[RU]

1. Молекула антитела, которая специфично связывает дабигатран и обладает способностью нейтрализовать активность антикоагулянта, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и CDR3 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

2. Молекула антитела по п.1, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

3. Молекула антитела по п.1 или 2, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 и 26, вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25 и 27.

4. Молекула антитела по п.3, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.

5. Молекула антитела по одному из предыдущих пунктов, представляющая собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, Fab-, Fab'- или F(ab') ₂ -фрагмент или одноцепочечное антитело, предпочтительно одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

6. Молекула антитела по п.5, представляющая собой scFv, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны друг с другом с помощью линкерного пептида, имеющего последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31.

7. Молекула антитела по п.6, где scFv включает SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.

8. Молекула антитела по п.5, содержащая тяжелую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, или содержащая тяжелую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43.

9. Антитело по п.5, представляющее собой Fab-молекулу, которая имеет Fd-фрагмент, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39.

10. Применение молекулы антитела по одному из предыдущих пунктов для терапии или для предупреждения побочных действий дабигатрана и/или для реверсии передозировки дабигатрана.

11. Применение по п.10, где побочное действие представляет собой случай кровотечения.

12. Способ получения молекулы антитела по любому из пп.1-9, включающий: (а) получение клетки-хозяина, которая содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих указанную молекулу антитела, которые функционально связаны с контролирующей экспрессию последовательностью, (б) культивирование клетки-хозяина и (в) выделение молекулы антитела из клеточной культуры.

13. Применение антитела по любому из пп.1-9 для нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента.

14. Способ нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента, включающий: (а) подтверждение того, что пациента подвергали лечению дабигатраном, дабигатрана этексилатом, пролекарством дабигатрана или его фармацевтически приемлемой солью, и устанавливают его количество, введенное пациенту; (б) нейтрализацию дабигатрана или его 1-О-ацилглюкуронида с помощью антитела по одному из пп.1-9 перед осуществлением теста или анализа на свертываемость или коагуляцию, при этом присутствие дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана может влиять на точные данные теста или результаты анализа; (в) проведение теста или анализа на свертываемость или коагуляцию с использованием образца, взятого из организма пациента, для определения уровня сгусткообразования при отсутствии дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана; и (г) регуляцию количества дабигатрана, дабигатрана этексилата, пролекарства дабигатрана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимых пациенту, с целью достижения требуемого баланса между образованием и деградацией сгустка в организме пациента.

15. Способ по п.14, в котором молярное соотношение антитела и дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 100.

16. Способ по п.14, в котором молярное соотношение антитела и дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 10.

17. Способ по п.14, в котором точные показания теста или результаты анализа представляют собой точные данные об уровнях фибриногена, устойчивости к действию активированного белка С или результаты родственных тестов.

(57) Реферат / Формула:

1. Молекула антитела, которая специфично связывает дабигатран и обладает способностью нейтрализовать активность антикоагулянта, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и CDR3 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

2. Молекула антитела по п.1, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

3. Молекула антитела по п.1 или 2, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 и 26, вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25 и 27.

4. Молекула антитела по п.3, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.

5. Молекула антитела по одному из предыдущих пунктов, представляющая собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, Fab-, Fab'- или F(ab') ₂ -фрагмент или одноцепочечное антитело, предпочтительно одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

6. Молекула антитела по п.5, представляющая собой scFv, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны друг с другом с помощью линкерного пептида, имеющего последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31.

7. Молекула антитела по п.6, где scFv включает SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.

8. Молекула антитела по п.5, содержащая тяжелую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, или содержащая тяжелую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43.

9. Антитело по п.5, представляющее собой Fab-молекулу, которая имеет Fd-фрагмент, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39.

10. Применение молекулы антитела по одному из предыдущих пунктов для терапии или для предупреждения побочных действий дабигатрана и/или для реверсии передозировки дабигатрана.

11. Применение по п.10, где побочное действие представляет собой случай кровотечения.

12. Способ получения молекулы антитела по любому из пп.1-9, включающий: (а) получение клетки-хозяина, которая содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих указанную молекулу антитела, которые функционально связаны с контролирующей экспрессию последовательностью, (б) культивирование клетки-хозяина и (в) выделение молекулы антитела из клеточной культуры.

13. Применение антитела по любому из пп.1-9 для нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента.

14. Способ нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента, включающий: (а) подтверждение того, что пациента подвергали лечению дабигатраном, дабигатрана этексилатом, пролекарством дабигатрана или его фармацевтически приемлемой солью, и устанавливают его количество, введенное пациенту; (б) нейтрализацию дабигатрана или его 1-О-ацилглюкуронида с помощью антитела по одному из пп.1-9 перед осуществлением теста или анализа на свертываемость или коагуляцию, при этом присутствие дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана может влиять на точные данные теста или результаты анализа; (в) проведение теста или анализа на свертываемость или коагуляцию с использованием образца, взятого из организма пациента, для определения уровня сгусткообразования при отсутствии дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана; и (г) регуляцию количества дабигатрана, дабигатрана этексилата, пролекарства дабигатрана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимых пациенту, с целью достижения требуемого баланса между образованием и деградацией сгустка в организме пациента.

15. Способ по п.14, в котором молярное соотношение антитела и дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 100.

16. Способ по п.14, в котором молярное соотношение антитела и дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 10.

17. Способ по п.14, в котором точные показания теста или результаты анализа представляют собой точные данные об уровнях фибриногена, устойчивости к действию активированного белка С или результаты родственных тестов.

