|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Противомикробная композиция, включающая по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, в которой по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus СНСС12697 DSM24616 и Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 DSM24652. 2. Противомикробная композиция по п.1, в которой штамм Lactobacillus paracasei представляет собой Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651. 3. Применение противомикробной композиции по любому из предшествующих пунктов для получения пищевого продукта. 4. Пищевой продукт, включающий противомикробную композицию по п.1 или 2. 5. Пищевой продукт по п.4, который выбран из группы, состоящей из фруктов и продуктов, получаемых из фруктов, овощей и продуктов, получаемых из овощей, зерна и продуктов, получаемых из зерна, молочных продуктов, мяса, домашней птицы и морских продуктов и их смесей. 6. Способ получения пищевого продукта, включающий добавление противомикробной композиции по п.1 или 2 на любой стадии осуществления данного способа. 7. Способ по п.6, в котором противомикробную композицию по п.1 или 2 добавляют таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляла по меньшей мере 1 ×10 6 Кое/г, или по меньшей мере 1 ×10 6 Кое/мл пищевого продукта, или по меньшей мере 1 ×10 5 Кое/см 2 поверхности пищевого продукта. 8. Способ по п.6 или 7, в котором способ включает одну или более стадий ферментации. 9. Штамм Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 DSM24652, используемый для получения противомикробной композиции.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Противомикробная композиция, включающая по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, в которой по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus СНСС12697 DSM24616 и Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 DSM24652. 2. Противомикробная композиция по п.1, в которой штамм Lactobacillus paracasei представляет собой Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651. 3. Применение противомикробной композиции по любому из предшествующих пунктов для получения пищевого продукта. 4. Пищевой продукт, включающий противомикробную композицию по п.1 или 2. 5. Пищевой продукт по п.4, который выбран из группы, состоящей из фруктов и продуктов, получаемых из фруктов, овощей и продуктов, получаемых из овощей, зерна и продуктов, получаемых из зерна, молочных продуктов, мяса, домашней птицы и морских продуктов и их смесей. 6. Способ получения пищевого продукта, включающий добавление противомикробной композиции по п.1 или 2 на любой стадии осуществления данного способа. 7. Способ по п.6, в котором противомикробную композицию по п.1 или 2 добавляют таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляла по меньшей мере 1 ×10 6 Кое/г, или по меньшей мере 1 ×10 6 Кое/мл пищевого продукта, или по меньшей мере 1 ×10 5 Кое/см 2 поверхности пищевого продукта. 8. Способ по п.6 или 7, в котором способ включает одну или более стадий ферментации. 9. Штамм Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 DSM24652, используемый для получения противомикробной композиции.
Евразийское ои 028377 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201391500
(22) Дата подачи заявки 2012.04.09
(51) Int. Cl. A01N63/00 (2006.01) A01P1/00 (2006.01) A01P3/00 (2006.01)
(54) ПРОТИВОМИКРОБНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
(31) 11161609.0
(32) 2011.04.08
(33) EP
(43) 2014.02.28
(86) PCT/EP2012/056384
(87) WO 2012/136830 2012.10.11
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КР. ХАНСЕН А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Хорнбек Тина, Лисберг Майке, Диемер Силья Кей (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A2-2009098411 US-A1-2008107699 EP-A1-0852114
(57) Настоящее изобретение относится к области биозащиты, в частности к противомикробной композиции, включающей штамм Lactobacillus rhamnosus и/или штамм Lactobacillus paracasei. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению такой противомикробной композиции, пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов, включающих такую противомикробную композицию, способу получения такого пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов и способу снижения содержания нежелательных микроорганизмов в таком пищевом продукте, корме и фармацевтических продуктах.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области биозащиты, в частности к противомикробной композиции, включающей штамм Lactobacillus rhamnosus и/или штамм Lactobacillus paracasei. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению такой противомикробной композиции, пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов, включающих такую противомикробную композицию, способу получения такого пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов и способу снижения содержания нежелательных микроорганизмов в таком пищевом продукте, корме и фармацевтических продуктах.
Предшествующий уровень техники
Биозащитные культуры применяют в качестве альтернативы химическим консервантам в различных пищевых продуктах. В молочных продуктах контаминация дрожжами и плесневыми грибами может ограничивать продолжительность хранения молочных продуктов. Продукты, в которых встречается значительная проблема контаминации дрожжами и плесневыми грибами, включают свежие сыры.
Для преодоления этих проблем в молочной промышленности разработаны биозащитные растворы. Некоторыми из самых известных и, вероятно, наиболее применяемых противогрибковых биозащитных растворов на рынке являются культуры HOLDBAC(tm) YM-b и HOLDBAC(tm) YM-C от компании Danisco, которые содержат комбинации подвидов Propionibacteria и Lactobacillus.
Применение пропионовокислых бактерий вместе с молочнокислыми бактериями для ингибирова-ния роста микроорганизмов описано в патентных заявках США 2005/00 95318 и WO 2004/041305.
Считается, что виды propionibacteria способствуют противогрибковому действию, главным образом, посредством образования пропионовой кислоты, а также и посредством образования уксусной кислоты и других метаболитов.
Однако эти виды являются довольно дорогостоящими в промышленном масштабе, и получение пропионовой кислоты может вызывать нежелательные органолептические свойства у полученных молочных продуктов.
Другие противогрибковые биозащитные растворы на рынке молочных продуктов включают Lyofast LPRA от SACCO, а также Aroma-Prox(r)RP80 от BIOPROX. Оба из этих продуктов включают комбинации Lactobacillus plantarum и Lactobacillus rhamnosus.
Tharmaraj и Shah (2009) описывают скрининг кандидатов биозащитных молочнокислых бактерий для cheese-based dips. Все штаммы Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus paracasei, тестированные по отдельности, проявили максимальное ингибирующее действие против дрожжей и плесневых грибов. Однако никакие комбинации Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus paracasei не исследовали.
Таким образом, существует промышленная потребность в разработке улучшенных биозащитных растворов, которые не включают виды propionibacteria без угрозы снижения противогрибковой эффективности.
Сущность настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения идентифицировали новые штаммы молочнокислых бактерий, которые эффективны в ингибировании роста бактериальных и грибковых микроорганизмов, которые, как известно, встречаются в виде контаминант в молоке и молочных продуктах. Авторы настоящего изобретения дополнительно обнаружили, что определенная группа молочнокислых бактерий при объединении с другой группой молочнокислых бактерий демонстрирует значительный синергический противомик-робный эффект. Противомикробный эффект двух объединенных групп бактерий, к удивлению, больше суммы индивидуальных эффектов двух групп бактерий.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к противомикробной композиции, включающей по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei. В предпочтительном варианте осуществления указанная противомикробная композиция включает:
(a) по меньшей мере один штамм Lactobacillus, выбранный из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 и Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 и их мутантов, и
(b) по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, выбранный из группы, состоящей из Lac-tobacillus paracasei СНСС12777 и его мутантного штамма. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение описывает противомикробную композицию, которая включает по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus штамм СНСС12697, Lactobacillus rhamnosus штамм СНСС14226, Lactobacillus paracasei штамм СНСС12777 и их мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
Композиции по настоящему изобретению обеспечивают преимущество в том, что может быть ин-гибирован рост нежелательных микроорганизмов, выбранных из грибов, бактерий и их смесей, например, на пищевом продукте, корме и фармацевтических продуктах и у людей, и у животных. В частности, предусматривается предотвращение и/или ингибирование роста грибов, таких как дрожжи и плесневые грибы. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления термин "противомикробный" необходимо
понимать как "противогрибковый".
Поэтому второй аспект настоящего изобретения направлен на применение одной из противомик-робных композиций первого аспекта для получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.
Третий аспект относится к применению одной из противомикробных композиций первого аспекта для ингибирования роста нежелательных микроорганизмов, выбранных из группы, состоящей из грибов, бактерий и их смесей. В частности, композиции по настоящему изобретению необходимо применять для ингибирования и/или предотвращения роста грибов и бактерий, которые являются традиционно известными контаминантами в процессах молочной промышленности, таких как процессы ферментации молока.
Четвертый аспект относится к применению одной из противомикробных композиций первого аспекта в качестве фармацевтического продукта. Фармацевтический продукт является предпочтительным для применения при лечении заражения объекта бактериями или грибами, более предпочтительно плесневыми грибами.
