаточного контакта для обеспечения адсорбции является применение носителя с диаметром пор 10-200 нм, предпочтительно 10-150 нм, более предпочтительно 20-100 нм и еще более предпочтительно от 30 до 75 нм. Было обнаружено, что меньший диаметр пор затрудняет абсорбцию, в то время при крупных порах получаются меньшие контактные поверхности с низкой адсорбционной способностью, особенно по отношению к фракции ВММ. Материал, из которого выполнен носитель, менее важен при условии, что будут соблюдены указанные характеристики. Таким образом, материал может представлять собой любой полимер или биоматериал, который является стабильным в условиях согласно способу, и который можно получить с порам с описанным диаметром пор, который в то же время функционализирован по меньшей мере одним гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa 2,5-5, который соединен с носителем через атом S или О, предпочтительно тиоэфир-ной группы.
Носитель для лиганда может представлять собой пористый синтетический полимер, пористый полисахарид, пористый неорганический материал или любую их комбинацию. Предпочтительно носитель может быть изготовлен из пористых синтетических полимеров, таких как полиметилметакрилат (ПММА), полиакриламид, полиметакрилат или полистирол, пористых полисахаридов, таких как целлюлоза, декстран или агароза и/или пористого диоксида кремния, стекла с контролируемым размером пор или гидроксиапатита. Однако наиболее предпочтительно в качестве носителя применяют агарозу и/или
ПММА.
Также можно применять носитель, содержащий комбинацию пористого твердого материала, такого как пористый неорганический материал, такой как керамика, с пористым гидрогелевым материалом, включая, например, некоторые пористые полисахариды, такие как агароза.
Лиганды, предназначенные для присоединения к носителю, имеют большое значение для достижения достаточной адсорбции картофельного белка на функционализированном носителе. Подходящие лиганды представляют собой гидрофобные смешанные лиганды. Это означает, что их поведение основано на комбинации электростатических и гидрофобных взаимодействий. Гидрофобность лиганда является важной для связывания фракции ВММ картофельного белка. Гидрофобные лиганды известны в данной области техники, они могут быть любой не смешивающейся с водой группы, например неполярными. Было обнаружено, что гидрофобные группы, описанные ниже в настоящем документе, обеспечивают введение изобретения в практику.
Было обнаружено, что пататин предпочитает слегка гидрофобную среду, и, следовательно, абсорбируется функционализированным носителем с определенной степенью гидрофобности. Гидрофобные лиганды известны в данной области техники и могут содержать ароматические или гетероароматические группы, а также другие гидрофобные молекулярные компоненты. Тем не менее, когда применяют только гидрофобные лиганды, без другой функциональности, наблюдается также и абсорбция фракции ВММ, а также абсорбция окрашенных загрязнителей, включая фенол. Это оказывает негативное влияние на выделение фракции ВММ картофельного белка. По этой причине также желательна другая функциональность для предотвращения загрязнения.
Было также установлено, что значение pKa лиганда на носителе, составляющее значение от 2,5 до 5, предпочтительно от 4 до 5, является полезным для надлежащей абсорбции картофельного белка на функционализированный носитель. Таким образом, предпочтительно в лиганде для использования в
функционализированном носителе в соответствии с настоящим изобретением присутствует группа кар-боновой кислоты, в качестве альтернативы можно применять другие лиганды и спейсеры со значением pKa в этом диапазоне.
В случаях когда применяют гидрофобный лиганд со значением pKa от 2,5 до 5,0, фракция картофельного белка НММ способна абсорбироваться на функционализированном носителе. Этот диапазон pKa имеет следующее преимущество: элюирование фракции картофельного белка может произойти с применением слабокислотного раствора или буфера. Элюирование при высоком рН вызывает окраску выделенной фракции картофельного белка, чего предпочтительно избегать. Кроме того, элюирование при значении рН ниже чем 2,5 может требовать присутствия сильной кислоты и/или высокого содержания соли, которая создает дорогостоящий поток отходов и может повлиять на качество выделенного изо-лята картофельного белка. Предпочтительно, чтобы значение pKa лиганда было от 2,5 до 5, так как при этих условиях баланс между упомянутыми недостатками элюирования при низких и высоких значениях рН оптимален, что приводит к оптимальной производительности.
Кроме того, было обнаружено, что применение функционализированного носителя, имеющего значение pKa от 2,5 до 5, такого как носитель, несущий кислотные группы, значительно снижает абсорбцию загрязняющих соединений на функционализированном носителе.
Было обнаружено, что при сочетании правильного диапазона значения pKa и правильной гидро-фобности как фракция ВММ, так и фракция НММ могут абсорбироваться на функционализированном носителе без существенной абсорбции загрязняющих соединений, таких как (полимерные) фенолы и другие окрашенные соединения. Это является явным улучшением по сравнению с положительно заряженными (смешанными) анионообменными и гидрофобными смолами.
В частности, значение pKa лигандов предпочтительно должно быть от 2,5 до 5, более предпочтительно 4-5. Лиганды могут быть алифатическими, замещенными алифатическими или ароматическими лигандами, включая замещенную и/или гетероароматическую группу или их комбинации. Подходящие ароматические группы представляют собой, например, замещенный или незамещенный фенил, нафтил, пиридин и пиримидиновые структуры.
По этой причине лиганд, который можно применять для того, чтобы функционализировать носитель, является гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa 2,5-5. Это лиганд должен быть соединен с носителем через атом S или О, предпочтительно через тиоэфирную группу.
Предпочтительно эти лиганды выбирают из группы замещенных пиридинов, бензойных кислот, салициловых кислот, никотиновых кислот или нафтойных кислот, где одно замещение группой (CH2)n-XH находится на доступном положении в кольце, где n представляет собой 0-4 и X представляет собой O или S. Предпочтительно эти лиганды выбраны из группы (CH2)n-SH замещенных пиридинов, бензойной, салициловой и никотиновой кислот, где n представляет собой 0-4. Еще более предпочтительно эти лиганды выбраны из группы меркаптозамещенной бензойной, салициловой и никотиновой кислот (при этом мер-каптогруппы равны тиольным группам). Однако наиболее предпочтительные лиганды представляют собой 4-меркаптобензойную кислоту и 2-меркаптоникотиновую кислоту (2-меркаптопиридин-3-карбоновая кислота), при этом из этих двух наиболее предпочтительных лигандов лучшим в настоящее время считается 4-меркаптобензойная кислота.