---

Евразийское
патентное
ведомство
028371
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201201016
(22) Дата подачи заявки
2011.01.20
(51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01) C07K16/44 (2006.01)
(54) АНТИДОТЫ АНТИКОАГУЛЯНТОВ
(31) 10151239.0; 61/383,914
(32) 2010.01.20; 2010.09.17
(33) EP; US
(43) 2013.02.28
(86) PCT/EP2011/050749
(87) WO 2011/089183 2011.07.28
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ИНТЕРНАЦИОНАЛЬ ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Ван-Рин Жоанне, Парк Джон Эдуард, Хауэль Норберт, Кунц Ульрих, Литценбургер Тобиас (DE), Кэнеде Кейт, Синх Санджая, Уотерман Алайса (US)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(56) ZIKRIA JENNIFER CARREIRO ET AL.: "Oral anticoagulation with factor Xa and thrombin inhibitors: on the threshold of change", September 2009 (2009-09), CURRENT OPINION IN HEMATOLOGY. SEP 2009, LNKD-PUBMED:19550318, VOL. 16, NR. 5, PAGE(S) 347-356, XP009131923, ISSN: 1531-7048, pages 347, 353 - page 355
SCHULMAN ET AL.: "Anticoagulants and
Their Reversal", TRANSFUSION MEDICINE REVIEWS, GRUNE AND STRATTON, ORLANDO, FL, US LNKD-DOI:10.1016/J.TMRV2006.08.002,
vol. 21, no. 1, 13 December 2006 (2006-12-13), pages
37-48, XP005749419, ISSN: 0887-7963, abstract
WO-A1-9837075
FRA CR DA CR RIC LAPOSTOLLE ET AL.: "Assessment of digoxin antibody use in patients with elevated serum digoxin following chronic or
acute exposure", INTENSIVE CARE MEDICINE, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 34, no. 8, 4 April
2008 (2008-04-04), pages 1448-1453, XP019619076, ISSN: 1432-1238. Introduction
HARDIN J.S. ET AL.: "Pharmacodynamics of a monoclonal antiphencyclidine Fab with broad selectivity for phencyclidine-like drugs", June 1998 (1998-06), THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY
AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS. JUN
1998, LNKD-PUBMED: 9618414, VOL. 285,
NR. 3, PAGE(S) 1113-1122, XP002577101, ISSN:
0022-3565, abstract, introduction, discussion
HURSTING M.J. ET AL.: "Drug-specific Fab therapy in drug overdose", August 1987 (1987-08), ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. AUG 1987, LNKD-PUBMED: 3632280, VOL. 111, NR. 8, PAGE(S) 693-697, XP002577102,
ISSN: 0003-9985, abstract
COLBURN W.A.: "Specific antibodies and Fab fragments to alter the pharmacokinetics and reverse the pharmacologic/toxicologic effects of drugs", 1980, DRUG METABOLISM REVIEWS 1980, LNKD-PUBMED: 7011759, VOL. 11, NR. 2, PAGE(S) 223-262, XP002577103, ISSN: 0360-2532, the whole document
(57) В изобретении описаны молекулы антител к антикоагулянтам, прежде всего к дабигатрану, и их применение в качестве антидотов таких антикоагулянтов.
Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, прежде всего к области антикоагулянтной терапии.
Информация о существующем уровне техники
Антикоагулянты представляют собой субстанции, которые предупреждают коагуляцию; т.е. они прекращают свертывание крови. Антикоагулянты нашли широкое применение в терапии человека в качестве лекарственного средства для связанных с тромбообразованием нарушений, например, для предупреждения первичного и вторичного тромбоза глубоких вен, эмболии легочной артерии, различных видов инфаркта миокарда и "удара" у предрасположенных к таким нарушениям индивидуумов.
Одним из важных классов, предназначенных для орального введения антикоагулянтов, являются соединения, которые действуют в качестве антагонистов витамина К, к ним относятся, например, кума-рины, включая варфарин. Ко второму классу относятся соединения, которые оказывают косвенное инги-бирующее воздействие на коагуляцию, посредством кофактора, такого как антитромбин III или кофактор гепарина II. К ним относится ряд низкомолекулярных производных гепарина, которые катализируют ингибирование преимущественно фактора Ха (и в меньшей степени тромбина) посредством антитромбина III (бемипарин, сертопарин, далтепарин, эноксапарин, надропарин, парнапарин, ревипарин, тинзапа-рин). Олигосахариды с меньшей длиной цепи (фондапаринукс, идрапаринукс) ингибируют только фактор Ха посредством антитромбина III. Гепариноиды (данапароид, сулодексид, дерматана сульфат) оказывают свое действие посредством обоих кофакторов и ингибируют как фактор Ха, так и тромбин. Третий класс включает ингибиторы коагуляции прямого действия. К ингибиторам фактора Ха прямого действия относятся апиксабан, эдоксабан, отамиксабан, ривароксабан, а к ингибиторам тромбина прямого действия относятся двухвалентные гирудины (бивалирудин, лепирудин, дезирудин) и одновалентные соединения аргатробан и дабигатран.
Свертывание крови представляет собой биологический механизм, посредством которого прекращается кровотечение, побочным действием антикоагулянтной терапии могут быть нежелательные кровотечения. Поэтому существует необходимость в разработке антидота, обладающего способностью прекращать такие связанные с применением антикоагулянтов кровотечения в случае их возникновения (Zikria и Ansell, Current Opinion in Hematology, 16(5), 2009, cc. 347-356). Одним из путей достижения этого является нейтрализация активности соединения-антикоагулянта, присутствующего в организме пациента после его введения.
К применяемым в настоящее время антидотам антикоагулянтов относятся протамин (для нейтрализации гепарина) и витамин К, который используют для нейтрализации антагонистов витамина К типа варфарина. В качестве обладающих неспецифическим действием антидотов применяли также свежезамороженную плазму и рекомбинантный фактор VIIa для пациентов, страдающих обширной травмой или серьезным кровоизлиянием, которых подвергали лечению низкомолекулярным гепарином (Lauritzen В. и др., Blood, 2005, cc. 607А-608А). Имеются данные также об использовании фрагментов протамина (патент США № 6624141) и низкомолекулярных синтетических пептидов (патент США № 6200955) в качестве антидотов гепарина или низкомолекулярного гепарина; и мутеинов тромбина (патент США № 6060300) в качестве антидотов ингибитора тромбина. Опубликованы данные о применении протромби-новых промежуточных продуктов и производных в качестве антидотов гирудина и синтетических ингибиторов тромбина (патенты США № 5817309 и 6086871). Для прямых ингибиторов фактора Ха были предложены в качестве антидотов неактивные аналоги фактора Ха (WO 2009/042962). Кроме того, применяли рекомбинантный фактор VIIa для реверсирования воздействия непрямых ингибиторов антитромбин III-зависимого фактора Ха, таких как фондапаринукс и идрапаринукс (Bijsterveld N.R. и др., Circulation, 106, 2002, cc. 2550-2554; Bijsterveld N.R. и др., British J. of Haematology (124), 2004, cc. 653-658). Обзор методов осуществления реверсии антикоагулянтного действия приведен у Schulman и Bijsterveld, Transfusion Medicine Reviews, 21(1), 2007, cc. 37-48.
Таким образом, существует необходимость в разработке улучшенных антидотов для антикоагу-лянтной терапии и прежде всего в разработке антидотов прямых ингибиторов тромбина типа дабигатра-на, для которого до настоящего времени не описаны специфические антидоты.
Краткое изложение сущности изобретения
Один из объектов настоящего изобретения относится к молекуле антитела, которая обладает способностью нейтрализовать активность антикоагулянта.
Согласно другому объекту изобретения молекула антитела обладает способностью специфически связываться с антикоагулянтом.
Согласно следующему объекту изобретения антикоагулянт представляет собой прямой ингибитор тромбина, ингибитор фактора Ха или антагонист витамина К.
Согласно следующему объекту изобретения антикоагулянт представляет собой дабигатран, аргат-робан, мелагатран, ксимелагатран, гирудин, бивалирудин, лепирудин, дезирудин, апиксабан, отамикса-бан, эдоксабан, ривароксабан, дефибротид, раматробан, антитромбин III или дротрекогин альфа.
В следующем варианте осуществления изобретения антикоагулянт представляет собой дизамещен
ный бициклический гетероцикл общей формулы
R. - А - Het - В - Аг - Е , (I)
в которой
А обозначает карбонильную или сульфонильную группу, связанную с бензогруппой, пиридогруп-пой или тиеногруппой группы Het,
В обозначает этиленовую группу, в которой метиленовая группа, связанная с группой Ar, может быть замещена атомом кислорода или серы или -NR1-группой, в которой
R1 обозначает атом водорода или С1-С4алкильную группу,
Е обозначает RbNH-С(=NH)-группу, в которой
Rb обозначает атом водорода, гидроксигруппу, С1-С9алкоксикарбонильную, циклогексилоксикарбо-нильную, фенил-С1-С3алкоксикарбонильную, бензоильную, пара-С1-С3алкилбензоильную или пириди-ноильную группу, при этом этоксигруппа в положении 2 в указанной выше С1-С9алкоксикарбонильной группе может быть дополнительно замещена C1-С3алкилсульфонильной или 2-(С1-С3алкокси)этильной группой,
Ar обозначает а 1,4-фениленовую группу, необязательно замещенную атомом хлора или метилом, этилом или метоксигруппой, или обозначает 2,5-тиениленовую группу,
Het обозначает 1-(С1-С3алкил)-2,5-бензимидазолиленовую, 1-циклопропил-2,5-бензимидазолиле-новую, 2,5-бензотиазолиленовую, 1-(С1-С3алкил)-2,5-индолиленовую, 1-(С1-С3алкил)-2,5-имидазо[4,5-b]пиридиниленовую, 3-(C1-С3алкил)-2,7-имидазо[1,2-а]пиридиниленовую или 1-(С1-С3алкил)-2,5-тие-но[2,3-d]имидазолиленовую группу и
Ra обозначает R2NR3-группу, в которой
R2 обозначает С1-С4алкильную группу, которая может быть замещена карбоксигруппой, C1-С6алкилоксикарбонильной, бензилоксикарбонильной, С1-С3алкилсульфониламинокарбонильной или 1Н-тетразол-5-ильной группой,
С2-С2алкильную группу, замещенную гидроксигруппой, бензилоксигруппой, карбокси-С1-С3ал-киламиногруппой, С1-С3алкоксикарбонил-C1-С3алкиламиногруппой, ^(Сг^алкшОкарбокси-С^С^л-киламиногруппой или N-(С1-С3алкил)-С1-С3алкоксикарбонил-С1-С3алкиламиногруппой, при этом в вышеуказанных группах атом углерода в а-положении по отношению к соседнему атому азота может быть незамещенным,
R3 обозначает С3-С7циклоалкильную группу, пропаргильную группу, в которой ненасыщенный фрагмент может быть не связан непосредственно с атомом азота R2NR3-группы, фенильную группу, необязательно замещенную атомом фтора или хлора, или метильной или метоксигруппой, пиразолильную, пиридазолильную или пиридинильную группу, необязательно замещенную метильной группой, или
R2 и R3 вместе с атомом азота, находящимся между ними, обозначают 5-7-членную циклоалкиле-ниминогруппу, необязательно замещенную карбоксигруппу или С1-С4алкоксикарбонильную группу, с которой дополнительно может быть слито фенильное кольцо,
его таутомеры, стереоизомеры и соли.
В следующем варианте осуществления изобретения антикоагулянт представляет собой соединение, выбранное из группы, включающей
(а) М-фенил-М-(2-карбоксиэтил)амид 2-[N-(4-
амидинофенил)аминометил]бензтиазол-5-карбоновой кислоты,
(б) Ы-фенил-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 2-[М-(4-амидинофенил)-Ы-
метиламинометил]бензтиазол-5-илкарбоновой кислоты,
(в) М-фенил-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[К-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(г) Н-фенил-М-(3-гидроксикарбонилпропил)амид 1-метил-2-[М-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(д) М-(2-пиридил)-М-(гидроксикарбонилметил)амид 1 -метил-2-[Н-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(е) Ы-(2-пиридил)-> 1-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[2-(2-
амидинотиофен-5-ил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ж) М-(2-пиридил)-г\[-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[N-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(з) Ы-(2-пиридил)-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[2-(4-
амидинофенил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(и) > Т-фенил-К-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[2-(4-
амидинофенил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(к) М-фенил^-[2-(1Н-тетразол-5-ил)этил]амид 1-метил-2-[2-(4-амидинофенил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(л) К-фенил-М-[2-(1Н-тетразол-5-ил)этил]амид 1-метил-2-[N-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(м) 1М-(2-пиридил)-Ь[-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[N-(4-амидинофенил)-К-метиламинометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(н) К-(3-пиридил)-1Ч-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[N-(4-амидинофенил)-Н-метиламинометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(о) К-фенил-К-(2-гидроксикарбонилэтил)амид l-Meran-2-[N-(4-амидинофенил)-К-метиламинометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(п) Ы-фенил-М-[(К-гидроксикарбонилэтил-М-метил)-2-аминоэтил]амид 1 -метил-2-[М-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(р) Ы-(3-фторфенил)-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[ГЧ-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
с) Н-(4-фторфенил)-Н-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[М-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(т) Ы-фенил-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидино-2-метоксифенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(у) К-(2-пиридил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2- [N-(4-амидино-2-метоксифенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ф) К-фенил-1М-(2-метоксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[М-(4-амидинофенил)аминометил]индол-5-илкарбоновой кислоты,
(х) М-фенил-г\1-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]тиено[2.3-с!]имидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ц) Ы-фенил-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ч) М-(2-пиридил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ш) N-(2-пиpидил)-N-(2-гидpoкcикapбoнилэтил)aмид 1 -метил-2-[N-(4-амидино-2-метоксифенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(щ) Н-(2-пиридил)-Ы-(2-этоксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[М-[4-(М-и-гексилоксикарбониламидино)фенил]аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты и
их таутомеры, стереоизомеры и соли.
Следующий объект настоящего изобретения относится к молекуле антитела к дабигатрану, этекси-лату дабигатрана и/или О-ацилглюкурониду дабигатрана.
Согласно следующему объекту молекула антитела представляет собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, фрагмент антитела, прежде всего Fab-, Fab'- или F(ab,)2-фрагмент, одноцепочечное антитело, прежде всего одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), доменное антитело, нанотело, димерное антитело (диабоди) или сконструированный белок с анкириновым повтором (Designed Ankyrin Repeat Protein, DARPin).
Следующий объект настоящего изобретения относится к описанной выше молекуле антитела, предназначенной для применения в медицине.
Следующий объект настоящего изобретения относится к описанной выше молекуле антитела,
предназначенной для применения в терапии или для предупреждения побочных действий антикоагу-лянтной терапии.
Согласно еще одному объекту изобретения побочное действие представляет собой случай кровотечения.
Следующий объект настоящего изобретения относится к способу лечения или предупреждения побочных действий антикоагулянтной терапии, заключающемуся в том, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят в эффективном количестве описанную выше молекулу антитела.
Следующий объект настоящего изобретения относится к набору, содержащему описанную выше молекулу антитела вместе с контейнером и этикеткой.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано
на фиг. 1 - данные, полученные при анализе на время свертывания, которые свидетельствуют о том, что при увеличении концентраций дабигатрана происходит возрастание времени свертывания. При использовании концентрации 200 нМ время свертывания возрастало примерно в 5 раз по сравнению с исходным уровнем, указанную концентрацию применяли в первой и второй серии экспериментов. В последней серии экспериментов применяли концентрацию 500 нМ (сверхтерапевтическая концентрация);
на фиг. 2 - данные о том, что все четыре различных антитела к дабигатрану (А-Г) нейтрализовали обусловленное дабигатраном увеличение времени свертывания в человеческой плазме. Исходное время свертывания в человеческой плазме составляло 10,9 с, после предварительной инкубации дабигатрана, взятого в концентрации 200 нМ, с плазмой время свертывания возрастало до 51 с. Каждое из антител добавляли к плазме, предварительно инкубированной с дабигатраном, взятым в концентрации 200 нМ, и дополнительно инкубировали в течение 5 мин. Затем путем добавления тромбина инициировали свертывание для определения тромбинового времени. Каждое антитело обладало различной способностью вызывать реверсию воздействия дабигатрана на время свертывания. Раствор с наибольшей концентрацией приводил к наибольшей реверсии антикоагулянтной активности;
на фиг. 3 - результаты измерений воздействия возрастающих концентраций поликлонального антитела (антитело Г), которое добавляли к человеческой плазме, предварительно инкубированной с дабигат-раном, взятым в концентрации 200 нМ. Исходное время свертывания составляло 11с, добавление даби-гатрана удлиняло время свертывания до 63,7 с. Затем тестировали влияние повышения степени разведения антитела на обусловленное дабигатраном удлинение тромбинового времени свертывания. Наименьшая концентрация снижала тромбиновое время свертывания до 43,9 с. Более высокие концентрации вызывали полное снижение тромбинового времени свертывания вплоть до исходных уровней и приводили к полной нейтрализации антикоагулянтного действия дабигатрана. Добавление неспецифического кроличьего поликлонального антитела (обозначено квадратом) не оказывало влияния, приводящего к реверсии антикоагулянтного действия дабигатрана;
на фиг. 4 - результаты измерений влияния возрастающих концентраций поликлонального антитела (антитело Г), добавленного к человеческой плазме, которую предварительно инкубировали с дабигатра-ном, взятым в концентрации 500 нМ. Исходное время свертывания составляло 10,9 с, добавление даби-гатрана в указанной более высокой концентрации удлиняло время свертывания до 111,7 с (~10-кратное увеличение). Применение антитела в разведении 1:2 или в виде маточного раствора приводило к реверсии обусловленного дабигатраном удлинения тромбинового времени свертывания, степень которой зависела от концентрации. Наибольшая концентрация также вызывала полное снижение тромбинового времени свертывания вплоть до исходных уровней и приводила к полной нейтрализации антикоагулянт-ного действия даже при сверхтерапевтических концентрациях дабигатрана;
на фиг. 5 - последовательности вариабельных областей тяжелых цепей молекулы антитела к даби-гатрану;
на фиг. 6 - последовательности вариабельных областей легких цепей молекулы антитела к дабигат-
рану;
на фиг. 7 - данные, демонстрирующие, что мышиное моноклональное антитело (клон 22) приводит к реверсии антикоагулянтного действия дабигатрана в человеческой плазме и человеческой цельной крови. Мышиное антитело добавляли в возрастающих концентрациях к человеческой плазме или цельной крови, которую предварительно инкубировали с дабигатраном, взятым в концентрации 30 нМ. Анализ начинали, добавляя 1,5-2 ед./мл тромбина и измеряли время свертывания. Разницу между временами свертывания в присутствии соединения и при его отсутствии принимали за 100% активности дабигатра-на. Антитело ингибировало в зависимости от дозы опосредуемое дабигатраном удлинение времени свертывания;
на фиг. 8 - данные, демонстрирующие, что мышиный Fab-фрагмент, полученный из клона 22 антитела, приводило к реверсии антикоагулянтного действия дабигатрана в человеческой плазме. Мышиный Fab-фрагмент добавляли в возрастающих концентрациях к человеческой плазме, которую предварительно инкубировали с дабигатраном, взятым в концентрации 7 нМ. В качестве положительного контроля тестировали также интактное антитело. Анализ начинали, добавляя 0,4 ед./мл тромбина и измеряли время свертывания. За 100%-ный уровень ингибирования принимали полную блокаду опосредуемого даби
