[RU]

1. Способ детекции взаимодействий в растворе, включающий следующие стадии: a) введение в раствор по меньшей мере одного первичного вещества, выбранного из группы, состоящей из эукариотических клеткок, прокариотических клеток, мембран, вирусов, прионов, митохондрий, хлоропластов, везикул, липосом, клеточных компонентов, жгутиконосцов, белков, липопротеинов, гликопротеинов, антител, нуклеиновых кислот, липидных комплексов, коллоидов, макромолекул, микрочастиц, наночастиц, антигенов, гормонов, лигандов белков и химических соединений, и по меньшей мере одного вторичного вещества, представляющего собой любое определенное выше вещество, способного взаимодействовать с первичным веществом; b) введение в раствор, полученный на стадии a), по меньшей мере двух частиц, выбранных из группы, состоящей из электрически заряженных частиц, магнитных частиц, частиц, покрытых по меньшей мере одним магнитным слоем, намагничиваемых частиц, частиц, покрытых намагничиваемым слоем, электрических, электромагнитных, электризуемых, несущих электрический заряд частиц, где частицы находятся на поверхности, погруженной в раствор; c) определение взаимодействия указанных веществ приложением электрического, магнитного или электромагнитного поля, предназначенного для приведения в движение указанных частиц, причем взаимодействие между веществами детектируется тогда, когда подвижность частиц на поверхности изменяется.

2. Способ по п.1, в котором по меньшей мере две магнитные или намагничиваемые частицы независимо выбраны из электрически заряженных, магнитных или намагничиваемых, или покрытых по меньшей мере одним магнитным или намагничиваемым слоем частиц.

3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором по меньшей мере две частицы подвергают действию электромагнитного поля, прилагаемого в импульсном режиме.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой ускорение движения частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой замедление движения частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

6. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой изменение траектории частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

7. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по группированию частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

8. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по отсутствию группирования частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

9. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по рассеянию частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором по меньшей мере две частицы освещают посредством источника света для детекции их движения.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором по меньшей мере две частицы представляют собой частицы, генерирующие сигнал.

12. Способ по любому из пп.1-11, в котором первичное вещество выбрано из группы, состоящей из эукариотических клеток, прокариотических клеток, мембран, вирусов, белков, антител, антигенов, химических соединений.

13. Способ по любому из пп.1-11, в котором вторичное вещество выбрано из группы, состоящей из эукариотических клеток, прокариотических клеток, мембран, вирусов, белков, антител, антигенов, химических соединений.

14. Способ по любому из пп.1-13, в котором способ включает вместо стадии a) предварительную стадию a') закрепления первичного вещества на поверхности вмещающего сосуда; стадию a") введения раствора во вмещающий сосуд; стадию a''') введения по меньшей мере одного вторичного вещества, способного взаимодействовать с первичным веществом.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ детекции взаимодействий в растворе, включающий следующие стадии: a) введение в раствор по меньшей мере одного первичного вещества, выбранного из группы, состоящей из эукариотических клеткок, прокариотических клеток, мембран, вирусов, прионов, митохондрий, хлоропластов, везикул, липосом, клеточных компонентов, жгутиконосцов, белков, липопротеинов, гликопротеинов, антител, нуклеиновых кислот, липидных комплексов, коллоидов, макромолекул, микрочастиц, наночастиц, антигенов, гормонов, лигандов белков и химических соединений, и по меньшей мере одного вторичного вещества, представляющего собой любое определенное выше вещество, способного взаимодействовать с первичным веществом; b) введение в раствор, полученный на стадии a), по меньшей мере двух частиц, выбранных из группы, состоящей из электрически заряженных частиц, магнитных частиц, частиц, покрытых по меньшей мере одним магнитным слоем, намагничиваемых частиц, частиц, покрытых намагничиваемым слоем, электрических, электромагнитных, электризуемых, несущих электрический заряд частиц, где частицы находятся на поверхности, погруженной в раствор; c) определение взаимодействия указанных веществ приложением электрического, магнитного или электромагнитного поля, предназначенного для приведения в движение указанных частиц, причем взаимодействие между веществами детектируется тогда, когда подвижность частиц на поверхности изменяется.

2. Способ по п.1, в котором по меньшей мере две магнитные или намагничиваемые частицы независимо выбраны из электрически заряженных, магнитных или намагничиваемых, или покрытых по меньшей мере одним магнитным или намагничиваемым слоем частиц.

3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором по меньшей мере две частицы подвергают действию электромагнитного поля, прилагаемого в импульсном режиме.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой ускорение движения частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой замедление движения частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

6. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой изменение траектории частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

7. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по группированию частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

8. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по отсутствию группирования частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

9. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по рассеянию частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором по меньшей мере две частицы освещают посредством источника света для детекции их движения.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором по меньшей мере две частицы представляют собой частицы, генерирующие сигнал.

12. Способ по любому из пп.1-11, в котором первичное вещество выбрано из группы, состоящей из эукариотических клеток, прокариотических клеток, мембран, вирусов, белков, антител, антигенов, химических соединений.

13. Способ по любому из пп.1-11, в котором вторичное вещество выбрано из группы, состоящей из эукариотических клеток, прокариотических клеток, мембран, вирусов, белков, антител, антигенов, химических соединений.

14. Способ по любому из пп.1-13, в котором способ включает вместо стадии a) предварительную стадию a') закрепления первичного вещества на поверхности вмещающего сосуда; стадию a") введения раствора во вмещающий сосуд; стадию a''') введения по меньшей мере одного вторичного вещества, способного взаимодействовать с первичным веществом.