Лиганды должны быть соединены с носителем через атом S или О, например, с помощью сложного тиоэфира (thioester), простого тиоэфира (thioether), простой или сложный эфирной группы. Это означает, что лиганд соединен с носителем посредством связующей группы, содержащей атом S или O в главной цепи.
Предпочтительно используют серосодержащие связующие группы, например простую тиоэфирную группу или сложную тиоэфирную связующую группу. Предпочтительно простая тиоэфирная группа соединяет лиганд с носителем (с помощью сульфидного мостика, -S-). Это важно, поскольку было обнаружено, что связывание как через атом S, так и через атом О, но особенно через атом S с применением тио-эфирной группы, придает устойчивость к разложению картофельным соком любого типа. Напротив, присутствие гетероатома азота в связующей группе, такой как, например, аминная или амидная группа ("соединение через N"), приводит к более быстрому разложению функционализированного носителя в присутствии картофельного сока. В случае присутствия в группе нескольких гетероатомов, соединяющих лиганд с носителем, предпочтительно, если, по меньшей мере, половина гетероатомов представляет собой атомы S и/или O, более предпочтительно по меньшей мере 3/4 и наиболее предпочтительно, если атомы азота не представлены в главной цепи. Гетероатомы включают атомы S, O, Р и N.
Лиганды, присоединенные через кислородсодержащую группу, такую как сложные эфиры или простые эфиры, предпочтительно простые эфиры, демонстрируют повышенную устойчивость к разложению (или окислению, модификации, изменению цвета и т.п.), но разлагаются, хотя и медленнее, чем лиганды, присоединенные через амин или амид.
Тем не менее, лиганды, присоединенные через кислород, в частности через простые эфиры, не так стабильны, как лиганды, присоединенные через серу, предпочтительно через тиоэфиры. Лиганды, присоединенные через серу, в частности те, в которых лиганд соединен с носителем посредством тиоэфир-ной группы, демонстрируют особенно высокую устойчивость к разложению под действием картофель
ного сока, и, следовательно, особенно предпочтительны для применения в выделении картофельных белков из картофельного сока с помощью абсорбционных способов.
В то же время лиганды, присоединенные через кислород, имеют более низкую связывающую способность по отношению к ВММ, чем лиганды, присоединенные через серу, в частности, через тиоэфиры. Это можно объяснить тем, что сера имеет приблизительно такую же электроотрицательность, что и углерод, так что связи между носителем и лигандом имеют лишь незначительную поляризацию, которая важна для максимизации гидрофобности лиганда.
По этим причинам предпочтительным является соединение лиганда с носителем через серу или через кислород, а азотное связывание лиганда с носителем не является предпочтительным. Из серного связывание и кислородного связывания предпочтительным является серное связывание. Наиболее предпочтительно, что соединение лиганда с носителем через тиоэфир является более предпочтительным, чем соединение через кислород.
Необязательно, лиганд может быть связан с носителем с использованием спейсера. Спейсеры должны быть подходящими для участия в ковалентном связывании с полимерным носителем через атом O или S и с лигандом через атом O или S. Спейсеры, применяемые для соединения лиганда и полимерного носителя, предпочтительно не содержат большого числа атомов азота в главной цепи. В случае если в главной цепи спейсера присутствуют дополнительные гетероатомы, по меньшей мере половина гетероа-томов представляет собой атомы S или O, предпочтительно по меньшей мере 3/4. Наиболее предпочтительно спейсеры, применяемые для соединения лиганда с полимерным носителем, не содержат атомов азота в главной цепи.
Предпочтительно спейсерные группы достаточно стабильны по отношению к кислотным и щелочным средам и устойчивы по отношению к восстановительным условиям в картофельном соке, образующимся в результате добавления сульфита. Такие спейсеры обладают высокой устойчивостью по отношению к компонентам, содержащимся в картофельном соке, или в технологическом потоке в целом. Спей-серы, которые можно применять для присоединения лигандов в соответствии с настоящим изобретением, включают спейсеры, содержащие эпоксиды и тиираны, производные галогенацетилов и алкилгалоге-нидов, производные акрилоила и/или арилирующие агенты. Предпочтительно для связывания применяют такие спейсеры, которые не вызывают значительную дополнительную полярность, такие как эпокси-ды и тиираны. Специалист в данной области техники может предположить большее количество спейсе-ров, которые обеспечат О- или S-соединение между лигандом и полимерным носителем, при этом по меньшей мере одно из этих соединений находится под влиянием тиоэфирной группы, и такие спейсеры не должны быть исключены из объема настоящего изобретения.
Лиганд должен быть присоединен к носителю в количествах, достаточных для достижения высокой связывающей способности в отношении белка. Это означает, что в целом подходящие лиганды присоединены к носителю в количестве 10-200 мэкв/л, предпочтительно 10-120 мэкв/л и более предпочтительно 30-80 мэкв/л. Это можно определить с помощью хорошо известных способов определения обменной емкости, пример которых описан ниже.
В еще одном аспекте настоящего изобретения связывающая способность функционализированного носителя для абсорбции картофельных белков должна быть достаточно высокой, чтобы обеспечить выделение картофельных белков в промышленных масштабах. По этой причине абсорбирующая способность функционализированного носителя должна быть не менее 25 г/л общего белка из КПС, предпочтительно по меньшей мере 30 г/л. Кроме того, функционализированный носитель должен быть способен абсорбировать по меньшей мере 20 г/л ВММ картофельных белков из КПС, обедненного НММ, предпочтительно по меньшей мере 25 г/л. Связывающую способность функционализированного носителя определяют путем определения обменной способности.
