EA 028359B1 20171130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/028359 Полный текст описания [**] EA201491838 20130411 Регистрационный номер и дата заявки EP12164087.4 20120413 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2013/057590 Номер международной заявки (PCT) WO2013/153159 20131017 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21711 Номер бюллетеня [**] ШТАММ BACILLUS ДЛЯ ДОБАВКИ К КОРМУ ЖИВОТНЫХ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Название документа [8] C12N 1/20, [8] C12N 15/01, [8] A23K 1/00, [8] A23L 1/30, [8] C12R 1/07, [8] C12R 1/125 Индексы МПК [DK] Нильсен Беатрис, [DK] Кантор Метте Динес, [DK] Стуэр-Лауридсен Биргитте, [DK] Дерккс Патрик, [DK] Йохансен Эрик Сведения об авторах [DK] КР. ХАНСЕН А/С Сведения о патентообладателях [DK] КР. ХАНСЕН А/С Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000028359b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Штамм Bacillus, используемый в качестве добавки к корму для животных, выбранный из: a) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839; b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 и CHCC 15539 DSM 27033; c) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841; d) мутанта любого из штаммов а), b) или с), где в мутантном штамме менее 1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с), причем любой из штаммов а), b), с) или d) характеризуется: i) чувствительностью к ампициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, стрептомицину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу; ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; и iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.

2. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

3. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

4. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

5. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

6. Способ получения мутантного штамма, выбранного из: a) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839; b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 или CHCC 15539 DSM 27033; или c) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841; где способ предусматривает мутагенез штамма а), b) или с), при котором происходит замена или делеция менее 1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с), и отбор мутантного штамма, характеризующегося: i) чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола; ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.

7. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

8. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

9. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

10. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

11. Композиция для добавления к корму животных, содержащая по меньшей мере один штамм Bacillus по любому из пп.1-5.

12. Композиция по п.11, содержащая по меньшей мере два штамма Bacillus по любому из пп.1-5.

13. Композиция по п.11 или 12, содержащая по меньшей мере три штамма Bacillus по любому из пп.1-5.

14. Композиция по любому из пп.11-13, где клетки указанных штаммов Bacillus находятся в форме спор.

15. Способ получения корма для животных с пробиотической добавкой, предусматривающий добавление композиции по любому из пп.11-14 в качестве премикса к корму для животных.

16. Способ кормления животного, отличающийся тем, что для кормления используют композицию по любому из пп.11-14.

17. Способ кормления животного по п.16, где указанное животное, выбрано из домашней птицы, жвачных животных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыб и домашних животных.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Штамм Bacillus, используемый в качестве добавки к корму для животных, выбранный из: a) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839; b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 и CHCC 15539 DSM 27033; c) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841; d) мутанта любого из штаммов а), b) или с), где в мутантном штамме менее 1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с), причем любой из штаммов а), b), с) или d) характеризуется: i) чувствительностью к ампициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, стрептомицину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу; ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; и iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.

2. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

3. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

4. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

5. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).

6. Способ получения мутантного штамма, выбранного из: a) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839; b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 или CHCC 15539 DSM 27033; или c) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841; где способ предусматривает мутагенез штамма а), b) или с), при котором происходит замена или делеция менее 1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с), и отбор мутантного штамма, характеризующегося: i) чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола; ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.

7. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

8. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

9. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

10. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).

11. Композиция для добавления к корму животных, содержащая по меньшей мере один штамм Bacillus по любому из пп.1-5.

12. Композиция по п.11, содержащая по меньшей мере два штамма Bacillus по любому из пп.1-5.

13. Композиция по п.11 или 12, содержащая по меньшей мере три штамма Bacillus по любому из пп.1-5.

14. Композиция по любому из пп.11-13, где клетки указанных штаммов Bacillus находятся в форме спор.

15. Способ получения корма для животных с пробиотической добавкой, предусматривающий добавление композиции по любому из пп.11-14 в качестве премикса к корму для животных.

16. Способ кормления животного, отличающийся тем, что для кормления используют композицию по любому из пп.11-14.

