|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с агрегированным амилоидным белком и представляет собой гуманизированную или химерную версию антитела 2А4, которое может быть получено из АТСС, номер доступа РТА-9662, или гуманизированную или химерную версию антитела 7D8, которое может быть получено из АТСС, номер доступа РТА-9468, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (a) вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, как показано в SEQ ID NO: 168, 169 и 170; или (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, как показано в SEQ ID NO: 177, 169 и 170; и (c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, как показано в SEQ ID NO: 171, 172 и 173. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из L87 и L90 (соглашение о нумерации по Kabat), занятый Y и F соответственно, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, +92 и +109 (линейная нумерация), занятый Т, S, L, D, Q, K, Y, L, F и L соответственно, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.3, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +75 и +92 (линейная нумерация), занятый Y и F соответственю, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.2, в котором вариабельная область легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека представляет собой каппа-подгруппу 2 вариабельной области легкой цепи человека (соглашение о нумерации по Kabat). 6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.5, в котором вариабельная область легкой цепи подгруппы 2 человека происходит из зародышевой линии VKIIA19/A3 человека. 7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.6, в котором вариабельная область легкой цепи Vk человека содержит последовательность SEQ ID NO: 166 или остатки 23-134 из SEQ ID NO: 167. 8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152, остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO:153 или представленную последовательностью SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176. 9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из Н37, Н49, Н70 и Н93 (соглашение о нумерации по Kabat), занятый I, A, F или V соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +10, +15, +19, +37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99 +119 (линейная нумерация), занятый R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, М, V или А соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +37, +49, +73 и +99 (линейная нумерация), занятый I, A, F или V соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.9, в котором вариабельной областью тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека является вариабельная область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 человека (нумерация по Kabat). 13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.12, в котором вариабельная область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 человека содержит последовательность SEQ ID NO: 165. 14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154 или представленную как последовательность SEQ ID NO: 161, 162 или 163. 15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO:153, и вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154. 16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 161, 162 или 163. 17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161. 18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162. 19. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163. 20. Способ терапевтического или профилактического лечения индивида, имеющего амилоидоз АА- или AL-типа или предрасположенного к амилоидозу АА- или AL-типа, включающий введение индивиду эффективной дозы антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19. 21. Способ по п.20, где индивидом является человек. 22. Способ по п.20, где терапевтическое лечение включает замедление развития амилоидоза АА- или AL-типа. 23. Способ по п.20, в котором индивид страдает амилоидным заболеванием, выбранным из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, псориатической артропатии, синдрома Рейтера, болезни Стилла у взрослых, синдрома Бехчета, болезни Крона, лепры, туберкулеза, бронхоэктатической болезни, язв при пролежнях, хронического пиелонефрита, остеомиелита, болезни Уиппла, ходжкинской лимфомы, почечной карциномы, карцином кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточной карциномы, волосатоклеточного лейкоза, семейной средиземноморской лихорадки и болезни Кастлемана. 24. Способ обнаружения амилоидного депо, связанного с амилоидозом АА- или AL-типа у индивида, включающий введение индивиду антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19, который связан с детектируемой меткой, и детекцию детектируемой метки у индивида. 25. Способ по п.24, где индивидом является человек. 26. Способ по п.24, где индивид страдает амилоидным заболеванием или является восприимчивым к амилоидному заболеванию, выбранному из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, псориатической артропатии, синдрома Рейтера, болезни Стилла у взрослых, синдрома Бехчета, болезни Крона, лепры, туберкулеза, бронхоэктатической болезни, язв при пролежнях, хронического пиелонефрита, остеомиелита, болезни Уиппла, ходжкинской лимфомы, почечной карциномы, карцином кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточной карциномы, волосатоклеточного лейкоза, семейной средиземноморской лихорадки и болезни Кастлемана. 27. Способ по п.24, где детектируемая метка является радиометкой. 28. Способ по п.24, где радиометкой является 125 I. 29. Способ по п.26, где детекцию осуществляют визуализацией с помощью SPECT/CT. 30. Способ по п.24, где детекцию проводят с помощью ядерно-магнитной спектроскопии. 31. Фармацевтическая композиция для терапевтического или профилактического лечения индивида, имеющего амилоидоз АА- или AL-типа или предрасположенного к амилоидозу АА- или AL-типа, содержащая: a) терапевтическое или профилактическое эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19; b) фармацевтически приемлемый носитель, который не влияет на биологическую активность композиции. 32. Фармацевтическая композиция по п.31 для парентерального введения. 33. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-19. 34. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента по пп.1-19, трансформированная нуклеиновой кислотой по п.33. 35. Клетка-хозяин по п.34, выбранная из группы, состоящей из клетки СНО, клетки HEK-293, клетки HeLa, клетки CV-1 и клетки COS. 36. Клетка-хозяин по п.35, которая представляет собой клетку СНО. 37. Гибридома, экспрессирующая моноклональное антитело мыши 2А4 (номер доступа в АТСС РТА-9662). 38. Гибридома, экспрессирующая моноклональное антитело мыши 7D8 (номер доступа в АТСС РТА-9468).
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с агрегированным амилоидным белком и представляет собой гуманизированную или химерную версию антитела 2А4, которое может быть получено из АТСС, номер доступа РТА-9662, или гуманизированную или химерную версию антитела 7D8, которое может быть получено из АТСС, номер доступа РТА-9468, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (a) вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, как показано в SEQ ID NO: 168, 169 и 170; или (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, как показано в SEQ ID NO: 177, 169 и 170; и (c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, как показано в SEQ ID NO: 171, 172 и 173. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из L87 и L90 (соглашение о нумерации по Kabat), занятый Y и F соответственно, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, +92 и +109 (линейная нумерация), занятый Т, S, L, D, Q, K, Y, L, F и L соответственно, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.3, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +75 и +92 (линейная нумерация), занятый Y и F соответственю, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.2, в котором вариабельная область легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека представляет собой каппа-подгруппу 2 вариабельной области легкой цепи человека (соглашение о нумерации по Kabat). 6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.5, в котором вариабельная область легкой цепи подгруппы 2 человека происходит из зародышевой линии VKIIA19/A3 человека. 7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.6, в котором вариабельная область легкой цепи Vk человека содержит последовательность SEQ ID NO: 166 или остатки 23-134 из SEQ ID NO: 167. 8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152, остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO:153 или представленную последовательностью SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176. 9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из Н37, Н49, Н70 и Н93 (соглашение о нумерации по Kabat), занятый I, A, F или V соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +10, +15, +19, +37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99 +119 (линейная нумерация), занятый R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, М, V или А соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +37, +49, +73 и +99 (линейная нумерация), занятый I, A, F или V соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека. 12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.9, в котором вариабельной областью тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека является вариабельная область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 человека (нумерация по Kabat). 13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.12, в котором вариабельная область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 человека содержит последовательность SEQ ID NO: 165. 14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154 или представленную как последовательность SEQ ID NO: 161, 162 или 163. 15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO:153, и вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154. 16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 161, 162 или 163. 17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161. 18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162. 19. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163. 20. Способ терапевтического или профилактического лечения индивида, имеющего амилоидоз АА- или AL-типа или предрасположенного к амилоидозу АА- или AL-типа, включающий введение индивиду эффективной дозы антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19. 21. Способ по п.20, где индивидом является человек. 22. Способ по п.20, где терапевтическое лечение включает замедление развития амилоидоза АА- или AL-типа. 23. Способ по п.20, в котором индивид страдает амилоидным заболеванием, выбранным из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, псориатической артропатии, синдрома Рейтера, болезни Стилла у взрослых, синдрома Бехчета, болезни Крона, лепры, туберкулеза, бронхоэктатической болезни, язв при пролежнях, хронического пиелонефрита, остеомиелита, болезни Уиппла, ходжкинской лимфомы, почечной карциномы, карцином кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточной карциномы, волосатоклеточного лейкоза, семейной средиземноморской лихорадки и болезни Кастлемана. 24. Способ обнаружения амилоидного депо, связанного с амилоидозом АА- или AL-типа у индивида, включающий введение индивиду антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19, который связан с детектируемой меткой, и детекцию детектируемой метки у индивида. 25. Способ по п.24, где индивидом является человек. 26. Способ по п.24, где индивид страдает амилоидным заболеванием или является восприимчивым к амилоидному заболеванию, выбранному из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, псориатической артропатии, синдрома Рейтера, болезни Стилла у взрослых, синдрома Бехчета, болезни Крона, лепры, туберкулеза, бронхоэктатической болезни, язв при пролежнях, хронического пиелонефрита, остеомиелита, болезни Уиппла, ходжкинской лимфомы, почечной карциномы, карцином кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточной карциномы, волосатоклеточного лейкоза, семейной средиземноморской лихорадки и болезни Кастлемана. 27. Способ по п.24, где детектируемая метка является радиометкой. 28. Способ по п.24, где радиометкой является 125 I. 29. Способ по п.26, где детекцию осуществляют визуализацией с помощью SPECT/CT. 30. Способ по п.24, где детекцию проводят с помощью ядерно-магнитной спектроскопии. 31. Фармацевтическая композиция для терапевтического или профилактического лечения индивида, имеющего амилоидоз АА- или AL-типа или предрасположенного к амилоидозу АА- или AL-типа, содержащая: a) терапевтическое или профилактическое эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19; b) фармацевтически приемлемый носитель, который не влияет на биологическую активность композиции. 32. Фармацевтическая композиция по п.31 для парентерального введения. 33. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-19. 34. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента по пп.1-19, трансформированная нуклеиновой кислотой по п.33. 35. Клетка-хозяин по п.34, выбранная из группы, состоящей из клетки СНО, клетки HEK-293, клетки HeLa, клетки CV-1 и клетки COS. 36. Клетка-хозяин по п.35, которая представляет собой клетку СНО. 37. Гибридома, экспрессирующая моноклональное антитело мыши 2А4 (номер доступа в АТСС РТА-9662). 38. Гибридома, экспрессирующая моноклональное антитело мыши 7D8 (номер доступа в АТСС РТА-9468).
Евразийское 028356 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201070812
(22) Дата подачи заявки 2008.12.29
(51) Int. Cl. C12P21/08 (2006.01)
(54) ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА АМИЛОИДОЗА
(31) 61/007,544; 61/095,932
(32) 2007.12.28; 2008.09.10
(33) US
(43) 2016.05.31
(86) PCT/US2008/088493
(87) WO 2009/086539 2009.07.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ПРОТЕНА БАЙОСАЙЕНСИЗ ЛИМИТЕД (IE); ЮНИВЕРСИТИ ОФ ТЕННЕССИ РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН
(US)
(72) Изобретатель:
Шенк Дейл Б., Сейберт Питер А., Уолл Джонатан (US), Сальданха Хосе (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20070178504
MALLE et al. "Mapping of antigenic determinants of punfied, lipid-free human serum amyloid A proteins" Scand J. Immunol, 1998, Vol 48, p 557-561, Abstract, and pg 559, Fig 1-B
US-A1-20050038117
US-A1-20070003552
US-A1-20040223912
US-B1-6375949
(57) Раскрыты способы, полезные для осуществления профилактики или лечения амилоидоза, включающего амилоидоз АА-типа и амилоидоз AL-типа, путем введения пептидов, содержащих неоэпитопы, такие как фрагменты АА из С-концевой области АА, и антител, специфичных для неоэпитопов агрегированных амилоидных белков, например антител, специфичных для С-концевой области АА-фибрилл. Антитела, ингибирующие образование и/или усиливающие удаление амилоидных депо у пациента, осуществляют таким образом профилактику или лечение амилоидной болезни.
Приоритет испрашивается по предварительной заявке США № 61/095932, поданной 10 сентября 2008 года, и предварительной заявке США № 61/007544, поданной 28 декабря 2007 года, каждая из которых включена в настоящее изобретение полностью посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к областям иммунологии и медицины.
Уровень изобретения
Амилоидоз является общим термином, который описывает ряд заболеваний, характеризующихся наличием патологических форм амилоидных белков, при которых часто наблюдается внеклеточное отложение (депонирование) белковых фибрилл, образующих многочисленные "амилоидные депо" или "амилоидные бляшки", расположенные локально или системно. Такие депо или бляшки, состоят, прежде всего, из растворимого белка или пептида природного происхождения, который собирается в тканях разной локализации в виде больших нерастворимых скоплений диаметром 10-100 мкм. Депо состоят из в общем латеральных скоплений фибрилл, имеющих диаметр примерно от 10 до 15 нм. Амилоидные фибриллы производят характерное светло-зеленое двупреломление в поляризованном свете при окрашивании красителем Конго красным. В общем, фибриллярное строение этих депо представляет собой идентифицирующий признак для разных форм амилоидного заболевания.
Пептиды или белки, образующие бляшечные депо, часто происходят из более крупного белка-предшественника. Более конкретно, в патогенез амилоидных агрегатов, таких как фибриллярные депо, обычно вовлечено протеолитическое расщепление "патологического" белка-предшественника на фрагменты, которые аггрегируются в непараллельные Р-складчатые листы.
Фибриллярное строение указанных депо является идентифицирующим признаком разных форм амилоидного заболевания. Например, интрацеребральные и цереброваскулярные депо, состоящие в основном из фибрилл бета-амилоидного пептида (Р-АР), характерны для болезни Алыдгеймера (как семейной, так и спорадической форм), островковый амилоидный полипептид (IAPP; амилин) характерен для фибрилл амилоидных депо в панкреатических островковых клетках, связанных с диабетом II типа, и Р2-микроглобулин представляет собой основной компонент амилоидных депо, которые образуются вследствие продолжительного проведения гемодиализа. Позднее амилоидными заболеваниями были также признаны прион-ассоциированные заболевания, такие как болезнь Крейтцфельдта - Якоба.
В общем, патологические первичные амилоидозы отличаются присутствием белковых фибрилл с "амилоидным типом легкой цепи" (AL-типом), называемых так по гомологии N-терминальной области AL-фибрилл и вариабельного фрагмента легкой цепи иммуноглобулина (каппа или лямбда).
Разные формы заболевания были разделены на классы, главным образом исходя из связи амилоидо-за с основным системным заболеванием. Таким образом, считается, что некоторые патологические состояния являются первичными амилоидозами, при которых не подтверждается предшествующее наличие заболевания или его существование в качестве сопутствующей патологии. При вторичном или реактивном амилоидозе (тип АА), который характеризуется наличием фибриллярных депо амилоидного белка (АА), выявляется основное или ассоциированное хроническое воспалительное или инфекционное патологическое состояние.
При семейно-наследственных амилоидозах возможно наличие ассоциированных нейропатических, почечных или сердечно-сосудистых депо ATTR-типа (транстиретинового). Другие семейно-наследственные амилоидозы включают другие синдромы и могут иметь разные амилоидные компоненты (например, семейная средиземноморская лихорадка, для которой характерны АА-фибриллы). Другие формы амилоидоза включают локализованные формы, отличающиеся фокальными, часто опухолеподоб-ными, депо, которые возникают в отдельных органах. Другие амилоидозы связаны со старением, и обычно характеризуются образованием бляшки в сердце или мозге. Также распространены амилоидные депо, связанные с продолжительным гемодиализом. Сведения об этих и других формах амилоидного заболевания объединены в табл. 1 (Tan, S. Y. and Pepys, ffistopathology 25:403-414, 1994; Harrison's Handbook of Internal Medicine, 13th Ed., Isselbacher, K. J., et al. , eds, McGraw-Hill, San Francisco, 1995), и описаны в патентах США №№ 6875434, 6890535, 6913745, 6923964 и 6936246, которые полностью включены путем ссылки в настоящий документ.
Легкие цепи
Ak, А,
Идиопатический
моноклонального
(например/
(первичный)
иммуноглобулина
AkIII)
амилоидоз:
(каппа, лямбда)
связанный с
миеломой или
макроглобулинемией;
системный
амилоидоз,
связанный с
иммуноцитарной
дискразией;
моноклональная
гаммопатия;
оккультная
дискразия;
локальный
нодулярный
амилоидоз,
связанный с
хроническими
воспалительными
заболеваниями
IgG (KYD)
Ayl
Амилоидоз,
связанный с
несколькими
имму н о ци т а р ньтми
дискразиями,
тяжелая цепь
ATTR
Транстиретин
По меньшей
Семейная амилоидная
(TTR)
мере 30
полинейропатия
известных
(например, метионин
точечных
Met3Q,
мутаций
португальский тип)
ATTR
Транстиретин
например,
Семейная амилоидная
(TTR)
Metlll
кардиомиопатия (датский тип)
ATTR
Транстиретин
Дикий шип
Системный сенильный
(TTR)
TTR или изолейцин 11el22
амилоидоз
AapoAI
ApoAI
Аргинин Arg2 6
Семейная амилоидная полинейропатия
Agel
Гельсолин
Аспарагин Asnl87
Семейный амилоидоз (финского типа)
Acys
Цистатин С
Глутамин Gln68
Наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (исландский тип)
A P.
j3 - амилоидный
ВэриэнтI
Болезнь
белок-
Gln618
Альцгеймера,
предшественник
синдром Дауна,
(например |3-
наследственный
АРР6а5)
церебральный
геморрагический
амилоидоз
(голландский тип),
спорадическая
церебральная
амилоидная
ангиопатия, миозит
с инклюзионными
тельцами
AB2M
Бета2-
микроглобулин
Связанный с хроническим гемодиализом
Acal
(Про)
(Про)
Медуллярная
кальцитонин
кальцитонин
карцинома
щитовидной железы
Фокальные сенильные
амилоидозы:
AANF
Атриальный
Изолированный
натрийуретический
атриальный амилоид;
фактор,
(3-амилоидный
Мозг
белок-
предше с твенник
SVEPa
Семенные пузырьки
AB2M
бета2-
Простата
микроглобулин
Кератин
Первичный
локализованный
кожный амилоид
(макулярный,
папулезный)
PrP
Белок-
Белок
Спорадическая
предшественник
скрепи
болезнь
прионов (33-35
(Scrapie)
Крейтцфельдта -
кДа, клеточная
27-30 кДа
Якоба, болезнь куру
форма)
(трансмиссивные
спонгиформные
энцефалопатии,
прионные болезни)
AIAPP
Островковый
Островки
амилоидный
Лангерганса; Диабет
полипептид (IAPP)
типа II; Инсулинома
Пептидные
например,
Экзокринный
гормоны,
прекальцитонин
амилоидоз,
фрагменты
связанный с
апудомами
Белок экзокринного семенного пузырька
Часто фибриллы, образующие большую часть амилоидного депо, происходят из одного или нескольких первичных белков-предшественников или пептидов, и обычно связываются с сульфатирован-ными гликозоаминогликанами. Кроме того, амилоидные депо могут включать незначительное количество белков и пептидов разных типов, наряду с другими компонентами, такими как протеогликаны, ганг-лиозиды и другие сахара, как описано более подробно в нижеследующих разделах.
Фибриллы АА-типа состоят из пептидных фрагментов, размер которых варьирует, но в общем составляет около 8000 дальтон (АА-пептид или белок), которые образуются путем протеолитического расщепления сывороточного А-амилоидного белка (SSA), циркулирующего аполипопротеина, который присутствует в частицах ЛПВ (липопротеинов высокой плотности) и синтезируется в гепатоцитах в ответ на такие цитокины как интерлейкин (IL)-1 и IL-6, а также фактор некроза опухолей TNF-cc. См. Husby, G. et al. Amyloid 1, 119-137 (1994). Протеолитическое расщепление приводит к патологическому накоплению N-терминального остатка около 76 аминокислот от двух третей белка SAA. Концентрация SAA в плазме человека обычно составляет около 0,1 мг/мл, но в ответ на воспалительный стимул может повышаться более чем в 1000 раз. Частью указанного процесса является протеолиз молекулы SAA, и продукт N-терминального расщепления систематически накапливается в виде АА-фибрилл в жизненно-важных ор
ганах, включающих печень, селезенку, почки и надпочечники. Обычно накопление часто происходит также в сердце и желудочно-кишечном тракте.
В общем, амилоидоз АА-типа является проявлением заболеваний, которые вызывают устойчивый острофазовый ответ. Такие заболевания включают хронические воспалительные заболевания, хронические локальные или системные микробные инфекции и злокачественные новообразования. Амилоидные заболевания АА-типа включают без ограничения воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическую артро-патию, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета и болезнь Крона. Депо АА также образуются в результате хронических микробных инфекций, таких как лепра, туберкулез, бронхоэктати-ческая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит и болезнь Уиппла. Некоторые злокачественные новообразования могут также вызывать образование АА-фибриллярных амилоидных депо. Они включают такие патологии, как ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточная карцинома и волосатоклеточный лейкоз. Амилоидное заболевание АА-типа также может быть результатом наследственных воспалительных заболеваний, таких как семейная средиземноморская лихорадка. Дополнительно, амилоидное заболевание АА-типа может быть обусловлено лимфопролиферативными заболеваниями, такими как болезнь Каст-лемана.
Амилоидоз АА-типа развивается без явной симптоматики и прогрессирует. Обычно симптомы выявляются на более поздних стадиях болезни. Часто пациент остается недиагностированным до появления тяжелого органного поражения. Накопление фибрилл АА-типа происходит в жизненно важных органах и приводит к дисфункции органа и, впоследствии, к смерти. Уровень пятилетнего выживания составляет 45-50%. После диагностики средняя выживаемость составляет от 4 до 8 лет. Заболевания почек на последней стадии являются причиной смерти в 40-60% случаев. См. Gillmore J.D. et al., Lancet 358:24-9 (2001).
В настоящее время не существует каких-либо одобренных амилоид-специфических способов лечения какой-либо из амилоидных заболеваний, включающих амилоидоз АА-типа. См. Gillmore J. D. et al., Lancet 358:24-9 (2001). При наличии основного или сопутствующего заболевания терапия направлена на уменьшение выработки амилоидогеннного белка путем лечения основного заболевания. Например, современная стратегия лечения амилоидоза АА-типа нацелена на основной воспалительный процесс путем уменьшения уровня белка ApoSSA ниже 10 мг/л. Применяемые в настоящее время способы лечения включают химиотерапию (хлорамбуцил и метотрексат МТХ), иммунодепрессанты (азатиоприн), противовоспалительные лекарства (колхицин) и ингибиторы TNF. Таким образом, настоящее изобретение осуществляет давнюю потребность в схемах лечения для улучшения состояния при амилоидозе АА-типа или для профилактики указанной патологии.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенному человеческому, гуманизированному или химерному антителу, или к его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с эпи-топом в пределах 70-76 остатков человеческого амилоидного пептида, например, с эпитопом в пределах 70-76 остатков последовательности SEQ ID NO: 2, или с эпитопом, содержащим остатки, представленные как SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Антитела или антиген-связывающие фрагменты по изобретению включают те из них, которые конкурируют за связывание с человеческим амилоидным пептидом с антителом 2А4, продуцируемым инвентарным номером АТСС или с антителом 7D8, продуцируемым инвентарным номером АТСС. Дополнительные антитела по изобретению конкурируют за связывание с человеческим А-амилоидным пептидом с антителом, имеющим вариабельную область легкой цепи, представляющую собой остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153 и вариабельную область тяжелой цепи, представляющую собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154.
Раскрытые в изобретении антитела включают гуманизированные и химерные версии антитела 2А4, продуцируемые инвентарным номером АТСС, или гуманизированную или химерную версию антитела 7D8, продуцируемую инвентарным номером АТСС.
Например, типичные антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую один или несколько участков, определяющих комплементарность, вариабельной области легкой цепи антитела 2А4, представленной как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или один или несколько участков, определяющих комплементарность, вариабельной области легкой цепи 7D8, представленной как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153. В качестве другого примера, типичные антитела и антиген-связывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую два участка, определяющие комплементарность, вариабельной области легкой цепи 2А4, представленной как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152, или два участка, определяющие комплементарность, вариабельной области легкой цепи 7D8, представленной как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153. Дополнительные типичные антитела и антиген-связывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющие комплементарность, вариабельной области легкой цепи 2А4, представленной как остатки 20
131 последовательности SEQ ID NO: 152, или три участка, определяющие комплементарность, вариабельной области легкой цепи 7D8, представленной как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153. Типичные версии гуманизированных антител 2А4 или 7D8 содержат по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из L87 и L90 (соглашение о нумерации по Rabat), который занят, соответственно, Y и F, и в которых остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина. Типичные антитела и антиген-связывающие фрагменты содержат по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, + 92 и +109 (линейная нумерация), который занят, соответственно Т, S, L, D, Q, K, Y, L, F и L, и в которых остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина. Например, типичные антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +75 и +92 (линейная нумерация), который занят, соответственно Y и F, и в которых остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина. В других типичных антителах и антиген-связывающих фрагментах по изобретению вариабельная область легкой цепи содержит остаток каркасного участка в +105 (линейная нумерация), который занят Q.
Например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают те из них, которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую остаток каркасного участка в +7 (линейная нумерация), занятый Т, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +14 (линейная нумерация), занятый S, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +15 (линейная нумерация), занятый L, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +17 (линейная нумерация), занятый D, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +18 (линейная нумерация), занятый Q, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +50 (линейная нумерация), занятый K, в которых остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +75 (линейная нумерация), занятый Y, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +88 (линейная нумерация), занятый L, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +92 (линейная нумерация), занятый F, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +109 (линейная нумерация), занятый L, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; и антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области легкой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +105 (линейная нумерация), занятый Q, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина.
Вариабельные области легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина, используемые в настоящем изобретении, включают человеческие вариабельные области каппа-подгруппы 2 легких цепей (нумерация по Rabat), например, человеческую вариабельную область подгруппы 2 легкой цепи из человеческой зародышевой линии VKIIA 19/А3, такую, как человеческая вариабельная область легкой цепи Vk, которая содержит последовательности, указанные, как SEQ ID NO: 166 или 167. В конкретных аспектах изобретения антитела и антиген-связывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, образованную остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152, остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153, или такие как SEQ ID
NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176.
Типичные антитела и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению также включают те из них, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую одну или несколько участков, определяющих комплементарность, вариабельной области тяжелой цепи 2А4, представленной как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154, например, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую два участка, определяющих комплементарность, в вариабельной области тяжелой цепи 2А4, представляющую собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащей три участка, определяющих комплементарность, в вариабельной области тяжелой цепи 2А4, представляющую собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154. Типичные гуманизированные антитела 2А4 и 7D8 и антиген-связывающие фрагменты содержат по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из Н37, Н49, Н70 и Н93 (соглашение о нумерации по Rabat), который занят I, A, F или V, соответственно, и в котором остаток из вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина. Типичные гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +10, +15, +19, +37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99, +119 (линейная нумерация), который занят R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, М, V или А, соответственно, и в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина. Например, типичные гуманизированные антитела и антиген-связывающие фрагменты содержат по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +37, +49, +73 и +99 (линейная нумерация), который занят I, A, F или V, соответственно, и в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина.
Например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению включают те из них, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую остаток каркасного участка в +10 (линейная нумерация), занятый R, при этом остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +15 (линейная нумерация), занятый K, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +19 (линейная нумерация), занятый K, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +37 (линейная нумерация), занятый I, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи, занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +49 (линейная нумерация), занятый А, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +73 (линейная нумерация), занятый F, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +78 (линейная нумерация), занятый Q, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +79 (линейная нумерация), занятый S, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +80 (линейная нумерация), занятый М, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +87 (линейная нумерация), занятый N, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +95 (линейная нумерация), занятый М, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; антитела и антиген-связывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержа
щие остаток каркасного участка в +99 (линейная нумерация), занятый V, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; и антитела и антигенсвязывающие фрагменты вариабельной области тяжелой цепи, содержащие остаток каркасного участка в +109 (линейная нумерация), занятый А, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина.
Вариабельная область тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина включает человеческую вариабельную область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 (соглашение о нумерации по Rabat), например, человеческую вариабельную область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3, содержащую последовательность, указанную как SEQ ID NO: 165, такую как вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, представляющую собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154 или указанную как SEQ ID NO: 161, 162 или 163.
Дополнительные примеры антител и антигенсвязывающих фрагментов содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющие комплементарность, из вариабельной области легкой цепи 2А4, которые представляют собой остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или три участка, определяющие комплементарность, из вариабельной области легкой цепи 7D8, которые представляют собой остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементарность, из вариабельной области тяжелой цепи 2А4, представляющую собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154. Например, такие антитела и антигенсвязывающие фрагменты включают те из них, которые имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющие комплементарность, указанные как SEQ ID NO: 168, 169 и 170 и вариабельную область тяжелой цепи, содержащие три участка, определяющие комплементарность, указанные как SEQ ID NO: 171, 172 и 173. В качестве другого примера, такие антитела и антигенсвязывающие фрагменты включают те из них, которые имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющие комплементарность, которые представляют собой SEQ ID NO: 177, 169 и 170, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащие три участка, определяющих комплементарность, которые представляют собой SEQ ID NO: 171, 172 и 173. В другом примере такие антитела и антигенсвязывающие фрагменты включают те из них, которые имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая представляет собой остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, которая представляет собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154. В качестве другого примера, такие антитела и антигенсвязывающие фрагменты включают те из них, которые имеют вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 161, 162 или 163.
В конкретных аспектах по настоящему изобретению антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:155, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:155, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:155, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:156, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:156, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:156, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:157, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:157, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 157, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:158, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:158, и вариабельную область тяжелой цепи, содер
жащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:158, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:159, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:159, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:159, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:160, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:160, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:160, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, указанные как SEQ ID NO:163; SEQ ID NO:174, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:174, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:174, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:175, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:175, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:162; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:175, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:163; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:176, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:161; вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:176, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO:162; или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:176, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:163.
Также настоящее изобретение рассматривает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие человеческое, гуманизированное или химерное антитело, или его антиген-связывающий фрагмент, которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 человеческого А-амилоидного пептида, и включает все указанные антитела и антиген-связывающие фрагменты, описанные выше в настоящем документе и приведенные в формуле изобретения. Дополнительно, изобретение относится к клеткам, экспрессирующим указанные нуклеиновые кислоты.
В других аспектах настоящее изобретение относится к выделенному антителу или к его антиген-связывающему фрагменту, которое специфически связывается с эпитопом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, где X1 и Х2 являются любой аминокислотой. Такие антитела и антиген-связывающие фрагменты включают человеческие, гуманизированные или химерные антитела и их анти-ген-связывающие фрагменты, например, те из них, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-76 в человеческом А-амилоидном пептиде.
Дополнительные примеры антител и антигенсвязывающих фрагментов включают такие, где X1 представляет собой Н, Т, F, S, P, A, L, С, Q, R, Е, K, D, G, V, Y, I или W, и где Х2 представляет собой Т, S,
E, R, I, V, F, D, A, G, M, L, N, Р, С, K, Y или Q; или X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А, и в которых Х2 представляет собой Т, S, E, R, I, V, F, D или А; или X1 является Н, Т, F или А; или Х2 является Т, S, E, D или А; или X1 является Н, Т, F или А и Х2 является Т, S, E, D или А; или X1 является Н, Т или А и Х2 является Т, S, Е или А; или X1 является Н или А, и Х2 представляет собой Т, S или А; или X1 является Н, и Х2 является Т или А; или X1 является А, и Х2 представляет собой S, Т, Е или V; или X1 представляет собой А и Х2 представляет собой S,T или Е; или X1 представляет собой Т и Х2 представляет собой Е; или X1 представляет собой F и Х2 представляет собой D; или X1 представляет собой S и Х2 представляет собой Е, F или А; или X1 является Р и Х2 представляет собой Е, I или F. Например, такие антитела и анти-ген-связывающие фрагменты связываются с представляет собой, FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22),
AEDV (SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) и SEDA (SEQ ID NO: 25); или с эпитопом, состоящим из аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), SEDF (SEQ ID 24) и SEDA (SEQ ID 25), или с эпитопом, состоящим из аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), SEDT (SEQ ID 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO: 16). В агрегированном амилоидном белке можно обнаружить раскрытые в изобретении эпитопы, например, эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, которая
выбрана из группы, состоящей из GHGAEDS (SEQ ID NO: 4), GHDAEDS (SEQ ID NO: 5), GDHAEDS (SEQ ID NO: 7), STVIEDS (SEQ ID NO: 8) и GRGHEDT (SEQ ID NO: 9); или эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность GHGAEDS (SEQ ID NO 4); или эпитоп, содержащий аминокислоты HEDT (SEQ ID NO: 12); или эпитоп, содержащий аминокислоты HEDA (SEQ ID NO: 15); или эпитоп, содержащий аминокислоты AEDS (SEQ ID NO: 13) или эпитоп, содержащий аминокислоты AEDT (SEQ ID NO: 14); или эпитоп, содержащий аминокислоты TEDE (SEQ ID NO: 16); или эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность AEDV (SEQ ID NO: 23); или эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность SEDF (SEQ ID NO: 24) или PEDF (SEQ ID NO: 22); или эпитоп, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из PEDS (SEQ ID NO: 26), PEDL (SEQ ID NO: 27), TEDV (SEQ ID NO: 28), AEDE (SEQ ID NO: 19), SEDI (SEQ ID NO: 29) и TEDT (SEQ ID NO: 30); или эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из LEDG (SEQ ID NO: 31), AEDM (SEQ ID NO: 32), HEDS (SEQ ID NO: 33), CEDD (SEQ ID NO: 34), QEDS (SEQ ID NO: 35), REDS (SEQ ID NO: 36), TEDG (SEQ ID NO: 16), QEDR (SEQ ID NO: 38), TEDL (SEQ ID NO: 39), PEDN (SEQ ID NO: 40), EEDP (SEQ ID NO: 41), LEDL (SEQ ID NO: 42), KEDA (SEQ ID NO: 43), SEDC (SEQ ID NO: 44), EEDD (SEQ ID NO: 45), SEDK (SEQ ID NO: 46), DEDD (SEQ ID NO: 47), DEDG (SEQ ID NO: 13), LEDE (SEQ ID NO: 49), GEDA (SEQ ID NO: 13), VEDF (SEQ ID NO: 51), YEDE (SEQ ID NO: 52), IEDL (SEQ ID NO: 53), WEDY (SEQ ID NO: 54), DEDW (SEQ ID NO:
55), SEDL(SEQ ID NO: 56), YEDQ (SEQ ID NO: 57), LEDW (SEQ ID SEQ NO: 58), YEDR (SEQ ID SEQ
NO: 59) и PEDK (SEQ ID NO: 60).
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, включают те из них, которые связываются с амилоидным белком в мономерной форме с аффинностью, составляющей менее чем примерно 10 М-1. Типичные амилоидные белки включают сывороточный амилоидный белок (SAA), белок легкой цепи иммуноглобулина (такой как VA6 Wil и VK), человеческий островковый амилоидный полипептид-предшественник (IAPP), бета-амилоидный пептид, транстиретин (TTR) и аполипо-протеин A1 (ApoAl).
Также настоящее изобретение рассматривает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 являются любыми аминокислотами, и включает все указанные антитела и антиген-связывающие фрагменты, описаннные выше и приведенные в формуле натоящего изобретения. Дополнительно рассматриваются клетки, экспрессирующие указанные нуклеиновые кислоты.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам терапевтического лечения или профилактики субъекта с выявленным амилоидозом АА-типа, с применением человеческого, гуманизированного или химерного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-76 в человеческом А-амилоидном пептиде, например, с эпитопом в пределах остатков 70-76 последовательности SEQ ID NO: 2. Субъекты, для которых могут быть полезными раскрытые в изобретении терапевтические способы лечения амилоидоза АА-типа, включают субъектов, страдающих амилоидным заболеванием, которое выбрано из группы, состоящей из следующих патологий: ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическая артропатия, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бех-чета и болезнь Крона, лепра, туберкулез, бронхоэктатическая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит, болезнь Уиппла, ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточная карцинома, волосатоклеточный лейкоз, семейная средиземноморская лихорадка, болезнь Кастлемана. Субъекты, для которых могут быть полезными раскрытые в изобретении способы профилактики, включают субъекты, предрасположенные к развитию любого из вышеуказанных заболеваний или находящиеся в группе риска.
Также настоящее изобретение рассматривает способы терапевтического лечения или профилактического лечения субъекта, страдающего амилоидозом, связанным с наличием агрегированного амилоидного белка, который содержит аминокислотную последовательность ED, с использованием антитела или антиген-связывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 являются любыми аминокислотами. В число субъектов, для которых могут быть полезными раскрытые в изобретении терапевтические способы лечения амилоидоза, связанного с агрегированным амилоидным белком, входят субъекты, страдающие
амилоидозом АА-типа, амилоидозом AL-типа, болезнью Алыдгеймера, умеренным когнитивным нарушением, амилоидной полинейропатией, средиземноморской лихорадкой, синдромом Макла-Уэллса, реактивным системным амилоидозом, связанным с системными воспалительными заболеваниями, амилои-дозом, связанным с миеломой или макроглобулинемией, амилоидозом, связанным с иммуноцитарной дискразией, моноклональной гаммапатией, оккультной дискразией, и страдающие локальным нодуляр-ным амилоидозом, связанным с хроническими воспалительными заболеваниями. В чило субъектов, для которых могут быть полезными раскрытые в изобретении способы профилактики, входят субъекты, предрасположенные или имеющие риск развития любого из вышеуказанных заболеваний. В одном аспекте изобретения амилоидный белок содержит аминокислотную последовательность AEDV (SEQ ID NO: 23), и терапевтическое или профилактическое лечение осуществляют путем применения раскрытых в изобретении способов лечения амилоидогенного зоболевания, которая представляет собой амилоидоз АА-типа, амилоидоз AL-типа, амилоидную полинейропатию, средиземноморскую лихорадку, синдром Макла-Уэллса, реактивный системный амилоидоз, связанный с системными воспалительными заболеваниями, амилоидоз, связанный с миеломой или макроглобулинемией, амилоидоз, связанный с иммуноци-тарной дискразией, моноклональной гаммапатией, оккультной дискразией, и локальный нодулярный амилоидов, связанным с хроническими воспалительными заболеваниями.
Раскрытые способы лечения и профилактики являются полезными для лечения людей.
Типичные показатели эффективности терапевтического лечения включают замедление прогресси-рования амилоидоза, торможение образования депо амилоидных фибриллярных агрегатов и/или устранение амилоидных фибриллярных агрегатов. Типичные показатели эффективного профилактического лечения включают задержку начала развития амилоидоза и/или снижение риска развития амилоидоза.
В дополнение к указанному, изобретение относится к способам обнаружения амилоидного депо, связанного с амилоидозом АА-типа у субъекта-человека, с использованием гуманизированного или химерного антитела, или его антиген-связывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпи-топом в пределах остатков 70-76 человеческого А-амилоидного пептида, и указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент связаны с детектируемой меткой, и затем у субъекта проводят детекцию детектируемой метки. Дополнительные способы включают обнаружение агрегированного амилоидного белка, содержащего аминокислотные последовательности ED, путем использования антитела или анти-ген-связывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, где X1 и Х2 являются любыми аминокислотами. Вышеуказанные способы обнаружения можно применять, например, для контроля начала или прогрессирования болезни, или для лечения любого из вышеупомянутых заболеваний и нарушений. В отношении раскрытых в настоящем изобретении способов лечения, такой контроль можно осуществлять у людей, а также у субъектов, отличных от людей. Полезные детектируемые метки включают радиометки, например, 125I. При осуществлении таких способов детекции этап обнаружения детектируемой метки можно проводить не-инвазивными способами, например, получением изображения с помощью мульти-функциональной томографической системы SPECT/CT и ядерно-магнитной (ЯМР) спектроскопии.
В дополнении к указанному способу рассматриваются способы активной иммунотерапии у субъекта с амилоидозом АА-типа путем применения средства, который индуцирует иммунный ответ к остаткам 70-76 из А-амилоидного пептида, который обладает эффектом индуцирования иммунного ответа и содержит антитела против остатков 70-76 из А-амилоидного пептида. Типичные средства, индуцирующие иммунный ответ, включают остатки 70-76 из А-амилоидных пептидов, или субфрагмент по меньшей мере из 3 смежных остатков, имеющих менее 20 смежных аминокислот из АА-пептида. Эти способы полезны с терапевтической и профилактической стороны для лечения вышеописанных субъектов, в отношении пассивной иммунотерапии, то есть, путем введения антитела или антиген-связывающего фрагмента, которые специфически связываются с остатками 70-76 А-амилоидного пептида. Показатели терапевтической и профилактической эффективности в отношении пассивной иммунотерапии анологичны указанным выше.
Вышеизложенное суммирует конкретные аспекты по настоящему изобретению, и далее описаны его дополнительные аспекты.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: выравнивание последовательностей человеческого белка SAA1, человеческого SAA2, человеческого SAA3 и человеческого SAA4.
Фиг. 2: выравнивание последовательностей человеческого SAA1 и человеческого АА1.
Фиг. 3: выравнивание последовательностей человеческого SAA2 и человеческого АА2.
Фиг. 4: выравнивание последовательностей человеческого SAA3 и человеческого АА3.
Фиг. 5: выравнивание последовательностей человеческого SAA4 и человеческого АА4.
Фиг. 6: выравнивание последовательностей человеческого АА1, человеческого АА2, человеческого АА3 и человеческого АА4.
Фиг. 7: выравнивание последовательностей последних семи остатков человеческого АА1, человеческого АА2, человеческого АА3 и человеческого АА4.
Фиг. 8: выравнивание последовательностей мышиного SAA1, мышиного SAA2, мышиного SAA3 и
мышиного SAA4.
Фиг. 9: выравнивание последовательностей мышиного SAA1 и мышиного АА1. Фиг. 10: выравнивание последовательностей мышиного SAA2 и мышиного АА2. Фиг. 11: выравнивание последовательностей мышиного SAA3 и мышиного АА3. Фиг. 12: выравнивание последовательностей мышиного SAA4 и мышиного АА4. Фиг. 13: выравнивание последовательностей мышиного АА1, мышиного АА2, мышиного АА3 и мышиного АА4.
Фиг. 14: выравнивание последовательностей последних семи остатков мышиного АА1, мышиного АА2, мышиного АА3 и мышиного АА4.
Фиг. 15: выравнивание последовательностей человеческого SAA1 и мышиного SAA1.
Фиг. 16: выравнивание последовательностей человеческого АА1 и мышиного АА1.
Фиг. 17: выравнивание последовательностей человеческого SAA1 и фрагмента мышиного SAA1.
Фиг. 18: выравнивание последовательностей человеческого SAAl-альфа, человеческого SAA1-бета и человеческого SAA1-гамма.
Фиг. 19: выравнивание последовательностей человеческого SAA2-альфа и человеческого SAA2-
бета.
Фиг. 20: сравнение последовательностей белков SAA. Область пептида, обычно продуцирующая 2А4, 8G9 и 7D8, показана пунктирными линиями. Вставки из 8 аминокислот между положениями 67 и 68 в последовательности шарпея подчеркнуты и обозначены стрелкой. Выравнивание проводили с CLUS-
TALW.
Фиг. 21: зародышевая последовательность легкой цепи Vk. Фиг. 22: зародышевая последовательность легкой цепи Vk. Фиг. 23: аминокислотная последовательность Vk6 Wil.
Фиг. 24: рентгенокристаллография Vk6 Wil, показывающая положение Glu50-Asp51.
Фиг. 25: рентгенокристаллография Vk6 Wil, показывающая положение Glu81-Asp82.
Фиг. 26: кинетика связывания моноклональных антител mAb Elan с синтетическими фибриллами Vk6 Wil. Измерения взаимодействия mAb 2A4, 7D8 и 8G9 в концентрации 6,6 нМ с иммобилизирован-ными фибриллами Vk6 Wil с помощью биосенсора BIAcore. Расчетная константа KD каждого взаимодействия составляла около 1 нМ.
Фиг. 27: кинетика связывания в зависимости от концентрации mAb 7D8 с синтетическими фибриллами Vk6 Wil. Взаимодействие антитела в концентрации 6,6 - 33,3 нМ с иммобилизированными фибриллами Vk6 Wil измеряли с помощью BIAcore.
Фиг. 28: кинетика связывания mAb 7D8 с синтетическими фибриллами Vk6 Wil в присутствии пептидов р39 и р41. Взаимодействие mAb 7D8 в концентрации 6,6 нМ с иммобилизированными фибриллами Vk6 измеряли с помощью BIAcore в присутствии пептидов р39 и р41 в концентрации 1 или 20 мкг/мл.
Фиг. 29: реактивность моноклональных антител с тканевыми амилоидными депо ALk.
Фиг. 30: биораспределение меченого 125I mAb 7D8 у мышей, несущих человеческую амилоидому
ALk.
Фиг. 31: взаимодействие анти-АА из культурального супернатанта с АА-фибриллами мышиного происхождения. Показатели связывания с мышиным фактором усиления амилоидоза (AEF) АА-типа мо-ноклонального антитела mAb из культурального супернатанта. На верхней и нижней схеме представлены данные, соответственно, по первому и второму сбору культуральной жидкости.
Фиг. 32: электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия SDS-PAGE белка-А, очищенного моноклональными антителами 2А4, 8G9 и 7D8.
Фиг. 33: связывание очищенных mAb с иммунизирующим (р#39) и контрольным пептидом (р#41).
Фиг. 34: связывание с мышиным амилоидным экстрактом АА-типа (AEF).
Фиг. 35: связывание очищенных mAb с амилоидным экстрактом АА-типа почек человека.
Фиг. 36А-36Е: мышиные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи 2А4, 7D8 и 8G9 (фиг. 36А); последовательности вариабельных областей легкой цепи гуманизированного 2A4/8G9 и 7D8 (фиг. 36В-36С); человеческие последовательности вариабельных областей легкой цепи, используемые в качестве акцепторных каркасов (фиг. 36D); последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированных 2A4/7D8/8G9 и человеческой вариабельной области тяжелой цепи, используемые в качестве акцепторного каркаса (фиг. 36Е).
Подчеркивание - CDR; двойное подчеркивание - лидерные последовательности; нижний регистр -обратные мутации.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к выделенному антителу или к его антиген-связывающему фрагменту, которое специфически связывается с эпитопом, включающим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, где X1 и Х2 являются любыми аминокислотами.
Типичные антитела по изобретению также включают антитела или их фрагменты, которые (а) кон
курируют до связывания с эпитопом, включающим X1EDX2, с антителами 2А4, 7D8 или 8G9; (B) связываются с тем же эпитопом, включающим X1EDX2, что и антитела 2А4, 7D8 или 8G9; (с) включают анти-ген-связывающий домен из антител 2А4, 7D8 или 8G9; или (d) включают шесть участков, определяющих копмплиментарность (CDR), из антител 2А4, 7D8 или 8G9.
Изобретение также относится к выделенной вариабельной области антитела, которая включает (а) вариабельную область легкой цепи антитела, полученного из 2А4, 7D8, или 8G9 антитело; или (b) вариабельную область тяжелой цепи антитела, происходящего из антител 2А4, 7D8 или 8G9.
Изобретение также относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельную область легкой цепи или вариабельную область тяжелой цепи антитела, которая включает (а) нуклеотид-ную последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антител 7D8, 2А4 или 8G9; (b) нуклеотидную последовательность, которая идентична нуклеотидной последовательности антител 7D8, 2А4 или 8G9, которая кодирует вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи; (с) нуклеотидную последовательность, которая по существу идентична нуклеотидной последовательности (а) или (b); или (d) нуклеиновую кислоту, которая специфически гибридизуется с нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности (а) или (b) при строгих условиях гибридизации.