гатраном увеличения времени свертывания. Fab-фрагмент ингибировал в зависимости от дозы индуцируемое дабигатраном удлинение времени свертывания в человеческой плазме;
на фиг. 9 - данные, демонстрирующие, что мышиное моноклональное антитело (клон 22) приводит к реверсии антикоагулянтного действия ацилглюкуронида дабигатрана в человеческой плазме. Мышиное антитело добавляли в возрастающих концентрациях к человеческой плазме, которую предварительно инкубировали с ацилглюкуронидом дабигатрана или дабигатраном, взятыми в концентрации 7 нМ. Анализ начинали, добавляя 0,4 ед./мл тромбина и измеряли время свертывания. За 100%-ный уровень инги-бирования принимали полную блокаду опосредуемого соединением увеличения времени свертывания. Антитело ингибировало в зависимости от дозы индуцируемое ацилглюкуронидом дабигатрана удлинение времени свертывания в человеческой плазме;
на фиг. 10 - данные, демонстрирующие, что гуманизированный Fab-фрагмент (Fab 18/15) приводит к реверсии антикоагулянтного действия дабигатрана в человеческой плазме. Fab 18/15 добавляли в возрастающих концентрациях к человеческой плазме, которую предварительно инкубировали с дабигатра-ном, взятым в концентрации 7 нМ. Анализ начинали, добавляя 0,4 ед./мл тромбина и измеряли время свертывания. За 100%-ный уровень ингибирования принимали полную блокаду опосредуемого даби-гатраном увеличения времени свертывания. Fab-фрагмент ингибировал в зависимости от дозы индуцируемое дабигатраном удлинение времени свертывания в человеческой плазме;
на фиг. 11 - измеренное ex vivo тромбиновое время свертывания цельной крови (3,0 ед./мл тромбина), взятой у крыс, которым вводили дабигатран путем непрерывной инфузии и Fab-фрагмент, взятый в эквимолярном количестве, в виде болюсной инъекции в момент времени t=0. Линия со сплошными кружками соответствует обработке наполнителем без лекарственного средства. Линия со сплошными квадратами соответствует антикоагулянтной активности дабигатрана в отсутствие Fab-фрагмента. Линия со сплошными треугольниками соответствует антикоагулянтной активности после введения Fab-фрагмента. Данные представлены в виде средних значений ± С.К.О., n=4 животных на группу обработки;
на фиг. 12 - измеренное ex vivo частичное активированное тромбопластиновое время (аРТТ) цельной крови, взятой у крыс, которым вводили дабигатран путем непрерывной инфузии и Fab-фрагмент, взятый в эквимолярном количестве, в виде болюсной инъекции в момент времени t=0. Линия со сплошными кружками соответствует обработке наполнителем без лекарственного средства. Линия со сплошными квадратами соответствует антикоагулянтной активности дабигатрана в отсутствие Fab-фрагмента. Линия со сплошными треугольниками соответствует антикоагулянтной активности после введения Fab-фрагмента. Данные представлены в виде средних значений ± С.К.О., n=4 животных на группу обработки;
на фиг. 13 - измеренное ex vivo тромбиновое время свертывания цельной крови (3,0 ед./мл тромбина), взятой у крыс, которым вводили дабигатран путем непрерывной инфузии и Fab-фрагмент в возрастающих дозах в виде болюсной инъекции в момент времени t=0. Линия со сплошными кружками соответствует обработке наполнителем без лекарственного средства. Линия со сплошными квадратами соответствует антикоагулянтной активности дабигатрана в отсутствие Fab-фрагмента. Линия со сплошными треугольниками соответствует антикоагулянтной активности после введения Fab-фрагмента в эквимолярном количестве, а штриховая линия - после введения Fab-фрагмента в количестве, составляющем 50% от эквимолярной дозы. Данные представлены в виде средних значений ± С.К.О., n=4 животных на группу обработки;
на фиг. 14 - измеренное ex vivo аРТТ цельной крови, взятой у крыс, которым вводили дабигатран путем непрерывной инфузии и Fab-фрагмент в возрастающих дозах в виде болюсной инъекции в момент времени t=0. Линия со сплошными кружками соответствует обработке наполнителем без лекарственного средства. Линия со сплошными квадратами соответствует антикоагулянтной активности дабигатрана в отсутствие Fab-фрагмента. Линия со сплошными треугольниками соответствует антикоагулянтной активности после введения Fab-фрагмента в эквимолярном количестве, а штриховая линия - после введения Fab-фрагмента в количестве, составляющем 50% от эквимолярной дозы. Данные представлены в виде средних значений ± С.К.О., n=4 животных на группу обработки.
Подробное описание изобретения
Одним из объектов настоящего изобретения является молекула антитела, обладающая способностью нейтрализовать активность антикоагулянта.
Антитела (которые называют также иммуноглобулинами, сокращенно Ig) представляют собой белки из класса гамма-глобулинов, которые присутствуют в крови или других жидкостях организма позвоночных, они используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов, таких как бактерии и вирусы. Как правило, они состоят из основных структурных элементов, каждый из которых содержит две большие тяжелые цепи и две небольшие легкие цепи, образующих, например, мономеры, включающие один элемент, димеры, включающие два элемента, или пентамеры, включающие пять элементов. Антитела могут связываться посредством нековалентного взаимодействия с другими молекулами или структурами, известными как антигены. Такое связывание является специфическим в том смысле, что антитело связывается с высокой аффинностью только с определенной структурой. Уникальный участок антигена, распознаваемый антителом, называют эпитопом или антигенной де
терминантой. Участок антитела, связывающийся с эпитопом, иногда называют паратопом, и он расположен в так называемом вариабельном домене или вариабельной области (Fv) антитела. Вариабельный домен содержит три так называемых гипервариабельных участка (CDR), разделенных каркасными участками (FR).
В контексте настоящего изобретения при упоминании CDR имеют в виду их определение, предложенное Хотиа (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, 1987, cc. 901-917), а также Кэботом (Е.А. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller и Н. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, изд-во National Institutes of Health, Bethesda, 1983).
Кроме того, в данной области были разработаны другие виды антител, которые стали универсальными "инструментами" в медицине и технологии. Так, в контексте настоящего изобретения понятия "молекула антитела" и "антитело" (в настоящем описании указанные понятия используются взаимозаменяемо) включают не только антитела, встречающиеся в естественных условиях, которые содержат, например, две легкие цепи и две тяжелые цепи, или только две тяжелые цепи, как в представителях верблюдо-вых, но также и все молекулы, содержащие по меньшей мере один паратоп, обладающий способностью специфически связываться с антигеном и структурным сходством с вариабельным доменом иммуноглобулина.
Так, молекула антитела, предлагаемая в изобретении, может представлять собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, фрагмент антитела, в частности, Fv-, Fab-, Fab'- или F(ab')2-фрагмент, одноцепочечное антитело, в частности, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), малое модульное иммунофармацевтическое средство (Small Modular Immunopharmaceutical, SMIP), доменное антитело, нанотело, димерное антитело.
Поликлональные антитела представляют собой совокупность молекул антител, имеющих различные аминокислотные последовательности, и их можно выделять из крови позвоночных после иммунизации антигеном с помощью хорошо известных в данной области методов.
Моноклональные антитела (МАт или МоАт) представляют собой моноспецифические антитела, имеющие идентичную аминокислотную последовательность. Их можно получать с помощью основанной на использовании гибридом технологии из гибридной клеточной линии (которую называют гибридо-мой), представляющей собой клон слияния продуцирующей специфическое антитело В-клетки с клеткой миеломы (В-клеточный рак) (Kohler G., Milstein С., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256, 1975, cc. 495-497). В альтернативном варианте моноклональные антитела можно создавать путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах (Norderhaug L., Olafsen Т., Michaelsen Т.Е., Sandlie I., "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells", J Immunol Methods 204 (1), май 1997, cc. 77-87; см. также ниже).
Для применения на человеке часто желательно снижать иммуногенность антител, имеющих происхождение из других видов, например, из мыши. Это можно осуществлять путем конструирования химерных антител или с помощью процесса, который называют "гуманизацией". В этом контексте под "химерным антителом" подразумевают антитело, которое содержит часть последовательности (например, вариабельный домен), выведенную из одного вида (например, из мыши), слитую с частью последовательности (например, с константными доменами), выведенной из других видов (например, из человека). Понятие "гуманизированное антитело" обозначает антитело, которое содержит вариабельный домен, первоначально выведенный из вида кроме человека, в котором определенные аминокислоты были подвергнуты мутации для того, чтобы вся последовательность указанного вариабельного домена стала более сходной с последовательностью человеческого вариабельного домена. Методы химеризации и методы гуманизации антител хорошо известны в данной области (Billetta R,. Lobuglio A.F., "Chimeric antibody", Int Rev Immunol., 10(2-3), 1993, cc. 165-176; Riechmann L., Clark M., Waldmann H., Winter G., "Reshaping human antibody for therapy", Nature, 332, 1988, с 323).
Кроме того, были разработаны технологии создания антител на основе последовательностей, выведенных из человеческого генома, например, с помощью фагового дисплея или с использованием трансгенных животных (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths и G. Winter, "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage", J.Mol.Biol., 222, 1991, cc. 581-597; Knappik и др., J. Mol. Biol. 296, 2000, cc. 57-86; S. Carmen и L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display", Briefings in Functional Genomics and Proteomics 1(2), 2002, cc. 189203; Lonberg N., Huszar D., "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995; 13(1), cc. 6593.; Bruggemann M., Taussig M.J. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice", Curr Opin Biotechnol., 8(4), август 1997 г., cc. 455-458). В контексте настоящего изобретения такие антитела рассматриваются как "человеческие антитела".
Молекулы антител, предлагаемые в настоящем изобретении, включают также фрагменты иммуноглобулинов, которые сохраняют способности связываться с антигеном, такие как Fab-, Fab'- или F(ab')2-фрагменты. Такие фрагменты можно получать путем фрагментации иммуноглобулинов, например, посредством протеолитического расщепления, или путем рекомбинантной экспрессии таких фрагментов. Например, расщепление иммуноглобулинов можно осуществлять с помощью стандартных методов, например, с использованием папаина или пепсина (WO 94/29348), или эндопротеиназы Lys-C (Kleemann и
др., Anal. Chem. 80, 2001-2009, 2008). Расщепление антитела с помощью папаина или Lys-C, как правило, приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, так называемых Fab-фрагментов, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и остаточного Fc-фрагмента. Обработка пепсином приводит к получению F(ab')2. Методы получения молекул Fab посредством реком-бинантной экспрессии в клетках-хозяевах описаны более подробно ниже.
Был разработан целый ряд технологий встраивания вариабельных доменов иммуноглобулинов или молекул, выведенных из таких вариабельных доменов, в различные молекулярные конструкции. В контексте настоящего изобретения их также следует рассматривать как "молекулы антител". В целом, такие молекулы антител имеют меньший размер по сравнению с иммуноглобулинами, и они могут содержать одну аминокислотную цепь или могут состоять из нескольких аминокислотных цепей. Например, одно-цепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет собой слияние вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, которые связаны друг с другом посредством короткого линкера, как правило, серина (S) или глицина (G) (WO 88/01649; WO 91/17271; Huston и др., International Reviews of Immunology, том 10, 1993, cc. 195-217). "Однодоменные антитела" или "нанотела" несут антигенсвязывающий сайт в одном Ig-подобном домене (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward и др., Nature, 341(6242), 12 октября 1989 г., cc. 544-546; Revets и др., Expert Opin Biol Ther. 5(1), 2005, cc. 111-124). Можно объединять вместе одно или несколько однодоменных антител, обладающих специфичностью в отношении связывания одного и того же антигена или различных антигеном. Димерные антитела представляют собой двухвалентные молекулы антител, которые состоят из двух аминокислотных цепей, содержащих два вариабельных домена (WO 94/13804, Holliger и др., Proc Natl Acad Sci USA., 90(14), 15 июля 1993 г., cc. 6444-6448). Другими примерами антитело-подобных молекул являются антитела из суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF; Srinivasan и Roeske, Current Protein Pept. Sci., 6(2), 2005, cc. 185-196). Другая концепция приводит к получению так называемых малых модульных фармацевтических средств (SMIP), которые содержат Fv-домен, связанный с одноцепочечными шарнирным и эффекторным доменами, без константного домена CHI (WO 02/056910).
Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела, предлагаемая в изобретении, может иметь лишь отдаленное структурное сходство с вариабельных доменом иммуноглобулина или совсем не иметь такого сходства, но при этом обладать определенной специфичностью и аффинностью связывания, сопоставимыми с соответствующими характеристиками вариабельного домена иммуноглобулина. Такие неиммуноглобулиновые "миметики антитела", которые иногда называют "каркасными белками", могут быть основаны на генах белка А, липокалинах, домене фибронектина, домене консенсусного анкирино-вого повтора и тиоредоксине (Skerra, Current Opinion in Biotechnology, 18(4), 2007, cc. 295-304). В контексте настоящего изобретения предпочтительными являются сконструированные белки с анкириновым повтором (DARPin; Steiner и др., J Mol Biol., 382(5), 24 октября 2008 г., cc. 1211-1227; Stumpp M.T., Am-stutz P., Curr Opin Drug Discov Devel., 10(2), март 2007 г., cc. 153-159).
Молекула антитела может быть слита (в виде слитого белка) или иным образом связана (посредством ковалентных или нековалентных связей) с другими молекулярными конструкциями, которые оказывают требуемое воздействие на свойства молекулы антитела. Например, может оказаться желательным улучшать фармакокинетические свойства молекул антитела, стабильность, например, в общей воде организма, такой как кровь, прежде всего, в случае одноцепочечных антител или доменных антител. Для этой цели был разработан целый ряд технологий, предназначенных, в частности, для удлинения времени полужизни таких молекул антител в кровотоке, например, пэгилирование (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), слияние или в другом варианте ковалентное присоединение молекулы антитела к другой молекуле антитела, обладающей аффинностью к сывороточному белку, такому как альбумин (WO 2004041865; WO 2004003019), или экспрессия молекулы антитела в виде слитого белка, включающего целиком сывороточный белок, такой как альбумин или трансферрин, или его часть (WO 01/79258).
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела обладает способностью специфически связываться с антикоагулянтом. Понятие "специфичность связывания" обозначает, что молекула антитела обладает существенно большей аффинностью к связыванию с антикоагулянтом, чем со структурно неродственными молекулами.
Аффинность представляет собой характеристику взаимодействия между одним антигенсвязываю-щим сайтом на молекуле антитела и одним эпитопом. Ее выражают в виде константы ассоциации KA = kass/kdiss, или константы диссоциации KD = kdiss/kass.
Согласно одному из объектов изобретения аффинность связывания антитела с антикоагулянтом, которую определяют, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics", Curr Opin Immunol., 5(2), апрель 1993 г., cc. 282-286), характеризуется величиной KD, составляющей от 0,1 пМ до 100 мкМ, предпочтительно от 1 пМ до 100 мкМ, предпочтительно от 1 пМ до 1 мкМ. Аффинность антитела можно оценивать также с помощью кинетического анализа исключения (Kinetic Exclusion Assay, KinExA, см. Darling R.J. и Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions", ASSAY and Drug Development Technologies, 2(6), декабрь 2004 г., cc. 647-657).
Аффинность связывания молекулы антитела можно повышать с помощью процесса, известного как
созревание аффинности (Marks и др., Biotechnology 10, 1992, cc. 779-783; Barbas и др., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994, cc. 3809-3813; Shier и др., Gene 169, 1995, cc. 147-155). Антитела с созревшей аффинностью также подпадают под объем настоящего изобретения.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела обладает способностью нейтрализовать активность антикоагулянта. Это означает, что после связывания с молекулой антитела антикоагулянт утрачивает способность проявлять свою антикоагулянтную активность или проявляет указанную активность в значительно меньшей степени. Предпочтительно после связывания с антителом антикоагу-лянтная активность снижается по меньшей мере в 2, 5, 10 или 100 раз по данным анализа активности, пригодного для конкретного антикоагулянта, прежде всего анализа свертываемости, чувствительного к тромбину, такого как анализ экаринового времени свертывания или тромбинового времени свертывания (Н. Bounameaux, Marbet G.A., Lammle В. и др., "Monitoring of heparin treatment. Comparison thrombin time, ща activated partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behavior of anti-thrombin III". American Journal of Clinical Pathology, 74(1), 1980, cc. 68-72).
Для получения молекул антител, предлагаемых в изобретении, специалист в данной области может выбрать любой из целого ряда методов, известных в данной области (Norderhaug и др., J Immunol Methods, 204 (1), 1997, cc. 77-87; Kipriyanow и Le Gall, Molecular Biotechnology 26, 2004, cc. 39-60; Shukla и др., J. Chromatography B, 848(1), 2007, cc. 28-39).
Как указано выше, антикоагулянты хорошо известны в данной области. Согласно еще одному объекту изобретения антикоагулянт представляет собой прямой ингибитор тромбина, ингибитор фактора Ха или антагониста витамина К. Примерами антагонистов витамина К являются кумарины, к которым относится варфарин. Примерами непрямых ингибиторов преимущественно фактора Ха являются субстанции гепариновой группы, которые оказывают свое действие посредством активации антитромбина III, они включают ряд низкомолекулярных гепариновых производных (бемипарин, сертопарин, далтепарин, эноксапарин, надропарин, парнапарин, ревипарин, тинзапарин), определенные олигосахариды (фондапа-ринукс, идрапаринукс), гепариноиды (данапароид, сулодексид, дерматан сульфат) и прямые ингибиторы фактора Ха (апиксабан, отамиксабан, ривароксабан). Примерами ингибиторов тромбина являются двухвалентные гирудины (бивалирудин, лепирудин, дезирудин) и одновалентные соединения аргатробан и дабигатран.
Так, согласно следующему объекту изобретения антикоагулянт представляет собой дабигатран, ар-гатробан, мелагатран, ксимелагатран, гирудин, бивалирудин, лепирудин, дезирудин, апиксабан, эдокса-бан, отамиксабан, ривароксабан, дефибротид, раматробан, антитромбин III или дротрекогин альфа.