17. Способ кормления животного по п.16, где указанное животное, выбрано из домашней птицы, жвачных животных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыб и домашних животных.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
028359
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201491838
(22) Дата подачи заявки
2013.04.11
(51) Int. Cl.
C12N1/20 (2006.01) C12N15/01 (2006.01) A23K1/00 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) C12R1/07 (2006.01) C12R1/125 (2006.01)
(54)
ШТАММ BACILLUS ДЛЯ ДОБАВКИ К КОРМУ ЖИВОТНЫХ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 12164087.4
(32) 2012.04.13
(33) EP
(43) 2015.01.30
(86) PCT/EP2013/057590
(87) WO 2013/153159 2013.10.17
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КР. ХАНСЕН А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Нильсен Беатрис, Кантор Метте Динес, Стуэр-Лауридсен Биргитте, Дерккс Патрик, Йохансен Эрик (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) BARBOSA TERESA M. ET AL.: "Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 71, no. 2, 1 February 2005 (2005-02-01), pages 968-978, XP002495034, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/ AEM.71.2.968-978.2005 cited in the application the whole document in particular Abstract; Materials and methods;
tables 3 and 5, page 973, column 1, paragraph 3 - page 974, column 2
CHAIYAWAN ET AL.: "Characterization and probiotic properties of Bacillus strains isolated from broiler", THE THAI JOURNAL OF VETERINARY MEDICINE, BANGKOK, vol. 40, no. 2, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 207-214, XP009161775, ISSN: 0125-6491 the whole document in particular Abstract; Materials and methods; tables 1, 2 page 209, column 2, line 24 - page 210, column 1, paragraph 2 Results section; page 210 - 213
XIAOHUA GUO ET AL.: "Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs", ANTONIE VAN LEEUWENHOEK, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 90, no. 2, 4 July 2006 (2006-07-04), pages 139-146, XP019390520, ISSN: 1572-9699, DOI: 10.1007/S10482-006-9067-9 cited in the application abstract
KLOSE V. ET AL.: "In vitro antagonistic activities of animal intestinal strains against swine-
associated pathogens", VETERINARY MICROBIOLOGY,
ELSEVIER BV, NL, vol. 144, no. 3-4, 26 August
2010 (2010-08-26), pages 515-521, XP027208319, ISSN:
0378-1135 [retrieved on 2010-02-20] cited in the application the whole document
SIMON M. CUTTING: "probiotics", FOOD MICROBIOLOGY, vol. 28, no. 2, 2011, pages 214-220, XP028360496, ISSN: 0740-0020, DOI: 10.1016/ J.FM.2010.03.007 [retrieved on 2010-03-24] cited in the application the whole document
(57) Изобретение относится к штамму Bacillus, используемуму в качестве добавки к корму для животных, выбранному из: (а) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839; (b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 и CHCC 15539 DSM 27033; (с) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841 и (d) мутанта любого из штаммов (а), (b) или (с), где в мутантном штамме менее 1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом (а), (b) или (с), причем любой из штаммов (а), (b), (с) или (d) характеризуется: (i) чувствительностью к ампициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, стрептомицину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу; (ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; и (iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации. Кроме того, предложены способ получения заявленного штамма, композиция на его основе и способ ее получения, способ получения корма для животных, а также способ кормления животного, предусматривающие использование предложенной композиции.
Область техники, к которой относится изобретение
Bacillus spp используют для пробиотических растворов в промышленности по производству кормов животных, и положительные действия пробиотиков на основе Bacillus на объем производства продуктов животноводства и здоровье хорошо известны (Spiehs et al., 2008; Cutting, 2011). Их использование связано со способностью Bacillus заменять или уменьшать применение антибиотиков, которые используются в качестве стимуляторов роста в промышленности по производству кормов для животных.
Однако существует неудовлетворенная потребность в отношении штаммов Bacillus, которые не имеют устойчивости к антибиотикам, против антибиотиков, которые обычно используют для людей. Данное изобретение представляет выделенные штаммы Bacillus, которые отличаются чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола и которые имеют также антимикробную активность против главных патогенов, таких как Е. coli и Clostridium perfringens. Эти штаммы имеют процент спору-ляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2, что делает возможным эффективное продуцирование безопасных и полезных спор Bacillus для производства кормов для животных.
Это изобретение дополнительно относится к применению спор штаммов Bacillus этого изобретения для производства кормовых добавок для животных, в частности продуктов для свиней и домашней птицы, где эти штаммы имеют пробиотическое действие (стимулирующее здоровье, утилизацию корма и рост).
Уровень техники изобретения
Свиньи, особенно поросята, страдают от поноса, то есть диареи, которая может быть вызвана бактериями, такими как Escherichia coli (E. coli) и Clostridium perfringens типов А и С (С. perfringens). Диарея может быть причиной смерти и тяжелых потерь продуктивности, включая в себя потерю массы, в случае отсутствия лечения.
Е. coli является первичной причиной диареи у поросят, и 50-75% антибиотиков, используемых в фермерских хозяйствах, используют против диареи отъема, первично вызываемой Е. coli. Диарея является самой большой проблемой в отлучаемом от матки и выращиваемом далее молодняке (вплоть до 40 кг), и Е. coli является наиболее важным патогеном, вызывающим диарею (Klose et al., 2010).
Кишечные клостридиальные инфекции у свиней встречаются преимущественно в периоде отъема, но также связаны с геморрагическим синдромом кишечника, поражающим свиней в заключительном периоде откорма. Хотя иммунизация к С. perfringens типа С в сильной степени уменьшала смертность перед отъемом, в настоящее время нет коммерческих вакцин к С. perfringens типа А. Инфекции С. per-fringens типа А теперь определяют с увеличивающейся частотой у свиней перед отъемом от матки, и подходы к диагностике и профилактике являются как различными, так и более сложными, чем подходы для инфекций типа С.
Несколько инфекций и заболеваний в домашних птицах вызываются патогенными бактериями, включающими Е. coli и Clostridium perfringens. Инфекции и заболевания, вызываемые патогенами, приводят к увеличенной смертности, уменьшенной производительности и увеличенным издержкам производства. Кроме того, многие из этих патогенов могут переноситься к людям. Птичий колибактериоз является системной инфекцией, вызываемой Е. coli, и встречается наиболее часто у молодых бройлеров и цыплят.
Пробиотики используются в применениях для здоровья животного для поддержания здоровой микрофлоры кишок, в том числе для уменьшения вредных бактерий, таких как Clostridia и Е. coli, и увеличения в полезных бактериях, таких как Lactobacillus spp. и Bifidobacterium. Пробиотики хорошо пригодны для поддержания здорового баланса между патогенными и полезными бактериями, так как в отличие от антибиотиков они не разрушают бактерии без разбора и не приводят к устойчивым к антибиотику штаммам патогенных бактерий. Существует много механизмов, посредством которых пробиотики поддерживают здоровую микрофлору кишечника: конкурентное исключение патогенных бактерий, уменьшение патогенных бактерий через продуцирование антимикробных веществ, увеличение роста и жизнеспособности полезной микрофлоры кишечника и стимуляция иммунной реакции в этом животном.
Ввиду вышеизложенного желательным было бы наличие одного или нескольких штаммов Bacillus для лечения или профилактики заболеваний, вызываемых инфекциями Е. coli и/или Clostridium у свиней и домашних птиц.
Guo et al., 2006, описывает скрининг штаммов Bacillus в качестве потенциальных пробиотиков и тест Bacillus subtilis МА139 у свиней. 124 пробы собирали у бройлера, свиней, из почв, ферментированных кормов и китайских трав. Из этих проб выделили 750 аэробных спорообразующих штаммов. Инги-бирующую активность против Е. coli K88 и K99, Salmonella и Staphylococcus aureus тестировали с использованием диффузионного анализа с диск-пластиной, 6 бацилл с наилучшей активностью тестировали на их выживаемость в имитирующих GIT-условиях (рН 2 и 0,3% желчная кислота). В. subtilis MA139 был наилучшим кандидатом, и его тестировали in vivo у поросят в 28-дневном испытании по откорму с 90 поросятами. ADG (средний суточный прирост массы) и потребление корма улучшались. Количества молочно-кислых бактерий увеличивались, количества Е. coli в фекалиях уменьшались. Однако антимикробную активность против Clostridium perfringens и чувствительность к антибиотикам не тестировали.
Barbosa et al., 2005, описывает выделение 237 Bacillus из фекалий у органически (в контакте с почвой) выращенных бройлеров. Были охарактеризованы изоляты в количестве 31. Среди них были В. sub-tilis и В. licheniformis. Несколько штаммов В. subtilis strains обнаружили ингибирование в отношении С. perfringens и S. aureus. В. licheniformis также обнаруживал действие против С. perfringens. Однако ни один из выделенных изолятов Bacillus не проявлял антимикробной активности против Е. coli, как определено в данной заявке. Один отобранный изолят Bacillus показывает уменьшение в интенсивности роста, но не завершает ингибирование против штамма Е. coli O78:K80 и не действует против другого тестируемого штамма Е. coli (см. табл. 5). Данные по проценту споруляции после 2 дней инкубирования или по чувствительности относительно ванкомицина, канамицина, стрептомицина и клиндамицина не представлены.
Chaiyawan et al., 2010, описывают штамм Bacillus sp. Т3-1, который является чувствительным к антибиотикам, широко используемым в медицинском лечении, и который проявляет антимикробную активность к С. perfringens ATCC 15191. Этот штамм не имеет антимикробной активности против Е. coli 0157. Данные по проценту споруляции после 2 дней инкубирования не представлены.
Benitez et al., 2011, недавно сообщили, что присутствие интактной или инактивированной Е. coli увеличивало синтез антимикробных пептидов штаммом Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006.
US 7754469 относится к микроорганизмам и способам для лечения домашней птицы, a US 8021654 относится к способам лечения свиней штаммами Bacillus.
Однако ни в одной из этих статей и ни в одном из этих патентов нет какого-либо описания или предположения для отбора штаммов Bacillus, которые являются чувствительными в отношении антибиотиков, которые обычно используются для людей, имеют антимикробную активность как к Clostridium perfringensr так и к Е. coli, и имеют высокий процент споруляции для получения штамма, применимого для эффективной споруляции, и, следовательно, производства пробиотика Bacillus.