---

Евразийское ои 028391 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. G01N11/10 (2006.01)
2017.11.30
(21) Номер заявки 201291396
(22) Дата подачи заявки
2011.06.30
(54) СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
(31) 1002810; 1056678
(32) 2010.07.02; 2010.08.19
(33) FR
(43) 2013.04.30
(86) PCT/FR2011/051528
(87) WO 2012/001312 2012.01.05
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БИОФИЛЬМ КОНТРОЛЬ (FR)
(72) Изобретатель:
Бернарди Тьерри, Майер Паскаль, Грелли Жером (FR)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) FR-A1-2866706 FR-A1-2883296 US-A-4935147
(57) Изобретение относится к способу детекции молекулярных взаимодействий в растворе. Предпочтительно изобретение относится к способу детекции молекулярных взаимодействий между двумя веществами, способными взаимодействовать между собой. Изобретение предпочтительно приемлемо для применения в области научных исследований и в области медицинского анализа.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способу детекции молекулярных взаимодействий. Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу детекции молекулярных взаимодействий между по меньшей мере двумя веществами, способными взаимодействовать между собой.
Изобретение приемлемо для применения предпочтительно в области научных исследований, в области медицины, в частности при анализе биологических образцов.
В дальнейшем описании номера ссылок в скобках [номер] отсылают к списку литературы, приведенному в конце описания.
Уровень техники
В области медицины и анализа существуют многочисленные ситуации, когда представляется интересным и даже необходимым детектировать события взаимодействий между молекулами и/или объектами, такими как антитела, клетки, бактерии, вирусы и макромолекулы. Например, для детекции бактериального загрязнения часто используют испытание на взаимодействие "антиген/антитело".
Для определения группы крови человека часто используют испытание на аффинность между антителами и красными кровяными тельцами человека, которое позволяет, таким образом, определить группу крови указанного человека.
В уровне техники существуют "простые" способы, которые могут быть реализованы в случае, когда детектируемые вещества содержатся в большом количестве. Таким является, например, способ, в котором используют смесь детектируемых веществ с веществами, обладающими аффинностью, т.е. с веществами, способными взаимодействовать с детектируемыми веществами. Взаимодействие позволяет образовывать осадок или агрегат, видимый невооруженным глазом и свидетельствующий о результате. Таким образом, например, возможно осуществлять определение группы крови, прибавляя антитела к капле крови и наблюдая образование или отсутствие образования агрегата красных кровяных телец.
Существуют также способы, которые позволяют измерять изменения вязкости среды, происходящие в случае, когда в этой среде группируются вещества, обладающие аффинностью.
Например, в US 3635678 [1] описан способ, в котором одиночный стальной шарик макроскопического размера (существенно больше микрометра), погруженный в жидкость, приводят во взвешенное состояние магнитом, определяя движение шарика во взвешенном состоянии посредством оптической системы. Когда вязкость среды возрастает, то амплитуда движения шарика уменьшается с течением времени, так что цель состоит в определении скорости коагуляции крови.
Главным недостатком методики, описанной в указанном патенте, является сложность ее реализации, поскольку шарик должен удерживаться во взвешенном состоянии. С другой стороны, шарик, находящийся в движении, в силу своего размера и своей массы, соответствующих описанию патента, может разрушать слабые взаимодействия, порождаемые изменением вязкости, и мешать их детекции. Чувствительность способа является низкой и ограничивается детекцией в отношении значительных изменений вязкости. Кроме того, для считывания результатов должны быть использованы сложные системы и реактивы.
Другая система, описанная в WO 01/86255 [2], включает микроскоп, который позволяет наблюдать движение частицы, находящейся во взвешенном состоянии в жидкости. Вязкость жидкости определяют по сдвигу второй гармоники сигнала, полученного исходя из наблюдения посредством микроскопа за частицей, находящейся во взвешенном состоянии в жидкости.
В другом варианте этого подхода, описанном в EP 1544596 [3], используют осцилляцию частицы, намагниченной в магнитном поле с целью генерирования сигнала и получения, таким образом, результата.
Одним из главных недостатков этих способов является сложность их реализации и наблюдения за осцилляцией частицы, приводимой в движение силой, прикладываемой периодически и регулируемым образом. Аппаратура, необходимая, с одной стороны, для побуждения осцилляции и поддержания осцилляции частицы, а с другой стороны, для наблюдения периодического движения частицы, является сложной, дорогостоящей и трудно параметризуемой.
Кроме того, эти способы позволяют измерять только изменения вязкости, которые должны иметь место в зоне осцилляции частицы, находящейся во взвешенном состоянии. Кроме того, изменения вязкости должны быть значительными, чтобы обеспечивать детекцию. При этом необходима также разработка решений для случаев большого числа веществ, обладающих аффинностью. Таким образом, эти способы являются малочувствительными и не обеспечивают достижения удовлетворительной точности в способах, в которых используют, например, антитела или другие вещества, обладающие аффинностью и предназначенные специально для детекции или количественного определения.
Другим способом, обычно используемым для детекции реакций по аффинности, является способ ELISA и его многочисленные варианты. Способ состоит в том, что
на подложке закрепляют первичное антитело, обладающее аффинностью с веществом;
в течение определенного времени детектируемое вещество держат в контакте с первичным антителом, закрепленным на подложке;
промывкой удаляют вещество, не прореагировавшее с антителом;
вещество, связанное с антителом, прикрепленным к поверхности, приводят в контакт с вторичным
антителом, обладающим аффинностью с данным веществом;
промывкой удаляют антитела, не прореагировавшие с веществом;
детектируют присутствие вторичного антитела, связанного с веществом, связанным с первичным антителом, связанным с подложкой.
Наиболее часто вторичное антитело связывают с маркером, прямо детектируемым физическим способом, например с флуоресцентным или магнитным маркером или с маркером, связанным с ферментом, например со щелочной фосфатазой или пероксидазой черной редьки, для детекции продукта реакции, катализированной ферментом исходя из соответствующего субстрата.
Этот способ имеет несколько недостатков, например в нем требуется осуществлять многочисленные регулируемые промывки, уменьшающие его чувствительность. Он включает также многочисленные стадии манипуляций, осуществляемые специалистами в данной области техники, осуществление по меньшей мере двух реакций по аффинности, обязательная маркировка вторичного антитела по меньшей мере одним чувствительным и сложным маркером, использование для детекции и количественного определения сигнала, испускаемого маркером, сложного и трудно параметризуемого устройства. Таким образом, этот способ является длительным, дорогостоящим и требующим сложной аппаратуры для своей реализации.
Для детекции реакции по аффинности, требующей только одного антитела, были разработаны другие способы, например способы, основанные на поверхностном плазмонном резонансе ("plasmon surface resonance"), на использовании пьезоэлектрических весов и даже на простом наблюдении под микроскопом в случае некоторых веществ, позволяющих такое наблюдение. С этой целью антитело закрепляли на подложке, адаптированной к методике детекции, вещество приводили в контакт в течение заданного времени с антителом, закрепленным на подложке, затем осуществляли считывание результатов непосредственно после этого или после промывки, осуществляемой для удаления веществ, не вступивших в реакцию по аффинности с антителами.
Эти способы имеют многие недостатки, например аппаратура, необходимая для осуществления считывания результатов, является сложной и дорогостоящей. Кроме того, они требуют использования особых подложек для закрепления антител. Кроме того, они требуют осуществления большого числа стадий и зависят от качества и количества закрепленных антител.
Таким образом, в указанных выше способах существенным обстоятельством является закрепление на подложке антитела или любого другого вещества, обладающего аффинностью. В уровне техники известны поверхности, обладающие аффинностью. Такие поверхности могут быть получены, например, способом "молекулярного формования".
Также известно, что можно применять указанные выше способы, закрепляя на подложке неспецифическим образом детектируемое вещество. Вещество, закрепленное таким образом, затем приводят в контакт с антителом или любым другим веществом, обладающим соответствующей аффинностью и меченым или немеченым в зависимости от способа детекции, и далее при необходимости промывают перед процедурой считывания результатов.
Тем не менее, эти варианты имеют многие недостатки. В частности, необходимо связывать детектируемое вещество с подложкой, что невозможно осуществлять ни универсальным, ни специфическим образом. Кроме того, это закрепление может изменять структуру закрепленного вещества. Это изменение структуры может ухудшать чувствительность и/или специфичность детекции, в частности, в случае, когда используют антитела. Кроме того, закрепление может приводить к получению ложноотрицатель-ных и/или ложноположительных результатов. Кроме того, закрепление может отличаться от одного случая осуществления к другому, так что получаемые таким образом результаты могут быть невоспроизводимыми. Кроме того, для детекции необходимы сложные и дорогостоящие устройства.
Таким образом, существует реальная потребность в разработке способа детекции молекулярных взаимодействий, смягчающего эти дефекты, недостатки и помехи предшествующего уровня техники, в частности способа, который позволяет улучшить чувствительность детекции молекулярных взаимодействий, уменьшить затраты на осуществление, применение которого является простым и который позволяет получать быстрые, надежные и воспроизводимые результаты.
Описание изобретения
Более конкретно, задачей настоящего изобретения является нахождение ответа на указанные выше многочисленные требования и недостатки предшествующего уровня техники за счет разработки способа детекции молекулярных взаимодействий.
В частности, объектом настоящего изобретения является способ детекции взаимодействий в растворе, включающий следующие стадии:
a) введение в раствор по меньшей мере одного первичного вещества и предпочтительно по меньшей мере одного вторичного вещества, способного взаимодействовать с первичным веществом;
b) введение в раствор, полученный на стадии a), по меньшей мере двух магнитных или намагничиваемых частиц, где частицы находятся на поверхности, погруженной в раствор;
c) определение взаимодействия указанных веществ приложением электрического, магнитного или электромагнитного поля, предназначенного для приведения в движение указанных частиц, причем взаи
