EA 028357B1 20171130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/028357 Полный текст описания [**] EA201171388 20100511 Регистрационный номер и дата заявки FR0953133 20090512 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок FR2010/050915 Номер международной заявки (PCT) WO2010/130946 20101118 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21711 Номер бюллетеня [**] ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ПРОТОФИБРИЛЛЯРНОЙ ФОРМЕ БЕТА-АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА Название документа [8] C07K 16/18, [8] G01N 33/68, [8] A61K 39/395, [8] A61P 25/28 Индексы МПК [FR] Борен Николя, [FR] Бланш Франсис, [FR] Камерон Беатрис, [FR] Дюшен Марк, [FR] Миколь Венсан, [FR] Нэми Суад, [FR] Прадье Лоран, [FR] Ши И Сведения об авторах [FR] САНОФИ Сведения о патентообладателях [FR] САНОФИ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000028357b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Гуманизированное антитело, специфичное к протофибриллярной форме пептида А- β, отличающееся тем, что указанное антитело содержит CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:16, 18 и 20 соответственно, CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20 соответственно или CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 30 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20, и отличающееся тем, что оно связывается с пептидами А- β, агрегированными в сенильные бляшки, но не с диффузными отложениями пептидов А- β.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 15, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.

3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.

4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 29, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.

5. Антитело по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что вариабельная часть его тяжелой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:28.

6. Антитело по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что вариабельная часть его легкой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 99%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:24.

7. Антитело по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:28.

8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что оно содержит легкую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:24.

9. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:6 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:8.

10. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:6 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:24.

11. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:28 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:24.

12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающиееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:26.

13. Антитело по любому из пп.1-12, отличающееся тем, что оно содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:22.

14. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:2 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:4.

15. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:2 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.

16. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:26 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.

17. Антитело по любому из пп.1-16, отличающееся тем, что оно вызывает уменьшение амилоидных бляшек.

18. Антитело по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что его сродство к протофибриллярной форме пептида А- β по меньшей мере в 100 раз выше его сродства к другим формам этого пептида.

19. Гуманизированное антитело, специфичное к протофибриллярной форме пептида А- β, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6, и легкую цепь, включающую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8.

20. Антитело по п.19, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, включающую полипептидную последовательность SEQ ID NO:2, и легкую цепь, включающую полипептидную последовательность SEQ ID NO:4.

21. Антитело по п.19, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, состоящую из полипептидной последовательности SEQ ID NO:2, и легкую цепь, состоящую из полипептидной последовательности SEQ ID NO:4.

22. Применение антитела по любому из пп.1-21 в лечении заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями.

23. Применение антитела по любому из пп.1-21 в лечении болезни Альцгеймера.

24. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-21 и эксципиенты.

25. Способ лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что он включает введение пациенту антител по любому из пп.1-21.

26. Клетка, продуцирующая антитело по любому из пп.1-21, отличающаяся тем, что указанная клетка трансформирована вектором, обеспечивающим экспрессию тяжелой и легкой цепей указанного антитела.

27. Способ получения антитела по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что он включает культивирование клеток по п.26 и очистку антитела из указанной культуры клеток.

28. Лекарственное средство для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями, содержащее антитело по любому из пп.1-21.

29. Полинуклеотид для экспрессии тяжелых цепей антитела по п.1, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:2, 6, 26 или 28.

30. Полинуклеотид для экспрессии легких цепей антитела по п.1, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:4, 8, 22 или 24.

31. Полинуклеотид для экспрессии тяжелых цепей антитела по п.1, отличающийся тем, что он содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:1, 5, 25 или 27.

32. Полинуклеотид для экспрессии легких цепей антитела по п.1, отличающийся тем, что он содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:3, 7, 21 или 23.

33. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.29-32.

34. Клетка-хозяина для продуцирования гуманизированного антитела, специфичного к протофибриллярной форме пептида А- β, содержащая вектор по п.33.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Гуманизированное антитело, специфичное к протофибриллярной форме пептида А- β, отличающееся тем, что указанное антитело содержит CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:16, 18 и 20 соответственно, CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20 соответственно или CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 30 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20, и отличающееся тем, что оно связывается с пептидами А- β, агрегированными в сенильные бляшки, но не с диффузными отложениями пептидов А- β.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 15, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.

3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.

4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 29, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.

5. Антитело по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что вариабельная часть его тяжелой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:28.

6. Антитело по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что вариабельная часть его легкой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 99%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:24.

7. Антитело по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:28.

8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что оно содержит легкую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:24.

9. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:6 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:8.

10. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:6 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:24.

11. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:28 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:24.

12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающиееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:26.

13. Антитело по любому из пп.1-12, отличающееся тем, что оно содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:22.

14. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:2 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:4.

15. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:2 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.

16. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:26 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.

17. Антитело по любому из пп.1-16, отличающееся тем, что оно вызывает уменьшение амилоидных бляшек.

18. Антитело по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что его сродство к протофибриллярной форме пептида А- β по меньшей мере в 100 раз выше его сродства к другим формам этого пептида.

19. Гуманизированное антитело, специфичное к протофибриллярной форме пептида А- β, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6, и легкую цепь, включающую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8.

20. Антитело по п.19, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, включающую полипептидную последовательность SEQ ID NO:2, и легкую цепь, включающую полипептидную последовательность SEQ ID NO:4.

21. Антитело по п.19, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, состоящую из полипептидной последовательности SEQ ID NO:2, и легкую цепь, состоящую из полипептидной последовательности SEQ ID NO:4.

22. Применение антитела по любому из пп.1-21 в лечении заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями.

23. Применение антитела по любому из пп.1-21 в лечении болезни Альцгеймера.

24. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-21 и эксципиенты.

25. Способ лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что он включает введение пациенту антител по любому из пп.1-21.

26. Клетка, продуцирующая антитело по любому из пп.1-21, отличающаяся тем, что указанная клетка трансформирована вектором, обеспечивающим экспрессию тяжелой и легкой цепей указанного антитела.

27. Способ получения антитела по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что он включает культивирование клеток по п.26 и очистку антитела из указанной культуры клеток.

28. Лекарственное средство для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями, содержащее антитело по любому из пп.1-21.

29. Полинуклеотид для экспрессии тяжелых цепей антитела по п.1, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:2, 6, 26 или 28.

30. Полинуклеотид для экспрессии легких цепей антитела по п.1, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:4, 8, 22 или 24.

31. Полинуклеотид для экспрессии тяжелых цепей антитела по п.1, отличающийся тем, что он содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:1, 5, 25 или 27.

32. Полинуклеотид для экспрессии легких цепей антитела по п.1, отличающийся тем, что он содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:3, 7, 21 или 23.

33. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.29-32.

34. Клетка-хозяина для продуцирования гуманизированного антитела, специфичного к протофибриллярной форме пептида А- β, содержащая вектор по п.33.