Также в настоящем изобретении рассматриваются клетки, экспрессирующие антитела и антиген-связывающие фрагменты по настоящему изобретению. Изобретение дополнительно относится к клеткам, экспрессирующим нуклеиновые кислоты по изобретению.
Изобретение также включает способы лечения амилоидных заболеваний и способы профилактики амилоидных заболеваний путем применения антител и антиген-связывающих фрагментов по изобретению. В настоящее время не существует каких-либо одобренных амилоид-специфических способов лечения какого-либо из амилоидных заболеваний, включающих амилоидоз АА-типа и амилоидоз AL-типа. См. Gillmore J.D. et al., Lancet 358:24-9 (2001). При наличии основного или сопутствующего заболевания терапия направлена на уменьшение выработки амилоидогеннного белка путем лечения основного заболевания. Например, современная стратегия лечения амилоидоза АА-типа нацелена на основной воспалительный процесс путем уменьшения уровня белка ApoSSA ниже 10 мг/л. Применяемые в настоящее время способы лечения включают химиотерапию (хлорамбуцил и метотрексат МТХ), иммунодепрессанты (азатиоприн), противовоспалительные лекарства (колхицин) и ингибиторы TNF. Изобретение относится к фармацевтическим композициям и способам лечения ряда амилоидных заболеваний, включающих амилоидоз, такой как, например, амилоидоз АА-типа и амилоидоз AL-типа. Согласно одному аспекту, изобретение включает фармацевтические композиции, которые в качестве активного компонента включают средство, обладающее действием индуцирования иммунного ответа против амилоидного компонента у пациента. Средство может быть пептидом, содержащим фрагмент, состоящий из аминокислотной последовательности X1EDX2, полученной из амилоидного белка. Средство может представлять собой антитело, которое специфически связывается с эпитопом, содержащим X1EDX2. В других вариантах осуществления средство может являться антиген-связывающим фрагментом антитела. Такие композиции будут также обычно включать наполнители, и в предпочтительных вариантах осуществления могут включать адъюванты. В дополнительно предпочтительных вариантах осуществления адъюванты включают, например, гидроокись алюминия, фосфат алюминия, монофосфорил-липид MPL(tm), QS-21 (STIM-ULON(tm)) или неполный адъювант Фрейнда. Согласно родственному варианту осуществления, указанные фармацевтические композиции могут включать множество средств, обладающих действием активации иммунного ответа у пациента на более чем один амилоидный компонент.
В родственном варианте осуществления средство обладает действием активации иммунного ответа, направленного против агрегированного амилоидного белка, такого как фибриллярный пептид или компонент амилоидного белка. Предпочтительно, указанный фибриллярный пептид или белок происходит из фибриллярного белка-предшественника, который достоверно связан с определенными формами амилоидных заболеваний, согласно описанию изобретения. Такие белки-предшественники включают без ограничения сывороточный А-амилоидный белок (ApoSSA), легкую цепь иммуноглобулина, тяжелую цепь иммуноглобулина, ApoAI, транстиретин, лизозим, цепь фиброгена а, гельсолин, цистатин С, белок-предшественник Р-амилоида (Р-АРР), бета2-микроглобулин, белок-предшественник приона (PrP), атри-альный натрийуретический фактор, кератин, островковый амилоидный полипептид, пептидный гормон и синуклеин. Такие предшественники также включают мутантные белки, фрагменты белков и протеолити-ческие пептиды указанных предшественников. В предпочтительном варианте осуществления средство обладает действием активации иммунного ответа, направленного против неоэпитопа, образованного фибриллярным белком или пептидом, относительно фибриллярного белка-предшественника. Таким образом, как описано более подробно в настоящем изобретении, многие фибрилл-образующие пептиды или белки представляют собой фрагменты таких белков-предшественников, например, вышеупомянутых белков-предшественников. При образовании указанных фрагментов, например, путем протеолитического расщепления, могут быть обнаружены эпитопы, которые не присутствуют у предшественника, и поэтому иммунологически не доступны для иммунной системы, если фрагмент является частью белка
предшественника. Средства, нацеленные на такие эпитопы, могут быть предпочтительными терапевтическими средствами, так как они с меньшей вероятностью могут вызывать аутоиммунную реакцию у пациента. Предпочтительно, такие средства вызывают иммунный ответ, направленный на патологическую форму амилоидного белка, в первую очередь, например, на агрегированный амилоидный белок, относительно непатологических форм амилоидного белка.
Согласно родственному варианту осуществления, фармацевтические композиции по изобретению включают вещества, нацеленные на амилоидные агрегаты, например, вещества, выбранные из группы, которые включают без ограничения следующие агрегированные (например, фибриллярные) пептиды или белки: АА, AL, ATTR, AApoAl, Alys, Agel, Acys, AP, AB2M, AScr, Acal, AIAPP и фрагмент синуклеин-NAC. В настоящем изобретении описаны полные наименования и композиции указанных пептидов. Такие пептиды можно изготовлять в соответствии с известными в данной области техники способами, согласно описанию по настоящему изобретению.
Способы содержат введение пациенту эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с эпитопом, содержащим X1EDX2 в амилоидном белке, где X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р, А или любой другой аминокислотный остаток, непосредственно предшествующий ED в указанном амилоидном белке; и в котором Х2 представляет собой Т, S, E, R, I, V, F, А или любой другой аминокислотный остаток, расположенный непосредственно после ED в таком амилоидном белке. Согласно некоторым способам, пациент страдает амилоидозом, связанным с агрегированным амилоидным белком, содержащим аминокислотные последовательности ED. Некоторые антитела специфически связываются с эпито-пом, состоящим из указанного X1EDX2. В некоторых антителах X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А, и Х2 является Т, S, E, D, R, I, V, F или А. В некоторых таких антителах, если X1 является Н, то Х2 представляет собой Т или А; если X1 является А, то Х2 представляет собой S, Т, Е или V; если X1 является Т, то Х2 представляет собой Е; если X1 является F, то Х2 является D; если X1 является S, то Х2 представляет собой Е, F или А; и если X1 является Р, то Х2 представляет собой Е, I или F. В некоторых антителах X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А и Х2 представляет собой Т, S, E, D, R, I, V, F или А, при условии, что если X1 является А, то Х2 не является V. В некоторых антителах, если X1 является А, то Х2 представляет собой S, Т или Е.
Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), AEDV
(SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25). Некоторые антитела специфически
связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO:
14) , HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), SEDF (SEQ ID NO: 24) и SEDA (SEQ ID NO: 25). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3, HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO:
15) и TEDE (SEQ ID NO: 16).
Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-76 из АА. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 71-75 из АА.
Некоторые антитела индуцированы к пептиду, содержащему GHEDT (SEQ ID NO: 3).
Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотные последовательности PEDS (SEQ ID NO: 26), PEDL (SEQ ID NO: 27), TEDV, (SEQ ID NO: 28), AEDE (SEQ ID NO: 19), SEDI (SEQ ID NO: 29) и TEDT (SEQ ID NO: 30). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотные последовательности LEDG (SEQ ID NO: 31), AEDM (SEQ
ID NO: 32), HEDS (SEQ ID NO: 33), CEDD (SEQ ID NO: 34), QEDS (SEQ ID NO: 35), REDS (SEQ ID NO: 36), TEDG (SEQ ID NO: 37), QEDR (SEQ ID NO: 38), TEDL (SEQ ID NO: 39), PEDN (SEQ ID NO: 40),
EEDP (SEQ ID NO: 41), LEDL (SEQ ID NO: 42), KEDA (SEQ ID NO: 43), SEDC (SEQ ID NO: 44), EEDD (SEQ ID NO: 45), SEDK (SEQ ID NO: 46), DEDD (SEQ ID NO: 47), DEDG (SEQ ID NO: 48), LEDE (SEQ ID NO: 49), GEDA (SEQ ID NO: 50), VEDF (SEQ ID NO: 51), YEDE (SEQ ID NO: 52), IEDL (SEQ ID NO:
53), WEDY (SEQ ID NO: 54), DEDW (SEQ ID NO: 55), SEDL (SEQ ID NO: 56), YEDQ (SEQ ID NO: 57),
LEDW (SEQ ID NO: 58), YEDR (SEQ ID NO: 59) и PEDK (SEQ ID NO: 60).
Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность AEDV (SEQ ID NO: 23). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEDF (SEQ ID NO: 24) или PEDF (SEQ ID NO: 22). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность AEDS (SEQ ID NO: 13). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность PEDI (SEQ ID NO: 21), AEDV (SEQ ID NO 23), SEDF (SEQ ID NO: 24), SEDA (SEQ ID NO: 25), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19) и PEDE (SEQ ID NO: 20). Некоторые антитела связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность TEDE
(SEQ ID NO: 16). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность AEDV (SEQ ID NO: 23). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEDF (SEQ ID NO: 24) или PEDF (SEQ ID NO: 22). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность AEDS (SEQ ID NO: 13). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность PEDI (SEQ ID NO: 21), AEDV (SEQ ID NO 23), SEDF (SEQ ID NO: 24), SEDA (SEQ ID NO: 25), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19) и PEDE (SEQ ID NO: 20). Некоторые антитела связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность TEDE (SEQ ID NO: 16).
Любое из вышеописанных антител можно вводить описанными выше способами для осуществления лечения или профилактики заболевания, характеризующегося накоплением амилоидного белка, например, амилоидного белка, содержащего аминокислотную последовательность ED. В некоторых способах для лечения или профилактики болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного нарушения не вводят антитело, если амилоидный белок содержит аминокислотную последовательность AEDV (SEQ ID NO: 23). Амилоидный белок может представлять собой что-либо из нижеперечисленного: сывороточный А-амилоидной белок, белок легкой цепи иммуноглобулина, такой как, например, Vk6 Wil или Vk, человеческий островковый амилоидный полипептид-предшественник (IAPP), бета-амилоидный пептид, тран-стиретин (TTR) или ApoAl.
Необязательно, пациент является человеком. Необязательно, антитело специфически связывается с пептидом, остатки которого состоят из последовательностей SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Необязательно, антитело специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из (SEQ ID NO: 2). Необязательно, антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. Необязательно, человеческое антитело представляет собой изотип человеческого IgG1, IgG4, IgG2 или IgG3. Необязательно, гуманизированное антитело является изотипом человеческого IgG1, IgG4, IgG2 или IgG3. Необязательно, химерное антитело представляет собой изотип человеческого IgG1, IgG4, IgG2 или IgG3. Необязательно, антитело является мышиным антителом.
Необязательно, антитело является поликлональным антителом. Необязательно, антитело является моноклональным антителом.
В некоторых способах лечения антитело содержит две копии одной и той же пары легких и тяжелых цепей. В других способах антитело представляет собой биспецифическое антитело, содержащее первую пару легкой и тяжелой цепи, которая специфически связывается с эпитопом АР, и вторую пару легкой и тяжелой цепи, которая специфически связывается с Fc-рецептором на микроглиальных клетках. Согласно другим способам, осуществляют слияние цепи антитела с гетерологичным полипептидом.
Согласно некоторым способам лечения, доза антитела составляет по меньшей мере 1 мг/кг массы тела пациента. По другим способам доза антитела составляет по меньшей мере 10 мг/кг массы тела пациента.
Согласно некоторым способам лечения антитело вводят с носителем в виде фармацевтической композиции. По другим способам, антитело представляет собой человеческое антитело к АА, приготовленное из В-клеток человека, иммунизированного пептидом АА. Необязательно, человек, иммунизированный пептидом АА, является больным. По некоторым способам антитело вводят интраперитонеально, перорально, интраназально, подкожно, внутримышечно, местно или внутривенно.
Согласно некоторым способам лечения антитело вводят посредством введения пациенту полинук-леотида, кодирующего по меньшей мере одну цепь антитела, и экспрессия полинуклеотида направлена на продукцию цепи антитела у пациента. Необязательно, полинуклеотид кодирует тяжелые и легкие цепи антитела, и полинуклеотид экспрессируется для продукции тяжелых и легких цепей у пациента.
Некоторые из вышеупомянутых способов лечения дополнительно содержат введение эффективной дозы по меньшей мере одного другого антитела, которое связывается с другим эпитопом АА. Некоторые из вышеупомянутых способов лечения дополнительно содержат контроль уровня вводимого пациенту антитела в крови пациента. В других способах антитело вводят в многократной дозе в течение по меньшей мере шести месяцев. В других способах антитело вводят в виде композиции с длительным высвобождением.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам осуществления профилактики ами-лоидоза АА-типа у пациента, предрасположеного к развитию амилоидоза АА-типа. Указанные способы содержат введение пациенту эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из АА. Необязательно, пациент является человеком. Необязательно, антитело специфически связывается с пептидом, остатки которого состоят из последовательностей SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Необязательно, антитело специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из (SEQ ID NO: 2). В некоторых способах основное заболевание пациента является амилоидным заболеванием, которое выбрано из группы, состоящей из следующих патологий: ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическая артропа-тия, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета, болезнь Крона, лепра, туберкулез,
бронхоэктатическая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит, болезнь Уи-ппла, ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточная карцинома, волосатоклеточный лейкоз, семейная средиземноморская лихорадка и болезнь Кастлемана.
Изобретение дополнительно расматривает человеческое, гуманизированное или химерное антитело, которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из АА. Необязательно, гуманизированное антитело специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из АА. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 7D8 (инвентарный № АТСС).
Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 7D29. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 7D19. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 7D47. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 7D39. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 7D66. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 8G9. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 8G3. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 8G4. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 8G51. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 8G22. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 8G30. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 8G46. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 2А4 (инвентарный номер АТСС). Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 2А20. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 2А44. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 2А77. Необязательно, гуманизированное антитело является гуманизированным антителом версии 2А13. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело версии 2А14.
Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям. Фармацевтические композиции содержат антитело, которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из АА, и фармацевтически приемлемый носитель. Некоторые фармацевтические композиции содержат человеческое, гуманизированное или химерное антитело, которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 70-76 из АА, и фармацевтически приемлемый носитель. Другие фармацевтические композиции содержат антитело, которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 7076 из АА, и фармацевтически приемлемый носитель, в которых изотипом антитела является человеческий IgG1, и носитель является фармацевтически приемлемым. В некоторых фармацевтических композициях изотип антитела представляет собой человеческие IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых фармацевтических композициях антитело является человеческим. В некоторых фармацевтических композициях антитело является гуманизированным. В некоторых фармацевтических композициях антитело является химерным. В некоторых фармацевтических композициях антитело представляет собой поликлональное антитело. В некоторых фармацевтических композициях антитело является моноклональным антителом.
В некоторых фармацевтических композициях антитело содержит две копии одной и той же пары легких и тяжелых цепей. В некоторых фармацевтических композициях антитело представляет собой биспецифическое антитело, содержащее первую пару легкой и тяжелой цепи, которая специфически связывается с эпитопом АА, и вторую пару легкой и тяжелой цепи, которая специфически связывается с Fc-рецептором на микроглиальных клетках. Некоторые фармацевтические композиции имеют цепи антитела, слитые с гетерологичным полипептидом.
В некоторых фармацевтических композициях носитель представляет собой физиологически приемлемый разбавитель для парентерального введения. Некоторые фармацевтические композиции адаптированы для интраперитонеального, перорального, интраназального, подкожного, внутримышечного, местного или внутривенного введения. Некоторые фармацевтические композиции приспособлены для введения в многократной дозе в течение по меньшей мере шести месяцев. Некоторые фармацевтические композиции приспособлены для введения в виде композиции с длительным высвобождением. Некоторые фармацевтические композиции дополнительно содержат по меньшей мере одно другое антитело, которое связывается с другой эпитопом АА.
Настоящее изобретение относится к способам лечения амилоидоза АА-типа у пациента. Эти способы включают введение средства, индуцирующего иммунный ответ на АА70-76, по схеме, эффективной для вызова иммунного ответа, и указанное средство содержит антитела против АА70-76, по схеме, эффективной для вызова иммунного ответа, содержащей антитела против АА70-76. В некоторых способах пациент является человеком. Необязательно, средство содержит остатки 70-76 из пептида АА или субфрагмент по меньшей мере из его 3 смежных остатков, и имеет менее 20 смежных аминокислот из АА. Необязательно, средство является пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, которая
выбрана из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11, и субфрагменты по меньшей мере из 3 смежных остатков указанных последовательностей, и имеет менее 20 аминокислот из пептида АА. Необязательно, средство соединено с первым и вторым гетерологичным полипептидом на N-конце и С-конце. Необязательно, средство соединено на N-конце с гетерологичным полипептидом, и на С-конце по меньшей мере с одной дополнительной копией N-концевого сегмента. В некоторых способах гетерологичный полипептид индуцирует Т-клеточный ответ против гетерологичного полипептида и, таким образом, В-клеточный ответ против АА. В некоторых способах полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную копию АА. Необязательно, полипептид содержит АА от N-конца к С-концу, множество дополнительных копий АА и гетерологичный аминокислотный сегмент.
Согласно некоторым способам лечения полипептид вводят с адъювантом, который усиливает иммунный ответ на N-концевой сегмент. Необязательно, адъювант и полипептид вводят вместе в виде композиции. Необязательно, адъювант вводят перед полипептидом. Необязательно, адъювант вводят после полипептида. В некоторых способах адъювантом являются квасцы. В некоторых способах адъювантом является монфосфорил-липид MPL. В некоторых способах адъювантом является QS-21. В некоторых способах адъювант представляет собой неполный адъювант Фрейнда. В некоторых способах иммунная реакция содержит Т-клетки, которые связываются с АА-пептидом в качестве компонента главных комплексов гистосовместимости МНС I или МНС II.
Настоящее изобретение относится к способам осуществления профилактики амилоидоза АА у пациента. Указанные способы включают введение средства, который вызывает иммунный ответ на АА70-76 по схеме, эффективной для индукции иммунного ответа, и указанное средство содержит антитела против АА70-76 по схеме, эффективной для индукции иммунного ответа, содержащей антитела против АА70-76. Согласно некоторым способам пациент является человеком. По некоторым способам у пациента отсутствует симптоматика. По некоторым способам основным заболеванием пациента является амилоидное заболевание, которое выбрано из группы, состоящей из следующего: ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическая артропатия, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета, болезнь Крона, лепра, туберкулез, брон-хоэктатическая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит, болезнь Уиппла, ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базаль-ноклеточная карцинома, волосатоклеточный лейкоз, семейная средиземноморская лихорадка и болезнь Кастлемана.
Согласно некоторым способам осуществления профилактики средство содержит АА70-76 или субфрагмент по меньшей мере из его 3 смежных остатков и имеет менее 20 смежных аминокислот из пептида АА. Необязательно, средством является пептид, имеющий аминокислотную последовательность из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11, и субфрагментов по меньшей мере из 3 смежных остатков этих последовательностей, и имеет менее 20 аминокислот из пептида АА. Необязательно, средство соединено с первым и вторым гетерологичным полипептидом на N-конце и С-конце.
Необязательно, средство соединено на N-конце с гетерологичным полипептидом, и на С-конце по меньшей мере с одной дополнительной копией N-концевого сегмента. В ряде способов гетерологичный полипептид индуцирует Т-клеточный ответ против гетерологичного полипептида и, таким образом, В-клеточный ответ против АА. В некоторых способах полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную копию АА. Необязательно, полипептид содержит АА от N-конца к С-концу, множество дополнительных копий АА и гетерологичный аминокислотный сегмент.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям. Фармацевтические композиции содержат АА-фрагмент, состоящий из остатков, начиная с остатка 70 из АА и заканчивая остатком 76 из АА. Необязательно, фрагмент АА соединен на С-конце с гетерологичным полипептидом. Необязательно, АА-фрагмент соединен на N-конце с гетерологичным полипептидом. Необязательно, АА-фрагмент соединен на N-конце и С-конце с первым и вторым гетерологичными полипептидами. Необязательно, фрагмент АА связан на N-конце с гетерологичным полипептидом, и на С-конце по меньшей мере с одной дополнительной копией N-концевого сегмента. Необязательно, полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную копию N-концевого сегмента. Необязательно, полипептид содержит АА от N-конца к С-концу, множество дополнительных копий АА и гетеро-логичный аминокислотный сегмент. В некоторых фармацевтических композициях гетерологичный полипептид индуцирует Т-клеточный ответ против гетерологичного полипептида и, таким образом, В-клеточный ответ против N-концевого сегмента.
Некоторые фармацевтические композиции дополнительно содержат адъювант, который усиливает иммунный ответ на АА. В некоторых способах адъювантом являются квасцы. В некоторых способах адъювантом является MPL. В некоторых способах адъювантом является QS-21. В некоторых способах адъювант представляет собой неполный адъювант Фрейнда. Необязательно, адъювант дополнительно содержит гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующий фактор GM-CSF. Необязательно, адъюван-том является макрофаго-колониестимулирующий фактор M-CSF.
Необязательно, композиция содержит более 10 микрограммов полипептида.
Настоящее изобретение относится к способам лечения амилоидоза АА-типа у пациента. Способы содержат введение средства, эффективно индуцирующего иммунную реакцию против пептидного компонента амилоидного депо у пациента, и введение другого средства, который лечит основное заболевание, и таким образом осуществляется лечение амилоидоза АА-типа у пациента. В некоторых способах основное заболевание выбирают из группы, состоящей из следующих патологий: ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическая артропатия, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета, болезнь Крона, лепра, туберкулез, брон-хоэктатическая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит, болезнь Уиппла, ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базаль-ноклеточная карцинома, волосатоклеточный лейкоз, семейная средиземноморская лихорадка и болезнь Кастлемана.
Настоящее изобретение относится к способам осуществления профилактики амилоидоза АА-типа у пациента. Способы содержат введение средства, обладающего действием индуцирования иммунной ре-акциии против пептидного компонента амилоидного депо у пациента, и другого средства, который лечит основное заболевание, и таким образом проводят лечение амилоидоза АА-типа у пациента. В некоторых способах основное заболевание выбирают из группы, состоящей из следующих патологий: ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическая артропатия, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета, болезнь Крона, лепра, туберкулез, бронхоэктатическая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит, болезнь Уиппла, ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточная карцинома, волосатоклеточный лейкоз, семейная средиземноморская лихорадка и болезнь Кастлемана.
Настоящее изобретение относится к способам скрининга антител на активность для лечения пациента, страдающего амилоидозом АА-типа. Указанные способы содержат контакт антитела с АА-пептидом и определение специфическиго связывания антитела с АА, при этом специфическое связывание является показателем активности антитела в лечении амилоидоза АА-типа.
Настоящее изобретение относится к способам скрининга антител на активность удаления биологических единиц, физически связанных с антигеном. Способы содержат объединение связанной с антигеном биологической единицы, антитела и клеток-фагоцитов, имеющих в среде Fc-рецепторы; и контроль количества связанных с антигеном биологических единиц, остающихся в среде, при этом уменьшение количества связанных с антигеном биологических единиц указывает на наличие активности антитела по удалению антигена. В некоторых способах на этапе контроля отслеживается количество антигена, остающегося в среде. В некоторых способах объединение содержит добавление связанной с антигеном биологической единицы к среде, и контакт среды с клетками-фагоцитами, несущими Fc-рецепторы. Согласно некоторым способам связанная с антигеном биологическая единица представляет собой образец ткани. В некоторых способах антигеном является биологическая единица. В некоторых способах образец ткани содержит амилоидное депо. Необязательно, образец ткани забирается у пациента или млекопитающего, страдающего амилоидозом АА-типа. В некоторых способах антигеном является АА. В некоторых способах клетки-фагоциты представляют собой микроглиальные клетки. В некоторых способах образец ткани выбирают из группы, состоящей из образца злокачественной ткани, образца инфицированной вирусом ткани, образца ткани, содержащего воспалительные клетки, образца с доброкачественным аномальным клоточным ростом и образца ткани, содержащего аномальный внеклеточный матрикс.
Изобретение относится к способам обнаружения амилоидного депо у пациента. Указанные способы содержат введение пациенту антитела, которое специфически связывается с эпитопом в АА в пределах от 70 до 76 аминокислот, и детекцию присутствия антитела у пациента. Необязательно, антитело является меченым. Необязательно, антитело имеет парамагнитную метку.
Необязательно, меченое антитело обнаруживают с помощью ядерномагнитного резонанса. Необязательно, меченое антитело обнаруживают получением отображения с помощью SPECT/CT. В некоторых способах антитело не способно вызывать у пациента реакцию элимнации при связывании с амилоидным депо.
Настоящее изобретение относится к диагностическим комплектам. Комплекты содержат антитело, которое специфически связывается с эпитопом с остатками 70-76 из АА. Некоторые комплекты дополнительно содержат маркировку, описывающую применение антитела in vivo у пациента для диагностики или контроля болезни, связанной с амилоидными депо АА-типа. В некоторых вариантах осуществления комплекты содержат инструкции по применению антитела или его антиген-связывающего фрагмента для обнаружения АА.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу диагностики амилоидоза у субъекта, содержащему: (а) введение субъекту антитела или его антиген-связывающего фрагмента, которые связаны с меткой обнаружения, и специфическое связывание указанного антитела или его фрагмента с эпито-пом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 являются любыми аминокислотами; и (b) обнаружение присутствия или отсутствия связанного антитела или его фрагмента, при этом присутствие связанного антитела или его фрагмента указывает на диагноз амилоидоза АА-типа.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики амилоидо-за с применением антитела или его антиген-связывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 являются любыми аминокислотами.
Настоящее изобретение относится к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим X1EDX2, в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 являются любыми аминокислотами. Например, X1 содержит Н, Т, F, S, P, A, L, С, Q, R, Е, K, D, G, V, Y, I или W, например, Н, Т, F, S, Р или А, или, например, Н, Т, F или А. Х2 содержит Т, S, E, R, I,
V, F, D, A, G, M, L, N, Р, С, K, Y, или Q, такие как Т, S, E, R, I, V, F, D или А, или, например, Т, S, E, D
или А. В других примерах X1 представляет собой Н, Т или А, и Х2 представляет собой Т, S, Е или А, например, X1 является Н или А, и Х2 представляет собой Т, S или А. В еще одном примере X1 является Н и Н2 представляет собой Т или А; или X1 представляет собой А, и Х2 является S, Т, Е или V, например, X1 является А и Х2 является S, Т или Е, или X1 представляет собой Т, и Х2 является Е, или X1 является F, и Х2 является D, или X1 является S, и Х2 является Е, F или А; или X1 является Р, и Х2 представляет собой Е, I или F.
В частности, эпитопы включают аминокислотные последовательности, такие как указанные последовательности от SEQ ID NO: 3 до SEQ ID NO: 25, например, SEQ ID NO: 3, 12, 13, 14, 15 и 16.
Дополнительные примеры содержат SEQ ID NO: 4, 5, 7, 8 и 9, например, SEQ ID NO: 4. Антитела по изобретению, которые связываются с эпитопами, например, с SEQ ID NO: 3, включают антитела 2А4,
7D8 и 8G9.
Агрегированные амилоидные белки, с которыми связываются антитела изобретения, представляют собой немономерные белки. Такие агрегированные амилоидные белки включают сывороточный А-амилоидный белок (SAA), белок легкой цепи иммуноглобулина, человеческий островковый амилоидный полипептид-предшественник (IAPP), бета-амилоидный пептид, транстиретин (TTR) и ApoAl, такой как
SAA.
Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые (а) конкурируют с антителами 2А4, 7D8, или 8G9 за связывание с эпитопом, который включает X1EDX2; (b) связываются с тем же эпитопом, который включает X1EDX2, что и антитела 2А4, 7D8, или 8G9; (с) имеют антиген-связывающий домен из антител 2А4, 7D8 или 8G9; или (d) включают шесть участков, определяющих комплементарность (CDR) из антител 2А4, 7D8 или 8G9. Изобретение также относится к химерным или гуманизированным версиям антител 2А4, 7D8 или 8G9.
Типичные антитела, которые специфически связываются с эпитопом, включающим X1EDX2, также включают антитела, имеющие по меньшей мере один, два, или три из участка, определяющих компле-ментарность (CDR) в легкой цепи антител 2А4, 7D8 или 8G9. Антитела по изобретению, которые специфически связываются с эпитопом, включающим X1EDX2, также включают антитела, имеющие по меньшей мере один, два или три участка CDR из тяжелой цепи антител 2А4, 7D8 или 8G9.
Участки CDR можно идентифицировать согласно способам, известным в данной области техники. Например, общепринятыми являются системы нумерации для распознавания участков CDR. Определение по Rabat основано на вариабельности последовательностей, и определение по Chothia основано на местоположении структурных петлевых участков. Определение AbM представляет собой компромисс между подходами по Rabat и Chothia. Участки CDR вариабельной области легкой цепи соединены посредством остатков в положениях 24 и 34 (CDR1-L), 50 и 56 (CDR2-L) и 89 и 97 (CDR3-L) согласно алгоритмам по Rabat, Chothia или AbM. Согласно определению Rabat, участки CDR вариабельной области тяжелой цепи соединены посредством остатков в положениях 31 и 35В (CDR1-H), 50 и 65 (CDR2-H) и 95 и 102 (CDR3-H) (соглашение о нумерации по Rabat). Согласно определению Chothia, участки CDR вариабельной области тяжелой цепи соединены посредством остатков в положениях 26 и 32 (CDR1-K), 52 и 56 (CDR2-H) и 95 и 102 (CDR3-H) (соглашение о нумерации по Chothia). Согласно определению AbM, участки CDR вариабельной области тяжелой цепи соединены посредством остатков в положениях 26 и 35В (CDR1-H), 50 и 58 (CDR2-H) и 95 и 102 (CDR3-H) (соглашение о нумерации по Rabat). См. публикации: Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1:126; и Rees et al. (1996) в издании Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172.
Антитела по изобретению дополнительно включают антитело, которое специфически связывается с эпитопом, содержащим X1EDX2, в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 являются любыми аминокислотами, имеющими вариабельные области, происходящие из вариабельных областей антител 2А4, 7D8 или 8G9. Антитела, имеющие вариабельные области антител 2А4, 7D8 или 8G9, также включены в изобретение.
Антитела по изобретению дополнительно включают химерные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела, тетрамерные антитела, тетравалентные антитела, мультиспецифичные антитела, домен-специфичные антитела, домен-делетированные антитела или слитые белки.
Фрагменты антител по изобретению также относятся к настоящему изобретению. Фрагменты по
изобретению могут быть фрагментами участков связывания антигена Fab, Fab'-фрагментами, F(ab')2-Фрагментами, Fv-фрагментами или ScFv-фрагментами. Такие антитела или их фрагменты могут функционировать в паре с цитостатическим средством, радиотерапевтическим средством или с детектируемой меткой.
Настоящее изобретение также относится к вариабельной области выделенного антитела, содержащей (а) вариабельную область легкой цепи, полученную из вариабельной области легкой цепи антитела 7D8, 2А4 или 8G9, или (b) вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области легкой цепи антитела 7D8, 2А4 или 8G9. Также рассматриваются выделенные вариабельные области, имеющие вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела 7D8, 2А4 или 8G9. Выделенные вариабельные области антитела являются полезными для получения антитела.
Изобретение также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельные области легкой цепи антитела или вариабельные области тяжелой цепи, которые имеют (а) нуклеотид-ную последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела 7D8, 2А4 или 8G9; (b) нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последовательности антитела 7D8, 2А4 или 8G9, которая кодирует вариабельную область легкой или тяжелой цепи; или (с) нуклеотидную последовательность, которая, по существу, идентична, то есть по меньшей мере на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или на 99% идентична нуклеотидной последовательности (а) или (b); или (d) нуклеиновую кислоту, которая специфически гибридизуется с нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности (а) или (b) при строгих условиях гибридизации, например, при условии заключительного промывания 0,1 раствором хлорида и цитрата натрия SSC при 65°С.
Настоящее изобретение дополнительно относится к клеткам и клеточным линиям, экспрессирую-щим антитела или нуклеиновые кислоты по изобретению. Типичные клетки-хозяева включают клетки человека и млекопитающих, такие как клетки яичников китайских хомячков СНО, клетки почечного эмбрионального эпителия НЕК-293, клетки из раковой опухоли HeLa, клетки африканской зеленой мартышки CV-I и клетки COS. Способы получения устойчивой клеточной линии после трансформации гете-рологичной конструкции в клетку-хозяина известны в данной области техники. Примеры клеток-хозяев, не относящиеся к клеткам млекопитающих, включают клетки насекомых (Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3): 103-112). Антитела также можно получать в трансгенных животных (Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6) :625-629) и трансгенных растениях (Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life. Sci.
60 (3) :433-45).
Настоящее изобретение также относится к способам осуществления лечения или профилактики амилоидоза, связанным с применением иммуногеннных фрагментов амилоидного белка, содержащего X1EDX2, в котором X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р, А или любой другой аминокислотный остаток, непосредственно предшествующий ED в таком амилоидном белке; и в котором Х2 представляет собой Т, S, E, R, I, V, F, А или любой другой аминокислотный остаток, следующий сразу после ED в указанном амилоидном белке. Без намерения установить связь с конкретной теорией, считается, что эпитоп, содержащий X1EDX2, может становиться доступным, когда происходит агрегация амилоидных белков, или фибриллогенез, или иным образом создается фибриллярная структура, или при расщеплении более крупного белка-предшественника, или при конформационном изменении. Например, примеры способов лечения или профилактики амилоидоза АА-типа включают введение остатков 70-76 АА или его иммуно-генных фрагментов. Изобретение также относится к способам осуществления лечения или профилактики амилоидоза, связанного с накоплением амилоидного белка, с использованием антител, реагирующих с X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р, А или любой другой аминокислотный остаток, непосредственно предшествующий ED в таком агрегированном амилоидном белке; и в котором Х2 представляет собой Т, S, E, R, I, V, F, А или любой другой аминокислотный остаток, расположенный сразу после ED в указанном агрегированном амилоидном белке. Предпочтительно, такие антитела предпочтительно реагируют с агрегированным амилоидным белком относительно непатологического амилоидного белка. Например, способы лечения или профилактики амилоидоза АА-типа, связанного с АА-фибриллами, могут включать введение антител, специфичных к С-концевому участку АА-фибрилл (примерно остатки 70-76 из АА). Антитела могут ингибировать образование АА-агрегатов (например, фибрилл) или вызывать их дезагрегацию и удаление, что таким образом является лечением или профилактикой амилоидоза АА-типа.
I. Определения.
Термин "по существу идентичны" означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием значений веса промежутков по умолчанию, имеют последовательности, идентичность которых составляет по меньшей мере 65%, предпочтительно идентичные последовательности по меньшей мере на 80 или 90%, более предпочтительны идентичные последовательности по меньшей мере на 95% или больше (например, идентичность последовательностей составляет 99% или выше). Предпочтительно, положения неидентичных остатков отличаются консервативными заменами аминокислот.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как контрольная
последовательность, с которой сравнивают тестовые последовательности. Используя алгоритм сравнения последовательностей, тестовые и контрольные последовательности вводят в компьютер, в случае необходимости задают координаты субпоследовательности и определяют параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Затем по алгоритму сравнения последовательности на основе заданных параметров программы вычисляют процент идентичности последовательностей для тестовой последовательности (последовательностей) относительно контрольной последовательности.
Можно проводить оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Smith & Waterman, Adv.Appl.Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологии по Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью поиска по методике сходства по Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci.USA 85:2444 (1988), с помощью компьютерных программ выполнения указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison), или путем визуального наблюдения (см. в общем публикации Ausubel et al., выше). Одним из примеров алгоритмов, подходящим для определения процента идентичности последовательностей и процента сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан авторами Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализа BLAST является общедоступным в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Как правило, можно использовать параметры программы по умолчанию для проведения сравнения последовательностей, вместе с тем, можно также использовать задаваемые параметры. Программа BLASTP для аминокислотных последовательностей использует по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10, и матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89, 10915 (1989)).
Для классификации аминокислотных замен на консервативные или неконсервативные аминокислоты разделены на группы следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, метио-нин, аланин, валин, лейцин, изолейцин; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): цистеин, серии, треонин; группа III (кислые боковые цепи): аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; группа IV (основные боковые цепи): аспарагин, глутамин, гистидин, лизин, аргинин; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): глицин, пролин; и группа VI (ароматические боковые цепи): триптофан, тирозин, фенилаланин. Консервативные замены охватывают замены между аминокислотами одной группы. Неконсервативные замены представляют собой обмен члена одной из указанных групп на член из другой группы.
Понятие "полностью-D" относится к пептидам, в которых > 75, > 80, > 85, > 90, > 95 и 100% аминокислот имеют D-конфигурацию.
Термин "средство" используется для описания соединения, которое обладает или может обладать фармакологическим действием. Средства включают соединения, которые являются известными лекарствами, соединениями с идентифицированным фармакологическим действием, но для которых проводится дополнительная терапевтическая оценка, и соединения, которые перечислены в коллекциях и библиотеках, для которых необходим скрининг на фармакологическое действие.
Термины "амилоидное заболевание" или "амилоидоз" относятся к любому ряду заболеваний, при которых накопление или образование амилоидных бляшек являются их симптомом или частью патологического процесса. "Амилоидная бляшка" представляет собой внеклеточное депо, состоящее в основном из белковых фибрилл. В общем, фибриллы состоят из доминантного белка или пептида; вместе с тем, бляшка может также включать дополнительные компоненты, которые являются пептидными или непептидными молекулами, как описано в настоящем изобретении.
" Амилоидный белок" или "амилоидный пептид" является белком или пептидом, который может подвергаться расщеплению, конформационному изменению, агрегации или фибриллогенезу, что приводит к образованию патологических олигомеров, амилоидных фибрилл, амилоидных бляшек и/или амилоидных компонентов.
" Амилоидный компонент" представляет собой любую молекулярную единицу, которая присутствует в амилоидной бляшке, включая антигенные части таких молекул. Амилоидные компоненты включают без ограничения белки, пептиды, протеогликаны и углеводы.
" Антиамилоидное средство" является средством, способным индуцировать иммунный ответ на амилоидный компонент бляшки у субъекта подтипа позвоночных, при введении способами активной или пассивной иммунизации.
Термины "АА-белок" или "АА-пептид" относятся к форме амилоидного белка или пептида А, образованного путем протеолитического расщепления сывороточного А-амилоидного белка (SAA), и мономерного и агрегированного, и растворимого и нерастворимого.
Понятия "агрегированный амилоидный белок" или "агрегированный амилоидный пептид" или " амилоидный агрегат " относятся к патологической, немономерной, агрегированной форме амилоидного белка или амилоидного пептида. Агрегированные амилоидные белки и амилоидные пептиды могут быть растворимыми или нерастворимыми. Некоторые агрегированные амилоидные белки и агрегированные амилоидные пептиды могут образовывать олигомеры, фибриллы и/или амилоидные бляшки. В настоя
щем изобретнии рассматриваются примеры таких агрегированных амилоидных белков и амилоидных пептидов, включающих фибриллярные пептиды и белки.
Термин "АА-агрегат " относится к агрегированной форме АА.
Терапевтические средства изобретения обычно, по существу, не содержат нежелательных примесей. Это означает, что средство обычно имеет чистоту по меньшей мере около 50% в/в (вес./вес.), а также, по существу, не содержит вредные белки и загрязнители. Иногда средства имеют чистоту по меньшей мере около 80% в/в, более предпочтительно чистота по меньшей мере составляет около 90% или 95% в/в. Вместе с тем, используя общепринятые способы очистки белка, можно получать гомогенные пептиды с чистотой по меньшей мере 99% в/в. Терапевтические средства изобретения могут предотвращать или лечить болезнь, связанную с амилоидными депо, или обладать профилактическим действием.
Специфичное связывание между единицами означает, что единицы имеют взаимную аффинность друг к другу, которая по меньшей мере в 10, в 100 или в 100 раз больше, чем аффинность контрольной единицы, например, постороннего антигена или антитела к другому антигену. Взаимная аффинность указанных двух единиц составляет друг для друга обычно по меньшей мере 107 М-1, 108 М-1, 109 М-1 или 1010 М-1. Предпочтительными являются показатели аффинности более 108 М-1.
Термины "иммуноглобулин" или "антитело" (используемые в настоящем изобретении взаимозаменяемо) относятся к антиген-связывающему белку, который обладает способностью специфически связываться с антигеном, имеющему основную структуру в виде цепи с четырьмя полипептидами, состоящую из двух тяжелых и двух легких цепей, и указанные цепи стабилизированы, например, межцепочечными дисульфидными связями. И тяжелые и легкие цепи свернуты в домены. Термин "домен" относится к глобулярному участку тяжелой или легкой цепи полипептида, содержащему пептидные петли (например, содержащему 3-4 пептидные петли), устойчивость которому придается, например, посредством Р-складчатой листовой структуры и/или межцепочечной дисульфидной связи. Дополнительно в изобретении упоминаются "постоянные" или "вариабельные" домены, в зависимости от относительной недостаточности вариантов последовательностей в пределах доменов у членов разных групп в случае "постоянного" домена, или значительного количества вариантов в пределах доменов у членов разных групп в случае "вариабельного" домена". В изобретении взаимозаменяемо упоминаются "постоянные" области легкой цепи, "постоянные домены легкой цепи", "постоянные области легкой цепи", "CL" области или "CL" домены". "Постоянные" домены тяжелой цепи взаимозаменяемо упоминаются в изобретении как "постоянные области тяжелой цепи", "постоянные домены тяжелой цепи", "СН" области или "СН" домены". "Вариабельные" домены легкой цепи взаимозаменяемо упоминаются как "вариабельные области легкой цепи", "вариабельные домены легкой цепи", "VL" области или "VL" домены". "Вариабельные" области тяжелой цепи взаимозаменяемо упоминаются как "вариабельные области тяжелой цепи", "вариабельные домены тяжелой цепи", "VH" области или "VH" области.
Термин "область" относится к части или участку цепи антитела и включает постоянные или вариабельные домены, определение которых приведено выше, а также более дискретные части или участки указанных доменов. Например, вариабельные области или домены легкой цепи включают "участки, определяющие комплементарность" или "CDR", вставленные между "каркасными областями" или "FR", упоминаемые в изобретении.
Иммуноглобулины или антитела могут существовать в мономерной или полимерной форме. Термин "антиген-связывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, связывающего антиген, или конкурирующего с интактным антителом (то есть, с интактным антителом, из которого они были получены) для связывания антигена (то есть, специфическиго связывания). Термин "конформация" относится к третичной структуре белка или полипептида (например, к антителу, цепи антитела, его домену или области). Например, понятие "конформация легкой (или тяжелой) цепи" относится к третичной структуре вариабельной области легкой (или тяжелой) цепи, и фраза "кон-формация антитела" или "конформация фрагмента антитела" относится к третичной структуре антитела или его фрагмента.
" Специфичное связывание" антитела означает, что антитело проявляет заметную аффинность к антигену или к предпочтительной антигенной детерминанте и, предпочтительно, не показывает значительной кросс-реактивности. "Заметное" или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 106, 107, 108, 109 М-1 или 1010 М-1. Предпочтительными являются показатели аффинности более 107 М-1, более предпочтительными более 108 М-1. Промежуточные значения указанных здесь показателей также считаются входящими в объем по настоящему изобретению, и предпочтительную связывающую аффинность можно обозначить в диапазоне показателей, например, от 106 до 1010 М-1, предпочтительно от 107 до 1010 М-1, более предпочтительно от 108 до 1010 М-1. Антитело, которое "не проявляет значительной кросс-реактивности", представляет собой антитело, которое не будет в заметной степени связываться с нежелательной единицей (например, с нежелательной белковой единицей). Например, антитело, которое специфически связывается с АА, будет в заметной степени связываться с АА, но не будет в значительной степени реагировать с белками или пептидами не АА-типа (например, с белками или пептидами не АА-типа, включенными в бляшки). Антитело, специфическое для предпочтительной антигенной детерминанты, не будет, например, в значительной степени перекрестно реагировать
с посторонними эпитопами в том же белке или пептиде. Специфичное связывание можно определять согласно любым принятым в данной области техники способам для определения такого связывания. Предпочтительно, специфическое связывание определяют с помощью анализа Scatchard и/или анализов конкурентного связывания.
Антигенсвязывающие фрагменты антитела производят способами рекомбинантных ДНК, или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, единственные цепи и одноцепочечные антитела. Дополнительные фрагменты антитела и варианты эффекторных функций рассмотрены в изобретении в разделе под названием "Антитела". В отличие от "биспецифичных" или "бифункциональных" иммуноглобулинов или антител, считается, что каждый иммуноглобулин или антитело имеет свой идентичный участок связывания. "Биспецифические" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разных пары тяжелых/легких цепей и два разных участка связывания. Биспе-цифичные антитела можно получать множеством способов, включающих слияние гибридом или связывание Fab' фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al. , J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Термины "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относятся к иммуноглобулину или антителу, которое включает по меньшей мере одну цепь гуманизированного иммуноглобулина или антитела (то есть, по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термины "цепь гуманизированного иммуноглобулина" или "цепь гуманизированного антитела" (то есть, "легкая цепь гуманизированного иммуноглобулина" или "тяжелая цепь гуманизированного иммуноглобулина") относятся к цепи иммуноглобулина или антитела (то есть, к легкой или тяжелой цепи, соответственно), имеющей вариабельную область, которая включает вариабельную каркасную область по существу из человеческого иммуноглобулина или антитела, и участки, определяющие комплементар-ность (CDR) (например, по меньшей мере один CDR, предпочтительно два CDR, более предпочтительно три CDR), от иммуноглобулина или антитела по существу нечеловеческого происхождения, и дополнительно включает постоянные области (например, по меньшей мере одну постоянную область или ее часть, в случае легкой цепи, и предпочтительно три постоянные области в случае тяжелой цепи). Термины "гуманизированная вариабельная область" (например, "гуманизированная вариабельная область легкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи") относятся к вариабельной области, которая включает вариабельную каркасную область по существу из человеческого иммуноглобулина или антитела, и участки, определяющие комплементарность (CDR) из иммуноглобулина или антитела по существу нечеловеческого происхождения.
Выражение "по существу из человеческого иммуноглобулина или антитела" или "по существу человеческий" означает, что выравнивание аминокислотной последовательности с человеческим иммуноглобулином или антителом в целях сравнения показывает идентичность областей по меньшей мере 8090%, предпочтительно 90-95%, более предпочтительно 95-99% (то есть, локальная идентичность последовательности) по отношению к человеческой последовательности каркасной или постоянной области, что позволяет осуществлять, например, консервативные замены, замены консенсусных последовательностей, замены зародышевых линий, обратные мутации и тому подобное. Вставка консервативных замен, замен консенсусных последовательностей, замен зародышевых линий, обратных мутаций и т.п. часто упоминается "как оптимизация" гуманизированного антитела или цепи. Выражение "по существу из иммуноглобулина или антитела нечеловеческого происхождения" или "по существу нечеловеческий" означает, что последовательность иммуноглобулина или антитела является идентичной по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно 90-95%, более предпочтительно, на 96, 97, 98 или 99% последовательности нечеловеческого организма, например млекопитающего нечеловеческого происхождения.
Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела, или цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, кроме, возможно, участков CDR, по существу идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более нативных последовательностей человеческого иммуноглобулина. Термин "соответствующая область" или "соответствующий остаток" относится к области или остатку во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая занимает такое же (то есть, эквивалентное) положение, как и область или остаток в первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, если первые и вторые последовательности оптимально выравнены в целях сравнения.
