|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Визуально прозрачный водный кислый раствор в качестве промежуточного продукта для получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, где раствор содержит: a) по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, где: (i) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков и имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и (ii) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах; и b) уксусную кислоту в концентрации по меньшей мере 10% (об./об.). 2. Водный кислый раствор по п.1, где: (a) раствор имеет величину pH, равную 5 или ниже; (b) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах с диаметром менее чем 0,22 мкм; и/или (c) по меньшей мере 80% мицелл имеют диаметр менее чем 100 нм. 3. Водный кислый раствор по п.1 или 2, содержащий один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов, которые: (i) имеют длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков; (ii) содержат по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков; и/или (iii) имеют изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и/или где по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид и/или один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов включают пептид, который: (iv) содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или (v) не содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков. 4. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, где ни один из фторуглерод-связанных пептидов, присутствующих в препарате, не представляет собой фторуглерод-связанный пептид, в котором пептид, связанный с фторуглеродом: (i) не содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или (ii) содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков. 5. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, в котором пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки. 6. Водный кислый раствор по п.5, где патогеном является вирус, бактерия, микобактерия, паразит или грибок. 7. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, где фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов углерода. 8. Водный кислый раствор по п.1, в котором фторуглерод является линейным насыщенным фрагментом C 8 F 17 (CH 2 ) 2 . 9. Способ получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, включающий: (i) солюбилизацию фторуглерод-связанного пептида в уксусной кислоте для получения раствора по любому из пп.1-8; (ii) стерилизацию фильтрованием солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида; и (iii) высушивание стерилизованного фильтрованием фторуглерод-связанного пептида. 10. Способ по п.9, при этом (a) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков, а также имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; (b) смесь из фторуглерод-связанного пептида и одного или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов солюбилизируют в уксусной кислоте; (c) способ дополнительно включает смешивание солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида с одним или более дополнительными солюбилизированными фторуглерод-связанными пептидами; (d) уксусная кислота представляет собой от 10 до 80% (об./об.) водную уксусную кислоту; (e) солюбилизированный фторуглерод-связанный пептид высушивают лиофилизацией; (f) способ дополнительно включает восстановление сухого фторуглерод-связанного пептида в водной фазе; (g) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант добавляют до этапа (ii); (h) способ дополнительно включает хранение сухого или восстановленного фторуглерод-связанного пептида в стерильном контейнере, и/или (i) пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки. 11. Способ по п.10, в котором пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки. 12. Способ по п.10, в котором фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Визуально прозрачный водный кислый раствор в качестве промежуточного продукта для получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, где раствор содержит: a) по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, где: (i) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков и имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и (ii) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах; и b) уксусную кислоту в концентрации по меньшей мере 10% (об./об.). 2. Водный кислый раствор по п.1, где: (a) раствор имеет величину pH, равную 5 или ниже; (b) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах с диаметром менее чем 0,22 мкм; и/или (c) по меньшей мере 80% мицелл имеют диаметр менее чем 100 нм. 3. Водный кислый раствор по п.1 или 2, содержащий один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов, которые: (i) имеют длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков; (ii) содержат по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков; и/или (iii) имеют изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и/или где по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид и/или один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов включают пептид, который: (iv) содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или (v) не содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков. 4. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, где ни один из фторуглерод-связанных пептидов, присутствующих в препарате, не представляет собой фторуглерод-связанный пептид, в котором пептид, связанный с фторуглеродом: (i) не содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или (ii) содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков. 5. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, в котором пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки. 6. Водный кислый раствор по п.5, где патогеном является вирус, бактерия, микобактерия, паразит или грибок. 7. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, где фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов углерода. 8. Водный кислый раствор по п.1, в котором фторуглерод является линейным насыщенным фрагментом C 8 F 17 (CH 2 ) 2 . 9. Способ получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, включающий: (i) солюбилизацию фторуглерод-связанного пептида в уксусной кислоте для получения раствора по любому из пп.1-8; (ii) стерилизацию фильтрованием солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида; и (iii) высушивание стерилизованного фильтрованием фторуглерод-связанного пептида. 10. Способ по п.9, при этом (a) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков, а также имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; (b) смесь из фторуглерод-связанного пептида и одного или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов солюбилизируют в уксусной кислоте; (c) способ дополнительно включает смешивание солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида с одним или более дополнительными солюбилизированными фторуглерод-связанными пептидами; (d) уксусная кислота представляет собой от 10 до 80% (об./об.) водную уксусную кислоту; (e) солюбилизированный фторуглерод-связанный пептид высушивают лиофилизацией; (f) способ дополнительно включает восстановление сухого фторуглерод-связанного пептида в водной фазе; (g) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант добавляют до этапа (ii); (h) способ дополнительно включает хранение сухого или восстановленного фторуглерод-связанного пептида в стерильном контейнере, и/или (i) пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки. 11. Способ по п.10, в котором пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки. 12. Способ по п.10, в котором фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов.
Евразийское 028396 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201390998
(22) Дата подачи заявки
2011.12.30
(51) Int. Cl.
A61K39/145 (2006.01) A61K39/00 (2006.01) A61K39/385 (2006.01)
(54) РАСТВОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ФТОРУГЛЕРОД-СВЯЗАННОГО ПЕПТИДА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКОГО ПРЕПАРАТА
(31) 1022147.1
(32) 2010.12.31
(33) GB
(43) 2014.02.28
(86) PCT/GB2011/001781
(87) WO 2012/090002 2012.07.05
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АЛТИММЬЮН ЮКЕЙ ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Браун Карлтон Брэдли, Жорж Бертран Виктор Жильбер, Табюре Жан Франсуа (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2009027688 WO-A2-2005099752 WO-A2-2005094891
(57) Изобретение относится к визуально прозрачному водному кислому раствору получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, при этом водный раствор содержит а) по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, где пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков и имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и (ii) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах; и b) уксусную кислоту в концентрации по меньшей мере 10% (об./об.). Также предложен способ получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида. Способ включает солюбилизацию фторуглерод-связанного пептида в уксусной кислоте для получения указанного раствора; стерилизацию фильтрованием солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида; и высушивание стерилизованного фильтрованием фторуглерод-связанного пептида.
Область техники изобретения
Изобретение относится к растворам, пригодным для получения фармацевтически приемлемого препарата, содержащего фторуглерод-связанный пептид и способу получения такого препарата.
Уровень техники изобретения
Синтетические пептидные антигены представляют интерес для использования в вакцинах, предназначенных для профилактики инфекционных заболеваний (таких как вирусные, бактериальные, паразитарные и грибковые инфекции). Синтетические пептидные антигены также представляют интерес в области иммунотерапии, включая лечение инфекции, стимуляцию иммунитета к раковым клеткам, понижающую регуляцию полипептидных гормонов и контроль ненадлежащих иммунных реакций, таких как анафилаксия и аллергия.
Одной из трудностей практического применения вакцин и иммунотерапевтических средств на основе пептидов является обеспечение индукции иммунного ответа путем эффективной доставки пептидных антигенов к антиген-презентирующим клеткам. Без такой целевой доставки могут потребоваться невероятно большие количества пептида, которые не только могут быть экономически невыгодными с точки зрения производства, но и создавать проблему токсичности.
Усовершенствования доставки пептидов можно достичь при помощи специализированных средств доставки, таких как структуры на основе частиц, допускающие замедленное высвобождение. Кроме того, были разработаны производные пептидов или модифицированные пептиды, содержащие интересующий пептид, ковалентно связанный с облегчающим доставку средством, с целью улучшения биодоступности и презентации пептида для конкретных целевых клеток и рецепторов.
Пептиды одного конкретного типа, модифицированные для улучшения доставки к антиген-презентирующим клеткам, были сконструированы путем ковалентного присоединения фторуглеродной цепи либо к N- или С-концу пептида, либо к любому положению между ними, для создания фторуглерод-связанного пептида (ФСП). Примеры фторуглерод-связанных пептидов приведены в WO 2005/099752 и WO 2009/027688, и там же описаны преимущества, обеспечиваемые присоединением фто-руглерода, для усиления иммунных ответов на пептид.
Разработчикам вакцин будет понятно, что для обеспечения более широкого профилактического или иммунотерапевтического эффекта может потребоваться более одного пептида. Такие многокомпонентные препараты являются желательными, так как они могут быть более эффективными для вызывания соответствующих иммунных реакций.
Для производства фармацевтического препарата такого рода необходимо синтезировать фторугле-род-связанные пептиды, очистить их, смешать друг с другом в соответствующих соотношениях, стерилизовать и предоставить в единообразном формате, подходящем для введения.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что фторуглерод-связанные пептиды часто плохо растворимы в водной среде, такой как вода или фосфатно-солевой буферный раствор, даже когда несвязанные пептиды растворимы в водной среде. Они также обнаружили, что длина и гидрофобность пептидного компонента фторуглерод-связанного пептида влияет на растворимость фторуглерод-связанного пептида. В частности, установлено, что фторуглеродные векторы, связанные с более длинными, более гидрофобными пептидами, проявляющими лучшие иммуногенные свойства, практически нерастворимы.
Фторуглерод-связанные пептиды являются амфифильными и, как правило, образуют мультимоле-кулярные структуры мицеллярного типа как в полярных (протонных и апротонных), так и в неполярных растворителях. Природные несвязанные пептиды обычно не образуют такие структуры. Однако авторы изобретения обнаружили, что многие фторуглерод-связанные пептиды, особенно обладающие лучшими иммуногенными свойствами, имеют тенденцию к образованию больших видимых агрегатов в водной среде и других растворителях. Образование таких агрегатов неприемлемо в фармацевтическом производственном процессе, когда необходимо получать однородные препараты, которые можно охарактеризовать.
Определив эту проблему, авторы настоящего изобретения занялись ее решением и разработали способ получения препаратов фторуглерод-связанных пептидов, в которых сохраняются надмолекулярные структуры, поддерживающие растворимость фторуглерод-связанных пептидов. Способ формулирования препарата, разработанный авторами изобретения, делает возможным производство стабильного препарата, содержащего иммуногенные фторуглерод-связанные пептиды, которые, как было обнаружено, трудно сформулировать в препарат, при этом препарат легко восстанавливать в водной среде для получения фармацевтически приемлемого раствора.
В частности, авторы изобретения обнаружили, что использование кислого раствора способствует образованию мицелл и предотвращает образование нерастворимых агрегатов. Солюбилизированные фторуглерод-связанные пептиды можно стерилизовать фильтрованием без потери фторуглерод-связанных пептидов из раствора. После лиофилизации, как правило, в присутствии криопротектора, фто-руглерод-связанные пептиды можно хранить в стабильной форме и растворять в водной среде, получая фармацевтически приемлемый раствор для введения.
Авторы изобретения обнаружили, что уксусная кислота является особенно подходящим раствори
телем для широкого диапазона фторуглерод-связанных пептидов, несмотря на высокую степень вариабельности с точки зрения заряда и гидрофобности различных пептидов. Следовательно, уксусная кислота также подходит, в частности, для солюбилизации смеси фторуглерод-связанных пептидов.
Соответственно, изобретение относится к визуально прозрачному водному кислому раствору, подходящему для использования в качестве промежуточного продукта для получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, где раствор содержит:
a) по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, где:
(i) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков и имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и
(ii) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах; и
b) уксусную кислоту в концентрации по меньшей мере 10% (об./об.).
Водный кислый раствор может иметь, например, величину pH, равную 5 или ниже.
Раствор может содержать один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов, присутствующих в мицеллах с диаметром менее 0,22 мкм.
Предпочтительно, по меньшей мере 80% мицелл фторуглерод-связанных пептидов, присутствующих в растворе, имеют диаметр менее 100 нм.
В одном варианте осуществления водный кислый раствор содержит один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов, которые:
(i) имеют длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков;
(ii) содержат по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков; и/или
(iii) имеют изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и/или где по меньшей мере один фто-руглерод-связанный пептид и/или один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов включают пептид, который:
(iv) содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или
(v) не содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков.
В еще одном варианте осуществления водный кислый раствор по изобретению содержит по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид ни один из которых не представляет собой фторуглерод-связанный пептид, в котором пептид, связанный с фторуглеродом:
(i) не содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или
(ii) содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков.
Пептиды, связанные с фторуглеродом, как правило, представляют собой иммуногенные пептиды, полученные из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки.
В водном кислом растворе по изобретению патогеном, предпочтительно, является вирус, бактерия, микобактерия, паразит или грибок.
Предпочтительно, фторуглерод в водном кислом растворе по изобретению содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов углерода. Более предпочтительно, фторуглерод является линейным насыщенным фрагментом C8F17(CH2)2.
По изобретению также предложены способ получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, включающий:
(i) солюбилизацию фторуглерод-связанного пептида в уксусной кислоте для получения водного кислого раствора;
(ii) стерилизацию фильтрованием солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида; и
(iii) высушивание стерилизованного фильтрованием фторуглерод-связанного пептида.