В следующем варианте осуществления изобретения антикоагулянт представляет собой дизамещен-ный бициклический гетероцикл общей формулы
R_ - А - Het - В - Ar - Е ,(I)
в которой
А обозначает карбонильную или сульфонильную группу, связанную с бензогруппой, пиридогруп-пой или тиеногруппой группы Het,
В обозначает этиленовую группу, в которой метиленовая группа, связанная с группой Ar, может быть замещена атомом кислорода или серы или -№^-группой, в которой
R1 обозначает атом водорода или С1-С4алкильную группу,
Е обозначает RbNH-C(=NH)-группу, в которой
Rb обозначает атом водорода, гидроксигруппу, С1-С9алкоксикарбонильную, циклогексилоксикарбо-нильную, фенил-С1-С3алкоксикарбонильную, бензоильную, пара-C1-С3алкилбензоильную или пириди-ноильную группу, при этом этоксигруппа в положении 2 в указанной выше С1-С9алкоксикарбонильной группе может быть дополнительно замещена С1-С3алкилсульфонильной или 2-(С1-С3алкокси)этильной группой,
Ar обозначает а 1,4-фениленовую группу, необязательно замещенную атомом хлора или метилом, этилом или метоксигруппой, или обозначает 2,5-тиениленовую группу,
Het обозначает 1-(С1-С3алкил)-2,5-бензимидазолиленовую, 1-циклопропил-2,5-бензимидазолилено-вую, 2,5-бензотиазолиленовую, 1-(С1-С3алкил)-2,5-индолиленовую, ^(Сг^алкил^^-имидазо^^-^пи-ридиниленовую, 3-(C1-С3алкил)-2,7-имидазо[1,2-а]пиридиниленовую или 1-(С1-С3алкил)-2,5-тиено[2,3-d]имидазолиленовую группу и
Ra обозначает R^NR^-группу, в которой
R2 обозначает С1-С4алкильную группу, которая может быть замещена карбоксигруппой, C1-С6алкилоксикарбонильной, бензилоксикарбонильной, C1-С3алкилсульфониламинокарбонильной или 1Н-тетразол-5-ильной группой,
С2-С2алкильную группу, замещенную гидроксигруппой, бензилоксигруппой, карбокси-Cr С3алкиламиногруппой, С1-С3алкоксикарбонил-С1-С3алкиламиногруппой, N-(C1-С3алкил)карбокси-С1-С3алкиламиногруппой или ^(Сг^алкил^Сг^алкоксикарбонил-СгС^лкиламиногруппой, при этом в вышеуказанных группах атом углерода в а-положении по отношению к соседнему атому азота может быть незамещенным,
R3 обозначает С3-С7циклоалкильную группу, пропаргильную группу, в которой ненасыщенный фрагмент может быть не связан непосредственно с атомом азота R2NR3-группы, фенильную группу, необязательно замещенную атомом фтора или хлора, или метильной или метоксигруппой, пиразолильную, пиридазолильную или пиридинильную группу, необязательно замещенную метильной группой, или
R2 и R3 вместе с атомом азота, находящимся между ними, обозначают 5-7-членную циклоалкиле-ниминогруппу, необязательно замещенную карбоксигруппу или С1-С4алкоксикарбонильную группу, с которой дополнительно может быть слито фенильное кольцо,
его таутомеры, стереоизомеры и соли. Соединения формулы (I), их получение и применение в качестве антикоагулянтов описано в WO 98/37075.
В следующем варианте осуществления изобретения антикоагулянт представляет собой соединение, выбранное из группы, включающей
(а) Н-фенил-М-(2-карбоксиэтил)амид 2-[N-(4-
амидинофенил)аминометил]бензтиазол-5-карбоновой кислоты,
(б) Ы-фенил-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 2-[М-(4-амидинофенил)-М-
метиламинометил]бензтиазол-5-илкарбоновой кислоты,
(в) Ы-фенил-Ь1-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(г) К-фенил-Ы-(3-гидроксикарбонилпропил)амид 1-метил-2-[]М-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(д) Ы-(2-пири дил)-М-(гидроксикарбонилметил)амид 1 -метил-2- [N-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(е) М-(2-пиридил)-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[2-(2-
амидинотиофен-5-ил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ж) М-(2-пиридил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[N-(4-
амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(з) М-(2-пиридил)-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[2-(4-
амидинофенил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(и) К-фенил-г\1-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[2-(4-
амидинофенил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(к) М-фенил-Ы-[2-(1Н-тетразол-5-ил)этил]амид 1-метил-2-[2-(4-амидинофенил)этил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(л) Ы-фенил-Ы-[2-(1Н-тетразол-5-ил)этил]амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(м) Ы-(2-пиридил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2- [N-(4-амидинофенил)-Г <1-метиламинометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(н) М-(3-пиридил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)-М-метиламинометил] бензимидазол-5 -илкарбоновой кислоты,
(о) М-фенил-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[]Ч-(4-амидинофенил)-К-метиламинометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(п) М-фенил-Н-[(Ы-гидроксикарбонилэтил-Ы-метил)-2-аминоэтил]амид 1 -метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(р) Ы-(3-фторфенил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[N-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
с) Ы-(4-фторфенил)-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(т) М-фенил-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидино-2-метоксифенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(у) Н-(2-пиридил)-М-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[Ы-(4-амидино-2-метоксифенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ф) М-фенил-М-(2-метоксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Н-(4-амидинофенил)аминометил]индол-5-илкарбоновой кислоты,
(х) М-фенил-Ы-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[Ы-(4-амидинофенил)аминометил]тиено[2.3-о!]имидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ц) М-фенил-1Ч-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1-метил-2-[N-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ч) ^(2-пиридил)-К-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-^-(4-амидинофенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(ш) Ы-(2-пиридил)-1Ч-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[N-(4-амидино-2-метоксифенил)аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты,
(щ) N-(2-пиpидил)-N-(2-этoкcикapбoнилэтил)aмид 1 -метия-2-[Ы-[4-(Ы-п-гексилоксикарбониламидино)фенил]аминометил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты и
их таутомеры, стереоизомеры и соли, которые все описаны в WO 98/37075.
В контексте настоящего изобретения предпочтительным антикоагулянтом является дабигатран (CAS 211914-51-1, N-[2-(4-амидинофениламинометил)-1-метил-1H-бензимидазол-5-илкарбонил]-N-(2-пиридил)бета-аланин), имеющий химическую формулу (II)
Дабигатран описан в WO 98/37075, в которой заявлены соединения, обладающие ингибирующим действием в отношении тромбина и действием, приводящим к увеличению тромбинового времени, под названием ^(2-пиридил)^-(2-гидроксикарбонилэтил)амид 1 -метил-2-[^-(4-амидинофенил)аминоме-тил]бензимидазол-5-илкарбоновой кислоты (см. также Hauel и др., J Med Chem, 45 (9), 2002, cc. 17571766.
Дабигатран применяют в виде пролекарства формулы (III)
Соединение формулы III (которое называют дабигатрана этексилатом, CAS 211915-06-9; этил-3-[(2-{[4-(гексилоксикарбониламиноиминометил)фениламино]метил}-1 -метил-1 Н-бензимидазол-5-карбо-нил)пиридин-2-иламино]пропионат) превращается в активное соединение (II) после поступления в организм. Предпочтительным полиморфом дабигатрана этексилата является мезилат дабигатрана этексилата.
Основными показаниями для применения дабигатрана являются постоперационное предупреждение тромбоза глубоких вен, лечение развитого тромбоза глубоких вен и предупреждение "ударов" у пациентов, страдающих мерцательной аритмией (Eriksson и др., Lancet, 370 (9591), 2007, cc. 949-956; Schulman S. и др., N Engl J Med, 361 (24), 2009, cc. 2342-2352; Connolly S. и др., N Engl J Med, 361 (12), 2009, cc. 1139-1151; Wallentin и др., Lancet, 376 (9745), 2010, cc. 975-983).
В организме человека основным характерным для человека путем метаболизма дабигатрана является глюкуронирование карбоксилатного фрагмента (Ebner и др., Drug Metab. Dispos., 38(9), 2010, cc. 15671575). Она приводит к образованию 1-О-ацилглюкуронида (бета-аномер). 1-О-ацилглюкуронид помимо того, что он в небольших количествах превращается в результате гидролиза в агликон, может подвергаться ацильной миграции в результате неферментативной реакции в водном растворе, в результате чего происходит образование 2-О-, 3-О- и 4-О-ацилглюкуронидов. Эксперименты с очищенным 1-О-ацилглю-куронидом и его полученными путем перегруппировки изомерными производными позволили установить, что они вызывают примерно одинаковое удлинение частичного активированного тромбопластино-вого времени по сравнению с удлинением, вызываемым дабигатраном.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела связывается и с дабигатраном и с дабигатрана этексилатом.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела связывается и с дабигатраном и с О-ацилглюкуронидами дабигатрана, прежде всего с 1 -О-ацилглюкуронидом дабигатрана.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела связывается также и с 2-О-, 3-O- и 4-O-ацилглюкуронидами дабигатрана.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела обладает способностью нейтрализовать активность дабигатрана и О-ацилглюкуронидов дабигатрана, прежде всего 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела молекула обладает способностью специфически связываться с дабигатраном и содержит последовательности CDR, представленные на фиг. 5 и 6.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность CDR тяжелой цепи, представленную на фиг. 5, и последовательность CDR легкой цепи, представленную на фиг. 6.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением DBG 13 VH, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением DBG 13
VK.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением DBG 14 VH, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением DBG 14
VK.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением DBG 22 VH, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением DBG 22
VK.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением Eng VH № 14, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением Eng VK
№ 11.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением Eng VH № 15, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением Eng VK
№ 17.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением Eng VH № 15, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением Eng VK
№ 18.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 под обозначением Eng VH № 31, и последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 6 под обозначением Eng VK
№ 18.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела обладает способностью специфически связываться с дабигатраном и содержит вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и CDR3 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2 имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область
тяжелой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 и 26, вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25 и 27.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 17.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 19.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 21.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 22, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 23.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 25.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 27.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 27.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела представляет собой молекулу scFv. В молекуле этого формата вариабельные области, заявленные в настоящем описании, могут быть слиты друг с другом с помощью пригодного линкерного пептида, например, имеющего последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 28, 29, 30 и 31. Конструкция может содержать указанные элементы, расположенные в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: (вариабельная область тяжелой цепи)-(линкерный пептид)-(вариабельная область легкой цепи), или (вариабельная область легкой цепи)-(линкерный пептид)-(вариабельная область тяжелой цепи).
Согласно другому объекту изобретения молекула антитела представляет собой молекулу scFv, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33. Согласно другому объекту изобретения молекула антитела представляет собой молекулу scFv, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.
В данной области известны методы, с помощью которых можно осуществлять рекомбинантную экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих scFv-конструкции, в клетках-хозяевах (таких как клетки Е. coli, Pichia pastoris или линии клеток млекопитающих, например, СНО или NS0), с получением функциональных молекул scFv (см., например, Rippmann и др., Applied and Environmental Microbiology, 64(12), 1998, cc. 4862-4869; Yamawaki и др., J. Biosci. Bioeng., 104(5), 2007, cc. 403-407; Sonoda и др., Protein Expr. Purif., 70(2), 2010, cc. 248-253).
В частности, предлагаемые в изобретении молекулы антитела в формате scFv можно получать следующим образом. Можно осуществлять экспрессию конструкций в различных штаммах Е. coli, таких как W3110, TG1, BL21, BL21(DE3), HMS174, HMS174(DE3), MM294, под контролем индуцибельного промотора. Такой промотор можно выбирать из группы, включающей lacUV5, tac, T7, trp, trc, T5, araB. Предпочтительными средами для культивирования являются среды, подробно описанные у Wilms с соавторами, 2001 (Wilms и др., Biotechnology and Bioengineering, 73(2), 2001, cc. 95-103), DeLisa с соавторами, 1999 (DeLisa и др., Biotechnology and Bioengineering, 65(1), 1999, cc. 54-64), или эквивалентные им среды. Однако может оказаться целесообразным вносить в партии среды и/или в подпитывающую среду добавки в виде аминокислот, таких как изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин, или сложные компоненты среды, такие как соевый пептон или дрожжевой экстракт. Процесс ферментации осуществляют в режиме периодического действия с подпиткой. Условия: температура 20-40°С, рН 5,5-7,5, DO поддерживают на уровне выше 20%. После поглощения исходного источника углерода культуру подпитывают указанными выше подпитывающими средами (или эквивалентными средами). Когда концентрация сухой клеточной массы в ферментере достигает 40-100 г/л, культуру индуцируют с помощью пригодного индуктора, соответствующего используемой системе промоторов (например, ИПТГ, лактоза, арабиноза). Индукцию можно осуществлять либо в виде импульсной полной индукции, либо в виде частичной индукции, подпитывая ферментер соответствующим индуктором в течение продолжительно периода времени, либо можно использовать комбинацию обоих подходов. Фаза производства должна продолжаться в течение по меньшей мере 4 ч. Клетки выделяют центрифугированием с использованием роторных центрифуг, трубчатых роторных центрифуг или центрифуг с коническими перегородками в роторе, клеточный супернатант отбрасывают.
Клеточную массу Е. coli ресуспендируют во взятом в 4-8-кратном количестве буфере для лизиса (фосфатный или Трис-буфер, рН 7-8,5). Лизис клеток предпочтительно осуществляют путем гомогенизации при повышенном давлении, после чего дебрис выделяют центрифугированием с использованием роторных центрифуг, трубчатых роторных центрифуг или центрифуг с коническими перегородками в роторе. Дебрис, включающий содержащие scFv тельца включения, отмывают 2-3 раза с помощью 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТК, 2М мочевины, 0,5% Тритон Х-100, рН 8,0, после чего осуществляют две стадии отмывки с помощью 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТК, рН 8,0. В завершение выделяют содержащие scFv тельца включения путем центрифугирования с использованием роторных, трубчатых роторных центрифуг или центрифуг с коническими перегородками в роторе. Солюбилизацию содержащих scFv телец включения можно осуществлять в смеси, содержащей 100мМ глицин/NaOH, 5мМ ЭДТК, 20мМ дитиотреитол, рН 9,5-10,5, которая включает хаотропные агенты, такие как 6М гуанидин-HCl или 8-10мМ мочевина. После инкубации в течение 30-60 мин раствор центрифугируют и выделяют суперна-тант, содержащий целевой белок, для осуществления последующего рефолдинга. Рефолдинг предпочтительно осуществляют в режиме периодической загрузки с подпиткой путем разведения раствора белка в соотношении 1:10-1:50 в буфере для рефолдинга до достижения конечной концентрации белка, составляющей 0,1-0,5 мг/мл. Буфер для рефолдинга может содержать 50-100 мМ Трис и/или 50-100 мМ глицин, 50-150 мМ NaCl, 1-3M мочевину, 0,5-1М аргинин, 2-6 мМ редокс-систему, такую, например, как пара цистеин/цистин или окисленный/восстановленный глутатион, рН 9,5-10,5. После инкубации в течение 24-72 ч при 4°С раствор для рефолдинга необязательно фильтруют с использованием 0,22 мкм фильтра, разводят и доводят значение рН до рН 7,0-8,0. Белок выделяют с помощью катионообменной хроматографии в режиме связывания (например, с использованием Toyopearl GigaCap S-650M, SP сефарозы FF или S HyperCel(tm)) при рН 7,0-8,5. Элюцию осуществляют с использованием линейно возрастающего градиента NaCl. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и затем разделяют на анионообменной колонке в несвязывающем режиме (например, с использованием Toyopearl GigaCap Q-650М, Q-сефарозы FF, Q HyperCel(tm)), после чего осуществляют стадию катионообменной доочистки (полировки) (например, с использованием SP сефарозы HP). Фракции, которые содержат целевой белок с уровнем чистоты, составляющим как минимум 90%, объединяют и подвергают диафильтрации или гель-фильтрации в ЗФР. Идентичность и качество продукта, представляющего собой полученную молекулу scFv, анализируют с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, при этом scFv можно обнаруживать в основной полосе, соответствующей примерно 26 кДа. Дополнительный анализ с целью характеризации scFv можно осуществлять с помощью масс-спектрометрии, ОФ-ЖХВР и ГФ-ЖХВР.
Согласно следующему объекту изобретения молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, предпочтительно иммуноглобулин изотипа IgG1 или его вариант с "выключенной" эффекторной функцией, или изотипа IgG4. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, тяжелая цепь которого содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 42, и легкая цепь содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 43.
Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, тяжелая цепь которого содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и легкая цепь содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, или тяжелая цепь содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и легкая цепь содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, тяжелая цепь которого содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, и легкая цепь содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43.
Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, тяжелая цепь которого состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 34, и легкая цепь состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35, или тяжелая цепь состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40, и легкая цепь состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет собой иммуноглобулин, тяжелая цепь которого состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 42, и легкая цепь состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43.
Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab. В конструкции такого формата каждая из описанных выше вариабельных областей может быть слита с константной областью иммуноглобулина, предпочтительно человеческого происхождения. Так, вариабельная область тяжелой цепи может быть слита с QH^-доменом (так называемый Fd-фрагмент), а вариабельная область легкой цепи может быть слита с CL-доменом.
Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющую Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющий Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, и
легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющий Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющий Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющий Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, и легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющий Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39. Согласно еще одному объекту изобретения молекула антитела представляет молекулу Fab, имеющий Fd-фрагмент, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, которая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие Fab-конструкции, можно применять для экспрессии как тяжелых, так и легких цепей в клетках-хозяевах, таких как клетки Е. coli, Pichia pastoris или линии клеток млекопитающих (например, СНО или NS0). В данной области известны методы, позволяющие осуществлять правильную укладку, ассоциацию и дисульфидное связывание указанных цепей с получением функциональных Fab-молекул, содержащих Fd-фрагмент и легкую цепь (Burtet и др., J. Biochem., 142(6), 2007, cc. 665-669; Ning и др., Biochem. Mol. Biol., 38, 2005, cc. 204-299; Quintero-Hernandez и др., Mol. Immunol., 44, 2007, cc. 1307-1315; Willems и др., J. Chromatogr. В. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,786,
2003, cc. 161-176).
В частности, Fab-молекулы, предлагаемые в изобретении, можно получать в СНО-клетках следующим образом. СНО-DG44-клетки (Urlaub G., Kas E., Carothers A.M. и Chasin L.A., Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells, Cell 33, 1983, cc. 405-412), выращенные в виде суспензионной культуры в бессывороточной среде, трансфектируют экспрессионными конструкциями, кодирующими тяжелую и легкую цепи Fab-молекулы, с использованием реагента Lipofectamine(tm) и Plus(tm) (фирма Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Через 48 ч осуществляют селекцию клеток в среде, содержащей антибиотик G418 в концентрации 200 мкг/мл и не содержащей гипоксантин и тимидин, получая популяции стабильно трансфектированных клеток. Затем осуществляют амплификацию генов указанных стабильных трансфектантов путем добавления в культуральную среду метотрекса-та (МТХ) в возрастающих концентрациях (вплоть до 100 или 400 нМ).
После адаптации клеток их подвергают ферментации в режиме периодического процесса с подпиткой в течение 10-11 дней, в результате чего получают белковый продукт в формате Fab.
Суспензионные культуры СНО-DG44-клеток и их стабильные трансфектанты инкубируют в имеющих определенный химический состав бессывороточных средах для культивирования. Осуществляют пересев затравочных маточных культур через каждые 2-3 дня с плотностями посева, составляющими 3х105-2 х105 клеток/мл соответственно. Клетки выращивают во встряхиваемых колбах в инкубаторах типа Multitron HT (фирма Infors) в атмосфере, содержащей 5% СО2, при 37°С и 120 об/мин.
Для экспериментов, проводимых в режиме периодического процесса с подпиткой, клетки высевают в концентрации 3 х 105 клеток/мл во встряхиваемые колбы в являющуюся собственностью фирмы BI среду для получения продукта, не содержащую антибиотики или МТХ. Культуры перемешивают при 120 об/мин при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2, затем по мере увеличения количества клеток его концентрацию снижают до 2%. Параметры культуры, включающие количество клеток, жизнеспособность, значение рН, концентрации глюкозы и лактата, определяют ежедневно и при необходимости регулируют с помощью карбоната значение рН, поддерживая его на уровне рН 7,0. Через каждые 24 ч добавляют подпитывающий раствор, являющийся собственностью фирмы BI. В различные моменты времени берут образцы супернатанта для определения методом ELISA концентрации продукта, представляющего собой Fab. Через 10-11 дней содержащую клеточную культуру жидкость собирают центрифугированием и передают в лаборатории, занимающиеся очисткой.
Fab-молекулу очищают от супернатанта культур, выращенных в режиме периодического процесса с подпиткой, с помощью хроматографии и фильтрации. В качестве первичной захватывающей стадии применяют аффинную хроматографию, например, на белке G или белке L. В альтернативном варианте, в случае низких аффинностей связывания и небольших масштабов производства, захват Fab осуществляют с помощью катионообменной хроматографии (СЕХ) на основе величины pI молекулы. Белки, происходящие из клеток-хозяев, и примеси, например, ДНК или вирусы, удаляют с помощью дополнительных ортогональных стадий очистки.
Идентичность и качество продукта, представляющего собой полученную Fab-молекулу, анализируют с помощью электрофоретических методов, например, ДСН-ПААГ, с помощью которых Fab можно обнаруживать в виде одной основной полосы, соответствующей примерно 50 кДа. Другими методами
анализа, которые можно применять для характеризации продукта, представляющего собой Fab, могут служить масс-спектрометрия, изоэлектрическое фокусирование и гель-фильтрация. Связывающую активность определяют с помощью BIAcore-анализа.
Количественное определение Fab или полноразмерных молекул IgG в супернатанте клеточных культур осуществляют с помощью сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ELI-SA). Полноразмерный IgG можно обнаруживать с использованием антител к человеческому Fc-фрагменту (фирма Jackson Immuno Research Laboratories) и к человеческой легкой каппа-цепи (конъюги-рованных с пероксидазой, фирма Sigma). Fab-фрагмент иммобилизуют с помощью козьего поликлональ-ного антитела к человеческому IgG (H и L, фирма Novus) и обнаруживают с помощью овечьих поликло-нальных антител к человеческому IgG (конъюгированных с пероксидазой, фирма The Binding Site).
Fab-молекулы можно создавать также из полноразмерных молекул антител путем ферментативного расщепления. Преимущество такого подхода заключается в том, что в этом случае можно применять процессы надежной и эффективной ферментации и очистки, которые служат пригодной платформой для повышения масштаба производства и достижения высоких выходов при требуемом качестве продукта. Для очистки можно применять аффинную хроматографию с использованием содержащей рекомбинант-ный белок А смолы в качестве первичной захватывающей стадии, которая, как правило, позволяет достигать высокой степени чистоты.
Для этой цели кодирующие тяжелую цепь Fab последовательности сливают с Fc-областью молекулы человеческого антитела в виде IgG. Затем образовавшимися экспрессионными конструкциями транс-фектируют СНО-DG44-клетки, выращиваемые в виде суспензионной культуры в бессывороточной среде, с помощью липофекции. Через 48 ч осуществляют селекцию клеток в среде, содержащей антибиотик G418 в концентрации 200 мкг/мл, и не содержащей гипоксантин и тимидин, в результате чего получают популяции стабильно трансфектированных клеток. Затем осуществляют амплификацию генов указанных стабильных трансфектантов путем добавления в культуральную среду метотрексата (МТХ) в возрастающих концентрациях (вплоть до 100 или 400 нМ). После адаптации клеток их подвергают ферментации в режиме периодического процесса с подпиткой в течение 10-11 дней, в результате чего получают белковый продукт в формате IgG.
Белок IgG очищают из супернатанта культуры с помощью аффинной хроматографии с использованием рекомбинантного белка А. Затем для получения требуемого обладающего нейтрализующей способностью Fab-фрагмента осуществляют инкубацию полноразмерного IgG в присутствии папаина, который расщепляет IgG в шарнирной области, в результате чего высвобождаются два Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Примером Fab-молекулы, которую можно получать путем расщепления папаином полноразмерного белка IgG, может служить Fab-молекула, содержащая Fd-цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 41.
Fab-молекулу выделяют с помощью аффинной хроматографии, например, с использованием белка G или белка L. В альтернативном варианте, в случае низких аффинностей связывания и небольших масштабов производства, захват Fab осуществляют с помощью катионообменной хроматографии (СЕХ) на основе величины pI молекулы. Белки, происходящие из клеток-хозяев, и примеси, например, папаин, ДНК или вирусы, удаляют с помощью дополнительных ортогональных стадий очистки.
Согласно другому объекту изобретения молекула антитела представляет собой вариант указанной в настоящем описании молекулы антитела с измененной аминокислотной последовательностью.
Варианты антител с измененной аминокислотной последовательностью можно получать путем осуществления соответствующих изменений нуклеотидов в ДНК антитела или путем пептидного синтеза. Такие варианты получают, например, удаляя путем делеции и/или встраивая путем инсерции, и/или заменяя остатки в аминокислотных последовательностях антител, которые представлены в примерах, приведенных в настоящем описании. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любую комбинацию делеций, инсерций и замен при том условии, что конечная конструкция будет обладать требуемыми характеристиками. Аминокислотные изменения могут приводить также к изменению посттрансляционных процессов, которым подвергается гуманизированное антитело или вариант антитела, например, к изменению количества или положения сайтов гликозилирования.
Пригодным методом идентификации конкретных остатков или областей антитела, которые находятся в предпочтительных с точки зрения осуществления мутагенеза положениях, является метод, который называют "мутагенезом на основе сканирования аланином", описанный у Cunningham и Wells (Science, 244, 1989, cc. 1081-1085). Согласно этому методу идентифицируют целевой остаток или группу целевых остатков (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют на нейтральную или несущую отрицательный заряд аминокислоту (как правило, на аланин) для того, чтобы оказать воздействие на взаимодействие аминокислот с антигеном. Затем уточняют положения аминокислот, для которых выявлена функциональная чувствительность к заменам, путем введения дополнительных или других вариантов в сайты, в которых осуществляли замены, или перед ними. При этом, хотя сайт, предназначенный для осуществления интродукции вариации аминокислотной последовательности, определен заранее, сама по себе природа мутации не должна быть заранее определенной. Например, для того, чтобы проанализировать влияние мутации в конкретном сайте, осуществляют аланин
сканирующий или случайный (неспецифический) мутагенез в целевом кодоне или целевой области и проводят скрининг экспрессированных вариантов антитела в отношении требуемой активности.
Инсерций в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, длина которых может составлять от одного остатка до полипептида, содержащего сто или большее количество остатков, а также инсерций одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примерами концевых инсерций являются слияния антитела с эпитопной меткой. К другим полученным путем инсерций вариантам молекулы антитела относятся варианты, полученные путем слияния с N- или С-концом антитела фермента или полипептида, увеличивающего время полужизни антитела в сыворотке.
Другим типом варианта является вариант, полученный путем аминокислотной замены. Для получения таких вариантов удаляют по меньшей мере один аминокислотный остаток из молекулы антитела и на его место встраивают другой остаток. К сайтам, представляющим наибольший интерес с точки зрения основанного на замене мутагенеза относятся гипервариабельные участки, но можно рассматривать также изменения в FR. В представленной ниже таблице под заголовком "Предпочтительные замены" приведены консервативные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно интродуцировать более существенные замены, которые перечислены под заголовком "Примеры замен" или более подробно описаны ниже со ссылкой на классы аминокислот, и осуществлять скрининг полученных продуктов.
Исходный остаток Примеры замен Предпочтительные замены
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gin; asn lys
Asn (N) gin; his; asp, lys; arg gin
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gin (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gin asp
Gly (G) ala ala
His (H) arg; asn; gin; lys; arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; норлейцин leu
Leu (L) ile; норлейцин; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gin; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) tyr; leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) phe;trp; thr; ser phe
Val (V) leu; ile; met; phe ala; норлейцин; leu
В химии белков является общепризнанным, что биологические свойства антитела можно усовершенствовать путем выбора замен, которые существенно различаются по своему воздействию на поддержание (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, плоской или спиральной кон-формации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени, или (в) размера боковой цепи. Встречающиеся в естественных условиях остатки подразделяют на группы на основе общих свойств их боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;
(3) кислотные: asp, glu;
(4) основные: asn, gin, his, lys, arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и
(6) ароматические: trp, tyr, phe.
Неконсервативные замены представляют собой замену представителя одного из указанных классов на представителя другого класса.
Любой остаток цистеина, который не участвует в поддержании правильной конформации гуманизированного антитела или варианта антитела, также можно заменять, как правило на серии, для улучшения устойчивости молекулы к окислению, предупреждения аномального перекрестного сшивания или для обеспечения общепринятых сайтов конъюгации с цитотоксическим или цитостатическим соединением. И наоборот, цистеиновую(ые) связь(и) можно вводить в антитело для улучшения его стабильности (прежде всего в том случае, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv
фрагмент).
Одним из типов варианта, полученного в результате замены, является вариант, в котором заменены один или несколько гипервариабельных участков родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, выбранный(е) для дальнейшего усовершенствования вари-ант(ы), полученный(е) таким путем, должен(ны) обладать улучшенными биологическими свойствами по сравнению с родительским антителом, на основе которого они созданы. Удобным подходом к созданию таких полученных путем замены вариантов является метод созревания аффинности, основанный на использовании фагового дисплея. В целом метод заключается в следующем: несколько сайтов в гипервариабельных участках (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации, осуществляя все возможные аминокислотные замены в каждом сайте. Созданные таким образом варианты антитела экспонируют методом одновалентного дисплея на частицах нитчатого фага в виде слияния с продуктом гена III фага М13, упакованным внутри каждой частицы. Затем полученные методом фагового дисплея варианты подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, аффинности связывания). Для того, чтобы выявить перспективные с точки зрения модификации сайты в гипервариабельных участках, можно осуществлять мутагенез на основе сканирования аланином, позволяющий идентифицировать остатки в гипервариабельных участках, вносящие наибольший вклад в связывание с антигеном. В альтернативном варианте или дополнительно может оказаться целесообразным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело с целью идентификации точек контакта между антителом и применяемым для человека дабигатраном. Такие участвующие в контакте остатки и соседние с ними остатки являются кандидатами для замены с помощью изложенных в данном описании методов. После создания указанных вариантов панель вариантов подвергают скринингу согласно представленным в настоящем описании методам, после чего антитела, обладающие наилучшими свойствами по данным одного или нескольких пригодных для данной цели анализов, можно отбирать для дальнейшего усовершенствования.
Другой тип вариации аминокислот антитела приводит к изменению исходной схемы гликозилиро-вания антитела. Под "изменением" в данном случае следует понимать удаление путем делеции одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые отсутствовали в антителе.
В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться целесообразным модифицировать антитела, предлагаемые в изобретении, путем добавления сайтов гликозилирования. Гликозилиро-вание антител, как правило, является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирова-ние представляет собой присоединение углеводного фрагмента к боковой цепи на остатке аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой распознаваемые последовательности, которые требуются для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из указанных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование представляет собой присоединение одного из таких сахаров, как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиами-нокислоте, как правило, к серину или треонину, хотя можно использовать также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Таким образом, для гликозилирования рассматриваемого белка, например, антитела, модифицируют аминокислотную последовательность белка таким образом, чтобы она содержала одну или несколько из указанных выше трипептидных последовательностей (для создания сайтов N-связанного гликозилирования). Изменение можно осуществлять также путем добавления одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательность исходного антитела или путем замены существующих остатков на указанные остатки (для создания сайтов О-связанного гликозилирования).
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты антитела с измененной аминокислотной последовательностью, можно получать различными методами, известными в данной области. Такие методы включают (но, не ограничиваясь только ими) выделение из природного источника (в случае вариантов, содержащих встречающиеся в естественных условиях аминокислотные последовательности) или получение с помощью олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-опосредованного мутагенеза и кассетного мутагенеза полученного ранее варианта или не подвергнутой вариации версии молекулы антитела, представленного в настоящем описании. Как указано выше, антиген для молекулы антитела, предлагаемой в изобретении, представляет собой антикоагулянт. Антиген используют для получения молекулы антитела либо путем иммунизации животного, либо путем отбора последовательностей антитела из библиотек последовательностей, а также с помощью методов фагового дисплея.
Протоколы иммунизации животных хорошо известны в данной области. Для достижения требуемого иммунного ответа может оказаться необходимым объединять антиген с адъювантом, таким как фосфат алюминия, гидроксид алюминия, сквален или полный/неполный адъювант Фрейнда.
В контексте настоящего изобретения антигены, такие как дабигатран, в основном представляют собой сравнительно небольшие органические молекулы, которые иногда не стимулируют образование антитела после их введения животному. Поэтому может оказаться необходимым присоединять антиген к
макромолекуле, такой как гаптен.
Следующим объектом настоящего изобретения является описанная выше молекула антитела, предназначенная для применения в медицине.
Следующим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит описанную выше молекулу антитела и фармацевтический носитель.