Ни один из документов предшествующего уровня техники, например, Barbosa et al., 2005, Chaiy-awan et al., 2010 и Guo et al., 2006, не раскрывает штаммов, имеющих чувствительность в отношении антибиотиков, которые обычно используют для людей, антимикробную активность в смысле ингибирова-ния роста как против Clostridium perfringens, так и против Е. coli, и высокий процент споруляции.
В целом, в предшествующем уровне техники, относящемся к скринингу штаммов Bacillus, не представлены три выдающихся признака настоящего изобретения, т. е. чувствительность в отношении антибиотиков, которые обычно используют для людей, антимикробную активность против Е. coli и Clostrid-ium perfringens и высокий процент споруляции. Предшествующий уровень техники также не обеспечивает штаммы Bacillus, удовлетворяющие этим трем критериям.
Сущность изобретения
Задачей, которая должна быть решена данным изобретением, является представление штамма Bacillus, который отличается чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, ка-намицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола; антимикробной активностью против Е. coli и Clostridium perfringens и процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2.
Это решение основано на способе отбора, разработанного авторами этого изобретения для идентификации улучшенных штаммов Bacillus, имеющих эти улучшенные свойства.
Одной основной стадией этого способа отбора является специфический скрининг на штаммы Bacillus, которые являются чувствительными в отношении антибиотиков, которые обычно используют для людей. Более конкретно эти штаммы подвергают скринингу на чувствительность в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола.
Дополнительно эти штаммы подвергают скринингу на антимикробную активность против Е. coli и Clostridium perfringens и на наличие процента споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2.
Из 261 изолята из почвы и фекалий и источников корма, исследуемых авторами этого изобретения, 161 изолят был устойчивым к антибиотикам в предварительном тесте скрининга, описанном в примерах. Из этих 100 изолятов, которые были чувствительны к антибиотикам, 56 имели антимикробное действие против Clostridium perfringens и только 22 имели действие как против Е. coli, так и против Clostridium perfringens. Из них 12 изолятов были из вида В. amyloliquefaciens. Другие репрезентативные штаммы были из видов В. subtilis и В. mojavensis. Табл. 2 и 3 суммируют результаты изготовленных штаммов Chr. Hansen (22 из 32 штаммов, отобранных для вторичного скрининга).
Процесс отбора был сосредоточен на i) безопасности, ii) действии и iii) высокой споруляции в средах, подходящих для продуцирования. Аспект безопасности основан в основном на отсутствии устойчивости к антибиотикам, которое является важным вследствие увеличивающихся случаев устойчивых бактерий в человеке. Эти бактерии приводили к хорошо известным заболеваниям, которые уже не могут быть обработаны антибиотиками, когда эти патогенные бактерии стали устойчивыми.
Хорошо известно, что Bacillus может продуцировать вещества, которые могут иметь антимикробную активность, такие как бактериоцины, бактериолитические ферменты или суфрактины. Этот второй критерий отбора, действие против Е. coli и Clostridium perfringens, является важным, когда оба патогена
являются главными причинами диареи у свиней и домашних птиц. Этот эффект тестируют против трех штаммов Е. coli и против Clostridium perfringens типа А, но предполагается, что эти результаты являются показателями для общего действия против Е. coli и для действия против других типов Clostridia, таких как Clostridium perfringens типа С.
Третий критерий отбора является важным для производства пробиотика. Процесс производства пробиотика имеет место в ферментерах, выращивающих Bacillus, и в конце этого процесса необходима высокая скорость споруляции для высокой эффективности производства. Процесс споруляции Bacillus исследовался в течение многих лет, но все еще имеется масса вопросов. Таким образом, среди специалистов в данной области, работающих с производством и процессом развития Bacillus, хорошо известно, что некоторые штаммы Bacillus имеют очень низкую скорость споруляции. Предполагалось, что Bacillus дифференцируется в субпопуляции специализированных клеток, т. е. в сообщества, которые продуцируют ферменты для деградации комплексных нутриентов и сообществ, которые умирают (Lopez and Kolter, 2010). Предполагается, что эта дифференцировка регулируется внеклеточными сигналами, большинство из которых продуцируется самим Bacillus. Таким образом, существовала гипотеза, что высокое продуцирование ферментов или антимикробных веществ может приводить к низкой эффективности споруляции. Таким образом, для специалиста в данной области является неожиданным и удивительным, что штамм Bacillus может иметь как антимикробную активность, так и высокий процент споруляции.
Описание чертежа
Чертеж показывает схематически антимикробную активность 261 штамма Bacillus. Удивительно, что многие штаммы Bacillus amyloliquefaciens имеют антимикробное действие.
Подробное описание этого изобретения
Постепенное сокращение антибиотических стимуляторов роста в Европейском союзе в 2006 году привело к увеличенной потребности в кормовых добавках с экономическим показателем "затраты-эффективность" с высокой эффективностью и, следовательно, к потребности в новых пробиотиках.
Пробиотические кормовые добавки на основе Bacillus известны из-за их высоких положительных действий на здоровье и продуцирование у свиней и домашних птиц. Эти продукты являются релевантными для кормовой промышленности, так как споры являются теплостойкими и могут выживать в процессе гранулирования при температуре вплоть до 90-95°С.
Пробиотики для свиней должны быть безопасными для животных, людей и окружающей среды и должны увеличивать рост и коэффициент утилизации корма животного. Целью данного изобретения был скрининг в трех стадиях широкого диапазона аэробных эндоспорообразующих бактерий (АЕВ) из разных источников на их пробиотическое действие у свиней. АЕВ выделяли из ферментированного корма (Kantong и первичные стартеры Gergoush), фекалий свиней, почвы и различных коллекций культур. 261 изолят АЕВ идентифицировали секвенированием генов 16S рДНК и исследовали на соответствующую устойчивость к антибиотикам определением минимальной ингибирующей концентрации (MIC) нескольких релевантных антибиотиков.
Дополнительные анализы включали в себя толерантность к желчи и кислотам, ингибирование патогенами, рост в различных средах, споруляцию, а также взаимодействие с клеточными линиями животного для оценивания сходства положительных действий на плотные контакты в кишечной системе. Результаты показывают высокое различие как между видами, так и между штаммами. Этими выделенными штаммами были сначала род Bacillus, включающий в себя В. amyloliquefaciens, В. subtilis и В. safensis из кормовых источников, В. subtilis, В. pumilus, В. amyloliquefaciens, В. licheniformis, В. megaterium из фекалий и В. licheniformis и В. simplex из почвы.
Многие из этих изолятов обнаруживали нежелательную устойчивость к антибиотикам выше критического уровня, определенного с использованием EFSA, и были отброшены по соображениям безопасности. Хороший рост наблюдали для большинства этих штаммов при выращивании в течение ночи в телячьем инфузионном бульоне, тогда как 16% имели неудовлетворительный рост в среде, подходящей для ферментации. В стадии 2 этого процесса скрининга 32 выбранных штамма без устойчивости к антибиотикам идентифицировали секвенированием гена gyrB и с использованием PFGE-фингерпринтинга. Кроме того, их антимикробное действие на выбранные патогены тестировали и наблюдали значительную вариацию между изолятами. Несколько из этих изолятов обнаруживали ингибирование Clostridium per-fringens, тогда как только малое число изолятов ингибировали Е. coli. Таким образом, эти результаты данного изобретения подтверждают, что ингибирование роста как Clostridium perfringens, так и Е. coli объединены только редко. Стадия 3 этого процесса скрининга включала в себя 10 штаммов с высоким ингибированием патогенов и включала в себя определение термостойкости спор, секвенирование генома и дополнительные стадии in vitro, показывающие их действие на плотные контакты.
Данное изобретение обеспечивает штаммы Bacillus, отличающиеся i) чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритомицина, клиндамици-на, тетрациклина и хлорамфеникола.
Под термином "чувствительность в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канами-цина, стрептомицина, эритомицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола" имеется в виду, что штамм, рассматриваемый в качестве чувствительного к конкретному антибиотику, должен расти при
критическом уровне, приведенном EFSA (EFSA, 2008), изображенном в табл. 1.
Величины MIC, изображенные в табл. 1, основаны на руководствах, изданных EFSA (Техническое руководство, приготовленное с использованием панели добавок и продуктов или веществ, используемых в корме для животных (FEEDAP) в коррекции критериев, используемых в оценивании бактериальной устойчивости к антибиотикам, важным для человека и важным в ветеринарии, журнал EFSA (2008) 732, 1-15 обеспечивает перечень антибиотиков и приемлемых пороговых величин для рода Bacillus. Критический уровень, даваемый EFSA для ампицилина в отношении Bacillus, не существует, однако критический уровень существует для нескольких других бактерий, т. е. Lactobacillus spp. Таким образом, эта чувствительность штаммов Bacillus против ампициллина была выбрана в качестве критического уровня для данного изобретения.
Чтобы находиться в объеме данного изобретения, этот штамм должен быть чувствительным в отношении всех вышеупомянутых антибиотиков. На практике это означает, что не наблюдается рост этого штамма при критическом уровне при тестировании способом микроразведения (минимальной ингиби-рующей концентрации (MIC)).
Согласно данному изобретению MIC измеряют способом микроразведения бульона, как изображено посредством стандарта CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute M07-A8 and M45-A2), выполняемым следующим образом.
Суспензию ночного роста подлежащего тестированию штамма инокулируют в бульоне ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473) в микротитрационных планшетах при приблизительной концентрации 105 КОЕ/мл (колониеобразующие ед/мл) в двухкратных серийных разведениях подлежащего тестированию антибиотика (общий объем 100 мкл на лунку) и инкубируют аэробно в течение 20-24 ч при 37°С. Могут быть использованы предварительно сфабрикованные панели VetMIC Lact-1 и Lact-2, содержащие антибиотики ампициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритомицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол. Эти результаты регистрируют после 24 ч при самой низкой концентрации антибиотика для ингибирования видимого роста.
Первая часть аспекта ii) этого изобретения относится к штамму Bacillus, который проявляет антимикробную активность против Е. coli. Согласно данному изобретению ее измеряют посредством капельного теста Е. coli на агаре, выполняемого следующим образом:
9 мл телячьего инфузионного бульона (VIB) инокулируют с подлежащей тестированию культурой Bacillus и инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Одновременно 9 мл сердечно-мозговой вытяжки (BHI) инокулируют со штаммом Е. coli, отобранным из Е. coli 0149 (0149:k91, k88a), Е. coli 0147 (0147:К89 F4) и Е. coli 0101 (0101, F5), и инкубируют в течение ночи при 37°С.
Ночные культуры Е. coli добавляют в объеме 2 мл, каждая в 200 мл жидкого агара при 50°С, и выливают в каждую чашку для биоанализа. Чашки сушат в стерильном ламинарном шкафу. Эту ночную культуру Bacillus, подлежащую тестированию, наносят в виде пятен на поверхность агара VIB, смешанного с Е. coli, и инкубируют при 37°С в течение 2 дней. Радиусы зон ингибирования вокруг пятен и диаметры пятен регистрируют.
Считается, что штамм Bacillus проявляет антимикробную активность в отношении Е. coli, если зона ингибирования равна по меньшей мере 1,5 мм. Предпочтительно зона ингибирования равна по меньшей мере 2,0 мм, например 2,5 мм, более предпочтительно по меньшей мере 3 мм, наиболее предпочтительно 3,5 мм и даже более предпочтительно по меньшей мере 4 мм. Эта зона ингибирования может быть различной для различных штаммов Е. coli. Чтобы штамм мог считаться штаммом, проявляющим антимикробную активность против Е. coli, по данному изобретению он должен проявлять зону ингибирования по меньшей мере 1,5 мм для всех из тестируемых штаммов Е. coli. Предпочтительно эта зона ингибирова
ния двух или даже более предпочтительно зона ингибирования всех трех штаммов Е. coli равна по меньшей мере 2 мм. Один штамм Bacillus этого изобретения характеризуется ингибированием роста Е. coli, в частности ингибированием роста этих тестируемых видов. Как показано предыдущим уровнем техники и подтверждено авторами этого изобретения, отсутствие ингибирования роста одного вида Е. coli часто объединено с отсутствием ингибирования роста другого вида Е. coli (табл. 5, Barbosa et al., 2005) и vice versa, т. е. ингибирующая активность одного вида Е. coli часто объединена с ингибирующей активностью другого вида Е. coli (табл. 1, Guo et al., 2006).
Вторая часть аспекта ii) этого изобретения относится к штамму Bacillus, который проявляет антимикробную активность против Clostridium perfringens. Согласно данному изобретению ее измеряют посредством капельного теста пятен Clostridium perfringens на агаре, выполняемого следующим образом:
9 мл VIB инокулируют с культурой Bacillus, подлежащей тестированию, и инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Одновременно 9 мл бульона BHI инокулируют С. perfringens типа A, DSM 756, и инкубируют в течение ночи при 37°C в анаэробном сосуде.
Культуры Bacillus наносят в виде пятен на поверхность агара VIB в чашках Петри и инкубируют при 37°С в течение ночи. Ночную культуру С. perfringens в объеме 2 мл смешивают с 200 мл жидкого агара BHI и выливают на агар VIB с растущими пятнами Bacillus. Эти чашки инкубируют анаэробно при 37°С в течение 1 дня. Радиусы осветленных зон вокруг этих пятен измеряют.
Считается, что штамм Bacillus проявляет антимикробную активность в отношении Clostridium per-fringens, если зона ингибирования равна по меньшей мере 5 мм. Предпочтительно эта зона ингибирова-ния равна по меньшей мере 6 мм, более предпочтительно по меньшей мере 7 мм. Штамм Bacillus этого изобретения характеризуется ингибированием роста Clostridium perfringens, в частности ингибированием роста тестируемых видов. Как известно квалифицированному в данной области специалисту, отсутствие ингибирования одного вида часто объединяется с отсутствием ингибирования роста другого вида Clos-tridium perfringens и vice versa, т. е. ингибирование роста одного вида Clostridium perfringens часто объединено с ингибированием роста другого вида Clostridium perfringens.
Клетки Bacillus существуют в виде споровых клеток Bacillus и вегетативных клеток Bacillus. При ссылке на клетки Bacillus эта ссылка относится к обеим.
Термин "спора Bacillus" в отношении споровой клетки Bacillus относится к споре, которая в соответствии с данной областью может быть охарактеризована как покоящаяся, прочная, нерепродуктивная структура, продуцируемая бактериями Bacillus. Первичной функцией спор является обычно обеспечение выживания бактерии на протяжении периодов внешнего стрессового воздействия. Таким образом, они являются резистентными к ультрафиолету и гамма-излучению, высушиванию, лизоциму, температуре, голоданию и химическим дезинфицирующим средствам. Споры обычно обнаруживаются в почве и воде, где они могут выживать в течение продолжительных периодов времени. Оболочка споры является непроницаемой для многих токсичных молекул и может также содержать ферменты, которые участвуют в прорастании. Это ядро имеет нормальные клеточные структуры, такие как ДНК и рибосомы, но является метаболически неактивным. Когда бактерия детектирует, что внешние условия становятся неблагоприятными, она начинает процесс споруляции, который занимает приблизительно 8 ч.
Термин "вегетативная клетка Bacillus" относится к функциональным вегетативным клеткам Bacillus, которые могут делиться для продуцирования большего количества вегетативных клеток.
В аспекте iii) это изобретение относится к штамму Bacillus, которые проявляет процент споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2. Согласно данному изобретению процент споруляции анализируют следующим образом:
штамм Bacillus, подлежащий тестированию, добавляют в объеме 50 мкл в 700 мкл VIB в планшете с глубокими лунками (DW) и инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Эту ночную культуру Bacillus в объеме 50 мкл переносят в 700 мкл среды споруляции, содержащей (м/м) 95% воды; 1,5% источник азота (т. е. дрожжи); 3% сахарозы; 0,06% микроминералов; дикалийгидрофосфат 0,1% в планшетах DW. Этот планшет инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение 3 дней.
Споруляцию наблюдают микроскопически и процент спор (количество спор в сравнении с общим количеством клеток Bacillus) определяют визуальным оцениванием после 1 дня (24 ч), 2 дней (48 ч) и 3 дней (72 ч) инкубации.
Под термином "имеющие процент споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2" имеется в виду, что по меньшей мере 80% этих клеток спорулировались после 2 дней инкубации. Процент споруляции может быть предпочтительно более высоким, таким как по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%. Одной важной целью данного изобретения является отбор на штаммы Bacillus, имеющие клетки с высоким процентом споруляции, чтобы сделать этот штамм применимым для производства корма для животных. Высокий процент споруляции, который может быть назван высокой скоростью споруляции, является необходимым для высокой эффективности производства, как описано выше.
Как описано выше, известный уровень техники описал способы для отбора штаммов Bacillus, но способы скрининга известного уровня техники не фокусировались на проценте споруляции. Таким образом, маловероятно, что отобранные с известным уровнем техники штаммы Bacillus спорулируются в до
статочной степени для требуемого процента споруляции, как описано здесь.
Три штамма, имеющих объединенную способность свойств высокого роста и споруляции, не имеющих устойчивости к антибиотикам и высокой антимикробной активности, выбирали и депонировали. Но также другие штаммы, в частности штаммы видов Bacillus amyloliquefaciens (см. штаммы D-J в табл. 2 и 3) удовлетворяют критериям, описанным в формуле этого изобретения и, следовательно, включены в объем данного изобретения.
Как видно из фиг. 1, в частности, многие штаммы вида Bacillus amyloliquefaciens находятся в объеме данного изобретения. Удивительно, что многие штаммы Bacillus amyloliquefaciens имеют антимикробное действие, так как до сих пор предполагалось, что антимикробное действие рода Bacillus является штаммспецифическим и не относящимся к видам.
На основе этих подробных описаний анализов квалифицированный в данной области специалист способен повторять эти анализы для определения, согласуется ли конкретный штамм Bacillus с чувствительностью пункта (i), антимикробной активностью пункта (ii) и процентом споруляции пункта (iii) различных аспектов этого изобретения. Таким образом, специалист с обычной квалификацией в данной области будет способен стойко продуцировать штаммы с указанными свойствами. Предпочтительно этот способ отбора будет также включать в себя (iv) анализ на чувствительность этих вегетативных клеток при pH 4 и (v) анализ на устойчивость к желчи для гарантии, что эти штаммы способны выживать до достаточной степени в желудочно-кишечном тракте. Очевидно, что эти анализы могут выполняться в любом порядке, и некоторые штаммы могут исключаться во время этого процесса, если они не удовлетворяют этим критериям.
Из литературы известно, что желчь имеет некоторые отрицательные влияния на выживание и прорастание и вырост споровых клеток Bacillus в вегетативные клетки в GIT (желудочно-кишечном тракте) животных.
Таким образом, пробиотические бактерии будут обычно способны выживать и пролиферировать в кишечнике животных, будучи способными выдерживать низкий pH и будучи резистентными к желчным солям для того, чтобы быть применимыми в качестве пробиотических композиций Bacillus для добавления к корму животных. В этом смысле эти примеры обеспечивают полезные тесты in vitro. Тест на чувствительность к низкому pH (воспроизводящий условия в желудке) фокусируется на устойчивости вегетативных клеток к pH 4. Хорошо известно, что споры являются устойчивыми при величинах pH 2-3, и что вегетативные клетки будут умирать при pH 2. Однако pH желудка может иметь величины pH до 4, особенно в условиях кормления. Это может приводить к прорастанию спор, и, следовательно, уместным является тестирование чувствительности вегетативных клеток при pH 4. Отобранные штаммы должны быть предпочтительно устойчивыми к pH 4. Результаты, относящиеся к отобранным штаммам, представлены в табл. 2.
Штаммом этого изобретения является род Bacillus, предпочтительно один из видов Bacillus amylo-liquefaciens, такой как Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens или Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum, Bacillus simplex, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilusr Bacillus safensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus, Bacillus methylotrophicus, Bacillus siamensis, Bacillus vallismortis или Bacillus tequilensis.
Исходный способ идентификации 261 штамма был основан на 16S. Этот способ не может различать между некоторыми близкородственными видами Bacillus. Таким образом, некий штамм может быть идентифицирован как родственный относительно группы, состоящей из видов Bacillus atyloliquefa-ciens/atrophaeus/methylotrophicus/siamensis/ vallismortis, или группы, состоящей из видов Bacillus mo-javensis/subtilis/tequilensis. Обе группы содержат много штаммов, которые удовлетворяют критериям этого изобретения, и, следовательно, эти группы представляют важные варианты этого изобретения.
После признания подходящими эти штаммы дополнительно идентифицируют более детальным способом (gyr В)). Эти данные, показанные в табл. 2 и 3, первично основывались на Bacillus amylolique-faciens (идентифцированной по gyr В). Отобранные изоляты Bacillus amyloliquefaciens дополнительно идентифицировали анализом последовательности гена бета-субъединицы РНК-полимеразы (gyr В) и подвидов, идентифицированных и представленных в табл. 4, 5 и 6.