Пятый аспект относится к пищевому продукту, корму или фармацевтическому продукту, включающему одну из противомикробных композиций согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта согласно пятому аспекту настоящего изобретения, способу, включающему добавление одной из противомикробных композиций согласно первому аспекту настоящего изобретения во время получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта. Там, где способ включает добавление противомикробной композиции, которая включает штамм Lactobacillus rham-nosus в комбинации со штаммом Lactobacillus paracasei, указанную композицию добавляют таким образом, чтобы каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляла по меньшей мере 1х106 Кое/г, предпочтительно 5х106 Кое/г, или каждая составляла по меньшей мере 1х106 Кое/мл, предпочтительно 5х106 Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта, или каждая составляла по меньшей мере 1х105 Кое/см2, предпочтительно 1х107 Кое/см2 поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта, и производственные параметры контролируют во время получения таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei увеличивалась или оставалась постоянной.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к Lactobacillus rhamnosus штамм CHCC12697, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24616, или его мутантному штамму, где мутантный штамм получен с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к Lactobacillus rhamnosus штамм СНСС14226, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24652, или его мутантному штамму, где мутантный штамм получен с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
В девятом аспекте настоящее изобретение относится к Lactobacillus paracasei штамм СНСС12777, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24651, или его мутантному штамму, где мутантный штамм получен с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает рост дрожжей и плесневых грибов в чашках с молоком, ферментированным только с одной стартовой культурой (контроль, первый столбец), вместе с Lb. rhamnosus CHCC12697 (второй столбец), вместе с Lb. paracasei CHCC12777 (третий столбец) или вместе с комбинацией Lb. rhamnosus CHCC12697 и Lb. paracasei СНСС12777 (четвертый столбец). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте слева направо: K. marxianus, P. fermentans, Y. lipolytica и С. sake, соответственно в верхнем ряду чашек. На втором ряду чашек сверху добавляли P. nalgiovense, виды Cladiosporium добавляли ниже слева и P. commune добавляли ниже справа. В последнем ряду чашек добавляли только виды Mucor. Чашки инкубировали при 7±1°C в течение 17 дней.
Фиг. 2 показавает подсчет количества клеток в изоляте Yarrowia lipolytica, добавленном к цельному молоку, инокулированному стартовой культурой CHN-19 в отдельности (залитый ромб) или вместе со следующими штаммами: HOLDBAC(tm) YM-B (незалитый квадрат), HOLDBAC(tm) YM-C (залитый ромб), Lb. paracasei CHCC12777 (залитый квадрат), Lb. rhamnosus CHCC12697 (залитый треугольник) или комбинация Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 (залитый круг), все из которых добавляли перед ферментацией при 29±1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,65+0,05.
Фиг. 3 показывает рост дрожжей и плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным со стартовой культурой в отдельности (контроль, первый столбец), вместе с Lb. rhamnosus СНСС14226 (второй столбец), вместе с Lb. paracasei CHCC12777 (третий столбец) или вместе с комбинацией Lb. rhamnosus СНСС14226 и Lb. paracasei CHCC12777 (четвертый столбец). Целевые контаминанты добав
ляли в концентрациях, указанных в тексте слева направо: K. marxianus, P. fermentans, Y. lipolytica и С. sake, соответственно в верхнем ряду чашек. В нижнем ряду чашек сверху добавляли P. nalgiovense, виды Cladiosporium добавляли ниже слева и P. commune добавляли ниже справа. Чашки инкубировали при 7+1°C в течение 15 дней.
Фиг. 4 показывает подсчет количества клеток в изоляте Klyveromyces marxianus, добавленном к цельному молоку, инокулированному стартовой культурой CHN-19 в отдельности (залитый ромб) или вместе со следующими штаммами: HOLDBAC(tm) YM-B (незалитый квадрат), HOLDBAC(tm) YM-C (залитый ромб), Lb. paracasei CHCC12777 (залитый квадрат), Lb. rhamnosus CHCC14226 (залитый треугольник) или комбинация Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 (залитый круг), все из которых добавляли перед ферментацией при 29+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,65+0,05.
Фиг. 5 показывает рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным со стартовой культурой в отдельности (контроль, первое изображение), вместе с Lb. paracasei СНСС14676 (второе изображение), вместе с Lb. rhamnosus CHCC5366 (третье изображение) или вместе с комбинацией Lb. paracasei СНСС14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 (четвертое изображение). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте с верхнего левого угла до нижнего правого угла: Penicil-lium nalgiovese, Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum соответственно. Чашки инкубировали при 7+1°C в течение 12 дней.
Фиг. 6 показывает рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным только со стартовой культурой (контроль, первое изображение) в отдельности, вместе с Lb. paracasei CHCC14676 (второе изображение), вместе с Lb. rhamnosus CHCC14226 (третье изображение) или вместе с комбинацией Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC14226 (четвертое изображение). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте с верхнего левого угла до нижнего правого угла: Penicil-lium nalgiovese, Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum соответственно. Чашки инкубировали при 7+1°C в течение 12 дней.
Фиг. 7 показывает рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным только со стартовой культурой (контроль, первое изображение) в отдельности, вместе с Lb. paracasei CHCC12777 (второе изображение), вместе с Lb. rhamnosus CHCC14226 (третье изображение) или вместе с комбинацией Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 (четвертое изображение). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте с верхнего левого угла до нижнего правого угла: Penicil-lium nalgiovese, Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum соответственно. Чашки инкубировали при 7+1°C в течение 12 дней.
Фиг. 8 показывает результаты исследования на сметане с участием Lactobacillus paracasei CHCC12777. Продемонстрировано, что P. commune (M6), A. versicolor (М7), P. Brevicompactum (M1), P. crustosum (M10) и Р. glabrum (M8) растут хорошо на сметане, полученной из молока, ферментированного только со стартовой культурой (верхний ряд) или со стартовой культурой и культурой HOLDBAC(tm) YM-B (средний ряд). Напротив, в присутствии Lactobacillus paracasei CHCC12777 при ферментации молока (нижний ряд) ингибировался рост всех тестированных плесневых грибов.
Фиг. 9 показывает исследование на твороге с участием Lactobacillus rhamnosus CHCC12697. Продемонстрировано, что виды Mucor хорошо растут на твороге, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой CHN-19 (Контроль). Плесневые грибы также хорошо растут на твороге, полученном из молока, ферментированного со стартовой культурой и культурой HOLDBAC(tm) YM-B, и в меньшей степени на твороге, полученном из молока, ферментированного со стартовой культурой и культурой HOLDBAC(tm) YM-C. Однако в присутствии штамма CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus при ферментации молока наблюдается значительно более заметное ингибирование роста видов Mucor.
Фиг. 10 показывает исследование на йогурте с участием Lactobacillus rhamnosus CHCC14226. P. brevicompactum (M1), P. commune (M6), A. versicolor (M7) и P. crustosum (M10) растут хорошо на йогурте, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой YF-L901 (верхний ряд) или со стартовой культурой и культурой HOLDBAC(tm) YM-B (средний ряд). Напротив, в присутствии Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 при ферментации молока (нижний ряд) ингибировался рост всех тестированных плесневых грибов.
Фиг. 11 показывает количественное определение ингибирующего действия Lactobacillus paracasei CHCC12777 и Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 в отношении K. lactis в твороге. Продемонстрировано, что рост K. lactis ингибировался в присутствии штамма СНСС12777 Lactobacillus paracasei, и в присутствии штамма CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus при инокулировании вместе со стартовой культурой CHN-19 перед ферментацией. Оба штамма, штамм СНСС12777 Lactobacillus paracasei и штамм СНСС12697 Lactobacillus rhamnosus, вызывали значительно большее ингибирование, чем коммерческая
культура HOLDBAC(tm) YM-B.
Фиг. 12 показывает количественное определение ингибирующего действия Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 в отношении Debaromyces hansenii в йогурте. Рост D. hansenii ингибировался в присутствии штамма СНСС14226 Lactobacillus rhamnosus, при инокулировании вместе со стартовой культурой YF-L901 перед ферментацией. Штамм оказывал значительно большее ингибирующее действие, чем коммер
ческая культура HOLDBAC(tm) YM-B.
Подробное описание настоящего изобретения
Определения
Термин "молочнокислая бактерия" обозначает грамположительную, микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с образованием кислот, включая молочную кислоту в качестве преимущественно образуемой кислоты. В промышленном отношении самые полезные молочнокислые бактерии находятся в отряде "Lactobacillales", который включает виды Lactococcus, виды Streptococcus, виды Lactobacillus, виды Leuconostoc, виды Pseudoleuconostoc, виды Pediococcus, виды Brevibac-terium и виды Enterococcus. Их часто применяют в отдельности в качестве пищевых культур или в комбинации с другими молочнокислыми бактериями.