В понятия "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" не входят химерные иммуноглобулины или антитела, как указано ниже. Гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей конструкции (то есть, они содержат области белков более чем от одного вида), они включают дополнительные признаки (то есть, вариабельные области, содержащие остатки донорской CDR и остатки акцепторного каркаса), но вместе с тем, они не относятся к химерным иммуноглобулинам или антителам, указанным в изобретении.
Термины "химерный" иммуноглобулин или "химерное" антитело относятся к иммуноглобулину или антителу, вариабельные области которых происходят от первого вида, и постоянные области которых происходят от второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, напри
мер, с помощью генной инженерии, из генных сегментов иммуноглобулина, принадлежащего разным видам.
" Антиген" представляет собой единицу (например, белковоподобную единицу или пептид), с которым антитело специфически связывается.
Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту в антигене, с которым специфически связываются иммуноглобулин или антитело (или его антиген-связывающий фрагмент). Эпито-пы могут быть образованы как из смежных аминокислот, так и из несмежных аминокислот, прилежащих друг к другу в третичной структуре белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные третичным свертыванием, обычно исчезают при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации антигенных детерминант включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерный магнитный резонанс. См., например, в издании Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.
E. Morris, Ed. (1996).
Типичные антитела по изобретению включают антитело или его фрагмент, который специфически связывается с эпитопом, включающим X1EDX2, в агрегированном амилоидном белке, который связывается с эпитопом, включающим X1EDX2, который также связывается, например, с антителами 2А4, 7D8 или 8G9. Антитела, которые распознают аналогичный эпитоп, можно идентифицировать с помощью простого иммуноанализа, демонстрирующего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, то есть, анализом конкурентного связывания. Определение конкурентного связывания проводят с помощью анализа, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном, таким как р. Известны многие типы анализов конкурентного связывания, например: прямой или непрямой твердофазный радиоиммуноана-лиз (РИА), прямой или непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), конкурентный сен-двич-анализ (см. публикации Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); прямой твердофазный ИФА с биотином-авидином (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); прямой твердофазный анализ с меткой, прямой твердофазный сендвич-анализ с меткой (см. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); прямой твердофазный РИА с использованием метки 125I (см. Morel et al. , Mol. Immunol. 25 (1):7 (1988)); прямой твердофазный ИФА с биотином-авидином (Cheung et al. , Virology 176:546 (1990)); и прямой РИА с мечением (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Обычно такие анализы охватывают использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клетки, несущей очищенный антиген, немеченого тестового иммуноглобулина и меченого стандартизированного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества меток, связанных с твердой поверхностью или клеткой в присутствии тестового иммуноглобулина. Обычно тестовый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, когда конкурентное антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или больше.
Эпитоп также распознается иммуными клетками, например, В-клетками и/или Т-клетками. Клеточное распознавание эпитопа можно выявлять в анализах in vitro, измеряющих антиген-зависимую пролиферацию, которую обнаруживают по включению Н-тимидина, по секреции цитокина, секреции антитела, или по антиген-зависимому киллингу (анализ цитотоксических Т-лимфоцитов).
Термин " неоэпитоп" относится к новому и/или уникальному сайту на антигене, на который отвечают В и/или клетки Т.
Термин " неоэпитопные антитела" относится к антителам, которые специфически распознают новую N-концевую или С-концевую аминокислотную последовательность, появивишуюся путем протеолитиче-ского расщепления молекулы, но не связываются с таким эпитопом на нативной (нерасщепленной) молекуле. Термин "неоэпитопные антитела" может относиться к антителам, которые специфически распознают новую N-концевую или С-концевую аминокислотную последовательность, полученную протеоли-тическим расщеплением SAA, но не связываются с таким эпитопом на нативной (нерасщепленной) молекуле SAA. Некоторые неоэпитопные антитела связываются как с растворимым, так и с нерастворимым АА, и вызывают диссоциацию агрегатов АА, включающих АА-фибриллы. "Неоэпитопное антитело" может также представлять собой антитело, которое специфически распознает новый эпитоп, который способен связываться с антителом только после того, как произойдет конформационное изменение белка, например, как в случае AL-амилоидоза, и легкую цепь, когда экспрессируется только легкая цепь и образует амилоид.
Термин "иммунологический ответ" или "иммунный ответ" означает развитие полезной гуморальной (опосредованной антителом) и/или клеточной (опосредованной антиген-специфичными Т-клетками или продуктами их секреции) реакции, направленной против амилоидного пептида у больного реципиента. Такой ответ может быть активным ответом, вызванным введением иммуногена, или пассивным ответом, вызванным введением антитела или примированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ вызывается представлением полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами МНС I класса или II класса для
активации антиген-специфических хелперных Т-клеток CD4+ и/или цитостатических Т-клеток CD8+. В такой ответ также может вовлекаться активация моноцитов, макрофагов, клеток НК (натуральных киллеров), базофилов, дендритных клеток, астроцитов, микроглиальных клеток, ацидофильных гранулоци-тов или других компонентов врожденного иммунитета. Присутствие клеточно-опосредованного иммунного ответа можно определить анализом пролиферации (Т-клетки CD4+) или ЦТЛ (цитотоксических Т-лимфоцитов) (см., Burke, выше; Tigges, выше). Можно раздельно оценивать относительный вклад гуморального и клеточного ответа на защитный или терапевтический эффект иммуногена путем отдельного выделения антител и Т-клеток от иммунизированного сингенного животного и измерения защитного или терапевтического действия у второго субъекта.
"Иммуногенное средство" или "иммуноген" способен индуцировать иммунологический ответ на самого себя при введении его млекопитающему, необязательно в сочетании с адъювантом.
Термин "голый полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, не образующему комплекс с коллоидными материалами. Голые полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор.
Термин " адъювант" относится к соединению, которое при введении в сочетании с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но при введении его единственным не вызывает иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ посредством ряда механизмов, включающих рек-рутинг лимфоцитов, активацию В- и/или Т-клеток и активацию макрофагов.
Термины "эффективная доза" или "эффективная дозировка" определяют количество, достаточное для достижения, или по меньшей мере, частичного достижения желательного эффекта. Термин "терапевтически эффективная доза" определяют, как количество, достаточное для излечения, или по меньшей мере частичного устранения болезни и ее осложнений у пациента, уже страдающего указанной болезнью. Количество, эффективное для этого применения, будет зависеть от тяжести инфекции и общего состояния собственной иммунной системы пациента.
Термин "пациент" включает субъекты человеческого происхождения и других млекопитающих, которые получают или профилактическое или терапевтическое лечение.
Настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с эпитопом, включающим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, и которые конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим X1EDX2, например, с антителами 2А4, 7D8 или 8G9.
Конкурирование между антителами определяют анализом, в котором тестовый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном, например, АА.
Известны многие типы анализов конкурентного связывания, например: прямой или непрямой твердофазный радиоиммуноанализ (РИА), прямой или непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), конкурентный сендвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); прямой твердофазный ИФА с биотином-авидином (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); прямой твердофазный анализ с меткой, прямой твердофазный сендвич-анализ с меткой (см. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); прямой твердофазный РИА с использованием метки 125I (см. Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1):7-15 (1988)); прямой твердофазный ИФА с биотином-авидином (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); и прямой РИА с мечением (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Обычно такие анализы подразумевают использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клеткой, несущей очищенный антиген, немеченого тестового иммуноглобулина и меченого стандартизированного иммуноглобулина. Конкурентное инги-бирование измеряют путем определения количества меток, связанных с твердой поверхностью или клеткой в присутствии тестового иммуноглобулина. Обычно тестовый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные в конкурентном анализе (конкурирующие антитела), включают антитела, связанные с одним и тем же эпитопом, что и референс-ссылки, и антитела, связанные со смежным эпитопом, расположенным в достаточной близости к эпитопу с присоединенным референс-антителом, чтобы возникло стерическое несоответствие. Обычно конкурентное антитело, находясь в избытке, будет ингибировать специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-75%.
Антитело, которое специфически связывается с амилоидным белком, представляет собой антитело, которое связывается с амилоидным белком с аффинностью по меньшей мере 107 М-1. Некоторые антитела связываются с амилоидным белком с показателями аффинности от 108 М-1 до 1011 М-1.
Антитело, которое специфически связывается с агрегированным амилоидным белком, таким как АА-агрегат, без специфическиго связывания с мономерным амилоидным белком, представляет собой антитело, которое связывается с агрегированным амилоидным белком, таким как, например, фибриллы (например, АА в агрегированной Р-складчатой листовой форме, например, от трупа больного амилоидо-зом АА или от трансгенной модели животных), как описано выше, и его специфичная связывающая аффинность к мономерным формам амилоидного белка ниже по меньшей мере в десять раз и обычно по меньшей мере в 100 раз. Например, такое антитело могло бы связываться с растворимым АА с аффинностью 109 М-1 и с бляшками с аффинностью менее 107 М-1. Аффинность таких антител для бляшек составляет обычно менее 107 М-1 или 106 М-1. Такие антитела дополнительно или альтернативно определяют по
интенсивности флюоресценции по сравнению с посторонним контрольным антителом, (например, с антителом или смесью поликлональных антител к АА-пептиду с обратной последовательностью), при контакте антител с фибриллами, и оценивают связывание по флуоресцентным меткам. Интенсивность флюоресценции антител, связанных с растворимым пептидом АА, которые не связываются с бляшками, находится в пределах фактора пять, иногда в пределах фактора два, и иногда неразличима в границах экспериментальной ошибки интенсивности флуоресценции контрольного антитела.
Композиции или способы, "содержащие" один или несколько упомянутых элементов, могут включать другие элементы, конкретно не упомянутые. Например, композиция, которая содержит АА-пептид, охватывает и выделенный АА-пептид, и АА-пептид в качестве компонента полипептидной последовательности большей длины.
II. Амилоидные заболевания.
1. Краткий обзор и патогенез.
Амилоидные заболевания, или амилоидозы, включают ряд патологических состояний, проявляющихся широким разнообразием объективных симптомов. Общим для этих заболеваний является присутствие аномальных внеклеточных депо фибриллярного белка, называемых "амилоидными депо" или "амилоидными бляшками", диаметр которых обычно составляет 10-100 мкм, с их локализацией в определенных органах или участках тканей. Такие бляшки состоят в основном из растворимого белка или пептида природного происхождения. Эти нерастворимые депо состоят из в общем латеральных агрегатов из фибрилл диаметром около 10-15 нм. Амилоидные фибриллы производят характерное светло-зелёное двупреломление в поляризованном свете при окрашивании красителем Конго красным. Указанные заболевания классифицируют в зависимости от основных фибриллярных компонентов, образующих бляшеч-ные депо, как расмотрено ниже.
Пептиды или белки, образующие бляшечные депо, часто происходят из более крупного белка-предшественника. Более конкретно, в патогенез амилоидных фибриллярных депо обычно вовлечено про-теолитическое расщепление на фрагменты "аномального" белка-предшественника. Эти фрагменты обычно собраны в антипараллельные Р-складчатые листы; вместе с тем, известны некоторые нерасщепленные формы белка-предшественника, способные к агрегации и образованию фибрилл при семейной амилоидной полинейропатии (вариант транстиретинновых фибрилл), и амилоидозе, связанном с диализом (Р2-микроглобулиновые фибриллы) (Tan, et al., 1994, см. выше).
2. Клинические синдромы.
В этом разделе приведено описание основных типов амилоидозов, в которое включено характерное строение их фибриллярных бляшек. Общим открытием по настоящему изобретению является возможность лечения амилоидных заболеваний путем введения средств, действие которых направлено на активацию иммунного ответа против компонента или разных компонентов амилоидных депо, конкретных для каждого заболевания. Как рассмотрено более подробно ниже в разделе С, такие компоненты предпочтительно представляют собой элементы фибрилл, которые образуют бляшки. В разделах ниже приведены примеры основных форм амилоидоза, которые не предназначены ограничивать объем по настоящему изобретению.
a. Амилоидозы AL-типа.
Амилоидные депо AL-типа обычно связаны практически с любой дискразией В-лимфоцитарной линии, варьируя от злокачественного развития плазматических клеток (множественная миелома) до доброкачественной моноклональной гаммапатии. Иногда присутствие амилоидных депо может быть первичным индикатором основной дискразии.
Фибриллы в амилоидных депо AL-типа состоят из легких цепей моноклонального иммуноглобулина или их фрагментов. Более конкретно, фрагменты происходят из N-концевой области легкой цепи (каппа или лямбда) и содержат полностью вариабельный домен (VL) или его часть. Депо обычно возникают в мезенхимальных тканях, вызывая периферическую и автономную нейропатию, синдром запястного канала, макроглоссию, рестриктивную кардиомиопатию, артропатию крупных суставов, имунные дискразии, миеломы, а также оккультные дискразии. Вместе с тем, необходимо отметить, что может быть вовлечена практически любая ткань, в особенности висцеральные органы, например, сердце.
b. Наследственные системные амилоидозы
Существует множество форм наследственных системных амилоидозов. Хотя они представляют собой относительно редкие состояния, появление симптомов во взрослом возрасте и характер наследования (обычно аутосомно-доминантный) приводит к персистентному существованию таких заболеваний в популяции. В общем, указанные синдромы обусловлены точечными мутациями в белке-предшественнике, что приводит к продукции амилоидогенных пептидов или белков. Табл. 2 приводит обобщенные данные фибриллярного строения при разных формах указанных заболеваний в качестве примеров.
а Данные получены из пуоликации Tan & Pepys, 1994, см. выше.
Данные, предоставленные в табл. 2, приведены в качестве примеров и не предназначены ограничивать объем по настоящему изобретению. Например, были описаны больше 40 отдельных точечных мутаций в гене транстиретина, все из которых дают начало клинически сходным формам семейной амилоид-нойполинейропатии.
Транстиретин (TTR) является белком размером 14 кДа, который также иногда называют преальбу-мином. Он вырабатывается в печени и хориодном сплетении и участвует в транспорте гормонов щитовидной железы и витамина А. По меньшей мере 50 разных форм белка, отличающиеся единственной заменой аминокислоты, отвечают за разные формы семейной амилоидной полинейропатии. Например, замена пролина на лейцин в положении 55 приводит к особенно прогрессирующей форме нейропатии; замена метионина на лейцин в положении 111 приводит к тяжелому поражению сердца у пациентов из Дании. Амилоидные депо, выделенные из сердечной ткани больных системным амилоидозом, показали, что депо состоят из гетерогенной смеси TTR и их фрагментов, вместе называемых ATTR, для которых были описаны полные параметры длины последовательностей. Из таких бляшек можно извлекать фибриллярные компоненты ATTR, и определять их структуру и последовательности согласно известным в данной области техники способам (например, Gustavsson, A., et al, Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995; Kametani, F., et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622-628, 1984; Pras, M., et al., PNAS 80: 539-42, 1983).
У людей, несущих точечные мутации в молекуле аполипопротеина А1 (например, Gly-Arg26; Trp-Arg50; Leu-Arg60), выявляют форму амилоидоза ("тип Ostertag"), которая отличается наличием депо аполипопротеинового белка А1 или его фрагментов (AApoA1). У таких больных обнаруживают низкие уровни липопротеинов высокой плотности (ЛВП) и периферическую нейропатию или почечную недостаточность.
Другая форма ненейропатического наследственного амилоида Ostertag-типа, наблюдаемая в английских семьях, обусловлена мутацией в альфа-цепи фермента лизозима (например, Ile- Thr56 или Asp- His57). В этом случае происходит накопление фибрилл мутантного белка лизозима (Alys), обычно проявляющееся у больных нарушением функции почек. Указанный белок в отличие от большинства фибрилл-образующих белков, описанных в настоящем изобретении, обычно присутствует в своей полной (нефрагментированной) форме (Benson, M.D., et al. CIBA Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996).
Р-амилоидный пептид (АР) представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, полученный путем протеолиза из более крупного белка, называемого бета-амилоидным белком-предшественником (РАРР). Мутации в РАРР приводят к семейным формам болезни Альцгеймера, синдрома Дауна и/или сенильного слабоумия, для которых характерны церебральные депо бляшек, состоящих из АР-фибрилл и других компонентов, которые более подробно описаны ниже. Известные мутации в АРР, связанные с болезнью Альцгеймера, возникают проксимальнее к сайтам расщепления Р-или у-секретазы, или в Ар. Например, положение 717 является ближайшим к сайту расщепления у-секретазы в АРР при его процессирования до АР, и положения 670/671 являются ближайшими к сайту расщепления Р-секретазы. Мутации в любом из этих остатков могут привести к болезни Альцгеймера, по-видимому, посредством увеличения количества 42/43 аминокислот АР-формы, созданного из АРР. Структура и последовательность АР-пептидов разной длины известна в данной области техники. Такие пептиды можно изготавливать согласно способам, известным в данной области техники (например, Glenner and Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 129: 885890, 1984; Glenner and Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984). Дополнительно, коммерчески доступны разные формы пептидов.
Синуклеин представляет собой связанный с синапсом белок, который напоминает алипопротеин и содержит обилие нейрональной цитозоли и пресинаптических терминалов. Пептидный фрагмент, полученный из сс-синуклеина, называемого NAC, также является компонентом амилоидных бляшек болезни Альцгеймера. (Clayton et al., 1998). Этот компонент также представляет собой цель иммунологического лечения согласно настоящему изобретению, как подробно описано ниже.
Гельсолин является кальцийсвязывающим белком, который связывается с фрагментами актиновых филаментов. Мутации белка в положении 187 (например, Asp- Ash; Asp- Tyr) приводят к возникновению формы наследственного системного амилоидоза, обычно выявляемого у пациентов в Финляндии, а также у людей в Голландии или Японии. У людей с указанным повреждением фибриллы, образованные из фрагментов гельсолина (Agel), обычно состоят из аминокислот 173-243 (карбоксиконцевой фрагмент размером 68 кДа) и накапливаются в кровеносных сосудах и базальных мембранах, что приводит к дистрофии роговицы и краниальной нейропатии, которая прогрессирует до периферической нейропатии, дистрофических изменений кожи и других органов, где происходит накопление. (Kangas, H., et al. Human Mol. Genet. 5 (9) : 1237-1243, 1996).
Другие подвергшиеся мутации белки, такие как мутантная альфа-цепь фибриногена (AfibA) и му-тантный цистатин С (Acys), также образуют фибриллы и вызывают характерные наследственные патологии. Фибриллы AfibA образуют депо, характерные для ненейропатического наследственного амилоида с почечной патологией; депо Acys характерны при наследственной церебральной амилоидной ангиопатии, выявляемой в Исландии. (Isselbacher, et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, et al., см. выше). По меньшей мере в некоторых случаях у больных церебральной
амилоидной ангиопатией (ЦАА) выявляли амилоидные фибриллы, содержащую немутантную форму цистатина С в соединении с бета-белком. (Nagai, A., et al. Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63-78, 1998).
В настоящее время некоторые формы прионной болезни считаются наследственными, при этом ранее предполагалось, что до 15% случаев имеют инфекционное происхождение ((Baldwin, et al., in Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). При указанных прионных патологиях у больных разрастаются бляшки, состоящие из аномальных изоформ нормального прионного белка (PrPC). Преобладающая мутантная изоформа PrPSc, также называемая AScr, отличается от нормального клеточного белка своей устойчивостью к расщеплению протеазой, нерастворимостью при экстракции детергентами, накоплением во вторичных лизосомах, посттрансляционным синтезом и высоким содержанием Р-складчатых листов. Были установлены генетические связи по меньшей мере для пяти мутаций, приводящих к болезни Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), синдрома Герст-мана-Штраусслера-Шейнкера (ГТТТТТТ) и фатальной семейной бессоннице (ФСБ) (Baldwin). Способы экстракции фибриллярных пептидов из скрапи-фибрилл, определения последовательностей и изготовления таких пептидов известны в данной области техники (например, публикации Beekes M., et al. J. Gen. Virol.
76: 2567-76, 1995).
Например, одна из форм ГШШ связана с мутацией PrP в кодоне 102, тогда как теленцефалическая форма ГШШ отличается мутацией в кодоне 117. Мутации в кодонах 198 и 217 вызывают форму ГШШ, при которой нейритные бляшки при болезни Альцгеймера имеют характерное содержание PrP вместо АР-пептида. Некоторые формы семейной БКЯ были связаны с мутациями в кодонах 200 и 210; мутации в кодонах 129 и 178 были обнаружены и при семейной форме БКЯ и при семейной форме ФСБ. (Baldwin, см. выше).
c. Сенильный системный амилоидоз.
Амилоидные депо, как системные, так и фокальные, увеличиваются с возрастом. Например, фибриллы дикого типа транстиретина (TTR) обычно обнаруживают в сердечной ткани пожилых людей. Указанные депо могут быть бессимптомными, клинически молчащими, или могут приводить к остановке сердца. Бессимптомные фибриллярные фокальные депо могут также возникать в мозге (АР), в амилоидных тельцах (corpora amylacea) простаты (микроглобулин АР2), суставах и семенных пузырьках.
d. Церебральный амилоидоз.
Локальные амилоидные депо часто встречаются в мозге, особенно у пожилых людей. Наиболее частый тип амилоида в мозге состоит в основном из фибриллярного пептида АР и приводит к слабоумию или спорадической (ненаследственной) болезни Альцгеймера. Фактически, частота встречаемости спорадической болезни Альцгеймера значительно превышает частоту форм, являющихся наследственными. Фибриллярные пептиды, образующие эти бляшки, очень сходны с описанными выше, в отношении наследственных форм болезни Альцгеймера (БА).
e. Амилоидоз, связанный с диализом.
Бляшки, состоящие из Р2-микроглобулиновых фибрилл (АР2М), обычно развиваются у больных, которым проводят продолжительный гемодиализ или перитонеальный диализ. Р2-микроглобулин представляет собой полипептид в 11,8 кДа, который является легкой цепью антигенов МНС I класса, присутствующие на всех клетках, содержащих ядра. При нормальных обстоятельствах он постоянно сбрасывается с клеточной мембраны и обычно фильтруется почками. Нарушение удаления Р2-микроглобулина, например, в случае ослабления функции почек, приводит к его накоплению в почке и других участках (прежде всего в богатых коллагеном тканях суставов). В отличие от других фибриллярных белков, молекулы АР2М обычно находятся в фибриллах в нефрагментированной форме. (Benson, см. выше).
f. Амилоидозы гормонального происхождения.
В эндокринных органах могут накапливаться амилоидные депо, особенно у пожилых людей. Гор-мон-секретирующие опухоли также могут нести амилоидные бляшки гормонального происхождения, фибриллы которых состоят из полипептидных гормонов, таких как кальцитонин (медуллярная карцинома щитовидной железы), островковый амилоидный полипептид (амилин; встречающийся у большинства больных диабетом II типа), и атриальный натрийуретический пептид (изолированный амилоидоз предсердий). Последовательности и структура указанных белков известны в данной области техники.
g. Разные амилоидозы.
Существует множество других форм амилоидного заболевания, которые обычно проявляются в виде локализованных депо амилоида. Предполагают, что эти болезни обычно являются результатом локальной продукции и/или недостаточного катаболизма определенных предшественников фибрилл, или предрасположенности конкретной ткани (такой, как сустав) к образованию фибриллярного депо. Примеры таких идиопатических депо включают нодулярный амилоид AL-типа, кожный амилоид, эндокринный амилоид и связанный с опухолью амилоид.
III. Амилоидные заболевания АА-типа.
Амилоидоз АА-типа ранее называли вторичным или реактивным амилоидозом, поскольку он развивается вторично в добавление к существовавшему ранее или сопутствующему заболеванию. Такие заболевания включают без ограничения воспалительные заболевания, например, ревматоидный артрит,
ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическую артропатию, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета и болезнь Крона. Депо АА также образуются в результате хронических микробных инфекций, таких как лепра, туберкулез, бронхоэктатиче-ская болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит и болезнь Уиппла. Некоторые злокачественные новообразования могут также вызывать образование АА-фибриллярных амилоидных депо. Они включают такие патологии, как ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточная карцинома и волосатоклеточный лейкоз. Амилоидное заболевание АА-типа может также быть результатом наследственных воспалительных заболеваний, таких как семейная средиземноморская лихорадка. Дополнительно, амилоидное заболевание АА-типа может быть обусловлено лимфопролиферативными заболеваниями, такими как болезнь Каст-лемана.
1. Воспалительные заболевания, связанные с амилоидозом АА-типа.
Ревматоидный артрит представляет собой хроническое системное заболевание, поражающее в первую очередь суставы. Симптомами ревматоидного артрита являются воспалительные изменения в синовиальных мембранах и суставных структурах (суставы), и атрофия и остеопороз (уменьшение плотности костей). В последних стадиях ревматоидного артрита развиваются деформации и анкилоз (неподвижность сустава). Модель ревматоидного артрита можно создать на мышах или крысах путем введения коллагена II типа в полном адъюванте Фрейнда.
Ювенильный хронический артрит проявляется множеством форм, наиболее распространенным является ювенильный ревматоидный артрит. Он может развиваться у детей в любом возрасте, но наиболее часто отмечают начало симптоматики в возрасте от 2 до 6 лет. Существует 3 основных типа ювенильного ревматоидного артрита, а именно, пауциартикулярный артрит, полиартикулярный артрит и системный артрит (также известный как болезнь Стилла). Пауциартикулярный артрит обычно затрагивает 4 или меньше суставов, обычно крупные суставы, например, коленные. Он может сопровождаться ригидностью сустава, заставляя ребенка хромать. Полиартикулярный артрит характеризуется вовлечением 5 или больше суставов, обычно мелких суставов рук и ног. У детей с полиартикулярным артритом часто наблюдается более тяжелая форма болезни. Системный артрит характеризуется опуханием суставов в сочетании с повышением температуры и розовой сыпью. Опухание суставов может не начинаться в течение нескольких месяцев или нескольких лет после начала повышения температуры. Болезнь может также затрагивать внутренние органы, такие как печень, сердце, селезенка и лимфатические узлы, и часто возникает анемия. Системный артрит имеет тенденцию к самостоятельному уменьшению, при этом небольшой процент больных детей может страдать тяжелой формой артрита, который продолжается в их взрослой жизни.
Анкилозирующий спондилит представляет собой ревматическое заболевание, при котором наблюдается артрит позвоночных и крестцовоподвздошных суставов и может возникать воспаление глаз, легких и сердечных клапанов. Симптомы варьируют от перемежающихся эпизодов болей в пояснице, которые наблюдаются в течение жизни, до тяжелого хронического заболевания, которое на протяжении жизни поражает позвоночник, периферические суставы и другие части тела, что приводит к развитию выраженной ригидности суставов и позвоночника, потере подвижности и деформации.
Псориаз является распространенным хроническим чешуйчатым дерматозом, с обострениями и ремиссиями, который имеет полигенный характер наследования. Симптомы псориаза заключаются в наличии округлых, сухих шелушащихся участков разных размеров, покрытых сероватыми, белыми или серебристо-белыми чешуйками, со склонностью к их появлению на разгибательных поверхностях, ногтях, волосистой части головы, гениталиях и в поясничнокрестцовой области.
Псориатическая артропатия представляет собой заболевание, при котором псориаз связан с развитием артрита. Эта патология может иметь варианты проявления. Артрит обычно проявляется в умеренной форме и поражает только некоторые суставы. У некоторых пациентов болезнь носит тяжелый характер и обычно поражает пальцы и позвоночник. При вовлечении позвоночника симптомы очень похожи на симптомы анкилозирующего спондилита.
Синдром Рейтера представляет собой группу симптомов, состоящих из артрита, уретрита (воспаления мочеполового тракта), конъюнктивита (воспаления оболочек глаза) и поражения кожи и слизистых оболочек. Синдром Рейтера также называется реактивным артритом, что означает, что указанный артрит возникает как "реакция" на инфекцию, которая началась в другом месте организма. Чаще всего с синдромом Рейтера связана бактериальная инфекция Chlamydia trachomatis, приобретенная при половом контакте. Некоторые другие бактериальные инфекции, связанные с синдромом Рейтера, включающие Salmonella, Shigella, Yersinia и Campylobacter, возникают через пищеварительный тракт.
Болезнь Стилла у взрослых, также называемая болезнью Стилла с началом в старшем возрасте, является редким воспалительным состоянием, при котором поражаются внутренние органы, суставы и другие части организма. Она может внезапно начинаться и исчезать. При очень тяжелых случаях взрослая форма болезни Стилла становится хронической и чрезвычайно изнурительной, вызывающей нестерпимую боль и ригидность. Через много лет болезнь поражает жизненноважные органы, такие как сердце и легкие.
Синдром Бехчета является полисистемной патологией, которая может приводить к слепоте и неврологическим нарушениям, с проявлением в виде рецидивирующих язв ротовой полости и/или гениталий, и хронического вторичного увеита. Для указанного синдрома характерны 4 основных симптома: афтозные язвы ротовой полости, поражение кожи, глазные симптомы и язвы области гениталий, и иногда воспаление тканей и органов всего организма, включая желудочно-кишечный тракт, центральную нервную систему, сосудистую систему, легкие и почки. Артрит при синдроме Бехчета обычно носит интер-миттирующий, самоограничивающийся, недеформирующий характер и ограничен коленными и голеностопными суставами.
Болезнь Крона представляет собой хроническое грануломатозное (с наличием маленьких зерно-подобных телец или новообразований) воспалительное заболевание, которое поражает любую часть желудочно-кишечного тракта от ротовой полости до ануса; но обычно вовлечена подвздошная кишка (нижний участок тонкой кишки длиной три пятых) с рубцеванием и утолщением кишечной стенки. Симптомы болезни Крона включают наличие хронической диареи, усиление перистальтического шума, судороги, возможно подтвержаемые потерей веса и отвращением к еде.
2. Хронические микробные инфекционные заболевания, связанные с амилоидозом АА-типа. Лепра представляет собой инфекционное заболевание, характеризующееся обезображивающими
рубцами на коже, поражением периферических нервов и прогрессирующим истощением.
Возбудителем лепры является микроорганизм Mycobacterium leprae, который имеет длительный инкубационный период и не обладает высокой контагиозностью. Распространены две формы лепры, тубер-кулоидная и лепроматозная. Обе формы вызывают образование кожных рубцов, но лепрматозная форма является более тяжелой, с образованием больших, обезображивающих узлов (шишек и неровностей). В конечной стадии лепра вызывает периферическое неврологическое поражение. Больные, страдающие лепрой продолжительное время, могут терять функции рук или ног из-за рецидивирующего поражения, обусловленного отсутствием чувствительности.
Туберкулез является контагиозной бактериальной инфекцией, вызываемой Mycobacterium tuberculosis. Болезнь характеризуется развитием гранулём (гранулярных опухолей) в пораженных тканях. В первую очередь поражаются легкие, но инфекция может распространяться на другие органы.
Бронхоэктаз представляет собой патологическую деструкцию и расширение крупных дыхательных путей. Бронхоэктаз часто вызывается рецидивирующим воспалением или инфекцией дыхательных путей. Классическим возбудителем, выявляемым у больных бронхоэктатической болезнью, является бактерия Pseudomonas aeruginosa, элиминация которой, как известно, очень затруднена. Частое инфицирование дыхательных путей указанной бактерией может приводить к обсеменению бронхов этим микроорганизмом, что вызывает у таких людей предрасположенность к псевдомональным пневмониям, для лечения которых необходимы специальные антибиотики.
Язвы лежачего положения, также называемые компрессионными язвами или пролежнями, представляют собой изъязвления кожи и подлежащих тканей, вызванные длительным давлением на вовлеченную область. Они начинаются с покраснения кожи, но быстро прогрессируют до ухудшения в виде образования пузырей, затем открытой раны, и, наконец, язвы. Такие язвы обычно возникают на костных выступах, например, пятках, на ягодицах в области копчика и на затылке.
Хронический пиелонефрит представляет собой инфекцию почек и мочеточников (трубочек, по которым моча выходит из почек). Пиелонефрит чаще всего возникает в результате инфицирования мочевых путей, особенно при наличии спорадического или постоянного обратного тока мочи из мочевого пузыря в мочеточники или почечную лоханку.
Остеомиелит является острой или хронической костной инфекцией, обычно вызываемой бактериями. Часто инфекция начинает в другой части организма и через кровь распространяется до кости. При инфицировании кости внутри нее образуется гной, что может приводить к абсцессу. При абсцессе нарушается кровоснабжение кости. При некрозе костной ткани в результате потери кровоснабжения остеомиелит становится хроническим. Хроническая инфекция может носить интермиттирующий характер и сохраняться в течение многих лет.
Болезнь Уиппла представляет собой редкое состояние, при котором происходит неадекватная абсорбция питательных веществ из кишечного тракта, обусловленная кишечной инфекцией.
Возбудителем болезни является бактерия Tropheryma whippelii. Симптомы включают диарею, кишечное кровотечение, боль в животе, потерю аппетита, потерю веса, утомляемость и слабость. Артрит и повышение температуры часто возникают за несколько лет до развития кишечных симптомов. Также у больных может выявляться неврологическая симптоматика. Диагноз основан на симптомах и результатах биопсии тканей тонкой кишки или других пораженных органов. При диагностике и проведении лечения болезнь Уиппла обычно можно излечить. Без лечения указанная патология обычно является смертельной.
3. Злокачественные новообразования, связанные с амилоидозом АА-типа.
Ходжкинская лимфома представляет собой рак лимфатической ткани, выявляемый в лимфатических узлах, селезенке, печени и в костном мозге. Первым симптомом указанного рака часто является увеличенный лимфатический узел. Болезнь может распространяться на соседние лимфоузлы, и в даль
нейшем может распространяться в легкие, печень или костный мозг.
Почечная карцинома представляет собой рак почки. Злокачественные клетки обнаруживают в выстилке почечных канальцев. Первым симптомом обычно является кровь в моче. Иногда поражаются обе почки. Указанный рак распространяется легко, чаще всего в легкие и другие органы. Карцинома почечных клеток является наиболее распространенным типом рака почек, за ним следует папиллярная почеч-но-клеточная карцинома, хромофобная почечная карцинома и карцинома собирательных протоков почек. Около 5% случаев карциномы почек не классифицированы, поскольку их симптоматика не вписывается ни в одну из категорий.
Кишечные карциномы включают раковые новообразования желудочно-кишечного тракта, такие как колоректальный рак, рак поджелудочной железы, желудка и пищевода. Колоректальный рак возникает в толстой кишке или в прямой кишке. Почти во всех случаях колоректальый рак начинается в виде доброкачественных полипов, которые в течение ряда лет перерождаются в раковые образования. В большинстве случаев колоректальный рак протекает бессимптомно. Панкреатический рак представляет собой злокачественное поражение поджелудочной железы. Его симптомы включают боль в животе, потерю аппетита, значительную потерю веса и безболезненную желтуху. Рак желудка, также называемый желудочным раком, может развиваться в любой части желудка и может распространяться на весь желудок и другие органы; в частности, на пищевод и тонкую кишку. Он также может метастазировать через стенку желудка в соседние лимфатические узлы и органы, такие как печень, поджелудочную железу и легкие, или в отдаленные органы, например, в надключичные лимфатические узлы, толстую кишку и яичники. Рак желудка часто является бессимптомным. Рак пищевода представляет собой злокачественное поражение пищевода. Его симптомы включают дисфагию (затрудненное глотание), боль и значительную потерю веса.
Карциномы легких представляют собой раковые заболевания легких, характеризующиеся наличием злокачественных опухолей. Существует два основных типа рака легкого: немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкого. Симптомы зависят от конкретного типа рака, но могут включать хронический кашель, кровохарканье, одышку, хрипы, боль в груди, потерю аппетита, потерю веса и утомляемость.
Карциномы мочеполового тракта включают без ограничения рак простаты, рак мочевого пузыря, рак эндометрия, цервикальный рак и рак яичника. Рак простаты охватывает злокачественные опухолевые новообразования предстательной железы. Его симптомы могут включать частое мочеиспускание, затрудненное начало мочеиспускания и поддержание равномерности потока мочи, кровь в моче, болезненное мочеиспускание, затрудненное достижение эрекции или болезненную эякуляцию. Рак мочевого пузыря подразумевает любой из нескольких типов злокачественных новообразований мочевого пузыря. Его симптомы включают кровь в моче, частое мочеиспускание, болезненное мочеиспускание и недержание мочи. Эндометриальный рак охватывает злокачественные новообразования эндометрия (оболочки матки). В основном он возникает после наступления менопаузы и проявляется влагалищным кровотечением. Цервикальный рак представляет собой злокачественную опухоль шейки матки. Ранние стадии церви-кального рака могут быть полностью бессимптомными. Влагалищное кровотечение может указывать на наличие злокачественной опухоли. В последующих стадиях могут появляться метастазы в желудке, легких или в другой локализации. Рак яичников представляет собой злокачественное новообразование яичников. Симптомы рака яичников являются часто нечеткими и неспецифическими, и включают неясный дискомфорт внизу живота, ощущение тяжести в тазовой области, нарушение менструального цикла, влагалищное кровотечение, увеличение веса или потерю веса, неспецифические желудочно-кишечные симптомы.
Злокачественные новообразования яичников являются источником распространения раковых клеток, которые часто имплантируются в матку, мочевой пузырь, кишку и в оболочки кишечной стенки. Эти раковые клетки могут давать начало новому опухолевому образованию прежде, чем возникнет предположение о раке.
Базальноклеточная карцинома представляет собой медленно растущую опухоль кожи, охватывающую злокачественные изменения базальных клеток кожи. Её симптомы включают поражение участков кожи, расположенных на лице, ухе, шее, груди, спине или волосистой части головы; видимые кровеносные сосуды на пораженных или смежных участках коже; и постоянные, незаживающие раны. Этот тип рака обычно остается локальным и почти никогда не метастазирует в отдаленные части организма, но его рост может продолжаться и инвазировать соседние ткани и структуры, включающие нервы, кости и головной мозг.
Волосатоклеточный лейкоз представляет собой рак лимфоцитов (В-клеток), который приводит к снижению количества форменных элементов крови. Болезнь вызывается В-клетками аномальной формы с волосообразной конфигурацией. Симптомы часто неопределенны. Снижение количества форменных элементов, вызванное волосатоклеточным лейкозом, может приводить к инфекциям, утомляемости и обильным чрезмерным кровотечениям.
4. Наследственное воспалительное заболевание, связанное с амилоидозом АА-типа.
Семейная средиземноморская лихорадка является наследственной патологией, характеризующейся
рекуррентным повышением температуры и воспалением, часто с вовлечением брюшной полости или легких. Симптомы включают воспаление покровов брюшной полости, воспаление грудной клетки, кожи или суставов, наряду с высокой температурой, обычно достигающей максимального подъема через 12-24 ч. Приступы лихорадки могут варьировать по степени тяжести симптомов, и между приступами у людей обычно отсутствует симптоматика. Это заболевание является очень редким. Факторы риска включают наличие в семейном анамнезе семейной средиземноморской лихорадки или происхождение из Средиземноморского региона.
5. Лимфопролиферативные заболевания, связанные с амилоидозом АА-типа.
Болезнь Кастлемана является формой лимфопролиферативного заболевания, с характерной патологической гигантской гиперплазией лимфатического узла с инфильтрацией плазматическими клетками.
У пациентов с болезнью Кастлемана обычно выявляют лихорадку, анемию, гипергаммаглобулине-мию и повышенную концентрацию в сыворотке белков - острофазовых средств, и все из перечисленных симптомов обусловлены большим количеством IL-6, который продуцируется в лимфатических узлах.
IV. Сывороточный амилоид А-типа.
1. Человеческий сывороточный амилоид А-типа.
Сывороточный амилоид А-типа (SAA) является циркулирующим предшественником амилоидного белка А-типа, фибриллярным компонентом амилоидных депо. Структурные исследования показали, что человеческий SAA является гетерогенным и представляет семейство полиморфных генов SAA и белковых продуктов. Суперсемейство генов SAA содержит группу близко связанных генов, локализованных в 11р15.1. См. Sellar, GC et al. Genomics 19: 221-227 (1994). У людей описаны четыре гена SAA. Типичные аминокислотные последовательности белков, кодируемых четырьмя указанными генами SAA, показаны в фиг. 1. Два гена (SAA1 и SAA2) кодируют сывороточный острофазовый амилоид (A-SAA), и их стимуляция является согласованным ответом на воспаление.
Последовательности SAA1 и SAA2 обладают 95% идентичнностью как в кодирующих, так и в не-кодирующих областях. Существуют альфа-, бета- и гамма-изоформы человеческого SAA1, и альфа- и бета-изоформы человеческого SAA2, как показано в фигурах 18 и 19. SAA3 является псевдогеном. SAA4 кодирует конститутивный SAA и имеет минимальную индуцибельность. См. публикации Cunnane G. Bailliere's Clin. Rheumatol. 13 (4): 615-628. Все человеческие молекулы SAA/AA несут теоретическую кальций-связывающую тетрапептидную последовательность Gly-Pro-Gly-Gly, которая при фибриллоге-незе возможно имеет значение для самоагрегации и для агрегации с экстрафибриллярными остатками амилоида. См. публикации Fykse, E.M. et al. Biochem. J. 256:973-980 (1988) и Turnell et al. Mol. Biol. Med. 3:387-407 (1986). N-концевой участок SAA/AA обладает мощной гидрофобностью, вероятно, важной для самоагрегации и с другими компонентами в амилоидных депозитах. См. Husby et al. Clin. Immunol. Im-munopathol. 70 (1):2-9 (1994). В фигурах 2-5 показаны последовательности каждой из изоформ АА и их отношение к соответствующей изоформе SAA. Например, человеческая альфа-изоформа SAA1 имеет последовательность:
ное выравнивание с SEQ ID NO:2.
2. Мышиный сывороточный амилоид А.
У мышей описаны четыре гена SAA. Типичные аминокислотные последовательности белков, кодируемые четырьмя мышиными генами SAA, показаны в фиг. 8. Генное семейство мышиных SAA содержит четыре члена, которые тесно связаны в хромосоме 7. Два из этих генов, кодирующих основные мышиные изотипы SAA (SAA1 и SAA2), имеют высокоидентичные последовательности не только в экзо-нах, но также и в интронах и фланкирующих областях, и в ответ на амилоидную индукцию в моделях индуцируются примерно в равных количествах. Указанные два изотипа отличаются только по 9 аминокислотным остаткам из 103; однако только SAA2 селективно депонируется в амилоидные фибриллы. См. публикации de Beer M.C. Biochem J. 1991 280 (Pt 1): 45-49 (1991); Hoffman J.S. et al. J Exp Med. 159:641646 (1984); Shiroo M. et al. Scand. J. Immunol. 26:709-716 (1987). SAA3 представляет собой минорный аполипопротеин ЛВП, и периферически продуцируемый острофазовый белок. SAA4 является конститутивным субсемейством, которое представляет собой минорный нормальный аполипопротеин ЛВП, содержащий более 90% SAA для поддержания гомеостаза. См. публикации Stearman R.S. et al. Nucleic Acids Research, 14(2)797-809 (1986) и de Beer M.C. Genomics, 34(1): 139-42 (1996).
Мышиный АА, который представляет собой протеолитический фрагмент SAA, также является гетерогенным. Аминокислотные последовательности каждой из мышиных SAA-изоформ показаны на фигурах 9-12. Выравнивание мышиных последовательностей АА1, АА2, АА3 и АА4 показано на фиг. 13.
Мышиный АА1 представляет собой мышиный эквивалент человеческого АА1. См. фиг. 16. В частности, остатки 69-75 из мышиных последовательностей АА1 (GRGHEDT, SEQ ID NO: 9) имеют максимальное выравнивание с остатками 70-76 человеческих АА1 (GHGAEDS, SEQ ID NO: 4). См. также фиг.
17.
3. Сывороточный А-амилоид шарпея.
Аминокислотная последовательность шарпея показана на фиг. 20. Интересно, что гомологичный участок в человеческом белке SAA-AEDS (SEQ ID NO: 13) несет консервативную замену Thr на Ser в положении 76, а также в значительной степени отличающуюся боковую цепь остатка в положении 73 (замена His на Ala; фиг. 1). Последовательность AEDS (SEQ ID NO: 13) также обнаруживают у собак породы шарпей, при этом указанная порода особенно восприимчива к АА-амилоидозу и может являться естественной моделью системного АА-амилоидоза, с помощью которой можно оценивать новые диагностические и терапевтические применения амилоид-специфических АА-антител и других соединений.
4. N-концевой сегмент А-белка определяет его фибриллогенные свойства.
Амилоидный фибриллярный белок АА состоит из вариабельной длинной части N-концевого сывороточного АА-белка-предшественника. Подтверждено, что амилоидогенная часть молекулы представляет собой N-концевой сегмент длиной от 10 до 15 аминокислот. Аминокислотые замены в этой части молекулы могут объяснить, почему только одна из двух мышиных изоформ SAA является амилоидогенной. См. Westermark G.T. Biochem Biophys Res Commun. 182 (l):27-33 (1992).
V. Другие человеческие амилоидогенные белки.
Ниже в табл. 3 представлены инвентарные №№ в банке генов Genbank и последовательности X1EDX2 для нескольких человеческих амилоидогенных белков, включающих некоторые из перечисленных выше белков из табл. 2.