Евразийское 028357 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201171388
(22) Дата подачи заявки 2010.05.11
(51) Int. Cl.
C07K16/18 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01)
(54) ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ПРОТОФИБРИЛЛЯРНОЙ ФОРМЕ БЕТА-АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА
(31) 0953133
(32) 2009.05.12
(33) FR
(43) 2012.05.30
(86) PCT/FR2010/050915
(87) WO 2010/130946 2010.11.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
САНОФИ (FR)
(72) Изобретатель:
Борен Николя, Бланш Франсис, Камерон Беатрис, Дюшен Марк, Миколь Венсан, Нэми Суад, Прадье Лоран, Ши И (FR)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) SCHUPF NICOLE ET AL.: "Peripheral Abeta subspecies as risk biomarkers of Alzheimer's disease." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 16 SEP 2008, vol. 105, no. 37, 16 September 2008 (2008-09-16), pages 14052-14057, XP002567834 ISSN: 1091-6490, page 14056, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 1
WO-A1-2007108755
WO-A1-2006081171
WO-A2-0246237
WO-A1-2005123775
WO-A2-2009065054
(57) Изобретение относится к гуманизированным антителам, специфичным к протофибриллярной форме бета-амилоидного пептида, содержащим CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:16, 18 и 20 соответственно, CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20 соответственно или CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 30 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20, которые связываются с пептидами А-Р, агрегированными в сенильные бляшки, но не с диффузными отложениями пептидов А-Р; а также к применению указанных антител в области болезни Альцгеймера.
Объектом настоящего изобретения являются гуманизированные антитела, специфичные к прото-фибриллярной форме Р-амилоидного пептида. Объектом настоящего изобретения является также применение этих антител в терапии, диагностике и/или профилактике, в частности в связи с возникновением и развитием нейродегенеративных нарушений и/или заболеваний, связанных с отложением амилоидных бляшек, в частности с болезнью Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, которое затрагивает значительную часть пожилого населения. Эта болезнь характеризуется в клиническом плане потерей памяти и ослаблением когнитивных функций, в невропатологическом плане присутствием в головном мозге нейрофибриллярных внутриклеточных отложений и внеклеточных отложений Р-амилоидного пептида (А-Р), образующих амилоидные бляшки (Yanker et al. Nature Med., vol 2, NO:8 (1996)). К этим признакам добавляется большое число других аномальных изменений, включая ухудшение иммунных и воспалительных систем, а также ухудшение митохондриальной функции, которые могут привести к повышению оксидативного стресса, активации механизмов апоптоза и в конечном счете к гибели клеток.
Амилоидные бляшки состоят в основном из пептидов А-Р с 40 или 42 остатками, которые образуются в протеолитическом процессе белка-предшественника Р-амилоидного пептида (АРР). Внеклеточные отложения пептидов А-Р представляют раннюю и неизменную характеристику всех форм AD, включая семейные формы (FAD). FAD появляются относительно рано (между 40 и 60 годами) и обусловлены мутациями в гене АРР в 5% случаев FAD (у> 20 семей) с шестью простыми или двойными миссенс-мутациями; в гене пресенилина-1 (PS-1) в 50-70% случаев FAD (у> 200 семей) с более чем 80 различными мутациями, идентифицированными к настоящему времени; и в гене пресенилина-2 (PS-2) в меньшем числе случаев FAD с 2 миссенс-мутациями, описанных у 8 семей. Было продемонстрировано, что мутации в этих трех генах вызывают изменения в протеолизе АРР, что ведет к сверхсинтезу А-Р и раннему появлению патологии и симптомов, которые похожи на симптомы спорадических форм AD.
Токсичность амилоидных бляшек в нейронах коренится, по-видимому, в фибриллах со значительной молекулярной массой, которые образуются в результате агрегации растворимых пептидов А-Р в фибриллярные формы, сначала растворимые (называемые также протофибриллярной формой), которые затем превращаются в нерастворимые формы в амилоидных бляшках. Действительно, было показано in vitro, что растворимый пептид А-Р постепенно агрегировал в фибриллярную форму (c-a-d, которую можно выделить такими агентами, как конго красный или тиофлавин S, которые распознают третичные структуры в листке бета пептидов/белков) с высокой молекулярной массой (> 200 кДа), но еще растворимую. Так как эта форма растворима, ее часто называют протофибриллярной формой, тогда как фибриллы, полученные в результате еще более сильной агрегации, ведут к потере растворимости. Переходные протофибриллярные формы обычно рассматривают как предшественники амилоидных волокон, которые могут быть ответственны за клеточные дисфункции и потерю нейронов при болезни Альцгеймера и при других заболеваниях, связанных с агрегацией белков.
Было показано, что сенильные амилоидные бляшки (то есть агрегированные, их называют также зрелыми бляшками) коррелируют с когнитивным статусом у пациентов с болезнью Альцгеймера в отличие от диффузных отложений пептида А-Р, которые также широко присутствуют у пациентов, не затронутых этой болезнью (Duyckaerts et al., Neurobiol. Aging 1997; 18: 33-42 и Jellinger et al. 1998; 54:77-95). Таким образом, воздействие, в частности, на эти сенильные амилоидные бляшки позволит более специфически и эффективно лечить патологию Альцгеймера.
Было испытано много подходов для предотвращения образования пептидов А-Р, как, например, ин-гибирующих процесс протеолиза АРР.
Были испытаны такие стратегии иммунотерапии, как введение антител анти-АР (для уменьшения отложения амилоидов) или иммунизация антигенами пептидов А-Р (чтобы стимулировать гуморальный ответ) в целях уменьшить размер и плотность бляшек.
Был, например, описан (США 7179463) способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение антител, направленных к протофибриллам, имеющим мутацию Arctic внутри области, кодирующей пептид А-Р. Реально не было описано какого-либо примера антител. Кроме того, не было приведено какого-либо сравнения сродства антител к пептидам в зависимости от молекулярной массы этих пептидов. В других патентах (США 6761888 и 6750324) раскрыты антитела, распознающие различные эпитопы по длине аминокислотной последовательности пептида А-Р42. Была подана международная заявка (WO 2007/108756), относящаяся к антителам, специфичным к протофибриллам, но описанные антитела распознают одновременно пептиды А-Р с высокой молекулярной массой и олигомеры со средней массой. Кроме того, ничего не говорится о сродстве антител к зрелым бляшкам в сравнении с их сродством к диффузным бляшкам.
Несмотря на современное развитие знаний о болезни Альцгеймера всегда имеется потребность в композициях и способах лечения и/или профилактики этой патологии при максимально ограниченных побочных эффектах. Антитела, которые описаны в настоящем изобретении, гуманизированные и специфичные к протофибриллярной форме пептидов А-Р, имеют целью решить эту задачу. Позволяя распо
знавать сенильные амилоидные бляшки, а не диффузные бляшки, антитела, являющиеся объектом настоящего изобретения, распознают патологические бляшки намного более эффективно, чем антитела, которые распознают все формы А-Р и которые будут удерживаться по большей части на диффузных отложениях или на растворимых формах мономерного или низкомолекулярного пептида А-Р.
Кроме того, благодаря распознаванию только протофибриллярных форм пептидов А-Р, а не прото-фибриллярных форм других белков, не связанных с болезнью Альцгеймера, предотвращается ненужное связывание, способное уменьшить концентрацию антител, эффективных в отношении этого заболевания.
Гуманизированные мышиные антитела по всему настоящему описанию будут обозначаться как антитела 13С3.
Последовательности, которые могут кодировать или составлять гуманизированные антитела, являющиеся объектом настоящего изобретения, представлены в табл.2.
Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, специфически связывающимся с протофибриллярной формой пептида А-Р, т.е. с высокомолекулярным пептидом.
В более предпочтительном варианте антитела связываются с пептидом А-Р, имеющим молекулярную массу выше 200, 300, 400 или 500 кДа.
