|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ген сахарной свеклы BvPRR7, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54. 2. Растительный экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 3. Растительный экспрессионный вектор по п.2, который представляет собой экспрессионный вектор для РНК i. 4. Клетка растения сахарной свеклы, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3. 5. Трансгенное растение сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования и содержит растительную клетку по п.3 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 6. Часть растения сахарной свеклы, выбранная из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли, которые получают из трансгенного растения сахарной свеклы по п.5, где указанная часть растения сахарной свеклы включает клетки растения сахарной свеклы по п.4 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 7. Способ трансформации растений свеклы, отличающийся тем, что в клетки сахарной свеклы вводят молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3. 8. Полинуклеотидный маркер, представляющий собой молекулу ДНК, созданный на основе нуклеотидных последовательностей, раскрытых в п.1, который позволяет различать генотипы, обеспечивающие проявление характерных для однолетнего и для двулетнего типа развития фенотипов растения сахарной свеклы, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, обеспечивающие проявление характерных для двулетнего или однолетнего типа развития фенотипов, причем указанный маркер дополнительно содержит один однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и способен обнаруживать один или несколько SNPs в положениях, которые выбраны из группы, включающей положения № 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8, причем указанные SNPs приведены в табл. 7-1 и 7-2. 9. Пара праймеров, состоящая из "прямого" праймера и "обратного" праймера, обладающих способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области геномной ДНК свеклы, для которой характерно полностью совместное наследование с геном, обусловливающим стрелкование (BvPRR7), причем указанная последовательность является нуклеотидной последовательностью по п.1, и к амплификации полинуклеотидного маркера по п.8, где указанный полинуклеотидный маркер содержит один или несколько SNPs, которые являются диагностическими для аллеля BvPRR7B в локусе BvPRR7, и позволяет различать растения сахарной свеклы, которые имеют характерный для однолетнего и для двулетнего типа развития генотип. 10. Пара праймеров по п.9, выбранная из группы, включающей: а) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в 3-м интроне гена BvPPR7, представленной в SEQ ID NO: 6, и к амплификации фрагмента из указанной области, который содержит SNP, б) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, и к амплификации фрагмента из указанной последовательности, содержащего SNP, выбранный из SNPs, которые присутствуют в различных аллелях указанной последовательности и представлены в табл. 7-1 и 7-2. 11. Пара праймеров по п.9 или 10, содержащая: а) "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и "обратный" праймер PRR7(T6)-R, представленный в SEQ ID NO: 50, для амплификации фрагмента, содержащего SNP № 2334; или б) "прямой" праймер PRR7(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 13, и "обратный" праймер PRR7(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 14, для амплификации фрагмента, содержащего SNP № 160.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ген сахарной свеклы BvPRR7, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54. 2. Растительный экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 3. Растительный экспрессионный вектор по п.2, который представляет собой экспрессионный вектор для РНК i. 4. Клетка растения сахарной свеклы, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3. 5. Трансгенное растение сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования и содержит растительную клетку по п.3 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 6. Часть растения сахарной свеклы, выбранная из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли, которые получают из трансгенного растения сахарной свеклы по п.5, где указанная часть растения сахарной свеклы включает клетки растения сахарной свеклы по п.4 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 7. Способ трансформации растений свеклы, отличающийся тем, что в клетки сахарной свеклы вводят молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3. 8. Полинуклеотидный маркер, представляющий собой молекулу ДНК, созданный на основе нуклеотидных последовательностей, раскрытых в п.1, который позволяет различать генотипы, обеспечивающие проявление характерных для однолетнего и для двулетнего типа развития фенотипов растения сахарной свеклы, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, обеспечивающие проявление характерных для двулетнего или однолетнего типа развития фенотипов, причем указанный маркер дополнительно содержит один однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и способен обнаруживать один или несколько SNPs в положениях, которые выбраны из группы, включающей положения № 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8, причем указанные SNPs приведены в табл. 7-1 и 7-2. 9. Пара праймеров, состоящая из "прямого" праймера и "обратного" праймера, обладающих способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области геномной ДНК свеклы, для которой характерно полностью совместное наследование с геном, обусловливающим стрелкование (BvPRR7), причем указанная последовательность является нуклеотидной последовательностью по п.1, и к амплификации полинуклеотидного маркера по п.8, где указанный полинуклеотидный маркер содержит один или несколько SNPs, которые являются диагностическими для аллеля BvPRR7B в локусе BvPRR7, и позволяет различать растения сахарной свеклы, которые имеют характерный для однолетнего и для двулетнего типа развития генотип. 10. Пара праймеров по п.9, выбранная из группы, включающей: а) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в 3-м интроне гена BvPPR7, представленной в SEQ ID NO: 6, и к амплификации фрагмента из указанной области, который содержит SNP, б) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, и к амплификации фрагмента из указанной последовательности, содержащего SNP, выбранный из SNPs, которые присутствуют в различных аллелях указанной последовательности и представлены в табл. 7-1 и 7-2. 11. Пара праймеров по п.9 или 10, содержащая: а) "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и "обратный" праймер PRR7(T6)-R, представленный в SEQ ID NO: 50, для амплификации фрагмента, содержащего SNP № 2334; или б) "прямой" праймер PRR7(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 13, и "обратный" праймер PRR7(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 14, для амплификации фрагмента, содержащего SNP № 160.
Евразийское 028355 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201001767
(22) Дата подачи заявки 2009.05.25
(51) Int. Cl. C12N15/82 (2006.01)
(54) ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ
(31) PCT/EP2008/056390
(32) 2008.05.23
(33) EP
(43) 2011.06.30
(86) PCT/EP2009/056262
(87) WO 2009/141446 2009.11.26
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЗИНГЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Гилен Йоханнес Якобус Лудгерус (FR), Крафт Томас, Пен Пьерр (SE)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Пивницкая Н.Н., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Комарова О.М., Белоусов Ю.В. (RU)
(56) WO-A-2008142167
DATABASE EMBL/GENBANK/DDBJ 24 September 2004 (2004-09-24), MCGRATH, J. MITCHELL: "MM5H06 young roots probed with 3 and 7 week old root enriched transcripts, Beta vulgaris cDNA, mRNA sequence." XP002535976 retrieved from EBI Database accession no. CV301305 * 100% identity in 840 nt overlap of CV301305 (840 nt) with SEQ ID NO: 1 (840 nt) of the present application *abstract
GAAFAR R.M. ET AL.: "Bacterial artificial chromosome-derived molecular markers
for early bolting in sugar beet" THEORETICAL
AND APPLIED GENETICS; INTERNATIONAL JOURNAL OF PLANT BREEDING RESEARCH, SPRINGER-VERLAG, BE, vol. 110, no. 6, 1 April 2005 (2005-04-01), pages 1027-1037, XP019321879 ISSN: 1432-2242 cited in the application the whole document
HOHMANN U. ET AL.: "A bacterial artificial chromosome (BAC) library of sugar beet and a physical map of the region encompassing the bolting
gene B." MGG MOLECULAR GENETICS AND
GENOMICS, vol. 269, no. 1, April 2003 (2003-04), pages 126-136, XP002487656 ISSN: 1617-4615 the whole document
EL-MEZAWY A. ET AL.: "High-resolution mapping of the bolting gene В of sugar beet"
THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol.
105, no. 1, July 2002 (2002-07), pages 100-105, XP002487538 ISSN: 0040-5752 the whole document
(57) В изобретении представлены трансгенные растения сахарной свеклы, имеющие фенотип замедленного стрелкования. В заявке описаны также полинуклеотиды, тесно сцепленные с обусловливающим стрелкование геном или геном B в геноме сахарной свеклы, и которые можно применять для дискриминации генотипа, ассоциированного с однолетним типом развития, и генотипа, ассоциированного с двулетним типом развития, или различных гаплотипов в группах растений сахарной свеклы, характеризующихся ассоциированным с двулетним типом развития генотипом.
Настоящее изобретение относится в целом к области молекулярной биологии растений, трансформации растений и селекции растений. Более конкретно изобретение относится к трансгенным растениям сахарной свеклы, для которых характерен фенотип замедленного стрелкования. Изобретение относится также к полинуклеотидным маркерам, которые тесно сцеплены или находятся в гене bolting (ген, обусловливающий стрелкование, ген, определяющий одно-двулетний тип развития) или гене B в геноме сахарной свеклы и которые можно применять для того, что различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплоидные генотипы (гаплотипы) в группах растений сахарной свеклы, которые имеют характерный для двулетнего типа развития генотип.
Окультуренная сахарная свекла (Beta vulgaris ssp. vulgaris L) представляет собой двулетнее растение, которое в первый год образует запасающий корень и листовую розетку. Удлинение побега (стрелкование) и образование цветка начинается после периода низкой температуры. В противоположность этому для многих диких представителей свекольных B. vulgaris ssp. maritima характерен однолетний тип развития в результате присутствия обусловливающего стрелкование гена B в локусе B, который картирован в центральной области хромосомы II. Ген BOLTING (B-ген) ответствен за детерминацию признака одно-летности у сахарной свеклы. Однолетность у видов p. Beta рассматривается как моногенный и доминантный признак. Растения, несущие доминантный В-аллель, обладают способностью переходить от юве-нильной к репродуктивной стадии независимым от яровизации образом, что отличает их от двулетних растений, которые несут b-аллель, при наличии которого яровизация является совершенно необходимой для того, чтобы могло происходить стрелкование и последующее цветение. Доминантный аллель локуса В часто встречается у различных диких видов свекольных, и он обусловливает стрелкование в течение периодов с длинным световым днем, и у таких растений отсутствует необходимость в низких температурах, которые, как правило, требуются для двулетних культиваров (Abe и др., 1997), несущих рецессивный аллель.
Стрелкование (удлинение побега) является первой хорошо заметной стадией перехода от вегетативного к репродуктивному росту.
Традиционно двулетнюю окультуренную сахарную свеклу высаживают весной и собирают осенью. Однако ожидается, что удлинение вегетационного периода в результате посева осенью и культивации в течение зимы должно существенно повышать урожайность и позволять расширять операции по переработке сахарной свеклы, что соответствует требованиям сахарной промышленности. Однако культивирование зимой существующей в настоящее время сахарной свеклы в центральной Европе (т.е. в виде озимой культуры) в современных условиях невозможно, поскольку яровизация (которая индуцируется воздействием низких температур в течение зимы) может приводить к стрелкованию и снижению урожайности. Таким образом, существует очень большая потребность в создании нестрелкующейся озимой сахарной свеклы, яровизационный ответ которой модифицируют с целью придания устойчивости к стрелкованию или значительного замедления стрелкования после индукции охлаждением. Поскольку ген B играет ключевую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, он является многообещающим кандидатом для конструирования устойчивости к стрелкованию путем модуляции яровизационного ответа.
Кроме того, у окультуренной сахарной свеклы стрелкование является нежелательным явлением, поскольку оно приводит к резкому снижению урожая и к проблемам в процессе сбора урожая и при экстракции сахара. Производство семян сахарной свеклы для продажи часто осуществляют в регионах, в которых произрастают однолетние сорные виды свекольных, что может вызывать загрязнение образующихся семян пыльцой этих растений, приводя к присутствию генотипа, характерного для однолетнего типа развития, в предназначенных для продажи семенах. Это является неприемлемым для покупателей. Для выявления загрязнения характерным для однолетнего типа развития генотипом партии предназначенных для продажи семян выращивают в регионах, в которых однолетние виды свекольных не вырастают непосредственно после сбора семян. Растения являются неяровизированными и загрязняющие растения выявляют по наличию стрелок. Является очень желательной замена такого метода оценки основанным на применении маркеров скрининговым анализом, с помощью которого можно получать результаты за более короткий период времени, что должно приводить к снижению стоимости переработки семян.
Подход, основанный на применении маркеров, может оказаться также целесообразным для селекции сахарной свеклы, например для ускорения процесса селекции, или для интродукции нового признака изменчивости, выбранного из множества диких видов свекольных. Из-за неполной пенетрантности B-аллеля и его зависимости от окружающей среды при селекции линий растений существует потребность в тесно сцепленных с ним молекулярных маркерах для осуществления скрининга по признаку его присутствия. Во всех этих случаях важно иметь маркер, тесно сцепленный с геном B, для того чтобы иметь возможность точно идентифицировать однолетний или двулетний типы развития.
Исходя из вышеизложенных потребностей существует необходимость в разработке трансгенных подходов (основанных на применении трансгенов), предназначенных для модуляции яровизационного ответа сахарной свеклы, а также в связанных с использованием маркеров подходов для того, что различать аллели гена B, с которыми ассоциирован однолетний или двулетний типы развития, что является важным для производства семян и селекции сахарной свеклы.
При создании настоящего изобретения были разработаны такие трансгенные подходы, а также ассоциированные с использованием маркеров подходы, предназначенные для решения указанных выше задач.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, которые имеют последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, к нуклеотидным последовательностям, которые содержат по меньшей мере 15 последовательно расположенных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, или к нук-леотидным последовательностям, которые гибридизуются в строгих условиях с одной из них, или к нук-леотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту. Касательно гомологии последовательностей, все индивидуальные численные значения, которые подпадают под диапазон, указанный выше в настоящем описании, который начинается по меньшей мере с 70, т. е. 71, 72, 73, 74, 75,...80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, должны также рассматриваться как подпадающие под объем настоящего изобретения. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, состоит по меньшей мере из 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или по меньшей мере из 50 последовательно расположенных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54. Следует понимать, что понятие "по меньшей мере x нук-леотидов" относится к молекулам нуклеиновых кислот, имеющих любое численное значение, начинающееся с x и выше. Например, подразумевается, что понятие "по меньшей мере 15 нуклеотидов" относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые включают 15, 16, 17, 18, 19, 20 или большее количество нуклеотидов. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная выше нуклео-тидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, гибридизуется в строгих условиях, более предпочтительно в очень строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54.
В одном из вариантов указанного объекта изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, и ее комплемент. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная выше нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит нуклеотид-ную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, где эта последовательность имеет одну или несколько замен, делеций или добавлений нуклеиновых кислот, которые представлены в табл. 7-1 и 7-2, где полиморфизмы, указанные в табл. 7-1 и 7-2, соответствуют 18 аллелям, ассоциированным с однолетним типом развития, и 2 аллелям, ассоциированным с двулетним типом развития, в последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8. Табл. 7-1 и 7-2 представлены также на фиг. 11 и 12.