На этапе с) настоящего изобретения белковые фракции десорбируют из функционализированного носителя путем элюирования. Это предпочтительно делают при помощи водного буфера с постоянным рН, который может элюировать фракцию белка, необязательно селективно, основываясь на его изоэлек-трической точке (ИЭТ). Буферы для применения в настоящем изобретении могут содержать любое слабокислотное или слабоосновное соединение, а также комбинации с сильными кислотами. Кислотное элюирование картофельного белка НММ является предпочтительным по сравнению с щелочным элюи-рованием, т.к. позволяет избежать потемнения и де-амидирования белка. Кроме того, элюирование картофельного белка НММ с помощью буфера с высоким содержанием соли не является предпочтительным из-за проблем, связанных с утилизацией сточных вод или буфера. Предпочтительно буферы для элюиро-вания фракции ВММ включают цитратный, ацетатный, карбонатный или фосфатный буферы. Буферы для элюирования фракции НММ могут включать муравьиную, уксусную, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, лимонную и/или фосфорную кислоту или комбинации слабокислотных буферов с сильными кислотами, такими как соляная или серная кислота. Однако предпочтительно элюировать как фракцию НММ, так и фракцию ВММ, а также их комбинации буфером на основе фосфорной кислоты или смесью муравьиной кислоты и соляной кислоты.
Если в процессе обработки необходимо отрегулировать рН картофельного сока, чтобы, например, понизить или повысить значение рН, для регулировки рН используют кислоту или основание. Такие ки
слоты и основания для регулирования рН картофельного сока преимущественно могут представлять собой слабые кислоты, такие как, например, лимонная, молочная, муравьиная, уксусная или фосфорная кислота, или сильные кислоты, такие как азотная кислота, соляная и/или серная кислота. Кроме того, возможно, что в процессе обработки картофельного сока будет необходимо приведение рН к более высокому значению. В этом случае предпочтительными являются сильные основания, например гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид кальция. Предпочтительные слабые основания представляют собой, например, натриевые и калиевые карбонаты, фосфаты, ацетаты, цитраты и (би)сульфиты. В случаях когда применяют буферы, применяют комбинации вышеупомянутых или других слабых кислот и слабых оснований, известных в данной области техники, для регулировки рН картофельного сока до требуемого значения.
На этапе d) настоящего изобретения элюированную фракцию белка, описанную выше, можно дополнительно очищать ниже по потоку, например, при помощи (ультра)фильтрации, центрифугирования, седиментации, микрофильтрации, осаждения и различных форм хроматографии, таких как, например, ионообменная хроматография, гель-фильтрация, аффинная хроматография, гидрофобная хроматография и хроматография с обращенной фазой. Кроме того, можно применять абсорбционную хроматографию с применением различных лигандов для дальнейшей очистки полученной белковой фракции.
Предпочтительно фракцию нативного картофельного белка концентрируют ультрафильтрацией. Выбор материала ультрафильтрационной мембраны может сильно повлиять на селективность. Предпочтительно мембрана для ультрафильтрации содержит регенерированную целлюлозу, полиэфирсульфоны (PES) и полисульфоны (PS). Изоляты ингибиторов протеазы можно концентрировать с применением мембран на основе PES или PS с молекулярной отсечкой в 2-20 кДа и до некоторой степени в 30 кДа. Изоляты пататина можно концентрировать с применением мембран на основе PES или PS с молекулярной отсечкой в 5-30 кДа или мембраной на основе регенерированной целлюлозы с молекулярной отсечкой в 5-30 кДа. Эти мембраны могут быть реализованы в виде трубчатых, спирально навитых, полых волокон, плит и рам либо в виде вращающихся поперечно со сдвигом фильтрующих блоков.
Изоляты пататина ультрафильтрируют при значениях рН 4,0-8,0, предпочтительно при рН 6,0-7,5. Для изолятов ингибиторов протеазы используют значения рН 3-7, предпочтительно 3,2-4,5. После удаления примесей рН можно увеличить до рН 7-10 для задействования потоков высокой интенсивности через мембраны. Ингибиторы протеазы предпочтительно обрабатывали при низком значении рН 3,0-5,0.
Помимо этапов очистки изоляты нативного картофельного белка, полученные согласно способу согласно настоящему изобретению, можно концентрировать до содержания сухого вещества более чем 20% при помощи выпаривания, концентрирования вымораживанием или изоэлектрического осаждения с применением диоксида углерода. Сухое вещество этих концентратов может содержать более 85% белка, предпочтительно более 90% белка в зависимости от уровня азота (содержание азота по Кьельдалю умножить на 6,25). Высушенные продукты могут содержать более 90%, предпочтительно более 92% белка при уровне влажности 4-9%.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к нативной фракции картофельного белка, получаемой при помощи способа в соответствии с изобретением. Эта фракция нативного картофельного белка может представлять собой всю фракцию нативного картофельного белка, фракцию пататина на-тивного картофельного белка или фракцию ингибиторов протеазы нативного картофельного белка или их любую комбинацию или подфракцию. Эти фракции картофельного белка характеризуются высокой степенью чистоты и стабильности. Вся фракция нативного картофельного белка согласно настоящему изобретению может иметь изоэлектрическую точку выше 4,5, молекулярную массу более 4 кДа. Предпочтительно фракция картофельного белка, по существу, не содержит полученных из картофеля органических кислот и аминокислот.
Фракция пататина нативного картофельного белка согласно настоящему изобретению может иметь изоэлектрическую точку ниже 5,8, предпочтительно 4,8-5,5, молекулярную массу более 30 кДа, предпочтительно 35 кДа.
Фракция ингибиторов протеазы картофельного белка согласно настоящему изобретению может иметь изоэлектрическую точку выше 5,5, предпочтительно выше 5,8, молекулярную массу менее 35 кДа, предпочтительно 4-30 кДа.