Молочнокислые бактерии, включая бактерии видов Lactobacillus и Streptococcus thermophilus, обычно поставляются в молочную промышленность или в виде замороженных культур, или в виде сублимированных культур для размножения промышленной закваски, или в качестве так называемых культур "Direct Vat Sat" (DVS), предназначенных для прямой инокуляции в сосуд ферментации или чан для получения молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт или сыр. Такие культуры молочнокислых бактерий в целом называют "стартовые культуры" или "закваски".
Термин "мезофил" в настоящем описании относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при умеренных температурах (15-40°C). В промышленном отношении самые полезные мезофильные бактерии включают виды Lactococcus и виды Leuconostoc. Термин "мезофильная ферментация" в настоящем описании относится к ферментации при температуре между приблизительно 22°C и приблизительно 35°C. Термин "мезофильный ферментированный молочный продукт" относится к ферментированным молочным продуктам, получаемым мезофильной ферментацией мезофильной стартовой культуры, и включает такие ферментированные молочные продукты как пахта, простокваша, сквашенное молоко, сметана, сливки и свежий сыр, такой как кварк, творог и сливочный сыр.
Термин "термофил" в настоящем описании относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при температурах выше 43°C. В промышленном отношении самые полезные термофильные бактерии включают виды Streptococcus и виды Lactobacillus. Термин "термофильная ферментация" в настоящем описании относится к ферментации при температуре выше приблизительно 35°C, такой как от приблизительно 35°C до приблизительно 45°C. Термин "термофильный ферментированный молочный продукт" относится к ферментированным молочным продуктам, получаемым термофильной ферментацией термофильной стартовой культуры, и включает такие ферментированные молочные продукты как неперемешиваемый йогурт, перемешиваемый йогурт и питьевой йогурт.
Термин "молоко" необходимо понимать как молочную секрецию, получаемую путем доения любых млекопитающих, таких как коровы, овцы, козы, буйволы или верблюды. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молоко является коровьим молоком. Термин молоко также включает белковые/жировые растворы, получаемые из растительных материалов, например, соевое молоко.
Термин "молочный субстрат" может обозначать любой сырой и/или переработанный молочный материал, который может быть подвергнут ферментации согласно способу по настоящему изобретению. Таким образом, полезные молочные субстраты включают, но не ограничены ими, растворы/суспензии любых молочных или молокоподобных продуктов, содержащих белок, такие как цельное или обезжиренное молоко, снятое молоко, пахта, восстановленное из сухого молока, сгущенное молоко, сухое молоко, сыворотка, сывороточный пермеат, лактоза, маточный раствор от перекристаллизации лактозы, концентрат сывороточного белка или крем. Очевидно, молочный субстрат может быть получен от любого млекопитающего, например, будучи существенно чистым молоком млекопитающего или восстановленным из сухого молока.
До ферментации молочный субстрат может быть гомогенизирован и пастеризован согласно способам, известным в области техники.
"Гомогенизация", как используется в настоящем описании, обозначает интенсивное смешивание для получения растворимой суспензии или эмульсии. Если гомогенизация выполняется до ферментации, она может быть выполнена так, чтобы разрушить капли молочного жира до меньших размеров так, чтобы он больше не отделялся от молока. Этого можно достичь путем пропускания молока под высоким давлением через небольшие отверстия.
"Пастеризация", как используется в настоящем описании, обозначает обработку молочного субстрата для снижения количества или удаления живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно пастеризация достигается путем поддерживания определенной температуры в течение определенного периода времени. Определенная температура, как правило, достигается путем нагревания. Температуру и продолжительность можно выбирать так, чтобы уничтожить или инактивировать конкретные бактерии, такие как вредоносные бактерии. Затем может следовать стадия быстрого охлаждения.
"Ферментация" в способах по настоящему изобретению обозначает преобразование углеводов в спирты или кислоты под действием микроорганизма. Предпочтительно ферментация по способам настоящего изобретения включает в себя преобразование лактозы в молочную кислоту.
Процессы ферментации, применяемые при получении молочных продуктов, известны, и специалист в области техники знает как выбирать подходящие условия способа, такие как температура, содержание кислорода, количество и характеристики микроорганизма(-ов) и продолжительность. Очевидно, условия ферментации выбирают так, чтобы поддержать достижение настоящего изобретения, т.е. чтобы получить молочный продукт в твердом виде (таком как сыр) или жидком виде (таком как ферментированный молочный продукт).
Термин "нежелательные микроорганизмы" в настоящем описании относится к микроорганизмам, таким как бактерии и грибы, такие как дрожжи, которые являются патогенными и/или могут ухудшать состояние пищевого продукта, корма или фармацевтических продуктов.
Термины "ингибировать" и "быть ингибирующим" в отношении нежелательных микроорганизмов означают, например, что рост или количество или концентрация нежелательных микроорганизмов, например, в продуктах питания и/или на поверхности продуктов питания, включающих противомикробную композицию, меньше, чем в продуктах питания и/или на поверхности продуктов питания, которые не включают такую противомикробную композицию.
В настоящем контексте термин "мутант" следует понимать как штамм, полученный из штамма по настоящему изобретению путем, например, генной инженерии, облучения и/или химической обработкой. Предпочтительно, чтобы мутант являлся функционально эквивалентным мутантом, например, мутантом, который имеет, по существу, те же самые или улучшенные свойства (например, в отношении получения диацетила, вязкости, жесткости геля, покрытия ротовой полости, аромата, постацидификация, скорость ацидификации и/или живучесть бактериофага) как материнский штамм. Такой мутант является частью настоящего изобретения. В частности, термин "мутант" относится к штамму, получаемому путем под-вергания штамма по настоящему изобретению любой традиционно применяемой мутагенной обработке, включая обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (EMS) или №метил-№-нитро-N-нитрогуанидин (NTG), УФ-свет, или к спонтанно возникающему мутанту. Мутант может быть получен в результате нескольких мутагенных обработок (единичную обработку следует считать за одну стадию матагенизации с последующей стадией скрининга/отбора), но сейчас считается предпочтительным, чтобы проводилось не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадии скрининга/отбора). В настоящем, в предпочтительном мутанте менее 5%, или менее 1%, или даже менее 0,1% нуклеотидов в бактериальном геноме сдвинуто другим нуклеотидом или удалено по сравнению с материнским штаммом.
Применение терминов в единственном числе в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте формулы изобретения) необходимо рассматривать как охватывающие и единственное, и множественное число, если не указано иначе в настоящем описании или нет четкого противоречия с контекстом. Термины "включающий", "имеющий" и "содержащий" необходимо рассматривать как обозначающие "включающий", если не указано иначе. Перечисление диапазонов значений в настоящем описании предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуального обращения к каждому отдельному значению, попадающему в диапазон, если не указано иначе в настоящем описании, и каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было индивидуально указано в настоящем описании. Все способы, описанные в настоящем описании, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если не указано иначе в настоящем описании или иначе четко не противоречат контексту. Применение любого и всех примеров или выражения, например, "такой как", предназначено для лучшего освещения настоящего изобретения и не налагает ограничения на объем настоящего изобретения, если не заявлено иначе. Никакие выражения в настоящем описании не должны быть интерпретированы как указание на какой-либо незаявленный элемент, что существенно для практики настоящего изобретения.
Осуществление и аспекты настоящего изобретения
Авторы изобретения провели обширный скрининг и исследование для того, чтобы описать проти-вомикробную композицию, включающую один или смесь двух различных штаммов молочнокислых бактерий, эффективных против нежелательных микроорганизмов, таких как плесневые грибы и дрожжи.
Авторы настоящего изобретения проскринировали 200 кандидатов Lactobacillus plantarum, Lactoba-cillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus для того, чтобы найти самые эффективные одиночные штаммы или комбинации из двух штаммов против широкого диапазона микроорганизмов, таких как дрожжи и плесневые грибы.
Скрининги были выполнены в модельном испытании, имитирующем в максимально возможной степени мезофильные ферментированные молочные продукты в питательных средах на основе молока, к которым добавляли соответствующую стартовую культура с или без биозащитных кандидатов и которые ферментировали в условиях, соответствующих мезофильным ферментированным молочным продуктам. Из мезофильных ферментированных молочных продуктов выделяли целевые организмы. Как очищенные молочнокислые бактерии из культур HOLDBAC(tm) от Danisco A/S, Дания, так и полные культуры HOLDBAC(tm) YM-B и HOLDBAC(tm) YM-C, содержащие и молочнокислые бактерии, и пропионовокис-лые бактерии, применяли в качестве контролей.