Согласно одному варианту осуществления антитела, являющиеся объектом изобретения, связываются с пептидами А-Р, агрегированными в сенильные бляшки, а не с диффузными отложениями пептидов А-Р.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела, являющиеся объектом изобретения, специфически связываются с протофибриллярными формами пептида А-Р, но не с другими белками амилоидной структуры (как, например, IAPP - Islet Amyloid Polypeptide, островковый амилоидный полипептид).
Настоящее изобретение относится также к гуманизированным антителам, имеющим сниженные эффекторные функции, что позволяет ограничить такие отрицательные эффекты, как появление микрокровотечений и вазогенных отеков.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела, являющиеся объектом изобретения, больше не обладают эффекторными функциями.
В еще более предпочтительном варианте осуществления антитела представляют собой иммуноглобулин G4, домен Fc которого подвергся мутациям, снижающим синтез полумолекул.
В еще более предпочтительном варианте осуществления антитела представляют собой иммуноглобулин G4, домен Fc которого подвергся мутациям, снижающим эффекторную активность.
Объектом настоящего изобретения являются гуманизированные антитела, содержащие
CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:16, 18 и 20 соответственно,
CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20 соответственно или
CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 30 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20.
Объектом настоящего изобретение являются также гуманизированные антитела, содержащие CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 15, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.
В другом варианте осуществления антитела, являющиеся объектом изобретения, содержат CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела содержат CDR, кодируемые нуклео-тидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 29, 31, 17 и 19, или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела, являющиеся объектом изобретения, имеют вариабельную часть их тяжелой цепи (VH), которая содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:28.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела, являющиеся объектом изобретения, имеют вариабельную часть их легкой цепи (VL), которая содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 99%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:24.
В еще более предпочтительном варианте осуществления антитела имеют тяжелую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:28.
В другом варианте осуществления антитела имеют легкую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:24.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела содержат полипептидные последовательности SEQ ID NO:6 и 8.
В другом варианте осуществления антитела содержат полипептидные последовательности SEQ ID NO:6 и 24.
В другом варианте осуществления антитела содержат полипептидные последовательности SEQ ID NO:28 и 24.
Объектом настоящего изобретение являются также антитела, содержащие тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:26.
В одном предпочтительном варианте осуществления антитела содержат легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:22.
Другим объектом изобретения являются антитела, последовательность которых содержит полипептидные последовательности SEQ ID NO:2 и 4.
Другим объектом изобретения являются антитела, последовательность которых содержит полипептидные последовательности SEQ ID NO:2 и 22.
Другим объектом изобретения являются антитела, последовательность которых содержит полипептидные последовательности SEQ ID NO:26 и 22.
Другим объектом изобретения являются гуманизированные антитела к пептиду А-Р, имеющие сродство к протофибриллярной форме пептида А-Р по меньшей мере в 100 раз выше их сродства к другим формам этого пептида.
Другим объектом изобретения являются антитела, характеризующиеся тем, что они вызывают уменьшение амилоидных бляшек.
Другим объектом изобретения является применение гуманизированных антител к пептиду А-Р в лечении заболеваний, связанных с нейродегенеративными нарушениями, в частности в лечении болезни Альцгеймера.
Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая гуманизированные антитела к пептиду А-Р и эксципиенты.
Другим объектом изобретения является способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту гуманизированных антител антипептид А-Р.
Другим объектом изобретения является клетка или клетки, продуцирующие гуманизированные антитела к пептиду А-Р, а также способ получения этих антител, включающий культивирование указанных клеток. Такие клетки предпочтительно получают из одной клеточной линии.
Одним объектом изобретения является лекарственное средство, содержащее гуманизированные антитела к пептиду А-Р.
Одним объектом изобретения является полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:2, 4,
6, 8, 22, 24, 26 или 28.
Другим объектом изобретения является полинуклеотид, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 21, 23, 25 или 27.
Другим объектом изобретения является рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, имеющую одну из последовательностей SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 21, 23, 25 или 27, а также клетка-хозяина, содержащая указанный вектор.
Определения.
Специфическое связывание понимают как разницу по меньшей мере примерно в 10, 20, 30, 40, 50 или 100 раз между силой связи с одним рецептором по сравнению с другим, здесь между связыванием с протофибриллярной формой пептида А-Р и связыванием с другими формами пептида.
Под "эпитопом" понимают участок антигена, с которым связываются антитела. Если антиген является полимером, таким как белок или полисахарид, эпитоп может быть образован смежными или несмежными остатками. Здесь эпитоп является конформационным, то есть связанным с трехмерной структурой протофибриллярного пептида А-Р.
Под "протофибриллярной формой" понимают олигомерную форму пептидов А-Р, растворимую in vitro, которую можно выделить как единое целое, с молекулярной массой выше 200, 300, 400 или 500 кДа, и которая может фиксировать такие агенты, как тиофлавин S или конго красный.
Под "сенильной бляшкой" понимают бляшку, состоящую из амилоидного ядра (фиксирующего ти-офлавин S или конго красный), окруженного дистрофическими нейритами и продуктами реакций гли-альных клеток. Сенильные бляшки находят, в частности, у пациентов с болезнью Альцгеймера в отличие от диффузных амилоидных отложений (не фиксирующих тиофлавин S или конго красный), которых гораздо больше, но которые не связаны с болезнью.
Антитела, называемые также иммуноглобулином, состоят из двух одинаковых тяжелых цепей ("СН") и двух одинаковых легких цепей ("CL"), которые связаны дисульфидным мостиком. Каждая цепь содержит константную область и вариабельную область. Каждая вариабельная область содержит три
сегмента, называемых "комплементарно-определяемыми областями" ("CDR") или "супервариабельными областями", которые в основном ответственны за связывание с эпитопом антигена.
Термин "VH" относится к вариабельным областям тяжелой цепи иммуноглобулина антитела, содержащего тяжелые цепи одного из фрагментов Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' или F(ab)'.
Термин "VL" относится к вариабельным областям легкой цепи иммуноглобулина антитела, включая легкие цепи фрагмента Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' или F(ab)'.
Под "антителом" понимают также любой функциональный фрагмент антител: Fab (Fragment antigen binding - антиген-связывающий фрагмент), Fv, scFv (single chain Fv -одноцепочечный Fv), Fc (кристаллизующийся фрагмент).
Предпочтительно эти функциональные фрагменты являются фрагментами типа Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, диателами, полиспецифическими антителами (в частности, биспецифическими), синтетическими полипептидами, содержащими последовательности одной или нескольких CDR, которые обладают обычно такой же специфичностью фиксации, что и гуманизированные антитела, из которых они получены. Согласно настоящему изобретению фрагменты антител по изобретению могут быть получены из гуманизированных антител такими способами, как расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или разрыв дисульфидных мостиков в результате химического восстановления.