Сухие нативные картофельные белки можно получить путем распылительной сушки, термической сушки или сублимационной сушки. Для фракции пататина фракции ингибиторов протеазы и всей фракции картофельного белка устанавливают подходящее значение рН для обеспечения хорошей растворимости в воде. Для концентратов устанавливают значение рН 7,0-9,0, предпочтительно 7,0-8,0. Концентраты ингибиторов протеазы можно высушивать распылением с использованием как низкого значения рН (3,0-4,0), так и высокого значения рН (7,0-9,0). Полученные таким образом нативные картофельные белки имеют растворимость в воде более 90%, предпочтительно более 95% при рН 7,0 и температуре 25°С. Растворимость выражают как процент белка в надосадочной жидкости после центрифугирования раствора.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения изолят нативного картофельного белка, полученный после концентрирования ультрафильтрацией, имеет содержание белка более 75%
от содержания сухого вещества. Содержание белка в настоящем документе определяют как содержания азота по Кьельдалю, умноженное на 6,25. Предпочтительно содержание белка в изоляте нативного картофельного белка составляет более 80%, более предпочтительно более 90% и еще более предпочтительно
более 95%.
Изоляты нативного картофельного белка согласно настоящему изобретению можно охарактеризовать с помощью двумерного анализа электрофореза в геле в сочетании с идентификацией ключевых белков в изоляте с помощью масс-спектрометрического анализа MALDITOF. Белки могут быть разделены в двухмерном гель-электрофорезе с помощью градиента рН от 3 до 8 и молекулярной массы 5-100 кДа.
Для применения изобретения функционализированный носитель иммобилизуют с помощью, например, установки его в колонку, шланг или трубу во время протекания картофельного сока мимо него или через него. В таком варианте реализации настоящего изобретения наиболее вероятно, что абсорбция достигается с помощью непрерывного или полунепрерывного способа, такого как, например, хроматографии в уплотненном слое, хроматографии в расширяющемся слое, мембранные адсорберы или хроматографии магнитно-стабилизированного слоя. Кроме того, функционализированный носитель может быть установлен в такой трубе в виде сетки, через которую поток картофельного сока вводят в контакт с функционализированным носителем. Специалисты в данной области техники могут без труда предложить другие средства, которые не должны быть исключены.
В другом аспекте настоящего изобретения функционализированный носитель вводят в контакт с картофельным соком путем объединения картофельного сока и носителя в одном сосуде, в этом случае, например, смесь можно перемешивать, встряхивать или иным образом физически смешивать для увеличения контакта между носителем и картофельным соком. В таком варианте реализации настоящего изобретения наиболее вероятно, что абсорбция картофельных белков представляет собой периодический процесс, что является преимуществом, когда применяют белковые растворы высокой вязкости.
Однако подойдет любое средство, обеспечивающее контакт картофельного сока с функционализи-рованным носителем, при условии, что контакт достаточно интенсивен, чтобы обеспечить абсорбцию картофельных белков на функционализированном носителе, имеющем такую пористость, как описано в настоящем документе, и чтобы обеспечить присоединение по меньшей мере одного гидрофобного смешанного лиганда, имеющего значение pKa 2,5-5, при этом лиганд соединен с носителем через атом S или O, предпочтительно тиоэфирной группы.
Теперь изобретение будет проиллюстрировано следующими не ограничивающими примерами.
Способы.
Функционализация носителя. Принцип.
Функционализация носителя, активированного эпоксидной смолой Sepabead ЕР (или HFA), которые были получены в компании Resindion Binasco, Италия, лигандом происходит при рН, равном или превышающем 8,5 в зависимости от связующей группы. Растворы лигандов, применяемые для функциона-лизации носителя, приведены к фиксированному значению рН следующим образом: рН раствора мер-каптофункционализированного лиганда приводили к значению 8,5, рН раствора амино-функционализированного лиганда к значению 9,5 и рН раствора гидроксифункционализированного ли-ганда к значению, равному или более 11. Если лиганд не растворялся при желаемом рН, рН увеличивается до тех пор, лиганд не растворялся полностью.
Способ.
Лиганд (1М, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Нидерланды) растворяли в 250 мл деминерализованной воды путем добавления гидроксида калия 5М до достижения желаемого значения рН. Раствор меркапто-или аминозамещенных лигандов буферизовали 100 мМ бората. Реакцию присоединения гидроксильных функционализированных лигандов осуществляли при рН 11 без добавления буфера. Во время растворения лиганда регулировали значение рН и добавляли дистиллированную воду до тех пор, пока лиганд полностью не растворялся при желаемом рН и объеме 300 мл. Раствору лиганда давали достичь комнатной температуры перед добавлением носителя.
Активированный эпоксидной смолой Sepabead ЕР носитель (100 мл, Resindion, Binasco, Italy, Италия) промывали дистиллированной водой в стеклянном фильтре, пока проводимость становилась меньше чем 10 мкСм/см и удаляли избыток воды в условиях вакуума. Затем носитель переносили в колбу объемом 500 мл с раствором лиганда, закрывали притертой пробкой и инкубировали в течение ночи при 175 об/мин. рН проверяли после 1 ч и на следующее утро.
После промывки избытка лиганда 100 мМ гидроксида натрия оставшиеся эпоксидные группы гид-ролизовали путем инкубации функционализированного носителя в 1М гидроксида натрия при 50°С в течение 2 ч. Функционализированный носитель хранили в 50 мМ гидроксиде натрия при 4°С.
ППМА- и агарозные носители, примененные в примере 2, были эпокси-активированы и, таким образом, могут быть функционализированы с 4МВА в соответствии с тем же принципом и способом, как описано выше для ЕР Sepabead и HFA.
Мембранные блоки, активированные эпоксидной смолой Sartobind, были функционализированы в соответствии с инструкциями завода-изготовителя (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Германия).
Расчет pKa.
pKa меченого лиганда рассчитывают с помощью программного обеспечения MarvinSketch (2011) 5.4.1.1 от компании ChemAxon с вариантами pKa, привенными в табл. 1. В расчет также принимали возможное изменение электронного распределения, вызванное меткой, которое может влиять на pKa анионной группы, рассчитывая pKa с эпоксидной группой функционализированного носителя.
Таблица 1
Выбранные варианты рКа для расчета рКа в MarvinSketch
Режим
Макро
Приставка кислота/основание
Статично
Мин. основн. рКа
-10
Макс, кислота. рКа
Температура (К)
298
Рассмотреть таутомеризацию
Нет
Общая обменная емкость.
