[RU]

1. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм, выбранный из оксифотобактерий или водорослей, для фотобиологического получения бутанола, содержащий набор нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-26, 34-45, кодирующий сконструированный с помощью методов генной инженерии набор ферментов, которые превращают промежуточный продукт цикла Кальвина, выбранный из группы, включающей глицеральдегид-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат в бутанол; и индуцибельный промотор нитраредуктазы, функционально связанный с кодирующими последовательностями указанных ферментов.

2. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД ⁺ -зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность SEQ ID NO: 47.

3. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ ⁺ -оксидоредуктазы, тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.

4. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-33, кодирующие набор сконструированных с помощью методов генной инженерии ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный набор содержит ферменты, выбранные из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.

5. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, выбранный из цианобактерий.

6. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 54-57, кодирующую стромальный сигнальный пептид, функционально связанную с кодирующими последовательностями указанных ферментов.

7. Способ фотобиологического продуцирования бутанола, согласно которому конструируют с помощью методов генной инженерии набор нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, обеспечивающие превращение промежуточного продукта цикла Кальвина, выбранного из группы, включающей глицеральдегида-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат, в бутанол с получением трансгенного фотосинтетического гидрофитного организма из оксифотобактерий и водорослей по п.1, который помещают в фотобиологический реактор для инициирования фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом в фотобиологическом реакторе, для синтеза бутанола, и выделяют синтезированный бутанол из фотобиологического реактора.

8. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм выбран из группы оксифотобактерий, включающей Thermosynechococcus elongatus BP-1, Nostoc sp. PCC 7120, Synechococcus elongatus PCC 6301, Syncechococcus sp. штамм PCC 7942, Syncechococcus sp. штамм PCC 7002, Syncechocystis sp. штамм PCC 6803, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL1A, Prochlorococcus SS120, Spirulina platensis (Arthrospira platensis), Spirulina pacifica, Lyngbya majuscula, Anabaena sp., Synechocystis sp., Synechococcus elongates, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Synechococcus WH7803, Synechococcus WH8102, Nostoc punctiforme, Syncechococcus sp. штамм PCC 7943, дефицитный по фикоцианину мутант PD-1 Synechocystis PCC 6714, Cyanothece штамм 51142, Cyanothece sp. CCY0110, Oscillatoria limosa, Symploca muscorum, Gloeobacter violaceus, Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica, Synechococcus (MC-A), Prochlorococcus marinus, Synechococcus bigranulatus, криофильную Oscillatoria sp., Phormidium sp., Nostoc sp.-1, Calothrix parietina, термофильный Synechococcus bigranulatus, Synechococcus lividus, термофильный Mastigocladus laminosus, Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Synechococcus vulcanus, Synechococcus sp. штамм МА4, Synechococcus sp. штамм МА19 и Thermosynechococcus elongatus.

9. Способ по п.7, где указанный трансгенный фотосинтетический организм дополнительно включает сконструированный ген протонного канала, контролируемый промотором Nia1, который вставляет протонный канал в цитоплазматическую мембрану для блокирования клеточного деления и скрещивания.

10. Способ по п.7, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ ⁺ -оксидоредуктазы, тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.

11. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм включает ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД ⁺ -зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность SEQ ID NO: 47.

12. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют для инактивации активности синтеза крахмала посредством ввода ДНК-конструкции, которая кодирует и индуцибельно экспрессирует молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, где ДНК-конструкция выбрана из группы, состоящей из ДНК-конструкций SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.

13. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют путем включения дополнительного набора сконструированных генов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-33, для индуцибельной экспрессии дополнительного набора сконструированных ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный дополнительный набор сконструированных ферментов включает по меньшей мере один из ферментов, выбранных из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.

(57) Реферат / Формула:

1. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм, выбранный из оксифотобактерий или водорослей, для фотобиологического получения бутанола, содержащий набор нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-26, 34-45, кодирующий сконструированный с помощью методов генной инженерии набор ферментов, которые превращают промежуточный продукт цикла Кальвина, выбранный из группы, включающей глицеральдегид-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат в бутанол; и индуцибельный промотор нитраредуктазы, функционально связанный с кодирующими последовательностями указанных ферментов.

2. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД ⁺ -зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность SEQ ID NO: 47.

3. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ ⁺ -оксидоредуктазы, тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.

4. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-33, кодирующие набор сконструированных с помощью методов генной инженерии ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный набор содержит ферменты, выбранные из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.

5. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, выбранный из цианобактерий.

6. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 54-57, кодирующую стромальный сигнальный пептид, функционально связанную с кодирующими последовательностями указанных ферментов.

7. Способ фотобиологического продуцирования бутанола, согласно которому конструируют с помощью методов генной инженерии набор нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, обеспечивающие превращение промежуточного продукта цикла Кальвина, выбранного из группы, включающей глицеральдегида-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат, в бутанол с получением трансгенного фотосинтетического гидрофитного организма из оксифотобактерий и водорослей по п.1, который помещают в фотобиологический реактор для инициирования фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом в фотобиологическом реакторе, для синтеза бутанола, и выделяют синтезированный бутанол из фотобиологического реактора.

8. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм выбран из группы оксифотобактерий, включающей Thermosynechococcus elongatus BP-1, Nostoc sp. PCC 7120, Synechococcus elongatus PCC 6301, Syncechococcus sp. штамм PCC 7942, Syncechococcus sp. штамм PCC 7002, Syncechocystis sp. штамм PCC 6803, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL1A, Prochlorococcus SS120, Spirulina platensis (Arthrospira platensis), Spirulina pacifica, Lyngbya majuscula, Anabaena sp., Synechocystis sp., Synechococcus elongates, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Synechococcus WH7803, Synechococcus WH8102, Nostoc punctiforme, Syncechococcus sp. штамм PCC 7943, дефицитный по фикоцианину мутант PD-1 Synechocystis PCC 6714, Cyanothece штамм 51142, Cyanothece sp. CCY0110, Oscillatoria limosa, Symploca muscorum, Gloeobacter violaceus, Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica, Synechococcus (MC-A), Prochlorococcus marinus, Synechococcus bigranulatus, криофильную Oscillatoria sp., Phormidium sp., Nostoc sp.-1, Calothrix parietina, термофильный Synechococcus bigranulatus, Synechococcus lividus, термофильный Mastigocladus laminosus, Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Synechococcus vulcanus, Synechococcus sp. штамм МА4, Synechococcus sp. штамм МА19 и Thermosynechococcus elongatus.

9. Способ по п.7, где указанный трансгенный фотосинтетический организм дополнительно включает сконструированный ген протонного канала, контролируемый промотором Nia1, который вставляет протонный канал в цитоплазматическую мембрану для блокирования клеточного деления и скрещивания.

10. Способ по п.7, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ ⁺ -оксидоредуктазы, тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.

11. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм включает ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД ⁺ -зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность SEQ ID NO: 47.

12. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют для инактивации активности синтеза крахмала посредством ввода ДНК-конструкции, которая кодирует и индуцибельно экспрессирует молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, где ДНК-конструкция выбрана из группы, состоящей из ДНК-конструкций SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.

13. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют путем включения дополнительного набора сконструированных генов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-33, для индуцибельной экспрессии дополнительного набора сконструированных ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный дополнительный набор сконструированных ферментов включает по меньшей мере один из ферментов, выбранных из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.