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа
PEDL, (SEQ ID N0: 27)
BAA97 671
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа против Entamoeba histolitica
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
BAA82105
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа против Entamoeba histolitica
TEDV, (SEQ ID NO: 28)
BAA82102
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAC41705
Вариабельный участок легкой цепи моноклонального Ig (иммуноглобулина)-каппа против GM2 ганглиозидного ДНК
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAC2 64 8 0
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа; против вируса тяжёлого острого респираторного синдрома SARS-CoV
PEDV, (SEQ ID NO: 151)
AAT51719
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа; против SARS-CoV
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAT51718
VLJ участок (соединительный участок легкой цепи) иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAD27502
VLJ участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
BAD27497
Легкая цепь иммуноглобулина 47е каппа против HIV-lgpl20
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAR88378
Легкая цепь иммуноглобулина 16с каппа против HIV-lgpl20
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAR88374
Легкая цепь иммуноглобулина 411д каппа против HIV-1др120
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
AAR88372
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAF14212
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAF14211
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID N0: 22)
AAF14210
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAF14209
V (вариабельный)участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDI, (SEQ ID NO: 21)
AAR02415
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
AAM46647
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа
ftEDV, (SEQ ID NO:
23)
AAM46643
Легкая цепь иммуноглобулина-каппа против Entamoeba histolitica
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
BAA82103
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAL65723
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
AAL65718
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
AAL65717
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
AAL65716
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
AAL65714
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
AAL65713
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65712
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65711
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65710
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
LEDG, (SEQ ID NO: 31)
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65709
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
LEDG, (SEQ ID NO: 31)
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65708
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65707
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65706
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65705
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65704
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
AAL65703
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
AAC64146
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
AAC64144
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
ABI64139
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAL04535
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAL65722
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
AEDV, (SEQ ID N0: 23)
AAL65720
V-J (вариабельный соединительный) участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
BAA19563
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
BAA19562
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
BAA19561
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAA19560
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAA19559
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
BAA19558
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDI, (SEQ ID NO: 21)
BAA19556
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
AAA71907
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAA71905
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина Gl Fab
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
BAF4 92 81
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина Gl Fab
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAF48998
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина Gl Fab
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAF48996
V-участок легкой цепи каппа
AEDM, (SEQ ID NO: 32)
CAA37 67 5
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина Gl Fab
SEDF, (SEQ ID NO: 24)
BAF48994
Вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина Gl Fab
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAF48992
V-J-C участок цепи предшественника Ig-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
A53261
V-участок цепи предшественника Ig-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
A49137
V-I участок цепи предшественника Ig-каппа
SEDI, (SEQ ID NO: 29)
PN0445
V-III участок цепи предшественника Ig-каппа (EVI-15)
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
A32274
V-IV участок (Dep) цепи Ig-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
A34153
V-IV участок (Fue) цепи Ig-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
B34153
V-II участок (Рес) цепи Ig-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
C34153
Цепь L (легкая) Fab-фрагыента Ig-g (связывание Cd25)
AEDA, (SEQ ID NO: 62)
1MIM L
Цепь Н (тяжелая) Fab-фрагмента Ig-g (связывание Cd25)
HEDS, (SEQ ID NO: 33)
1MIM_H
С - облаешь цепи Ig-мю, секретируеыая сплайс-форма
CEDD, (SEQ ID NO: 34)
MHHU
V-J участок цепи иммуноглобулина-каппа
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAA58 923
Вариабельный участок легкой цепи рекомбинантного моноклонального антитела IgM 12 каппа
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
ABA41551
Легкая цепь иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
CAA65054
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAL65769
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAL65767
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAL65765
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
TEDE, (SEQ ID NO: 16)
AAL65764
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAL65763
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
AAL65762
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
AAL65761
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
AAL65760
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAL65759
Вариабельный участок легкой цепи лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAL65758
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDF, (SEQ ID NO:
22)
BAA19563
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
BAA19562
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
BAA19561
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
BAA19560
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDF, (SEQ ID NO: 22)
BAA19559
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
BAA19558
V-J участок легкой цепи иммуноглобулина
PEDI, (SEQ ID NO: 21)
BAA19556
Вариабельный участок легкой цепи 3 0-лямбда иммуноглобулина
AEDE, (SEQ ID NO: 19)
AAK95335
Прогноз: сходный с низкоаффинным
иммуноглобулином-гамма, Fc-участок рецептора 11-а предшественника (Fc-гамма RII-a) (FcRII-a) (IgG Fc-рецептор II-a) (Fc-гамма-Rlla) (антиген CD32) (CDw32)
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
XP_001129584
Fc-фрагмент IgG, высокоаффинный la, рецептор (CD64)
REDS, (SEQ ID NO: 36)
TEDG, (SEQ ID NO: 37)
QEDR, (SEQ ID NO:
NP_000557
Fc-фрагмент IgG, низкоаффинный lib, рецептор для (CD32), изоформа 2
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
NP 001002273 XP_943944
Fc-фрагмент IgG, низкоаффинный lib, рецептор для (CD32), изоформа 1
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
NP_00 3992
Fc-фрагмент IgG, низкоаффинный lib, рецептор для (CD32), изоформа 4
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
NP 001002275
Fc-фрагмент IgG, низкоаффинный lib, рецептор для (CD32), изоформа 3
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
NP_001002274 XP 001129592
Fc-фрагмент IgG, высокоаффинный lb, рецептор для (CD64), изоформа а
QEDR, (SEQ ID NO: 38)
NP 001017986
Fc-фрагмент IgG, высокоаффинный lb, рецептор для (CD64), изоформа b
QEDR, (SEQ ID NO: 38)
NP_001004340 XP_4 9638 6
Fc-фрагмент IgG, низкоаффинный На, рецептор для (CD32)
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
NP_067674 XP 943942
Низкоаффинный
иммуноглобулин-гамма, Fc-участок рецептора III-b предшественника
TEDL, (SEQ ID NO: 39)
PEDN, (SEQ ID NO: 40)
EEDP, (SEQ ID NO: 41)
NP 000561
Fc-фрагмент IgG, низкоаффинный II1-а, рецептор для (CD16)
TEDL, (SEQ ID NO: 39)
PEDN, (SEQ ID NO: 40)
EEDP, (SEQ ID NO: 41)
NP_000560 XP_001133750
Низкоаффинный
иммуноглобулин-гамма, Fc-участок рецептора 11-а предшественника (Fc-гамма RII-a) (FcRII-a) (IgG Fc-рецептор II-a) (Fc-гамма-RHa) (антиген CD32) (CDw32)
QEDS, (SEQ ID NO: 35)
P12318
Низкоаффинный
иммуноглобулин-гамма, Fc-участок рецептора III-B предшественника (IgG Fc-рецептор II1-1) (Fc-гамма-RIII-бета) (Fc-гаыыа RHIb) (FcRIIIb) (Fc-raMMa-RIII) (Fc-RIII) (FcR-10) (антиген CD16b)
TEDL, (SEQ ID NO: 39)
PEDN, (SEQ ID NO: 40)
EEDP, (SEQ ID NO: 41)
075015
Низкоаффинный
иммуноглобулин-гамма, Fc-участок рецептора III-A предшественника (IgG Fc-рецептор III-2) (Fc-гамма-RIII-альфа) (Fc-гамма RHIa) (FcRIIIa) (Fc-гамма-RIII) (Fc-RIII) (FcR-10) (антиген CD16a)
TEDL, (SEQ ID NO: 39)
PEDN, (SEQ ID NO: 40)
EEDP, (SEQ ID NO: 41)
P08637
Высокоаффинный иммуноглобулин-гамма, Fc-участок рецептора I предшественника (Fc-гамма-RI) (Fc-RI) (IgG Fc-рецептор I) (антиген CD64)
REDS, (SEQ ID NO: 36)
TEDG, (SEQ ID NO: 37)
QEDR, (SEQ ID NO: 38)
P12314
Постоянная тяжелая цепь иммуноглобулина IGHG1 гамма1 (Glm маркер)
AEDT, (SEQ ID NO: 14)
Q6PJA4
apoAl (Homo sapiens)
LEDL, (SEQ ID NO: 42)
CAA01253
Предшественник аполипопротеина C-III (Homo sapiens)
AEDA, (SEQ ID NO:
62)
NP 000031
Предшественник аполипопротеина A-IV (Homo sapiens)
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
NP 000473
Гельсолин (амилоидоз, финский тип) (Homo sapiens)
TEDT, (SEQ ID NO: 30)
KEDA, (SEQ ID NO: 43)
SEDC, (SEQ ID NO: 44)
QEDL, (SEQ ID NO: 63)
CAM20459
Гельсолин (амилоидоз, финский тип) (Homo sapiens)
TEDT, (SEQ ID NO: 30)
KEDA, (SEQ ID NO: 43)
SEDC, (SEQ ID NO: 44)
QEDL, (SEQ ID NO: 63)
CAI14413
Гельсолин (амилоидоз, финский тип), изоформа CRA с (Homo sapiens)
TEDT, (SEQ ID NO: 30)
KEDA, (SEQ ID NO: 43)
SEDC, (SEQ ID NO: 44)
QEDL, (SEQ ID NO: 63)
EAW87491
Гельсолин (амилоидоз,
финский тип! . изп^ппмл
CRA b (Homo sapiens)
TEDT, (SEQ ID NO: 30)
KEDA, (SEQ ID NO: 43)
SEDC, (SEQ ID NO: 44)
QEDL, (SEQ ID NO: 63)
EAW87490
Гельсолин (амилоидоз, финский тип), изоформа CRA a (Homo sapiens)
TEDT, (SEQ ID NO: 30)
KEDA, (SEQ ID NO: 43)
SEDC, (SEQ ID NO: 44)
QEDL, (SEQ ID NO: 63)
EAW87489
Амилоидный белок-предшественник; АРР (Homo sapiens)
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAB23646
Амилоидный белок-предшественник; АРР {Homo sapiens)
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAB19991
Амилоидный белок
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAA51768
Белок-предшественник амилоид-бета А4 (АРР) (АВРР) (амилоидный белок болезни Альцгеймера) (церебральный васкулярный амилоидный пептид) (CVAP) (протеаза nexin-II) (PN-II) (APPI) (РгеА4) [содержит: растворимый АРР-альфа (S-АРР-альфа); растворимый АРР-бета (S-APP-бета) ; С99; бета-амилоидный белок 42 (бета-АРР42); бета-амилоидный белок 40 (бета-АРР40); С83; Р3(42); Р3(40); гамма-CTF(59) (С-концевой фрагмент 5 9 гамма-секретазы) (амилоидный внутриклеточный домен 5 9) (AID(59)) EEDD, (SEQ ID NO: 45)
SEDK, (SEQ ID NO: 46)
DEDD, (SEQ ID NO: 47)
DEDG, (SEQ ID NO: 48)
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
P05067
Белок АРР (Homo sapiens)
EEDD, (SEQ ID NO: 45)
SEDK, (SEQ ID NO: 46)
DEDD, (SEQ ID NO: 47)
DEDG, (SEQ ID NO: 48)
AAH65523
Белок АРР (Homo sapiens)
EEDD, (SEQ ID NO: 45)
SEDK, (SEQ ID NO: 46)
DEDD, (SEQ ID NO: 47)
DEDG, (SEQ ID NO: 48)
AAH04369
Белок-предшественник амилоид-бета А4 (протеаза nexin-II, болезнь Альцгеймера) (Homo sapiens)
EEDD, (SEQ ID NO: 45)
SEDK, (SEQ ID NO: 46)
DEDD, (SEQ ID NO: 47)
DEDG, (SEQ ID NO: 48)
AEDV, (SEQ ID NO: 23)
AAW82435
Кальцитонин
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
AAA58403
Предшественник кальцитонина
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
AAA35501
Препрокальцитонин (Homo sapiens)
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
CAA25103
Препрокальцитонин
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
AAA51913
Предшественник кальцитонина [содержит: кальцитонин; катакальцин
(кальцитониновый карбокси-концевой пептид) (ССР) (PDN-21)]
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
P01258
Изоформа кальцитонина препропротеин CALCA (Homo sapiens)
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
NP 001029124
Изоформа кальцитонина препропротеин CALCA (Homo sapiens)
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
NP_001732
Изоформа кальцитонина препропротеин CGRP (Homo sapiens)
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
NP 001029125
Предшественник кальцитонинового генно-родственного пептида 1 (кальцитониновый генно-родственный пептид 1) (CGRP-I) (CGRP альфа-типа)
SEDE, (SEQ ID NO: 18)
P06881
Атриальный
натрийуретический фактор
LEDE, (SEQ ID NO: 49)
AAA35528
Пропептид атриального натрийуретического фактора (Homo sapiens)
LEDE, (SEQ ID NO: 49)
CAA25700
Атриальный
натрийуретический фактор
LEDE, (SEQ ID NO: 49)
1101403A
Предшественник атриального натрийуретическоно фактора (ANF) (атриальный натрийуретический пептид) (ANP) (препронатрийдилатин) (CDD-ANF) [содержит: кардиодилатин-родственный пептид (CDP)]
LEDE, (SEQ ID NO: 49)
P01160
Атриальный
натрийуретический пептид
LEDE, (SEQ ID NO: 49)
AAA35529
Кератин (Homo sapiens)
GEDA, (SEQ ID NO: 50)
AAB30058
Кератин (Homo sapiens)
VEDF, (SEQ ID NO: 51)
YEDE, (SEQ ID NO: 52)
СААЗ 1695
Кератин
IEDL, (SEQ ID NO: 53)
GEDA, (SEQ ID NO: 50)
AAB59562
Кератин, цитоскелетный 6С II типа (цитокератин-бс) (СК 6С) (Кбс кератин) (цитокератин-6Е) (СК 6Е) (кератин K6h)
VEDL, (SEQ ID NO: 64)
YEDE, (SEQ ID NO: 52)
LED A, (SEQ ID NO: 65)
P48668
Фибриноген (Homo sapiens)
WEDY, (SEQ ID NO: 54)
CAA50740
Предшественник фибриногена, альфа-субъединица (Homo sapiens)
DEDW, (SEQ ID NO: 55)
SEDL, (SEQ ID NO: 56)
YEDQ, (SEQ ID NO: 57)
SEDG, (SEQ ID NO: 66)
LEDW, (SEQ ID NO: 58)
AAC97142
Фибриноген альфа-цепь (Homo sapiens)
DEDW, (SEQ ID NO: 55)
SEDL, (SEQ ID NO: 56)
YEDQ, (SEQ ID NO: 57)
SEDG, (SEQ ID NO: 66)
AAI01936
Фибриноген альфа-цепь (Homo sapiens)
DEDW, (SEQ ID NO: 55)
SEDL, (SEQ ID NO: 56)
YEDQ, (SEQ ID NO: 57)
SEDG, (SEQ ID NO: 66)
AAH98280
Фибриноген альфа-цепь, изоформа CRA b (Homo sapiens)
DEDW, (SEQ ID NO: 55)
SEDL, (SEQ ID NO:
56)
YEDQ, (SEQ ID NO: 57)
SEDG, (SEQ ID NO:
66)
LEDW, (SEQ ID NO: 58)
EAX04926
Фибриноген альфа-цепь, изоформа CRA с (Homo sapiens)
DEDW, (SEQ ID NO: 55)
SEDL, (SEQ ID NO:
56)
YEDQ, (SEQ ID NO: 57)
SEDG, (SEQ ID NO:
66)
EAX04928
Фибриноген альфа-цепь,
изоформа CRA a (Homo sapiens)
DEDW, (SEQ ID NO:
55)
SEDL, (SEQ ID NO: 56)
EAX04924
Предшественник прионного белка; PRNP [ Homo sapiens]
YEDR, (SEQ ID NO: 59)
AAC62750
Основной предшественник прионного белка (РгР) (РГР27-30) (РГРЗЗ-35С (ASCR) (антиген CD230)
YEDR, (SEQ ID NO:
59)
P04156
Предшественник прионного белка [Homo sapiens]
YEDR, (SEQ ID NO: 59)
NP.000302
Пролактин [Яолю sapiens]
PEDK, (SEQ ID NO:
60)
CAA 38264
Пролактин [Яолю sapiens]
PEDK, (SEQ ID NO: 60)
AAH8 8 37 0
VI. Амилоидные пептиды для активной иммунизации.
Терапевтические средства, применяемые в способах по настоящему изобретению, представляют собой иммуногенные пептиды, такие как пептиды АА-типа и пептиды AL-типа, которые при введении пациенту создают антитела, специфически связывающиеся с одним или несколькими эпитопами, содержащими XiEDX2, например, с такими, как эпитопы между остатками 70-76 АА ("АА-средства"). Дополнительные примеры средств включают иммуногенные пептиды, которые содержат фрагмент, состоящий из XiEDX2, полученного из других амилоидных белков ("фрагменты XiEDX2"), такие как AL-фрагменты VK, состоящие из аминокислотных последовательностей PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), AEDV (SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25), и AL-фрагменты Vk, состоящие из аминокислотных последовательностей SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), TEDE (SEQ ID NO: 16) или PEDE (SEQ ID NO: 20). Также может использоваться AL-фрагмент VX, состоящий из аминокислотной последовательности FEDD (SEQ ID NO: 17). Некоторые подходящие амилоидные белки включают сывороточный А-амилоидный белок, белок легкой цепи иммуноглобулина, человеческий островковый амилоидный полипептид-предшественник (IAPP), бета-амилоидный пептид, трансти-ретин (TTR), ApoA1 и другие амилоидные белки, перечисленные в табл. 1, которые содержат аминокислотную последовательность X1EDX2. В некоторых средствах X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р, А или любой другой аминокислотный остаток, непосредственно предшествующий ED в амилоидном белке; и Х2 представляет собой Т, S, E, R, I, V, F, D, А или любой другой аминокислотный остаток, расположенный непосредственно после ED в таком амилоидном белке. В некоторых средствах X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А и Х2 является Т, S, E, D, R, I, V, F или А. Если X1 в некоторых указанных средствах представляет собой Н, то Х2 является Т или А; если X1 представляет собой А, то Х2 является S, Т, Е или V; если X1 представляет собой Т, то Х2 является Е; если Xi представляет собой F, то Х2 является D; если X1 представляет собой S, то Х2 является Е, F или А; и если X1 представляет собой Р, то Х2 является Е, I или F. В некоторых средств X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А и Х2 является Т, S, E, D, R, I, V, F или А, при условии, что если X1 представляет собой А, то Х2 не является V. Если X1 в некоторых средствах представляет собой А, то Х2 является S, Т или Е.
Некоторые средства содержат аминокислотную последовательность GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), AEDV (SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25). Некоторые средства состоят из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3, HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS, (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID
NO: 22), AEDV (SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25), которые связаны с
носителем для образования конъюгата. Некоторые средства содержат аминокислотные последовательности GHEDT (SEQ ID NO: 3, HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), AEDV (SEQ ID
NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25). Некоторые средства состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), AEDV (SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25), которые связаны с носителем для образования коньюгата. Некоторые средства содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3, HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO: 16).
Предпочтительными АА-фрагментами являются остатки 70-76 альфа-изоформы человеческой АА1 (НАА1) (GHGAEDS, SEQ ID NO:4), остатки 70-76 бета-изоформы НАА1 (GHDAEDS, SEQ ID NO:5), остатки 70-76 гамма-изоформы НАА1 (GHDAEDS, SEQ ID NO: 5), остатки 70-76 альфа- и бета-изоформ НАА2 (GHGAEDS, SEQ ID NO: 4), остатки 70-76 HAA3 (GDHAEDS, SEQ ID NO:7), остатки 78-84 HAA4 (STVIEDS, SEQ ID NO:8), остатки 69-75 мышиной АА1 (MAA1) (GRGHEDT, SEQ ID NO:9), остатки 6975 MAA2 (GRGHEDT, SEQ ID NO: 9), остатки 62-68 MAA3 (GHGAEDS, SEQ ID NO: 10) и остатки 76-82 MAA4 (NHGLETL, SEQ ID NO: 11) или субфрагменты по меньшей мере из трех смежных аминокислот любого из указанных остатков. Некоторые АА-фрагменты не содержат остатков АА- амилоидного пептида, кроме обозначенного выше сегмента. Другие АА-фрагменты содержат дополнительные фланкирующие остатки АА-амилоидного пептида, но содержат всего не более 20, или предпочтительно не более 10 смежных остатков из АА-амилоидного пептида. Дополнительные предпочтительные фрагменты X1EDX2 и AL-типа включают GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO: 16).
Терапевтические средства для применения в способах по настоящему изобретению также включают
иммуногенные АА-пептиды, которые при введении пациенту создают антитела, специфически связывающиеся с N-концевыми эпитопами АА. Предпочтительные средства индуцируют иммуногенный ответ, направленный на эпитоп в пределах 1-15 остатков человеческих АА-пептидов.
Предпочтительно вводимые фрагменты АА или AL, или другие средства, такие как фрагменты X1EDX2, содержат недостаточно эпитопов, которые будут вызывать Т-клеточный ответ на фрагмент. В общем, Т-клеточные эпитопы имеют более 10 смежных аминокислот. Поэтому предпочтительные фрагменты амилоидных белков, такие как АА или фрагменты X1EDX2, имеют размер от 4 до 10, или предпочтительно, от 7 до 10 смежных аминокислот; то есть, обладают достаточной длиной для индукции ответа антитела, без генерации ответа Т-клеток. Отсутствие Т-клеточных эпитопов является предпочтительным, поскольку указанные эпитопы не являются необходимыми для иммуногенного действия фрагментов, и они могут вызывать нежелательную воспалительную реакцию у подгрупп пациентов (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3).
Предпочтительными АА-фрагментами являются остатки 70-76 альфа изоформы человеческого АА1 (НАА1) (GHGAEDS) (SEQ ID NO: 4), остатки 70-76 бета изоформы НАА1 (GHDAEDS) (SEQ ID NO:5), остатки 70-76 гамма изоформы НАА1 (GHDAEDS, SEQ ID NO: 5), остатки 70-76 альфа- и бета-изоформ
НАА2 (GHGAEDS, SEQ ID NO: 4), остатки 70-76 HAA3 (GDHAEDS) (SEQ ID NO:7), остатки 78-84
HAA4 (STVIEDS) (SEQ ID NO:8), остатки 69-75 мышиного АА1 (MAA1) (GRGHEDT) (SEQ ID NO:9),
остатки 69-75 MAA2 (GRGHEDT, SEQ ID NO: 9), остатки 62-68 MAA3 (GHGAEDS) (SEQ ID NO: 10) и
остатки 76-82 MAA4 (NHGLETL) (SEQ ID NO: 11) или субфрагменты по меньшей мере из трех смежных аминокислот любого из указанных остатков. Некоторые фрагменты АА не содержат остатков амилоидного АА-пептида, кроме обозначенного выше сегмента. Другие АА-фрагменты АА содержат дополнительные фланкирующие остатки амилоидного АА-пептида, но содержат всего не более 20, или предпочтительно, не более 10 смежных остатков амилоидного АА-пептида. Дополнительные предпочтительные фрагменты X1EDX2 и AL включают GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO: 16).
Для индукции иммунного ответа в способах и композициях по настоящему изобретению можно также использовать аналоги АА-амилоидного, AL-амилоидного и других амилоидных пептидов природного происхождения. Аналоги включают аллельные, видовые варианты и варианты индуцирования. Аналоги АА-пептида индуцируют антитела, которые специфически связываются с АА-пептидом остатков 70-76 природного происхождения. Некоторые такие аналоги не способны индуцировать антитела, которые специфически связываются с эпитопами вне остатков 70-76 в АА-пептиде. Обычно отличия аналогов АА от пептидов природного происхождения составляют до 30% положений аминокислот, и указанные отличия заключаются в заменах до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10 положений. Каждая делеция или замена аминокислотного остатка природного происхождения считается заменой положения в виде вставки остатка без замены. Замены аминокислот часто представляют собой консервативные замены.
Некоторые аналоги АА или АА-фрагментов AL или AL-фрагментов или других амилоидных фрагментов белка, таких как фрагменты X1EDX2, также включают аминокислоты искусственного происхождения или модификации N-концевых или С-концевых аминокислот в первом, втором, пятом, десятом или даже во всех положениях. Например, остаток аспарагиновой кислоты прородного происхождения можно заменить на изоаспарагиновую кислоту. Примерами аминокислот искусственного происхождения являются D, альфа, альфа-дизамещенные аминокислоты, N-алкильные аминокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, эпсилон-^^^триметиллизин, эпсилон-^ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, омега^-метил-аргинин, Р-аланин, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, тироксин, гамма-аминомасляная кислота, гомосерин, цитруллин и изоаспарагиновая кислота. Некоторые терапевтические средства по изобретению представляют собой полностью-D пептиды, например, полностью-D АА или полностью-D фрагменты АА, и полностью-D пептидные аналоги. Некоторые терапевтические средства по изобретению на 90% являются полностью-D пептидами, например, на 90% полностью-D АА или на 90% полностью-D фрагментами АА, и на 90% полностью-D пептидными аналогами. Некоторые терапевтические средства по изобретению на 80% являются полностью-D пептидами, например, на 80% полностью-D АА или на 80% полностью-D фрагментами АА, и на 80% полностью-D пептидными аналогами. Можно проводить скрининг фрагментов и аналогов на профилактическую или терапевтическую эффективность с помощью трансгенных моделей животных по сравнению с контролем без лечения или плацебо, как описано ниже.
Пептиды АА, AL, их фрагменты и аналоги, и фрагменты X1EDX2 и их аналоги можно синтезировать путем твердофазного синтеза пептидов или путем рекомбинантной экспрессии, или их можно получать из источников природного происхождения. Автоматические пептидные синтезаторы являются коммерчески доступными у многочисленных поставщиков, таких как компания Applied Biosystems, Foster City, Калифорния. Рекомбинантную экспрессию можно осуществлять в бактериях, например, Е. coli, в дрожжах, в клетках насекомых или клетках млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны авторами Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989).
Терапевтические средства также включают более длинные полипептиды, которые включают, на
пример, иммуногенный фрагмент АА-пептида, AL-пептида или фрагмент X1EDX2, вместе с одной или больше другими аминокислотами, фланкирующими АА-пептид, AL-пептид или фрагмент X1EDX2 на одной стороне или на одной или обеих сторонах. Например, предпочтительные средства включают слитые белки, содержащие сегмент АА, AL или фрагмент X1EDX2, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которые индуцируют Т-клеточный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности, и таким образом В-клеточный ответ против сегмента АА, сегмента AL или фрагмента X1EDX2. Также можно использовать одну или больше фланкирующих гетерологичных аминокислот, чтобы накрыть пептиды АА или AL, или фрагмент X1EDX2 для защиты от их разрушения при изготовлении, хранении или применении. С помощью животных моделей можно проводить скрининг указанных полипептидов на их профилактическую или терапевтическую эффективность по сравнению с контролем без лечения или плацебо, как описано ниже. Терапевтические средства по изобретению включают иммуногенный фрагмент АА или AL, или фрагмент X1EDX2 между последовательностями полилизина. Последовательности полилизина можно сливать с N-концом, С-концом, или и с N-концом и С-концом АА или AL, или с иммуногенным фрагментом АА или AL, или с фрагментом X1EDX2. Пептиды АА или AL, фрагмент X1EDX2, аналог, активный фрагмент АА или другого полипептида можно вводить в связанной или мультимерной форме, или в диссоциированной форме.
Терапевтические средства также включают мультимеры мономерных иммуногенных средств.
В дополнительных вариантах иммуногенный фрагмент АА, или AL, или фрагмент X1EDX2 могут быть представлены вирусом или бактерией в виде части иммуногенной композиции. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный пептид, вставлена в геном или эписому вируса или бактерий. Необязательно, нуклеиновая кислота вставлена таким образом, что иммуногенный пептид экспрессируется в виде секретируемого белка или в виде белка, слитого с белком внешней оболочки вируса или с трансмембранным белком бактерии, для фенотипирования пептида. Вирусы или бактерии, используемые в таких способах, должны быть непатогенными или аттенуироваными. Подходящие вирусы включают аденовирус, вирус простого герпеса HSV, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита и другие альфа-вирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдовирусы, возбудители вакцинии и оспы птиц. Подходящие бактерии включают Salmonella и Shigella. Особенно подходит слияние иммуногенного пептида с поверхностным антигеном вируса гепатита В HBsAg HBV.
Терапевтические средства также включают пептиды и другие соединения, которые не обязательно имеют аминокислотные последовательности, в значительной степени подобные АА, или AL, или фрагменту X1EDX2, но тем не менее являются миметиками АА или AL или фрагмента X1EDX2 и индуцируют сходный иммунный ответ. Например, можно проводить скрининг на применимость любых пептидов и белков, образующих Р-складчатые листы. Также можно использовать анти-идиотипические антитела против моноклональных антител к АА, или AL, или к другим амилоидогенным пептидам, например, фрагментам X1EDX2. Такие анти-Id (антиидиотипические) антитела подражают антигену и создают иммунный ответ на него (см. Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed) p. 181). Другие средства, кроме АА-пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или больше предпочтительных сегментов АА, упомянутых выше (например, АА 70-76 или GHEDT (SEQ ID NO: 3) или упомянутого выше фрагмента X1EDX2, такого как, например, HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO:
16).
Предпочтительно, что такие средства индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на один из указанных сегментов, и при этом не направлен на другие сегменты АА, или AL, или амилоидного белка, из которого происходит фрагмент X1EDX2.
Также можно проводить скрининг на применимость рандомизированных библиотек пептидов или других соединений. Можно создавать комбинаторные библиотеки для многих типов соединений, которые можно синтезировать поэтапно. Такие соединения включают полипептиды, бета-варианты мимети-ков, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки указанных соединений можно конструировать с помощью способа кодирующих синтетических библиотек (ESL), описанного в следующих источниках: Affymax, патент WO 95/12608, Affymax, патент WO 93/06121, Колумбийский университет, патент WO 94/08051, Фармакопея, патент WO 95/35503 и Scripps, патент WO 95/30642 (каждый из которых для всех целей включен в настоящее изобретение со ссылкой). Пептидные библиотеки также можно создавать способами фаговых дисплеев. См., например, Devlin, патент WO 91/18980.
Вначале проводят скрининг комбинаторных библиотек и других соединений на применимость, путем определения способности соединений специфически связываться с антителами или лимфоцитами (Вили Т-), которые достоверно специфичны для АА или других амилоидогенных пептидов. Например, начальный скрининг можно проводить с любой поликлональной сывороткой или моноклональным антителом к АА, или AL, или их фрагментам, или к фрагменту X1EDX2. Можно проводить скрининг на специфическое связывание со специфическим эпитопом в пределах АА (например, остатки АА 70-76 или GHEDT (SEQ ID NO: 3), или в пределах AL, или вышеупомянутого фрагмента X1EDX2, такого как, на
пример, HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO: 16).
Можно тестировать соединения с помощью методик, аналогичных описанным методикам картирования характеристик эпитопов антитела. Идентифицированные с помощью такого скрининга соединения затем дополнительно анализируют на способность индуцировать антитела или реактивные лимфоциты к АА, или AL, или их фрагментам, или к фрагменту X1EDX2. Например, можно тестировать серийные разведения сывороток на микротитровальных планшетах с предварительным нанесением АА, или AL, или их фрагментов, или фрагмента X1EDX2, и можно проводить стандартный твердофазный иммунофер-ментный анализ ELISA для тестирования на реактивные антитела к АА, или AL, или их фрагментам, или к фрагменту X1EDX2. Также можно тестировать соединения на профилактическую и терапевтическую эффективность у трансгенных животных, предрасположенных к амилоидозу, например, к амилоидозу АА-типа или амилоидозу AL-типа. Такой же скрининговый подход можно применять с другими потенциальными средствами, аналогами АА, аналогами AL и более длинными пептидами, включающими фрагменты АА, AL и фрагменты X1EDX2, описанные выше.
VII. Конъюгаты.
Некоторые средства для индуцирования иммунного ответа содержат соответствующий эпитоп для индукции иммунного ответа на АА, но имеют слишком малый размер, чтобы обладать иммуногенными свойствами. В таком случае пептидный иммуноген может быть связан с подходящей молекулой-носителем для образования конъюгата, который способствует активации иммунного ответа. Единственное средство может быть связано с единственным носителем, множественные копии средства можно связывать с множественными копиями носителя, которые в свою очередь связаны друг с другом, множественные копии средства могут быть связаны с единственной копией носителя, или единственная копия средства может быть связана с множественными копиями носителя или разных носителей. Подходящие носители включают альбуминовую сыворотку, гемоцианин лимфы улитки, молекулы иммуноглобулина, тироглобулин, овальбумин, токсоид столбняка или токсоид других патогенных бактерий, таких как дифтерия, Е. coli, холера или Н. pilory, или аттенуированное производное токсина. Т-клеточные эпитопы также представляют собой подходящие молекулы-носители. Некоторые конъюгаты можно создавать путем связывания средств по настоящему изобретению с иммуностимулирующей полимерной молекулой (например, трипальмитоил^-глицерин-цистеином (Pam3Cys), маннаном (манозный полимер) или глюканом (бета 1-2 полимер)), цитокинами (например, пептиды интерлейкины IL-1, IL-1-альфа и бета, IL-2, гамма-интерферон, IL-10, гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующий фактор GM-CSF) и хе-мокинами (например, альфа- и бета-MIP! и RANTES). Иммуногенные средства также могут быть связаны с пептидами, которые увеличивают транспорт через ткани, как описано автором O'Mahony в патентах WO 97/17613 и WO 97/17614. Связь иммуногенов с носителями может осуществляться со спейсерными аминокислотами (например, Gly-Gly), или без них.
Некоторые конъюгаты можно образовывать посредством связывания средств по изобретению по меньшей мере с одним Т-клеточным эпитопом. Некоторые Т-клеточные эпитопы являются промискуи-тентными, тогда как другие Т-клеточные эпитопы универсальны. Промискуитентные Т-клеточные эпи-топы способны усиливать индукцию Т-клеточного иммунитета у широкого ряда субъектов с выявленными разными типами HLA. В отличие от промискуитентных Т-клеточных антигенных детерминант, универсальные Т-клеточные эпитопы обладают способностью усиливать индукцию Т-клеточного иммунитета в большем процентном отношении, например, по меньшей мере, у 75% субъектов с выявленными разными молекулами HLA, кодируемыми разными аллелями HLA-DR.
Существует большое количество Т-клеточных эпитопов природного происхождения, таких как ток-соид столбняка (например, эпитопы Р2 и Р30), поверхностный антиген гепатита В, токсоид коклюша, F-белок вируса кори, основной белок внешней мембраны Chlamydia trachomitis, токсоид дифтерии (например, CRM197), антигены Т Plasmodium falciparum circumsporozite, CS Plasmodium falciparum, триозофос-фат изомераза Schistosoma mansoni, TraT Escherichia coli и гемагглютинин (ГА) вируса гриппа. Иммуно-генные пептиды по настоящему изобретению также можно конъюгировать с Т-клеточными антигенными детерминантами, описанным в публикациях Sinigaglia F. Et al, Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M. et al, J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer J. Et al. , Cell 74:197-203 (1993); Falk K. Et al. , Immunogenetics, 39:230-242 (1994); в патенте WO 98/23635; и авторами Southwood S. et al. J. Immunology; 160:3363-3373 (1998); и Giannini G. et al. Nucleic Acids Res. 12: 4063-4069 (1984), (все из которых включены со ссылкой настоящее изобретение во всех целях). Дополнительные примеры включают:
Гемагглютинин вируса гриппа: НА307-319.
CS малярии: антигенная детерминаната Т3 EKKIAKMEKASSVFNV, (SEQ ID NO: 67).
Поверхностный антиген гепатита В: HBsAg19-28 FFLLTRILTI, (SEQ ID NO: 68).
Белок теплового шока 65: hsp65153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG, (SEQ ID NO: 69).
Бацилла Кальметта-Герена QVHFQPLPPAVVKL, (SEQ ID NO: 70).
Токсоид столбняка: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID NO: 71).
Токсоид столбняка: ТТ947-967 FNNFTVSFWLRVPKVS ASHLE, (SEQ ID NO: 72).
Вирус иммунодефицита человека HIV gp120 T1:
KQIINMWQEVGKAMYA, (SEQ ID NO: 73).
Токсоид столбняка: ТТ947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA.
Альтернативно, можно создавать конъюгат путем связывания средств по изобретению по меньшей мере с одним Т-клеточным эпитопом искусственного происхождения, способным к связыванию с большой пропорцией молекул II класса главного комплекса гистосовместимости МНС, например, с пан-DR-эпитопом ("PADRE"). Описание PADRE приведено в патенте США 5,736141, WO 95/07707 и в публикации Alexander J. Et al. , Immunity, 1:751-761 (1994) (каждая из которых включена в настоящее изобретение со ссылкой во всех целях). Предпочтительный пептид PADRE представляет собой AKX-VAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 74), (общие остатки выделены жирным шрифтом), в котором X предпочтительно является циклогексилаланином, тирозином или фенилаланином, при этом наиболее предпочтительным является циклогексилаланин.
Иммуногенные средства могут быть связаны с носителями посредством химических связей. Методики связывания иммуногена с носителем включают образование дисульфидных связей с использованием №сущинимидил-3-(2-тридил-тио)пропионата (SPDP) и сукцинимидил-4-^-малеимидометил)цик-логексан-1-карбоксилата (SMCC) (если в пептиде не хватает сульфгидрильной группы, ее можно обеспечить путем добавления остатка цистеина). Указанные средства создают дисульфидную связь между собой и остатком пептида цистеина в одном белке, и амидную связь посредством эпсилон-аминогруппы на лизине, или посредством другой свободной аминогруппы в других аминокислотах. Многие из таких ди-сульфидно/амино-образующих средств описаны в журнале Immun. Rev. 62, 185 (1982). Другие бифункциональные связывающие средства образуют не дисульфидную связь, а тиоэфир. Многие из таких тио-эфир-образующих средств являются коммерчески доступными и включают реактивные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-йодоуксусной кислоты, 4-(№малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы можно активизировать путем сочетания их с сукцинимидом или 1-гидроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислотой, натриевая соль.
Иммуногенность можно улучшить путем добавления спейсерных остатков (например, Gly-Gly) между Th (Т-хелперной) эпитопом и пептидным иммуногеном по изобретению. В дополнение к физическому отделению Th-эпитопа от В-клеточного эпитопа (то есть, иммуногенного пептида), глициновые остатки могут разрушать любые исксственные вторичные структуры, созданные посредством присоединения ^-эпикта к иммуногенному пептиду, и таким образом устранять интерференцию между Т-клеточными и/или В-клеточными ответами. Таким образом, конформационное разделение эпитопа адъюванта и домена активации антитела позволяет достичь более эффективного взаимодействия между представленным иммуногеном и подходящими ^-клетками и В-клетками.
Для усиления индукции Т-клеточного иммунитета к средству по настоящему изобретению у большего процентного количества субъектов с разными типами HLA можно изготовлять смесь конъюгата с разными ^-клеточными эпитопами. Смесь может содержать смесь по меньшей мере двух конъюгатов с разными ^-клеточными антигенными детерминантами, смесь по меньшей мере трех конъюгатов с разными ^-клеточными эпитопами, или смесь по меньшей мере четырех конъюгатов с разными Th-клеточными эпитопами. Смесь можно вводить с адъювантом.
Иммуногенные пептиды также могут представлять собой белки, слитые с носителями (то есть, ге-терологичными пептидами). Иммуногенный пептид может быть связан с амино-концом носителем, с карбокси-концом носителя, или с двумя указанными концами. Необязательно, в слитом белке могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида. Необязательно, иммуногенный пептид может быть связан с множественными копиями гетерологичного пептида, например, и на N-конце, и на С-конце пептида. Необязательно, множественные копии иммуногенного пептида могут быть связаны с множественными копиями гетерологичного пептида, которые связаны друг с другом. Некоторые пептиды носителя служат индуктором Т-клеточного ответа адъюванта на пептид-носитель. Активированные Т-клетки адъюванта в свою очередь вызывают В-клеточный ответ на иммуногенный пептид, связанный с носителем.
Ниже показаны некоторые примеры слитых белков, подходящих для использования в настоящем изобретении. Некоторые из этих слитых белков содержат сегменты АА, связанные с эпитопами токсоида столбняка, например, описанные в патентах США 5196512, ЕР 378881 и ЕР 427347. Некоторые слитые белки содержат сегменты АА, связанные по меньшей мере с одним пептидом PADRE, описанным в патенте США 5736142. Некоторые гетерологичные пептиды представляют собой разнородные Т-клеточные эпитопы, тогда как другие гетерологичные пептиды являются универсальными Т-клеточными эпитопа-ми. В некоторых способах средство, предназначенное для введения, является просто единственным слитым белком с сегментом АА, который связан с гетерологичным сегментом в линейной конфигурации. Терапевтические средства по настоящему изобретению могут быть представлены формулой. Например, в некоторых способах средство представляет собой мультимер слитых белков, представленный формулой 2х, в которой х является целым числом от 1 до 5. Предпочтительно, х равен 1, 2 или 3, при этом наиболее предпочтительно, что х равен 2. Если х равен двум, такой мультимер имеет четыре слитых белка, связанные в предпочтительной конфигурации, называемой МАР4 (см. патент США 5229490).
Ниже показана конфигурация МАР4, в которой получают разветвленные структуры посредством начала пептидного синтеза в аминах лизина и на N-конце и в боковой цепи. В зависимости от количества повторов лизин вставляют в аминокислотную последовательность и допускают ветвление, при этом получаемая структура будет представлять собой множественные N-концы. В этом примере четыре идентичных N-конца были получены на разветвленном лизин-содержащем ядре. Такая мультиплетность в значительной степени повышает реактивность аутоиммунных В-клеток. В приведенных ниже примерах Z относится к иммуногенному фрагменту АА, AL или фрагменту X1EDX2, и Z1-4 относится к иммуно-генному фрагменту (фрагментам) АА, AL или фрагменту X1EDX2. Фрагменты могут быть сходными друг с другом или разными.
- KGG
Z3 _
- KGG
Z4 '
Другие примеры слитых белков включают: Z-токсоид столбняка 830-844 в конфигурации МАР4:
Z-QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID NO: 71)
Z-токсоид столбняка 947-967 в конфигурации МАР4: Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (SEQ ID NO: 72) Z-токсоид столбняка 830-844 в конфигурации МАР4:
Z-QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID NO: 71)
Z-токсоид столбняка 830-844 + 947-967 в линейной конфигурации:
Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (SEQ ID NO: 75).
Пептиды PADRE (все в линейных конфигурациях), в которых X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, при этом наиболее предпочтительным Z является циклогексилаланин:
AKXVAAWTLKAAA-Z, (SEQ ID NO: 74).
Zx3 PADRE пептид:
Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA, (SEQ ID NO: 74).
Z - овальбумин 323-339 в линейной конфигурации:
Z-ISQAVHAAHAEINEAGR, (SEQ ID NO: 76).
Дополнительные примеры слитых белков включают:
AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z, (SEQ ID NO: 74). Z-AKXVAAWTLKAAA, (Z-(SEQ ID NO: 74). PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z, (SEQ ID NO: 77). Z-PKYVKQNTLKLAT-Z, (SEQ ID NO: 77). Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT, (SEQ ID NO: 77). Z-Z-PKYVKQNTLKLAT, (Z-Z-(SEQ ID NO: 77) Z-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- (SEQ ID NO: 78)
Z-Z-Z-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (SEQ ID NO: 79). Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z, (SEQ ID NO: 79).
QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z, (SEQ ID NO: 79)
Z-QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID NO: 71) на 2 разветвленных смолах: фрагменты могут быть одинаковыми или разными.
Z ---
Lys-Gly-Cys
Можно использовать те же самые или подобные белки-носители и способы связи для получения иммуногенов, которые предполагается применять для создания антител против АА или иммуногенного фрагмента АА, AL, или фрагмента X1EDX2. Например, для получения моноклональных антител к АА или к иммуногенным фрагментам АА, AL, или фрагменту X1EDX2 лабораторному животному можно вводить АА, или иммуногенные фрагменты АА, AL или фрагмент X1EDX2, связанные с носителем.
VIII. Кодирующие нуклеиновые кислоты как терапевтические средства.
Терапевтические средства по настоящему изобретению также включают нуклеиновые кислоты. Иммунные реакции на амилоидные депо также можно индуцировать путем введения нуклеиновых кислот, кодирующих сегменты АА-пептида и их фрагменты, других иммуногенных пептидов, таких как фрагменты X1EDX2, или антитела и цепи, составляющие эти антитела, такие как антитела 2А4, 8G9 и 7D8, применяемые для пассивной иммунизации. Такие средства для использования в способах по настоящему изобретению включают нуклеиновые кислоты, кодирующие АА-пептиды, которые при введении пациенту создают антитела, которые специфически связываются с одной или несколькими эпитопа
ми между остатками 70-76 из АА, AL, или нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, которые содержат фрагменты X1EDX2. Такие средства для использования в способах изобретения также включают нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, которые специфически связываются с С-концом неоэпи-топа АА или с X1EDX2. В частности, такие нуклеиновые кислоты кодируют антитела, которые специфически связываются с альфа-изоформой НАА1 в пределах остатков 70-76 (GHGAEDS (SEQ ID NO: 4), бета-изоформой НАА1 в пределах остатков 70-76 (GHDAEDS (SEQ ID NO: 5), гамма-изоформой НАА1 в пределах остатков 70-76 (GHDAEDS (SEQ ID NO: 5), альфа- и бета-изоформами НАА2 в пределах остатков 70-76 (GHGAEDS (SEQ ID NO: 4), НАА3 в пределах остатков 70-76 (GDHAEDS (SEQ ID NO: 7),
НАА4 в пределах остатков 78-84 (STVIEDS (SEQ ID NO: 8), с Мишиным АА1 (МАА1) в пределах остатков 69-75 (GRGHEDT (SEQ ID NO: 9), МАА2 в пределах остатков 69-75 (GRGHEDT (SEQ ID NO: 9), МАА3 в пределах остатков 62-68 (GHGAEDS (SEQ ID NO: 4), и МАА4 в пределах остатков 76-82 (NHGLETL (SEQ ID NO: 11). Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК. Дополнительные предпочтительные нуклеиновые кислоты кодируют антитела, которые специфически связываются с HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) или TEDE (SEQ ID NO: 16) или с другими пептидами X1EDX2, упомянутыми выше. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, обычно связан с регуляторными элементами, такими как про-моторное и энхансерное средство, которые позволяют экспрессировать сегмент ДНК в предполагаемых клетках-мишенях пациента. Поскольку для индукции имунного ответа желательна экспрессия в клетках крови, подходящими для прямой экспрессии являются промоторный и энхансерный участки из легких или тяжелых цепей генов иммуноглобулина, или основной промежуточный ранний промотор и энхансер CMV. Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируются в вектор. Для введения двухцепочечных антител эти две цепи можно клонировать в одни и те же или отдельные векторы. Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтических средства изобретения, могут также кодировать по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп. Раскрытия по настоящему изобретению, которые касаются применения адъювантов и применения носителей, mutatis mutandis применимы к их использованию с нуклеиновыми кислотами, кодирующими терапевтические средства по настоящему изобретению.
Доступны многие вирусные векторные системы, включающие ретровиральные системы (см., например, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); аденовирусные векторы (см., например, Bett et al, J. Virol. 67, 5911 (1993)); адено-ассоциированные вирусные векторы (см., например, Zhou et al, J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), вирусные векторы семейства оспы, включая вирус вакцинии и вирусы птичьей оспы, вирусные векторы рода альфа-вирусов, такие как полученные из вирусов Sindbis and Semliki Forest (см., например, Dubensky et al. , J. Virol. 70, 508-519 (1996)), вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (см. патент США 5643576) и рабдовирусы, такие как вирус везикулярного стоматита (см. патент WO 96/34625) и папилломавирусы (One et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al, WO 94/12629 и Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).
ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий указанную ДНК, можно упаковывать в ли-посомы. Подходящие липиды и родственные аналоги описаны в патентах США 5208036, 5264618, 5279833 и 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, могут также быть адсорбированными на макрочастицах-носителях или быть связанными с ними, примеры макрочастиц-носителей включают по-лиметилметакрилатные полимеры, и полилактиды и поли(лактид-ко-гликозиды), см., например, McGee et
al., J. Micro Encap. (1996).
Векторы для генной терапии или голую ДНК может доставлять in vivo путем введения их отдельным пациентам, обычно путем системного введения (например, внутривенным, внутрибрюшинным, назальным, гастральным, внутрикожным, внутримышечным, подкожным путем или внутричерепной инфу-зией) или путем местного применения (см. например, патент США 5399346). Такие векторы могут дополнительно включать вспомогательные вещества, такие как бупивацин (патент США 5593970). Можно также вводить ДНК с применением генной пушки. (См. Xiao & Brandsma, выше). ДНК, кодирующая им-муноген, преципитирована на поверхности микроскопических металлических шариков. Выстреливание микроинъекций происходит с помощью ударной волны или расширения газа гелия, и они проникают через ткани на глубину в несколько клеточных слоев. Например, подходящим является устройство для доставки Accel(tm) Gene Delivery Device производства компании Agacetus, Inc Middleton WI. Альтернативно, проникновение через кожу голой ДНК в кровеносное русло можно осуществлять просто точечным нанесением ДНК на кожу с помощью химического или механического раздражения (см. патент WO
95/05853).
В дополнительных вариантах векторы, кодирующие иммуногены, можно доставлять в клетки ex vivo, например, в клетки, эксплантированные у конкретного пациента (например, лимфоциты, аспириро-ванные клетки костного мозга, биоптаты тканей), или в гематопоэтические стволовые клетки универсального донора, с последующей реимплантацией пациенту, обычно после селекции клеток, в которые внедрили вектор.