Желательным является проявление теплостойкости этим штаммом. Результаты для отобранных штаммов представлены в табл. 4. Теплостойкость при 99,5°С измеряют в КОЕ как уменьшение после 2,5 и 10 мин относительно времени 0 (log/log). Уменьшение ниже 2 достигается обычными коммерческими препаратами спор Bacillus. Для штаммов в объеме данного изобретения уменьшение должно быть предпочтительно 0,5 или менее после 2 мин, более предпочтительно 0,25 или менее, наиболее предпочтительно 0,05 или менее. В предпочтительных вариантах осуществления уменьшение после 5 мин должно быть предпочтительно 2,5 или менее, наиболее предпочтительно 0,5 или менее и после 10 мин уменьшение должно быть также предпочтительно 2,5 или менее, более предпочтительно 1 или менее, наиболее предпочтительно 0,5 или менее. Все эти штаммы в этой таблице проявляют подходящую теплостойкость. Как видно из этой таблицы, штаммы В, D и F имеют очень высокую теплостойкость даже после 10 мин. Заслуживает внимания то, что как В, так и F являются штаммами Bacillus amyloliquefaciens subsp. amylo-liquefaciens, что делает этот подвид предпочтительным вариантом данного изобретения.
Продуцирование ферментов исследовали в примере 4. Полученные данные показывают для всех исследованных штаммов целлюлазную активность 50 мЕ/мл или более. Предполагается, что такая активность будет выгодным свойством для штамма Bacillus этого изобретения. Для определенного варианта может быть предпочтительным, что этот штамм имеет даже более высокую целлюлазную активность, такую как 100 мЕ/мл или более, как обнаружено для штаммов В. amyloliquefaciens subsp. plantarum, что делает этот подвид предпочтительным вариантом данного изобретения. Для штаммов в объеме данного изобретения целлюлазная активность должна быть предпочтительно 50 мЕ/мл или более, более предпочтительно 100 мЕ/мл или более, наиболее предпочтительно 250 мЕ/мл или более, даже более предпочтительно 400 мЕ/мл или более.
Некоторые штаммы обнаруживают высокую ксиланазную активность 70 мЕ/мл или более. Табл. 5 показывает, что высокая целлюлазная активность исследованных штаммов необязательно объединена с высокой ксиланазной активностью или высокой протеазной активностью, определенных как 40000 RFU/OD или более. Штаммы G, I и J, которые все являются штаммами В. amyloliquefaciens subsp. planta-rum, являются примерами штаммов, демонстрирующих высокую активность для всех трех ферментов.
В одном предпочтительном варианте осуществления штаммом Bacillus является Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis или Bacillus amyloliquefaciens. Наиболее предпочтительно этот штамм выбран из группы, состоящей из штамма a) Bacillus mojavensis с номером доступа DSM 25839; b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens с номерами доступа DSM 25840, DSM 27032 или DSM 27033 и (с) штамма Bacillus sub-tilis с номером доступа DSM 25841; и их мутантных штаммов.
Другой аспект этого изобретения относится к способу получения мутантного штамма:
(a) штамма Bacillus mojavensis с номером доступа DSM 25839;
(b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens с номерами доступа DSM 25840, DSM 27032 или DSM 27033
или
(c) мутантного штамма Bacillus subtilis с номером доступа DSM 25841;
причем этот способ предусматривает необязательно подвергание этого штамма мутагенизационной обработке и отбору на мутантные штаммы, имеющие следующие свойства:
(i) чувствительность в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола;
(ii) антимикробную активность против Е. coli и Clostridium perfringens и
(iii) процент споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2.
Этот штамм может быть подвергнут мутагенизационной обработке, как описано более подробно ниже, для получения мутантных штаммов, и после этого выполняют процесс отбора. Альтернативно, отбор выполняют в отношении спонтанно встречающихся мутантов.
Этот способ получения мутантного штамма может также включать в себя (iv) анализ на чувствительность вегетативных клеток при pH 4 и (v) анализ на устойчивость к желчи для гарантии, что эти штаммы способны выживать до достаточной степени в желудочно-кишечном тракте. Очевидно, что эти анализы могут выполняться в любом порядке, и некоторые штаммы могут исключаться во время этого процесса, если они не удовлетворяют этим критериям.
Термин бактериальный "штамм" относится в данном контексте к бактерии, которая остается генетически неизмененной при росте или размножении. Множество идентичных бактерий включены в этот термин.
Термин "штамм дикого типа" относится к немутированной форме бактерии, обнаруживаемой в природе.
Термин "мутантная бактерия" или "мутантный штамм" относятся к природной (спонтанной, при-родно существующей) мутантной бактерии или индуцированной мутантной бактерии, содержащей одну или несколько мутаций в ее геноме (ДНК), которые отсутствуют в ДНК дикого типа. Одним "индуцированным мутантом" является бактерия, в которой эта мутация была индуцирована обработкой человеком, такой как любая обычно используемая мутагенизационная обработка, включающая в себя обработку химическими мутагенами, такими как химический мутаген, выбранный из (i) мутагена, который ассоциируется с ДНК или становится включенным в ДНК, такой как аналог основания, например 2-аминопурин или интерхелатирующий агент, такой как ICR-191, (ii) мутагена, который реагирует с ДНК, включающий алкилирующие агенты, такие как нитрозогуанидин или гидроксиламин, или этанметилсульфонат (EMS) или №метил-№-нитро^-нитрогуанидин (NTG), UV- или гамма-излучение и т. д. В отличие от этого "спонтанный мутант" или "природно-встречающийся мутант" не был мутагенизирован человеком.
Мутант может быть подвергнут действию нескольких мутагенизационных обработок (единственную обработку следует понимать как одну стадию мутагенизации с последующим стадией скрининга/отбора), но в настоящее время предпочитается выполнение не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадий скрининга/отбора). В предпочтительном в настоящее время мутанте менее 1, менее 0,1, менее 0,01, менее 0,001 или даже менее 0,0001% нуклеотидов в бактериальном геноме были заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении с материнским штаммом.
Мутантные бактерии, описанные выше, являются не-GMO, т. е. не модифицированы технологией рекомбинантных ДНК. В качестве альтернативы предпочтительного описанного выше способа обеспе
чения этого мутанта случайным мутагенезом можно обеспечивать такой мутант сайт-направленным (сайт-специфическим) мутагенезом, например, с использованием подходящим образом сконструированных ПЦР-способов или с использованием мобильного генетического (подвижного) элемента, который является интегрируемым в бактериальных репликонах.
При обеспечении этого мутанта в виде спонтанно встречающегося мутанта штамм дикого типа, описанный выше, подвергают стадии отбора без предшествующей обработки мутагенизацией.
Несколько видов Bacillus имеют статус GRAS, т. е. они обычно признаются как безопасные. Все штаммы В. subtilis являются GRAS (общепризнано безопасными). Описанные здесь штаммы Bacillus являются аэробными и факультативными спорообразующими штаммами. Штаммы Bacillus являются образующими только одну спору штаммами, которые считаются GRAS (общепризнано безопасными). Кормление скота микроорганизмами, которые имеют статус GRAS, является признанной практикой среди поставщиков, ветеринаров и других производителей в животноводстве на промышленной основе.
Таким образом, дополнительный аспект этого изобретения относится к композиции Bacillus, содержащей клетки штамма Bacillus этого изобретения. Эта композиция может содержать клетки по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех или даже больше штаммов Bacillus, выбранных по меньшей мере из одного из штаммов этого изобретения. Предпочтительно эти клетки композиции Bacillus являются споровыми клетками.
Релевантные штаммы Bacillus этой композиции могут присутствовать в коммерчески релевантной форме, известной квалифицированному в данной области специалисту.
Соответственн, в одном варианте штаммы Bacillus этой композиции присутствуют в виде высушенных (например, высушенных распылительной сушкой) клеток или в виде замороженных клеток. Эта композиция может быть обеспечена в любой подходящей форме, такой как форма жидкости, густой суспензии, порошка или кормовой гранулы.
В одном предпочтительном варианте осуществления композиция Bacillus содержит от 105 до 1012 КОЕ/г, более предпочтительно от 106 до 1012 КОЕ/г и наиболее предпочтительно от 107 до 1012 КОЕ/г.
Термин "КОЕ/г" относится к массе в граммах этой композиции, как таковой, включающей в себя подходящие релевантные добавки, присутствующие в этой композиции. Как известно специалисту с квалификацией в данной области, коммерчески релевантная бактериальная композиция обычно содержит другие релевантные добавки, такие как, например, один носитель/ингредиент из группы, принадлежащей сыворотке, пермеату сыворотки, карбонату кальция/известняку и предотвращающим слеживание (спекание) агентам, таким как силикаты алюминия и кизельгур (диатомовая земля). Эта композиция не включает в себя массу подходящего контейнера, используемого для упаковки композиции Bacillus. Один вариант относится к композиции, упакованной в подходящий контейнер.
Композиции данного изобретения могут включать в себя штамм Bacillus этого изобретения, включающий в себя мутанты, и носители, которые делают эти композиции подходящими для кормления животных в качестве кормовой добавки или в качестве добавки для питьевой воды. Альтернативно, штамм Bacillus этого изобретения, включающий в себя мутанты, может быть приготовлен с ингредиентами корма животных, включающими в себя кормовой белок и/или кормовые углеводы. Такие комбинации могут находиться в форме кормовых гранул, которые экструдируют посредством стандартных процессов гранулирования.
Эта описанная здесь композиция Bacillus может быть использована в качестве пробиотической добавки к корму животных. Это изобретение обеспечивает также способ получения корма животных или премикса, предусматривающий добавление композиции Bacillus этого изобретения к корму животных.
В данном контексте термин "премикс" относится к штамму Bacillus, добавляемому к носителю для получения премикса, который затем добавляют к корму при желаемой скорости включения и скармливают животному.
Другой аспект этого изобретения относится к способу кормления животного, предусматривающему введение композиции Bacillus этого изобретения, или корма, или премикса для животного, приготовленного в соответствии с этим изобретением, животному.
Пример 5 описывает испытания кормления со штаммами В и С и показывает, что пробиотические продукты обоих штаммов Bacillus, добавленные к рационам питомника, численно улучшали продуктивность в сравнении с группой отрицательного контроля. Во время этого испытания можно было наблюдать значительное действие на параметры продуктивности. Процент смертности уменьшался как в группах Bacillus, так и в обоих испытаниях.