---

Евразийское 028407 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201070990
(22) Дата подачи заявки
2009.02.21
(51) Int. Cl. C12P 7/16 (2006.01) C10L 1/30 (2006.01)
(54) СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ОРГАНИЗМЫ ДЛЯ ФОТОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОДУЦИРОВАНИЯ БУТАНОЛА ИЗ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА И ВОДЫ
(31) 61/066,835; 61/066,845
(32) 2008.02.23
(33) US
(43) 2011.04.29
(86) PCT/US2009/034801
(87) WO 2009/105733 2009.08.27 (71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и
ЛИ ДЖЕЙМС ВАЙФУ (US)
(74) Представитель:
Носырева Е.Л. (RU)
патентовладелец:
(56) WO-A2-2008006038 WO-A2-2005100582
RAMESH V. NAIR et al., Regulation of the sol Locus Genes for Butanol and Acetone Formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 by a Putative Transcriptional Repressor. Journal of Bacteriology, Jan. 1999; Vol. 181, N. 1, p. 319-330, реферат, с. 325
KANEKO TAKAKAZU et al., Complete Genomic Sequence of the Filamentous Nitrogen-fixing Cyanobacterium Anabaena sp. Strain PCC 7120. DNA Research 8, 2001, p. 205-213, реферат
(57) Данное изобретение обеспечивает технологию биобезопасного фотобиологического I продуцирования бутанола на основе сконструированных трансгенных растений, | сконструированных водорослей, сконструированных сине-зеленых водорослей (цианобактерий и оксихлоробактерий) или сконструированных растительных клеток. Сконструированные фотосинтетические организмы создаются так, чтобы эндогенный механизм фотобиологической регуляции был управляемым, и восстановительная способность (НАДФН) и энергия (АТФ), приобретенные в результате фотосинтетического процесса, использовались для синтеза бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О). Способы продуцирования бутанола данного изобретения целиком устраняют проблему неподатливых лигноцеллюлоз путем обхода проблемы узких мест технологии биомассы. Технология фотобиологического продуцирования бутанола данного изобретения, как ожидается, обладает более высокой эффективностью энергопревращения солнечной энергии в бутанол, чем современная технология и может также помочь защитить окружающую среду Земли от опасного накопления CO2 в атмосфере.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет предварительных заявок США номера US61/066845 и US61/066835, поданных 23 февраля 2008 г. Полное раскрытие обеих этих заявок включено в данный документ по ссылке.
Область изобретения
Данное изобретение, в общем, касается биобезопасной технологии продуцирования биотопливной энергии. А именно, данное изобретение предлагает методологию фотобиологического продуцирования бутанола, основанную на сконструированных трансгенных растениях, таких как трансгенные водоросли, сине-зеленые водоросли (цианобактерии и оксихлоробактерии), или растительных клетках, которые созданы для использования восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ (аденозинтрифос-фат)), приобретенных в результате фотосинтетического процесса, для прямого синтеза бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О).
Предпосылки изобретения
Бутанол (CH3CH2CH2CH2OH), четырёхуглеродный спирт, может использоваться в качестве жидкого топлива для работы двигателей, таких как автомобильные. Бутанол может заменить бензин, и запасы энергии двух топлив примерно одинаковы (110000 Btu (британская тепловая единица) на галлон для бутанола; 115000 Btu на галлон для бензина). Также бутанол имеет много превосходящих свойств по сравнению с этанолом в качестве альтернативного топлива. А именно: 1) бутанол имеет более высокий запас энергии (110000 Btu на галлон бутанола), чем этанол (84000 Btu на галлон этанола); 2) бутанол обладает в шесть раз меньшей "испарительной способностью", чем этанол, и в 13,5 раз меньшей испарительной способностью, чем бензин, что делает его более безопасным для применения в качестве оксигената и, таким образом, устраняет необходимость очень нестандартных смесей в течение летних и зимних времён года; 3) бутанол можно транспортировать посредством существующей топливной инфраструктуры, включая бензотрубопроводы, в то время как этанол должен поставляться посредством железной дороги, баржи или грузовика; и 4) бутанол может использоваться как замена галлона бензина на галлон, например 100% или какой-либо другой процентной доли, тогда как этанол можно использовать только в качестве добавки к бензину до около 85% (E-85) и, к тому же, только после значительной модификации в двигателе (в то время как бутанол может работать как 100%-ая замена топлива без необходимости модификации современного автомобильного двигателя).
Значительный потенциальный рынок бутанола в качестве жидкого топлива уже существует в современной транспортной и энергетической системах. Бутанол также используется как промышленный растворитель. В Соединенных Штатах, в настоящее время, бутанол производится, прежде всего, из нефти. Исторически (1900-1950 гг.) биобутанол производился из кукурузы и мелассы ферментационным процессом, при котором также получается ацетон и этанол, и был известен как АБЭ (ацетон, бутанол, этанол) ферментация обычно с помощью определенных бактерий, продуцирующих бутанол, таких как Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii. Хотя США потеряли свои источники поставки дешевого сахара из Кубы около 1954 г., тем не менее, продуцирование бутанола путем ферментации упало, главным образом, из-за того, что цена нефти снизилась больше таковой на сахар. В последнее время, возобновляется научно-исследовательский интерес в продуцировании бутанола и/или этанола из биомассы, такой как кукурузный крахмал, используя ферментационный процесс с помощью Clostridia и/или дрожжей. Однако, аналогично ситуации "продуцирования этанола из кукурузного крахмала", способ "продуцирования бутанола из кукурузного крахмала" также нуждается в ряде энергопотребляющих этапов, включая сельскохозяйственное культивирование кукурузной культуры, уборку кукурузного зерна, обработку крахмала из кукурузного зерна и ферментацию крахмал-сахар-бутанол. На процесс "продуцирования бутанола из кукурузного крахмала" возможно, также может затрачиваться приблизительно столько же много энергии, сколько составляет энергетическая ценность его продукта бутанола. Это очевидно и не удивительно, так как кукурузный крахмал, который может использовать современная технология, представляет собой только небольшую часть биомассы кукурузной культуры, которая включает кукурузные стебли, листья и корни. Кукурузная солома, как правило, утилизируется в сельскохозяйственных полях, где она медленно разлагается назад до CO2, так как она представляет собой в основном лигноцел-люлозные материалы биомассы, которые современная биоперерабатывающая промышленность не может эффективно использовать для продуцирования этанола или бутанола. Проводятся научно-исследовательские работы в попытке получить этанол или бутанол из лигноцеллюлозных растительных материалов биомассы - замысел, называемый "целлюлозный этанол" или "целлюлозный бутанол". Однако растительная биомасса развила эффективные механизмы сопротивления нападениям на ее структурные сахара клеточной стенки из микробного и животного царств. Это свойство лежит в основе естественной неподатливости, создавая преграды для экономичной трансформации лигноцеллюлозной биомассы в ферментируемые сахара. Поэтому, одна из таких проблем, известная как "лигноцеллюлозная неподатливость", представляет собой труднопреодолимую техническую преграду экономичной трансформации растительной биомассы в ферментируемые сахара. То есть, из-за проблемы неподатливости лигно-целлюлозные биомассы (такие как кормовая кукуруза, просо и материалы древесных растений) не могут быть полностью превращены в ферментируемые сахара для продуцирования этанола или бутанола без
определенной предварительной обработки, которую обычно связывают высокими издержками технологического процесса. Вопреки более чем 50-летним научно-исследовательским попыткам по предварительной обработке лигноцеллюлозной биомассы и технологического процесса продуцирования ферментативного бутанола, проблема не поддающихся обработке лигноцеллюлоз по-прежнему остается труднопреодолимым техническим препятствием, которое еще до сих пор не устранено. Кроме того, все этапы культивирования лигноцеллюлозной биомассы, сбора, технологического процесса предварительной обработки и ферментации целлюлоза-сахар-бутанол расходуют энергию. Следовательно, любая новая технология, которая сможет обойти эти проблемы узких мест технологии биомассы, может быть пригодной.
Оксифотобактерии (также известные как сине-зеленые водоросли, включая цианобактерии и оксихлоробактерии) и водоросли (такие как Chlamydomonas reinhardtii, Platymonas subcordiformis, Chlorella fusca, Dunaliella salina, Ankistrodesmus braunii и Scenedesmus obliquus), которые могут выполнять фотосинтетическое усвоение CO2 с выделением O2 из воды в жидкой культуральной среде с более чем 10% максимальным теоретическим превращением солнечной энергии в биомассу, имеют огромный потенциал, чтобы быть чистым и возобновляемым энергетическим ресурсом. Однако, кислородные фотосинтетические зеленые растения дикого типа, такие как сине-зеленые водоросли и эукариотические водоросли, не обладают способностью продуцировать бутанол непосредственно из CO2 и Н2О. Фотосинтез дикого типа использует восстановительную способность (НАДФН) и энергию (АТФ) фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, через систему тилакоидных мембран водорослей для восстановления CO2 в углеводороды (CH2O)n, такие как крахмал, с помощью ряда ферментов в совокупности называемых "цикл Кальвина" в стромальной области в хлоропласте водоросли или зеленого растения. Общий результат фотосинтетического процесса дикого типа - это превращение CO2 и H2O в углеводороды (CH2O)n и О2, используя энергию солнечного света, согласно следующей реакции процесса:
пС02 + пН20 -> (СН20)п + n02 [ 1 ]
Углеводороды (CH2O)n, кроме того, затем превращаются во все виды усложненных клеточных (биомассных) материалов, включая белки, липиды и целлюлозу, и другие материалы клеточных стенок в процессе клеточного метаболизма и роста.
У определенной водоросли, такой как Chlamydomonas reinhardtii, некоторые из органических запасов, таких как крахмал, могут быть медленно метаболизированы в этанол (но не в бутанол) посредством вторичного ферментативного метаболического пути. Водорослевый ферментативный метаболический путь подобен дрожжевому процессу брожения, при котором крахмал расщепляется на более мелкие сахара, такие как глюкоза, которые, в свою очередь, трансформируются в пируват посредством процесса гликолиза. Пируват можно затем превратить в формиат, ацетат и этанол посредством дополнительных метаболических этапов (Gfeller and Gibbs (1984) "Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii," Plant Physiol. 75:212-218). Эффективность этого вторичного метаболического процесса довольно ограничена, возможно, из-за того, что он может использовать только малую часть ограниченного органического запаса, такого как крахмал в водорослевой клетке. Кроме того, естественный водорослевый вторичный метаболический процесс вовсе не может продуцировать бутанол. Как указывалось выше, бутанол имеет много превосходных физических свойств, чтобы служить заменой бензину в качестве топлива. Поэтому необходим новый фотобиологический механизм продуцирования бутанола с высокий энергетическим КПД превращения солнечной энергии в бутанол.
Данное изобретение обеспечивает принципиально новые сконструированные фотосинтетические организмы, которые способны непосредственно синтезировать бутанол из CO2 и Н2О, используя солнечный свет.
Фотобиологическая продуцирующая бутанол система, обеспеченная данным изобретением, может обойти все упомянутые выше проблемы узких мест технологии биомассы.
Краткое описание изобретения
Данное изобретение обеспечивает способы фотобиологического продуцирования бутанола, основанные на сконструированных трансгенных растениях (таких как водоросли и оксифотобактерии) или растительных клетках. Сконструированные фотосинтетические организмы созданы посредством генной инженерии так, чтобы эндогенные механизмы регуляции фотосинтеза были управляемы, а восстановительная способность (НАДФН) и энергия (АТФ), приобретенные в результате фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, использовались для синтеза бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О). Фотобиологические способы продуцирования бутанола по данному изобретению целиком устраняют проблему неподатливых лигноцеллюлоз путем того, что обходят проблему узких мест технологии биомасс. Технология фотосинтетического продуцирования бутанола по данному изобретению, как предполагается, имеет намного более высокую эффективность энергопревращения солнечной энергии в бута-нол, чем современная технология.
Основным признаком настоящей методологии фотосинтетического продуцирования бутанола является создание сконструированных растений (таких как водоросли) или растительных клеток, которые содержат трансгены, кодирующие набор ферментов, которые могут воздействовать на промежуточный
продукт цикла Кальвина и превращать промежуточный продукт непосредственно в бутанол, вместо того, чтобы создавать крахмал и другие сложные материалы биомассы. Соответственно, данное изобретение обеспечивает, среди прочего, способы продуцирования бутанола на основе сконструированного растения или растительных клеток, ДНК-конструкты, кодирующие гены сконструированного пути продуцирования бутанола, а также созданные сконструированные растения и сконструированные растительные клетки.
В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ фотосинтетического продуцирования бу-танола, при котором выращивают сконструированное растение (такое как сконструированная водоросль или сконструированная сине-зеленая водоросль) или растительные клетки в жидкой культуральной среде, где растение или растительные клетки создаются посредством генной инженерии для экспрессии набора ферментов, которые воздействуют на промежуточный продукт цикла Кальвина и превращают промежуточный продукт в бутанол.
В соответствии с данным изобретением сконструированное растение, такое как сконструированная водоросль или сконструированная растительная клетка, для использования при фотосинтетическом продуцировании бутанола, могут быть созданы с использованием в принципе любого растения, растительной ткани или растительных клеток в качестве хозяина, поскольку такое растение, растительная ткань и клетки обладают фотосинтетической способностью и могут культивироваться в жидкой среде. В предпочтительном варианте осуществления водное растение (гидрофиты) используется для создания сконструированного растения, которое включает, но не ограничивается, подводные водяные травы (такие как Hydrilla verticillata, Elodea densa, Aponogeton boivinianus, Hygrophila difformmis), ряски (такие как Spi-rodela polyrrhiza, Wolffia globosa, Landoltia punctata), водный салат (Pistia stratiotes), лютики (Ranunculus), рогульник (Trapa natans и Trapa bicornis), кувшинку (такую как Nymphaea lotus), водяной гиацинт (Eich-hornia crassipes), морские травы (такие как Heteranthera Zosterifolia) и водоросли.
В особенно предпочтительном варианте осуществления водоросли применяются в качестве хозяина для создания сконструированных водорослей для фотосинтетического продуцирования бутанола. Водорослями, пригодными для применения в данном изобретении, могут быть или одноклеточные, или многоклеточные водоросли (последние, включающие, но без ограничений, крупные морские водоросли, такие как Ulva latissima (ульва), Ascophyllum nodosum и Porphyra tenera) и включают зеленые водоросли (Chlorophyta), красные водоросли (Rhodophyta), бурые водоросли (Phaeophyta), диатомовые водоросли (Bacillariophyta) и сине-зеленые водоросли (Oxyphotobacteria, включая Cyanophyta (цианобактерии) и представителей Prochlorophyta (оксихлоробактерии)). Как прокариотические сине-зеленые водоросли (оксифотобактерии), так и эукариотические водоросли являются чрезвычайно пригодными для использования в данном изобретении. Особенно предпочтительными видами водорослей для использования в данном изобретении является вид зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii, геном которых был недавно секвенирован.
Выбор ферментов, подходящих для использования для создания сконструированного пути продуцирования бутанола в хозяине зависит от того, от какого промежуточного продукта цикла Кальвина сконструированный путь ответвляется из цикла Кальвина. В одном варианте осуществления данного изобретения сконструированный путь ответвляется от точки глицеральдегида-3-фосфатов и превращает их в бутанол при помощи, например, набора ферментов, включающего глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (или пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу), тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолде-гидрогеназу. В этом сконструированном пути для превращения двух молекул глицеральдегид-3-фосфата в бутанол образуются две молекулы НАДН из НАД на этапе от глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата, катализируемом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой; при этом две молекулы НАДН превращаются в НАД+: одна на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления ацетоацетил-КоА до 3-гидроксибутирил-КоА, и другая на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления кротонил-КоА до бутирил-КоА. В результате, на этом сконструированном пути количество расходуемых молекул НАДН уравнено с количеством образованных молекул НАДН. Кроме того, как этап, катализируемый бутиральдегиддегидрогеназой при восстановлении бутирил-КоА до бутиральдегида, так и конечный этап, катализируемый бутанолдегидрогена-зой при восстановлении бутиральдегида до бутанола, могут использовать НАДФН, которую можно регенерировать фотосинтетическим расщеплением воды и процессом транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом. Поэтому этот сконструированный путь продуцирования бутанола может функционировать непрерывно.
В другом примере сконструированный путь создают так, что он потребляет промежуточный продукт, 3-фосфоглицерат, и превращает его в бутанол посредством использования, например, набора ферментов, включающего фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируватферредоксиноксидоредук-тазу, тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бути-ральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. Для того чтобы работал путь продуцирования бутано-ла, ответвленный от 3-фосфоглицерата, важно использовать 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу и
бутирил-КоА-дегидрогеназу, которые могут использовать НАДФН, которая может поставляться посредством фотоуправляемого процесса транспорта электронов. Альтернативно, когда используются 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа и бутирил-КоА-дегидрогеназа, которые могут использовать только НАДН, здесь предпочтительно использовать дополнительный вариант осуществления данного изобретения, который может давать механизм превращения НАДФН/НАДН для поставки НАДН путем превращения НАДФН в НАДН, чтобы способствовать фотосинтетическому продуцированию бутанола посредством сконструированного пути, ответвленного от 3-фосфоглицерата.
В еще одном примере сконструированный путь создают так, что он потребляет фруктоза-1,6-дифосфат и превращает его в бутанол посредством использования, например, набора ферментов, включающего альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицерат-киназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу (или пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу), тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. Добавление еще одного дополнительного фермента в сконструированный организм, фосфофруктокиназы позволяет создание другого сконструированного пути, который ответвляется от точки фруктоза-6-фосфата, для продуцирования бутанола. Подобно пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата, как путь, ответвленный от фруктоза-1,6-дифосфата, так и путь, ответвленный от фруктоза-6-фосфата, могут сами собой образовывать НАДН для использования в пути на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и другой на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления кротонил-КоА в бутирил-КоА. В каждом из этих сконструированных путей продуцирования бутанола количества расходуемых молекул НАДН уравнены с количествами образованных молекул НАДН; и как бутиральдегиддегидрогеназа (которая катализирует этап при восстановлении бутирил-КоА в бутиральдегид), так и бутанолдегидрогеназа (которая катализирует конечный этап при восстановлении бутиральдегида в бутанол) все могут использовать НАДФН, которая может быть регенерирована посредством фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом. Поэтому эти сконструированные пути продуцирования бутанола могут функционировать непрерывно. Можно отметить, что определенные наборы сконструированных ферментов могут разрешать два или более сконструированных пути, т.е., пути, которые ответвляются от двух или более точек цикла Кальвина для продуцирования бутанола.
В соответствии с данным изобретением нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, создаются посредством генной инженерии так, чтобы экспрессирующиеся ферменты были вставлены в хлоро-пласты хозяина для достижения целевой клеточной локализации. Целевое введение сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола может достигаться посредством использования нуклеотидной последовательности, которая кодирует стромальный "сигнальный" пептид, расположенный в функциональный связи с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный фермент. Ряд последовательностей транзитных пептидов пригоден для использования для целевого введения сконструированных ферментов продуцирования бутанола в хлоропласт, включая, но без ограничений, последовательности транзитных пептидов гидрогеназных апобелков (таких как Hyd1), апобелка ферредоксина (Frx1), апобелка тиоредоксина m (Trx2), апобелка глютаминсинтазы (Gs2), LhcII апобелков, PSII-Т апо-белка (PsbT), PSII-S апобелка (PsbS), PSII-W апобелка (PsbW), апобелка у-субъединицы CF0CF1 (АТРС), апобелка 5-субъединицы CF0CF1 (ATPD), апобелка субъединицы-II CF0CF1 (ATPG), апобелков фотосистемы I (PSI) (таких как, генов PsaD, PsaE, PsaF, PsaG, PsaH, и PsaK) и апобелков малой субъединицы (SSU) Rubisco (рибулеза-1,5-бифосфаткарбоксилаза) (такой как RbcS2). Предпочтительные последовательности транзитных пептидов включают транзитный пептид Hyd1, транзитный пептид Frx1 и транзитные пептиды SSU Rubisco (такой как RbcS2).
Кроме того, в соответствии с данным изобретением экспрессия сконструированного, продуцирующего бутанол пути контролируется путем использования индуцибельного извне промотора так, что сконструированные трансгены индуцибельно экспрессируются при определенных специфических условиях. В одном варианте осуществления индуцибельный промотор, применяемый для контроля экспрессии сконструированных генов, является промотором, который индуцируется анаэробиозом, включая, например, промоторы гена гидрогеназы (Hyd1), гена Cyc6, кодирующего апобелок цитохрома C6, и гена Cpx1, кодирующего копрогеноксидазу. Дополнительные индуцибельные промоторы, пригодные для применения в данном изобретении, включают промотор нитратредуктазы (Nia1), промотор белка теплового шока HSP70A, промотор CabII-1, промотор Ca1, промотор Ca2, промоторы гена нитритредуктазы (nirA), промоторы гена hox двухсторонней гидрогеназы, свето- и теплочувствительные groE промоторы, промоторы rbcL оперона Rubisco, металл (цинк)-индуцибельный smt промотор, железочувствительный idiA промотор, редокс-чувствительный crhR промотор, промотор гена теплового шока hsp16.6, промотор малого белка теплового шока (Hsp), чувствительные к CO2 промоторы гена карбоангидразы, чувствительный к зеленому/красному свету срсВ2А2 промотор, чувствительные к УФ-свету (ультрафиолетовый свет) lexA, recA и ruvB промоторы, промоторы гена нитратредуктазы (narB) и их сочетания.
В другом аспекте данного изобретения предлагаются сконструированные ДНК-конструкты, которые содержат одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола, каждый из которых расположен в функциональный связи с индуцибельным промотором и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей соответствующий, нацеленный на хлоропласт транзитный пептид. Конструкты могут содержать дополнительные соответствующие последовательности, такие как маркерный ген, для селекции, чтобы способствовать скринингу и идентификации трансформантов. Нуклеиновокислотные конструкты, несущие сконструированные гены, могут доставляться в водоросль-хозяина, растительный организм или растительную ткань или клетки при помощи доступных техник генной трансформации, таких как электропорация, естественная трансформация, конъюгация, ПЭГ-индуцированное поглощение и баллистическая доставка ДНК, и опосредованная Agrobacterium трансформация.
Сконструированные растения (например, сконструированные водоросли), растительные ткани и растительные клетки, которые были созданы для содержания одного или более сконструированного конструкта, образуют другой вариант осуществления данного изобретения. В дальнейшем аспекте данное изобретение обеспечивает дополнительные способы усиленного фотосинтетического продуцирования бутанола, относящиеся к нему сконструированные конструкты и сконструированные растения, растительные ткани и клетки.
В определенном варианте осуществления данного изобретения фотосинтетическое, продуцирующее бутанол сконструированное растение (например, сконструированная водоросль), растительная ткань или клетка(клетки), описанные выше, дополнительно модифицированы для содержания дополнительных сконструированных трансгенов для индуцибельной экспрессии одного или более ферментов, чтобы способствовать НАДФН/НАДН превращению, таких как НАД+-зависимая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, НАДФН-фосфатаза и НАД-киназа. Альтернативно, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу сконструированного растения, растительной ткани или клетки(клеток) можно выбрать и модифицировать так, что они также смогут использовать НАДФН.
В другом варианте осуществления данного изобретения фотосинтетические, продуцирующие бута-нол сконструированное растение или растительная ткань или клетка(клетки) дополнительно модифицированы для инактивации активности синтеза крахмала. В определенном варианте осуществления данного изобретения такая дополнительная модификация включает ввод сконструированного ДНК-конструкта, который кодирует и индуцибельно экспрессирует молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, например, крахмалсинтазу, глюкоза-1-фосфатаденилилтрансферазу, глюкозофосфатизомеразу и/или фосфоглюкомутазу для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола.
В еще одном другом варианте осуществления сконструированные, продуцирующие бутанол растение или растительные ткань или клетка(клетки) для фотосинтетического продуцирования бутанола дополнительно модифицированы для содержания дополнительного набора сконструированных генов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в строме. Такие дополнительные сконструированные гены включают, например, гены, кодирующие амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фос-фоглюкомутазу и глюкозофосфатизомеразу.
В другом варианте осуществления фотобиологический путь(пути) продуцирования бутанола распределяется частично как в хлоропласте, так и цитоплазме. Распределение сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола между хлоропластом и цитоплазмой контролируется использованием и/или удалением последовательностей транзитных пептидов в сконструированных ДНК-конструктах.
В еще одном другом варианте осуществления фотобиологический путь(пути) продуцирования бу-танола распределяется полностью в цитоплазме, как в случае сконструированных оксифотобактерий (сине-зеленых водорослей), включая сконструированные цианобактерии и сконструированные оксихлоро-бактерии.
Данное изобретение также обеспечивает биобезопасную технологию фотобиологического продуцирования биотоплива на основе сконструированных, с контролируемым клеточным делением трансгенных растений, водорослей, сине-зеленых водорослей (цианобактерий и оксихлоробактерий) или растительных клеток. Сконструированные фотосинтетические организмы с контролируемым клеточным делением содержат две ключевые функции: сконструированный механизм(ы) биологической безопасности и сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива.
Сконструированное свойство(свойства) биологической безопасности придается с помощью ряда механизмов, включающих: (1) индуцибельную вставку сконструированных протонных каналов в цито-плазматическую мембрану для полной блокировки какого-либо клеточного деления и/или способности к скрещиванию, (2) избирательное использование сконструированного регуляторного белка цикла клеточного деления или интерференционной РНК (иРНК) для постоянного ингибирования цикла клеточного деления и, предпочтительно удерживания клетки в G1 фазе или G0 состоянии, и (3) инновационное использование фотосинтетического организма-хозяина, нуждающегося в высоком содержании CO2, для экспрессии сконструированного пути(путей) продуцирования биотоплива. Технология управления деле
нием сконструированной клетки может помочь обеспечить биологическую безопасность при применении сконструированных организмов для фотосинтетического продуцирования биотоплива.
Данное изобретение, кроме того, обеспечивает способ применения сконструированного фотосинтетического организма (такого как сконструированная цианобактерия или водоросль) в сочетании с фотобиологической реакторной системой и процессом сепарации/сбора бутанола для фотобиологического продуцирования бутанола и O2 непосредственно из CO2 и Н2О с помощью солнечного света. Как промышленные источники CO2, так и/или атмосферный CO2 из окружающей среды можно использовать в способе фотобиологического продуцирования бутанола.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 показывает сконструированные пути продуцирования бутанола, ответвленные от цикла Кальвина с применением восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ) из фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, для восстановления диоксида углерода (CO2) в бутанол CH3CH2CH2CH2OH посредством серий ферментативных реакций.
Фиг. 2A показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена(генов) пути продуцирования бу-танола.
Фиг. 2B показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена превращения НАДФН/НАДН для взаимопревращения НАДФН/НАДН.
Фиг. 2C показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена иРНК-ингибитора(ингибиторов) синтеза крахмала/гликогена.
Фиг. 2D показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена(генов) гликолитического распада крахмала.
Фиг. 2E показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена(генов) пути продуцирования бу-танола для цитозольной экспрессии.
Фиг. 2F показывает ДНК-конструкт сконструированного гена(генов) пути продуцирования бутано-ла с двумя сайтами рекомбинации для интегративной генетической трансформации у оксифотобактерий.
Фиг. 2G показывает ДНК-конструкт сконструированного гена(генов) контроля биологической безопасности.
Фиг. 2H показывает ДНК-конструкт сконструированного гена(генов) протонного канала.
Фиг. 3A иллюстрирует сконструированный организм с контролируемым клеточным делением, который содержит две ключевые функции: сконструированный механизм(механизмы) биологической безопасности и сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива.
Фиг. 3B иллюстрирует сконструированный организм с контролируемым клеточным делением для фотобиологического продуцирования бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О) с сконструированным механизмом(механизмами) биологической безопасности.
Фиг. 3C иллюстрирует сконструированный организм с контролируемым клеточным делением для биобезопасного фотобиологического продуцирования других биотоплив, таких как этанол (CH3CH2OH), из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О).
Детальное описание изобретения
Данное изобретение направлено на технологию фотобиологического продуцирования бутанола на основе сконструированных фотосинтетических организмов, таких как сконструированные трансгенные растения (например, водоросли и оксифотобактерии) или растительные клетки. Сконструированные растения и растительные клетки создаются с помощью техник генной инженерии так, чтобы контролировался эндогенный механизм регуляции фотосинтеза, а восстановительная способность (НАДФН) и энергия (АТФ), приобретенные из фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, могли использоваться для прямого синтеза бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О) в соответствии со следующей реакцией процесса:
4С02 + 5Н20 -> СН3СН2СН2СН2ОН + 602 [2]
Способы фотобиологического продуцирования бутанола по данному изобретению полностью устраняют проблему неподатливых лигноцеллюлоз посредством того, что обходят проблему узких мест технологии биомассы. Как показано на фиг. 1, фотосинтетический процесс в сконструированном организме эффективно использует восстановительную способность (НАДФН) и энергию (АТФ) из фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, для прямого синтеза бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О) без оттягивания в другой путь для синтеза нежелательных лигноцеллюлозных материалов, которые являются очень твердыми и обычно не эффективны для использования в биоперерабатывающей промышленности. Этот подход также отличается от существующего способа "продуцирования бутанола из кукурузного крахмала". В соответствии с данным изобретением бутанол может получаться непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О) без необходимости проходить через многие энергопотребляющие этапы, через которые должен проходить способ продуцирования бутанола из кукурузного
крахмала, включая культивирование кукурузной культуры, сбор кукурузного зерна, технологический процесс кукурузное зерно-крахмал и ферментацию крахмал-сахар-бутанол. В результате технология фотосинтетического продуцирования бутанола по данному изобретению, как ожидается, обладает более (более чем в 10 раз) высокой эффективностью энергопревращения солнечной энергии в бутанол, чем современная технология. Предполагая 10%-ную эффективность превращения солнечной энергии для предлагаемого способа фотосинтетического продуцирования бутанола, максимальная теоретическая продуктивность (выход) может быть около 72700 кг бутанола на акр в год, которую могут поддерживать около 70 машин (в год на акр). Поэтому, данное изобретение может дать значительную возможность обществу в том, чтобы помочь обеспечить энергетическую безопасность. Данное изобретение может также помочь защитить окружающую среду Земли от опасного накопления CO2 в атмосфере, так как данные способы превращают CO2 непосредственно в чистую энергию бутанола.
Основным признаком данной методологии является использование растения (например, водоросли или оксифотобактерии) или растительных клеток, введение в растение или растительные клетки молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих набор ферментов, которые могут воздействовать на промежуточный продукт цикла Кальвина и превращать промежуточный продукт в бутанол, как иллюстрируется на фиг. 1, вместо того, чтобы создавать крахмал и другие сложные материалы клетки (биомассы) как конечные продукты посредством пути фотосинтеза дикого типа. Соответственно, данное изобретение обеспечивает, среди прочего, способы продуцирования бутанола на основе сконструированного растения (такого как сконструированная водоросль и сконструированная оксифотобактерия), сконструированной растительной ткани или сконструированных растительных клеток, ДНК-конструктов, кодирующих гены сконструированного пути продуцирования бутанола, а также созданные сконструированные водоросли, сконструированные оксифотобактерии (включая сконструированные цианобактерии), сконструированные растения, сконструированные растительные ткани и сконструированные растительные клетки. Различные аспекты данного изобретения дополнительно детально описаны ниже.
Фотосинтетические организмы-хозяева
В соответствии с данным изобретением сконструированный организм или клетка для фотосинтетического продуцирования бутанола по данному изобретению могут быть созданы с использованием в качестве хозяина любого растения (включая водоросль и оксифотобактерию), растительной ткани или растительных клеток, которые обладают фотосинтетической способностью, т.е., активным фотосинтетическим аппаратом и ферментативным путем, который захватывает энергию света посредством фотосинтеза, используя эту энергию для превращения неорганических веществ в органический материал. Предпочтительно организм-хозяин должен обладать достаточной фотосинтетической скоростью фиксации CO2, например, для обеспечения фотосинтетического продуцирования бутанола из CO2 и Н2О, по меньшей мере, около 1450 кг бутанола на акр в год, более предпочтительно 7270 кг бутанола на акр в год или даже более предпочтительно 72700 кг бутанола на акр в год.
В предпочтительном варианте осуществления водное растение используется для создания сконструированного растения. Водные растения, также называемые гидрофитные растения, являются растениями, которые живут в или на водной среде, такой как в воде (включая на или под водной поверхностью) или нефти, постоянно насыщенной газом. Как используется в данном документе, водные растения включают, например, водоросли, сине-зеленые водоросли (цианобактерии и оксихлоробактерии), погруженные водные травы
(Hydrilla
verticillata, Elodea densa, Hippuris vulgaris, Aponogeton Boivinianus Aponogeton
Rigidifolius, Aponogeton Longiplumulosus, Didiplis Diandra, Vesicularia Dubyana,
Hygrophilia Augustifolia, Micranthemum Umbrosum, Eichhornia Azurea, Saururus
Cernuus, Cryptocoryne Lingua, Hydrotriche Hottoniiflora Eustralis Stellata,
Vallisneria Rubra, Hygrophila Salicifolia, Cyperus Helferi, Cryptocoryne Petchii,
Vallisneria americana, Vallisneria Torta, Hydrotriche Hottoniiflora, Crassula
Helmsii, Limnophila Sessiliflora, Potamogeton Perfoliatus, Rotala Wallichii,
Cryptocoryne Becketii, Blyxa Aubertii, Hygrophila Difformmis), ряски (Spirodela
polyrrhiza, Wolffia globosa, Lemna trisulca, Lemna gibba, Lemna minor, Landoltia punctata), водный салат (Pistia stratiotes), лютики (Ranunculus), рогульник (Trapa
natans и Trapa bicornais), кувшинку (Nymphaea lotus, Nymphaeaceae и
Nelumbonaceae), водяной гиацинт (Eichhornia crassipes), Bolbitis heudelotii,
Cabomba sp., морские травы (Heteranther a Zosterifolia, Posidoniaceae, Zosteraceae,
Hydrocharitaceae и Cymodoceaceae).
Бутанол, продуцированный из водного растения, может диффундировать в воду, давая возможность нормальному росту растений и более активному продуцированию бутанола из растений. Жидкие тканевые культуры водных растений (включая, но без ограничений, многоклеточные водоросли) или клетки (включая, но без ограничений, одноклеточные водоросли) также высоко предпочтительны для применения, так как молекулы бутанола, продуцированные из сконструированного пути продуцирования бутано-ла, могут легко диффундировать из клеток или тканей в жидкую водную среду, которая может служить в качестве большого пула для хранения продукта бутанола, который затем можно собрать посредством техник фильтрации и/или дистилляции/выпаривания.
Хотя водные растения или клетки являются предпочтительными организмами-хозяевами для применения в способах по данному изобретению, ткань и клетки неводных растений, которые являются фотосинтетическими и могут культивироваться в жидкой культуральной среде, могут также применяться для создания сконструированной ткани или клеток для фотосинтетического продуцирования бутанола. Например, следующие ткань или клетки неводных растений также можно выбрать для применения в качестве организма-хозяина в данном изобретении: фотоавтотрофная культура ткани побега лимона персидского Feronia limonia, хлорофильная каллюсная культура растения кукурузы Zea mays, культуры корней, способные к фотосинтезу, видов Asteraceae и Solanaceae, тканевая культура паренхимы стебля сахарного тростника, тканевая культура бриофита Physcomitrella patens, суспензионные культуры фотосинтетических клеток растения сои (Glycine max), фотоавтотрофная и фотомиксотрофная культура зеленых табачных (Nicofiana tabacum L.) клеток, клеточные суспензионные культуры Gisekia pharnaceoides (C4-растение), фотосинтетические суспензионно культивированные клеточные линии Amaranthus powellii Wats., Datura innoxia Mill., Gossypium hirsutum L., и гибрид, образованный путем слияния Nicotiana tabacum x Nicotiana glutinosa L.
Под "жидкой средой" понимается жидкая вода плюс относительно небольшие количества неорганических питательных веществ (например, N, P, K и так далее, как правило в их солевых формах) для фотоавтотрофных культур; и иногда также включающая определенные органические субстраты (например, сахарозу, глюкозу или ацетат) для фотомиксотрофных и/или фотогетеротрофных культур.
В особо предпочтительном варианте осуществления растение, используемое в способе продуцирования бутанола по данному изобретению, является водорослью или сине-зеленой водорослью. Использование водорослей и/или сине-зеленых водорослей имеет несколько преимуществ. Их можно вырастить в открытом пруду в больших количествах и при низких затратах. Сбор и ректификация бутанола из водной фазы также легко достигается посредством дистилляции/испарения или мембранной сепарации.
Водоросли, пригодные для использования в данном изобретении, включают как одноклеточные водоросли, так и многоклеточные формы одноклеточных водорослей. Многоклеточные водоросли, которые можно выбрать для использования в данном изобретении, включают, но без ограничений, крупные морские водоросли, такие как
Ulva latissima (ульва), Ascophyllum nodosum,
Codium fragile, Fucus vesiculosus, Eucheuma denticulatum, Gracilaria gracilis,
Hydrodictyon reticulatum, Laminaria japonica, Undaria pinntifida, Saccharina
japonica, Porphyra yezoensis и Porphyra tenera. Пригодные водоросли могут быть также выбраны из следующих отделов водорослей: зеленые водоросли (Chlorophyta), красные водоросли (Rhodophyta), бурые водоросли (Phaeophyta), диатомовые водоросли (Bacillariophyta) и сине-зеленые водоросли (Oxyphotobacteria, включая Cyanophyta и представителей Prochlorophyta). Пригодные порядки зеленых водорослей включают Ulvales, Ulotrichales, Volvo-cales, Chlorellales, SchizogoNiales, OedogoNiales, Zygnematales, Cladophorales, Siphonales и Dasycladales. Пригодными родами Rhodophyta являются Porphyra, Chondrus, Cyanidioschyzon, Porphyridium, Gracilaria, Kappaphycus, Gelidium и Agardhiella. Пригодными родами Phaeophyta являются Laminaria, Undaria, Mac-rocystis, Sargassum и Dictyosiphon. Пригодные роды Cyanophyta (также известного как Cyanobacteria) включают (но без ограничений) Phoridium, Synechocystis, Syncechococcus, Oscillatoria и Anabaena. Пригодные роды представителей Prochlorophyta (также известные как оксихлоробактерии) включают (но без ограничений) Prochloron, Prochlorothrix и Prochlorococcus. Пригодными родами Bacillariophyta являются Cyclotella, Cylindrotheca, Navicula, Thalassiosira и Phaeodactylum. Предпочтительные виды водорослей для использования в данном изобретении включают
Chlamydomonas reinhardtii, Platymonas subcordiformis, Chlorella fusca, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris, 'Chlorella' ellipsoidea, Chlorella spp., Dunaliella salina, Dunaliella viridis, Dunaliella bardowil, Haematococcus pluvialis; Parachlorella kessleri, Betaphycus gelatinum, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, Galdieria sulphuraria, Gelidiella acerosa, Gracilaria changii, Kappaphycus alvarezii, Porphyra miniata, Ostreococcus tauri, Porphyra yezoensis, Porphyridium sp., Palmaria palmata, Gracilaria spp., Isochrysis galbana, Kappaphycus spp., Laminaria japonica, Laminaria spp., Monostroma spp., Nannochloropsis oculata, Porphyra spp., Porphyridium spp., Undaria pinnatifida, Ulva lactuca, Ulva spp., Undaria spp., Phaeodactylum Tricornutum, Navicula saprophila, Crypthecodinium cohnii, Cylindrotheca fusiformis, Cyclotella cryptica, Euglena gracilis, Amphidinium sp., Symbiodinium microadriaticum, Macrocystis pyrifera, Ankistrodesmus braunii и Scenedesmus obliquus.
Предпочтительные виды сине-зеленых водорослей (оксифотобактерии, включая цианобактерии и оксихлоробактерии) для использования в данном изобретении включают
Thermosynechococcus elongatus ВР-1, Nostoc sp. PCC 7120,
Synechococcus elongatus PCC 6301, Syncechococcus sp. штамм PCC 7942,
Syncechococcus sp. штамм PCC 7002, Syncechocystis sp. штамм PCC 6803,
Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313,
Prochlorococcus marinus NATL1A, Prochlorococcus SSI20, Spirulina platensis
(Arthrospira platensis), Spirulina pacifica, Lyngbya majuscule, Anabaena sp., Synechocystis sp., Synechococcus elongates, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium
sp., Richelia intracellular is, Synechococcus WH7803, Synechococcus WH8102,
Nostoc punctiforme, Syncechococcus sp. штамм PCC 7943, дефицитный no
фикоцианину мутант PD-1 Synechocyitis PCC 6714, Cyanothece штамм 51142,
Cyanothece sp. CCY0110, Oscillatoria limosa, Lyngbya majuscula, Symploca
muscorum, Gloeobacter violaceus, Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica,
Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellular is, Prochlorococcus
marinus, Prochlorococcus SSI20, Synechococcus WH8102, Lyngbya majuscula,
Symploca muscorum, Synechococcus bigranulatus, криофильную Oscillatoria sp.,
Phormidium sp., Nostoc sp.-l, Calothrix parietina, термофильный Synechococcus
bigranulatus, Synechococcus lividus, термофильный Mastigocladus laminosus,
Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Synechococcus vulcanus, Synechococcus sp.
штамм MA4, Synechococcus sp. штамм MAI9 и Thermosynechococcus elongatus. Также существенным является подходящий выбор фотосинтетических организмов-хозяев по их генетическим фонам и определенным отдельным признакам. Например, фотосинтетическая продуцирующая бутанол сконструированная водоросль, созданная из криофильных водорослей (психрофилы), которые могут расти в снегу и льде, и/или из хладотолерантных штаммов хозяина, таких как холодовой штамм CCMG1619 Chlamydomonas, который был охарактеризован, как способный выполнять фотосинтетическое расщепление воды с температурой до 4°C (Lee, Blankinship and Greenbaum (1995), "Temperature effect on production of hydrogen and oxygen by Chlamydomonas cold strain CCMP1619 and wild type 137c," Applied Biochemistry and Biotechnology 51/52:379-386), дает возможность фотобиологического продуцирования бутанола даже в холодные времена года и в холодных регионах, таких как Канада. При
этом сконструированная водоросль, созданная из термофильного/теплотолерантного фотосинтетического организма, такого как термофильные водоросли Cyanidium caldarium и Galdieria sulphuraria и/или термофильные цианобактерии (сине-зеленые водоросли), такие как Thermosynechococcus elongatus BP-1 и Synechococcus bigranulatus, может позволить хорошо расширить осуществление на практике данного изобретения в теплые времена года или в зонах, таких как Мексика и Юго-Западный регион Соединенных Штатов, включая Неваду, Калифорнию, Аризону, Нью-Мехико и Техас, где погода часто может быть жаркой. Кроме того, сконструированная водоросль для фотосинтетического продуцирования бута-нола, созданная из морской водоросли, такой как Platymonas subcordiformis, позволит осуществлять на практике данное изобретение, используя морскую воду, в то время как сконструированная водоросль, созданная из пресноводной водоросли, такой как Chlamydomonas reinhardtii, может использовать пресную воду. Дополнительные факультативные признаки фотосинтетической продуцирующей бутанол сконструированной водоросли включают преимущества уменьшенного размера хлорофильной антенны, которая, как было показано, обеспечивает более высокую фотосинтетическую продуктивность (Lee, Mets, and Greenbaum (2002). "Improvement of photo synthetic efficiency at high light intensity through reduction of chlorophyll antenna size," Applied Biochemistry и Biotechnology, 98-100: 37-48) и толерантность к бутанолу, что позволяет более повышенное и эффективное фотосинтетическое продуцирование бутанола из CO2 и Н2О. С помощью дефицитного по фикоцианину мутанта Synechocystis PCC 6714 было экспериментально продемонстрировано, что фотоингибирование может быть также уменьшено с помощью уменьшения содержания светособирающих пигментов (Nakajima, Tsuzuki, and Ueda (1999) "Reduced pho-toinhibition of a phycocyanin-deficient mutant of Synechocystis PCC 6714", Journal of Applied Phycology 10: 447-452). Эти факультативные признаки могут включаться в сконструированную водоросль, например, с помощью мутанта, толерантного к бутанолу, и/или с дефицитом по хлорофильной антенне (например, Chlamydomonas reinhardtii штамм DS521) в качестве организма-хозяина, для генной трансформации сконструированными генами пути продуцирования бутанола. Поэтому в одном из различных вариантов осуществления водоросль-хозяина выбирают из группы, включающей зеленые водоросли, красные водоросли, бурые водоросли, сине-зеленые водоросли (оксифотобактерии, включая цианобактерии и прохло-рофиты), диатомовые водоросли, морские водоросли, пресноводные водоросли, одноклеточные водоросли, многоклеточные водоросли, крупные морские водоросли, хладотолерантные водорослевые штаммы, теплотолерантные водорослевые штаммы, мутантов с дефицитом по светособирающему антенному пигменту, толерантные к бутанолу водорослевые штаммы и их сочетания.