Обнаружили, что семнадцать кандидатов среди Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus в целом ингибировали 12 индикаторных грибов также хорошо или лучше, чем молочнокислые бактерии контроля при тестировании при 25°C. Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к противомикробной композиции, включающей по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus или Lactobacillus paracasei.
Девять из идентифицированных штаммов-кандидатов также проявляли активность в том же самом диапазоне как и молочнокислые бактерии контроля при тестировании в условиях охлаждения, и в частности, три штамма оказались очень эффективными: Lactobacillus paracasei CHCC12777 с номером доступа DSM24651, Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 с номером доступа DSM24616 и Lactobacillus rhamno-sus CHCC14226 с номером доступа DSM24652. Эти три штамма были депонированы в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ).
Эти отдельные штаммы оказались лучше или сопоставимыми по действию против различных дрожжей при тестировании в так называемом бутылочном испытании по сравнению с культурами HOLDBAC(tm). Таким образом, эти отдельные штаммы являются в высокой степени подходящими для применения в качестве бактерицидных агентов. Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретение описывает противомикробную композицию, включающую по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из
Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24616,
Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24652,
Lactobacillus paracasei CHCC12777, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24651, и их мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
В частном предпочтительном варианте осуществления противомикробная композиция по настоящему изобретению включает один из вышеуказанных штаммов или его мутант в виде единственного агента, который обнаруживает противомикробную активность.
Кроме трех указанных выше штаммов, настоящее изобретение также относится к мутантам, которые происходят от этих штаммов, т.е. их получают с применением одного из депонированных штаммов СНСС12777, СНСС12697 или СНСС14226 в качестве исходного материала. Мутантный штамм может быть получен из одного из этих штаммов, например, путем генной инженерии, облучения, УФ-света, химической обработки и/или способами, которые вызывают изменения в геноме. Мутант по настоящему изобретению ингибирует и/или предотвращает рост определенных бактерий или грибов, предпочтительно плесневых грибов. Предпочтительно, чтобы мутант обладал существенным по меньшей мере 80% или более, по меньшей мере 90% или более, по меньшей мере 95% или более, или даже вплоть до 100% или более противомикробным действием, например, противогрибковым действием по сравнению со своим материнским штаммом при определении, например, в испытании, как описано в примере 2, с применением одних из дрожжей K. marxianus, P. fermentas, Y. lipolytica или С. sake в качестве контаминанта.
Ингибирующее действие этих штаммов в отношении нежелательных микроорганизмов может быть определено при хранении бутылей при подходящей температуре в течение подходящего времени хранения, как описано в примерах ниже.
В целом, подходящая температура, при которой следует осуществлять этот способ, зависит от температуры, при которой, как правило, конкретный пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт хранят и/или производят. Температуры, при которых обычно хранят бутыли, составляют между 5°C и 26°C, предпочтительно температура составляет приблизительно 8°C.
Продолжительность хранения при определенной температуре зависит от времени, в течение которого, как правило, хранят пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт (срок годности). Продолжительность хранения обычно составляет 7-28 дней, предпочтительно продолжительность хранения составляет приблизительно 21 день.
При тестировании комбинаций из 2 штаммов неожиданно обнаружили, что комбинации из самых эффективных отдельных штаммов были даже более эффективны, чем любой из штаммов по отдельности, даже когда общие концентрации добавляемых клеток были равны в тестах отдельных штаммов и комбинаций из 2 штаммов. Комбинации Lactobacillus paracasei CHCC12777 и Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 или Lactobacillus paracasei CHCC12777 и Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 обнаруживали большую эффективность, чем контрольные культуры HOLDBAC(tm) YM-B и HOLDBAC(tm) YM-C от Dan-isco, Дания.
Соответственно в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к противомикробной композиции, включающей по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, в которой по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 с номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 с номером DSM24652 и их мутантных штаммов, где мутантные
штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei выбран из группы, состоящей из Lactobacillus paracasei CHCC12777 с номером DSM24651 и его мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к противомикроб-ным и более предпочтительно к противогрибковым композициям, включая по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, в которых по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 с номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 с номером DSM24652 и их му-тантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала; и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei выбран из группы, состоящей из Lactobacillus paracasei CHCC12777 с номером DSM24651 и его мутантных штаммов, где му-тантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
Противомикробная композиция, включающая по меньшей мере Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 и Lactobacillus paracasei СНСС12777, является предпочтительной. Аналогично, противомикробная композиция, включающая по меньшей мере Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 и Lactobacillus paracasei СНСС12777, является предпочтительной согласно настоящему изобретению.
Противомикробная композиция, как правило, включает бактерии в концентрированной форме, включая замороженные, высушенные или сублимированные концентраты, как правило, с концентрацией жизнеспособных клеток в диапазоне 104-1012 Кое (колониеобразующих единиц) на грамм композиции, включая по меньшей мере 104 Кое/г композиции, как, например, по меньшей мере 105 Кое/г, например, по меньшей мере 106 Кое/г, как, например, по меньшей мере 107 Кое/г, например, по меньшей мере 108 Кое/г, как, например, по меньшей мере 109 Кое/г, например, по меньшей мере 1010 Кое/г, как, например, по меньшей мере 1011 Кое/г. Таким образом, противомикробная композиция по настоящему изобретению предпочтительно находится в замороженной, высушенной или сублимированной форме, например, такой как культура Direct Vat Set (DVS). Однако, как используется в настоящем описании, противомикробная композиция может также представлять собой жидкость, полученную после суспендирования замороженных, высушенных или сублимированных концентратов клеток в жидкой среде, такой как вода или фос-фатно-солевой буфер. Где противомикробная композиция по настоящему изобретению представляет собой суспензию, концентрация жизнеспособных клеток находится в диапазоне 104-1012 Кое (колониеобра-зующих единиц) на мл композиции, включая по меньшей мере 104 Кое/мл композиции, как, например, по меньшей мере 105 Кое/мл, например, по меньшей мере 106 Кое/мл, как, например, по меньшей мере 10 Кое/мл, например, по меньшей мере 108 Кое/мл, как, например, по меньшей мере 109 Кое/мл, например, по меньшей мере 1010 Кое/мл, как, например, по меньшей мере 1011 Кое/мл.
Композиция может дополнительно содержать в качестве дополнительных компонентов криопро-текторы и/или традиционные добавки, включая питательные вещества, такие как дрожжевые экстракты, сахар и витамины, например, витамин A, C, D, K или витамины из семейства витамина B. Подходящие криопротекторы, которые могут быть добавлены к композициям по настоящему изобретению, являются компонентами, которые улучшают устойчивость микроорганизмов к холоду, такими как маннитол, сорбит, триполифосфат натрия, ксилит, глицерин, рафиноза, мальтодекстрин, эритрит, треитол, трегалоза, глюкоза и фруктоза. Другие добавки могут включать, например, углеводы, ароматизаторы, минералы, ферменты (например, реннин, лактаза и/или фосфолипаза).
В противомикробных композициях по настоящему изобретению, которые включают штамм Lacto-bacillus rhamnosus и штамм Lactobacillus paracasei, соотношение между штаммом Lactobacillus rhamnosus и штаммом Lactobacillus paracasei, например, соотношение между концентрацией или количеством бактерий Lactobacillus rhamnosus и концентрацией или количеством бактерий Lactobacillus paracasei предпочтительно составляет от 1:100 до 100:1, предпочтительно от 1:10 до 10:1.
Противомикробная композиция по настоящему изобретению может быть использована в любом пищевом продукте, корме и фармацевтическом продукте, который подвержен микробному разложению и/или контаминации дрожжами и плесневыми грибами. Они включают, но не ограничены ими, плоды и овощи, включая производные продукты, зерно и получаемые из зерна продукты, молочные продукты, мясо, домашнюю птицу и морепродукты. В особенно предпочтительных вариантах осуществления композицию применяют к молочным продуктам и/или мясу и домашней птице. В предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению предназначены для применения в качестве добавки при получении молочных продуктов, таких как йогурт, творог, сметана, творожный сыр и т.п.
Противомикробная композиция согласно настоящему изобретению также может применяться для ингибирования роста нежелательных микроорганизмов, выбранных из группы, состоящей из грибов и бактерий и их смесей. Композиции по настоящему изобретению особенно полезны для ингибирования и/или предотвращения роста грибов и бактерий, являющихся традиционно известными контаминантами в процессах молочной промышленности, таких как процесс ферментации молока.