В указанном способе, необязательно:
(a) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков, а также имеет изоэлектриче-скую точку, больше или равную 7;
(b) смесь из фторуглерод-связанного пептида и одного или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов солюбилизируют в уксусной кислоте;
(c) способ дополнительно включает смешивание солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида с одним или более дополнительными солюбилизированными фторуглерод-связанными пептидами;
(d) уксусная кислота представляет собой от 10 до 80% (об./об.) водную уксусную кислоту;
(e) солюбилизированный фторуглерод-связанный пептид высушивают лиофилизацией;
(f) способ дополнительно включает восстановление сухого фторуглерод-связанного пептида в водной фазе;
(g) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант добавляют до этапа (ii);
(a)
(h) способ дополнительно включает хранение сухого или восстановленного фторуглерод-
связанного пептида в стерильном контейнере, и/или
(i) пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патоге-
на, аутологичного белка или опухолевой клетки.
Кроме того, в способе, необязательно, пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуноген-ным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки, где, необязательно фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 приведен пример типичной последовательности операций при производстве фторуглерод-связанных пептидов;
на фиг. 2 изображена альтернативная последовательность операций при производстве фторуглерод-связанных пептидов;
на фиг. 3 приведена таблица, демонстрирующая результаты визуального изучения отдельных ФСП, солюбилизированных в различных растворителях. После интенсивного перемешивания каждый раствор визуально исследовали на прозрачность по шкале от "+++" в случае прозрачного раствора до "-" в случае очень мутного раствора. Также регистрировали степень пенообразования и наличия частиц, при этом "+++" присваивали в случае высоких уровней, а "-" присваивали в случае отсутствия каждого из указанных признаков. "*" указывает на то, что раствор становится вязким;
на фиг. 4 - таблица, демонстрирующая результаты визуального изучения отдельных ФСП, солюби-лизированных в различных растворителях после разбавления раствором маннита. Каждый раствор визуально исследовали на прозрачность по шкале от "+++" в случае прозрачного раствора до "-" в случае очень мутного раствора. Также регистрировали степень пенообразования и наличия частиц, при этом "+++" присваивали в случае высоких уровней, а "-" присваивали в случае отсутствия каждого из указанных признаков;
на фиг. 5 - размеры частиц фторуглерод-связанных пептидов в растворе после смешивания и разбавления, определенные методом динамического рассеяния света (ДРС);
на фиг. 6 - размеры и форма частиц фторуглерод-связанных пептидов в растворе после смешивания и разбавления, определенные при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ);
на фиг. 7 показано распределение объема по размерам частиц фторуглерод-связанных пептидов до (A) и после (B) стерилизации поэтапным фильтрованием, по оценке методом ДРС;
на фиг. 8 - распределение объема по размерам частиц фторуглерод-связанных пептидов, восстановленных в 10 мМ Трис pH 7,85 (A) и воде (B), по оценке методом ДРС;
на фиг. 9 приведены результаты анализа методом ОФ-ВЭЖХ смеси семи фторуглерод-связанных пептидов, подвергнутых воздействию 50% (об./об.) уксусной кислоты в течение 24 ч;
на фиг. 10 - фотографии сформулированных и несформулированных смесей фторуглерод-связанных пептидов после встряхивания вручную. Флакон A: сформулированные плюс смесь ман-нит/вода; флакон В: сформулированные плюс смесь маннит/гистидин; флакон С: несформулированные плюс смесь маннит/вода; флакон D: несформулированные плюс смесь маннит/гистидин;
на фиг. 11 - фотографии сформулированных и несформулированных смесей фторуглерод-связанных пептидов после интенсивного перемешивания и обработки ультразвуком. Флакон A: сформулированные плюс смесь маннит/вода; флакон В: сформулированные плюс смесь маннит/гистидин; флакон С: несформулированные плюс смесь маннит/вода; флакон D: несформулированные плюс смесь ман-нит/гистидин;
на фиг. 12 - фотографии, сделанные с помощью просвечивающего электронного микроскопа, препарата, содержащего шесть фторуглерод-связанных пептидов вируса гриппа (FP-01.1);
на фиг. 13 - профиль ВЭЖХ FR01.1 после фильтрования в момент времени t0 (верхняя панель) и через 24 ч (нижняя панель);
на фиг. 14 - профиль ВЭЖХ FP01.1 после восстановления в воде;
на фиг. 15 - сравнение восстановленных в воде сформулированных фторуглеродных пептидов (FP01.1) и несформулированных пептидов. Фотография слева сделана после 20 мин нахождения в покое, а фотография справа сделана после 3 мин обработки ультразвуком;
на фиг. 16 - сравнение восстановленных в 28 мМ L-гистидине сформулированных фторуглеродных пептидов (FP01.1) и несформулированных пептидов. Фотография слева сделана после 20 мин нахождения в покое, а фотография справа сделана после 3 мин обработки ультразвуком;
на фиг. 17 показан скорректированный на объем эффект дозы у крыс. FP-01.1 индуцировал положительный по IFN-y Т-клеточный ответ дозозависимым образом при всех тестируемых уровнях доз;
на фиг. 18 - индуцированные вакциной Т-клеточные реакции, наблюдаемые при ex vivo анализе ELISpot на IFN-y. МКПК (РВМС) стимулировали 6 отдельными пептидами (соответствующими пептидам, содержащимся в вакцине) в течение 18 ч. Положительные результаты анализа определяли как среднее число точек в лунках отрицательного контроля плюс 2 стандартных отклонения от среднего. Число точек для каждого из 6 пептидов объединяли для получения "суммы для длинных пептидов" и выражали
как число точек на миллион внесенных МКПК.
Краткое описание списка последовательностей
Список последовательностей соответствует пептидам, используемым в примерах, как показано в
таблице ниже
Последовательность
Пептид
SEQ ID N0:1
PI без N-концевого лизина
SEQ ID N0:2
P8 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:3
P9 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:4
Р2 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:5
Р4 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:6
Р5 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:7
Р1 вариант без N-концевого лизина
SEQ ID N0:8
Р8 вариант без N-концевого лизина
SEQ ID N0:9
Р8 вариант без N-концевого лизина
SEQ ID N0:10
Р10 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:11
РЗ без N-концевого лизина
SEQ ID N0:12
Р4 вариант без N-концевого лизина
SEQ ID N0:13
Р6 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:14
Р7 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:15
Р11 без N-концевого лизина
SEQ ID N0:16
Р12 без N-концевого лизина
SEQ ID NO:17
Р1 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:18
Р8 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:19
Р9 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:20
Р2 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:21
Р4 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:22
Р5 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:23
РЗ с N-концевым лизином
SEQ ID N0:24
Рб с N-концевым лизином
SEQ ID N0:25
Р7 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:26
Р10 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:27
Р11 с N-концевым лизином
SEQ ID N0:28
Р12 с N-концевым лизином
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к получению фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида. Способ по изобретению включает этап солюбилизации фторуглерод-связанного пептида в кислом растворе, предпочтительно в уксусной кислоте, стерилизацию фильтрованием солюби-лизированного фторуглерод-связанного пептида; и высушивание стерилизованного фильтрованием фторуглерод-связанного пептида. Изобретение также относится к визуально прозрачному водному кислому раствору в качестве промежуточного продукта для получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида.
Как правило, по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, используемый в способе получения или присутствующий в водном кислом растворе по изобретению, включает пептид из по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, содержащий по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков и имеющий изоэлектрическую точку, больше или равную 7.
Раствор по изобретению может содержать, или в способе получения по изобретению может быть использован по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, содержащий по меньшей мере примерно 20 аминокислот, из которых по меньшей мере примерно 50% аминокислот являются гидрофобными. Другие фторуглерод-связанные пептиды, присутствующие в растворе, могут иметь длину менее чем 20 аминокислот и/или могут содержать менее чем 50% гидрофобных остатков.
Раствор по изобретению может содержать по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, при этом по меньшей мере 50% аминокислот в пептиде являются гидрофобными. Как правило, от примерно 50 до примерно 80%, например от примерно 70 до примерно 75% остатков являются гидрофобными. Нижний предел может составлять 48 или 49%. Предпочтительно, пептид содержит от примерно 55 до примерно 60% или примерно 65% гидрофобных остатков. Если препарат содержит дополнительные фто-руглерод-связанные пептиды, дополнительные фторуглерод-связанные пептиды могут быть менее чем на 50% гидрофобными. Например, пептидный компонент дополнительного фторуглерод-связанного пептида может содержать от примерно 30 до примерно 70% гидрофобных остатков, например примерно 40,
например примерно 45, 50, 55, 60 или 65% гидрофобных остатков. Триптофан (W), тирозин (Y), изолей-цин (I), фенилаланин (F), лейцин (L), валин (V), метионин (M), аргинин (A), пролин (Р), глицин (G) и цистеин (С) являются гидрофобными аминокислотами. В предпочтительном варианте осуществления ни один из пептидов, присутствующих в препарате, не содержат непрерывную последовательность из 20 или более аминокислотных остатков, в которой более чем 80% остатков являются гидрофобными.
Один или более из дополнительных фторуглерод-связанных пептидов могут включать пептид, который имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков; содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков; и/или имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7. Первый фторуглерод-связанный пептид и/или один или более из дополнительных фторуглерод-связанных пептидов могут включать пептид, который содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или не содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков.
В одном варианте осуществления ни один из пептидов в растворе по изобретению не имеет изо-электрическую точку менее 7, все содержат положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода, и/или ни один из пептидов не содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков.
Фторуглерод-связанные пептиды в растворе по изобретению, как правило, присутствуют в мицеллах с диаметром менее 0,22 мкм. Мицеллы, как правило, имеют диаметр от примерно 15 до примерно 200 нм, как правило, от примерно 20 до примерно 100 нм, например от примерно 20 до примерно 30 нм или от примерно 30 до примерно 50 нм. Однако могут присутствовать несколько более крупных мицелл. Как правило, не более 20%, например от примерно 10 до примерно 15% агрегатов имеют диаметр более 100 нм. Предпочтительно, по меньшей мере 80% из мицелл фторуглерод-связанного пептида имеют диаметр менее 100 нм. Размер мицелл можно определять любым подходящим методом, например методом динамического рассеяния света (ДРС) или при помощи просвечивающей электронной микроскопии
(ПЭМ).
Образование мицелл можно облегчать, солюбилизируя фторуглерод-связанные пептиды в кислом растворе. Например, фторуглерод-связанные пептиды можно солюбилизировать в уксусной кислоте, как описано в данном документе. Водный раствор по изобретению, используемый для получения фармацевтически приемлемого препарата, может быть кислым, например с pH 5 или ниже.
Фармацевтически приемлемый препарат по изобретению может быть в сухой, например лиофили-зированной, форме. Фармацевтически приемлемый препарат по изобретению может представлять собой водный раствор, например, полученный растворением лиофилизата или другого сухого препарата в водной среде. Водный раствор, как правило, имеет нейтральное значение pH.
Водный раствор по изобретению, как правило, является визуально прозрачным, без видимых агрегатов. В частности, в растворе после возмущения в результате интенсивного перемешивания и обработки ультразвуком не видны частицы. Это относится как к кислому раствору, так и к фармацевтически приемлемому препарату.
Пептид, как правило, представляет собой пептидный антиген или аллерген, способный вызывать иммунный ответ в организме животного, включая человека, т.е. пептид, как правило, является иммуно-генным пептидом. Предпочтительно, иммунный ответ будет полезен для хозяина. Иммуногенные пептиды могут быть получены из инфекционного агента (патогена), такого как вирус, бактерия, микобактерия, паразит или грибок.
Примеры вирусов включают, но не ограничиваются ими, вирусы животных и человека, такие как: вирус гриппа, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита A (HAV), респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус венесуэльского конского энцефалита (VEE), вирус японского энцефалита (JEV), вирус цитомегалии (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус герпеса (HSV-1 или HSV-2), вирусы Эбола, Марбург, Денге, Западного Нила и желтой лихорадки, вирус свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRSV) и вирус кошачьего иммунодефицита (FIV).
Примеры бактерий и микобактерий включают, но не ограничиваются ими, Mycobacterium tuberculosis, легионеллы, риккетсии, хламидии и Listeria monocytogenes.
Примеры паразитов включают, но не ограничиваются ими, Plasmodium falciparum и другие виды семейства плазмодиевых.
Примеры грибков включают, но не ограничиваются ими, Candida albicans, дрожжевидный грибок, родоторулу и пневмоцисты.
В одном варианте осуществления пептид получен из вируса гриппа. Пептидный антиген вируса гриппа может содержать один или более эпитопов из белка вируса гриппа типа А, белка вируса гриппа типа В или белка вируса гриппа типа C. Примеры белков вируса гриппа, как из вируса гриппа типа А, так и типа В, включают гемагглютинин, нейраминидазу, матричный (M1) белок, М2, нуклеопротеин (NP),
PA, PB1, РВ2, NS1 или NS2 в любых сочетаниях.
Используемый в данном документе термин "иммуногенный" означает молекулу, обладающую способностью быть узнанной иммунологическими рецепторами, такими как Т-клеточный рецептор (TCR) или В-клеточный рецептор (BCR или антитело). Иммуногенный пептид может быть природным или неприродным, при условии, что он содержит по меньшей мере один эпитоп, например Т-клеточный и/или В-клеточный эпитоп. Пептид может содержать один или более Т-клеточных эпитопов, включая эпитопы Т-хелперов и/или эпитопы цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), и/или один или более В-клеточных эпитопов, либо сочетания Т- и В-клеточных эпитопов, таких как эпитопы МНС класса I или МНС класса II. Методы идентификации эпитопов хорошо известны в данной области.