Принципом общей обменной емкости является нейтрализация протонированных анионных групп избытком основания (жидкости для нейтрализации). Обменную емкость функционализированного носителя определяют при помощи обратного титрования с применением соляной кислоты в качестве титран-та.
Кондиционирование функционализированного носителя (Протонирование анионной группы).
Функционализированный носитель помещают в колонку диаметром 1 см с толщиной слоя 16 см, эти размеры соответствуют объему слоя 12 мл. Если требуется тщательная очистка функционализиро-ванного носителя, то функционализированный носитель очищают при помощи 50 мл гидроксида натрия 1М, а затем 150 гидроксида натрия 100 мМ при 10 мл/мин. Функционализированный носитель промывают 200 мл воды при 10 мл/мин. Лиганд на функционализированном носителе протонируют 200 мл соляной кислоты при 10 мл/мин. Избыток соляной кислоты промывают 200 мл воды при 10 мл/мин или до тех пор, пока проводимость не достигнет значения <10 мкСм/см.
Нейтрализация анионной группы.
Свободный объем удаляют, вытягивая 50 мл вакуумом шприца, и количественно перемещают функционализированный носитель с 200 мл нейтрализующего раствора 30 мМ гидроксида натрия в колбу вместимостью 300 мл. В колбу вставляют притертую пробку и встряхивают на протяжении по меньшей мере 1 ч со скоростью 175 об/мин.
Титрование.
Потребление гидроксида натрия лигандом/функционализированным носителем можно определять по концентрации гидроксида натрия 30 мМ в нейтрализационном растворе и по концентрации после нейтрализации (обратное титрование). Таким образом, 25 мл нейтрализационного раствора и 25 мл частично нейтрализованного нейтрализационного раствора титруют с использованием в качестве титранта 100 мМ HCl. Точка эквивалентности классического кислотно-основного титрования представляет собой точку перегиба S-образной кривой титрования.
Коррекция системной ошибки и образование карбоксильной группы окислением метакрилата.
Объем, оставшийся после осушения носителя, функционализированного Sepabead, с помощью 50 мл шприца, оценен как 68%, что составляет 7 мл при рекомендуемом объеме 12 мл (3,5 мл удалено с помощью шприца). Оставшийся объем разбавляет нейтрализационную жидкость с 30 Мм до 29 мМ, что соответствует системной ошибке в 15 мэкв./л. Для коррекции системной ошибки и образования карбоксильных групп окислением метакрилата носитель во время нанесения меток на носитель, функционали-зированный гидролизованным Sepabead (контроль), титруют тем же образом, что и меченый носитель Sepabead.
Расчеты
neutralisation
V -V
resin sample
TEC , =TEC , -TEC ,","
corr .sample sample unlabeled support carrier
где ТЕС - общая обменная емкость (мэкв/л),
TECsample - общая обменная емкость образца без коррекции системной ошибки, (мэкв./л), TECcorxsample- общая обменная емкость образца с коррекцией системной ошибки (мэкв./л), TECunlabeled support carrier - общая обменная емкость образца (контроля)/коррекция системной ошибки (мэкв./л),
Vtitrsample - объем, пошедший на титрование образца (или контроля) (мл),
Vtitrneutralization - объем раствора, пошедший на нейтрализацию, при титровании (мл),
cHCl - концентрация HCl (ммоль/мл),
Vflask - объем NaOH, добавленный в колбу (250 мл),
Vsample - объем образца (25 мл"25,0 г).
Определение размера и объема пор.
Размер пор и объем пор применяемых носителей Sepabead определяли метолом ртутной поромет-рии при помощи системы для порометрии Micromeretics ASAP2400 в соответствии со стандартизированной процедурой, хорошо известной в данной области техники.
Эксперименты по адсорбции белка.
Эксперименты по адсорбции проводили в соответствии со следующей процедурой для сохранения как можно большей однородности экспериментов. НММ обозначает фракцию картофельных белков с низкой молекулярной массой, преимущественно состоящую из ингибиторов протеазы, тогда как ВММ обозначает фракцию картофельных белков с высокой молекулярной массой, преимущественно состоящую из пататина.
Взятую для примера партию картофельного плодового сока (КПС) и КПС, обедненного НММ (AVEBE, Gasselternijveen, Нидерланды), замораживали, так что можно было провести точное сравнение емкости и сродства каждого лиганда для процессов селективного элюирования и селективной адсорбции без введения неопределенности, основанной на естественных вариациях в концентрации белков. Перед экспериментом замороженный КПС (или КПС, обедненный НММ) оттаивали при 4°С с последующим дополнительным оттаиванием в водяной бане при 28°С в соответствии с установленными требованиями. Картофельный плодовый сок (или КПС, обедненный НММ) доводили до желаемого значения рН и центрифугировали в течение 5 мин при 4600 g для удаления остаточных твердых веществ.
Функционализированный носитель помещали в колонку с внутренней поверхностью 1,767 см2 и с толщиной слоя 34 см, эти размеры соответствуют объему слоя 60 см3. Поток устанавливали на 10 см/мин. Носитель уравновешивали с помощью уравновешивающего/промывочного буфера цитрата натрия 30 мМ с требуемым для адсорбцией рН 5,2 или 6,0 до тех пор, пока колонка не достигала желаемого рН. Для полной адсорбции белка загружали 6 объемов слоя (ОС) картофельного плодового сока рН 5,2. Для селективной адсорбции картофельных белков НММ из картофельного плодового сока (рН 6,0) или картофельных белков ВММ из обедненного НММ картофельного плодового сока (рН 5,2) загружали 9 объемов слоя.
Колонку промывали примерно 2,5 объемами слоя уравновешивающего/промывочного буфера 30 мМ цитрата натрия для удаления неадсорбированных компонентов. Адсорбированный белок можно элюировать желаемыми элюентами с последующей полной десорбцией всех оставшихся белков с помощью гидроксида натрия.
Общее связывание белка при рН 5,2.
Колонку уравновешивали с помощью 30 мМ цитрата натрия (рН 5,2) до достижения рН 5,2.
Загружали 6 объемов слоя картофельного плодового сока и собирали выходящий раствор.