IX. Адъюванты.
Иммуногенные вещества по настоящему изобретению, такие как пептиды, иногда вводят в комби
нации с адъювантом. Адъювант повышает титр индуцированных антител и/или связывающую аффинность индуцированных антител, по сравнению с показателями при использовании пептида единственным. Для активации иммунного ответа можно применять множество адъювантов в сочетании с иммуно-генным фрагментом АА. Предпочтительные адъюванты увеличивают исходную реакцию на иммуноген и не вызывают конформационных изменений иммуногена, что влияет на качественную форму реакции. Предпочтительные адъюванты включают гидроокись алюминия и фосфат алюминия, 3-де-О-ацилированный монофосфофорил-липид (MPL(tm)) (см. патент GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc, Гамильтон, Монтана, в настоящее время является часть Corixa), RC-529 (Corixa, Гамильтон, Монтана). Адъювант STIMULON(tm) QS-21 представляет собой тритерпеновый гликозид или сапонин, выделяемый из коры дерева Quillaja Saponaria Molina, произрастающего в Южной Америке (см. Kensil et al., в издании Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); патент США № 5057540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, Массачусетс). Другие адъюван-ты представляют собой эмульсии масло-в-воде (такие, как сквален или арахисовое масло), необязательно в сочетании с иммуностимуляторами, например, монофосфорил-липидом (см. Stoute et al, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), полимеры плуроника и инактивированные микобактерии. Другим адъювантом является CpG (патент WO 98/40100). Адъюванты можно вводить в качестве компонента терапевтической композиции с активным средством, или их можно вводить отдельно, перед введением терапевтического средства, одновременно, или после его введения.
Предпочтительный класс адъювантов представляет собой соли алюминия (квасцы), например, гидроокись алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Указанные адъюванты можно применять со специфичными иммуностимулирующими средствами, такими как монофосфорил-липид MPL или 3-де-О-ацилированный монофосфофорил-липид 3-DMP, QS-21, полимерные или мономерные аминокислоты, например, полиглутаминовая кислота или полилизин, или без указанных средств. Другим классом адъю-вантов являются рецептуры эмульсии масло-в-воде. Такие адъюванты можно использовать с другими специфичными иммуностимулирующими средствами, такими как мурамиловые пептиды (например, N-ацетилмурамил^-треонил^-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидрофосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), N-ацетилглюкозоаминил-N-ацетилмурамил-L-Al-D-изоглу-L-ала-дипальмитокси-пропиламид (DTP-DPP) THERAMIDE(tm)), или другие компоненты оболочки бактериальной клетки, или без вышеперечисленных средств. Эмульсии масло-в-воде включают (a) MF59 (патент WO 90/14837), содержащую 5% сквалена, 0,5% Твин-80 и 0,5% Span-85 (которая необязательно содержит варьирующее количество МТР-РЕ), которую помещают в субмикронные частицы, используя микро-флюидизатор, наприме, микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, содержащую 10% сквалена, 0,4% Твин-80, 5% плуроник блок-полимер L121 и thr-MDP, которые или микро-флюидизируют в субмикронную эмульсию, или интенсивно перемешивают для получения эмульсии с большим размером частиц, и (с) адъювантную систему RIBI(tm) (RAS), (Ribi ImmunoChem, Гамильтон, Монтана), содержащую 2% сквалена, 0,2% Твин-80, и один или больше компонентов оболочки бактериальной клетки из группы, состоящей из монофосфорил-липида A (MPL), димиколята трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (DETOX(tm)).
Другой класс предпочтительных адъювантов представляет собой сапониновые адъюванты, такие как STIMULON(tm) (QS-21, Aquila, Framingham, MA), или образованные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы) и ISCOMATRIX. Другие адъюванты включают RC-529, GM-CSF, полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA). Другие адъюванты включают цитокины, такие как интерлейкины (например, а- и Р-пептиды IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13 и IL-15), макрофаго-колониестимулирующий фактор M-CSF (MCSF), гранулоцито-макрофаго-колониести-мулирующий фактор (GM-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), хемокины, такие как MIP1 а- и Р-и RANTES. Другим классом адъювантов являются аналоги гликолипидов, включающие N-гликозиламиды, N-гликозилмочевины и N-гликозилкарбаматы, в сахарном остатке каждого из которых имеется замена на аминокислоту, в качестве иммуномодуляторов или адъювантов (см. патент США № 4855283). Также в качестве адъювантов можно использовать белки теплового шока, например, HSP70 и HSP90.
Адъювант можно вводить с иммуногеном в виде монолитной композиции, или его можно вводить перед введением иммуногена, параллельно или после его введения. Иммуноген и адъювант можно упаковывать и поставлять в одном флаконе, или их можно упаковывать в раздельных флаконах и смешивать перед применением. Иммуноген и адъювант обычно упаковывают с маркировкой, на которой указано предназначенное терапевтическое применение. Если иммуноген и адъювант упакованы отдельно, упаковка обычно включает инструкции по смешиванию перед применением. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от устойчивости иммуногенных рецептур, содержащих адъювант, от пути введения, схемы введения, эффективности адъюванта для вакцинируемых видов, и в отношении людей - фармацевтически приемлемым адъювантом является адъювант, получивший одобрение подходящих регулирующих органов для введения человеку или возможный для одобрения. Например, полный адъювант Фрейнда не подходит для введения человеку. Предпочтительными являются квасцы, MPL и QS-21. Необязательно,
можно одновременно применять два или больше разных адъювантов. Предпочтительные комбинации включают квасцы с MPL, квасцы с QS-21, MPL с QS-21, MPL или RC-529 с GM-CSF, и совместное введение квасцов, QS-21 и MPL. Также можно использовать неполный адъювант Фрейнда (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), необязательно в комбинации с чем-либо из квасцов, QS-21 и MPL и всех сочетаний из них. X. Пассивное введение антител.
Терапевтические средства по настоящему изобретению включают антитела, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, где X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р, А или любой другой аминокислотный остаток, непосредственно предшествующий ED в этом агрегированном амилоидном белке; и Х2 представляет собой Т, S, E, R, I, V, F, А или любой другой аминокислотный остаток, расположенный сразу после ED в этом агрегированном амилоидном белке, включающем эпитопы в амилоидных пептидах, таких как АА-пептиды. Антитела, применяемые для пассивного введения, могут быть антителами, которые связываются с эпитопами N-конца или С-конца АА. Другие амилоидные белки, в дополнение к сывороточному амилоидному белку А, включают сывороточный А-амилоидный белок, белок легкой цепи иммуноглобулина, такой как, например, VA6 Wil или Vk, человеческий островковый амилоидный полипептид-предшественник (IAPP), бета-амилоидный пептид, транстиретин (TTR) и ApoAl, а также другие, перечисленные в табл. 1 выше.
Пептид АА образуется путем протеолитического расщепления SAA. Предпочтительные антитела специфически связываются с неоэпитопами АА, которые образуются при протеолитическом расщеплении SAA. Предпочтительные антитела специфически связываются с С-концом неоэпитопа из АА, в частности, такие антитела специфически связываются с альфа-изоформой НАА1 в пределах остатков 70-76 (GHGAEDS SEQ ID NO:4), бета-изоформой НАА1 в пределах остатков 70-76 (GHDAEDS, SEQ ID NO:5), гамма-изоформой НАА1 в пределах остатков 70-76 (GHDAEDS, SEQ ID NO: 5), альфа- и бета-изоформами НАА2 в пределах остатков 70-76 (GHGAEDS, SEQ ID NO: 10), НАА3 в пределах остатков
70-76 (GDHAEDS, SEQ ID NO:7), НАА4 в пределах остатков 78-84 (STVIEDS, SEQ ID NO:8), с мышиным АА1 (МАА1) в пределах остатков 69-75 (GRGHEDT, SEQ ID NO:9), МАА2 в пределах остатков 6975 (GRGHEDT, SEQ ID NO: 9), МААЗ в пределах остатков 62-68 (GHGAEDS, SEQ ID NO: 10) и МАА4 в пределах остатков 76-82 (NHGLETL, SEQ ID NO: 11). Некоторые антитела связываются с эпитопом только в одном из указанных пептидов. Другие антитела связываются с эпитопами более чем в одном из указанных пептидов. Например, некоторые антитела специфически связываются с пептидом GHGAEDS (SEQ ID NO: 4) и пептидом GHDAEDS, SEQ ID NO: 5). Некоторые антитела связываются с пептидом GHGAEDS, SEQ ID NO: 4), и при этом не образуют специфическиго связывания с пептидом GHDAEDS, SEQ ID NO: 5). Связывание по меньшей мере с одним из человеческих АА-пептидов является предпочтительным. Связывание по меньшей мере с одним из человеческих АА-пептидов и с соответствующим мышиным пептидом представляется полезным, поскольку одно и то же антитело можно тестировать на мышиной модели и впоследствии применять у людей. Некоторые предпочтительные антитела специфически связываются с антигенными детерминантами в следующих остатках: остатки альфа-изоформы НАА1 71-76, 72-76, 73-76, 74-76, 70-75, 70-74, 70-73, 70-72, 71-75, 72-75, 73-75, 71-74, 71-73, 72-74, или остатки МАА1 70-75, 71-75, 72-75, 73-75, 69-74, 69-73, 69-72, 69-71, 70-74, 71-74, 72-74, 70-73, 70-72. Такие антитела обычно специфически связываются с амилоидными депо, но могут связываться или не связываться с растворимым АА. Если считается, что антитело специфически связывается с эпитопом в пределах указанных остатков, например, с остатками 70-76 альфа-изоформы НАА1, то подразумевается, что указанное антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим указанные остатки (то есть, остатки 70-76 из альфа-изоформы НАА1, в качестве примера). Такое антитело не обязательно контактирует с каждым остатком в пределах остатков 70-76 альфа-изоформы НАА1, не придает каждой отдельной замене или делеции аминокислоты в остатках 70-76 альфа-изоформы НАА1 обязательно значительного влияния на связывающую аффинность. Такие неоэпитопные антитела связываются с АА, но не с SAA. Можно определять эпитопную специфичность антитела, например, согласно описанию в патенте
WO 00/72880.
Антитела, используемые для пассивного введении, могут быть антителами к N-концевым эпитопам АА. Предпочтительные антитела специфически связываются с N-концевым неоэпитопом АА, в особенности, такие антитела специфически связываются с остатками НАА1 1-15 (RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID NO: 80), остатками НАА2 1-15 (RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID NO: 80), остатками НАА3 1-15 (QGWL TFLKAAGQGAK, SEQ ID NO: 81), остатками НАА4 1-15 (ESWRSFFKEA, (SEQ ID NO: 82), остатками МАА11-15 (GFFSFVHEAFQGAGD, SEQ ID NO: 83), остатками МАА2 1-15 (GFFSFVHEAFQGAGD, SEQ ID NO: 83), остатками МАА3 1-9 (EAGQGSRD, (SEQ ID NO: 84) и остатками 1-14 MAA4 (WYSFFREA VQGTWD, SEQ ID NO: 85). Некоторые антитела связываются только с эпитопом в пределах одного из этих пептидов. Другие антитела связываются с эпитопами более чем одного из этих пептидов. Например, некоторые антитела специфически связываются с пептидом RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID NO: 80) и пептидом QGWLTFLKAAGQGAK, SEQ ID NO: 81). Некоторые антитела связываются с пептидом RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID NO: 80), при этом не связываются специфически с пептидом QGWLT-FLKAAGQGAK, SEQ ID NO: 81). Связывание по меньшей мере с одним из человеческих АА-пептидов
является предпочтительным. Связывание по меньшей мере с одним из человеческих АА-пептидов и с соответствующим мышиным пептидом является полезным, поскольку одно и то же антитело можно тестировать на мышиной модели и впоследствии применять у людей.
Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом, состоящим из указанного X1EDX2. Предпочтительно, такие антитела специфически связываются с указанным эпитопом в агрегированном амилоидном белке. Некоторые из таких антител предпочтительно специфически связываются с агрегированным амилоидным белком относительно мономерной формы такого амилоидного белка. В некоторых антителах X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А и Х2 представляет собой Т, S, E, D, R, I, V, F или А. В некоторых таких антителах, если X1 является Н, то Х2 представляет собой Т или А; если X1 является А, то Х2 является S, Т, Е или V; если X1 является Т, то Х2 представляет собой Е; если X1 является F, то Х2 является D; если X1 является S, то Х2 является Е, F или А; и если X1 является Р, то Х2 представляет собой Е, I или F. В некоторых антителах X1 представляет собой Н, Т, F, S, Р или А и Х2 представляет собой Т, S, E, D, R, I, V, F или А, при условии, что если X1 представляет собой А, то Х2 не является V. В некоторых антителах, если X1 является А, то Х2 представляет собой S, Т или Е.
Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность GHEDT (SEQ ID NO 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), AEDV (SEQ ID NO: 23), SEDF (SEQ ID NO: 24) или SEDA (SEQ ID NO: 25).
Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (ID SEQ NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15), TEDE (SEQ ID NO: 16), FEDD (SEQ ID NO: 17), SEDE (SEQ ID NO: 18), AEDE (SEQ ID NO: 19), PEDE (SEQ ID NO: 20), PEDI (SEQ ID NO: 21), PEDF (SEQ ID NO: 22), SEDF (SEQ ID NO: 24) и SEDA (SEQ ID NO: 25). Некоторые антитела специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GHEDT (SEQ ID NO: 3), HEDT (SEQ ID NO: 12), AEDS (SEQ ID NO: 13), AEDT (SEQ ID NO: 14), HEDA (SEQ ID NO: 15) и TEDE (SEQ ID NO: 16).
Некоторые антитела индуцируют к пептиду, содержащему GHEDT (SEQ ID NO: 3), такие как, например, 2А4, 7D8 и 8G9, или их гуманизированные или химерные версии.
Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Поликлональные сыворотки обычно содержат смесь популяций антител, которые специфически связываются с несколькими эпитопами по всей длине АА. Вместе с тем, поликлональные сыворотки могут быть специфичными для конкретного сегмента АА, такого как остатки 70-76 в альфа-изоформе НАА1.
Предпочтительные антитела являются химерными или гуманизированными (см. Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) и патенты WO 90/07861, США 5693762, США 5693761, США 5585089, США 5530101 и патент Winter, США 5225539), или человеческими (Lonberg et al., WO 93/12227
(1993) ; патенты США 5877397, США 5874299, США 5814318, США 5789650, США 5770429, США 5661016, США 5633425, США 5625126, США 5569825, США 5545806, публикации Nature 148, 1547-1553
(1994) , Nature Biotechnology 14, 826 (1996), патент Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)). Альтернативный подход получения гуманизированного антитело, также известный как маскировка, описан в патенте США 6797492. В качестве исходных материалов для изготовления гуманизированных антител доступны несколько мышиных антител с разными характеристиками связывания.
Типичными гуманизированными антителами являются гуманизированное антитело версии 7D8 (инвентарный номер АТСС), гуманизированное антитело версии 7D29, гуманизированное антитело версии 7D19, гуманизированное антитело версии 7D47, гуманизированное антитело версии 7D39, гуманизированное антитело версии 7D66, гуманизированное антитело версии 8G9, гуманизированное антитело версии 8G3, гуманизированное антитело версии 8G4, гуманизированное антитело версии 8G51, гуманизированное антитело версии 8G22, гуманизированное антитело версии 8G30, гуманизированное антитело версии 8G4 6, гуманизированное антитело версии 2А4 (инвентарный номер АТСС), гуманизированное антитело версии 2А20, гуманизированное антитело версии 2А44, гуманизированное антитело версии 2А77, гуманизированное антитело версии 2А13, и гуманизированное антитело версии 2А14. Гибридомы, которые продуцируют антитело 7D8 (JH80 7D8.29.19.47) и антитело 2А4 (JH80 2А4.20.44077) были депонированы, соответственно, 4 сентября 2008 года и 17 декабря 2008 года в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной в настоящее время по адресу: 10801 University Boulevard, Ma-nassas, VA20110-2209, согласно условиям будапештского соглашения о международном признании депонирования микроорганизмов для цели процедуры выдачи патентов (будапештское соглашение). Согласно АТСС, гибридома, продуцирующая 7D8, имеет инвентарный номер АТСС___ , и гибридома, продуцирующая 2А4, имеет инвентарный номер АТСС___ .
Человеческий изотип IgG1 является предпочтительным для антител к С-концевой области АА, поскольку обладает наиболее высокой из человеческих изотипов аффинностью для рецептора FcRI на фагоцитарных клетках. Некоторые антитела специфически связываются с АА, со связывающей аффинностью больше или равной примерно 107, 108, 109 или 1010 М-1.
Активную иммунизацию фрагментами АА можно комбинировать с пассивным введением антител. Примеры специфичных комбинаций включают фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 7076 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 71-76 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 72-76 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 73-76 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 7476 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-75 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-74 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-73 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1 с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 7072 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 71-75 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 72-75 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 73-75 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 7375 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 71-74 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 71-73 альфа-изоформы НАА1; фрагменты АА, содержащие остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 72-74 альфа-изоформы НАА1. Дополнительно, фрагменты АА, содержащие остатки
альфа-изоформы НАА1: 71-76, 72-76, 73-76, 74-76, 70-75, 70-74, 70-73, 70-72, 71-75, 72-75, 73-75, 71-74,
71-73, 72-74, можно объединять с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков альфа-изоформы НАА1: 71-76, 72-76, 73-76, 74-76, 70-75, 70-74, 70-73, 70-72, 71-75, 72-75,
73-75, 71-74, 71-73, 72-74. Фрагменты АА, содержащую остатки 70-76 альфа-изоформы НАА1, остатки 70-76 бета-изоформы НАА1, остатки 70-76 гамма-изоформы НАА1, остатки 70-76 альфа- и бета-изоформ НАА2, остатки 69-75 МАА1, остатки 69-75 МАА2 или остатки 62-68 МАА3, можно объединять с антителами, которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 70-76 альфа-изоформы НАА1, остатков 70-76 бета-изоформы НАА1, остатков 70-76 гамма-изоформы НАА1, остатков 70-76 альфа- и бета-изоформ НАА2, остатков 69-75 МАА1, остатков 69-75 МАА2 или остатков 62-68 МАА3.
Некоторые из описанных выше антител не связываются специфически с мономерной формой или формой амилоидного белка-предшественника. Некоторые из таких антител специфически связываются с неоэпитопом, полученным при расщеплении белка-предшественника, в результате чего создается амилоидный белок.
Например, некоторые антитела специфически связываются с С-концевыми остатками мышиных АА-фибрилл, такими как HEDT, (SEQ ID NO: 12), но специфически не связываются с пептидом, который продолжается в неамилоидной части SAA (GHEDTMADQE, SEQ ID NO: 61). Некоторые антитела специфически связываются с конформационным эпитопом. Некоторые из таких конформационных эпито-пов являются линейными. Некоторые из таких конформационных эпитопов проявляются, если у амилоидного белка возникает агрегированная структура (например, фибриллярная), или он становится частично денатурированным. Примеры таких антител включают мышиные моноклональные антитела 2А4 (инвентарный номер АТСС___), 8G9 (инвентарный номер АТСС___ ) и 7D8 (инвентарный номер АТСС___), их человеческие, гуманизированные и химерные формы, другие антитела, которые специфически связываются с одним и тем же эпитопом, что и антитела 2А4, 8G9 или 7D8, и антигенсвязывающие фрагменты любых таких антител. Некоторые антитела специфически связываются с амилоидным белком, содержащим аминокислотные последовательности ED. Некоторые антитела специфически связываются с амилоидным белком, выбранным из группы, состоящей из белка легкой цепи иммуноглобулина, человеческого островкового амилоидного полипептида-предшественника (IAPP), бета-амилоидного пептида, трансти-ретина (TTR) и ApoAl.
Известно, что основная структурная единица антитела содержит тетрамер из субъединиц. Каждый тетрамер составлен из двух идентичных пар полипептидных цепей, и каждая пара имеет одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). Амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область примерно из 100-110 или больше аминокислот, отвечающих, главным образом, за
распознавание антигена. Карбокси-концевая часть каждой цепи определяет постоянную область, отвечающую главным образом за эффекторную функцию.
1. Антитела.
В объем по настоящему изобретению входят интактные антитела и антиген-связывающие фрагменты антитела, также пегилированные антитела и фрагменты антител, а также антитела с нарушенной (например, уменьшенной или элиминированной) эффекторной функцией, например, антитела, содержащие мутации или замещенные остатки в Fc области. Примеры иммунологически активных частей иммуног-лобулиновых молекул включают фрагменты F(ab) и F(ab')2 tri-Fab, Fab', Fv, scFv, di-Fab', которые можно создавать посредством ферментной обработки антитела, например, пепсином, или создавать с помощью признанных в данной области технологий рекомбинантной инженерии. Дополнительные антиген-связывающие фрагменты антител по изобретению включают фрагменты терапевтических антител, которые включают фрагменты пегилированных антител, такие как PEG-(пегилированные) Fab' и PEG-di-Fab'. Примеры мутантов с эффекторными функциями описаны в патенте США № 5624821, который включен полностью со ссылкой в настоящее изобретние. Некоторые антитела обладают уменьшенной связывающей аффинностью к RI-рецептору Fc-гамма. Мутантные антитела с эффекторной функцией включают антитела, содержащие мутации в шарнирной области. Некоторые мутантные антитела IgG содержат мутацию в постоянной области тяжелой цепи в одном или больше из положений 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322. В некоторых антителах имеются замены одного или нескольких из остатков 234, 236 и 237 на аланин. В некоторых антителах остаток 235 заменен на глутамин. В некоторых антителах остаток 297 заменен на аланин. В некоторых антителах остатки 318, 320 и 322 заменены на аланин. В некоторых антителах остаток 318 заменен на валин. В некоторых антителах остаток 322 заменен на глутамин. Антитела с усиленной эффекторной функцией включают антитела с единственной мутацией S239D и I332E и с двойной и тройной мутацией S239D/I332E и S239D/I332E/A330L (нумерация по Rabat).
2. Поликлональные антитела.
Поликлональные антитела можно изготовлять согласно описанию выше, путем иммунизации подходящего субъекта иммуногеном. Титр антител у иммунизированного субъекта можно контролировать в течение времени с помощью стандартных способов, например, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием иммобилизированного антигена-мишени.
Если желательно, молекулы антитела, направленные против антигена-мишени, можно выделять от млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищать общеизвестными способами, такими как сефарозная хроматография А-белка, чтобы получить фракцию антитела, например, IgG. В соответствующее после иммунизации время, например, когда титры анти-антигенного антитела являются наиболее высокими, от субъекта можно получать антитело-продуцирующие клетки и использовать их для изготовления моноклональных антител с помощью стандартных методик, таких как технология гибридом, описанная впервые авторами Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495-497) (см. также, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; и Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75). Об изготовлении химерных поликлональных антител см. Buechler et al., патент США № 6420113.
3. Моноклональные антитела.
Для получения моноклонального антитела можно применять любой из многих общеизвестных протоколов, используемых для слияния лимфоцитов и бессмерных клеточных линий (см., например, публикации G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., цитированные выше; Lerner, Yale J. Biol. Med., цитированная выше; Kenneth, Monoclonal Antibodies, цитированная выше). Кроме того, рядовой специалист в данной области сможет оценить, что существует ряд вариантов указанных способов, которые также могут быть полезными. Обычно бессмертную клеточную линию (например, клеточную линию миеломы), получают от тех видов млекопитающих, от которых получены лимфоциты. Например, мышиные гибридомы можно создавать путем слияния с бессмертной мышиной клеточной линией лимфоцитов мыши, иммунизированных иммуногенным препаратом по настоящему изобретению. Предпочтительными бессмертными клеточными линиями являются клеточные линии мышиной миеломы, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда HAT"). В качестве пары для слияния можно использовать любую из множества мие-ломных клеточных линий согласно стандартным способам, например, миеломные линий Р3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 или Sp2/0-Ag14. Указанные миеломные линии доступны в АТСС. Обычно НАТ-чувствительные клетки мышиной миеломы сливают с мышиными спленоцитами с использованием поли-этиленгликоля ("PEG"). Затем проводят селекцию полученных в результате слияния клеток гибридомы с использованием среды HAT, которая уничтожает неслитые и недостаточно слитые миеломные клетки (неслитые спленоциты умирают через несколько дней, так как они не подверглись трансформации). Детекцию гибридомных клеток, продуцирующих моноклональное антитело по изобретению, проводят путем скрининга супернатантов культуры гибридомы на антитела, которые связываются с антигеном-мишенью, например, АР, с помощью стандартного анализа ELISA.
4. Рекомбинантные антитела.
Альтернативой к изготовлению гибридом, секретирующих моноклональные антитела, можно иден
тифицировать и выделять моноклональное антитело путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов (например, библиотеки фаговых дисплеев антител) с антигеном-мишенью, чтобы таким образом выделить элементы в библиотеке иммуноглобулинов, которые связываются с антигеном-мишенью. Комплекты для создания и скрининга библиотек фаговых дисплеев коммерчески доступны (например, Рекомбинантная фаговая система антител (Recombinant Phage Antibody System) Pharmacia, № каталога 27-9400-01; и комплект фаговых дисплеев Stratagene SurfZAP(tm), № каталога 240612). Дополнительно, примеры способов и реактивов, особенно подходящих для использования в создании и скрининге библиотеки дисплеев антител, можно найти в следующих публикациях: например, Ladner et al. U.S. Patent No. 5223409; Kang et al. PCT International Publication No. WO 92/18619; Dower et al. PCT International Publication No. WO 91/17271; Winter et al. PCT International Publication WO 92/20791; Markland et al. PCT International Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. PCT International Publication WO 93/01288; McCafferty et al. PCT International Publication No. WO 92/01047; Garrard et al. PCT International Publication No. WO 92/09690; Ladner et al. PCT International Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 88:7978-7982; and McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.
5. Химерные и гуманизированные антитела.
Дополнительно, в объем по настоящему изобретению входят рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие и человеческие и нечеловеческие части, которые можно изготовлять с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК.
Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, которое включает по меньшей мере одну цепь гуманизированного иммуноглобулина или антитела (то есть, по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термины "цепь гуманизированного иммуноглобулина", или "цепь гуманизированного антитела" (то есть, "легкая цепь гуманизированного иммуноглобулина" или "тяжелая цепь гуманизированного иммуноглобулина") относится к цепи иммуноглобулина или антитела (то есть, соответственно, к легкой или тяжелой цепи), имеющей вариабельную область, которая включает вариабельный каркасный участок в основном от человеческого иммуноглобулина или антитела, и участки, определяющие комплементар-ность (CDR), (например, по меньшей мере один CDR, предпочтительно два CDR, более предпочтительно три CDR) в основном от нечеловеческого иммуноглобулина или антитела, и дополнительно включает постоянные области, (например, по меньшей мере одну постоянную область или ее часть, в случае легкой цепи, и три постоянные области в случае тяжелой цепи). Термин "гуманизированная вариабельная область" (например, "гуманизированная вариабельная область легкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи") относится к вариабельной области, которая включает вариабельный каркасный участок в основном от человеческого иммуноглобулина или антитела, и участок, определяющий комплементарность (CDR), в основном от нечеловеческого иммуноглобулина или антитела.
Выражение "в основном от человеческого иммуноглобулина или антитела" или "в основном человеческий" означает, что при выравнивании с человеческим иммуноглобулином или с аминокислотной последовательностью антитела в целях сравнения идентичность указанных участков составляет по меньшей мере 80-90%, 90-95%, или 95-99% (то есть, идентичность локальных последовательностей) с аминокислотной последовательностью человеческого каркасного участка или постоянного участка, что позволяет, например, осуществлять консервативные замены, замены консенсусных последовательностей, замены зародышевых линий, обратные мутации и тому подобное. Вставка консервативных замен, замен консенсусных последовательностей, замен зародышевых линий, обратных мутаций и тому подобного часто называют "оптимизацией" гуманизированного антитела или цепи. Выражение "в основном от нечеловеческого иммуноглобулина или антитела" или "в основном нечеловеческий" означает, что иммуноглобулин или аминокислотная последовательность антитела являются идентичными по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно на 96, 97, 98 или на 99% идентичными иммуноглобулину или аминокислотной последовательности антитела от организма нечеловеческого происхождения, например, от млекопитающего нечеловеческого происхождения.
Соответственно, все участки или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела, или цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, кроме CDR, в основном идентичны соответствующим участкам или остаткам одной или больше нативных последовательностей человеческого иммуноглобулина. Термин "соответствующий участок" или "соответствующий остаток" относится к участку или остатку во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая занимает одинаковое (то есть, эквивалентное) положение, что и участок или остаток в первой аминокислотной или нук-леотидой пследовательности, при оптимальном выравнивании первой и второй последовательности в целях сравнения.
Термин "по существу идентичны" означает что две полипептидные последовательности при опти
мальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием значений веса промежутков по умолчанию, имеют по меньшей мере на 50-60% идентичные последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 60-70% процентов идентичные последовательности, более предпочтительно по меньшей мере на 70-80% идентичные последовательности, более предпочтительно по меньшей мере на 80-90% идентичные последовательности, более предпочтительно по меньшей мере на 80-90% идентичные последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90-95% идентичные последовательности, и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичные последовательности, (например, идентичность последовательностей составляет 99% или выше). Термин "по существу идентичные" означает что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием значений веса промежутков по умолчанию, имеют по меньшей мере на 80-90% идентичные последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 90-95% идентичные последовательности, и более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичные последовательности, или больше (например, идентичность последовательностей составляет 99% или выше). Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как контрольная последовательность, с которой сравнивают тестовые последовательности. Используя алгоритм сравнения последовательностей, тестовые и контрольные последовательности вводят в компьютер, в случае необходимости задают координаты субпоследовательности и определяют параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Затем по алгоритму сравнения последовательности вычисляют процент идентичности последовательностей для тестовой последовательности (последовательностей) относительно контрольной последовательности, на основе заданных параметров программы.
Можно проводить оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Smith & Waterman, Adv.Appl.Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологии по Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью поиска по методике сходства по Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютерных программ выполнения указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison), или путем визуального наблюдения (см. в общем публикации Ausubel et al., выше). Одним из примеров алгоритмов, подходящим для определения процента идентичности последовательностей и процента сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан авторами Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализа BLAST является общедоступным в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (публично доступное на Интернет-сервере Национальных институтов здоровья NCBI). Обычно можно использовать параметры программы по умолчанию для проведения сравнения последовательностей, вместе с тем, можно также использовать задаваемые параметры. Программа BLASTP для аминокислотных последовательностей использует по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10, и
матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915 (1989)).
Предпочтительно, положения неидентичных остатков отличаются консервативными аминокислотными заменами. В целях классификации аминокислотных замен на консервативные или неконсервативные аминокислоты разделены на группы следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, метионин, аланин, валин, лейцин, изолейцин; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): цистеин, серии, треонин; группа III (кислые боковые цепи): аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; группа IV (основные боковые цепи) : аспарагин, глутамин, гистидин, лизин, аргинин; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): глицин, пролин; и группа VI (ароматические боковые цепи): триптофан, тирозин, фенилаланин. Консервативные замены охватывают замены между аминокислотами одной группы. Неконсервативные замены представляют собой обмен члена одной из указанных групп на член из другой группы.
Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связываются с антигеном с аффинностью, которая находится в диапазоне фактора трех, четырех или пяти от аффинности соответствующего негуманизированного антитела. Например, если негуманизированное антитело обладает связывающей аффинность 10-9 М, то гуманизированные антитела будут иметь связывающую аффинность по меньшей мере 3х10-8 М, 4х10-8 М, 5х10-8 М или 10-9 М. Описывая связывающие характиристики цепи иммуноглобулина или антитела, можно описать цепь на основании ее способности "направлять антигенное связывание" (например, АР). Считается, что цепь "направляет антигенное связывание" когда она придает интактному иммуноглобулину или антителу (или его антиген-связывающему фрагменту) свойства специфического связывания или связывающую аффинность. Считается, что мутация (например, обратная мутация), в значительной степени влияет на способность тяжелой или легкой цепи направлять связывание антигена, если она влияет (например, уменьшает), связывающую аффинность интактного иммуноглобулина или антитела (или его антиген-связывающего фрагмента), которые содержат указанную цепь по меньшей мере в порядке величины, по сравнению с показателями аффинности антитела (или его антиген-связывающего фрагмента), которые содержат эквивалентную цепь без указанной мутации. Мутация "по существу не влияет (например, уменьшает) на способность цепи направлять связыва
ние антигена", если она влияет (например, уменьшает) связывающую аффинность интактного иммуноглобулина или антитела (или его антиген-связывающего фрагмента), которые содержат указанную цепь, только с фактором два, три, или четыре от показателей антитела (или его антиген-связывающего фрагмента), которые содержат эквивалентную цепь без указанной мутации.
Термин "химерный иммуноглобулин" или антитело относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельные области которого происходят от первых видов, и чьи постоянные области происходят от вторых видов. Можно конструировать химерные иммуноглобулины или антитела из генных сегментов иммуноглобулина, принадлежащих разным видам, например, с помощью технологий генной инженерии. В понятия "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" не входят химерные иммуноглобулины или антитела, определение которых приведено ниже. По своей конструкции гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными (то есть, содержат области белков от более чем одного вида), но вместе с тем, они включают дополнительные признаки (то есть, вариабельные области, содержащие донорские остатки CDR и акцепторные каркасные остатки), которые не обнаруживаются в химерных иммуноглобулинах или антителах, определенных согласно изобретению.
Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать технологией ре-комбинантных ДНК, известной в данной области техники, например, используя способы, описанные в следующих публикациях: Robinson et al. International Application No. PCT/US86/02269; Akira, et al. European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et al. European Patent Application 173,494; Neuberger et al PCT International Publication No. WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent No. 4816567; Cabilly et al. European Patent Application 125023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al (1987) J. Immunol 139:3521-3526; Sun et al (1987) Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al (1987) Cane. Res. 47:999-1005; Wood et al (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al (1988) J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al (1986) BioTechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al (1988) Science 239:1534; and Beidler et al (1988) J. Immunol 141:4053-4060.
Терапевтические средства также включают миметики антител, такие как миметики области, определяющей комплементарность (CDR).
6. Человеческие антитела от трансгенных животных и фаговые дисплеи.
С другой стороны, в настоящее время возможно получение трансгенных животных (например, мышей), которые при иммунизации способны продуцировать полную гамму человеческих антител при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена тяжелой цепи соединяющего участка (JH) антитела в химерной и зародышевой линии мутантных мышей приводит к полному ингибированию эндогенной продукции антитела. Перенос матрицы гена зародышевой линии человеческого иммуноглобулина в такие зародышевые линии мутантных мышей приводит к продукции человеческих антител на антигенную провокацию. См., например, патенты США №№ 6150584; 6114598 и 5770429.
Полностью человеческие антитела также можно получать из библиотек фаговых дисплеев (Hoogen-boom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)). Химерные поликло-нальные антитела также могут быть получены из библиотек фаговых дисплеев (Buechler et al., патент
США № 6420113).
7. Биспецифичные антитела, слитые с антителом полипептиды и одноцепочечные антитела.
Биспецифичные антитела (BsAbs) являются антителами, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двуми разными эпитопами. Такие антитела можно получать из полноразмерных антител или из фрагментов антител (например, биспецифичные антитела F(ab)'2). Способы изготовления биспецифичных антител известны в данной области техники. Общепринятое получение полноразмерных биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар иммуноглобулиновых тяжелых цепей - легких цепей, при этом эти две цепи имеют разную специфичность (Millstein et al., Nature, 305:537539 (1983)). По причине рандомизированного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина указанные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь разных молекул антитела (см. патент WO 93/08829 и публикацию Traunecker et al, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).
Биспецифичные антитела также включают сшитые или "гетероконъюгированные" антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое с биотином или другим полезным элементом. Гетероконъюгированные антитела можно изготовлять с использованием любых приемлемых способов сшивания. Подходящие сшивающие средства известны в данной области техники и раскрыты в патенте США № 4676980, наряду с некоторыми способами сшивания.
В еще одном аспекте антитело может быть химически или генетически слитым с полезным элементом, таким как реагирующая, обнаружимая или функциональная группа, например, с иммунотоксином, чтобы получить слитый с антителом полипептид. Такие полезные элементы включают, например, имму-нотоксины, химиотерапевтические препараты и радиоизотопы, все из которых известны в данной области техники.
Одноцепочечные антитела также подходят для придания устойчивости согласно изобретению. Эти
фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) с помощью линкера, который позволяет каждой вариабельной области соединяться друг с другом и восстанавливает антиген-связывающий карман родительского антитела, из которого получены области VL и VH. См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Подразумевается, что любая из упомянутых полипептидных молекул, единственная или в сочетании, подходит для изготовления в качестве стабилизированных рецептур согласно изобретению.
XI. Субъекты, поддающиеся лечению.
В число субъектов или пациентов, поддающихся лечению, входят люди из группы риска заболевания, но не проявляющие симптомов, а также пациенты (больные), с выраженной текущей симптоматикой. Таким образом, способы по настоящему изобретению можно применять у всей популяции с профилактической целью, не нуждающейся в какой-либо оценке риска для субъекта - пациента. Способы по настоящему изобретению особенно полезны для людей с подтвержденным генетическим риском аутоиммунных патологий. В число таких людей входят люди, имеющие родственников с таким заболеванием и люди из группы риска, который подтвержден анализом генетических или биохимических маркеров.
Пациенты, страдающие амилоидозом АА-типа, могут не иметь симптомов в течение длительного периода времени. Поэтому постановка клинического диагноза амилоидоза АА-типа часто опаздывает или упущена до момента, пока амилоидные депо не распространяются в организме. Считается, что диагностированы только 53% случаев у пациентов с явной симптоматикой. См. L. Е. K. Consulting, Independent Market Research (2003).
Изобретение относится к способам, полезным для осуществления лечения или профилактики заболевания, характеризующегося депонированием амилоидного белка, например, такого, как вышеописанные заболевания, включающие перечисленные в табл. 1. Некоторые способы полезны для осуществления лечения или профилактики заболевания, характеризующегося депонированием амилоидного белка, содержащего аминокислотные последовательности ED. В некоторых способах, если амилоидный белок содержит аминокислотную последовательность AEDV, не вводят антитело для проведения лечения или профилактики болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного нарушения. Амилоидный белок может представлять собой любой из амилоидных белков, описанных выше, включая белки, перечисленные в табл. 1, например, такие, как сывороточный А-амилоидный белок, белок легкой цепи иммуноглобулина, такой как, VA6 Wil или Vk, человеческий островковый амилоидный полипептид-предшественник (IAPP), бета-амилоидный пептид, транстиретин (TTR) или ApoA1.
Настоящие способы особенно полезны для людей, которые имеют достоверный риск амилоидоза АА-типа или амилоидоза AL-типа, имеют предполагаемый или подтвержденный диагноз амилоидоза АА-типа или амилоидоза AL-типа. В число таких людей входят без ограничения люди, имеющие хронические воспалительные заболевания, наследственные воспалительные заболевания и хронические микробные инфекции, такие как ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатическая артропатия, синдром Рейтера, болезнь Стилла у взрослых, синдром Бехчета, болезнь Крона, семейная средиземноморская лихорадка, лепра, туберкулез, бронхоэктатическая болезнь, язвы при пролежнях, хронический пиелонефрит, остеомиелит, болезнь Уиппла, миелома, мак-роглобулинемия, иммуноцитарная дискразия, моноклональная гаммапатия, оккультная дискразия. Хронические воспалительные и инфекционные состояния являются предпосылкой к развитию амилоидоза АА-типа и амилоидоза AL-типа, с проявлением в виде локального нодулярного амилоидоза, который может быть связан с хроническими воспалительными заболеваниями. В число людей с достоверным риском амилоидоза АА-типа также входят без ограничения люди, страдающие злокачественными новообразованиями, такими как ходжкинская лимфома, почечная карцинома, карциномы кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточная карцинома и волосатоклеточный лейкоз. Дополнительно, в число людей с достоверным риском амилоидоза АА-типа также входят без ограничения люди, страдающие лимфопролиферативными нарушениями, например, болезнью Кастлемана.
Лечение больных без симптомов и с явной симптоматикой можно начинать в любое время перед диагностикой или после диагностики основного амилоидного заболевания АА-типа или AL-типа. Лечение обычно подразумевает множественное введение доз на протяжении времени. Лечение можно контролировать путем оценки реакций антител, активированных Т-клеток (побочный эффект) или В-клеток на терапевтическое средство (например, АА-пептид), или посредством сцинтиграфии с радиометкой SAP в течение времени. При снижении реакции показано применение бустерной дозы.
XII. Схемы лечения.
В общем, схемы лечения охватывают введение средства, который эффективно индуцирует иммуно-генный ответ на амилоидный белок, и предпочтительно, на агрегированную форму указанного амилоидного белка, например, АА- или AL-белка. Предпочтительно пациенту вводят иммуногенный фрагмент АА или AL или фрагмент X1EDX2. Для профилактических применений фармацевтические композиции или лекарства вводят пациенту, восприимчивому к возникновению амилоидоза, такому как амилоидоз АА-типа или амилоидоз AL-типа, или имеющему риск его возникновения, в количестве, достаточном для устранения или снижения риска, уменьшения тяжести болезни или отдаления времени начала болезни, включающего физиологические, биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы
болезни, ее осложнения и промежуточные патологические проявления в ходе развития болезни. Для терапевтических применений средство вводят пациенту с подозрением на наличие указанной болезни или уже страдающему такой болезнью, по схеме, содержащей достаточное количество и частоту введения средства для излечения, или, по меньшей мере, частичного сдерживания или торможение ухудшения симптомов болезни (физиологических, биохимических, гистологических и/или поведенческих), включающих их осложнения и промежуточные патологические проявления в ходе развития болезни. В некоторых способах введение средства приводит к уменьшению или устранению ранней симптоматики у пациентов с еще неразвившейся характерной патологией амилоидоза АА-типа или AL-типа. Количество, адекватное для осуществления терапевтического или профилактического лечения, называют терапевтически или профилактически эффективной дозой. Сочетание количества и частоты введения, адекватное для осуществления терапевтического или профилактического лечения, называют терапевтически- или профилактически эффективной схемой введения. В схемах как профилактических, так и терапевтических, обычно осуществляют введение средств в нескольких дозах, до достижения достаточной иммунной реакции. Дозу и частоту введения, адекватные для осуществления терапевтического или профилактического лечения, называют терапевтически- или профилактически эффективными схемами введения. Обычно проводят контроль иммунной реакции у пациента и вводят повторные дозы, если начинается уменьшение иммунной реакции. Иммунную реакцию можно контролировать с помощью обнаружения антител, например, к АА или AL, в крови пациента, или путем определения содержания, например, АА или AL.
Эффективные дозы средств и композиции по настоящему изобретению для лечения вышеописанных состояний варьируют в зависимости от ряда разных факторов, включающих способы введения, от локализации предназначенной для введения, физиологического состояния пациента, вида пациента - человек или животное), от введения других лекарств и вида лечения профилактическое или терапевтическое лечение. Обычно пациент является человеком, но лечению также могут подвергаться млекопитающие нечеловеческого происхождения, включающие трансгенных млекопитающих. Для оптимизации безопасности и эффективности необходимо титрование лечебных доз. Количество иммуногена зависит от сопутствующего введения адъюванта, если в отсутствии адъюванта необходимы более высокие дозы. Количество иммуногена для введения иногда варьирует от 1 до 500 мкг на одного пациента и чаще от 5 до 500 мкг на одну инъекцию для введения человеку. Иногда применяют более высокую дозу 1-2 мг на инъекцию. Обычно для каждой инъекции человеку применяют по меньшей мере 10, 20, 50 или 100 мкг. Количество иммуногена также зависит от количественного отношения иммуногенного эпитопа в имму-ногене к количеству иммуногена в целом. Обычно на 1 мкг иммуногена используют от 10-3 до 10-5 мкмоль иммуногенного эпитопа. Выбор частоты введения может варьировать в значительной степени от одного раза в день до одного раза в год, до одного раза в десять лет. В любой конкретный день введения дозы иммуногена указанная доза при сопутствующем введении адъюванта составляет более 1 мкг/на пациента, и обычно более 10 мкг/на пациента, и более 10 мкг/на пациента и обычно более 100 мкг/на пациента в отсутствии адъюванта. Обычная схема введения состоит из иммунизации с последующими бус-терными инъекциями с интервалами времени, например, с интервалами в 6 недель. Другая схема введения состоит из иммунизации, с последующими бустерными инъекциями через 1, 2 и 12 месяцев. Другая схема подразумевает инъекции каждые два месяца в течение жизни. Альтернативно, бустерные инъекции можно проводить нерегулярно, при показаниях на основе контроля иммунной реакции.
Дозы нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногены, варьируют в диапазоне от около 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг, или от 30 до 300 мкг ДНК на одного пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10 до 100 или больше вирионов на дозу.
Для пассивной иммунизации с антителом (при комбинированных способах лечения) диапазон дозы составляет от около 0,0001 до 100 мг/кг, от 0,5 до менее 5 мг/кг, и чаще от 0,01 до 5 мг/кг, от 0,5 до 3 мг/кг массы тела пациента. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела, или 10 мг/кг массы тела, или находиться в диапазоне от 1 до 10 мг/кг, или другими словами, составлять 70 мг или 700 мг, или, соответственно, быть в диапазоне от 70 до 700 мг для пациента массой 70 кг. Как дополнительный пример, дозы могут составлять менее 5 мг/кг массы тела, или 1,5 мг/кг массы тела, или находиться в диапазоне от 0,5 до 1,5 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1,5 мг/кг. Примерные схемы лечения подразумевают однократное введение каждые две недели, или введение один раз в месяц, или однократно каждые 3-6 месяцев. В некоторых способах два или больше моноклональных антител с разной специфичностью связывания вводят одновременно, если доза каждого вводимого антитела находитсятся в пределах указанных диапазонов. Обычно антитело вводят способом многократного введения. Интервалы между введением монолитных доз могут составлять неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, и показание для введения определяют путем измерения уровня антитела к АА в крови пациента. В некоторых способах дозу подбирают до достижения концентрации антитела в плазме от 1 до 1000 мкг/мл, и в некоторых способах от 25 до 300 мкг/мл. Альтернативно, антитело можно вводить в виде рецептуры с замедленным высвобождением, в этом случае необходимо менее частое введение. Дозы и частота введения варьируют в зависимости от периода полувыведения антитела у пациента. В целом, самым продолжительным периодом полувыведения обладают человеческие антитела, следом за
ними располагаются гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела нечеловеческого происхождения. Дозы и частота введения могут варьировать в зависимости от профилактического или терапевтического предназначения лечения. Для применения с профилактической целью относительно низкую дозу вводят с относительно большими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца жизни. Для применения с терапевтической целью иногда необходима относительно высокая дозировка с относительно короткими интервалами до уменьшения или прекращения прогресса заболевания, и предпочтительно, до тех пор, пока у пациента не выявляют частичного или полного улучшения симптоматики заболевания. После этого пациента можно переводить на профилактический режим.
Вещества для индукции иммунного ответа с целью профилактического и/или терапевтического лечения можно вводить парентерально, местно, внутривенно, перорально, подкожно, внутриартериально, внутричерепным путем, внутрибрюшинно, интраназально или внутримышечно. Наиболее общепринятым путем введения иммуногенного средства является подкожный, хотя другие пути введения могут быть одинаково эффективными. Следующим самым распространенным путем введения является внутримышечная инъекция. Указанный тип инъекции чаще всего выполняют в мышцы руки или ноги. В некоторых способах средства вводят непосредственно в конкретную ткань с образовавшимся депо, например, путем внутричерепной инъекции. Предпочтительным путем введения антитела является внутримышечная инъекция или внутривенное вливание (в комбинированных способах лечения). В некоторых способах конкретные терапевтические антитела вводят непосредственно в череп. В некоторых способах антитела вводят в виде рецептуры с замедленным высвобождением или с помощью устройства, например, устройства MEDIPAD(tm).