Следующим объектом настоящего изобретения являются также полипептиды, которые кодируются указанными выше нуклеотидными последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный выше полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 11 или 12.
Изобретение относится также к применению гена B, прежде всего гена BvPRR7, в основанном на использовании трансгенов подходе для получения растений, имеющих характеризующийся отсутствием стрелкования фенотип. В частности, изобретение относится к химерным конструкциям, содержащим кассету экспрессии, которая несет указанную выше нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, под контролем регуляторных элементов, в частности под контролем регулятор-ных элементов, обладающих функциональной активностью в растениях.
В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, описанная выше, может содержать также ген маркера для селекции, который позволяет различать трансформированный и не-трансформированный растительный материал при осуществлении процесса отбора.
В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в изобретении, содержит маркер отрицательной селекции, прежде всего маркер для селекции, который кодирует фактор, определяющий устойчивость к токсичным для растения соединениям, таким как антибиотики или гербициды. В другом варианте осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в изобретении, содержит маркер положительной селекции, прежде всего маркер для селекции, который кодирует фермент, придающий трансформированному растению селективное преимущество по сравнению с нетрансформированными растениями, прежде всего преимущество с позиций питания, такой, например, как ген фосфоманнозоизомеры или ген ксилозоизомеразы.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, предназначенная для трансгенной понижающей регуляции экспрессии гена BvPRR7, в частности посредством антисмыслового или PHKi-подхода. В этом контексте подразумевается, что понятие "понижающая регуляция" или "супрессирующее действие" относится к любому снижению уровня экспрессии гена BvPPR7 по сравнению с экспрессией гена в нентрансформированных растениях в таких же условиях. Под это понятие подпадает также "молчание" гена, при котором не удается выявлять экспрессию гена. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, которая предназначена для трансгенной понижающей регуляции экспрессии гена BvPRR7, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую dsPHK, которая обладает способностью к целенаправленному расщеплению мРНК, полученных в результате транскрипции последовательности ДНК, которая кодирует белок, являющийся продуктом гена B, предпочтительно белок, являющийся продуктом гена BvPRR7. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная выше химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую dsPHK, где молекула нуклеиновой кислоты состоит по меньшей мере из 21 нуклеотида и практически идентична по меньшей мере части кодирующей последовательности гена BvPRR7. Указанные кодирующие последовательности гена BvPRR7 представляют собой предпочтительно указанные выше нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении. Более предпочтительно кодирующие последовательности гена BvPRR7 представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 53 или 54, предлагаемую в настоящем изобретении. Понятие " практически идентичны" относится к двум молекулам нуклеиновых кислот, которые могут гибридизо-ваться друг с другом в строгих условиях. Как правило, идентичность или гомология между dsPHK и кодирующей последовательностью гена BvPRR7 или его частями не подразумевает наличие идентичности или гомологии по всей длине dsPHK. Является достаточным, если идентичными являются участки, состоящие меньшей мере из 21 нуклеотида, однако предпочтительно выбирают нуклеотидные последовательности, кодирующие dsPHK, которые гомологичны молекуле РНК-мишени на участке длиной более 21 нуклеотида. Предпочтительно указанная выше химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует dsPHK и состоит более чем из 21 нуклеотида, более предпочтительно более чем из 50, 100, 250, 500, 600, 750, 1000 или большего количества нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей dsPHK, которая входит в химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, которая находится под контролем конститутивного промотора, предпочтительно промотора Ubi3 из Arabidopsis. В другом варианте осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит также последовательность второго интрона из гена StLS1 картофеля (Eckes и др., 1986; Vancanneyt и др., 1990). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит инвертированный повтор, мишенью которого является BvPRR7, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, клонированной между промотром Ubi3 (Norris и др., 1993) и терминатором Nos, как в антисмысловой, так и в смысловой ориентации, разделенными с помощью второго интрона гена StLS1 из картофеля.
Одним из вариантов осуществления изобретения является трансформирующий вектор и/или экс-прессионный вектор, прежде всего растительный трансформирующий вектор и/или экспрессионный вектор, который содержит химерную конструкцию, предлагаемую в изобретении и описанную выше. Согласно следующему варианту осуществления изобретения растительный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионный вектор, применяемый для PHKi, который содержит указанную выше химерную конструкцию, предлагаемую в изобретении. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения экспрессионный вектор, применяемый для PHKi, содержит химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, которая представлена на фиг. 10.
Другим объектом настоящего изобретения является растительная клетка, содержащая химерную конструкцию или векторную молекулу (например, трансформирующий вектор или экспрессионный вектор), предлагаемую в изобретении и описанную выше. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растительная клетка, содержащая химерную конструкцию или векторную молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, представляет собой растительную клетку растения сахарной свеклы.
Кроме того, в изобретении предложены трансгенные растения, прежде всего растения сахарной свеклы, для которых характерен фенотип замедленного стрелкования, или их клетки, ткани или семена, которые все содержат растительную клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, и/или химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, и/или нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, как они описаны выше, где трансгенное растение экспрессирует dsPHK, которая замедляет стрелкование, в частности подавляет стрелкование, и растение характеризуется фенотипом замедленного стрелкования, предпочтительно фенотипом отсутствия стрелкования. Под понятием "замедление стрелкования" подразумевают модуляцию встречающейся в естественных условиях реакции
стрелкования растений сахарной свеклы. В процессе стрелкования стебель удлиняется на первой стадии стрелкования и во время перехода от вегетативного роста к репродуктивному росту после яровизации растений (т.е. воздействия низких температур), и в конце концов приводит к развитию цветка. Подразумевается, что замедление реакции стрелкования относится к удлинению стебля, которое начинается позднее, чем у растений в норме; такие растения характеризуются фенотипом замедленного стрелкования. Реакцию стрелкования можно замедлить на несколько дней (т. е. на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней) и на период вплоть до нескольких недель (т.е. на 2, 3. 4 недели) или нескольких месяцев (т.е. на 1, 2, 3, 5 или 6 месяцев). В предпочтительном варианте осуществления изобретения реакцию стрелкования полностью подавляют; такие растения не начинают давать стрелку после яровизации и характеризуются фенотипом отсутствия стрелкования. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются трансгенные растения, прежде всего растения сахарной свеклы, которые получают из клеток, тканей или семян, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридных семян, из которых можно выращивать растения, прежде всего растения сахарной свеклы, которые имеют фенотип модулированного стрелкования. Указанные способы предпочтительно заключаются в том, что а) получают линию растений, прежде всего линию сахарной свеклы, которые имеют фенотип модулированного стрелкования, прежде всего трансгенного растения сахарной свеклы, предлагаемого в изобретении и описанного выше, в качестве первой родительской линии, б) получают вторую линию растений, прежде всего линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; где одна из родительских линий, полученных на стадии а) или стадии б), представляет собой мужскую стерильную линию, обладающую ЦМС (цитоплазматическая мужская стерильность), и где вторая родительская линия обладает мужской фертильностью, и в) дают растениям родительской линии, обладающей мужской фертильностью, опылять цветки второй родительской линии, обладающей мужской стерильностью, дают развиться семенам, и собирают гибридный семенной материал; где собранные гибридные семена представляют собой семена гибридного растения, прежде всего гибридного растения сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования. В предпочтительном варианте осуществления изобретения обе родительские линии представляют собой линии растений сахарной свеклы, при этом по меньшей мере одна из родительских линий сахарной свеклы представляет собой трансгенную линию сахарной свеклы, предлагаемую в настоящем изобретении. По меньшей мере одна родительская линия сахарной свеклы, имеющая фенотип модулированного стрелкования, может предпочтительно представлять собой также растение, не несущее какого-либо трансгена, который затем создают другими методами генетической манипуляции, которые описаны ниже. Согласно одному из вариантов этого объекта линия растения сахарной свеклы, полученная на стадии а), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы с мужской стерильностью, обладающую ЦМС, которая содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, или их фрагментов, а вторая родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии б), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, обладающую мужской фертильностью. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии а), представляет собой растение сахарной свеклы, обладающее мужской фертильностью, которое содержит одну или несколько нуклео-тидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, или их фрагментов, а вторая родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии б), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы с мужской стерильностью, обладающую ЦМС.
Следующим объектом настоящего изобретения является гибридное семя растения, прежде всего растения сахарной свеклы, характеризующееся фенотипом замедленного стрелкования. Согласно другому объекту настоящего изобретения гибридное семя получают с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении и описанного выше. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридное растение, прежде всего гибридное растение сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования, получают путем выращивания описанного выше гибридного семени, предлагаемого в настоящем изобретении. Следующий предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к частям растения, выбранным из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, клетки, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли, экстракты или биологические образцы, которые получают из трансгенного растения сахарной свеклы или его семян, предлагаемых в настоящем изобретении, или получают из описанных выше гибридных растений или семян, предлагаемых в настоящем изобретении.
Следующим объектом настоящего изобретения является применение нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, или их фрагментов для трансформации растительных клеток, прежде всего клеток растений сахарной свеклы. Целью трансформации растительных клеток, прежде всего клеток растения сахарной свеклы, нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении, или ее фрагментами является модуляция особенностей стрелкования растений, описанная выше. Другим вариантом этого объекта изобретения является способ трансформации растительных клеток, прежде всего клеток растения сахарной свеклы, где способ заключается в том, что применяют нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или химерную кон
струкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, или вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, которые описаны выше. Следующим объектом настоящего изобретения является применение трансгенного растения, предлагаемого в настоящем изобретении, гибридного растения, предлагаемого в настоящем изобретении, или частей растений, предлагаемых в настоящем изобретении и указанных выше, в способе, выбранном из группы, включающей способы получения сахара, способы аэробной ферментации и способы анаэробной ферментации. Предпочтительно трансгенное растение, предлагаемое в настоящем изобретении, гибридное растение, предлагаемое в настоящем изобретении, или части растения, предлагаемые в настоящем изобретении и указанные выше, применяют в способе получения сахара. Другим объектом изобретения является способ получения сахара, в котором растение сахарной свеклы или его клетки или ткани, предлагаемые в настоящем изобретении и указанные выше, перерабатывают для получения сахара. Настоящее изобретение относится также к сахару, полученному из переработанного растения сахарной свеклы, или его клеток, или тканей, предлагаемых в настоящем изобретении и указанных выше.
Следующим объектом настоящего изобретения является полинуклеотидный маркер, созданный на основе нуклеотидной последовательности, которую можно получать из области геномной ДНК, для которой характерна истинная косегрегация с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (геном B), у сахарной свеклы, где маркер позволяет различать генотип, характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, которые имеют генотип, характерный для двулетнего типа развития или характерный для однолетнего типа развития. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклео-тидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют нуклеотидную последовательность, которую можно получать из одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении и указанных выше. В одном из вариантов осуществления изобретения полинук-леотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, несут также один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на SNP (однонуклеотидный полиморфизм, полиморфизм единичных нуклеотидов), SSR (простые повторяющиеся последовательности), делеции или инсер-ции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на SNP, этот полиморфизм является диагностическим для аллеля B в локусе B. Указанные полинуклеотидные маркеры предпочтительно обладают способностью выявлять по меньшей мере один из различных SNP, присутствующих в различных аллелях геномной последовательности, которая представлена в контексте настоящего описания в виде SEQ ID NO: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12), где указанный полипептидный маркер позволяет осуществлять дифференциацию различных аллелей, прежде всего различать однолетние и двулетние линии сахарной свеклы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидный маркер, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает способностью выявлять по меньшей мере один SNP, выбранный из группы SNP в положениях №№ 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12). Следующим объектом настоящего изобретения является набор полинуклеотидных маркеров, который содержит множество индивидуальных маркеров, предлагаемых в настоящем изобретении, которые описаны выше. В этом контексте понятие "множество" относится к набору, включающему больше одного полинуклеотидного маркера, который предпочтительно состоит из двух, трех или большего количества маркеров.
Другим объектом настоящего изобретения является пара праймеров, которая состоит из "прямого" праймера и "обратного" праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в геномной области геномной ДНК сахарной свеклы, характеризующейся истинной косегрегацией с обусловливающим стрелкование геном (геном B). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пара праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в изобретении и указанной выше, и обеспечивает амплификацию полинуклеотида, предпочтительно полинуклеотидного маркера, предлагаемого в настоящем изобретении, или его информативного фрагмента, где указанный полинуклеотид содержит один или несколько полиморфизмов, прежде всего один или несколько полиморфизмов, который(ые) является(ются) диагностическим(и) для аллеля B в локусе B, и позволяет различать генотип, характерный для однолетнего типа развития, и генотип, характерный для двулетнего типа развития. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пару праймеров, предлагаемую в настоящем изобретении, выбирают из группы, включающей а) пару праймеров, которая обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в 3-м интроне BvPPR7, представленной в SEQ ID NO: 6, и к амплификации информативного фрагмента из указанной области, который содержит полиморфизм, прежде всего полиморфизм, представляющий собой SNP С/Т в положении № 87, и/или SNP С/Т в положении № 160, и/или SNP A/G в положении № 406; или б) пару праймеров, которая обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, и к амплификации информативного фрагмента из указанной последовательности области, которая содержит полиморфизм, выбранный из полиморфизмов на основе SNP, которые присутствуют в различ
ных аллелях указанной последовательности, что показано в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения пара праймеров, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит а) "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и "обратный" праймер PRR7(T6)-R, представленный в SEQ ID NO: 50, для амплификации фрагмента, который содержит SNP № 2334; или б) "прямой" праймер PRR7(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 13, и "обратный" праймер PRR7(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 14, для амплификации фрагмента, который содержит SNP № 160; или в) "прямой" праймер 1r22(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 55, и "обратный" праймер 1r22(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 56, для амплификации фрагмента и молекулы-зонда 1r22(T1)-VIC, представленной в SEQ ID NO: 57, в качестве первой молекулы-зонда, меченной VIC в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулы-зонда 1r22(T1)-FAM, представленной в SEQ ID NO: 58, в качестве второй молекулы-зонда, меченной FAM в качестве второго флуоресцентного красителя.