Для применения в терапии молекулу антитела включают в состав фармацевтических композиций, позволяющих облегчать введение животным или человеку. Общепринятые препаративные формы, содержащие молекулу антитела, можно приготавливать путем смешения молекулы антитела с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, в виде лиофилизированных или иным методом высушенных препаратов или водных растворов, или водных или неводных суспензий. Носители, эксципиенты, модификаторы или стабилизаторы должны быть нетоксичными в применяемых дозах и концентрациях. Они включают буферные системы, такие как фосфат, цитрат, ацетат и другие неорганические или органические кислоты и их соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты, такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бен-залкония хлорид, бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль (ПЭГ); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспа-рагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды, олигосахариды или полисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу, сахарозу, трегалозу, декстрины или декстраны; хелати-рующие агенты, такие как ЭДТК; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие про-тивоионы, такие как ион натрия; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или ионогенные или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN(tm) (полисорбаты), PLURONICS(tm) или эфиры жирных кислот, простые эфиры жирных кислот или сложные эфиры сахаров. Препаративные формы антител могут содержать также органические растворители, такие как этанол или изопропанол. Эксципиенты могут обладать также модифицирующей высвобождение или модифицирующей абсорбцию функцией.
Согласно одному из объектов изобретения фармацевтическая композиция содержит молекулу антитела в водном забуференном растворе в концентрации 10-20 мг/мл, или лиофилизат, приготовленный из такого раствора.
Предпочтительным путем введения является парентеральный путь введения, введение путем инфу-зии или инъекции (внутривенной, внутримышечной, подкожной, внутрибрюшинной, внутрикожной), но можно использовать также и другие пути введения, такие как введение, посредством ингаляции, транс-дермальное, интраназальное, трансбуккальное, оральное введение.
Другим объектом настоящего изобретения является описанная выше молекула антитела, предназначенная для применения в терапии или для предупреждения побочных действий антикоагулянтной терапии, прежде всего случаев кровотечения.
Другим объектом настоящего изобретения является описанная выше молекула антитела, предназначенная для применения с целью реверсии воздействия передозировки антикоагулянта, прежде всего дабигатрана или дабигатрана этексилата.
Другим объектом настоящего изобретения является описанная выше молекула антитела, предназначенная для применения в качестве антидота антикоагулянта, прежде всего дабигатрана или дабигат-рана этексилата.
Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения или предупреждения побочных действий антикоагулянтной терапии, заключающийся в том, что вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в эффективном количестве описанную выше молекулу антитела.
Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения случая передозировки при осуществлении антикоагулянтной терапии, заключающийся в том, что вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в эффективном количестве описанную выше молекулу антитела.
"Терапевтически эффективное количество" антитела, подлежащего введению, представляет собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения побочных действий антикоагулянтной терапии, прежде всего, минимальное количество, эффективное в отношении прекращения кровотечения. Это может быть достигнуто при использовании молекулы антитела в стехио-метрических количествах.
Например, концентрация дабигатрана в плазме при его введении в рекомендованной дозе может достигать величины 200 нМ. В случае применения одновалентной молекулы антитела с молекулярной массой примерно 50 кДа нейтрализацию можно обеспечить, например, путем внутривенного введения в виде болюса дозы, составляющей примерно 1 мг/кг. В другом варианте осуществления изобретения доза молекулы Fab, вводимая больному человеку, может составлять 50-1000 мг на одно введение, например она может составлять 100, 200, 500, 750 или 1000 мг. В зависимости от ситуации, например, в случае передозировки дабигатрана при введении пациенту, может оказаться целесообразным вводить даже еще более высокие дозы, составляющие, например, 1250, 1500, 1750 или 2000 мг на одно введение. Требуе
мая доза может быть различной в зависимости от типа и дозы введенного антикоагулянта; времени, прошедшего с момента такого введения, природы молекулы антигена, состояния пациента и других факторов. Специалисту в данной области известны методы определения доз, которые являются как терапевтически эффективными, так и безопасными.
Следующим объектом настоящего изобретения является молекула антитела, обладающая аффинностью к связыванию с дабигатраном и/или дабигатрана этексилатом. Предпочтительно аффинность к связыванию молекулы антитела с дабигатраном и/или дабигатрана этексилатом, которую можно оценивать, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics", Curr Opin Immunol., 5(2), апрель 1993 г., cc. 282-286) или с помощью кинетического анализа исключения (KinExA-технология) (Darling R.J. и Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions", ASSAY and Drug Development Technologies, 2(6), декабрь 2004 г., cc. 647-657), величиной KD, составляющей от 0,1 пМ до 100 мкМ, предпочтительно от 1 пМ до 100 мкМ, более предпочтительно от 1 пМ до 1 мкМ.
Молекулу антитела, предлагаемую в изобретении, можно применять также для аналитических и диагностических процедур, например, для определения концентрации антигена в образцах, таких как плазма, сыворотка или другие жидкости организма. Например, молекулы антитела можно применять в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA), как это описано в примерах. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения являются аналитические и диагностические наборы, содержащие описанные выше молекулы антитела, и соответствующие аналитические и диагностические способы.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения молекулы антитела, указанной в любом из предыдущих разделов, заключающийся в том, что
(а) создают клетку-хозяина, которая содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирую-
щих указанную молекулу антитела, которые функционально связаны с контролирующей экспрессию
последовательностью,
(б) культивируют клетку-хозяина и
(в) выделяют молекулу антитела из клеточной культуры.
В изобретении предложены также изделие и набор, содержащие продукты, которые можно применять для нейтрализации вводимых оральным путем антикоагулянтов, прежде всего прямые ингибиторы тромбина. Изделие содержит контейнер, снабженный этикеткой. Пригодными контейнерами могут служить, например, бутыли, пузырьки и лабораторные пробирки. Контейнеры можно изготавливать из разнообразных материалов, таких как стекло, металл, пластик или их комбинации. Контейнер содержит фармацевтическую композицию, включающую представленное в настоящем описании антитело или да-бигатран, дабигатрана этексилат, пролекарство дабигатрана или его фармацевтически приемлемую соль. Действующее вещество в фармацевтической композиции представляет собой конкретное антитело или дабигатран, дабигатрана этексилат, пролекарство дабигатрана или его фармацевтически приемлемую соль. В этикетке на контейнере, содержащем антитело, указано, что фармацевтическую композицию применяют для нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана, дабигатрана этексилат, проле-карства дабигатрана или его фармацевтически приемлемой соли in vivo.
Набор, предлагаемый в изобретении, включает один или несколько указанных выше контейнеров. Кроме того, он может включать другие материалы, полезные с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
В одном из вариантов осуществления изобретения набор содержит любое антитело из числа представленных в настоящем описании антител или включающую его фармацевтическую композицию. Например, набор может содержать (1) любое из описанных выше антител или включающую его фармацевтическую композицию, (2) контейнер и (3) этикетку.
В другом варианте осуществления изобретения набор содержит любое антитело из числа представленных в настоящем описании антител или включающую его фармацевтическую композицию и дабигат-ран, дабигатрана этексилат, пролекарство дабигатрана или его фармацевтически приемлемую соль. Да-бигатран, дабигатрана этексилат, пролекарство дабигатрана или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в форме твердого вещества, жидкости или геля. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемая соль дабигатрана этексилата представляет собой мезилат. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения количество дабигатрана, дабигатрана этексилата, пролекарства дабигатрана или его фармацевтически приемлемой соли на стандартную дозу составляет от примерно 50 до примерно 400 мг, от примерно 75 до примерно 300 мг, от примерно 75 до примерно 150 мг или от примерно 110 до примерно 150 мг, и его вводят один раз в день (QD) или дважды в день (BID).
Например, набор может содержать (1) любое из представленных в настоящем описании антител или включающую его фармацевтическую композицию, (2) фармацевтическую композицию, включающую дабигатран, дабигатрана этексилат, пролекарство дабигатрана или его фармацевтически приемлемую соль, (3) контейнер и (4) этикетку.
В другом варианте осуществления изобретения набор содержит (1) первую фармацевтическую
композицию, включающую дабигатран, дабигатрана этексилат, пролекарство дабигатрана или его фармацевтически приемлемую соль, (2) вторую фармацевтическую композицию, включающую любое из представленных в настоящем описании антител или их комбинацию, (3) инструкции по раздельному введению первой и второй фармацевтических композиций пациенту, где первая и вторая фармацевтические композиции содержатся в отдельных контейнерах и вторую фармацевтическую композицию вводят пациенту, нуждающемуся в нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1 -О-ацилглюкуронида дабигатрана.
В изобретении предложен также диагностический способ нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента, подвергающегося лечению дабигатраном, дабигатрана этексилатом, пролекарством дабигатрана или его фармацевтически приемлемой солью заключающийся в том, что вводят любое из представленных в настоящем описании антитела, их комбинацию или включающую их фармацевтическую композицию. Более конкретно, в изобретении предложен способ нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-O-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента, заключающийся в том что осуществляют стадии, на которых (а) подтверждают, что пациента подвергали лечению дабигатраном, дабигатрана этексила-том, пролекарством дабигатрана или его фармацевтически приемлемой солью и устанавливают их количество, введенное пациенту; (б) нейтрализуют дабигатран или 1-O-ацилглюкуронид с помощью любого из представленных в настоящем описании антител или их комбинации до осуществления теста или анализа на свертываемость или коагуляцию, при этом присутствие дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана может влиять на точные данные теста или результаты анализа; (в) проводят тест или анализ на свертываемость или коагуляцию на образце, взятом из организма пациента, для определения уровня сгусткообразования при отсутствии дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана; и (г) регулируют количество дабигатрана, дабигатрана этексилата, пролекарства дабигатрана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимой пациенту, с целью достижения требуемого баланса между образованием и деградацией сгустка в организме пациента. Молярное соотношение антитела и дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 100, предпочтительно от 0,1 до 10. Точные показания теста или результаты анализа могут представлять собой точные данные об уровнях фибриногена, устойчивости к действию активированного белка С или результаты родственных тестов.
Примеры
I. Получение поликлональных антител к дабигатрану
Для получения поликлональных антител к дабигатрану были созданы 3 различных иммуногена с использованием двух различных гаптенов и различных вносимых молярных соотношений гаптена и белка-носителя (БСА).
Для осуществления скрининга был создан конъюгат, содержащий фермент пероксидазу из хрена (HRP), и разработан твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Дополнительную очистку поликлональных антител осуществляли с помощью аффинной хроматографии на сорбенте белок А/сефароза FF.
1. Материалы и методы
Тестируемое соединение (дабигатран)
Код
Дабигатран, цвиттерион
Структурная формула
но о
I /снз
C25H25N7O3
^молекулярная масса: 471,5 г/моль
Код
Hapten2
Структурная формула лиганда
О xHCI
C27H31N902*HCI
молекулярная масса: 550,07 г/моль
1.2 Синтез гаптенов
Гаптены Hapten1 и Hapten2 синтезировали следующим образом:
1а Метиловый эфир 3-[(4-метиламино-3-нитробензоил)фениламино]пропионовой кислоты
Hapten1 [2-(4-аминобутилкарбамоил)этил]фениламид 2-[(4-карбамимидоилфениламино)метил]-1 -метил- Ш-бензимидазол-5-карбоновой кислоты
К раствору, содержащему хлорангидрид 4-метиламино-3-нитробензойной кислоты (23,3 ммоль) и метиловый эфир 3-фениламинопропионовой кислоты (23,3 ммоль) в 80 мл безводного тетрагидрофурана (ТГФ) добавляли по каплям при перемешивании при комнатной температуре триэтиламин (50,2 ммоль). Спустя 3 ч реакционную смесь упаривали досуха, оставшийся твердый продукт растирали с водой и твердый продукт выделяли фильтрацией.
Выход: 99%
C18H19N3O5 (357,36)
ТСХ (силикагель; дихлорметан/этанол 19:1): Rf = 0,48
16 Метиловый эфир 3-[(3-амино-4-метиламинобензоил)фениламино]пропионовой кислоты
Нитрогруппу продукта 1 а восстанавливали путем гидрирования при комнатной температуре в этаноле в присутствии Pd (10% на угле) в качестве катализатора.
Выход: 99%
C18H21N3O3 (327,38)
TCX (силикагель; дихлорметан/этанол 9:1): Rf = 0,23 Масс-спектр (ESI): [M+H]+ = 328
Продукт 1б (23,2 ммоль) и ^(4-цианфенил)глицин (23,2 ммоль) подвергали реакции сочетания с
1в Метиловый эфир 3-({3-[2-(4-цианфениламино)ацетиламино]-4-метиламинобензоил}фенилами-но)пропионовой кислоты
карбодиимидом (КДИ) (23,2 ммоль) в безводном ТГФ при комнатной температуре. После завершения реакции смесь упаривали досуха и неочищенный продукт использовали без дополнительной очистки. Выход: 97%
C27H27N5O4 (485,54)
Масс-спектр (ESI): [М+Н]+ = 486
1г Метиловый эфир 3-({2-[(4-цианфениламино)метил]-1-метил-1Н-бензимидазол-5-карбонил}фе-ниламино)пропионовой кислоты
Раствор, содержащий продукт 1в (22,6 ммоль) в 100 мл концентрированной уксусной кислоты, выдерживали при температуре дефлегмации в течение 1 ч. Затем раствор упаривали досуха, оставшийся твердый продукт растирали с водой и при перемешивании доводили значение рН примерно до 8-9.
Неочищенный продукт выделяли путем экстракции этилацетатом и очищали с помощью хроматографии на силикагеле (элюент: дихлорметан/этанол 1:1).
Выход: 58%
C27H25N5O3 (467,52)
ТСХ (силикагель; дихлорметан/этанол 9:1): Rf = 0,71 Масс-спектр (ESI): [М+Н]+ = 468
1д 3-( {2-[(4-Цианфениламино)метил] -1 -метил-1 Н-бензимидазол-5 -карбонил } фениламино)пропио -новая кислота
К раствору, содержащему продукт 1г (13,0 ммоль) в 100 мл метанола добавляли гидроксид натрия (20,0 ммоль). Смесь перемешивали в течение 2,5 ч при 40°С и затем упаривали досуха. Оставшийся твердый продукт перемешивали с 100 мл воды и значение рН доводили примерно до 6 с помощью концентрированной уксусной кислоты. Осадившийся продукт выделяли фильтрацией, промывали водой и сушили при 60°С.
Выход: 88%
C26H23N5O3 (453,49)
ТСХ (силикагель; дихлорметан/этанол 9:1): Rf = 0,33 Масс-спектр (ESI): [М+Н]+ = 454
1e трет-Бутиловый эфир {4-[3-({2-[(4-цианфениламино)метил]-1-метил-1Н-бензимидазол-5-кар-бонил}фениламино)пропиониламино]бутил}карбаминовой кислоты
Раствор, содержащий продукт 1д (5,23 ммоль), тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (ТБТУ, 5,23 ммоль) и N-метилморфолин (5,23 ммоль) в 20 мл ДМФ, перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли трет-бутиловый эфир (4-аминобу-тил)карбаминовой кислоты (5,23 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 24 ч. Затем смесь разводили водой (100 мл) и продукт выделяли путем экстракции этилацетатом.
Выход: 92%
C35H41N7O4 (623,75)
ТСХ (силикагель; дихлорметан/этанол 9:1): Rf = 0,51
Продукт 1е (4,81 ммоль) растворяли в насыщенном растворе HCl в этаноле (250 мл), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и затем упаривали досуха при 30°С. Оставшийся неочищенный продукт растворяли в 200 мл безводного этанола, затем добавляли карбонат аммония (48,1 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи.
После выпаривания растворителя оставшийся неочищенный продукт растирали с примерно 5 мл этанола, нерастворившийся продукт отделяли фильтрацией и растворитель выпаривали при 30°С. Затем продукт растворяли в 30 мл воды, раствор перемешивали с примерно 2 г угля, фильтровали и упаривали досуха.
Выход: 90%
C30H36N8O2 (540,67)
ТСХ (обращенная фаза RP-8; метанол/5%-ный водный раствор NaCl, 9:1): Rf =0,79 Масс-спектр (ESI): [М+Н]+ = 541 [M+Cl]- = 575/7
Hapten2 [2-(2-Аминоэтилкарбамоил)этил]пиридин-2-иламид 2-[(4-карбамимидоилфениламино)ме-тил]-1 -метил-1 Н-бензимидазол-5-карбоновой кислоты
К раствору, содержащему гидроксид натрия (50,0 ммоль) в 500 мл этанола и 50 мл воды, добавляли этиловый эфир 3-({2-[(4-цианфениламино)метил]-1-метил-1Н-бензоимидазол-5-карбонил}пиридин-2-иламино)пропионовой кислоты (41,4 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, затем удаляли путем дистилляции примерно 350 мл этанола, добавляли примерно 100 мл воды и значение рН доводили до 6. Затем добавляли диэтиловый эфир (50 мл) и смесь перемешивали в течение ночи. Продукт выделяли фильтрацией и применяли без дополнительной очистки.
Выход: 78% C25H22N6O3 (454,48)
2б трет-Бутиловый эфир {2-[3-({2-[(4-цианфениламино)метил]-1-метил-1Н-бензоимидазол-5-карбо-нил}пиридин-2-иламино)пропиониламино]этил}карбаминовой кислоты
Раствор, содержащий продукт 2а (2,20 ммоль), тетрафторборат 2-(1Н-бензтриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (ТБТУ, 2,20 ммоль) и N-метилморфолин (2,20 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (100 мл), перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли трет-бутиловый эфир (2-аминоэтил)карбаминовой кислоты (2,20 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 24 ч. Затем смесь разводили с использованием 40 мл воды, продукт выделяли путем экстракции этилацетатом и очищали с помощью хроматографии (силикагель; дихлорметан/метанол
15:1).
Выход: 61%
C32H36N8O4 (596,68) Масс-спектр (ESI): [М+Н]+ = 597 [М+Н]- = 595
2в [2-(2-Аминоэтилкарбамоил)этил]пиридин-2-иламид 2-[(4-карбамимидоилфениламино)метил]-1 -метил-Ш-бензоимидазол-5-карбоновой кислоты
Продукт 2б (1,34 ммоль) добавляли к насыщенному раствору HCl в безводном этаноле (30 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч, затем упаривали досуха при 30°С. Добавляли этанол (30 мл) и карбонат аммония (13,0 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем растворитель выпаривали, оставшийся продукт растирали 5 раз с примерно 4 мл смеси дихлорметан/метанол (30:1), фильтровали и выпаривали для выделения продукта из неорганической соли. Выход: 27%
C27H31N9O2 (513,61)
Масс-спектр (ESI): [M+Cl]- = 548/50
[M+HCl+Cl]- = 584/6 [М+Н]+ = 514
2. Химические вещества
2.1 Химические вещества, применяемые при синтезе реагентов
Название
Спецификация
Поставщик
Каталожный номер