Нанотела также подпадают под это определение.
" Областями CDR" будут обозначаться гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, как определено Kabat и др. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5 Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 и более поздние издания). Существует 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин CDR используется здесь для обозначения в зависимости от конкретного случая одной или нескольких из этих областей или даже всех этих областей, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за родственное связывание антитела с антигеном или эпитопом, которые он распознал. Наиболее сохраняющиеся области вариабельных доменов называются областями или последовательностями FR от "framework" или "каркасными".
Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам.
Под "гуманизированными антителами" понимают антитела, которые содержат главным образом последовательности человеческого иммуноглобулина. Этот термин относится также к иммуноглобулину, не являющемуся человеческим, который был модифицирован введением человеческих последовательностей или остатков, имеющихся в человеческих последовательностях.
Вообще говоря, гуманизированные антитела содержат один или обычно два вариабельных домена, в которых все или часть областей CDR соответствуют частям, полученным из исходной не человеческой последовательности, и в которых все или часть областей FR получены из последовательности человеческого иммуноглобулина. Таким образом, гуманизированные антитела могут содержать по меньшей мере один участок константной области иммуноглобулина (Fc), в частности выбранного базового человеческого иммуноглобулина.
Таким образом, необходимо получить антитела, которые будут минимально иммуногенными у человека. Так, возможно, чтобы одна или две аминокислоты одной или нескольких CDR были модифицированы аминокислотой, менее иммуногенной для хозяина-человека, без существенного снижения специфичности связи антител к высокомолекулярному пептиду А-Р. Равным образом, остатки каркасных областей могут не быть человеческими, и разрешается, чтобы они не были модифицированы, так как они не вносят вклад в иммуногенный потенциал антител.
Существует несколько известных специалисту в данной области способов гуманизации, чтобы модифицировать исходные нечеловеческие антитела в антитела, менее иммуногенные для человека. Полная идентичность последовательности с антитела человека не является строго необходимой. Действительно, полная идентичность последовательности необязательно является индикатором, предсказывающим сниженную иммуногенность, и модификация ограниченного числа остатков может вести к гуманизированным антителам, имеющим очень ослабленный иммуногенный потенциал у человека (Molecular Immunology (2007) 44, 1986-1998).
Разными методами являются, например, инклюзия CDR (прививка) (ЕРО 0239400; WO 91/09967 и патенты США 5530101 и 5585089), изменение поверхности (ЕРО 0592106; ЕРО 0519596; Padlan, 1991, Molec. Imm. 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7 (6): 805-814 и Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), а также смешение цепей (патент США 5565332).
Настоящее изобретение относится, в частности, к гуманизированным антителам, у которых вариабельные части модифицированы согласно технологии, раскрытой в международной патентной заявке
WO 2009/032661.
В этом методе используют, в частности, моделирование молекулярной динамики исходя из трехмерных моделей антител, где указанные модели разработаны путем гомологии.
Настоящее изобретение относится также ко всем формам антител со сниженными эффекторными функциями, таким как иммуноглобулины, имеющие мутации в домене Fc, снижающие его сродство к рецепторам иммунной системы, или как нанотела.
Под "эффекторными функциями" понимают любую фиксацию домена Fc антитела к рецепторам
или белкам, вызывающую иммунные ответы. Ослабление этих эффекторных функций позволяет уменьшить такие осложнения, как возникновение микрокровотечений (Racke et al. J Neurosci 2005, 25:629).
Сродство может быть измерено любым методом, известным специалисту в данной области. Предпочтительно измерять его методом Biostat Speed, разработанным исходя из алгоритмов, описанных Rat-
kovsky DA и Reedy TJ (Biometries, 1986, 42, 575-82).
Чтобы можно было экспрессировать тяжелые цепи и/или легкие цепи антител, являющихся объектом изобретения, полинуклеотиды, кодирующие указанные цепи, вводят в экспрессионные векторы. Эти экспрессионные векторы могут быть плазмидами, YAC, космидами, ретровирусами, эписомами, производными от EBV и любым другим вектором, который специалист в данной области сможет посчитать подходящим для указанных цепей.
Эти векторы могут быть использованы для трансформации клеток, полученных предпочтительно из одной клеточной линии. Еще более предпочтительно такая клеточная линия получена от млекопитающего.
Предпочтительно эта линия представляет собой линию СНО или линию, производную от этой линии, или линию HEK293 или линию, производную от этой линии.
Трансформация клеток может быть осуществлена любым способом, известным специалисту в данной области, чтобы ввести полинуклеотиды в клетку-хозяина. Одним таким способом может быть трансформация с помощью декстрана, осаждение фосфатом кальция, трансфекция с помощью полибре-на, слияние протопластов, электропорация, инкапсуляция полинуклеотидов в липосомах, биолистическая инъекция и прямая микроинъекция ДНК в ядро.
Антитела, являющиеся объектом изобретения, могут содержаться в фармацевтических композициях для местного введения, пероральным, парентеральным, интраназальным, внутривенным, внутримышечным, подкожных, внутриглазным и т. д. способами.
Предпочтительно фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемые носители для препаратов, годных для инъекции. Это могут быть, в частности, солевые растворы (мононатрийфос-фат, динатрийфосфат, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т.д. или смеси таких солей), стерильные, изотонические или сухие композиции, в частности лиофилизованные, которые при добавлении в зависимости от конкретного случая стерилизованной воды или физиологического раствора позволяют создать пригодные для инъекций растворы.
В качестве примера фармацевтическая композиция содержит 1) фосфатный буфер Dulbecco (pH ~7,4), необязательно содержащий от 1 до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, 2) 0,9% (мас./об.) хлорида натрия (NaCl)) и 3) 5% (мас./об.) декстрозы. Она может также содержать антиокси-дант, такой как триптамин, и стабилизатор, такой как Tween 20.
Рассматриваемыми патологиями могут быть любые заболевания, связанные с отложением амилоидных бляшек. В частности, целевой патологией является болезнь Альцгеймера.
Дозы зависят от желаемого эффекта, длительности лечения и способа введения; обычно они составляют от 5 до 1000 мг антител в сутки для взрослого. Обычно врач определяет подходящую дозировку в зависимости от стадии заболевания, возраста пациента, его массы или любых других факторов, которые следует учитывать в зависимости от пациента.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, однако не ограничено ими.
Краткое описание фигур
Фиг. 1А. Карта плазмиды pXL4973, позволяющей экспрессию легкой цепи LC1 антител анти-АР 13C3-VH1VL1.
Фиг. 1В. Карта плазмиды pXL4 97 9, позволяющей экспрессию тяжелой цепи HCl антител анти-АР 13C3-VH1VL1.
Фиг. 2А и 2В. Разделение протофибрилл и низкомолекулярных олигомеров гель-хроматографией на Superdex 75 (соответственно при t=0 и t=16 ч).
Фиг. 3. Определение молекулярной массы протофибрилл.
Фиг. 4А, 4В и 4С. Определение сродства гуманизированных антител (соответственно антител
LP09027 (4А), LP09026 (4В) и LP09028 (4С)) к протофибриллам (среднее по 3 эксперимен-
там±среднеквадратичная погрешность).
Фиг. 5. Специфичность гуманизированных антител LP09027 по отношению к фибриллам А-Р.
Фиг. 6А и 6В. Специфичность гуманизированных антител (LP09027) к зрелым сенильным бляшкам соответственно для фронтального кортекса (6А) и гиппокампа (6В) мыши. Стрелки указывают на се-нильные бляшки.