В одном из этих участков количество животных, обрабатываемых на загон энрофлуксацином для преодоления тяжелой диареи, было значимо более высоким (P> 0,05) в животных, вскармливаемых контрольным рационом, чем животных, вскармливаемых Bacillus.
Таким образом, этот пример демонстрирует, что введение композиции Bacillus этого изобретения может быть использовано для лечения и предотвращения заболеваний, например ингибированием патогенов, таких как Е. coli и Clostridium, в этом животном. Эта композиция Bacillus может скармливаться непосредственно в виде микробов или в виде кормовой добавки к корму для животных. Композиции данного изобретения вводят или скармливают животному в количестве, эффективном для уменьшения
роста патогенных бактерий, таких как Clostridia и Escherichia coli в кишечнике этого животного.
Это животное может быть выбрано из группы, состоящей из домашней птицы, жвачных животных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыбы и домашних животных. В одном предпочтительном варианте осуществления этим животным является сельскохозяйственное животное, которое выращивается для потребления, такое как свиньи, или как продуценты пищи, такие как бройлеры и продуцирующие яйца курицы.
Обеспечены также способы введения одного или нескольких штаммов Bacillus этого изобретения поросенку. Такие способы могут включать в себя скармливание одного или нескольких штаммов Bacillus этого изобретения матке поросенка. Этот штамм (эти штаммы) можно скармливать во время беременности, лактации или в обоих случаях. Один или несколько штаммов Bacillus могут также скармливаться поросятам, находящимся в питомнике для поросят, и поросятам в заключительной стадии откорма.
Применения терминов "а" и "an" и "the" и подобных символов в контексте описания этого изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должны пониматься как включающие в себя как единственное, так и множественное число, если здесь нет другого указания или это не противоречит явно контексту. Термины "содержащий", "имеющий", "включающий в себя" и "вмещающий" должны пониматься как термины с открытым концом (т. е. означающие "включающие в себя, но не ограничивающиеся ими"). Перечисление диапазонов величин предназначено здесь только в качестве стенографического способа для ссылки индивидуально на каждую отдельную величину, попадающую в этот диапазон, если здесь нет других указаний, и каждая отдельная величина включена в это описание, как если бы она была индивидуально перечислена здесь. Все способы, описанные здесь, могут выполняться в любом подходящем порядке, если здесь нет другого указания или если они иным образом явно противоречат контексту. Применение любого или всех примеров или языка примера (например, "такой как"), обеспеченного здесь, предназначено просто для освещения этого изобретения и не для предложения ограничения в объеме этого изобретения, если нет другого заявления. Никакая фраза в этом описании не должна пониматься как указание любого незаявленного элемента в качестве существенного для применения к практике этого изобретения.
Депонированные штаммы.
Штамм Bacillus mojavensis CHCC 15510 был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) под номером доступа DSM 25839 с датой депонирования 3 апреля 2012 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Штамм Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) под номером доступа DSM 25840 с датой депонирования 3 апреля 2012 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Штамм Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15536 был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) под номером доступа DSM 27032 с датой депонирования 21 марта 2013 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Штамм Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15539 был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) под номером доступа DSM 27033 с датой депонирования 21 марта 2012 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Штамм Bacillus subtilis CHCC 15541 был депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorgan-ismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) под номером доступа DSM 25841 с датой депонирования 3 апреля 2012 года Chr. Hansen A/S, Denmark. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Для всех идентифицированных выше депонированных микроорганизмов применимы следующие дополнительные указания:
что касается соответствующих патентных ведомств соответствующих указанных государств, заявители требуют, чтобы пробы депонированных микроорганизмов, заявленных выше, становятся доступными только эксперту, назначенному заявителем, до даты, до которой этот патент предоставлен, или до даты, при которой эта заявка была отклонена, или отозвана, или предположительно является отозванной.
Варианты данного изобретения описаны ниже с использованием неограничивающих примеров.
Примеры
Материалы.
Телячий инфузионный бульон (VIB) (Difco, 234420).
Агар с телячьим инфузионным бульоном (VIB) (VIB+1,5% агар бактериологический (агар № 1), Oxoid LPOO11).
Чашки с агаром Т3 (на 1л: 3 г триптона, 2 г триптозы, 1,5 г дрожжевого экстракта, 0,05М натрий-дигидрофосфат и 0,005 MnCl2 (pH 6,8) и 15 г агара).
Бульон Laura-Bertani (LB) (г/л: бактотриптон 10 (Difco 0123), дрожжевой экстракт 5 (Oxoid L21), NaCl 10 (Merck № 106404)).
Бульон сердечно-мозговой вытяжки (BHI) (Oxoid CM225).
Агар с сердечно-мозговой вытяжкой (BHI) (Oxoid CM375).
Соли желчных кислот (желчный экстракт, свиной; Sigma В8631).
Чашки для проб для анализа (Nunc 240845).
Чашки Петри (Procudan 140096, чашки Петри с рубчиками).
Среда споруляции: % (м/м) 95% воды; 1,5% источника азота (т.е. дрожжи); 3% сахарида; 0,06% микроминералов; дикалий-гидрофосфат 0,1%.
Физиологический солевой раствор с пептоном (0,9% хлорид натрия, 1% пептон) FKP VetMIC Lact-1 и Lact-2 (SVA, Uppsala, Sweden).
Бульон ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473).
Культуры.
Штаммы Bacillus выделяли из фекалий, почвы, кормовых источников и собирали из коллекций банков и поддерживали в VIB с 20%-ным глицерином в основных чашках МТР при -80°С. Антибиотики.
Ампициллин (Sigma, A9518-5G). Ванкомицин (Sigma, V1764-250MG). Гентамицин (Sigma, G1264-50MG). Канамицин (Sigma, K137 7-1G). Стрептомицин (Sigma, S6501-5G). Эритромицин (Sigma E-5389). Клиндамицин (Sigma, C2569-10MG). Тетрациклин (Sigma T-7660). Хлорамфеникол (Sigma, C0378-5G). Патогены.
Е. coli 0101 F5 (State Serum Institute, Copenhagen, Denmark).
E. coli 0147:K89 F4 (State Serum Institute, Copenhagen, Denmark).
E. coli 0149:k91, k88a (NCTC 10650) National Collection of Type Cultures.
Штаммы Е. coli поддерживали в LB с 20%-ным глицерином в основных чашках МТР при -80°С. Clostridium perfringens Type A, DSM 756, поддерживали в BHI с 20%-ным глицерином при -80°С. Пример 1. Предварительный скрининг.
261 изолят из почвы, фекалий и кормовых источников подвергали предварительному скринингу на чувствительность к антибиотикам, ингибирование патогенов и чувствительность к низкому pH.
1.1. Чувствительность к антибиотикам.
Штаммы Bacillus добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в 700 мкл VIB в планшеты DW (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Пробы ISO-теста, дополненные антибиотиками, перечисленные в табл. 1, при 2 концентрациях и ISO-контроли без антибиотиков добавляли в чашки МТР в объеме 180 мкл. Ночные культуры Bacillus разводили в 100 раз и переносили в аликвоты 20 мкл в пробы ISO-теста и контроли. Чашки МТР инкубировали при 37°С. Оптическую плотность (OD) при 620 нм измеряли в инокуляте и в тест-чашках МТР после 24 и 48 ч инкубирования. Чувствительность к антибиотикам бактерий оценивали в виде процента OD в пробах ISO-теста относительно OD в ISO-контролях.
1.2. Скрининг штаммов Bacillus на ингибирование патогенов.
Штаммы Bacillus добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек чашек МТР в 700 мкл VIB в планшеты DW (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи.
Перед этим анализом штаммы Е. coli выращивали в LB в течение ночи при 30°С. С. perfringens CHCC14372 выращивали в BHI в течение ночи в анаэробном сосуде при 37°С.
1.2.1. Ингибирование Е. coli посредством агарового капельного теста.
2 мл ночной культуры Е. coli перемешивали с 200 мл жидкого агара VIB при 50°С и выливали в каждую чашку биоанализа. Эти чашки сушили в стерильном боксе. Ночные культуры Bacillus, 2 мкл каждая, наносили в виде пятен на поверхность VIB-агара, смешанного с Е. coli, и инкубировали при 37°С в течение 2 дней. Радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих пятен измеряли и регистрировали как "высокий" - радиус больший чем 2 мм, "средний" - радиус между 0,5-2 мм и "низкий" - радиус, меньший чем 0,5 мм.
1.2.2. Ингибирование С. perfringens посредством агарового капельного теста.
VIB-агар наливали в чашки для биоанализа (200 мл на чашку) и основательно сушили в стерильном боксе. Ночные культуры Bacillus, 2 мкл каждая, наносили в виде пятен на поверхность чашек с VIB
агаром и инкубировали при 37°С в течение ночи. С. perfringens типа А СНСС14372 добавляли в объеме 2 мл к 200 мл жидкого агара BHI, перемешивали и наносили осторожно в чашки для биоанализа с пятнами Bacillus. Эти чашки инкубировали анаэробно при 37°С в течение 1 дня.
Радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих пятен измеряли и регистрировали как "высокий" - больший чем 2 мм, "средний" - между 1 и 2 мм и "низкий" - меньший чем 1 мм.
1.2.3. Ингибирование С. perfringens посредством диффузионного луночного теста.
2 мл ночной культуры Е. coli перемешивали с 200 мл жидкого агара BHI и выливали в каждую чашку биоанализа. После отверждения делали лунки 10 мм в агаре BHI стерильным сверлом и 80 мкл ночной культуры Bacillus переносили в каждую лунку. Чашки инкубировали анаэробно при 37°С в течение 1 дня. Радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих лунок измеряли и регистрировали как "высокий" - больший чем 2 мм, "средний" - между 1-2 мм и "низкий" - меньший чем 1 мм.
1.3. Анализ резистентности к желчи.
Штаммы Bacillus добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в 700 мкл VIB в планшеты DW (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Ночные культуры Bacillus в объеме 50 мкл переносили в 800 мкл VIB, дополненный 0,3% желчными солями (тест-пробы) и VIB без желчи (контроли) в DW-планшетах (с глубокими лунками). Планшеты инкубировали при 37°С и 175 об/мин. Оптическую плотность при 620 нм (OD620) измеряли при времени 0,6 и 24 ч в VIB с желчью и вычитали из соответствующих величин OD620 в VIB-контролях. Культуры ранжировали в соответствии с различиями в величинах OD620 в группы A (OD <0,1), В (OD=0,1-0,4) и С (OD> 0,4). Штаммы в группе А рассматривали как наиболее резистентные к желчным солям. Отобранные штаммы должны находиться в группе А или В. Результаты для отобранных штаммов представлены в табл. 2.
1.4. Чувствительность к низкому pH (моделирующему условия в желудке).