Создание сконструированного пути продуцирования бутанола у хозяина. Выбор подходящих сконструированных ферментов.
Одним из ключевых признаков в данном изобретении является создание сконструированного пути продуцирования бутанола для того, чтобы управлять и работать с естественными фотосинтетическими механизмами для достижения необходимого синтеза бутанола непосредственно из CO2 и Н2О. Естественные фотосинтетические механизмы включают (1) процесс фотосинтетического расщепления воды и транспорт электронов, сопряженный с протонным градиентом, через тилакоидную мембрану, который дает восстановительную способность (НАДФН) и энергию (АТФ), и (2) цикл Кальвина, который восстанавливает CO2 посредством потребления восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ).
В соответствии с данным изобретением используется ряд ферментов для создания сконструированного продуцирующего бутанол пути, который потребляет промежуточный продукт цикла Кальвина и превращает промежуточный продукт в бутанол как иллюстрируется на фиг. 1. "Сконструированный фермент пути продуцирования бутанола" в данном документе определяется как фермент, который служит в качестве катализатора, по меньшей мере, для одного из этапов в сконструированном пути продуцирования бутанола. В соответствии с данным изобретением ряд промежуточных продуктов цикла Кальвина может использоваться для создания сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола; а ферменты, необходимые для сконструированного пути продуцирования бутанола, выбирают в зависимости от какого промежуточного продукта цикла Кальвина ответвляется сконструированный путь продуцирования бутанола цикла Кальвина.
В одном примере сконструированный путь создается так, чтобы он потреблял глицеральдегид-3-фосфаты и превращал их в бутанол с помощью, например, набора ферментов, который включает, как показано с помощью числовых подписей 01-12 на фиг. 1, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу 01, фосфоглицераткиназу 02, фосфоглицератмутазу 03, энолазу 04, пируваткиназу 05, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу 06, тиолазу 07, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу 08, кротоназу 09, бутирил-КоА-дегидрогеназу 10, бутиральдегиддегидрогеназу 11 и бутанолдегидрогеназу 12. В этом сконструированном пути, ответвленном от глицеральдегидов-3-фосфата, для превращения двух молекул глицеральде-гид-3-фосфата в бутанол из НАД+ образуются две молекулы НАДН на этапе от глицеральдегид-3-фосфат до 1,3-дифосфоглицерата, который катализируется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой 01; при этом две молекулы НАДН превращаются в НАД+: одна на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой 08, при восстановлении ацетоацетил-КоА в 3- гидроксибутирил-КоА, а другая на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой 10, при восстановлении кротонил-КоА в бутирил-КоА. В результате, в этом сконструированном пути, ответвленном от глицеральдегидов-3-фосфата (01-12), коли
чество потребляемых молекул НАДН уравнены с количеством образованных молекул НАДН. Кроме того, как этап пути, катализируемый бутиральдегиддегидрогеназой 11 (при восстановлении бутирил-КоА до бутиральдегида), так и конечный этап, катализируемый бутанолдегидрогеназой 12 (при восстановлении бутиральдегида до бутанола), могут использовать НАДФН, который может быть образован фотосинтетическим расщеплением воды и процессом транспорта электронов, сопряженным с протонным градиентом. Следовательно, этот сконструированный путь продуцирования бутанола, ответвленный от глице-ральдегидов-3-фосфата, может функционировать непрерывно.
В другом примере сконструированный путь создают так, чтобы он потреблял промежуточный продукт, 3-фосфоглицерат, и превращал его в бутанол с помощью, например, набора ферментов, который включает (как показано с помощью числовых подписей 03-12 на фиг. 1) фосфоглицератмутазу 03, энола-зу 04, пируваткиназу 05, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу 06, тиолазу 07, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу 08, кротоназу 09, бутирил-КоА-дегидрогеназу 10, бутиральдегиддегидрогеназу 11 и бута-нолдегидрогеназу 12. Следует отметить, что последние десять ферментов (03-12) сконструированного пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфатов, (01-12) являются идентичными с теми, которые используются в сконструированном пути, ответвленном от 3-фосфоглицерата (03-12). Другими словами, сконструированные ферменты (01-12) пути, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфатов, позволяют получать бутанол как из точки 3-фосфоглицерата, так и из точки глицеральдегид-3-фосфатов в цикле Кальвина. Эти два пути, однако имеют разные характеристики. В отличие от пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата, путь, ответвленный от 3-фосфоглицерата, который состоит из активностей только десяти ферментов (03-12), не может самостоятельно образовывать сколько-либо НАДН, который необходим для использования в двух местах: один на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой 08, при восстановлении ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и другой на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой 10, при восстановлении кротонил-КоА в бутирил-КоА. То есть, если (или когда) используется 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа и/или бутирил-КоА-дегидрогеназа, которая может использовать строго только НАДН, но не НАДФН, для функционирования пути, ответвленного от 3-фосфоглицерата, (03-12) будет необходима поставка НАДН. Следовательно, для того, чтобы функционировал путь продуцирования бутанола, ответвленный от 3-фосфоглицерата, важно использовать 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу 08 и бутирил-КоА-дегидрогеназу 10, которые могут использовать НАДФН, которая может поставляться посредством фотоуправляемого процесса транспорта электронов.
Поэтому предпочтительной практикой является использование 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы и бутирил-КоА-дегидрогеназы, которые могут использовать НАДФН или и НАДФН, и НАДН (т.е., НАД(Ф)Н) для этого сконструированного пути продуцирования бутанола, ответвленного от 3-фосфоглицерата (03-12 на фиг. 1). Альтернативно, когда используются 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа и бутирил-КоА-дегидрогеназа, которые могут использовать только НАДН, здесь предпочтительно использовать дополнительный вариант осуществления изобретения, который может предоставить механизм превращения НАДФН/НАДН (для поставки НАДН посредством превращения НАДФН в НАДН, более детально смотри далее в тексте) в сконструированном организме, чтобы способствовать фотосинтетическому продуцированию бутанола посредством сконструированного пути, ответвленного от 3-фосфоглицерата.
В еще одном другом примере сконструированный путь создают так, чтобы он потреблял фруктоза-1,6-дифосфат и превращал его в бутанол с помощью, как показано с помощью числовых подписей 20-33 на фиг. 1, набора ферментов, который включает альдолазу 20, триозофосфатизомеразу 21, глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназу 22, фосфоглицераткиназу 23, фосфоглицератмутазу 24, энолазу 25, пируват-киназу 26, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу (или пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу) 27, тиолазу 28, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу 29, кротоназу 30, бутирил-КоА-дегидрогеназу 31, бутиральде-гиддегидрогеназу 32 и бутанолдегидрогеназу 33, при этом альдолаза 20 и триозофосфатизомераза 21 являются единственными двумя дополнительными ферментами, относящимися к сконструированному пути, ответвленному от глицеральдегид-3-фосфатов. Использование пируват-НАДФ+-оксидоредуктазы 27 (вместо пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы) при катализе превращения молекулы пирувата в ацетил-КоА делает возможным продуцирование НАДФН, который может использоваться в некоторых других этапах пути продуцирования бутанола. Добавление еще одного фермента в сконструированный организм, фосфофруктокиназы 19, позволяет создать другой сконструированный путь, который ответвляется от точки фруктоза-6-фосфата цикла Кальвина, для продуцирования бутанола. Наподобие пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата, как путь, ответвленный от фруктоза-1,6-дифосфата (20-33), так и путь, ответвленный от фруктоза-6-фосфата, (19-33) могут сами образовывать НАДН для использования в пути на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой 29, для восстановления ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой 31, для восстановления кротонил-КоА в бутирил-КоА. В каждом из этих сконструированных путей продуцирования бутанола количества расходуемых молекул НАДН уравновешены с количествами образованных молекул НАДН; и как бутиральдегиддегидрогеназа 32 (катализирующая этап при восстановлении бутирил-КоА в бутиральдегид), так и бутанолдегидрогеназа 33 (катализирую- 11
щая конечный этап при восстановлении бутиральдегида в бутанол) все могут использовать НАДФН, который может регенерироваться посредством фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом. Следовательно, эти сконструированные пути продуцирования бутанола могут функционировать непрерывно.
Табл. 1 перечисляет примеры ферментов, включающие те, которые указаны выше, для построения сконструированных путей продуцирования бутанола. В этом описании, когда речь идет о ферменте, таком как, например, любой из ферментов, перечисленных в табл. 1, он включает их изозимы, функциональные аналоги и сконструированные модифицированные ферменты, и их сочетания. Эти ферменты можно выбрать для использования при построении сконструированных путей продуцирования бутанола (таких как проиллюстрированные на фиг. 1). "Изозимы или функциональные аналоги" относятся к определенным ферментам, которые имеют тождественную каталитическую функцию, но могут обладать или не обладать совершенно тождественными белковыми структурами. Наиболее важным признаком фермента является его активный центр, который катализирует ферментативную реакцию. Поэтому определенный фрагмент(фрагменты) или субъединица(субъединицы) ферментного белка, который содержит такой активный каталитический центр, могут также быть выбраны для использования в данном изобретении. По различным причинам некоторые из естественных ферментов содержат не только важную каталитическую структуру, но также другие структурные компоненты, которые могут быть или не быть необходимыми для данного применения. Посредством техник молекулярного конструирования с помощью биоинформатики возможно выбрать важную каталитическую структуру (структуры) для использования при построении сконструированного ДНК-конструкта, кодирующего необходимый сконструированный фермент. Поэтому в одном из различных вариантов осуществления сконструированный ген фермента создают посредством искусственного синтеза ДНК-конструкта согласно молекулярному конструированию последовательности с помощью биоинформатики. С помощью подхода синтетической биологии при помощи компьютера любую последовательность ДНК (и таким образом структура ее белка) сконструированного фермента можно избирательно модифицировать для достижения более желаемых результатов посредством конструирования. Поэтому, выражения "сконструированные модифицированные последовательности" и "сконструированные модифицированные ферменты" в данном документе определяются как последовательности ДНК и ферментные белки, которые модифицированы посредством молекулярного конструирования с помощью биоинформатики. Например, когда ДНК-конструкт для сконструированного хлоропласт-нацеленного фермента сконструирован из последовательности митохондриального фермента, предпочтительной практикой является модифицирование некоторых белковых структур посредством, например, избирательного вырезания определенного структурного компонента(компонентов), такого как его последовательность митохондриальных транзитных пептидов, которая является непригодной для данного использования, и/или путем добавления определенных пептидных структур, таких как экзогенная последовательность хлоропластного транзитного пептида (например, 135-по (пар оснований) транзитный пептид малой субъединицы Rubisco (RbcS2)), которая необходима для предоставления способности сконструированного белка у хлоропласт-нацеленой вставки. Следовательно, один из различных вариантов осуществления гибко применяет ферменты, их изозимы, функциональные аналоги, сконструированные модифицированные ферменты, и/или их сочетания при построении сконструированного пути (путей) продуцирования бутанола.
Как показано в табл. 1, многие гены ферментов, указанных выше, были клонированы и/или секве-нированы из различных организмов. Данные последовательностей как геномной ДНК, так и/или мРНК могут быть использованы при конструировании и синтезе сконструированных ДНК-конструктов для трансформации хозяйской водоросли, оксифотобактерии, растения, растительной ткани или клеток для создания сконструированного организма для фотобиологического продуцирования бутанола (фиг. 1). Однако из-за возможных вариаций, часто связанных с различными организмами-источниками и клеточными компартментами по отношению к отдельному организму-хозяину и его хлоропласт/тилакоидному окружению, где для работы с циклом Кальвина сконструирован(ы) путь(пути) продуцирования бутанола, для правильной работы сконструированного ДНК-конструкта при конструировании ДНК-конструкта (фиг. 2) часто необходима определенная работа из области техники молекулярной инженерии, включая оптимизацию использования кодона и модификацию последовательности. Например, при создании продуцирующей бутанол сконструированной эукариотической водоросли, в случае, если исходные последовательности происходят из цитозольных ферментов (последовательностей), функциональная хлоропласт-нацеливающая последовательность может быть присоединена для обеспечения способности сконструированного фермента, который кодируется внеядерным геном, вставляться в хозяйский хлоропласт для предоставления ему функции сконструированного пути продуцирования бутанола. Кроме того, для обеспечения способности переключаться на сконструированный путь продуцирования бутанола также важно включить функциональную последовательность индуцибельного промотора, например, промотора гид-рогеназы (Hyd1) или гена нитратредуктазы (Nia1), или гена нитритредуктазы (nirA) в определенном сконструированном ДНК-конструкте(конструктах), как проиллюстрировано на фиг. 2А, для контроля экспрессии сконструированного гена(генов). Кроме того, как указывалось ранее, определенные функциональные производные или фрагменты этих ферментов (последовательностей), последовательностей
хлоропласт-нацеливающих транзитных пептидов и последовательностей индуцибельных промоторов можно также выбрать для использования полностью, частично или в их сочетаниях для создания сконструированных организмов согласно различным вариантам осуществления данного изобретения. Методы при создании и использовании сконструированных организмов дополнительно описаны далее в данном документе.
Табл. 1 перечисляет примеры ферментов для построения сконструированных путей продуцирования бутанола.
Фермент
Источник (организм)
Регистрационный номер GenBank, идентификатор белка (protein ID) no IGI (loint Genome Institute) или ссылка на него
Бутанолдегидрогеназа
Clostridium
saccharoperbutylacetonicum; Propionibacterium freudenreichii; Trichomonas vaginalis; Aeromonas hydrophila; Clostridium beijerinckii; Clostridium acetobutylicum
GenBank: АВ257439; AJ508920; AF112135; AF388671; AF157307; M96946, M96945
Бутиральдегиддегидро -геназа
Clostridium
saccharoperbutylacetonicum
GenBank: AY251646
Бутирил-КоА-дегидрогеназа
Clostridium beijerinckii; Butyrivibrio fibrisolvens; продуцирующая бутират бактерия L2-50; Thermo anaerobacterium thermosaccharolyticum;
GenBank: AF494018; AB190764; DQ987697; Z92974
Кротоназа
Clostridium beijerinckii; Butyrivibrio fibrisolvens; продуцирующая бутират бактерия L2-50; Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum;
GenBank: AF494018; AB 190764; DQ987697; Z92974
3 -гидроксибутирил-
Clostridium beijerinckii; Butyrivibrio fibrisolvens; Ajellomyces capsulatus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus clavatus; Neosartorya fischeri; продуцирующая бутират бактерия L2-50; Arabidopsis thaliana; Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum;
GenBank: AF494018; AB 190764; XM_001537366; XM_741533; XM_001274776; XM_001262361; DQ987697; BT001208; Z92974
Тиолаза
Butyrivibrio fibrisolvens; продуцирующая бутират бактерия L2-50; Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum;
GenBank: AB 190764; DQ987697; Z92974
Глицеральдегид-З-
Me so stigma viride цитозоль;
GenBank: DQ873404;
фосфатдегидрогеназа
Triticum aestivum цитозоль;
EF592180; L27668;
Chlamydomonas reinhardtii
XM_001549497;
хлоропласт; Botryotinia fuckeliana;
J01324; M18802;
Saccharomyces cerevisiae;
EU078558;
Zymomonas mobilis; Karenia brevis;
XM_001539393;
Ajellomyces capsulatus; Pichia
XM_0013 86423,
stipitis; Pichia guilliermondii;
XM_001386568;
Kluyveromyces marxianus, Triticum
XM_001485596;
aestivum; Arabidopsis thaliana; Zea
DQ681075; EF592180;
mays цитозольная
NM_101214; U45857,
ZMU45856, U45855
Фософоглицераткиназа
Chlamydomonas reinhardtii
GenBank: U14912,
хлоропласт; Plasmodium vivax;
AF244144;
Babesia bovis; Botryotinia
XM_001614707;
fuckeliana; Monocercomonoides sp.;
XM_001610679;
Lodderomyces elongisporus; Pichia
XMOO1548271;
guilliermondii; Arabidopsis
DQ665858;
thaliana; Helianthus annuus; Oryza
XM_001523 843;
sativa; Dictyostelium discoideum;
XM_001484377;
Euglena gracilis; Chondrus crispus;
NM_179576;
Phaeodactylum tricornutum;
DQ835564; EF122488;
Solanum tuberosum
AF316577;
AY647236;
AY029776;
AF108452; AF073473
Фосфоглицератмутаза
Chlamydomonas reinhardtii
JGI Chlre2 protein ID
(фосфоглицеромутаза)
цитоплазма; Aspergillus fumigatus;
161689, GenBank:
Coccidioides immitis; Leishmania
AF268078;
braziliensis; Ajellomyces capsulatus;
XM_747847;
Monocercomonoides sp.; Aspergillus
XM_749597:
clavatus; Arabidopsis thaliana; Zea
XM_001248115;
mays
XM_001569263;
XM_001539892
DQ665859;
XM_001270940
NM_117020; M80912
Энолаза
Chlamydomonas reinhardtii
GenBank: X66412,
цитоплазма; Arabidopsis thaliana;
P31683; AK222035;
Leishmania Mexicana;
DQ221745;
Lodderomyces elongisporus;
XM 001528071;
Babesia bovis; Sclerotinia
XM_001611873;
sclerotiorum; Pichia guilliermondii;
XM_001594215;
Spirotrichonympha leidyi; Oryza
XM_001483612;
sativa; Trimastix pyriformis;
AB221057; EF122486,
Leuconostoc mesenteroides;
U09450; DQ845796;
Davidiella tassiana; Aspergillus
AB088633; U82438;
oryzae; Schizosaccharomyces
D64113; U13799;
pombe; Brassica napus; Zea mays
AY307449; U17973
Пируваткиназа
Chlamydomonas
reinhardtii
JGI Chlre3 protein ID
цитоплазма; Arabidopsis thaliana;
138105; GenBank:
Saccharomyces cerevi
siae; Babesia
AK229638;
bovis; Sclerotinia
sclerotiorum;
AY949876,
Trichomonas vaginalis; Pichia
AY949890,
guilliermondii; Pichia stipitis;
AY949888;
Lodderomyces
elongisporus;
XM_001612087
Coccidioides immitis; Trimastix
XM_001594710
pyriformis; Glycine max (соя)
XM_001329865
XM_001487289
XM_0013 84591
XM_001528210
XM_001240868
DQ845797; L08632
Фосфофруктокиназа
Chlamydomonas
reinhardtii;
JGI Chlre2 protein ID
Arabidopsis thaliana,
Ajellomyces
159495; GenBank:
capsulatus; Yarrowia lipolytica;
NM_001037043
Pichia stipitis;
Dictyostelium
NM_179694,
discoideum;
Tetrahymena
NM_119066,
thermophila; Trypanosoma brucei;
NM_125551;
Plasmodium falciparum; Spinacia
XM_001537193
oleracea;
AY142710;XM_
00138
2359, XM_001383014;
XM_639070;
XM_001017610
XM_838827;
XM_001347929
DQ437575;
Фруктозодифосфат-
Chlamydomonas reinhardtii
GenBank: X69969;
альдолаза
хлоропласт; Fragaria х ananassa
AF308587;
цитоплазма; Homo sapiens;
NM_005165;
Babesia bovis; Trichomonas
XM_001609195;
vaginalis; Pichia stipitis;
XM_001312327,
Arabidopsis thaliana
XM_001312338;
XM_001387466;
NM_120057,
NM_001036644
Триозофосфатизомераз
Arabidopsis thaliana;
GenBank:
Chlamydomonas reinhardtii;
NM_127687,
Sclerotinia sclerotiorum; Chlorella
AF247559;
pyrenoidosa; Pichia guilliermondii;
AY742323;
Euglena intermedia; Euglena longa;
XM 001587391;
Spinacia oleracea; Solanum
AB240149;
chacoense; Hordeum vulgare; Oryza
XM_001485684;
sativa
DQ459379;
AY742325; L36387;
AY438596; U83414;
EF575877;
Глюкозо-1 -фосфат
Arabidopsis thaliana; Zea mays;
GenBank:
аденилилтрансфераза
Chlamydia trachomatis; Solanum
NM_127730,
tuberosum (картофель); Shigella
NM_124205,
flexneri; Lycopersicon esculentum
NM_121927,
AY059862; EF694839,
EF694838; AF087165;
P55242; NP_709206;
T07674
Крахмалсинтаза
Chlamydomonas reinhardtii; Phaseolus vulgaris; Oryza sativa; Arabidopsis thaliana; Colocasia esculenta; Amaranthus cruentus; Parachlorella kessleri; Triticum aestivum; Sorghum bicolor; Astragalus membranaceus; Perilla frutescens; Zea mays; Ipomoea batatas
GenBank: AF026422,
AF026421,DQ019314,
AF433156; AB293998;
D16202, AB115917,
AY299404; AF121673,
AK226881;
NM_101044;
AY225862,
AY142712;
DQ178026;
AB232549; Y16340; AF168786; AF097922; AF210699; AF019297; AF068834
Альфа-амилаза
Hordeum vulgare клетки алейронового слоя; Trichomonas vaginalis; Phanerochaete chrysosporium; Chlamydomonas reinhardtii; Arabidopsis thaliana; Dictyoglomus thermophilum ген теплостойкой амилазы;
GenBank: J04202; XM_001319100; EF143986; AY324649; NM_129551;X07896
Бета-амилаза
Arabidopsis thaliana; Hordeum vulgare; Musa acuminata
GenBank:
NM 113297; D21349;
DQ166026
Крахмалфосфорилаза
Citrus hybrid cultivar корень; Solanum tuberosum хлоропласт; Arabidopsis thaliana; Triticum aestivum; Ipomoea batatas
Genbank: AY098895; P53535; NM_113857, NM_114564; AF275551;M64362
Фосфоглюкомутаза
Oryza sativa пластида; Ajellomyces capsulatus; Pichia stipitis; Lodderomyces elongisporus; Aspergillus fumigatus; Arabidopsis thaliana; Populus tomentosa; Oryza sativa; Zea mays
GenBank: AC 105932, AF455812; XM_001536436; XM 001383281; XM_001527445; XM_749345; NM_124561, NM_180508, AY128901; AY479974;
AF455812; U89342, U89341
Глюкозофосфат(глюко
зо-6-фосфат)-
изомераза
Chlamydomonas reinhardtii; Saccharomyces cerevisiae; Pichia stipitis; Ajellomyces capsulatus; Spinacia oleracea цитозоль; Oryza sativa цитоплазма; Arabidopsis thaliana; Zea mays
JGI Chlre3 protein ID 135202; GenBank: M21696; XM_001385873; XM_001537043; T09154; P42862; NM_123638, NM_118595; U17225
Гексокиназа
Ajellomyces capsulatus; Pichia
GenBank:
(глкжокиназа)
stipitis; Pichia angusta;
XM_001541513;
Thermosynechococcus elongates;
XM_0013 86652,
Babesia bovis; Solanum chacoense;
AY278027;
Oryza sativa; Arabidopsis thaliana
XM_001386035;
NC_004113;
XM_001608698;
DQ177440;
DQ116383;
NM_112895
НАДФ(Н)-фосфатаза
Methanococcus jannaschii
The Journal Of
Biological Chemistry
280 (47): 39200-39207
(2005)
НАД-киназа
Babesia bovis; Trichomonas
GenBank:
vaginalis
XM_001609395;
XM_001324239
Пируват-НАДФ+-
Peranema trichophorum; Euglena
GenBank: EF114757;
оксиредуктаза
gracilis
AB021127, AJ278425
Пируват-ферредоксин-
Mastigamoeba balamuthi;
GenBank: AY101767;
оксидоредуктаза
Desulfovibrio africanus; Entamoeba
Y09702; U30149;
histolytica; Trichomonas vaginalis;
XM_001582310,
Cryptosporidium parvum;
XM_001313670,
Cryptosporidium baileyi; Giardia
XM_001321286,
lamblia; Entamoeba histolytica;
XM_001307087,
Hydrogenobacter thermophilus;
XM_001311860,
Clostridium pasteurianum;
XM_001314776,
XM_001307250;
EF030517; EF030516;
XM_764947;
XM_651927;
AB042412; Y17727
Нацеливание сконструированных ферментов на стромальную область хлоропластов
Некоторые из сконструированных ферментов, обсуждаемых выше, таких как, пируват-ферредоксин-оксидоредуктаза, тиолаза, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа, кротоназа, бутирил-КоА-дегидрогеназа, бутиральдегиддегидрогеназа и бутанолдегидрогеназа, как известно, функционируют в определенных особых бактериях, таких как Clostridium; но растительные хлоропласты дикого типа, в общем, не обладают этими ферментами для функционирования с циклом Кальвина. Поэтому, в одном из различных вариантов осуществления при создании продуцирующего бутанол сконструированного эука-риотического организма, сконструированные нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, экс-прессируются в хлоропласте(хлоропластах) клетки-хозяина. Этого можно достичь посредством доставки сконструированного гена(генов) пути продуцирования бутанола в геном хлоропласта эукариотической клетки-хозяина, как правило, с помощью генной пушки. В определенной степени молекулярная генетика хлоропластов подобна таковой цианобактерий. После доставки в хлоропласт сконструированный ДНК-конструкт, который содержит пару подходящих сайтов рекомбинации, как иллюстрируется на фиг. 2F, может включаться в хлоропластный геном посредством естественного процесса двойной рекомбинации гомологичных ДНК.
В другом варианте осуществления данного изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, создаются посредством генной инженерии таким образом, чтобы экспрессированные ферменты вставлялись в хлоропласты для функционирования там с циклом Кальвина. В зависимости от генетического фона конкретного организма-хозяина, некоторые из сконструированных ферментов, обсуждаемых выше, такие как фосфоглицератмутаза и энолаза, могут существовать при некоторых фоновых
уровнях в их природной форме в хлоропласте дикого типа. Однако по различным причинам, включая обычно недостаток их контролируемости, некоторые фоновые ферменты хлоропласта могут быть или не быть достаточными, чтобы служить в качестве значительной части сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Кроме того, ряд пригодных индуцибельных промоторов, как оказалось, функционируют в ядерном геноме. Например, и промотор гидрогеназы (Hyd1), и промотор нитратредуктазы (Nia1), которые могут использоваться для контроля экспрессии сконструированных путей продуцирования бутанола, расположены в ядерном геноме Chlamydomonas reinhardtii, геном которой недавно был секвенирован. Поэтому, в одном из различных вариантов осуществления данного изобретения предпочтительно использовать сконструированные гены, которые могут кодироваться ядерным геномом, для предоставления переключаемого пути продуцирования бутанола. В результате нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, также необходимо создать генной инженерией посредством соответствующей модификации последовательности так, чтобы ферменты контролируемо экспрессировались и вставлялись в хлоропласты для создания сконструированного пути продуцирования бутанола.
Согласно одному из различных вариантов осуществления лучше всего экспрессировать сконструированные ферменты продуцирующего бутанол пути только в хлоропластах (в стромальной области), как раз именно где необходимо действие ферментов для обеспечения возможности фотосинтетического продуцирования бутанола. Если экспрессировать без механизма вставки, нацеленной на хлоропласт, ферменты будут просто оставаться в цитозоле и не будут способны непосредственно взаимодействовать с циклом Кальвина для продуцирования бутанола. Поэтому, кроме очевидных отличительных признаков при конструировании и связанных подходах, другим значительным отличием является то, что один из различных вариантов осуществления инновационно задействует нацеленный на хлоропласт механизм для генетической вставки многочисленных сконструированных ферментов пути продуцирования бута-нола в хлоропласт для непосредственного взаимодействия с циклом Кальвина для фотобиологического продуцирования бутанола.
С помощью нацеленного на строму хлоропласта механизма клетки будут в состоянии не только продуцировать бутанол, но также расти и регенерировать сами себя, когда они возвращаются в определенные условия, при которых выключается сконструированный путь, например, при аэробных условиях, в случае, когда используются сконструированные гены пути продуцирования бутанола, контролируемые промотором гидрогеназы. Сконструированные водоросли, растения или растительные клетки, которые содержат нормальные митохондрии, должны быть в состоянии использовать восстановительную способность (НАДН) из органических запасов (и/или некоторого экзогенного органического субстрата, такого как ацетат или сахар) для снабжения энергией клеток сразу после возвращения в аэробные условия. В результате, когда сконструированные водоросли, растения или растительные клетки возвращаются в аэробные условия после использования в анаэробных условиях для фотосинтетического продуцирования бутанола, клетки прекратят образование ферментов продуцирующего бутанол пути и начнут восстанавливать нормальную фотоавтотрофную способность посредством синтеза новых и функциональных хло-ропластов. Поэтому возможно использовать такие созданные посредством генной инженерией сконструированные водорослевые/растительные организмы для повторяющихся циклов фотоавтотрофного роста при нормальных аэробных условиях и эффективного продуцирования бутанола непосредственно из CO2 и Н2О при определенных специфических сконструированных условиях для продуцирования бутано-ла, например, при анаэробных условиях и/или в присутствии нитрата, когда используется путь продуцирования бутанола, контролируемый промотором Nia1.
Нацеленная вставка сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола может достигаться посредством использования ДНК-последовательности, которая кодирует стромальный "сигнальный" пептид. Сигнальный (транзитный) пептид белка стромы направляет транспорт и вставку вновь синтезированного белка в строму. В соответствии с одним из различных вариантов осуществления специфическая нацеливающая ДНК-последовательность предпочтительно расположена между промотором и последовательностью сконструированного фермента пути продуцирования бутанола, как показано в сконструированном ДНК-конструкте (фиг. 2A). Эта нацеливающая последовательность кодирует сигнальный (транзитный) пептид, который синтезируется в качестве части апобелка фермента в цитозоле. Транзитный пептид руководит вставкой апобелка сконструированного фермента пути продуцирования бутанола из цитозоля в хлоропласт. После того, как апобелок вставляется в хлоропласт, транзитный пептид отщепляется от апобелка, который затем становится активным ферментом.
Ряд последовательностей транзитных пептидов пригодны для использования для нацеленной вставки сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола в хлоропласт, включая, но без ограничений, последовательности транзитных пептидов: гидрогеназных апобелков (таких как HydA1 (Hyd1) и HydA2, регистрационный номер GenBank AJ308413, AF289201, AY090770), апобелка ферредоксина (Frx1, регистрационные номера L10349, Р07839), апобелка тиоредоксина m (Trx2, X62335), апобелка глютаминсинтазы (Gs2, Q42689), LhcII апобелков (AB051210, AB051208, AB051205), PSII-T апобелка (PsbT), PSII-S апобелка (PsbS), PSII-W апобелка (PsbW), апобелка у-субъединицы CF0CF1 (AtpC), апобелка 5-субъединицы CF0CF1 (AtpD, U41442), апобелка субъединицы-II CF0CF1 (AtpG), апобелков фотосис
темы I (PSI) (таких как генов PsaD, PsaE, PsaF, PsaG, PsaH, и PsaK), апобелков SSU Rubisco (таких как RbcS2, X04472). В этом описании, когда речь идет о последовательности транзитного пептида, такой как, например, любой из последовательности транзитного пептида, описанной выше, она включает их функциональные аналоги, модифицированные сконструированные последовательности и их сочетания. "Функциональный аналог" или "модифицированная сконструированная последовательность" в этом контексте относится к пептидной последовательности, полученной или модифицированной (посредством, например, консервативной замены, средней делеции или удаления аминокислоты, или модификации боковых цепочек аминокислот) на основе нативной последовательности транзитного пептида, такой как те, которые указаны выше, которая имеет такую же функцию как нативная последовательность транзитного пептида, т.е., выполнение нацеленной вставки необходимого фермента.
В определенных отдельных вариантах осуществления следующие последовательности транзитных пептидов используются для того, чтобы направлять вставку сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола в стромальную область хлоропласта: транзитный пептид Hyd1 (имеющий аминокислотную последовательность: msalvlkpca avsirgsscr arqvaprapl aastvrvala tleaparrlg nvacaa (SEQ ID NO: 54)), транзитные пептиды RbcS2 (имеющие аминокислотную последовательность: maaviakssv saavarpars svrp-maalkp avkaapvaap aqanq (SEQ ID NO: 55)), транзитный пептид ферредоксина (имеющий аминокислотную последовательность: mamamrs (SEQ ID NO: 56)), транзитный пептид 5-субъединицы CF0CF1 (имеющий аминокислотную последовательность: mlaaksiagp rafkasavra apkagrrtw vma (SEQ ID NO: 57)), их аналоги, функциональные производные, сконструированные последовательности и их сочетания.
Применение генетического переключателя для контроля экспрессии сконструированного
продуцирующего бутанол пути
Другим ключевым признаком данного изобретения является применение генетического переключателя для контроля экспрессии сконструированного продуцирующего бутанол пути(путей), как проиллюстрировано на фиг. 1. Эта переключающая способность достигается посредством использования извне индуцибельного промотора так, что сконструированные трансгены индуцибельно экспрессируются при определенных специфических индуцирующих условиях. Предпочтительно, промотор, применяемый для контроля экспрессии сконструированных генов в хозяине, происходит от собственно хозяина или близкородственного организма. Активности и индуцибельность промотора в клетке-хозяине может проверяться посредством размещения промотора перед геном-репортером, введения этого конструкта-репортера в ткань или клетки хозяина любой известной техникой доставки ДНК и оценки экспрессии гена-репортера.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения индуцибельный промотор, применяемый для контроля экспрессии сконструированных генов, является промотором, который индуцируется анаэробиозом, т.е., активным при анаэробных условиях, но неактивным при аэробных условиях. Сконструированный водорослевый/растительный организм может осуществлять автотрофный фотосинтез, используя CO2 как источник углерода при аэробных условиях, а когда культура сконструированных организмов выращена и готова для фотосинтетического продуцирования бутанола, будут применены анаэробные условия для включения промотора и сконструированных генов, которые кодируют сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола.
Ряд промоторов, которые становятся активными при анаэробных условиях, пригодны для использования в данном изобретении. Например, промоторы генов гидрогеназ Chlamydomonas reinhardtii (HydA1 (Hyd1) и HydA2, регистрационный номер GenBank: AJ308413, AF289201, AY090770), которые активны при анаэробных условиях, но неактивны при аэробных условиях, могут использоваться в качестве эффективного генетического переключателя для контроля экспрессии сконструированных генов в водоросли-хозяине, такой как Chlamydomonas reinhardtii. Фактически, клетки Chlamydomonas содержат несколько ядерных генов, которые координационно индуцируются при анаэробных условиях. Они включают собственно структурный ген гидрогеназы (Hyd1), ген Cyc6, кодирующий апобелок цитохрома C6, и ген Cpx1, кодирующий копрогеноксидазу. Регуляторные участки для последних двух были хорошо охарактеризованы, а участок приблизительно из 100 по оказывается достаточным для предоставления регуляции посредством анаэробиоза у синтетических генных конструктов (Quinn, Barraco, Ericksson and Merchant (2000). "Coordinate copper- and oxygen-responsive Cyc6 and Cpx1 expression in Chlamydomonas is mediated by the same element." J Biol Chem 275: 6080-6089). Хотя вышеупомянутые индуцибельные водорослевые промоторы могут быть пригодны для использования в других растениях-хозяевах, особенно в растениях близкородственных к водорослям, промоторы гомологичных генов из этих других растений, включая высшие растения, можно получить и задействовать для контроля экспрессии сконструированных генов в этих растениях.
В другом варианте осуществления индуцибельный промотор, используемый в данном изобретении, является промотором водорослевой нитратредуктазы (Nia1), который индуцируется ростом в среде, содержащей нитрат, и подавляется в среде с дефицитом по нитрату, но содержащей аммоний (Loppes and Radoux (2002) "Two short regions of the promoter are essential for activation and repression of the nitrate re-ductase gene in Chlamydomonas reinhardtii" Mol Genet Genomics 268: 42-48). Поэтому промотор Nia1 (регистрационный номер гена AF203033) можно выбрать для использования, чтобы контролировать экс
прессию сконструированных генов в водоросли согласно концентрационным уровням нитрата и аммония в культуральной среде. Дополнительные индуцибельные промоторы, которые также можно выбрать для использования в данном изобретении, включают, например, промотор белка теплового шока HSP70A (регистрационный номер: DQ059999, AY456093, М98823; Schroda, Blocker, Веек (2000) The HSP70A promoter as a tool for the improved expression of transgenes in Chlamydomonas. Plant Journal 21:121-131), промотор гена CabII-1 (регистрационный номер М24072), промотор гена Ca1 (регистрационный номер Р20507) и промотор гена Ca2 (регистрационный номер Р24258).
В случае сине-зеленых водорослей (оксифотобактерий, включая цианобактерии и оксихлоробакте-рии), есть также ряд индуцибельных промоторов, которые можно выбрать для использования в данном изобретении. Например, промоторы генов hox анаэробно-чувствительной двухсторонней гидрогеназы Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank: BA000019), Prochlorothrix hollandica (GenBank: U88400; промотор hox-UYH оперона), Synechocystis sp. штамм PCC 6803 (CyanoBase: sll1220 и sll1223), Synechococcus elongatus PCC 6301 (CyanoBase: syc1235_c), Arthrospira platensis (GenBank: ABC26906), Cyanothece sp. CCYO 110 (GenBank: ZP01727419) и Synechococcus sp. PCC 7002 (GenBank: AAN03566), которые активны при анаэробных условиях, но неактивны при аэробных условиях (Sjoholm, Oliveira, and Lindblad (2007) "Transcription and regulation of the bidirectional hydrogenase in the Cyanobacterium Nostoc sp. strain PCC 7120," Applied and Environmental Microbiology, 73(17): 5435-5446), могут использоваться как эффективный генетический переключатель для контроля экспрессии сконструированных генов в оксифотобактерии-хозяине, такой как Nostoc sp. PCC 7120, Synechocystis sp. штамм PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 6301, Cyanothece sp. CCY0110, Arthrospira platensis или Synechococcus sp. PCC 7002.
В другом варианте осуществления при создании переключаемых сконструированных организмов для продуцирования бутанола, таких как переключаемые сконструированные оксифотобактерии, инду-цибельный промотор, выбранный для использования, является промотором нитритредуктазы (nirA), который индуцируется ростом в среде, содержащей нитрат, и подавляется в среде с дефицитом по нитрату, но содержащей аммоний (Qi, Hao, Ng, Slater, Baszis, Weiss, and Valentin (2005) "Application of the Syne-chococcus nirA promoter to establish an inducible expression system for engineering the Synechocystis toco-pherol pathway," Applied and Environmental Microbiology, 71(10): 5678-5684; Maeda, Kawaguchi, Ohe, and Omata (1998) "си-Acting sequences required for NtcB-dependent, nitrite-responsive positive regulation of the nitrate assimilation operon in the Cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942," Journal of Bacteriology, 180(16):4080-4088). Поэтому последовательности промотора nirA можно выбрать для использования, чтобы контролировать экспрессию сконструированных генов у ряда оксифотобактерий, согласно концентрационным уровням нитрата и аммония в культуральной среде. Последовательности nirA промотора, которые можно выбрать и модифицированы для использования, включают (но без ограничений) nirA промоторы из следующих оксифотобактерий: Synechococcus elongatus PCC 6301 (GenBank: AP008231, участок 355890-255950), Synechococcus sp. (GenBank: X67680.1, D16303.1, D12723.1 и D00677), Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank: NP 442378, BA000022, AB001339, D63999-D64006, D90899-D90917), Anabaena sp. (GenBank: X99708.1), Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank: BA000019.2 и AJ319648), Plectonema bory-anum (GenBank: D31732.1), Synechococcus elongatus PCC 7942 (GenBank: P39661, CP000100.1), Thermo synechococcus elongatus BP-1 (GenBank: BAC08901, NP_682139), Phormidium laminosum (GenBank: CAA79655, Q51879), Mastigocladus laminosus (GenBank: ABD49353, ABD49351, ABD49349, ABD49347), Anabaena variabilis ATCC 29413 (GenBank: YP 325032), Prochlorococcus marinus str. MIT 9303 (GenBank: YP 001018981), Synechococcus sp. WH 8103 (GenBank: AAC17122), Synechococcus sp. WH 7805 (GenBank: ZP 01124915) и Cyanothece sp. CCY0110 (GenBank: ZP 01727861).
В еще одном варианте осуществления индуцибельный промотор, выбранный для использования, является свето- и теплочувствительным промотором гена шаперона groE, который может индуцироваться теплом и/или светом (Kojima and Nakamoto (2007) "A novel light- and heat-responsive regulation of the groE transcription in the absence of HrcA or CIRCE in cyanobacteria," FEBS Letters 581 : 1871-1880). Ряд промоторов groE, таких как промоторы groES и groEL (шаперонов), доступны для использования в качестве индуцибельного промотора при контроле экспрессии сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола. GroE промоторные последовательности, которые можно выбрать и модифицировать для использования в одном из различных вариантов осуществления, включают (но без ограничений) промоторы groES и/или groEL из следующих оксифотобактерий: Synechocystis sp. (GenBank: D 12677.1),
Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank: BA000022.2), Synechococcus elongatus PCC 6301 (GenBank:
АР008231.1) Synechococcus sp (GenBank: M58751.1), Synechococcus elongatus PCC 7942 (GenBank:
CP000100.1), Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank: BA000019.2), Anabaena variabilis ATCC 29413 (GenBank:
CP000117.1), Anabaena sp. L-31 (GenBank: AF324500); Thermosynechococcus elongatus BP-1 (CyanoBase:
tll0185, tll0186), Synechococcus vulcanus (GenBank: D78139), Oscillatoria sp. NKBG091600 (GenBank:
AF054630), Prochlorococcus marinus MIT9313 (GenBank: BX572099), Prochlorococcus marinus str. MIT
9303 (GenBank: CP000554), Prochlorococcus marinus str. MIT 9211 (GenBank: ZP_01006613), Synechococ-cus sp. WH8102 (GenBank: BX569690), Synechococcus sp. CC9605 (GenBank: CP000110), Prochlorococcus
marinus subsp. marinus штамм CCMP1375 (GenBank: AE017126) и Prochlorococcus marinus MED4 (Gen-
Bank: BX548174).
Дополнительные индуцибельные промоторы, которые могут быть также выбраны для использования в данном изобретении, включают: например, металл (цинк)-индуцибельный smt промотор Synecho-coccus PCC 7942 (Erbe, Adams, Taylor and Hall (1996) "Cyanobacteria carrying an smt-lux transcriptional fusion as biosensors for the detection of heavy metal cations," Journal of Industrial Microbiology, 17:80-83); же-лезочувствительный idiA промотор Synechococcus elongatus PCC 7942 (Michel, Pistorius, and Golden (2001) "Unusual regulatory elements for iron deficiency induction of the idiA gene of Synechococcus elongatus PCC 7942" Journal of Bacteriology, 183(17):5015-5024); редокс-чувствительный цианобактериальный crhR промотор (Patterson-Fortin, Colvin and Owttrim (2006) "A LexA-related protein regulates redox-sensitive expression of the cyanobacterial RNA helicase, crhR", Nucleic Acids Research, 34(12):3446-3454); промотор гена теплового шока hsp16.6 Synechocystis sp. PCC 6803 (Fang and Barnum (2004) "Expression of the heat shock gene hsp16.6 and promoter analysis in the Cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803," Current Microbiology 49:192-198); промотор малого белка теплового шока (Hsp), такой как промотор гена hspA Synechococcus vulcanus (Nakamoto, Suzuki, and Roy (2000) "Constitutive expression of a small heat-shock protein confers cellular thermotolerance and thermal protection to the photosynthetic apparatus in cyanobacteria," FEBS Letters 483:169-174); чувствительные к CO2 промоторы гена оксифотобактериальной карбоангидразы (GenBank: EAZ90903, EAZ90685, ZP 01624337, EAW33650, АВВ17341, ААТ41924, САО89711, ZP 00111671, YP 400464, AAC44830; и CyanoBase: all2929, PMT1568 slr0051, slr1347 и syc0167_c); промоторы гена нитратредуктазы (narB) (такие как с регистрационными номерами GenBank: BAC08907,
NP_682145, AAO25121; ABI46326, YP_732075, BAB72570, NP_484656); чувствительные к зеленому/красному свету промоторы, такие как светорегулируемый срсВ2А2 промотор Fremyella diplosiphon (Casey and Grossman (1994) "In vivo and in vitro characterization of the light-regulated cpcB2A2 promoter of Fremyella diplosiphont" Journal of Bacteriology, 176(20):6362-6374); и чувствительные к УФ-свету промоторы цианобактериальных генов lexA, recA и ruvB (Domain, Houot, Chauvat, and Cassier-Chauvat (2004) "Function and regulation of the cyanobacterial genes lexA, recA and ruvB: LexA is critical to the survival of cells facing inorganic carbon starvation," Molecular Microbiology, 53(1): 65-80).
Кроме того, также в одном из различных вариантов осуществления определенные "полуиндуци-бельные" или конститутивные промоторы также можно выбрать для использования в сочетании с инду-цибельным промотором (промоторами) для построения сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Также, например, промоторы оксифотобактериального оперона Rubisco, например, rbcL генов (GenBank: Х65960, ZP 01728542, Q3M674, BAF48766, NP 895035, 0907262A; CyanoBase: PMT1205, PMM0550, Pro0551, tll1506, SYNW1718, glr2156, alr1524, slr0009), которые имеют определенную светозависимость, но могут быть расценены почти как конститутивные промоторы, также можно выбрать для использования в сочетании с индуцибельным промотором(промоторами), такими как промоторы nirA, hox и/или groE, для построения сконструированного пути (путей) продуцирования бутано-ла.
В этом описании, когда речь идет о индуцибельном промоторе, таком как, например, любой из ин-дуцибельных промоторов, описанных выше, он включает их аналоги, функциональные производные, сконструированные последовательности и их сочетания. "Функциональный аналог" или "модифицированная сконструированная последовательность" в этом контексте относится к промоторной последовательности, полученной или модифицированной (посредством, например, замены, средней делеции или добавления, или модификации нуклеотидов) на основе собственной промоторной последовательности, такой как те, которые установлены в данном документе выше, которые сохраняют функцию нативной промоторной последовательности.
ДНК-конструкты и трансформация в организмы-хозяева
ДНК-конструкты образовывают с целью введения сконструированных генов пути продуцирования бутанола в хозяйскую водоросль, растение, растительную ткань или растительные клетки. То есть, нук-леотидную последовательность, кодирующую сконструированный фермент пути продуцирования бута-нола, размещают в векторе в функциональный связи с промотором, предпочтительно индуцибельным промотором, и в функциональной связи с нуклеотидной последовательностью, кодирующей подходящую последовательность нацеливающего на хлоропласт транзитного пептида. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновокислотные конструкты создают так, чтобы иметь элементы, расположенные в следующей от 5' (выше) к 3' (ниже) ориентации: индуцибельный извне промотор, транзитная нацеливающая последовательность и нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированный фермент пути продуцирования бутанола, и, предпочтительно, подходящая последовательность терминации транскрипции. Один или более сконструированных генов (ДНК-конструкты) можно разместить в один генетический вектор. Пример такого конструкта изображен на фиг. 2A. Как показано в варианте осуществления, иллюстрируемом на фиг. 2A, сконструированный трансген пути продуцирования бутанола является нуклеиновокислотным конструктом, включающим: а) прямой ПЦР-праймер (ПЦР - полимеразная цепная реакция); b) индуцибельный извне промотор; c) транзитную нацеливающую последовательность; d) сконструированную последовательность, кодирующую фермент пути продуцирования бутанола, с подходящей последовательностью терминации транскрипции и e) обратный ПЦР-праймер.
В соответствии с различными вариантами осуществления любой из компонентов от a) до e) этого
ДНК-конструкта регулируются так, чтобы подходить для определенных специфических условий. На практике любой из компонентов от a) до e) этого ДНК-конструкта применяется полностью или частично, и/или в любой отрегулированной комбинации для достижения более желаемых результатов. Например, когда промотор водорослевой гидрогеназы используется как индуцибельный промотор в сконструированном ДНК-конструкте пути продуцирования бутанола, трансгенная сконструированная водоросль, которая содержит этот ДНК-конструкт, будет способна осуществлять автотрофный фотосинтез с помощью CO2 окружающего воздуха в качестве источника углерода и нормально расти при аэробных условиях, например в открытом пруду. Когда водорослевая культура выращена и готова для продуцирования бутанола, то сконструированный трансген(трансгены) затем может экспрессироваться путем индуцирования при анаэробных условиях благодаря использованию промотора гидрогеназы. Экспрессия сконструированного гена(генов) продуцирует набор сконструированных ферментов пути продуцирования бу-танола для работы с циклом Кальвина для фотобиологического продуцирования бутанола (фиг. 1).