Примеры
Пример 1. Получение гуманизированных антител. Были гуманизированы мышиные антитела 13С3.
Данный пример описывает последовательность и получение гуманизированных антител к пептиду А-Р, VH1VL1 (LP09027) путем продуцирования в переходной экспрессии в линии млекопитающего HEK293, называемой Freestyle 293-F.
кДНК, кодирующие гуманизированные вариабельные цепи VL1 и VH1, подвергали слиянию с кДНК, кодирующими константные области человеческих Ckappa и lgG4 соответственно. Последовательность константной области lgG4 представляет собой последовательность варианта, имеющего замещения S241P и L248E, согласно номенклатуре Kabat, чтобы существенно снизить продуцирование полумолекул (Angla et al., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108) и эффекторные функции (WO 97/09351).
Нуклеиновые последовательности, кодирующие CH1 (SEQ ID NO:1) и CL1 (SEQ ID NO:3), клонировали независимо в экспрессионном векторе, чтобы образовать соответственно плазмиды pXL4973 (фиг. 1А) и pXL4979 (фиг. 1В).
Одну серию антител получали путем продуцирования в переходной экспрессии в линии Freestyle 293-F (Invitrogen) после ко-трансфекции плазмид pXL4973 и pXL4 979 согласно протоколу, описанному Invitrogen (номер в каталоге K9000-01). Эту серию (LP09027) затем очищали методом афинной хроматографии на колонке геля MabSelect (Amersham) согласно рекомендациям поставщика, затем смешивали с буфером PBS (Dulbecco, индекс 14190-094) и стерилизовали фильтрованием (0,2 мкм). Из 1 л культуры путем денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и пространственно-эксклюзионной хроматографии получали 33 мг антител чистотой 97%. Масса, полученная денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и по ЖХ/МС, согласуется с первичной последовательностью аминокислот и присутствием N-гликана в домене Fc, то есть масса 23969 Да для LC1 и 49650 Да для HCl, учитывая N-гликан в форме G0F. Масса, полученная электрофорезом в полиакриламидном геле без денатурирующих условий и по эксклюзионной хроматографии, согласуется с гетеротетрамерной структурой антител массой 150 кДа (фиг. 4А).
Этим же способом получали серии гуманизированных антител LP09026 и LP09028 исходя из нук-
леотидных последовательностей SEQ ID NO:25 и SEQ ID NO:21 для LP09026 (фиг. 4В) и SEQ ID NO:1 и
SEQ ID NO:21 для LP09028 (фиг. 4С).
Пример 2. Получение протофибрилл из пептида АР1-42.
Протофибриллы получали из синтетических пептидов АР 1-42 согласно способу, описанному Johansson et al. (FEBS, 2006, 2618-2630). Лиофилизованный пептид (Anaspec, индекс 24224) растворяли в 10 мМ NaOH до концентрации 100 мкМ, затем перемешивали в течение 1 мин и инкубировали на стекле в течение 10 мин. Раствор пептида разводили затем буфером (100 мМ фосфат натрия, 200 мМ NaCl pH 7,4) до концентрации 50 мкМ, затем перемешивали одну минуту. Препарат инкубировали в течение ночи при 37°С, чтобы достичь образования протофибрилл, затем центрифугировали при 17900 g в течение 15 мин при 16°С для удаления нерастворимых агрегатов. Чтобы отделить протофибриллы олигомерных форм А-Р с низкой молекулярной массой, супернатант вводили в гель-хроматографическую колонку Su-perdex 75, уравновешенную в буфере (50 мМ ацетата аммония рН 8,5). Фракции, соответствующие про-тофибриллам и низкомолекулярным олигомерам, собирали и хранили при 4°С. На фиг. 2 показан типичный профиль разделения протофибрилл. Молекулярную массу протофибрилл определяли по гель-хроматографии на Superdex200, используя в качестве индикатора молекулярной массы калибровочный набор Biorad (индекс 150-1901). Фиг. 3 показывает, что молекулярная масса протофибрилл выше 200
кДа.
Пример 3. Специфичность и сродство гуманизированных антител к протофибриллам.
50 мкл протофибрилл и низкомолекулярных олигомеров при концентрации 1 мкг/мл в PBS (Gibco, индекс 70011) помещали в лунки планшета ELISA (Nunc, индекс 442404) и инкубировали при 4°С в течение ночи. После удаления избытка антигенов в каждую лунку помещали 200 мкл буфера PBS+5% сухого молока (мас./об.), чтобы ликвидировать неспецифическую адсорбцию, и инкубировали 2 ч при температуре окружающей среды. Затем лунки промывали 4 раза 300 мкл буфера PBS Tween 0,02%. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора первичных антител (трехкратное разведение в 3 раза в PBS Tween исходя из концентрации 100 мкг/мл для олигомеров и 25 мкг/мл для протофибрилл) и инкубировали 1 ч при температуре окружающей среды. Лунки промывали 4 раза 300 мкл буфера PBS Tween. Вторичные человеческие антитела анти-Fc, комбинированные с пероксидазой (Goat Anti Human IgG (Fc) peroxidase conjugated, Pierce, индекс 31413), разведенные до 1/10000 в буфере PBS Tween, добавляли в каждую лунку и инкубировали 1 ч при температуре окружающей среды. После 4 промывок 300 мкл PBS Tween в каждую лунку добавляли 100 мкл ТМВ (Interchim, индекс UP664782) и инкубировали в течение примерно 10 мин, затем реакцию останавливали 1 М раствором HCl (Interchim, индекс UPS29590), и планшеты считывали при OD, измеренной на длине волны 450 нм. Значения EC50 определяли на BioStat Speed. Полученные результаты приведены в табл.1, а также на фиг. 4, и показывают очень высокую специфичность антител к протофибриллам по сравнению с низкомолекулярными олигомерами (в 184 раза выше).
Таблица1
ли 460 мкл PBS, чтобы получить концентрацию 1 мг/мл. Готовили аликвоты 10 мкл и хранили при -80°С. В лунки планшета ELISA помещали 50 мкл раствора пептида АР1-42 концентрацией 1 мкг/мл в карбонатном буфере (NaHCO3 0,025М (Acros Organics, индекс 217120010), Na2CO3 0,025М (Acros Organics, индекс 207810010), рН 9,7 и инкубировали в течение ночи при температуре окружающей среды. Как и выше, лунки промывали буфером PBS Tween, инкубировали в присутствии буфера PBS+5% сухого молока (мас./об.), и промывали буфером PBS Tween. Гуманизированные антитела в концентрации 0,02 мкг/мл инкубировали в течение 1 ч при температуре окружающей среды с несколькими концентрациями (начиная с 1 мкг/мл) пептидов АР1-28 (Bachem, индекс Н7865), АР1-16 (Anaspec, индекс 24225), АР25-35 (Anaspec, индекс 24227), низкомолекулярных олигомеров или протофибрилл, полученных, как описано выше. Затем в каждую лунку помещали смесь антитела/антиген, и микротитровальный планшет инкубировали 1 ч при температуре окружающей среды. Свободные несвязанные антитела определяли по тому же протоколу ELISA, как описано выше. Эти конкурентные эксперименты показывают, что только про-тофибриллы с намного более сильным сродством, чем у низкомолекулярных олигомеров, способны нейтрализовать гуманизированные антитела, препятствуя взаимодействию с пептидом АР1-42, и никакой пептид не способен нейтрализовать антитела.
Пример 4. Специфичность гуманизированных антител LP09027 к фибриллам АР1-42.
Пептид АР1-42 (Anaspec, 20276) растворяли в 200 мкл NaOH 10 мМ до концентрации 5 мг/мл. Пептид IAPP (Anaspec, 60804) растворяют в 200 мкл 50%-ного ДМСО до концентрации 5 мг/мл. 100 мкл каждого препарата растворяли в 400 мкл PBS 1,25Х. Конечная концентрация пептидов составляла 1 мг/мл в 500 мкл. Образцы инкубировали 72 ч при 37°С. После инкубации образцы центрифугировали при 17900 g в течение 30 мин при 4°С. Супернатант удаляли, и осадок промывали 3 раза PBS 1X. После последней промывки осадок фибрилл вводили в 150 мкл PBS. Чтобы проконтролировать присутствие фибрилл амилоидного типа, проводили тест на флуоресценцию тиофлавина Т (Anaspec, 88306). 20 мкл тиофлавина Т (конечная концентрация 20 мкМ), 10 мкл образца и 70 мкл PBS IX (конечный объем 100 мкл) смешивают в лунке черного планшета (Corning, 3792). Тиофлавин Т возбуждался на 450 нм и в присутствии структуры амилоидного типа флуоресцировал на 482 нм. В каждую лунку микротитровального планшета помещали 50 мкл фибрилл АР1-42 концентрацией 1 мкг/мл и IAPP концентрацией 0,5 мкг/мл. Применяли протокол ELISA, используя последовательное разбавление гуманизированных антител, начиная с 10 мкг/мл. Фиг. 5 показывает, что гуманизированные антитела LP0 9027 специфически распознают фибриллы АР1-42, но не фибриллы IAPP.
Пример 5. Специфичность гуманизированных антител LP09027 к зрелым сенильным бляшкам, но не к диффузным бляшкам.