Одним из вариантов осуществления изобретения является один или множество молекул-зондов и/или один или множество праймеров, прежде всего один или несколько праймеров, но особенно предпочтительно одна или множество пар праймеров, содержащих "прямой" праймер и "обратный" праймер, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью, которую можно получать из области геномной ДНК, характеризующейся истинной косегрегацией с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (геном B), у сахарной свеклы, где маркер позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, которые имеют генотип, характерный для двулетнего типа развития или характерный для однолетнего типа развития.
Одним из вариантов осуществления изобретения является набор полинуклеотидных зондов, содержащий по меньшей мере две различные молекулы-зонды, которые комплементарны подобласти в информативном полинуклеотидном фрагменте, предлагаемом в изобретении и описанном выше, который содержит полиморфный сайт, с помощью которого амплифицируют частично перекрывающиеся фрагменты, различающиеся только одним или двумя ошибочными спариваниями оснований в области перекрытия, при этом первый зонд, прежде всего зонд, меченный первым флуоресцентным красителем, более предпочтительно первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а второй зонд, прежде всего зонд, меченный вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, более предпочтительно вторым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой другой аллель.
Указанные выше полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, набор по-линуклеотидных маркеров, предлагаемый в изобретении, или пару праймеров, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять для анализа аллельной дискриминации с целью выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития, у растения сахарной свеклы.
В другом варианте осуществления изобретения предложен анализ аллельной дискриминации для выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития, у растения сахарной свеклы, который позволяет различать однолетние и двулетние растения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для осуществления этого анализа применяют полинуклеотид-ный маркер, предлагаемый в изобретении, набор полинуклеотидных маркеров, предлагаемый в изобретении, или пару праймеров, предлагаемую в настоящем изобретении.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в настоящем изобретении, заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) отбирают образец геномной ДНК из растения сахарной свеклы, подлежащий анализу, б) амплифици-руют фрагмент из указанного образа или геномной ДНК с использованием пары праймеров, предлагаемой в настоящем изобретении, и в) сравнивают амплифицированный фрагмент с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с фенотипом двулетнего типа развития, но не с фенотипом однолетнего типа развития. В этом анализе последовательность амплифицированного фрагмента на стадии в) сравнивают с последовательностями аллелей, в отношении которых известно, что они ассоциированы с фенотипом двулетнего типа развития. Если последовательность отличается от последовательностей аллелей, ассоциированных с фенотипом двулетнего типа развития, то это свидетельствует о присутствии аллеля, ассоциированного с фенотипом однолетнего типа развития (т. е. однолетнего растения). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения амплифицированный фрагмент, полученный на стадии в), при анализе аллельной дискриминации зондируют первой флуоресцентноме-ченной молекулой-зондом, которая содержит последовательность, специфическую для аллеля, ассоциированного с фенотипом однолетнего типа развития. Если уровень флуоресценции красителя первого зонда увеличивается в процессе реакции, то это свидетельствует о присутствии аллеля, ассоциированного с фенотипом однолетнего типа развития.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения в анализе, предлагаемом в настоящем изобретении, применяют либо а) "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и " обратный" праймер PRR7(T6)-R, представленный в SEQ ID NO: 50, для амплификации фрагмента, кото
рый содержит SNP № 2334, и молекулу-зонд PRR7(T6)-VIC, представленную в SEQ ID NO: 51, в качестве первой молекулы-зонда, меченной с помощью VIC в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулу-зонд PRR7(T6)-FAM, представленную в SEQ ID NO: 52, в качестве второй молекулы-зонда, меченной с помощью FAM в качестве второго флуоресцентного красителя; или б) "прямой" праймер PRR7(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 13, и "обратный" праймер PRR7(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 14, для амплификации фрагмента, который содержит SNP № 160, и молекулу-зонд PRR7(T1)-VIC, представленную в SEQ ID NO: 15, в качестве первой молекулы-зонда, меченной с помощью VIC в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулу-зонд PRR7(T1)-FAM, представленную в SEQ ID NO: 16, в качестве второй молекулы-зонда, меченной с помощью FAM в качестве второго флуоресцентного красителя; или (в) "прямой" праймер 1r22(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 55, и " обратный" праймер 1r22(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 56, для амплификации фрагмента, и молекулу-зонд 1r22(T1)-VIC, представленную в SEQ ID NO: 57, в качестве первой молекулы-зонда, меченной с помощью VIC в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулу-зонд 1r22(T1)-FAM, представленную в SEQ ID NO: 58, в качестве второй молекулы-зонда, меченной с помощью FAM в качестве второго флуоресцентного красителя.
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа развития генотипом предназначенных для продажи семян, заключающийся в том, что применяют основанный на использовании маркера анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в изобретении и описанный выше.
Краткое описание чертежей и последовательностей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - сравнение аминокислотных последовательностей REC-доменов различных видов и предполагаемого REC-домена EST CV301305 сахарной свеклы. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; консервативные - серым цветом; аминокислоты с низким уровнем подобия - светлосерым цветом и неподобные - белым цветом. Bb, Bordetella bronchiseptica; Bs, Bacillus subtilis; Bv, Beta vulgaris; Ec, Escherichia coli; Kp, Klebsiella pneumoniae; Pa, Pseudomonas aeruginosa; Re, Rhodobacter cap-sulatus; Sc, Streptomyces coelicolor; Sf, Shigella flexneri; St, Salmonella typhimurium;
на фиг. 2 - сравнение аминокислотных последовательностей белка PRR7 Arabidopsis и предсказанного фрагмента белка EST V301305 сахарной свеклы. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; подобные - серым цветом; и неподобные - белым цветом;
на фиг. 3 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей геномной и мРНК гена PRR7 Arabidopsis и EST CV301305 сахарной свеклы. Консервативные нуклеотиды Arabidopsis и Beta vulgaris L. обозначены серым цветом. Интроны обозначены заштрихованными полосами;
на фиг. 4 - генетическая карта хромосомы II сахарной свеклы. Название маркеров приведены справа от хромосомы, а слева показаны генетические дистанции в порядке их возрастания;
на фиг. 5 - схематическое изображение генной структуры гена BvPRR7, включая предполагаемые экзоны и интроны. Область, консервативная EST CV301305, обозначена широкой стрелкой;
на фиг. 6 - сравнение аминокислотных последовательностей представителей семейства продуктов гена PRR Arabidopsis и белка BvPRR7. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; консервативные - серым цветом; аминокислоты с низким уровнем подобия - светло-серым цветом и неподобные - белым цветом;
на фиг. 7 - филогенетическая взаимосвязь между BvPRR7 и родственными белками из других видов цветковых растений, установленная с помощью филогенетического анализа множества представителей семейства гена PRR из нескольких видов растений, включая гомолог PRR7 из сахарной свеклы, Arabi-dopsis thaliana (TOC1, NP 200946; PRR3, NP_568919; PRR5, NP 568446; PRR7, NP 568107; и PRR9, NP 566085), Oryza sativa (PRR37, Q0D3B6), Hordeum vulgare (PPD-H1, AAY17586) и Triticum aestivum (PPD-D1, ABL09477), с использованием метода "объединения соседей" (Neighbor-Joining Method) (Saitou и Nei, 1987). Для выведения эволюционной истории анализируемых таксонов применяли консенсусное дерево, построенное методом "бутстрэпа" ("bootstrap") на основе 1000 реплик (Felsenstein, 1985). Ветви, соответствующие разделению, воспроизводимому менее чем в 50% "bootstrap''-реплик, удаляли (осуществляли их коллапс). Рядом с ветвями указан процент реплик деревьев, для которых ассоциированные таксоны кластеризовали, при осуществлении "bootstrap"-анализа (1000 реплик). Дерево изображено в таком масштабе, когда длины ветвей представлены в тех же единицах, представляющих собой эволюционные расстояния, которые применяли для выведения филогенетического дерева. Эволюционные расстояния рассчитывали с помощью метода коррекции Пуассона (Zuckerkandl и Pauling, 1965) и выражали в единицах, представляющих собой количество аминокислотных замен на один сайт. Все позиции, содержащие "бреши", и недостающие данные исключали из базы данных ("опция полной делеции"). В конечной базе данных содержалось в целом 352 позиции;
на фиг. 8 - суточные профили экспрессии BvPRR7 в однолетних и двулетних растениях сахарной свеклы. Листовые ткани собирали каждые 2 ч в течение периода времени, составляющего 24 ч. Белым и темно-серым фоном обозначены соответственно данные, полученные в течение периода света и периода темноты. Данные представлены в виде средних значений, полученных для трех независимых биологиче
ских образцов. Значения выражали в виде относительных уровней экспрессии, стандартизованных относительно референс-гена BvICDH, с помощью анализа на основе геометрического усреднения (Vandesom-pele и др., 2002). "Усами" обозначено ±C.K.O. ZT, таймер;
на фиг. 9 - конечный результат анализа аллельной дискриминации для набора однолетних и двулетних отдельных растений. Значения, отложенные на осях Y и X, представляют собой уровни флуоресценции красителя FAM и красителя VIC соответственно. Значительное увеличение уровня флуоресценции только красителя VIC (ось X) свидетельствует о гомозиготности аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития (обозначен на этом чертеже как аллель X). Значительное увеличение уровня флуоресценции только красителя FAM свидетельствует о гомозиготности аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития (обозначен на этом чертеже как аллель Y). Значительное увеличение уровня обоих флуоресцентных сигналов свидетельствует о гетерозиготности, т.е. об однолетнем растении, гетерозиготном по локусе B;
на фиг. 10 - плазмидная карта бинарного вектора, применяемого для трансгенной супрессии BvPRR7 с помощью PHKi. Инвертированный повтор для BvPRR7 состоит из кДНК-фрагмента размером 0,6 т.п.н., который клонировали между промотором Ubi3 (Norris и др., 1993) и терминатором Nos как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации, разделенных вторым интроном гена StLS1 картофеля (Eckes и др., 1986; Vancanneyt и др., 1990). Селектируемый маркер представляет собой ген PMI под контролем промотора HSP80 (Brunke и Wilson, 1993);
на фиг. 11 - таблица, в которой представлены полиморфизмы, идентифицированные в промоторной области BvPRR7, полученные при сравнении 18 аллелей BvPRR7, которые ассоциированы с однолетним типом развития, и 2 аллелей BvPRR7, которые ассоциированы с двулетним типом развития, положения SNP, представленные в таблице, пронумерованы согласно SEQ ID NO: 8;
на фиг. 12 - таблица, в которой представлены полиморфизмы, идентифицированные в кодирующей области BvPRR7, полученные при сравнении 18 аллелей BvPRR7, которые ассоциированы с однолетним типом развития, и 2 аллелей BvPRR7, которые ассоциированы с двулетним типом развития, положения SNP, представленные в таблице, пронумерованы согласно SEQ ID NO: 8.
Последовательности.
SEQ ID NO: 1 - нуклеотидная последовательность EST CV301305 сахарной свеклы, SEQ ID NO: 2 - нуклеотидная последовательность "прямого" праймера PRR7-F, SEQ ID NO: 3 - нуклеотидная последовательность "обратного" праймера PRR7-F SEQ ID NO: 4 - нуклеотидная последовательность интрона 3 аллельного варианта 2 BvPRR7 (гапло-тип №2),
SEQ ID NO: 5 - нуклеотидная последовательность интрона 3 аллельного варианта 1 BvPRR7 (гапло-тип №1),
SEQ ID NO: 6 - нуклеотидная последовательность интрона 3 BvPRR7 и ее аллельная изменчивость, предназначенная для картирования,
SEQ ID NO: 7 - геномная нуклеотидная последовательность аллеля BvPRR7, ассоциированного с двулетним типом развития,
SEQ ID NO: 8 - нуклеотидная последовательность геномной нуклеотидной последовательности BvPRR7, включающая промоторную и терминирующую области,
SEQ ID NO: 9 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля BvPRR7, ассоциированного с двулетним типом развития,
SEQ ID NO: 10 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля BvPRR7, ассоциированного с однолетним типом развития,
SEQ ID NO: 11 - предполагаемая аминокислотная последовательность аллеля BvPRR7, ассоциированного с двулетним типом развития,
SEQ ID NO: 12 - предполагаемая аминокислотная последовательность аллеля BvPRR7, ассоциированного с однолетним типом развития,
SEQ ID NO: 13 - нуклеотидная последовательность праймера PRR7(T1)-F, SEQ ID NO: 14 - нуклеотидная последовательность праймера PRR7(T1)-R, SEQ ID NO: 15- нуклеотидная последовательность зонда PRR7(T1)-VIC, SEQ ID NO: 16 - нуклеотидная последовательность зонда PRR7(T1)-FAM, SEQ ID NO: 17 - нуклеотидная последовательность праймера GJ131(T1)-F, SEQ ID NO: 18 - нуклеотидная последовательность праймера GJ131(T1)-R, SEQ ID NO: 19 - нуклеотидная последовательность зонда GJ131(T1)-VIC, SEQ ID NO: 20 - нуклеотидная последовательность зонда GJ131(T1)-FAM, SEQ ID NO: 21 - нуклеотидная последовательность праймера ED031700(T1)-F, SEQ ID NO: 22 - нуклеотидная последовательность праймера ED031700(T1)-R, SEQ ID NO: 23 - нуклеотидная последовательность зонда ED031700(T1)-VIC, SEQ ID NO: 24 - нуклеотидная последовательность зонда ED031700(T1)-FAM, SEQ ID NO: 25 - нуклеотидная последовательность праймера 27(T2)-F, SEQ ID NO: 26 - нуклеотидная последовательность праймера 27(T2)-R,
SEQ ID NO: 27 - нуклеотидная последовательность зонда 9_27(T2)-VIC, SEQ ID NO: 28 - нуклеотидная последовательность зонда 9_27(T2)-FAM, SEQ ID NO: 29 - нуклеотидная последовательность праймера GJ01(T1)-F, SEQ ID NO: 30 - нуклеотидная последовательность праймера GJ01(T1)-R, SEQ ID NO: 31 - нуклеотидная последовательность зонда GJ01(T1)-VIC, SEQ ID NO: 32 - нуклеотидная последовательность зонда GJ01(T1)-FAM, SEQ ID NO: 33 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3977, SEQ ID NO: 34 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3988, SEQ ID NO: 35 - нуклеотидная последовательность праймера SELA4442, SEQ ID NO: 36 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3809, SEQ ID NO: 37 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3810, SEQ ID NO: 38 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3807, SEQ ID NO: 39 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3766, SEQ ID NO: 40 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3769, SEQ ID NO: 41 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3857, SEQ ID NO: 42 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3860, SEQ ID NO: 43 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3861, SEQ ID NO: 44 - нуклеотидная последовательность праймера SELA3864,
SEQ ID NO: 45 - нуклеотидная последовательность "прямого" праймера BvPRR7, применяемого для анализа экспрессии генов,
SEQ ID NO: 46 - нуклеотидная последовательность "обратного" праймера BvPRR7, применяемого для анализа экспрессии генов,
SEQ ID NO: 47 - нуклеотидная последовательность "прямого" праймера BvICDH, применяемого для анализа экспрессии генов,
SEQ ID NO: 48 - нуклеотидная последовательность "обратного" праймера BvICDH, применяемого для анализа экспрессии генов,
SEQ ID NO: 49 - нуклеотидная последовательность праймера PRR7(T6)-F,
SEQ ID NO: 50 - нуклеотидная последовательность праймера PRR7(T6)-R,
SEQ ID NO: 51 - нуклеотидная последовательность зонда PRR7(T6)-VIC,
SEQ ID NO: 52 - нуклеотидная последовательность зонда PRR7(T6)-FAM,
SEQ ID NO: 53 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля PRR7, ассоциированного с однолетним типом развития, расположенная по ходу транскрипции относительно ее промотор-ной области длиной примерно 1,3 т.п.н.,
SEQ ID NO: 54 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля PRR7, ассоциированного с однолетним типом развития, включающая ее промоторную область длиной примерно 1,3 т.п.н. и ее терминаторную область длиной примерно на 0,7 т.п.н.,
SEQ ID NO: 55 - нуклеотидная последовательность праймера 1r22(T1)-F,
SEQ ID NO: 56 - нуклеотидная последовательность праймера 1r22(T1)-R,
SEQ ID NO: 57 - нуклеотидная последовательность зонда 1r22(T1)-VIC,
SEQ ID NO: 58 - нуклеотидная последовательность зонда 1r22(T1)-FAM.