Два ПЦР-праймера - это прямой ПЦР-праймер (ПР ПЦР-праймер), расположенный в начале (5' конец) ДНК-конструкта, и обратный ПЦР-праймер (ОБ ПЦР-праймер), расположенный на другом конце (3' конец), как показано на фиг. 2A. Эта пара ПЦР-праймеров сконструирована для обеспечения определенного удобства при необходимости относительно легкой ПЦР-амплификации сконструированного ДНК-конструкта, что полезно не только во время и после того, как сконструированный ДНК-конструкт синтезируется при подготовке для генной трансформации, но также после того, как сконструированный ДНК-конструкт доставлен в геном водоросли-хозяина для проверки сконструированного гена у трансформантов. Например, после завершения трансформации сконструированного гена у клетки-хозяина Chlamydo-monas reinhardtii-arg7 с помощью техники электропорации и скрининга на комплементацию аргинино-сукцинат-лиазы (arg7) продуцированные трансформанты можно затем проанализировать с помощью ПЦР ДНК-пробы их ядерной ДНК, используя эту пару ПЦР-праймеров для проверки, успешно ли включен в геном данного трансформанта весь ген сконструированного пути продуцирования бутанола ген (ДНК-конструкт). В случае, когда ПЦР-проба ядерной ДНК трансформанта может образовывать ПЦР-продукт, который совпадает с прогнозируемым размером и последовательностью ДНК в соответствии с сконструированным ДНК-конструктом, успешное включение сконструированного гена(генов) в геном трансформанта является проверенным.
Поэтому различные варианты осуществления также раскрывают соответствующий способ для эффективного создания сконструированных трансгенных водорослей, растений или растительных клеток для фотобиологического продуцирования бутанола. Этот способ, в одном из вариантов осуществления, включает следующие этапы: a) выбирают подходящую хозяйскую водоросль, растение, ткань растения или растительные клетки с учетом их генетический фонов и особых признаков в связи с продуцированием бутанола; b) вводят нуклеиновокислотные конструкты сконструированных генов в геном указанной хозяйской водоросли, растения, растительной ткани или растительных клеток; c) проверяют включение сконструированных генов в трансформированную водоросль, растение, растительную ткань или растительные клетки с помощью ПЦР-проб ДНК, используя указанные ПЦР-праймеры сконструированного ДНК-конструкта; d) измеряют и проверяют признаки сконструированного организма, такие как индуци-бельная экспрессия сконструированных генов бутанолового пути для фотосинтетического продуцирования бутанола из диоксида углерода и воды посредством проб мРНК, белка, и характеристик продуцирования бутанола согласно специфическим сконструированным признакам ДНК-конструкта(конструктов)
(фиг. 2A).
Вышеупомянутый вариант осуществления способа создания сконструированного трансгенного организма для фотобиологического продуцирования бутанола можно также повторно применять на протяжении множества технологических циклов для достижения более желаемых результатов. В различных вариантах осуществления какой-либо из этапов от a) до d) этого способа, описанного выше, регулируются для того, чтобы соответствовать определенным специфическим условиям. В различных вариантах осуществления какой-либо из этапов от a) до d) этого способа применяют полностью или частично, и/или в каком-либо отрегулированном сочетании.
Примеры сконструированных генов пути продуцирования бутанола (ДНК-конструктов) показаны в перечне последовательностей. SEQ ID NO: 1 представляет собой детализированный ДНК-конструкт сконструированного гена бутанолдегидрогеназы (1809 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор Nia1 нитратредуктазы (21-282), 135-по транзитный пептид RbcS2 (283-417), последовательность, кодирующую фермент, (418-1566), выделенную и модифицированную из последовательности бутанолдегидрогеназы Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AB257439), 223-по терминатор RbcS2 (1567-1789) и ОБ ПЦР-праймер (1790-1809). 262-по промотор Nia1 (ДНК-последовательность 21-282) используется как пример индуцибельного промотора для контроля экспрессии сконструированного гена бутанолдегидрогеназы пути продуцирования бутанола (ДНК-последовательность 418-1566). 135-По транзитный пептид RbcS2 (ДНК-последовательность 283-417) используется как пример для направления вставки сконструированного фермента (ДНК-последовательность 418-1566) в хлоропласт организма-хозяина. RbcS2 терминатор (ДНК-последовательность 1567-1789) задействован так, чтобы правильно завершалась транскрипция и транс
ляция сконструированного гена для продуцирования необходимого сконструированного апобелка (RbcS2 транзитный пептид бутанолдегидрогеназы). Так как промотор Nia1 является ядерной ДНК, которая может контролировать экспрессию только для ядерных генов, синтетический ген пути продуцирования бу-танола в этом примере сконструирован согласно частоте использования кодона ядерного генома Chlamy-domonas. Поэтому в этом случае, сконструированный ген фермента транскрибируется в ядре. Его мРНК по природе перемещается в цитозоль, где мРНК транслируется в апобелок, который включает транзитный пептид RbcS2 (соответствующий ДНК-последовательности 283-417), связанный своей C-концевой областью вместе с N-концевой областью белка бутанолдегидрогеназы (соответствующего ДНК-последовательности 418-1566). Транзитный пептид апобелка направляет его транспорт через мембрану хлоропласта и в стромальную зону, где транзитный пептид вырезается из апобелка. Получаемая бута-нолдегидрогеназа затем возобновляет свою функцию в качестве фермента для сконструированного пути продуцирования бутанола в хлоропласте. Два ПЦР-праймера (последовательности 1-20 и 1790-1809) получены и модифицированы из последовательности гена актина человека и могут соединяться друг с другом. Анализ BLAST последовательностей против GenBank Chlamydomonas не выявил наличия у них гомологичных последовательностей. Поэтому их можно использовать как подходящие ПЦР-праймеры в ПЦР-пробах ДНК для проверки сконструированного гена у трансформированной водоросли.
SEQ ID NO: 2 представляет пример 2 для сконструированного ДНК-конструкта бутиральдегидде-гидрогеназы (2067 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор Nia1 нитратредуктазы (21-282), 135-по транзитный пептид RbcS2 (283-417), последовательность, кодирующую бутиральдегиддегидрогеназу (418-1824), выделенную и модифицированную из последовательности бутиральдегиддегидрогеназы Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AY251646), 223-по RbcS2 терминатор (1825-2047) и ОБ ПЦР-праймер (2048-2067). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, SEQ ID NO: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая бутиральдегиддегид-рогеназу (418-1824), которая выделена и модифицирована из последовательности бутиральдегиддегид-рогеназы Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AY251646).
SEQ ID NO: 3 представляет пример 3 для сконструированного конструкта бутирил-КоА-дегидрогеназы (1815 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Xho I NdeI сайт (283-291), 135-по транзитный пептид RbcS2 (292426), последовательность, кодирующую бутирил-КоА-дегидрогеназу (427-1563), выделенную/модифицированную из последовательностей бутирил-КоА-дегидрогеназы Clostridium beijerinckii (AF494018), 9-по XbaI сайт (1564-1572), 223-по RbcS2 терминатор (1573-1795) и ОБ ПЦР-праймер (17961815) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, SEQ ID NO: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая бутирил-КоА-дегидрогеназу (427-1563), выделенная/модифицированная из последовательностей бутирил-КоА-дегидрогеназы Clostridium beijerinckii (AF494018), и добавляются сайты рестрикции XhoI NdeI и XbaI для создания ключевых компонентов, таких как нацеливающая последовательность (292-426) и последовательность сконструированного фермента (427-1563) в качестве модульного элемента, который можно легко заменить, когда необходимо сэкономить расходы на генный синтез и повысить рабочую продуктивность. Обратите внимание, что фермент не обязательно должен быть бутирил-КоА-дегидрогеназой Clostridium beijerinckii; ряд бутирил-КоА-дегидрогеназных ферментов (таких как те, которые перечислены в табл. 1), включая их изозимы, сконструированные модифицированные ферменты и функциональные аналоги из других источников, таких как Butyrivibrio fibrisolvens, продуцирующая бутират бактерия L2-50, Thermoanaerobacterium thermos accharolyticum, могут также быть выбраны для использования.
SEQ ID NO: 4 представляет пример 4 для сконструированного ДНК-конструкта кротоназы (1482 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Xho I NdeI сайт (283-291) 135-по транзитный пептид RbcS2 (292-426), последовательность, кодирующую кротоназу (427-1209), выделенную/модифицированную из последовательности кротоназы Clostridium beijerinckii (Genbank: AF494018), 21-по последовательность, кодирующую Lumio-метку (1210-1230), 9-по XbaI сайт (1231-1239), содержащий стоп-кодон, 223-по RbcS2 терминатор (1240-1462) и ОБ ПЦР-праймер (1463-1482) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 3, SEQ ID NO: 3, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая кротоназу (427-1209), выделенная/модифицированная из последовательностей кротоназы Clostridium beijerinckii (Genbank: AF494018), и 21-по последовательность, кодирующая Lumio-метку (1210-1230) добавляется к C-концевой области последовательности энолазы. 21-по последовательность-метка Lumio (1210-1230) задействована здесь для кодирования пептидной последовательности Lumio Gly-Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO: 58), которая может стать флуоресцентной при обработке Lumio реагентом, который сейчас является коммерчески доступным от Invitrogen [https://catalog.invitrogen.com]. Технология молекулярного мечения Lumio основана на соединенной с ЭДТ (1,2-этандитиол) димышьяковой производной (Lumio реагент) флюорес-цеина, которая связывается с сконструированной последовательностью тетрацистеина (Keppetipola, Coffman, and et al. (2003). Rapid detection of in vitro expressed proteins using Lumio(tm) technology, Gene Expression, 25.3: 7-11). Тетрацистеиновая последовательность состоит из Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys (SEQ ID NO: 59), где Xaa является любой нецистеиновой аминокислотой, такой как Pro или Gly в этом примере.
ЭДТ-связанный Lumio реагент позволяет свободное вращение атомов мышьяка, которое гасит флуоресценцию флюоресцеина. Образование ковалентной связи между тиолами мышьяковых групп Lumio и тет-рацистеинами препятствует свободному вращению атомов мышьяка, что выделяет флуоресценцию флю-оресцеина (Griffin, Adams, and Tsien (1998), "Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells", Science, 281:269-272). Это также дает возможность визуализации тетрацистеин-меченых белков посредством флуоресцентного молекулярного изображения. Поэтому, использование Lumio метки, таким образом, делает возможным мониторинг и/или отслеживание сконструированной кротоназы в случае, когда экспрессируется для проверки, действительно ли доставляется в хлоропласт организма-хозяина сконструированный фермент пути продуцирования бутанола как конструировалось. Метка Lu-mio (короткий пептид из 7 аминокислот), которая связана с C-концевой областью белка кротоназы, в этом примере должна иметь минимальное влияние на функцию сконструированного фермента, но давать возможность молекуле сконструированного фермента визуализироваться при обработке Lumio реагентом. Применение Lumio метки является полностью факультативным. Если Lumio метка каким-либо образом оказывает влияние на функцию сконструированного фермента, эту метку можно удалить из конструирования ДНК-последовательности.
SEQ ID NO: 5 представляет пример 5 для сконструированного ДНК-конструкта 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (1367 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 84-по промотор нитратредуктазы (21-104), 9-по Xho I NdeI сайт (105-113) 135-по транзитный пептид RbcS2 (114-248), последовательность, кодирующую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (249-1094), выделенную/модифицированную из 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназной последовательности Clostrid-ium beijerinckii (Genbank: AF494018), 21-по последовательность-метку Lumio (1095-1115), 9-по XbaI сайт (1116-1124), 223-по RbcS2 терминатор (1125-1347) и ОБ ПЦР-праймер (1348-1367). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 4, SEQ ID NO: 4, за исключением того, что используются 84-по промотор нитратредук-тазы (21-104) и последовательность, кодирующая 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (249-1094), выделенная/модифицированная из 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназной последовательности Clos-tridium beijerinckii (Genbank: AF494018). 84-По промотор нитратредуктазы искусственно создан посредством соединения двух участков частично гомологичных последовательностей (-231 до -201 и -77 до -25 относительно сайта начала транскрипции) нативного промотора Nia1 Chlamydomonas reinhardtii. Экспериментальные исследования продемонстрировали, что 84-по последовательность является более активной, чем нативный промотор Nia1 (Loppes and Radoux (2002) "Two short regions of the promoter are essential for activation and repression of the nitrate reductase gene in Chlamydomonas reinhardtii," Mol Genet Ge-nomics 268: 42-48). Поэтому, это является также примером, где функциональные синтетические последовательности, аналоги, функциональные производные и/или сконструированные модифицированные последовательности, такие как синтетическая 84-по последовательность, можно выбрать для использования согласно различным вариантам осуществления в данном изобретении.
SEQ ID NO: 6 представляет пример 6 для сконструированного тиолазного ДНК-конструкта (1721 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 84-по промотор нитратредуктазы (21-104), 9-по Xho I NdeI сайт (105-113) 135-по транзитный пептид RbcS2 (114-248), последовательность, кодирующую тиолазу (248-1448), выделенную/модифицированную из последовательности тиолазы Bu-tyrivibrio fibrisolvens (AB 190764), 21-по последовательность-метку Lumio (1449-1469), 9-по XbaI сайт (1470-1478), 223-по терминатор RbcS2 (1479-1701) и ОБ ПЦР-праймер (1702-1721). Этот ДНК-конструкт также подобен примеру 4, SEQ ID NO: 4, за исключением того, что используют кодирующую последовательность, кодирующую тиолазу (249-1448) и 84-по синтетический промотор Nia1 (21-104). Это другой пример того, что функциональные синтетические последовательности также можно выбрать для использования в сконструированных ДНК-конструктах.
SEQ ID NO: 7 представляет пример 7 для сконструированного ДНК-конструкта пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы (4211 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 2х84-по промотор нитратредуктазы (21-188), 9-по Xho I NdeI сайт (189-197), 135-по транзитный пептид RbcS2 (198-332), последовательность, кодирующую пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (3333938), выделенную/модифицированную из последовательностей пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы Mastigamoeba balamuthi (GenBank: AY1 01767), 21-по последовательность-метку Lumio (3939-3959), 9-по XbaI сайт (3960-3968), 223-по терминатор RbcS2 (3969-4191) и ОБ ПЦР-праймер (4192-4211). Этот ДНК-конструкт также подобен примеру 4, SEQ ID NO: 4, за исключением того, что используются сконструированный 2х 84-по промотор Nia1 и последовательность, кодирующая пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (333-3938), выделенная/модифицированная из последовательностей пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы Mastigamoeba balamuthi (GenBank: AY101767). 2х84-по промотор Nia1 построен в виде тандемной дупликации 84-по синтетической последовательности промотора Nia1, представленной выше в SEQ ID NO: 6. Экспериментальные тесты показали, что 2х84-по синтетический промотор Nia1 является даже более сильным, чем 84-по последовательность, которая более активна, чем нативный промотор Nia1 (Loppes and Radoux (2002) "Two short regions of the promoter are essential for activation and repression of the nitrate reductase gene in Chlamydomonas reinhardtii," Mol Genet Genomics 268:
42-48). Применение этого типа последовательностей индуцибельных промоторов с различными промо-торными силами может также помочь при регулировании уровней экспрессии сконструированных ферментов для пути(путей) продуцирования бутанола.
SEQ ID NO: 8 представляет пример 8 для сконструированного ДНК-конструкта пируваткиназы (2021 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 84-по промотор нитратредук-тазы (21-104), 9-по Xho I NdeI сайт (105-113), 135-по транзитный пептид RbcS2 (114-248), последовательность, кодирующую пируваткиназу (249-1748), выделенную/модифицированную из последовательности пируваткиназы Saccharomyces cerevisiae (GenBank: AY949876), 21-по последовательность-метку Lumio (1749-1769), 9-по XbaI сайт (1770-1778), 223-по терминатор RbcS2 (1779-2001) и ОБ ПЦР-праймер (2002-2021). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 6, SEQ ID NO: 6, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая пируваткиназу (249-1748).
SEQ ID NO: 9 представляет пример 9 для сконструированного гена энолазы (1815 по), включающий ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Xho I NdeI сайт (283-291), 135-по транзитный пептид RbcS2 (292-426), последовательность, кодирующую энолазу (427-1542), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной энолазы Chlamydo-monas reinhardtii (Genbank: X66412, Р31683), 21-по последовательность, кодирующую метку Lumio (1507-1527), 9-по XbaI сайт (1543-1551) содержащий стоп-кодон, 223-по терминатор RbcS2 (1552-1795) и ОБ ПЦР-праймер (1796-1815) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 3, SEQ ID NO: 3, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая энолазу (427-1542), выделенная/модифицированная из последовательности цитозольной энолазы Chlamydomonas reinhardtii.
SEQ ID NO: 10 представляет пример 10 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицерат-мутазы (2349 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Xho I NdeI сайт (283-291), 135-по транзитный пептид RbcS2 (292-426), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (427-2097), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы Chlamydomonas reinhardtii (JGI Chlre2 белок ID 161689, Genbank: AF268078), 9-по XbaI сайт (2098-2106), 223-по терминатор RbcS2 (2107-2329) и ОБ ПЦР-праймер (2330-2349) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 3, SEQ ID NO: 3, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая фосфоглицератмутазу (427-2097), выделенная/модифицированная из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы Chlamydomonas reinhardtii.
SEQ ID NO: 11 представляет пример 11 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицерат-киназы (1908 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор Nia1 нитратредуктазы (21-282), последовательность, кодирующую фосфоглицераткиназу (283-1665), выделенную из последовательности фосфоглицераткиназы хлоропласта Chlamydomonas reinhardtii, включающей ее хлоропластный сигнальный пептид и последовательность зрелого фермента (GenBank: U14912), 223-по терминатор RbcS2 (1666-1888) и ОБ ПЦР-праймер (1889-1908). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, SEQ ID NO: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая фосфоглицераткиназу (283-1665), выделенная из последовательности фосфоглицераткиназы хлоропласта Chlamydomonas reinhardtii, включающей ее хлоропластный сигнальный пептид и последовательность зрелого фермента. Поэтому это также является примером того, что последовательность фермента хлоропласта, которая кодируется ядром, такого как фосфоглицераткиназа хлоропласта Chlamydomonas rein-hardtii, может также использоваться при конструировании и построении сконструированного гена пути продуцирования бутанола, когда целесообразно, с подходящим индуцибельным промотором, таким как промотор Nia1 (ДНК-последовательность 21-282).
SEQ ID NO: 12 представляет пример 12 для сконструированного гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1677 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор Nia1 нитратредуктазы (21-282), 135-по транзитный пептид RbcS2 (283-417), последовательность, кодирующую фермент (418-1434), выделенную и модифицированную из последовательности (мРНК) цитозольной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Mesostigma viride (регистрационный номер GenBank DQ873404), 223-по терминатор RbcS2 (1435-1657) и ОБ ПЦР-праймер (1658-1677). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, SEQ ID NO: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая фермент (418-1434), выделенная и модифицированная из последовательности (мРНК) цитозольной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Mesostigma viride (регистрационный номер
GenBank DQ873404).
SEQ ID NO: 13 представляет пример 13 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицерат-мутазы, связанной с промотором HydA1 (2351 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (438-2108), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы Chlamydomonas reinhardtii (JGI Chlre2 белок ID 161689, Genbank: AF268078), 223-по терминатор RbcS2 (2109- 2331) и ОБ ПЦР-праймер (2332-2351). Этот сконструированный ДНК-конструкт весьма подобен примеру 1, SEQ ID NO:1, за исключением того, что используют 282-по промотор HydA1 (21-302) и последовательность, кодирующая фосфоглицератмутазу
(438-2108), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной фосфоглицератмута-зы Chlamydomonas reinhardtii. 282-По промотор HydA1 (21-302) доказан активным посредством экспериментальных испытаний в лаборатории изобретателя. Использование промотора HydA1 (21-302) делает возможным активацию экспрессии сконструированного фермента посредством использования анаэробных условий культуральной среды.
С помощью того же принципа использования индуцибельного анаэробного промотора и нацеливающей на хлоропласт последовательности, как это показано в SEQ ID NO: 13 (пример 13), SEQ ID NO: 14-23 показывает примеры сконструированных генов 14-23. Кратко говоря, SEQ ID NO: 14 представляет пример 14 для сконструированного ДНК-конструкта энолазы, связанной с промотором HydA1 (1796 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую энолазу (438-1553), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной энолазы Chlamydomonas reinhardtii (Gen-bank: X66412, Р31683), 223-по терминатор RbcS2 (1554-1776) и ОБ ПЦР-праймер (1777-1796).
SEQ ID NO: 15 представляет пример 15 для сконструированного ДНК-конструкта пируваткиназы под контролем промотора HydA1, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую пируваткиназу (438-1589), вьщеленную/модифицированную из последовательности цитозоль-ной пируваткиназы Chlamydomonas reinhardtii (JGI Chlre3 белок ID 138105), 223-по терминатор RbcS2 (1590-1812) и ОБ ПЦР-праймер (1813-1832).
SEQ ID NO: 16 представляет пример 16 для сконструированного ДНК-конструкта пируват-ферредоксиноксидоредуктазы, связанной с промотором HydA1 (4376 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (438-4133), выделенную/модифицированную из последовательности пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы Desulfovibrio africanus (регистрационный номер GenBank Y09702), 223-по терминатор RbcS2 (4134-4356) и ОБ ПЦР-праймер (4357-4376).
SEQ ID NO: 17 представляет пример 17 для сконструированного ДНК-конструкта пируват-НАДФ+-оксидоредуктазы, связанной с промотором HydA1 (6092 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу (438-5849), выделенную/модифицированную из последовательности пируват-НАДФ+ оксидоредуктазы Euglena gracilis (регистрационный номер GenBank AB021127), 223-по терминатор RbcS2 (5850-6072) и ОБ ПЦР-праймер
(6073-6092).
SEQ ID NO: 18 представляет пример 18 для сконструированного ДНК-конструкта тиолазы, связанной с промотором HydA1 (1856 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую тиолазу (438-1613), выщеленную/модифицированную из последовательностей тиолазы Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), 223-по терминатор RbcS2 (1614-1836) и ОБ ПЦР-праймер (1837-1856).
SEQ ID NO: 19 представляет пример 19 для сконструированного ДНК-конструкта 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, связанной с промотором HydA1 (1550 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (438-1307), выделенную/модифицированную из последовательностей 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы Ther-moanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), 223-по терминатор RbcS2 (1308-1530) и ОБ ПЦР-праймер (1531-1550).
SEQ ID NO: 20 представляет пример 20 для сконструированного ДНК-конструкта кротоназы, связанной с промотором HydA1 (1457 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую кротоназу (438-1214), выщеленную/модифицированную из последовательностей кротоназы Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), 223-по терминатор RbcS2 (1215-1437) и
ОБ ПЦР-праймер (1438-1457).
SEQ ID NO: 21 представляет пример 21 для сконструированного ДНК-конструкта бутирил-КоА-дегидрогеназы, связанной с промотором HydA1 (1817 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую бутирил-КоА-дегидрогеназу (438-1574), выделенную/модифицированную из последовательностей бутирил-КоА-дегидрогеназы Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), 223-по терминатор RbcS2 (1575-1797) и ОБ ПЦР-праймер (1798-1817).
SEQ ID NO: 22 представляет пример 22 для сконструированного ДНК-конструкта бутиральдегидде-гидрогеназы, связанной с промотором HydA1 (2084 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую бутиральдегиддегидрогеназу (438-1841), выщеленную/модифицированную из
последовательностей бутиральдегиддегидрогеназы Clostridium saccharoperbutylacetonicum (GenBank AY251646), 223-по терминатор RbcS2 (1842-2064) и ОБ ПЦР-праймер (2065-2084).
SEQ ID NO: 23 представляет пример 23 для сконструированного ДНК-конструкта бутанолдегидро-геназы, связанной с промотором HydA1 (1733 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор HydA1 (21-302), 135-по транзитный пептид RbcS2 (303-437), последовательность, кодирующую бутанолдегидрогеназу (438-1490), выщеленную/модифицированную из последовательностей бутанолдегидрогеназы Clostridium beijerinckii (GenBank AF157307), 223-по терминатор RbcS2 (1491-1713) и ОБ ПЦР-праймер (1714-1733).
С помощью того же принципа использования 2x84 синтетического промотора Nia1 и механизма нацеливания на хлоропласт, как уже упоминалось ранее, SEQ ID NO: 24-26 показывают больше примеров ДНК-конструктов сконструированных ферментов. Вкратце, SEQ ID NO: 24 представляет пример 24 для сконструированного ДНК-конструкта фруктозодифосфатальдолазы, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х 84-по промотор NR (нитратредуктаза) (21-188), последовательность, кодирующую фруктозодифосфатальдолазу (189-1313), выщеленную/модифицированную из последовательности фруктоза-1,6-бисфосфатальдолазы хлоропласта C. reinhardtii (GenBank: X69969), 223-по терминатор RbcS2 (1314-1536) и ОБ ПЦР-праймер (1537-1556).
SEQ ID NO: 25 представляет пример 24 для сконструированного ДНК-конструкта триозофосфати-зомеразы, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по промотор NR (21188), последовательность, кодирующую триозофосфатизомеразу (189-1136), выделенную и модифицированную из последовательности триозофосфатизомеразы хлоропласта Arabidopsis thaliana (GenBank: AF247559), 223-по терминатор RbcS2 (1137-1359) и ОБ ПЦР-праймер (1360-1379).
SEQ ID NO: 26 представляет пример 26 для сконструированного ДНК-конструкта фосфофруктоки-назы, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по промотор NR (21-188), 135-по транзитный пептид RbcS2 (189-323), последовательность, кодирующую фосфофруктокиназу (3241913), выделенную/модифицированную из последовательности 6-фосфофруктокиназы Arabidopsis thali-ana (GenBank: NM 001037043), 223-по терминатор RbcS2 (1914-2136) и ОБ ПЦР-праймер (2137-2156).
Нуклеиновокислотные конструкты, такие как представленные в примерах выше, могут включать дополнительные подходящие последовательности, например маркерный ген для селекции и факультативные последовательности биомолекулярных меток (такие как метка Lumio, описанная в примере 4, SEQ ID NO: 4). Селектируемые маркеры, которые можно выбрать для использования в конструктах, включают маркеры, придающие устойчивости к канамицину, гигромицину, спектиномицину, стрептомицину, сульфонилмочевине, гентамицину, хлорамфениколу, среди прочих, все из которых были клонированы и доступны специалистам данной области техники. Альтернативно, селективным маркером является маркерный ген усвоения, который может быть комплементарным дефишенси у организма-хозяина. Например, ген, кодирующий аргининосукцинатлиазу (arg7) может использоваться в качестве маркерного гена для селекции в сконструированном конструкте, что дает возможность идентифицировать трансформантов в случае, когда используются arg7- (минус) клетки Chlamydomonas reinhardtii в качестве клеток-хозяев.
Нуклеиновокислотные конструкты, несущие сконструированные гены могут доставляться в хозяйскую водоросль, сине-зеленую водоросль, растение или растительную ткань или клетки с помощью доступных техник генных трансформаций, таких как электропорация, индуцированное ПЭГ поглощение и баллистическая доставка ДНК и опосредованная Agrobacterium трансформация.
С целью доставки сконструированного конструкта в водорослевые клетки, техники электропора-ции, стеклянных бус и биолистической генной пушки можно выбрать для использования в качестве предпочтительных способов; а водоросль с единичными клетками или простой талломной структурой является предпочтительной для использования при трансформации. Трансформанты можно идентифицировать и протестировать на основе стандартных техник.
Различные сконструированные гены можно ввести в хозяйские клетки последовательно поэтапным образом, или одновременно, с помощью одного конструкта или за одну трансформацию. Например, десять ДНК-конструктов, показанных в SEQ ID NO: 13-16 (или 17) и 18-23 для десятиферментного пути продуцирования бутанола, ответвленного от 3-фосфоглицерата, можно разместить в генетический вектор, такой как p389-Arg7 с одним маркером для селекции (Arg7). Поэтому, путем использования плазми-ды таким образом, возможно доставить все десять ДНК-конструктов (сконструированные гены) в нуждающегося в аргинине Chlamydomonas reinhardtii-axg7 хозяина (СС-48) за одну трансформацию для экспрессии ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1). При необходимости трансформант, содержащий десять ДНК-конструктов, можно дополнительно трансформировать для внесения большего количества сконструированных генов в его геномную ДНК с дополнительным маркером для селекции, таким как стрептомицин. Путем использования комбинаций различных ДНК-конструктов сконструированных ферментов, таких как представленные в SEQ ID NO: 1-26, в генетической трансформации с подходящим организмом-хозяином можно построить различные пути продуцирования бутанола, такие как проиллюстрированные на фиг. 1. Например, сконструированные ДНК
конструкты SEQ ID NO: 1-12 можно выбрать для построения ответвленного от глицеральдегид-3-фосфатов пути продуцирования бутанола (01-12 на фиг. 1); сконструированные ДНК-конструкты SEQ ID NO: 1-12, 24 и 25 можно выбрать для построения ответвленного от фруктозо-1,6-дифосфата пути продуцирования бутанола (20-33); и сконструированные ДНК-конструкты SEQ ID NO: 1-12 и 24-26 можно выбрать для построения ответвленного от фруктозо-6-фосфата пути продуцирования бутанола (19-33).
Дополнительные модификации хозяина для усиления фотосинтетического
продуцирования бутанола Механизм превращения НАДФН/НАДН
Согласно пути(путям) фотосинтетического продуцирования бутанола для продуцирования одной молекулы бутанола из 4CO2 и 5Н2О вероятно необходимо 14 АТФ и 12 НАДФН, обе из которых образовываются фотосинтетическим расщеплением воды и фотофосфорилированием посредством тилакоидной мембраны. Для функционирования ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1), предпочтительной практикой является использование фермента(ферментов) пути продуцирования бутанола, которые могут использовать НАДФН, который образовывается фотоуправляе-мым процессом транспорта электронов. Бутанолдегидрогеназа (регистрационный номер GenBank: AB257439) и бутиральдегиддегидрогеназа (GenBank: AY251646) Clostridium saccharoperbutylacetonicum являются примерами фермента пути продуцирования бутанола, который способен принимать или НАДФ(Н), или НАД(Н). Такой фермент пути продуцирования бутанола, который может использовать как НАДФН, так и НАДН (т.е., НАД(Ф)Н), также можно выбрать для использования в данном ответвленном от 3-фосфоглицерата и каком-либо другом сконструированном пути(путях) продуцирования бу-танола (фиг. 1). Бутирил-КоА-дегидрогеназа (GenBank: AF494018) и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа (GenBank: AF494018) Clostridium beijerinckii являются примерами фермента пути продуцирования бутанола, который может принимать только НАД(Н). Когда задействован фермент пути продуцирование бутанола, который может использовать только НАДН, может понадобиться механизм превращения НАДФН/НАДН для правильного функционирования этого ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола. Однако, в зависимости от генетических фонов организма-хозяина, механизм превращения между НАДФН НАДН может существовать у хозяина, так что НАДФН и НАДН смогут взаимозаменяемо использоваться в организме. Кроме того, известно, что НАДФН может быть превращен в НАДН с помощью НАДФН-фосфатазной активности (Pattanayak and Chatterjee (1998) "Nicoti-namide adenine dinucleotide phosphate phosphatase facilitates dark reduction of nitrate: regulation by nitrate and ammonia," Biologia Plantarium 41(l):75-84) и что НАД может быть превращен в НАДФ с помощью НАД-киназной активности (Muto, Miyachi, Usuda, Edwards and Bassham (1981) "Light-induced conversion of nic-otinamide adenine dinucleotide to nicotinamide adenine dinucleotide phosphate in higher plant leaves," Plant Physiology 68(2):324-328; Matsumura-Kadota, Muto, Miyachi (1982) "Light-induced conversion of NAD+ to NADP+ in Chlorella cells," Biochimica Biophysica Acta 679(2):300-300). Поэтому в случае, когда необходимо повышенное превращение НАДФН/НАДН, хозяин может быть генетически модифицирован для усиления НАДФН-фосфатазной и НАД-киназной активностей. Таким образом в одном из различных вариантов осуществления сконструированное для фотосинтетического продуцирования бутанола растение, сконструированная водоросль или растительная клетка кроме всего содержит дополнительные сконструированные трансгены (фиг. 2В) для индуцибельной экспрессии одного или более ферментов для способствования взаимопревращения НАДФН/НАДН, таких как НАДФН-фосфатаза и НАД-киназа (Gen-Bank: ХМ 001609395, ХМ 001324239), в стромальной области хлоропласта водоросли.
Другим вариантом осуществления, который может обеспечить механизм превращения НАДФН/НАДН, является правильный выбор точки ветвления в цикле Кальвина для ответвления сконструированного пути продуцирования бутанола. Для предоставления этого механизма превращения НАДФН/НАДН с помощью конструирования пути согласно данному варианту осуществления предпочтительной практикой является ответвлять сконструированный путь продуцирования бутанола в или после точки глицеральдегид-3-фосфатов цикла Кальвина, как показано на фиг. 1. В этих конструированиях путей превращение НАДФН/НАДН достигается главным образом двухступенчатым механизмом: 1) использование этапа с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой цикла Кальвина, который использует НАДФН при восстановлении 1,3-дифосфоглицерата до глицеральдегид-3-фосфатов; и 2) использование этапа с НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой сконструированного пути 01, который продуцирует НАДН при окислении глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат. Конечным результатом двух этапов, описанных выше, является превращение НАДФН в НАДН, который может поддерживать необходимую восстановительную способность в форме НАДН для сконструированного пу-ти(путей) продуцирования бутанола. Для этапа 1) обычно достаточным является использование НАДФН-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы цикла Кальвина естественной в организме-хозяине. В результате введение сконструированной НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 01 для работы с НАДФН-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой цикла Кальвина может обеспечить способность функционирования механизма превращения НАДФН/НАДН, который необходим для правильного функционирования ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1). По этой причине в одном из различных вариантов осуществления сконструированный
ДНК-конструкт НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (пример 12, SEQ ID NO: 12) используется также в качестве сконструированного гена для превращения НАДФН/НАДН (фиг. 2B) для поддержки ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1). Это также объясняет почему является важным использование НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 01 для предоставления этому двухэтапному механизму превращения НАДФН/НАДН для сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Поэтому в одном из различных вариантов осуществления предпочтительной практикой является использование НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ее изозимов, функциональных производных, аналогов, сконструированных модифицированных ферментов и/или их сочетаний в сконструированном пу-ти(путях) продуцирования бутанола, как проиллюстрировано на фиг. 1.
Техники иРНК для дополнительного управления механизмом регуляции фотосинтеза
В другом варианте осуществления данного изобретения хозяйское растение или клетку дополнительно модифицируют для управления циклом Кальвина так, чтобы хозяин мог непосредственно продуцировать жидкое топливо бутанол вместо того, чтобы синтезировать крахмал (гликоген в случае оксифо-тобактерий), целлюлозы и лигноцеллюлозы, которые часто являются неэффективными и трудными для использования в биоперерабатывающей промышленности. Согласно одному из различных вариантов осуществления инактивация активности синтеза крахмала достигается супрессированием экспрессии какого-либо из ключевых ферментов, таких как, крахмалсинтаза (гликогенсинтаза в случае оксифотобак-терий) 13, глюкоза-1-фосфат (G-1-P) аденилтрансфераза 14, фосфоглюкомутаза 15 и гексозофосфатизо-мераза 16 пути синтеза крахмала, который соединяется с циклом Кальвина (фиг. 1).
Введение генетически передаваемого фактора, который может ингибировать активность синтеза крахмала, которая конкурирует с сконструированным путем(путями) продуцирования бутанола за продукты цикла Кальвина, может дополнительно усиливать фотосинтетическое продуцирование бутанола. В отдельном варианте осуществления генетически кодируемый (или который может кодироваться) ингибитор (фиг. 2C) для конкурентного пути синтеза крахмала представляет собой молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, например, крахмалсинтазу 16, глюкоза-1-фосфат (G-1-P) аденилтрансферазу 15, фосфоглюкомутазу 14 и/или гексо-зофосфатизомеразу 13, как показано цифровыми отметками 13-16 на фиг. 1. Последовательности ДНК, кодирующие иРНК крахмалсинтазы, иРНК глюкоза-1-фосфат (G-1-P) аденилтрансферазы, иРНК фос-фоглюкомутазы и/или иРНК G-P-изомеразы, соответственно, можно сконструировать и синтезировать на основе техник РНК интерференции, известных специалистам данной области техники (Liszewski (June 1, 2003) Progress in RNA interference, Genetic Engineering News, Vol. 23, number 11, pp. 1-59). В общих чертах, молекула интерферирующей РНК (иРНК) является антисмысловой, но комплементарной нормальной мРНК конкретного белка (гена) так, чтобы такая иРНК молекула могла специфически связываться с нормальной мРНК конкретного гена, таким образом, ингибируя (блокируя) трансляцию ген-специфичной мРНК в белок (Fire, Xu, Montgomery, Kostas, Driver, Mello (1998) "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans". Nature 391(6669):806-11; Dykxhoorn, Novina, Sharp (2003) "Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression", Nat Rev Mol Cell Biol.
4(6): 457-67).
Примеры сконструированного ДНК-конструкта иРНК синтеза крахмала (фиг. 2C) показаны в приведенных в списке SEQ ID NO: 27 и 28. Вкратце, SEQ ID NO: 27 представляет пример 27 для сконструированного ДНК-конструкта иРНК крахмалсинтазы под контролем Nia1 промотора (860 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по Nia1 промотор (21-282), последовательность иРНК крахмалсинтазы (283-617), включая старт-кодон atg и обратную комплементарную последовательность двух фрагментов уникальной последовательности мРНК-последовательности крахмалсинта-зы Chlamydomonas reinhardtii (GenBank: AF026422), 223-по терминатор RbcS2 (618-850) и ОБ ПЦР-праймер (851-860). По причине использования Nia1 промотора (21-282) этот сконструированный ген иРНК синтеза крахмала конструируют, чтобы экспрессировать только в случае необходимости усиления фотобиологического продуцирования бутанола в присутствии его специфического индуктора, нитрата (NO3), который можно добавить в культуральную среду в качестве удобрения для индуцирования сконструированных организмов. Последовательность иРНК крахмалсинтазы (283-617) конструируют для связывания с нормальной мРНК гена крахмалсинтазы, таким образом, блокируя ее трансляцию в функциональную крахмалсинтазу. Ингибирование крахмал/гликогенсинтазной активности в 16 таким образом должно канализировать больше фотосинтетических продуктов цикла Кальвина в ответвленный от цикла Кальвина путь(пути) продуцирования бутанола, такие как ответвленный от глицеральдегид-3-фосфатов путь продуцирования бутанола 01-12, как проиллюстрировано на фиг. 1.
SEQ ID NO: 28 представляет пример 28 для сконструированного конструкта иРНК крахмалсинтазы под контролем HydA1 промотора (1328 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 282-по HydA1 промотор (21-302), сконструированную последовательность иРНК крахмалсинтазы (303-1085), 223-по терминатор RbcS2 (1086-1308) и ОБ ПЦР-праймер (1309-1328). Сконструированная последовательность иРНК крахмалсинтазы (303-1085) включает: 300-по смысловой фрагмент (303-602), выделенный из первых 300-по уникальной кодирующей последовательности мРНК-последовательности
крахмалсинтазы Chlamydomonas reinhardtii (GenBank: AF026422), 183-по сконструированную интрон-подобную петлю (603-785) и 300-по антисмысловую последовательность (786-1085), комплементарную к начальной 300-по кодирующей последовательности мРНК-последовательности крахмалсинтазы Chlamy-domonas reinhardtii (GenBank: AF026422). Эту сконструированную последовательность иРНК крахмал-синтазы (303-1085) конструируют для ингибирования синтеза крахмалсинтазы с помощью следующих двух механизмов. Сначала, 300-по антисмысловая комплементарная последовательность иРНК (соответствующая ДНК-последовательности 786-1085) связывается с нормальной мРНК гена крахмалсинтазы, таким образом, блокируя его трансляцию в функциональную крахмалсинтазу. Затем, 300-по антисмысловая комплементарная последовательность иРНК (соответствующая ДНК-последовательности 7861085) может также связываться с 300-по смысловой комплементарной частью (соответствующей ДНК-последовательности 303-602) в тождественной сконструированной молекуле иРНК, формируя шпилько-подобную двуцепочечную РНК-структуру с 183-по сконструированной интрон-подобной последовательностью (603-785) в виде петли. Экспериментальные исследования показывают, что этот тип шпилькопо-добной двуцепочечной РНК может также запускать посттранскрипционный генный сайленсинг (Fuhr-mann, Stahlberg, Govorunova, Rank and Hegemann (2001) Journal of Cell Science 114:3857-3863). По причине использования промотора HydA1 (21-302) этот сконструированный ген иРНК синтеза крахмала конструируют для экспрессии только при анаэробных условиях в случае необходимости усиления фотобиологического продуцирования бутанола путем канализирования большего количества фотосинтетических продуктов цикла Кальвина в путь(пути) продуцирования бутанола, такие как 01-12, 03-12 и/или 20-33, как проиллюстрировано на фиг. 1.
Сконструированные гены расщепления крахмала и гликолиза
В еще одном варианте осуществления данного изобретения фотобиологическое продуцирование бутанола усиливают путем включения дополнительного набора сконструированных генов (фиг. 2D), который может способствовать расщеплению крахмала/гликогена и гликолизу в сочетании с сконструированным геном(генами) продуцирования бутанола (фиг. 2A). Такие дополнительные сконструированные гены для расщепления крахмала включают, например, гены, кодирующие для 17: амилазу, крахмалфос-форилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, и для 18: глюкозофосфатизомеразу (G-P-изомеразу), как проиллюстрировано на фиг. 1. Сконструированные гены гликолиза кодируют нацеленные на хлоропласт ферменты гликолиза: глюкозофосфатизомеразу 18, фосфофруктокиназу 19, альдолазу 20, триозофосфа-тизомеразу 21, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу 22, фосфоглицераткиназу 23, фосфоглицератму-тазу 24, энолазу 25 и пируваткиназу 26. Сконструированные гены расщепления крахмала и гликолиза в сочетании с каким-либо из путей продуцирования бутанола, которые показаны на фиг. 1, могут формировать дополнительный путь(пути) из крахмала/гликогена в бутанол (17-33). Следовательно, коэкспрес-сия сконструированных генов расщепления крахмала и гликолиза с генами пути продуцирования бута-нола может также усиливать фотобиологическое продуцирование бутанола. Таким образом, этот вариант осуществления представляет другой подход для управления циклом Кальвина для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола. В этом случае некоторые из продуктов цикла Кальвина проходят по пути синтеза крахмала (13-16) и далее по пути крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33) как показано на фиг. 1. В данном случае крахмал/гликоген действует в качестве временного хранилищного пула продуктов цикла Кальвина перед тем, как они смогут быть превращены в бутанол. Этот механизм может быть вполне пригодным для максимизации выхода продукции бутанола в определенных случаях. Например, при высокой интенсивности солнечного света, например около полудня, скорость фотосинтетической фиксации CO2 цикла Кальвина может быть настолько высокой, что может превышать максимально возможную скорость пути(путей) продуцирования бутанола; использование механизма синтеза крахмала также позволяет временно хранить избыток фотосинтетических продуктов, которые необходимо позже использовать для продуцирования бутанола.
Фиг. 1 также иллюстрирует использование сконструированного пути крахмал/гликоген-в-бутанол с сконструированными ферментами (как отмечено от 17 до 33) в сочетании с ответвленным от цикла Кальвина сконструированным путем(путями) продуцирования бутанола, таким как ответвленный от глице-ральдегид-3-фосфатов путь продуцирования бутанола 01-12 для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола. Подобно преимуществам использования ответвленных от цикла Кальвина сконструированных путей продуцирования бутанола, использование сконструированного пути крах-мал/гликоген-в-бутанол (17-33) может также помочь превращать фотосинтетические продукты в бутанол перед тем, как сахара смогут быть превращены в другие сложные биомолекулы, такие как лигноцеллю-лозные биомассы, которые не могут полностью использоваться биоперерабатывающей промышленностью. Таким образом, подходящее использование ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола (таких как 01-12, 03-12 и/или 20-33) и/или сконструированного пути крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33) может представлять собой принципиально новые, среди прочего, технологии, которые могут эффективно обходить проблемы узких мест современной технологии биомассы, включая проблему "лигноцеллюлозной неподатливости".
Другим признаком является то, что активность ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути продуцирования бутанола (такого как, 01-12, 03-12 и/или 20-33) может происходить преиму
щественно днем, когда есть свет, потому что она использует промежуточный продукт цикла Кальвина, который нуждается в поставках восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ), образованных путем фотосинтетического расщепления воды и управляемого светом процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным перемещением, посредством системы тилакоидных мембран. Сконструированный путь крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33), который может использовать избыточный сахар, сохранявшийся в виде крахмала/гликогена во время фотосинтеза, может функционировать не только днем, но также и ночью. Следовательно, использование ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути продуцирования бутанола (такого как 01-12, 03-12 и/или 20-33) вместе с сконструированным путем(путями) крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33), как проиллюстрировано на фиг. 1, делает возможным продуцирование бутанола как днем, так и ночью.