a)
модействие между веществами детектируется тогда, когда подвижность частиц на поверхности изменяется.
Согласно настоящему изобретению под подвижностью понимают движение частиц при приложении и/или под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля. Эта подвижность может быть определена, например, исходя из соотношения между скоростью частиц в данной точке пространства и второй степенью напряженности магнитного поля в этом месте пространства, например, исходя из соотношения между скоростью частиц в данной точке пространства и разностью электрических потенциалов в этом месте пространства.
Согласно настоящему изобретению изменение подвижности может быть выбрано из торможения, замедления, изменения траектории, ускорения или остановки частиц.
Таким образом, приложение электрического, магнитного или электромагнитного поля по изобретению может вызывать группирование, не вызывать группирование или вызывать рассеяние частиц.
Согласно настоящему изобретению под взаимодействием веществ понимают, например, молекулярное взаимодействие, например взаимодействие типа водородной, ионной связи, ван-дер-ваальсовых сил, биологическое взаимодействие, например взаимодействие при распознавании трехмерных специфических звеньев типа "гормон-рецептор", "антитела-антигены", электростатическое взаимодействие, магнитное взаимодействие, градиент концентрации ионов или молекул, иначе говоря, любой градиент потенциалов, концентрации молекул или ионов, природа которого определяется на уровне веществ, и который стремится принудить их сблизиться или оттолкнуться, например, посредством водородных связей, взаимодействия ван-дер-ваальсовых сил, гидрофобных связей, ковалентных связей, ионных связей, например, посредством хемотаксиса. Можно использовать, например, взаимодействие "антигены-антитела", "ферменты-субстраты", "рецепторы-лиганды", "молекулы-клетки", "клетки-векторы", "клетки-вирусы", "эукариотические клетки-прокариотические клетки", "эукариотические клетки-эукариотические клетки", "прокариотические клетки-прокариотические клетки".
Раствор, приемлемый для использования по настоящему изобретению, может представлять собой жидкий раствор или газ. Раствор может представлять собой любой раствор, известный специалистам в данной области техники. Он может представлять собой, например, культуральную среду, например среду для культивирования эукариотических и/или прокариотических клеток, буферную среду, например любую буферную среду, известную специалистам в данной области техники, например буферную среду, реализуемую в торговой сети, например забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), биологический образец, например образец крови, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости, солевой раствор, например физиологический раствор, культуральную среду, например экстракт из сердца и головного мозга, реализуемый в торговой сети, растворитель, например ацетон, диметилсульфоксид, этанол, метанол, пропанол, ацетонитрил, этилацетат, диэтиловый эфир, фенол, хлороформ, тетрагидрофуран, дифторэтилен и/или углеводород, например гексан, циклогексан, бензол, октан, декан, нефть, бензин, газойль.
Газ по настоящему изобретению может представлять собой, например, воздух, кислород, азот, неон, аргон, диоксид углерода, метан, озон.
Жидкий раствор по настоящему изобретению может иметь плотность от 0,1 до 4 кг/л, от 0,3 до 3
15 310 35 3
кг/л; газовый раствор может иметь плотность от 10- до 1000 кг/м , от 10- до 30 кг/м , от 10- до 3 кг/м .
Специалисты в данной области техники на основе этих общих сведений могут легко определить плотность раствора. Например, определение плотности раствора может быть осуществлено по соотношению массы к объему, например, при взвешивании раствора известного объема.
Раствор по настоящему изобретению может быть предварительно обработан, например раствор может быть очищен, разбавлен, сконцентрирован.
Раствор по настоящему изобретению может быть очищен любым способом, известным специалистам в данной области техники, например диализом, фильтрованием, ультрафильтрацией, осветлением и центрифугированием. Например, способ фильтрования может включать пропускание раствора через сетку с ячейками от 0,2 до 100 мкм, способ ультрафильтрации может включать, например, центрифугирование со скоростью от 1 до 3000 об/мин в течение от 0,1 до 30 мин, способ диализа может представлять собой, например, способ, включающий стадию нанесения раствора на мембрану для диализа, например, с пределом разделения 500 Д, причем мембрана флотирует на дистиллированной воде, содержащейся в сосуде. Способ осветления может представлять собой, например, способ, включающий прибавление к раствору 0,1% (мас./мас.) альбумина бычьей сыворотки.
Очистка раствора по настоящему изобретению предпочтительно может позволять удалять из раствора любое загрязняющее вещество и/или соединения, способные ухудшать детекцию молекулярного взаимодействия, например, очистка может позволять независимо удалять бактерии, вирусы, белки, химические соединения, соли, гранулы веществ, агрегаты молекул. Разумеется, специалисты в данной области техники на основе этих общих сведений могут адаптировать способ очистки в зависимости от раствора.
Раствор по настоящему изобретению может быть также разбавлен, например, любым способом, известным специалистам в данной области техники, например серийным разбавлением. Разбавление может быть осуществлено любым разбавителем, известным специалистам в данной области техники. Он может
представлять собой, например, буферный раствор, например забуференный фосфатом солевой раствор, солевой раствор, например физиологический раствор, этанол, ДМСО, ацетон, гексан и/или любой растворитель, углеводород или раствор, описанный выше.
Раствор может быть разбавлен, например, с коэффициентом от 2 до 20000, от 5 до 500, от 5 до 50.
Разбавление раствора может позволять предпочтительно изменять концентрацию компонентов, содержащихся в растворе, например уменьшать концентрацию, например разбавление может позволять уменьшать концентрацию белков. Таким образом, разбавление может позволять уменьшать концентрацию возможно присутствующих маскирующих соединений и предпочтительно улучшать специфичность и/или чувствительность способа по настоящему изобретению.
Раствор по настоящему изобретению может быть также сконцентрирован, например, любым способом, известным специалистам в данной области техники, например ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, упариванием, лиофилизацией.
Очистка, разбавление и/или концентрирование раствора по настоящему изобретению может предпочтительно позволять регулировать плотность раствора.
Регулирование плотности раствора предпочтительно обеспечивает улучшение специфичности и/или чувствительности способа по настоящему изобретению, в частности за счет увеличения, уменьшения или компенсации действия силы тяжести, которая толкает частицы к поверхности.
Объем раствора, используемого в способе по настоящему изобретению, может составлять, например, от 0,3 мкл до 100 мл, от 3 мкл до 10 мл, от 30 мкл до 1 мл.
Раствор по настоящему изобретению может обеспечивать управление взаимодействием между первичным и вторичным веществами. Например, раствор может увеличивать или уменьшать взаимодействие между указанными веществами.
Раствор по настоящему изобретению может предпочтительно содержать соединение, которое увеличивает или уменьшает взаимодействие между первичным и вторичным веществами. Соединение может быть прибавлено к раствору, например, до осуществления способа по настоящему изобретению. Соединение может представлять собой, например, химические соединения, соли, ионы, полимеры, макромолекулы, коллоиды, микрочастицы, например, кислоты и основания, которые изменяют pH раствора, например, NaCl, который изменяет ионную силу раствора, например полиэтиленгликоль, который, например, может увеличивать аффинность веществ.
Настоящее изобретение позволяет предпочтительно определять эффективность управления раствором взаимодействия путем сравнения результатов, полученных способом по настоящему изобретению с разными растворами в случае, когда вещества являются одинаковыми.
По настоящему изобретению первичное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из эу-кариотических клеткок, прокариотических клеток, мембран, вирусов, прионов, митохондрий, хлоропла-стов, везикул, липосом, клеточных компонентов, жгутиконосцов, белков, липопротеинов, гликопротеи-нов, антител, нуклеиновых кислот, липидных комплексов, коллоидов, макромолекул, микрочастиц, на-ночастиц, антигенов, гормонов, лигандов белков и химических соединений.
Эукариотические клетки, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, могут представлять собой, например, эукариотические клетки животных, например клетки крови, например лейкоциты, гранулоциты, полиядерные нейтрофилы, многоядерные эозинофилы, многоядерные базофи-лы, лимфоциты B, лимфоциты T, лимфоциты NK, моноциты, эритроциты, тромбоциты. Они могут представлять собой также растительные эукариотические клетки, например клетки растительного эпидермиса, ксилемы, флоэмы, паренхимы, колленхимы, склеренхимы. Они могут представлять собой также грибы, дрожжи. Можно использовать, например, Candida, Cryptococcus, Malassezia, Pityrosporum, Pneumocystis, Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton. Можно также использовать простейших, например Entamoeba histolytica, Acanthamoeba castellanii, Naegleria fowleri.
Прокариотические клетки по настоящему изобретению могут представлять собой, например, любые бактерии, известные специалистам в данной области техники. Бактерии, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, представляют собой, например, бактерии, входящие в группу, которая не является ограничительной и в которую входят
Acetobacter
aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium
tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii,
Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus
fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides
gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae,
Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella
pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis,
Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis,
Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei
Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli,
Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia
pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis,
Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium
botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens,
Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium
diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii,
Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans,
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli,
Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella
vaginalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae,
Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus
vaginalis, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis,
Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens,
Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium
avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae,
Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae,
Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium
smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma fermentans,
Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma
pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,
Nocardia asteroides, Pasteurella multocida, Pasteurella
tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia
prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia
quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae,
Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia
dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi,
Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella
dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus
bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium,
Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus
gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior,
Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus
oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus
sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio
cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio
vulnificus, Xanthomonas maltophilia, Yersinia enterocolitica,
Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и т.д.
Мембраны, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, могут представлять собой любые фрагменты мембран эукариотических и прокариотических клеток, например указанных выше прокариотических или эукариотических клеток, любые фрагменты клеточных мембран и/или отделов клеток, например митохондрии, хлоропласты, эндопласты, эндоплазматический ретикулум.
Белки, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, могут представлять собой плазматические белки, клеточные белки, бактериальные белки. Например, белки могут представлять собой гормоны, например прогестерон, вазопрессин, тиреотропный гормон, лютеинизирующий гормон (LH), гормон стимуляции щитовидной железы (TSH), гормон роста (GH), эпидермальный фактор роста (EGF), инсулин, окситоцин. Можно использовать, например, каналы, например кальциевые каналы, например каналы, описанные Catterall W.A. в (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16:521-55 [4], калиевые каналы, например каналы, описанные Dick G.M. и Tune J.D. в Role of potassium channels in coronary vasodilation, Exp. Biol. Med. (Maywood), 2010 Jan; 235(1):10-22 [6]. Они могут представлять собой также пептиды, участвующие в главном комплексе гис-тосовместимости (CMH), например CMH I и/или CMH II. Они могут представлять собой также рецепторы, например ядерные, внутриклеточные, мембранные, трансмембранные рецепторы, рецепторы, связанные с белками G, рецепторы ацетилхолина, рецептор FSH, рецептор тестостерона, например рецепторы, описанные Mostallino M.C. и соавт. в Plasticity and function of extrasynaptic GABA(A) receptors during pregnancy and after delivery, Psychoneuroendocrinology, 2009 Dec; 34 Suppl. 1: S74-83 [7]. Они могут представлять собой также ферменты, например бактериальные ферменты, например рестрикционные ферменты, например HindIII, Eco RI, BamHI, MstII, TaqI, NotI, HinfI, AluI, BglIII, HaeII, HhaI, PstI, SmaI, ферменты, участвующие в трансдукции клеточных сигналов, например протеинкиназы, ферменты, участвующие в биосинтезе, например в биосинтезе жирных кислот, фосфорилазы, дегидрогеназы, например глюкозодегидрогеназу, ферменты, участвующие в общем метаболизме, например альдегиддегидрогена-зу, альфа-амилазу, L-гулонолактоноксидазу, родопсин, цитохром B, цитохром C. Они могут представлять собой также структурные белки, например актин, миозин, пептин, альбумин, коллаген, гистон H4.
Антитела, которые могут быть использованы по изобретению, могут представлять собой любые антитела, известные специалистам в данной области техники. Например, можно использовать любые антитела, реализуемые коммерчески, например, IgG, IgA, IgM, IgE и IgD, антитела могут представлять собой, например, антитела, направленные к указанным выше белкам, антитела, направленные к другим антителам, например антитела кролика, направленные к антителам человека, например антитела, специфически направленные к антителам, направленным к рецептору FSH. Они могут представлять собой также антитела, полученные после иммунизации субъекта, например способом, описанным в Biologie cellulaire et moleculaire, Concepts et experiences, 2nd edition 2004, Gerald Karp [5]. Они могут представлять собой, например, антитела, продуцируемые человеком или животным в ответ на инфицирование, например, вирусами, бактериями, прионами, паразитами, простейшими, а также в ответ на болезнь, например на рак, аутоиммунное заболевание, такое как, например, базедова болезнь, рассеянный склероз, а также в ответ на интоксикацию, отравление, заражение, допинг, проглатывание, вдыхание и инъецирование, например, пестицида, яда, инсектицида, гербицида, аллергенного агента, а также в ответ на имплантацию, например, костного мозга, органа, такого как, например, почка, легкое, печень, конечности, такой как, например, рука, голень, стопа, а также в ответ на имплантацию искусственного органа, имплантируемой камеры, водителя ритма, искусственного сердца, искусственного тазобедренного сустава.
Химические соединения, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, могут представлять собой любые химические соединения, известные специалистам в данной области техники. Они могут представлять собой, например, коагулянты, реактивы, описанные выше, гормоны, например, стероидные гормоны, например кортизол, альдостерон, прогестерон, дегидроэпиандростерон (DHEA), сульфат дегидроэпиандростерона (DHEAS), эстрадиол, андростендион, дигидротестостерон (DHT), эстрон, эстриол, тестостерон, например тироксин, например пептидные гормоны, например эри-тропоэтин (EPO), глюкагон, соматостатин, атриальный натрийуретический пептид (ANP), кортикотропин
(АСТН).
Первичное вещество по настоящему изобретению может содержаться в растворе, в данном случае первичное вещество не требуется вводить в раствор.
Первичное вещество по настоящему изобретению может быть предварительно закреплено на погруженной поверхности. Способ закрепления первичного вещества, который может быть использован по настоящему изобретению, может представлять собой любой способ, известный специалистам в данной области техники. Разумеется, специалисты в данной области техники на основе этих общих сведений могут выбрать способ закрепления в зависимости от первичного вещества.
Согласно настоящему изобретению в случае, когда первичное вещество закреплено, молекулярное взаимодействие с вторичным веществом изменяет погруженную поверхность и, например, может уплотнять эту поверхность, на которой находится частица, тормозя, таким образом, перемещение частицы при приложении электрического, магнитного или электромагнитного поля и свидетельствуя, таким образом, о взаимодействии.
Вторичное вещество по настоящему изобретению может представлять собой любое определенное
выше вещество, способное взаимодействовать с первичным веществом.
Плотность первичного и/или вторичного вещества по настоящему изобретению может быть больше или меньше плотности раствора и предпочтительно больше плотности раствора. Превышение плотности первичного и/или вторичного вещества предпочтительно обеспечивает нахождение первичного и/или вторичного вещества вблизи дна вмещающего сосуда.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ может быть осуществлен с раствором, предварительно содержащим по меньшей мере одно первичное и по меньшей мере одно вторичное вещество. В этом варианте осуществления способ может не включать стадию a) и может включать только указанные выше стадии b) и c).
Способ по настоящему изобретению может включать вместо стадии a)
предварительную стадию a') закрепления первичного вещества на поверхности вмещающего сосуда; стадию a") введения раствора во вмещающий сосуд;
стадию a"') введения по меньшей мере одного вторичного вещества, способного взаимодействовать с первичным веществом.
Способ по настоящему изобретению может быть осуществлен с множеством частиц, например по меньшей мере с 2 частицами, например от 2 до 10000000, от 1000 до 1000000, от 10000 до 1000000, от 100000 до 1000000, от 10000 до 100000. Множественность частиц предпочтительно обеспечивает прямую детекцию, без использования сложного устройства для визуализации и без красителя, взаимодействия между веществами в противоположность способам уровня техники, в которых используют только одну частицу и которые требуют для детекции взаимодействия использования сложных устройств для визуализации информации или красителей.
Согласно настоящему изобретению указанные выше по меньшей мере две частицы могут быть выбраны из группы, состоящей из электрически заряженных частиц, магнитных частиц, частиц, покрытых по меньшей мере одним магнитным слоем, намагничиваемых частиц, частиц, покрытых намагничиваемым слоем, электрических, электромагнитных, электризуемых, несущих электрический заряд частиц или смеси двух или нескольких таких частиц. Можно использовать, например, частицы, которые состоят полностью или частично из магнитного и/или намагничиваемого материала и которые могут быть приведены в движение при действии/приложении электрического, магнитного или электромагнитного поля. Фактически можно использовать любые частицы, позволяющие осуществить настоящее изобретение.
Частицы предпочтительно могут представлять собой частицы любой формы, приемлемой для осуществления настоящего изобретения, например в виде шариков, дисков, неправильной геометрической формы, например, с лицевой плоскостью и т.д.
Могут быть использованы магнитные частицы любого приемлемого размера. Размер может быть выбран, например, в зависимости от размера сосуда, вмещающего раствор. Например, размер частиц может быть меньше одной десятой размера вмещающего сосуда, предпочтительно меньше одной сотой и более предпочтительно меньше одной тысячной размера вмещающего сосуда. Например, частица может иметь размер от 10 нм до 100 мкм, от 0,1 до 10 мкм.
Способ по настоящему изобретению предпочтительно позволяет измерять малые изменения вязко-упругих свойств раствора, в который погружены частицы. Чем меньше эти изменения, тем более чувствительным должно быть измерение. Изобретение позволяет, используя множественность частиц, надлежащим и выгодным образом детектировать малые изменения, обусловленные слабыми взаимодействиями между веществами, которые как присутствуют в малом количестве, так и порождают слабые силы взаимодействий. Использование только одной магнитной или намагничиваемой частицы и/или шарика не позволяет детектировать взаимодействия удовлетворительным образом. Кроме того, существует значительный риск детекции неспецифических феноменов, например, обусловленных присутствием агрегатов, примесей, способных влиять на движение микрочастицы, намагничиваемой под действием магнитного, электрического или электромагнитного поля.
В противоположность этому способ по настоящему изобретению, в котором используют по меньшей мере две частицы, позволяет получать надежный и статистически представительный результат.