Пептид может содержать один или более эпитопов. Пептид может содержать более одного эпитопа, связанные между собой. Одним из таких примеров является использование слитых пептидов, в которых случайные эпитопы Т-хелперов могут быть ковалентно связаны с одним или несколькими эпитопами CTL, или одним или несколькими В-клеточными эпитопами. В качестве примера случайный эпитоп Т-хелперов может представлять собой пептид PADRE, пептид столбнячного анатоксина (830-843) или ге-магглютинин вируса гриппа, НА(307-319).
Эпитопы могут быть перекрывающимися линейными эпитопами, так что пептид содержит кластер плотно упакованных мультиспецифических эпитопов.
Конец пептида, который не конъюгирован с фторуглеродным фрагментом, можно изменять, чтобы улучшать растворимость конструкта за счет образования мицелл. Например, положительно заряженную аминокислоту можно добавлять к пептиду, чтобы способствовать сборке мицелл. Либо N-конец, либо С-конец пептида можно соединять с вектором для создания конструкта. Для облегчения крупномасштабного синтеза конструкта N- или С-концевые аминокислотные остатки пептида можно модифицировать. Если желаемый пептид особенно чувствителен к расщеплению пептидазами, нормальную пептидную связь можно заменять на нерасщепляющийся пептидомиметик. Такие связи и методы синтеза хорошо известны в данной области.
Нестандартные, неприродные аминокислоты также можно включать в пептидную последовательность при условии, что они не будут мешать способности пептида взаимодействовать с молекулами МНС и оставаться перекрестно реагирующим с Т-клетками, узнающими природные последовательности. Неприродные аминокислоты можно использовать для повышения устойчивости пептида к протеазе или химической устойчивости. Примеры неприродных аминокислот включают D-аминокислоты и модификации цистеина.
Пептид можно получать путем очистки из природного белка или получать рекомбинантными методами или химическим синтезом. Методы получения пептидов хорошо известны в данной области.
Разработчикам вакцин будет понятно, что для обеспечения более широкого профилактического или иммунотерапевтического эффекта может потребоваться более одного пептида. Такие многокомпонентные препараты являются желательными, так как они могут быть более эффективными для вызывания соответствующих иммунных реакций. Например, оптимальный препарат противогриппозной вакцины может содержать ряд пептидных эпитопов из различных белков вируса гриппа, или оптимальный имму-нотерапевтический препарат против ВИЧ может содержать ряд эпитопов из различных белков ВИЧ. Альтернативно, несколько эпитопов можно включать в препарат, чтобы создать иммунитет против ряда патогенов. Например, вакцина против инфекции дыхательных путей может содержать эпитопы из вируса гриппа и респираторно-синцитиального вируса. Раствор по изобретению может содержать несколько иммуногенных пептидов. Как правило, каждый пептид содержит отличающийся эпитоп. Каждый пептид может быть связан с общим фторуглеродным вектором. Более конкретно, в препарате по изобретению могут присутствовать сочетания фторуглерод-связанных пептидов, при этом различные пептиды независимо связаны с фторуглеродными цепями. В смеси фторуглерод-связанных пептидов каждый пептид может быть связан с фторуглеродной цепью единой структуры. Альтернативно, смесь может содержать пептиды, связанные с фторуглеродными цепями различной структуры.
Раствор по изобретению может содержать один или более фторуглерод-связанных пептидов, предпочтительно от примерно 2 до примерно 20, предпочтительно от примерно 3 до примерно 10. В конкретных вариантах осуществления многокомпонентная вакцина может содержать 4, 5, 6, 7, 8 или 9 фторугле-род-связанных пептидов. Это помогает создавать иммунный ответ на несколько эпитопов.
Различные пептиды, присутствующие в многокомпонентном растворе, могут быть различными антигенами из одного и того же патогена или могут быть антигенами из различных патогенов. Альтернативно, пептиды могут быть различными опухолевыми антигенами или антигенами из различных частей аутологичного белка.
В примерах использованы фторуглерод-связанные пептиды, содержащие иммуногенные пептиды вируса гриппа. Настоящее изобретение не ограничивается данными конкретными пептидами, но распространяется на любые иммуногенные пептиды, обладающие описанными выше свойствами. Однако предпочтительные препараты по изобретению включают один или более из следующих шести иммуногенных пептидов вируса гриппа, которые выбраны из высоко консервативных сегментов белков PA, PB1, РВ2,
NP и M1:
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK (SEQ ID N0:1)
VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG (SEQ ID N0:2) YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE (SEQ ID N0:3) APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA (SEQ ID N0:4) DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS (SEQ ID N0:5) DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER (SEQ ID N0:6).
Предпочтительно, каждый из пептидов отдельно связан с фторуглеродным вектором. Особенно предпочтительные препараты по изобретению содержат все шесть из вышеуказанных фторуглерод-связанных пептидов и не содержат фторуглерод-связанные пептиды, включающие пептиды с последовательностями, приведенными в любой из SEQ ID N0:13, 14, 23 и 24. В предпочтительные препараты по изобретению можно включать другие фторуглерод-связанные пептиды. Однако предпочтительно, если препарат содержит шесть фторуглерод-связанных пептидов, описанных выше, и никаких других фторуг-лерод-связанных пептидов.
Один или более из шести пептидов можно заменять вариантным пептидом, содержащим одну, две или три аминокислотные замены. Вариантные пептиды могут содержать последовательность, полученную из различных штаммов вируса гриппа. Например, SEQ ID N0:1 можно заменять на SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:2 можно заменять на SEQ ID N0:8 или 9, SEQ ID N0:3 можно заменять на SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:4 на SEQ ID N0:11 и/или SEQ ID N0:5 на SEQ ID N0:12.
Пептиды можно связывать с фторуглеродным вектором через спейсерный фрагмент, как описано ниже. Предпочтительно, спейсерный фрагмент представляет собой остаток лизина. Соответственно, предпочтительный препарат по изобретению может содержать фторуглерод-связанные пептиды, в которых пептиды имеют одну или более из последовательностей, приведенных в SEQ ID N0:17-22. Предпочтительно, N-концевой остаток лизина в пептидах связан с фторуглеродом, имеющим формулу C8F17(CH2)2C00H. Фторуглерод предпочтительно связан с эпсилон-цепью N-концевого остатка лизина.
Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретение относится к прозрачному водному кислому раствору в качестве промежуточного продукта для получения фармацевтически приемлемого препарата, состоящего из, или состоящему практически из, шести фторуглерод-связанных пептидов с SEQ ID N0:1-6 и фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя и, необязательно, адъюванта.
В каждом из шести фторуглерод-связанных пептидов пептиды предпочтительно состоят из одной из SEQ ID N0:1-6 с добавленным N-концевым остатком лизина (т.е. одной из SEQ ID N0:17-22), при этом остаток лизина связан с фторуглеродной цепью, имеющей формулу C8F17(CH2)2C00H через эпсилон-цепь остатка лизина.
Присоединенный фрагмент фторуглерода в фторуглерод-связанном пептиде может содержать одну или более цепей, производных от перфторуглерода или смешанных фторуглерод/углеводородных радикалов, и может быть насыщенным или ненасыщенным, при этом каждая цепь содержит от 3 до 30 атомов углерода.
Таким образом, цепи в присоединенном фрагменте фторуглерода, как правило, являются насыщенными или ненасыщенными, предпочтительно насыщенными. Цепи в присоединенном фрагменте фто-руглерода могут быть линейными или разветвленными, но предпочтительно являются линейными. Каждая цепь, как правило, содержит от 3 до 30 атомов углерода, предпочтительно от 5 до 25, более предпочтительно от 8 до 20.
Для ковалентного связывания фрагмента фторуглерода с пептидом включают реакционноспособ-ную группу или лиганд, например -C0-, -NH-, S, О или любую другую подходящую группу. Использование таких лигандов для создания ковалентных связей хорошо известно в данной области. Реакционно-способная группа может находиться в любом положении на фторуглеродной молекуле.
Присоединение фторуглеродного фрагмента к пептиду можно осуществлять при помощи функциональных групп, таких как -ОН, -SH, -C00H и -NH2, естественным образом присутствующих или введенных в любой участок пептида. Примеры таких связей включают амидные, гидразоновые, дисульфидные, тиоэфирные и оксимовые связи.
Настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида.
В способе по изобретению по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид солюбилизирован в уксусной кислоте в качестве первого этапа формулирования фармацевтического препарата. Фторугле-род-связанный пептид, используемый в качестве исходного материала, как правило, находится в высушенной форме. Фторуглерод-связанный пептид(ы), солюбилизированный в уксусной кислоте, как правило, включает пептид, который имеет длину по меньшей мере примерно 20 аминокислот, и в котором по меньшей мере примерно 50% аминокислот являются гидрофобными. Другие фторуглерод-связанные пептиды могут быть солюбилизированы в уксусной кислоте или в других растворителях. В частности, фторуглерод-связанные пептиды, которые включают пептиды, имеющие длину менее 20 аминокислот и/или содержащие менее 50% гидрофобных остатков, можно солюбилизировать в ином растворителе, чем уксусная кислота.
Используемый в данном документе термин "солюбилизация" означает диспергирование фторугле
род-связанных пептидов в растворителе с образованием визуально прозрачного раствора, который не теряет материал при стерилизации фильтрованием. Фторуглерод-связанные пептиды могут присутствовать в мультимолекулярной мицеллярной структуре. "Диспергирование" означает растворение лиофили-зированных фторуглерод-связанных пептидов с целью разрушения частиц и достижения растворимости за счет образования мицеллярных структур.
Термин "агрегаты" используют в данном документе для описания макромолекулярных структур фторуглерод-связанных пептидов. Мицеллярные агрегаты фторуглерод-связанных пептидов могут способствовать солюбилизации. Крупные агрегаты фторуглерод-связанных пептидов приводят к появлению видимых частиц. Термин "частицы" используют в данном документе для обозначения агрегатов фторуг-лерод-связанных пептидов, видимых невооруженным глазом.
Солюбилизация фторуглерод-связанных пептидов в уксусной кислоте обычно приводит к образованию прозрачного раствора, содержащего мицеллярные агрегаты фторуглерод-связанных пептидов. Мицеллярные агрегаты, как правило, имеют диаметр от примерно 20 до примерно 50 нм, например от примерно 17 до примерно 30 нм. Однако некоторые более крупные агрегаты, имеющие диаметр более чем примерно 50 нм, обычно не более 20%, например от примерно 10 до примерно 15% агрегатов, имеют диаметр более 100 нм. Предпочтительно, агрегаты не видны невооруженным глазом. Размер частиц можно определять любым подходящим методом, например методом динамического рассеяния света (ДРС) или при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Например, при использовании метода ПЭМ в негативном окрашивании, 20 мкл раствора фторуглерод-связанного пептида помещают на медную сетку с формвар-углеродным покрытием электронного микроскопа (300 меш). Затем добавляют 20 мкл уранилацетата (1% водный раствор). Через 30 с избыток раствора быстро удаляют фильтровальной бумагой ватман. Затем образец оставляют высыхать в течение по меньшей мере 2 мин до анализа. Затем проводит исследование с помощью просвечивающего электронного микроскопа Philips CM120 biotwin при ускоряющем напряжении 120 кВ. Изображения получают при прямом увеличении в диапазоне от 50000х до 150000х.
Примеры типичной последовательности операций производственного процесса с момента первоначального этапа солюбилизации до окончательного представления препарата приведены на фиг. 1 и 2. Это подчеркивает необходимость для растворителя не только обеспечивать растворение фторуглерод-связанного пептида, но также быть совместимым с последующими процессами, включая смешивание с потенциальными стабилизаторами, стерилизацию фильтрованием и лиофилизацию. На блок-схеме буква п используется для обозначения переменного числа дополнительных фторуглерод-связанных пептидов, которые могут быть включены в препарат.
Как известно специалистам в данной области, вариации технологического процесса допустимы при достижении таких же итоговых характеристик препарата; а именно, что исходные компоненты гомогенно смешивают друг с другом в требуемых соотношениях с диспергированием любых агрегатов, стерилизуют и представляют в подходящем формате для введения. Такие примеры могут включать введение интенсивного перемешивания и/или обработку ультразвуком после стадии смешивания или после разбавления для облегчения солюбилизации. Другие изменения последовательности операций производственного процесса могут включать проведение стерилизации фильтрованием на более ранней стадии процесса или пропуск этапа лиофилизации, чтобы иметь возможность представить жидкий конечный препарат.
Альтернативно, один набор фторуглерод-связанных пептидов можно солюбилизировать индивидуально в одном органическом растворителе, затем смешивать вместе и стерилизовать фильтрованием, при этом второй набор фторуглерод-связанных пептидов солюбилизируют в альтернативном растворителе, смешивают и стерилизуют фильтрованием (фиг. 2), прежде чем два набора фторуглерод-связанных пептидов смешивают вместе для дальнейшей обработки.