1,4-бензохинон
Fluka
12309
бычий
сывороточный альбумин (БСА)
Serva
11920
карбонилди( 1,2,4-триазол)
Fluka
21861
лимонная кислота
аналитически чистая
Riedel-De Haen
33114
N,N-
диметилформамид (ДМФ)
чистота, пригодная для синтеза
Merck
822275
этанол
аналитически чистый
Baker
806
адъювант Фрейнда (CFA)
полный
Sigma
F-5881
адъювант Фрейнда (IFA)
неполный
Sigma
F-5506
глицерин
чистый
Merck
104093
пероксидаза из хрена (HRP)
25000 ед./100 мг
Boehringer Mannheim
108090
H2S04
аналитически чистая
Riedel-De Haen
30743
КН2РО4
аналитически чистый
Merck
4873
NaHC03
аналитически чистый
Merck
106329
Na2C03
аналитически чистый
Merck
106392
(NH4)2S04
аналитически чистый
Merck
101217
орто-
фенилендиамин
таблетка 30 мг
Sigma
P8412
перборат натрия
чистый
Riedel-De Haen
11621
тимол
чистый
Merck
8167
2.3. Буферы для ELISA
Название
Ингредиенты
Применение
буфер 1 стабильность:
0,05М Na2HP04/KH2P04
0,15MNaCl, рН=7,4
4 недели при примерно +4°С
сенсибилизация
буфер 2 стабильность:
те же, что и для буфера 1, с
добавлением 5 г/л БСА
10 дней при примерно +4°С
буфер для анализа
буфер 3 стабильность:
те же, что и для буфера 1, с добавлением 5 г/л БСА и 0,1 г/л тимеросала 4 недели при примерно +4°С
блокирование
микропланшетов;
хранение
буфер 4 стабильность:
0,1М лимонная кислота,
значение рН доведено до рН
5,0 с помощью NaOH,
6,5 ммоля/л пербората натрия
лимонная кислота:
6 месяцев при примерно +4°С,
с перборатом:
10 дней при примерно +4°С
субстратный буфер для opwo-фенилендиамина
Для приготовления буферных растворов использовали воду из системы для ультрачистой обработки воды Elgastat Maxima-ЖХВР. 3. Синтез иммуногенов
Для стимуляции иммунной системы кроликов с целью продуцирования поликлональных антител к дабигатрану были синтезированы три иммуногена (номера лотов GL256, GL258 и GL262) посредством сочетания гаптенов HAPTEN1 и HAPTEN2 с белком-носителем, представляющим собой бычий сывороточный альбумин (БСА), с использованием 1,4-бензохинона или 1,1'-карбонилди(1,2,4-триазола) в качестве реагента для сочетания.
Для синтеза GL256 в качестве гомобифункционального соединения с двумя реакционноспособны-ми сайтами применяли 1,4-бензохинон. Сначала при кислых значениях рН оно вступает во взаимодействие с аминогруппами только в одном из двух сайтов, а при щелочном значении рН - в другом сайте при минимальном уровне полимеризации.
GL258 и GL262 синтезировали, применяя в качестве реагента для сочетания 1,1'-карбонилди(1,2,4-триазол) с различными исходными соотношениями гаптена и белка-носителя.
3.1 Синтез GL256
К раствору, содержащему 0,75мкМ БСА в 8,5 мл 0,1 М КЩЮ^буфера (рН 4,5), добавляли 0,416 мМ 1,4-бензохинон (в 1,5 мл этанола) и инкубировали в течение 1,5 ч в темноте при комнатной температуре. После этого раствор пропускали через заполненную сефадексом G25 колонку, уравновешенную в 0,15М NaCl, для удаления избытка 1,4-бензохинона (конечный объем 12,5 мл). К раствору, содержащему 525 мкМ гаптен HAPTEN1, растворенный в 2 мл 0,1М №ЖЮ3/№2Ш3-буфера (рН 8,5), медленно добавляли при перемешивании 2,5 мл (0,15 мкМ) раствора очищенного БСА. В процессе добавления раствора БСА значение рН доводили до примерно 8,0. Исходное молярное соотношение гаптена и белка-носителя составляло 3500:1.
После инкубации в течение ночи при комнатной температуре иммуноген 6-кратно подвергали диализу в противотоке 1 л дистиллированной воды. Результаты анализа с помощью тонкослойной хроматографии продемонстрировали отсутствие пятен, соответствующих несвязанному гаптену, который мог присутствовать в конъюгатах гаптен-носитель.
Аликвоты иммуногена хранили в замороженном состоянии при -20°С. По данным спектрометрических измерений УФ-абсорбции при 302 нм степень замещения БСА гаптеном в супернатанте иммуногена составляла примерно 1:18. Содержание иммуногена в конечном растворе составляло 0,75 мг GL256/мл.
3.2. Синтез GL258
Раствор, содержащий 158 мкМ HAPTEN2 в 6,3 мл ^^диметилформамида (ДМФ), приготавливали
при комнатной температуре. Добавляли 158 мкМ 1,1'-карбонилди(1,2,4-триазол) и инкубировали сначала в течение 4 ч при 10°С, а затем в течение 30 мин при комнатной температуре. Выход продукта химической реакции проверяли с помощью тонкослойной хроматографии, было установлено, что он составлял примерно 20-25%.
После этого растворяли 0,75мкМ БСА в 2 мл 0,13М NaHCO3 и добавляли по каплям при перемешивании 1 мл ^^диметилформамида (ДМФ). Значение рН доводили до уровня примерно 8,3. После этого к раствору БСА добавляли по каплям при перемешивании раствор гаптена (6,3 мл) и 4 мл 0,13М NaHCO3 и значение рН доводили до 8,4. Исходное молярное соотношение гаптена и белка-носителя для иммуногена GL258 составляло 210:1.
После инкубации в течение ночи при комнатной температуре при перемешивании иммуноген 6-кратно подвергали диализу в противотоке 1 л дистиллированной воды. Результаты анализа с помощью тонкослойной хроматографии продемонстрировали отсутствие пятен, соответствующих несвязанному гаптену, который мог присутствовать в конъюгатах гаптен-носитель.
Аликвоты иммуногена хранили в замороженном состоянии при -20°С. По данным спектрометрических измерений УФ-абсорбции при 302 нм степень замещения БСА гаптеном в супернатанте иммуногена составляла примерно 1:5. Содержание иммуногена в конечном растворе составляло 0,28 мг GL258/мл.
3.3 Синтез GL262
Раствор, содержащий 225мкМ HAPTEN2 в 8,75 мл ^^диметилформамида (ДМФ), приготавливали при комнатной температуре. Добавляли 225 мкМ 1,1'-карбонилди(1,2,4-триазола) и инкубировали в течение 4 ч при 10°С. Выход продукта химической реакции проверяли с помощью тонкослойной хроматографии, было установлено, что он составлял примерно 20-25%.
После этого растворяли 0,49 мкМ БСА в 2 мл 0,13М NaHCO3 и добавляли по каплям при перемешивании 1 мл ^^диметилформамида (ДМФ). Значение рН доводили до уровня примерно 8,2. После этого к раствору БСА добавляли по каплям при перемешивании раствор гаптена (8,75 мл) и 6 мл 0,13М NaHCO3 и значение рН доводили до 8,3. Исходное молярное соотношение гаптена и белка-носителя для иммуногена GL262 составляло 460:1.
После инкубации в течение ночи при комнатной температуре при перемешивании иммуноген 6-кратно подвергали диализу в противотоке 1 л дистиллированной воды. Результаты анализа с помощью тонкослойной хроматографии продемонстрировали отсутствие пятен, соответствующих несвязанному гаптену, который мог присутствовать в конъюгатах гаптен-носитель.
Аликвоты иммуногена хранили в замороженном состоянии при -20°С. По данным спектрометрических измерений УФ-абсорбции при 302 нм степень замещения БСА гаптеном в супернатанте иммуногена составляла примерно 1:32. Содержание иммуногена в конечном растворе составляло 0,71 мг GL262/мл.
4. Синтез конъюгатов
4.1 Синтез GL261
Раствор, содержащий 37,4мкМ HAPTEN2 в 1,5 мл ^^диметилформамида (ДМФ), приготавливали при комнатной температуре. Добавляли 37,5мкМ 1,1'-карбонилди(1,2,4-триазола) и инкубировали сначала в течение 4 ч при 10°С, а затем в течение 30 мин при комнатной температуре. Выход продукта химической реакции проверяли с помощью тонкослойной хроматографии, было установлено, что он составлял примерно 20-25%.
Затем растворяли 1,125мкМ фермент пероксидазу из хрена (HRP) в 0,4 мл 0,13М NaHCO3 и добавляли по каплям при перемешивании 0,267 мл ^^диметилформамида (ДМФ). Значение рН доводили до примерно 8,2. После этого к раствору HRP добавляли по каплям при перемешивании 0,9 мл раствора гаптена (22,5мкМ) и 0,57 мл 0,13М NaHCO3 и значение рН доводили до 8,4. Исходное соотношение гаптена и HRP в содержащем HRP конъюгате GL261 составляло 20:1.
После инкубации при комнатной температуре в течение ночи при перемешивании содержащий HRP конъюгат отделяли от органических растворителей и избытка гаптена с помощью гель-хроматографии. Раствор пропускали через заполненную сефадексом G25 колонку, уравновешенную 0,1М фосфатным буфером, рН 7,0.
Для получения конечной концентрации конъюгата гаптен-HRP (трейсер, 5,64 мг/мл) быстро вносили БСА, получая концентрацию примерно 10 мг/л, равный объем глицерина для предупреждения замораживания и кристалл тимола для предупреждения бактериального роста. Раствор трейсера обозначали как лот № GL261 и хранили в виде аликвот при -20°С.
По данным УФ-спектроскопии при 302 нм степень замещения HRP гаптеном составляла 1:0,2.
Удельную активность трейсера измеряли в блокированных с помощью БСА титрационных микропланшетах с использованием орто-фенилендиамина (ОФД) в качестве субстрата и нативной HRP в качестве эталонного продукта. Смесь, содержащую разведенные HRP-стандарты или конъюгат гаптен-HRP и раствор субстрата, инкубировали в течение 30 мин в темноте, реакцию прекращали путем добавления серной кислоты и измеряли абсорбцию при 490 нм.
Остаточная активность составляла 94% от активности нативной HRP, а удельная активность препарата конъюгата в глицерине составляла 611 ед./мл.
5. Иммунизация и получение антител 5.1 Иммунизация кроликов
Двенадцать самок кроликов породы шиншилла возрастом 3 месяца иммунизировали эмульсией, содержащей 100 мкг иммуногена GL256, GL258 и GL262 в 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (CFA). Через месяц осуществляли несколько бустерных иммунизации. Для третьей иммунизации использовали 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Каждую иммунизацию осуществляли в четыре подкожные и четыре внутримышечные области.
Группа А - иммуноген GL256
Кролик 1 № 50
Кролик 2 № 51
Кролик 3 № 52
Кролик 4 № 53
Группа Б - иммуноген GL258
Кролик 5 № 54
Кролик 6 № 55
Кролик 7 № 56
Кролик 8 № 57
Группа В - иммуноген GL262
Кролик 9 № 46
Кролик 10 № 47 Кролик 11 № 48 Кролик 12 № 49
*Кроликов № 1-12 полностью обескровливали через 10 дней после пятой иммунизации.
Обескровливание осуществляли через сонную артерию под анестезией с использованием ксилазина (Rompun(r), фирма Bayer, Леверкузен, Германия) и гидрохлорида кетамина (Ketavet(r), фирма Parke-Davis, Фрейбург, Германия).
5.2 Анализ кроличьей сыворотки
Сыворотку получали путем центрифугирования коагулированной кроличьей крови. Протеиновую фракцию получали путем осаждения сульфатом аммония и обессоливания путем пропускания через заполненную сефадексом G25 колонку.
Осуществляли скрининг индивидуальных белковых фракций из кроличьей сыворотки на основе оценки титра антител к дабигатрану с помощью стандартной процедуры ELISA.
Скрининг с помощью ELISA
Стадия
Процедура
Протеиновые фракции, выделенные из образцов, полученных при каждом кровоизвлечении, адсорбировали при температуре окружающей среды на титрационные микропланшеты (100 мкл/лунку; 1, 2 или 4 мкг/мл) в буфере 1;
отмывали микропланшеты 4 раза, используя каждый раз по 450 мкл; блокировали с помощью 250 мкл буфера 3 в течение по меньшей мере 1 ч
Отмывали микропланшеты 4 раза, используя каждый раз по 450 мкл
Добавляли в каждую лунку титрационного микропланшета в трех
повторностях:
+ 50 мкл буфера 2
+ 50 мкл калибровочных стандартов в буфере 2
+ 25 мкл конъюгата дабигатран-пероксидаза из хрена (HRP) GL 261 (трейсер) (1/40000)
Запечатывали микропланшеты адгезивной фольгой, полное распределение образцов для всех микропланшетов инкубировали в течение 4 ч на шейкере при температуре окружающей среды
Отмывали микропланшеты 4 раза, используя каждый раз по 450 мкл
Добавляли в каждую лунку титрационного микропланшета по 100 мкл о/?/яо-фенилендиаминаНС1, 2,7 мг*мл (одна таблетка 30 мг в 11 мл буфера 4);
инкубировали в течение 30 мин на шейкере при температуре окружающей среды
Добавляли в каждую лунку титрационного микропланшета по 100 мкл H2S04 (2,25М); встряхивали в течение 5 мин
Считывали абсорбцию; длина тест-волны: 490 нм, длина референс-волны: 650 нм
5.3 Обнаружение антител к дабигатрану в кроличьей сыворотке Последние три колонки: величины для дабигатрана Кровоизвлечение 2
Кролик
Иммуноген
Концентрация
Конц.
Выделенный
р-ра для
(в молях)
титр
сенсибилизации
(мкг/мл)
1 №50
GL256
1,812
100%
2.Е-12
1,574
87%
2.Е-11
0,461
25%
2.Е-10
0,059
2 №51
GL256
2,193
100%
2.Е-12
2,086
95%
2.Е-11
1,515
69%
2.Е-10
0,207
3 №52
GL256
1,513
100%
2.Е-12
1,419
94%
2.Е-11
0,728
48%
2.Е-10
0,107
4 №53
GL256
1,474
100%
2.Е-12
1,388
94%
2.Е-11
0,848
58%
2.Е-10
0,142
10%
5 №54
GL258
2,114
100%
2.Е-12
1,892
89%
2.Е-11
0,646
31%
2.Е-10
0,159
6 №55
GL258
1,295
100%
2.Е-12
0,937
72%
2.Е-11
0,265
20%
2.Е-10
0,140
11%
7 №56
GL258
1,611
100%
2.Е-12
1,372
85%
2.Е-11
0,424
26%
2.Е-10
0,145
8 №46
GL258
1,640
100%
2.Е-12
1,290
79%
2.Е-11
0,425
26%
2.Е-10
0,196
12%
9 №47
GL262
1,854
100%
2.Е-12
1,534
83%
2.Е-11
0,530
29%
2.Е-10
0,254
14%
10 №48
GL262
1,458
100%
2.Е-12
1,142
78%
2.Е-11
0,300
21%
2.Е-10
0,131
11 №49
GL262
1,646
100%
2.Е-12
1,393
85%
2.Е-11
0,460
28%
2.Е-10
0,257
16%
12 №50
GL262
1,605
100%
2.Е-12
1,400
87%
2.Е-11
0,389
24%
2.Е-10
0,109
Конечное кровоизвлечение
Кролик
Иммуноген
Концентрация
Конц.
Выделенный
р-ра для
(в молях)
титр
сенсибилизации
(мкг/мл)
1,589
100%
2.Е-12
1,442
91%
2.Е-11
0,491
31%
2.Е-10
0,130
1,375
100%
2.Е-12
1,041
76%
2.Е-11
0,293
21%
2.Е-10
0,101
1,400
100%
2.Е-12
1,081
77%
2.Е-11
0,288
21%
2.Е-10
0,097
1,183
100%
2.Е-12
0,882
75%
2.Е-11
0,396
33%
2.Е-10
0,183
15%
1,335
100%
2.Е-12
1,066
80%
2.Е-11
0,183
14%
2.Е-10
0,057
1,214
100%
2.Е-12
0,976
80%
2.Е-11
0,250
21%
2.Е-10
0,123
10%
1,822
100%
2.Е-12
1,702
93%
2.Е-11
0,661
36%
2.Е-10
0,189
10%
1,234
100%
2.Е-12
1,085
88%
2.Е-11
0,671
54%
2.Е-10
0,147
12%
1,911
100%
2.Е-12
1,862
97%
2.Е-11
0,980
51%
2.Е-10
0,292
15%
1,933
100%
2.Е-12
1,891
98%
2.Е-11
1,055
55%
2.Е-10
0,076
1,874
100%
2.Е-12
1,817
97%
2.Е-11
1,539
82%
2.Е-10
0,181
10%
1,599
100%
2.Е-12
1,425
89%
2.Е-11
0,475
30%
2.Е-10
0,050
После скрининга белковых фракций образцов крови, полученных при кровоизвлечении 2 от всех кроликов, было установлено, что кролик № 5 (№ 54) характеризовался наибольшим титром антител к дабигатрану, несущих предпочтительный гаптен HAPTEN2. Кроме того, оказалось возможным вытеснять трейсер из сайтов связывания антитела при использовании анализируемой субстанции (дабигатрана) в очень низких концентрациях.
Для скрининга образцов, полученных при конечном кровоизвлечении 3, в качестве определяющего критерия для принятия решения рассматривали вытеснение трейсера из сайта связывания антитела при использовании анализируемой субстанции (дабигатрана) в очень низких концентрациях, поскольку отсутствовала информация о применяемом иммуногене. Таким образом, для дальнейшей очистки были отобраны образцы, взятые у кроликов № 2, 3 и 5.
5.4 Очистка поликлональных антител
Антисыворотку, полученную от кролика № 5 (№ 54) при кровоизвлечении № 2 и от кроликов № 2, 3 и 5 при кровоизвлечении № 3 (конечное кровоизвлечение), осаждали с помощью сульфата аммония. Осадок центрифугировали в течение 30 мин при 10°С и 4500 об/мин, выделяли из раствора и ресуспен-дировали в Трис-буфере. Эту процедуру повторяли. Дополнительную очистку осуществляли с помощью аффинной хроматографии на белок А-сефарозе FF. В качестве буфера для колонки использовали 0,01М Трис, рН 7,5, а для элюирования использовали 0,1М глицин, рН 3,0. Объединяли фракции, содержащие кроличий IgG. Концентрацию белка определяли с помощью УФ-спектроскопии при длине волны 280 нм.
Обобщение характеристик антител
Иммуноген:
HAPTEN2-BCA (лот номер GL258)
Кролик:
№ 5 (№ 54), сыворотка (кровоизвлечение номер 2)
Содержание белка:
1,85 мг/мл
Хранение:
при примерно -20°С
Иммуноген:
HAPTEN 1-БСА (лот номер GL256) или
HAPTEN2-BCA (лот номер GL258) или
HAPTEN2-BCA (лот номер GL262)
Кролик:
номер 2, собранная сыворотка (конечное кровоизвлечение)
Содержание белка:
3,9 мг/мл
Хранение:
при примерно -20°С
Иммуноген:
HAPTEN 1-БСА (лот номер GL256) или
HAPTEN2-BCA (лот номер GL258) или
HAPTEN2-BCA (лот номер GL262)
Кролик:
номер 3, сыворотка (конечное кровоизвлечение)
Содержание белка:
9,96 мг/мл
Хранение:
при примерно -20°С
Иммуноген:
HAPTEN 1-БСА (лот номер GL256) или
HAPTEN2-BCA (лот номер GL258) или
HAPTEN2-BCA (лот номер GL262)
Кролик:
номер 5, сыворотка (конечное кровоизвлечение)
Содержание белка:
5,72 мг/мл
Хранение:
при примерно -20°С
II. Нейтрализация дабигатрана
Для демонстрации воздействия антител на антикоагулянтную активность дабигатрана in vitro были проведены две серии экспериментов. В лаборатории были созданы четыре поликлональных антитела и было проведено их дополнительное тестирование с использованием образцов человеческой плазмы. Это тестирование проводили с помощью функционального анализа, а именно, анализа на тромбиновое время свертывания.
Описание анализа
В целом, метод заключался в следующем. Для получения человеческой плазмы цельную кровь вносили в 3,13% цитрат натрия. Затем этот продукт центрифугировали для получения свободной от тромбоцитов плазмы, переносили в отдельную пробирку и хранили в замороженном состоянии до применения в день проведения анализа. В день проведения анализа плазму подвергали оттаиванию при 37°С.
Анализ на тромбиновое время свертывания проводили следующим образом. Сначала разводили тромбин согласно спецификации производителя (3 мед./мл тромбина) в поставляемом вместе с набором буфере (набор Dade Behring Test) и предварительно нагревали до 37°С. Продукт использовали в течение 2 ч с момента его приготовления. Все анализы проводили с использованием поступающего в продажу устройства для анализа свертывания типа CL4 (фирма Behnk Electronics, Нордерштадт, Германия). 50 мкл плазмы вносили с помощью пипетки в прилагаемые к набору кюветы с магнитной мешалкой и осуществляли перемешивание в течение 2 мин в лунке, предварительно нагретой до 37°С, в устройстве CL4. В этот момент времени добавляли 100 мкл раствора тромбина и автоматически с помощью CL4 регистрировали время, необходимое для свертывания образца плазмы. Перед добавлением тромбина и начала измерений осуществляли предварительную инкубацию дабигатрана в плазме в течение 5 мин. Когда осуществляли тестирование в присутствии также и антитела (вплоть до 50 мкл маточного раствора), то дополнительно осуществляли инкубацию еще в течение 5 мин при 37°С перед началом свертывания (т.е. осуществляли инкубацию с дабигатраном в общей сложности в течение 10 мин, инкубацию с антителом в общей сложности в течение 5 мин и затем инициировали свертывание с помощью тромбина).
Сначала получали стандартную кривую для дабигатрана, для чего добавляли в возрастающих концентрациях дабигатран к человеческой плазме и после добавления тромбина измеряли время до свертывания (фиг. 1). Было выявлено зависящее от концентрации увеличение тромбинового времени свертывания при увеличении концентраций дабигатрана.
В первой серии экспериментов по нейтрализации во все образцы плазмы добавляли для нейтрализации дабигатран в рекомендованной для клинических целей концентрации, составляющей 200 нМ. Было установлено, что все 4 препарата антител обладали способностью сокращать время до свертывания в плазме, содержащей дабигатран (фиг. 2). Степень нейтрализации зависела от концентрации белка в каждом препарате антитела. Затем содержащий антитело раствор с наиболее высокой концентрацией (Г) серийно разводили и тестировали в отношении способности нейтрализовать антикоагулянтную активность дабигатрана, применяемого в концентрации 200 нМ, для чего проводили отдельную серию экспериментов. Как продемонстрировано на фиг. 3, при увеличении концентрации антитела было выявлено зависящее от концентрации ингибирование индуцированной дабигатраном антикоагулянтной активности. Кроме того, было установлено, что когда к плазме, содержащей дабигатран, добавляли неспецифическое кроличье поликлональное антитело (синий квадрат), то оно не обладало способностью нейтрализовать антикоагулянтную активность. Наличие указанной зависимости от концентрации и отсутствие
нейтрализации при применении неспецифического антитела свидетельствует о том, что вызываемая антителом реверсия антикоагулирующего действия является специфической в отношении дабигатрана.