В предпочтительном варианте осуществления противомикробные композиции по настоящему изо
бретению применяют против грибов, таких как дрожжи и плесневые грибы. Это означает, что композиции применяют для ингибирования и/или предотвращения роста грибов, которые вызывают контаминацию в процессах молочной промышленности, в частности в процессе ферментации молока. Противомик-робные композиции по настоящему изобретению могут применяться, например, для ингибирования и/или предотвращения роста дрожжей, таких как дрожжи родов Klyveromyces (например, K. marxianus, K. lactis), Pichia (например, P. fermentans), Yarrowia (например, Y. lipolytica), Candida (например, С. sake) и т.п.; или плесневых грибов, таких как плесневые грибы из рода Penicillium (например, Р. nalgiovense, P. commune, P. crustosum, P. brevicompactum, P. glabrum), виды Mucor, виды Cladiosporium, Aspergillus (например, A. versicolor), Debaromyces (например, D. hansenii) и т.п. Особенно предпочтительно применение противомикробных композиций по настоящему изобретению для ингибирования и/или предотвращения роста видов Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, видов Cladiosporium, Penicillium commune, видов Mucor, Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crusto-sum, Kluyveromyces lactis и/или Debaromyces hansenii.
Противомикробная композиция по первому аспекту настоящего изобретения также может применяться в качестве фармацевтического продукта для лечения инфекций патогенными грибами, предпочтительно патогенными дрожжами.
Как указано выше, настоящее изобретение в одном аспекте относится к пищевому продукту, корму или фармацевтическому продукту, включающим противомикробные композиции по первому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такой пищевой продукт выбран из группы, состоящей из фруктов, и продуктов, получаемых из фруктов, овощей и продуктов, получаемых из овощей, зерна и продуктов, получаемых из зерна, молочных продуктов, мяса, домашней птицы и морепродуктов и их смесей.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является молочным продуктом, предпочтительно мезофильным или термофильным ферментированным молочным продуктом, таким как творожный сыр, йогурт, сметана или творог.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является мясом или домашней птицей.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический продукт является продуктом, полезным для введения противомикробной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения человеку или животному для ингибирования патогенных микроорганизмов и облегчения симптомов, связанных с патогенными микроорганизмами. Примеры таких симптомов включают симптомы, связанные с дрожжевой инфекцией. В таком варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический продукт может представлять собой единичную лекарственную форму, включающую противомикробную композицию. Предпочтительно единичная лекарственная форма представляет собой капсулу или таблетку. Однако единичная лекарственная форма также может быть подходящей для применения к слизистой оболочке или коже и, таким образом, быть в форме пасты, крема, мази и т.п.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта согласно пятому аспекту настоящего изобретения, включающему добавление противомикробной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения во время получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus или Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1x106 Кое/г, предпочтительно 5x106 Кое/г, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1x108 Кое/г или по меньшей мере 1x106 Кое/мл, предпочтительно по меньшей мере 5x106, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1 x 108 Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 1x105 Кое/см2, предпочтительно по меньшей мере 1x105 Кое/см2, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1x107 Кое/см2 поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.
Там, где пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт получают путем добавлением композиции, включающей по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма Lactobacil-lus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1 x 106 Кое/г или по меньшей мере 1 x 106 Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 1 x 105 Кое/см2 поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта. Предпочтительно каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляет 5x106 Кое/г, по меньшей мере 5x106 Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 5x105 Кое/см2 поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляет по
меньшей мере 1 x 108 Кое/г или по меньшей мере 1 x 108 Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 1x107 Кое/см2 поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения параметры получения контролируются во время получения таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei увеличивалась или оставалась постоянной.
Противомикробную композицию по настоящему изобретению наиболее легко применять путем смешивания и/или нанесения на смешиваемый пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт, но она также должна быть эффективна для обработки поверхности твердых пищевых продуктов или внутренней части таких продуктов, например, путем инъекции. Во все еще других вариантах осуществления композиция может применяться в качестве маринада, панировки, приправы при вялении, глазури, пигментной смеси и т.п., при этом ключевым критерием является то, что противомикробная композиция доступна на поверхности, которая подвергается бактериальному разложению и контаминации дрожжами и плесневые грибами. Во все еще других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может быть приведена в контакт с поверхностью пищевого продукта косвенно, путем применения композиции к упаковке пищевых продуктов с последующим применением упаковки к поверхности пищевого продукта. Оптимальное количество для применения зависит от состава конкретного обрабатываемого пищевого продукта и способа применения композиции к поверхности пищевого продукта, но может быть определено простым экспериментированием.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает одну или более стадий ферментации, и противомикробная композиция может быть добавлена в пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт до, во время или после такой одной или более стадий ферментации.
В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает ферментацию молочного субстрата со стартовой культурой, включающей по меньшей мере один штамм из родов, выбранных из Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus и Leuconostoc, такой как по меньшей мере один штамм Lactobacillus bulgaricus и по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophiles или такой как по меньшей мере один штамм Lactococcus lactis подвида lactis, по меньшей мере один штамм Leuconostoc mesenteroides подвида cremoris и по меньшей мере один штамм Lactococcus lactis подвида diacetylactis.
Последние аспекты настоящего изобретения относятся к штамму Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, который депонировали в немецкой Коллекцией микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24616, или его мутантному штамму, штамму Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, который депонировали в немецкой Коллекцией микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24652, или его мутантному штамму и штамму Lactobacillus paracasei CHCC12777, который депонировали в немецкой Коллекцией микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM24651, или его мутантному штамму, где мутантные штаммы получены с применением депонированных штаммов в качестве исходного материала.
Специалистам в области техники ясно, что с применением депонированного штамма в качестве исходного материала, специалист путем обыкновенного мутагенеза или техники повторного выделения может рутинным образом получить дополнительные мутанты или их производные, которые сохраняют приведенные в настоящем описании соответствующие свойства и преимущества. Соответственно термин "их мутант" в первом аспекте относится к мутантным штаммам, получаемым с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.
Варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже при помощи неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: полуколичественные определения ингибирующего действия Lb. Paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 в отдельности и в комбинации против различных дрожжей и плесневых грибковых контаминант
Для полуколичественных измерений ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697, как в отдельности, так и в комбинации, проводили испытание на агаре, воспроизводя производственный способ и получение свежего сыра.
Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79±1°C в течение 20 с и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS CHN-19 производства Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали при 0,1 и/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Различные бутыли инокулированы с Lb. paracasei CHCC12777 и/или Lb. rhamnosus CHCC12697 в общих концентрациях 5x106 Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, 5% pH-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли для получения показателя скорости окисления и получения синего/зеленого цвета питатель
ных сред, что позволяло легче обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29±1°C и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60±0,1. После ферментации бутыли сразу же охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°C и добавляли к 40 мл 5%-ного стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°C. Этот раствор ферментированного молока и агара затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.
Отобранные дрожжи и плесневые грибы наносили каплями в концентрациях 104, 103 и 102 Кое/капля соответственно для дрожжей Klyveromyces marxianus, Pichia fermentans, Yarrowia lipolytica и Candida sake. Полностью проросшие суспензии спор разбавлены в 1000, 100, 10 раз или применяли не-разведенные для плесневых грибов Penicillium nalgiovense, видов Mucor, Penicillium commune и видов Cladiosporium соответственно. Чашки инкубировали при 7±1°C и регулярно обследовали на предмет на роста дрожжей и плесневых грибов.
Результаты анализа на агаре, представленные на фиг. 1, показывают, что все тестированные дрожжи и плесневые грибы росли очень хорошо в чашках с агаром, полученным из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда во время ферментации молока присутствовали Lb. paracasei CHCC12777 или Lb. rhamnosus CHCC12697, получаемые чашки с агаром предотыв-ращали рост K. marxianus и Y. lipolytica, добавленных во всех концентрациях. Кроме того, значительное ингибирование наблюдали для всех плесневых грибов, нанесенных каплями на чашки, когда Lb. paracasei CHCC12777 или Lb. Rhamnosus CHCC12697 присутствовали во время ферментации молока. Ни в случае, когда добавляли Lb. paracasei CHCC12777, ни в случае, когда добавляли Lb. rhamnosus CHCC12697 в качестве единственного штамма, они не оказывали какого-либо ингибирующего действие на P. fermen-tans или штаммы С. sake. Однако когда Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 оба присутствовали во время ферментации молока, ингибирование роста Р. fermentans наблюдали при его нанесении каплями в низких концентрациях 102 и 103 Кое/капля, и плесневые грибы видов Cladiosporium, а также видов Mucor, ингибировались больше, чем тогда, когда добавляли только какой-либо один из штаммов Lb. paracasei CHCC12777 или Lb. rhamnosus CHCC12697. Эти результаты иллюстрируют некоторое синергическое противогрибковое действие двух штаммов Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamno-
sus CHCC12697.