По причине того, что экспрессия как сконструированного пути(путей) крахмал/гликоген-в-бутанол, так и ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола контролируется использованием индуцибельного промотора, такого как анаэробный промотор гидрогеназы, этот тип сконструированных организмов также способен расти фотоавтотрофно при аэробных (нормальных) условиях. Когда сконструированные фотосинтетические организмы выращены и готовы для фотобиологического продуцирования бутанола, клетки затем помещают в специфические индуцирующие условия, такие как в анаэробные условия [или сдвигают использование удобрения от аммониевого к нитратному, если используется сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола под контролем Nia1/nirA промотора] для усиления продуцирования бутанола, как показано на фиг. 1 и 3.
Примеры сконструированных генов расщепления крахмала (гликогена) показаны в приведенных в списке SEQ ID NO: 29-33. Вкратце, SEQ ID NO: 29 представляет пример 29 для сконструированного ДНК-конструкта амилазы (1889 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NR промотор (21-188), 9-по Xho I NdeI сайт (189-197), 135-по транзитный пептид RbcS2 (198332), последовательность, кодирующую амилазу (333-1616), выделенную и модифицированную из альфа-амилазы ячменя (GenBank: J04202A my46 экспрессия протестирована в алейроновых клетках), 21-по последовательность-метку Lumio (1617-1637), 9-по XbaI сайт (1638-1646), 223-по терминатор RbcS2 (1647-1869) и ОБ ПЦР-праймер (1870-1889).
SEQ ID NO: 30 представляет пример 30 для сконструированного ДНК-конструкта крахмалфосфо-рилазы (3089 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NR промотор (21-188), 135-по транзитный пептид RbcS2 (189-323), последовательность, кодирующую крахмалфосфо-рилазу (324-2846), выделенную и модифицированную из последовательности крахмалфосфорилазы корня цитруса (GenBank: AY098895, экспрессия протестирована в корне цитруса), 223-по терминатор RbcS2 (2847-3069) и ОБ ПЦР-праймер (3070-3089).
SEQ ID NO: 31 представляет пример 31 для сконструированного ДНК-конструкта гексокиназы (1949 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NR промотор (21188), 135-по транзитный пептид RbcS2 (189-323), последовательность, кодирующую гексокиназу (3241706), выделенную и модифицированную из мРНК-последовательности гексокиназы Ajellomyces capsu-latus (Genbank: XM 001541513), 223-по терминатор RbcS2 (1707-1929) и ОБ ПЦР-праймер (1930-1949).
SEQ ID NO: 32 представляет пример 32 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглюкому-тазы (2249 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NR промотор (21-188), 135-по транзитный пептид RbcS2 (189-323), последовательность, кодирующую фосфоглюкому-тазу (324-2006), выделенную и модифицированную из последовательности фосфоглюкомутазы Pichia stipitis (GenBank: XM 00 1383281), 223-по терминатор RbcS2 (2007-2229) и ОБ ПЦР-праймер (2230-2249).
SEQ ID NO: 33 представляет пример 33 для сконструированного ДНК-конструкта глюкозофосфати-зомеразы (2231 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NR промотор (21-188), 135-по транзитный пептид RbcS2 (189-323), последовательность, кодирующую глюкозофосфатизомеразу (324-1988), выделенную и модифицированную из последовательности фосфоглюкои-зомеразы S. cerevisiae (GenBank: M21696), 223-по терминатор RbcS2 (1989-2211) и ОБ ПЦР-праймер
(2212-2231).
Сконструированные гены расщепления крахмала, такие как показанные в SEQ ID NO: 29-33, можно выбрать для использования в сочетании с различными сконструированными генами пути продуцирования бутанола для построения различных сконструированных путей продуцирования бутанола расщеплением крахмала, таких как пути, показанные на фиг. 1. Например, сконструированные гены, показанные в SEQ ID NO: 1-12, 24-26 и 29-33, можно выбрать для построения пути продуцирования крахмала в бута-нол под контролем Nia1 промотора, который включает следующие сконструированные ферменты: амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктоки-назу, фруктозодифосфатальдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу (или пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу), тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротона-зу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. Этот путь крах-мал/гликоген-в-бутанол 17-33 может использоваться самостоятельно и/или в сочетании с другим пу
тем(путями) продуцирования бутанола, таким как ответвленный от 3-фосфоглицерата путь продуцирования бутанола 03-12, как проиллюстрировано на фиг. 1.
Распределение сконструированных путей продуцирования бутанола между хлоропластом и
цитоплазмой
В еще одном варианте осуществления данного изобретения фотобиологическую продуктивность бутанола усиливают посредством выбранного распределения сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола между хлоропластом и цитоплазмой у эукариотической растительной клетки. То есть, не весь(все) сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола (фиг. 1) должны функционировать в хлоропласте; при необходимости часть сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола может также функционировать в цитоплазме. Например, в одном из различных вариантов осуществления значительная часть активности сконструированного пути крахмал-в-бутанол от дигидроксиацетонфосфа-та до бутанола (21-33) сконструирована для прохождения в цитоплазме, в то время как этапы от крахмала до дигидроксиацетонфосфата (17-20) - в хлоропласте. В этом примере связь между хлоропластной и цитоплазматической частями сконструированного пути достигается путем использования триозофосфат-фосфатного транслокатора, который способствует перемещению дигидроксиацетона через мембрану хлоропласта. Также путем использования триозофосфат-фосфатного транслокатора, также появляется возможность ответвленному от глицеральдегид-3-фосфата сконструированному пути продуцирования бутанола функционировать не только в хлоропласте, но также и в цитоплазме. Цитоплазматическую часть сконструированного пути продуцирования бутанола можно построить путем использования сконструированных генов пути продуцирования бутанола (ДНК-конструктов фиг. 2A), при этом опускают их нацеливающую на хлоропласт последовательность, как показано на фиг. 2E.
Сконструированные оксифотобактерии со сконструированными путями продуцирования бутанола в цитоплазме.
У прокариотических фотосинтетических организмов, таких как сине-зеленые водоросли (оксифото-бактерии, включая цианобактерии и оксихлоробактерии), которые обычно содержат фотосинтетическую тилакоидную мембрану, но не хлоропластную структуру, цикл Кальвина располагается в цитоплазме. В этом особом случае весь сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола (фиг. 1), включая (но без ограничений) ответвленный от глицеральдегид-3-фосфата путь продуцирования бутанола (01-12), ответвленный от 3-фосфоглицерата путь продуцирования бутанола (03-12), ответвленный от фруктоза-1,6-дифосфата путь (20-33), ответвленный от фруктоза-6-фосфата путь (19-33) и пути крахмал (или гли-коген)-в-бутанол (17-33) регулируют при конструировании для функционирования с циклом Кальвина в цитоплазме сине-зеленой водоросли. Построение цитоплазматических сконструированных путей продуцирования бутанола может достигаться путем использования сконструированных генов пути продуцирования бутанола (ДНК-конструкт фиг. 2A), при этом опускают всю их нацеливающую на хлоропласт последовательность. В случае, когда нацеливающая на хлоропласт последовательность у сконструированного ДНК-конструкта(конструктов) опускается, как проиллюстрировано на фиг. 2E, сконструированный ген(гены) транскрибируется и транслируется в сконструированные ферменты в цитоплазме, тем самым придавая сконструированный путь(и) продуцирования бутанола. Сконструированный ген(гены) можно включить в хромосомную и/или плазмидную ДНК у хозяйских сине-зеленых водорослей (оксифотобак-терии, включая цианобактерии и оксихлоробактерии) с помощью техник генной трансформации, известной специалистам данной области техники. Предпочтительной практикой является интегрирование сконструированных генов посредством интегративной трансформации в хромосомную ДНК, которая обычно может обеспечить лучшую генетическую стабильность для сконструированных генов. У оксифо-тобактерии, таких как цианобактерии, интегративная трансформация может достигаться посредством способа двойной рекомбинации гомологичных ДНК в хозяйскую хромосомную ДНК с помощью сконструированного ДНК-конструкта, как проиллюстрировано на фиг. 2F, который обычно, от 5' выше к 3' ниже, включает: сайт рекомбинации 1, сконструированный ген(гены) пути продуцирования бутанола и сайт рекомбинации 2. Этот тип ДНК-конструктов (фиг. 2F) может доставляться в оксифотобактерии (сине-зеленые водоросли) с помощью ряда доступных техник генетической трансформации, включая электро-порацию, естественную трансформацию и/или конъюгацию. Трансгенные сконструированные организмы, созданные из сине-зеленых водорослей также называются сконструированными сине-зелеными водорослями (сконструированными оксифотобактериями, включая сконструированные цианобактерии и сконструированные оксихлоробактерии).
Примеры сконструированных оксифотобактериальных генов пути продуцирования бутанола показаны в приведенных в списке SEQ ID NO: 34-45. Вкратце, SEQ ID NO:34 представляет пример 34 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта бутанолдегидрогеназы (1709 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 400-по промотор нитритредуктазы (nirA) из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-420), последовательность, кодирующую фермент (421-1569), выделенную и модифицированную из последовательности бутанолдегидрогеназы Clostridium saccharop-erbutylacetonicum (AB257439), 120-по терминатор rbcS из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (15701689) и ОБ ПЦР-праймер (1690-1709) на 3' конце.
SEQ ID NO: 35 представляет пример 35 для сконструированного оксифотобактериального ДНК
конструкта бутиральдегиддегидрогеназы (1967 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 400-по промотор нитритредуктазы nirA Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-420), последовательность, кодирующую фермент (421-1827), выделенную и модифицированную из последовательности бутиральдегиддегидрогеназы Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AY251646), 120-по терминатор rbcS из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1828-1947) и ОБ ПЦР-праймер (1948-1967) на 3' конце.
SEQ ID NO: 36 представляет пример 36 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта бутирил-КоА-дегидрогеназы (1602 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по промотор нитратредуктазы Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), последовательность, кодирующую бутирил-КоА-дегидрогеназу (326-1422), выделенную/модифицированную из последовательности бутирил-КоА-дегидрогеназы Clostridium beijerinckii (AF494018), 120-по терминатор rbcS Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1423-1582) и ОБ ПЦР-праймер (1583-1602) на 3' конце.
SEQ ID NO: 37 представляет пример 37 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта кротоназы (1248 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по промотор нитратредуктазы Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), последовательность, кодирующую кротоназу (326-1108), выщеленную/модифицированную из последовательностей кротоназы Clostridium beijerinckii (GenBank: AF494018), 120-по терминатор rbcS Thermosynechococcus elongatus BP-1 (11091228) и ОБ ПЦР-праймер (1229-1248).
SEQ ID NO: 38 представляет пример 38 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (1311 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по nirA промотор из (21-325), последовательность, кодирующую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (326-1171), выщеленную/модифицированную из кротоназы 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназной последовательности Clostridium beijerinckii (GenBank: AF494018), 120-по терминатор rbcS Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1172-1291) и ОБ ПЦР-праймер
(1292-1311).
SEQ ID NO: 39 представляет пример 39 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта тиолазы (1665 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по nirA промотор из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), последовательность, кодирующую тиола-зу (326-1525), выделенную/модифицированную из последовательности тиолазы Butyrivibrio fibrisolvens (AB 190764), 120-по терминатор rbcS из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1526-1645) и ОБ ПЦР-праймер (1646-1665).
SEQ ID NO: 40 представляет пример 40 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы (4071 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по nirA промотор из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), последовательность, кодирующую пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (326-3931), выделенную/модифицированную из последовательностей пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы Mastigamoeba balamuthi (GenBank: AY101767), 120-по терминатор rbcS из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (39324051) и ОБ ПЦР-праймер (4052-4071).
SEQ ID NO: 41 представляет пример 41 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта пируваткиназы (1806 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по nirA промотор из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), последовательность, кодирующую пируваткиназу (326-1666), выделенную/модифицированную из пируваткиназы Thermoproteus tenax (GenBank: AF065890), 120-по терминатор rbcS Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1667-1786) и ОБ ПЦР-праймер (1787-1806) на 3' конце.
SEQ ID NO: 42 представляет пример 42 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта энолазы (1696 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 231-по nirA промотор из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-251), последовательность, кодирующую энола-зу (252-1556), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной энолазы Chlamy-domonas reinhardtii (GenBank: X66412, Р31683), 120-по терминатор rbcS из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1557-1676) и ОБ ПЦР-праймер (1677-1696) на 3' конце.
SEQ ID NO: 43 представляет пример 43 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта фосфоглицератмутазы (2029 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 231-по nirA промотор из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-251), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (252-1889), выделенную/модифицированную из последовательностей фосфоглицератмутазы Pelotomaculum thermopropionicum SI (GenBank: YP 001213270), 120-по терминатор rbcS Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1890-2009) и ОБ ПЦР-праймер (2010-2029) на 3' конце.
SEQ ID NO: 44 представляет пример 44 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта фосфоглицераткиназы (1687 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 231-по nirA промотор из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-251), последовательность, кодирующую фосфоглицераткиназу (252-1433), выделенную из фосфоглицераткиназы Pelotomaculum thermo-propionicum SI (BAF60903), 234-по терминатор rbcS Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1434-1667) и
ОБ ПЦР-праймер (1668-1687).
SEQ ID NO: 45 представляет пример 45 для сконструированного оксифотобактериального ДНК
конструкта глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1514 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по nirA промотор Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), последовательность, кодирующую фермент (326-1260), выделенную и модифицированную из НАД-зависимой гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназы Biastochloris viridis (CAC80993), 234-по терминатор rbcS из Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1261-1494) и ОБ ПЦР-праймер (1495-1514).
Сконструированные оксифотобактериальные гены, такие как показанные в SEQ ID NO: 34-45, можно выбрать для использования полностью или частично, и/или в сочетании с различными другими сконструированными генами пути продуцирования бутанола для построения различных сконструированных оксифотобактериальных путей продуцирования бутанола, таких как пути, показанные на фиг. 1. Например, сконструированные гены, показанные в SEQ ID NO: 34-45, можно выбрать для построения оксифо-тобактериального, управляемого nirA промотором и ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата пути продуцирования бутанола (01-12), который включает следующие сконструированные ферменты: НАД-зависимая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 01, фосфоглицераткиназа 02, фосфоглицератмутаза 03, энолаза 04, пируваткиназа 05, пируват-ферредоксин-оксидоредуктаза (или пируват-НАДФ+-оксидоредуктаза) 06, тиолаза 07, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа 08, кротоназа 09, бутирил-КоА-дегидрогеназа 10, бутиральдегиддегидрогеназа 11 и бутанолдегидрогеназа 12. Использование этих сконструированных оксифотобактериальных генов пути продуцирования бутанола (SEQ ID NO: 34-45) у термофильной и/или терморезистентной цианобактерии может представлять собой термофильную и/или терморезистентную продуцирующую бутанол оксифотобактерию. Например, использование этих сконструированных генов (SEQ ID NO: 34-45) у термофильной/терморезистентной цианобактерии, такой как Thermosynechococcus elongatus BP-1 может представлять собой сконструированную термофильную/терморезистентную продуцирующую бутанол бактерию, такую как сконструированный продуцирующий бутанол Thermosynechococcus.
Дополнительные модификации хозяина для помощи в обеспечении биологической безопасности
Данное изобретение также обеспечивает способы биобезопасного продуцирования фотосинтетического биотоплива на основе сконструированных трансгенных растений (таких как водоросли и оксифо-тобактерии) или растительных клеток с контролируемым клеточным делением. Сконструированный фотосинтетическое организм с контролируемым клеточным делением (фиг. 3) создают посредством использования сконструированного гена(генов) контроля биологической безопасности (фиг. 2G) в сочетании с сконструированным геном(генами) пути продуцирования бутанола (фиг. 2A-2F) так, чтобы его клеточное деление и функцию скрещивания можно было контролируемо остановить для обеспечения более хороших признаков биологической безопасности.
В одном из различных вариантов осуществления основным признаком является то, что сконструированный фотосинтетический организм с контролируемым клеточным делением (такой как водоросль, растительная клетка или оксифотобактерия) содержит две ключевые функции (фиг. 3A): сконструированный механизм(ы) биологической безопасности и сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива. Как показано на фиг. 3B, сконструированный признак(признаки) биологической безопасности придается с помощью ряда механизмов, включая: (1) индуцибельную вставку сконструированных протонных каналов в цитоплазматическую мембрану для постоянного блокирования какого-либо клеточного деления и способности к скрещиванию, (2) избирательное применение сконструированного ре-гуляторного белка цикла клеточного деления или интерференционной РНК (иРНК) для постоянного ин-гибирования цикла клеточного деления и предпочтительно удерживания клетки в G1 фазе или G0 состоянии и (3) инновационное использование фотосинтетического организма-хозяина нуждающегося в высоком содержании CO2 для экспрессии сконструированного пути(путей) продуцирования биотоплива. Примеры сконструированного пути(путей) продуцирования биотоплива включают сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола, который работает с циклом Кальвина для синтеза биотоплива, такого как бутанол, непосредственно из диоксида углерода (CO2) и воды (Н2О). Сконструированная технология контроля клеточного деления может помочь обеспечить биологическую безопасность при использовании сконструированных организмов для фотосинтетического продуцирования биотоплива. Соответственно, данный вариант осуществления обеспечивает, среди прочего, биобезопасные способы продуцирования биотоплива на основе сконструированной, продуцирующей биотопливо, с контролируемым клеточным делением водоросли, цианобактерии, оксихлорбактерии, растения или растительных клеток.
В одном из различных вариантов осуществления сконструированную, продуцирующую бутанол, с контролируемым клеточным делением эукариотическую водоросль или растительную клетку создают путем введения сконструированного гена протонного канала (фиг. 2H) в хозяйскую водоросль или растительную клетку (фиг. 3B). SEQ ID NO: 46 представляет пример 46 для детализированного ДНК-конструкта сконструированного, под управлением Nia1 промотора гена протонного канала (609 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы Nia1 (21-282), последовательность, кодирующую мелиттиновый протонный канал (283-366), 223-по терминатор RbcS2 (367-589) и ОБ ПЦР-праймер (590-609).
Экспрессия сконструированного гена протонного канала (фиг. 2H) контролируется индуцибельным
промотором, таким как промотор нитратредуктазы (Nia1), который может также использоваться для контроля экспрессии сконструированного гена(генов) пути продуцирования биотоплива. Поэтому, перед тем, как индуцируют экспрессию сконструированного гена(генов), сконструированный организм может расти фотоавтотрофно, используя CO2 в качестве источника углерода и Н2О в качестве источника электронов, подобно организмам дикого типа. Когда культура сконструированного организма выращена и готова для фотобиологического продуцирования биотоплив, тогда клеточную культуру помещают в специфическое индуцирующее условие (например, путем внесения нитрата в культуральную среду, если в качестве индуцибельного промотора используется промотор нитратредуктазы (Nia 1)) для индуцирования экспрессии как сконструированного гена протонного канала, так и сконструированного гена(генов) продуцирования биотоплива. Экспрессия гена протонного канала сконструирована так, чтобы осуществлять его транскрипцию в ядре и его трансляцию в цитозоле. Из-за специфического молекулярного конструирования экспрессированные протонные каналы автоматически включаются в цитоплазматическую мембрану, но оставляют интактной фотосинтетическую тилакоидную мембрану. Включение сконструированных протонных каналов в цитоплазматическую мембрану нарушает протонный градиент через ци-топлазматическую мембрану так, чтобы клеточное деление и функция скрещивания были постоянно заблокированы. Однако фотосинтетическая тилакоидная мембрана внутри хлоропласта сохраняется ин-тактной (функциональной) так, чтобы сконструированные ферменты пути продуцирования биотоплива, которые экспрессируются в стромальную область, могли работать с циклом Кальвина для фотобиологического продуцирования биотоплив из CO2 и Н2О. То есть, когда как сконструированный ген протонного канала, так и сконструированный ген(гены) пути продуцирования биотоплива запустятся, сконструированный организм станет невоспроизводимой клеткой для целенаправленного фотосинтетического продуцирования биотоплив. Из-за того, что клеточное деление и функция скрещивания на этой стадии постоянно заблокированы (устранены), культура сконструированного организма более не является живой материей, за исключением ее каталитической функции для фотохимического превращения CO2 и Н2О в биотопливо. Он более не будет способен скрещиваться и обмениваться какими-либо генетическими материалами с какими-либо другими клетками, даже если он каким-либо образом войдет во взаимодействие с клеткой дикого типа, как это будет в случае непредвиденной утечки в окружающую среду.
Согласно одному из различных вариантов осуществления промотор нитратредуктазы (Nia1) или промотор нитритредуктазы (nirA) является предпочтительным индуцибельным промотором для использования для контроля экспрессии сконструированных генов. В присутствии аммония (но не нитрата) в культуральной среде, например, сконструированный организм с сконструированным геном протонного канала под контролем Nia1 промотора и геном(генами) пути продуцирования биотоплива может расти фотоавтотрофно, используя CO2 в качестве источника углерода и Н2О в качестве источника электронов подобно организму дикого типа. Когда культура сконструированного организма выращена и готова для фотобиологического продуцирования биотоплив, тогда экспрессия как сконструированного гена протонного канала, так и сконструированного гена(генов) пути продуцирования биотоплива может быть индуцирована путем внесения некоторого количества нитратного удобрения в культуральную среду. Нитрат широко представлен в почвах и почти во всей поверхностной воде на Земле. Поэтому, даже если непредвиденно произойдет утечка сконструированного организма под контролем Nia1 промотора в естественную окружающую среду, он вскоре умрет, так как нитрат в окружающей среде запустит экспрессию сконструированного, находящегося под контролем Nia1 промотора гена протонного канала, который включит протонные каналы в цитоплазматическую мембрану, тем самым, убивая клетку. То есть, сконструированный фотосинтетический организм с находящимся под контролем Nia1 промотора геном протонного канала запрограммирован умереть, как только встретится с нитратом в окружающей среде. Эта характеристика сконструированных организмов с контролируемым клеточным делением с находящимся под контролем Nia1 промотора геном протонного канала обеспечивает дополнительное свойство биологической безопасности.
Недавно был раскрыта область техники построения гена протонного канала (фиг. 2H) с нацеливающей на тилакоидную мембрану последовательностью [James W. Lee (2007). Сконструированные трансгенные водоросли с протонным каналом для фотобиологического продуцирования водорода, международная публикация PCT номер: WO 2007/134340 А2]. В данном изобретении создания сконструированного организма с контролируемым клеточным делением при конструировании гена протонного канала должна быть упущена нацеливающая на тилакоидную мембрану последовательность. Например, важными компонентами сконструированного, находящегося по контролем Nia1 промотора гена протонного канала может быть просто Nia1 промотор, связанный с последовательностью, кодирующей протонный канал (без какой-либо нацеливающей на тилакодиную мембрану последовательности) так, чтобы протонный канал включался в цитоплазматическую мембрану, но не в фотосинтетическую тилакоидную мембрану.
Согласно одному из различных вариантов осуществления предпочтительной практикой является использование такого же индуцибельного промотора, например Nia1 промотора, для контроля экспрессии как сконструированного гена протонного канала, так и сконструированного гена пути продуцирования биотоплива. Таким образом, сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива может ин
дуцибельно экспрессироваться одновременно с экспрессией сконструированного гена протонного канала, который ликвидирует определенные клеточный функции, включая клеточное деление и скрещивание.
В одном из различных вариантов осуществления индуцибельный промотор, который может использоваться в данном варианте осуществления сконструированной биологической безопасности, выбирают из группы, включающей промоторы гидрогеназ [HydA1 (Hyd1) и HydA2, регистрационный номер: AJ308413, AF289201, AY090770], промотор гена Cyc6, промотор гена Cpx1, промотор белка теплового шока HSP70A, промотор гена CabII-1 (регистрационный номер М24072), промотор гена Ca1 (регистрационный номер Р20507), промотор гена Ca2 (регистрационный номер Р24258), промотор нитратредукта-зы (Nia1), промоторы гена нитритредуктазы (nirA), промоторы гена hox двухсторонней гидрогеназы, све-то- и теплочувствительные groE промоторы, промоторы rbcL оперона Rubisco, металл (цинк)-индуцибельный smt промотор, чувствительный к железу idiA промотор, редокс-чувствительный crhR промотор, промотор, гена теплового шока hsp16.6, промотор малого белка теплового шока (Hsp), промоторы чувствительного к CO2 гена карбоангидразы, чувствительный к зеленому/красному свету промотор срсВ2А2, чувствительные к УФ-свету lexA, recA и ruvB промоторы, промоторы гена нитратредуктазы (narB) и их сочетания.
В другом варианте осуществления сконструированный фотосинтетический организм с контролируемым клеточным делением создают с использованием мутанта с дефицитом по карбоангидразе или мутанта, нуждающегося в высоком содержании CO2, в качестве организма-хозяина для создания сконструированного организма для продуцирования биотоплива. Мутанты, нуждающиеся в высоком содержании CO2, которые можно выбрать для использования в данном изобретении, включают (но без ограничений): 12-1С мутант с дефицитом по карбоангидразе Chlamydomonas reinhardtii (CC- 1219 cal mt-), cia3 мутант Chlamydomonas reinhardtii (Plant Physiology 2003, 132:2267-2275), нуждающийся в высоком содержании CO2 M3 мутант Synechococcus sp. штамм PCC 7942 или дефицитные по карбоксисомам клетки Synechocystis sp. PCC 6803 (Plant biol (Stuttg) 2005, 7:342-347), у которых отсутствует механизм концентрирования CO2, могут расти фотоавтотрофно только при повышенном концентрационном уровне CO2, таком как 0,2-3% CO2.
При атмосферном концентрационном уровне CO2 (380 ppm (частей на миллион)), мутанты с дефицитом по карбоангидразе или нуждающиеся в высоком содержании CO2 как правило не выживают. Поэтому ключевым концептом здесь является то, что сконструированный, продуцирующий биотопливо организм, нуждающийся в высоком содержании CO2, у которого отсутствует механизм коцентрирования CO2, будет выращиваться и использоваться для фотобиологического продуцирования биотоплив всегда при повышенном концентрационном уровне CO2 (0,2-5% CO2) в герметизированном биореакторе с подачей CO2. Такой сконструированный трансгенный организм не может выжить, если будет подвергнут атмосферному концентрационному уровню CO2 (380 ppm = 0,038% CO2) по причине того, что его CO2-концентрирующий механизм (CCM) для эффективной фотосинтетической фиксации CO2 был ослаблен мутацией. Даже если произойдет непредвиденная утечка такого сконструированного организма в естественную окружающую среду, его клетка вскоре не будет способна делиться или скрещиваться, но быстро умрет из-за углеродного голодания, так как она не может эффективно осуществлять фотосинтетическую фиксацию CO2 при атмосферной концентрации CO2 (380 ppm). Таким образом, использование такого мутанта, нуждающегося в высоком содержании CO2, в качестве организма-хозяина для генной трансформации сконструированного гена(генов) пути продуцирования биотоплива представляет собой другой путь при создании сконструированных организмов с предусмотренным контролируемым клеточным делением для биобезопасного фотобиологического продуцирования биотоплив из CO2 и Н2О. Здесь нет необходимости в сконструированном гене протонного канала.
В другом варианте осуществления сконструированный организм с контролируемым клеточным делением (фиг. 3B) создают путем использования сконструированного регуляторного гена цикла клеточного деления в качестве гена контроля биологической безопасности (фиг. 2G), который может контролировать экспрессию генов цикла клеточного деления (cdc) у организма-хозяина так, чтобы он мог индуци-бельно останавливать свои репродуктивные функции, например, перманентно выключая клеточное деление и возможность скрещивания при специфическом индуцировании сконструированного гена.
Биологически это является экспрессией естественных cdc генов, которая контролирует клеточный рост и цикл клеточного деления у цианобактерий, водорослей и клеток высших растений. Наиболее основной функцией клеточного цикла является безошибочное удвоение огромного количества ДНК в хромосомах во время S фазы (S для синтеза) и затем точное разделение копий на две идентичные дочерние клетки во время M фазы (M для митоза). Митоз обычно начинается с хромосомной конденсации: удвоенные нити ДНК, упакованные в удлиненные хромосомы, конденсируются в намного более компактные хромосомы, необходимые для их расхождения. Затем ядерная оболочка разрушается и реплицированные хромосомы, каждая включающая пару сестринских хроматид, становятся прикрепленными к микротрубочкам митотического веретена. В ходе митоза клетка ненадолго делает паузу в состоянии, называемом метафаза, когда хромосомы выстроены в линию на экваторе митотического веретена, уравновешены для расхождения. Неожиданное расхождение сестринских хроматид обозначает начало анафазы, во время которой хромосомы движутся к противоположным полюсам веретена, где они деконденсируются, и за
ново формируется интактное ядро. Клетка затем перешнуровывается в две с помощью цитоплазматиче-ского деления (цитокинез), и после этого клеточное деление завершено. Следует отметить, что большинству клеток необходимо гораздо больше времени для роста и удвоения их массы белков и органелл, чем им нужно для репликации их ДНК (S-фаза) и деления (M-фаза). Поэтому существуют две промежуточные фазы: G1-фаза между M-фазой и S-фазой, и G2-фаза между S-фазой и митозом. В итоге цикл эука-риотической клетки традиционно разделяют на четыре последовательные фазы: G1, S, G2 и M. Физиологически две промежуточные фазы также обеспечивают время для клетки для наблюдения за внутренней и внешней окружающей средой для того, чтобы удостовериться, что условия являются пригодными и приготовления завершены перед тем, как клетка сама подвергнется S-фазе и митозу. Фаза G1 является особо важной в этом аспекте. Ее длительность может сильно варьировать в зависимости от внешних условий и внеклеточных сигналов из других клеток. Если внеклеточные условия неблагоприятны, например, клетки откладывают продвижение через G1 и могут даже войти в специализированное состояние покоя, известное как G0 (G ноль), в котором они остаются дни, недели или даже годы перед тем, как возобновить пролиферацию. Фактически многие клетки остаются постоянно в состоянии G0 до тех пор, пока не умрут.
В одном из различных вариантов осуществления сконструированный ген(гены), который кодирует сконструированный cdc-регуляторный белок или специфическую cdc-иРНК, используется для индуци-бельного ингбирования экспрессии определенного cdc гена(генов) для остановки клеточного деления и блокирования возможности скрещивания в случае, когда сконструированный ген(гены) переключаются специфическим индуцирующим условием. Когда, например, сконструированные культуры с контролируемым клеточным делением выращены и готовы для фотосинтетического продуцирования биотоплив, предпочтительной практикой является индуцирование экспрессии специфического сконструированного гена(генов) cdc-иРНК наряду с индукцией сконструированного гена (гены) пути продуцирования биотоплива так, что клетки будут перманентно остановлены в G1 фазе или G0 состоянии. Таким образом, выращенные клетки сконструированного организма станут превосходными катализаторами фотосинтетического продуцирования биотоплив из CO2 и Н2О в то время как их функции клеточного деления и скрещивания перманентно выключены в G1 фазе или G0 состоянии, чтобы помочь обеспечить биологическую безопасность.
Применение вариантов осуществления биологической безопасности с различными сконструированными генами пути продуцирования биотоплива, которые перечислены в SEQ ID: 1-45, может создать различные биобезопасные фотобиологические продуценты биотоплива (фиг. 3A, 3B и 3C). Следует отметить, что SEQ ID NO: 46 и 1-12 (примеры 1-12) представляют собой пример сконструированного эука-риотического организма с контролируемым клеточным делением, такой как сконструированная водоросль, с контролируемым клеточным делением (например, Chlamydomonas), которая содержит находящийся под контролем Nia1 промотора сконструированный ген протонного канала (SEQ ID NO: 46) и набор находящихся под контролем Nia1 промотора сконструированных генов пути продуцирования бута-нола (SEQ ID NO: 1-12). По причине того, что сконструированный ген протонного канала и сконструированный ген(гены) пути продуцирования биотоплива, все контролируются одними и теми же Nia1 про-моторными последовательностями, они могут одновременно экспрессироваться при индукции путем внесения нитратного удобрения в культуральную среду для обеспечения возможности биобезопасного фотосинтетического продуцирования биотоплива, как проиллюстрировано на фиг. 3B. Применение сконструированных, находящихся под контролем Nia1 промотора генов пути продуцирования бутанола (SEQ ID NO: 1-12) у нуждающегося в высоком содержании CO2 хозяйского фотосинтетического организма, такого как 12-1С мутант с дефицитом по карбоангидразе Chlamydomonas reinhardtii (CC-1219 cal mt-) или cia3 мутант Chlamydomonas reinhardtii, представляет собой другой пример при создании сконструированного фотосинтетического организма с контролируемым клеточным делением для обеспечения биологической безопасности.
Этот сконструированный признак биологической безопасности можно применять для продуцирования других биотоплив, таких как биомасла, биоводород, этанол, а также промежуточных продуктов. Например, этот вариант осуществления биологической безопасности в сочетании с набором сконструированных генов пути продуцирования этанола, таких как показанные в SEQ ID NO: 47-53, может представлять собой продуцент этанола с контролируемым клеточным делением (фиг. 3C). Вкратце, SEQ ID NO: 47 представляет пример 47 детализированного ДНК-конструкта (1360 пар оснований (по)) находящегося под контролем nirA промотора сконструированного гена НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы, который включает: ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор (21-108), выделенный из промоторной последовательности гена нитратредуктазы штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (пресноводная цианобактерия), последовательность, кодирующую фермент (1091032), выделенную и модифицированную из последовательности цитозольной НАД-зависимой глице-ральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Cyanidium caldarium (регистрационный номер GenBank: CAC85917), 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1033-1340) и ОБ ПЦР-праймер (1341-1360) на 3' конце.
SEQ ID NO: 48 представляет пример 48 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицерат
киназы под контролем nirA промотора (1621 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор нитратредуктазы штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (21-108), последовательность, кодирующую фосфоглицераткиназу (109-1293), выделенную из последовательности фос-фоглицераткиназы НТА426 Geobacillus kaustophilus (GenBank: BAD77342), 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1294-1601) и ОБ ПЦР-праймер (1602-1621).
SEQ ID NO: 49 представляет пример 49 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицерат-мутазы под контролем nirA промотора (1990 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор нитритредуктазы штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (21-108), 9-по Xho I NdeI сайт (109-117), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (118-1653), выделенную из последовательности фосфоглицератмутазы DSM 8903 Caldicellulosiruptor saccharolyticus (Gen-Bank: АВР67536), 9-по XbaI сайт (1654-1662), 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1663-1970) и ОБ ПЦР-праймер (1971-1990).
SEQ ID NO: 50 представляет пример 50 для сконструированного ДНК-конструкта энолазы под контролем nirA промотора (1765 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор нитритредуктазы штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (21-108), 9-по Xho I NdeI сайт (109117), последовательность, кодирующую энолазу (118-1407), выделенную из последовательности энолазы CCY0110 Cyanothece sp. (GenBank: ZP 01727912), 21-по последовательность, кодирующую Lumio-метку (1408-1428), 9-по XbaI сайт (1429-1437), содержащий стоп-кодон, 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1438-1745) и ОБ ПЦР-праймер (1746-1765) на 3' конце.
SEQ ID NO: 51 представляет пример 51 для сконструированного ДНК-конструкта пируваткиназы под контролем nirA промотора (1888 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор нитритредуктазы штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (21-108), 9-по Xho I NdeI сайт (109-117), последовательность, кодирующую пируваткиназу (118-1530), выделенную из последовательности пируваткиназы Selenomonas ruminantium (GenBank: AB037182), 21-по последовательность-метку Lumio (1531-1551), 9-по XbaI сайт (1552-1560), 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1561-1868) и ОБ ПЦР-праймер (1869-1888).
SEQ ID NO: 52 представляет пример 52 для сконструированного ДНК-конструкта пируватдекар-боксилазы под контролем nirA промотора (2188 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор нитритредуктазы штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (21-108), 9-по Xho I NdeI сайт (109-117), последовательность, кодирующую пируватдекарбоксилазу (118-1830), выделенную из последовательностей пируватдекарбоксилазной последовательности Pichia stipitis (GenBank: XM 001387668), 21-по последовательность-метку Lumio (1831-1851), 9-по XbaI сайт (1852-1860), 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1861-2168) и ОБ ПЦР-праймер (2169-2188) на 3' конце.
SEQ ID NO: 53 представляет пример 53 для сконструированного ДНК-конструкта НАД(Ф)Н-зависимой алкогольдегидрогеназы под контролем nirA промотора (1510 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по nirA промотор нитритредуктазы штамма PCC 7942 Synecho-coccus sp. (21-108), последовательность, кодирующую НАД(Ф)Н-зависимую алкогольдегидрогеназу (109-1161), выщеленную/модифицированную (удалена ее последовательность митохондриального сигнального пептида) из последовательности гена алкогольдегидрогеназы (ADH3) Kluyveromyces lactis (GenBank: X62766), 21-по последовательность-метку Lumio (1162-1182), 308-по rbcS терминатор штамма PCC 7942 Synechococcus sp. (1183-1490) и ОБ ПЦР-праймер (1491-1510) на 3' конце.
Следует отметить, что SEQ ID NO: 47-53 (примеры ДНК-конструктов 47-53) представляют собой набор сконструированных генов, находящихся под контролем nirA промотора, пути продуцирования этанола, которые могут использоваться у оксифотобактерий, таких как штамм PCC 7942 Synechococcus sp. Применение этого набора сконструированных генов пути продуцирования этанола у нуждающейся в высоком содержании CO2 цианобактерии, такой как Synechococcus sp. мутант M3 штамма PCC 7942 представляет собой другой пример сконструированной цианобактерии с контролируемым клеточным делением для биобезопасного фотосинтетического продуцирования биотоплив из CO2 и Н2О.
Применение сконструированных продуцирующих бутанол организмов способами фотобиореактор-сбор бутанола.
Различные варианты осуществления, кроме того, раскрывают как сконструированные организмы, включая сконструированные организмы с контролируемым клеточным делением (фиг. 3) могут применяться с помощью фотобиореактора и способа сепарации-сбора бутанола для фотосинтетического продуцирования бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) и О2 непосредственно из CO2 и Н2О, используя солнечный свет. Существует ряд вариантов осуществления в отношении того, как сконструированные организмы могут применяться для фотобиологического продуцирования бутанола. Одним из предпочтительных вариантов осуществления является применение сконструированных организмов для непосредственного фотосинтетического продуцирования бутанола из CO2 и Н2О с помощью системы фотобиологического реактора и сбора бутанола (фильтрация и перегонка/выпаривание), которое включает специфический технологический процесс, описанный в виде серии следующих этапов: a) выращивают сконструированный трансгенный организм фотоавтотрофно в минимальной культуральной среде, используя CO2 возду
ха в качестве источника углерода в аэробных (нормальных) условиях перед индукцией экспрессии сконструированных генов пути продуцирования бутанола; b) когда культура сконструированных организмов выращена и готова для продуцирования бутанола, герметизируют или помещают культуры в специфическое условие, такое как анаэробное условие, которое может быть образовано удалением О2 из фотобиологического реактора, для индукции экспрессии сконструированных генов продуцирования бутанола; c) когда сконструированные ферменты пути продуцирования бутанола экспрессируются, обеспечивают видимую световую энергию, такую как солнечный свет, для клеток с экспрессируемыми сконструированными генами для работы в качестве катализаторов для фотосинтетического продуцирования бутанола из CO2 и Н2О; d) собирают продукт бутанол каким-либо способом, известным специалистам данной области техники. Например, собирают продукт бутанол из фотобиологического реактора сочетанием техник мембранной фильтрации и дистилляции/выпаривания для сбора бутанола и гибко собирают газовый продукт О2 из реактора. Вышеуказанный способ применения сконструированных организмов для фотосинтетического продуцирования CH3CH2CH2CH2OH и О2 из CO2 и Н2О с помощью биологического реактора и сбора бутанола и сепарации газового продукта и системы сбора отходов может повторяться в течение множества технологических циклов для достижения более желаемых результатов. Какой-либо из этапов a)-d) данного способа, описанного выше, можно также отрегулировать в соответствии с данным изобретением для того, чтобы удовлетворять определенным специфическим условиям. На практике, какой-либо из этапов a)-d) способа может применяться полностью или частично, и/или в каком-либо регулируемом сочетании, а также для усиления фотобиологического продуцирования бутанола в соответствии с данным изобретением. Источники CO2 которые могут использоваться в данном способе, включают, но без ограничений, промышленный CO2, (би)карбонаты и атмосферный CO2. Например, CO2 дымового газа из промышленного оборудования, которое работает на ископаемом топливе или биомассе, может вводиться через трубопровод в фотобиологический реактор в данном способе. Промышленное оборудование, которое может генерировать CO2 ресурсы для сконструированного процесса фотосинтетического продуцирования бутанола, включает (но без ограничений): угольные электростанции, черную металлургию, производящие цемент заводы, оборудование нефтеперерабатывающих заводов, фабрики по производству химических удобрений, оборудование для перегонки/сепарации биотоплив (или промежуточных продуктов), работающее на биомассе и/или ископаемом топливе, способы пиролиза биомассы, дымовые трубы, ферментационные биореакторы, оборудование для производства биотоплива и их сочетания.
Альтернативно, этот сконструированный процесс фотобиологического продуцирования бутанола может также использовать CO2 в окружающей среде, а также из атмосферы. Газообразный CO2, растворённый CO2, бикарбонат и карбонаты все могут использоваться с помощью технологии фотобиологического продуцирования бутанола сконструированным организмом.
Этот вариант осуществления иллюстрируется более детально в данном документе с помощью, например, сконструированных водорослей. Как описано выше, сконструированные водоросли по данному изобретению, такие как содержащая набор сконструированных генов под контролем HydA1 промотора пути продуцирования бутанола (например, ДНК-конструкты SEQ ID NO: 13-16 (или 17) и 18-23), могут расти нормально в аэробных условиях с помощью автотрофного фотосинтеза, используя CO2 воздуха путем, подобным таковому водоросли дикого типа. Сконструированные водоросли могут также расти фотогетеротрофно, используя также органический субстрат.
В предпочтительном варианте осуществления сконструированную водоросль выращивают фотоав-тотрофно, используя CO2 воздуха в качестве источника углерода в аэробных условиях в минимальной среде, которая содержит необходимые минеральные (неорганические) питательные вещества. Органический субстрат, такой как ацетат, не нужен для роста сконструированной водоросли в нормальных условиях перед тем, как экспрессируются сконструированные гены фотосинтетического пути продуцирования бутанола. Большинство водорослей могут быстро расти в воде посредством автотрофного фотосинтеза, используя CO2 воздуха, поскольку есть достаточно минеральных питательных веществ. Питательными элементами, которые, как правило, нужны для водорослевого роста являются: N, Р и K при концентрациях около 1-10 мМ, и Mg, Ca, S и Cl при концентрациях около 0,5 -1,0 мМ, плюс некоторые следовые элементы Mn, Fe, Cu, Zn, В, Со, Mo среди прочих при цМ концентрационных уровнях. Все минеральные питательные вещества могут поставляться в водную минимальную среду, которую можно сделать по общепринятым рецептам водорослевых культуральных сред, используя воду (пресную воду для сконструированных пресноводных водорослей; морскую воду для солетолерантных сконструированных морских водорослей) и относительно небольшие количества недорогих удобрений и минеральных солей, таких как аммония бикарбонат (NH4HCO3) (или аммония нитрат, мочевина, аммония хлорид), калия фосфаты (K2HPO4 и KH2PO4), магния сульфат гептагидрат (MgSO4-7H2O), кальция хлорид (CaCl2), цинка сульфата гептагидрат (ZnSO4-7H2O), железа (II) сульфата гептагидрат (FeSO4-7H2O) и борная кислота (H3BO3), среди прочих. То есть, большие количества клеток сконструированных водорослей можно недорого выращивать за короткий промежуток времени, потому что, при аэробных условиях, таких как в открытом пруду, сконструированные водоросли могут фотоавтотрофно расти сами по себе, используя CO2 воздуха так же быстро, как и их родственные штаммы дикого типа. Это является значимым призна
ком (преимуществом) данного изобретения, который может предоставить экономичное решение при выработке фотоактивных биокатализаторов (сконструированные, фотосинтетические, продуцирующие бу-танол водоросли) для продуцирования возобновляемой солнечной энергии.