Вещества по изобретению часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активное терапевтическое средство, i.e., и ряд других фармацевтически приемлемых компонентов. См. издание Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Предпочтительная лекарственная форма зависит от предполагаемого пути введения и терапевтического применения. Композиции могут также включать, в зависимости от желательной рецептуры, фармацевтически приемлемые нетоксичные носители или разбавители, которые представляют собой носители, обычно используемые для создания рецептуры фармацевтических композиций для введения животным или людям. Выбирают разбавитель, не влияющий на биологическую активность комбинированного препарата. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический фосфатно-буферный раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хенкса. Дополительно, фармацевтическая композиция или рецептура может также включать другие носители, адъюванты, или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное.
Фармацевтические композиции могут также включать большие макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, например, хитозан, полимолочные кислоты, полигликоле-вые кислоты и сополимеры (такие как латексная функционализированная Сефароза(tm), агароза, целлюлоза и т. п.), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие как капельки масла или липосомы). Дополнительно, указанные носители могут действовать как иммуностимулирующие средства (то есть, адъюванты).
Для парентерального введения средства по изобретению можно вводить в виде доз растворов или суспензий для инъекций указанного вещества в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода-масло, солевой раствор, глицерин или этанол. Дополнительно, в композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства, сурфактанты, регуляторы уровня рН, буферные вещества и тому подобное. Другими компонентами фармацевтических композиций являются масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло и вазелиновое масло. В общем, предпочтительными жидкими носителями, в частности, в растворах для инъекций, являются гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэти-ленгликоль. Антитела можно вводить в виде инъекции с замедленным всасыванием или имплантируемого препарата, рецептура которого может предусматривать длительное высвобождение активного компонента. В качестве примера, композиция содержит моноклональное антитело в рецептуре 5 мг/мл в водном буфере, состоящем из 50 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, с уровнем рН 6,0, который регулируют HCl. Композиции для парентерального введения обычно являются по существу стерильными, изотоническими, и их производят при соблюдении условий GMP (надлежащей медицинской практики) Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств FDA или подобных органов.
Обычно композиции изготовляют в форме для инъекций, как в виде жидких растворов, так и суспензий; также можно изготовлять твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгированным или инкапсулированным в липосомах или микрочастицах, например, из полилактида, полигликолида или сополимера, для усиления адъювантного эффекта, как рассмотрено выше (см. Langer, Science 249, 1527 (1990) and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Вещества по настоящему изобретению можно вводить в форме инъекций замедленного всасывания или имплантируемого препарата, рецептура которых может
позволять длительное или пульсирующее высвобождение активного компонента.
Дополнительные рецептуры, подходящие для других способов введения, включают пероральные, интраназальные и легочные рецептуры, суппозитории и трансдермальное применение.
Связующие вещества и носители для суппозиториев включают, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно изготовлять из смесей с содержанием активного компонента в диапазоне от 0,5 до 10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные рецептуры включают наполнители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу и карбонат магния. Указанные композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, рецептур с постоянным высвобождением или порошков и содержат от 10 до 95% активного компонента, предпочтительно от 25 до 70%.
Местное применение может заключаться в трансдермальной или внутрикожной доставке. Местное применение можно облегчать с помощью совместного введения средства с холерным токсином или его детоксифицированными производными или субъединицами или с другими подобными бактериальными токсинами (См. Glenn et al. , Nature 391, 851 (1998)). Совместное введение может быть достигнуто при использовании компонентов в виде смеси или молекулярного связывания, полученного химическим сшиванием или экспрессией в виде слитого белка.
Альтернативно, можно осуществлять трансдермальную доставку, применяя кожный маршрут или используя трансферосомы ((Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).
XIII. Схемы лечения с комбинированной лекарственной терапией.
Комбинированную терапию согласно изобретению можно проводить как единственную, так и в сочетании с другим видом терапии, для лечения или профилактики амилоидоза АА-типа. Также комбинированная терапия согласно изобретению может проводиться в сочетании с другим видом терапии, с помощью которой осуществляют лечение или профилактику основной амилоидной болезни, например, воспалительных заболеваний, хронических микробных инфекций, злокачественных новообразований, наследственных воспалительных заболеваний и лимфопролиферативных патологий. Существует широкий диапазон доступных видов лечения по коммерческому использованию, по клинической оценке и в доклинических разработках, которые можно выбирать для использования с настоящим раскрытым изобретением для осуществления профилактики и лечения амилоидоза АА-типа с помощью комбинированной лекарственной терапии. Такие лекарственные средства могут представлять собой одно или несколько соединений, выбранных без ограничения из нескольких основных групп, а именно, (i) нестероидные противовоспалительные средства (НПВС; например, детопрофен, диклофенак, дифлунизал, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, меклофенамеат, мефенамовая кислота, мелоксикам, набумеон, натрия напроксен, оксапрозин, пироксикам, сулиндак, толметин, целекок-сиб, рофекоксиб, аспирин, холиновый эфир салициловой кислоты, салсалат и натриевый и магниевый эфиры салициловой кислоты); (ii) стероиды (например, кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метил-преднизолон, преднизолон, преднизон, триамцинолон); (iii) БПРП, то есть базовые противоревматические препараты, модифицирующие течение болезни (например, циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, лефлуномид, циклофосфамид, гидроксихлорокин, сульфазалазин, D-пеницилламин, миноциклин и препараты золота); или (iv) рекомбинантные белки (например, ENBREL(r) (этанесепт, растворимый рецептор TNF) и REMICADE(r) (инфликсимаб) химерное моноклональное анти-TNF антитело).
Продолжительность комбинированной терапии зависит от типа основного заболевания, которое лечат, от возраста и состояния пациента, стадии и типа болезни пациента и от реакции пациента на лечение. Врач может непосредственно наблюдать терапевтические эффекты и осуществлять любую необходимую регуляцию. Дополнительно, человек с более высоким риском развития амилоидоза АА-типа (например, человек с генетической предрасположенность или наличием в анамнезе воспалительного заболевания или других основных заболеваний), или амилоидоза AL-типа может получать профилактическое лечение для замедления или отдаления во времени развития AL и АА агрегатов, таких как фибриллы.
Можно осуществлять независимый контроль дозировки, частоты и способа введения каждого компонента комбинированной терапии. Например, одно соединение можно вводить перорально три раза в день, тогда как второе соединение можно вводить внутримышечно один раз в день. Комбинированную терапию можно проводить периодическими циклами, которые включают перерывы в лечении. Также соединения можно объединять в одной рецептуре, таким образом, что при одном введении доставляются оба соединения. Комбинированный препарат по изобретению также может быть предоставлен в виде компонентов фармацевтической упаковки. Лекарства могут находиться в рецептуре совместно или раздельно, и в индивидуальной по количеству дозировке. Каждое соединение смешивают с подходящим веществом носителя, и обычно оно присутствует в количестве от 1 до 95% веса от общего веса композиции.
Композиция может представлять собой лекарственную форму, которая подходит для перорального, парентерального (например, внутривенного, внутримышечного, подкожного), ректального, трансдер-мального, интраназального, влагалищного, ингаляционного или глазного введения. Таким образом, фор
мой композиции могут быть, например, таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, суспензии, эмульсии, растворы, гели, включающие гидрогели, пасты, мази, кремы, пластыри, примочки, устройства для доставки, суппозитории, клизмы, растворы для инъекций, импланты, спреи или аэрозоли. Фармацевтические композиции можно создавать согласно общепринятой фармацевтической практике (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa. и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. С. Boylan, 19881999, Marcel Dekker, N.Y.
XIV. Способы контроля или диагностики амилоидоза АА-типа или AL-типа.
Способы контроля или диагностики амилоидоза АА-типа или AL-типа включают измерение концентраций в плазме SAA и С-реактивного белка, проведение биопсии тканей (почечной, ректальной, желудочной, гингивальной, жировой, ткани слюнных желез, лабиальных желез) и гистологического анализа с окрашиванием Конго красным и/или иммуноокрашиванием со специфичными антителами против агрегатов АА или AL, таких как фибриллы. Изобретение относится к способам обнаружения ответа антитела на пептид АА у пациента, страдающего амилоидозом АА-типа или восприимчивого к нему. Способы особенно полезны для контроля проводимого у пациента курса лечения. Указанные способы можно применять для контроля как терапевтического лечения пациентов с выраженной симптоматикой, так и профилактического лечения у бессимптомных пациентов. Некоторые способы подразумевают определение исходных показателей ответа антитела у пациента перед введением дозы иммуногенного средства, и сравнение их с показателями иммунного ответа после лечения. Значительное увеличение показателей ответа антитела (то есть, больше чем обычные границы экспериментальной ошибки в повторных измерениях одного и того же образца, выраженной в виде одного стандартного отклонения от средних значений таких измерений), сигнализирует о положительном результате лечения (а именно, что введение средства вызывает иммунный ответ или усиливает его). Если происходит незначительное изменение или уменьшение показателей ответа антитела, это указывает на отрицательный результат лечения. В общем, у пациентов, проходящих начальный курс лечения иммуногенным средством, предполагается увеличение ответа антитела при последовательном введении доз, который в конечном счете достигает плато. Обычно продолжают вводить средство при нарастании ответа антитела. Достижение плато является индикатором возможного прекращения или уменьшения дозы или частоты введения препарата.
В других способах контрольные значения (то есть, среднее значение и стандартное отклонение) ответа антитела определены для контрольной популяции. Обычно люди из контрольной популяции не получают предшествующего лечения. Затем проводят сравнение контрольного значения и измеренных показателей ответа антитела у пациента после введения терапевтического средства. Значительное увеличение относительно контрольного значения (например, более чем на одно стандартное отклонение от среднего значения) говорит о положительном результате лечения. Отсутствие значительного повышения или уменьшение показателей ответа антитела указывает на отрицательный результат лечения. Введение средства обычно продолжают при нарастании ответа относительно котрольных значений. Как указано выше, достижение плато относительно контрольных значений является индикатором возможного прекращения или уменьшения дозы или частоты введения препарата.
В других способах контрольные значения ответа антитела (например, среднее значение и стандартное отклонение) определяют в контрольной популяции людей, которые подвергались введению терапевтического средства, и у которых реакция на лечение в виде ответа антитела достигла плато. Измеренные значения ответа антитела у пациента сравнивают с контрольными значениями. Если имеется незначительное отличие от контрольных показателей, измеренных у пациента (например, больше чем на одно стандартное отклонение), лечение может быть прекращено. Если показатели пациента значительно ниже контрольных значений, гарантировано длительное введение средства. Если показатели пациента остаются ниже контрольных значений, это может быть показанием для изменения режима лечения, например, для применения другого адъюванта, фрагмента или для переключения на пассивное введение.
В других способах для определения необходимости возобновления лечения проводят контроль у пациента, не проходящего текущего лечения, который при этом прошел курс лечения раньше. Показатели ответа антитела, измеренные у пациента, можно сравнивать с показателями ответа антитела, которые пациент показывал после предыдущего курса лечения. Значительное уменьшение относительно предыдущих показателей (то есть, больше чем обычная граница погрешностей при повторных измерениях одного и того же образца) служит показанием для возможного возобновления лечения. Альтернативно, измеренные у пациента показатели можно сравнивать с контрольными значениями (среднее значение плюс стандартное отклонение), которые определяют в популяции пациентов после прохождения курса лечения. Альтернативно, показатели, измеренные у пациентов, можно сравнивать с контрольными значениями в популяциях пациентов после профилактического лечения, у которых отсутствуют симптомы болезни, или в популяциях пациентов после терапевтического лечения, у которых выявлено улучшение патологических показателей. Во всех этих случаях значительное уменьшение относительно контрольного уровня (то есть, больше чем на одно стандартное отклонение) является показанием для возобновления лечения пациента.
В некоторых способах применяется сцинтиграфия с меченным йодом-123 или йодом-125 сыворо
123 125 123
точным Р-амилоидным компонентом (123I-SAP или 125I-SAP). Пациентам внутривенно вводят 123I-SAP или 125I-SAP и проводят визуализацию с помощью гамма-камеры. Радиосцинтиграфия с SAP представляет собой полезный способ контроля развития амилоидоза у пациентов и оценки их лечения. Он специфичен для амилоида и может применяться для количественного контроля локализации и количества амилоидных депо у пациентов. У здоровых субъектов или у пациентов, не страдающих амилоидозом, не происходит накопление 123I-SAP и 125I-SAP. Радиосцинтиграфию с SAP можно применять для контроля динамики метаболизма в амилоиде, и с ее помощью можно оценивать эффективность лечения, направленного на регресс амилоидных депо. Дополнительно, радиосцинтиграфия с SAP является неинвазивным способом и позволяет полностью сканировать тело.
Способы изобретения подразумевают определение исходных показателей ответа антитела у пациента перед введением дозы средства, и сравнение их с показателями иммунного ответа после лечения пациента. Значительное увеличение показателей ответа антитела (то есть, больше чем обычные границы экспериментальной ошибки в повторных измерениях одного и того же образца, выраженной в виде одного стандартного отклонения от средних значений таких измерений), сигнализирует о положительном результате лечения (а именно, что введение средства приводит к возникновению иммунного ответа или к его усилению). Если происходит незначительное изменение или уменьшение показателей ответа антитела, это указывает на отрицательный результат лечения. В общем, у пациентов, проходящих начальный курс лечения иммуногенным средством, предполагается увеличение ответа антитела при последовательном введении доз, который в конечном счете достигает плато. Введение средства обычно продолжают при нарастании ответа антитела. Достижение плато является индикатором возможного прекращения или уменьшения дозы или частоты введения препарата.
Образцом ткани для анализа обычно является кровь, плазма, сыворотка, слизистая или спинномозговая жидкость от пациента. Образец анализируют для определения имунного ответа на любую форму пептида AL или АА. Иммунный ответ можно определить по присутствию антител, которые специфически связываются с пептидом AL или АА. Антитела могут быть обнаружены в анализе связывания с ли-гандом, который специфически связывается с антителами. Обычно лиганд вляется иммобилизирован-ным.
Связывание можно обнаруживать с использованием меченого антиидиотипического антитела.
В комбинированных схемах, использующих и активное и пассивное введение, можно применять аналогичные подходы для контроля уровня антитела, создаваемого пассивной иммунизацией.
Также можно применять способы диагностики амилоидоза, которые подразумевают, например, введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связан с обнаружимой меткой, при котором антитело или его фрагмент специфически связываются с эпитопом, включающим X1EDX2 в агрегированном амилоидном белке, при этом X1 и Х2 представляют собой любые аминокислоты, и обнаружение присутствия или отсутствия связанного антитела или его фрагмента. Обнаружение связанного антитела или фрагмента поддерживает диагноз амилоидоза. Полезные для диагностики ами-лоидоза антитела и фрагменты включают антитела, раскрытые в настоящем изобретении.
Диагностические антитела или фрагменты по настоящему изобретению можно вводить, например, путем внутривенной инъекции в тело пациента, или непосредственно в мозг путем внутричерепной инъекции. Дозу антитела легко определит специалист в данной области техники. Обычно антитело несет метку, хотя в некоторых способах присутствует немеченое антитело, и для связывания с этим антителом используют второе меченое средство. Выбор метки зависит от способов обнаружения. Например, для оптического обнаружения подходит флуоресцентная метка. Использование парамагнитных меток подходит для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Можно применять радиометки, включаяющие 211At, 212Bi, 67Cu, 125I, 131I, inIn, 32P, 212Pb, 186Re, 188Re, 153Sm, 99mTc или 90Y. Такие метки можно обнаруживать с помощью позитронно-эмиссионной томографии PET или мультифункцио-нальной томографической системы SPECT или других подходящих технологий.
Диагноз можно устанавливать также путем сравнения количества, размера, и/или интенсивности меченых участков, с соответствующими исходными значениями. Исходные значения могут отражать средние показатели в популяции не больных людей. Исходные значения также могут отражать предыдущие показатели, полученные у этого же пациента. Например, у пациента можно определять исходные значения и затем проводить сравнение измеренных значений с исходными значениями. Увеличение значений относительно исходных показателей подтверждает диагноз амилоидоза АА-типа.
Диагностические способы по изобретению можно применять для диагностики амилоидозного заболевания, включающего амилоидоз АА-типа, амилоидоз AL-типа, болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение, амилоидную полинейропатию, средиземноморскую лихорадку, синдром Макла-Уэллса, реактивный системный амилоидоз, связанный с системными воспалительными болезнями, ами-лоидоз, связанный с миеломой или макроглобулинемией, амилоидоз, связанный с иммуноцитарной дис-кразией, моноклональной гаммопатией, оккультной дискразией, или локальный нодулярный амилоидоз, связанный с хроническими воспалительными болезнями.
XV. Животные модели амилоидоза АА-типа.
Амилоидоз АА-типа можно экспериментально вызывать у мышей с выраженным повышением кон
центрации SAA посредством инъекции нитрата серебра, казеина или липополисахарида. Указанные средства активируют выработку цитокинов. См. See Skinner et al. Lab Invest. 36:420-427 (1997) and Kis-ilevsky et al. Bailliere 's Clin. Immunol. Immunopathol. 8(3) 613-626 (1994). В течение 2 или 3 недель после стимуляции воспаления у животных развиваются системные депо АА, сходные с депо, которые выявляют у больных с амилоидозом АА-типа. Эта латентная фаза значительно сокращается, если мышам вводят сопутствующую внутривенную инъекцию белка из экстракта мышиной селезенки или печени, несущей АА-амилоид. См. Axelrad et al. Lab Invest. 47(2): 139-46 (1982). Действие таких препаратов, ускоряющих амилоидогенное развитие, назвали "фактором усиления амилоидоза" (AEF). Авторы Lundmark et al. сообщает, что действующим началом AEF однозначно является сама АА-фибрилла. Дополнительно, они показали, что этот материал обладает чрезвычайно мощным действием, будучи активным в дозах менее 1 нг, и сохраняет свою биологическую активность на протяжении значительного периода времени. Примечательно, что AEF также эффективен при пероральном введении. Авторы пришли к заключению, что АА и возможно другие формы амилоидоза относятся к трансмиссивным болезням, сходным с прионсвязан-ными патологиями. См. Lundmark et al. Proc. Nat. Acad. Scl 99: 6979-6984 (2002).
Амилоидов АА-типа также можно индуцировать у трансгенных линий мышей, несущих ген человеческого интерлейкина-6 при контроле с энхансером металлотионеин-I, в результате чего заметно возрастает концентрация SAA, и к 3-месячному возрасту развивается амилоидоз в селезенке, печени и почках. К моменту смерти в возрасте около 8-9 месяцев в органах таких трансгенных мышей обнаруживали обширные амилоидные депо. См. Solomon et al., Am. J. Pathol. 154 (4) :1267-1272 (1999).
Модель трансгенного быстро индуцируемого амилоидного заболевания (TRIAD) у трансгенных мышей является усовершенствованной вышеупомянутой трансгенной мышиной моделью. Мыши TRIAD несут ген человеческого интерлейкина-6 при контроле промотора гистосовместимости H-2LD. Введение AEF мышам TRIAD в возрасте 8 недель приводит к развитию выраженных АА-амилоидных депо в селезенке и печени в течение 3-4 недель. Впоследствии указанный процесс распространяется на другие органы, и через 4-6 недель приводит к смерти. Развитие системного амилоидоза происходит быстрее по сравнению с описанной выше моделью трансгенных мышей. См. Публикации University of Tennessee Research Corporation, WO 01/77167, Фрамакопея, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 Wall et al. Amyloid 12(3): 149-156 (2005) (каждая из которых включена во всех целях по настоящему изобретению со ссылкой).
В биомедицинских исследованиях широко задействован мелкий примат Нового Света из Бразилии -обыкновенная игрунка (Callithreix jacchus). Авторы Ludlage et al. сообщают, что у обыкновенной игрунки обнаруживали амилоидные депо в одном или больше органах, включающих печень, надпочечники, почки и кишечник. Авторы установили, что у этого примата развитие амилоидоза АА-типа может быть обусловлено наследственными факторами. В этой связи, обыкновенная игрунка может служить уникальной экспериментальной моделью для исследования патогенеза и терапии АА-амилоидоза и других системных амилоидных заболеваний. См. Ludlage et al. Vet Pathol 42: 117-124 (2005).
Порода собак шарпей несет аминокислотную последовательность АА с мотивом -AEDS и является особенно восприимчивой к АА-амилоидозу. Она представляет собой природную модель системного АА-амилоидоза, позволяющую оценивать новые диагностические и терапевтические применения АА амилоид-специфичных антител и других соединений.
Примеры
Пример 1. Фрагменты АА.
Пептиды, соответствующие аминокислотам 71-75 -GHEDT, как описано Yamamoto и Migita Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2915-2919, были синтезированы компанией AnaSpec, San Jose, Калифорния, США. Были индуцированы поликлональные антитела (Pab) АА и выделена фракция иммуноглобулина, как ранее описано авторами Bard, F. Et al., (2000) Nat. Med. 6, 916-919.
Пример II. Иммуноген для изготовления мышиных антител.
Использовали эпитоп GHEDT, (SEQ ID NO: 3) с CG-линкером на N-конце. Пептид EPRB-39, содержащий указанный эпитоп, соединяли в паре с овечьим анти-мышиным антителом. Пептид EPRB-39 был получен в компании Anasec, Сан-Хосе, Калифорния. Очевидно, что полученные антитела являются специфичными к неоэпитопу, поскольку они не связываются специфически с пептидом, который охватывает области GHEDTIADQE, (SEQ ID NO: 89).
Пример III. Методика иммунизации.
Мышам A/J в возрасте шести недель внутрибрюшинно вводили 50 мкг EPRB-39/овечьего антимышиного IgG с полным адъювантом Фрейнда (CFA), с последующим введением неполного адъюванта Фрейнда (IFA) один раз в две недели, проведя в общей сложности три инъекции. За три дня до слияния в хвостовую вену вводили 50 мкг EPRB-39 овечьего анти-мышиного (SAM) IgG в 90 мкл фосфатно-буферного раствора (ФБР). Титр, оцененный в анализе ELISA, составлял 1/10000 при высоком исходном уровне.
Номером слияния для EPRB-39 является JH80. Ниже приведен список клонов и клонов предельных разведений, которые являются активными:
7D8.29.19.47*,39,66 IgG2bk
8G9.3.4.51.22*, 30,46 IgG2b к
2A4.20.44.77*, 13, 14 IgG2b к
7D47, 8G9 и 2А77 определены как предпочтительные субклоны. Очевидно, что полученные антитела являются специфичными к неоэпитопу, поскольку они не реагируют с пептидом, который охватывает С-концевой сайт расщепления SAA.
Пример IV. Связывание антитела с агрегированным и растворимым АА.
Определение сывороточных титров (по серийным разведениям) и моноклональное связывание антитела с агрегированным АА выполняли посредством анализа ELISA, как ранее описано авторами Schenk D. Et al., (1999) Nature 400, 173-177. Растворимый АА относится к фибриллам АА, разрушенным ультразвуком в диметилсульфоксиде. Серийные разведения антитела инкубировали с 125ЬАА с числом импульсов в минуту 50000 cpm в течение ночи при комнатной температуре. 50 мкл жидкого раствора, содержащего 75 мг/мл белка А-сефарозу (Amersham Biosciences, Uppsala, Швеция) /200 мкг антимышиного кроличьего IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Пенсильвания, США) инкубировали с разведенными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, дважды промывали и производили подсчет в гамма-счетчике Wallac (PerkinElmer Life Science, Grove, Иллинойс, США). Все этапы выполняли в буфере для радиоиммунологического анализа, состоящего из 10 мМ Трис, 0,5 М NaCl, 1 мг/мл желатина и 0,5% Nonidet P-40, уровень рН 8,0.
Пример V. Анализ структуры VA6 Wil.
Последовательности экспрессируемых генов зародышевой линии легких цепей человеческих Vk и VA иммуноглобулина показаны в фигурах 21 и 22. За исключением подгрупп kla, Ala, A3 а и A3 с, в них имеется остаток Glu-Asp, и указанная пара находится в положениях 81 и 82 во всех Vk и VA генных последовательностях зародышевой линии (фигуры 21 и 22). Дополнительно, вторая зародышевая линия, кодируемая парой Glu-Asp в положениях 50 и 51, является уникальной для гена VA6 зародышевой линии. Таким образом, VA6 Wil содержит пары Glu-Asp и в 50-51 и в 81-82. Обе боковые цепи остатков 50 и 51 доступны на поверхности VA6 Wil, по данным рентгенкристаллографии (фиг. 24). Напротив, только боковая цепь Glu81 выступает на поверхность, и боковая цепь Asp82 частично заглублена и, очевидно, взаимодействует (или посредством электростатических взаимодействий или Н-связи) с боковыми цепями
Lys79 и Arg61 (фиг. 25).
На основе этих исследований рентгеновской кристаллической структуры, учитывая относительную доступность боковых цепей Glu-Asp, авторы по настоящему изобретению пришли к заключению, что заглубленные Glu81 становятся доступным, поскольку домен принимает агрегированную (например, фибриллярную) структуру (или становится частично денатурированным), таким образом открывается криптическая антигенная детерминанта, скрытая в других случаях.
Пример VI. Анализ связывания анти-АА моноклональных антител с VA6.
А. Поверхностный плазмонный резонанс.
Для определения кинетики связывания нескольких моноклональных антител с фибриллами и мономером VA6 Wil применяли поверхностный плазмонный резонанс. При концентрации 6,6 нМ все 3 антитела связывались с иммобилизированными синтетическим VA6 Wil фибриллами с KD около 1 нМ, и указанное значение сопоставимо со значением их реактивности с мышиными АА-фибриллами (фиг. 26). Отклонение (выраженное в единицах RU) во время фазы связывания было сходным со значением для mAb 7D8 и 2А4, но на 50% ниже, чем для 8G9. В этой связи предполагается, что плотность указанного антитела на фибриллах была ниже, чем у 2 других средств, поскольку расчетные показатели аффинности были одинаковыми для всех 3 антител. MAb IgGl служило контролем и не проявляло связывания с фибриллами VA6 Wil.
Титрование mAb 7D8 в диапазоне от 6,6 нМ до 33,3 нМ вызывало ожидаемое уменьшение максимального отклонения, связанного с kon (фиг. 27). В общем, кинетика связывания была сходной при каждой концентрации, хотя в этих пилотных экспериментах значение KD для 7D8 при 26,6 нМ действительно отличались от значений, полученных при других концентрациях.
Для оценки специфичности реакции и гарантии, что связывание mAb с фибриллами происходит посредством классического взаимодействия F(ab)-антиген (в противоположность Fc-опосредованному связыванию или неспецифической адсорбции), данные о связывании были получены в присутствии имму-ногенного пептида (р39) в концентрации 20 и 1 мкг/мл (фиг. 8). Пептид р41, который не связывается с mAb 7D8 при низких концентрациях, служил контролем. В присутствии 20 мкг/мл пептида р41, кинетика связывания mAb 7D8 с фибриллами VA6 Wil была идентичной 7D8 единственному. Напротив, иммуно-генный пептид р39 при 1 мкг/мл вызывал больше, чем 2-кратное уменьшение степени связывания, что оценивали по отклонению измеренного сигнала (фиг. 28). Ингибирование связывания с фибриллами 7D8 почти полностью подавлялось при использовании 20 мкг/мл пептида р39. Эти данные указывают, что mAb 7D8 связывается с фибриллами посредством F(ab) области молекулы, поскольку это взаимодействие может быть полностью подавляться иммуногенным пептидом.
С помощью биосенсора BIAcore исследовали реактивность mAb 7D8 с мономером VA6, иммобили-зированном на чипе. Антитело не реагировало с мономерным белком. Эти данные указывают, что анти-ген-связывающий участок, распознаваемый mAb 7D8, присутствует на фибриллах, но не на растворимом белке-предшественнике, подразумевая, что антиген имеет конформационную или криптическую структуру.
B. Иммуногистохимия.
Иммуногистохимический анализ выполняли следующим образом: срезы толщиной 6 мкм, отрезанные от фиксированных в формалине и залитых в парафин блоков, подвергали антигенной демаскировке путем инкубации с CitraPlus (BioGenex, San Ramon, Калифорния) в течение 30 мин при 90°С. Ткани подвергали иммуноокрашиванию раствором 3 мкг/мл mAb 2A4, 7D8 или 8G9. Контролем являлось IgG2a mAb TY11. Конъюгированное с HRPO лошадиное антимышиное Ig антитело (ImmPRESS Universal Reagent, Vector Labs, Burlingame, Калифорния) использовали в качестве вторичного реактива. Слайды обрабатывали 3,3'-диаминобензидином (Vector Labs) и исследовали с помощью микроскопа Leica DM500. Взаимодействие моноклональных антител с депо амилоидных тканей ALk и ALA также изучали с использованием иммуногистохимических иследований. Как показано в фиг. 29, амилоидные депо в щитовидной железе пациента, которые состояли из Х2 фрагментов, подвергались иммуноокрашиванию с помощью 7D8, 2А4 и 8G9. Области реактивности коррелировали с амилоидными депо, обозначенными зелено-золотым двойным лучепреломлением, которое видно на срезе ткани, окрашенном Конго красным. Самая впечатляющая реактивность была достигнута с mAb 7D8 и 2А4 mAb, тогда как 8G9, при положительных результатах, проявляло намного более слабую реакцию. Эти качественные показатели хорошо соотносятся с анализами BIAcore, в которых отмечено меньшее связывание 8G9 с фибриллами VA6 Wil, чем показывали другие 2 реактива (фиг. 26). Изотип соответствовал mAb TY11, который служил контролем и не проявлял амилоидной иммунореактивности.
Аминокислотная последовательность этого белка A2 (SEQ ID NO: 86) (показанная ниже) содержит зародышевую линию, которую кодируют остатки Glu и Asp в положении 81 и 82, соответственно.
1 ii 21 2":d 35
SSWISFrS V5Git?RGTvA I5C533SSJiI ^OOIPSSa?
4S SS 6t 12- Si
VrfLZTZVblL P*IGYS3S55Ђ. ZAIRGiaSSls SGDYYCAASD
Изучение депо AL-к-амилоидной ткани показало положительную реактивность 2А4, и в меньшей степени 7D8 и 8G9. Было вновь выявлено соответствие между иммуноокрашиванием и двойным лучепреломлением, амилоидные участки окрашивались Конго красным. Реактивность mAb TY11 отсуствова-ла.
C. Радиовизуализация амилоидомы AL-типа с использованием 7D8, меченого 125I. Экспериментальная модель амилоидомы AL-типа in vivo использовали для изучения возможности
визуализации человеческого AL-амилоида с радиометкой mAb 7D8. Эффективность радиомеченого 7D8, определяемая электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия SDS-PAGE, показала, что указанная метка 125I включена в обе цепи и IgH и IgL, и достоверно не выявлено полос, связанных с фрагментацией или аггрегацией. Визуализация с помощью SPECT/CT мышей, несущих индуцированную AL-амилоидома, показала, что меченое 125I антитело локализовано в индуцированной, расположенной в области спины амилоидной массе, о чем свидетельствует накопление радиомеченых антител в амилоиде, по сравнению с тканями без амилоидного поражения (например, печень, сердце, селезенка и почки). Постороннее mAb IgG с радиометкой не накапливалось в амилодной массе; вместе с тем, обнаружен свободный радиоактивный йодид, который накапливался в щитовидной железе, что говорит о катаболизме и дегалогенировании IgG антитела. Распределение меченого mAb 125I-7D8 у мышей, несущих амилоидому, определяли количественно, путем измерения активности, связанной с амилоидной массой, по сравнению с показателями из печени, селезенки, почки, желудка, сердца и легкого. Эти данные подтверждали анализом с визуализацией SPECT/CT. Через 72 ч после инъекции (в этот момент времени производили забор ткани и получали изображения), амилоидома содержала около 8% ID, что примерно в 4 раза превышает уровень, отмеченный в печени (в которой локализуется катаболизм mAb), и в сердце, где предполагается высокая остаточная активность кровяного пула. Активность, определяемая в легком, была обусловлена способом эвтаназии (данные не показаны).
Для подтверждения данных биораспределения производили забор тканей амилоидомы, а также печени, селезенки, сердца и почек, и срезы тканей были подготовлены к авторадиографическому анализу. Радиоактивное мечение проводили следующим образом: антитело 7D8 метили 125I 2 в дозе mCi, не содержащим редуктант (Perkin Elmer), с использованием ограничивающего количества хлорамина Т, и суспендировали в ФБР, содержащем 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА/ФБР). Несвязанный изотоп и белковые агрегаты удаляли с помощью эсклюзионной жидкостной хроматографии на колонке Ultrogel AcA34 (Amersham Pharmacia). Для экспериментов визуализации собирали фракции, содержащие
мономер IgG. Радиохимический выход составлял около 50%, обеспечивая специфичную активность около 25 ixCi/мкг. Меченое 125I mAb подвергали SDS-PAGE (10% гели) в присутствии или отсутствии редуцирующего средства и анализировали с помощью устройства Циклон для фосфор-визуализации. Согласно изображениям SPECT и измерениям биораспределения, авторадиограммы подтвердили значительное накопление 125I -7D8 в амилоидоме по сравнению с печенью. Не было выявлено какого-либо захвата радиомеченого антитела 125I-7D8 в любых других органах (кроме ожидаемой активности в печени, связанной с катаболизмом антитела). Хотя mAb 7D8 имело относительно равномерное распределение в общей амилоидной массе, наблюдалась слегка более высокая плотность в периферических зонах на границе амилоид-живот. Отсутствовал захват радиомеченого контрольного IgG в каких-либо органах. D. Выводы и заключение.
С помощью поверхностного плазмонного резонанса, иммуногистохимии и радиовизуализации in vivo установлено, что АА-реактивные антитела 2А4, 7D8 и 8G9 связываются с амилоидом AL-типа, и фибриллами (Kd около 1 нМ) происходящими из легкой цепи иммуноглобулина. Вероятно, указанное взаимодействие происходит в глубоко консервативных Glu-Asp аминокислотах в положениях 81 и 82, соответственно, образующих криптический линейный эпитоп, который становится выступающим только при вставке амилоидогенной легкой цепи в фибриллы.
Пример VII. Анализ ELISA, демонстрирующий связывание антитела с пептидами X1EDX2.
Анализ BIAcore проводили для оценки связывания антител 2А4, 7D8 и 8G4 на пептидах разных последовательностей. Как показано ниже в табл. 4, было выявлено, что антитела реагировали с пептидами, имеющими аминокислотную последовательность X1EDX2. Интересно, что антитела не реагировали с пептидами, имеющими дополнительные С-концевые остатки. Потому предполагается, что антитела специфически связываются с неоэпитопом, образованным расщеплением SAA, чтобы создать свободный С-конец. Однако, как показано в примере V, свободный конец не является необходимым для связывания этих антител с VA6 Wil, а скорее происходит конформация доменов X1EDX2 с их адаптацией для связи с антителами, когда они принимают агрегированную (например, фибриллярную) структуру (или становятся частично денатурированными), таким образом открывается криптическая антигенная детерминанта, скрытая в других случаях.
Пример VIII. Иммуногистохимический анализ мышиного АА.
В иммуногистохимическом анализе подтверждали реактивность супернатантов от гибридом, экс-прессирующих антитела 2А4, 8G9 и 7D8, к мышиным АА-амилоидным депо в селезёнке и печени (основные локализации накопления амилоида). Для этих исследований срезы тканей от мышей TRIAD с обширным амилоидом АА-типа в печени и селезенке (о чем свидетельствует зеленое двойное лучепреломление в депо, окрашиваемых Конго красным) окрашивали содержащим mAb супернатантами. Все 3 антитела связывались с амилоидом печени и селезёнки. Напротив, отсутствовала какая-либо реактивность с культурой супернатантов, полученых из посторонних гибридом. Используя 2А4, 8G9 и 7D8, тестировали возможность иммуноокрашивания амилоида в свежих (нефиксированной), залитых в соединение ОСТ (с оптимальной температурой резания) срезах мышиной печени и селезенки. Доказано, что антитела mAb сохраняют свою способность связывать АА амилоид в синусах печени. Дополнительно, облегчалась интерпретация реактивности антитела в ткани селезёнки, и перифолликулярный амилоид подвергался интенсивному иммуноокрашиванию. Чтобы показать специфичность связывания mAb с АА амилоидом, супернатанты mAb в разведении 1:25 предварительно инкубировали с 50 мкг/мл или пептида #39 (р#39) или #41 (р#41) в течение 1 ч при комнатной температуре. На фиксированной формалином ткани в качестве субстрата пептид р#39 (50 мкг/мл) значительно подавлял амилоидную реактивность обеих mAb, и 2А4 и 7D8 (результаты 8G9 находятся на рассмотрении). Напротив, пептид р#41 не показал эффективности. Сопоставимые результаты были получены на свежих тканях.
Пример IX. Иммуногистохимический анализ человеческого АА.
Сравнение аминокислотной последовательности мышиного и человеческого SAA из положений 7376 показало 2 идентичных остатка, консервативную замену Ser на Thr и неконсервативную замену Ala на His. Для тестирования возможности перекрестной реакции mAb 2A4, 8G9 и 7D8 с человеческими АА-амилоидными депо авторы проверили их реактивность к несущим АА-амилоид человеческим почке, надпочечнику, яичнику и печени. Во всех случаях супернатанты mAb проявляли иммуноокрашивание амилоидных депо. В ткани яичников пептид р#39 эффективно блокировал связывание антител mAb с периваскулярным АА-амилоидом, тогда как пептид р#41 не подавлял эту реакцию.
Пример X. Взаимодействие анти-АА из культуры супернатантов с АА-фибриллами мышиного происхождения.
Взаимодействие mAb 2A4, 8G9 и 7D8 с АА-амилоидом вначале тестировали в анализе ELISA, и данные, представленные в фигуре 31, анализировали с использованием программы SigmaPlot (SPSS Inc). Каждая точка отражает среднее значение ± стандартная ошибка SE (n=3). Супернатантную культуру посторонней гибридомы использовали в качестве контроля (Ctrl Culture Sup). Выявили чрезвычайно низкое отношение шум-сигнал, и результаты показали, что содержание mAb в первом сборе культуры был больше по сравнению со вторым сбором, о чем свидетельствует более сильный сигнал поглощения относительно супернатантного контроля. (Дополнительно, иммуногистохимическая реактивность в материале от 1 дня была выше, чем в образце от 2 дня). При более высоких значениях SE из этих данных очевидно, что связывающая аффинность 2А4, 8G9 и 7D8 была почти эквивалентной, при отсутствии реактивности в разведениях примерно после 1:64. По показателям связывания также предполагается, что емкость, то есть, количество связей mAb, варьирует при соотношении 7D8> 8G9> 2А4; вместе с тем, приведенные данные не корректировались по концентрации mAb, и такая тенденция в последующих исследованиях не наблюдалась. По причине низкого сигнала и высокой вариабельности, выявленной в культуре суперна-тантов, и для более точного определения относительной связывающей аффинности антител mAb для мышиных и человеческих АА-амилоидных фибрилл (а также для получения материала с целью изучения биораспределения in vivo), было необходимо выделить mAb с помощью А-белковой аффинной хроматографии. Чистоту выделенных mAb устанавливали в SDS-PAGE, используя 10% акриламидные гели при редуцирующих и нередуцирующих условиях (фиг. 32). Образцы из полос 1-4 обрабатывали меркапто-этанолом, полосы 5-9 были без обработки. Гель окрашивали красителем Кумасси синим: mAb 8G9, полосы 1 и 6; mAb 2A4, полосы 2 и 7; mAb 7D8, полосы 3 и 8; SP2/0 супернатантный контроль, полосы 4 и 9; пусто, полоса 5. Маркерами белка Mr (Std) являлись, сверху вниз: 176, 119, 75, 49, 39, 25 и 19 кДа. Взаимодействие очищенных mAb с иммунизирующим пептидом р#39, контрольным пептидом (р#41), мышиными и человеческими экстрактами АА были определены в анализе ELISA, как описано выше. Полученные данные анализировали путем подбора сигмоидальной кривой, используя программное обеспечение SigmaPlot и показатели концентрации mAb в растворе 50% насыщенности (ЕС50) (табл. 5).
Таблица 5. Значения ЕС50 для связывания очищенного mAb
Субстрат
mAb
Человеческий АА
Мышиный АА (AEF)
Пептид 3 9
Пептид 41
8G9
31,7 нМ
5, 64 нМ
4, 0 нМ
"100 нМ
2А4
26,4 нМ
4,09 нМ
3,4 нМ
"100 нМ
7D8
13,3 нМ
1,84 нМ
2,3 нМ
"100 нМ
Взаимодействие 3 mAb с пептидом р#39 показало насыщаемое связывание при значениях ЕС50 в низком наномолярном диапазоне (см. выше табл. 5). Напротив, даже при самой высокой используемой концентрации mAb (100 нМ) обнаруживали небольшое связывание с пептидом р#41 (фиг. 33 - каждая точка показывает среднее значение ±SE, (n=3 для каждой концентрации)). Эти данные подтверждают иммуногистохимические результаты, описанные выше, то есть, что пептид р#39 способен полностью блокировать связывание mAb с тканями, несущими АА-амилоид. Расчетные значения ЕС50 для связывания каждого mAb с пептидом р#39 были в высокой степени идентичны, поскольку в одном случае экстракт мышиного АА-амилоида использовали в качестве субстрата (фигура 34 - каждая точка показывает среднее значение ±SE (n=3 для каждой концентрации)). Расчетные значения ЕС50 для mAb, связывающегося с экстрактом мышиного АА, были чрезвычайно идентичны значениям, полученным при использовании в качестве субстрата пептида р#39 (фиг. 34; табл. 5). Напротив, если экстракт человеческого АА-амилоида высушивали на лунках микропланшета, значения ЕС50 были ниже от 5 до 7 раз, чем значения, выявленные для мышиного АА и пептида р#39 (фиг. 35 - каждая точка показывает среднее значение ± SE (n=3 для каждой концентрации); табл. 5). Значение ЕС50 для связывания mAb 7D8 было самым низким из указанных 3 тестированных антител, и авторы по настоящему изобретению выбрали указанный реактив для совместной локализации in vivo и анализах визуализации. На значения ЕС50 влияли 2 аминокислотные замены в человеческой последовательности SAA относительно мышиного белка. Не будучи связанными с конкретной теорией, авторы изобретения объясняют более высокие значения ЕС50 для человеческого АА более плохой "пригодностью" боковых цепей аминокислоты в антиген-связывающем сайте, вместе с тем, этот эффект соответствует только 5-кратному уменьшению относительной аффинности при поверхностной адсорбции амилоидных экстрактов, как в анализе ELISA. Кроме того, приведенные данные подтверждают наблюдение, что все 3 mAb связываются как с мышиной, так и с человеческой тканью АА-амилоидных депо.
Пример XI. Конкурентное связывание антител mab с мышиным и человеческим АА-амилоидом.
Чтобы определить эффект, при его наличии, потенциальной денатурации при поверхностной адсорбции на микротитровальной лунке, оценивали реактивность 2А4, 8G9 и 7D4, используя конкурентный анализ ELISA, в котором использовали экстракт мышиного или человеческого АА-амилоида в качестве растворимого конкурента для взаимодействия с антителами mAb с поверхностным экстрактом АА. Во всех случаях растворимые (неадсорбированные) амилоидные фибриллы АА и человеческого и мышиного происхождения были способны к конкуренции за 3 mAb, указывая на то, что антигенная детерминанта, распознаваемая реактивами, не зависит от частичной денатурации, которая происходит в результате поверхностной адсорбции. В общем, экстракт мышиного АА (AEF) являлся лучшим конкурентом, чем человеческий АА (табл. 6).
* Человеческий АА-амилоид в растворе, конкурирующий с адсорбированным мышиным АА (AEF);
** Мышиный АА (AEF) в растворе, конкурирующий с адсорбированным человеческим АА-амилоидным экстрактом на планшете.
Значения IC50 (концентрация АА (по весу), при которых на 50% уменьшалось связывание mAb), для мышиного AEF в растворе составляли около 20 мкг/мл, тогда как для человеческого АА значения были от 6 до 44 раз выше (напротив, значения ЕС50 для человеческого АА были только в 7 раз ниже, чем значения ЕС50 для мышиного АА). Это может говорить о том, что антигенная детерминанта на амилоидных фибриллах в растворе является менее доступной в препаратах человеческого АА по сравнению с мышиным АА. Как предполагалось, самая высокая концентрация АА-амилоида для достижения конкуренции потребовалась для mAb 7D8, которое показывало самую высокую относительную аффинность к человеческим и мышиным фибриллам АА, если они были адсорбированы на поверхности.
Пример XII. Радиомеченное mAb 7D8.
Эффективность радиомечения 7D8 определяли с помощью SDS-PAGE. Анализировали редуцированное и нативное mAb, белки визуализировали с использованием устройства для фосфор-визуализации. И цепи IgH и цепи IgL включали метки I125, и достоверно отсутствовали полосы, связанные с фрагментацией или аггрегацией.
Пример XIII. Визуализация АА-амилоида с использованием 125Гмеченого 7D8.
Для ислледования in vivo локализации радиомеченного mAb 7D8 использовали три группы мышей: трансгенные IL-6; индуцированные AgNO3/AEF, и контрольные без амилоида (WT). Визуализация с помощью SPECT/CT показала, что mAb 125I-7D8 находились в АА-амилоидных депо мышей в селезенке и печени, о чем свидетельствует накопление радиомеченных mAb в этих тканях, относительно контрольных мышей, у которых отмечена только низкая активность кровяного пула в печени и свободный йодид
в щитовидной железе. В отличие от этих мышей, захват свободного йодида обнаружен в щитовидной железе у мышей после введения AgNO3, некоторая активность в печени, но основная зона связывания 125I-7D8 выявлена в месте подкожной инъекции AgNO3 (нижняя правая часть спины). Активность в этой зоне четко контурирована рентген-поглощающим раствором серебра, что обнаруживают с помощью компьютерной томографии КТ. Показано, что у мышей TRIAD антитело mAb 7D8 связывается с АА-амилоидными депо и в печени и в селезенке в присутствии циркулирующего SAA, что подтверждается визуализацией SPECT.
A. Биораспределение 125I-7D8 у мышей.
Через 48 ч после инъекции 125I-7D8 обнаруживали радиоактивность в кровяном пуле, которая обусловлена относительно высоким захватом в легких (которые заполняются кровью при умерщвлении мышей). Необходимо отметить, что накопление mAb в печени и селезёнке у мышей IL-6 указывает на присутствие амилоида. Отображения SPECT/CT подтвердили распределение mAb в этих органах. Через 72 ч после инъекции значения кровяного пула слегка изменились, о чем свидетельствует неизменившаяся активность в сердце и легких по сравнению с мышами, которых умерщвляли через 48 ч, из-за относительно долгого периода полувыведения T1/2b10 этого mAb (около 60 ч). Отмечено значительное накопление радиомеченного mAb у мышей IL-6, которое коррелирует с полученными изображениями SPECT, демонстрирующими выраженный захват в селезёнке и, в меньшей степени, в печени. Из других органов самым важным была печень (которая является зоной катаболизма IgG и источником sAA во время острофазового ответа). У мышей линии WT без воспалительной или амилоидной индукции в печени содержалось <6% ID/г, что сопоставимо с почкой и сердцем, где сигнал почти исключительно обусловлен кровяным пулом.