Кроме того, чем больше число частиц, тем больше их соответствующие перемещения дают информации, в частности, за счет более хорошего покрытия поверхности, в контакте с которой проявляется определяемый феномен. Таким образом, способ по настоящему изобретению позволяет предпочтительно интерпретировать не только собственное движение микрочастиц (траекторию, скорость перемещения и т.д.), но также и общую картину, которую они составляют после приложения магнитного, электрического или электромагнитного поля. На практике, исходное однородное распределение множества микрочастиц нарушается при приложении этого поля в зависимости от вязкоупругих свойств среды. Например, если среда является высоковязкой и между имеющимися веществами развивается сильное взаимодействие, то распределение остается однородным, частицы не могут смещаться или смещаются в малой степени под действием поля. Если среда является маловязкой или невязкой или между имеющимися веществами развивается очень слабое взаимодействие или взаимодействие отсутствует, то распределение будет соответствовать наиболее сильным линиям, например, образуя кольцо или пятно над цилиндрическим магнитом, причем частицы имеют полную свободу для смещения под действием поля.
Кроме того, способ по настоящему изобретению благодаря использованию множества частиц предпочтительно позволяет, например, за счет однородного распределения и/или рассеяния частиц в растворе, содержащем вещества, наблюдать визуально взаимодействие, видимое не только на уровне молекул, т.е. в нанометровом диапазоне, но также и при исследовании под микроскопом, т.е. в микрометровом диапазоне, и даже макроскопически, т.е. в диапазоне больше микрометра.
Например, взаимодействие между веществами ведет 1) к образованию агрегатов, центров образования зародышей и кристаллов, взаимодействующих с частицами отличающимся образом по сравнению с веществами, взаимодействие которых ведет 2) к образованию более или менее структурированных полимеров. В первом случае частицы имеют тенденцию группироваться около агрегатов, центров образования зародышей и кристаллов со стороны, противоположной направлению движения, возникающего при приложении электрического, магнитного или электромагнитного поля к частицам. При этом частицы формируют контрастное изображение в области зон скопления. Во втором случае, если полимеризация развивается в растворе однородным и равномерным образом, то изображение отражает постепенное уменьшение подвижности частиц по мере уменьшения напряженности электрического, магнитного или электромагнитного поля (например, по мере отдаления от магнита). Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно позволяет получать изображения, свидетельствующие о структурах, возникающих вследствие взаимодействия между веществами и частицами в растворе.
Число частиц, используемых для визуализации изображений в микроскопическом и даже в макроскопическом диапазоне, предпочтительно составляет от 1000 до 1000000, от 10000 до 1000000, от 100000
до 1000000, от 10000 до 100000.
Согласно настоящему изобретению частицы предпочтительно могут иметь плотность, близкую к плотности веществ, способных взаимодействовать между собой. Например, частицы могут иметь плотность относительно веществ в интервале от 0,3 до 3.
Согласно настоящему изобретению плотность частиц может быть определена любым способом, известным специалистам в данной области техники, например по соотношению между массой частиц и приращением объема раствора, в который вносят эти частицы.
Согласно настоящему изобретению плотность частиц предпочтительно обеспечивает улучшение специфичности и/или чувствительности способа по настоящему изобретению, например за счет увеличения, уменьшения или компенсации действия силы тяжести.
Частицы и вещества предпочтительно должны иметь плотность, превышающую плотность раствора, в котором они содержатся. Частицы и вещества предпочтительно должны иметь плотность, немного превышающую плотность раствора, в котором они содержатся, например, в интервале, превышающем от
1,0001 до 3 раз.
Молекулы адгезионного слоя предпочтительно могут быть связаны с поверхностью частиц. Связывание этих молекул с поверхностью частиц предпочтительно обеспечивает адгезию частиц между собой. Например, частицы могут быть покрыты полимерами, например блок-полимерами, содержащими гидрофильные и гидрофобные части, предпочтительно обеспечивающими после приложения электрического, магнитного или электромагнитного поля устойчивую группировку частиц. Иначе говоря, взаимодействие между молекулами адгезионного слоя обеспечивает объединение частиц между собой после приложения поля и, следовательно, стабильный и неизменный результат.
Частицы по настоящему изобретению могут быть одинаковых или разных размеров.
В случае, когда частицы имеют одинаковые размеры, они, по существу, тормозятся или ускоряются при молекулярном взаимодействии в одно и то же время. В случае, когда используемые частицы имеют разные размеры, размер малых частиц может быть выбран, например, так, чтобы они тормозились в начальный момент молекулярного взаимодействия, а крупные частицы тормозились позднее. В этом случае частицы меньших размеров тормозятся раньше частиц более крупных размеров.
В случае, когда частицы имеют разные размеры, малые частицы могут иметь размеры, например, от 10 нм до 1 мкм, от 100 до 500 нм, и крупные частицы могут иметь размеры, например, от 1 до 100 мкм, от 1 до 10 мкм, от 1 до 5 мкм.
Частицы разных размеров предпочтительно могут обеспечивать более раннюю и более чувствительную детекцию и/или анализ молекулярного взаимодействия.
Согласно настоящему изобретению также можно использовать множество частиц одинаковых размеров с разной намагниченностью.
Разница в поведении разных частиц предпочтительно может позволять оценивать силу молекулярного взаимодействия. Так, по сравнению с полной неподвижностью всех частиц в случае сильного взаимодействия приложением магнитного поля можно вызвать движение частиц, которые были намагничены сильнее и магнитная сила которых является более значительной, в то время как частицы, которые были намагничены слабее, не могут быть приведены в движение.
Согласно настоящему изобретению по меньшей мере одна частица предпочтительно представляет собой частицу, генерирующую детектируемый сигнал. Детекция этого сигнала будет зависеть от свойств частицы. Например, по меньшей мере одна частица может быть флуоресцирующей, фосфоресцирующей, радиоактивной, хемилюминесцирующей, отражающей или окрашенной.
Например, в случае, когда по меньшей мере одна частица является флуоресцирующей, флуоресценция, создаваемая этой частицей, может быть детектирована, например, визуально и/или любыми оптическими устройствами, известными специалистам в данной области техники. По меньшей мере одна такая частица для отслеживания ее движения может быть освещена, например, посредством источника света, например лазерным лучом.
Согласно настоящему изобретению освещение может быть непрерывным или прерывистым. Например, освещение может осуществляться в течение всего времени осуществления способа или, например, в течение стадии a) или b), или c), a) и c), a) и b), b) и c).
Например, в случае, когда по меньшей мере одна частица является фосфоресцирующей, эта частица может быть детектирована, например, визуально, любыми оптическими устройствами, известными специалистам в данной области техники.
Например, в случае, когда частица является радиоактивной, эта частица может быть детектирована даже через оптически непрозрачные жидкости или культуральные среды, а также через оптически непрозрачные планшеты для микроразведений любыми устройствами для детекции радиоактивности, известными специалистам в данной области техники, предпочтительно традиционным способом обнаружения на ауторадиографической пленке. При этом достаточно наложить чувствительную пленку на планшет для микроразведений и затем проявить изображение дна этого планшета для микроразведений.
Например, в случае, когда по меньшей мере одна частица является хемилюминесцирующей, детекция этой частицы может осуществляться прибавлением к среде химического реактива, обеспечивающего эмиссию этой частицей лучистой энергии. Детекция этого сигнала может быть осуществлено, например, визуально и/или любыми устройствами, известными специалистам в данной области техники, и предпочтительно посредством камеры CCD ("Charges Coupled Device" (прибор с зарядовой связью)), чувствительной в диапазоне длин волн испускаемого излучения и считывающей (сканирующей) сигналы лунок планшета для микроразведений.
Например, в случае, когда по меньшей мере одна частица является отражающей, детекция этой частицы может быть осуществлена, например, визуально или любыми оптическими устройствами, известными специалистам в данной области техники. По меньшей мере одна такая частица для отслеживания ее движения предпочтительно может быть освещена, например, посредством источника света, например лазерным лучом.
Например, в случае, когда по меньшей мере две частицы являются окрашенными, детекция этих частиц может быть осуществлена, например, визуально и/или любым устройством, известным специалистам в данной области техники и предназначенным для детекции окрашенных частиц.
Согласно настоящему изобретению частицы предпочтительно могут быть выбраны разного цвета в зависимости от их размера и/или в зависимости от их магнитной силы. В этом случае приложение магнитного поля обеспечивает появление на поверхности окрашенной точки, или кольца, или окрашенного пятна вследствие группирования частиц. Это свойство предпочтительно обеспечивает облегченную визуальную детекцию группировки. На практике, например, в случае, когда частицы имеют два разных размера, причем крупные частицы имеют один цвет, а малые частицы имеют другой цвет, при приложении магнитного поля в случае слабого взаимодействия между веществами малые частицы в растворе остаются неподвижными, в то время как крупные частицы группируются. Такое группирование может отображаться появлением окрашенной точки, цвет которой, в данном случае, идентичен цвету частиц более крупного размера. Если какое-либо молекулярное взаимодействие между веществами в растворе отсутствует, то малые и крупные частицы могут группироваться, при этом группирование частиц отображается появлением окрашенной точки, соответствующей наложению двух цветов. Наконец, если молекулярное взаимодействие является сильным, то частицы могут полностью тормозиться и, следовательно, не могут группироваться, при этом не отображается какая-либо цветная точка.
Иными словами, группировка может быть оценена, например, по измерению пятна, образованного сгруппированными частицами. Например, в случае когда частицы являются окрашенными, определяют цвет частиц. Кроме того, группировка может быть оценена, например, в зависимости от формы полученного пятна, например в зависимости от формы, диаметра, его топологии, например в виде диска, кольца.
Специалистам в данной области техники будет легко понятно, что для осуществления настоящего изобретения выбор визуальных свойств по меньшей мере двух частиц также может быть сделан в зависимости от раствора. На практике детекция движения по меньшей мере двух частиц осуществляется тем легче, чем больше контраст между цветом по меньшей мере двух частиц и цветом раствора.