Когда водорослевые культуры выращены и готовы для продуцирования бутанола, выросшие водорослевые культуры герметизируют или помещают в определенные специфичные условия, например, анаэробные условия, которые можно образовать удалением О2 из герметизированного фотобиологического реактора, для индукции экспрессии сконструированных генов под контролем HydA1 промотора пути продуцирования бутанола. В случае, когда экспрессируются сконструированные ферменты пути продуцирования бутанола, видимая световая энергия, такая как солнечный свет, поставляется для того, чтобы экспрессирующие сконструированные гены водорослевые клетки работали в качестве катализаторов для фотосинтетического продуцирования бутанола из CO2 и Н2О. В случае, когда экспрессируются сконструированные гены, водорослевые клетки могут главным образом стать эффективными и мощными "зелеными машинами", которые являются превосходными для фотосинтетического продуцирования бутанола (CH3CH2CH2CH2OH) и О2 из CO2 и Н2О. Продукт бутанол из водорослевого фотобиологического реактора можно собирать сочетанием техник мембранной фильтрации и перегонки/выпаривания для сбора бутанола, включая (но без ограничений) экстракцию жидкость/жидкость, отгонку газа, мембранное выпаривание, первапорацию и адсорбционные техники (Durre, P. 1998 Appl Microbiol Biotechnol 49: 639648; Qureshi, Hughes, Maddox, and Cotta 2005 Bioprocess Biosyst Eng 27: 215-222).
Фотосинтетическое продуцирование CH3CH2CH2CH2OH и О2 непосредственно из CO2 и Н2О в соответствии с данным изобретением может, в принципе, иметь высокий квантовый выход. Теоретически, нужно только 48 фотонов для продуцирования CH3CH2CH2CH2OH и 6О2 из воды и диоксида углерода с помощью этого механизма. Максимальный теоретический КПД по энергии солнечный свет-в-бутанол способом непосредственного фотосинтетического продуцирования бутанола из CO2 и Н2О составляет около 10%, что является наиболее высоким возможным среди всех биологических подходов. В результате этот подход имеет огромный потенциал, когда правильно осуществляется с помощью водорослевого реактора и способа сбора бутанола и кислорода.
Вышеуказанный способ применения сконструированных водорослей для фотосинтетического продуцирования CH3CH2CH2CH2OH и О2 из CO2 и Н2О с помощью водорослевого реактора и сбора бутано-ла, и сепарации газового продукта, и системы сбора отходов можно повторять в течение множества технологических циклов для достижения более желаемых результатов.
Другим признаком является то, что сконструированный переключаемый организм продуцирования бутанола обеспечивает способность повторяющихся циклов фотоавтотрофного роста культуры в нормальных аэробных условиях таким образом, который подобен таковому дикого типа, и эффективное фотобиологическое продуцирование бутанола (фиг. 1 и 3) в случае, когда сконструированный путь продуцирования бутанола включается индуцибельным промотором (таким как промотор гидрогеназы) при определенных специфических индуцирующих условиях (например, в анаэробных условиях) в биореактор. Например, переключаемая сконструированная водоросль с сконструированными, находящимися под контролем промотора гидрогеназы генами продуцирования бутанола содержит нормальную митохондрию, которая использует восстановительную способность (НАДН) из органических запасов (и/или экзогенного субстрата, такого как ацетат) для питания энергией клетку сразу после ее возвращения в аэробные условия. Таким образом, когда водорослевую клетку возвращают в аэробные условия после ее применения в анаэробных условиях для продуцирования бутанола, клетка остановит продуцирование ферментов пути продуцирования бутанола и начнет восстанавливать свою нормальную фотоавтотрофную способность посредством синтеза нормального функционального хлоропласта. Следовательно, возможно применение такого типа генетически трансформированного организма в течение повторяющихся циклов фотоавтотрофного роста культур в нормальных аэробных условиях и эффективное продуцирование бу-танола в анаэробных условиях в анаэробном реакторе. То есть, эта технология фотобиологического продуцирования бутанола может находиться в действии в течение множества технологических циклов путем омоложения использованной культуры в аэробных условиях и вторичного использования омоложенной водорослевой культуры в условиях продуцирования бутанола для достижения более желаемых результатов. Факультативно, эта технология фотобиологического продуцирования бутанола находится в действии непрерывно путем циркуляции омоложенной водорослевой культуры из аэробного реактора в анаэробный реактор, в тоже время циркуляции использованной водорослевой культуры из анаэробного реактора (после ее применения для продуцирования бутанола) в аэробный реактор для омоложения путем синтеза нормальных функциональных хлоропластов посредством фотосинтетической фиксации CO2 и фотоавтотрофного роста. Некоторые из сконструированных организмов могли расти фотоавтотрофно даже при включенном пути(путей) продуцирования бутанола. Сможет ли вообще или как быстро сконструированный организм расти в условиях продуцирования бутанола может зависеть от его генетического фона и того, насколько много продуктов цикла Кальвина все еще доступны для роста клеток после применения посредством сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Сконструированные организмы, которые могут в условиях продуцирования бутанола поддерживать важные клеточные функции с подходящей скоростью роста могут также использоваться для непрерывного фотобиологического
продуцирования CH3CH2CH2CH2OH и О2 из CO2 и Н2О с помощью биореактора и способа сбора материала бутанола.
Существуют дополнительные пути, которые могут применяться переключаемыми сконструированными организмами, включая сконструированные организмы с контролируемым клеточным делением (фиг. 3) для биобезопасного фотобиологического продуцирования биотоплив. С помощью применения сконструированных признаков биологической безопасности, описанных ранее, например, использованная сконструированная водорослевая культура из реактора для фотобиологического продуцирования бутанола не должна циркулировать назад в реактор для роста культур. Вместо этого использованная водорослевая культура изымается для применения в качестве удобрений или исходного материала биомассы для другого технологического процесса, так как фотоавтотрофный рост переключаемой сконструированной водоросли в реакторе для роста культур способен непрерывно поставлять водорослевые клетки в реактор фотобиологического продуцирования бутанола для продуцирования биотоплива. Этот вариант осуществления является, в частности, полезным для применения некоторых сконструированных организмов, которые могут расти фотоавтотрофно только до, но не после того, как включен путь(пути) продуцирования бутанола. Например, путем удерживания непрерывно растущей культуры сконструированной водоросли (которая может расти фотоавтотрофно только до того, как включен путь(пути) продуцирования бутанола) в реакторе для роста культур можно обеспечить непрерывные подачи выращенных водорослевых клеток для применения в реакторе фотобиологического продуцирования бутанола. Этот подход также делает возможным применение таких сконструированных организмов, которые могут расти только до того, как включен путь(пути) продуцирования бутанола, для фотобиологического продуцирования бутанола.
В силу различных причин некоторые из сконструированных организмов для продуцирования бута-нола смогут расти только фотогетеротрофно или фотомиксотрофно, но не фотоавтотрофно. Применение реактора для роста культур может также выращивать этот тип сконструированных организмов для продуцирования бутанола фотогетеротрофно или фотомиксотрофно, используя органические субстраты, включая, но без ограничений, сахарозу, глюкозу, ацетат, этанол, метанол, пропанол, бутанол, ацетон, крахмал, гемицеллюлозу, целлюлозу, липиды, белки, органические кислоты, материалы биомассы и их сочетание. Выращенные таким образом культуры могут также поставляться в реактор фотобиологического продуцирования бутанола для индукции сконструированных путей для продуцирования бутанола. Этот модифицированный вариант осуществления роста культуры также делает возможным применение таких сконструированных организмов, которые могут расти только фотогетеротрофно или фотомиксо-трофно, также для фотобиологического продуцирования бутанола.
Для определенных специфических сконструированных организмов с сконструированными, находящимися под контролем промотора нитратредуктазы (Nia1) генами пути продуцирования бутанола вышеупомянутый фотобиологический реакторный процесс может быть дополнительно кроме того отрегулирован для достижения более благоприятных результатов. Например, как сконструированная водоросль, которая содержит находящиеся под контролем Nia1 (или nirA) промотора гены пути продуцирования бутанола, такие как показанные в примерах конструкции ДНК-последовательностей 1-12 (SEQ ID NO: 1-12), так и сконструированная оксифотобактерия, которая несет сконструированные, находящиеся под контролем nirA промотора гены пути продуцирования бутанола, показанные в SEQ ID NO: 34-45, могут нормально расти в культуральной среде с аммонием (но не нитратом) с помощью автотрофного фотосинтеза, используя CO2 воздуха таким образом, который подобен таковому водоросли дикого типа. Это по причине того, что экспрессия генов пути продуцирования бутанола у сконструированного организма будет запускаться только в присутствии нитрата в качестве необходимого владения для применения промотора нитратредуктазы (Nia1) или промотора нитритредуктазы (nirA) при контроле экспрессии сконструированного пути(путей). Значимым признаком сконструированных организмов с находящимися под контролем nirA или Nia1 промотора генами пути продуцирования бутанола является то, что экспрессия сконструированных путей продуцирования бутанола может индуцироваться манипулированием концентрационными уровнями нитрата (NO3-) относительно таковых аммония (NH4+) в культуральной среде без необходимости каких-либо анаэробных условий. То есть, экспрессия сконструированного пу-ти(путей) продуцирования бутанола может индуцироваться как в аэробных так и в анаэробных условиях. Это позволяет сконструированному фотобиологическому способу продуцирования бутанола функционировать даже в аэробных условиях, используя атмосферный CO2. Аналогичным образом этот тип сконструированных организмов с находящимися под контролем Nia1 промотора генами пути продуцирования бутанола также может расти фотоавтотрофно как в аэробных, так и в анаэробный условиях. Поэтому, в качестве дополнительного варианта осуществления, технологический способ применения сконструированного организма с находящимися под контролем промотора нитратредуктазы (Nia1) генами пути продуцирования бутанола настраивают следующим образом: a) выращивают сконструированный трансгенный организм фотоавтотрофно в минимальной культуральной среде в присутствии аммония (NH4+), но не нитрата (NO3-) до индукции экспрессии сконструированных генов пути продуцирования бутанола; b) когда культура сконструированного организма выращена и готова для продуцирования бутанола, добавляют нитратное (NO3-) удобрение в культуральную среду для повышения концентрации нитрата (NO3-)
по отношению к таковой аммония (NH4+) для индукции экспрессии сконструированных генов пути продуцирования бутанола; c) когда сконструированные ферменты пути продуцирования бутанола экспрес-сируются, обеспечивают видимую световую энергию, такую как солнечный свет для того, чтобы клетки с экспрессируемыми сконструированными генами работали в качестве катализаторов для фотосинтетического продуцирования бутанола из CO2 и Н2О; d) собирают продукт бутанол из фотобиологического реактора сочетанием техник мембранной фильтрации и сбора бутанола.
Дополнительно к продуцированию бутанола, также возможно применение сконструированного организма или части его сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола для продуцирования определенных промежуточных продуктов, включая бутиральдегид, бутирил-КоА, кротонил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА, ацетоацетил-КоА, ацетил-КоА, пируват, фосфоенолпируват, 2-фосфоглицерат, 1,3-дифосфоглицерат, глицеральдегид-3-фосфат, дигидроксиацетонфосфат, фруктоза-1,6-дифосфат, фруктоза-6-фосфат, глюкоза-6-фосфат, глюкозу и глюкоза-1-фосфат. Таким образом, дополнительный вариант осуществления включает дополнительный этап сбора промежуточных продуктов, которые можно получить также из индуцированного трансгенного сконструированного организма. Продуцирование промежуточного продукта можно избирательно усилить путем выключения активности сконструированного фермента, которая катализирует его потребление в сконструированном пути. Продуцирование указанного промежуточного продукта можно увеличить также путем применения сконструированного организма с одним или несколькими сконструированными ферментами, которые опущены из сконструированных путей продуцирования бутанола. Например, сконструированный организм с бутанолдегидроге-назой или бутиральдегиддегидрогеназой, опущенной из сконструированного пути(пути) фиг. 1, может применяться для продуцирования бутиральдегида или бутирил-КоА, соответственно.
Несмотря на то, что данное изобретение проиллюстрировано описанием нескольких вариантов осуществления и, несмотря на то, что иллюстративные варианты осуществления описаны относительно детально, намерением заявителя не является сужение или ограничение каким-либо образом объема прилагаемой формулы изобретения до таких деталей. Дополнительные преимущества и модификации будут полностью понятны специалистам данной области техники.
Данное изобретение в его широчайших аспектах, поэтому не ограничивается до специфических деталей, образцового аппарата и способов, и показанных и описанных иллюстративных примеров. Таким образом, можно сделать отступления от таких деталей без отступления от замысла или объема основной идеи заявителя данного изобретения.
Перечень последовательностей Последовательность № 1
Пример 1: сконструированный ДНК-конструкт бутанолдегидрогеиазы
(1809 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC tatatggtag ggtgcgagtg accccgcgcg acttggagct 60
cgatggcccc gggttgcttg gggcgtccgc ctctcgcgct attctgagct ggagaccgag 120
gcgcatgaaa atgcattcgc ttccatagga cgctgcattg tggcttgaag gttcaaggga 180
agggttcaaa cgaccccgcc gtacgaactt ttgtcggggg gcgctcccgg ccccgggctc 240
ttgtgcgcgc attagggctt cgggtcgcaa gcaagacgat acATGGCCGC CGTCATTGCC 300
AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT CCAGCGTGCG CCCCATGGCC 360
GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC CGGCTCAGGC CAACCAGatg 420
gagaatttta gatttaatgc atatacagag atgctttttg gaaagggaca aatagagaag 480
cttccagagg ttttaaaaag atatggtaaa aatatattac ttgcatatgg tggtggaagt 540
ataaaaaaga atggactcta tgatactatc caaaagctat tgaaagattt taatattgtt 600
gaattaagtg gtattgaacc aaatccaaga attgaaactg taagacgtgg agttgaactt 660
tgcagaaaaa ataaagtaga tgttatttta gctgttggtg gagggagtac aatagactgc 720
tcaaaggtta taggggcagg ttattattat gctggagatg catgggacct tgtaaaaaat 780
ccagctaaaa taggtgaggt tttaccaata gtgacagttt taacaatggc agctactggt 840
tctgaaatga atagaaatgc tgttatttca aagatggata caaatgaaaa gcttggaaca 900
ggatcaccta agatgabccc tcaaacttct attttagatc cagaatattt gtatacattg 960
ccagcaattc aaacagctgc aggttgtgct gatattatgt cacacatatt tgaacaatat 1020
tttaataaaa ctacagatgc ttttgtacaa gataaatttg cggaaggttt gttgcaaact 1080
tgtataaaat attgccctgt tgctttaaag gaaccaaaga attatgaagc tagagcaaat 1140
ataatgtggg ctagttcaat ggctcttaac ggacttttag gaagtgggaa agctggagct 1200
tggacttgtc atccaataga acatgaatta agtgcatttt atgatataac tcatggagta 1260
ggtcttgcaa ttttaactcc aagttggatg agatatatct taagtgatgt aacagttgat 1320
aagtttgtta acgtatggca tttagaacaa aaagaagata aatttgctct tgcaaatgaa 1380
gcaatagatg caacagaaaa attctttaaa gcttgtggta ttccaatgac tttaactgaa 1440
cttggaatag ataaagcaaa ctttgaaaag atggcaaaag ctgcagtaga acatggtgct 1500
ttagaatatg catatgtttc attaaatgcc gaggatgtat ataaaatttt agaaatgtcc 1560
ctttaaTAAA TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC CCTGACGAAC GGCGGTGGAT 1620
GGAAGATACT GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT CCCCGTTTCG TGCTGATCAG 16 80
TCTTTTTCAA CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT TGTTGGTTGT AACGATCCTC 174 0
CGTTGATTTT GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT ATTTGAAGCg gttctctctt 1800
ctgccgtta 1809
Последовательность № 2
Пример 2: сконструированный ДНК-конструкт бутиральдегиддегидрогеназы (2067 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC tatatggtag ggtgcgagtg accccgcgcg acttggagct 60
cgatggcccc gggttgtttg gggcgtccgc ctctcgcgct attctgagct ggagaccgag 120
gcgcatgaaa atgcattcgc ttccatagga cgctgcattg tggcttgaag gttcaaggga 180
agggttcaaa cgaccccgcc gtacgaactt ttgtcggggg gcgctcccgg ccccgggctc 240
ttgtgcgcgc attagggctt cgggtcgcaa gcaagacgat acATGGCCGC CGTCATTGCC 300
AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT CCAGCGTGCG CCCCATGGCC 360
GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC CGGCTCAGGC CAACCAGatg 420
attaaagaca cgctagtttc tataacaaaa gatttaaaat taaaaacaaa tgttgaaaat 480
gccaatctaa agaaczacaa ggatgattct tcatgtttcg gagttttcga aaatgttgaa 540
aatgctataa gcaatgccgt acacgcacaa aagatattat cccttcatta tacaaaagaa 600
caaagagaaa aaatcataac tgagataaga aaggccgcat tagaaaataa agagattcta 660
gctacaatga ttcttgaaga aacacatatg ggaagatatg aagataaaat attaaagcat 720
gaattagtag ctaaatacac tcctgggaca gaagatttaa ctactactgc ttggtcagga 780
gataacgggc ttacagttgt agaaatgtct ccatatggcg ttataggtgc aataactcct 840
tctacgaatc caactgaaac tgtaatatgt aatagtatag gcatgatagc tgctggaaat 900
actgtggtat. ttaacggaca tccaggcgct aaaaaatgtg ttgcttttgc tgtcgaaatg 960
ataaataaag ctattatttc atgtggtggt cctgagaatt tagtaacaac tataaaaaat 1020
ccaactatgg actctctaga tgcaattatt aagcaccctt caataaaact actttgcgga 1080
actggagggc caggaatggt aaaaaccctc ttaaattctg gtaagaaagc tataggtgct 1140
ggtgctggaa atccaccagt tattgtagat gatactgctg atatagaaaa ggctggtaag 1200
agtatcattg aaggctgttc ttttgataat aatttacctt gtattgcaga aaaagaagta 1260
tttgtttttg agaacgttgc agatgattta atatctaaca tgctaaaaaa taatgctgta 1320
attataaatg aagatcaagt atcaaagtta atagatttag tattacaaaa aaataatgaa 1380
actcaagaat actcte.taaa taagaaatgg gtcggaaaag atgcaaaatt attcttagat 1440
gaaatagatg ttgagtctcc ttcaagtgtt aaatgcataa tctgcgaagt aagtgcaagg 1500
catccatttg ttatge.caga actcatgatg ccaatattac caattgtaag agttaaagat 1560
atagatgaag ctattcaata tgcaaaaata gcagaacaaa atagaaaaca tagtgcctat 1620
atttattcaa aaaata.taga caacctaaat aggtttgaaa gagaaatcga tactactatc 1680
tttgtaaaga atgcte.aatc ttttgccggt gttggttatg aagcagaagg ctttacaact 1740
ttcactattg ctggat.ccac tggtgaagga ataacttctg caagaaattt tacaagacaa 1800
agaagatgtg tactcgccgg ttaaTAAATG GAGGCGCTCG TTGATCTGAG CCTTGCCCCC 1860
TGACGAACGG CGGTGGATGG AAGATACTGC TCTCAAGTGC TGAAGCGGTA GCTTAGCTCC 1920
CCGTTTCGTG CTGATCAGTC TTTTTCAACA CGTAAAAAGC GGAGGAGTTT TGCAATTTTG 1980
TTGGTTGTAA CGATCCTCCG TTGATTTTGG CCTCTTTCTC CATGGGCGGG CTGGGCGTAT 204 0
TTGAAGCggt tctctcttct gccgtta 2067
Последовательность № 3
Пример 3: сконструированный ДНК-конструкт бутирил-КоА-дегидрогеназы (1815 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 60
CGATGGCCCC GGGTTG TTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 120
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 180
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 240
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACctcgagca tATGGCCGCC 30 0
GTCATTGCCA AGTCCTCCGT CTCCGCGGCC GTGGCTCGCC CGGCCCGCTC CAGCGTGCGC 3 60
CCCATGGCCG CGCTGAAGCC CGCCGTCAAG GCTGCCCCCG TGGCTGCCCC GGCTCAGGCC 42 0
AACCAGatga atttccaatt aactagagaa caacaattag tacaacaaat ggttagagaa 480
ttcgcagtaa atgaagttaa gccaatagct gctgaaatcg acgaaacaga aagattccct 540
atggaaaacg ttgaas.aaat ggctaagctt aaaatgatgg gtatcccatt ttctaaagaa SOO
tttggtggag caggccgaga tgttctttca tatataatag ctgtggaaga attatcaaaa 660
gtttgtggta ctacacgagt tattctttca gcgcatacat cattatgtgc atcagtaatt 720
aatgaaaatg gaacte.acga acaaagagca aaatatttac ctgatctttg cagcggtaaa 780
aagatcggtg ctttcggatt aactgaacca ggtgctggta cagatgctgc aggacaacaa 840
acaactgctg tattagaagg ggatcattat gtattaaatg gttcaaaaat cttcataaca 900
aatggtggag ttgctgaaac tttcataata tttgctatga cagataagag tcaaggaaca 960
aaaggaattt ctgcattcat agtagaaaag tcattcccag gattctcaat aggaaaatta 1020
gaaaataaga tggggatcag agcatcttca actactgagt tagttatgga aaactgcata 1080
gtaccaaaag aaaacctact tagcaaagaa ggtaagggat ttggtatagc aatgaaaact 1140
cttgatggag gaagaattgg tatagctgct caagctttag gtattgcaga aggagctttt 1200
gaagaagctg ttaactatat gaaagaaaga aaacaatttg gtaaaccatt atcagcattc 1260
caaggattac aatggtatat agctgaaatg gatgttaaaa tccaagctgc taaatactta 1320
gtatacctag ctgcaacaaa gaagcaagct ggtgagcctt actcagtaga tgctgcaaga 1380
gctaaattat: ttgctgcaga tgttgcaatg gaagttacaa ctaaagcagt tcaaatcttt 1440
ggtggatatg gttacactaa agaataccca gtagaaagaa tgatgagaga tgctaaaata 1500
tgcgaaatct acgaaggaac ttcagaagtt caaaagatgg ttatcgcagg aagcatttta 1560
agaTAATCTA GAtaaatgga ggcgctcgtt gatctgagcc ttgccccctg acgaacggcg 1620
gtggatggaa gatactgctc tcaagtgctg aagcggtagc ttagctcccc gtttcgtgct 1680
gatcagtctt tttcaacacg taaaaagcgg aggagttttg caattttgtt ggttgtaacg 1740
atcctccgtt gattttggcc tctttctcca tgggcgggct gggcgtattt gaagcGGTTC 1800
TCTCTTCTGC CGTTA 1815
Последовательность № 4
Пример 4: сконструированный ДНК-конструкт кротоназы (1482 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 60
CGATGGCCCC GGGTTGTTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 120
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 180
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 240
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACctcgagca tATGGCCGCC 3 00
GTCATTGCCA AGTCCTCCGT CTCCGCGGCC GTGGCTCGCC CGGCCCGCTC CAGCGTGCGC 36 0
CCCATGGCCG CGCTGAAGCC CGCCGTCAAG GCTGCCCCCG TGGCTGCCCC GGCTCAGGCC 420
AACCAGatgg aattaaaaaa tgttattctt gaaaaagaag ggcatttagc tattgttaca 480
atcaatagac caaaggcatt aaatgcattg aattcagaaa cactaaaaga tttaaatgtt 540
gttttagatg atttagaagc agacaacaat gtgtatgcag ttatagttac tggtgctggt 600
gagaaatctt ttgttgctgg agcagatatt tcagaaatga aagatcttaa tgaagaacaa 660
ggtaaagaat ttggta~ttt aggaaataat gtcttcagaa gattagaaaa attggataag 720
ccagttatcg cagctatatc aggatttgct cttggtggtg gatgtgaact tgctatgtca 780
tgtgacataa gaatagcttc agttaaagct aaatttggtc aaccagaagc aggacttgga 84 0
ataactccag gatttggtgg aactcaaaga ttagcaagaa tagttggacc aggaaaagct 900
aaagaattaa tttatacttg tgaccttata aatgcagaag aagcttatag aataggctta 960
gttaataaag tagttgaatt agaaaaattg atggaagaag caaaagcaat ggctaacaag 1020
attgcagcta atgctccaaa agcagttgca tattgtaaag atgctataga cagaggaatg 1080
caagttgata tagatg^agc tatattaata gaagcagaag actttgggaa gtgctttgca 1140
acagaagatc aaacagaagg aatgactgcg ttcttagaaa gaagagcaga aaagaatttt 1200
caaaataaaG GCTGCT3CCC CGGCTGCTGC taatctagaT AAATGGAGGC GCTCGTTGAT 1260
CTGAGCCTTG CCCCCT3ACG AACGGCGGTG GATGGAAGAT ACTGCTCTCA AGTGCTGAAG 1320
CGGTAGCTTA GCTCCCCGTT TCGTGCTGAT CAGTCTTTTT CAACACGTAA AAAGCGGAGG 1380
AGTTTTGCAA TTTTGTTGGT TGTAACGATC CTCCGTTGAT TTTGGCCTCT TTCTCCATGG 144 0
GCGGGCTGGG CGTATTTGAA GCggttctct cttctgccgt ta 14 82
Последовательность № 5
Пример 5: сконструированный ДНК-конструкт 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (1367 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 6 0
CAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGCtcgag catATGGCCG 120
CCGTCATTGC CAAGTCCTCC GTCTCCGCGG CCGTGGCTCG CCCGGCCCGC TCCAGCGTGC 180
GCCCCATGGC CGCGCTGAAG CCCGCCGTCA AGGCTGCCCC CGTGGCTGCC CCGGCTCAGG 240
CCAACCAGat gaaaaagatt tttgtacttg gagcaggaac tatgggtgct ggtatcgttc 300
aagcattcgc tcaaaa.aggt tgtgaggtaa ttgtaagaga cataaaggaa gaatttgttg 360
acagaggaat agctgcaatc actaaaggat tagaaaagca agttgctaaa ggaaaaatgt 420
ctgaagaaga taaags.agct atactttcaa gaatttcagg aacaactgat atgaagttag 480
ctgctgactg tgattt.agta gttgaagctg caatcgaaaa catgaaaatt aagaaggaaa 540
tctttgctga gttags.tgga atttgtaagc cagaagcgat tttagcttca aacacttcat 600
ctttatcaat tactgsiagtt gcttcagcta caaagagacc tgataaagtt atcggaatgc 660
atttctttaa tccagctcca gtaatgaagc ttgttgaaat tattaaagga atagctactt 720
ctcaagaaac ttttgatgct gttaaggaat tatcagttgc tattggaaaa gaaccagtag 780
aagttgcaga agctccagga ttcgttgtaa acggaatctt aatcccaatg attaacgaag 840
cttcattcat ccttcaiagaa ggaatagctt cagttgaaga tattgataca gctatgaaat 900
atggtgctaa ccatccaatg ggacctttag ctttaggaga tcttattgga ttagatgttt 960
gcttagctat. catggatgtt ttattcactg aaacaggtga taacaagtac agagctagca 1020
gcatattaag aaaatatgtt agagctggat ggcttggaag aaaatcagga aaaggattct 1080
atgattattc taaaGGCTGC TGCCCCGGCT GCTGCtaatc tagaTAAATG GAGGCGCTCG 1140
TTGATCTGAG CCTTGCCCCC TGACGAACGG CGGTGGATGG AAGATACTGC TCTCAAGTGC 1200
TGAAGCGGTA GCTTAGCTCC CCGTTTCGTG CTGATCAGTC TTTTTCAACA CGTAAAAAGC 1260
GGAGGAGTTT TGCAATTTTG TTGGTTGTAA CGATCCTCCG TTGATTTTGG CCTCTTTCTC 1320
CATGGGCGGG CTGGGCGTAT TTGAAGCggt tctctcttct gccgtta 1367
Последовательность № 6
Пример 6: сконструированный ДНК-конструкт тиолазы (1721 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 6 0
CAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGCtcgag catATGGCCG 120
CCGTCATTGC CAAGTCCTCC GTCTCCGCGG CCGTGGCTCG CCCGGCCCGC TCCAGCGTGC 18 0
GCCCCATGGC CGCGCTGAAG CCCGCCGTCA AGGCTGCCCC CGTGGCTGCC CCGGCTCAGG 240
CCAACCAGat gggcaaagaa agtagtttta gctgtgcatg tcgtacagcc atcggaacaa 300
tgggtggatc tcttagcaca attcctgcag tagatttagg tgctatcgtt atcaaagagg 360
ctcttaaccg cgcaggtgtt aaacctgaag atgttgatca cgtatacatg ggatgcgtta 420
ttcaggcagg acagggacag aacgttgctc gtcaggcttc tatcaaggct ggtcttcctg 480
tagaagtacc tgcagttaca actaacgttg tatgtggttc aggtcttaac tgtgttaacc 540
aggcagctca gatgatcatg gctggagatg ctgatatcgt tgttgccggt ggtatggaaa 600
acatgtcact tgcaccattt gcacttccta atggccgtta cggatatcgt atgatgtggc 660
caagccagag ccagggtggt cttgtagaca ctatggttaa ggatgctctt tgggatgctt 720
tcaatgatta tcatatgatc cagacagcag acaacatctg cacagagtgg ggtcttacac 780
gtgaagagct cgatgagttt gcagctaaga gccagaacaa ggcttgtgca gcaatcgaag 840
ctggcgcatt caaggatgag atcgttcctg tagagatcaa gaagaagaaa gagacagtta 900
tcttcgatac agatgaaggc ccaagacagg gtgttacacc tgaatctctt tcaaagcttc 960
gtcctatcaa caaggatgga ttcgttacag ctggtaacgc ttcaggtatc aacgacggtg 1020
ctgcagcact cgtagttatg tctgaagaga aggctaagga gctcggcgtt aagcctatgg 1080
ctacattcgt agctggagca cttgctggtg ttcgtcctga agttatgggt atcggtcctg 1140
tagcagctac tcagaaggct atgaagaagg ctggtatcga gaacgtatct gagttcgata 1200
tcatcgaggc taacgaagca ttcgcagctc agtctgtagc agttggtaag gatcttggaa 1260
tcgacgtcca caagcagctc aatcctaacg gtggtgctat cgctcttgga cacccagttg 1320
gagcttcagg tgctcgtatc cttgttacac ttcttcacga gatgcagaag aaagacgcta 1380
agaagggtct tgctacactt tgcatcggtg gcggtatggg atgcgctact atcgttgaga 1440
agtacgaaGG CTGCTGCCCC GGCTGCTGCt aatctagaTA AATGGAGGCG CTCGTTGATC 150 0
TGAGCCTTGC CCCCTGACGA ACGGCGGTGG ATGGAAGATA CTGCTCTCAA GTGCTGAAGC 1560
GGTAGCTTAG CTCCCCGTTT CGTGCTGATC AGTCTTTTTC AACACGTAAA AAGCGGAGGA 1620
GTTTTGCAAT TTTGTTGGTT GTAACGATCC TCCGTTGATT TTGGCCTCTT TCTCCATGGG 16 80
CGGGCTGGGC GTATTTGAAG Cggttctctc ttctgccgtt a 1721
Последовательность № 7
Пример 7: сконструированный ДНК-конструкт пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы (4211 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 60
CAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGATGGTA GGGTGCGAGT 120
GACCCCGCGC GACTTGGAAG GGTTCAAACG ACCCCGCCGT ACGAACTTTT GTCGGGGGGC 180
GCTCCCGGct cgagcatATG GCCGCCGTCA TTGCCAAGTC CTCCGTCTCC GCGGCCGTGG 240
CTCGCCCGGC CCGCTCCAGC GTGCGCCCCA TGGCCGCGCT GAAGCCCGCC GTCAAGGCTG 3 00
CCCCCGTGGC TGCCCCGGCT CAGGCCAACC AGatggcgca gaggtgcaag gagcccgtcg 360
acggaacgac agccacgacg cacgtggcct acttcatgag cgacagcgcg ttcatcttcc 420
ccatcacgcc cagctcggtc atgtccgagg tcgcccacga gtggtccatg aacggccgca 480
agaacgcctt cggcca.gccc acgatggtcc gccagatgca gagcgaggct gggtctgccg 540
gcgccctgca cggcgcgctc agcgagggag cgctggcgac gacgttcacg agcagccagg 600
gcctgctgct catgat.cccc aacatgtaca agatcgccgg cgagctcctg ccctgcgtca 660
tgcacatcgc cgcccccacc gtcgccaccg aggccctctc tatcttcggc gaccacacgg 720
atgtctacgc ggtgaggtcg acggggttcg cgttcctgtg ctccgcgacc gtccaggagt 780
gcatccacat gtccgccgcc gcgcacgccg ccaccctgtc cagcgaggtc ccgttcgccc 840
acttcttcga cggcttccgc acgtcccacg agatccagaa gatcgacttc ccctcggacg 900
ccgacctgct ggcctgcatg aactttgacg acgtccgcag gttccgtggc cgctcgctgt 960
gctgcgagcg cccgctgctg cgcgggacgg cgcagaaccc cgacgtcttc atgcaggcgt 1020
ccgagtcgaa cctggcgacg ctggccaggg tccccgcggc catcgacgag gcgctggctc 1080
gtgtgaacaa ggtgttcggg accaactaca ggacctacga gtactatggc caccccgagg 1140
ccacggacgt gatcgtggcc atgggaagcg gcaccgaagt ggccatctcg actgccaact 1200
tcctcaactc gcgcgacgcg aactcgaggg tcggcgtcgt gagggtgcgg ctgttccggc 1260
cgtttgtgtc ggcggcgttt gtggctgcgc tgcccaagac cgtcaagagg atctgcgttc 1320
tggaccgcgg gagggacggg caggcggccg cggaccccct gcaccaggac gtcctgtcgg 1380
cgctgggtct ggcagcgccc gggagggttc aggtgtgcgt gggaggcgtg tacggtctgt 1440
cgtccaagga cttcaacccc gaccacgtga tcgccgtgta caggaacctc gcgtcggcga 1500
gccccaagaa caggttcagc gtcggcatcg tcgacgacgt gacgcacaac agcctggaca 1560
tgggagagca cgtggacgcg ctgccgcagg ggacgaagca gtgcctgctg tggggcatcg 1620
gcggagacgg gaccatcggg gcgaacaaga cggccatcaa gctgatcgcg gaccacacgg 1680
agctgcacgc gcaggggtac tttgcgtacg acgccaacaa ggccggcggc ctgacagtct 1740
cgcacctgcg gttcggcccg acgcggttcg aggcgccgta cctggtgaac gacagcaact 1800
acgtggcgtg ccacaacttc tcgtacgtgc acaggttcaa cctgctgtcg tcgctgcgca 1860
ccgggggcac gttcgtgctc aactgcccgt gccggaccgt ggaggagctg gacacggcac 1920
tcccggtgcg cctgaggcgc gagatcgcca ggcggcaggc caagttctat gtgatcgacg 1980
cgaccaagat cgccaaggac aacgggatgg gcccgttcat caacatggtc ctccaggccg 2040
tgttcttcta tctgtcccac gtgctcgatg tgaacgaggc agtggcactc ctgaagaaga 2100
gcatccagaa gatgtacgcg cgcaagggcg aggaggttgt caggaagaac gtggcatcgg 216 0
tcgacgcgtc gctggatccc aaggcgttgc tgcacatcga gtaccccgca gacaggtggc 2220
ttgcgctggc cgacgagcac gtgccccgca tgggtctgct cactgtcccc gagcgcctgc 2280
agaagttcaa cgccgagctg tacgagccga ccctcgcgta cgatggggag agcatcccgg 2340
tcagcaggtt ccctcgcggc ggcgagacgc cgacgggcac gactcagctg ggcaagcgtg 2400
gcatcgccga gagcgtgccg cactggaacc acgagaagtg cgtgcagtgc aaccagtgct 2460
cgttcgtgtg cccgcacgcc gtcatccggt cgtaccagat cagcgaggag gagatgaaga 2520
acgcccctgc cggcttcgac actcttaagt cgcgcaagcc cgggtatcgt ttccgcatca 2580
acgtcagcgc cctggactgc actggctgca gcgtgtgcgt ggagcagtgc ccagtcaagt 2640
gcctggagat gaagcctctc gagtccgagt tcgagatgca gaaggacgcc atcaggttcg 2700
tccgcgagat ggtcgcgccc aagcccgagc tgggagaccg caagactccc gtcggcatcg 2760
cgtctcacac gccgctgttc gagttcccgg gagcctgcgc cgggtgcggt gagaccccgc 2820
tggtgcgcct cgtgacgcag atgttcggtg agcgcatggt catcgccgcg gccactgggt 2880
gcaactcgat ctggggagcg tcgttcccga acgtgccgta cacaaccaac gcccgcgggg 2940
agggccccgc gtggcacaac tcgctgttcg aggacgcggc ggagctcggg tatggcatta 3000
cgtgtgcgta tcgccagcgc cgcgagcgcc tcatcggcat cgtgcggagc gtcgtcgacg 3060
atgcgggatc cgtgcagggt ctgtctgctg agctgaaggc tctgctggtc gagtggctcg 3120
cgcacgtcag ggacttcgag aagacccgcg agctccgcga caggatgaac cccctgatcg 3180
acgcaatccc agcgaacgcg gactgcaggg ttctggagct cagggagaag cacaaccgcg 3240
agctgatcgc gcgcacgagt ttctggatcc tcggtggcga cgggtgggcg tacgacatcg 3300
gcttcggtgg actggaccac gtgatcgcca acaacgagga cgtcaacatc cttgttctcg 3360
acacggaggt ctactccaac actggtggcc agcgctccaa gtcgacgccg ctcggcgccc 3420
gcgccaagta cgctgtgctg ggcaaggaca ctgggaagaa ggacctgggg cgcatcgcga 3480
tgacctacga gaccgcgtac gtggccagca tcgcgcaggg agccaaccag cagcagtgca 3540
tggacgcgct gagggaggcc gaggcctacc agggcccctc gatcgtcatt gcgtacactc 3600
cgtgcatgga gcaccagatg gtccgcggga tgaaggagag ccagaagaac cagaagctgg 3660
ctgtggagac gggctactgg ctgctgtacc gcttcaaccc cgacctcatc cacgagggca 3720
agaacccctt caccctcgac tcgaagcctc cctcgaagcc tcccaaggag ttcctggaca 3780
cgcagggccg tttcattact ctgcagcgcg agcaccccga gcaggcccac ctccttcacg 3840
aggcactcac ccgctctctg gccacccgct tcgtgcgcta ccagcgcctc gtgcagctgt 3900
acgagcccgc tgcccctgcc gcagctcctg ccacgcatGG CTGCTGCCCC GGCTGCTGCt 3 960
aatctagaTA AATGGAGGCG CTCGTTGATC TGAGCCTTGC CCCCTGACGA ACGGCGGTGG 4020
ATGGAAGATA CTGCTCTCAA GTGCTGAAGC GGTAGCTTAG CTCCCCGTTT CGTGCTGATC 4080
AGTCTTTTTC AACACGTAAA AAGCGGAGGA GTTTTGCAAT TTTGTTGGTT GTAACGATCC 414 0
TCCGTTGATT TTGGCCTCTT TCTCCATGGG CGGGCTGGGC GTATTTGAAG Cggttctctc 4200
ttctgccgtt a 4211
Последовательность № 8
Пример 8: сконструированный ДНК-конструкт пируваткиназы (2021 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 60
CAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGCtcgag catATGGCCG 120
CCGTCATTGC CAAGTCCTCC GTCTCCGCGG CCGTGGCTCG CCCGGCCCGC TCCAGCGTGC 18 0
GCCCCATGGC CGCGCTGAAG CCCGCCGTCA AGGCTGCCCC CGTGGCTGCC CCGGCTCAGG 240
CCAACCAGat gtctacatta gaaagattga cctcattaaa cgttgttgct ggttctgact 300
tgagaagaac ctccat.catt ggtaccatcg gtccaaagac caacaaccca gaaaccttgg 360
ttgctttgag aaaggctggt ttgaacattg tccgtatgaa cttctctcac ggttcttacg 420
aataccacaa gtctgtcatt gacaacgcca gaaagtccga agaattgtac ccaggtagac 480
cattggccat tgctttggac accaagggtc cagaaatcag aactggtacc accaccaacg 540
atgttgacta cccaatccca ccaaaccacg aaatgatctt caccaccgat gacaagtacg 600
ctaaggcttg tgacgacaag atcatgtacg ttgactacaa gaacatcacc aaggtcatct 660
ccgctggtag aatcatctac gttgatgatg gtgttttgtc tttccaagtt ttggaagtcg 720
ttgacgacaa gactttgaag gtcaaggctt tgaacgccgg taagatctgt tcccacaagg 780
gtgtcaactt accaggtacc gatgtcgatt tgccagcttt gtctgaaaag gacaaggaag 840
atttgagatt cggtgtcaag aacggtgtcc acatggtctt cgcttctttc atcagaaccg 900
ccaacgatgt tttgaccatc agagaagtct tgggtgaaca aggtaaggac gtcaagatca 960
ttgtcaagat tgaaaaccaa caaggtgtta acaacttcga cgaaatcttg aaggtcactg 1020
acggtgttat ggttgocaga ggtgacttgg gtattgaaat cccagcccca gaagtcttgg 1080
ctgtccaaaa gaaattgatt gctaagtcta acttggctgg taagccagtt atctgtgcta 1140
cccaaatgtt ggaatccatg acttacaacc caagaccaac cagagctgaa gtttccgatg 1200
tcggtaacgc tatcttggat ggtgctgact gtgttatgtt gtctggtgaa accgccaagg 1260
gtaactaccc aatcaacgcc gttaccacta tggctgaaac cgctgtcatt gctgaacaag 1320
ctatcgctta cttgccaaac tacgatgaca tgagaaactg tactccaaag ccaacctcca 1380
ccaccgaaac cgtcgctgcc tccgctgtcg ctgctgtttt cgaacaaaag gccaaggcta 1440
tcattgtctt gtccacttcc ggtaccaccc caagattggt ttccaagtac agaccaaact 1500
gtccaatcat cttggttacc agatgcccaa gagctgctag attctctcac ttgtacagag 1560
gtgtcttccc attcgttttc gaaaaggaac ctgtctctga ctggactgat gatgttgaag 1620
cccgtatcaa cttcggtatt gaaaaggcta aggaattcgg tatcttgaag aagggtgaca 1680
cttacgtttc catccaaggt ttcaaggccg gtgctggtca ctccaacact ttgcaagtct 1740
ctaccgttGG CTGCTGCCCC GGCTGCTGCt aatctagaTA AATGGAGGCG CTCGTTGATC 1800
TGAGCCTTGC CCCCTGACGA ACGGCGGTGG ATGGAAGATA CTGCTCTCAA GTGCTGAAGC 1860
GGTAGCTTAG CTCCCCGTTT CGTGCTGATC AGTCTTTTTC AACACGTAAA AAGCGGAGGA 192 0
GTTTTGCAAT TTTGTTGGTT GTAACGATCC TCCGTTGATT TTGGCCTCTT TCTCCATGGG 198 0
CGGGCTGGGC GTATTTGAAG Cggttctctc ttctgccgtt a 2021
Последовательность № 9
Пример 9: сконструированный ДНК-конструкт энолазы (1815 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 6 0
CGATGGCCCC GGGTTGTTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 120
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 180
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 240
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACctcgagca tATGGCCGCC 300
GTCATTGCCA AGTCCTCCGT CTCCGCGGCC GTGGCTCGCC CGGCCCGCTC CAGCGTGCGC 36 0
CCCATGGCCG CGCTGAAGCC CGCCGTCAAG GCTGCCCCCG TGGCTGCCCC GGCTCAGGCC 420
AACCAGgtga ccaaggctgt tgagaacatc aacgctatta ttgcccccgc cctgaagggc 480
atggaccccg tcaagcaggc ggagattgac cagaagatga aggacctgga cggcactgac 540
aacaagggca agctgggtgc caacgccatc ctggccgtct ccatggccgt gtgcaaggcc 600
ggtgccgctg agaagggcgt gcccctgtac aagcacattg cggacctggc cggcaacagc 660
aagctgatcc tgcccgtgcc ctcgttcaac atcatcaacg gcggcagcca cgccggcaac 720
gccctggcta tgcaggagtt catgatcctg cccgttggcg cctcgagctt ctctgaggcc 780
atgcgcatgg gctgcgaggt gtaccacgcc ctgaagggcc tgatcaaggc caagtacggc 840
caggacgcct gcaacgtggg tgatgagggt ggcttcgccc ccaacatcgg ctccaacgat 900
gagggcctga acttggtgaa cgaggccatc gagaaggccg gctacaccgg caaggtgaag 960
atcggcatgg acgtggcctc gtcggagttc tacaccgagg acggcatgta cgacctggac 1020
ttcaagaacc agcccaacga tggctcgcag aagaagacca aggagcagat gctggagctg 1080
tacaacgagt tctgcaagaa gtacccggtc atctccatcg aggacccctt cgagcaggac 1140
gactgggagc cctgcgccaa gctgaccacc gagaacatct gccaggtggt cggcgacgac 1200
atcctggtga ccaaccccgt gcgcgtgaag aaggccatcg acgccaaggc cgtcaacgct 1260
ctgctgctca aggtcaacca gatcggtacc attaccgagt ccattgaggc cgtgcgcatg 1320
gccaaggagg ccggctgggg tgtcatgacc agccaccgct cgggtgagac tgaggactct 1380
ttcatcgccg acctggcggt gggcctggcc tccggccaga tcaagaccgg cgccccctgc 1440
cgctcggagc gcaatgccaa gtacaaccag ctgctgcgca tcgaggagga gctgggcgag 1500
aacgctgtgt acgctggcga gagctggcgc cacatcggct ggGGCTGCTG CCCCGGCTGC 1560
TGCtaatCta gaTAAATGGA GGCGCTCGTT GATCTGAGCC TTGCCCCCTG ACGAACGGCG 1620
GTGGATGGAA GATACTGCTC TCAAGTGCTG AAGCGGTAGC TTAGCTCCCC GTTTCGTGCT 16 80
GATCAGTCTT TTTCAACACG TAAAAAGCGG AGGAGTTTTG CAATTTTGTT GGTTGTAACG 1740
ATCCTCCGTT GATTTTGGCC TCTTTCTCCA TGGGCGGGCT GGGCGTATTT GAAGCggttC 1800
tctcttctgc cgtta 1815
Последовательность № 10
Пример 10: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы
(2349 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 6 0
CGATGGCCCC GGGTTGTTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 12 0
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 18 0
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 24 0
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACctcgagca tATGGCCGCC 300
GTCATTGCCA AGTCCTCCGT CTCCGCGGCC GTGGCTCGCC CGGCCCGCTC CAGCGTGCGC 3 60
CCCATGGCCG CGCTGAAGCC CGCCGTCAAG GCTGCCCCCG TGGCTGCCCC GGCTCAGGCC 420
AACCAGatgg cgcacgacta caagctgaag gcccacccgg cgattcctgc gcccgagggc 480
ccgctgctgg tctgcattct ggacggcttc ggcgagaacg agtacaagga tgagttcaac 540
gccgtgcacg tggctaagac gcccactgtg gacgcgctgc gcgctgtgcc ccatcgcttc 600
cgttccatca aggcgcacgg aaaggctgtg ggcctgccca gcgatgccga catgggcaac 660
agcgaggtgg ggcacaacgc cctgggctcg ggccaggtgg tggaccaagg cgcgcgcctg 720
gtggacctgg cgctggagac cggccgtatg ttctcggacc ccggctggaa gctcatcagc 780
gaggccttcc cctcccacac cgtccacttc atcggcctgc tgtccgacgg cggcgtgcac 840
tcgcgcgccg atcagctgca cggctgcctg cgcggcgccg tggagcgcgg cgccaagcgc 900
gtgcgcgtgc acatcctgac tgacggccgc gacgtgccgg acggcagcag catccggttc 960
gtggaggagc tggaggcggt gctggcggag ctgcgcggca agggctgcga catcgccatc 1020
gcctcgggcg gcggccgcat gcaggtcacc atggaccgct acgaggcgga ctggagcatg 1080
gtgaagcgcg gctgggacgc gcacgtgctg ggcaaggcgc cccactactt caaggacgcc 1140
aagaccgcgg tcaccaccct gcgcggctcc gaggacgcgc cggtgtctga ccagtacgtg 1200
gccccctttg tgattgtgga cgaggcggac aagccggtgg gcaccattga ggacggcgac 1260
gcggtggtgc tgttcaactt ccgcgcggac cgcatggtgg agatcagcaa ggccttcgag 1320
tacgaggacg gcttcaccgc ctttgagcgc gagcgcttcc ccaagggcct gcgcttcgtg 1380
ggcatgatgc agtacgacgg cgacctgaag ctgcccgcca acttcctggt gccgccgccc 1440
ctgattgagc acgtgtcggg cgagtacctg tgcaagaacg ggctgagcac cttcgcctgc 1500
tccgagactc agaagttcgg gcacgtgacg ttcttctgga acggcaaccg ctccggctac 1560
ctggacgcca agcaggagca gtacctggag atcccgtcgg acaagatcga gttcaacaag 1620
gctccggaca tgaaggcgcg cgagatcacc gccgccggca ttgaggcgct caagagcggc 1680
aagtacaagg tggtgcgcat caactacgcc aacccggaca tggtcggcca caccggcgac 1740
atggctgcca ccgtccgcgc ctgcgagacc gtggacgggt gcgtgaagga gctgctggag 1800
gtggtggaca gcctgaacgg ccgctggatc gtcacgtccg accacggcaa cgccgacgac 1860
atggtgcagc gcgacaagaa gggcaagccc ctgctgggcg aggacggcaa gccgctgccc 1920
ctgaccagcc acacgctggc gcccgtgccg ttcttcatcg gcggcaaggg cctgccggac 1980
ggcgtggtgc tgcgcgacga cctgccggac gccgggctgg ccaacgtggc cgccaccacc 2040
ttcaacctgc tgggcttcga ggcgcccggc atctacaagc ccagcatggt caaggcgTAA 2100
TCTAGAtaaa tggaggcgct cgttgatctg agccttgccc cctgacgaac ggcggtggat 2160
ggaagatact gctctcaagt gctgaagcgg tagcttagct ccccgtttcg tgctgatcag 2220
tctttttcaa cacgtaaaaa gcggaggagt tttgcaattt tgttggttgt aacgatcctc 2280
cgttgatttt ggcctctttc tccatgggcg ggctgggcgt atttgaagcG GTTCTCTCTT 2340
CTGCCGTTA 234 9
Последовательность № 11
Пример 11: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицераткиназы
(1908 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 60
CGATGGCCCC GGGTTGTTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 120
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 180
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 240
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACatggccct ctctatgaag 300
atgcgcgcca acgcgcgcgt gtccggtcgc cgcgtcgccg ctgtggcccc ccgcgtggtg 360
cccttctcgt cggcctccag ctccgtgctg cgctctggct tcgcgctgag gtgtctgtgg 420
acatccgccg cgtgggccgc tctcgcatcc gtcgtcgagg cggtgaagaa gtcggttggc 480
gacctgcaca aggctgacct ggagggcaag cgcgtgttcg tccgcgcgga cctgaacgtg 540
cctcttgaca aggccaccct ggccatcacc gacgacaccc gcattcgcgc ggccgtcccc 600
accctgaagt acctgctgga caacggtgct aaggtcctgc tgacctcgca cctgggtcgc 660
ccgaagggcg gtcccgagga caagtaccgc ctgacccccg tggtggcccg cctgtcggag 720
ctgctgggca agcccgtgac caaggtcgat gactgcatcg gccccgaggt ggagaaggcg 780
gtgggcgcca tgaagaacgg cgagctgctg ctgctggaga actgccgctt ctacaaggag 840
gaggagaaga acgagcccga gttcgccaag aagctggccg ccaacgccga cctgtacgtg 900
aacgacgcgt tcggcactgc ccaccgcgcc cacgcctcca ccgagggtgt gaccaagttc 960
ctgaagccct ccgtggccgg cttcctgctg cagaaggagc tggactacct tgatggcgcc 1020
gtgtccaacc ccaagcgccc cttcgtggcc attgtgggcg gctccaaggt gtcctccaag 1080
atcaccgtca ttgaggcgct gatggagaag tgcgacaaga tcatcatcgg cggtggcatg 1140
atcttcacct tctacaaggc ccgcgcgctg aaggtgggct cctcgctggt tgaggacgac 1200
aagatcgagc tggccaagaa gctggaggag atggccaagg ccaagggtgt gcagctgctg 1260
ctgcccaccg acgtggtggt ggccgacaag ttcgacgcca acgccaacac ccagaccgtg 1320
cccatcaccg ccatccccga tggctggatg ggtctggaca ttggcccgga ctccgtcaag 1380
accttcaacg acgccctggc cgacgccaag accgttgtgt ggaacggccc catgggtgtg 1440
ttcgagtttc cccaagttcg ccaacgcacc gtgtcgatcg ccaacaccct ggccggcctg 1500
acgcccaagg gctgcatcac catcattggt ggcggtgact ccgtggctgc cgtcgagcag 1560
gccggcgttg ccgagaagat gagccacatc tccaccggcg gcggtgcctc cctggagctg 1620
ctggagggca aggtcctgcc cggcgtggcc gccctggacg agaagTAAAT GGAGGCGCTC 1680
GTTGATCTGA GCCTTGCCCC CTGACGAACG GCGGTGGATG GAAGATACTG CTCTCAAGTG 174 0
CTGAAGCGGT AGCTTAGCTC CCCGTTTCGT GCTGATCAGT CTTTTTCAAC ACGTAAAAAG 180 0
CGGAGGAGTT TTGCAATTTT GTTGGTTGTA ACGATCCTCC GTTGATTTTG GCCTCTTTCT 1860
CCATGGGCGG GCTGGGCGTA TTTGAAGCgg ttctctcttc tgccgtta 1908
Последовательность № 12
Пример 12: сконструированный ДНК-конструкт НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1677 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC tatatggtag ggtgcgagtg accccgcgcg acttggagct 6 0
cgatggcccc gggttgtttg gggcgtccgc ctctcgcgct attctgagct ggagaccgag 120
gcgcatgaaa atgcattcgc ttccatagga cgctgcattg tggcttgaag gttcaaggga 180
agggttcaaa cgaccccgcc gtacgaactt ttgtcggggg gcgctcccgg ccccgggctc 240
ttgtgcgcgc attagggctt cgggtcgcaa gcaagacgat acATGGCCGC CGTCATTGCC 300
AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT CCAGCGTGCG CCCCATGGCC 36 0
GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC CGGCTCAGGC CAACCAGatg 420
gctcccatca agatcggcat caatggtttt ggtcgtattg gccgcctcgt gtggcgtgcc 480
actcttaacc gtgacgatgt cgaggtcgtc gccatcaatg atccattcat tgatgtgcca 540
tacatggtct acatggccaa gtatgactcg gtccacggca acctgaccca cgacgttcag 600
caaggcgacg gcaagctgat ggtcaatggc aagtcaatca ccatcttcgg caagatggat 660
gccaaggaga tcccatggaa ggaggccggc gcgaccttcg tcgttgagtc gactggtgtg 720
ttcaccaccc tggagggcgc cagctctcac ctggtcggcg gtgctgagac cgtcgtcatc 780
tccgccccat caaacgatgc ccccatgttc gtcatgggtg tcaacgagga gggctacaag 840
ccagacatga aagtggzgtc caacgcgtct tgcaccacca actgcctggg ccccctggcc 900
aaggtcatcc accttaagtt cggcatcctg gagggcctga tgaccaccgt ccacgcgacc 960
accgccaccc agaagaccgt cgacgggccg tccaagaagg actggcgcgg cgggcgcggc 1020
atcctggaca acatcatccc ctcggcgact ggtgccgcca aggccgtcgg caaggtgctg 1080
cctgccctga acggcaagct caccggcatg gccttccgcg tgcccacccc cgatgtctcg 1140
gtcgtcgatc tgaccgtgcg cctggagaag ggtgcgtcgt acgacgccat caaggccgag 1200
atcaagcgcg cgagcgagaa cgagctcaag ggcatcctgg cctacaccga ggatgccgtg 1260
gtctccaccg acttcatcgg caacaagcac agctccatct tcgacgccga ggccggcatc 1320
gccctcaacg acaactttgt caagctggtc tcctggtacg acaacgagtg gggctactcc 1380
aaccgtgtcg tcgacctgat cgcgcacatg gccaaggtca aggccgccag ccacTAAATG 1440
GAGGCGCTCG TTGATCTGAG CCTTGCCCCC TGACGAACGG CGGTGGATGG AAGATACTGC 15 00
TCTCAAGTGC TGAAGCGGTA GCTTAGCTCC CCGTTTCGTG CTGATCAGTC TTTTTCAACA 1560
CGTAAAAAGC GGAGGAGTTT TGCAATTTTG TTGGTTGTAA CGATCCTCCG TTGATTTTGG 162 0
CCTCTTTCTC CATGGGCGGG CTGGGCGTAT TTGAAGCggt tctctcttct gccgtta 1677
Последовательность № 13
Пример 13: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы, связанной с промотором HydAl (2351 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 60
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtca.aggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 360
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 420
CGGCTCAGGC CAACCAGatg gcgcacgact acaagctgaa ggcccacccg gcgattcctg 480
cgcccgaggg cccgctgctg gtctgcattc tggacggctt cggcgagaac gagtacaagg 540
atgagttcaa cgccgtgcac gtggctaaga cgcccactgt ggacgcgctg cgcgctgtgc 600
cccatcgctt ccgttccatc aaggcgcacg gaaaggctgt gggcctgccc agcgatgccg 660
acatgggcaa cagcgsiggtg gggcacaacg ccctgggctc gggccaggtg gtggaccaag 720
gcgcgcgcct ggtggctcctg gcgctggaga ccggccgtat gttctcggac cccggctgga 780
agctcatcag cgaggccttc ccctcccaca ccgtccactt catcggcctg ctgtccgacg 840
gcggcgtgca ctcgcgcgcc gatcagctgc acggctgcct gcgcggcgcc gtggagcgcg 900
gcgccaagcg cgtgcgcgtg cacatcctga ctgacggccg cgacgtgccg gacggcagca 960
gcatccggtt cgtggaggag ctggaggcgg tgctggcgga gctgcgcggc aagggctgcg 1020
acatcgccat cgcctcgggc ggcggccgca tgcaggtcac catggaccgc tacgaggcgg 1080
actggagcat ggtgaagcgc ggctgggacg cgcacgtgct gggcaaggcg ccccactact 1140
tcaaggacgc caagaccgcg gtcaccaccc tgcgcggctc cgaggacgcg ccggtgtctg 1200
accagtacgt ggcccccttt gtgattgtgg acgaggcgga caagccggtg ggcaccattg 1260
aggacggcga cgcgg~ggtg ctgttcaact tccgcgcgga ccgcatggtg gagatcagca 1320
aggccttcga gtacgaggac ggcttcaccg cctttgagcg cgagcgcttc cccaagggcc 1380
tgcgcttcgt gggca:gatg cagtacgacg gcgacctgaa gctgcccgcc aacttcctgg 1440
tgccgccgcc cctgactgag cacgtgtcgg gcgagtacct gtgcaagaac gggctgagca 1500
ccttcgcctg ctccgagact cagaagttcg ggcacgtgac gttcttctgg aacggcaacc 1560
gctccggcta cctggacgcc aagcaggagc agtacctgga gatcccgtcg gacaagatcg 1620
agttcaacaa ggctccggac atgaaggcgc gcgagatcac cgccgccggc attgaggcgc 1680
tcaagagcgg caagtacaag gtggtgcgca tcaactacgc caacccggac atggtcggcc 1740
acaccggcga catggctgcc accgtccgcg cctgcgagac cgtggacggg tgcgtgaagg 1800
agctgctgga ggtggtggac agcctgaacg gccgctggat cgtcacgtcc gaccacggca 1860
acgccgacga catggtgcag cgcgacaaga agggcaagcc cctgctgggc gaggacggca 1920
agccgctgcc cctgaccagc cacacgctgg cgcccgtgcc gttcttcatc ggcggcaagg 1980
gcctgccgga cggcgtggtg ctgcgcgacg acctgccgga cgccgggctg gccaacgtgg 2040
ccgccaccac cttcaacctg ctgggcttcg aggcgcccgg catctacaag cccagcatgg 2100
tcaaggcgTA AATGGAGGCG CTCGTTGATC TGAGCCTTGC CCCCTGACGA ACGGCGGTGG 2160
ATGGAAGATA CTGCTCTCAA GTGCTGAAGC GGTAGCTTAG CTCCCCGTTT CGTGCTGATC 2220
AGTCTTTTTC AACACGTAAA AAGCGGAGGA GTTTTGCAAT TTTGTTGGTT GTAACGATCC 22 8 0
TCCGTTGATT TTGGCCTCTT TCTCCATGGG CGGGCTGGGC GTATTTGAAG Cggttctctc 2340
ttctgccgtt a 2351
Последовательность № 14
Пример 14: сконструированный ДНК-конструкт энолазы, связанной с промотором HydAl (1796 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 6 0
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 360
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 420
CGGCTCAGGC CAACCAGgtg accaaggctg ttgagaacat caacgctatt attgcccccg 480
ccctgaaggg catggacccc gtcaagcagg cggagattga ccagaagatg aaggacctgg 540
acggcactga caacaagggc aagctgggtg ccaacgccat cctggccgtc tccatggccg 600
tgtgcaaggc cggtgccgct gagaagggcg tgcccctgta caagcacatt gcggacctgg 660
ccggcaacag caagctgatc ctgcccgtgc cctcgttcaa catcatcaac ggcggcagcc 720
acgccggcaa cgccctggct atgcaggagt tcatgatcct gcccgttggc gcctcgagct 780
tctctgaggc catgcgcatg ggctgcgagg tgtaccacgc cctgaagggc ctgatcaagg 840
ccaagtacgg ccaggacgcc tgcaacgtgg gtgatgaggg tggcttcgcc cccaacatcg 900
gctccaacga tgagggcctg aacttggtga acgaggccat cgagaaggcc ggctacaccg 960
gcaaggtgaa gatcggcatg gacgtggcct cgtcggagtt ctacaccgag gacggcatgt 1020
acgacctgga cttcaagaac cagcccaacg atggctcgca gaagaagacc aaggagcaga 1080
tgctggagct gtacaacgag ttctgcaaga agtacccggt catctccatc gaggacccct 1140
tcgagcagga cgactgggag ccctgcgcca agctgaccac cgagaacatc tgccaggtgg 1200
tcggcgacga catcctggtg accaaccccg tgcgcgtgaa gaaggccatc gacgccaagg 1260
ccgtcaacgc tctgctgctc aaggtcaacc agatcggtac cattaccgag tccattgagg 1320
ccgtgcgcat ggccaaggag gccggctggg gtgtcatgac cagccaccgc tcgggtgaga 1380
ctgaggactc tttcatcgcc gacctggcgg tgggcctggc ctccggccag atcaagaccg 1440
gcgccccctg ccgctcggag cgcaatgcca agtacaacca gctgctgcgc atcgaggagg 1500
agctgggcga gaacgctgtg tacgctggcg agagctggcg ccacatcggc tggTAAATGG 1560
AGGCGCTCGT TGATCTGAGC CTTGCCCCCT GACGAACGGC GGTGGATGGA AGATACTGCT 1620
CTCAAGTGCT GAAGCGGTAG CTTAGCTCCC CGTTTCGTGC TGATCAGTCT TTTTCAACAC 16 8 0
GTAAAAAGCG GAGGAGTTTT GCAATTTTGT TGGTTGTAAC GATCCTCCGT TGATTTTGGC 1740
CTCTTTCTCC ATGGGCGGGC TGGGCGTATT TGAAGCggtt CtctCttctg ccgtta 1796
Последовательность № 15
Пример 15: сконструированный ДНК-конструкт пируваткиназы, связанной с промотором HydAl (1832 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 6 0
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtceiaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 3 60
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 42 0
CGGCTCAGGC CAACCAGatg tgcgagatgc tggacgcggg cgtggtgggc tgccgcgtgg 480
acctgacgtg gggccegctg gagttccacc gcaagtcgct tgccaatctg cagcaggcca 540
tgcgcaagag ccgccgcctg tgttgcacca tggtggacac gctgggccgc gagctcatga 600
tccgccgcca gagaggggca ggctggaccc agcgccagag gggtggggtg atcatcacca 660
cgcgcacgga cgtggacgcc agcagcaacg tgctgcccat cacttacagc aagttcacgg 720
agatggcggt caagggcgac accatctaca tcggccgcta cctggtgtgc ggcgcagaca 780
gcgcctcgct gtacctggag gtcatggacg tgcagggcga cgacgtgtac tgcatcgcca 840
agaacgacgc ggtgc;ggac ggcctgctga cggtgttcca cgcggagcgc tccgtggagg 900