Аликвоты VIB 800 мкл, установленные на pH 4 1,0М хлористо-водородной кислотой, и VIB-контроли (pH 7) распределяли в DW-планшетах. Штаммы Bacillus добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в DW-планшеты и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение 24 ч. Оптическую плотность (OD620) измеряли в 200 мкл клеточных суспензий при времени 0 и после 24 ч инкубирования. Бактериальный рост при pH 4 определяли вычитанием величин OD620 перед инкубированием из соответствующих величин после инкубирования. Культуры, показывающие увеличение в OD620, большее чем 0,1, рассматривали как резистентные к pH 4 (указанные как R в табл. 2), тогда как культуры с величинами OD620, меньшими чем 0,1 (отсутствие роста или отрицательные величины), рассматривали как чувствительные к pH 4 (указанные как S в табл. 2).
1.5. Результаты предварительного скрининга.
На основе этого теста предварительного скрининга были отобраны 32 штамма для вторичного скрининга. Отобранные штаммы должны быть чувствительными в отношении описанных антибиотиков и проявлять антимикробное действие как против Е. coli, так и против Clostridium perfringens, и выступать приемлемо в других выполняемых тестах.
Из количества 261 этих изолятов из почвы и фекалий и кормовых источников изоляты в количестве 161 были устойчивыми к антибиотикам в тесте предварительного скрининга. Из 100 изолятов, которые были чувствительными к антибиотикам, 56 имели антимикробное действие против Clostridium perfrin-gens и только 22 имели действие как против Е. coli, так и против Clostridium perfringens. Из них 12 изоля-тов были из вида В. amyloliquefaciens. Другие репрезентативные штаммы были из видов В. subtilis и В. mojavensis. Табл. 2 и 3 суммируют эти результаты патентованных Chr. Hansen штаммов (22 из 32 штаммов, отобранных для вторичного скрининга).
Пример 2. Вторичный скрининг.
На основе результатов первичного скрининга 40 отобранных изолятов и ссылочных штаммов тестировали на ингибирование патогенов повторением агаровых капельных тестов и на споруляцию. 32 штамма тестировали также на чувствительность к антибиотикам с использованием MIC-теста.
2.1. Скрининг штаммов Bacillus на ингибирование патогенов.
Перед анализом 9 мл VIB инокулировали культурами Bacillus и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Одновременно 9 мл бульона BHI инокулировали штаммами Е. coli и инкубировали в течение ночи при 37°С. Clostridium perfringens выращивали при тех же самых условиях в анаэробном сосуде.
2.1.1. Ингибирование Е. coli с использованием агарового капельного теста.
Ночные культуры патогенов добавляли в объеме 2 мл, каждой, в 200 мл жидкого VIB-агара при 50°С и выливали в каждую чашку биоанализа. Чашки сушили в стерильном боксе.
Ночные культуры Bacillus наносили в виде пятен на поверхность VIB-агара, смешанного с патогенами, и инкубировали 37°С в течение 2 дней. Радиусы зон ингибирования вокруг пятен и диаметры пятен регистрировали.
2.1.2. Ингибирование С. perfringens с использованием агарового капельного теста.
Культуры Bacillus наносили в виде пятен на поверхность VIB-агара в чашках Петри и инкубировали при 37°С в течение ночи. Ночную культуру С. perfringens в объеме 2 мл смешивали с 200 мл жидкого BHI-агара и выливали в VIB-агар с выросшими пятнами Bacillus. Эти чашки инкубировали анаэробно
при 37°С в течение 1 дня. Измеряли радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих пятен.
2.2. Рост в VIB и в среде спору ляции.
Штаммы Bacillus добавляли в объеме 50 мкл основных планшетов МТР в 700 мкл VIB или среды споруляции в DW-планшетах (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение 24 ч. Бактериальный рост определяли по оптической плотности при 620 нм (OD620) в 200 мкл суспензий. Вследствие высокой мутности среды споруляции и ее варьирования между лунками величины OD620 перед инкубированием вычитали из величин OD620 в соответствующих лунках после инкубирования. Культуры, показывающие OD620, большее чем 0,4, ранжировали в группу А (высокий рост), и OD620, меньшее чем 0,4, в группу В (низкий рост).
2.3. Споруляция в среде споруляции.
Штаммы Bacillus добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в 700 мкл VIB в DW-планшетах и инкубировали при 37°C и 175 об/мин в течение ночи. Ночные культуры Bacillus в объеме 50 мкл переносили в 700 мкл среды споруляции (SM) в DW-планшетах.
Планшеты инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение 3 дней. Споруляцию наблюдали микроскопически, и процент спор (количество спор относительно общих клеток) определяли визуальным оцениванием после 1 дня (24 ч), 2 дней (48 ч) и 3 дней (72 ч) инкубирования.
2.4. Чувствительность к антибиотикам, измеренная с использованием MIC.
Эти штаммы анализировали на чувствительность к антибиотикам измерением минимальной инги-бирующей концентрации (MIC) для ряда антибиотиков. Используемым способом был способ микроразведения бульона, описанный стандартом CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов М07-А8 и М45-А2).
Суспензию ночного роста, подлежащую тестированию, инокулируют в бульон ISO-SENSITEST (Oxoid CM0473) в микротитрационных планшетах при приблизительной концентрации 105 КОЕ/мл (ко-лониеобразующих ед/мл) в двукратных серийных разведениях тестируемого антибиотика (общий объем 100 мкл/лунка) и инкубировали аэробно в течение 20-24 ч при 37°С. Могут быть использованы предварительно сфабрикованные панели VetMIC Lact-1 и Lact-2, содержащие антибиотики амипициллин, ван-комицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол. Эти результаты регистрируют после 24 ч в виде самой низкой концентрации антибиотика для ингибирования видимого роста. Этот тест выполняли дважды в виде независимых биологических повтор-ностей.
2.5. Результаты.
Результаты из 32 отобранных штаммов показали, что Bacillus amyloliquefaciens имела наилучшие объединенные свойства чувствительности к антибиотикам, антимикробного действия и споруляции (ср. табл. 2). Включены только данные патентованных Chr. Hansen штаммов (22 из 32 штаммов).
Таблица 2
Базовые данные для отобранных штаммов Bacillus. Источник, вид по gyr В, рост в VIB и среде споруляции, а также процент споруляции. Штамм А=15510; штамм В=15516; штамм С=15541; штамм Н=15536; штамм 1=15539.
Рост
Споруляция,
Устойчивость
День
День
День
Штаммы Источник
Вид
к антибиотикам
VIВ
Фекалии
B.mojavensis
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
B.subtilis
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
LMG
В. amyloliquefaciens
Чувствительный
Фекалии
B.licheniformis
Чувствительный
Почва
В. licheniformis
Устойчивый
Почва
В. megaterium
Устойчивый
Фекалии
B.subtilis
Чувствительный
Фекалии
В. pumilus
Устойчивый
Фекалии
В. licheniformis
Устойчивый
Фекалии
В. licheniformis
Устойчивый
немного
Фекалии
В. pumilus
Чувствительный
Почва
В. megaterium
Устойчивый
Почва
В. licheniformis
Устойчивый
немного
Фекалии
B.subtilis
Устойчивый
Пример 3. Теплостойкость.
3.1. Способ для теста теплостойкости.
Штаммы Bacillus выращивали в течение ночи в VIB при 37°С и 220 об/мин. Ночные культуры распределяли на чашках с агаром T3 (100 мкл 105-106 разведений) и инкубировали при 37°С в течение 1-2 дней, пока не завершалась споруляция. Споры выскребали из этих чашек, суспендировали в растворе FKP и инкубировали при 80°С в течение 15 мин для инактивации вегетативных клеток.
Суспензии спор помещали на лед сразу же после нагревания. Препараты спор промывали дважды в FKP, ресуспендировали в FKP с 20% глицерином и хранили при 80°С перед применением. Теплостойкость бактериальных спор оценивали удерживанием пробирок Эппендорфа с 500 мкл в FKP (при концентрации приблизительно 1x106 КОЕ на мл) при 99,5°С в течение 2, 5 и 10 мин. Количества КОЕ определяли в разведениях нагретых суспензий, посеянных на VIB-агар, после инкубирования при 37°C в течение ночи.
3.2. Результаты теста на теплостойкость. Данные теплостойкости показаны в табл. 4.
Обычно уменьшение меньшее чем 2 (log/log) КОЕ после 2 мин относительно времени 0 является подходящим для спор, подлежащих включению в корм для гранулирования, и результаты ниже 2 достигаются с обычными коммерческими препаратами спор Bacillus. Таким образом, все штаммы, тестирован
ные и показанные в табл. 4, имеют хорошую теплостойкость. Некоторые штаммы также показали хорошую теплостойкость после 5 и 10 мин, а именно штамм В и штамм F, оба В. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens, которые не обнаруживали уменьшения КОЕ. Пример 4. Получение ферментов.
4.1. Способ для анализа целлюлазы.
Штаммы Bacillus выращивали в карбоксиметилцеллюлозной среде (CMC) (Abou-Taleb et al., 2009) (на л: 10,0 г карбоксиметилцеллюлозы (С9481), 2,0 г Бакто Триптона (кат. 211705, Becton Dickinson A/S, Denmark), 4 г KH2PO4, 4,0 г Na2HPO4, 0,2 г MgSO4-7H2O, 0,001 г CaCl2-2H2O, 0,04 г FeSO4-7H2O, pH 7) при 37°С и сильном магнитном перемешивании в течение 24 ч. Продуцирование целлюлазы определяли с использованием набора EnzChek Cellulase Substrat (кат. Е33953, Life Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце супернатанты культур собирали центрифугированием и распределяли в МТР (200 мкл на лунку) в серийных разведениях. Стандартные кривые конструировали с использованием целлюлазы из Aspergillus niger, начиная от 2 Е/л. Раствор субстрата EnzChek добавляли к культу-ральным супернатантам в 96-луночных планшетах Nunc Black FluoroNunc (кат. 237105, Thermo Fisher Scientific, NUNC Inc.). Флуоресценцию регистрировали при возбуждении 360 нм/испускании 420 нм после 30-минутной инкубации (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc.). Активность целлюлазы рассчитывали из стандартных кривых в двух независимых экспериментах и выражали как средние величины (Е/мл).
4.2. Способ для анализа ксиланазы.
Культуры Bacillus выращивали в среде, содержащей ксилан древесины бука (Cordeiro et al., 2002) (на л: 5,0 г ксилана (Х4252), 2,0 г дрожжевого экстракта (кат. 288620, Becton Dickinson A/S, Denmark), 5,0 г Бакто Пептона (кат. 211677, Becton Dickinson A/S, Denmark), 0,5 г NaCl, 0,5 г MgSO4-7H2O, 0,15 г CaCl2-2H2O, pH 7,5) при 37°С и сильном магнитном перемешивании в течение 24 ч. Анализ ксиланазы выполняли с использованием набора EnzChek Ultra Xylanase Assay (кат. E33650, Life Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце супернатанты культур собирали центрифугированием и распределяли в МТР (200 мкл на лунку) в серийных разведениях и добавляли рабочий раствор субстрата ксиланазы. Флуоресценцию в культуральных супернатантах измеряли при возбуждении 360 нм/испускании 420 нм после инкубирования в течение 30 мин (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc.) - Thermomyces lanuginosis (X2753) использовали в качестве стандартного фермента и загружали в МТР в серийных разведениях, начиная от 25 мЕ на мл. Активность ксиланазы рассчитывали из стандартных кривых и выражали в виде средних величин (мЕ/мл) двух независимых анализов.
4.3. Способ для анализа протеазы.
Ночные культуры Bacillus (росшие в VIB при 37°C) переносили в реакционную смесь с флуорес-цеинизотиоцианатом (FITC-C) в виде субстрата (Sigma C3777) и инкубировали при 37°С 3 ч. После преципитации количество растворимых пептидов измеряли посредством флуоресценции при возбуждении 497 нм, испускании 515 нм. Этот анализ детектирует широкий диапазон протеаз (серина, аспарагиновой кислоты, цистеина и металлопротеаз).