Согласно настоящему изобретению магнитное, или электрическое, или электромагнитное поле может представлять собой любое поле, позволяющее привести в движении по меньшей мере две частицы на поверхности, погруженной в раствор, например электромагнитное поле или магнитное поле. Магнитное, или электрическое, или электромагнитное поле может быть создано, например, магнитом или соленоидом. Магнит может иметь, например, форму бруска, острого конуса, стержня и т.п. или любую форму, приемлемую для осуществления настоящего изобретения. Поле может быть приложено в любом режиме, известном специалистам в данной области техники, например в импульсном режиме, в режиме постепенного увеличения напряженности электромагнитного поля, в режиме переменного изменения
напряженности электромагнитного поля или в виде комбинации этих режимов.
Постепенное увеличение напряженности электромагнитного поля может быть получено, например, за счет приближения магнита по прямолинейной или синусоидальной траектории или за счет колебательного движения, которое необязательно имеет переменную амплитуду и/или частоту колебаний. Более сложные изменения напряженности электромагнитного поля могут быть получены, например, вращением или комбинацией перемещений магнитного материала вблизи по меньшей мере одной частицы.
Таким образом, магнитное поле по настоящему изобретению может быть создано генерирующими поле устройствами, которые необязательно могут находиться в движении.
В случае, когда в движение должно быть приведено несколько частиц, поле должно быть в состоянии группировать частицы на поверхности, погруженной в раствор.
Независимо от варианта осуществления настоящего изобретения способ по настоящему изобретению может быть предпочтительно осуществлен одновременно в нескольких ячейках.
В данном случае для приведения в движение частиц в ячейках предпочтительно может быть использовано несколько источников магнитных полей, например магнитов. Магниты могут быть, например, закреплены на опоре, так чтобы обеспечить приложение к каждой ячейке, в которой осуществляют способ по настоящему изобретению с магнитом с опорой. Приложение магнитного поля к ячейкам не зависит от той или иной ячейки. Магнитное поле, прилагаемое к ячейкам, может быть одинаковым или различаться от ячейки к ячейке и предпочтительно является одинаковым.
Согласно настоящему изобретению магнитное, электромагнитное или электрическое поле может быть приложено, например, на время от 1 с до 15 мин, от 10 с до 10 мин. Таким образом, специалисты в данной области техники согласно этим общим сведениям смогут адаптировать время в зависимости от испытуемых веществ и/или напряженности прилагаемого поля.
Под ячейкой по настоящему изобретению понимают, например, реактор для культивирования, чашки, пробирки или лунки, например, планшеты для микроразведений. Под планшетом для микроразведений понимают планшет, тип которого определен, например, Американским национальным институтом стандартов (American National Standards Institute) и Обществом биомолекулярных наук (Society for Bio-molecular Sciences) ("микропланшеты") и который имеет 96, 384 и даже 1536 лунок.
Материал, образующий ячейку, может представлять собой любой материал, приемлемый для осуществления настоящего изобретения, например пластмассу, например поликарбонат, полистирол и т.п., стекло, металл и т.п. Предпочтительно можно использовать планшеты для микроразведений из полистирола, имеющие чашки без днищ. Днища этих чашек образуют, закрепляя пластины на планшете для микроразведений. Эти пластины могут быть выполнены из прозрачных материалов, например из пластмассы, из стекла и т.п., или из непрозрачных материалов, например из металла, из керамики и т.п. Способ закрепления пластин на планшете для микроразведений может представлять собой любой приемлемый способ, известный специалистам в данной области техники для такого закрепления, например приклеивание посредством клея, приклеивание трением, приклеивание плавлением пластического материала, например лазером и т.д.
Согласно настоящему изобретению различные ячейки могут быть сгруппированы на одной опоре, например на пластине, имеющей от 1 до 1536 лунок, например 6, 16, 64, 96 и т.д.
Ячейка может представлять собой, например, камеру, закрытую с одного конца, типа пробирки, лунки и т.п. или камеру, имеющую два отверстия.
Согласно первому варианту исполнения ячейка может иметь один закрытый конец, образующий плоское днище.
Согласно второму варианту исполнения ячейка может иметь один закрытый конец, образующий полусферическое днище.
Согласно настоящему изобретению определение взаимодействия между веществами может быть осуществлено непосредственно после приложения магнитного, электромагнитного или электрического поля. Например, определение может быть осуществлено в течение от 0,01 с до 30 мин, от 1 с до 3 мин после приложения поля.
Определение взаимодействия между веществами по настоящему изобретению может быть осуществлено также путем сравнения группирования частиц во время приложения магнитного, электромагнитного или электрического поля. Например, можно сравнивать группирование частиц в растворе, который не содержит какого-либо вещества или содержит только одно из указанных выше веществ, с группированием частиц в растворе, содержащем первичное и вторичное вещества. Если группирование является значительным или менее значительным в растворе, который не содержит какого-либо вещества или содержит только одно из указанных веществ, то эти вещества взаимодействуют, и таким образом определяется это взаимодействие. Иными словами, взаимодействие между веществами может понижать или повышать группирование частиц во время приложения поля и таким образом может быть определено. Например, если взаимодействие вызывает агрегацию веществ, то среда может стать менее вязкой, и группирование частиц будет повышенным. Например, если взаимодействие вызывает преципитацию веществ, то поверхность может покрыться осадком, и группирование частиц будет пониженным. Например, если взаимодействие вызывает перекрестное сшивание веществ, то сетка веществ будет замедлять
частицы, и группирование частиц будет пониженным. Например, если взаимодействие вызывает образование линейных цепочек веществ, то вязкость среды станет повышенной, и группирование частиц будет пониженным.
Способ по настоящему изобретению может быть осуществлен, например, в нескольких ячейках, каждая из которых содержит раствор;
по меньшей мере одну частицу;
вещества, способные взаимодействовать между собой.
Способ по настоящему изобретению может включать также стадию b' смешивания. Смешивание может быть осуществлено, например, перемешиванием раствора, в котором содержатся указанные выше вещества. Можно использовать, например, смешивание магнитной или орбитальной мешалкой. Согласно настоящему изобретению смешивание может осуществляться, например, в течение от 1 с до 15 мин, от 10 с до 10 мин.
Настоящее изобретение относится также к применению способа по настоящему изобретению, например для идентификации веществ, содержащихся в растворе, анализа биологических образцов, осуществления биологических испытаний, определения типа крови, осуществления иммуногематологических испытаний, осуществления детекции естественного или искусственного заражения, например, вирусами, бактериями, амебами, дрожжами, раковыми клетками, прионами, пестицидами, фунгицидами, антибиотиками, гормонами, токсинами. Настоящее изобретение относится также к применению способа по настоящему изобретению, например для осуществления испытаний на допинг, осуществления научных исследований с веществами, например для исследования действия раствора на взаимодействие между веществами, например в водных растворах, в органических растворах, в газах, например, содержащих молекулы, коллоидные частицы, наночастицы, микрочастицы. Настоящее изобретение относится также к применению способа по настоящему изобретению, например для осуществления научных исследований субъектов или веществ, связанных, например, с биологией, онкологией, эндокринологией, инфекционными болезнями, например для исследования гидрогелей, образующихся в водных растворах, аэрогелей, образующихся в газах, гелей, образующихся в растворителях или в углеводородах.
Например, способ по настоящему изобретению может быть использован для анализа биологических образцов, например для определения серологического типа крови, определения CMH пациента, определения присутствия, например, характерного белка, антитела, рецептора в образце. Способ по настоящему изобретению также может быть использован для идентификации химических веществ в растворе.
Например, в случае, когда способ по настоящему изобретению используют для определения серологического типа, раствор представляет собой образец крови, отобранной у пациента, например человека или животного, и содержащей первичное вещество.
Кроме того, способ по настоящему изобретению может быть использован для детекции взаимодействия между рецептором и возможным лигандом, между антителом и белком, химическим соединением, другим антителом и/или любым веществом, которое может быть распознано антителом. Способ по настоящему изобретению также может быть использован для детекции взаимодействия между клетками, например между эукариотическими клетками, прокариотическими клетками, между эукариотическими и прокариотическими клетками. Способ по настоящему изобретению также может быть использован для независимой детекции взаимодействия между бактериями, вирусами, дрожжами и/или эукариотически-ми клетками.
Способ по настоящему изобретению также может быть использован, например, для детекции хемотаксиса, явлений клеточной адгезии.
Способ по настоящему изобретению также может быть использован, например, для детекции взаимодействия между наночастицами, между микрочастицами, между объектами сложной формы микро- и нанометровых размеров.
Способ по настоящему изобретению также может быть использован, например, для детекции взаимодействия (i) первичного вещества, например антител, продуцируемых человеком или животным в ответ на инфицирование, например вирусами, бактериями, прионами, паразитами, простейшими, а также в ответ на болезнь, например на рак, аутоиммунное заболевание, такое как, например, базедова болезнь, рассеянный склероз, а также в ответ на интоксикацию, отравление, заражение, допинг, проглатывание, ингаляцию и инъекцию, например, пестицида, яда, инсектицида, гербицида, аллергенного агента, а также в ответ на имплантацию, например, костного мозга, органа, такого как, например, почка, легкое, печень, конечности, такой как, например, рука, голень, стопа, а также в ответ на имплантацию искусственного органа, имплантируемой камеры, водителя ритма, искусственного сердца, искусственного тазобедренного сустава, и (ii) вторичного вещества, например вещества, способного вызывать продуцирование первичного вещества, например антигена, ответственного за продуцирование указанных выше антител.
Раствор по настоящему изобретению может содержать вторичное вещество, способное вызывать продуцирование первичного вещества, подлежащего детекции.