ggctggccaa cgtgcagaac gacctgccgc tgctgtccga ctacgacaag gagtgcctgc 960
acatcctggc gcaggacttc gagcgcgcgc cctacatctc caagctggag tccatcgcct 1020
cctccgccgt gcgcgccgcc gaccgcgtgg gcgccagcct gattgtggtg tacacgcaca 1080
ccggcaagac ggcgcagctg gtggccaagt accggccgcc catgcccatc ctgacgctgg 1140
tggtgccgca cctggtgtct gaccagctca agtggaagct ggagggcagg tccagcgcgc 1200
gccagtgcct catcagtcgc gcgctgctgc cggtgctggc cgcgccctcg cccagcggcg 1260
accagctgct gcaggaggcg gtggccatgg cgggccgcgt caagctggtc aagccgcacg 1320
accacgtggt gtgcgtgcag cgcatccacg acgacttctg cgtcaagatc atctccgtgg 1380
acgacatggg cgcgggoatc aagcgcgacg acacggtcat gtcgcacagc gtgtttggca 144 0
gcagccccat ggccgtgcag ggctcgtccg gctacgactc gccgcgcgtg cacaacaacc 1500
ccatcggcaa caagttcggc cccatgccgc ccgccatcat caccaccggc aatagcttca 1560
ccctgggcgg catgggcgtg ggcgtgctgT AAATGGAGGC GCTCGTTGAT CTGAGCCTTG 1620
CCCCCTGACG AACGGCGGTG GATGGAAGAT ACTGCTCTCA AGTGCTGAAG CGGTAGCTTA 16 8 0
GCTCCCCGTT TCGTGCTGAT CAGTCTTTTT CAACACGTAA AAAGCGGAGG AGTTTTGCAA 1740
TTTTGTTGGT TGTAACGATC CTCCGTTGAT TTTGGCCTCT TTCTCCATGG GCGGGCTGGG 18 00
CGTATTTGAA GCggttctct cttctgccgt ta 1832
Последовательность № 16
Пример 16: сконструированный ДНК-конструкт пируват-ферредоксиноксидоредуктазы, связанной с промотором HydAl (4376 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 6 0
ttcgagcgct gcccggEiaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 12 0
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 36 0
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 42 0
CGGCTCAGGC CAACCAGatg ggaaagaaaa tgatgacgac tgatggcaat acagcgacag 480
cgcacgtggc gtatgccatg agcgaagtcg ccgccatcta ccccatcacc ccttcctcga 540
ccatgggcga ggaggctgac gactgggcgg cgcaaggacg caagaacatc tttggccaga 600
ccctgaccat acgcgaaatg cagtccgagg ccggcgccgc cggcgcggtg cacggggccc 660
tggcggccgg cgccctgacc acgaccttca cggcgtcgca gggtctgctg ctgatgatcc 720
ccaacatgta caagatctcc ggcgaacttc tgcccggcgt gttccacgtc accgcccgcg 780
ccatcgccgc gcacgccctg tccatcttcg gtgaccacca ggatatctac gccgcgcgcc 840
agacaggctt cgccatgctc gcctccagct cggtgcagga ggcccacgac atggccctgg 900
tggcccactt ggcggccatc gagtccaacg tgccgttcat gcacttcttc gacggattcc 960
gcacctcgca cgaaatccag aagatcgagg tcctggacta cgcggacatg gcctcgctgg 1020
tgaaccagaa ggccctggcg gaattccgcg ccaagtccat gaaccccgag cacccccacg 1080
tgcgcggcac ggcccagaac cccgacatct acttccaggg tcgcgaggca gccaacccct 1140
actacctcaa ggtgcccggc atcgttgccg agtacatgca gaaggtcgcc tccctcacgg 1200
gccgcagcta caagctcttt gactacgtgg gtgctcccga cgccgagcgc gtcatcgtgt 1260
ccatgggctc ctcgtgcgag accatcgagg aggtcatcaa ccacctcgcg gccaagggcg 1320
aaaagatcgg cctgatcaag gtccgcctgt acaggccctt cgtaagcgag gccttcttcg 1380
ctgctctgcc cgcttcggcc aaggtcatca cggtcctcga ccgcaccaag gaacccggcg 1440
cgcccggcga tccgctctac ctcgacgtgt gctcggcctt cgtggagcgc ggcgaagcca 1500
tgcccaagat cctggccggc cgctacggcc tgggttccaa ggaattcagc ccggccatgg 1560
tcaagtccgt gtacgacaac atgtccggcg ctaagaagaa ccacttcacc gtgggcatcg 1620
aagacgacgt gaccggcact tcgctgccgg tggacaacgc cttcgccgac accacgccca 1680
agggcaccat ccagtgccag ttctggggcc tcggcgccga cggcactgtg ggcgccaaca 1740
agcaggccat caagatcatc ggcgacaaca cggacctgtt tgcccagggt tacttctcct 1800
acgactccaa gaaatcgggc ggcatcacca tctcgcacct gcgcttcggc gagaagccca 1860
-ccagtccac ctacctggtc aacagggccg actatgtcgc ctgtcacaac ccggcctacg 1920
rgggcatata cgacatcctc gaaggcatca aggatggcgg aaccttcgtg ctcaactcgc 1980
cttggagcag cctcgaggac atggacaagc acctgccctc cggcatcaag cgcaccatcg 2040
cgaacaagaa gctcaagttc tacaacatcg acgcggtgaa aatcgccacc gatgtgggac 2100
cgggcggccg catcaacatg atcatgcaga cggccttctt caagctggcc ggagtgctgc 2160
ccttcgaaaa ggccgtggat ctgctcaaga agtccatcca caaggcctac ggcaaaaagg 2220
gcgagaagat cgtcaagatg aacaccgacg ccgtggacca ggccgtcacc tccctgcagg 2280
aattcaagta tccggattcc tggaaggacg ctcccgctga gaccaaggcc gagcccatga 2340
cgaacgagtt cttcaagaac gtcgtcaagc ccatcctgac ccagcagggc gacaagctgc 2400
cggtgagcgc cttcgaggcc gacggccgtt tccccctcgg caccagccag ttcgagaagc 2460
gcggcgtggc catcaacgtg ccgcagtggg tccccgagaa ctgcatccag tgcaaccagt 2520
gcgccttcgt ctgtccgcac agcgccatcc tgcccgtgct ggccaaggaa gaggagttgg 2580
tcggcgcgcc ggcgaacttc acggccctgg aagccaaggg caaggagctc aagggctaca 2640
agttccgcat ccagatcaac accctggact gcatgggctg cggcaactgc gccgacatct 2700
gtccgcccaa ggaaaaggct ctggtcatgc agcccctgga tacccagcgc gacgcgcagg 2760
tgcccaacct ggagtacgca gcgcgcatcc cggtcaaatc cgaggtgctg ccgcgcgact 2820
cgctcaaggg cagccagttc caggagcctc tcatggaatt ctcgggcgcc tgctcgggct 2880
gcggcgagac gccctacgtg cgcgtcatca cccagctctt cggcgagcgc atgttcattg 2940
ccaacgccac gggttgctcg tccatctggg gcgcgtcggc tccttccatg ccttacaaga 3000
ccaaccgcct cggacaaggc ccggcctggg gtaactccct gttcgaagac gcggccgaat 3060
acggcttcgg catgaacatg tccatgttcg cccgccgcac gcatttggcc gatcttgccg 3120
ccaaggccct ggagagcgat gcctccggcg atgtcaagga agccctgcag ggctggcttg 3180
ccggcaagaa cgatcccatc aagtccaagg aatacggcga caagctcaag aagctgctgg 3240
ctggtcagaa ggatggtctg ctcggacaga tcgccgccat gtccgacctg tacaccaaga 3300
agagcgtgtg gatcttcggt ggcgacggct gggcctacga catcggttac ggcggcctgg 3360
accatgtgct cgcctcgggc gaggacgtga acgtcttcgt catggatacc gaggtctact 3420
ccaacaccgg cggccagtcc tccaaggcaa cgcccacggg cgccgtggcc aagttcgcgg 3480
cggccggcaa gcgtaccggc aagaaggacc tggcgcgcat ggtcatgacc tacggctacg 3540
tctacgtggc tacggtctcc atgggttaca gcaagcagca gttcctcaag gtgctcaagg 3600
aagccgaaag cttccceggc ccctcgctgg tcatcgccta tgctacctgc atcaaccagg 3660
gtctgcgcaa gggcatgggc aagagccagg acgtcatgaa caccgcggtc aagtccggtt 3720
actggccgct gttccgctac gatccgcgct tggccgccca gggcaagaac cccttccagc 3780
tcgactccaa ggctcctgac ggttccgtcg aggagttcct gatggcccag aaccgcttcg 3840
ccgtcctcga tcggtcettc cccgaggacg ccaagagact gcgcgcccag gtcgctcacg 3 900
aattggacgt gcgttteaag gagttggagc acatggccgc cacgaacatc ttcgagtcct 3960
tcgcgccagc gggcggcaag gccgatggtt cggtggattt cggcgaaggt gcggagttct 4020
gcacgcgcga cgatactccc atgatggccc gacctgattc cggtgaggcc tgcgaccaga 4080
accgcgctgg cacgagcgaa cagcagggag acctcagcaa gcggacgaag aagTAAATGG 414 0
AGGCGCTCGT TGATCTGAGC CTTGCCCCCT GACGAACGGC GGTGGATGGA AGATACTGCT 420 0
CTCAAGTGCT GAAGCGGTAG CTTAGCTCCC CGTTTCGTGC TGATCAGTCT TTTTCAACAC 426 0
GTAAAAAGCG GAGGAGTTTT GCAATTTTGT TGGTTGTAAC GATCCTCCGT TGATTTTGGC 432 0
CTCTTTCTCC ATGGGCGGGC TGGGCGTATT TGAAGCggtt Ctctcttctg ccgtta 4376
Последовательность № 17
Пример 17: сконструированный ДНК-конструкт пируват-НАДФ+-оксидоредуктазы, связанной с промотором HydAl (6092 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 60
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 360
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 42 0
CGGCTCAGGC CAACCAGatg aagcagtctg tccgcccaat tatttccaat gtactgcgca 480
aggaggttgc tctgtactca acaatcattg gacaagacaa ggggaaggaa ccaactggtc 540
gaacatacac cagtggccca aaaccggcat ctcacattga agttccccat catgtgactg 600
tgcctgccac tgaccgcacc ccgaatcccg atgctcaatt ctttcagtct gtagatgggt 660
cacaagccac cagtcacgtt gcgtacgctc tgtctgacac agcgttcatt tacccaatta 720
cacccagttc tgtgatgggc gagctggctg atgtttggat ggctcaaggg aggaagaacg 780
cctttggtca ggttgtggat gtccgtgaga tgcaatctga ggctggagcc gcaggcgccc 840
tgcatggggc actggctgct ggagctattg ctacaacctt cactgcctct caagggttgt 900
tgttgatgat tcccaasatg tataagattg caggtgagct gatgccctct gtcatccacg 960
ttgcagcccg agagcttgca ggccacgctc tgtccatttt tggaggacac gctgatgtca 1020
tggctgtccg ccaaacagga tgggctatgc tgtgctccca cacagtgcag cagtctcacg 1080
acatggctct catctcccac gtggccaccc tcaagtccag catccccttc gttcacttct 1140
ttgatggttt ccgcacaagc cacgaagtga acaaaatcaa aatgctgcct tatgcagaac 1200
tgaagaaact ggtgcctcct ggcaccatgg aacagcactg ggctcgttcg ctgaacccca 1260
tgcaccccac catccgagga acaaaccagt ctgcagacat ctacttccag aatatggaaa 1320
gtgcaaacca gtactacact gatctggccg aggtcgttca ggagacaatg gacgaagttg 1380
caccatacat cggtcgccac tacaagatct ttgagtatgt tggtgcacca gatgcagaag 1440
aagtgacagt gctcatgggt tctggtgcaa ccacagtcaa cgaggcagtg gaccttcttg 1500
tgaagcgtgg aaagaaggtt ggtgcagtct tggtgcacct ctaccgacca tggtcaacaa 1560
aggcatttga aaaggtcctg cccaagacag tgaagcgcat tgctgctctg gatcgctgca 1620
aggaggtgac tgcactgggt gagcctctgt atctggatgt gtcggcaact ctgaatttgt 1680
tcccggaacg ccagaatgtg aaagtcattg gaggacgtta cggattgggc tcaaaggatt 1740
tcatcccgga gcatgccctg gcaatttacg ccaacttggc cagcgagaac cccattcaaa 1800
gattcactgt gggtatcaca gatgatgtca ctggcacatc cgttcctttc gtcaacgagc 1860
gtgttgacac gttgcccgag ggcacccgcc agtgtgtctt ctggggaatt ggttcagatg 1920
gaacagtggg agccaatcgc tctgccgtga gaatcattgg agacaacagc gatttgatgg 1980
ttcaggccta cttccaattt gatgctttca agtcaggtgg tgtcacttcc tcgcatctcc 2040
gttttggacc aaagcccatc acagcgcaat accttgttac caatgctgac tacatcgcgt 2100
gccacttcca ggagtatgtc aagcgctttg acatgcttga tgccatccgt gaggggggca 2160
cctttgttct caattctcgg tggaccacgg aggacatgga gaaggagatt ccggctgact 2220
tccggcgcaa gctggcacag aagaaggtcc gcttctacaa tgtggatgct cgaaagatct 2280
gtgacagttt tggtcttggg aagcgcatca atatgctgat gcaggcttgt ttcttcaagc 2340
tgtctggggt gctcccactg gccgaagctc agcggctgct gaacgagtcc attgtgcatg 24 00
agtatggaaa gaagggtggc aaggtggtgg agatgaacca agcagtggtg aatgctgtct 2460
ttgctggtga cctgccccag gaagttcaag tccctgccgc ctgggcaaac gcagttgata 2520
aatccacccg tacccccacc gggattgagt ttgttgacaa gatcatgcgc ccgctgatgg 2580
atttcaaggg tgaccagctc ccagtcagtg tgatgactcc tggtggaacc ttccctgtcg 2640
ggacaacaca gtatgccaag cgtgcaattg ctgctttcat tccccagtgg attcctgcca 2700
actgcacaca gtgcaantat tgttcgtatg tttgccccca cgccaccatc cgacctttcg 2760
tgctgacaga ccaggaggtg cagctggccc cggagagctt tgtgacacgc aaggcgaagg 2820
gtgattacca ggggatgaat ttccgcatcc aagttgctcc tgaggattgc actggctgcc 2880
aggtgtgcgt ggagacgtgc cccgatgatg ccctggagat gaccgacgct ttcaccgcca 2940
cccctgtgca acgcaccaac tgggagttcg ccatcaaggt gcccaaccgc ggcaccatga 3000
cggaccgcta ctccctgaag ggcagccagt tccagcagcc cctcctggag ttctccgggg 3060
cctgcgaggg ctgcggcgag accccatatg tcaagctgct cacccagctc ttcggcgagc 3120
ggacggtcat cgccaacgcc accggctgca gttccatctg gggtggcact gccggcctgg 3180
cgccgtacac caccaacgcc aagggccagg gcccggcctg gggcaacagc ctgttcgagg 3240
acaacgccga gttcggcttt ggcattgcag tggccaacgc ccagaagagg tcccgcgtga 33 00
gggactgcat cctgcaggca gtggagaaga aggtcgccga tgagggtttg accacattgt 3360
tggcgcaatg gctgcaggat tggaacacag gagacaagac cttgaagtac caagaccaga 3420
tcattgcagg gctggcacag cagcgcagca aggatcccct tctggagcag atctatggca 34 80
tgaaggacat gctgcctaac atcagccagt ggatcattgg tggtgatggc tgggccaacg 3540
acattggttt cggtgggctg gaccacgtgc tggcctctgg gcagaacctc aacgtcctgg 3600
tgctggacac cgagatgtac agcaacaccg gtgggcaggc ctccaagtcc acccacatgg 3660
cctctgtggc caagtttgcc ctgggaggga agcgcaccaa caagaagaac ttgacggaga 3720
tggcaatgag ctatggcaac gtctatgtgg ccaccgtctc ccatggcaac atggcccagt 3780
gcgtcaaggc gtttgtggag gctgagtctt atgatggacc ttcgctcatt gttggctatg 3840
cgccatgcat cgagcatggt ctgcgtgctg gtatggcaag gatggttcaa gagtctgagg 3900
ctgccatcgc cacgggatac tggcccctgt accgctttga cccccgcctg gcgaccgagg 3960
gcaagaaccc cttccagctg gactccaagc gcatcaaggg caacctgcag gagtacctgg 4020
accgccagaa ccggtatgtc aacctgaaga agaacaaccc gaagggtgcg gatctgctga 4080
agtctcagat ggccgacaac atcaccgccc ggttcaaccg ctaccgacgc atgttggagg 4140
gccccaatac aaaagccgcc gcccccagcg gcaaccatgt gaccatcctg tacggctccg 4200
aaactggcaa cagtgagggt ctggcaaagg agctggccac cgacttcgag cgccgggagt 4260
actccgtcgc agtgcaggct ttggatgaca tcgacgttgc tgacttggag aacatgggct 4320
tcgtggtcat tgcggtgtcc acctgtgggc agggacagtt cccccgcaac agccagctgt 4380
tctggcggga gctgcagcgg gacaagcctg agggctggct gaagaacttg aagtacactg 4440
tcttcgggct gggcgacagc acatactact tctactgcca caccgccaag cagatcgacg 4500
ctcgcctggc cgccttgggc gctcagcggg tggtgcccat tggcttcggc gacgatgggg 4560
atgaggacat gttccacacc ggcttcaaca actggatccc cagtgtgtgg aatgagctca 4620
agaccaagac tccggaggaa gcgctgttca ccccgagcat cgccgtgcag ctcaccccca 4680
acgccacccc gcaggatttc catttcgcca agtccacccc agtgctgtcc atcaccggtg 4740
ccgaacgcat cacgccggca gaccacaccc gcaacttcgt cactatccga tggaagaccg 4800
atttgtcgta ccaggtgggt gactctcttg gtgtcttccc tgagaacacc cggtcagtgg 4860
tggaggagtt cctgcagtat tacggcttga accccaagga cgtcatcacc atcgaaaaca 4920
agggcagccg ggagttgccc cactgcatgg ctgttgggga tctcttcacg aaggtgttgg 4980
acatcttggg caaacccaac aaccggttct acaagaccct ttcttacttt gcagtggaca 5040
aggccgagaa ggagcccttg ttgaagatcg ccgagatggg gccggagtac agcaacatcc 5100
tgtctgagac gtacca.ctac gcggacatct tccacatgtt cccgtccgcc cggcccacgc 5160
tgcagtacct catcge.gatg atccccaaca tcaagccccg gtactactcc atctcctccg 5220
cccccatcca cacccctggc gaggtccaca gcctggtgct catcgacacc tggatcacgc 5280
tgtccggcaa gcaccgcacg gggctgacct gcaccatgct ggagcacctg caggcgggcc 5340
aggtggtgga tggctgcatc caccccacgg cgatggagtt ccccgaccac gagaagccgg 54 00
tggtgatgtg cgccatgggc agtggcctgg caccgttcgt tgctttcctg cgcgacggct 54 60
ccacgctgcg gaagcagggc aagaagaccg ggaacatggc attgtacttc ggcaacaggt 5520
atgagaagac ggagttcctg atgaaggagg agctgaaggg tcacatcaac gatggtttgc 5580
tgacacttcg atgcgctttc agccgagatg accccaagaa gaaggtgtat gtgcaggacc 5640
ttatcaagat ggacgaaaag atgatgtacg attacctcgt ggtgcagaag ggttctatgt 5700
attgctgtgg atcccgcagt ttcatcaagc ctgtccagga gtcattgaaa cattgcttca 5760
tgaaagctgg tgggctgact gcagagcaag ctgagaacga ggtcatcgat atgttcacga 5820
ccgggcggta caatatcgag gcatggtaaT AAATGGAGGC GCTCGTTGAT CTGAGCCTTG 5880
CCCCCTGACG AACGGCGGTG GATGGAAGAT ACTGCTCTCA AGTGCTGAAG CGGTAGCTTA 5 94 0
GCTCCCCGTT TCGTGCTGAT CAGTCTTTTT CAACACGTAA AAAGCGGAGG AGTTTTGCAA 60 00
TTTTGTTGGT TGTAACGATC CTCCGTTGAT TTTGGCCTCT TTCTCCATGG GCGGGCTGGG 6060
CGTATTTGAA GCggttctct cttctgccgt ta 60 92
Последовательность № 18
Пример 18: сконструированный ДНК-конструкт тиолазы, связанной с
промотором HydAl (1856 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 6 0
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 3 60
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 420
CGGCTCAGGC CAACCAGatg aaagaagtag ttattgcaag tggtgtaagg actgctgtcg 480
ggaaatttgg tggcacgctt ctaaatgtac ctgcagtaga tttaggtgct gtgaataata 540
aaagaagcat aaaaagagcc aatgtgaaac ctgaagatgt tagtgaagtg ataatgggaa 600
atgtattgca ggcaggtctt gggcagaacc ccgcaagaca agctgaaata aaagcgggca 660
taccagtaga agttccggct atgactgtaa acatggtatg tggatcaggt cttagagctg 720
tgacacttgc tgctcaggca gttatgcttg gtgatgctga cattgttgta gccggtggaa 780
tggaaaatat gtcaagagca ccatatatat taaatgatgc tcgctttggg tacaggatga 840
acaatggcca gcttgtagat gaaatggtat atgatggttt aacagatgtt tttaaccaat 900
atcacatggg aatcactgcc gaaaatcttg ctgaaaaata cggcatatca agagaagagc 960
aggatgaatt tgcatataga agccaaaaat tagcgtcaga agcgatatca tcaggaagat 1020
ttgaggatga gatagttcct gtgattgtgc cgcagaaaaa aggtgaaccg atagaattta 1080
aagttgatga acatgtgaga cctaatacga caattgaagc acttgcaaaa ttaaaaccag 1140
cattccaaaa agatggaact gtaactgctg gaaatgcatc aggaattaac gatgcagctg 1200
cagcagtagt tgtgatgtca aaagaaaagg catgtgaact tggaataaag accattgcaa 1260
cgattaaatc atttggttat gcaggtgttg accccagcat cacgggaatt ggtccagtat 1320
atgctacgag aaaggcatta gaaaaagcta atctaactgt agatgattta gatttaattg 1380
aagcaaatga agcatttgca gcacaatcac tggctgttgc aaaagaatta aaatttaata 1440
tggacagagt gaatgtaaat ggtggcgcaa ttgcgatagg tcatccaatc ggcgccagcg 1500
gatgtagaat tctagtgacg cttttatatg agatgcagaa gaggaattcg catactggac 1560
ttgcaacatt gtgcatcggc ggaggaatgg gaatagcaat ggttgtcgaa agaTAAATGG 1620
AGGCGCTCGT TGATCTGAGC CTTGCCCCCT GACGAACGGC GGTGGATGGA AGATACTGCT 168 0
CTCAAGTGCT GAAGCGGTAG CTTAGCTCCC CGTTTCGTGC TGATCAGTCT TTTTCAACAC 174 0
GTAAAAAGCG GAGGAGTTTT GCAATTTTGT TGGTTGTAAC GATCCTCCGT TGATTTTGGC 1800
CTCTTTCTCC ATGGGCGGGC TGGGCGTATT TGAAGCggtt ctctcttctg ccgtta 1856
Последовательность № 19
Пример 19: сконструированный ДНК-конструкт 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, связанной с промотором HydAl (1550 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 60
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 360
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 420
CGGCTCAGGC CAACCAGatg caaaagattt gtgtaatagg tgctggaaca atgggctcag 480
gcatcgctca agtatttgca caaaatggct ttgaagtaat tttacgcgat attgatatga 540
agttcgtaga aaaaggattt ggcacaattg aaaaaattta caaagaaatg ttgacaaagg 600
gaaaattaca gcagatgaga aaacgaattt taagcagaat cagaggtaca acaaatttgg 660
aagacgcaaa agaagcagat tttgtagttg aagcggctat agaaaatatg gatctcaaga 720
aacaaatatt caaagagcta gatgaaatat gcaaaatgga aacaatcctt gcgtcaaata 780
catcatcact atccataaca gaaatagcaa gtgcgacaaa aagacctgag aaagtcatag 840
gaatgcattt cttcaaccca gttccagtaa tgaaacttgt tgaagtcata aaaggattaa 900
agacatcaga gcaaacattt aatgtcgtca gagaattggc tttaaaagta gacaaaacac 960
ctatagaggt caaagaagca cctggatttg ttgtaaatag gattttaatc ccaatgatta 1020
atgaagcaat tggaatactt gcagtggtgt tggcaactga caagagcata gatgaagcta 1080
tgaaacttgg tgcaaa.tcat ccaataggac ctttggcatt gtctagtttg ataggcaatg 1140
acgtcgttct tgctataatg aatgtgcttt atgaagagta cggcgattcg aaatacagac 1200
cacatccact tctaaaaaaa gtggtaagag gcggattgct gggtagaaaa actggcaaag 1260
gtttctttga atacaa.aatt aatcttttaa ggaggagaat atcatgaTAA ATGGAGGCGC 1320
TCGTTGATCT GAGCCTTGCC CCCTGACGAA CGGCGGTGGA TGGAAGATAC TGCTCTCAAG 13 8 0
TGCTGAAGCG GTAGCTTAGC TCCCCGTTTC GTGCTGATCA GTCTTTTTCA ACACGTAAAA 144 0
AGCGGAGGAG TTTTGCAATT TTGTTGGTTG TAACGATCCT CCGTTGATTT TGGCCTCTTT 15 00
CTCCATGGGC GGGCTGGGCG TATTTGAAGC ggttctctct tctgccgtta 1550
Последовательность № 20
Пример 20: сконструированный ДНК-конструкт кротоназы, связанной с промотором HydAl (1457 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 60
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 3 60
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 42 0
CGGCTCAGGC CAACCAGatg gattttaata atgttttatt aaataaggat gatgggatag 480
ctctcatcat tataaatcgt ccaaaggctt taaatgcatt aaactatgag acactaaaag 540
agttagatag tgtgct;gat atagttgaaa atgataaaga gataaaagtt ttaattataa 600
ctggcagcgg tgaaaaaacc ttcgttgcag gtgctgatat agctgagatg agtaatatga 660
caccacttga agcgaagaag ttctctcttt atggacagaa agtatttagg aagatagaaa 720
zgctaagtaa gcctgttata gcagcggtaa atggttttgc acttggtggt ggatgcgagc 780
cttctatggc atgtgacata cgtattgcaa gtaaaaatgc aaaatttggt caacctgaag 840
taggacttgg aataatacct ggcttttcag gaactcaaag attaccacgt cttataggca 900
cttctaaagc taaagagctt attttcacag gtgacatgat aaattctgat gaagcatata 960
aaataggcct tatatc.aaa gttgttgaac tatctgatct cattgaagaa gcaaaaaaac 1020
ncgcgaaaaa aatgatgtca aaaagtcaaa tagcaatttc tctagcaaag gaagcaataa 1080
ataagggaat ggaaacagac ttagatacag gcaatactat agaagctgag aaattttcct 1140
tatgttttac aacaga:gat caaaaagaag gtatgattgc gttttctgaa aagagggcgc 1200
ctaaatttgg caaaTAAATG GAGGCGCTCG TTGATCTGAG CCTTGCCCCC TGACGAACGG 1260
CGGTGGATGG AAGATACTGC TCTCAAGTGC TGAAGCGGTA GCTTAGCTCC CCGTTTCGTG 132 0
CTGATCAGTC TTTTTCAACA CGTAAAAAGC GGAGGAGTTT TGCAATTTTG TTGGTTGTAA 13 8 0
CGATCCTCCG TTGATTTTGG CCTCTTTCTC CATGGGCGGG CTGGGCGTAT TTGAAGCggt 144 0
;ctctcttct gccgtta 1457
Последовательность № 21
Пример 21: сконструированный ДНК-конструкт бутирил-КоА-дегидрогеназы, связанной с промотором HydAl (1817 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 6 0
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 2,40
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 3 60
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 42 0
CGGCTCAGGC CAACCAGatg gacttttcat taacaaagga gcaagaaatg gtaaggcgtg 480
ttgtgagaga attcgctgaa aaagaagttg ctcctaaagc aaaagaaata gatatcacag 540
aagagtttcc atgggataca gtaagaaaaa tggctcaaaa cgatatgatg ggtattcctt 600
atccagaaga gtatggtgga gcaggtggag attacttgag ttatatcata gctgttgaag 660
agatatcaag agcttgtgct acgactggag taattttatc tgctcatact tcattgggaa 720
gttttccaat atatcaatgg ggaacagaag aacaaaaaag aaaatatcta gtgccacttg 780
caaaaggtga aaaattgggc gcttttggcc ttacagaacc taacgcaggt acagatgcag 840
ctggacagca gacaactgca gtattagatg gtgatcacta cgtattaaac ggctcaatat 900
ttattacaaa cggaggaaaa gctgacatat atataatctt tgcaatgaca gacaaatcaa 960
aaggcacaag aggcat:agt gcatttatag ttgagaaaga ttttccgggt tttagcattg 1020
gcaaaattga agaaaaaatg ggtataagag cttcatcaac tgccgaactt gtgtttgaag 1080
attgtattgt accaaaagaa aatttacttg gtaaagaagg agaaggtttt aaaattgcga 1140
tggctacact agatgg;gga agaataggaa tagcagcgca acgccttgga atagctcagg 1200
ctgctttaga tgaagagata aaatatgcaa aggaaagaca acagtttgga agaccaattg 1260
gaaaatttca aggcat~caa tggtatatag ctgatatggc aacgagaata aatgcttcaa 1320
gatggcttgt atacaa;gcc gcttggagaa agcaggtagg tcttccgtac acaatggaag 1380
cagctatggc aaaattatat gcttccgaaa cagcaatgtt tgtaacgaca aaaacagttc 1440
agatatttgg cggcta^ggc tttacaaaag attatccagt ggaaagattt atgagagatg 1500
caaaaataac agaaat;tat gaaggcacat cggaagtcca gaaaatggtt atttccggta 1560
acctattgaa aatgTAAATG GAGGCGCTCG TTGATCTGAG CCTTGCCCCC TGACGAACGG 1620
CGGTGGATGG AAGATACTGC TCTCAAGTGC TGAAGCGGTA GCTTAGCTCC CCGTTTCGTG 16 8 0
CTGATCAGTC TTTTTG^ACA CGTAAAAAGC GGAGGAGTTT TGCAATTTTG TTGGTTGTAA 174 0
CGATCCTCCG TTGATTTTGG CCTCTTTCTC CATGGGCGGG CTGGGCGTAT TTGAAGCggt 180 0
tctctcttct gccgtta 1817
Последовательность № 22
Пример 22: сконструированный ДНК-конструкт бутиральдегиддегидрогеназы, связанной с промотором HydAl (2084 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 6 0
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 3 00
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 36 0
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 420
CGGCTCAGGC CAACCAGatg attaaagaca cgctagtttc tataacaaaa gatttaaaat 480
taaaaacaaa tgttgaaaat gccaatctaa agaactacaa ggatgattct tcatgtttcg 540
gagttttcga aaatgttgaa aatgctataa gcaatgccgt acacgcacaa aagatattat 600
cccttcatta tacaaaagaa caaagagaaa aaatcataac tgagataaga aaggccgcat 660
tagaaaataa agagattcta gctacaatga ttcttgaaga aacacatatg ggaagatatg 720
aagataaaat attaaagcat gaattagtag ctaaatacac tcctgggaca gaagatttaa 780
ctactactgc ttggtcagga gataacgggc ttacagttgt agaaatgtct ccatatggcg 840
ttataggtgc aataactcct tctacgaatc caactgaaac tgtaatatgt aatagtatag 900
gcatgatagc tgctggaaat actgtggtat ttaacggaca tccaggcgct aaaaaatgtg 960
ttgcttttgc tgtcgaaatg ataaataaag ctattatttc atgtggtggt cctgagaatt 1020
tagtaacaac tataaaaaat ccaactatgg actctctaga tgcaattatt aagcaccctt 1080
caataaaact actttgcgga actggagggc caggaatggt aaaaaccctc ttaaattctg 1140
gtaagaaagc tataggtgct ggtgctggaa atccaccagt tattgtagat gatactgctg 1200
atatagaaaa ggctgg:aag agtatcattg aaggctgttc ttttgataat aatttacctt 1260
gtattgcaga aaaagaagta tttgtttttg agaacgttgc agatgattta atatctaaca 1320
tgctaaaaaa taatgcngta attataaatg aagatcaagt atcaaagtta atagatttag 1380
tattacaaaa aaataa;gaa actcaagaat actctataaa taagaaatgg gtcggaaaag 1440
atgcaaaatt attcttagat gaaatagatg ttgagtctcc ttcaagtgtt aaatgcataa 1500
tctgcgaagt aagtgcaagg catccatttg ttatgacaga actcatgatg ccaatattac 1560
caattgtaag agttaaagat atagatgaag ctattgaata tgcaaaaata gcagaacaaa 1620
atagaaaaca tagtgcctat atttattcaa aaaatataga caacctaaat aggtttgaaa 1680
gagaaatcga tactac^atc tttgtaaaga atgctaaatc ttttgccggt gttggttatg 1740
aagcagaagg ctttacaact ttcactattg ctggatccac tggtgaagga ataacttctg 1800
caagaaattt tacaagacaa agaagatgtg tactcgccgg tTAAATGGAG GCGCTCGTTG 1860
ATCTGAGCCT TGCCCCCTGA CGAACGGCGG TGGATGGAAG ATACTGCTCT CAAGTGCTGA 1920
AGCGGTAGCT TAGCTCCCCG TTTCGTGCTG ATCAGTCTTT TTCAACACGT AAAAAGCGGA 1980
3GAGTTTTGC AATTTTGTTG GTTGTAACGA TCCTCCGTTG ATTTTGGCCT CTTTCTCCAT 204 0
3GGCGGGCTG GGCGTATTTG AAGCggttct ctcttctgcc gtta 2084
Последовательность № 23
Пример 23: сконструированный ДНК-конструкт бутанолдегидрогеназы. связанной с промотором HydAl (1733 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 60
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGGCCGC CGTCATTGCC AAGTCCTCCG TCTCCGCGGC CGTGGCTCGC CCGGCCCGCT 360
CCAGCGTGCG CCCCATGGCC GCGCTGAAGC CCGCCGTCAA GGCTGCCCCC GTGGCTGCCC 42 0
CGGCTCAGGC CAACCAGatg aaaggttttg caatgctagg tattaataag ttaggatgga 480
tcgaaaaaga aaggccagtt gcgggttcat atgatgctat tgtacgccca ttagcagtat 540
ctccgtgtac atcagatata catactgttt ttgagggagc tcttggagat aggaagaata 600
tgattttagg gcatgaagct gtaggtgaag ttgttgaagt aggaagtgaa gtgaaggatt 660
ttaaacctgg tgacagagtt atagttcctt gtacaactcc agattggaga tctttggaag 720
ttcaagctgg ttttcaacag cactcaaacg gtatgctcgc aggatggaaa ttttcaaatt 780
tcaaggatgg agtttttggt gaatattttc atgtaaatga tgcggatatg aatcttgcga 840
ttctacctaa agacatgcca ttagaaaatg ctgttatgat aacagatatg atgactactg 900
gatttcatgg agcagaactt gcagatattc aaatgggttc aagtgttgtg gtaattggca 960
ttggagctgt tggcttaatg ggaatagcag gtgctaaatt acgtggagca ggtagaataa 1020
ttggagtggg gagcaggccg atttgtgttg aggctgcaaa attttatgga gcaacagata 1080
ttctaaatta taaaaal;ggt catatagttg atcaagttat gaaattaacg aatggaaaag 1140
gcgttgaccg cgtaatl:atg gcaggcggtg gttctgaaac attatcccaa gcagtatcta 1200
tggttaaacc aggaggaata atttctaata taaattatca tggaagtgga gatgctttac 1260
taataccacg tgtagaatgg ggatgtggaa tggctcacaa gactataaaa ggaggtcttt 1320
gtcctggggg acgtttgaga gcagaaatgt taagagatat ggtagtatat aatcgtgttg 1380
atctaagtaa attagttaca catgtatatc atggatttga tcacatagaa gaagcactgt 1440
tattaatgaa agacaagcca aaagacttaa ttaaagcagt agttatatta TAAATGGAGG 1500
CGCTCGTTGA TCTGAGCCTT GCCCCCTGAC GAACGGCGGT GGATGGAAGA TACTGCTCTC 1560
AAGTGCTGAA GCGGTAGCTT AGCTCCCCGT TTCGTGCTGA TCAGTCTTTT TCAACACGTA 1620
AAAAGCGGAG GAGTTTTGCA ATTTTGTTGG TTGTAACGAT CCTCCGTTGA TTTTGGCCTC 16 8 0
TTTCTCCATG GGCGGGCTGG GCGTATTTGA AGCggttCtC tcttctgccg tta 1733
Последовательность № 24
Пример 24: сконструированный ДНК-конструкт фруктозодифосфатальдолазы (1556 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 6 0
CAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGATGGTA GGGTGCGAGT 12 0
GACCCCGCGC GACTTGGAAG GGTTCAAACG ACCCCGCCGT ACGAACTTTT GTCGGGGGGC 180
GCTCCCGGat ggccctgatg atgaagtcgt cggccagcct gaaggctgtg tcgctggccg 240
ctctcgccgc gccgtcgttg tgcgcgccgg gcaagtacga tgaggagctg attaagaccg 300
ctggcaccgt tgcctccaag ggccgcggta tcctggccat ggacgagtca aacgccacct 360
gcggcaaacg cctggactcc atcggcgtgg agaacaccga ggagaaccgc cgcgcctacc 420
gcgagctgct ggtgacogcc cccggcctgg gccagtacat ctccggcgct atcctgttcg 480
aggagaccct gtatcagtcc accgcctccg gcaagaagtt cgtcgatgtg atgaaggagc 540
agaacatcgt gcccggcatc aaggtcgaca agggcctggt gccctgtcca acaccaacga 600
tgagctggtg catgggcctg gacggctgga caagcgctgc tgagtactac aaggccggcg 660
ctcgcttcgc caagtggcgc tcggtcgtct cgatccccca cggcccctcg atcatgctgc 720
cgcgactggc ctacggcctg gcccgctacg ccgccatcgc ccagaacgcc ggtctggtgc 780
ccattgtgga gcccgaggtc ctgctggacg gtgagcacga catcgaccgc tgcctggagg 840
tgcaggaggc catctgggcc gagaccttca agtacatggc cgacaacaag gtcatgttgc 900
agggtatcct gctgaagccc gccatggtca cccccggcgc tgactgcaag aacaaggccg 960
gccccgccaa ggttgccgag tacaccctga agatgctggc cgcgcgtgcc cccccggtcc 1020
ccggcatcat gttcctgtcg ggcggccagt ccgagctgga gtcgaccctg aacctgaacg 1080
ccatgaacca gagccccaac ccgtggcacg tgtcgttctc gtacgcccgc gctctgacga 1140
acaccgttct gaagacctgg caggcaagcc cgagaacggt ccaggcgccc aggctcgctg 1200
ctcaagcgcg caaggccaac tcggacgctc agcagggcaa gtacgacgcc accaccgagg 1260
gcaaggaggc tgcccagggc atgtacgaga agggaaaagg ctacgtctac taaTAAATGG 1320
AGGCGCTCGT TGATCTGAGC CTTGCCCCCT GACGAACGGC GGTGGATGGA AGATACTGCT 13 80
CTCAAGTGCT GAAGCGGTAG CTTAGCTCCC CGTTTCGTGC TGATCAGTCT TTTTCAACAC 1440
GTAAAAAGCG GAGGAGTTTT GCAATTTTGT TGGTTGTAAC GATCCTCCGT TGATTTTGGC 15 00
CTCTTTCTCC ATGGGCGGGC TGGGCGTATT TGAAGCggtt Ctctcttctg ccgtta 1556
Последовательность № 25
Пример 25: сконструированный ДНК-конструкт триозофосфатизомеразы
(1379 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 60
iZAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGATGGTA GGGTGCGAGT 120
GACCCCGCGC GACTTGGAAG GGTTCAAACG ACCCCGCCGT ACGAACTTTT GTCGGGGGGC 180
GCTCCCGGat ggcagc^acc tctctcactg cccctccttc tttctccggt ctccgccgca 240
cttctcccaa gctcgacgct gccgccgtct cctcccacca atccttcttc caccgcgtca 300
attcctctac ccgtctcgtt tcttcctctt cttcttctca tcgctccccc agaggtgttg 360
ztgccatggc tggatccgga aagtttttcg ttggaggaaa ctggaagtgt aacgggacta 420
aggactccat cgccaagctt atctccgatc tcaacagtgc aaccttggaa gcagatgtag 480
atgttgttgt gtcacc;cca tttgtctaca tcgaccaggt caaatcctcg ttgacagacc 540
gtattgacat atcaggzcag aactcttggg ttgggaaagg tggagccttc actggtgaaa 600
zcagcgtgga acagctcaaa gaccttggct gcaagtgggt cattcttggg cattccgaac 660
ggagacatgt catcggagaa aaagatgagt ttatcgggaa gaaagctgca tatgcattga 720
gtgagggtct tggagtgata gcttgtattg gggaaaagct agaagagagg gaagcaggca 780
agacgtttga tgtttgcttc gcgcaactga aggcgtttgc tgatgctgtg cctagctggg 840
acaatatagt tgttgcatac gagcctgtat gggcaattgg aactggtaaa gttgcatctc 900
ctcagcaagc acaagaagtc catgtagctg tccgcggttg gctaaagaag aatgtctctg 960
aggaagttgc ttccaaaacg agaatcatat atggaggttc tgtcaatgga ggcaacagtg 1020
cagagcttgc caaagaagaa gacattgatg gatttcttgt tggtggtgcc tccttgaagg 1080
gtcctgagtt tgcaaccatt gtgaactcag tcacgtcgaa gaaagttgct gcttgaTAAA 1140
TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC CCTGACGAAC GGCGGTGGAT GGAAGATACT 1200
GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT CCCCGTTTCG TGCTGATCAG TCTTTTTCAA 1260
CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT TGTTGGTTGT AACGATCCTC CGTTGATTTT 1320
GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT ATTTGAAGCg gttctctctt Ctgccgtta 13 7 9
Последовательность № 26
Пример 26: сконструированный ДНК-конструкт фосфофруктокиназы
(2156 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC atggtagggt gcgagtgacc ccgcgcgact tggaagggtt 60
caaacgaccc cgccgtacga acttttgtcg gggggcgctc ccggatggta gggtgcgagt 120
gaccccgcgc gacttggaag ggttcaaacg accccgccgt acgaactttt gtcggggggc 180
gctCCCggAT GGCCGCCGTC ATTGCCAAGT CCTCCGTCTC CGCGGCCGTG GCTCGCCCGG 240
CCCGCTCCAG CGTGCGCCCC ATGGCCGCGC TGAAGCCCGC CGTCAAGGCT GCCCCCGTGG 300
CTGCCCCGGC TCAGGCCAAC CAGatggaag cttcgatttc gtttctgggg tcaacaaaac 360
ccaatatttc cttgtttaac ccttcttcaa acgtccttcc tcgtagagat ttccctcttc 420
ctgctttgaa attgaagaaa gtttcagtgc tgcctcgaat cttgcaccag aaacgactca 480
tcagagctca gtgctctgat ggattcaaac cagaggaaga cgatgggttt gtcctagaag 540
acgttcctca cttgaccaaa tttctccctg atttaccgtc atatccaaat ccattgaaag 600
aaagccaagc atatgccatt gttaagcgaa cttttgtcag ttccgaagat gtggttgcgc 660
aaaatattgt agtccagaag ggaagtaagc gaggagtaca ctttaggcga gcagggcctc 720
gagaaagagt gtacttcaga tcagatgaag taaaagcttg catagtgact tgtgggggct 780
tgtgccctgg aatcaatact gttatacggg aaattgtatg tggattgaac aatatgtatg 840
gtgttaataa cattctcggc attcagggag gatatagagg cttttactcc aaaaacacta 900
tgaacctgac acctaaagta gttaacgata ttcataaacg cggtggcact tttcttcaaa 960
cctcaagagg aggacatgat acagcgaaga ttgttgataa tattcaagat agaggaataa 1020
atcaggtata tattattgga ggtggtggga cgcaaaaggg tgcagagaag atatacgagg 1080
aagttgagag gcgtggtctt caagtggcgg tttctggcat tcctaagaca attgataatg 1140
atattgctgt gattgacaaa tcatttggct ttgatacggc ggttgaggaa gcacaacgag 1200
ctattaatgc tgcacatgta gaggtcgaga gcgtggaaaa tggagttggt atcgttaaac 1260
tcatgggcag atacagtggt tttattgcca tgattgcaac tttagcgaat cgtgatgtgg 1320
attgttgctt gattccagag tctccatttt ttcttgaagg aaagggtggg ctctttgagt 1380
ttattgaaga acgactcaaa gagaataggc acatggttat tgtgatagct gaaggagctg 1440
gacaggatta tgttgctcaa agcatgcgtg catctgaaac taaagacgcc tcaggaaata 1500
gactcttgct tgatgttggt ctatggttga ctcaacagat aaaggatcac tttacaaatg 1560
ttcggaaaat gatgataaat atgaagtaca tagacccaac gtatatgata agagcaatac 1620
cgagtaacgc atcagacaat gtctattgca ctcttcttgc ccaaagtgca gttcatggag 1680
caatggctgg gtactcaggt ttcactgtag gaccagttaa cagtagacat gcttacatcc 1740
caatttctgt gacggaagtg acaaatacgg tgaagttaac tgataggatg tgggctagac 1800
tccttgcatc gacaaatcaa ccgagtttct tgactggtga aggagcattg cagaatgtga 1860
tcgacatgga aactcaagaa aagatcgata acatgaagat ctcttctatc taaTAAATGG 1920
AGGCGCTCGT TGATCTGAGC CTTGCCCCCT GACGAACGGC GGTGGATGGA AGATACTGCT 1980
CTCAAGTGCT GAAGCGGTAG CTTAGCTCCC CGTTTCGTGC TGATCAGTCT TTTTCAACAC 2 040
GTAAAAAGCG GAGGAGTTTT GCAATTTTGT TGGTTGTAAC GATCCTCCGT TGATTTTGGC 2100
CTCTTTCTCC ATGGGCGGGC TGGGCGTATT TGAAGCggtt Ctctcttctg ccgtta 2156
Последовательность № 27
Пример 27: сконструированный ДНК-конструкт иРНК крахмалсинтазы, связанной с Nial промотором (860 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 6 0
CGATGGCCCC GGGTTGTTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 12 0
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 180
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 24 0
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACatgCcagC cggctcacca 300
ccgccaccag cggcttgcgg gggtccacct ccaggcccag acccttctgc agaaactcct 360
-gcacagcgc cttcccggcg gggcggtcgg cgtcgaagtt ggctggcagc agcgcgtcag 420
rggccgggtt ccactcotca cagtcaatgc cgttcaggat gccgtggaac ttggagcgca 480
gctcggggcg cgcgaaggtg gatctcgccg tcccagcggt agcccttggg cacctcgatg 540
tcgcattcgt gcttgaggcc ctcaatctgg tccttgggca ggcactcgta gaacggcagc 600
atgaccgtca cgaagtgTAA ATGGAGGCGC TCGTTGATCT GAGCCTTGCC CCCTGACGAA 660
CGGCGGTGGA TGGAAGATAC TGCTCTCAAG TGCTGAAGCG GTAGCTTAGC TCCCCGTTTC 720
GTGCTGATCA GTCTTTTTCA ACACGTAAAA AGCGGAGGAG TTTTGCAATT TTGTTGGTTG 780
TAACGATCCT CCGTTGATTT TGGCCTCTTT CTCCATGGGC GGGCTGGGCG TATTTGAAGC 84 0
ggttctctct tctgccgtta 860
Последовательность № 28
Пример 28: сконструированный ДНК-конструкт иРНК крахмалсинтазы, связанной с HydAl промотором (1328 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC gagctgtcat gcgttgttcc gttatgtgtc gtcaaacgcc 60
ttcgagcgct gcccggaaca atgcgtacta gtataggagc catgaggcaa gtgaacagaa 120
gcgggctgac tggtcaaggc gcacgatagg gctgacgagc gtgctgacgg ggtgtaccgc 180
cgagtgtccg ctgcattccc gccggattgg gaaatcgcga tggtcgcgca taggcaagct 240
cgcaaatgct gtcagcttat cttacatgaa cacacaaaca ctctcgcagg cactagcctc 300
aaATGAAGAG CTTCATGCGG AGGGATGCGC TCGGCGCGGG GCTCCGCGGT GCAGCCAGCA 36 0
CAAAGCCCGT CTCAAGGGTC GCCAGCGTGA GGCCTGCGCC TACCGCCTAC CGCACTGCCT 420
GCCAAGTTGC GAAGGTGGAT GAAATGGTGT CGGTGGATGA GGAGCTTACT CGTCTCCGCA 4 80
AGGAGAACGA GCTCCTGCGC GCCCAACTGG CGCTGTACCA GCAGAACCAG CAGCCGTCCG 540
TGGGTGCCGC TGCCGTTGCC CCGCCTGCTG CCGCCACGAA GGTGCTGGAG AAGCCGGCGC 600
CGtaagtaac ctaaCGGTGA GCAGCATGCA ATATTTTAGC GTCGATACTC GGAAACTATA 660
3GAGCGCATC AGCCGACCGA TGTTCGCGTT GCTGTCGCAG GCCCAACCGT GCCACCGCCG 720
TGGTGTGCAA GGCGCA3AAG GCGGCCAGGC CGCCGCTGCC GCTGCTCTGG CCAtaagtaa 78 0
cctaaCGGCG CCGGCTTCTC CAGCACCTTC GTGGCGGCAG CAGGCGGGGC AACGGCAGCG 84 0
GCACCCACGG ACGGCT3CTG GTTCTGCTGG TACAGCGCCA GTTGGGCGCG CAGGAGCTCG 90 0
TTCTCCTTGC GGAGAC3AGT AAGCTCCTCA TCCACCGACA CCATTTCATC CACCTTCGCA 96 0
ACTTGGCAGG CAGTGC3GTA GGCGGTAGGC GCAGGCCTCA CGCTGGCGAC CCTTGAGACG 1020
GGCTTTGTGC TGGCTGCACC GCGGAGCCCC GCGCCGAGCG CATCCCTCCG CATGAAGCTC 10 80
TTCATtaaat ggaggcgctc gttgatctga gccttgcccc ctgacgaacg gcggtggatg 1140
gaagatactg ctctcaagtg ctgaagcggt agcttagctc cccgtttcgt gctgatcagt 1200
ctttttcaac acgtaaaaag cggaggagtt ttgcaatttt gttggttgta acgatcctcc 1260
gttgattttg gcctctttct ccatgggcgg gctgggcgta tttgaagcGG TTCTCTCTTC 1320
TGCCGTTA 1328
Последовательность № 29
Пример 29: сконструированный ДНК-конструкт амилазы (1889 по)
agaaaatctg gcaccacacc ATGGTAGGGT GCGAGTGACC CCGCGCGACT TGGAAGGGTT 6 0
CAAACGACCC CGCCGTACGA ACTTTTGTCG GGGGGCGCTC CCGGATGGTA GGGTGCGAGT 120
GACCCCGCGC GACTTGGAAG GGTTCAAACG ACCCCGCCGT ACGAACTTTT GTCGGGGGGC 18 0
GCTCCCGGct cgagcatATG GCCGCCGTCA TTGCCAAGTC CTCCGTCTCC GCGGCCGTGG 240
CTCGCCCGGC CCGCTCCAGC GTGCGCCCCA TGGCCGCGCT GAAGCCCGCC GTCAAGGCTG 3 00
CCCCCGTGGC TGCCCC3GCT CAGGCCAACC AGatggcgaa caaacacatg tccctttctc 360
tcttcatcgt cctccttggc ctctcgtgca gcttggcctc cgggcaagtc ctgtttcagg 420
gttttaactg ggagtcgtgg aagcacaatg gcgggtggta caacttcctg atgggcaagg 480
tggacgacat cgccgccgct ggcgtcacgc acgtgtggct ccccccggcg tcgcagtccg 540
tcgccgagca agggtacatg ccgggccggc tctacgacct ggacgcctcc aagtacggca 600
acaaggcgca gctcaagtcc ctcatcggcg cgctccacgg caagggcgtc aaggccatcg 660
ccgacatcgt catcaaccac cgcacggcgg agcgcaagga cggccggggc atctactgca 720
tcttcgaggg cggcaccccg gacgcgcgcc tcgactgggg cccccacatg atctgccgcg 780
acgaccggcc ctacgccgac ggcaccggca acccggacac cggcgccgac ttcggggccg 840
cgccggacat cgaccacctc aacccgcgcg tccagaagga gctcgtcgag tggctcaact 900
ggctcaggac cgacgtcggc ttcgacggct ggcgcttcga cttcgccaag ggctactccg 960
cggacgtggc caagatctac gtcgaccgct ccgagcccag cttcgccgtc gccgagatat 1020
ggacgtcgct ggcgtacggc ggggacggca agccgaacct caaccaggac ccgcaccggc 1080
aggagctggt gaactgggtg aacaaggtgg gcggctccgg ccccgccacc acgttcgact 1140
tcaccaccaa gggcatcctc aacgtggccg tggagggcga gctgtggcgc ctgcgcggca 1200
ccgacggcaa ggcgccgggc atgatcgggt ggtggccggc caaggcggtg accttcgtcg 1260
acaaccacga caccggctcc acgcagcaca tgtggccctt cccttccgac agggtcatgc 1320
agggatatgc ctacatcctc acgcacccag ggaccccatg catcttctac gatcatttct 1380
tcgactgggg cttgaaggag gagatcgatc gtctggtgtc aatcaggacc cgacagggga 1440
tacacagtga gagcaagctg cagatcatgg aggccgacgc cgacctttac cttgccgaga 1500
tcgacggcaa ggtcatcgtc aagctcgggc caagatacga tgtcggacac ctcattcctg 1560
aaggcttcaa ggtggtcgcg catggcaatg actatgccgt atgggagaaa gtataaGGCT 1620
GCTGCCCCGG CTGCTGCtaa tctagaT/ЛАА TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC 1680
CCTGACGAAC GGCGGTGGAT GGAAGATACT GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT 1740
CCCCGTTTCG TGCTGATCAG TCTTTTTCAA CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT 18 0 0
TGTTGGTTGT AACGATGCTC CGTTGATTTT GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT 186 0
ATTTGAAGCg gttctctctt ctgccgtta 1889
Последовательность № 30
Пример 30: сконструированный ДНК-конструкт крахмалфосфорилазы
(3089 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC atggtagggt gcgagtgacc ccgcgcgact tggaagggtt 6 0
caaacgaccc cgccgtacga acttttgtcg gggggcgctc ccggatggta gggtgcgagt 120
gaccccgcgc gacttggaag ggttcaaacg accccgccgt acgaactttt gtcggggggc 180
gctCCCggAT GGCCGCCGTC ATTGCCAAGT CCTCCGTCTC CGCGGCCGTG GCTCGCCCGG 24 0
CCCGCTCCAG CGTGCGCCCC ATGGCCGCGC TGAAGCCCGC CGTCAAGGCT GCCCCCGTGG 3 00
CTGCCCCGGC TCAGGCCAAC CAGatggcgg atgcgaaagc aaacggaaag aatgaggcgg 3 60
ccaaactggc gaaaattccg gcggctgcga atccattggc taatgaacca tcggcgattg 420
catcaaatat aagttaccac gtgcagtaca gtcctcattt ctcgccgact aagttcgagc 480
cggagcaagc tttctttgcc acggcggagg ttgtccgcga tcgtcttatt caacaatgga 540
atgagacata ccaccatttt aataaagttg atccgaagca aacatactac ctatcaatgg 600
aatttcttca aggaaggact ttgactaatg caattggcag tttggacatt cagaatgcat 660
atgctgatgc tttaaat;aat ttggggcatg tccttgagga gatagctgaa caggaaaaag 720
atgctgcact aggaaatggt gggctgggca ggctagcttc atgcttctta gactccatgg 780
caacattgaa tttgcctgca tggggttatg gtttgagata ccggtatggg ctgttcaagc 840
agaagatcac caagcagggt caagaagaag ttgctgaaga ttggcttgag aaatttagtc 900
cttgggaagt tgtcaggcat gatgtggtat ttccggtcag attttttggg agtgttatgg 960
ttaatccaaa tggaacgaga aaatgggttg ggggtgaagt tgtccaagcc gtagcttatg 1020
atataccaat tccagggtac aaaaccaaga acactatcag tcttcgtctc tgggacgcta 1080
aagctagcgc tgaggatttc aatttatttc agtttaatga tggacaatac gaatctgctg 1140
cacagcttca ttctcgagct caacagattt gtgctgtgct ctaccccggg gattctactg 1200
aagaagggaa gctttteiagg ctgaaacaac aattctttct ctgcagtgct tcacttcagg 1260
atatgattct tagattcaag gagaggaaaa gtggaaggca gtggtctgaa tttcccagca 1320
aggtagctgt acaactgaat gatactcatc caacacttgc aattccagag ttgatgcgat 1380
tgctaatgga tgaggaagga cttggatggg atgaagcatg ggatataaca acaaggactg 1440
ttgcttatac caatcacaca gtacttcctg aagcacttga gaagtggtca caagcagtaa 1500
tgtggaagct tcttcctcgc catatggaaa taattgaaga gattgacaag agattcattg 1560
caatggtccg ctccacaagg agtgaccttg agagtaagat tcccagcatg tgcatcttgg 1620
ataataatcc caaaaagccg gttgttagga tggcaaactt atgtgtagta tctgcgcata 1680
cggtaaatgg tgttgctcag ttgcacagtg atatcttaaa ggccgacttg ttcgctgact 1740
atgtttctct atggccaaac aaactccaaa ataaaactaa tggcattact cctcgtcgat 1800
ggctccggtt ttgcaatcct gagctcagca aaattatcac aaaatggtta aaaaccgatc 1860
agtgggttac gaaccttgac ctgcttgtag gtcttcgtca gtttgctgac aacacagaac 1920
-ccaagctga atgggaatct gctaagatgg ccagtaagaa acatttggca gactacatat 1980
ggcgagtaac cggtgtaacg attgatccta atagcttatt tgacatacaa gtcaagcgca 2040
ttcatgaata caagagacaa ctgctaaata ttttgggcgc aatctacaga tacaagaagt 2100
tgaaggagat gagccctcag gagcggaaga aaactactcc acgcaccatt atgtttggag 2160
ggaaagcatt tgcaacatat acaaacgcaa aaagaatagt aaagttggtt aatgatgttg 2220
gtgaagtcgt caacacegat cctgaggtca atagttattt gaaggtggta tttgttccaa 2280
attacaatgt ctctgttgcg gagttgctta ttccaggaag tgagctatct cagcatatta 2340
gcacagcagg catggaggca agtggcacaa gcaacatgaa attttctcta aatggttgcc 2400
tcattatagg aacattggat ggagctaatg tggaaatcag gcaggagata ggagaggaga 2460
atttctttct ctttggtgca ggagcagacc aagtccctaa gctgcggaag gaaagagaag 2520
atggattgtt caaaccagat cctcggtttg aagaggccaa gcaatttata agaagtggag 2580
catttggaag ctatgaotac aacccgcttc ttgattccct ggaggggaac actggttatg 2640
gtcgtggtga ttattttcta gttggttatg acttcccaag ttacttagag gctcaggaca 2700
gagttgacca agcttacaag gaccggaaga agtggctgaa gatgtctata ttaagtacag 2760
ctggcagtgg gaaattcagc agtgatcgca caattgcaca gtatgctaag gaaatctgga 2820
acataacaga atgccgtaca tcatgaTAAA TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC 2880
CCTGACGAAC GGCGGTGGAT GGAAGATACT GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT 2 940
CCCCGTTTCG TGCTGATCAG TCTTTTTCAA CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT 3 000
TGTTGGTTGT AACGATGCTC CGTTGATTTT GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT 3 060
ATTTGAAGCg gttctctctt ctgccgtta 3089
Последовательность № 31
Пример 31: сконструированный ДНК-конструкт гексокиназы (1949 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC atggtagggt gcgagtgacc ccgcgcgact tggaagggtt 6 0
caaacgaccc cgccgtacga acttttgtcg gggggcgctc ccggatggta gggtgcgagt 120
gaccccgcgc gacttggaag ggttcaaacg accccgccgt acgaactttt gtcggggggc 180
gctCCCggAT GGCCGCCGTC ATTGCCAAGT CCTCCGTCTC CGCGGCCGTG GCTCGCCCGG 24 0
CCCGCTCCAG CGTGCGCCCC ATGGCCGCGC TGAAGCCCGC CGTCAAGGCT GCCCCCGTGG 300
CTGCCCCGGC TCAGGCCAAC CAGatggcta taacaccccg ccgaaaacct tcccggaagg 360
gatcaatggc tgatatgccg aaggatgtgc ttgaccagct caagacgctg gaagagctct 420
tcacagttga ccaggagaag ctgaagcaga tcgttgagca tttcatcaag gagttacaga 480
agggcctcag tgtcgaaggc ggaaacattc ccatgaacgt gacttgggtt ctgggatttc 540
ccactggcca tgagaaaggt acatttctgg ctctggacat ggggggcacc aacctgcgcg 600
tctgcgaaat tgagctctcc gaagagaagg gcgagtttga tgtcacacag tccaagtatc 660
gaatccccga agagctcaag agcggtgaat catcagaact atgggaatat attgccgact 720
gtgtacagca gttcatagaa tactaccatg acggttgcac ggctttgcca gacctgccgc 780
tgggctttac cttttcgtac cctgctactc aagaatatgt tgaccacggt gtcctacaga 840
gatggaccaa gggttt:gat attgacggcg tcgagggcaa agacgtcgtc ccaatgttag 900
aagaagcttt ggctaagaag gttaaaaatt cagctctttc cccatttttc tttggctata 960
tggtgctaat tactttacag ggtctcccca ttaaagttgc cgctctagta aacgacacga 1020
ctggcacact tattgc;tcc gcctacactg acccagagat gaaaatcggc tgtatcttcg 1080
gcacaggcgt caacgccgcc tacatggaaa atgcgggctc tatccctaaa atagcccact 1140
acaatttacc tcccgacacc ccagtcgcta tcaactgcga atacggcgcc ttcgacaacg 1200
aactcattgt cctcccccga acgcagtatg acgacgtatc ccaactacgt aaaccatact 1260
ccctggactc ctccttccta gccttcatcg aagaagatcc cttcgagaac ctgtcagaaa 1320
cgcgagatct cttcgaacgc accctgggga tctacgcatt gccctcggag ctagaattct 1380
gcagacgcct ggcggaattg atcggcacac gtgccgcacg cctctccgct tgcggtgttg 1440
cggccatctg caagaagaaa aatatcaccc attgccatgt cggagcggac gggtcggtgt 1500
tcgagaagta cccgcanttc aaggccaggg gcgccagagc cctgcgggag atccttgact 1560
ggccagatag tgaaccggat cgggttgtga tgagcggagc ggaggatggg tctggcgttg 1620
gtgcggcgct tattgcggct ttgacgcttg agagggttaa acaagcttct tgggaatgga 1680
agtacatcgg aagcgg:ctg tcttaaTAAA TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC 1740
CCTGACGAAC GGCGGTGGAT GGAAGATACT GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT 1800
CCCCGTTTCG TGCTGATCAG TCTTTTTCAA CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT 18 60
TGTTGGTTGT AACGATGCTC CGTTGATTTT GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT 192 0
ATTTGAAGCg gttctc;ctt ctgccgtta 1949
Последовательность № 32
Пример 32: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглюкомутазы
(2249 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC atggtagggt gcgagtgacc ccgcgcgact tggaagggtt 6 0
caaacgaccc cgccgtacga acttttgtcg gggggcgctc ccggatggta gggtgcgagt 120
gaccccgcgc gacttggaag ggttcaaacg accccgccgt acgaactttt gtcggggggc 180
gctcccggAT GGCCGCCGTC ATTGCCAAGT CCTCCGTCTC CGCGGCCGTG GCTCGCCCGG 24 0
CCCGCTCCAG CGTGCGCCCC ATGGCCGCGC TGAAGCCCGC CGTCAAGGCT GCCCCCGTGG 300
CTGCCCCGGC TCAGGCCAAC CAGatgtccg atttctccgt ccagaccatt gccaccacgg 360
ccttcacaga ccaaaagcct ggaacctctg gtctcagaaa gaaagttact gtgtttcaac 420
agcctcacta cactgaaaac ttcattcagg ctattctcga tgccattccg gaaggtgccc 480
aaggtgccac tcttgttgta ggaggtgatg gccgtttcta caacgacaag gtcatcaact 540
tgatcgccaa aatcgcctcg gccaacggag tttccaagtt gattttgggt caagacggga 600
ttctttccac tccagcaact tcgcatgtaa tcaggatcag gggtgcaact ggaggaatta 660
ttctcactgc ttcacacaac cccggaggcc ccaaaaacga tttgggtatt aagtacaact 720
tgggaaacgg tgcaccagct ccagaatcgg ttaccaacaa gatctatgat gtctccaagg 780
aattgacttc gtacaagctc attgatttac ccgacattga tttgtccaaa acccagaccg 840
tgcaattggg ccctcttgaa gtggaaatca ttgactccac ctctgattac gtagccatgt 900
tgaaggatat ctttgacttc cccttgatca agtcgttcct cgagactgcc actaaggagc 960
agggattcaa ggttttattt gattcgctca atggtgtcac tggcccctac ggctacaaga 1020
tcttcgttga agaattagga ttgcctctta actcaatcca aaattaccac ccattgcctg 1080
actttggtgg tttacaccca gatccaaact tgacctatgc tcatactttg gtcgagaggg 1140
tcgataagga gaatattgcc tttggtgctg catctgatgg tgacggtgac agaaacatga 1200
tctacggtgc tggtaccttt gtttcgcctg gtgactctgt agccatcatc tcggaatacg 1260
ccgattccat cccttacttc aagaagcaag gtgtctacgg tttggccaga tccatgccta 1320
cctctggagc catcgatttg gtagcaaagg ctaaaggatt gaatgtttac gaagtgccaa 1380
ccggttggaa gttcttctgc aaccttttcg acgctgacaa gttgagtatc tgtggtgaag 1440
agtcgtttgg aacaggctcc aaccacatca gagaaaagga cggcctttgg gctgtagttg 1500
cctggttgaa cgtgctagca gattacaacg tcaagaatcc agaatccaag acatctattt 1560
ctgtagtgca gaactcgttt tggaagaaat acggaagaac tttcttcact agatatgact 1620
acgaaaacgt atcgtctgaa ggtgctgccg agctcatcaa cttgttgtct tctattgttg 1680
actctaagaa accaggaagt agcttagctg atggctacgt cgtcaaggaa gctgctaact 1740
tctcgtacac cgatttggac ggctctgttt cgtccaacca aggtttgttc atcaagtttg 1800
aaagcggctt gagattcata gtaagattgt ctggtactgg atcatccggt gctacagtca 1860
gattatatct cgaaaagcac tctgccgacg aatccaccta tggcttaggc gtagaccagt 1920
acttagttga tgacatcaag tttgtcttgg acttgttgaa gttcaagcag ttcttgggaa 1980
aggatgaacc agatgt-cgt acctagTAAA TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC 2040
CCTGACGAAC GGCGGTGGAT GGAAGATACT GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT 2100
CCCCGTTTCG TGCTGATCAG TCTTTTTCAA CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT 2160
TGTTGGTTGT AACGATGCTC CGTTGATTTT GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT 2220
ATTTGAAGCg gttctctctt ctgccgtta 2249
Последовательность № 33
Пример 33: сконструированный ДНК-конструкт глюкозофосфатизомеразы (2231 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC atggtagggt gcgagtgacc ccgcgcgact tggaagggtt 60
caaacgaccc cgccgtacga acttttgtcg gggggcgctc ccggatggta gggtgcgagt 120
gaccccgcgc gacttggaag ggttcaaacg accccgccgt acgaactttt gtcggggggc 180
gctcccggAT GGCCGCCGTC ATTGCCAAGT CCTCCGTCTC CGCGGCCGTG GCTCGCCCGG 24 0
CCCGCTCCAG CGTGCGCCCC ATGGCCGCGC TGAAGCCCGC CGTCAAGGCT GCCCCCGTGG 3 00
CTGCCCCGGC TCAGGCCAAC CAGatgtcca ataactcatt cactaacttc aaactggcca 360
ctgaattgcc agcctggtct aagttgcaaa aaatttatga atctcaaggt aagactttgt 420
ctgtcaagca agaattccaa aaagatgcca agcgttttga aaaattgaac aagactttca 480
ccaactatga tggttccaaa atcttgttcg actactcaaa gaacttggtc aacgatgaaa 540
tcattgctgc attgattgaa ctggccaagg aggctaacgt caccggtttg agagatgcta 600
tgttcaaagg tgaacacatc aactccactg aagatcgtgc tgtctaccac gtcgcattga 660
gaaacagagc taacaagcca atgtacgttg atggtgtcaa cgttgctcca gaagtcgact 720
ctgtcttgaa gcacatgaag gagttctctg aacaagttcg ttctggtgaa tggaagggtt 780
ataccggtaa gaagatcacc gatgttgtta acatcggtat tggtggttcc gatttgggtc 840
cagtcatggt cactgaggct ttgaagcact acgctggtgt cttggatgtc cacttcgttt 900
ccaacattga cggtactcac attgctgaaa ccttgaaggt tgttgaccca gaaactactt 960
tgtttttgat tgcttccaag actttcacta ccgctgaaac tatcactaac gctaacactg 1020
ccaagaactg gttcttgtcg aagacaggta atgatccatc tcacattgct aagcatttcg 1080
ctgctttgtc cactaacgaa accgaagttg ccaagttcgg tattgacacc aaaaacatgt 1140
ttggtttcga aagttgggtc ggtggtcgtt actctgtctg gtcggctatt ggtttgtctg 1200
ttgccttgta cattggctat gacaactttg aggctttctt gaagggtgct gaagccgtcg 1260
acaaccactt cacccaaacc ccattggaag acaacattcc attgttgggt ggtttgttgt 1320
ctgtctggta caacaacttc tttggtgctc aaacccattt ggttgctcca ttcgaccaat 1380
acttgcacag attcccagcc tacttgcaac aattgtcaat ggaatctaac ggtaagtctg 1440
ttaccagagg taacgtgttt actgactact ctactggttc tatcttgttt ggtgaaccag 1500
ctaccaacgc tcaacactct ttcttccaat tggttcacca aggtaccaag ttgattccat 1560
ctgatttcat cttagctgct caatctcata acccaattga gaacaaatta catcaaaaga 1620
tgttggcttc aaacttcttt gctcaagctg aagctttaat ggttggtaag gatgaagaac 1680
aagttaaggc tgaaggtgcc actggtggtt tggtcccaca caaggtcttc tcaggtaaca 1740
gaccaactac ctctatcttg gctcaaaaga ttactccagc tactttgggt gctttgattg 1800
cctactacga acatgttact ttcactgaag gtgccatttg gaatatcaac tctttcgacc 1860
aatggggtgt tgaattgggt aaagtcttgg ctaaagtcat cggcaaggaa ttggacaact 1920
cctccaccat ttctacccac gatgcttcta ccaacggttt aatcaatcaa ttcaaggaat 1980
ggatgtgaTA AATGGAGGCG CTCGTTGATC TGAGCCTTGC CCCCTGACGA ACGGCGGTGG 2040
ATGGAAGATA CTGCTCTCAA GTGCTGAAGC GGTAGCTTAG CTCCCCGTTT CGTGCTGATC 2100
AGTCTTTTTC AACACGTAAA AAGCGGAGGA GTTTTGCAAT TTTGTTGGTT GTAACGATCC 2160
TCCGTTGATT TTGGCCTCTT TCTCCATGGG CGGGCTGGGC GTATTTGAAG Cggttctctc 2220
ttctgccgtt a 2231
Последовательность № 34
Пример 34: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт
бутанолдегидрогеназы (1709 по)
agaaaatctg gcaccacacc АТССАААСТС GCCACCCGCA AACCAATGGC ATGGCCGAGC 6 0
GCTGCAACGG TCGCATTGCC AAGATTCTGC GTGCTGAGCG CTTTGTCTCC GCTGCTGATC 120
TGCAAGAGAC GCTCACGCGA TACCTCTGGG CGTGCAATCA CCGCATTCCC CAACGCGCTT 180
TGGGCCACAT GACCCCCATC GAGAGACTCC GAACGTGGCA AATGGAGGGA CCAGAGTTGT 240
TCAGTTCACA GGTAGATAAT GTCGCGGGTC TTGATAGTTA GCAATAAATA CAGTTTCAGA 300
ATATCTGTAA TACAAAAACT GTATCGAGAC AAGAAAAAAG TAGCAAAATT TACAAATGTT 360
CATGATTCAT CTGGCTAAAT TGGATGTTCA ACTGACCCAT TGAAGACAAG GGCAACAACC 42 0
atggagaatt ttagatttaa tgcatataca gagatgcttt ttggaaaggg acaaatagag 480
aagcttccag aggttttaaa aagatatggt aaaaatatat tacttgcata tggtggtgga 540
agtataaaaa agaatggact ctatgatact atccaaaagc tattgaaaga ttttaatatt 600
gttgaattaa gtggtattga accaaatcca agaattgaaa ctgtaagacg tggagttgaa 660
ctttgcagaa aaaataaagt agatgttatt ttagctgttg gtggagggag tacaatagac 720
tgctcaaagg ttataggggc aggttattat tatgctggag atgcatggga ccttgtaaaa 780
aatccagcta aaataggtga ggttttacca atagtgacag ttttaacaat ggcagctact 840