Однако рассмотренные концентрации дабигатрана являются рекомендованными для клинического применения, но кровотечения или передозировка могут иметь место при более высоких концентрациях. Поэтому было проведено тестирование способности антитела ингибировать антикоагулянтную активность дабигатрана при его применении в наиболее высокой концентрации (500нМ), использованной для получения стандартной кривой, представленной на фиг. 1. На фиг. 4 продемонстрировано, что антитело Г обладало способностью ингибировать также и действие дабигатрана, применяемого в высоких концентрациях.
III. Получение и характеризация моноклональных антител к дабигатрану
1. Получение моноклональных антител к дабигатрану и Fab-фрагментов
Мышей иммунизировали с помощью Hapten1 (см. пример 1.1), конъюгированного с белками-носителями, такими как гемоцианин и иммуноглобулин, и создавали гибридомы согласно стандартным методам. Моноклональные антитела, очищенные из супернатантов культуры, связывались с конъюгата-ми дабигатран-белок и это связывание могли конкурировать с дабигатраном, находящимся в растворе, при этом ингибирование на уровне, составлявшем половину от максимального, имело место при концентрациях в диапазоне от 1 до 10 нМ. Fab-фрагменты создавали путем расщепления папаином моноклональных антител с последующим удалением Fc-домена с использованием белка А.
Клонировали вариабельные области тяжелых и легких цепей мышиных антител и осуществляли их секвенирование с помощью стандартных методов. Последовательности подтверждали путем анализа белка с помощью масс-спектрометрии и N-концевого секвенирования антител. Создавали ДНК-конструкции, кодирующие химерные антитела, которые содержали специфические мышиные вариабельные области и константные области человеческого IgG, осуществляли экспрессию белка в клетках линии HEK 293Т и его очистку.
2. Характеризация моноклональных антител к дабигатрану и Fab-фрагментов
Последовательности вариабельных областей трех клонов моноклонального антитела представлены на фиг. 5 и фиг. 6. Аминокислотные последовательности вариабельных областей клона 13 представлены на фиг. 5 (DBG 13 VH, тяжелая цепь, SEQ ID NO: 16) и фиг. 6 (DBG 13 VK, легкая цепь, SEQ ID NO: 17). Аминокислотные последовательности вариабельных областей клона 14 представлены на фиг. 5 (DBG 14 VH, тяжелая цепь, SEQ ID NO: 18) и фиг. 6 (DBG 14 VK, легкая цепь, SEQ ID NO: 19). Аминокислотные последовательности вариабельных областей клона 22 представлены на фиг. 5 (DBG 22 VH, тяжелая цепь, SEQ ID NO: 20) и фиг. 6 (DBG 22 VK, легкая цепь, SEQ ID NO: 21).
Клон 22 мышиного моноклонального антитела тестировали в отношении его способности нейтрализовать антикоагулянтную активность дабигатрана в человеческой плазме с помощью анализа на тром-биновое время свертывания, описанного в примере II. Антитело вызывало полную реверсию опосредуемого дабигатраном удлинения обусловленного тромбином свертывания в человеческой плазме в зависимости от дозы (фиг. 7). Антитело эффективно ингибировало также функцию дабигатрана в человеческой цельной крови. Fab-фрагмент, выделенный из указанного антитела, блокировал активность дабигатрана в человеческой плазме, демонстрируя тем самым, что одновалентные антигенсвязывающие домены могут нейтрализовать антикоагулянтную активность соединения (фиг. 8).
Основной путь метаболизма дабигатрана в организме человека заключается в глюкуронидации кар-боксилатного фрагмента. Было установлено, что ацилглюкурониды дабигатрана обладают фармакологической активностью (Ebner и др., Drug Metab. Dispos., 38(9), 2010, cc. 1567-1575). Для тестирования того, обладает ли клон 22 мышиного моноклонального антитела способностью нейтрализовать указанные метаболиты, проводили очистку ацилглюкуронидов дабигатрана из мочи макак резус, обработанных даби-гатраном, и оценку с помощью анализа на тромбиновое время свертывания. Антитело в зависимости от дозы вызывало реверсию опосредуемого ацилглюкуронидом дабигатрана удлинения обусловленного тромбином свертывания в человеческой плазме с эффективностью, сходной с эффективностью в отношении дабигатрана (фиг. 9). Таким образом было установлено, что антитело обладало эффективностью в отношении блокирования антикоагулянтной активности метаболитов дабигатрана, присутствующих в организме человека.
Аффинности Fab-фрагментов и мышиных-человеческих химерных антител, содержащих вариабельные области клонов 22, 13 и 14 и константные области человеческого иммуноглобулина (константная область легкой цепи: SEQ ID NO: 44; константная область тяжелой цепи: SEQ ID NO: 45), определяли с помощью технологии Kinexa. Fab-фрагмент или химерное антитело в фиксированной концентрации инкубировали с дабигатраном, взятым в различных концентрациях, до достижения равновесия. После осуществления указанной инкубации определяли концентрацию свободного антитела путем захвата антитела покрытыми нейтравидином гранулами, которые были связаны с аналогом дабигатрана, конъюги-рованным с биотином. Захваченный Fab-фрагмент обнаруживали с использованием F(ab')2-фрагмента анимышиного IgG (Fab-специфического), меченного с помощью ФИТЦ. Захваченные химерные антитела обнаруживали с использованием античеловеческого IgG, конъюгированного с Су5. Константы диссоциации рассчитывали на основе модели связывания 1:1. Результаты этих экспериментов обобщены приве-
Как Fab-фрагмент, так и химерные антитела связывались с дабигатраном с высокой аффинностью.
3. Создание гуманизированных моноклональных антител к дабигатрану и Fab-фрагментов
Для снижения потенциальной иммуногенности после введения человеку осуществляли "гуманизацию" мышиных моноклональных антител. Последовательности человеческих каркасных участков для перспективным мышиных вариантов отбирали на основе гомологии каркасного участка, структуры CDR, консервативных канонических остатков, консервативных упаковывающих интерфейс остатков и других параметров. С помощью специфических замен аминокислотных остатков в этих положениях в каркасе можно улучшать различные особенности характеристик антитела, включая аффинность связывания и/или стабильность, по сравнению с характеристиками, которыми обладают гуманизированные антитела, созданные путем "прямой замены" гипервариабельных участков (CDR) или гипервариабельных петель (HVL) в каркасных участках человеческой зародышевой линии. Fab-фрагменты, обладавшие более высокой или такой же способность к связыванию и более высокой экспрессией, чем химерный родительский Fab-фрагмент, отбирали для дальнейшей характеризации. Аминокислотные последовательности вариабельных областей гуманизированных Fab представлены на фиг. 5 (Eng VH 14, SEQ ID NO: 22; ENG VH 15, SEQ ID NO: 24 и ENG VH 31, SEQ ID NO: 26) и на фиг. 6 (Eng VK 11, SEQ ID NO: 23; ENG VK 17, SEQ ID NO: 25 и ENG VK 18, SEQ ID NO: 27). Fab-фрагмент, содержащий Eng VH 15 и Eng VK 18 (легкая цепь: SEQ ID NO: 37; тяжелая цепь: SEQ ID NO: 36), экспрессировали непосредственно в СНО-клетках и очищали с использованием среды Kappa select и содержащих белок G смол.
Fab-фрагмент, содержащий Eng VH15 и Eng VK 18, превращали также в полноразмерный IgG в формате IgG1KO (легкая цепь: SEQ ID NO: 35; тяжелая цепь: SEQ ID NO: 40). IgG1KO (с "выключенными" эффекторными функциями) имел две мутации в Fc-области, а именно Leu234Ala и Leu235Ala, которые приводили к снижению эффекторной функции, такой как связывание с FcgR и комплементом. IgG-формат описан в литературе (см., например, Hezareh и др., Journal of Virology 75, 2001, cc. 12161-12168). Гуманизированные антитела к дабигатрану необязательно содержат специфические аминокислотные замены в консенсусных каркасных участках или каркасных участках зародышевой линии. Антитело 18/15 экспрессировали в HEK 293Т-клетках или СНО-клетках и очищали. Fab-фрагменты создавали посредством расщепления интактного антитела с помощью либо Lys-C, либо папаина, и очищали путем удаления Fc-домена с использованием белка А.
4. Характеризация Fab-фрагментов антител к дабигатрану
Fab-фрагмент 18/15, созданный путем расщепления с помощью Lys-C интактного антитела, тестировали в отношении его способности нейтрализовать антикоагулянтную активность дабигатрана в человеческой плазме с помощью анализа на тромбиновое время свертывания, описанного в примере II. Fab-фрагмент приводил к полной реверсии в зависимости от дозы опосредуемого дабигатраном увеличения времени свертывания, обусловленного тромбином, при этом величина IC50 составляла 2,6 нМ (фиг. 10). Полученный непосредственно путем экспрессии Fab-фрагмент и Fab-фрагмент, созданный путем расщепления папаином интактного антитела, также нейтрализовали антикоагулянтную активность дабигатра-на, что характеризовалось величинами IC50, составлявшими 2,6 и 2,7 нМ соответственно.
Аффинность Fab-фрагмента 18/15, созданного путем расщепления с помощью Lys-C интактного антитела и Fab-фрагмента, полученного непосредственно путем экспрессии, определяли с помощью устройства фирмы BIAcore на основе технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fab-фрагменты подвергали предварительной инкубации с дабигатраном в возрастающих концентрациях в течение 30 мин при комнатной температуре. Смеси давали протекать по поверхности сенсорного чипа, сенсибилизированного иммобилизованным конъюгированным с биотином аналогом дабигатрана, и определяли связывание свободного Fab-фрагмента. С использованием указанной схемы конкурентного анализа в растворе определяли величины KD, характеризующие воздействие Fab-фрагментов на активность дабигатрана, которые составляли 0,16пМ для Fab-фрагментов, созданных путем расщепления с помощью Lys-C, и 0,45пМ для полученных непосредственно путем экспрессии Fab-фрагментов.
Эксперименты in vivo с использованием Fab-фрагментов, полученных путем расщепления с помощью папаина
Крыс (самцы линии Wistar, ~300 г) анестезировали пентобарбиталом, который вводили в виде болюса (60 мг/кг i.p.) и путем непрерывной инфузии в качестве поддерживающей анестезии (20 мг/кг/ч i.p.), и помещали на нагретую до 37°С подушку для поддержания внутренней температуры тела. Обнажали сонную артерию и вводили канюлю для взятия образцов крови, а в правую яремную вену вводили субстанцию. Дабигатран вводили сначала в виде болюса (0,3 мкМ/кг), а затем путем инфузии (0,1
мкМ/кг/ч) в течение 20 мин для достижения постоянных уровней в плазме. Через 20 мин осуществляли однократную i.v. инъекцию Fab-фрагмента в виде болюса либо в эквимолярной концентрации, либо в концентрации, равной половине эквимолярной концентрации, в левую яремную вену. Брали образцы крови (разведение 1/10 в 3,13%-ном растворе цитрата натрия) для определения исходного уровня (-20, -2 мин) и с различными интервалами времени в течение 30 мин после инъекции Fab-фрагмента.
Антикоагулянтные воздействия дабигатрана оценивали на основе измерений времен свертывания цельной крови, включая тромбиновое время (ТТ) и частичное активированное тромбопластиновое время (аРТТ). В целом, метод заключался в следующем: тромбиновое время определяли с помощью коагуло-метра, для этого вносили 50 мкл цельной крови в лунку, предварительно нагретую до 37°С. Добавляли тромбин (фирма Siemens Healthcare, Марбург, Германия) в концентрации 3,0 ед./мл (объем 100 мкл) и измеряли время, необходимое для свертывания образца. аРТТ цельной крови измеряли путем предварительного нагревания в коагулометре 50 мкл цельной крови до 37°С и добавления 50 мкл реагента для аРТТ (фирма Roche Diagnostics, Маннгейм, Германия) в течение 3 мин. Процесс для определения времени свертывания инициировали путем добавления 50 мкл 0,025М предварительно нагретого (37°С) хлорида кальция. После этого регистрировали время, требуемое для свертывания образца цельной крови.
Результаты, полученные для Fab-фрагмента 18/15 (легкая цепь: SEQ ID NO: 37, Fd фрагмент тяжелой цепи: SEQ ID NO: 41; создан путем расщепления папаином полноразмерного иммуноглобулина, экс-прессированного в СНО-клетках), который вводили путем однократной i.v. инъекции эквимолярной по отношению к дабигатрану дозы, представлены на фиг. 11 и 12. При использовании этой модели наблюдалось быстрое, почти мгновенное, ингибирование антикоагулянтной активности дабигатрана по оценкам как на основе измерения ТТ (фиг. 11), так и аРТТ (фиг. 12). В течение одной минуты после инъекции происходила полная нейтрализация антикоагулянтной активности дабигатрана и она возвращалась к исходным уровням. Это действие продолжалось в течение более чем 20 мин, несмотря на продолжающуюся непрерывную i.v. инфузию дабигатрана.
При введении более низкой дозы, составлявшей половину от молярной дозы дабигатрана также сначала имело место снижение как ТТ (фиг. 13), так и аРТТ (фиг. 14). Однако это действие в условиях продолжающейся непрерывной инфузии дабигатрана наблюдалось не так долго, как в случае более высокой дозы.
Таким образом, представленные результаты демонстрируют, что для описанной модели с использованием животных имеет место предсказуемая зависящая от дозы и очень быстро возникающая после однократного i.v. введения Fab-фрагмента к дабигатрана нейтрализация антикоагулянтной активности да-бигатрана.
Перечень последовательностей
<110> ВЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ИНТЕРНАЦИОНАЛЬ ГМБХ
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 45 <211> 330 <212> PRT
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Молекула антитела, которая специфично связывает дабигатран и обладает способностью нейтрализовать активность антикоагулянта, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и CDR3 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
2. Молекула антитела по п.1, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, в которой CDR1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2 имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, в которой CDR1 имеет
1.
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
3. Молекула антитела по п.1 или 2, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 и 26, вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25 и 27.
4. Молекула антитела по п.3, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, или вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.
5. Молекула антитела по одному из предыдущих пунктов, представляющая собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, Fab-, Fab'- или F(ab')2-фрагмент или одноцепочечное антитело, предпочтительно одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
6. Молекула антитела по п.5, представляющая собой scFv, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны друг с другом с помощью линкерного пептида, имеющего последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31.
7. Молекула антитела по п.6, где scFv включает SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.
8. Молекула антитела по п.5, содержащая тяжелую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, или содержащая тяжелую цепь, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, которая имеет последовательность, представленную в
SEQ ID NO: 43.
9. Антитело по п.5, представляющее собой Fab-молекулу, которая имеет Fd-фрагмент, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39.
10. Применение молекулы антитела по одному из предыдущих пунктов для терапии или для предупреждения побочных действий дабигатрана и/или для реверсии передозировки дабигатрана.
11. Применение по п.10, где побочное действие представляет собой случай кровотечения.
12. Способ получения молекулы антитела по любому из пп.1-9, включающий:
(а) получение клетки-хозяина, которая содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, коди-
рующих указанную молекулу антитела, которые функционально связаны с контролирующей экспрессию
последовательностью,
(б) культивирование клетки-хозяина и
(в) выделение молекулы антитела из клеточной культуры.
13. Применение антитела по любому из пп.1-9 для нейтрализации или частичной нейтрализации да-бигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента.
14. Способ нейтрализации или частичной нейтрализации дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана в организме пациента, включающий:
(а) подтверждение того, что пациента подвергали лечению дабигатраном, дабигатрана этексилатом,
пролекарством дабигатрана или его фармацевтически приемлемой солью, и устанавливают его количест-
во, введенное пациенту;
(б) нейтрализацию дабигатрана или его 1-О-ацилглюкуронида с помощью антитела по одному из
пп.1-9 перед осуществлением теста или анализа на свертываемость или коагуляцию, при этом присутст-
вие дабигатрана или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана может влиять на точные данные теста или ре-
зультаты анализа;
(в) проведение теста или анализа на свертываемость или коагуляцию с использованием образца,
взятого из организма пациента, для определения уровня сгусткообразования при отсутствии дабигатрана
или 1-О-ацилглюкуронида дабигатрана; и
и дабигатрана или 1-О-ацил-и дабигатрана или 1-О-ацил-
(г) регуляцию количества дабигатрана, дабигатрана этексилата, пролекарства дабигатрана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимых пациенту, с целью достижения требуемого баланса между образованием и деградацией сгустка в организме пациента.
15. Способ по п.14, в котором молярное соотношение антитела глюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 100.
16. Способ по п.14, в котором молярное соотношение антитела глюкуронида дабигатрана составляет от 0,1 до 10.
17. Способ по п.14, в котором точные показания теста или результаты анализа представляют собой точные данные об уровнях фибриногена, устойчивости к действию активированного белка С или результаты родственных тестов.
> DBG 13 VH DVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSgrSSrsriyPWVRQSPGKGLEWLGVrgSAGSrwry
> DBG 14 VH QVQLEQSGPGLVAPSQRLSITCTVSGFSXTjyrjVPWVRQSPGKGLEWLGVjyAGGSrsyy
> DBG 22 VH QVQLEQSGPGLVAPSQRLSITCTVS GFS1TSYIVPWVRQ S PGKGL EWLGVXKAGGSTNYN
> Eng VH#14 QVQLQESGPGLVKPSETLS L T С T V S GFS.E ГЗ YIVDWIRQPPGKGLEWIG VIWAGGSTRYN
> Eng VH#15 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS GFSLTSYIVDWIRQPPGKGLEWIGVIWAGGSTGYN
> Eng VH#31 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS GFSLTSYIVDWIRQ P PGKG LEWLGVlffAGGSTAYW
> DBG 13 VH SALgSRLNITKDNSKNQVFLKMNSLQTDDTAIYYCASAAYYSYYWFDGFAYWGQGTLVTVSA
> DBG 14 VH SALRSRL SITKNNSKSQVFLQMNSLQT D DT AT Y Y С A SAA YYS У YWYDGFAYW GQO'T LVT VS A
> DBG 22 VH SALBSRLSITКSNSKSQVFLQMNSLQTDDTAIYYСASAAYYSYYWYDGFAYWGQGTLVTVSA
> Eng VH#14 SALRSRVTISKDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVY YCASAAYY5YYWYDGFAYWGQGT LVTVS S
> Eng VH#15 SALRSRV SITKDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVY YСASAAYYSУУУYPGFAYWGQGT LVTVS S
я Антитело/РаЬ-фрагмент (мкг/мл)
> Eng VH#31 SAXRSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAIY YСASAAYYSУУУYPGFAYWGQGT LVTVS S
-•-контроль
-¦-0,3 + 0,1мкМ/кг/ч
-*-Fab, 0,ЗмкМ/кг
Дабигатран: болюс (0,ЗмкМ/кг) + инфузия (0,1мкМ/кг/ч) Тромбиновое время: в анализе применяли 3,0 ед./мл тромбина Данные выражены в виде средних значений ± С.К.О., п=4
Фиг. 11
-•- контроль
-¦- 0,3 + 0,1мкМ/кг/ч
-A- Fab, 0,ЗмкМ/кг
Дабигатран: болюс (0,ЗмкМ/кг) + инфузия (0,1мкМ/кг/ч) Данные выражены в виде средних значений ± С.К.О., п=4
Фиг. 12
-¦- контроль
-*¦ 0,3 + 0,1мкМ/кг/ч
Fab, 0,15мкМ/кг -*- Fab, 0,ЗмкМ/кг
контроль 0,3 + 0,1мкМ/кг/ч Fab, 0,15мкМ/кг Fab, 0,ЗмкМ/кг
Дабигатран: болюс (0,ЗмкМ/кг) + инфузия (0,1мкМ/кг/ч) Данные выражены в виде средних значений ± С.К.О., п=4
Фиг. 14
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028371
- 1 -
028371
- 1 -
028371
- 1 -
028371
- 1 -
028371
- 4 -
028371
- 28 -
028371
- 29 -
028371
- 34 -
028371
- 48 -
028371
- 51 -
028371
- 53 -