Пример 2. Количественные определения ингибирующего действия Lb. Paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 против Yarrowia lipolytica no отдельности и в комбинации
Для количественного анализа ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 в отдельности и в комбинации проводили анализ, воспроизводящий производственный способ и получение свежего сыра:
Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79±1°C в течение 20 секунд и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS CHN-19 производства Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали с 0,1 u/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 1 л. Различные бутыли инокулировали с Lb. paracasei CHCC12777 и/или Lb. rhamnosus CHCC12697 в общих концентрациях 5x106 Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, 2 бутыли инокулировали либо HOLDBAC(tm) YM-B (50DCU/100L; Danisco A/S, Дания), либо HOLDBAC(tm) YM-C (20 DCU/100L; Danisco A/S, Дания) вместе со стартовой культурой CHN-19. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29±1°C и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,65+0,05. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят.
Содержание каждой бутыли распределяли по более мелким пластмассовым чашкам для инокуляции штаммом дрожжей Yarrowia lipolytica, ранее изолированным в качестве контаминанта из свежего сырного продукта. Две отдельные чаши инокулировали объемом 1% (об./мас.) для достижения итогового уровня контаминации Y. lipolytica в ферментированном молочном продукте приблизительно 1 x 102 Кое/г. Пластмассовые чаши запечатывали и хранили при 8+1°C. Пробы ферментированных молочных продуктов регулярно отбирали для определения уровня контаминации Y. lipolytica путем посева в чашки соответствующих 10-кратных разведений, полученных в солевом пептоне, на Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) агаре с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°C. Кроме того, pH различных образцов ферментированного молока регулярно измеряли в течение хранения.
Как проиллюстрировано на фиг. 2, рост Y. lipolytica ингибировался в присутствии обоих штаммов Lb. paracasei СНСС12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 при их применении в качестве единственного штамма вместе со стартовой культурой CHN-19 перед ферментацией. Оба штамма вызывали значительно более сильное ингибирование, чем HOLDBAC(tm) YM-B и HOLDBAC(tm) YM-C. Кроме того, синергиче-ское ингибирующее действие было обнаружено при применении Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamno-sus CHCC12697 в комбинации по сравнению с ингибирующим действием каждого штамма, примененного по отдельности. При применении в комбинации, штаммы Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC12697 резко влияли как на продолжительность лаг-фазы, так и на максимальное количество кле
ток, полученное для Y. lipolytica в ферментированном молочном продукте, и этот синергический эффект, может способствовать продлению срока хранения для подобных продуктов.
Пример 3. Полуколичественные определения ингибирующего действия Lb. Paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации против различных дрожжей и плесневых кон-таминант
Для полуколичественного анализа ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rham-nosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводящее производственный способ и получение свежего сыра.
Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79+1°C в течение 20 с и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS CHN-19) инокулировали при помощи 0,1 u/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Различные бутыли инокулировали с Lb. paracasei CHCC12777 и/или Lb. rhamnosus СНСС14226 в общих концентрациях 5x106 Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, добавляли 5% pH-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого для получения индикации скорости окисления и получения синего/зеленого цвета питательных сред, что позволяет легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29+1°C и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°C и добавляли к 40 мл 5%-ного стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°C. Этот раствор ферментированного молока и агара затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.
Отобранные дрожжи и плесневые грибы, нанесенные по каплям с концентрациями 104, 103 и 102 Кое/капля соответственно, для дрожжей Klyveromyces marxianus, Pichia fermentans, Yarrowia lipolytica и Candida sake. Полностью проросшие суспензии спор разбавляли в 1000, 100, 10 раз или применяли не-разведенными для плесневых грибов Penicillium nalgiovense, видов Mucor, Penicillium commune и видов Cladiosporium соответственно. Чашки инкубировали при 7+1°C и регулярно обследовали на предмет роста дрожжей и плесневых грибов.
Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 3, показывают что все тестированные дрожжи и плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках, полученных из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль).
Однако, когда во время ферментации молока присутствовал Lb. paracasei CHCC12777, полученные пластинки предотвращали рост K. marxianus и Y. lipolytica, добавленных во всех концентрациях. Для Lb. rhamnosus CHCC14226, полученные пластинки также предотвращали рост K. marxianus, добавленного во всех концентрациях, а также Y. lipolytica, добавленного в двух самых низких концентрациях. Когда Lb. paracasei CHCC12777 или Lb. rhamnosus CHCC14226 добавляли в качестве единственного штамма, они также, казалось, вызвали небольшое ингибирующее действие на P. fermentans, добавленный в самых низких концентрациях. Однако, когда Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 оба присутствовали во время ферментации молока, рост Р. fermentans предотвращался при его добавлении в самой низкой концентрации 102 Кое/капля. Для плесневых грибов значительное ингибирование наблюдали тогда, когда Lb. paracasei CHCC12777 или Lb. rhamnosus CHCC14226 присутствовал во время ферментации молока. При применении комбинации Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 рост видов Cladiosporium ингибировался больше, чем тогда, когда один из штаммов Lb. paracasei СНСС12777 или Lb. rhamnosus CHCC14226 добавляли в отдельности. Эти результаты иллюстрируют некоторое синерги-ческое противогрибковое действие двух штаммов Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226.
Пример 4. Количественные определения ингибирующего действия Lb. Paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации против Klyveromyces marxianus
Для анализа ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 в отдельности и в комбинации проводили анализ, воспроизводящий производственный способ и получение свежего сыра:
Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79+1°C в течение 20 секунд и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS CHN-19) инокулировали с 0,1 u/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 1 л. Различные бутыли инокулировали с Lb. paracasei CHCC12777 и/или Lb. rhamnosus CHCC14226 в общих концентрациях 5x106 Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, 2 бутыли инокулировали или с HOLDBAC(tm) YM-B (50DCU/100L) или с HOLDBAC(tm) YM-C (20 DCU/100L) вместе со стартовой культурой CHN-19. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29+1°C и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,65+0,05. После ферментации бутыли немедленно охлаждались на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят.
Содержание каждой бутыли распределяли по более мелким пластмассовым чашкам для инокуляции штаммом дрожжей Klyveromyces marxianus, ранее изолированным в качестве контаминанты из свежего
сырного продукта. Две отдельных чашки инокулировали объемом 1% (об./масс.) для достижения итогового уровня контаминации K. marxianus в ферментированном молочном продукте приблизительно 1 x 102 Кое/г. Пластмассовые чашки запечатывали и хранили при 8+1°C. Регулярно отбирали пробы ферментированных молочных продуктов для определения уровня контаминации K. marxianus путем посева в чашки соответствующих 10-кратных разведений в солевом пептоне на агаре Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) с последующей аэробной инкубацией в течение 3-5 дней при 25°C. Кроме того, pH различных образцов ферментированного молока регулярно измеряли в течение хранения.
Как проиллюстрировано на фиг. 4, рост K. marxianus ингибировался в присутствии обоих штаммов Lb. paracasei СНСС12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 при их применении в качестве единственного штамма вместе со стартовой культурой CHN-19 перед ферментацией. Как замечено в примере 2, Lb. par-acasei CHCC12777 также вызывал значительно более высокое ингибирование K. marxianus, чем культуры HOLDBAC(tm) YM-B и HOLDBAC(tm) YM-C, тогда как ингибирование, вызываемое Lb. rhamnosus CHCC14226, как обнаружили, было на том же самом уровне, что и у культуры HOLDBAC(tm). Синергиче-ское ингибирующее действие обнаружили при применении Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 в комбинации по сравнению с ингибирующим действием каждого штамма, примененного в отдельности. Применении в комбинации штаммов Lb. paracasei СНСС12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 приводило к более медленному росту K. marxianus в ферментированном молочном продукте, и поэтому это может способствовать продлению срока хранения для этого типа продуктов.
Пример 5. Полуколичественные определения ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 по отдельности и в комбинации против различных плесневых контаминант
Для полуколичественного анализа Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводящее производственный способ и получение йогурта:
Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5 мас./об.%) пастеризовали при 95°C в течение пяти минут и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS YC-350 производства Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали с 0,02%, и молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Бутыли дополнительно инокулировали с Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC5366 и комбинацией этих двух штаммов соответственно в общих концентрациях 1x107 Кое/мл. Одна бутыль без дополнительной инокуляции кроме стартовой культуры служила контролем. Кроме того, 5% pH-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли ко всем бутылям, чтобы получить индикацию скорости окисления и получить питательные среды синего/зеленого цвета, которые позволяют легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 43+1°C и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°C и добавляли к 40 мл 5%-ого стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°C. Этот раствор затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопото-ком в течение 30 мин.