Промывали приблизительно 2,5 объемами слоя уравновешивающего буфера 30 мМ цитрата натрия, рН 5,2, для удаления неадсорбированных компонентов, промывку собирали для определения баланса мас.
Выделение белка путем щелочного элюирования. Элюирование гидроксидом натрия.
Элюировали 50 мМ гидроксида натрия, и начинали сбор элюента, когда наклон OD280 составил > 60 миллиединиц оптической плотности/мин. Выдерживали до рН> 9,5, OD280 <150 миллиединиц оптической плотности, наклон OD280> -50 миллиединиц оптической плотности/мин и останавливали сбор. Продолжали на протяжении 0,25 объемов слоя.
Колонку очищали при помощи 1,5 объемов слоя гидроксида натрия 1М.
Раствор 1М гидроксида натрия в колонке заменяли на 0,5 объема слоя 50 мМ гидроксида натрия с целью хранения.
Выделение ВММ при pH 5,2 путем селективной абсорбции.
Колонку уравновешивали с помощью 30 мМ буфера цитрата натрия (рН 5,2) до достижения рН 5,2. Загружали 9 объемов слоя картофельного плодового сока, обедненного НММ, и собирали выходящий раствор.
Промывали приблизительно 2,5 объемами слоя уравновешивающего буфера 30 мМ цитрата натрия, рН 5,2, для удаления неадсорбированных компонентов, промывку собирали для определения баланса мас.
Элюирование карбонатом натрия.
Элюировали 100 мМ карбоната натрия, и не начинали сбор пор, пока наклон OD280 не составил > 60 миллиединиц оптической плотности/мин. Выдерживали до рН> 6,0, OD280 <150 миллиединиц оптической плотности, наклон OD280> -50 миллиединиц оптической плотности/мин и останавливали сбор. Продолжали поток еще на протяжении 0,25 объемов слоя.
Колонку очищали при помощи 1,5 объемов слоя гидроксида натрия 1М.
Раствор 1М гидроксида натрия заменяли на 0,5 объемов слоя 50 мМ гидроксида натрия с целью хранения.
Изоляция НММ при pH 6,0 при помощи селективной абсорбции.
Уравновешивали с помощью 30 мМ буфера цитрата натрия (рН 6,0) до достижения pH 6,0.
Загружали 9 объемов слоя картофельного плодового сока и собирали выходящий раствор.
Промывали приблизительно 2,5 объемами слоя уравновешивающего буфера 30 мМ цитрата натрия, рН 6,0, для удаления неадсорбированных компонентов, промывку собирали для определения баланса мас.
Элюирование фосфорной кислотой.
Элюировали 50 мМ форфорной кислоты, и не начинали сбор, пока наклон OD280 не составил > 60 миллиединиц оптической плотности. Выдерживали до рН <3,5, OD280 <150 миллиединиц оптической плотности, наклон OD280> -50 миллиединиц оптической плотности/мин и останавливали сбор. Продолжали поток еще на протяжении 0,25 объемов слоя.
Элюирование гидроксидом натрия.
Элюировали 50 мМ гидроксида натрия, и не начинали сбор, пока наклон OD280 не составил > 60. Выдерживали до рН> 9,5, OD280 <150, наклон OD280> -50 миллиединиц оптической плотности/мин, останавливали сбор и продолжали на протяжении 0,25 объемов слоя.
Колонку очищали при помощи 1,5 объемов слоя гидроксида натрия 1M.
1M гидроксид натрия заменяли на 0,5 объемов слоя 50 мМ гидроксида натрия с целью хранения.
Содержание белка определяют при помощи быстрого анализатора белка Sprint (фирмы СЕМ), отка-либрованного по методу Кьельдаля с коэффициентом преобразования 6,25, который обычно применяют для растительных белков. Способность элюирования с функционализированного носителя выражена в граммах белка на литр. Эксперименты были проверены по балансу масс белков путем проверки концентраций белка во всех потоках, включая поступающий поток, собранный поток и промывочные потоки. Выход составил от 95 до 102% (не показано).
Общую адсорбцию белка оценивали с помощью адсорбции белка из КПС при рН 5,2 из 6 объемов слоя с последующим щелочным элюированием белковых фракций как НММ, так и BMM.
Селективная адсорбция BMM оценивается путем адсорбции белка из КПС, обедненного НММ, при рН 5,2, из 9 объемов слоя с последующим мягким элюированием с использованием 100 мМ карбоната рН 8,0 для предотвращения изменения нативных белков.
Процент белков ВММ, присутствующих в полученном элюате (общий белок и селективно адсорбированный ВММ), определяли, анализируя соотношение белков > 35 кДа с помощью набора для анализа Experion Pro260 (Bio-Rad Laboratories).
Влияние pKa на кислотное элюирование оценивали при помощи ряда лигандов с различными pKa. НММ адсорбировали из 9 объемов слоя КПС при рН 6,0 и получали элюированием 50 мМ фосфорной кислотой с последующим полным элюированием недесорбированного белка при помощи 50 мМ гидро-ксида натрия.
Стабильность функционализированного носителя в нестабилизированном КПС (ускоренное загрязнение).
Нестабилизированный КПС.
Из свежих клубней отжимали сок/измельчали при помощи терки в центрифужной соковыжималке Braun. Нерастворимые волокна удаляют фильтрованием сока через воронку Бюхнера с бумажным фильтром 595. Значение рН для КПС должно составлять рН 6,0±0,5, если нет, то рН следует довести до 6.
Кондиционирование функционализированного носителя.
Обычно функционализированный носитель хранят в 50 мМ NaOH, следовательно, достаточно промыть функционализированный носитель деионизированной водой до тех пор, пока проводимость не станет мене 50 мкСм/см. (В уравновешивании нет необходимости, поскольку эндогенная буферная емкость КПС будет предотвращать увеличение рН.)
Колонку Kontes(r) (1,0x20 см) заполняли доверху функционализированным носителем (20 см"16
мл).
Промывали, используя минимум 100 мл деионизированной воды, и продолжали до тех пор, пока проводимость не стала менее 50 мкСм/см.
Функционализированный носитель осушали при помощи шприца объемом 50 мл.
Очистка, хранение или кондиционирование функционализированного носителя во второй раз.