Исходный растворитель может быть одним и тем же или разным для каждого фторуглерод-связанного пептида, так что один или более из фторуглерод-связанных пептидов можно солюбилизиро-вать в уксусной кислоте, и один или более из фторуглерод-связанных пептидов можно солюбилизиро-вать в другом растворителе, имеющем соответствующие свойства. Например, в последовательности производственных операций на фиг. 1 "В" может быть иным растворителем, чем "А".
Альтернативно, уксусную кислоту можно использовать в качестве исходного растворителя для различных фторуглерод-связанных пептидов, однако ее можно использовать в различных оптимизированных концентрациях для различных фторуглерод-связанных пептидов. Например, в последовательности производственных операций на фиг. 1 "В" может быть тем же растворителем, что и "А", но в другой концентрации.
Различные фторуглерод-связанные пептиды можно смешивать до солюбилизации. Уксусную кислоту можно использовать в концентрации от 5 до 80% (об./об.) водного раствора уксусной кислоты, например, в концентрации от 10 до 70% (об./об.), например, в концентрации примерно 20 или 50% (об./об.). В способе для формулирования смеси фторуглерод-связанных пептидов различные пептиды можно солюбилизировать в уксусной кислоте различной концентрации перед смешиванием. Например, один или более фторуглерод-связанных пептидов можно солюбилизировать в 10% (об./об.) уксусной кислоте, а один или более пептидов можно солюбилизировать в 80% (об./об.) уксусной кислоте.
Когда в производственном процессе используют более одного растворителя, каждый используемый растворитель, как правило, способен солюбилизировать фторуглерод-связанный пептид, который солю-билизируют в относительно высоких концентрациях (например, вплоть до 10-миллимолярной, например до 2-миллимолярной); смешивается с водой для облегчения разведения водой перед лиофилизацией; совместим со стабилизаторами, используемыми при лиофилизации, такими как маннит, которые могут быть использованы в процессе производства; имеет профиль безопасности, приемлемый для регулирующих органов в фармацевтике, например соответствует требованиям ICH Q3C (Примечание к руководству по примесям: остаточные растворители) и требованиям к растворителям III класса, определенным в Фармакопее США для остаточных растворителей <467> (максимально допустимое количество остаточного растворителя 50 мг/сутки в конечном препарате или менее чем 5000 промилле или 0,5%); поддается лиофилизации, т. е. является достаточно летучим, чтобы быть удаленным до безопасного уровня при лиофилизации; способен эффективно диспергировать молекулы фторуглерод-связанного пептида воспроизводимым единообразным образом, так что потери выхода при стерилизации фильтрованием сводятся к минимуму; неспособен реагировать с, или стимулировать деградацию молекулы фторуглерод-связанного пептида; и/или совместим с материалами, обычно используемыми в производстве фармацевтических препаратов (контейнерами/мембранными фильтрами/трубопроводами и так далее).
Примеры растворителей, которые можно использовать для диспергирования одного или более из фторуглерод-связанных пептидов в смеси, включают фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), про-пан-2-ол, трет-бутанол, ацетон и другие органические растворители.
Если различные фторуглерод-связанные пептиды солюбилизируют отдельно, например, в различных растворителях или при различных концентрациях уксусной кислоты, солюбилизированные пептиды смешивают для получения смеси фторуглерод-связанных пептидов.
Один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов и/или адъювантов также можно добавлять к солюбилизированному фторуглерод-связанному пептиду или смеси фторуглерод-связанных пептидов.
"Эксципиент" означает неактивное вещество, используемое в качестве носителя для фторуглерод-связанных пептидов. Как правило, солюбилизированные фторуглерод-связанные пептиды смешивают с эксципиентом. Потенциальные эксципиенты, которые могут быть использованы в процессе производства, включают стабилизаторы или наполнители, необходимые для эффективной лиофилизации. Примеры включают сорбит, маннит, поливинилпирролидон и их смеси, предпочтительно маннит. Другие эксципи-енты включают консерванты, такие как антиоксиданты, лубриканты, криопротекторы и связующие вещества, хорошо известные в данной области.
Для увеличения широты охвата и интенсивности иммунного ответа, вызываемого пептидным антигеном, в препарат можно включать один или более адъювантов и/или других иммунопотенциирующих веществ. В данном контексте "адъювант" представляет собой вещество, способное модулировать иммунный ответ, направленный на введенный совместно с ним антиген, которое при этом оказывает очень незначительное, если вообще оказывает, воздействие, если вводить только его. Такие адъюванты могут быть способны усиливать иммунный ответ с точки зрения интенсивности и/или профиля цитокинов.
Подходящие адъюванты включают:
(1) природные или полученные синтетическим путем усовершенствованные производные природных компонентов бактерий, например адъювант Фрейнда и его производные, мурамилдипептидные (MDP) производные, CpG, монофосфориллипид A;
(2) другие известные адъюванты или потенцирующие вещества, такие как сапонины, соли алюминия и цитокины;
(3) адъюванты типа "масло-в-воде", такие как субмикронная эмульсия типа "масло-в-воде" MF-59, адъюванты типа "вода-в-масле", иммуностимулирующие комплексы (ISC0M), липосомы, сформулированные нано- и микрочастицы;
(4) бактериальные токсины и анатоксины, и
(5) другие полезные адъюванты, хорошо известные специалистам в данной области.
После солюбилизации и смешивания раствор фторуглерод-связанного пептида(ов) разбавляют. Например, смесь можно разбавлять водой.
Раствор, содержащий фторуглерод-связанные пептиды, предпочтительно стерилизуют. Стерилизация является особенно предпочтительной, если препарат предназначен для системного применения. Можно использовать любые подходящие способы стерилизации, такие как УФ-стерилизация или стерилизация фильтрованием. Предпочтительно используют стерилизацию фильтрованием. Стерилизация фильтрованием может включать поэтапное фильтрование через 0,45-мкм фильтр, а затем через 0,22-мкм фильтр.
Стерилизацию можно проводить до или после добавления любых эксципиентов и/или адъювантов.
После стерилизации фильтрованием выход фторуглерод-связанного пептида, присутствующего в стерильном растворе, как правило, составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% от количества фторуглерод-связанного пептида, присутствующего до стерилизации. Можно добиться выхода более чем 95%, например, выхода 98, 99% или
более, например выхода 100%.
После стерилизации фторуглерод-связанный пептид, как правило, присутствует в растворе в ми-целлярных структурах, имеющих диаметр от примерно 20 до примерно 100 нм, например примерно 30 или примерно 50 нм. Более крупные частицы, присутствующие в растворе до стерилизации, как правило, могут видоизменяться в результате стерилизации фильтрованием. Стерилизованный раствор можно хранить в стерильном контейнере.
Стерильный препарат высушивают для удаления уксусной кислоты. Высушивание препарата также способствует длительному хранению. Можно использовать любой подходящий метод высушивания. Лиофилизация является предпочтительной, но можно использовать и другие подходящие методы высушивания, такие как вакуумная сушка, распылительная сушка, распылительная сублимационная сушка или сушка в псевдоожиженном слое. Процедура высушивания может приводить к образованию аморфного брикета, в котором заключены фторуглерод-связанные пептиды.
Для длительного хранения стерильный препарат можно лиофилизировать. Лиофилизацию можно проводить путем сублимационной сушки. Сублимационная сушка, как правило, включает замораживание, а затем высушивание. Например, смесь фторуглерод-связанных пептидов можно замораживать в течение 2 ч при -80°С и сушить вымораживанием в аппарате для сублимационной сушки в течение 24 ч.
Фармацевтически приемлемые препараты по изобретению могут быть твердыми композициями. Композицию фторуглерод-связанного пептида можно получать в форме сухого порошка. Брикет, полученный после лиофилизации, можно измельчать в порошок. Таким образом, твердая композиция по изобретению может принимать форму сыпучих частиц. Твердую композицию обычно предоставляют в виде порошка в герметичном флаконе, ампуле или шприце. Предназначенные для ингаляции порошки можно предоставлять в ингаляторе сухого порошка. Альтернативно, твердую матрицу можно предоставлять в виде пластыря. Порошок может быть спрессован в форме таблетки.
Сухой, например лиофилизированный, препарат фторуглерод-связанного пептида можно восстанавливать перед введением. Используемый в данном документе термин "восстановление" означает растворение сухого препарата вакцины перед использованием. После высушивания, например лиофилиза-ции, препарат фторуглерод-связанного пептида предпочтительно восстанавливают для получения изотонической, pH-нейтральной, гомогенной суспензии. Препарат обычно восстанавливают в водной фазе, например добавляя воду для инъекций (Hyclone), гистидиновый буфер (например 28 мМ L-гистидиновый буфер) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Восстановленный препарат, как правило, разливают в стерильные контейнеры, такие как флаконы, шприцы или любой другой формат, подходящий для хранения или введения.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Пример 1. Синтез пептидов.
Синтезировали пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID N0:1-6, 10, 11 и 13-16. Синтез каждого пептида проводили на твердой фазе, применяя классическую стратегию с использованием Fmoc/трет-бутила и смолы TentaGel HL NH2. Остаток лизина добавляли к N-концу каждой последовательности. Последовательности с добавленным N-концевым остатком лизина приведены в SEQ ID N0:17-28. После добавления N-концевого остатка лизинила, блок смолы был разделен на две части. Одну часть использовали для присоединения фторуглеродной цепи (C8F17(CH2)2C00H) к эпсилон-цепи N-концевого остатка лизина для получения фторуглерод-связанного пептида (ФСП). На второй части проводили ацетилирование эпсилон-цепи N-концевого остатка лизина с целью получения природного пептида для использования в сравнительных исследованиях. Очищенные фторуглерод-связанные пептиды (ФСП) и природные пептиды получали путем расщепления в присутствии трифто-руксусной кислоты (ТФУ) и окончательной очистки методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Как ФСП, так и природные пептиды, описанные ниже, имеют амидогруппу на С-конце. Все препараты имели чистоту 95% или выше и были предоставлены в виде сухого лиофилизированного порошка. Чистую массу пептидов рассчитывали на основании анализа содержания азота.
Следующие пептиды Р1-Р12 связывали с фторуглеродной цепью для получения ФСП или ацетили-ровали для получения природных пептидов (использовали стандартный однобуквенный код для обозначения аминокислот; X = фторуглеродный вектор (фторуглерод-связанные пептиды); Z = ацетил (природные пептиды)):
P1: NH2-K(X или Z)HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK-C0NH2
Р2: NH2-K(X или Z)APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA-C0NH2
P3: NH2-K(X или Z)APIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA-C0NH2
Р4: NH2-K(X или Z)DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS-C0NH2
Р5: NH2-K(X или Z)DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER-C0NH2
P6: NH2-K(X или Z)SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY-C0NH2 Р7: NH2-K(X или Z)KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG-C0NH2
Р8: NH2-K(X или Z)VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG-C0NH2 Р9: NH2-K(X или Z)YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-C0NH2
Р10: NH2-K(X или Z)YITKNQPEWFRNILSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-C0NH2 P11: NH2-K(X или Z)QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNK-C0NH2
P12: NH2-K(X или Z)PDLYDYKENRFIEIGVTRREVHIYYLEKANKIKSE-C0NH2
Физико-химические свойства природных пептидов приведены в табл. 1 ниже. Остатками, считающимися гидрофобными, являются W, Y, I, F, L, V, М, А, Р, G и C. Заряженными остатками являются (+): K, R, Н; (-): D, Е.
Таблица 1. Физико-химические свойства выбранных пептидов
Пептид
Процентное содержание гидрофобных остатков
Положительно заряженные (включая остаток лизина, добавленный на N-конце)
Отрицательно заряженные
Р10
Р11
Р12
Пример 2. Растворимость природных пептидов и ФСП в воде.
Оценивали растворимость каждого ФСП в воде. Каждый ФСП диспергировали в 300 мкл воды до конечной концентрации 1,333 мМ и перемешивали на вихревой мешалке и обрабатывали ультразвуком. Типичные условия диспергирования представляли собой четыре последовательности из трехминутных обработок в ультразвуковой ванне, перемежающиеся с 30-секундным встряхиванием на вихревой мешалке. После осмотра полученный раствор разбавляли раствором маннита (потенциальная среда для лиофилизации, конечная концентрация пептида 0,167 мМ, 1,33% (мас./об.) маннит). Растворимость оценивали визуально по мутности полученной дисперсии (по шкале: прозрачный/мутный-/мутный/мутный+) и наличию частиц. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2. Диспергируемость и растворимость ФСП в воде и 1,33% (мас./об.) растворе маннита
Фторуглерод-связанный пептид
Диспергирование в воде
Дальнейшее растворение в смеси маннит:вода
Растворимость
Растворимость
FCP1
мутный/частицы
прозрачный/частицы
FCP2
мутный-/без частиц
прозрачный/без частиц
FCP3
мутный-/частицы
прозрачный/частицы
FCP4
прозрачный/без частиц
прозрачный/без частиц
FCP5
мутный/частицы
мутный-/частицы
FCP6
мутный-/частицы
прозрачный/частицы
FCP7
мутный+/без частиц
мутный+/без частиц
FCP8
мутный/частицы
мутный/ч а с тицы
FCP9
мутный-/частицы
прозрачный/частицы
FCP10
мутный-/частицы
прозрачный/частицы
FCP11
прозрачный/без частиц
прозрачный/без частиц
FCP12
мутный/частицы
мутный-/частицы
Визуальный осмотр отдельных растворов фторуглерод-связанных пептидов после первоначального диспергирования в воде показал, что только Р4 и Р11 были полностью растворимы в воде; каждый из этих растворов был прозрачным без наличия частиц. Все остальные растворы были мутными и содержали частицы, свидетельствующие о том, что эти ФСП растворились не полностью. При последующем разбавлении раствором маннита, Р2, Р4 и Р11 становились полностью растворимыми, образуя прозрачные растворы без видимых частиц. Растворы Р1, P3, P6, Р9 и Р10 также были прозрачными, однако в них наблюдались частицы, свидетельствующие о том, что они были частично растворимыми в смеси ман
нит/вода. Р5, Р7, Р8 и Р12 были нерастворимы в смеси маннит/вода, образуя мутные растворы, содержащие частицы. Не было обнаружено корреляции между процентным содержанием гидрофобных аминокислот в пептидной последовательности, либо положительным или отрицательным зарядом, и растворимостью.