Полностью проросшие суспензии спор с соответствующими разведениями отобранных плесневых грибов Penicillium nalgiovese (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) и Penicillium crustosum (100x ) наносили по каплям на чашки. Чашки инкубировали при 7°C и оценивали на предмет роста плесневых грибов с подходящим, регулярным интервалом.
Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 5, показывают, что все тестированные плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда Lb. paracasei CHCC14676 или Lb. rhamnosus CHCC5366 присутствовали во время ферментации молока, полученные пластинки предотвращали рост всех плесневых грибов. Кроме того, когда Lb. paracasei СНСС14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 присутствовали в комбинации во время ферментации молока, для Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum, нанесенных каплями на чашки с агаром, наблюдали значительное ингибирование.
Пример 6. Полуколичественные определения ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации против различных плесневых контаминант
Для полуколичественного анализа Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводившее производственный способ и получение йогурта:
Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5 мас./об.%) пастеризовали при 95°C в течение 5 мин и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS Yoflex(r) Mild производства Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали с 0,02%, и молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Бутыли дополнительно инокулированы с Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC14226 и комбинацией этих двух штаммов соответственно в общих концентрациях 1x107 Кое/мл. Одна бутыль без дополнительной инокуляции кроме стартовой культуры служила контролем. Кроме того, 5% pH-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли ко всем бутылям, чтобы получить инди
кацию скорости окисления и получить питательные среды синего/зеленого цвета, что позволяет легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 43+1°C и ферментировали при этих условиях до тех пор, пока показатель pH не достигал 4,60+0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°C и добавляли к 40 мл 5%-ого стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°C. Этот раствор затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухо-потоком в течение 30 мин.
Полностью проросшие суспензии спор с соответствующими разведениями отобранных плесневых грибов Penicillium nalgiovese (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) и Penicillium crustosum (100x ) наносили каплями на чашки. Чашки инкубировали при 7°C и оценивали на предмет роста плесневых грибов с подходящим, регулярным интервалом.
Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 6, показывают, что все тестированные плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда Lb. paracasei CHCC1466 или Lb. rhamnosus CHCC14226 присутствовали во время ферментации молока, получаемые пластинки предотвращали рост всех плесневых грибов. Кроме того, когда Lb. paracasei СНСС14676 и Lb. rhamnosus CHCC14226 присутствовали в комбинации во время ферментации молока, значительное ингибирование наблюдали для Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum, нанесенных каплями на чашки с пластинками агара.
Пример 7. Полуколичественные определения ингибирующего действия Lb. Paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации против различных плесневых контаминант
Для полуколичественного анализа Lb. paracasei CHCC12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводящее производственный способ и получение йогурта:
Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5 мас./об.%) пастеризовали при 95°C в течение пяти минут и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (F-DVS YC-350 производства Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали с 0,02%, и молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Бутыли дополнительно инокулировали с Lb. paracasei CHCC12777, Lb. rhamnosus CHCC14226 и комбинацией этих двух штаммов соответственно в общих концентрациях 1x107 Кое/мл. Одна бутыль без дополнительной инокуляции кроме стратовой культуры служила контролем. Кроме того, 5% pH-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли ко всем бутылям, чтобы получить индикацию скорости окисления и получить питательные среды синего/зеленого цвета, что позволяет легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 43+1°C и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°C и добавляли к 40 мл 5%-ого стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°C. Этот раствор затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопото-ком в течение 30 мин.
Полностью проросшие суспензии спор в соответствующих разведениях отобранных плесневых грибов Penicillium nalgiovese (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) и Penicillium crustosum (100x ) наносили каплями на чашки с агаром. Чашки инкубировали при 7°C и оценивали на предмет рост плесневых грибов с подходящим, регулярным интервалом.
Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 7, показывают, что все тестированные плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда Lb. paracasei CHCC12777 или Lb. rhamnosus CHCC14226 присутствовали во время ферментации молока, получаемые пластинки предотвращали рост всех плесневых грибов. Кроме того, когда Lb. paracasei СНСС12777 и Lb. rhamnosus CHCC14226 присутствовали в комбинации во время ферментации молока, значительное ингибирование наблюдали для всех плесневых грибов, нанесенных каплями на чашки с агаром.
Пример 8. Исследование задачи на сметане с Lactobacillus paracasei CHCC12777
Для визуальной оценки ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12777 Lactobacillus par-acasei на различные плесневые грибы P. commune, A. versicolor, P. brevicompactum, P. crustosum и P. gla-brum получали сметану:
Пастеризованное цельное молоко инокулировали коммерческой гетероферментативной стартовой культурой (F-DVS DSG-2000 производства Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали HOLDBAC(tm) YM-B (10DCU/100L) или штаммом СНСС12777 Lactobacillus rhamnosus (5x106 Кое/г), и одну партию применяли в качестве контроля и инокулировали только стартовой культурой.
Молоко ферментировали при 28°C+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,05, и за
тем дообрабатывали сметану. Сметану перемешивали и охлаждали до 20°C+1°C и хранили при 7°C+1°C.
Через один день после получения сметаны проводили инокуляцию различными плесневыми грибами в виде поверхностных контаминант с двойной повторностью в чашки с йогуртом одной каплей на поверхности йогурта с содержанием целевой культуры 100 спор/капля. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 45 дней при 7°C+1°C.
Результат теста на сметане, представленный на фиг. 8, показывает, что P. commune (M6), A. versi-color (M7), Р. brevicompactum (M1), P. crustosum (M10) и Р. glabrum (M8) хорошо росли на сметане, полученной из молока, ферментированного только со стартовой культурой (верхний ряд) или со стартовой культурой и HOLDBAC(tm) YM-B культура (средний ряд). Напротив, когда Lactobacillus paracasei CHCC12777 присутствовал во время ферментации молока (нижний ряд), рост всех тестированных плесневых грибов ингибировался.
Пример 9. Исследование задачи на твороге с Lactobacillus rhamnosus CHCC12697
Для визуальной оценки ингибирующего действия отдельного штамма CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus на виды mucor получали творог:
Пастеризованное обезжиренное молоко инокулировали коммерческой стартовой культурой (F-DVS CHN-19 производства Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулиро-вали HOLDBAC(tm) YM-B (5DCU/100L) или штаммом СНСС12697 Lactobacillus rhamnosus (5x106 Кое/г), и одну партию применяли в качестве контроля и инокулировали только стартовой культурой.
Молоко ферментировали при 28°C+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,05. Температура варки составляла около 38-40°C. После дренирования творожистый осадок отжимали в течение 30 мин под давлением 1 бар.
Через один день после получения творога проводили инокуляцию видами Mucor в виде поверхностных контаминант в чашках с двойной повторностью из пипетки тремя каплями на поверхности творога (100 г) с содержанием целевой культуры 100 спор/капля. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 18 дней при 7°C+1°C.
Результат теста на твороге, представленный на фиг. 9, показывает, что виды Mucor хорошо росли на твороге, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой CHN-19 (контроль). Плесневые грибы также росли хорошо на твороге, полученном из молока, ферментированного стартовой культурой и культурой HOLDBAC(tm) YM-B и в меньшей степени на твороге, полученном из молока, ферментированного стартовой культурой и культурой HOLDBAC(tm) YM-C. Однако когда штамм CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus присутствовал во время ферментации молока, наблюдали значительно более заметное ингибирование роста видов Mucor.
Пример 10. Исследование задачи на йогурте с Lactobacillus rhamnosus CHCC14226
Для визуальной оценки ингибирующего действия отдельного штамма СНСС14226 Lactobacillus rhamnosus на различных плесневых грибах P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor и Р. crustosum получали йогурт с содержанием жира 1,5%
Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5%) пастеризовали при 95°C+1°C в течение 5 мин в бутылях объемом 1 л на водяной бане и немедленно охлаждали. Проводили инокуляцию коммерческой стартовой культурой (F-DVS YF-L901 производства Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,02%. Молоко было дополнительно инокулировали с HOLDBAC(tm) YM-B (20DCU/100L) или Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 (1x107 Кое/мл), и одну бутыль, которая служила контролем, инокулировали только стартовой культурой.
Молоко ферментировали при 43°C+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,05. Полученный йогурт выливали в чашки (100 г) и хранили при 7°C+1°C.