Определения.
Технические понятия и выражения, применяемые в настоящем описании, как правило, если специально не указано иное, имеют значения, которые обычно используют в области молекулярной биологии растений.
В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения подразумевается, если из контекста ясно не следует иное, что употребляемое в единственном числе существительное включает также множественное число. Так, например, ссылка на "растение" включает одно или несколько растений, а ссылка на " клетку" включает смеси клеток, тканей и т. п.
Понятие "сахарная свекла" относится ко всем видам и подвидам рода Beta, а также ко всем сортам культурной свеклы Beta vulgaris. Культурные сорта свеклы подразделяют на четыре группы: листовая свекла, огородная свекла, кормовая свекла и сахарная свекла. Понятие "сахарная свекла" относится также ко всем культурным сортам свеклы, включая сорта, выращиваемые для целей, отличных от получения сахара, например, для получения этанола, пластиков или индустриальных продуктов. В частности, понятие "сахарная свекла" относится к кормовой свекле и сахарной свекле, но наиболее предпочтительно к сахарной свекле. Под это понятие подпадают также растения сахарной свеклы, адаптированные для выращивания в тропических или субтропических регионах.
Понятие "однолетняя линия сахарной свеклы" относится к растению сахарной свеклы, содержащему доминантный аллель В в локусе B в гетерозиготном или гомозиготном состоянии.
Понятие "двулетняя линия сахарной свеклы" относится к растению сахарной свеклы, содержащему рецессивный аллель b в локусе B в гетерозиготном состоянии.
Понятие "стрелкование" относится к переходу от вегетативной розеточной стадии к стадии цветения или репродуктивного роста.
Под понятием "замедленное стрелкование" или "замедление стрелкования" в контексте настоящего описания подразумевается модуляция встречающейся в естественных условиях реакции стрелкования растений сахарной свеклы. У растений с замедленным стрелкованием удлинение стебля, представляющее собой первую видимую стадию стрелкования, начинается позднее, чем у нормальных растений. Реакцию стрелкования можно замедлять всего лишь на несколько дней (т. е., например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней) и на период, составляющий вплоть до нескольких недель (т.е. на 2, 3, 4 недели) или нескольких месяцев (т.е. на 1, 2, 3, 5 или 6 месяцев)." Замедление стрелкования может приводить также к полному подавлению реакции стрелкования; у таких растений не образуется стрелка после яровизации, и они характеризуются нестрелкующим фенотипом.
Понятие "ген B" в контексте настоящего описания относится к гену, который ответствен за детерминацию признака однолетности (раннее стрелкование) у сахарной свеклы. У растений, несущих доминантный аллель В, может происходить переключение с ювенильной на репродуктивную стадию не зависящим от яровизации образом, т.е. происходить удлинение побега и последующее цветение без предварительного нахождения при низких температурах.
Понятие "яровизация" относится к процессу, при котором у некоторых растений ускоряется индукция цветения при охлаждении растений в течение определенного периода времени.
Понятие "аллель" в контексте настоящего изобретения относится к альтернативным формам различных генетических единиц, ассоциированных с различными формами гена или любыми видами идентифицируемого генетического элемента, которые альтернативно наследуются, поскольку расположены в одном и том же локусе в гомологичных хромосомах. В диплоидной клетке или организме два аллеля данного гена (или маркера), как правило, расположены в соответствующих локусах на паре гомологичных хромосом.
В контексте настоящего описания понятие "гаплотип" относится к набору аллелей, наследуемых индивидуумом от одного родителя. Таким образом, диплоидный индивидуум имеет два гаплотипа. Понятие " гаплотип" можно использовать в более ограниченном смысле для обозначения физически связанных и/или несвязанных генетических маркеров (например, полиморфизмы последовательностей), ассоциированных с фенотипическим признаком (в контексте настоящего описания с таким признаком, как признак стрелкования при однолетнем или двулетнем типе развития растений сахарной свеклы). Касательно гена B гаплотип этого гена также определяет непосредственно фенотип. Признак однолетнего типа развития сахарной свеклы, например, определяется присутствием доминантного аллеля локуса В на хромосоме II.
Понятие "локус" в контексте настоящего изобретения относится к области на хромосоме, которая содержит ген или любой другой генетический элемент или фактор, определяющий признак.
В контексте настоящего описания понятие "генетический маркер" относится к особенности индивидуального генома (например, к нуклеотидной или полинуклеотидной последовательности, которая присутствует в индивидуальном геноме), ассоциированной с одним или несколькими представляющими интерес локусами. В некоторых вариантах осуществления изобретения в зависимости от контекста генетический маркер является полиморфным в представляющей интерес популяции или представляет собой локус, в котором присутствует полиморфизм. Генетические маркеры представляют собой, например, такие маркеры, как (но не ограничиваясь только ими) однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), инделы (т.е. инсерции/делеции), простые повторяющиеся последовательности (SSR), полиморфизмы длин рест-рикционных фрагментов (RFLP), произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (RAPD), маркеры, представляющие собой расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (CAPS), маркеры, полученные с помощью технологии разнообразия массивов (Diversity Arrays Technology (DArT), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (AFLP). Генетические маркеры можно применять, например, для локализации на хромосоме генетических локусов, содержащих аллели, с которыми связана вариабельность экспрессии фенотипических признаков. Под понятием "генетический маркер" можно подразумевать также полинуклеотидную последовательность, комплементарную геномной последовательности, такую как последовательность нуклеиновой кислоты, применяемую в качестве зондов.
Генетический маркер физически может быть локализован в положении на хромосоме внутри или вне генетического локуса, с которым он ассоциирован (т.е. он может являться интрагенным или экстрагенным соответственно). Другими словами, хотя генетические маркеры, как правило, применяют, когда локализация на хромосоме гена, соответствующего представляющему интерес локусу, не идентифицирована и имеет место не нулевая степень рекомбинации между генетическим маркером и представляющим интерес локусом, согласно одному из объектов настоящего изобретения можно применять также генетические маркеры, которые физически являются пограничными генетическому локусу (например, находятся внутри геномной последовательности, которая соответствует гену, такому как (но не ограничиваясь только им) полиморфизм в интроне или экзоне гена). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько генетических маркеров включают от 1 до 10 маркеров, а в некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько генетических маркеров включает более 10 генетических маркеров.
В контексте настоящего описания понятие "фенотипический признак" относится к появляющейся или иным образом проявляющейся характеристике индивидуума, являющейся результатом взаимодействия генома с его окружением.
Понятие "фенотип" в контексте изобретения относится к различимой(ым) характеристике(ам) генетически контролируемого признака.
В настоящем описании понятия "тесно сцеплена" или "генетически тесно сцеплена" касательно геномной области генома сахарной свеклы, сцепленной с геном B, подразумевается тесная ассоциация геномной области и гена B при наследовании благодаря близкой локализации обоих на одной и той же хромосоме, что оценивают на основе процента частоты рекомбинации между локусами (в сантиморга-нах, сМ). В контексте настоящего описания понятие "сцепление" и его грамматические варианты относятся к тенденции аллелей, находящихся в различных локусах на одной и той же хромосоме, к сегрегации друг с другом (к косегрегации) чаще, чем это можно было бы ожидать, если бы их перенос был независимым.
В контексте настоящего описания понятие "информативный фрагмент" относится к полинуклео-тидному фрагменту с информационным содержанием, которое является восстановимым и может способствовать определению и/или характеризации представляющего интерес генетического локуса. Это информационное содержание может представлять собой полиморфизм, ассоциированный с указанным представляющим интерес локусом, такой, например, как (но не ограничиваясь только ими) однонуклео-тидные полиморфизмы (SNP), инделы (т.е. инсерции/делеции), простые повторяющиеся последовательности (SSR), полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (RFLP), маркеры, представляющие собой произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (RAPD), расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (CAPS), маркеры, полученные с помощью технологии разнообразия массивов (DArT), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (AFLP), и их можно применять для создания генетического маркера. Информационное содержание "информативного фрагмента" может представлять собой также специфическую последовательность, которую можно выявлять с помощью соответствующей молекулы-зонда. Указанные информативные фрагменты могут представлять собой праймер, или маркер, или их часть. Указанные фрагменты могут состоять по меньшей мере из 10 нуклео-тидов, предпочтительно по меньшей мере из 15, 20, 25, 30, 50 или 100 нуклеотидов.
Понятие "основанная на применении маркера селекция" в контексте настоящего изобретения относится к применению генетических маркеров для выявления одной или нескольких нуклеиновых кислот растения, где нуклеиновая кислота ассоциирована с требуемым признаком, для идентификации растений, которые несут гены требуемых (или нежелательных) признаков, в результате чего эти растения можно использовать (или избегать их использования) в программе селективного размножения.
Понятие "ПЦР (полимеразная цепная реакция)" в контексте изобретения относится к методу получения в относительно больших количествах специфических областей ДНК, что позволяет осуществлять различные анализы, основанные на использовании этих областей.
"ПЦР-праймер" или "праймер" в контексте изобретения относится к коротким фрагментам выделенной одноцепочечной ДНК, применяемым для ПЦР-амплификации специфических областей ДНК. Они обладают способностью к ренатурации с комплементарной цепью ДНК-мишени в результате гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени, а затем к удлинению цепи ДНК-мишени с помощью полимеразы, такой как ДНК-полимераза. Пары или наборы праймеров можно применять для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других общепринятых методов амплификации нуклеиновых кислот. Праймеры, как правило, состоят из 10-15 или большего количества нуклеотидов. Праймеры могут состоять по меньшей мере из 20 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 25 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 30 или большего количества нуклеоти-дов. Указанные праймеры специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в строгих условиях гибридизации. Праймеры, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь полную последовательность, комплементарную последовательности-мишени. Должно быть очевидно, что длина прайме-ров, предлагаемых в настоящем изобретении, может иметь любое численное значение, находящееся в пределах указанного численного диапазона. Так, к праймерам, состоящим из 10-15 или большего количества нуклеотидов, относятся праймеры, состоящие из 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов, в то время как под понятие "по меньшей мере 20 нуклеотидов" подпадают также праймеры, включающие 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. Это относится также и к понятию "включает по меньшей мере 25 или большее количество нуклеотидов" и "включает по меньшей мере 30 или большее количество нуклеотидов".
В контексте настоящего описания понятие "амплифицированный, амплификация" относится к созданию множества копий молекулы нуклеиновой кислоты или множества копий комплементарной молекулы нуклеиновой кислоты с использованием по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Системы амплификации включают систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему на основе лигазной цепной реакции (ЛЦР), транскрипционный метод амплификации нуклеиновых кислот (амплификация на основе нуклеотидных последовательностей) (NASBA, фирма Cangene, Миссиссауга, провинция Онтарио), системы на основе Q-бета репликазы, транскрипционную
систему амплификации (TAS) и амплификации с удалением (вытеснением) цепи (SDA) (см., например, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, под ред. D. H. Persing и др., изд-во American Society for Microbiology, Washington D.C., 1993). Продукт амплификации называют ампликоном.
" Зонд" представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой присоединяют общепринятую выявляемую метку или репортерную молекулу, такую как радиоактивный изотоп, лиганд, хеми-люминисцентный агент, флуросцентную метка или фермент. Указанный зонд является комплементарным цепи нуклеиновой кислоты-мишени. Зонды, предлагаемые в настоящем изобретении, включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также и полиамиды и другие материалы, из которых состоят зонды, которые связываются специфически с последовательностью ДНК-мишени и которые можно применять для выявления присутствия этой последовательности ДНК-мишени.
Праймеры и зонды, как правило, состоят из 10-15 или большего количества нуклеотидов. Праймеры и зонды могут состоять также по меньшей мере из 20 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 25 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 30 или большего количества нуклеотидов. Указанные праймеры и зонды специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в строгих условиях гибридизации. Праймеры и зонды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь полную последовательность, комплементарную последовательности-мишени, хотя с помощью общепринятых методов можно создавать зонды, отличающиеся от последовательности-мишени и сохраняющие способность гибридизоваться с последовательностями-мишенями. Должно быть очевидно, что длина праймеров и зондов, предлагаемых в настоящем изобретении, может иметь любое численное значение, находящееся в пределах указанного численного диапазона. Так, к праймерам и зондам, которые, как правило, состоят из 10-15 или большего количества нуклеотидов, относятся праймеры и зонды, состоящие из 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов, в то время как под понятие "по меньшей мере 20 нуклеотидов" подпадают также праймеры и зонды, включающие 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеоти-дов. Это относится также и к понятию "включает по меньшей мере 25 или большее количество нуклео-тидов" и "включает по меньшей мере 30 или большее количество нуклеотидов".