4.4. Методы для получения биопленки.
Штаммы Bacillus добавляли в VIB (приблизительно 107 КОЕ/мл), распределяли в полипропилен (РР) МТР (9б-луночные Conical Btm PP Pit Natural; NUNC Inc., Denmark) и инкубировали при 37°C в течение 24 ч без встряхивания. Рост контролировали измерениями оптической плотности (OD) при 620 нм. Образование биопленки оценивали с использованием окрашивания кристаллическим фиолетовым красителем, как описано ранее (Auger et al., 2009). Вкратце после промывания этих лунок дистиллированной водой раствор кристаллического фиолетового красителя 0,1% (м/о) добавляли к РР-МТР, и эти планшеты инкубировали в течение 30 мин. Затем процедуру промывания повторяли и в эти планшеты добавляли этанол 96% (о/о). Поглощение при 570 нм измеряли после 15 мин ингибирования (Wallac Victor2-спектромер, Perkin Elmer Inc.). Штаммы Bacillus spp. классифицировали либо как высокие (ADS570 нм> 2,0), средние (ADS570 нм=1,0-2,0) или низкие (ADS570 нм <1,0) продуценты биопленки. Этот анализ выполняли в двух повторностях.
4.5. Результаты для анализов ферментов.
4.5.
Эта таблица показывает, что штаммы Е, G, Н, I и J, которые все являются В. amyloliquefaciens subsp. plantarum, имеют высокую целлюлазную активность, тогда как штаммы В и F, которые являются В. amy-loliquefaciens subsp. amyloliquefaciens, имеют низкую целлюлазную активность.
Пример 5. Испытания на поросятах.
Два отобранных штамма Bacillus (штамм В или С) добавляли к рациону питомника для оценивания их действия на показатели роста и смертность поросят после отъема. Поскольку Е. coli является одним из главных патогенов в период пребывания в питомнике с большим воздействием на параметры продуктивности и смертность, эти испытания могут дать информацию о действии на ингибирование Е. coli в этих животных. Эти испытания выполняли в 2 различных участках; участком 1 было экспериментальное хозяйство, а участком 2 был университет. Схема испытания была одинаковой в обоих участках.
5.1.1. Экспериментальная схема на участке 1.
В день отъема 576 поросят (28-дневных) из двух последовательных партий (288 поросят в каждой), происходящих из экспериментальной фермы, использовали в этом эксперименте. Поросятами были поросята кроссбреда (первого поколения от скрещивания неродственных особей) (АСМСxPietrain). Отобранные поросята были здоровыми, с хорошим общим видом и не получали никакой вакцинации в фазе питомника. Эта экспериментальная ферма была положительной в отношении свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRS), но была под контролем и имела некоторые проблемы колибактериоза в фазе после отъема. Этих поросят сортировали по массе тела и затем распределяли в 48 загонах в обеих партиях отъема (96 загонов в целом), так что каждый блок загонов содержал 6 поросят, 3 некастрированных самцов и 3 самок, со сходной массой тела в обеих обработках. Эти обработки распределяли в загоны легких и тяжелых поросят по блоку, так что каждую обработку применяли к 24 загонам из 6 поросят (6 загонов на обработку и помещение; 12 загонов на обработку и партию отъема). Продукты Bacillus добавляли к корму при 400 г на тонну корма или l,28x107 КОЕ на г корма.
Свиней индивидуально взвешивали в дни 28 (день 0; день отъема), 35, 42 и 63 возраста для расчета среднего ежедневного прироста массы (ADWG). Среднее ежедневное потребление корма (ADFI) и затрату корма на единицу продукции (FCR) измеряли на загон в одних и тех же фазах (28-35; 35-42; 42-63) и для основных периодов (престартер: возраст 28-42 дней; стартер: возраст 42-63 дня и общий период питомника). Смертность и случаи патологий контролировали один раз в день, в том числе регистрацию индивидуальных применяемых обработок антибиотиками.
Таблица 7
Параметры продуктивности на участке 1. Р-величины в сравнении с контролем (А:Р <0,1; а <0,05). Штамм В=15516; штамм С=15541, SE - стандартная ошибка
продуктивность в сравнении с группой отрицательного контроля, без проявления различий между ними. Существенные действия как на ADG, так и на FU можно было наблюдать в фазе престартера (возраста 28-42 дней). Процент смертности уменьшался в обеих группах Bacillus (% смертности: контроль (3,47), штамм В (1,39%), штамм С (2,08)).
5.2.1. Экспериментальная серия в участке 2.
Сразу же после отъема всех поросят содержали в отъемном отделении из 24 загонов с 30 животными на один загон. Это отделение оборудовано центральным обогреванием и принудительной вентиляцией с системой охлаждения и полностью покрытыми шифером полами. Каждый загон оборудован коммерческой двухсторонней кормушкой для полужидких-сухих кормов для гарантии кормления ad libitum и свободного доступа воды с возможностью одновременного кормления трех животных. Корм распределяли ad libitum на протяжении всей экспериментальной фазы.
В целом использовали 720 коммерческих скрещенных поросят-отъемышей (Pietrainx(Land-racexLarge White)). Этих животных получали от свиноматок одной и той же фермы в день отъема и перемещали в экспериментальные установки (без транспортирования). Использовали самцов и самок 26-дневных поросят 7,0 кг, SD=1,64 BW (по массе). Использовали идентификационную пластиковую ушную бирку с номером животного. Этих животных распределяли в три блока по начальной массе тела. Таким образом, каждый блок состоял из 8 загонов 30 животных, в которые случайным образом назначали экспериментальные рационы.
Испытание начинали при отъеме в возрасте 28 дней. Животных по отдельности взвешивали в дни 0 и 7, и группу взвешивали в дни 21 и 35 в испытании. Исчезновение корма из каждого бункера измеряли на протяжении этого эксперимента. Таким образом, рассчитывали среднее суточное потребление корма (ADFI), средний суточный прирост (ADG) и затрату корма на прирост продукции (FCR) в соответствии с общим потреблением корма. Состояние здоровья поросят оценивали регулярно и регистрировали любые аномальные признаки или лекарственное лечение. Рассчитывали показатель смертности и процент выбраковки.
Таблица 8
Показатели продуктивности в участке 2. Средние величины наименьших квадратов, Р-величины в сравнении с контролем (А:Р <0,1).
5.2.2. Результаты.
Оба штамма Bacillus, добавленные к рационам питомника, численно улучшали продуктивность в сравнении с группой отрицательного контроля без обнаруживания различий между ними. Существенное действие как на ADG, так и на FU можно было наблюдать в периодах испытания.
Количество животных, обработанных на один загон энрофлуксацином для преодоления тяжелой диареи, было значимо более высоким (Р> 0,05) у животных, которых кормили с Bacillus во время первой недели после отъема. Такие же результаты (Р <0,05) наблюдали в течение всего экспериментального периода ((0-35 дней после отъема). Процент смертности уменьшался в обеих группах Bacillus (% смертности: контроль (4,17), штамм В (0,04%), штамм С (2,65)).
Ссылки
Barbosa et al., 2005, Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract, Applied and Environmental Microbiology, 968-978
Benitez et al., 2011, Antimicrobial Activity of Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 is enhanced in the Presence of Escherichia coli, Curr Microbiol 62, 1017-1022
Chaiyawan et al., 2010, Characterization and probiotic properties of Bacillus strains isolated from broiler, The Thai Journal of Veterinary Medicine, 40, 2, 207-214
Cutting, S. M. 2011. Bacillus probiotics. Food Microbiology 28 (2):214-20.
EFSA 2008. Technical Guidance. Update of antibiotic resistance criteria. The EFSA Journal 732, 9-15
Guo et al, 2006, Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs, Antonie van Leeuwenhoek 90:139-146
Klose et al., 2010. In vitro antagonistic activities of animal intestinal strains against swine-associated pathogens. Vet. Microbiology 144:515-521.
Lopez, D., and R. Kolter. 2010. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in bacillus subtilis. FEMS Microbiol . Rev. 34 (2):134-149.
Spiehs, M. J., G. C. Shurson, and L. J. Johnston. 2008. Effects of two direct-fed microbial on the ability of pigs to resist an infection with salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Swine Health and Production. 16(1):27-36.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Штамм Bacillus, используемый в качестве добавки к корму для животных, выбранный из:
a) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839;
b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 и CHCC 15539 DSM 27033;
c) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841;
d) мутанта любого из штаммов а), b) или с), где в мутантном штамме менее 1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или
с),
причем любой из штаммов а), b), с) или d) характеризуется:
i) чувствительностью к ампициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, стрептомицину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу;
ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; и
iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.
2. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).
3. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).
4. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).
5. Штамм Bacillus по п.1, где в мутантном штамме менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), b) или с).
6. Способ получения мутантного штамма, выбранного из:
a) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839;
b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 или CHCC 15539 DSM 27033; или
c) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841;
где способ предусматривает мутагенез штамма а), b) или с), при котором происходит замена или делеция менее 1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с), и отбор мутантного штамма, характеризующегося:
i) чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стреп
томицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола;
ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens;
iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.
7. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).
8. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).
9. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).
10. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), b) или с).
11. Композиция для добавления к корму животных, содержащая по меньшей мере один штамм Bacillus по любому из пп.1-5.
12. Композиция по п.11, содержащая по меньшей мере два штамма Bacillus по любому из пп.1-5.
13. Композиция по п.11 или 12, содержащая по меньшей мере три штамма Bacillus по любому из пп.1-5.
14. Композиция по любому из пп.11-13, где клетки указанных штаммов Bacillus находятся в форме
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
спор.
15. Способ получения корма для животных с пробиотической добавкой, предусматривающий добавление композиции по любому из пп.11-14 в качестве премикса к корму для животных.
16. Способ кормления животного, отличающийся тем, что для кормления используют композицию по любому из пп.11-14.
17. Способ кормления животного по п.16, где указанное животное, выбрано из домашней птицы, жвачных животных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыб и домашних животных.
028359
- 1 -
028359
- 1 -
028359
- 1 -
028359
- 1 -
028359
- 4 -