Через один день после получения йогурта проводили инокуляцию различными плесневыми грибами в виде поверхностных контаминант на чашках с йогуртом с двойной повторностью по одной капле на поверхности йогурта с содержанием целевой культуры 100 спор/капля. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 45 дней при 7°C+1°C.
Результат теста на йогурте, представленный на фиг. 10, показывает что P. brevicompactum (M1), P. commune (M6), А. versicolor (M7) и P. crustosum (M10) росли хорошо на йогурте, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой YF-L901 (верхний ряд) или со стартовой культурой и HOLDBAC(tm) YM-B культура (средний ряд). Напротив, когда Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 присутствовали во время ферментации молока (нижний ряд), рост всех тестированных плесневых грибов ингибировался.
Пример 11. Количественные определения ингибирующего действия Lactobacillus paracasei CHCC12777 против K. lactis в твороге
Для количественного анализа ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12777 Lactobacil-lus paracasei на K. lactis получали творог.
Пастеризованное обезжиренное молоко инокулировали коммерческой стартовой культурой (F-DVS CHN-19 производства Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали с HOLDBAC(tm) YM-B (20DCU/100L) или штаммом СНСС12777 Lactobacillus rhamnosus (5x106
Кое/г), и одну партию, которую применяли в качестве контроля, инокулировали только стартовой культурой.
Молоко ферментировали при 28°C+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,05. Температура варки составляла 38-40°C. После дренирования творожистый осадок отжимали в течение 30 мин под давлением 1 бар.
На следующий день после получения творога отрезали типовые блоки творога массой приблизительно 10 г и помещали в гомогенизирующие пакеты. Затем блоки инокулировали с двойной повторно-стью 0,1 мл дрожжевого инокулята с концентрацией 10000 Кое/мл путем впрыскивания дрожжей внутрь творога тонкой иглой. Пакеты оборачивали вокруг творога и запечатывали клейкой лентой.
Образцы хранили при 7°C+1°C и анализированы с подходящим интервалом времени на уровень контаминации K. Lactis путем посева в чашки 1 г творога с дополнительным соответствующим 1-кратным разведением в солевом пептоне на агаре Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°C.
Как проиллюстрировано на фиг. 11, рост K. lactis ингибировался в присутствии штамма СНСС12777 Lactobacillus paracasei, когда инокуляцию проводили вместе со стартовой культурой CHN-19 перед ферментацией. Штамм СНСС12777 Lactobacillus paracasei вызывал значительно более сильное ин-гибирование, чем коммерческая культура, HOLDBAC(tm) YM-B.
Пример 12. Количественные определения ингибирующего действия Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 против K. lactis в твороге
Для количественного анализа ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12697 Lactobacil-lus rhamnosus на K. lactis получали творог:
Пастеризованное обезжиренное молоко инокулировали коммерческой стартовой культурой (F-DVS CHN-19 производства Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали с HOLDBAC(tm) YM-B (5DCU/100L) или штаммом СНСС12697 Lactobacillus rhamnosus (5x106 Кое/г), и одну партию, которую применяли в качестве контроля, инокулировали только стартовой культурой.
Молоко ферментировали при 28°C+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,05. Температура варки составляла около 38-40°C. После дренирования творожистый осадок отжимали в течение 30 мин под давлением 1 бар.
Через один день после получения творога отрезали типовые блоки творога массой приблизительно 10 г и помещали в гомогенизирующие пакеты. Затем блоки инокулировали с двойной повторностью 0,1 мл дрожжевого инокулята с концентрацией 10000 Кое/мл путем впрыскивания дрожжей внутрь творога тонкой иглой. Пакеты оборачивали вокруг творога и запечатывали клейкой лентой.
Образцы хранили при 7°C+1°C и анализировали с подходящим интервалом времени на уровень контаминации K. lactis путем посева в чашки 1 г творога с дополнительным соответствующим 1-кратным разведением в солевом пептоне на агаре Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°C.
Как проиллюстрировано на фиг. 11, рост K. lactis ингибировался в присутствии штамма CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus, когда проводили инокуляцию вместе со стартовой культурой CHN-19 перед ферментацией. Штамм вызывал значительно более сильное ингибирование, чем коммерческая
культура HOLDBAC(tm) YM-B.
Пример 13. Количественные определения ингибирующего действия Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 против Debaromyces hansenii в йогурте
Для количественного анализа ингибирующего действия отдельного штамма СНСС14226 Lactobacil-lus rhamnosus на D. Hansenii получали йогурт следующим образом.
Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5%) пастеризовали при 95°C+1°C в течение 5 мин в бутылях объемом 1 л на водяной бане и затем немедленно охлаждали. Проводили инокуляцию коммерческой стартовой культурой (F-DVS YF-L901 производства Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,02%. Молоко дополнительно инокулировали с HOLDBAC(tm) YM-B (20DCU/100L) или Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 (1x107 Кое/г), и одну бутыль, которая служила контролем, инокулировали только стартовой культурой.
Молоко ферментировали при 43°C+1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60+0,1. Полученный йогурт выливали в чашки (100 г) и хранили при 7°C+1°C.
Через один день после получения йогурта чашки инокулировали с двойной повторностью дрожжами в количестве 1,00 мл/чашка с концентрацией целевой культуры 20 Кое/г. Дрожжи равномерно распределяли в йогурте. Чашки хранили под крышкой при 7°C+1°C и анализировали с подходящим интервалом времени на уровень контаминации D. Hansenii путем посева в чашки 1 мл йогурта с дополнительным соответствующим 1-кратным разведением в солевом пептоне на агаре Yeast Glucose Chlorampheni-col (YGC) с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°C.
Как проиллюстрировано на фиг. 12, рост D. hansenii ингибировался в присутствии штамма СНСС14226 Lactobacillus rhamnosus, когда инокуляцию проводили вместе со стартовой культурой YF-L901 перед ферментацией. Штамм вызывал значительно более сильное ингибирование, чем коммерче
ская культура HOLDBAC(tm) YM-B.
Депонирование и экспертное решение
Заявитель просит, чтобы образец депонированных микроорганизмов, указанных ниже, мог быть доступным для эксперта только до даты, до которой выдается патент.
Штамм СНСС12697 Lactobacillus rhamnosus, депонированный 01.03.2011 в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124, Брауншвейг, с присвоенным номером: DSM2 4 616.
Штамм СНСС14226 Lactobacillus rhamnosus, депонированный 15.03.2011 в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124, Брауншвейг, с присвоенным номером: DSM24652.
Штамм СНСС12777 Lactobacillus paracasei, депонированный 15.03.2011 в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124, Брауншвейг, с присвоенным номером: DSM24651.
Депонирования были сделаны согласно Будапештскому соглашению о международном признании депонирования микроорганизмов в целях процедуры выдачи патента.
Ссылки
US 2005/0095318 (Schwenninger et al.) WO 2004/041305 (Valio Ltd)
Tharmaraj, N. & Shah, N.P. (2009) Antimicrobial effects of probiotic bacteria against selected species of yeasts and molds
in cheese-based dips. International Journal of Food Science &
Technology. 44: 1916-1926.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Противомикробная композиция, включающая по меньшей мере один штамм Lactobacillus rham-nosus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, в которой по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus СНСС12697 DSM24616 и Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 DSM24652.
2. Противомикробная композиция по п.1, в которой штамм Lactobacillus paracasei представляет собой Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651.
3. Применение противомикробной композиции по любому из предшествующих пунктов для получения пищевого продукта.
4. Пищевой продукт, включающий противомикробную композицию по п.1 или 2.
5. Пищевой продукт по п.4, который выбран из группы, состоящей из фруктов и продуктов, получаемых из фруктов, овощей и продуктов, получаемых из овощей, зерна и продуктов, получаемых из зерна, молочных продуктов, мяса, домашней птицы и морских продуктов и их смесей.
6. Способ получения пищевого продукта, включающий добавление противомикробной композиции по п. 1 или 2 на любой стадии осуществления данного способа.
7. Способ по п.6, в котором противомикробную композицию по п.1 или 2 добавляют таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus rhamnosus и по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляла по меньшей мере 1 x 106 Кое/г, или по меньшей мере 1 x 106 Кое/мл пищевого продукта, или по меньшей мере 1x105 Кое/см2 поверхности пищевого продукта.
8. Способ по п.6 или 7, в котором способ включает одну или более стадий ферментации.
9. Штамм Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 DSM24652, используемый для получения противо-микробной композиции.
1.
1.
1.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028377
- 1 -
028377
- 1 -
028377
- 1 -
028377
- 1 -
028377
- 4 -
028377
- 17 -
|