Понятие "полиморфизм" в контексте изобретения относится к присутствию в популяции двух или большего количества различных форм гена, генетического маркера или наследуемого признака.
Подразумевается, что понятие "однонуклеотидный полиморфизм" или "SNP" в контексте изобретения относится к вариации последовательности ДНК, которая имеет место, когда один нуклеотид в геноме (или другой рассматриваемой последовательности) является различным у представителей видов или в спаренных хромосомах у индивидуума. Два секвенированных ДНК-фрагмента из различных индивидуумов, имеющие различие в одном нуклеотиде, называют также двумя аллелями. Предпочтительно SNP имеет только два аллеля.
Понятие "полинуклеотид" в контексте настоящего описания относится к полимерной высокомолекулярной молекуле, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной, состоящей из мономеров (нуклеотидов), которые содержат сахар, фосфат и основание, относящееся либо к пуринам, либо к пири-мидинам. "Фрагмент полинуклеотида (полинуклеотидный фрагмент)" представляет собой часть данной полинуклеотидной молекулы. В высших растениях дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой генетический материал, а рибонуклеиновая кислота (РНК) участвует в переносе информации, входящей в ДНК, на белки. "Геном" представляет собой полную совокупность генетического материала, входящего в каждую клетку организма. Таким образом, понятие "полинуклеотид" относится к полимеру ДНК или РНК, который может быть одно- или двухцепочечным, необязательно содержащему синтетические не встречающиеся в естественных условиях или измененные нуклеотидные основания, которые могут включаться в полимеры ДНК или РНК. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, включает также ее полученные в результате консервативной модификации варианты (например, замены кодонов из-за вырожденности генетического кода) и комплементарные последовательности, а также определенные указанные последовательности. В частности, для замены кодонов из-за вырожденности генетического кода можно создавать последовательности, в которых в третьем положении в одном или в нескольких выбранных (или во всех) кодонах произведена замена смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (Batzer и др., 1991; Ohtsuka и др., 1985; Rossolini и др., 1994). Понятие "полинуклеотид" используют взаимозаменяемо с понятием "нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность, кДНК и мРНК, кодируемая геном" и т. д.
Понятие "выделенный" в контексте молекул нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем изобретении, относится к нуклеотидной последовательности, идентифицированной в хромосоме и выделенной/отделенной от хромосомной нуклеотидной последовательности, присутствующей в соответствующем организме-источнике. Выделенная нуклеиновая кислота не является нуклеиновой кислотой, которая встречается в естественных условиях, если реально существует ее встречающийся в естественных условиях дубликат. В противоположность этому невыделенные нуклеиновые кислоты представляют собой нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, которые находятся в таком же состоянии, в котором они встречаются в естественных условиях. Например, данная последовательность ДНК (например, ген) при
сутствует в хромосоме клетки-хозяина вблизи от соседних генов. Выделенная нуклеотидная последовательность может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. В альтернативном варианте она может содержать смысловую и антисмысловую цепи (т. е. нуклеотидная последовательность может быть двухцепочечной). В контексте растительного генома молекула нуклеиновой кислоты, предлагаемая в изобретении, отличается от ее встречающихся в естественных условиях дубликатов инсерционным участком, встроенным в геном, и последовательностями, фланкирующими указанный инсерционный сайт. В предпочтительном варианте осуществления изобретения подразумевается, что молекулы нуклеиновых кислот, предлагаемые в изобретении, должны быть выделенными.
В контексте настоящего описания понятие "нуклеиновая кислота" относится к любой физической цепи мономерных единиц, которая может соответствовать цепи нуклеотидов, включая полимер нуклео-тидов (например, типичный полимер ДНК или РНК), модифицированных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотиды, содержащие основания, не являющиеся типичными для биологической РНК или ДНК, например 2'-O-метилированные олигонуклеотиды), и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной, двухцепочечной, многоцепочечной или представлять собой их комбинации. Если не указано иное, то конкретная нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, необязательно содержит или кодирует комплементарные последовательности помимо любых конкретно указанных последовательностей.
Понятие "ген" в широком смысле относится к любому сегменту нуклеиновой кислоты, связанному с биологической функцией. Так, гены включают кодирующие последовательности и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, понятие "ген" относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует конкретный белок и который включает регуляторные последовательности. Гены включают также неэкспресси-руемые сегменты ДНК, которые, например, образуют последовательности, распознаваемые другими белками. Гены можно получать из различных источников, включая клонирование из представляющего интерес источника или синтез из известного или предсказанного на основе информации о последовательности источника, или они могут включать последовательности, сконструированные так, что они имеют требуемые параметры.
В контексте настоящего описания "кассета экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, она содержит промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая функционально связана с сигналами термина-ции. Она, как правило, содержит также последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Кассета экспрессии может содержать также последовательности, которые не являются необходимыми для обеспечения экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности, но присутствие которых связано с созданием соответствующих сайтов рестрикции, предназначенных для удаления кассеты из экспрессионного вектора. Кассета экспрессии, которая содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной, т. е. по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным относительно по меньшей мере одного из других ее компонентов. Кассета экспрессии может представлять собой также кассету, которая встречается в естественных условиях, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетеро-логичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной для хозяина, т.е. конкретная нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты не встречается в естественных условиях в клетке-хозяине и ее необходимо интродуцировать в клетку-хозяина или предшественника клетки-хозяина с помощью известного в данной области метода трансформации. Экспрессия нуклеотид-ной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только при воздействии на клетку-хозяина некоторых определенных внешних стимулов. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфическим для конкретной ткани или органа или стадии развития. Кассету экспрессии или ее фрагмент при трансформации растения можно обозначать также как "встроенная последовательность" или "последовательность-вставка".
Понятие "экспрессия" при применении касательно нуклеотидной последовательности, такой как ген, относится к процессу преобразования генетической информации, кодируемой в гене, в РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК или малая ядерная РНК (мяРНК)) посредством "транскрипции" гена (т.е. посредством ферментативной активности РНК-полимеразы) и, если это возможно, в белок (когда ген кодирует белок) посредством "трансляции" мРНК. Экспрессию генов можно регулировать на многих стадиях этого процесса.
Понятие "химерный ген" относится к любому гену, который содержит
1) последовательности ДНК, включая регуляторные и кодирующие последовательности, которые не встречаются вместе в естественных условиях, или
2) последовательности, кодирующие участки белков, которые не объединены в естественных условиях, или
3) участки промоторов, которые не объединены в естественных условиях.
Таким образом, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, выведенные из различных источников, или содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, выведенные из одного и того же источника, но собранные иным образом по сравнению с их укладкой в естественных условиях.
Понятие "трансген" относится к интродуцированному путем трансформации в геном и стабильно поддерживаемому гену. К трансгенам относятся, например, гены, которые гетерологичны или гомологичны генам конкретного подлежащего трансформации растения. Кроме того, трансгены могут представлять собой нативные гены, встроенные в ненативный организм, или химерные гены.
" Трансформация" представляет собой процесс интродукции гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку- или организм-хозяин. В частности, "трансформация" означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.
" Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растения, в которого интродуцирована молекула гетерологичной нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном хозяина или молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать также в виде внехромосомной молекулы. Указанная вне-хромосомная молекула может обладать способностью к саморепликации. Под трансформированными клетками, тканями или растениями подразумеваются не только конечный продукт процесса трансформации, но также их трансгенное потомство. Понятие "нетрансформированный", "нетрансгенный" или "не-рекомбинантный" хозяин относится к организму дикого типа, например бактерии или растению, который не содержит молекулу гетерологичной нуклеиновой кислоты. В контексте настоящего описания понятие " трансгенный" относится к растению, растительной клетке или к множеству структурированных или неструктурированных растительных клеток, в которые интегрирована с помощью хорошо известных методов генетической манипуляции и встраивания генов последовательность нуклеиновой кислоты, характерная для представляющего интерес гена, в том числе интегрирована в геном растения и, как правило, в хромосому клеточного ядра, митохондрий или в другую содержащую хромосомы органеллу клетки, в другой локус или в большем количестве копий по сравнению с встречающимся в норме в нативном растении или растительной клетке. Трансгенные растения получают в результате манипуляции и встраивания указанных нуклеотидных последовательностей, в отличие от встречающихся в естественных условиях мутаций, с получением не встречающегося в естественных условиях растения, которое имеет не встречающийся в естественных условиях генотип. Методики трансформации растений и растительных клеток хорошо известны в данной области и могут представлять собой, например, электропорацию, микроинъекцию, опосредуемую Agrobacterium трансформацию и баллистическую трансформацию.
Понятие "белок", "пептид" и "полипептид" в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо.
Понятие "кодирующая последовательность" относится к последовательности ДНК или РНК, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность, и не включает некодирующие последовательности. Она может представлять собой "непрерывную кодирующую последовательность", т.е. последовательность, в которой отсутствуют интрон, такую как кДНК, или может включать один или несколько интронов, ограниченных соответствующими сплайсинговыми стыками. "Интрон" представляет собой последовательность РНК, которая входит в первичный транскрипт, но которая удаляется в результате расщепления и повторного лигирования РНК в клетке с образованием зрелой мРНК, которая может транслироваться в белок.
Понятие "промотор" относится к нуклеотидной последовательности, как правило, расположенной против хода транскрипции (5') относительно кодирующей последовательности, которая контролирует экспрессию кодирующей последовательности, обеспечивая распознавание РНК-полимеразой и другими факторами, необходимыми для правильной транскрипции. "Промотор" включает минимальный промотор, который представляет собой короткую последовательность ДНК, содержащую ТАТА-бокс и другие последовательности, которые обеспечивают специфичность сайта инициации транскрипции, к которому добавляют регуляторные элементы для контроля экспрессии. Понятие "промотор" относится также к нуклеотидной последовательности, которая содержит минимальный промотор плюс регуляторные элементы, которые обладают способностью контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Этот тип промотора состоит из проксимальных и более дистально расположенных против хода транскрипции элементов, последние элементы часто относят к энхансерам. Таким образом, "энхансер" обозначает последовательность ДНК, которая может стимулировать активность промотора и может представлять собой присущий промотору элемент или гетерологичный элемент, встроенный для повышения уровня активности или тканеспецифичности помотора. Он может проявлять активность в обоих направлениях (прямом или обратном) и может функционировать даже при его смещении либо против хода, либо по ходу транскрипции относительно промотора. И энхансеры, и другие находящиеся против хода транскрипции промоторные элементы связывают специфические для последовательности ДНК-связывающие белки, которые опосредуют их действия. Промоторы могут быть полностью выведены из нативного гена или состоять из различных элементов, выведенных из различных промоторов, присутствующих в природе, или даже состоять из различных синтетических ДНК-сегментов.
Промотор может включать также последовательности ДНК, которые участвуют в связывании белковых факторов, контролирующих эффективность инициации транскрипции в ответ на физиологические или связанные с фазой развития условия.
"Сайт инициации" представляет собой положение, окружающее первый нуклеотид, который является частью транскрибируемой последовательности, который обозначают также как положение +1. Относительно этого сайта нумеруют все другие последовательности гена и его контролирующие области. Расположенные по ходу транскрипции последовательности (т. е. дополнительные кодирующие белок последовательности, расположенные в 3'-направлении) нумеруют положительными числами, а расположенные против хода транскрипции последовательности (главным образом контролирующие области, расположенные в 5'-направлении) нумеруют отрицательными числами.
Промоторные элементы, в частности TATA-элемент, которые являются неактивными или обладают значительно пониженной промоторной активностью в отсутствии активации против хода транскрипции, обозначают как "минимальные или внутренние промоторы". В присутствии приемлемого фактора транскрипции минимальный промотор функционирует, обеспечивая транскрипцию. Таким образом, "минимальный или внутренний промотор" состоит только из всех основных элементов, необходимых для инициации транскрипции, например TATA-бокса и/или инициатора.
Понятие "конститутивная экспрессия" относится к экспрессии с использованием конститутивного или регулируемого промотора. Понятие "обусловленная" или "регулируемая экспрессия" относится к экспрессии, контролируемой регулируемым промотором.
Понятие "конститутивный промотор" относится к промотору, который может обеспечивать экспрессию открытой рамки считывания (OPC), который обеспечивает контроль во всех или практически во всех растительных тканях в течение всех или практически всех стадий развития растения. Любой из активирующих транскрипцию элементов не характеризуется абсолютной тканеспецифичностью, но опосредует активацию транскрипции в большинстве частей растения на уровне > 1% от уровня, достигаемого в растении, в котором транскрипция является наиболее активной.
Понятие "регулируемый промотор" относится к промоторам, которые контролируют генную экспрессию не конститутивно, а регулируемым временем и/или пространственным положением образом, к ним относятся как тканеспецифические, так и индуцибельные промоторы. Они включают встречающиеся в естественных условиях и синтетические последовательности, а также последовательности, которые могут представлять собой комбинацию синтетических и встречающихся в естественных условиях последовательностей. Различные промоторы могут контролировать экспрессию гена в различных типах тканей или клеток или на различных стадиях развития или в ответ на различные факторы окружающей среды. В настоящее время открыты новые промоторы различных типов, которые можно применять в растительных клетках, их многочисленные примеры описаны у Okamuro и др., 1989. Типичные регулируемые промоторы, которые можно применять в растениях, включают (но не ограничиваясь только ими) индуцируемые антидотами промоторы, промоторы, выведенные из индуцируемой тетрациклином системы, промоторы, выведенные из индуцируемых салицилатами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых спиртами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых глюкокортикоидами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых патогенами систем, и промоторы, выведенные из индуцируемых экдизонами систем.
Понятие "тканеспецифический промотор" относится к регулируемым промоторам, которые экс-прессируются не во всех растительных клетках, а только в одном или нескольких типах клеток в конкретных органах (таких как листья или семена), конкретных тканях (таких как зародыш или семядоля) или в конкретных типах клеток (таких как паренхима листа или запасающие клетки семян). К ним относятся также промоторы, регуляция которых обусловлена периодом времени, таким как ранняя или поздняя стадия эмбриогенеза, стадия созревания в развитии семян и плодов, стадия полностью дифференцированной ткани листа или начало старения.