Удаляли КПС из функционализированного носителя, сливая КПС через стеклянный фильтр с пористостью 3, и промывали функционализированный носитель деионизированной водой.
Воронку помещали в колонку Kontes(r) и переносили функционализированный носитель со стеклянного фильтра в колонку.
Белок и цвет элюировали с 250 мл NaOH 50 мМ при 10 мл/мин. Функционализированный носитель можно хранить в 50 мМ NaOH при 4°С или промыть 250 мл деионизированной воды для следующего инкубирования КПС. Если функционализированный носитель будет применяться для следующего инку-
бирования, то функционализированный носитель осушали при помощи шприца объемом 50 мл. Инкубирование нестабилизированного КПС. Мерный цилиндр заполняли КПС до 150 мл.
Из этих 150 мл заполняли шприц 50 мл КПС, и переносили функционализированный носитель из колонки Kontes с помощью шприца в колбу объемом 300 мл. pH проверяли через 1,5 ч и на следующее утро.
После инкубирования в течение одной ночи функционализированный носитель очищали, как описано выше, и повторяли инкубирование по меньшей мере два раза. Цветовая матрица элюированного белка.
Цветовую матрицу элюированного белка выражают как соотношение цвет/белок, где поглощение цвета, измеренную спектрофотометрически при 310 нм, делят на концентрацию белка, измеренную при помощи анализатора белка Sprint rapid protein analyzer (A310 нм/Р (%)). Анализатор белка Sprint rapid protein analyzer хорошо известен, его использование является стандартизованным способом в области анализа концентрации белков, и определение по цветовой матрицы при 310 нм происходит при быстром определении белка между 280 и 310 нм, где длину волны 310 нм используют для коррекции цветовой матрицы.
Методика
Элюированный образец разводили 100 мМ бората, рН 10,0, до экстинкции от 0,1 до 0,8, и таким же образом разбавляли контрольный образец, состоящий из воды.
Контрольный образец автоматически принимали за ноль и образец измеряли при 310 нм. Расчеты
Я310/Р(%) = Езю
Р(%)
где А310/Р(°/о) - соотношение цвет/белок
E310 - экстинкция при длине волны 310 нм,
f - коэффициент разбавления в борате 100 мМ рН 10,0,
Р(%) - концентрация белка, измеренная с помощью Sprint (%).
Пример 1. Выбор лиганда.
Результаты.
Это изобретение проиллюстрировано с помощью экспериментов с применением 11 смешанных ли-гандов, выбранных так, чтобы они обладали различной кислотностью, которые закреплены на носителе с размером пор 30-150 нм. Среди этих лигандов 10 представляют собой слабокислотные смешанные ли-ганды, и 1 представляют собой сильнокислотный смешанный лиганд. Кроме того, в эти эксперименты были включены Streamline Direct CST1 (композиция лиганда и спейсера, идентичная GE-healthcare Capto ММС) и Sepabeads HFA (exe065) (оба содержат азотсодержащий спейсер), функционализированные 4-меркаптобензойной кислотой таким же образом, как описано выше, а также гидрофобно взаимодействующий носитель Amberlite XAD7HP. Эти лиганды были протестированы на их способность:
адсорбировать по меньшей мере 25, предпочтительно > 30 г/л всего белка из картофельного сока при рН 5,2 (табл. 2);
адсорбировать по меньшей мере 20, предпочтительно > 25 г/л картофельного белка ВММ из обедненного НММ картофельного сока при рН 5,2 (табл. 3);
десорбировать картофельный белок НММ путем кислотного элюирования с последующим элюиро-ванием недесорбированных белков путем щелочного элюирования (табл. 4);
противостоять (ферментативному) окислению картофельным соком без добавления сульфита в тесте с ускоренным старением (фиг. 2 и 3, табл. 5 и 6).
Из этого следует, что емкость анионных смешанных лигандов для абсорбции картофельного белка находится примерно между 30 и 40 г/л, в то время как для карбоксильной акриловой смолы она составляет 11 г/л, а гидрофобно-взаимодействующие смолы (XAD7HP и фенилсефароза) имеют низкую емкость 8-9 г/л. Таким образом, адсорбционная способность анионных лигандов гораздо выше.
Таблица 3
Адсорбционная способность (емкость) в отношении картофельного белка ВММ (г/л) из обедненного НММ картофельного сока при рН 5,2 для 11 кислотных смешанных лигандов, одного смешанного лиганда, соединенного через азотсодержащий спейсер (CST1), слабой катионообменной смолы (карбоксильная акриловая смола) и двух гидрофобных смол (фенилсефароза и XAD7HP). Соответствующее содержание ВММ (% ВММ, выраженный в % белков > 35 кДа) для полученного картофельного белка ВММ приведено в последнем столбце
Лиганд
Емкость
(г/л)
% ВММ
4-аминобензойная кислота
19,8
77,9
3-аминобензойная кислота
22,0
84,1
3-аминобензолсульфоновая кислота
14,0
85,1
2-гидрокси-4-аминобензойная кислота (4-аминосалициловая кислота)
19,5
90,8
3-гидроксибензойная кислота
16,5
86,0
2,4-дигидроксибензойная кислота
15,8
82,0
4-гидроксибензойная кислота
13,9
80,1
2-меркаптопиридин-З-карбоновая кислота
(2-меркаптоникотиновая кислота)
24,6
79,6
4-меркаптобензойная кислота
30,5
84,8
6-гидрокси-2-нафтойная кислота
16,7
77,5
3,5-дигидрокси-2-нафтойная кислота
20,9
94,4
карбоксил (акриловая смола)
0,9
82,0
фенилсефароза
2,5
85,3
Amberlite XAD7HP
1,9
82,4
Streamline Direct CST1
22,8
72,1
Отсюда следует, что наиболее высокая адсорбционная способность по отношению к фракции ВММ картофельных белков из НММ-обедненного картофельного сока наблюдается для лигандов, соединенных тиоэфиром.