B. Авторадиографические и гистохимические исследования.
Чтобы определить, является ли увеличенное накопление 125I-7D8 в печени у мышей IL-6 и мышей AgNO3 результатом захвата амилоида, проводили авторадиографический анализ печени, а также других тканей, на катаболическое удаление или связывание с вновь синтезированным sAA. На основе визуализации с помощью SPECT и измерений биораспределения предполагается, что наибольшее количество амилоида у трансгенных мышей IL-6 находится в печени и селезенке. Эта гипотеза была подтверждена окрашиванием срезов Конго красным, в которых наблюдали значительное количество амилоида во всей красной пульпе, а также в периваскулярных зонах и синусах печени. Дополнительно, менее заметные двупреломляющие депо присутствовали в почках и сердце. Распределение 125I-7D8 в этих тканях хорошо коррелировало с окрашиванием Конго красным и АА-реактивным материалом. Отсутствовало какое-либо накопление в гепатоцитах, в которых не было амилоида.
По данным биораспределения у мышей после введения AgNO3 выявлен больший захват 125I-7D8 в печени, чем в селезенке, что было неожиданным, так как печень не является нормальной структурой накопления АА у таких животных. Окрашивание Конго красным показало небольшое количество амилоида в единственной перифолликулярной области селезенки (верхний правый угол), и обширные периваску-лярные депо в печени, и оба этих факта подтверждены авторадиографически. Дополнительно, в отображениях SPECT на участке подкожной инъекции AgNO3 выявлена значительная концентрация 125I-7D8 (авторы также наблюдали этот факт при использовании меченого радиоактивным йодом SAP (сывороточного Р-амилоидного компонента) в качестве средства визуализации). В этом участке отсутствует амилоид (то есть, материал с двойным лучепреломлением Конго красного); однако, он подвергался имму-ноокрашиванию с помощью анти-АА mAb. Без связи с конкретной теорией, возможно, что mAb 7D8 локализуется в участках воспаления или "предамилоидных" участках (а также в зрелых амилоидных депо). В отличие от внушительного накопления 7D8 в органах мышей IL-6, в тканях контрольных мышей был выявлен слабый след или отсутствие следа в любом органе, кроме кровяного пула. В срезах любого органа этих контрольных мышей при окрашивании Конго красным амилоид не был обнаружен.
C. Фармакокинетика 125I-7D8.
После инъекции радиомеченного антитела 7D8 определяли скорость исчезновения молекулы и периоды полувыведения T1/2bio, полученные данные приведены в табл. 7. Определено, что T1/2bio у 7D8 составлял около 60 ч, что сопоставимо с T4bio IgG2b мышиного mAb (примечание: 7D8 происходит из подкласса IgG2b). Незначительно более быстрое выведение 125I-7D8 у мышей IL-6 (TRIAD) было несущественным. По этим данным, на скорость экскреции не влияет удержание mAb в амилоидной ткани более чем на 72 ч, о чем свидетельствуют данные SPECT.
Таблица 7. Анализ полу выведения 125I-7D у мышей
Мыши
"(S.E,|
hiibio
11 'Л eff
1Е1Г48Ч
ПГ95П
JL-6, 72ч
175.2 (3.99)
0.012(8.9)
0.97
57.7 ч
AgNO;. 45ч
181.0(1.99)
0.0106 (4.9)
0.99
65.3 ч
61.1
AgNCb. 72ч
174.1 (2.97)
0.0112(5.8)
0.98
62.2 ч
Ctrl, 48ч
185.1 (3.19)
0.0108 (7.6)
0.98
64.3 ч
61.3
Ctrl, 72ч
185.1 (3.09)
0.0109(5.6)
0.98
63.7 ч
1. Способ идентификации средств для профилактики или лечения амилоидоза, в котором используют трансгенных мышей или мышей TRIAD.
Методики изготовления средств описаны авторами Schenk et al. Nature 400:173-177. Средства эмульгировали в соотношении 1:1 (объем/объем) с полным адъювантом Фрейнда для первой иммунизации трансгенных мышей, с последующим усилением полным адъювантом Фрейнда через 2 недели и ежемесячно после этого. Инъекции ФБР проводили по той же схеме, и для контроля мышам вводили смесь 1:1 ФБР/адъюванта. Сравнивали продолжительность жизни трансгенных мышей, чтобы определить эффективность средств для профилактики амилоидоза АА-типа посредством увеличения срока жизни животного.
2. Гистопатология.
Для световой и поляризующей микроскопии готовили срезы ткани толщиной от 4 до 6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ) и свежеприготовленным щелочным раствором Конго красного, соответственно. Для электронной микроскопии образцы помещали в смолу Epon (Ted Pella, Redding, Калифорния), готовили срезы и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе JEOL IOOS. См. Ludlage et al. Vet. Pathol 42: 117-124 (2005).
3. Иммуногистохимия.
Помещенные в парафин срезы ткани (6 мкм толщиной) нарезали на микротоме, закрепляли на слайдах с покрытием поли-Ь-лизином, высушивали в течение ночи при комнатной температуре и удаляли парафин. Выполняли иммуноокрашивание, используя комплексную авидин-биотин (ABC-elite) технологию, как описано ранее. Первичными антителами являлись мышиная античеловеческая А-амилоидная (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) и антимышиная SAA поликлональные антисыворотки. В качестве вторичных антител использовали конъюгат аффинно-очищенного лошадиного антимышиного иммуноглобулина-G (IgG) с пероксидазой хрена (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния) или конъюгаты козьего антикроличьего, антимышиного или антикрысиного IgG с пероксидазой хрена (BioRad Laboratories, Richmond, Калифорния).
4. Количественное определение SAA анализом ELISA.
Концентрации SAA измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) с использованием многовидового комплекта ELISA SAA (Multispecies SAA ELISA kit) согласно инструкциям изготовителя (Biosource, Camarillo, Калифорния). Стандартные кривые были подготовлены с использованием известного количества человеческого белка SAA, и поглощение измеряли при 405 нм на планшетном ридере модели 4450 BioRad (Fullerton, Калифорния).
5. Изучение метаболизма с помощью радиосцинтиграфии SAP у мышей.
SAP подвергали окислительному иодированию с 125I (2-5 MBq/мг) с использованием N-бромсукцинимида. Мышам в возрасте 6-12 недель внутривенно вводили от 2 до 10 мкг 125I - SAP в 200 мкл. Точно отмеренные пробы крови из хвоста (от 0,01 до 0,04 г) брали в определенные интервалы времени, и проводили подсчет радиоактивности с осаждением трихлоруксусной кислотой в каждой партии в конце каждого эксперимента вместе со стандартными аликвотами введенного меченого вещества. Pepys et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:5602-5606 (1994).
6. Изучение метаболизма с помощью радиосцинтиграфии SAP и анализ визуализации у человека. Для применения у человека выделяли SAP из плазмы единственного нормального официального
донора и подвергали окислительному иодированию с 125I (2-5 MBq/мг) или 123I (110 MBq/50 мкг белка) с использованием N-бромсукцинимида. После инъекции 123I SAP полученные данные обрабатывали в гамма-камере IGE Starcam (IGE Medical Systems, Slough, Великобритания). Выведение 125!-меченого SAP изучали у здоровых людей и больных амилоидозом АА-типа. Pepys et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 91 :5602-5606 (1994).
7. Экстракция и очистка амилоида.
Для экстракции амилоида из ткани применяли способы, описанные авторами Pras, et al. См. Pras et al. J. Clin. Invest. 47:924-933 (1968) Коротко, образец печени или тканей из других органов, полученных при вскрытии трупа и сохраняемых при -80°С, гомогенизировали с холодным солевым раствором в ледяной ванне с использованием Omni-миксера (Omni International, Waterbury, Коннектикут). Экстракт центрифугировали при 10000 оборотов в минуту в течение 30 минут при 4°С, и осадок повторно экстрагировали еще дважды с холодным солевым раствором, один раз с 0,1 М цитратно-натриевым Трис-буферный раствором с уровнем рН 8,0, и затем снова с солевым раствором, пока показатели А280 супер-натанта не стали <0,10. Полученный осадок гомогенизировали с холодной дистиллированной водой, и смесь центрифугировали при 35000 оборотах в минуту в течение 3 ч при 4°С. Затем полученный из водного эктракта осадок лиофилизировали.
8. Поверхностный плазмонный резонанс.
Кинетику связывания измеряли с помощью устройства BIAcore X. Фибриллы, подготовленные из VA,6 Wil, быстро разрушали ультразвуком с соникатором образцов и затем соединяли с чипом СМ-5, используя химию аминов согласно протоколу BIAcore. Для этой методики применяют EDC и нормальную человеческую сыворотку NHS для активации карбоксильной группы на чипе, для соединения со свобод
ными аминогруппами на фибриллах. Соединение проводят в буфере NaOAc с уровнем рН 4,0 при концентрации 100 мкг/мл. Контрольный канал подвергали "пробному соединению", и оба канала реагировали с этаноламином для насыщения непрореагировавших участков. Были соединены около 16000 RU фибрилл V\6 Wil.
Сенсограммы проводили по методике в буфере HBS-EP от компании BIAcore в 20 мкл/мин в FcI (фибриллы Vi6 Wil) минус Fc-2 (контроль). В образцы, содержащие mAb или mAb вместе с пептидными ингибиторами, вводили инъекции (70 мкл), и получали сенсограммы с использованием функции задержки промывания в течение 200 секунд. Данные анализировали с программным обеспечением BIAevaluta-tion, используя 1:1 модель Ленгмюра с коррекцией действия массы.
9. Микро-SPECT/CT.
В двух группах по 3 мыши в каждой мышам подкожно между лопатками вводили 50 мг экстракта человеческого AL-амилоида. Через 7 дней в одной группе мышам внутривенно путем в/в инъекции в хвостовую вену вводили 300 |xCi, 125I меченого mAb 7D8. Второй группе вводили равное количество мышиного mAb МОРС 31С в качестве контроля. Через 72 ч мышей умерщвляли передозировкой изо-флурана и получали отображения SPECT/CT. Для обеспечения повышения контрастности сосудов на KT-отображениях, мышам за 5 мин до сканирования в/в вводили 200 мкл Фенестра VC(tm) (Fenestra VC(tm) Advanced Research Technologies, Монреаль, Канада).
Данные SPECT получали с помощью сканера MicroCAT II + SPECT с технологией двойного отображения (SPECT dual modality imaging platform (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN) , дающей возможность субмиллиметроваго разрешения, оборудованным коллиматором с точечной апертурой диаметром 0,5 мм. Для получения отображения 2 датчика (состоящие из мультианодной фотоумножитель-ной трубки Хамамацу R2486-0250 диаметром 50 мм, присоединенной к кристаллической решетке CsI (Т1) 1x1x8 мм, закрепленной на гриде 1,2 мм2 ), помещали примерно в 45 мм от центра вращения. Каждый набор данных SPECT содержал 45 проекций, полученных на 360° в течение около 50 мин. Реконструкцию изображений проводили с использованием алгоритма максимизации ожидания максимального правдоподобия (EM-ML).
После сбора данных SPECT были получены изображения компьютерной томографии (КТ) высокого разрешения. Сканер MicroCAT II имеет геометрию конического луча с круговой орбитой, оборудованную микрофокусными рентгеновскими источниками с пиковым напряжением в киловольтах 20-80 kVp, и с размером зоны визуализации 90x60 мм, с использованием CCD-матричного детектора 2048x3072, оптически соединенного с люминесцентным экраном minR посредством опто-волоконной связи. Каждый набор данных КТ состоял из 360 проекций с азимутом 1 °, который получали в течение 8 мин. Изображения реконструировали в реальном времени на изотропических вокселах 77 мкм с использованием алгоритма обратных проекций Feldkamp.
Для облегчения совместной регистрации реконструированных изображений SPECT и КТ, на визуализируемое основание помещали герметичные источники Со-57. Визуализировали пакеты данных мик-ро-SPECT и КТ и регистрировали их совместно вручную с помощью пакета программ 3-D анализа отображений (Amira, Версия 3.1: Mercury Computer Systems).
10. Биораспределение.
У мышей забирали образцы печени, селезенки, почки, сердца, легкого, и имплантированных амилоидных опухолей (а именно, амилоидомы) и помещали в тарированные флаконы, взвешивали и измеряли радиоактивность. Первичные значения индекса выражали как % введенной дозы на 1 грамм ткани (ID/г
%).
11. Авторадиография.
Срезы толщиной 6 мкм, отрезанные от фиксированных в формалине и залитых в парафин блоков тканей, полученных от мышей, умерщвленных через 72 часа после инъекций 125I-7D8, наносили на слайды для микроскопа Probond (Fisher Scientific), опускали в эмульсию NTB-2 (Eastman Kodak),
сохраняли в темноте и обрабатывали после экспозиции в течение 24 часов. Срезы подвергали контр-окрашиванию гематоксилином и эозином (ГЭ), накрывали со сдвигом с использованием Permount (Fisher Scientific), и исследовали световой микроскопией. Дополнительно, следующие слайды окрашивали щелочным Конго красным и наблюдали в поляризованном свете. Наконец, третий слайд подвергали иммуноокрашиванию, используя в качестве первичного реактива АА-реактивное mAb по настоящему изобретению. Применяли цифровую камеру для изображений с микроскопа и оценивали их с использованием программного пакета анализа изображений (Image Pro Plus, Media, Cybernetics).
Пример XIV. Создание гуманизированного антитела 2А4 и 7D8 Гуманизированные антитела 2А4, 7D8, и 8G9 изготовляли путем трансплантации мышиных 2А4, 7D8, и 8G9 CDR на человеческие акцепторные каркасы согласно способам, известным в данной области техники. Обратные мутации осуществляли для уменьшения антигенности при сохранении связывающей аффинности. Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи мышиных 2А4 представляли собой остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 и остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154, соответственно. Вариабельные области легкой цепи и тяжелые цепи 7D8 представляли собой остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO:
153 и остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154, соответственно. Вариабельные области легкой цепи мышиных 2А4 и 8G9 идентичны друг другу и отличаются от вариабельной области легкой цепи 7D8 по единственному остатку в CDR1. Вариабельные области тяжелой цепи каждого из 2А4, 7D8, и 8G9 были идентичными.
Вариабельная область каппа (Vk) из 2А4 и 7D8 относится к мышиной подгруппе 2, которая соответствует человеческой подгруппе 2, и вариабельная область тяжелой цепи (Vh) относится к мышиной подгруппе 3, которая соответствует человеческой подгруппе 3 (Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242). CDR-L1 включает 16 остатков и принадлежит к каноническому классу 4 из Vk. CDR-L2 включает 7 остатков и относится к классу 1 из Vk. CDR-L3 включает 9 остатков и относится к классу 1 из Vk. См. Martin А.С, Thornton JM. (1996) J Mol Biol. 263, 800-15. Лейцин в положении 27 в 7D8 является довольно необычным, и глутамин в 2А4 является более типичным. На модели показано, что боковая цепь находится на поверхности связывающего сайта, и поэтому должна быть важной для связывания антигена. CDR-H1 включает 5 остатков и относится к классу 1, и CDR-H2 включает 19 остатков и относится к классу 4 (Martin & Thornton, 1996). Область CDR-H3 не имеет каких-либо канонических классов, но в петле из 8 остатков, вероятно, имеется перекрученное основание согласно правилам Shirai et al. (1999) FEBS Lett. 455, 188-97. В модели она является консервативной, вместе с тем, конформация верхушки CDR-H3 может быть разной. Остатки в области контакта между доменами Vk и Vh представляют собой остатки, обычно выявляемые для 2А4 Vk, 7D8
Vk и 2А4 Vh.
Чтобы найти структуры, способные направить выбор обратных мутаций, проводили поиск в базе данных PDB (Deshpande et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7). Поиск по статически определимой базе данных последовательностей белка Национального центра биотехнологической информации NCBI позволил выбрать подходящие человеческие структуры для трансплантации мышиных CDR. Для области Vk была выбрана человеческая легкая цепь каппа с кодом доступа NCBI BAC01562 (gi:21669075) (SEQ ID NO: 166). Она имеет одинаковую длину с CDR-L3 и относится к человеческой зародышевой линии VKIIA 19/А3 и к подгруппе 2 человеческой области каппа. Также была найдена подобная структура, отличавшаяся только по J-области, с кодом доступа NCBI BAC01733 (gi:21669417) (SEQ ID NO: 167). BAC01562 использовали в качестве каркаса для 2А4 Vk, и ВАС01733 использовали как каркас для 7D8 Vk. Для области Vh использовали тяжелую цепь человеческого Ig AAC51024 (gi: 1791061) (SEQ ID NO: 165). См. Glas et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 107: 372-380. Она относится к человеческой зародышевой линии VH3-72 и подгруппе 3 человеческой тяжелой цепи.
Вариабельные области легкой цепи типичного гуманизированного антитела 2А4 представляют собой SEQ ID NO: 155, 156, и 157. Вариабельные области легкой цепи типичного гуманизированного 7D8 представляют собой SEQ ID NO: 158, 159, 160, 174, 175 и 176. Вариабельные области тяжелой цепи типичного гуманизированного 2A4/7D8 представляют собой SEQ ID N0: 161, 162 и 163. См. фигуры 36А-36Е. Типичные гуманизированные антитела по изобретению включают антитела, имеющие вариабельные области легкой цепи, выбранные из одного из остатков 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152, остатков 20-131 последовательности SEQ ID NO: 153 и SEQ ID NO: 155, 156, 157, 157, 159, 160, 174, 175 и 176; и вариабельные области тяжелой цепи, выбранные из одного из остатков 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154 и SEQ ID NO: 161, 162 и 163.
Пример XV. Терапевтические эффекты mAB 2A4 у мышей с тяжелым системным амилоидозом АА-
типа.
Терапевтическую эффективность mAb 2A4 оценивали у мышей H2/huIL-6 с тяжелым системным амилоидозом. У трансгенных H2/huIL-6 мышей, которые конститутивно экспрессируют трансгенный человеческий IL-6, подтверждается быстрое и необратимое развитие системного амилоидоза АА-типа. В первом и втором исследовании мышам вводили изотипически сходное mAb TY-11, которое не имеет активности у мышей, и использовалось в качестве контроля. Перед введением фактора усиления амилоида для индукции АА у мышей H2/huIL-6 забирали образцы крови через ретроорбитальную пазуху, приготовляли сыворотку, и определяли концентрации SAA с использованием коммерчески доступного комплекта ELISA. Были получены следующие репрезентативные значения: 2196,7 мкг/мл, 823,91 мкг/мл, 1415,00 мкг/мл, 1673,01 мкг/мл, 814,53 мкг/мл, 1088,18 мкг/мл, 736,34 мкг/мл, 1546,35 мкг/мл, 953,70 мкг/мл, 886,46 мкг/мл, при среднем значении = 1213,4 ± 478 мкг/мл.
В начале второго исследования (неделя 0) мышам H2/huIL-6 в/в вводили 100 мкг фактора усиления амилоида (AEF). После индукции патологии АА путем введения AEF мышам подкожно в другую конечность вводили 5 инъекций по 100 мкг mAb 2A4 (13 животных) или TY11 (11 животных). Лечение начинали примерно через 1 неделю после инъекции AEF. Выживаемость животных в каждой группе лечения регистрировали и анализировали. Результаты показаны в табл. 7. Только 45% мышей, которым вводили mAb TY11, выжили до конца исследования. Напротив, ни одна из мышей, получавших 2А4, не погибла в течение исследования. Анализ данных выживаемости с использованием стандартных методик показал существенное различие в кривых выживания (Р <0,0025) в обеих группах. Средняя выживаемость мышей с введением TY11 составляла 41 день, что сопоставимо с данными предыдущего исследования (38,5
дней).
На 6 неделе после введения AEF у мышей забирали кровь и забивали, и их органы забирали для дальнейшего анализа. Для определения количества амилоида в печени и селезенке проводили микроскопию в поляризованном свете, визуализировали двойное лучепреломление с окрашиванием Конго красным и регистрировали в цифровой форме. Область двупреломляющего материала определяли путем отбора (с использованием методики спектральной сегментации) и подсчета количества амилоид-связанных пикселей. Индекс амилоидной нагрузки (ABI), как меру содержания амилоида, выражали как процент занятой амилоидом области в каждом органе. Определение количества амилоида в печени и селезенке у мышей, получавших 2А4 и TY11, не показало существенного различия между указанными двумя видами лечения. Однако, при сравнении мышей, получавших 2А4, у мышей, которым вводили TY11 и выжившим к 42 дню, не выявлено развития патологических признаков или такого распределения АА-амилоида, которое приводит к заболеванию.
Также в течение исследования на выживаемость контролировали амилоидную гепатоселезеночную массу, чтобы оценить увеличение амилоидной нагрузки, которая коррелирует с заболеваемостью.
В третьем исследовании проводили сравнение mAb 2A4 с изотипически сходным mAb JH70, о реактивности которого у мышей не сообщалось. Дополнительно, на протяжении всего периода лечения проверяли химические показатели крови и другие параметры. В этом исследовании использовали самцов и самок мышей H2/huIL-6, рожденных в период между 8/1/08 и 9/7/08. У двадцати трех самок мышей и 16 самцов мышей осуществляли забор крови через ретроорбитальную пазуху. Цельную кровь использовали для химического анализа азота мочевины крови (АМК) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), чтобы оценить функции почек и печени, с использованием VetScan VS2 (Abaxix, Union City, Калифорния). Одновременно измеряли концентрацию в сыворотке 12 других белков и анализируемых веществ. Проводили общий анализ крови (СВС) с использованием оборудования VetScan HM5. Дополнительно, каждой мыши вводили низкие дозы (-50-60 мк Ci) человеческого сывороточного амилоидного компонента Р с радиоактивным йодом (125I-SAP) в 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, для оценки амилоидной нагрузки у мышей до инициирования патологического процесса. Измеряли процент 125I-SAP, остаточного через 24 ч после инъекций (П/И), путем помещения каждой мыши в калибратор дозы. Показателем амилоидного заболевания было более высокое, чем наблюдаемое у нетрансгенных (контрольных) мышей, удержание 125I-SAP. Наконец, использовали сыворотку для измерения концентрации сывороточного амилоидного белка (sAA) с помощью коммерческого набора для анализа ELISA. Итоги полученных перед лечением данных, некоторых химических показателей крови и результаты лечения, приведенные для каждой мыши, показаны ниже в табл. 8 и 9.
АМК
(мг/дл)
ГЛЮ
(мг/дл)
АЛТ (ед/дл) АЛБ (г/дл) ОБ (г/дл) ИГ (г/дл)
В начале третьего исследования (неделя 0), все мьшги из всей группы H2/huIL-6 внутривенно получали 100 мкг фактора усиления амилоида (1 мг/мл). Через одну неделю после начала лечения каждой мыши подкожно вводили 100 мкг или mAb 2A4 или JH70, как описано в общих чертах в табл. 8. Инъекции mAb продолжались еженедельно в течение 7 недель.
Через 2 недели после введения AEF проводили анализы СВС, биохимии крови и сывороточного sAA путем забора крови через ретроорбитальную пазуху. В это время мышам в группе 1 также вводили около 60 uCl 125I-SAP в БСА, как описано выше, для оценки накопления амилоида, что подтверждается удержанием радиомеченого SAP. У нескольких животных проявился побочный эффект экстремального стресса, и поэтому оценку амилоидной нагрузки с использованием 125I-SAP у них не продолжали. Результаты некоторых химических показателей крови, полученных через 2 недели после введения AEF, показаны в табл. 10.
Таблица 10
129 8 25 6 13
178 0 82 0
33 9
46 0 22 0
63 3 30 6 13
134 0 32 0
iil^icHiK
Высокий Низкий Средние
АМК лич мочскины кропи ГЛЮ иноком АЛТ (ЫдниндминофЕши^рл-м
(XJIOK LMHopol кИ ИГ ИМ\ПН01Л0Б\ЛНИ F-LdMkJ. M-ej\!U( ЧГ) LI JH.VpiHOL
и(.потьтусмы\ для опрслсиашя гкжятателсп
Через 8 недель после введения AEF у мышей производили заключительный забор крови и сразу после этого вводили около 200 MKCi 125I-SAP с использованием в качестве носителя 5% нормальную мышиную сыворотку. В ответ на это введение несколько животных проявили слегка необычное поведение, которое нормализовалось в течение 30 минут. Через двадцать четыре часа мышам вводили рентгенокон-трастное вещество для КТ (около 200 мкл в/в в хвостовую вену) и затем их умерщвляли путем передозировки изофлурана. Были получены томографические изображения одиночной фотонной эмиссии (SPECT) и рентгеновские изображения (КТ) каждого животного. Производили забор органов, вычисляли количество радиоактивности в каждом образце, которое выражали в виде % введенной дозы на грамм ткани. Дополнительно, часть каждой ткани фиксировали в буферизованном формалине в течение ночи в препаратах для микротомирования и проведения микроскопии.
В течение 7 недели клинических исследований 2 мыши были обнаружены мертвыми, и 3 мышей забили по причине малой вероятности их выживания в течение ночи и плохих показателей состояния организма ( <2; связанных с потерей веса > 15%). Мышей, проявивших побочные реакции на инъекцию I-SAP и 1 мышь, которую забили по причине осложнений в результате ретроорбитального кровотечения, не оценивали в части анализа выживаемости. Выживаемость мышей в каждой группе лечения mAb показана в табл. 11.
Около 65% мышей с введением mAb JH70, которые могли войти в оценку, выжили до конца исследования. Напротив, ни одна из мышей с 2А4, которая могла войти в оценку, не умерла в течение этих 57 дней. Анализ данных выживаемости с использованием стандартных методик показал значительные отличия в кривых выживания (Р=0,015, с использованием теста Мантел-Кокса и Р=0,016 с использованием теста Грехана-Бреслау-Вилкоксона (Grelian-Breslow-Wilcoxon).
Заключительные химические показатели крови анализировали в соответствии с препаратами, которые получала каждая мышь. Из-за отличий параметров средних значений, связанных с полом (самки и самцы) мышей H2/huIL-6 (в момент эвтаназии уровни АМК у самок мышей были выше, как при введении 2А4, так и при введении JH70), и в табл. 12 ниже включены только выжившие самки мышей.
Таблица12
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Elan Pharmaceuticals, Inc. Schenk, Dale B. Wall, Jonathan Seubert, Peter A. Saldanha, Jose
<120> Лечение и профилактика амилоидоза
<130> 021452-0376734
<150> 61/007,544 <151> 2007-12-28
<150> 61/095,932 <151> 2008-09-10
<160> 177
<170> PatentIn версия 3.4
<210> 1 <211> 122 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> Homo sapiens
MISC_FEATURE (область биологического интереса, которая не может быть описана никаким другим ключом, новая или редкая характерстика)
<223> Человеческий амилоидный белок пептид A
<400> 2
Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Tyr Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser
65 70 75
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из А-амилоидного пептида
<400> 3
Gly His Glu Asp Thr
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 4
Gly His Gly Ala Glu Asp Ser
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из A-амилоидного белка
<400> 5
Gly His Asp Ala Glu Asp Ser 1 5
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из амилоидного белка
<400> 6
Gly His Gly Ala Glu Asp Ser
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из A-амилоидного белка
<400> 7
Gly Asp His Ala Glu Asp Ser 1 5
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из A-амилоидного белка
<400> 8
Ser Thr Val Ile Glu Asp Ser
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 9
Gly Arg Gly His Glu Asp Thr
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
Gly His Gly Ala Glu Asp Ser
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 11
Asn His Gly Leu Glu Thr Leu 1 5
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из амилоидного пептида
<400> 12
His Glu Asp Thr 1
<210> <211>
13 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
<400> 13
Ala Glu Asp Ser 1
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<210> <211>
14 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
<400> 14
Ala Glu Asp Thr 1
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 15
His Glu Asp Ala
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент лямбда из амилоидного AL-белка
<400> 16
Thr Glu Asp Glu 1
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент лямбда из амилоидного AL-белка
<400> 17
Phe Glu Asp Asp 1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент лямбда из амилоидного AL-белка
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 18
Ser Glu Asp Glu 1
<211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент лямбда из амилоидного AL-белка
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилоидогенных белков
<400> 19
Ala Glu Asp Glu 1
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент лямбда из амилоидного AL-белка
<400> 20
Pro Glu Asp Glu 1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент каппа из амилоидного AL-белка
<220> <221> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 21
Pro Glu Asp Ile 1
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент каппа из амилоидного AL-белка
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 22
Pro Glu Asp Phe
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент каппа из амилоидного AL-белка
<220> <221> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 23
Ala Glu Asp Val 1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент каппа из амилоидного AL-белка
<220> <221> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 24
Ser Glu Asp Phe 1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V фрагмент каппа из амилоидного AL-белка
<400> 25
Ser Glu Asp Ala 1
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 26
Pro Glu Asp Ser 1
<210> 27 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 27
Pro Glu Asp Leu
<210> <211>
28 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
<400> 28
Thr Glu Asp Val 1
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 29
Ser Glu Asp Ile 1
<210> 30 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои
догенных белков
<400> 30
Thr Glu Asp Thr 1
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 31
Leu Glu Asp Gly
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 32
Ala Glu Asp Met
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 33
His Glu Asp Ser
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 34
<210> 35
<211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилоидо-генных белков
<400> 35
Gln Glu Asp Ser 1
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 36
Arg Glu Asp Ser 1
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-
догенных белков
<400> 37
Thr Glu Asp Gly
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 38
Gln Glu Asp Arg 1
<212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 39
Thr Glu Asp Leu 1
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 40
Pro Glu Asp Asn 1
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-
догенных белков
<400> 41
Glu Glu Asp Pro
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 42
Leu Glu Asp Leu
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
Консенсусная
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<400> 43
Lys Glu Asp Ala
<210> <211>
44 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
<400> 44
последовательность, полученная из человеческих амилои-
Ser Glu Asp Cys 1
<210> 45 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 45
Glu Glu Asp Asp 1
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 46
Ser Glu Asp Lys
<210> 47
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная догенных белков
<400> 47
Asp Glu Asp Asp
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<210> 48
<211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 48
Asp Glu Asp Gly
<210> 49
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 49
Leu Glu Asp Glu
<210> <211>
50 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
<400> 50
Gly Glu Asp Ala 1
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<210> <211>
51 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 51
Val Glu Asp Phe
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 52
Tyr Glu Asp Glu 1
<210> <211>
53 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 53
Ile Glu Asp Leu
<210> <211>
54 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
догенных белков
<400> 54
Trp Glu Asp Tyr 1
последовательность, полученная из человеческих амилои-
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
догенных белков
<400> 55
последовательность, полученная из человеческих амилои-
Asp Glu Asp Trp 1
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-
догенных белков
Ser Glu Asp Leu
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 57
Tyr Glu Asp Gln 1
<210> 58 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилоидо-генных белков
<400> 58
Leu Glu Asp Trp
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 59
Tyr Glu Asp Arg 1
<210> 60 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 60
Pro Glu Asp Lys
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная
<223> Неамилоидная часть сывороточного A амилоидного белка
<400> 61
Gly His Glu Asp Thr Met Ala Asp Gln Glu
1 5 10
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 62
Ala Glu Asp Ala 1
<210> 63 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 63
Gln Glu Asp Leu
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 64
Val Glu Asp Leu
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 65
Leu Glu Asp Ala
<210> 66
<211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 66
Ser Glu Asp Gly 1
<210> <211>
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из CS малярии
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Антигенная детерминанта T3
<400> 67
Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val
<210> <211>
68 10
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из остатков 19-28 поверхностного антигена гепатита B
<400> 68
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
<210> <211>
69 19
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из остатков 153-171 белка теплового шока 65 микобактерии
<400> 69
Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly
1 5 10 15
Asn Glu Gly
<211> 14
<212> PRT
<213> Бацилла Кальметта - Герена
<400> 70
Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu
1 5 10
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из остатков 830-844 токсоида столбняка
<400> 71
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 72
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из остатков 947-967 токсоида столбняка
<400> 72
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu 20
<210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> HIV
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HIV gb120 T1
<400> 73
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может быть любой аминокислотой природного происхождения
<400> 74
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> <211>
75 36
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
Слитый белок, полученный из T остатков токсоида столбняка 830-844 и
947-967
<400> 75
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe
1 5 10 15
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
20 25 30
Ser His Leu Glu
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из остатков 323-389 овальбумина
<400> 76
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 78 <211> 65
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Слитый белок, полученный из остатков 307-319 гемагглютинина А вируса гриппа, CD малярии: эпитоп T3, остатки 830-844 и 947-967 токсоида столбняка
<400> 78
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys
1 5 10 15
Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile
20 25 30
Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe
35 40 45
Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
50 55 60
Glu 65
<210> 79
<211> 37
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Слитый белок
<400> 79
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys
1 5 10 15
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
20 25 30
Ala Ser His Leu Glu 35
<210> 80 <211> 15 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из человеческого A амилоидного белка
<400> 80
Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из человеческого A амилоидного белка
<400> 81
Gln Gly Trp Leu Thr Phe Leu Lys Ala Ala Gly Gln Gly Ala Lys
1 5 10 15
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из мышиного A амилоидного белка
<400> 82
Glu Ser Trp Arg Ser Phe Phe Lys Glu Ala
1 5 10
<210> <211>
83 15
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
Получена из мышиного A амилоидного белка
<400> 83
Gly Phe Phe Ser Phe Val His Glu Ala Phe Gln Gly Ala Gly Asp
<210> <211>
84 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из мышиного A амилоидного белка
<400> 84
Glu Ala Gly Gln Gly Ser Arg Asp
1 5
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из мышиного A амилоидного белка
<400> 85
Trp Tyr Ser Phe Phe Arg Glu Ala Val Gln Gly Thr Trp Asp
1 5 10
<210> 86
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Фрагменты 2 лямбда из человеческих амилоидных депо
<400> 86
Gly Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gln
1 5 10 15
Thr Val Ala Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ala Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Leu
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 87
<210> <211>
88 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 88
Cys Gly Gly Ala Glu Asp Ser
<210> <211>
89 10
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 89
Gly His Glu Asp Thr Ile Ala Asp Gln Glu
<210> <211>
90 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 90
Cys Gly Gly Ala Glu Asp Thr
<210> <211>
91 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 91
Cys Gly Gly His Ala Asp Thr
<210> <211>
92 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 92
Cys Gly Gly His Glu Ala Thr
1 5
<210> <211>
93 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 93
Cys Gly Gly His Glu Asp Ala
<210> <211>
94 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 94
Cys Gly Gly His Glu Asp Thr Met
<210> <211>
95 9
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 95
Cys Gly Gly His Glu Asp Thr Met Ala
<210> <211>
96 10
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 96
Cys Gly Gly His Glu Asp Thr Met Ala Asp
1 5 10
<210> 97 <211> 6 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Получена из сывороточного A амилоидного белка
<400> 97
Cys Gly Gly His Glu Asp
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HSAA1
<400> 98
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 99
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HSAA2
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Ser Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asn Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Leu Thr Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Lys Trp Gly Arg Ser Gly Arg Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 100 <211> 122 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HSAA3
<400> 100
Met Lys Leu Ser Thr Gly Ile Ile Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Ser Gln Gly Trp Leu Thr Phe Leu Lys Ala Ala Gly Gln Gly Ala
20 25 30
Lys Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Lys Glu Ala Asn Tyr Lys
35 40 45
Lys Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Val Gln
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Thr Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Val Gln Arg Leu Thr Gly Asp His Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Gly Gln Ala Thr Asn Lys Trp Gly Gln Ser Gly Lys Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 101 <211> 130 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HSAA4
<400> 101
Met Arg Leu Phe Thr Gly Ile Val Phe Cys Ser Leu Val Met Gly Val
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Trp Arg Ser Phe Phe Lys Glu Ala Leu Gln Gly Val
20 25 30
Gly Asp Met Gly Arg Ala Tyr Trp Asp Ile Met Ile Ser Asn His Gln
35 40 45
Asn Ser Asn Arg Tyr Leu Tyr Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Lys Leu Ile Ser Arg Ser Arg
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Gly Leu Ile Asp Tyr Tyr Leu Phe Gly Asn Ser Ser
85 90 95
Thr Val Leu Glu Asp Ser Lys Ser Asn Glu Lys Ala Glu Glu Trp Gly
100 105 110
Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asp Arg Phe Arg Pro Asp Gly Leu Pro Lys
115 120 125
Lys Tyr
130
<210> 102 <211> 76 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HAA1
<400> 102
Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser
65 70 75
<210> 103 <211> 76 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HAA2
<400> 103
Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asn Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Ile Gln Arg Leu Thr Gly His Gly Ala Glu Asp Ser
65 70 75
<210> 104 <211> 76 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HAA3 <400> 104
Gln Gly Trp Leu Thr Phe Leu Lys Ala Ala Gly Gln Gly Ala Lys Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Lys Glu Ala Asn Tyr Lys Lys Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Val Gln Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Val Trp Ala Thr Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Val Gln Arg Leu Thr Gly Asp His Ala Glu Asp Ser
65 70 75
<210> 105 <211> 84 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HAA4
<400> 105
Glu Ser Trp Arg Ser Phe Phe Lys Glu Ala Leu Gln Gly Val Gly Asp
1 5 10 15
Met Gly Arg Ala Tyr Trp Asp Ile Met Ile Ser Asn His Gln Asn Ser
20 25 30
Asn Arg Tyr Leu Tyr Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Lys Leu Ile Ser Arg Ser Arg Val Tyr
50 55 60
Leu Gln Gly Leu Ile Asp Tyr Tyr Leu Phe Gly Asn Ser Ser Thr Val
65 70 75 80
Ile Glu Asp Ser
<212> PRT
<213> Mus musculus (мышь домовая)
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> MSAA1
<400> 106
Met Lys Leu Leu Thr Ser Leu Val Phe Cys Ser Leu Leu Leu Gly Val
1 5 10 15
Cys His Gly Gly Phe Phe Ser Phe Val His Glu Ala Phe Gln Gly Ala
20 25 30
Gly Asp Met Trp Arg Ala Tyr Thr Asp Met Lys Glu Ala Asn Trp Lys
35 40 45
Asn Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Lys Ile Ser Asp Gly Arg
65 70 75 80
Glu Ala Phe Gln Glu Phe Phe Gly Arg Ile Ala Asp Gln Glu Ala Asn
85 90 95
Arg His Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn Tyr Tyr Arg Pro Pro Gly
100 105 110
Leu Pro Asp Lys Tyr
115
<210> 107
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> MSAA2
<400> 107
Met Lys Leu Leu Thr Ser Leu Val Phe Cys Ser Leu Leu Leu Gly Val
1 5 10 15
Cys His Gly Gly Phe Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Phe Gln Gly Ala
20 25 30
Gly Asp Met Trp Arg Ala Tyr Thr Asp Met Lys Glu Ala Gly Trp Lys
35 40 45
Asp Gly Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Lys Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ser Phe Gln Glu Phe Phe Gly Arg Gly His Glu Asp Thr Met Ala
85 90 95
Asp Gln Glu Ala Asn Arg His Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn Tyr
100 105 110
Tyr Arg Pro Pro Gly Leu Pro Ala Lys Tyr
115 120
<210> 108 <211> 122 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> MSAA3
<400> 108
Met Lys Pro Ser Ile Ala Ile Ile Leu Cys Ile Leu Ile Leu Gly Val
1 5 10 15
Asp Ser Gln Arg Trp Val Gln Phe Met Lys Glu Ala Gly Gln Gly Ser
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Lys Lys Ala Asn Trp Lys
35 40 45
Asn Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Arg
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Lys Val Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ala Val Gln Lys Phe Thr Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Arg Ala
85 90 95
Asp Gln Phe Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Lys Arg Tyr
115 120
<210> 109
<211> 130
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MSAA4 <400> 109
Met Arg Leu Ala Thr Val Ile Val Leu Cys Ser Leu Phe Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Gly Asp Gly Trp Tyr Ser Phe Phe Arg Glu Ala Val Gln Gly Thr
20 25 30
Trp Asp Leu Trp Arg Ala Tyr Arg Asp Asn Leu Glu Ala Asn Tyr Gln
35 40 45
Asn Ala Asp Gln Tyr Phe Tyr Ala Arg Gly Asn Tyr Glu Ala Gln Gln
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Gly Ile Trp Ala Ala Lys Ile Ile Ser Thr Ser Arg
65 70 75 80
Lys Tyr Phe Gln Gly Leu Leu Asn Arg Tyr Tyr Phe Gly Ile Arg Asn
85 90 95
His Gly Leu Glu Thr Leu Gln Ala Thr Gln Lys Ala Glu Glu Trp Gly
100 105 110
Arg Ser Gly Lys Asn Pro Asn His Phe Arg Pro Glu Gly Leu Pro Glu
115 120 125
Lys Phe
130
<210> 110 <211> 85 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> MAA1
<400> 110
Gly Phe Phe Ser Phe Val His Glu Ala Phe Gln Gly Ala Gly Asp Met
1 5 10 15
Trp Arg Ala Tyr Thr Asp Met Lys Glu Ala Asn Trp Lys Asn Ser His
20 25 30
Glu Asp Thr Ile Ala Asp Gln Glu Ala Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg
35 40 45
Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala
50 55 60
Glu Lys Ile Ser Asp Gly Arg Glu Ala Phe Gln Glu Phe Phe Gly Arg
65 70 75 80
Gly His Glu Asp Thr 85
<210> 111 <211> 75 <212> PRT
<213> Мышиная
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> MAA2
<400> 111
Gly Phe Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Phe Gln Gly Ala Gly Asp Met
1 5 10 15
Trp Arg Ala Tyr Thr Asp Met Lys Glu Ala Gly Trp Lys Asp Gly Asp
20 25 30
Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly Pro
35 40 45
Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Lys Ile Ser Asp Ala Arg Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Glu Phe Phe Gly Arg Gly His Glu Asp Thr
65 70 75
<210> 112 <211> 68 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MAA3
Glu Ala Gly Gln Gly Ser Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met
1 5 10 15
Lys Lys Ala Asn Trp Lys Asn Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly
20 25 30
Asn Tyr Asp Ala Ala Arg Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Lys
35 40 45
Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Ala Val Gln Lys Phe Thr Gly His Gly
50 55 60
Ala Glu Asp Ser 65
<210> 113 <211> 82 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MAA4 <400> 113
Trp Tyr Ser Phe Phe Arg Glu Ala Val Gln Gly Thr Trp Asp Leu Trp
1 5 10 15
Arg Ala Tyr Arg Asp Asn Leu Glu Ala Asn Tyr Gln Asn Ala Asp Gln
20 25 30
Tyr Phe Tyr Ala Arg Gly Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Arg Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Ile Trp Ala Ala Lys Ile Ile Ser Thr Ser Arg Lys Tyr Phe Gln
50 55 60
Gly Leu Leu Asn Arg Tyr Tyr Phe Gly Ile Arg Asn His Gly Leu Glu
65 70 75 80
Thr Leu
<210> 114
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 115 <211> 122 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> HSSA1 beta
<400> 115
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Asp Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 116
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HSSA1 гамма
<400> 116
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Asp Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Lys Trp Gly Arg Ser Gly Arg Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 117 <211> 122 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HSAA2 альфа <400> 117
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Ser Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asn Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Leu Thr Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Lys Trp Gly Arg Ser Gly Arg Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 118 <211> 122 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HSAA2 бета
<400> 118
Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Ser Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
20 25 30
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile
35 40 45
Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys
50 55 60
Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asn Ala Arg
65 70 75 80
Glu Asn Ile Gln Arg Leu Thr Gly Arg Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Ala Ala Asn Lys Trp Gly Arg Ser Gly Arg Asp Pro Asn His
100 105 110
Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120
<210> 119 <211> 104 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Бета изоформа HAA1
<400> 119
Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg
85 90 95
Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 100
<210> 120 <211> 102 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Сывороточный A амилоидный белок
<400> 120
Gly Phe Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Phe Gln Gly Ala Gly Asp Met
1 5 10 15
Trp Arg Ala Tyr Thr Asp Met Lys Glu Ala Gly Trp Lys Asp Gly Asp
20 25 30
Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly Pro
35 40 45
Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Lys Ile Ser Asp Ala Arg Glu Ser Gln
50 55 60
Glu Phe Phe Gly Arg Gly His Glu Asp Thr Met Ala Asp Gln Glu Ala
65 70 75 80
Asn Arg His Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn Tyr Tyr Arg Pro Pro
85 90 95
Gly Leu Pro Ala Lys Tyr 100
<210> 121 <211> 84 <212> PRT
<213> Canis lupus familiaris (шарпей)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Сывороточный А амилоидный белок
<400> 121
Trp Tyr Ser Phe Val Gly Glu Ala Ala Gln Gly Ala Trp Asp Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Lys Asn Ser Asp Lys
20 25 30
Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly Pro Gly
35 40 45
Gly Ala Trp Ala Ala Lys Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn Ser Gln
50 55 60
Arg Asp Ser Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Lys Ala Asp Gln Ala Ala
65 70 75 80
Asn Glu Trp Gly
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
Аминокислотная вставка между положениями 67 и 68 в последовательности шарпея
<400> 122
Ile Thr Asp Leu Leu Arg Phe Gly 1 5
<210> 123
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221> <223>
MISC_FEATURE
kpla
<220> <221> <223>
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser
85 90 95
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kplb
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 124
Ser Gln Asp Asn Tyr Asn Asp Asn Thr Asp Phe Glu Ile Asp Asn Leu
1 5 10 15
Pro
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kplc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 125
Ser Tyr Asn Ala Gln Asp Glu Ser Tyr Thr Pro
1 5 10
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221>
MISC_FEATURE
<223> kpld
<220> <221> <223>
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 126
Ser Gly Arg Asn Asp Gly Arg Ala Gln Glu Leu His Pro
<210> <211> <212>
127
PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 127
Ser Gly Asn Tyr Phe Ser Ala Gln Asp Glu Pro
<210> <211> <212>
128
PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221>
MISC_FEATURE
<223> kplf
<220> <221> <223>
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 128
Ala Leu Ser Gly Ala Asp Asp Glu Phe Asn Pro
<210> <211> <212>
129
PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221>
MISC_FEATURE
<223> kplg
<220> <221> <223>
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 129
Ser Val Gly Ala Gln Asp Glu Ala Phe Pro
<210> <211> <212>
130
PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221>
MISC_FEATURE
<223> kp2a
<220> <221> <223>
Val Thr Leu Ser Pro Val Thr Pro Glu Pro Ala Ser Ser Ser Leu Leu
1 5 10 15
Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Asp Leu Gln Ser Gln Thr Leu Tyr
20 25 30
Arg Ala Asp Asp Lys Arg Val Glu Ala Glu Val Gly Val Met Arg Ile
35 40 45
Glu Phe Pro 50
<210> 131
<211> 49
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kp2b
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 131
Val Leu Ser Pro Val Thr Pro Glu Pro Ala Ser Ser Ser Leu Leu His
1 5 10 15
Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Asp Leu Gln Ser Gln Leu Gly Asn Arg Ala
20 25 30
Asp Asp Lys Arg Val Glu Ala Glu Val Gly Val Met Ala Leu Gln Thr
35 40 45
Pro
<210> 132
<211> 50
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kp2c
Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gln Pro Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu
1 5 10 15
His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Tyr Leu Gln Pro Gln Glu Val Asn Arg
20 25 30
Phe Asp Asp Lys Arg Val Glu Ala Glu Val Gly Val Met Ser Ile Gln
35 40 45
Leu Pro
<210> 133
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kp3a
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 133
Glu Val Ala Val Pro Glu Ala Leu Ser Val Asn Gln Arg Gly Thr Arg
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ala Ser Glu Val Asn Trp Pro 20 25
<210> 134
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kp3b
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 134
Glu Val Leu Gly Leu Pro Glu Ala Leu Ser Val Ser Tyr Gln Arg Gly
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Asp Asp Arg Glu Glu Val Gly Ser Pro 20 25
<210> 135
<211> 31 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kp3c
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 135
Glu Val Leu Ala Leu Pro Glu Ala Leu Ser Val Ser Tyr Gln Arg Asp
1 5 10 15
Asn Arg Ala Thr Ile Ala Asp Glu Glu Val Arg Ser Asn Trp Pro
20 25 30
<210> 136
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221> <223> <220> <221> <223>
MISC_FEATURE
kp4
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности
V легкой цепи лямбда
<400> 136
Val Asp Ser Ala Val Leu Glu Ala Asn Lys Ser Val Leu Tyr Ser Ser
1 5 10 15
Asn Asn Lys Asn Tyr Gln Pro Trp Thr Arg Asp Asp Ala Glu Val Val
20 25 30
Tyr Thr Pro 35
<210> 137
<211> 49
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> kp5
<400> 137
Glu Thr Thr Leu Ala Phe Met Thr Pro Lys Asn Ser Lys Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Met Asn Glu Ala Ile Phe Ile Gln Glu Thr Thr Val Pro Ile Pro
20 25 30
Tyr Asp Asn Asn Ile Glu Ser Glu Ala Tyr Phe Leu His Asp Asn Phe
35 40 45
Pro
<210> 138
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lmla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 138
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr
65 70 75 80
Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser
85 90 95
Ala
<210> 139 <211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> lmlb
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 139
Ala Gly Thr Arg Ser Tyr Arg Gln Val Ser Ala Ser Arg Ser Glu Ala
1 5 10 15
Ala Asp Gly
<210> 140
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> lmlc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 140
Val Gly Arg Thr Ala Gly Tyr Asp His Gly Ser Asn Val Ser Ala Ala
1 5 10 15
Glu Gln Ser Tyr Gly 20
<210> 141
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> lm2a
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 141
Ala Ala Gly Ser Ser Ile Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu His Lys Met
1 5 10 15
Gly Ser Val Ser Ala Ala Glu Gln Ser Tyr Gly 20 25
<210> 142
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm2b
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 142
Ala Arg Gly Ser Val Ile Thr Thr Asp Val Gly Tyr His Lys Met Asp
1 5 10 15
Val Ser Val Asn Thr Ser Thr Ser Ala Glu Cys Ser Tyr Ala Gly Tyr
20 25 30
Thr Phe
<210> 143
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> <221> <223> <220> <221>
MISC_FEATURE
lm3a
MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 143
Ser Tyr Val Lys Thr Ala Arg Thr Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5 10 15
His Lys Gln Val Val Val Asp Asp Ser Asp Glu Asn Asn Thr Thr Ser
20 25 30
Arg Val Glu Ala Gln Val Ser Asp His 35 40
<210> 144
<211> 38
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm3b
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 144
Ser Tyr Glu Val Ser Thr Ala Arg Thr Asp Ala Leu Pro Lys Gln Ala
1 5 10 15
Tyr Lys Gln Val Val Lys Asp Ser Glu Glu Ser Thr Val Thr Ser Val
20 25 30
Ala Glu Gln Ser Ala Gly 35
<210> 145
<211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm3c
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 145
Ser Tyr Glu Val Ser Thr Ala Ser Thr Asp Lys Leu Gly Asp Lys Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Ser Val Val Gln Asp Ser Glu Asn Asn Thr Thr Ser Thr
20 25 30
Ala Met Gln Ala Thr Ala His 35
<210> 146
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm4
<400> 146
Ser Glu Asp Ala Val Leu Thr Arg Thr Gln Asp Leu Arg Ser Tyr Ala
1 5 10 15
Lys Gln Val Val Gly Lys Asn 20
<210> 147
<211> 38
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm6
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 147
Asn Phe Met His Glu Ser Lys Thr Thr Arg Gly Ser Ala Ser Gln Arg
1 5 10 15
Ser Ser Thr Thr Val Asp Gln Val Ile Asp Ser Ser Asn Ser Thr Ser
20 25 30
Lys Glu Gln Ser Tyr Asn 35
<210> 148
<211> 57
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm7
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 148
Thr Val Glu Leu Thr Val Ser Gly Thr Leu Thr Ala Ser Thr Gly Ala
1 5 10 15
Val Thr Ser Gly Tyr Pro Asn Phe Lys Gln Arg Ala Ser Thr Ser Asn
20 25 30
Lys His Trp Thr Ala Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Ala Gln 50 55
<210> 149
<211> 50 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> lm8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда легкой цепи
<400> 149
Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Gly His Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Ile Ala His Gln Glu Lys Gly Arg Tyr Met Lys Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ser Ala Glu Arg Tyr Thr Ser Ser Ser Glu Gln Gly Thr
35 40 45
Gly Ile 50
<210> 150 <211> 98 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V лямбда Wil
<400> 150
Asn Phe Leu Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Asn Asn
20 25 30
Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Phe Glu Asp Asp His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Val Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp His
85 90 95
Asn Asn
<210> 151
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> V каппа фрагмент из AL-амилоидного белка
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Консенсусная последовательность, полученная из человеческих амилои-догенных белков
<400> 151
Pro Glu Asp Val 1
<210> 152 <211> 131 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V каппа легкой цепи мышиных 2A4 и 8G9
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<223> Лидерная последовательность
<220>
<221> mat_пептид (кодирующая последовательность зрелого пептида или бел-
ка(tm))
<222> (20)..(131)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(58)
<223> CDR 1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(80)
<223> CDR 2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (113)..(121)
<223> CDR 3
<400> 152
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
-15 -10 -5
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
-1 1 5 10
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
15 20 25
Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
30 35 40 45
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr
65 70 75
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
80 85 90
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
Glu Ile Lys 110
<210> 153
<211> 131
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> V каппа легкой цепи мышиного 7D8
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<223> Лидерная последовательность
<220>
<221> mat_пептид
<222> (20)..(131)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(58)
<223> CDR 1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(80)
<223> CDR 2
<220> <221> <222> <223>
MISC_FEATURE
(113)..(121)
CDR 3
<400> 153
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
-15 -10 -5
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
-1 1 5 10
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu
15 20 25
Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
30 35 40 45
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr
65 70 75
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
80 85 90
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
Glu Ile Lys 110
<210> 154
<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> v тяжелой цепи мышиных 2A4, 8G9 и 7D8
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<223> Лидерная последовательность
<220>
<221> пш±_пептид
<222> (20)..(138)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(54)
<223> CDR 1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(87)
<223> CDR 2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (120)..(127)
<223> CDR 3
<400> 154
Met Val Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly
-15 -10 -5
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln
-1 1 5 10
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
Asn Thr Tyr Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asp Ser
65 70 75
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr
80 85 90
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp
95 100 105
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115
<210> 155
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 1 v каппа легкой цепи гуманизированного 2A4 и 8G9
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 156 <211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 2 v каппа легкой цепи гуманизированного 2A4 и 8G9
<400> 156
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 157
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 3 v каппа легкой цепи гуманизированного 2A4 и 8G9
<400> 157
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 158 <211> 112 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 1 v каппа легкой цепи гуманизированного 7D8
<400> 158
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 159
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
Версия 2 v каппа легкой цепи гуманизированного 7D8
<400> 159
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 160
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223>
Версия 3 v каппа легкой цепи гуманизированного 7D8
<400> 160
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 161 <211> 119 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 1 тяжелой цепи гуманизированного 2A4, 8G9 и 7D8
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 162
<211> 119
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 2 тяжелой цепи гуманизированного 2A4, 8G9 и 7D8
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 163
<211> 119
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 3 тяжелой цепи гуманизированного 2A4, 7D8 и 8g9
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 164 <211> 119 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 165 <211> 120 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Каркасный участок человеческой тяжелой цепи <400> 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Tyr Val Val Gly Ala Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 166 <211> 113 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Каркасный участок человеческой v каппа легкой цепи
<400> 166
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 167 <211> 276
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Каркасный участок человеческой v каппа легкой цепи
<400> 167
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn
65 70 75 80
Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys Ser Ala Arg Gln Ser Thr Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln
245 250 255
Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly 275
<210> 168 <211> 16 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 2A4 VL CDR1
<400> 168
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 2A4 VL CDR2
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 2A4 VL CDR3
<400> 170
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr 1 5
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 2A4 VH CDR1
<400> 171
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Tyr
1 5 10
<210> 172
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> 2A4 VH CDR2
<400> 172
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(8)
<223> 2A4 VH CDR3
<400> 173
Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr 1 5
<210> 174
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 4 v каппа легкой цепи гуманизированного 7D8
<400> 174
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 175 <211> 112 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 5 v каппа легкой цепи гуманизированного 7D8
<400> 175
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 176 <211> 112 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Версия 6 v каппа легкой цепи гуманизированного 7D8
<400> 176
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 177 <211> 16 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 177
Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с агрегированным амилоидным белком и представляет собой гуманизированную или химерную версию антитела 2А4, которое может быть получено из АТСС, номер доступа РТА-9662, или гуманизированную или химерную версию антитела 7D8, которое может быть получено из АТСС, номер доступа РТА-9468, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементар-ность, как показано в SEQ ID NO: 168, 169 и 170; или
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементар-ность, как показано в SEQ ID NO: 177, 169 и 170; и
(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три участка, определяющих комплементар-ность, как показано в SEQ ID NO: 171, 172 и 173.