Понятие "индуцибельный промотор" относится к таким регулируемым промоторам, которые могут превращаться в специфические для одного или нескольких типов клеток под воздействием внешнего стимула, такого как химические агенты, свет, гормон, стресс или патоген.
Понятие "функционально связаны" относится к ассоциации нуклеотидных последовательностей на одном фрагменте нуклеиновой кислоты так, что функция одной оказывает воздействие на функцию другой. Например, регуляторная последовательность ДНК "функционально связана с" или "ассоциирована с" последовательностью ДНК, которая кодирует РНК или полипептид, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК обладает способностью воздействовать на экспрессию кодирующей последовательности ДНК (т. е. транскрипция кодирующей последовательности или функциональной РНК находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.
Понятие "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции эндогенного гена, OPC или ее части или трансгена в растениях. Например, в случае антисмысловых конструкций понятие экспрессия может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК. Кроме того, экспрессия относится к
транскрипции и стабильной аккумуляции смысловой (мРНК) или функциональной РНК. Экспрессия может относиться также к производству белка.
Понятие "сверхэкспрессия" относится к уровню экспрессии в трансгенных клетках или организмах, превышающим уровни экспрессии в нормальных или нетрансформированных (нетрансгенных) клетках или организмах.
Понятие "антисмысловое ингибирование" относится к производству антисмысловых РНК-транскриптов, которые обладают способностью подавлять экспрессию белка с эндогенного гена или трансгена.
Понятие "молчание гена" относится к зависящему от гомологии подавлению вирусных генов, трансгенов или эндогенных ядерных генов. Молчание гена может быть транскрипционным, когда подавление обусловлено пониженной транскрипцией пораженных генов, или посттранскрипционным, когда подавление обусловлено повышенным круговоротом (расщепление) видов РНК, гомологичных пораженным генам. Молчание гена включает индуцированное вирусом молчание гена.
Понятие "РНК-интерференция" (PHKi) относится к процессу специфического для последовательности посттранскрипционного молчания гена у растений и животных, опосредуемому малыми интерферирующими РНК (siPHK). Различные понятия, такие как siPHK, молекула РНК-мишень, фермент Dicer или рибонуклеаза III, представляют собой концепции, известные специалистам в данной области, и полное описание указанных понятий и других концепций, относящихся к PHKi, присутствует в литературе. Очевидно, что любая из конкретных гипотез, касающихся механизмов PHKi, не является необходимой для воплощения на практике настоящего изобретения.
Понятие "siPHK" относится к малым интерферирующим РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения siPHK содержат дуплекс или двухцепочечную область, состоящую примерно из 21-23 нуклеотидов; часто siPHK содержат примерно от 2 до 4 неспаренных нуклеотидов на 3'-конце каждой цепи. По меньшей мере одна цепь дуплекса или двухцепочечной области siPHK является практическим гомологом или практически комплементарна молекуле РНК-мишени. Цепь, комплементарная молекуле РНК-мишени, представляет собой "антисмысловую цепь": цепь, гомологичная молекуле РНК-мишени, представляет собой "смысловую цепь", и она комплементарна также антисмысловой цепи siPHK. siPHK могут содержать также дополнительные последовательности; примерами таких последовательностей являются (но не ограничиваясь только ими) связывающие последовательности (последовательности-линкеры) или петли, а также "ствол" и другие складчатые структуры. Вероятно, siPHK функционируют в качестве имеющих решающее значение посредников, участвующих в запуске РНК-интерференции, у беспозвоночных и позвоночных животных и в запуске специфического для последовательности расщепления РНК в процессе посттранскрипционного молчания генов у растений.
"dsPHK" или "двухцепочечная РНК" представляет собой РНК с двумя комплементарными цепями, которая контролирует специфическое для последовательности расщепление мРНК с помощью процесса, известного как РНК-интерференция (PHKi). dsPHK превращаются в результате расщепления в siPHK, которые оказывают интерферирующее воздействие на экспрессию специфического гена.
Понятие "молекула РНК-мишень" относится к молекуле РНК, по отношению к которой по меньшей мере одна цепь короткой двухцепочечной области или siPHK (или dsPHK) является гомологичной или комплементарной. Как правило, когда указанная гомология или комплементарность составляет примерно 100% для участка, состоящего по меньшей мере из 21 нуклеотида, siPHK может вызывать молчание или ингибировать экспрессию молекулы РНК-мишени. Хотя, вероятно, процессированная мРНК является мишенью для siPHK, настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной гипотезой, и такие гипотезы не являются необходимыми для воплощения на практике настоящего изобретения. Так, подразумевается, что другие молекулы РНК также могут являться мишенями для siPHK. Указанные молекулы РНК-мишени представляют собой непроцессированную мРНК, рибосомную РНК и вирусную геномную РНК. Не является необходимым, чтобы 100%-ная гомология между молекулой РНК-мишенью и dsPHK имела место по всей длине dsPHK, но "шпильки" dsPHK должны содержать участки, состоящие по меньшей мере из 21 нуклеотида, предпочтительно по меньшей мере из 23 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере из 50 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере из 500 нуклео-тидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 700 нуклеотидов и вплоть до 1000 нуклеотидов, для которых характерна гомология на уровне, составляющем по меньшей мере 95%, предпочтительно 100%, с молекулой РНК-мишенью.
Понятие "гибридизуется" в контексте настоящего описания относится к общепринятым условиям гибридизации, предпочтительно к таким условиям гибридизации, в которых используют 5xSSPE, 1% ДСН, 1x раствор Денхардта в качестве раствора и/или температуры гибридизации от 35 до 70°C, предпочтительно 65°C. После гибридизации отмывку предпочтительно осуществляют сначала с использованием 2xSSC, 1% ДСН, а затем 0,2xSSC при температуре от 35 до 75°C, в частности от 45 до 65°C, но наиболее предпочтительно при 59°C (описание обозначений SSPE, SSC и раствор Денхардта см. у Sambrook и др., loc. cit (в указанном месте). Строгие условия гибридизации, например, описанные у Sambrook и др. выше, являются наиболее предпочтительными. Наиболее предпочтительные строгие условия гибридиза
ции представляют собой вышеописанные условия, при которых гибридизацию и отмывку осуществляют при 65°C. Нестрогие условия гибридизации, при которых, например, гибридизацию и отмывку осуществляют при 45°C, являются менее предпочтительными, а при 35°C еще менее предпочтительными.
Понятия "гомология последовательностей или идентичность последовательностей" в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо. Понятия "идентичный" или процент "идентичности" в отношении двух или большего количества нуклеотидных или белковых последовательностей обозначает, что две или большее количество последовательностей или подпоследовательностей являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов при сопоставлении и сравнительном анализе максимального соответствия, что оценивают с помощью одного из приведенных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Если две подлежащие сравнению друг с другом последовательности имеют различную длину, то понятие идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательностей традиционно можно определять с помощью компьютерных программ, таких как программа Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Программа Bestfit основана на алгоритме локальной гомологии Смита и Уотермана (Smith и Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, c. 482-489) для поиска сегмента, имеющего самую высокую степень идентичности между двумя последовательностями. При применении Bestfit или другой программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей для решения вопроса о том, идентична ли конкретная последовательность на 95% референс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, параметры предпочтительно регулируют так, чтобы процент идентичности рассчитывать по всей длине референс-последовательности и чтобы допускать гомологию брешей вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности. При использовании Bestfit так называемые необязательные параметры предпочтительно имеют свои предварительно установленные ("принимаемые по умолчанию") значения. Отклонения, обнаруженные при сравнении данной последовательности и описанных выше последовательностей, предлагаемых в изобретении, могут быть обусловлены, например, добавлением, делецией, заменой, инсерцией или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей предпочтительно можно осуществлять также с помощью программы "fasta20u66" (версия 2.0u66, сентябрь 1998 г., William R. Pearson и the University of Virginia; см. также у Pearson, 1990 прилагаемые примеры, а также на сайте http://workbench.sdsc.edu/). Для этой цели можно использовать установку "принимаемых по умолчанию" параметров.
Другим доказательством того, что две нуклеотидные последовательности практически идентичны, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях. Фраза "специфично ги-бридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в строгих условиях, когда последовательность присутствует в комплексной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. Понятие "практически свя-зан(ы)" относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотой-зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью и подразумевает наличие небольшого количества ошибочных спариваний, которые можно допускать при снижении строгости сред для гибридизации для достижения требуемого обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
Понятия "строгие условия", "строгие условия гибридизации" или "условия отмывки, соответствующие строгой гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и Нозерн-гибридизация, зависят от условий, в которых зонд будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности-мишени и являются разными при применении различных параметров окружающей среды и должны отличаться в зависимости от структуры полинуклеотида. Для специфичной гибридизации более длинных последовательностей используют более высокие температуры. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является работа Tijssen "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes", часть I, глава 2: "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", изд-во Elsevier, New York, 1993; и Current Protocols in Molecular Biology, глава 2, под ред. Ausubel и др., изд-во Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1995;a также Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 5-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
Специфичность, как правило, является функцией условий отмывок после гибридизации, при этом имеющими решающее значение факторами является ионная сила и температура раствора для конечной отмывки. Как правило, выбирают очень строгие условия гибридизации и отмывки, при которых температура примерно на 5°C ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении pH. Как правило, при использовании "строгих условий" зонд должен гибридизоваться с подпоследовательностью-мишенью, но не гибридизоваться с другими последовательностями.
Tm обозначает температуру (при определенной ионной силе и значении pH), при которой 50% по
следовательностей-мишеней гибридизуется с точно подобранным зондом. При выборе очень строгих условий гибридизации температура равна Tm конкретного зонда. Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или Нозерн-блоттинга для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного фор-мамида с 1 мг гепарина при 42°C при осуществлении гибридизации в течение ночи.
Часто отмывке в очень строгих условиях предшествует отмывка в расслабленных условиях для удаления фонового сигнала зонда. Примером отмывки в очень строгих условиях является отмывка в 0,2xSSC при 65°C в течение 15 мин (см. у Sambrook, выше описание SSC-буфера), а примером очень строгих условий отмывки является применение 0,15М NaCl при 72°C в течение примерно 15 мин. Примером отмывки в условиях умеренной строгости для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 1 xSSC при 45°C в течение 15 мин. Примером расслабленных условий отмывки для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 4-6xSSC при 40°C в течение 15 мин. Для коротких зондов (например, состоящих примерно из 10-50 нук-леотидов) строгие условия, как правило, включают концентрации солей, соответствующие менее чем 1,0М концентрации ионов Na, как правило, примерно от 0,01 до 1,0М концентрации ионов Na (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, при этом температура, как правило, составляет по меньшей мере примерно 30°C. Строгие условия также можно получать при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Как правило, величина отношения сигнала к шуму, равная 2 (или выше) по сравнению с обнаруженной при применении неродственного зонда в конкретном опыте по гибридизации, свидетельствует о наличии специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в строгих условиях, все еще являются практически идентичными, если белки, которые они кодируют, являются практически идентичными. Это имеет место, например, в случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.
Ниже приведен ряд примеров условий гибридизации/отмывки, которые можно использовать для гибридизации нуклеотидных последовательностей, которые практически идентичны нуклеотидной ре-ференс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении: нуклеотидная референс-последовательность предпочтительно гибридизуется с нуклеотидной референс-последовательностью в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO4, 1мМ ЭДТК при 50°C с отмывкой в 2xSSC, 0,1% ДСН при 50°C, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO4, 1мМ ЭДТК при 50°C с отмывкой в 1xSSC, 0,1% ДСН при 50°C, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO4, 1мМ ЭДТК при 50°C с отмывкой в 0,5xSSC, 0,1% ДСН при 50°C, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO4, 1мМ ЭДТК при 50°C с отмывкой в 0,1xSSC, 0,1% ДСН при 50°C, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO4, 1мМ ЭДТК при 50°C с отмывкой в 0,1xSSC, 0,1% ДСН при 65°C. Последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно выявлять с использованием всех вышеуказанных условий. При создании изобретения использовали очень строгие условия.
" Растение" обозначает любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.
Понятие "растительная клетка" относится к структурной и физиологической единице растения, включающей протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой, например, как ткань растения, орган растения или целое растение.
" Культура растительных клеток" обозначает культуры структурных единиц растения, таких, например, как протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльца, пыльцевые трубки, семяпочки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.
Понятие "растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или любой другой части или продукту растения. Оно включает также каллус или ткань каллуса, а также экстракты (например, экстракты главных корней) или образцы.
" Орган растения" обозначает отдельную и четко структурно оформленную дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, листовая почка или зародыш.
В контексте настоящего описания понятие "растительная ткань" относится к группе растительных клеток, организованных в виде структурной и функциональной единицы. Под это понятие подпадает любая ткань растения, присутствующая в самом растении или находящаяся в культуре. Это понятие включает (но не ограничиваясь только ими) целые растения, органы растения, семена растения, культуру ткани и любые группы растительных клеток, организованных в виде структурных и/или функциональных единиц. Использование этого понятия в сочетании с указанием какого-либо конкретного типа растительной ткани (или безотносительно к нему), как это имеет место выше или в ином месте в настоящем описании, не следует истолковывать в том смысле, что оно не может относиться к любому другому типу растительной ткани.
В контексте настоящего описания понятие "размножение" и его грамматические варианты относит
ся к любому процессу, позволяющему получать потомство индивидуального растения. Размножение может быть половым или вегетативным или представлять собой любую их комбинацию. Примерами типов размножения являются (но не ограничиваясь только ими) скрещивание, самоопыление, создание производных с двумя гаплоидными наборами и их комбинации.
Под "селективным размножением" в контексте настоящего изобретения подразумевается программа размножения, в которой используют растения, которые несут или характеризуются требуемыми родительскими признаками.