Для сравнения, растворимость природных пептидов также оценивали в воде при той же концентрации молекул; в случае всех природных пептидов, за исключением Р8, растворы были прозрачными без видимого присутствия частиц.
В заключение, растворимость каждого фторуглерод-связанного пептида зависит от его агрегацион-ных свойств; большинство ФСП не были полностью растворимыми в воде или в растворе маннита. Растворимость каждого ФСП невозможно предсказать на основании его физико-химических характеристик. Эквивалентные природные пептиды были более растворимы в воде, чем ФСП при той же концентрации.
Также оценивали растворимость смесей фторуглерод-связанных пептидов. Готовили восьмивалентные препараты (конечная концентрация каждого пептида 0,167 мМ, 1,33% (мас./об.) маннит, композиции ФСП, приведенные в табл. 3). Выход каждого пептида после стерилизации фильтрованием (0,22-мкм Millex 25-мм ПВДФ фильтр) определяли методом ОФ-ВЭЖХ.
Визуальные наблюдения были подтверждены результатами ВЭЖХ по выходу после фильтрования. Общие выходы по данным ОФ-ВЭЖХ после фильтрования составляли примерно 50 и 57% для смеси 1 и смеси 2 соответственно, свидетельствуя о том, что крупные частицы ФСП удалялись при фильтровании. Вследствие этого смеси ФСП также плохо растворимы в воде.
Пример 3. Растворимость ФСП в эксципиентах и диспергаторах.
С целью повышения растворимости фторуглерод-связанных пептидов в воде проводили оценку ряда эксципиентов и диспергаторов, которые ранее были признаны полезными в производстве фармацевтических препаратов. К ним относятся полиэтиленгликоли, плюрониловые сурфактанты, лецитин, глицерин, соевое масло, сафлоровое масло, гликофурол, дипальмитоилфосфатидилхолин, Labrafac CC (гли-церид со средней длиной цепи), гидроксилпропил-бета-циклодекстрин (HPBCD) и сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина, а также их сочетания. Растворимость семивалентной эквимассовой смеси фторуглерод-связанных пептидов определяли при помощи микроскопического исследования (конечная концентрация 2,5 мг/мл).
Ни одно из протестированных условий не позволило достичь хорошего диспергирования фторугле-род-связанных пептидов. Было обнаружено, что HPBCD улучшает солюбилизацию, но требовалась инкубация в течение одного дня при комнатной температуре для достижения 70-80% растворимости. В заключение, фторуглерод-связанные пептиды были устойчивы к действию диспергаторов, таких как цик-лодекстрины, сурфактанты или блок-сополимеры.
Пример 4. Растворимость ФСП в органических растворителях.
Оценивали растворимость фторуглерод-связанных пептидов в ряде органических растворителей. В случае 80% (об./об.) пропан-2-ола, трет-бутанола, ДМСО и ацетона растворы готовили с одной и той же конечной концентрацией 1,33 мМ фторуглерод-связанных пептидов. В случае 80% (об./об.) уксусной кислоты конечная концентрация фторуглерод-связанных пептидов составляла 2,0 мМ. Результаты представлены на фиг. 3.
В заключение, все фторуглерод-связанные пептиды были растворимы в 80% (об./об.) уксусной кислоте, без пены или наличия частиц. Растворы 80% (об./об.) пропан-2-ола, трет-бутанола, ДМСО и ацетона не могли обеспечить полную растворимость изучаемых ФСП.
Пример 5. Влияние маннита на солюбилизацию.
Изучали эффект разведения или добавления маннита на солюбилизацию в различных растворителях. Каждый фторуглерод-связанный пептид диспергировали в 80% (об./об.) растворителе в воде согласно подписям к фиг. 4 и перемешивали на вихревой мешалке, с последующим семикратным разведением раствором маннита. В случае 80% (об./об.) пропан-2-ола, трет-бутанола, ДМСО и ацетона растворы гото
вили с одной и той же конечной концентрацией 0,167 мМ фторуглерод-связанных пептидов и конечной концентрацией 1,33% (мас./об.) маннита. В случае 80% (об./об.) уксусной кислоты конечная концентрация фторуглерод-связанных пептидов составляла 0,25 мМ. Результаты представлены на фиг. 4.
Также готовили эквимолярные смеси фторуглерод-связанных пептидов, описанные выше, содержащие следующие пептиды в каждом растворителе:
смесь 1: ФСП1, ФСП3, ФСП4, ФСП5, ФСП6, ФСП7, ФСП9, ФСП12;
смесь 2: ФСП2, ФСП4, ФСП5, ФСП6, ФСП7, ФСП8, ФСП 10, ФСП11.
Эффективной растворимости отдельных ФСП, а также смесей 1 и 2 удалось достичь только при использовании 80% (об./об.) уксусной кислоты, как показано на фиг. 4.
Пример 6. Выход ФСП после стерилизации фильтрованием растворов ФСП.
Выход после стерилизации фильтрованием (0,22-мкм Millex 25-мм ПВДФ фильтр) каждого из фторуглерод-связанных пептидов в смесях, полученных в примере 4, определяли методом ОФ-ВЭЖХ. Результаты приведены в табл. 4 и 5 ниже.
Таблица 4. Процент выхода после фильтрования отдельных ФСП из восьмивалентной смеси 1
Фторуглерод-связанный пептид
80% (об./об.) уксусная кислота
80% (об./об.) пропан-2-ол
80% (об./об.)
трет-бутанол
80% (об./об.) ДМСО
80% (об./об.) ацетон
ФСП1
100,2
97, 8
96, 1
95, 1
89, 9
ФСП12
100,2
16, 9
6, 6
32, 0
12,7
ФСПЗ
100,5
97, 9
102, 0
100, 8
99, 6
ФСП4
99, 8
20,5
19,3
77,2
24, 4
ФСП7
99, 4
90, 9
99, 9
47,8
42, 7
ФСП9
99, 8
84,3
84,9
87,7
69, 1
ФСП5
100,2
34, 3
90,2
17,2
3,2
ФСПб
101,3
78,4
62, 3
85, 8
63, 2
Среднее
100,2
65, 1
70,2
67, 9
50, 6
Процент выхода после фильтрования отдельных ФСП из восьмивалентн
Фторуглерод-связанный пептид
80% (об./об.) уксусная кислота
80% (об./об.) пропан-2-ол
80% (об./об.)
трет-бутанол
80% (об./об.) ДМСО
80% (об./об.) ацетон
ФСП11
99, 5
57,4
52, 3
85, 4
76, 4
ФСП2
99, 8
92, 7
99, 5
98,2
85, 4
ФСП4
100
21, 6
10, 0
73, 0
4,5
ФСП7
93,3
90, 5
89, 2
46, 4
43,7
ФСП8
99, 8
20, 7
21,2
34, 9
17, 6
ФСП10
98, 1
87, 7
87, 3
89, 4
79, 4
ФСП5
99, 1
35, 9
51, 8
18,1
2,9
ФСПб
97, 4
69, 5
82, 1
91, 0
64, 1
Среднее
98, 4
59, 5
61, 7
67, 1
46,7
Никакой потери фторуглерод-связанных пептидов не наблюдали после стерилизации фильтрованием смесей, полученных с использованием 80% (об./об.) уксусной кислоты. Сделан вывод, что уксусная кислота с последующим разбавлением водой является предпочтительным растворителем для растворения и фильтрования фторуглерод-связанных пептидов, однако потребуется снижать концентрацию, чтобы свести к минимуму остаточные уровни уксусной кислоты в конечном препарате.
Пример 7. Влияние концентрации уксусной кислоты на растворимость ФСП.
Для того чтобы ограничить концентрацию уксусной кислоты далее в процессе формулирования и в конечном препарате, для каждого фторуглерод-связанного пептида определяли наименьшую концентрацию уксусной кислоты в воде, позволяющую достичь эффективного диспергирования и поддерживать видимость растворимости. При использовании маннита в качестве криопротектора важно свести к минимуму концентрацию уксусной кислоты на этапе лиофилизации для получения стабильного и аморфного лиофилизированного препарата. Определяли минимальную концентрацию уксусной кислоты для достижения приемлемой диспергируемости и растворимости отдельных фторуглерод-связанных пептидов. Конечная концентрация фторуглерод-связанного пептида после первоначального диспергирования в уксусной кислоте составляла 2 мкмоль/мл, а после разведения маннитом 0,250 мкмоль/мл.
Было установлено, что концентрация уксусной кислоты всего лишь 10% (об./об.) обеспечивает достаточное диспергирование для некоторых из фторуглерод-связанных пептидов. Однако при том, что некоторым фторуглерод-связанным пептидам требуется менее чем 80% (об./об.) уксусная кислота для достижения полного растворения, полученный препарат оказался с течением времени физически нестабильным с образованием геля или растворимых частиц (например, ФСП6, ФСП8 и ФСП9). Для этих трех пептидов было установлено, что 80% (об./об.) уксусная кислота позволяет достичь полного диспергирования, при этом предотвращая любые изменения физического состояния.
Выход после фильтрования определяли количественно методом ОФ-ВЭЖХ, сравнивая площади пиков каждого фторуглерод-связанного пептида в смеси 3 до и после стерилизации фильтрованием. Процент выхода измеряли для каждого ФСП, и средний выход рассчитывали как среднее из процентов выхода каждого отдельного ФСП. Общий выход после фильтрования (при использовании 0,22-мкм фильтра), измеренный после смешивания и разведения, как правило, составлял более 95%.
Пример 8. Характеристика структур, образованных фторуглерод-связанными пептидами.
Образование самоорганизующихся мультимолекулярных мицеллярных структур может играть центральную роль в процессе солюбилизации фторуглерод-связанных пептидов. Таким образом растворимость фторуглерод-связанных пептидов можно поддерживать после диспергирования и затем на протяжении всего процесса формулирования, особенно при восстановлении лиофилизированного препарата. Определение физических характеристик мультимолекулярных структур, собранных в процессе диспергирования, проводили с использованием метода динамического рассеяния света (ДРС) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
Анализатор частиц Zetasizer Nano S (позволяющий измерять частицы от 0,6 нм до 6 мкм) использовали для мониторинга размера частиц в смеси фторуглерод-связанных пептидов, на основании ДРС. Смесь 1 (ФСП1, ФСП3, ФСП4, ФСП5, ФСП6, ФСП7, ФСП9 и ФСП12) получали, как описано в примере 1 (табл. 3) с разбавителем маннитом.
Средний размер частиц (нм) в каждой смеси измеряли при 25°С, используя Nanosizer (Zetasizer Nano Series ZS, Malvern Instruments, UK). Использовали 250 мкл раствора, помещая его в пластиковую микрокювету. Времена корреляции были основаны на продолжительности 10 с на прогон, и в общей сложности проводили 5 прогонов на измерение. Результаты анализировали при помощи программы Dispersion Technology Software (Malvern Instruments, UK). Распределение объема частиц по размерам и по интенсивности получали для смеси 1. Средние количественные показатели объема частиц на основании размера рассчитывали при помощи программы Dispersion Technology Software.
ДРС для фторуглерод-связанных пептидов в растворе продемонстрировало наличие мультимолеку-лярных структур с диаметром, преимущественно находящимся в пределах примерно 20-50 нм (> 95% по объему) и приблизительно 12-16% (по интенсивности) популяции с размером более 100 нм (фиг. 5).
ПЭМ показала наличие гомогенной популяции сферических структур с размерами, согласующимися с данными ДРС (фиг. 6).
Пример 9. Влияние стерилизации поэтапным фильтрованием на мультимолекулярные структуры
ФСП.
Изучали влияние стерилизации поэтапным фильтрованием на мультимолекулярные структуры ФСП. Смесь 1 примера 7 фильтровали через стерилизующий 0,22-мкм Millex 25-мм ПВДФ фильтр, а затем анализировали методом ДРС, используя анализатор частиц Zetasizer Nano S, как описано в примере
Анализ ДРС продемонстрировал, что образованные структуры являются очень динамичными с вариабельной воспроизводимостью даже в пределах одной аналитической серии. Результаты от пяти до семи анализов собирали для расчета среднего размера частиц (представлено различными профилями на фиг. 7).