Гуманизированные антитела (LP09027), сопряженные с дигоксигенином (N-гидроксисукцинимидный эфир дигоксигенин-3-О-метилкарбонил-е-аминокапроновой кислоты: Roche 11333054001; 11418165001) использовали в иммуногистохимии (Robot Ventana) на срезах головного мозга мышей АРР PS1 (модель Альцгеймера, описанная Schmitz С. et al., Am. J. Pathol, 2004, 164, 14951502)), а также на срезах головного мозга человека (церебральный кортекс), взятых у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Образцы предварительно фиксировали в формалине и вводили в парафин.
Результаты, полученные на мышах (фиг. 6А и 6В), четко показывают, что гуманизированные антитела распознают исключительно зрелые и плотные сенильные бляшки, но не диффузные отложения пептида А-Р.
Эти данные коррелируют со свойствами антител, которые являются специфическими к протофиб-риллярной форме А-Р и, следовательно, не распознают растворимые, мономерные или олигомерные, формы этого пептида.
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности
Белковые последовательности
Антитела 1 VH1VL1
VH1 + CH1
SEQ ID N0:1
SEQ ID N0:2
VL1 + CL1
SEQ ID N0:3
SEQ ID N0:4
VHi
SEQ ID N0:5
SEQ ID N0:6
VLi
SEQ ID N0:7
SEQ ID N0:8
CDR VHi
SEQ ID N0:9, 11, 13
SEQ ID N0:10, 12, 14
CDR VLi
SEQ ID N0:15, 17, 19
SEQ ID N0:16, 18, 20
Антитела 2 VHI VL2
VHi + CHi
SEQ ID N0:1
SEQ ID N0:2
VL2+CL2
SEQ ID N0:21
SEQ ID N0:22
VHi
SEQ ID N0:5
SEQ ID N0:6
VL2
SEQ ID N0:23
SEQ ID N0:24
CDR VHi
SEQ ID N0:9, 11, 13
SEQ ID N0:10, 12, 14
CDR VL2
SEQ ID N0:31, 17, 19
SEQ ID N0:32, 18, 20
Антитела 3 VH2 VL2
VH2+CH2
SEQ ID N0:25
SEQ ID N0:26
VL2+CL2
SEQ ID N0:21
SEQ ID N0:22
VH2
SEQ ID N0:27
SEQ ID N0:28
VL2
SEQ ID N0:23
SEQ ID N0:24
CDR VH2
SEQ ID N0:9, 11, 29
SEQ ID N0:10, 12, 30
CDR VL2
SEQ ID N0:31, 17, 19
SEQ ID N0:32, 18, 20
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> SANOFI-AVENTIS
<12 0> Гуманизированные антитела, специфичные к протофибриллярной форме бета-амилоидного пептида
<130> FR2009-054
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1326
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220> <223>
Гуманизированная последовательность
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1326)
<400> 1
gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gtg aag cct ggg gtc Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
gct atg cac tgg gtg aag cag agt cct ggc aag agt ctg gag tgg att Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
144
gga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc agc ttt Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
192
cag ggc cag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat
240
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctt gcc agc ttg aag gcc tcc gat tct gcc atc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga ggg gac gat ggt tat tcc tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 336 Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
gtc tcc agc gct tct acc aag ggc cct tcc gtg ttc cct ctg gcc cct 384
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
tgc tcc cgg tcc acc tcc gag tcc acc gcc gct ctg ggc tgc ctg gtg 432
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
aag gac tac ttc cct gag cct gtg acc gtg tcc tgg aac tct ggc gcc 480
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
ctg acc tcc ggc gtg cac acc ttc cct gcc gtg ctg cag tcc tcc ggc 528
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
ctg tac tcc ctg tcc tcc gtg gtg acc gtg cct tcc tcc tcc ctg ggc 576
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
acc aag acc tac acc tgt aac gtg gac cac aag cct tcc aac acc aag 624
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
gtg gac aag cgg gtg gag tcc aag tac ggc cct cct tgc cct ccc tgc 672
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
cct gcc cct gag ttc gag ggc gga cct agc gtg ttc ctg ttc cct cct 720 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
aag cct aag gac acc ctg atg atc tcc cgg acc cct gag gtg acc tgt 768 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
gtg gtg gtg gac gtg tcc cag gag gac cct gag gtc cag ttc aac tgg 816
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag acc aag cct cgg gag 864 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
gag cag ttc aat tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg acc gtg ctg 912 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
cac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gaa tac aag tgt aag gtc tcc aac 960
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
aag ggc ctg ccc tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aag gcc aag ggc
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
cag cct agg gag cct cag gtg tac acc ctg cct cct agc cag gaa gag Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
1056
atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctg gtg aag ggc ttc tac Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
1104
cct tcc gac atc gcc gtg gag tgg gag tcc aac ggc cag cct gag aac Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
1152
aac tac aag acc acc cct cct gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
1200
ctg tac tcc agg ctg acc gtg gac aag tcc cgg tgg cag gag ggc aac
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
1248
gtc ttt tcc tgc tcc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
1296
cag aag tcc ctg tcc ctg tct ctg ggc tga Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
1326
<210> 2
<211> 441
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 3
<211> 660
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированная последовательность
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(660)
<400> 3
gag atc gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gat aga gcc tcc atc tct tgc aga tct ggt cag agc ctt gtg cac agt 96
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
aat gga aac acc tat ctg cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca aag ctc ctg atc tat aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc ccg 192
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg tca gat ttc aca ctc acc atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa aat 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
aca ttt gtt cct tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 384
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 432
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 480
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 528
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 576
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 624
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga 660 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 5 <211> 345 <212>
ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированная последовательность
<220>
<221> CDS <222> (1)..(345)
<400> 5
gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gtg aag cct ggg gtc 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtg aag cag agt cct ggc aag agt ctg gag tgg att 144
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc agc ttt 192
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
cag ggc cag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctt gcc agc ttg aag gcc tcc gat tct gcc atc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga ggg gac gat ggt tat tcc tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 336
Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
gtc tcc agc 345
Val Ser Ser 115
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
<210> 7
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированная последовательность
<220> <221> <222>
CDS
(1)..(339)
<400> 7
gag atc gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gat aga gcc tcc atc tct tgc aga tct ggt cag agc ctt gtg cac agt
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
aat gga aac acc tat ctg cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
144
cca aag ctc ctg atc tat aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc ccg
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg tca gat ttc aca ctc acc atc
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
240
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa aat