В контексте настоящего описания понятие "ферментация" относится к процессу превращения органической молекулы в другую молекулу с помощью микроорганизма. Например, "ферментация" может относиться к аэробному превращению сахаров или других молекул из растительного материала, такого как растительный материал, предлагаемый в настоящем изобретении, с получением спиртов (например, этанола, метанола, бутанола); органических кислот (например, лимонной кислоты, уксусной кислоты, итаконовой кислоты, молочной кислоты, глюконовой кислоты); кетонов (например, ацетона); аминокислот (например, глутаминовой кислоты); газов (например, H2 и CO2); антибиотиков (например, пенициллина и тетрациклина); ферментов; витаминов (например, рибофлавина, B12, бета-каротина) и/или гормонов. Ферментация включает ферментации, применяемые для промышленного приготовления пригодных для потребления человеком алкогольных продуктов (например, пива и вина). Ферментация включает также анаэробные ферментации, например, для производства различных видов биотоплива. Для осуществления ферментации можно использовать любой организм, пригодный для применения на требуемой стадии ферментации, включая (но не ограничиваясь только ими) бактерии, грибы, архебактерии и одноклеточные организмы. К пригодным ферментирующим организмам относятся организмы, которые могут прямо или косвенно превращать моно-, ди- и трисахариды, прежде всего глюкозу и мальтозу, или любую другую полученную из биомассы молекулу в требуемый продукт ферментации (например, этанол, бута-нол и т.д.). К пригодным ферментирующим организмам относятся также организмы, которые могут превращать не относящиеся к сахарам молекулы в требуемый продукт ферментации. Указанные организмы и методы ферментации известны специалистам в данной области.
Понятие "биотопливо" в контексте настоящего описания относится к любому биотопливу, полученному с помощью аэробной или анаэробной ферментации растительного материала. Примером биотоплива, полученного путем аэробной ферментации, является (но не ограничиваясь только им) биоэтанол. Примерами биотоплива, которое можно получать путем анаэробной ферментации, являются (но не ограничиваясь только ими) биогазы и/или дизельное биотопливо. Методы аэробной и/или анаэробной ферментации известны специалисту в данной области.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям сахарной свеклы, для которых характерен фенотип замедленного стрелкования. Окультуренная сахарная свекла (Beta vulgaris ssp. vulgaris L) представляет собой двулетнее растение, которое в первый год образует запасающий корень и листовую розетку. Удлинение побега (стрелкование) и образование цветка начинается после периода низкой температуры, однако для многих диких представителей свекольных B. vulgaris ssp. maritima характерен однолетний тип развития в результате присутствия обусловливающего стрелкование гена B в локусе B. Ген BOLTING (B-ген) ответствен за детерминацию признака однолетности у сахарной свеклы. Однолетность у видов p. Beta рассматривается как моногенный и доминантный признак. Растения, несущие доминантный аллель В, обладают способностью переходить от ювенильной к репродуктивной стадии независимым от яровизации образом, что отличает их от двулетних растений, которые несут b-аллель, при наличии которого яровизация является совершенно необходимой для того, чтобы могло происходить стрелкование и последующее цветение. Доминантный аллель локуса В часто встречается у различных диких видов свекольных, и он вызывает стрелкование в течение периодов с длинным световым днем и у таких растений отсутствует необходимость в низких температурах, которые, как правило, требуются для двулетних культиваров (Abe и др., 1997), несущих рецессивный аллель. Хотя известно, что ген B играет решающую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, сам ген к настоящему времени не идентифицирован.
При создании настоящего изобретения был использован подход, основанный на применении гена-кандидата, для идентификации и характеризации предполагаемых контролирующих стрелкование генов у сахарной свеклы. При использовании этого подхода была идентифицирована EST-последовательность, имеющая регистрационный номер CV301305, в качестве предполагаемого гомолога гена PRR7 свеклы с помощью оценки гомологии BLAST-методом (см. пример 1.1). Частью соответствующей аминокислотной последовательности является мотив домена-приемника регулятора псевдоответа (PRR, pfam00072) или домена-приемника сигнала (REC, cd00156) (фиг. 1), отличительного признака семейства генов PRR, которые все, вероятно, имеют решающее значение при некоторых связанных с циркадными ритмами (внутренними часами организма) событиях (Nakamichi и др., 2005). На фиг. 2 представлено сравнение аминокислотной последовательности CV301305 и PRR7, ее ближайшего гомолога из Arabidopsis. Ген
регулятора псевдоответа 7 (PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7) (PRR7), впервые описанный у Arabi-
dopsis, является представителем семейства генов регуляторов псевдоответа (PRR1 или TOC1, PRR3,
PRR5, PRR7 и PRR9), которые все содержат два характерных мотива: домен-приемник регулятора ответа (REC) и CCT-домен. Уровни транскрипции представителей PRR-семейства колеблются в циркадном ритме, что позволяет предположить, что их белки тесно связаны с внутренними часами организма. Так, PRR7 описан в качестве компонента чувствительной к температуре циркадной системы у Arabidposis (Nakamichi и др., 2007; Salome и McClung, 2005). У растений внутренние часы организма участвуют в регуляции ряда фундаментальных биологических процессов, включая движение листьев, ежедневные изменения активности фотосинтеза и фотопериодический контроль времени цветения (Imaizumi и Kay, 2006; Zhou и др., 2007). В настоящее время гомологи PRR7 идентифицированы и охарактеризованы у ячменя, пшеницы и риса (HvPPD, TaPPD и OsPRR37) и установлено, что они являются основными определяющими факторами фотопериодического ответа у зерновых культур.
Одним из объектов изобретения являются последовательности нескольких аллелей BvPRR7, ассоциированных с однолетним или двулетним типом развития, предпочтительно последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, которые кодируют белок, который является функциональным эквивалентом белка гена B.
На основе EST-последовательности амплифицировали и секвенировали частичный PRR7-фрагмент длиной примерно 0,5 т.п.н. (см. пример 1.1). Эксперименты по картированию, проведенные с использованием Р2-популяции, включающей 198 растений, которые получали скрещиванием однолетней линии и двулетней линии, полиморфной по одному SNP в положении № 160, продемонстрировали, что ген BvPRR7 картирован на хромосоме II на расстоянии примерно 1 сМ по ходу транскрипции относительно маркера GJ131 (фиг. 4), в области, которая, как известно, содержит ген В, обусловливающий независимое от яровизации цветение (Mohring и др., 2004; Gaafar и др., 2005). Результаты анализа с использованием маркеров продемонстрировали точное соответствие между предсказанным генотипом гена B и генотипом гена BvPRR7(см. пример 1.1). Результаты дополнительного картирования, т.е. определение положения на карте, в сочетании с биологической функцией, связанной с чувствительным к температуре циркадным ритмом (Salome и McClung, 2005), подтвердили, что BvPRR7 является наиболее перспективным кандидатом на роль гена B (пример 1.1).
На следующей стадии библиотеку BAC подвергали скринингу с использованием стандартных методов ПЦР, которые хорошо известны специалистам в данной области, для выделения полноразмерной геномной последовательности гена PRR7 сахарной свеклы (см. пример 1.2). Применяемая библиотека BAC представляла собой библиотеку BAC, созданную с использованием ДНК из поступающего в продажу двулетнего культивара сахарной свеклы Н20. Осуществляли двукратный отбор частично расщепленных (HindIII) высокомолекулярных (HMW) ДНК-фрагментов размером 100-400 т.п.н. ДНК-фрагменты встраивали путем лигирования в вектор pBeloBAC-Kan. Библиотека содержала 57600 клонов со средним размером вставки примерно 120 т.п.н., что соответствует примерно 8-кратному перекрытию генома. Избыточность оценивали путем скрининга с использованием однокопийных зондов, было установлено, что частота клонов из митохондриальной или плазмидной ДНК составляла менее 1%. Последующий скрининг пулов ДНК в отношении BvPRR7-фрагментов привел к положительной идентификации BAC-клона, несущего соответствующий фрагмент.
Для получения полноразмерной последовательности гена BvPRR7 ранее идентифицированный BAC-клон (BAC SBA079-L24) секвенировали с использованием стандартного метода секвенирования. Два неперекрывающихся набора последовательных фрагментов, последовательность которых обладала гомологией с последовательностью EST CV301305, затем можно объединять в одной последовательности (SEQ ID NO: 8). На основе сравнительного анализа первичной структуры последовательностей набора последовательных фрагментов BAC и EST CV301305 и на основе гомологии с последовательностью гена PRR7 из Arabidopsis удалось предсказать предполагаемую структуру гена BvPRR7 сахарной свеклы, включающую интроны и экзоны, которая представлена на фиг. 5. На основе указанной предсказанной геномной последовательности удалось продемонстрировать, что участок полного гена BvPRR7 размером 3,6 т. п. н. простирается на последовательности против хода транскрипции от стоп-кодона ATG и участок размером 2,2 т.п.н. простирается по ходу транскрипции относительно кодирующей области. Соответствующая аминокислотная последовательность BvPRR7 представлена в SEQ ID NO: 11. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотной последовательности BvPRR7 и всех представителей семейства PRR-гена из Arabidopsis, включая WO^RR!), PRR3, PRR5, PRR7 и PRR9, позволил проиллюстрировать выраженную консервативность мотива домена-приемника регулятора псевдоответа (PRR) (pfam00072) вблизи №г[2-конца и CCT-мотива (pfam06203) на COOH-конце (фиг. 6). Помимо гомологии с семейством PRR-гена из Arabidopsis BvPRR7 характеризуется также выраженной гомологией с PRR7 зерновых культур, что проиллюстрировано с помощью филогенетического дерева, представленного на фиг. 7. Установлено, что гомолог PRR7 в зерновых культурах, более известный как Ppd, представляет собой основной определяющий фактор фотопериодической реакции (Turner и др., 2005; Beales и др., 2007). Его роль в яровизационном ответе, как это обнаружено для сахарной свеклы, пока не установлена.
С учетом их гомологии с известными контролирующими время цветения генами или их возможной регуляторной функции, которую можно предположить исходя из присутствия консервативных доменов, характерных для регуляторных белков, удалось идентифицировать несколько генов в качестве потенци
альных кандидатов на роль гена B. Эти гены нуждаются в дополнительной валидации с помощью опытов, оценивающих аллельную вариабельность и/или генную экспрессию, генотипов, характерных для однолетнего и двулетнего типа развития, или на основе экспериментов по оценке комплементарности или " выключения" с использованием трансгенных подходов.
Признак однолетнего типа развития растений проявляется в зависимости от состояния гена B как моногенный доминантный признак; таким образом, потребность в яровизации у двулетних растений является рецессивной. Таким образом, можно предположить, что трансформация определяющего однолетний тип развития аллеля BvPRR7 в характерный для двулетнего типа развития генотип приводит к включению признака ежегодного цветения, в характерный для двулетнего типа развития акцепторный генотип. Для подтверждения этой гипотезы кодирующей последовательностью определяющего однолетний тип развития аллеля гена BvPRR7, находящейся под контролем характерных для однолетнего типа развития промотора и фрагмента терминатора, трансформируют характерный для двулетнего типа развития генотип, такой, например, как G018 (см. пример 2). Трансформацию можно осуществлять методами, известными в данной области, такими как методы, описанные у Chang и др., 2002, используя меристему сахарной свеклы в качестве эксплантата и ген фосфоманнозоизомеразы (PMI) в качестве селектируемого маркера. Трансгенные проростки отбирают по признаку экспрессии маркера селекции, такого, например, как PMI-активность (Joersbo и др., 1998), и затем укореняют, высаживают в почву и переносят в теплицу. В качестве отрицательного контроля используют нетрансгенные проростки, которые подвергают такой же процедуре регенерации in vitro, но без заражения Agrobacterium и селекции. Растения выращивают в вегетационных камерах при постоянной температуре 18°C и фотопериоде 17 ч света и 7 ч темноты. В этих условиях (без индукции стрелкования с помощью низких температур) нетрансгенные двулетние контрольные растения не обладают какими-либо признаками стрелкования в течение периода наблюдения, составляющего вплоть до 12 недель, в то время как однолетние контрольные растения в норме начинают выбрасывать стрелку в пределах 6-8-недельного периода времени. В отличие от нетрансгенных двулетних контрольных растений у большинства трансгенов стрелкование начинается через 4-10 недель, и они обладают основным признаком, характерным для однолетних растений, несмотря на их генетический фон, соответствующий двулетним растениям. Трансгенные растения, у которых обнаружено стрел-кавание и цветение, подвергают перекрестному опылению двулетней поддерживающей линией с получением потомства. У растений-потомков оценивают активность PMI и затем оценивают в отношении стрелкования и цветения без яровизации. Эти растения-потомки характеризуются коэффициентом сегрегации 1:1 и прямой корреляцией между активностью PMI и признаком однолетности. Эти данные подтверждают причинную связь между BvPRR7 и независящим от яровизации цветением у сахарной свеклы.
При создании настоящего изобретения установлено также, что BvPRR7 играет основную роль в яровизационном ответе сахарной свеклы и поэтому его можно применять для создания устойчивости к стрелкованию у растений сахарной свеклы путем подавления яровизационного ответа. Согласно одному из объектов изобретения в результате ген BvPRR7 можно использовать для трансгенного подхода к получению трансгенных растений сахарной свеклы, содержащих полинуклеотиды, стабильно интегрированные в геном сахарной свеклы. В частности, после экспрессии из генома продукт экспрессии можно применять для модуляции яровизационного ответа растения сахарной свеклы путем подавления или понижающей регуляции экспрессии гена B.
Представляющие интерес последовательности ДНК собирают в виде химерных конструкций, которые содержат нуклеотидную последовательность, подлежащую экспрессии в трансгенном растении, под контролем регуляторных элементов, которые функционируют в растениях. Методы сборки указанных химерных конструкций хорошо известны специалисту в данной области.
Получение достаточных уровней трансгенной экспрессии в соответствующих растительных тканях является важным аспектом выращивания созданных с помощью генной инженерии культурных растений. Экспрессия гетерологичных последовательностей ДНК в растении-хозяине зависит от присутствия функционально связанного промотора, который функционирует в растении-хозяине. Выбор промоторной последовательности должен определять время, когда экспрессируется гетерологичная последовательность ДНК, и место в организме, где это происходит.
Например, можно применять растительный промоторный фрагмент, который обеспечивает экспрессию гена во всех тканях регенерированного растения. Указанные промоторы в контексте настоящего описания обозначены как "конститутивные" промоторы, и они обладают активностью при большинстве условий окружающей среды и стадиях развития или клеточной дифференцировки. Примерами конститутивных промоторов являются область инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, 1'- или 2'-промотор, выведенный из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, и другие области инициации транскрипции из различных растительных генов, которые известны специалистам в данной области. Такие гены включают, например, ген АР2, АСТ11 из Arabidopsis (Huang и др., Plant Mol. Biol. 33, 1996, c. 125-139), Cat3 из Arabidopsis (GenBank NO: U43147, Zhong и др., Mol. Gen. Genet. 251, 1996, c. 196-203), ген, кодирующий стеароил-АПБ (ацилпереносящий белок)-десатуразу из Brassica napus (Genbank NO: X74782, Solocombe и др., Plant Physiol. 104, 1994, c. 1167-1176), GPc1 из кукурузы (Gen-
Bank NO: X15596, Martinez и др., J. Mol. Biol 208, 1989, c. 551-565) и Gpc2 из кукурузы (GenBank NO: U45855, Manjunath и др., Plant Mol. Biol. 33, 1997, c. 97-112).