Неожиданно было обнаружено, что пропускание через 0,22-мкм фильтр может видоизменять муль-тимолекулярные структуры, образованные фторуглерод-связанными пептидами, первоначально солюби-лизированными в уксусной кислоте. Результаты ДРС продемонстрировали, что крупные частицы преобразуются в более мелкие частицы после фильтрования и что Kcount (параметр, который коррелирует с количеством частиц в растворе) также резко сокращается после фильтрования (до фильтрования 200 Kcounts; после фильтрования 120 Kcounts). Кроме того, введение 0,45-мкм фильтра перед использованием 0,22-мкм фильтра не уменьшало выход после фильтрования. Вследствие этого, стерилизация поэтапным фильтрованием может влиять на полученный размер собранных структур, не только просто удаляя крупные частицы из препарата и ограничивая их прохождение в следующие стадии производственного процесса (с сопутствующим уменьшением выхода), но, скорее, видоизменяя структуры посредством деформации так, что они становятся способными проходить через фильтр. Частицы с размером более 220 нм составляют примерно от 12 до 16% (по интенсивности) частиц в смеси, согласно данным ДРС. Они, по-видимому, не удаляются из раствора, поскольку выход после фильтрования, определяемый методом ВЭЖХ, составляет более 97%.
Распределение по размерам частиц препарата смеси 1 также оценивали после следующего за лио-филизацией восстановления образцов в 10 мМ Трис-HCl или в воде (фиг. 8). Препарат смеси 1 легко восстанавливался до прозрачного или слегка опалесцирующего раствора в воде или в 10 мМ Трис-HCl, соответственно. Размеры частиц были сконцентрированы в области примерно 20-50 нМ с профилем, в целом аналогичным тому, который наблюдался в процессе формулирования (до лиофилизации). Это показывает, что после восстановления мультимолекулярные структуры ФСП поддерживаются без образования крупных видимых агрегатов.
Пример 10. Химическая стабильность ФСП.
Химическую стабильность фторуглерод-связанных пептидов оценивали, подвергая лиофилизиро-ванный препарат семи фторуглерод-связанных пептидов воздействию 50% (об./об.) уксусной кислоты в течение 24 часов. Смесь 3 готовили, первоначально солюбилизируя ФСП в уксусной кислоте (концентрация растворителя для каждого ФСП такая, как указано в примере 6), с последующим разбавлением и смешиванием с раствором маннита. Затем смесь лиофилизировали до восстановления в 50% (об./об.) уксусной кислоте.
Никакой деградации не наблюдали методом ВЭЖХ по сравнению с необработанным контролем (см. фиг. 9). Это продемонстрировало, что выбранные фторуглерод-связанные пептиды химически стабильны в 50% (об./об.) уксусной кислоте на протяжении типичного этапа смешивания во время фармацевтического производственного процесса.
Пример 11. Остаточная концентрация ацетата в конечной форме.
Важно свести к минимуму концентрацию уксусной кислоты в последующем процессе формулирования. Это позволит образоваться стабильному брикету во время лиофилизации и повысит pH препарата ближе к желаемой нейтральности. Уксусная кислота является летучей, и ее содержание, таким образом, снижается в процессе лиофилизации.
Для лиофилизации препараты смеси 3, полученные как описано в примере 9 (3-мл флаконы для лиофилизации с объемом 1,4 мл), сначала замораживали в течение двух часов в морозильной камере при -80°С, а затем лиофилизировали (настольный прибор Christ Alpha2-4 LSC) в течение 24 ч. Такая процедура позволяла получать лиофилизированные брикеты со стабильной структурой и однородной консистенцией. По расчетам, концентрация ацетата в препарате перед лиофилизацией составляла 8,8% (об./об.).
Для трех различных партий остаточная концентрация ацетата после лиофилизации (противоионы ацетата плюс уксусная кислота) во флаконах, определенная экспериментально, составляла 0,3-0,4, 0,7 и 0,5% (мас./мас.) соответственно. Стандартное отклонение для этого анализа было определено как +/-0,07% (мас./мас.) для ацетата; предел количественного определения составлял 0,1% (мас./мас.). Среднее значение остаточного ацетата соответствует приемлемому уровню приблизительно 0,35 мг на дозу для человека, намного ниже количества, рекомендованного ICH (максимально 50 мг в сутки).
Пример 12. Восстановление лиофилизированных препаратов ФСП.
Сравнивали восстановление сформулированных фторуглерод-связанных пептидов (семивалентная смесь 3) и несформулированного эквивалентного препарата. Отдельные ФСП солюбилизировали в уксусной кислоте, как описано в примере 9, смешивали и разводили раствором маннита и лиофилизирова
ли (конечная концентрация 0,35 мг на ФСП). Один флакон сформулированной смеси восстанавливали в 0,7 мл воды для инъекций (Hyclone); дополнительный флакон восстанавливали в 0,7 мл 28 мМ раствора гистидинового буфера. Для несформулированной смеси по 0,35 мг каждого необработанного ФСП помещали во флакон без какой-либо дополнительной обработки. Один флакон несформулированной смеси восстанавливали в 0,7 мл 4,5% раствора маннита для обеспечения концентрации эксципиента, идентичной той, которая была во флаконах сформулированного препарата. Дополнительный флакон несформулированной смеси восстанавливали в 0,7 мл 28 мМ гистидина в 4,5% растворе маннита.
Фотографии ниже (фиг. 10 и 11) иллюстрируют растворимость ФСП после первоначального диспергирования ручным встряхиванием с последующим перемешиванием на вихревой мешалке в течение 30 с и обработкой в ультразвуковой ванне в течение одного часа.
Визуальный осмотр несформулированных образцов после восстановления как раствором ман-нит/вода, так и раствором гистидинового буфера, показал, что растворы не были полностью диспергированными и солюбилизированными. Каждый раствор был мутным, и можно было видеть крупные частицы, особенно прилипшие к стенке стеклянного флакона, которые не диспергировали с течением времени. Напротив, растворы сформулированной вакцины диспергированные как в воде, так и в растворе гисти-динового буфера, были прозрачными без присутствия частиц.
Данные результаты свидетельствуют о том, что способ первоначальной солюбилизации оказывает влияние на агрегационные свойства конечного восстановленного препарата. Диспергирование ФСП в уксусной кислоте в начале процесса формулирования приводит к образованию мицеллярных структур, которые сохраняются на протяжении последующих процессов смешивания, фильтрования и лиофилиза-ции. Это облегчает восстановление конечного лиофилизированного препарата в водной фазе в форме, не содержащей частиц.
Выводы.
Продемонстрировано, что уксусная кислота является хорошим растворителем для всех отдельных изученных фторуглерод-связанных пептидов. Была достигнута полная солюбилизация при высоких концентрациях ФСП (вплоть до 2000 нмоль/мл; примерно 10 мг/мл), при этом не наблюдалось никаких частиц после возмущений, вызванных интенсивным перемешиванием и обработкой ультразвуком. Растворимость сохранялась на протяжении последующей обработки благодаря амфифильным свойствам фто-руглерод-связанных пептидов, способствующим образованию спонтанно самоорганизующихся макро-молекулярных структур, что можно наблюдать при помощи динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопии. Таким образом, растворитель играет двойную роль; во-первых, он обеспечивает достаточную разрушительную способность для гарантированного разрушения крупных неупорядоченных структур в виде частиц и, во-вторых, поддерживает состояние среды, в которой муль-тимолекулярные упорядоченные мицеллярные структуры могут возникать и сохраняться. Эти структуры достаточно малы, чтобы сделать возможной солюбилизацию ФСП, так что при стерилизации фильтрованием не происходит потери материала. Мицеллярные структуры также сохраняются во время лиофили-зации и очень важны для облегчения повторной солюбилизации лиофилизата в водной среде перед введением препарата людям. ФСП, которые не были предварительно солюбилизированы в уксусной кислоте, невозможно в удовлетворительной степени восстановить из лиофилизировнного состояния в воде или гистидиновом буфере (пример 12).
Установлено, что 80% (об./об.) уксусная кислота солюбилизирует все ФСП. Однако избыточное содержание уксусной кислоты может предотвращать образование приемлемого брикета лиофилизата после сублимационной сушки. Кроме того, существуют законодательные ограничения, наложенные на уровни ацетата в фармацевтических препаратах. Вследствие этого, были исследованы более низкие концентрации уксусной кислоты; при этом концентрация 10% (об./об.) оказалась подходящей для четырех из семи ФСП, в то время как концентрация 80% (об./об.) была наименьшей концентрацией, пригодной для остальных трех ФСП. При обработке эта смесь из семи ФСП образовывала приемлемый брикет лиофилиза-та с уровнями ацетата, совместимыми с дозами, предназначенными для человека.
Все другие исследованные растворители были неспособны обеспечить полную солюбилизацию всех ФСП. Успех уксусной кислоты было невозможно предсказать, поскольку фторуглеродная цепь придает необычные физико-химические свойства молекуле (сравните, например, способности к солюбили-зации ФСП и эквивалентных природных пептидов в примере 1). Кроме того, отсутствует корреляция между способностью 10% (об./об.) уксусной кислоты солюбилизировать ФСП и гидрофобностью или содержанием заряженных остатков в пептиде.
Таким образом, уксусная кислота имеет следующие преимущества:
способна обеспечивать адекватную растворимость не только для отдельных ФСП, но также и для их смесей;
пригодна для всех изученных ФСП;
приводит к получению устойчивых и однородных препаратов;
смешивается с водой в концентрациях, предназначенных для использования (10-80% (об./об.)); способна солюбилизировать ФСП в относительно высоких концентрациях (по меньшей мере 10 миллимолярной);
находится в списке растворителей III класса ICH, подходит для использования человеком;
поддается лиофилизации (при этом уровни снижаются после типичной стадии лиофилизации);
приводит после последующего смешивания и разбавления к образованию раствора, который можно подвергать стерилизации поэтапным фильтрованием с минимальными потерями выхода;
приводит после лиофилизации к получению препарата, который может быть легко восстановлен с образованием изотонической, pH-нейтральной, гомогенной суспензии;
не реагирует с, и не стимулирует деградацию фторуглерод-связанных пептидов, и
совместима с материалами, обычно используемыми в производстве фармацевтических препаратов.
Пример 13. Получение вакцины против гриппа на основе фторуглерод-связанных пептидов.
Целью данного исследования является демонстрация преимущества способа формулирования, разработанного для производства в соответствии с требованиями надлежащей производственной практики (GMP) фармацевтически приемлемой универсальной вакцины против гриппа A (FP01.1), содержащей шесть фторпептидов, включающих пептиды с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:1-6. Конкретными целями были:
1. оценить ключевые параметры препарата для производства FP-01.1:
a. легкость солюбилизации фторпептида в растворах уксусной кислоты;
b. определение размера мицелл в момент фильтрования;
c. выход после фильтрования;
d. химическую и физическую стабильность фторпептидов; и
2. сравнить качество восстановленной вакцины FP-01.1 (сформулированные фторпептиды) с эквивалентным препаратом, содержащим несформулированные фторпептиды.
Авторы изобретения разработали способ формулирования и применили его к производству универсальной вакцины FP-01.1 против гриппа А, состоящей из шести фторуглерод-связанных пептидов, содержащих последовательности SEQ ID NO:1-6 соответственно. Шесть пептидов, имеющих последовательности, приведенные в SEQ ID NO:1-6, связывали с фторуглеродной цепью C8F17(CH2)2COOH через эпсилон-цепь N-концевого спейсерного остатка лизина. Таким образом, шесть фторуглерод-связанных пептидов соответствовали ФСП1, ФСП8, ФСП9, ФСП2, ФСП4 и ФСП5, описанным в предшествующих примерах. Способ формулирования основан на использовании уксусной кислоты, кислотном растворителе, который, как обнаружили авторы изобретения, обеспечивает хорошую диспергируемость фторпепти-дов, при этом сохраняя физическую и химическую стабильность фторпептидов на протяжении всего процесса. Уксусная кислота обладает высокой летучестью и может быть сублимирована в процессе лио-филизации, к тому же авторы изобретения обнаружили, что ее количество неизменно сокращается до остаточных уровней, которые оказывают незначительное влияние на pH восстановленного препарата.
Способ формулирования, описанный ниже, позволяет производить лиофилизированную вакцину FP01.1 (обеспечивая долговременную стабильность), которую затем восстанавливают в буферном растворе (28 мМ L-гистидине), получая стабильный гомогенный раствор (без видимых агрегатов) с нейтральным значением pH (6-7,5) и приемлемой осмоляльностью (280-320 мОсм). Было получено в соответствии с правилами GMP несколько партий препарата для клинического применения, и авторы изобретения продемонстрировали, что препарат безопасен и проявляет иммуногенность в организме человека.
Материалы и инструменты.
Фторпептиды (содержащиеся в FP-01.1), произведены American Peptide Company. Ледяная уксусная кислота (Sigma #27225), D-маннит (Merck Emprove). Вода Hyclone (Fisher #HYC-001-189G). Millex, ПВДФ Durapore, 0,2-мкм (033 мм) Millipore.
30 автоклавируемых (флаконов для лиофилизации (Adelphi #VC002-13C) плюс пробки (Adelphi
#FDW13)).