Вторичное вещество предпочтительно может быть закреплено на поверхности вмещающего сосуда, причем закрепление вторичного вещества позволяет предпочтительно детектировать взаимодействие
между первичным и вторичным веществами независимо от их концентрации, например между антителами и антигенами даже в случае, когда они содержатся в малом количестве.
Способ по изобретению может включать также использование (iii) третичного вещества.
Оно может представлять собой, например, определенное выше вещество, например антитела, способные распознавать по меньшей мере одно из первичных и/или вторичных веществ. Оно может представлять собой, например, идиотипические антитела, например антитела, специфически распознающие антитела, продуцируемые человеком или животным, например антикроличьи антитела, антикозьи антитела, антитела анти-IgG или анти-IgM, или анти-IgA, или анти-IgE.
Согласно настоящему изобретению третичное вещество может быть предварительно закреплено на поверхности вмещающего сосуда для обеспечения, например, детекции взаимодействия третичного вещества с первичным и/или вторичным веществом.
Согласно настоящему изобретению третичное вещество предпочтительно представляет собой идио-типическое антитело, т.е. антитело анти-антитела, которое может взаимодействовать, например, с антителом, продуцируемым человеком или животным в ответ на антиген и/или антиген, имеющийся или имевшийся в организме человека или животного, как указано выше.
Таким образом, настоящее изобретение предпочтительно позволяет косвенно детектировать вещество, например вещество, имеющееся или имевшееся в организме человека или животного без необходимости обнаружения антитела, специфически взаимодействующего с этим веществом.
Таким образом, настоящее изобретение предпочтительно позволяет прямо или косвенно детектировать присутствие антител, продуцируемых в ответ на инфицирование, болезнь, интоксикацию, отравление, заражение, допинг, проглатывание, пестицид, имплантат. Кроме того, настоящее изобретение позволяет также детектировать бессимптомные инфекции, т.е., например, инфекции, не детектируемые общими микробиологическими средствами, например гемокультивированием, культивированием биопсий-ных материалов, отбираемых физиологических жидкостей, увлажняющих или орошающих предполагаемую зону инфекции, например спинномозговой жидкости, мочи, слюны, детектируя, например, с использованием идиотипических антител, взаимодействующих с антителами, специфически направленными против этих инфекций.
Другие преимущества могут быть очевидны специалистам в данной области техники при прочтении приведенных ниже примеров, поясненных фигурами, представленными в порядке иллюстрации.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлены фотографии пятен, полученных с веществами, обладающими аффинностью с антителами (swH) или не проявляющими (swE) аффинность между собой. Фотография 1А была получена после намагничивания в течение 20 с, и фотография 1В - после намагничивания в течение 5 мин;
на фиг. 2 - фотографии пятен, полученных с веществами, обладающими аффинностью с антиантителами, определяющими группы крови и эритроцитов;
на фиг. 3 - изображения пятен, полученных с веществами, обладающими аффинностью с антиантителами, определяющими группы крови и эритроцитов.
Примеры
Пример 1. Детекция взаимодействия антител, обладающих или не обладающих аффинностью между собой.
В данном примере использовали две 8-луночные панели с плоскими днищами (каталожный номер MSW002B, BioFilm Control, Франция), обозначенные соответственно swH и swE. В каждую из лунок каждой из панелей вносили по 70 мкл раствора антитела, полученного смешиванием 15 мкл соответственно антитела анти-IgG человека (каталожный номер BI2018, Paris Anticorps, Франция) или антитела анти-E.coli (каталожный номер ВР2298, Acris Antibodies, Германия) с 1,5 мл буферного раствора PBS (8 г/л NaCl (Sigma Aldrich, США), 200 мг/л KCl (Sigma Aldrich, США)), 1,44 г/л Na2HPC> 4 (Sigma Aldrich, США), 240 мг/л KH2PO4 (Sigma Aldrich, США)) перед помещением на 16 ч в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C.
Получали растворы, соответственно обозначенные SIgO, SIgH и SIgE и содержавшие 200 мкл реактива для исследования антиэритроцитарных антител человека анти-FY1 (IJB-IH Controle 3, каталожный номер 108030357, Institut Jacques Boy, Франция), 2 мкл парамагнитных микрошариков (Ton004N, Biofilm Control, Франция) и 15 мкл воды для инъекций или 200 мкл антитела анти-IgG человека (каталожный номер BI2018, Paris Anticorps, Франция), или 200 мкл антитела анти-E.coli (каталожный номер ВР2298, Acris Antibodies GmbH, Германия).
Далее из панелей swH и swE удаляли растворы антитела и трижды в каждую из лунок вносили и затем удаляли по 150 мкл буферного раствора PBS.
В лунки D, E и F панелей swH и swE вносили соответственно по 100 мкл SIgO, SIgH и SIgE. Затем панели помещали на 5 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C, и далее помещали на 20 с в испытательный магнитный блок (BKT-MSW002 BioFilm Control, Франция). Затем панели помещали на сканер для копирования документов (модель V-750 PRO, Epson, США), на котором осуществляли первую фиксацию изображения посредством программы Epson-Scan (Epson, США). Цикл "намагничивание/фиксация изображения" осуществляли второй раз с целью
получения также второго изображения после совокупного намагничивания в течение 5 мин. Конечные изображения получали, вычитая зеленую компоненту изображений из красной компоненты цветных изображений, полученных на сканере, с использованием программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov.ij), и вырезая изображения, полученные с различной настройкой контрастности. Соответствующие фотографии представлены изображениями на фиг. 1.
Были получены кольца различных диаметров, соответствовавшие скоплению шариков на дне лунок в ходе их миграции в магнитном поле. Диаметр кольца рассматривают в качестве меры согласно закону уменьшения магнитной подвижности шариков.
Как и ожидалось, диаметр кольца, наблюдаемого в случае реакции по аффинности, ожидаемой между иммуноглобулинами, содержащимися в реактиве для исследования антиэритроцитарных антител, и антителами анти-Ig человека (панель swH, лунка Е), имеет значительно больший размер, чем в случае отсутствия реакции по аффинности между иммуноглобулинами, содержащимися в реактиве для исследования анти-эритроцитарных антител, и антителами анти-E.coli (панель swH, лунки D и F) после намагничивания в течение 20 с и в лунках E после намагничивания в течение 5 мин (панели swH и swE, лунки E).
Как можно видеть на фиг. 1, лунки Е, этот эффект усиливается в случае, когда оба вещества, обладающие аффинностью, одновременно содержатся в растворе и адсорбированы в лунках, что сильно уменьшает миграцию шариков (панель swH, лунка Е) по сравнению с ситуацией, показанной на фиг. 1, панель swH, лунка D, когда одно из веществ не содержится в растворе, а только адсорбировано на поверхности.
Кроме того, в случае, когда оба вещества, обладающие аффинностью, а именно антитела, содержатся в растворе, и, если одно из веществ уже адсорбировано на поверхности, явление уменьшения подвижности шариков еще более усиливается (лунки Е, панель swH по сравнению с swE).
Наконец, в случае, когда вещество, обладающее аффинностью, не адсорбировано на поверхности, осуществление реакции по аффинности в растворе детектируется по наблюдению диаметра образованного кольца (панель SwE, лунка E по сравнению с лунками D и F).
Пример 2. Детекция взаимодействия между анти-антителами, определяющими группы крови и эритроцитов.
В данном примере использовали три 8-луночные панели формата SBS с плоскими днищами (каталожный номер MSW002B, BioFilm Control, Франция), обозначенные swA, swB и swAB соответственно. В каждую из лунок панелей вносили по 70 мкл раствора антитела соответственно анти-А (каталожный номер 102010153, Institut Jacques Boy, Франция), анти-В (102010253, Institut Jacques Boy, France) и анти-АВ (каталожный номер 102010353, Institut Jacques Boy, Франция).
Панели помещали на 10 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C.
Получали суспензии образцов крови, обозначенные соответственно hA, hB, hAB и h0, смешивая 1 мл буферного раствора TS, содержавшего 8 г/л NaCl (Sigma-Aldrich, США) и 1 г/л триптона (Difco, США), со 100 мкл эритроцитов соответственно типов А, В, АВ и 0 (IJB-IH Controle 2, каталожный номер 108020257, Institut Jacques Boy, Франция), 6 мкл парамагнитных микрошариков (Ton005N, Biofilm Control, Франция) и 1 мкл синего пищевого красителя (Vahine, Франция).
Растворы антител удаляли из лунок перед внесением 70 мкл препаратов соответственно hA, hB, hC и h0 в лунки А и В, затем С и D, затем E и F, затем G и Н панелей swA, swB и swAB.
Панели помещали на 10 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C, и затем помещали на 1 мин в испытательный магнитный блок (BKT-MSW002 Bio-Film Control, Франция). Затем панели помещали на сканер для копирования документов (модель V-750 PRO, Epson, США), на котором осуществляли фиксацию изображения посредством программы Epson-Scan (Epson, США). Конечное изображение получали аналогично примеру 1, см. фиг. 2.
Как показано на фиг. 2, в лунках С, D, G и Н панели SwA, в лунках А, В, G и Н панели SwB и в лунках G и Н панели SwAB было отмечено образование темного диска диаметром приблизительно 2+/-1 мм, которое приписывали отсутствию реакции по аффинности между антителами, связанными с лунками, и эритроцитами. В других лунках какого-либо темного образования не было видно, что свидетельствовало о реакции по аффинности между антителами, связанными с лунками, и эритроцитами. Наблюдения обобщены в приведенной ниже табл. 1, в которой отсутствие диска обозначено знаком и наличие диска обозначено знаком "+".
стоящему изобретению позволяет определить серологический тип пробы крови.
Пример 3. Детекция взаимодействия между анти-антителами, определяющими антиэритроцитарные антитела.
В данном примере использовали две 8-луночные панели с плоскими днищами (каталожный номер MSW002B, BioFilm Control, Франция), обозначенные swD и swK. В каждую из лунок панелей вносили по 50 мкл раствора, полученного смешиванием 15 мкл антитела анти-IgG человека (каталожный номер BI2018, Paris Anticorps, Франция) с 1,5 мл буферного раствора TS (8 г/л NaCl (Sigma Aldrich, США), 1 г/л триптона (Difco, США)). Затем панели инкубировали в течение 16 ч в термостате (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированном при 37°C.
Далее получали растворы, обозначенные соответственно Sp и St и содержавшие 150 мкл соответственно буферного раствора PBS и TS и 0,75 мкл Ton005N. Эти растворы соответствовали растворам-свидетелям, не содержавшим эритроциты.
Также получали суспензии, обозначенные соответственно Si, Sii и Siii и содержавшие 150 мкл суспензии эритроцитов типов I, II и III (каталожный номер ID-DiaCell I-II-III, Diamed, Франция) и 0,75 мкл парамагнитных микрошариков (Ton005N, Biofilm Control, Франция).
Антигены, содержавшиеся на поверхности эритроцитов, были проверены поставщиком и распределялись согласно табл. 2, приведенной далее.
Таблица 2
Суспензии
Эритроциты
Duffy
KEL
Эритроциты типа I