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
288
aca ttt gtt cct tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
336
cgt Arg 339
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 9
<211> 33
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(33)
<400> 9
tcc ggc tac aca ttc act gat tat gct atg cac 33
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 10
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His
1 5 10
<210> 11
<211> 30
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<221> CDS <222> (1)..(30)
<400> 11
gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac 30
Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 12
Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 18
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(18)
<400> 13
ggg gac gat ggt tat tcc 18 Gly Asp Asp Gly Tyr Ser 1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 14
Gly Asp Asp Gly Tyr Ser 1 5
<210> 15
<211> 48
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(48)
<400> 15
aga tct ggt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aac acc tat ctg cat 48
Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 16
Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 17
<211> 24
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 17
aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg 24 Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 18
Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 1 5
<210> 19
<211> 27
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(27)
<400> 19
tct caa aat aca ttt gtt cct tgg acg 27 Ser Gln Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr 1 5
<210> <211> <212> <213> 20 9
PRT
Mus sp.
<400> 20
Ser Gln Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr 1 5
<210> 21
<211> 660
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированная последовательность
<220> <221> <222>
CDS
(1)..(660)
<400> 21
gag atc gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gat aga gcc tcc atc tct tgc aga tct ggt cag agc ctt gtg cac agt
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
aat acc aac acc tat ctg cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
144
cca aag ctc ctg atc tat aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc ccg
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg tca gat ttc aca ctc acc atc
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
240
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa aat
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
288
aca ttt gtt cct tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
336
cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
384
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
432
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
480
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
528
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 624
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga 660 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 22
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 22
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 23
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220> <223>
Гуманизированная последовательность
<220> <221> <222>
CDS
(1)..(339)
<400> 23
gag atc gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gat aga gcc tcc atc tct tgc aga tct ggt cag agc ctt gtg cac agt
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
aat acc aac acc tat ctg cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
144
cca aag ctc ctg atc tat aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc ccg
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
192
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg tca gat ttc aca ctc acc atc
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
240
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa aat
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
288
aca ttt gtt cct tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
336
cgt Arg
<210> <211> <212>
24 113
PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 24
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 25
<211> 1326
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированная последовательность
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1326) <400> 25
gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gtg aag cct ggg gtc 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtg aag cag agt cct ggc aag agt ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc agc ttt 192
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
cag ggc cag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctt gcc agc ttg aag gcc tcc gat tct gcc atc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga ggg gac gag ggt tat tcc tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 336
Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
gtc tcc agc gct tct acc aag ggc cct tcc gtg ttc cct ctg gcc cct 384
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
tgc tcc cgg tcc acc tcc gag tcc acc gcc gct ctg ggc tgc ctg gtg 432
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
aag gac tac ttc cct gag cct gtg acc gtg tcc tgg aac tct ggc gcc 480
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
ctg acc tcc ggc gtg cac acc ttc cct gcc gtg ctg cag tcc tcc ggc 528
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
ctg tac tcc ctg tcc tcc gtg gtg acc gtg cct tcc tcc tcc ctg ggc 576
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
acc aag acc tac acc tgt aac gtg gac cac aag cct tcc aac acc aag 624
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
gtg gac aag cgg gtg gag tcc aag tac ggc cct cct tgc cct ccc tgc 672
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
cct gcc cct gag ttc gag ggc gga cct agc gtg ttc ctg ttc cct cct 720
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
aag cct aag gac acc ctg atg atc tcc cgg acc cct gag gtg acc tgt 768
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
gtg gtg gtg gac gtg tcc cag gag gac cct gag gtc cag ttc aac tgg 816
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag acc aag cct cgg gag 864
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
gag cag ttc aat tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg acc gtg ctg 912
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
cac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gaa tac aag tgt aag gtc tcc aac His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
aag ggc ctg ccc tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aag gcc aag ggc
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
1008
cag cct agg gag cct cag gtg tac acc ctg cct cct agc cag gaa gag
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
1056
atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctg gtg aag ggc ttc tac
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
1104
cct tcc gac atc gcc gtg gag tgg gag tcc aac ggc cag cct gag aac
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
1152
aac tac aag acc acc cct cct gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
1200
ctg tac tcc agg ctg acc gtg gac aag tcc cgg tgg cag gag ggc aac
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
1248
gtc ttt tcc tgc tcc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
1296
cag aag tcc ctg tcc ctg tct ctg ggc tga Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
1326
<210> 26
<211> 441
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 26
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 27
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированная последовательность
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 27
gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gtg aag cct ggg gtc 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtg aag cag agt cct ggc aag agt ctg gag tgg att 144
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc agc ttt 192
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
cag ggc cag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctt gcc agc ttg aag gcc tcc gat tct gcc atc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga ggg gac gag ggt tat tcc tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 336
Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
gtc tcc agc 345
Val Ser Ser 115
<210> 28
<211> 115
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 28
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 29
<211> 18
<212> ДНК <213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(18)
<400> 29
ggg gac gag ggt tat tcc 18
Gly Asp Glu Gly Tyr Ser
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 30
Gly Asp Glu Gly Tyr Ser
1 5
<210> 31
<211> 48
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(48)
<400> 31
aga tct ggt cag agc ctt gtg cac agt aat acc aac acc tat ctg cat 48
Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 32
Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Гуманизированное антитело, специфичное к протофибриллярной форме пептида А-Р, отличающееся тем, что указанное антитело содержит
CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:16, 18 и 20 соответственно,
CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 14 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20 соответственно или
CDR 1-3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO:10, 12 и 30 соответственно и CDR 1-3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO:32, 18 и 20, и
отличающееся тем, что оно связывается с пептидами А-Р, агрегированными в сенильные бляшки, но не с диффузными отложениями пептидов А-Р.
2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 15, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.
3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 13, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.
4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит CDR, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:9, 11, 29, 31, 17 и 19 или последовательностями, отличающимися соответственно на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов от указанных последовательностей.
5. Антитело по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что вариабельная часть его тяжелой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:28.
6. Антитело по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что вариабельная часть его легкой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 99%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:24.
7. Антитело по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:28.
8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что оно содержит легкую цепь, имеющую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:24.
9. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:6 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:8.
10. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:6 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO: 24.
11. Антитело по любому из пп.5-8, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную часть тяжелой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:28 и вариабельную часть легкой цепи полипептидной последовательности SEQ ID NO:24.
12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающиееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:26.
13. Антитело по любому из пп.1-12, отличающееся тем, что оно содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из полипептидных последовательностей SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:22.
14. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:2 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:4.
15. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:2 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.
16. Антитело по п.12 или 13, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:26 и легкую цепь полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.
17. Антитело по любому из пп.1-16, отличающееся тем, что оно вызывает уменьшение амилоидных бляшек.
18. Антитело по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что его сродство к протофибриллярной форме пептида А-Р по меньшей мере в 100 раз выше его сродства к другим формам этого пептида.
19. Гуманизированное антитело, специфичное к протофибриллярной форме пептида А-Р, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:6, и легкую цепь, включающую вариабельную часть с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:8.
20. Антитело по п.19, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, включающую полипептидную последовательность SEQ ID NO:2, и легкую цепь, включающую полипептидную последовательность SEQ ID NO:4.
21. Антитело по п.19, отличающееся тем, что оно содержит тяжелую цепь, состоящую из полипептидной последовательности SEQ ID NO:2, и легкую цепь, состоящую из полипептидной последовательности SEQ ID NO:4.
22. Применение антитела по любому из пп.1-21 в лечении заболеваний, связанных с нейродегенера-
тивными нарушениями.
23. Применение антитела по любому из пп.1-21 в лечении болезни Альцгеймера.
24. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейро-дегенеративными нарушениями, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-21 и эксципиенты.
25. Способ лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что он включает введение пациенту антител по любому из пп.1-21.
26. Клетка, продуцирующая антитело по любому из пп.1-21, отличающаяся тем, что указанная клетка трансформирована вектором, обеспечивающим экспрессию тяжелой и легкой цепей указанного антитела.
27. Способ получения антитела по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что он включает культивирование клеток по п.26 и очистку антитела из указанной культуры клеток.
28. Лекарственное средство для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейродегене-ративными нарушениями, содержащее антитело по любому из пп.1-21.
29. Полинуклеотид для экспрессии тяжелых цепей антитела по п.1, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:2, 6, 26 или
28.
30. Полинуклеотид для экспрессии легких цепей антитела по п.1, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:4, 8, 22 или
24.
31. Полинуклеотид для экспрессии тяжелых цепей антитела по п.1, отличающийся тем, что он содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:1, 5, 25 или 27.
32. Полинуклеотид для экспрессии легких цепей антитела по п.1, отличающийся тем, что он содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с одной из последовательностей SEQ ID NO:3, 7, 21 или 23.
33. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.29-32.
34. Клетка-хозяина для продуцирования гуманизированного антитела, специфичного к протофиб-риллярной форме пептида А-Р, содержащая вектор по п.33.
CMV Е/Р (-723/+7) Ч/TPLenhMLP
% VL1 13СЗ гуманизированный
7571 bp / pA LATE SV40
pXL4973 I 7571 bp / Г
ORI P
Фиг. 1 А
CMV Е/Р (-723/+7) TPLenhMLP
AmpR ^ VH1 13C3 гуманизированный
PXL4979 1. ?lnE 8237 bp I ; h|gG4 (S241 p + L248E)
pA LATE SV40
ORI P
Фиг. 1В
Время (мин.) Фиг. 2А
Протофибриллы
/*-- Олигомеры
Концентрация антител (мкг/мл)
Фиг. 4А
Концентрация антител (мкг/мл)
Фиг. 4С
(r) Фибриллы А[31-42
i= 8.5 .. О
ФибрИЛЛЫ IAPP
IBS 0.01 0.1
Концентрация антител (мкг/мл)
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028357
028357
- 1 -
- 1 -
(19)
028357
028357
- 1 -
- 1 -
(19)
028357
028357
- 2 -
- 1 -
(19)
028357
028357
- 4 -
- 3 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
028357
- 8 -
- 8 -
028357
1008
028357
- 9 -
- 10 -
028357
1008
028357
- 11 -
- 10 -
028357
028357
- 12 -
- 12 -
115
028357
115
028357
- 16 -
- 16 -
115
028357
115
028357
- 16 -
- 16 -
115
028357
115
028357
- 16 -
- 16 -
028357
028357
17 ¦
<220>
17 ¦
<220>
028357
028357
- 18 -
- 18 -
028357
028357
19 ¦
19 ¦
028357
028357
19 ¦
19 ¦
028357
028357
19 ¦
19 ¦
028357
028357
576
- 20 -
576
- 20 -
028357
028357
576
- 20 -
576
- 20 -
028357
028357
576
- 20 -
576
- 20 -
028357
028357
- 21 -
339
- 22 -
028357
028357
- 21 -
339
- 22 -
028357
028357
- 21 -
339
- 22 -
028357
028357
- 21 -
339
- 22 -
028357
028357
- 21 -
339
- 22 -
028357
028357
- 23 -
339
- 22 -
960
028357
028357
- 25 -
- 24 -
960
028357
028357
- 25 -
- 26 -
028357
028357
- 27 -
- 27 -
028357
028357
- 31 -
- 31 -
028357
028357
- 31 -
- 31 -
028357
028357
- 32 -
- 32 -
028357
028357
- 33 -
- 33 -
028357
028357
- 33 -
- 33 -
028357
028357
- 33 -
- 33 -
028357
028357
- 33 -
- 33 -
028357
028357
- 34 -
- 34 -