Система для ВЭЖХ, снабженная колонкой Discovery C18, 250x2,1 мм, 5 мкм.
10-мл комбинированные наконечники для пипетки (Fisher #PMP-117-523N) плюс степпер Eppendorf.
Лиофилизатор 2-4-LSC (Christ). Осмометр: Osmomat 030 (Gonotec). pH-метр, снабженный микроэлектродом Inlab(r) (Mettler). Методы.
Приготовление растворов.
1. 3,3% (мас./мас.) маннит в 50 мл в воде (6,6 г в 200 мл воды), охладить при 4°C.
2. 5 мл растворов уксусной кислоты в концентрации 10% (об./об.) в стерильной воде.
3. 5 мл растворов уксусной кислоты в концентрации 80% (об./об.) в стерильной воде. Взвешивание фторуглерод-связанных пептидов.
Получение препарата для FP-01.1.
1. Взвешивают каждый пептид (нужно 10 мг пептида нетто) в 2-мл стеклянный флакон.
2. Диспергируют каждый из фторпептидов в концентрации 10 мг нетто/мл в примерно 1,0 мл (регулировать объем в зависимости от результатов взвешивания, чтобы получить точно 10 мг нетто/мл) 10% или 80% раствора уксусной кислоты в воде (см. табл. 10).
3. Перемешивают на вихревой мешалке и обрабатывают ультразвуком и записывают результаты визуального осмотра.
4. Повторяют этап 3 до полного растворения.
5. Смешивают вместе 950 мкл каждого из 6 диспергированных фторпептидов в 40-мл стеклянном контейнере. Затем добавляют 950 мкл 80% уксусной кислоты (общий объем 6,65 мл). Каждый пептид находится в концентрации 1,42 8 мг/мл в 40% уксусной кислоте.
6. Записывают результаты визуального осмотра смешанного раствора.
7. Разбавляют смешанные фторпептиды 25,93 мл 3,3% раствора маннита (раствор с концентрацией 0,2915 мг/мл каждого пептида), всего уксусной кислоты 8,16%.
8. Записывают результаты визуального осмотра разбавленного раствора.
9. Фильтруют примерно 32 мл раствора на 0,2-мкм Millex 33-мм ПВДФ фильтре (сохраняя 0,3 мл нефильтрованного раствора для изучения выхода после фильтрования).
Заполнение.
Лиофилизация.
1. Замораживают флаконы при -80°С в течение одного часа.
2. Лиофилизируют в течение 40 ч.
3. Вентилирование при лиофилизации проводят в атмосфере азота и флаконы укупоривают при давлении от 400 до 600 мбар.
Получение эквивалента FP-01.1 с использованием несформулированных фторпептидов.
Готовят два флакона, содержащие 0,35 мг каждого из 6 фторпептидов: ФСП1, ФСП8, ФСП9, ФСП2,
ФСП4 и ФСП5.
Просвечивающая электронная микроскопия.
Для ПЭМ в негативном окрашивании 20 мкл раствора фторуглерод-связанного пептида помещают на медную сетку с формвар-углеродным покрытием электронного микроскопа (300 меш). Затем добавляют 20 мкл уранилацетата (1% водный раствор). Через 30 с избыток раствора быстро удаляют фильтровальной бумагой ватман. Затем образец оставляют высыхать в течение по меньшей мере 2 мин до анализа. Затем проводит исследование с помощью просвечивающего электронного микроскопа Philips CM120 biotwin при ускоряющем напряжении 120 кВ. Изображения получают при прямом увеличении в диапазоне от 50000Х до 150000Х.
Анализ ОФ-ВЭЖХ.
Метод ВЭЖХ: FP-01.1.
Колонка: Discovery C18: 2,1 Х25 мм, 5 мкм, поток 0,3 мл/мин. Растворитель A: смесь 90% вода/10% ацетонитрил/0,04% ТФУ. Растворитель В: смесь 90% ацетонитрил/10% вода/0,04% ТФУ. Градиент
Время (мин)
Растворитель В
0, 01
10%
10%
28%
44%
57%
70%
82%
82%
10%
Результаты.
Этап формулирования (до лиофилизации). Диспергирование пептидов.
Пептиды были легко растворимы без необходимости в обработке ультразвуком, в то время как для двух пептидов, растворимых в 80% уксусной кислоте, требовался по меньшей мере 1 цикл обработки ультразвуком.
Смешивание/разбавление.
Раствор 6 смешанных пептидов был прозрачным (без видимых агрегатов). После разбавления ман-
нитом в концентрации 3,3% раствор по-прежнему был прозрачным (без видимых агрегатов).
Таблица 11. Внешний вид препаратов
ФСП
ФСП1
ФСП2
ФСП4
ФСП5
ФСП9
ФСП8
Выход пептида %
100,2
101, 6
100, 8
100,2
99, 8
99, 6
Получение изображений методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Анализ методом ПЭМ мицелл, образованных до фильтрации, показал наличие гомогенной популяции небольших сферических мицелл с размерами в диапазоне 17-30 нм (фиг. 12). Химическая стабильность (после фильтрования).
Химическую стабильность определяли методом ОФ-ВЭЖХ в момент времени Т0 и через 24 ч после фильтрования. Результаты приведены на фиг. 13 и в табл. 13.
Таблица 13. Чистота после фильтрования с течением времени
Лиофилизированный препарат образует плотный однородный брикет прекрасного качества. Анализ чистоты лиофилизированного препарата FP-01.1.
Образец восстанавливали в 0,70 мл воды для достижения концентрации 0,5 мг/пептид. Деградация в процессе лиофилизации отсутствовала, чистота препарата составляла 97%.
Восстановление лиофилизированного FP-01.1. Сравнение с несформулированными фторпептидами.
Для демонстрации преимущества способа формулирования, использованного для получения FP-01.1, сравнивали качество восстановленной вакцины FP-01.1 (сформулированные фторпептиды) и эквивалентного препарата, содержащего несформулированные фторпептиды.
Эквивалент FP-01.1 на основе несформулированных фторпептидов получали, взвешивая 6 фторпептидов в одном флаконе (0,35 мг каждого пептида). Несформулированный эквивалент FP-01.1 восстанавливали либо в 0,7 мл воды (содержащей 4,5% маннита, чтобы соответствовать FP-01.1), либо в 28 мМ L-гистидине (содержащем 4,5% маннита) и сравнивали с сформулированным препаратом FP-01.1 (полученным при помощи способа формулирования, описанного выше) и восстановленным в таких же условиях. Восстановленный сформулированный FP01.1 анализировали методом ОФ-ВЭЖХ, и результаты анализа приведены на фиг. 14.
Сформулированный препарат FP-01.1 легко восстанавливался в воде, в то время как несформулированный эквивалент FP-01.1 был нерастворим, с крупными агрегатами в суспензии, и прилипал к стеклянным стенкам (см. фиг. 15). Результатом восстановления FP-01.1 в воде был совсем немного опалесци-рующий гомогенный раствор без видимых агрегатов. Несформулированные фторпептиды не становились растворимыми с течением времени и даже после обработки ультразвуком и интенсивного перемешивания.
Аналогичным образом, сформулированный препарат FP-01.1 легко восстанавливался в 28 мМ L-гистидине (буфер, предназначенный для клинического препарата с целью обеспечения нейтрального значения pH), тогда как несформулированные пептиды были нерастворимыми (образовывали крупные агрегаты) (см. фиг. 16). Результатом восстановления FP-01.1 в воде был слегка опалесцирующий гомогенный раствор без видимых агрегатов. Несформулированные фторпептиды не становились растворимыми с течением времени и даже после обработки ультразвуком и интенсивного перемешивания.
На основании полученных результатов можно заключить, что препарат на основе несформулированных фторпептидов не может считаться фармацевтически приемлемым вследствие его плохой диспер-гируемости и отсутствия гомогенности у препарата.
Осмоляльность и pH препарата в L-гистидине.
Таблица 15. рН и осмоляльность препарата, восстановленного в L-гистидине
FP-01.1, восстановленный в 28 мМ гистидине
Осмоляльность (мОсм/кг)
302
б, 65
Выводы.
Все фторпептиды достигали полной растворимости в момент диспергирования. Были образованы мицеллы с диаметром в диапазоне от 17 до 30 нм, совместимые со стерилизацией фильтрованием (отсечка 220 нм).
Выход после стерилизации фильтрованием был выше 99% для всех фторпептидов. FP-01.1 был легко восстановим в предназначенных для него буферных системах на основе 28 мМ L-гистидина с образованием гомогенного слегка опалесцирующего раствора с близким к нейтральному значением pH и приемлемой осмоляльностью (примерно 300 мОсм).
Эквивалентный препарат FP-01.1, полученный из несформулированных фторпептидов, было трудно восстанавливать, при этом фторпептиды образовывали крупные нерастворимые агрегаты, большей частью прилипающие к стеклянным стенкам. Это резко отличается от восстановления сформулированного FP-01.1 и демонстрирует преимущество способа формулирования для создания фармацевтически приемлемого препарата.
Пример 14. Иммуногенность FP01.1 у крыс.
Иммунный ответ, который может быть вызван препаратом FP-01.1, оценивали на крысах, иммунизированных внутримышечно в левую нижнюю часть боковой поверхности сотрудниками CBS, St Mary's Campus, Imperial College в соответствии с GD RD004. Получение спленоцитов.
Крыс умерщвляли в соответствии с местными регулирующими положениями и GDRD004. Селезенки собирали (любые аномальные селезенки фотографировали) и получали одноклеточные суспензии в соответствии с GD_RD007, число клеток определяли, как описано в GD_RD001 (метод TruCount). Спле
ноциты ресуспендировали до плотности клеток 1х107/мл в полной среде и высевали для анализа ELISpot на IFNy и СВА.
Анализ ELISpot на IFNy.
Антигены для стимуляции готовили непосредственно перед использованием в 4х концентрации из маточных растворов и помещали в двойном повторе в лунки для анализа ELISPOT на IFNy. Клетки вносили в количестве 0,5х106 спленоцитов/лунку (50 мкл клеточной суспензии), вместе с 50 мкл 4х препарата антигена (т.е. отдельные длинные пептиды и LPMIX6 для стимуляции) и 100 мкл полной среды (общий объем равен 200 мкл). Планшеты для ELISpot инкубировали в течение 18 ч при 37°С, 5% CO2 во влажной среде.
Три дозы FP-01.1 корректировали по объему, сохраняя постоянную концентрацию ФСП, равную 500 мкг/мл для каждого пептида. Крысам линии SD вводили в/м инъекцией 12,5, 50 или 100 мкг/пептид FP-01.1 в дни 0 и 14, и их селезенки собирали в день 24 для анализа ELISPOT на IFNy через 18 ч инкубации с отдельными природными пептидами из FP-01.1. Обе дозы, 12,5 и 50 мкг/пептид, вводили в одно место инъекции в объеме 25 и 100 мкл соответственно, при этом дозу 100 мкг/пептид вводили в объемах 2х100 мкл в два различных места инъекции.
FP-01.1 дозозависимым образом индуцировал положительный по IFNy Т-клеточный ответ при всех тестируемых уровнях доз (фиг. 17).
Пример 15. Данные клинических испытаний для FP01.1.
Три возрастающие дозы FP-01.1 (50, 150, 500 мкг/пептид) и плацебо, введенные в дни 1, 2 9, оценивали с точки зрения безопасности, переносимости и иммуногенности в фазе I клинического испытания с участием в общей сложности 48 здоровых индивидуумов.
FP-01.1 был хорошо переносим во всех трех группах после двух внутримышечных инъекций. Не было четких доказательств зависимости от дозы в случаях возникновения ТЕАЕ, в лабораторных параметрах или при появлении реакции в местах инъекций. Ни у кого не проявлялись какие-либо заметные местные или системные реакции на вакцинацию ни при первой, ни при второй инъекции, ни в одной из трех групп.
Индуцированные вакциной Т-клеточные реакции оценивали при помощи ex vivo анализа ELISPOT на IFNy. МКПК стимулировали 6 отдельными пептидами (соответствующими пептидам, содержащимся в вакцине) в течение 18 ч. Положительные результаты анализа определяли как среднее значение числа точек в лунках с отрицательным контролем плюс 2 стандартных отклонения от среднего. Число точек для каждого из 6 пептидов объединяли для получения "суммы для длинных пептидов" и выражали как число точек на миллион внесенных МКПК.
Было показано, что препарат FP-01.1 является иммуногенным. В группе с дозой 150 мкг FP-01.1 наблюдали более сильный ответ по сравнению с группами двух других доз вакцины и плацебо, как видно на фиг. 18. В этой группе наблюдали бустерный эффект после второй инъекции в поддержку концепции бустерного усиления при нескольких инъекциях в случаях пептидных вакцин.