2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из L87 и L90 (соглашение о нумерации по Kabat), занятый Y и F соответственно, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека.
3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, +92 и +109 (линейная нумерация), занятый Т, S, L, D, Q, K, Y, L, F и L соответственно, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека.
4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.3, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из +75 и +92 (линейная нумерация), занятый Y и F соответственю, в котором остаток вариабельной области легкой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека.
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.2, в котором вариабельная область легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека представляет собой каппа-подгруппу 2 вариабельной области легкой цепи человека (соглашение о нумерации по Kabat).
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.5, в котором вариабельная область легкой цепи подгруппы 2 человека происходит из зародышевой линии VKIIA19/A3 человека.
7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.6, в котором вариабельная область легкой цепи Vk человека содержит последовательность SEQ ID NO: 166 или остатки 23-134 из SEQ ID NO: 167.
8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152, остатками 20-131 последовательности SEQ ID NO:153 или представленную последовательностью SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176.
9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из Н37, Н49, Н70 и Н93 (соглашение о нумерации по Kabat), занятый I, A, F или V соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека.
10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +10, +15, +19, +37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99 +119 (линейная нумерация), занятый R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, М, V или А соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека.
11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, которое содержит по меньшей мере один остаток каркасного участка тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из +37, +49, +73 и +99 (линейная нумерация), занятый I, A, F или V соответственно, в котором остаток вариабельной области тяжелой цепи занят соответствующим остатком в вариабельной области тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека.
10.
12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.9, в котором вариабельной областью тяжелой цепи акцепторного иммуноглобулина человека является вариабельная область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 человека (нумерация по Kabat).
13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.12, в котором вариабельная область тяжелой цепи гамма-подгруппы 3 человека содержит последовательность SEQ ID NO: 165.
14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154 или представленную как последовательность SEQ ID NO: 161, 162 или 163.
15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO: 152 или остатки 20-131 последовательности SEQ ID NO:153, и вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как остатки 20-138 последовательности SEQ ID NO: 154.
16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 или 176; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 161, 162 или 163.
17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 161.
18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162.
19. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.16, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163.
20. Способ терапевтического или профилактического лечения индивида, имеющего амилоидоз АА-или AL-типа или предрасположенного к амилоидозу АА- или AL-типа, включающий введение индивиду эффективной дозы антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19.
21. Способ по п.20, где индивидом является человек.
22. Способ по п.20, где терапевтическое лечение включает замедление развития амилоидоза АА-или AL-типа.
23. Способ по п.20, в котором индивид страдает амилоидным заболеванием, выбранным из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, псориатической артропатии, синдрома Рейтера, болезни Стилла у взрослых, синдрома Бех-чета, болезни Крона, лепры, туберкулеза, бронхоэктатической болезни, язв при пролежнях, хронического пиелонефрита, остеомиелита, болезни Уиппла, ходжкинской лимфомы, почечной карциномы, карцином кишки, легкого и мочеполового тракта, базальноклеточной карциномы, волосатоклеточного лейкоза, семейной средиземноморской лихорадки и болезни Кастлемана.
24. Способ обнаружения амилоидного депо, связанного с амилоидозом АА- или AL-типа у индивида, включающий введение индивиду антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19, который связан с детектируемой меткой, и детекцию детектируемой метки у индивида.
25. Способ по п.24, где индивидом является человек.
26. Способ по п.24, где индивид страдает амилоидным заболеванием или является восприимчивым к амилоидному заболеванию, выбранному из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, анкилозирующего спондилита, псориаза, псориатической артропатии, синдрома Рейтера, болезни Стилла у взрослых, синдрома Бехчета, болезни Крона, лепры, туберкулеза, бронхоэкта-тической болезни, язв при пролежнях, хронического пиелонефрита, остеомиелита, болезни Уиппла, ход-жкинской лимфомы, почечной карциномы, карцином кишки, легкого и мочеполового тракта, базальнок-леточной карциномы, волосатоклеточного лейкоза, семейной средиземноморской лихорадки и болезни Кастлемана.
27. Способ по п.24, где детектируемая метка является радиометкой.
28. Способ по п.24, где радиометкой является 125I.
29. Способ по п.26, где детекцию осуществляют визуализацией с помощью SPECT/CT.
30. Способ по п.24, где детекцию проводят с помощью ядерно-магнитной спектроскопии.
31. Фармацевтическая композиция для терапевтического или профилактического лечения индивида, имеющего амилоидоз АА- или AL-типа или предрасположенного к амилоидозу АА- или AL-типа, содержащая:
a) терапевтическое или профилактическое эффективное количество антитела или антигенсвязы-вающего фрагмента по любому из пп.1-19;
b) фармацевтически приемлемый носитель, который не влияет на биологическую активность ком
по любому из по пп.1-19,
позиции.
АТСС
АТСС
32. Фармацевтическая композиция по п.31 для парентерального введения.
33. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент пп.1-19.
34. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента трансформированная нуклеиновой кислотой по п.33.
35. Клетка-хозяин по п.34, выбранная из группы, состоящей из клетки СНО, клетки HEK-293, клетки HeLa, клетки CV-1 и клетки COS.
36. Клетка-хозяин по п.35, которая представляет собой клетку СНО.
37. Гибридома, экспрессирующая моноклональное антитело мыши 2А4 (номер доступа в РТА-9662).
38. Гибридома, экспрессирующая моноклональное антитело мыши 7D8 (номер доступа в РТА-9468).
HSAA1
(SEQ
NO:
98)
MKLLTGLVFC
SLVLGVSSRS
FFS FLGEAFD
GARDMWRAYS DMREANYIGS
HSAA2
(SEQ
NO:
99)
MKLLTGLVFC
SLVLSVSSRS
FFS FLGEAFD
GARDMWRAYS DMREANYIGS
HSAA3
(SEQ
NO:
100)
MKLSTGIIFC
SLVLGVSSQG
WLTFLKAAGQ
GAKDMWRAYS DMKEANYKKS
HSAA4
(SEQ
NO:
101)
MRLFTGIVFC
SLVMGVTSES
WRSFFKEALQ
GVGDMGRAYw DIMISNHQNS
HSAA1
(SEQ
NO:
98)
51 .
DKYFHARGNY
DAAKRGPGGV
WAAEAISDAR
ENIQRFFGHG A E
HSAA2
(SEQ
NO:
99)
DKYFHARGNY
DAAKRGPGGA
WAAEVISNAR
ENIQRLTGHG A E
HSAA3
(SEQ
NO:
100)
DKYFHARGNY
DAVQRGPGGV
WATEVISDAR
ENVQRLTGdh A E
HSAA4
(SEQ
NO:
101)
NRYLYARGNY
DAAQRGPGGV
WAAKLISRSR
vylqglidyy lfgnsstvlE
НЕАА1
(SEQ
NO:
98)
DSLADQAANE
WGRSGKD PNH
FRPAGLPEKY
HSAA2
(SEQ
NO:
99)
DSLADQAANK
WGRSGRDPNH
FRPAGLPE KY
HSAA3
(SEQ
NO:
100)
DSLAGQATNK
WGQSGKDPNH
FRPAGLPEKY
HSAA4
(SEQ
NO:
101)
101
DSKSNEKAEE
WGRSGKDPDR
FRPDGLPKKY
Фиг. 1
HSAA1 (SEQ ID NO: 98) HAA1 (SEQ ID NO: 102)
1 mJclltglvfc slvlgvssRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS
! Rs FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS
HSAA1 (SEQ ID NO: 9B) HAA1 (SEQ ID NO: 102)
51 DKYFHARGNY DAAKRGPGGV WAAEAI SDAR ENIQRFFGHG AEDsladqaa
33 DKYFHARGNY DAAKRGPGGV WAAEAISDAR ENIQRFFGHG AEDS
HSAA1 (SEQ ID NO: 98) HAA1 (SEQ ID NO: 102) 101 newgrsgkdp nhfrpaglpe ky
Фиг. 2
HSAA2(alpha) (SEQ ID NO: 99) HAA2 (alpha) (SEQ ID NO-. 103)
mJclltglvfc slvlsvssRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS
RS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS
HSAA2(alpha) (SEQ ID NO: 99) HAA2(alpha) (SEQ ID NO: 103)
51 33
DKYFHARGNY DAAKRGPGGA WAAEVISNAR ENIQRLTGHG AEDSladqaa
DKYFHARGNY DAAKRGPGGA WAAEVISNAR ENIQRLTGHG AEDS
HSAA2(alpha) (SEQ ID NO: HAA2(alpha) (SEQ ID NO:
99) 103)
101 nkwgrsgrdp nhfrpaglpe ky
Фиг. 3
Фиг. 4
HSAA4 (SEQ ID NO: 101) HAA4 (SEQ ID NO: 105)
1 mrlftgivfc slvmgvtsES WRSFFKEALQ GVGDMGRAYW DIMISNHQNS
1 ES WRSFFKEALQ GVGDMGRAYW DIMISNHQNS
HSAA4 (SEQ ID NO: 101) HAA4 (SEQ ID NO: 105)
51 NRYLYARGNY DAAQRGPGGV WAAKLISRSR VYLQGLIDYY LFGNSstvle
33 NRYLYARGNY DAAQRGPGGV WAAKLISRSR VYLQGLIDYY LFGNS
HSAA4 (SEQ ID NO: 101) HAA4 (SEQ ID NO: 105)
101 dsksnekaee wgrsgkdpdr frpdglpkky
Фиг. 5
HAAl
(SEQ
NO:
102)
RSFFSFLGEA
FDGARDMWRA
YSDMREANYI
GSDKYFHARG
NYDAAKRGPG
HAA2
(SEQ
NO:
103)
RSFFSFLGEA
FDGARDMWRA
YSDMREANYI
GSDKYFHARG
NYDAAKRGPG
НААЗ
(SEQ
NO:
104)
QGWLTFLKAA
GQGAKDMWRA
YSDMKEANYK
KSDKYFHARG
NYDAVQRGPG
HAA4
(SEQ
NO:
105)
ESWRSFFKEA
LQGVGDMGRA
YWDIMISNHQ
NSNRYLYARG
NYDAAQRGPG
HAAl
(SEQ
NO:
102)
GVWAAEAISD
ARENTQRF--
FGHGA--
-EDS
HAA2
(SEQ
NO:
103)
GAWAAEVISN
ARENIQRL--
TGHGA--
-EDS
НААЗ
(SEQ
NO:
104)
GVWATEVISD
AHENVQRL--
TGdhA--
-EDS
HAA4
(SEQ
КТО:
105)
GVWAAKLISR
SRVYLQGLid
yylFGNSStV
1EDS
Фиг. 6
HAAl
(SEQ
ID NO:
102)
GHGAEDS
H7AA2
(SEQ
ID NO:
103)
GHGAEDS
НААЗ
(SEQ
ID NO:
104)
GdhAEDS
HAA4
(SEQ
ID NO:
105)
StvlEDS
Мышиная SAAl Мышиная SAA2 Мышиная SAA3 Мышиная SAfi.4 (SEQ ID NO: 106)
(SEQ ID NO: 107)
(SEQ ID NO: 108)
(SEQ ID NO: 109)
Фиг. 7
1 MKLLTSLVFC SLLLGVCHGG FFSFVHEAFQ GAGDMWRAYT DMKEANWKNS 1 MKLLTSLVFC SLLLGVCHGG FFSFIGEAFQ GAGDMWRAYT DMKEAGWKDG 1 MKPSIAIILC ILILGVDSQR WVQFMKEAGQ GSRDMWRAYS DMKKANWKNS 1 MRLATVIVLC SLFLGVSGDG WYSFFREAVQ GTWDLWRAYR DnlEANYQNA
Мышиная SAAl
Мышиная SAA2
Мышиная SAA3 Мышиная SAA4 (SEQ ID NO: 106)
(SEQ ID NO: 107)
(SEQ ID NO: 108)
(SEQ ID NO: 109)
51 DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDGR EAFQE FFG RGHE
51 DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDAR ESFQE FFG RGHE
51 DKYFHARGNY DAARRGPGGA WAAKVISDAR EAVQK FTG HGAE
51 DQYFYARGNY EAQQRGSGGI WAAKIISTSR KYFqgllnry YFGirnHGLE
Мышиная SAAl
Мышиная SAA2
Мышиная SAA3
Мышиная SAA4
(SEQ ID NO: 106)
(SEQ ID NO: 107)
(SEQ ID NO: 108)
(SEQ ID NO: 109)
93 DTIADQEANR HGRSGKDPNY YRPPGLPDKY
93 DTMADQEANR HGRSGKDPNY YRPPGLPAKY
93 DSEADQFANE WGRSGKDPNH FRPAGLPKRY
101 TLQATQKAEE WGRSGKNPNH FRPEGLPEKF
Фиг. 8
MSAAl MAAl
(SEQ (SEQ
ID NO: ID NO:
106) 110)
1 1
mklltslvfс slllgvchgG FFSFVHEAFQ GAGDMWRAYT DMKEANWKNS
<3 FFSFVHEAFQ GAGDMWRAYT DMKEANWKNS
MSAAl MAAl
(SEQ (SEQ
ID NO: ID NO:
106) 110)
51 32
DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDGR EAFQEFFGRG HEDTiadqea
DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDGR EAFQEFFGRG HEDT
MSAAl MAAl
(SEQ (SEQ
ID NO: ID NO:
106) 110)
101
nrhgrsgkdp nyyrppglpd ky
Фиг. 9
MSAA2 MAA2
(SEQ (SEQ
ID NO: ID NO:
107) 1115
1 1
mklltslvfс slllgvchgG FFSFIGEAFQ GAGDMWRAYT DMKEAGWKDG
G FFSFIGEAFQ GAGDMWRAYT DMKEAGWKDG
MSAA2 MAA2
(SEQ (SEQ
ID NO: ID NO:
107) 111)
51 32
DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDAR ESFQEFFGRG HEDTmadqea
DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDAR ESFQEFFGRG HEDT
MSAA2 MAA2
(SEQ (SEQ
ID NO: ID NO:
107) 111)
10l'
nrhgrsgkdp nyyrppglpa ky
Фиг. 10
MSAA3 (SEQ ID NO: 108) MAA3 (SEQ ID NO: 112)
1 mkpsiaiilc ililgvdsqr wvqfmkEAGQ GSRDMWRAYS DMKKANWKNS
1 EAGQ GSRDMWRAYS DMKKANWKNS
MSAA3 (SEQ ID NO: 108) MAA3 (SEQ ID NO: 112)
51 DKYFHARGNY DAARRGPGGA WAAKVISDAR EAVQKFTGHG AEDSradqfa
25 DKYFHARGNY DAARRGPGGA WAAKVISDAR EAVQKFTGHG AEDS
MSAA3 (SEQ ID NO: 108) MAA3 (SEQ ID NO: 112) 101 newgrsgkdp nhfrpaglpk ry
Фиг. 11
MSAA4 (SEQ ID NO: 109) MAA4 (SEQ ID NO: 113)
1 mrlatvivlc slflgvsgdg WYSFFREAVQ GTWDLWRAYR DNLEANYQNA
! WYSFFREAVQ GTWDLWRAYR DNLEANYQNA
MSAA4 (SEQ ID NO: 10 9)
MAA4 (SEQ ID NO: 113)
MSAA4 (SEQ ID NO: 10 9)
MAA4 (SEQ ID NO: 113)
51 DQYFYARGNY EAQQRGSGGI WAAKIISTSR KYFQGLLNRY YFGIRNHGLE 31 DQYFYARGNY EAQQRGSGGI WAAKIISTSR KYFQGLLNRY YFGIRNHGLE
101 TLqatqkaee wgrsgknpnh frpeglpekf
81 TL-- -
Фиг. 12
MAAl MAA2 МААЗ MAA4
(SEQ ID NO:
(SEQ ID NO:
(SEQ ID NO:
(SEQ ID NO:
110) 111) 112) 113)
1 GFFSFVHEAF QGAGDMWRAY TDMKEANWKN SDKYFHARGN YDAAQRGPGG
1 GFFSFIGEAF QGAGDMWRAY TDMKEAGWKD GDKYFHARGN YDAAQRGPGG
1 BAG QGSRDMWRAY SDMKKANWKN SDKYFHARGN YDAARRGPGG
1 -WYSFFREAV QGTWDLWRAY RDNLEANYQN ADQYFYARGN YEAQQRGSGG
MAAl MAA2 MAA3 MAA4
(SEQ ID NO:
(SEQ ID NO:
(SEQ ID NO:
(SEQ ID NO:
110) 111) 112) 113)
51 VWAAEKISDG REAFQE -FFG RGH EDT
51 VWAAEKISDA RESFQE -FFG RGH EDT
44 AWAAKVISDA REAVQK -FTG HGA EDS
50 TWAAKIISTS RKYFQgllnr yYFGirnHGL ETL
Фиг. 13
MAAl (SEQ ID NO: 110)
MAA2 (SEQ ID NO: 111)
MAA3 (SEQ ID NO: 112)
MAA4 (SEQ ID NO:- 113)
69 GRGHEDT
69 GRGHEDT
62 GHGAEDS
76 nHGLETL
Фиг. 14
HSAAl (SEQ ID NO: 98) MSAAl (SEQ ID NO: 106)
MKLLTGLVFC SLVLGVSSRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS MKLLTSLVFC SLLLGVCHGG FFSFVHEAFQ GAGDMWRAYT DMKEANWKNS
HSAAl (SEQ ID NO: 98) MSAAl (SEQ ID NO: 106)
51 51
DKYFHARGNY DAAKRGPGGV WAAEAISDAR eniQRFFGHG AEDSLADQAA DKYFHARGNY DAAQRGPGGV WAAEKISDGR eafQEFFGRG HEDTIADQEA
HSAAl (SEQ ID NO: 98) MSAAl (SEQ ID NO: 106)
101 101
NEWGRSGKDP NHFRPAGLPE KY NRHGRSGKDP NYYRPPGLPD KY
Фиг. 15
HAAl (SEQ ID NO: 102) MAAl (SEQ ID NO: 110)
rsFFSFLGEA FDGARDMWRA YSDMREANYi gSDKYFHARG NYDAAKRGPG g-FFSFVHEA FQGAGDMWRA YTDMKEANWk nSDKYFHARG NYDAAQRGPG
HAAl (SEQ ID NO: 102) MAAl (SEQ ID NO: 110)
51 GVWAAEAISD AREniQRFFG HGAEDS 50 GVWAAEKISD GREafQEFFG RGHEDT
Фиг. 16
HAAl (SEQ ID NO: 102) MAAl (SEQ ID NO: 110)
Фиг. 17
GHGAEDS GRGHEDT
HSAAlальфа HSAAl бета HSAAlraMMa
(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
114) 115) 116)
1 mKLLTGLVFC SLVLGVSSRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS 1 mKLLTGLVFC SLVLGVSSRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS 1 mKLLTGLVFC SLVLGVSSRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DMREANYIGS
HSAAlальфа HSAAlбета HSAAlraMMa
(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
114) 115) 116)
51 DKYFHARGNY DAAKRGPGGV WAAEAISDAR ENIQRFFGHG AEDSLADQAA 51 DKYFHARGNY DAAKRGPGGA WAAEVISDAR ENIQRFFGHD AEDSLADQAA 51 DKYFHARGNY DAAKRGPGGV WAAEAISDAR ENIQRFFGHD AEDSLADQAA
HSAAlальфа HSAAl бета HSAAlraMMa
(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
114) 115) 116)
101 NEWGRSGKDP NHFRPAGLPE KY 101 NEWGRSGKDP NHFRPAGLPE KY 101 NEWGRSGKDP NHFRPAGLPE KY
Фиг. 18
HSAA2альфа (SEQ ID NO: 114) HSAA26eTa (SEQ ID NO: 115)
mKLLTGLVFC SLVLSVSSRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DmREANYIGS mKLLTGLVFC SLVLSVSSRS FFSFLGEAFD GARDMWRAYS DmREANYIGS
HSAA2альфа (SEQ ID NO: 114) HSAA26eTa (SEQ ID NO: 115)
51 51
DKYFHARGNY DAAKRGPGGA WAAEVISNAR ENIQRLTGHG AEDSLADQAA DKYFHARGNY DAAKRGPGGA WAAEVISNAR ENIQRLTGRG AEDSLADQAA
HSAA2альфа НЗАА2бета (SEQ ID NO: 114) (SEQ ID NO: 115)
101 101
NKWGRSGKDP NHFRPAGLPE KY NKWGRSGRDP NHFRPAGLPE KY
Фиг. 19
10 20 30 40
Человеческая (SEQ ID NO: 119) : RSFFSFLGEA FDGARDMWRA YSDMREANYI GSDKYFHARG
Мышиная (SEQ ID NO: 120) : G FFSFIGEA FQGAGDMWRA YTDMKEAGWK DGDKYFHARG
Шарпей (SEQ ID NO: 121) : E WYSFVGEA AQGAWDMLRA YSDMREANYK NSDKYFHARG
Человеческая Мышиная Шарпей
(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
119) 120) 121)
NYDAAKRGPG NYDAAQRGPG NYDAAQRGPG
GVWAAEAISD GVWAAEKISD GAWAAKVISD
ARENIQRFFG ARESFQEFFG ARENSQRDSG
HGAEDSLADQ RGHEDTMADQ HGAEDSKADQ
ITDLLRFG
Человеческая Мышиная Шарпей
(SEQ ID NO: 119): (SEQ ID NO: 120): (SEQ ID NO: 121):
AANEWGRSGK EANRHGRSGK AANEWG
100 DPNHFRPAGL DPNYYRPPGL
104 PEKY PAKY
Фиг. 20
kpla
(SEQ
123)
kplb
(SEQ
124)
kplc
(SEQ
125)
kpld
(SEQ
126)
kple
(SEQ
127)
kplf
(SEQ
128)
kpig
(SEQ
129)
kp2a
(SEQ
130)
kp2b
(SEQ
NO-.131)
kp2c
(SEQ
132)
kp3a
(SEQ
133)
kp3b
(SEQ
134)
kp3c
(SEQ
135)
kp4
(SEQ
136)
kp5
(SEQ
137)
0 1 2 3 3 4 5
111 abc def 0 5 5 4
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSI* *****SSWLA WYQQKPGKAP KLLIYKASSL
S Q. . -D NY.N D. .N.
S Y.N A
G A D
--G A
.S. . S . . .LL DSDDGNTY.D . .L QS . Q TL.YR
.S..S...LL HS.NGYNY.D ..L....QS. Q....LG.NR
.S.KS. .-LL HS.DGKTY.Y ..L QP. Q EV.NR
LS V N Q. . R G. .TR
LS VS Y Q. . R G. . .R
LS VS Y Q. . R D. .NR
S G RND.G R...A
S G NY.. .F S...A
. .V. .
.T.LS
. .V. .
. . .LS
. .V. .
-T.LS
E.V. .
. . .A.
E.VL.
. . -G.
E.VL,
. . .A.
. .V. .
. . .DS
ETTL.
. . -AF
A. .L S
S V
. PVTP. EPAS .PVTP.EPAS ..VTP.QPAS ..V.P.E.A. . .L.P.E.A. ..L.P.E.A-
..V DS .AV.L.E.A. .N.KS...VL YSSNNKNY QP W..TR
ETTL.... AF M. . TP ..K.N .S.K...D DDDMN E.A IFI.QE.TT.
kpla
(SEQ
N0:123)
ESGVPSRFSG
SG* * SGTEFT
LTISSLQPDD
FATYYCQQYN
SYS****
kplb
(SEQ
NO 124)
-T
D. .
NLP
kplc kpld
(SEQ (SEQ
N0:125) NO:126)
D. .
E.
....SY
.TP... .
..L.H.
kple
(SEQ
N0:127)
D. .
E.
. .P
kplf
(SEQ
N0:128)
D. .
E.
N.P
kpig
(SEQ
NO:129)
D. .
E.
....A.
. FP
kp2a
(SEQ
NO.-130)
VGV.
..M.RI
EFP
kp2b
(SEQ
NO:131)
VGV.
..M.AL
QTP
kp2c
(SEQ
NO:132)
F D
D. .
VGV.
.-M.SI
QLP
kp3a
(SEQ
N0:133)
SE.
NWP
kp3b
(SEQ
N0:134)
AT.I.D
R.E.E.
. .V.
.SP
kp3c
(SEQ
N0:135)
AT.I.A
E.E.
NWP
kp4
(SEQ
NO:136)
D
D. .
AE.
V.V.
.TP
kp5
(SEQ
NO:137)
VP.I.P
..Y.-D..
A.Y.
F.D.HD
NFP
Фиг. 21
Imla
(SEQ
NO:
138)
lmlb
(SEQ
NO:
139)
1ml с
(SEQ
NO:
14 0)
lm2a
(SEQ
NO:
141)
lm2b
(SEQ
NO:
142)
lm3a
(SEQ
NO;
143)
lm3b
(SEQ
N0:
144)
lm3c
(SEQ
NO:
145)
lm4
(SEQ
NO:
146)
lm6
(SEQ
NO:
147)
lici7
(SEQ
NO:
148)
ImB
(SEQ
NO:
149)
5 4
WYQQLPGTAP KLLIYENNKR
R--Q¦
G.SN.
...-H..K.. .-M...GS.. . . . .H. -K. . . ,M.-DVS. .
0 1 2 3 3 4
111 abc def 05 5
QSVLTQPPS* VSAAPGQKVT ISCSGSSSNI G****NNYVS
A.GT. . -R S . . . Y
. . -V G R T A. . .GYD.H
..A A.. ..GS...SI. ...T.T..DV .S.-.Y.L..
..A R. . ..GS...VI. ...T.T..DV .G...Y
SY V. ..KTAR .T-G-NNIG* * SKS-H . . . .K. .Q. . V.W.DDSD.
SYE VS...TAR .T...DALP* * KQ .AY K. .Q . . V.V..KDSE.
SYE ..VS...TAS -T...DKLG* *....DK.AC ....K..QS. V.V..QDS..
S.E...D.A. ..V.L..T.R .T.Q.D.LR* * SY.A K. .Q. . V.V..GK.N.
NFM H. . . .ES..KT TR..GS. A S...Q R..SS. TTV...D.Q.
.T.V..E... LTVS..GT.. LT.AS.TGAV TS...GY.PN .F..K..Q.. RA...STSNK
.L S... A..SL.AS.K LT.TL..G** *..HSSYAIA .H..Q.EKG. RY.MKL.SDG
8 9
5 ab
3 3
Imla
(SEQ
138)
PSGIPDRFSG
SK**SGTSAT
LGITGLQTGD
EADYYCGTWD SSLSA**
lmlb
(SEQ
139)
AA. . D..-G..
1ml с
(SEQ
NO:
140)
1тп2а
(SEQ
NO:
141)
. ..VSN....
.-NT.S
-T.S...AE.
CSYA G.STL. .
lm2b
(SEQ
NO:
142)
. . .V
.NT.S
T.S...AE.
CSYA G.YTF..
lm3a
(SEQ
NO:
143)
.N.
...NT.
.T.SRVEA.
QV.. ..SDH.
lm3b
(SEQ
NO:
144)
E
.S. .
...TV.
.T.S.V.AE.
QSA. ..G**..
lm3c
(SEQ
NO:
145)
lm4
(SEQ
NO:
146)
.S. .
..NT.S
.T. . .A.AE.
NSR. ..GNH..
lm6
(SEQ
NO:
147)
. . .V
IDS .
SN. .S
T.S..K.E.
QSY. ..N**..
lm7
(SEQ
NO:
148)
H-WT.A....
.L. .
L.GK.A
.TLB.V.PE.
..E...LLYY GGAQ*..
lm8
(SEQ
NO:
149)
GD
.S. .
. . AERY
.T.SS..SE.
Q.-G TGI**--
Фиг. 22
1 10 21 31 35
NFLLTQPHS VSESPGKTVT ISCTRSSGSI A****NNYVH WYQQRPGSSP
45 55 65AB 73 82 93
TTVIFEDDHR PSGVPDRFSG SVDTSSNSAS LTISGLKTED EADYYCQSYD HNN
Vj.6 Wil (SEQ Ш NO: 150) Фиг. 23
Фиг. 28
X /"2 3 ' 4 • -5 б. 7 " '8 9 Std
Мышиный VL (2А4 и 8G9)
MKLPWLLVLMFWIPASSSDVVMTOTPLSLPVSLGDOASISCRSSOSLVHSTGNTl^ GSGT/YTTX^SRVEAEDLGVYFCSOSTHWFTFGGGTKLEIK (SEQ Ш NO: 152)
Мышиный VL (7D8) NuCLPyRLLvTMFWiPASSS
GSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSOSTHVPFTFGGGTKLEIK (SEQ Ш NO: 153) Мышиный VH (2A4, 7D8, 8G9)
MVLGLKWWF\^YOGVHCEVOLVESGGRLVOPKGSI^
DRFTgRDDSOSMLYLOMNNLKTEDTAMYYCVRPYSDSFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ГО NO: 154)
Фиг. 36A
Человеческий VL 24A Версия 1
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNT^ Y"CSQSTHVPFTFGGGTXVEIK(SEQIDNO: 155)
Человеческий VL 24A Версия 2 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLVHST^^ YfCSQSTHVPFTFGGGTKVEIK (SEQ Ш NO: 156)
Человеческий VL 24A Версия 3 DVVMTQSPLSLP\HTPGEPASISCRSSQSLVHSTG YYCSQSTHVPFTFGGGTKVEIK (SEQ Ш NO: 157)
Фиг. 36B
Человеческий VL 7D8 Версия 1 DVVMTQSPLSIJPVTPGEPASISCBJSSLSL^ YfCSQSTHVPFTFGQGTKLEIK (SEQ Ш NO: 158)
Человеческий VL 7D8 Версия 2 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSLSLVHSTGN^ YKSQSTHWFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 159)
Человеческий VL 7D8 Версия 3 DVVMTQSPLSIJP\nrPGEPASISCRSSLSL^ YYCSQSTHVPFTFGQGtKLEIK (SEQ Ш NO: 160)
Человеческий VL 7D8 Версия 4 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSLSL\TSCST YfCSQSTHTVPFTFGGGTKLErK (SEQ Ш NO: 174)
Человеческий VL 7D8 Версия 5
DVVMTQSPLSIJPVTPGEPASISCRSSLSLVHSTGNTYLHWYLQKPG YfCSQSTHVPFTFGGGTKLEIK(SEQIDNO: 175)
Человеческий VL 7D8 Версия 6 DVVMTQSPLSLPVTFGEPASISCRSSLSLVHS YYCSQSTHWFTFGGGTKLEIK (SEQ Ш NO: 176)
Фиг. 36C
Каркасный VL инвентарный No. Gen Bank ВАС 01562 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLHSNGYN^ YYCMQALQTPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 166)
Каркасный VL инвентарный No. Gen Bank ВАС 01733 MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAJVLAJWVMTQSPLS FSGSGSGTDFTLKJSRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTK^^ DNALQSGNSQESVraQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD AGGGSGGGSG (SEQ Ш NO: 167)
Фиг. 36D
Человеческий VH 24A/7D8/8G9 Версия 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN KTEDTAVYYCvRPYSDSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 161)
Человеческий VH 24A/7D8/8G9 Версия 2
EVQLVESGGGLVQPGGSLPvLSCAASGFTFNWAMYWiRQAPGKGLEWVaPJRSKS KTEDTAVYYCvRPYSDSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 162)
Человеческий VH 24A/7D8/8G9 Версия 3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYA KTEDTAVYYCARPYSDSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ГО NO: 163)
24A 7D8 8G9 H_ цепь_ pro (мышиный VH 2A4) EVQLVESGGRLVQPKGSLKLSCAASGFTFN"^ LKTEDTAMYYCVRPYSDSFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 164)
Каркасный VH инвентарный No. Gen Bank AAC51024 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYM^ SLKTEDTAVYYCARYWGATLDYWGQGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 165)
Фиг. 36Е
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028356
028356
- 1 -
- 1 -
(19)
028356
028356
- 1 -
- 1 -
(19)
028356
028356
- 1 -
- 1 -
(19)
028356
028356
- 2 -
- 1 -
028356
028356
- 4 -
- 3 -
028356
028356
- 4 -
- 4 -
028356
028356
- 27 -
- 27 -
028356
028356
- 28 -
- 28 -
028356
028356
- 35 -
- 35 -
028356
028356
- 44 -
- 44 -
028356
028356
- 67 -
- 68 -
028356
028356
- 70 -
- 70 -
028356
028356
- 76 -
- 76 -
028356
028356
- 76 -
- 76 -
028356
028356
- 76 -
- 76 -
028356
028356
- 77 -
- 77 -
028356
028356
- 78 -
<220> <221>
- 78 -
<220> <221>
028356
028356
- 79 -
<210> 6 <211> 7
- 79 -
<210> 6 <211> 7
028356
028356
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
028356
028356
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
028356
028356
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
028356
028356
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
028356
028356
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
<220>
<223> Получена из А-амилоидного белка
<400> 10
- 80 -
028356
028356
- 81 -
<210> 15
- 81 -
<210> 15
028356
028356
- 81 -
<210> 15
- 81 -
<210> 15
028356
028356
- 81 -
<210> 15
- 81 -
<210> 15
028356
028356
- 81 -
<210> 15
- 81 -
<210> 15
028356
028356
- 81 -
<210> 15
- 81 -
<210> 15
028356
028356
- 82 -
<210> 19
- 82 -
<210> 19
028356
028356
<220>
- 83 -
<221> MISC_FEATURE
<220>
- 83 -
<221> MISC_FEATURE
028356
028356
- 84 -
<210> 26 <211> 4
- 84 -
<210> 26 <211> 4
028356
028356
- 85 -
<220> <223>
- 85 -
<220> <223>
028356
028356
- 85 -
<220> <223>
- 85 -
<220> <223>
028356
028356
- 85 -
<220> <223>
- 85 -
<220> <223>
028356
028356
Cys Glu Asp Asp
- 86 -
Cys Glu Asp Asp
- 86 -
028356
028356
- 87 -
<210> 39 <211> 4
- 87 -
<210> 39 <211> 4
028356
028356
<220> <223>
- 88 -
догенных белков
<220> <223>
- 88 -
догенных белков
028356
028356
<220> <223>
- 88 -
догенных белков
<220> <223>
- 88 -
догенных белков
028356
028356
- 89 -
- 89 -
028356
028356
- 89 -
- 89 -
028356
028356
- 89 -
- 89 -
028356
028356
- 89 -
- 89 -
028356
028356
- 89 -
- 89 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
028356
028356
- 91 -
<400> 56
- 90 -
<220>
028356
<220>
028356
- 93 -
- 93 -
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
- 94 -
<210> 70
- 94 -
<210> 70
028356
028356
<220>
- 95 -
<223> Эпитоп Pan DR
<220>
- 95 -
<223> Эпитоп Pan DR
028356
028356
<223> Получена из гемагглютинина А вируса гриппа
<400> 77
- 96 -
<223> Получена из гемагглютинина А вируса гриппа
<400> 77
- 96 -
028356
028356
<223> Получена из гемагглютинина А вируса гриппа
<400> 77
- 96 -
<223> Получена из гемагглютинина А вируса гриппа
<400> 77
- 96 -
028356
028356
<223> Получена из гемагглютинина А вируса гриппа
<400> 77
- 96 -
<223> Получена из гемагглютинина А вируса гриппа
<400> 77
- 96 -
028356
028356
- 97 -
- 97 -
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
- 98 -
<210> 85 <211> 14 <212> PRT
028356
028356
Cys Gly Gly His Glu Asp Thr
- 99 -
1 5
Cys Gly Gly His Glu Asp Thr
- 99 -
1 5
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 100 -
- 100 -
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 101 -
- 102 -
<400> 99
028356
028356
- 104 -
- 104 -
028356
028356
- 105 -
106
<210> 106 <211> 117
028356
028356
- 108 -
- 108 -
028356
028356
- 110 -
<400> 112
- 110 -
<400> 112
028356
028356
<220>
- 111 -
<221> MISC_FEATURE <223> HSAA1 alpha
<220>
- 111 -
<221> MISC_FEATURE <223> HSAA1 alpha
028356
028356
- 112 -
- 112 -
028356
028356
- 117 -
- 117 -
028356
028356
- 117 -
- 117 -
028356
028356
- 117 -
- 117 -
028356
028356
- 117 -
- 117 -
028356
028356
- 117 -
- 117 -
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
<220>
- 118 -
<221> MISC_FEATURE <223> kple
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
MISC_FEATURE
Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 130
119
028356
028356
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 132
- 120 -
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Зародышевые последовательности V каппа легкой цепи
<400> 132
- 120 -
028356
028356
- 121 -
<220>
<221> MISC_FEATURE
- 122 -
<223> V лямбда легкой цепи
028356
028356
- 124 -
- 124 -
028356
028356
- 125 -
<220>
<221> MISC_FEATURE
- 126 -
<223> V лямбда легкой цепи
028356
028356
- 125 -
<220>
<221> MISC_FEATURE
- 126 -
<223> V лямбда легкой цепи
028356
028356
- 125 -
<220>
<221> MISC_FEATURE
- 126 -
<223> V лямбда легкой цепи
028356
028356
- 128 -
- 128 -
028356
028356
- 129 -
- 130
028356
028356
- 129 -
- 130
028356
028356
- 131 -
- 130
028356
028356
- 131 -
- 130
028356
028356
- 132 -
<400> 155
- 132 -
<400> 155
028356
028356
- 133 -
- 133 -
028356
028356
- 135 -
- 135 -
028356
028356
- 135 -
- 135 -
028356
028356
- 135 -
- 135 -
028356
028356
- 135 -
- 135 -
028356
028356
- 141 -
<400> 169
- 140 -
028356
028356
- 143 -
- 143 -
028356
028356
- 145 -
- 145 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 147 -
- 147 -
028356
028356
- 148 -
- 148 -
028356
028356
- 148 -
- 148 -
028356
028356
- 148 -
- 148 -
028356
028356
- 148 -
- 148 -
028356
028356
- 148 -
- 148 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 149 -
- 149 -
028356
028356
- 150 -
- 150 -
028356
028356
- 150 -
- 150 -
028356
028356
- 152 -
- 152 -
028356
- 153 -
- 154 -
028356
- 153 -
- 154 -
028356
- 155 -
- 154 -
028356
028356
- 156 -
- 156 -
|