Таблица 4
Адсорбционная способность (емкость) в отношении картофельного белка НММ (г/л) для сильного (№ 3) и двух слабокислотных смешанных лигандов (№ 6 и 9). Процент белка НММ, десорбированного путем
Кислотное элюирование НММ картофельного белка является предпочтительным по сравнению с щелочным элюированием, т.к. позволяет избежать потемнения и де-амидирования белка. Кроме того, элюирование НММ картофельного белка с помощью буфера с высоким содержанием соли не является предпочтительным из-за проблем, связанных с повторным применением сточных вод или буфера. Сильнокислотные лиганды, такие как номер 3 в этом эксперименте, демонстрируют неэффективное элюиро-вание слабокислотными буферами. Слабокислотные буферы являются предпочтительными для того, чтобы избежать денатурации белка. Чтобы обеспечить кислотное элюирование с применением слабокислого буфера, лучше всего подходят слабокислые лиганды, такие как номера 6 и 9. Отсюда и применение слабокислых лигандов, имеющих pKa от 2,5 до 5.
Таблица 5
Увеличение общей обменной емкости после инкубирования картофельного сока, который не стабилизировали сульфитом
Лиганд
увеличения обменной емкости
4-аминобензойная кислота
125
3-аминобензойная кислота
3-аминобензолсульфоновая кислота
2-гидрокси-4-аминобензойная кислота (4-аминосалициловая кислота)
3-гидроксибензойная кислота
2,4-дигидроксибензойная кислота
4-гидроксибензойная кислота
2-меркаптопиридин-З-карбоновая кислота
(2-меркаптоникотиновая кислота)
4-меркаптобензойная кислота
6-гидрокси-2-нафтойная кислота
3,5-дигидрокси-2-нафтойная кислота
карбоксил (акриловая смола)
фенилсефароза
Нет данных
Sepabead HFA с 4МВА
Amersham Streamline Direct CST I
106
Данные, приведенные в табл. 4, а также на фиг. 1, демонстрируют, что присоединенные через азот смешанные лиганды чувствительны к окислению картофельным соком. Картофельный сок обычно стабилизируют добавлением сульфита. Однако ингибирование окислительного потемнения сульфитом, как правило, не является полным и со временем может произойти постепенное разложение лиганда. В отличие от лигандов, присоединенных через аминогруппу, лиганды, присоединенные через кислород, и особенно лиганды, присоединенные через тиоэфирную группу, гораздо более устойчивы к разложению посредством, например, окисления.
Из табл. 4 следует, что лиганды, соединенные через аминогруппу, имеют среднее увеличение обменной емкости на 86% в экспериментах по ускоренному загрязнению, лиганды, присоединенные через гидроксильную группу, - на 49%, а лиганды, присоединенные через тиоэфирную группу, - на 5%. Азотсодержащие спейсеры также демонстрируют ускоренное загрязнение (см. номера 14 и 15). Таким образом, азотсодержащие группы являются менее подходящими для применения для выделения картофельных белков из картофельного сока. Группы, присоединенные через кислород, имеют более высокую стойкость к загрязнению и группы, через тиоэфир, имеют самую высокую устойчивость к загрязнению.
Отсюда следует, что кислотный лиганд, который имеет самое низкое соотношение цвет/белок, представляет собой 4-меркаптобензойную кислоту как для абсорбции всего белка, так и для абсорбции ВММ, а 2-меркаптопиридин-3-карбоновая кислота на втором месте. Таким образом, кислотные лиганды, присоединенные через тиоэфир, демонстрируют низкую аффинность в отношении окрашенных или фе-нольных комплексов, которые могут вызвать загрязнение в долгосрочной перспективе и приводят к тому, что элюат белка оказывается менее окрашенным.
Пример 2. Выбор носителя.
Отсюда следует, что адсорбционная способность по отношению к ВММ соответствует критериям при диаметре пор более 30 нм, и остается такой по меньшей мере до диаметра пор 90 нм. Кроме того, из-за разницы в материале следует, что размер пор является основным параметром этой разницы. Поэтому логично, что размеры пор от 10 до 200 нм, в сочетании с соответствующими лигандами, будут иметь благоприятные абсорбционные характеристики. Таким образом, функционализированные носители, содержащие подходящие лиганды, должны иметь диаметр пор от 10 до 200 нм, предпочтительно 10-150 нм, более предпочтительно 20-100 нм и еще более предпочтительно от 30 до 75 нм.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выделения фракции нативного картофельного белка из картофельного сока, включающий следующие этапы:
a) доведение рН картофельного сока до 4,0-6,5;
b) приведение картофельного сока в контакт с функционализированным пористым носителем, в котором по меньшей мере 90% пор имеют диаметр от 10 до 200 нм, причем указанный носитель функцио-нализирован гидрофобным смешанным лигандом, имеющим значение pKa от 2,5 до 5, при этом указанный лиганд связан с указанным носителем через атом S или O;
c) десорбция фракции картофельного белка из функционализированного пористого носителя путем элюирования.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий этап концентрирования и/или сушки указанной фракции картофельного белка.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование проводят при рН от 5,7 до 8,9.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что фракция картофельного белка представляет собой фракцию пататина.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование проводят при значении рН выше 9 или ниже
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фракция картофельного белка представляет собой фракцию ингибитора протеазы.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что элюирование проводят с водным буфером.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что смешанный лиганд выбран из группы замещенных бензойных кислот, салициловых кислот, никотиновых кислот и нафтойных кислот, при этом замещение представляет собой замещение по доступному положению кольца группой (CH2)n-XH, где n=0-4 и X=S.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что носитель представляет собой пористый синтетический полимер, пористый полисахарид, пористый неорганический материал или любую их комбинацию.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что гидрофобный смешанный лиганд присоединен к носителю через спейсер, который связан с носителем через атом О или S и не содержит азотсодержащих функциональных групп.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что рН картофельного сока регулируют с помощью кислоты и/или основания.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что картофельный сок подвергают предварительной обработке, включающей абсорбцию примесей на силикате слоистой структуры и/или активированном угле и/или флокуляцию.
6.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028415
- 1 -
(19)
028415
- 1 -
(19)
028415
- 1 -
(19)
028415
- 1 -
(19)
028415
- 4 -
(19)
028415
- 18 -
|