ggttctgaaa tgaatagaaa tgctgttatt tcaaagatgg atacaaatga aaagcttgga 900
acaggatcac ctaagatgat ccctcaaact tctattttag atccagaata tttgtataca 960
ttgccagcaa ttcaaacagc tgcaggttgt gctgatatta tgtcacacat atttgaacaa 1020
tattttaata aaactacaga tgcttttgta caagataaat ttgcggaagg tttgttgcaa 1080
acttgtataa aatattgccc tgttgcttta aaggaaccaa agaattatga agctagagca 1140
aatataatgt gggctagttc aatggctctt aacggacttt taggaagtgg gaaagctgga 1200
gcttggactt gtcatccaat agaacatgaa ttaagtgcat tttatgatat aactcatgga 1260
gtaggtcttg caattttaac tccaagttgg atgagatata tcttaagtga tgtaacagtt 1320
gataagtttg ttaacgtatg gcatttagaa caaaaagaag ataaatttgc tcttgcaaat 1380
gaagcaatag atgcaacaga aaaattcttt aaagcttgtg gtattccaat gactttaact 1440
gaacttggaa tagataaagc aaactttgaa aagatggcaa aagctgcagt agaacatggt 1500
gctttagaat atgcatatgt ttcattaaat gccgaggatg tatataaaat tttagaaatg 1560
tCCCtttaaT AAGGCTGAGA TCTTCTTCAG TGCATTGTAG TTGAATGAAG GGTTAGGGGG 1620
GAAATGCCCC CCTATTTTTT GTCTAGCCAT CCTGCCACGT TTGACAGGGT AGCAATTTCG 16 80
ACACGATAGg gttctctctt ctgccgtta 1709
Последовательность № 35
Пример 35: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт бутиральдегиддегидрогеназы (1967 по)
agaaaatctg gcaccacacc АТССАААСТС GCCACCCGCA AACCAATGGC ATGGCCGAGC 60 GCTGCAACGG TCGCATTGCC AAGATTCTGC GTGCTGAGCG CTTTGTCTCC GCTGCTGATC 120 TGCAAGAGAC GCTCACGCGA TACCTCTGGG CGTGCAATCA CCGCATTCCC CAACGCGCTT 180
TGGGCCACAT GACCCCCATC GAGAGACTCC GAACGTGGCA AATGGAGGGA CCAGAGTTGT 24 0
TCAGTTCACA GGTAGATAAT GTCGCGGGTC TTGATAGTTA GCAATAAATA CAGTTTCAGA 300
ATATCTGTAA TACAAAiVACT GTATCGAGAC AAGAAAAAAG TAGCAAAATT TACAAATGTT 360
CATGATTCAT CTGGCTJVWT TGGATGTTCA ACTGACCCAT TGAAGACAAG GGCAACAACC 420
atgattaaag acacgctagt ttctataaca aaagatttaa aattaaaaac aaatgttgaa 480
aatgccaatc taaagaacta caaggatgat tcttcatgtt tcggagtttt cgaaaatgtt 540
gaaaatgcta taagcaatgc cgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 600
gaacaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattagaaaa taaagagatt 660
ctagctacaa tgattc;tga agaaacacat atgggaagat atgaagataa aatattaaag 720
catgaattag tagctaaata cactcctggg acagaagatt taactactac tgcttggtca 780
ggagataacg ggcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gcgttatagg tgcaataact 840
ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagta taggcatgat agctgctgga 900
aatactgtgg tatttaacgg acatccaggc gctaaaaaat gtgttgcttt tgctgtcgaa 960
atgataaata aagcta:tat ttcatgtggt ggtcctgaga atttagtaac aactataaaa 1020
aatccaacta tggactctct agatgcaatt attaagcacc cttcaataaa actactttgc 1080
ggaactggag ggccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 1140
gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 1200
aagagtatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 1260
gtatttgttt ttgagaacgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 1320
gtaattataa atgaagatca agtatcaaag ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 1380
gaaactcaag aatactctat aaataagaaa tgggtcggaa aagatgcaaa attattctta 1440
gatgaaatag atgttgagtc tccttcaagt gttaaatgca taatctgcga agtaagtgca 1500
aggcatccat ttgttargac agaactcatg atgccaatat taccaattgt aagagttaaa 1560
gatatagatg aagctaitga atatgcaaaa atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1620
tatatttatt caaaaaatat agacaaccta aataggtttg aaagagaaat cgatactact 1680
atctttgtaa agaatgctaa atcttttgcc ggtgttggtt atgaagcaga aggctttaca 1740
actttcacta ttgctggatc cactggtgaa ggaataactt ctgcaagaaa ttttacaaga 1800
caaagaagat gtgtactcgc cggttaaTAA GGCTGAGATC TTCTTCAGTG CATTGTAGTT 1860
GAATGAAGGG TTAGGGGGGA AATGCCCCCC TATTTTTTGT CTAGCCATCC TGCCACGTTT 1920 GACAGGGTAG CAATTTCGAC ACGATAGggt tctctcttct gccgtta 1967
Последовательность № 36
Пример 36: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт бутирил-КоА-дегидрогеназы (1602 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 6 0
AATCACCGCA TTCCCCAACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 12 0
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 18 0
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 240
AAAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 3 00
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCatgaa tttccaatta actagagaac aacaattagt 360
acaacaaatg gttagagaat tcgcagtaaa tgaagttaag ccaatagctg ctgaaatcga 42 0
cgaaacagaa agattcecta tggaaaacgt tgaaaaaatg gctaagctta aaatgatggg 480
tatcccattt tctaaagaat ttggtggagc aggcggagat gttctttcat atataatagc 540
tgtggaagaa ttatcaaaag tttgtggtac tacaggagtt attctttcag cgcatacatc 600
attatgtgca tcagtaatta atgaaaatgg aactaacgaa caaagagcaa aatatttacc 660
tgatctttgc agcggtaaaa agatcggtgc tttcggatta actgaaccag gtgctggtac 720
agatgctgca ggacaacaaa caactgctgt attagaaggg gatcattatg tattaaatgg 780
ttcaaaaatc ttcataacaa atggtggagt tgctgaaact ttcataatat ttgctatgac 840
agataagagt caaggaacaa aaggaatttc tgcattcata gtagaaaagt cattcccagg 900
attctcaata ggaaaattag aaaataagat ggggatcaga gcatcttcaa ctactgagtt 960
agttatggaa aactgcatag taccaaaaga aaacctactt agcaaagaag gtaagggatt 1020
¦cggtatagca atgaaaactc ttgatggagg aagaattggt atagctgctc aagctttagg 1080
cattgcagaa ggagcttttg aagaagctgt taactatatg aaagaaagaa aacaatttgg 1140
;aaaccatta tcagcattcc aaggattaca atggtatata gctgaaatgg atgttaaaat 1200
ccaagctgct aaatacttag tatacctagc tgcaacaaag aagcaagctg gtgagcctta 1260
ctcagtagat gctgcaagag ctaaattatt tgctgcagat gttgcaatgg aagttacaac 1320
raaagcagtt caaatctttg gtggatatgg ttacactaaa gaatacccag tagaaagaat 13 8 0
gatgagagat gctaaaatat gcgaaatcta cgaaggaact tcagaagttc aaaagatggt 1440
;atcgcagga agcattttaa gaTAAGGCTG AGATCTTCTT CAGTGCATTG TAGTTGAATG 1500
AAGGGTTAGG GGGGAAATGC CCCCCTATTT TTTGTCTAGC CATCCTGCCA CGTTTGACAG 1560
GGTAGCAATT TCGACACGAT AGggttctct cttctgccgt ta 1602
Последовательность № 37
Пример 37: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт
кротоназы (1248 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 6 0
AATCACCGCA TTCCCCAACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 120
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 180
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 24 0
.AAAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 3 00
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCatgga attaaaaaat gttattcttg aaaaagaagg 360
gcatttagct attgttacaa tcaatagacc aaaggcatta aatgcattga attcagaaac 420
actaaaagat ttaaatgttg ttttagatga tttagaagca gacaacaatg tgtatgcagt 480
tatagttact ggtgctggtg agaaatcttt tgttgctgga gcagatattt cagaaatgaa 540
agatcttaat gaagaacaag gtaaagaatt tggtatttta ggaaataatg tcttcagaag 600
attagaaaaa ttggataagc cagttatcgc agctatatca ggatttgctc ttggtggtgg 660
atgtgaactt gctatgtcat gtgacataag aatagcttca gttaaagcta aatttggtca 720
accagaagca ggacttggaa taactccagg atttggtgga actcaaagat tagcaagaat 780
agttggacca ggaaaagcta aagaattaat ttatacttgt gaccttataa atgcagaaga 840
agcttataga ataggcttag ttaataaagt agttgaatta gaaaaattga tggaagaagc 900
aaaagcaatg gctaacaaga ttgcagctaa tgctccaaaa gcagttgcat attgtaaaga 960
tgctatagac agaggaatgc aagttgatat agatgcagct atattaatag aagcagaaga 1020
ctttgggaag tgctttgcaa cagaagatca aacagaagga atgactgcgt tcttagaaag 1080
aagagcagaa aagaattttc aaaataaaTA AGGCTGAGAT CTTCTTCAGT GCATTGTAGT 1140
TGAATGAAGG GTTAGGGGGG AAATGCCCCC CTATTTTTTG TCTAGCCATC CTGCCACGTT 120 0
TGACAGGGTA GCAATTTCGA CACGATAGgg ttctctcttc tgccgtta 1248
Последовательность № 38
Пример 38: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт
3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (1311 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 60
AATCACCGCA TTCCCCAACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 120
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 180
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 24 0
AAAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 3 00
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCatgaa aaagattttt gtacttggag caggaactat 360
gggtgctggt atcgttcaag cattcgctca aaaaggttgt gaggtaattg taagagacat 420
aaaggaagaa tttgttgaca gaggaatagc tggaatcact aaaggattag aaaagcaagt 480
tgctaaagga aaaatgtctg aagaagataa agaagctata ctttcaagaa tttcaggaac 540
aactgatatg aagttagctg ctgactgtga tttagtagtt gaagctgcaa tcgaaaacat 600
gaaaattaag aaggaaatct ttgctgagtt agatggaatt tgtaagccag aagcgatttt 660
agcttcaaac acttcatctt tatcaattac tgaagttgct tcagctacaa agagacctga 720
taaagttatc ggaatgcatt tctttaatcc agctccagta atgaagcttg ttgaaattat 780
taaaggaata gctacttctc aagaaacttt tgatgctgtt aaggaattat cagttgctat 840
tggaaaagaa ccagtagaag ttgcagaagc tccaggattc gttgtaaacg gaatcttaat 900
cccaatgatt aacgaagctt cattcatcct tcaagaagga atagcttcag ttgaagatat 960
tgatacagct atgaaatatg gtgctaacca tccaatggga cctttagctt taggagatct 1020
tattggatta gatgtttgct tagctatcat ggatgtttta ttcactgaaa caggtgataa 1080
caagtacaga gctagcagca tattaagaaa atatgttaga gctggatggc ttggaagaaa 1140
atcaggaaaa ggattctatg attattctaa aTAAGGCTGA GATCTTCTTC AGTGCATTGT 1200
AGTTGAATGA AGGGTTAGGG GGGAAATGCC CCCCTATTTT TTGTCTAGCC ATCCTGCCAC 1260
GTTTGACAGG GTAGCAATTT CGACACGATA Gggttctctc ttctgccgtt a 1311
Последовательность № 39
Пример 39: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт
тиолазы (1665 по)
agaaaatctg gcaccs.cacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 6 0
AATCACCGCA TTCCCCAACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 12 0
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 180
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 24 0
AAAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 3 00
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCatggg caaagaaagt agttttagct gtgcatgtcg 360
tacagccatc ggaacaatgg gtggatctct tagcacaatt cctgcagtag atttaggtgc 420
tatcgttatc aaagaggctc ttaaccgcgc aggtgttaaa cctgaagatg ttgatcacgt 480
atacatggga tgcgttattc aggcaggaca gggacagaac gttgctcgtc aggcttctat 540
caaggctggt cttcctgtag aagtacctgc agttacaact aacgttgtat gtggttcagg 600
tcttaactgt gttaaccagg cagctcagat gatcatggct ggagatgctg atatcgttgt 660
tgccggtggt atggaaaaca tgtcacttgc accatttgca cttcctaatg gccgttacgg 720
atatcgtatg atgtggccaa gccagagcca gggtggtctt gtagacacta tggttaagga 780
tgctctttgg gatgctttca atgattatca tatgatccag acagcagaca acatctgcac 840
agagtggggt cttacacgtg aagagctcga tgagtttgca gctaagagcc agaacaaggc 900
ttgtgcagca atcgaagctg gcgcattcaa ggatgagatc gttcctgtag agatcaagaa 960
gaagaaagag acagttatct tcgatacaga tgaaggccca agacagggtg ttacacctga 1020
atctctttca aagcttcgtc ctatcaacaa ggatggattc gttacagctg gtaacgcttc 1080
aggtatcaac gacggtgctg cagcactcgt agttatgtct gaagagaagg ctaaggagct 1140
cggcgttaag cctatggcta cattcgtagc tggagcactt gctggtgttc gtcctgaagt 1200
tatgggtatc ggtcctgtag cagctactca gaaggctatg aagaaggctg gtatcgagaa 126 0
cgtatctgag ttcga;atca tcgaggctaa cgaagcattc gcagctcagt ctgtagcagt 1320
tggtaaggat cttggaatcg acgtccacaa gcagctcaat cctaacggtg gtgctatcgc 1380
tcttggacac ccagt:ggag cttcaggtgc tcgtatcctt gttacacttc ttcacgagat 1440
gcagaagaaa gacgctaaga agggtcttgc tacactttgc atcggtggcg gtatgggatg 1500
cgctactatc gttgagaagt acgaaTAAGG CTGAGATCTT CTTCAGTGCA TTGTAGTTGA 1560
ATGAAGGGTT AGGGGGGAAA TGCCCCCCTA TTTTTTGTCT AGCCATCCTG CCACGTTTGA 1620
CAGGGTAGCA ATTTCGACAC GATAGggttc tctcttctgc cgtta 1665
Последовательность № 40
Пример 40: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт
пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы (4071 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 60
AATCACCGCA TTCCCCAACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 120
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 180
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 240
iWAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 3 00
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCatggc gcagaggtgc aaggagcccg tcgacggaac 3 60
gacagccacg acgcacgtgg cctacttcat gagcgacagc gcgttcatct tccccatcac 420
gcccagctcg gtcatgtccg aggtcgccca cgagtggtcc atgaacggcc gcaagaacgc 480
cttcggccag cccacgatgg tccgccagat gcagagcgag gctgggtctg ccggcgccct 540
gcacggcgcg ctcagcgagg gagcgctggc gacgacgttc acgagcagcc agggcctgct 600
gctcatgatc cccaacatgt acaagatcgc cggcgagctc ctgccctgcg tcatgcacat 660
cgccgcccgc accgtcgcca ccgaggccct ctctatcttc ggcgaccaca cggatgtcta 720
cgcggtgagg tcgacggggt tcgcgttcct gtgctccgcg accgtccagg agtgcatcca 780
catgtccgcc gccgcgcacg ccgccaccct gtccagcgag gtcccgttcg cccacttctt 840
cgacggcttc cgcacgtccc acgagatcca gaagatcgac ttcccctcgg acgccgacct 900
gctggcctgc atgaactttg acgacgtccg caggttccgt ggccgctcgc tgtgctgcga 960
gcgcccgctg ctgcgcggga cggcgcagaa ccccgacgtc ttcatgcagg cgtccgagtc 1020
gaacctggcg acgctggcca gggtccccgc ggccatcgac gaggcgctgg ctcgtgtgaa 1080
caaggtgttc gggaccaact acaggaccta cgagtactat ggccaccccg aggccacgga 1140
cgtgatcgtg gccatgggaa gcggcaccga agtggccatc tcgactgcca acttcctcaa 1200
ctcgcgcgac gcgaactcga gggtcggcgt cgtgagggtg cggctgttcc ggccgtttgt 1260
gtcggcggcg tttgtggctg cgctgcccaa gaccgtcaag aggatctgcg ttctggaccg 1320
cgggagggac gggcaggcgg ccgcggaccc cctgcaccag gacgtcctgt cggcgctggg 1380
tctggcagcg cccgggaggg ttcaggtgtg cgtgggaggc gtgtacggtc tgtcgtccaa 1440
ggacttcaac cccgaccacg tgatcgccgt gtacaggaac ctcgcgtcgg cgagccccaa 1500
gaacaggttc agcgtcggca tcgtcgacga cgtgacgcac aacagcctgg acatgggaga 1560
gcacgtggac gcgctgccgc aggggacgaa gcagtgcctg ctgtggggca tcggcggaga 1620
cgggaccatc ggggcgaaca agacggccat caagctgatc gcggaccaca cggagctgca 1680
cgcgcagggg tactttgcgt acgacgccaa caaggccggc ggcctgacag tctcgcacct 1740
gcggttcggc ccgacgcggt tcgaggcgcc gtacctggtg aacgacagca actacgtggc 1800
gtgccacaac ttctcgtacg tgcacaggtt caacctgctg tcgtcgctgc gcaccggggg 1860
cacgttcgtg ctcaactgcc cgtgccggac cgtggaggag ctggacacgg cactcccggt 1920
gcgcctgagg cgcgagatcg ccaggcggca ggccaagttc tatgtgatcg acgcgaccaa 1980
gatcgccaag gacaacggga tgggcccgtt catcaacatg gtcctccagg ccgtgttctt 2040
ctatctgtcc cacgtgctcg atgtgaacga ggcagtggca ctcctgaaga agagcatcca 2100
gaagatgtac gcgcgcaagg gcgaggaggt tgtcaggaag aacgtggcat cggtcgacgc 2160
gtcgctggat cccaaggcgt tgctgcacat cgagtacccc gcagacaggt ggcttgcgct 2220
ggccgacgag cacgtgcccc gcatgggtct gctcactgtc cccgagcgcc tgcagaagtt 2280
caacgccgag ctgtacgagc cgaccctcgc gtacgatggg gagagcatcc cggtcagcag 2340
gttccctcgc ggcggcgaga cgccgacggg cacgactcag ctgggcaagc gtggcatcgc 2400
cgagagcgtg ccgcactgga accacgagaa gtgcgtgcag tgcaaccagt gctcgttcgt 2460
gtgcccgcac gccgtcatcc ggtcgtacca gatcagcgag gaggagatga agaacgcccc 2520
tgccggcttc gacactctta agtcgcgcaa gcccgggtat cgtttccgca tcaacgtcag 2580
cgccctggac tgcactggct gcagcgtgtg cgtggagcag tgcccagtca agtgcctgga 2640
gatgaagcct ctcgagtccg agttcgagat gcagaaggac gccatcaggt tcgtccgcga 2700
gatggtcgcg cccaageccg agctgggaga ccgcaagact cccgtcggca tcgcgtctca 2760
cacgccgctg ttcgagttcc cgggagcctg cgccgggtgc ggtgagaccc cgctggtgcg 2820
cctcgtgacg cagatgttcg gtgagcgcat ggtcatcgcc gcggccactg ggtgcaactc 2880
gatctgggga gcgtcgttcc cgaacgtgcc gtacacaacc aacgcccgcg gggagggccc 2940
cgcgtggcac aactcgctgt tcgaggacgc ggcggagctc gggtatggca ttacgtgtgc . 3000
gtatcgccag cgccgcgagc gcctcatcgg catcgtgcgg agcgtcgtcg acgatgcggg 3060
atccgtgcag ggtctgtctg ctgagctgaa ggctctgctg gtcgagtggc tcgcgcacgt 3120
cagggacttc gagaagaccc gcgagctccg cgacaggatg aaccccctga tcgacgcaat 3180
cccagcgaac gcggactgca gggttctgga gctcagggag aagcacaacc gcgagctgat 3240
cgcgcgcacg agtttctgga tcctcggtgg cgacgggtgg gcgtacgaca tcggcttcgg 3300
-ggactggac cacgtgatcg ccaacaacga ggacgtcaac atccttgttc tcgacacgga 3360
ggtctactcc aacactggtg gccagcgctc caagtcgacg ccgctcggcg cccgcgccaa 3420
gtacgctgtg ctgggcaagg acactgggaa gaaggacctg gggcgcatcg cgatgaccta 3480
cgagaccgcg tacgtggcca gcatcgcgca gggagccaac cagcagcagt gcatggacgc 3540
gctgagggag gccgaggcct accagggccc ctcgatcgtc attgcgtaca ctccgtgcat 3600
ggagcaccag atggtccgcg ggatgaagga gagccagaag aaccagaagc tggctgtgga 3660
gacgggctac tggctgctgt accgcttcaa ccccgacctc atccacgagg gcaagaaccc 3720
cttcaccctc gactcgaagc ctccctcgaa gcctcccaag gagttcctgg acacgcaggg 3780
ccgtttcatt actctgcagc gcgagcaccc cgagcaggcc cacctccttc acgaggcact 3840
cacccgctct ctggccci.ccc gcttcgtgcg ctaccagcgc ctcgtgcagc tgtacgagcc 3900
cgctgcccct gccgcagctc ctgccacgca tTAAGGCTGA GATCTTCTTC AGTGCATTGT 3 960
AGTTGAATGA AGGGTTAGGG GGGAAATGCC CCCCTATTTT TTGTCTAGCC ATCCTGCCAC 402 0
GTTTGACAGG GTAGCAATTT CGACACGATA GggttCtCtC ttctgccgtt a 4071
Последовательность № 41
Пример 41: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт пируваткиназы (1806 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 60
AATCACCGCA TTCCCCAACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 12 0
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 18 0
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 24 0
AAAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 3 00
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCgtgtt cactaaaatt gtagctacat tggggccttc 360
gactgataga ctgccggata taacggccct gttgagcaag gttcacggcg tgcggataaa 420
tatgtctcac gcatcgccat cggaggtaga ggcccgcgtg aacgccgtga ggaagtatga 480
ggagaccagc gggaggtata tagccattat agcggatcta aggggcccca gcgtcaggac 540
cggccttatg cgccctctac agataacggc gggcgcccgc gtctccttta aattagccga 600
gaagggggac ggcttcgtac ctgtgccgcg gcgtgagttc ttcgaagtaa tcgaggaggg 660
agacgaggtt cttatgttag acggaaaact cgtcttgagg ataatcagcg cagcgcagac 720
ctcggccgag gccgagtcgt tatcctccgg cgtcatatcc agcaataagg caatagtggt 780
caaaggcaag gaatatcata tagagcagcc tgtggaggaa gacataaggg cgcttcagac 840
gctctctcgg ttcagagacg acgtagacta cgtggccctc agccttgtga gagacggagc 900
agacgtgagg aaaatgagga gcgtcgtcga ggaggctggg ctcacctccg gcataatggc 960
caaaatagag acgaagagcg cagtagataa aatcgaggag ataatcaatg cggccgacta 1020
catagttata gcgagaggcg atctggcgct gcactacgga ctggagtaca ttcctaaagt 1080
acagaggctc ttggtggaga gatctctctc ggcaggaagg cccgtggcgg tggccacgca 1140
gcttttggac tctatgcaga ccaacacgac gcccactagg gcggaggtca acgacgtgta 1200
cacaacggcg agtctcggag tggactctct gtggctgacc aacgagactg cgagcggaga 1260
gcacccgtta gaggcagtgg attggctgag gaggatagtg tcgcaggtcg agttcgggag 1320
acttaaggct gcgtcgccgg ccgacgcacg cgataggttc gccaaagccg tggtagatat 1380
ggccgaggac atgggagggg aaatcgcagt atactcaatg acgggaactc tggcgaagag 1440
aatagctaaa tttaggccga tgacgacagt ctacgtcgga gtcaacgaga ggaggctcgc 1500
gaggatgttg gagctccgcg aggatgttgg agctcatatg gggcctagag cctgtggtcg 1560
;gccggcgca tacttacgag gagggcctcg agaggctcct ctccagattc tccgacaaag 1620
tcttgatagc cacgtatggg ctcagaggcg gcacacatac tattaaTAAG GCTGAGATCT 16 80
TCTTCAGTGC ATTGTAGTTG AATGAAGGGT TAGGGGGGAA ATGCCCCCCT ATTTTTTGTC 1740
TAGCCATCCT GCCACGTTTG ACAGGGTAGC AATTTCGACA CGATAGggtt ctctcttctg 1800
ccgtta 1806
Последовательность № 42
Пример 42: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт
энолазы (1696 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGACCCCCAT CGAGAGACTC CGAACGTGGC AAATGGAGGG 6 0
ACCAGAGTTG TTCAGTTCAC AGGTAGATAA TGTCGCGGGT CTTGATAGTT AGCAATAAAT 12 0
ACAGTTTCAG AATATCTGTA ATACAAAAAC TGTATCGAGA CAAGAAAAAA GTAGCAAAAT 18 0
TTACAAATGT TCATGATTCA TCTGGCTAAA TTGGATGTTC AACTGACCCA TTGAAGACAA 240
GGGCAACAAC Cttatt-ttt cttcaagtta aagaatgcgt tcattccagg ataaacggca 300
atgctgccaa gctcttcttc aattctcaag agctgattgt attttgctac tctgtctgtt 360
cttgacggtg cacctgcctt tatctgacca gcatttactg caacaacaag gtcagcaatt 420
gttgtatctt cagtctcacc tgatctgtgg gatacaactg cagtgtagcc tgctctattt 480
gccatttcaa tagcttctaa agtttctgta agtgttccta tctgattaag cttaatcaat 540
attgagtttg caacgccaag ttctattccc tttgcaagcc tctttgtgtt tgtaacaaac 600
aaatcatcac ccacaagctg aatcttcttg ccaagtgctt cagttagcat cttccagcct 660
tcccagtcct cttctgcaac accgtcttca attgatacaa ttgggtactt ttcaacaagt 720
tttacccaga attctaccat ttcttctttt gttctaactt taccttctct ttcgaaatga 780
tactttccat cttcttcatt gtagagctca gatgttgcag ggtcaagcgc aattgcaata 840
tccttaccag gagtataacc agctttttca attgcttcga caattacttc caatggctct 900
tcgttagact tcaagtttgg tgcaaatcca ccttcatcac ccactgttgt gttgtatcct 960
cttgccttca atacatttct taattgatgg aatgtctcag cacacatcct gagtgcttcg 1020
ctaaaagatt ttgcaceaac tggcattatc ataaactctt gtaggtcaac agagttgtca 1080
gcatgctttc caccgttcaa aatattcatc attggcacag gtaaatactt tgcattgaca 1140
ccaccaatgt attggtacag tggaagacca agtgcgtttg ccgctgcctt cgcaactgcc 1200
aaagatacac ccaaaattgc atttgcacca agcttgctct tgttctctgt cccatcaagc 1260
ccaatcataa gcctgtcaat ctcaacttgg ttaagagcgt tcattccaat tatttctggc 1320
gcaataacct cgtttacatt ttcgactgct ttgagaaccc cttttcccat atatcttttt 1380
ttatcaccgt ctctgagttc aacagcctcg aacatacctg ttgacgcacc tgatggaaca 1440
gcagctctac ctacaaattc atcatttaca acaacttcta cttcaacagt tgggtttcct 1500
cttgaatcca gaatttctct tgcttttaca gctgtaattg aaagatcaac cttcatTAAG 1560
GCTGAGATCT TCTTCAGTGC ATTGTAGTTG AATGAAGGGT TAGGGGGGAA ATGCCCCCCT 1620
ATTTTTTGTC TAGCCATCCT GCCACGTTTG ACAGGGTAGC AATTTCGACA CGATAGggtt 16 80
ctctcttctg ccgtta 1696
Последовательность № 43
Пример 43: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы (2029 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGACCCCCAT CGAGAGACTC CGAACGTGGC AAATGGAGGG 60
ACCAGAGTTG TTCAGTTCAC AGGTAGATAA TGTCGCGGGT CTTGATAGTT AGCAATAAAT 120
ACAGTTTCAG AATATCTGTA ATACAAAAAC TGTATCGAGA CAAGAAAAAA GTAGCAAAAT 18 0
TTACAAATGT TCATGATTCA TCTGGCTAAA TTGGATGTTC AACTGACCCA TTGAAGACAA 24 0
GGGCAACAAC Cctacgccgg cgcctgcttc tcctcctgcc ggcagcactt ctccaaaggg 300
tgcacgttcg cttctcttgt aatcagggtc tggccggtca tctcggccgg tttcgggatg 360
cccagcaggt gcaggatggt gggggccaca tcccgcaggc tgccgtcccg cagcgcaatg 420
ccggcggtat cccgcccgat caggatgaac ggcaccgggc tggtggtgtg ggccgtatga 480
ggctgtccct cttcgtccac catctcatcc gcattgccgt ggtctgccgt tatcaggagc 540
gtgccgtcct tttccaggac ggcccgcgcc acctttccaa ggcagcggtc gattgtttct 600
atggccttta ccgttgcctt catgtcgccg gtatgcccga ccatgtcggg attggcgtaa 660
ttcattatga ttacgtcgta cttgcccgag gccagccgct ccagaaaggt gccggtgacc 720
tcgttggcgc tcatttcggg cttcaggtcg taggtggcca cccgcgggga gggcaccagg 780
atcctgtctt cgccggggta tggcttttct aagccgccgt tgaagaagaa ggtcacatgg 840
gcgtactttt ccgtttcggc caggcggagc tgggtcatgc cgtgcctgct taaaacctcg 900
cccagggtat tgcgcagctc ctgcggctga aacgccaccg gcgccttaat ggtcttgtcg 960
taaagggtca tgcagg~aaa atgcacggca gggtagccct gctttctggc aaacccggtg 1020
aaatcctcgt ccacaaaggc cctggtaatc tggcgggccc ggtccggccg gaagttaaag 1080
aaaataacgg cgtcgccctt cattattttg gcggccggcc cacccgaccc gtttaccacg 1140
acggtgggct ggataaactc gtcggtttca tcccttccgt accccaggtc aaccgcctcc 1200
agcgggcttg ttgcctgaat gccctcgcct aaaaccattg cgttgtacgc ccgctcggtg 1260
cggtcccagc ggcggtctct gtccatggcg taatagcgcc ccattaccgt tgccaccgcc 1320
ccaaagccca gttcgcccag cttcttcctt aactgctcga agtattcttt tgcgttggcc 1380
ggcggcacgt cgcgcccgtc caggaaggca tggacaaaga cgttgcgcat gttctcgcgg 1440
gcggccaggt ccaggagggc gaaaaggtgg ctgatatggc tgtgcactcc gccgtccgat 1500
aaaagcccca tcaggtgaag ggccttatta ttctccctgg cgtatctcac cgcctccagc 1560
aggacttcgt tcttgaaaaa ggtcccgtcc ttgatggcgc ggcttattct ggtaagctcc 1620
tggtacacca ccctgccggc gcctatgttc aagtgtccca cctcggaatt gcccatctgg 1680
ccctcgggaa gccccacgtc ctcgccggaa cagctcaggg cacagtgggg gtaaccggcc 1740
agaaagctct tgaaattcgg tgtgctggcc agggctatgg cattgccccg gacattggaa 1800
ctgaggcccc agccgtccag aaccaccagc accaggggcc tgccgccggc ataccggccg 1860
cagggcgttg cagctacgtc ttccttcaaT AAGGCTGAGA TCTTCTTCAG TGCATTGTAG 1920
TTGAATGAAG GGTTAGGGGG GAAATGCCCC CCTATTTTTT GTCTAGCCAT CCTGCCACGT 1980
TTGACAGGGT AGCAATTTCG ACACGATAGg gttctctctt ctgccgtta 2029
Последовательность № 44
Пример 44: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт фосфоглицераткиназы (1687 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGACCCCCAT CGAGAGACTC CGAACGTGGC AAATGGAGGG 60
ACCAGAGTTG TTCAGTTCAC AGGTAGATAA TGTCGCGGGT CTTGATAGTT AGCAATAAAT 12 0
ACAGTTTCAG AATATCTGTA ATACAAAAAC TGTATCGAGA CAAGAAAAAA GTAGCAAAAT 180
TTACAAATGT TCATGATTCA TCTGGCTAAA TTGGATGTTC AACTGACCCA TTGAAGACAA 24 0
GGGCAACAAC Cttatttatc gagcagcgcc cttactcccg gcagttgctt cccttccaga 300
aactccaggg aagcgccgcc gccggttgag atatgggtca ttttgccggc tacgccggcc 360
ttcttggccg ccgccgccgt gtcaccgccg ccgattacgg tgacggcgtt taattcggcc 420
agcgtccggg ctattgcttc ggtgcccctg gcaaaaggat ccatttcaaa aacgcccatt 480
ggtccgttcc agaccacggt cctggccgcc ctgagggctt cggtgaaaag tctgatggac 540
tcgggcccta tatccagggc catccactcc gccgggattt gatcgaccgg caccgtcctt 600
tgctcctggc cgggcgocgg ccccggcgcc accaccacat ccaccggcag gaggagcttt 660
acttccctgc ttctggcttc tgcaatcagc ttcctggcca ggtcaatctt gtcggcctcc 720
agcagggact taccgaogct gtacccttgt gccttcagaa aggtattggc catcccgccg 780
ccaatgataa ccgtatogac tttggtcagc aggttgaaaa ttactcccag cttgtcggaa 840
actttcgagc cgcccacgac ggctgcaaaa gggcgctccg ggctggtcag cagcctgccc 900
agtatttcca gctctttttc catcagcagg cctgccacgg ccggcaaaaa cccggcaacg 960
ccctcggtgg aggcgtgggc ccggtgtgcg gttccaaacg catcgtttac aaagacatct 1020
gccagctcag ccagttgccg ggcaaacttc tcgtcgtttt tctcctcctc cgggtggaaa 1080
cggacgtttt ccagcagcac cacgtccccg tcctgcatct gggcaacggc ggacctggcg 1140
gcttctccca cgcagtcgcc ggccttaacc accgttttcc ccagcagttc ggaaaggcgc 1200
ctggcaacgg gatccatttt gtacctctcg tccaccctgc ccttgggccg gcccaggtgc 1260
gaaaccagaa taaccctggc tttttgtccg ataaggtagt ttatggtggg cacggcctcc 1320
tttattttaa cgtcatcggc cacccggccg ttttccatcg gcacgttgaa gtccacccgc 1380
aacaggaccc gcttgccctt tacatctata tcccttaccg tttttttggc cacTAAGGCT 1440
GAGATCTTCT TCAGTGCATT GTAGTTGAAT GAAGGGTTAG GGGGGAAATG CCCCCCTATT 15 00
TTTTGTCTAG CCATCCTGCC ACGTTTGACA GGGTAGCAAT TTCGACACGA TAGCGTGCTG 156 0
TACTGTTTTT TGCTCGTCAG GGTTGGGTTT TGTCATCGAC ACCCAAGGAT TGGAGTCGGT 1620
GCTCAATAAT CGCCAGTTGC TGTTGGGCAG CCGCCAATTG CGCCTGAggt tctctcttct 1680
gccgtta 1687
Последовательность № 45
Пример: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1514 по)
agaaaatctg gcaccacacc TGATCTGCAA GAGACGCTCA CGCGATACCT CTGGGCGTGC 60
AATCACCGCA TTCCCCi^ACG CGCTTTGGGC CACATGACCC CCATCGAGAG ACTCCGAACG 12 0
TGGCAAATGG AGGGACCAGA GTTGTTCAGT TCACAGGTAG ATAATGTCGC GGGTCTTGAT 180
AGTTAGCAAT AAATACAGTT TCAGAATATC TGTAATACAA AAACTGTATC GAGACAAGAA 24 0
AAAAGTAGCA AAATTTACAA ATGTTCATGA TTCATCTGGC TAAATTGGAT GTTCAACTGA 300
CCCATTGAAG ACAAGGGCAA CAACCaatgg atttgggcgg atcggacgtt tagcattcag 360
aagaattcaa gatgtagaag gtcttgaagt agttgcagtt aacgacttaa cagatgacga 420
-atgttagct catttattaa aatacgatac tatgcaaggt cgtttcactg gagaagttga 480
agttatcgaa ggtggattcc gtgttaacgt aaaagaaatt aaatcattcg atgaccagat 540
gctgggtaaa ttaccatggg gcgatttaga tatcgacgta gtattagaat gtactggttt 600
ctatactgat aaagaaaaag cacaagctca catcgatgca ggtgctaaaa aagtattaat 660
ctcagctcca gctaaaggtg atgtaaaaac aatcgtattc aacactaacc atgacgcatt 720
agacggttca gaaacagttg tttcaggtgc ttcttgtact actaactcat tagcaccagt 780
tgcaaaagtt ttaagtgatg aattcggttt agttgaaggt ttcatgacta caattcacgc 840
ttacactggt gaccaaaata cacaagacgc acctcacaga aaaggtgaca aacgtcgtgc 900
acgtgcagca gcagaaaata ttatccctaa ctcaacaggt gctgctaaag ctatcggtaa 960
agttattcca gaaatcgatg gtaaattaga cggtggagca caacgtgttc cagttgctac 1020
tgggtcttta actgaattaa ctgtagtatt agacaaacaa gatgtaactg ttgaccaagt 1080
taacagtgct atgaaacaag cttcagacga atcattcggt tacactgaag acgaaatcgt 1140
atcttctgat atcgttggta tgacttacgg ttcattattc gatgcgactc aaactcgtgt 1200
tatgactgtt ggagatcgtc aattagttaa agttgcagct tggtacgaca aagagtgggg 1260
TAAGGCTGAG ATCTTCTTCA GTGCATTGTA GTTGAATGAA GGGTTAGGGG GGAAATGCCC 1320
CCCTATTTTT TGTCTAGCCA TCCTGCCACG TTTGACAGGG TAGCAATTTC GACACGATAG 13 80
CGTGCTGTAC TGTTTTTTGC TCGTCAGGGT TGGGTTTTGT CATCGACACC CAAGGATTGG 144 0
AGTCGGTGCT CAATAATCGC CAGTTGCTGT TGGGCAGCCG CCAATTGCGC CTGAggttct 1500
ctcttctgcc gtta 1514
Последовательность № 46
Пример 46: сконструированный ДНК-конструкт протонного канала под контролем Nial промотора (609 по)
agaaaatctg gcaccacacc TATATGGTAG GGTGCGAGTG ACCCCGCGCG ACTTGGAGCT 6 0
CGATGGCCCC GGGTTGTTTG GGGCGTCCGC CTCTCGCGCT ATTCTGAGCT GGAGACCGAG 120
GCGCATGAAA ATGCATTCGC TTCCATAGGA CGCTGCATTG TGGCTTGAAG GTTCAAGGGA 18 0
AGGGTTCAAA CGACCCCGCC GTACGAACTT TTGTCGGGGG GCGCTCCCGG CCCCGGGCTC 240
TTGTGCGCGC ATTAGGGCTT CGGGTCGCAA GCAAGACGAT ACatggccgg catcggcgcc 300
gtgctgaagg tcctgaccac cggcctgccc gccctgatca gctggatcaa gcgcaagcgc 360
cagcagTAAA TGGAGGCGCT CGTTGATCTG AGCCTTGCCC CCTGACGAAC GGCGGTGGAT 420
GGAAGATACT GCTCTCAAGT GCTGAAGCGG TAGCTTAGCT CCCCGTTTCG TGCTGATCAG 480
TCTTTTTCAA CACGTAAAAA GCGGAGGAGT TTTGCAATTT TGTTGGTTGT AACGATCCTC 540
CGTTGATTTT GGCCTCTTTC TCCATGGGCG GGCTGGGCGT ATTTGAAGCg gttctctctt 600
ctgccgtta 609
Последовательность № 47
Пример 47: сконструированный ДНК-конструкт НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы под контролем nirA промотора
(1360 по)
agaaaatctg gcaccacacc CTTCTTGCAG AACATGCATG ATTTACAAAA AGTTGTAGTT 6 0
TCTGTTACCA ATTGCG.AATC GAGAACTGCC TAATCTGCCG AGTATATGaa cggatttggc 120
aggataggac gactggtgtt gcgggcggcg gtggagaagg gcacggtgga ggtggtggcg 180
gtgaacgatc cgttcatctt cccggacgcg gcgtacgctg cgtacatgct gcagtacgac 240
tcgacgcacg gggcgttccc gggtgaggtg ggcagcgacg gggagcactt ggtggtgaac 300
gggaagaagc tggcgtgctt tgcgatccgc gatccggcgg agatcccgtg gggctcggtc 360
ggcgccgact acgtcgtgga gtccaccggc gtgttcaccg tgaccgagaa ggcgtcgttg 420
cacgtcaagg gcggcgcgaa gaaggtggtt atatcggcgc cgtcgaagga tgcgcccatg 480
cttgtgatgg gcgtgaacca tgacgcctac accaaggact tgacggtggt gtcgaatgcg 540
tcttgcacca ccaacttgtt tggcgccgct ggccaagatc atcgacgagg cgttcggcat 600
cgggatgggc ctcatgagca ccatccacgc ggtgacggcc acgcaaaaga cggtggatgg 660
gccgagctcc aaagactggc gcggtgtcgc ggcgcgttcc agtcgattat tcccagcagc 720
accggcgctg cgaaagcggt cggcaaggtg tacccgaagc tgaacggcaa gctgaccggc 780
atggcgttcc gcgtgccggt gcccgacgtg tccgtggtag acttgacagt gaccctgaag 840
aaggagacca actacgagga gatcaaaaag gctgtcaagc aggcgtcgca gagcccgcac 900
tacaagggca tcgtggcgta caccgagcac cccatcgtgt cggccgacct ggtgcacaac 960
ccgtactcgt cggtgttcga tgccgaagcc ggtatcatgc tgtcgcccac gtttgtgaaa 1020
Ctggtcagct ggTAATAGTG ATCCCGGCCG CTACTAAAGC CTGATTTGTC TTGATAGCTG 1080
CTCCTGCCTT TGGGCAGGGG CTTTTTTCTG TCTGCCATTC TTGAGGATGG CGGACTCTTT 114 0
CCCTTTTGCT CTACGCCCAT GAATGCGATС GCAGTCTCCC CTGTCCAGCA CGTTGGAGTG 12 0 0
ATTGGTGGTG GCCAGTTAGC TTGGATGCTG GCACCAGCAG CGCAACAGTT GGGGATGTCG 1260
CTGCACGTTC AAACACCCAA TGATCACGAC CCAGCAGTAG CGATCGCGGA TCAAACCGTA 1320
TTAGCAGCAG TTGCTGACGC ggttctctct tctgccgtta 136 0
Последовательность № 48
Пример 48: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицераткиназы под контролем nirA промотора (1621 по)
agaaaatctg gcaccacacc CTTCTTGCAG AACATGCATG ATTTACAAAA AGTTGTAGTT 6 0
TCTGTTACCA ATTGCGAATC GAGAACTGCC TAATCTGCCG AGTATATGtC atttgtcttc 120
gagcgcgacg acacccggca gctgttttcc ttccataaac tcgagcgaag cgccgccgcc 180
ggtggagata tgatccattt tgtcggccaa gccgaatttc tcaaccgccg ccgccgaatc 240
cccgccgccg atgaccgaat aggtgtcggg cgcttccgcc agtgcttcgg cgatcgcttt 300
tgtcccatgg gcgaacgctt ccatttcaaa gacgcccatc gggccgttcc agacaacgag 360
cttcgattga cgaatgacat cgcggtacaa ttcgcgcgtt ttcgggccga tgtcaagcgc 420
ctcccaatcg ctcggaatgg cgtcgatggc gacgactttc gtgttggcgt cgttcgcaaa 480
ccggtcggcg acgaccacgt ccaccggcat ataaaaacgg acgccttttt ctttcgcctt 540
ttccataaac gatttggcga gttcgatttt gtcctcctca agcagcgact tgccgacgtc 600
atggccgagc gctttgacga acgtatacgc cagtccgccg ccgatgatca agttgtcgac 660
tttttcaagc aaattgtcga tgacgccgat tttgtctttc actttcgcgc cgccgatgat 720
cgccgtaaac gggcggtccg gattcgagag cgctttgccg agcacttcga gttctttttc 780
catcaaaaac ccggccaccg caggcaagta atgggcgatg ccttccgtcg acgcatgagc 840
gcggtgggcg gcgccgaacg catcgttgac atacagatcc gcgagctccg caaacgcttt 900
ggccagctct ggatcgtttt tctcttcgcc agggtaaaaa cggacgttct caagcaagag 960
cacgtcgcct tcgttcaaac ggtcgaccgc cgctttcacc tcatcgccga ccgcttcatt 1020
cgttttggcg accggccgtt caagcagctc gccgagccgc ttcgcaacgg catccaaacg 1080
caattcttcg accacttttc ctttcgggcg gccgaggtgg ctcgccaaaa tgactttcgc 1140
cccgtgctcg atcaaatagc ggatcgtcgg gagtgcggcg cgaatgcgcg tgtcatcggt 1200
gatggcgcct tgctccatcg gaacgttgaa atcgacgcgg caaaagacgc gctttcccct 1260
cacctcaacg tcgcggatcg tcttcttgtt catTAATAGT GATCCCGGCC GCTACTAAAG 1320
CCTGATTTGT CTTGATAGCT GCTCCTGCCT TTGGGCAGGG GCTTTTTTCT GTCTGCCATT 13 8 0
CTTGAGGATG GCGGACTCTT TCCCTTTTGC TCTACGCCCA TGAATGCGAT CGCAGTCTCC 144 0
CCTGTCCAGC ACGTTGGAGT GATTGGTGGT GGCCAGTTAG CTTGGATGCT GGCACCAGCA 15 00
GCGCAACAGT TGGGGATGTC GCTGCACGTT CAAACACCCA ATGATCACGA CCCAGCAGTA 156 0
GCGATCGCGG ATCAAACCGT ATTAGCAGCA GTTGCTGACG Cggttctctc ttctgccgtt 1620
a 1621
Последовательность № 49
Пример 49: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы под котролем nirA промотора (1990 по)
agaaaatctg gcaccacacc CTTCTTGCAG AACATGCATG ATTTACAAAA AGTTGTAGTT 60
TCTGTTACCA ATTGCGAATC GAGAACTGCC TAATCTGCCG AGTATATGct cgagcatTTA 120
TTTAATAATA AGCGAGCTTC CCTTCATCTC TGAAGGTTTT TCTAACCCTA AGATGTCTAA 180
GATTGTTGGA GCAATGTCTG CTAAGATTCC ATCATCTCTT AATTTAACAT TGCCATATCC 24 0
CACAAGATAC AAAGGCACCT TATTTGTTGT ATGAGCTGTA TGAGGCTCAC CTGTCTCATA 3 00
ATCAATCATC TGTTCACAGT TGCCATGGTC AGCAGTAATA ATAACCACTC CACCCTTTTC 36 0
TAAAACCTTG TTAACAPLCTT TTCCAATACA CTCATCTACA GCCTCAACTG CCTTTATTGC 420
AGCCTCTAAA ACGCCT3TGT GCCCTACCAT GTCACCATTT GCATAGTTAC ATATTATCAC 48 0
ATCATATTCA TCTCTTTCAA TTCTCTCAAG TAAAGCTTCT GTTACCTCGT ATGCACTCAT 540
CTCAGGTTTA AGATCATATG TTGCAACCTT TGGTGATGGT ACCAATACCC TGTCTTCTCC 600
GACATTTGGT ACTTCCACAC CGCCGTTGAA GAAAAAGGTG ACATGAGCAT ACTTTTCTGT 660
CTCAGCAATT CGAAGTTGTT TTAACCCTAA CTTGCTAAAA TACTCTCCCA AAGTGTTTGT 720
CAGGTTCTCT GGTTTGAATG CAACATGGCA ATTTTTTATT GTCACATCAT ACTGAGTCAT 780
GCATACAAAG AACACTTCGA AATATCCTTT TTTCCTTTCA AAACCGTCAA ATTCAACATC 84 0
ACAAAACGCT CTTGTAAGCT GTCTTGCTCT GTCAGGTCTG AAGTTAAAGA AAATAATACT 900
GTCATGTTCA TTTATTGTTG CGACAGGTTT TCCATTTTCA AGCACAACAG TCGGAATTAC 96 0
AAACTCATCA GTGTTACCTT TTTTATACGA CTTTTCAACC GCCTCTAATC CTGAGCTTGC 1020
ATACTCGCCT TCACCAAAGA CCATTGCATT ATATGCCTTT TCAACTCTTT CCCATCTTTT 10 8 0
GTCTCTGTCC ATTGCA.TAGT ATCTGCCCAT CACTGTTGCA ATCTTACCAC AACCAATTTC 114 0
TTTTATCTTC TGTTCAAGCT CTTCAATGTA AATTTTTGCG CTCGAAGGTG GAACATCTCG 12 00
CCCATCCAAA AAGCAATGAA CATATACTTT TTCAAGATTG TGCCTCTTTG CAAGTTTTAA 126 0
AAGTGCGTAA AGATGTGTGT TGTGGCTGTG AACACCACCA TCTGATAAAA GTCCCATCAG 1320
ATGAAGAGAA GAGTTATATT TTTTGCAATT CTCTATTGCC ATCAAAAACT CTTCTTTTTC 13 80
AAAAAAATCA CCGTCTTTAA TTGACTTTGT TATTCTTGTA AATTCTTGGT AAACAATTCT 144 0
TCCTGCACCC AGGTTCAGAT GTCCAACTTC AGAATTCCCC ATTTGTCCTT CGGGAAGACC 1500
AACATCCATA CCACTGCTAC CAATCAGGGT ATATGGGTAA TTCTTTTCGT AATAGTCAAG 156 0
GTTAGGGGTC TTACCCAAAG CAACAGCGTT TCCCTCTTGC TTTGGGTTAT AACCCCAACC 1620
GTCCATGATA ATCAACACAA CAGGTTTTTT CATtaatCta gaTAATAGTG ATCCCGGCCG 1680
CTACTAAAGC CTGATTTGTC TTGATAGCTG CTCCTGCCTT TGGGCAGGGG CTTTTTTCTG 1740
TCTGCCATTC TTGAGCJATGG CGGACTCTTT CCCTTTTGCT CTACGCCCAT GAATGCGATC 18 00
GCAGTCTCCC CTGTCCAGCA CGTTGGAGTG ATTGGTGGTG GCCAGTTAGC TTGGATGCTG 186 0
GCACCAGCAG CGCAACAGTT GGGGATGTCG CTGCACGTTC AAACACСCAA TGATCACGAC 1920
CCAGCAGTAG CGATCGCGGA TCAAACCGTA TTAGCAGCAG TTGCTGACGC ggttctctct 1980
tctgccgtta 1990
Последовательность № 50
Пример 50: сконструированный ДНК-конструкт энолазы под контролем nirA промотора (1765 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC cttcttgcag aacatgcatg atttacaaaa agttgtagtt 60
tctgttacca attgcgaatc gagaactgcc taatctgccg agtatatgCT CGAGCATatg 120
ctaaataaac ccgtcgtttc cattgaagaa attaccgcta gagaaatttt agactctcgt 180
ggccgtccta ccattgaagc agaagtctta ctggaaacag gggctttcgg tattgcccag 240
gttcccagtg gcgcgtcaac tggtagcttc gaggcccacg aattacggga tgatgacccc 300
aaccgctacg gtggtaaagg cgttctcaaa gcggttagta acgttataga cgaaattgcc 360
cctaaaatta tcggaatgga tgggttagat caaactgcga tcgatcacac catgattgag 420
ttagacggtt ctactaataa aaaagaatta ggggccaatg ctatccttgc cgtttcctta 480
gccactgcaa aagctgccgc cgatgaatta gcccttcccc tgtaccgtta tttagggggt 540
cccttggcca atgtcttacc cgtccccatg atgaacgtga ttaacggggg ttctcacgcg 600
gataataacg tagacttcca ggagtttatg attatgccag tgggtgcgga ctcttttaaa 660
gaagctttga ggtggggggc cgaagtgttt gcttccctca gtaaagttct aaaagagcgt 720
aaattgctct ctggggtagg agacgagggg ggatacgccc cgaacctggg atcgaaccag 780
gaagccttag atttgctcat agaagccatt gaaaaggcgg ggtataagcc aggggaacag 840
gtggctttag cgatggatgt ggcttcaagt gagttttata aggatggcga atatatttat 900
gatggttctc cccattcccc tcaagaattt atcgattatt taggtaaatt agtggatcaa 960
tatcctatta tttccattga agatggctta caagaagatg actgggatag ctggaaaagt 1020
ttgaccgata cgttaggatc tcgcattcag ttagttgggg acgatctttt tgtcacgaac 1080
cccactcgtc tgcaaasiagg cattgatatg ggtgtgggta atagtattct cattaaactc 1140
aatcaaattg gtagtttaac ggaaacgtta gatacgattg ctttagcgac tcgtcatcaa 1200
tatagttccg ttatttccca tcgttccgga gaaaccgaag acactaccat tgcagactta 1260
gccgtagcta cacgcgctgg acaaatcaaa accggttctc tgtgtcgtag tgaacgggta 1320
gccaaatata accgactatt acgtattgaa gaagaattag gcgatcgcgc agtttatgct 1380
gcaaaagtgg gtttaggccc tcaataaGGC TGCTGCCCCG GCTGCTGCta atctagaTAA 144 0
TAGTGATCCC GGCCGCTACT AAAGCCTGAT TTGTCTTGAT AGCTGCTCCT GCCTTTGGGC 15 00
AGGGGCTTTT TTCTGTCTGC CATTCTTGAG GATGGCGGAC TCTTTCCCTT TTGCTCTACG 15 60
GCCATGAATG CGATCGCAGT CTCCCCTGTC CAGCACGTTG GAGTGATTGG TGGTGGCCAG 16 20
TTAGCTTGGA TGCTGGCACC AGCAGCGCAA CAGTTGGGGA TGTCGCTGCA CGTTCAAACA 16 80
CCCAATGATC ACGACCCAGC AGTAGCGATC GCGGATCAAA CCGTATTAGC AGCAGTTGCT 174 0
GACGCggttc tctcttctgc cgtta 1765
Последовательность № 51
Пример 51: сконструированный ДНК-конструкт пируваткиназы под контролем nirA промотора (1888 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC cttcttgcag aacatgcatg atttacaaaa agttgtagtt 6 0
tctgttacca attgcgaatc gagaactgcc taatctgccg agtatatgCT CGAGCATatg 120
ttaaaaaaga cgaaaatcgt ttgcacgcag ggtccgtcca cagagaaacc gggcgtaatt 180
gatgcactga ttgccaatgg catgaactgc gcacgcttca atttctccca tggtgaccac 240
gaagaacatc ttggccgtat caatatggtt cgtgaagctg ccaagaaggc tggcaaggtt 3 00
atctctttaa tcctcgatac caaaggtccg gaaatgcgtc tgggcgagtt caaagatggc 360
aaagttatgc tcgaaaaggg caacaagttc actttgacct atgacgatga accgggtgat 420
gaaactcatg tttccgtaaa ccacaaaggt ctttacacgg aagttaagcc gggcgacacc 480
ctgctcctct ccgatggcct cgtagctctc aaagttgatg aaatcaaggg caaggatatc 540
gttacgacga ttcagaacag cggtaagatg agcacgcgca agcgcgtagc tgctccgggc 600
gtaccccttg gtctgcotcc tatctccgaa caggatgcta aggacatcat ctttggctgc 660
gaacaggata tggatttcgt agctgcttcc ttcatccagc gtccggatga tgttatcgcc 720
atccgcaagc tcatcgaaga gcacaatggc cacatggaaa ttctgccgaa gatcgaaaac 780
ctcgaaggtg ttaagaactt cgatgcaatc ctggaagttt ccgacggcat catggttgcc 840
cgtggtgacc tgggcgtaga agttccggca gaagatgtgc cccttattca gaaggaaatc 900
atccgcaagt gcaacgctgc tggcaagccg gttatcgttg ctacgcagat gctcgactcc 960
atggaacgca acccgcgtcc gacccgtgca gaagtttctg acgttggtaa cgccatcctc 1020
gatggtacgg atgccatcat gctgtccggc gaaacggctt ccggtgacta tccggtagaa 1080
gcagttgcca cgatgaaccg cattgcacag cgcatggaaa gctcccttga atacaaggaa 1140
ctctatgtag aacgtggtct gcagcacatg gaatcccgta cgcgtgctat cgctcatgct 1200
acggttcaga tggcttatga gctcgatgct ccggctatta tcacgccgac cgaatccggt 1260
tacacgacga aggtcgtttc caagtatcgt ccgaaggctg ctatcgtagc ttacacgccg 1320
agcgaaaaag ttctgcgtca gctgaacctg cgttggggcg tatatccggt actcggcacc 13 80
cagtggagcg atgtggatga aatgatcagc aatgcaacgg ctgctgctgt taaggaagac 1440
ctcgtacagc gcggcgacct caccatcatc acctccggtg tgaagatgga atcccgtacg 15 00
cgtgctatcg ctcatgetac ggacatctaa GGCTGCTGCC CCGGCTGCTG Ctaatctaga 1560
TAATAGTGAT CCCGGCCGCT ACTAAAGCCT GATTTGTCTT GATAGCTGCT CCTGCCTTTG 16 20
GGCAGGGGCT TTTTTCTGTC TGCCATTCTT GAGGATGGCG GACTCTTTCC CTTTTGCTCT 16 80
ACGCCCATGA ATGCGATCGC AGTCTCCCCT GTCCAGCACG TTGGAGTGAT TGGTGGTGGC 174 0
CAGTTAGCTT GGATGCTGGC ACCAGCAGCG CAACAGTTGG GGATGTCGCT GCACGTTCAA 18 00
ACACCCAATG ATCACGACCC AGCAGTAGCG ATCGCGGATC AAACCGTATT AGCAGCAGTT 18 60
GCTGACGCgg ttctctcttc tgccgtta 18 88
Последовательность № 52
Пример 52: сконструированный ДНК-конструкт пируватдекарбоксилазы под контролем nirA промотора (2188 по)
AGAAAATCTG GCACCACACC cttcttgcag aacatgcatg atttacaaaa agttgtagtt 60
tctgttacca attgcgaatc gagaactgcc taatctgccg agtatatgCT CGAGCATatg 120
gtatcaacct acccagaatc agaggttact ctaggaaggt acctctttga gcgactccac 180
caattgaaag tggacaccat tttcggcttg ccgggtgact tcaacctttc cttattggac 240
aaagtgtatg aagttccgga tatgaggtgg gctggaaatg ccaacgaatt gaatgctgcc 3 00
tatgctgccg atggtteictc cagaataaag ggattgtctt gcttggtcac aacttttggt 360
gttggtgaat tgtctgottt aaacggagtt ggtggtgcct atgctgaaca cgtaggactt 420
ctacatgtcg ttggagttcc atccatatcg tcacaggcta aacagttgtt gctccaccat 480
accttgggta atggtgactt cactgttttt cacagaatgt ccaatagcat ttctcaaact 540
acagcatttc tctcagatat ctctattgca ccaggtcaaa tagatagatg catcagagaa 600
gcatatgttc atcagagacc agtttatgtt ggtttaccgg caaatatggt tgatctcaag 660
gttccttcta gtctcttaga aactccaatt gatttgaaat tgaaacaaaa tgatcctgaa 720
gctcaggaag aagttgt:tga aacagtcctg aagttggtgt cccaagctac aaaccccatt 780
atcttggtag acgcttgtgc cctcagacac aattgcaaag aggaagtcaa acaattggtt 840
gatgccacta attttcaagt ctttacaact ccaatgggta aatctggtat ctccgaatct 900
catccaagat ttggcggtgt ctatgtcggg acaatgtcga gtcctcaagt caaaaaagcc 960
gttgaaaatg ccgatcttat actatctgtt ggttcgttgt tatcggactt caatacaggt 1020
tcattttcat actcctacaa gacgaagaat gttgttgaat tccactctga ctatatgaaa 1080
atcagacagg ccaccttccc aggagttcaa atgaaagaag ccttgcaaca gttgataaaa 1140
agggtctctt cttacatcaa tccaagctac attcctactc gagttcctaa aaggaaacag 1200
ccattgaaag ctccatcaga agctcctttg acccaagaat atttgtggtc taaagtatcc 1260
ggctggttta gagagggtga tattatcgta accgaaactg gtacatctgc tttcggaatt 1320
attcaatccc attttcccag caacactatc ggtatatccc aagtcttgtg gggctcaatt 1380
ggtttcacag taggtgcaac agttggtgct gccatggcag cccaggaaat cgaccctagc 1440
aggagagtaa ttttgttcgt cggtgatggt tcattgcagt tgacggttca ggaaatctct 1500
acgttgtgta aatgggattg taacaatact tatctttacg tgttgaacaa tgatggttac 1560
actatagaaa ggttgatcca cggcaaaagt gccagctaca acgatataca gccttggaac 1620
catttatcct tgcttcgctt attcaatgct aagaaatacc aaaatgtcag agtatcgact 1680
gctggagaat tggactettt gttctctgat aagaaatttg cttctccaga taggataaga 1740
atgattgagg tgatgtl:atc gagattggat gcaccagcaa atcttgttgc tcaagcaaag 1800
ttgtctgaac gggtaaacct tgaaaattga GGCTGCTGCC CCGGCTGCTG Ctaatctaga i860
TAATAGTGAT CCCGGCCGCT ACTAAAGCCT GATTTGTCTT GATAGCTGCT CCTGCCTTTG 1920
GGCAGGGGCT TTTTTCTGTC TGCCATTCTT GAGGATGGCG GACTCTTTCC CTTTTGCTCT 1980
ACGCCCATGA ATGCGATCGC AGTCTCCCCT GTCCAGCACG TTGGAGTGAT TGGTGGTGGC 204 0
CAGTTAGCTT GGATGCTGGC ACCAGCAGCG CAACAGTTGG GGATGTCGCT GCACGTTCAA 210 0
ACACCCAATG ATCACGACCC AGCAGTAGCG ATCGCGGATC AAACCGTATT AGCAGCAGTT 216 0
GCTGACGCgg ttctctcttc tgccgtta 2188
Последовательность № 53
Пример 53: сконструированный ДНК-конструкт НАД(Ф)Н-зависимой алкогольдегидрогеназы под контролем nirA промотора (1510 по)
agaaaatctg gcaccacacc CTTCTTGCAG AACATGCATG ATTTACAAAA AGTTGTAGTT 6 0
TCTGTTACCA ATTGCGAATC GAGAACTGCC TAATCTGCCG AGTATATGtt agctacctct 120
gtgccagaaa cccaaaaggg tgttattttc tatgagaatg gtggtaaatt ggaatacaag 180
gacattccag ttccaaagcc aaagccaaat gaaatcttga tcaacgtcaa gtactccggt 240
gtgtgtcata ccgatt-gca cgcatggaag ggtgactggc cattgccaac caagttgcca 300
ttggtcggtg gtcacgaagg tgctggtgtc gttgttgcta tgggtgaaaa cgtcaagggc 360
tggaacattg gtgactttgc gggtatcaaa tggttgaacg gttcttgtat gtcctgtgaa 420
tactgtgaat tgtccaatga atccaactgt ccagatgctg acttgtctgg ttacacccac 480
gatggttctt tccaacaata ccgtaccgca gatgctgttc aagctgccag aattccaaag 540
ggtaccgatt tggctgaagt tgctccaacc ctatgtgccg gtgttactgt ttacaaggct 6 00
ttgaaaagtg ctaacttgaa ggctggtgac tgggttgcca tctctggtgc tgctggtggt 660
ctaggttctc tagctgtcca atacgccaag gccatgggtt acagagtcgt tggtatcgac 720
ggtggtgaag aaaagggtaa gttggtcaag caattgggtg gtgaagcctt tgttgatttc 780
accaaaacca aggacatggt tgctgaaatc caagaaatca ccaacggtgg tccacacggt 840
gtcattaacg tctctgtttc tgaagctgcc atgaacgctt ccactcaatt cgtcagacca 900
actggtactg tcgtattggt cggtttgcca gctggtgccg tcatcaagtc cgaagtcttc 960
tcccacgtcg ttaagtctat taacatcaag ggttcttacg tcggtaacag agctgacacc 1020
agagaagcta tcaacttctt cgctaacggt cacgtccact ctccaatcaa ggttgttggt 1080
ttgtccgaac taccaaaggt ttacgaattg atggaacaag gtaagatttt gggtagatac 1140
gttgttgaca cctccaacta gGGCTGCTGC CCCGGCTGCT GCtaatagtg atcccggccg 1200
ctactaaagc ctgatttgtc ttgatagctg ctcctgcctt tgggcagggg cttttttctg 1260
tctgccattc ttgaggatgg cggactcttt cccttttgct ctacgcccat gaatgcgatc 1320
gcagtctccc ctgtccagca cgttggagtg attggtggtg gccagttagc ttggatgctg 1380
gcaccagcag cgcaacagtt ggggatgtcg ctgcacgttc aaacacccaa tgatcacgac 1440
ccagcagtag cgatcgcgga tcaaaccgta ttagcagcag ttgctgacgc GGTTCTCTCT 1500
TCTGCCGTTA 1510
Последовательность № 54
Пример 54: сконструированный выделенный транзитный пептид Hydl (последовательность аминокислот): MSALVLKPCA AVSIRGSSCR ARQVAPRAPL AASTVRVALA TLEAPARRLG NVACAA
Последовательность № 55
Пример 55: сконструированные выделенные транзитные пептиды RbcS2
(последовательность аминокислот): MAAVIAKSSV SAAVARPARS SVRPMAALKP AVKAAPVAAP AQANQ
Последовательность № 56
Пример 56: сконструированный выделенный транзитный пептид ферредоксина (последовательность аминокислот): MAMAMRS
Последовательность № 57
Пример 57: сконструированный выделенный транзитный пептид 5-субъединицы CF0CFi (последовательность аминокислот): MLAAKSIAGP RAFKASAVRA APKAGRRTVV VMA
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм, выбранный из оксифотобактерий или водорослей, для фотобиологического получения бутанола, содержащий набор нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-26, 34-45, кодирующий сконструированный с помощью методов генной инженерии набор ферментов, которые превращают промежуточный продукт цикла Кальвина, выбранный из группы, включающей глицеральдегид-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат в бутанол; и индуцибельный промотор нитраредуктазы, функционально связанный с кодирующими последовательностями указанных ферментов.
2. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД+-зависимой гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность SEQ ID NO: 47.
3. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фос-фоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазы, тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.
4. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-33, кодирующие набор сконструированных с помощью методов генной инженерии ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный набор содержит ферменты, выбранные из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглю-комутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глице-ральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.
5. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, выбранный из цианобактерий.
6. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 54-57, кодирующую стромальный сигнальный пептид, функционально связанную с кодирующими последовательностями указанных ферментов.
7. Способ фотобиологического продуцирования бутанола, согласно которому конструируют с помощью методов генной инженерии набор нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, обеспечивающие превращение промежуточного продукта цикла Кальвина, выбранного из группы, включающей глицеральдегида-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат, в бутанол с получением трансгенного фотосинтетического гидрофитного организма из оксифотобактерий и водорослей по п.1, который помещают в фотобиологический реактор для инициирования фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом в фотобиологическом реакторе, для синтеза бутанола, и выделяют синтезированный бутанол из фотобиологического реактора.
8. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм выбран из группы оксифотобактерий, включающей Thermosynechococcus elongatus BP-1, Nostoc sp. PCC 7120, Synechococcus elongatus PCC 6301, Syncechococcus sp. штамм PCC 7942, Syncechococcus sp. штамм PCC 7002, Syncechocystis sp. штамм PCC 6803, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL1A, Prochlorococcus SS120, Spirulina platensis (Arthrospira platensis), Spirulina pacifica, Lyngbya majuscula, Anabaena sp., Synechocystis sp., Synechococcus elongates, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Synechococcus WH7803, Synechococcus WH8102, Nostoc punctiforme, Syncechococcus sp. штамм PCC 7943, дефицитный по фикоцианину мутант PD-1 Synechocystis PCC 6714, Cyanothece штамм 51142, Cyanothece sp. CCY0110, Oscillatoria limosa, Symploca muscorum, Gloeobacter violaceus, Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica, Synechococcus (MC-A), Prochlorococcus marinus, Synechococcus bigranulatus, криофильную Oscillatoria sp., Phormidium sp., Nostoc sp.-1, Calothrix parietina, термофильный Synechococcus bigranulatus, Synechococcus lividus, термофильный Mastigocladus laminosus, Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Synechococcus vulcanus, Synechococcus sp. штамм МА4, Synechococcus sp. штамм МА19 и Thermosynechococcus elongatus.
9. Способ по п.7, где указанный трансгенный фотосинтетический организм дополнительно включает сконструированный ген протонного канала, контролируемый промотором Nia1, который вставляет протонный канал в цитоплазматическую мембрану для блокирования клеточного деления и скрещивания.
10. Способ по п.7, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральде-
гид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазы, тиолазы, 3 -гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолде-гидрогеназы.
11. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм включает ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность SEQ ID NO: 47.
12. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют для инактивации активности синтеза крахмала посредством ввода ДНК-конструкции, которая кодирует и индуцибельно экспрессирует молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, где ДНК-конструкция выбрана из группы, состоящей из ДНК-конструкций SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
13. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют путем включения дополнительного набора сконструированных генов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2933, для индуцибельной экспрессии дополнительного набора сконструированных ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный дополнительный набор сконструированных ферментов включает по меньшей мере один из ферментов, выбранных из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.
Фиг. 2A
" " ^ " " " _ " _
\ ^ПЩЧар^^ Ha^^iltiM | Г'сц(ы) ирслращриил НАДФН/НАДН I , ¦ it W ^
Фиг. 2B
1- _ _ _ _ т -3'
Фиг. 2C
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028407
028407
- 1 -
- 1 -
(19)
028407
028407
- 1 -
- 1 -
(19)
028407
028407
- 4 -
- 3 -
(19)
028407
028407
- 10 -
028407
028407
- 13 -
- 13 -
028407
028407
- 14 -
- 14 -
028407
028407
- 18 -
- 18 -
028407
028407
- 44 -
- 44 -
028407
028407
- 76 -
- 76 -
028407
028407
- 79 -
- 79 -