Sii
Эритроциты типа II
Siii
Эритроциты типа III
+: антиген присутствует; 0: антиген отсутствует.
Также получали суспензии, обозначенные соответственно SDi и SKi, SDii и Skii, а также SDiii и Skiii и содержавшие 100 мкл суспензии эритроцитов соответственно типов I, II и III (каталожный номер ID-DiaCell I-II-III, Diamed, Франция), 50 мкл сыворотки соответственно анти-FY! (или анти-Duffy) и ан-ти-КБЫ (IJB-IH Controle 3, каталожный номер 108030357, Institut Jacques Boy, Франция) и 0,75 мкл парамагнитных микрошариков (Ton005N, Biofilm Control, Франция) (см. табл. 3). Эти суспензии представляют собой отрицательные контрольные образцы, содержащие эритроциты, сайты аффинности которых блокированы антителами, содержащимися в сыворотке, так что комплексы "эритроциты-антитела" больше не представляют собой свободные сайты аффинности, которые могут связываться с антителами, закрепленными на дне лунок.
Таблица 3
Эритроциты
Сыворотка
SDi
I (D)
анти-FYl (анти-D)
SKi
I (D)
анти-KELl (анти-К)
SDii
II (D)
анти-FYl (анти-D)
SKii
II (D)
анти-KELl (анти-К)
SDiii
III (K)
анти-FYl (анти-D)
SKiii
III (K)
анти-KELl (анти-К)
Далее из панелей swD и swK удаляли раствор антитела анти-IgG и дважды вносили и затем удаляли по 150 мкл буферного раствора TS. В каждую из лунок панелей swD и swK вносили соответственно по 50 мкл реактива для исследования антиэритроцитарных антител, соответственно анти-FY! (или анти-Duffy) и анти-КБЫ (IJB-IH Controle 3, каталожный номер 108030357, Institut Jacques Boy, Франция). Затем панели помещали на 10 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C.
Далее из панелей swD и swK удаляли реактив для исследования антиэритроцитарных антител и дважды вносили и затем удаляли по 150 мкл буферного раствора TS.
Вносили по 70 мкл разных суспензий соответственно указаний табл. 4, приведенной далее.
Затем панели помещали на 20 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C, и далее помещали на 30 с в испытательный магнитный блок (BKT-MSW002 BioFilm Control, Франция). Затем панели помещали на сканер для копирования документов (модель V-750 PRO, Epson, США), на котором осуществляли фиксацию изображения посредством программы Ep-sonScan (Epson, США). Это изображение использовали для анализа панели swK. Цикл "намагничивание/фиксация изображения" осуществляли второй раз с целью получения также после совокупного намагничивания в течение одной минуты изображения, используемого для анализа панели swD. Конечные изображения, полученные аналогично примеру 1, представлены на фиг. 3.
На фиг. 3 показано, что в контрольных лунках D и E видно хорошо сформированное кольцо, свиде
тельствующее о значительной подвижности парамагнитных шариков; подобное кольцо получено в лунках F, G и Н, что свидетельствует о сохранении значительной подвижности в присутствии эритроцитов, сайты аффинности которых блокированы антителами, содержащимися в сыворотке. В лунках А, В и С можно установить наличие
или кольца, сравнимого с кольцами в лунках F, G и Н, что свидетельствует о значительной подвижности, объясняемой отсутствием связывания по аффинности между эритроцитами и антителами, связанными с днищами лунок;
или размытого пятна, свидетельствующего о пониженной подвижности парамагнитных шариков, объясняемой реакцией по аффинности между антителами, связанными с лунками, и эритроцитами. Размещение видимых колец и пятен описано в табл. 5, приведенной ниже.
Таблица 5. Полученные изображения
swD
swK
Таким образом, способ по настоящему изобретению позволяет детектировать молекулярное взаимодействие между двумя веществами.
Пример 4. Детекция взаимодействия между антибактериальными антителами, содержащимися в сыворотке, и веществами, полученными из культур бактерий.
В данном примере использовали две 8-луночные панели с плоскими днищами (каталожный номер MSW002B, BioFilm Control, Франция), обозначенные соответственно swH и swE. В каждую из лунок каждой из панелей вносили по 70 мкл раствора антитела, полученного смешиванием 15 мкл соответственно антитела анти-IgG человека (каталожный номер BI2018, Paris Anticorps, Франция) или антитела анти-E.coli (каталожный номер ВР2298, Acris Antibodies, Германия) с 1,5 мл буферного раствора PBS (8 г/л NaCl (Sigma Aldrich, США), 200 мг/л KCl (Sigma Aldrich, США)), 1,44 г/л Na2HPO4 (Sigma Aldrich, США), 240 мг/л KH2PO4 (Sigma Aldrich, США)) перед помещением на 16 ч в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C (см. табл. 6).
Таблица 6
swH
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
чело-
чело-
чело-
чело-
чело-
чело-
чело-
чело-
века
века
века
века
века
века
века
века
swE
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
анти-
coli
coli
coli
coli
coli
coli
coli
coli
Далее из панелей swH и swE удаляли раствор IgG и дважды вносили и затем удаляли по 150 мкл буферного раствора TS. В каждую из лунок А, В, С, D и Е, F, G, Н панелей swH и swE вносили по 150 мкл сыворотки человека, полученной соответственно от людей, больных стафилококковой инфекцией (сыворотка Staph +), и людей, не зараженных этой инфекцией (сыворотка Staph -) (см. табл. 7). Затем панели помещали на 10 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C.
В лунки панелей вносили по 50 мкл реактива для детекции стафилококковой инфекции, содержавшего вещества, полученные из стафилококковых культур, и парамагнитные микрошарики (каталожный номер RDS-01R, BioFilm Control, Франция).
Затем панели помещали на 20 мин в термостат (каталожный номер ВС240, Firelabo, Франция), стабилизированный при 37°C, и далее помещали на 10 с в испытательный магнитный блок (BKT-MSW002 BioFilm Control, Франция). Затем панели помещали на сканер для копирования документов (модель V-750 PRO, Epson, США), на котором осуществляли фиксацию изображения посредством программы Ep-sonScan (Epson, США). Цикл "намагничивание/фиксация изображения" осуществляли второй раз с целью получения также изображения после совокупного намагничивания в течение 5 мин. Конечные изображения получали аналогично примеру 1.
Диаметр кольца, наблюдаемого в случае реакции по аффинности, ожидаемой между иммуноглобулинами, содержащимися в сыворотке инфицированного пациента, и веществами, содержащимися в реактиве для детекции стафилококка (лунки А, В, С и D), имеет значительно больший размер, чем в случае отсутствия реакции по аффинности в сыворотке неинфицированных пациентов (лунки Е, F, G и Н).
Список литературы
1. US 3635678 CLOT-TIMING SYSTEM AND METHOD, Seitz, L.J. and Bowen, J.G.
2. WO 01/8 6255, METHOD AND APPARATUS FOR DETERMINING LOCAL VISCOELASTICITY, Cronin-Golomb, M. Shabtai, Y. Nemet, B.
3. EP 1544596, Methode et appareil de determination de la viscosite, Kurowski D.; Schoen С.; Peters R.; Bartos H.; Yu Y.
4. Catterall W.A. (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 521-55.
5. Gerald Karp, Biologie cellulaire et moleculaire, Concepts et experiences, 2nd edition 2004.
6. Dick G.M. and Tune J.D., Role of potassium channels in coronary vasodilation, Exp. Biol. Med. (Maywood). 2010 Jan; 235(1) : 10-22 .
7. Mostallino M.C. et al. Plasticity and function of extrasynaptic GABA(A) receptors during pregnancy and after delivery, Psychoneuroendocrinology. 2009 Dec; 34 Suppl. 1: S74-83 .
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ детекции взаимодействий в растворе, включающий следующие стадии:
a) введение в раствор по меньшей мере одного первичного вещества, выбранного из группы, состоящей из эукариотических клеткок, прокариотических клеток, мембран, вирусов, прионов, митохондрий, хлоропластов, везикул, липосом, клеточных компонентов, жгутиконосцов, белков, липопротеинов, гликопротеинов, антител, нуклеиновых кислот, липидных комплексов, коллоидов, макромолекул, микрочастиц, наночастиц, антигенов, гормонов, лигандов белков и химических соединений, и по меньшей мере одного вторичного вещества, представляющего собой любое определенное выше вещество, способного взаимодействовать с первичным веществом;
b) введение в раствор, полученный на стадии a), по меньшей мере двух частиц, выбранных из группы, состоящей из электрически заряженных частиц, магнитных частиц, частиц, покрытых по меньшей мере одним магнитным слоем, намагничиваемых частиц, частиц, покрытых намагничиваемым слоем, электрических, электромагнитных, электризуемых, несущих электрический заряд частиц, где частицы находятся на поверхности, погруженной в раствор;
c) определение взаимодействия указанных веществ приложением электрического, магнитного или электромагнитного поля, предназначенного для приведения в движение указанных частиц, причем взаимодействие между веществами детектируется тогда, когда подвижность частиц на поверхности изменяется.
2. Способ по п.1, в котором по меньшей мере две магнитные или намагничиваемые частицы независимо выбраны из электрически заряженных, магнитных или намагничиваемых, или покрытых по меньшей мере одним магнитным или намагничиваемым слоем частиц.
3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором по меньшей мере две частицы подвергают действию электромагнитного поля, прилагаемого в импульсном режиме.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой ускорение движения частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.
5. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой замедление движения частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.
6. Способ по любому из пп.1-3, в котором изменение подвижности представляет собой изменение траектории частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.
7. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по группированию частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.
8. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по отсутствию группирования частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.
9. Способ по любому из пп.1-3, в котором взаимодействие детектируют по рассеянию частиц под действием электрического, магнитного или электромагнитного поля.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором по меньшей мере две частицы освещают посредством источника света для детекции их движения.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором по меньшей мере две частицы представляют собой частицы, генерирующие сигнал.
10.
12. Способ по любому из пп.1-11, в котором первичное вещество выбрано из группы, состоящей из эукариотических клеток, прокариотических клеток, мембран, вирусов, белков, антител, антигенов, химических соединений.
13. Способ по любому из пп.1-11, в котором вторичное вещество выбрано из группы, состоящей из эукариотических клеток, прокариотических клеток, мембран, вирусов, белков, антител, антигенов, химических соединений.
14. Способ по любому из пп.1-13, в котором способ включает вместо стадии a)
предварительную стадию a') закрепления первичного вещества на поверхности вмещающего сосуда;
стадию a") введения раствора во вмещающий сосуд;
стадию a''') введения по меньшей мере одного вторичного вещества, способного взаимодействовать с первичным веществом.
SwA SwB _
SwAB _
Лунки:
* #
А В С D
Фиг. 2
i 5:Шрй
& О о
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028391
- 1 -
028391
- 1 -
028391
- 4 -
028391
- 5 -
028391
- 6 -
028391
- 17 -
028391
- 17 -