список последовательностей
<110> Immune Targeting Systems (ITS) Ltd
<120> ПРЕПАРАТ ФТОРУГЛЕРОД-СВЯЗАННЫХ ПЕПТИДОВ
<130> N110619A
<150> GB 1022147.1
<151> 2010-12-31
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 1
His Met Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn
1 5 10 15
Pro Ser Leu Arg Met Lys Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr
20 25 30
Ala Asp Lys
<210> <211> <212> <213>
Белок
Вирус гриппа
<400> 2
Val Ala Tyr Met Leu Glu Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu
1 5 10 15
Pro Val Ala Gly Gly Thr Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu
20 25 30
Thr Gln Gly 35
<210> 3
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 3
Tyr Ile Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val Leu Ser Ile
1 5 10 15
Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly Tyr
20 25 30
Met Phe Glu 35
<210> <211> <212> <213>
Белок
Вирус гриппа
<400> 4
Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly Tyr
1 5 10 15
Met Phe Glu Ser Lys Arg Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile Pro Ala Glu
20 25 30
Met Leu Ala 35
<210> <211> <212> <213>
Белок
Вирус гриппа
<400> 5
Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala
20 25 30
His Lys Ser
<210> 6
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 6
Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser
1 5 10 15
Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro
20 25 30
Ser Glu Arg 35
<210> 7
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 7
His Met Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn
1 5 10 15
Pro Ala Leu Arg Met Lys Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr
20 25 30
Ala Asp Lys
<210> 8
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 8
Val Ala Tyr Met Leu Glu Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu
1 5 10 15
Pro Val Ala Gly Gly Thr Ser Ser Ile Tyr Ile Glu Val Leu His Leu
20 25 30
Thr Gln Gly 35
<210> 9
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 9
Val Ala Tyr Met Leu Glu Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu
1 5 10 15
Pro Val Ser Gly Gly Thr Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu
20 25 30
Thr Gln Gly 35
<210> 10 <211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 10
Tyr Ile Thr Lys Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Ile Leu Ser Ile
1 5 10 15
Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly Tyr
20 25 30
Met Phe Glu 35
<210> 11
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 11
Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly Tyr
1 5 10 15
Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile Pro Ala Glu
20 25 30
Met Leu Ala 35
<210> 12
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 12
Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp
1 5 10 15
Leu Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala
20 25 30
His Lys Ser
<210> 13 <211> 33
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 13
Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu
1 5 10 15
Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Lys Tyr Thr Lys Thr Thr
20 25 30
Tyr
<210> 14
<211> 35
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 14
Lys Lys Lys Ser Tyr Ile Asn Lys Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser
1 5 10 15
Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro
20 25 30
Ser Phe Gly 35
<210> 15
<211> 33
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 15
Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe Asn Tyr Asn
20 25 30
Lys
<210> <211> <212> <213>
Белок
Вирус гриппа
<400> 16
Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr Lys Glu Asn Arg Phe Ile Glu Ile Gly Val
1 5 10 15
Thr Arg Arg Glu Val His Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile
20 25 30
Lys Ser Glu
<210> 17
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 17
Lys His Met Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys
1 5 10 15
Asn Pro Ser Leu Arg Met Lys Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile
20 25 30
Thr Ala Asp Lys 35
<210> 18
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 18
Lys Val Ala Tyr Met Leu Glu Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe
1 5 10 15
Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His
20 25 30
Leu Thr Gln Gly 35
<210> 19
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 19
Lys Tyr Ile Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val Leu Ser
1 5 10 15
Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly
20 25 30
Tyr Met Phe Glu 35
<210> 20
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 20
Lys Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly
1 5 10 15
Tyr Met Phe Glu Ser Lys Arg Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile Pro Ala
20 25 30
Glu Met Leu Ala 35
<210> 21
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 21
Lys Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asp Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val
20 25 30
Ala His Lys Ser
<210> 22
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 22
Lys Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg Pro Ile Leu
1 5 10 15
Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val
20 25 30
Pro Ser Glu Arg 35
<210> 23
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 23
Lys Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly
1 5 10 15
Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile Pro Ala
20 25 30
Glu Met Leu Ala 35
<210> 24
<211> 34
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 24
Lys Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val
1 5 10 15
Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Lys Tyr Thr Lys Thr
20 25 30
Thr Tyr
<210> 25
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 25
Lys Lys Lys Lys Ser Tyr Ile Asn Lys Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr
1 5 10 15
Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu
20 25 30
Pro Ser Phe Gly 35
<210> 26
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 26
Lys Tyr Ile Thr Lys Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Ile Leu Ser
1 5 10 15
Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly
20 25 30
Tyr Met Phe Glu 35
<210> 27
<211> 34
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 27
Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val Arg Gly
1 5 10 15
Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe Asn Tyr
20 25 30
Asn Lys
<210> 28
<211> 36
<212> Белок
<213> Вирус гриппа
<400> 28
Lys Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr Lys Glu Asn Arg Phe Ile Glu Ile Gly
1 5 10 15
Val Thr Arg Arg Glu Val His Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys
20 25 30
Ile Lys Ser Glu 35
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Визуально прозрачный водный кислый раствор в качестве промежуточного продукта для получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, где раствор содержит:
a) по меньшей мере один фторуглерод-связанный пептид, где:
(i) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков и имеет изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и
(ii) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах; и
b) уксусную кислоту в концентрации по меньшей мере 10% (об./об.).
2. Водный кислый раствор по п.1, где:
(a) раствор имеет величину pH, равную 5 или ниже;
(b) фторуглерод-связанный пептид присутствует в мицеллах с диаметром менее чем 0,22 мкм; и/или
(c) по меньшей мере 80% мицелл имеют диаметр менее чем 100 нм.
3. Водный кислый раствор по п.1 или 2, содержащий один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов, которые:
(i) имеют длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков;
(ii) содержат по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков; и/или
(iii) имеют изоэлектрическую точку, больше или равную 7; и/или где по меньшей мере один фто-руглерод-связанный пептид и/или один или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов включают пептид, который:
(iv) содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или
(v) не содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков.
4. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, где ни один из фторуглерод-связанных пептидов, присутствующих в препарате, не представляет собой фторуглерод-связанный пептид, в котором пептид, связанный с фторуглеродом:
(i) не содержит положительно заряженную аминокислоту среди последних 15 смежных аминокислот, наиболее удаленных от фторуглерода; и/или
(ii) содержит непрерывную последовательность из 20 аминокислотных остатков, содержащих более 80% гидрофобных аминокислотных остатков.
5. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, в котором пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки.
6. Водный кислый раствор по п.5, где патогеном является вирус, бактерия, микобактерия, паразит или грибок.
7. Водный кислый раствор по любому из предшествующих пунктов, где фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов углерода.
8. Водный кислый раствор по п.1, в котором фторуглерод является линейным насыщенным фрагментом C8F17(CH2)2.
9. Способ получения фармацевтически приемлемого препарата фторуглерод-связанного пептида, включающий:
(i) солюбилизацию фторуглерод-связанного пептида в уксусной кислоте для получения раствора по любому из пп.1-8;
(ii) стерилизацию фильтрованием солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида; и
(iii) высушивание стерилизованного фильтрованием фторуглерод-связанного пептида.
10. Способ по п.9, при этом
(a) пептид, связанный с фторуглеродом, имеет длину по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и содержит по меньшей мере 50% гидрофобных аминокислотных остатков, а также имеет изоэлектриче-скую точку, больше или равную 7;
(b) смесь из фторуглерод-связанного пептида и одного или более дополнительных фторуглерод-связанных пептидов солюбилизируют в уксусной кислоте;
(c) способ дополнительно включает смешивание солюбилизированного фторуглерод-связанного пептида с одним или более дополнительными солюбилизированными фторуглерод-связанными пептидами;
(d) уксусная кислота представляет собой от 10 до 80% (об./об.) водную уксусную кислоту;
(e) солюбилизированный фторуглерод-связанный пептид высушивают лиофилизацией;
(f) способ дополнительно включает восстановление сухого фторуглерод-связанного пептида в водной фазе;
(a)
(g) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант добавляют до этапа (ii);
(h) способ дополнительно включает хранение сухого или восстановленного фторуглерод-
связанного пептида в стерильном контейнере, и/или
(i) пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патоге-
на, аутологичного белка или опухолевой клетки.
11. Способ по п.10, в котором пептид, связанный с фторуглеродом, является иммуногенным пептидом, полученным из патогена, аутологичного белка или опухолевой клетки.
12. Способ по п.10, в котором фторуглерод содержит цепь длиной от 3 до 30 атомов.
11.
Фторуглерод-связанный пептид 1
Фторуглерод-связанный пептид 2
Фторуглерод-связанный пептид 3
Фторуглерод-связанный пептид 4
Фторуглерод-связанный пептид п
Солюбилизировать в растворителе А
Солюбилизировать в растворителе В
Солюбилизировать в растворителе С
Солюбилизировать в растворителе D
Солюбилизировать в растворителе Е
Смешать
Разбавить
Стерилизация фильтрованием
НЕРАСФАСОВАННАЯ СТЕРИЛЬНАЯ ВАКЦИНА
Разлить по флаконам
Лиофилизация
КОНЕЧНЫЙ ПРЕПАРАТ ВАКЦИНЫ
Восстановление
Фиг. 1
Фторуглерод-связанный пептид 1
Фторуглерод-связанный пептид 2
Фторуглерод-связанный пептид п
Фторуглерод-связанный пептид 3
Фторуглерод-связанный пептид 4
Фторуглерод-связанный пептид п
Растворить в растворителе А
Растворить в растворителе А
Растворить в растворителе А
Растворить в растворителе В
Растворить в растворителе В
Растворить в растворителе В
Смешать
Смешать
Фиг. 2
20 15
О 5
0.1
10 100 Размер (д. нм)
1000
10000
Диаграмма 399: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 2 Диаграмма 402: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 5 Диаграмма 401: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 4 Диаграмма 403: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 6 Диаграмма 404: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 7
Фиг. 5
Ю ЮО
Размер (д. нм)
юоо
*Ш)
Диаграмма 399: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 2 Диаграмма 401: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 4 Диаграмма 402: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 5 Диаграмма 403: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 6 Диаграмма 404: FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 7
Распределение объема частиц по размеру
Ю Ю0
Размер (д. нм)
ЮОО
юооо
Диаграмма 393 FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 3 Диаграмма 394 FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 4 Диаграмма 395 FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 5 Диаграмма 396 FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 6 Диаграмма 397 FA-MIX-8D (NF) приготовлено с уксусной кислотой и маннитом 7
Фиг. 7
А
15i 1 1 1
? 10
ю 5 О
о^ 1- I '- I- ' ¦
Размер (д. нм)
Диаграмма 287: FA-MIX8C (10 мМ Трис-HCl, рН7,04) 1 Диаграмма 288: FA-MIX8C (10 мМ Трис-HCl, рН7,04) 1 1
Диаграмма 289: FA-MIX8C (10 мМ Трис-HCl, рН7,04) 1
Распределение объема частиц по размеру
30т
0.1
10 100
Размер (д. нм)
1000
10000
Диаграмма 202: MIX8C Повторно растворено в воде 1 Диаграмма 204: MIX8C Повторно растворено в воде 1 Диаграмма 206: MIX8C Повторно растворено в воде 1 Диаграмма 208: MIX8C Повторно растворено в воде 1
Диаграмма 203: MIX8C Повторно растворено в воде 1 Диаграмма 205: MIX8C Повторно растворено в воде 1 Диаграмма 207: MIX8C Повторно растворено в воде 1
Фиг. 8
uV_ 650066 600066 550006 500066 450006 400000 350006 30000О 250006 200006 150006 100006 56666 0^
-56666
Контроль
Уксусная кислота 50%/24 ч
15.6 26.6 25.6 30.0 35.6 46.6 45.6 56.0 55.0 min
Фиг. 9
Фиг. 11
, " 1 <3.fi нм
2073.2 1 UA 10Э НМ
FP01.1 Б161111.01 BF HV=120KB
Увеличение печати: 21500Ох @ 203 мм Прямое увеличение: 93000х
2:23 09/05/04
Фиг. 12
"мВ
Детектор А:215 нм?
зоо^
25Q1
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 МИН
15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0
2 150-
LL.
50-
S lOO-
? о-
250
200-
150-
'00-
IFN
50-
ПЛАЦЕБО
у- 50 мкг 150 мкг 500 мкг
Фиг. 18
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028396
028396
- 1 -
- 1 -
(19)
028396
028396
- 1 -
- 1 -
(19)
028396
028396
- 1 -
- 1 -
(19)
028396
028396
- 1 -
- 1 -
(19)
028396
028396
- 4 -
- 3 -
(19)
028396
028396
- 22 -
- 22 -
028396
028396
- 22 -
- 22 -
028396
028396
- 22 -
- 22 -
028396
028396
- 23 -
- 23 -
028396
028396
- 23 -
- 23 -
028396
028396
- 23 -
- 23 -
028396
028396
- 23 -
- 23 -
028396
028396
- 26 -
- 26 -
028396
028396
- 26 -
- 26 -
028396
028396
- 31 -
- 31 -
028396
028396
- 32 -
- 32 -
028396
028396
- 32 -
- 32 -
028396
028396
- 32 -
- 32 -
028396
028396
- 32 -
- 32 -
028396
028396
- 33 -
- 33 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 34 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 34 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 34 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
Распределение объема частиц по размеру
028396
Распределение объема частиц по размеру
- 35 -
- 36 -
028396
028396
- 37 -
- 37 -
028396
028396
- 37 -
- 37 -
028396
028396
- 37 -
- 37 -
028396
028396
- 38 -
- 38 -
028396
028396
- 39 -
- 39 -
028396
028396
- 39 -
- 39 -
|