В другом варианте промотор может обеспечивать экспрессию молекул нуклеиновых кислот в конкретной ткани или может более точно контролироваться условиями окружающей среды или стадией развития. Примерами условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию с помощью ин-дуцибельных промоторов, являются анаэробные условия, повышенная температура или присутствие света. Такие промоторы в контексте настоящего описания обозначены как "индуцибельные" или "тканеспе-цифические" промоторы. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что тканеспецифиче-ский промотор может обеспечивать экспрессию функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, в контексте настоящего описания тканеспецифический промотор представляет собой промотор, который обеспечивает экспрессию прежде всего в ткани-мишени, но может контролировать также определенный уровень экспрессии в других тканях.
Примерами промоторов, действие которых зависит от стадии развития, являются промоторы, которые инициируют транскрипцию только (или практически только) в определенных тканях, таких как плод, семена или цветки. Промоторы, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот в семяпочках, цветках или семенах, являются наиболее предпочтительными согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего описания под специфическим или предпочтительным для семени промотором подразумевается промотор, который обеспечивает экспрессию специфически или предпочтительно в тканях семян, например, указанные промоторы могут быть специфическими для семяпочки, специфическими для зародыша, специфическими для эндосперма, специфическими для интегумента, специфическими для семенной оболочки или специфическими для определенных комбинаций этих органов. Их примером является промотор из специфического для семяпочки гена BEL1, который описан у Reiser и др., Cell 83, 1995, c. 735-742 (GenBank NO: U39944). Другие пригодные специфические для семян промоторы выводят из следующих генов: МАС1 из кукурузы (Sheridan и др., Genetics 142, 1996, c. 1009-1020, Cat3 из кукурузы (GenBank NO: L05934, Abler и др., Plant Mol. Biol. 22, 1993, c. 10131-1038), кодирующий олеозин ген размером 18 т.п.н. из кукурузы (GenBank No, J05212, Lee и др., Plant Mol. Biol. 26, 1994, c.1981-1987), vivparous-1 из Arabidopsis (Genbank NO: U93215), кодирующий олеозин ген из Arabidopsis (Genbank NO: Z17657), Atmyc1 из Arabidopsis (Urao и др., Plant Mol. Biol. 32, 1996, c. 571-576), семейство генов 2s запасающего белка семян Arabidopsis (Conceicao и др., Plant 5, 1994, c. 493-505), кодирующий олеозин ген размером 20 т.п.н. из Brassica napus (GenBank NO: M63985), napA из Brassica napus (GenBank NO: J02798, Josefsson и др., JBL 26, 1987, c. 12196-1301, семейство генов напина из Brassica napus (Sjo-dahl и др., Planta 197, 1995, c. 264-271), ген, кодирующий запасающий белок 2S, из Brassica napus (Das-gupta и др., Gene 133, 1993, c. 301-302), гены, кодирующие олеозин A (Genbank NO: U09118) и олеозин В (Genbank NO: U09119) из сои, и ген, кодирующий низкомолекулярный богатый серой белок из сои (Choi и др., Mol. Gen., Genet. 246, 1995, c. 266-268).
В другом варианте можно идентифицировать конкретные последовательности, представляющие собой промотор с требуемыми характеристиками экспрессии или промотор с повышенной экспрессионной активностью, или эти или подобные последовательности интродуцировать в последовательности посредством мутации. Кроме того, можно осуществлять мутагенез этих последовательностей для повышения экспрессии трансгенов в конкретных видах.
Кроме того, можно применять промоторы, в которых объединены элементы более одного промотора. Например, в US 5491288 описана комбинация промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и промотора гистона. Таким образом, элементы промоторов, представленных в настоящем описании, можно объединять с элементами других промоторов.
Для применения согласно настоящему изобретению доступны различные регулирующие транскрипцию 5'- и 3'-последовательности. Терминаторы транскрипции ответственны за терминацию транскрипции и правильное полиаденилирование мРНК. 3'-нетраслируемая регуляторная последовательность ДНК предпочтительно включает от примерно 50 до примерно 1000, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 1000 пар оснований (нуклеотидов) и содержит растительные терминирующие транскрипцию и трансляцию последовательности. Приемлемые терминаторы транскрипции и терминаторы, для которых известно, что они функционируют в растениях, представляют собой терминатор 35S CaMV, терминатор tml, терминатор нопалинсинтазы, терминатор Е9 rbcS гороха, терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens и 3'-конец генов протеазных ингибиторов I или II из картофеля или томатов, хотя можно применять также другие 3'-концевые элементы, известные специалистам в данной области. В другом варианте можно применять также терминатор коиксина гамма, олеозина 3 или другие терминаторы из рода Coix.
Предпочтительными 3'-элементами являются элементы из гена нопалинсинтазы Agrobacterium tu-mefaciens (Bevan и др., 1983), терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы Agrobacterium tu-mefaciens и 3'-концевые элементы генов протеазных ингибиторов I или II из картофеля или томатов.
Поскольку последовательность ДНК, расположенная между сайтом инициации транскрипции и стартовым кодоном кодирующей последовательности, т. е. нетранслируемая лидерная последовательность, может влиять на экспрессию гена, может оказаться желательным применять конкретную лидер
ную последовательность. Считается, что предпочтительными лидерными последовательностями являются последовательности, которые включают последовательности, для которых предсказана способность обеспечивать оптимальную экспрессию присоединенного гена, т.е. предпочтительные консенсусные ли-дерные последовательности, которые могут повышать или поддерживать стабильность мРНК и предупреждать несоответствующую инициацию трансляции. Выбор указанных последовательностей должен быть очевиден специалистам в данной области в свете настоящего описания. Наиболее предпочтительными являются последовательности, выведенные из генов, характеризующихся высоким уровнем экспрессии в растениях.
Другими последовательностями, для которых обнаружена способность повышать генную экспрессию в трансгенных растениях, могут служить интронные последовательности (например, из генов Adh1, bronze1, actin1, actin 2 (WO 00/760067), или интрон синтазы сахарозы) и вирусные лидерные последовательности (например, из вирусов TMV, MCMV и AMV). Например, известно несколько нетранслируе-мых лидерных последовательностей, полученных из вирусов, которые обладают способностью повышать экспрессию. В частности, установлено, что лидерные последовательности из вируса табачной мозаики (TMV), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) и вирус мозаики люцерны (AMV) обладают эффективностью в отношении повышения экспрессии (например, Gallie и др., 1987; Skuzeski и др., 1990). Другие известные в данной области лидерные последовательности представляют собой (но не ограничиваясь только ими): лидеры пикорнавирусов, например лидер EMCV (5'-некодирующая область вируса энцефаломиокардита) (Elroy-Stein и др., 1989); лидеры потивирусов, например лидер TEV (вирус табачной гравировки); лидер MDMV (вирус мозаичной карликовости кукурузы); лидер человеческого белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулинов (BiP) (Macejak и др., 1991); нетранслируемый лидер из мРНК оболочечного белка вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4), (Jobling и др., 1987), лидер вируса табачной мозаики (TMV), (Gallie и др., 1989) и лидер хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) (Lommel и др., 1991) (см. также Della-Cioppa и др., 1987).
При необходимости можно включать также регуляторные элементы, такие как интрон 1 Adh (Callis и др., 1987), интрон синтазы сахарозы (Vasil и др., 1989) или элемент TMV-омега (Gallie и др., 1989).
Примерами энхансеров являются элементы промотора 35S CaMV, генов октопинсинтазы (Ellis и др., 1987), гена актина I риса, гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Callis и др., 1987), гена I морщинистости кукурузы (Vasil и др., 1989), элемент TMV-омега (Gallie и др., 1989) и промоторы из эукриотиче-ских организмов, кроме растений (например, дрожжей; Ma и др., 1988).
Одним из основных методов контроля экспрессии является обеспечение пониженной экспрессии. Известны два основных метода для достижения пониженной экспрессии, которые обычно обозначают как "антисмысловая регуляция по типу отрицательной связи (понижающая регуляция)" и "смысловая регуляция по типу отрицательной связи (понижающая регуляция)" (смысловую регуляцию по типу отрицательной связи обозначают также как "косупрессия"). В целом, эти процессы обозначают как "молчание генов". Оба эти метода позволяют осуществлять ингибирование экспрессии гена-мишени.
Изобретение относится к различным стратегиям снижения экспрессии, уровня, активности и/или функции молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении. Специалисту в данной области очевидно, что существуют различные методы воздействия требуемым образом на экспрессию, уровень, активность и/или функцию молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении. Их примерами являются (но не ограничиваясь только ими).
" Смысловая" супрессия.
Изменение экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно снижение ее экспрессии, получают с помощью "смысловой" супрессии (описание см., например, у Jorgensen и др., Plant Mol. Biol. 31, 1996, c. 957-973). В этом случае полную нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или ее часть включают в молекулу ДНК. Молекулу ДНК предпочтительно функционально связывают с промотором, который обладает способностью функционировать в клетке, содержащей ген-мишень, предпочтительно растительной клетке, и ин-тродуцируют в клетку, в которой может происходить экспрессия нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность встраивают в молекулу ДНК в "смысловой ориентации", т.е. таким образом, что кодирующая цепь нуклеотидной последовательности может транскрибироваться. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является полностью транслируемой, и вся генетическая информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности или ее части, транслируется в полипептид. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является частично транслируемой, и продуктом трансляции является короткий пептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для этой цели используют инсерцию по меньшей мере одного преждевременного стоп-кодона в нуклеотидную последовательность, что снижает трансляцию наполовину. В другом более предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность транскрибируется, но при этом не образуется продукт трансляции. Для этой цели, как правило, используют удаление стартового кодона, например "ATG", полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последователь
ность или ее часть, стабильно интегрируют в геном растительной клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, включают во внехромосомно реплицирующуюся молекулу.
В трансгенных растениях, которые содержат одну из описанных непосредственно выше молекул ДНК, экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности, которая содержится в молекуле ДНК, предпочтительно понижают. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, входящая в ДНК, идентична нуклеотидной последовательности, экспрессию которой понижают по меньшей мере на 80%, более предпочтительно идентична по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере на 99%.
" Антисмысловая" супрессия.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения изменение экспрессии нуклео-тидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно снижение ее экспрессии, осуществляют с помощью "антисмысловой" супрессии. Полную нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или ее часть включают в молекулу ДНК. Молекулу ДНК предпочтительно функционально связывают с промотором, который обладает способностью функционировать в клетке, содержащий ген-мишень, и интродуцируют в растительную клетку, в которой может происходить экспрессия нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность встраивают в молекулу ДНК в "антисмысловой ориентации", т.е. таким образом, что может транскрибироваться обратный комплемент (называемый также иногда некодирующей цепью) нуклеотидной последовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нук-леотидную последовательность или ее часть, стабильно интегрируют в геном растительной клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нук-леотидную последовательность или ее часть, включают во внехромосомно реплицирующуюся молекулу. С целью дополнительной иллюстрации ниже процитирован ряд публикаций, в которых описан указанный подход (Green P.J. и др., Ann. Rev. Biochem. 55, 1986, c. 569-597; van der Krol A. R. и др., Antisense Nuc. Acids & Proteins, 1991, c. 125-141; Abel P. P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 86, 199, c. 6949-6952; Ecker J.R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 83, август 1986 г., c. 5372-5376).
В трансгенных растениях, которые содержат одну из описанных непосредственно выше молекул ДНК, экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности, которая содержится в молекуле ДНК, предпочтительно понижают. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, входящая в ДНК, идентична нуклеотидной последовательности, экспрессию которой понижают по меньшей мере на 80%, более предпочтительно идентична по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере на 99%.
Гомологичная рекомбинация.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одну геномную копию, соответствующую нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, модифицируют в геноме растения путем гомологичной рекомбинации, что дополнительно проиллюстрировано у Paszkowski и др., EMBO Journal 7, 1988, c. 4021-4026. Этот метод основан на способности гомологичных последовательностей распознавать друг друга и обмениваться друг с другом нуклеотидными последовательностями с помощью процесса, известного как гомологичная рекомбинация. Гомологичная рекомбинация может происходить между хромосомной копий нуклеотидной последовательности в клетке и внесенной копией нуклеотидной последовательности, интродуцированной в клетку путем трансформации. Таким образом, интродуцируют специфические модификации точно в хромосомную копию нуклеотидной последовательности. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения можно модифицировать регуляторные элементы нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении. Указанные регуляторные элементы легко получать путем скрининга геномной библиотеки с использованием нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, или ее части в качестве зонда. Существующие регуляторные элементы заменяют различными регуляторными элементами, изменяя тем самым экспрессию нуклеотидной последовательности, или их подвергают мутации или изымают путем делеции, упраздняя тем самым экспрессию нуклеотидной последовательности. Согласно другому варианту осуществления изобретения нуклеотидную последовательность модифицируют путем делеции части нуклеотидной последовательности или полной нуклеотидной последовательности или с помощью мутации. Экспрессия мутантного полипептида в растительной клетке подпадает также под объем настоящего изобретения. Опубликовано более современный усовершенствованный вариант этого метода, предназначенный для нарушения эндогенных растительных генов (Kempin и др., Nature 389, 1997, c. 802-803 и Miao и Lam, Plant J., 7, 1995, c. 359-365).
Специалисту в данной области известны многочисленные приемлемые методы целенаправленной модификации геномных последовательностей. Они включают, в частности, такие методы, как получение " молчащих (выключенных)" мутантов с помощью процессов целенаправленной гомологичной рекомбинации, например, путем создания стоп-кодонов, сдвигов рамки считывания и т.д. (Hohn В. и Puchta H.,
Proc Natl Acad Sci США 96, 1999, c. 8321-8323) или целенаправленной делеции или инверсии последовательностей с помощью, например, специфических для последовательности рекомбиназ или нуклеаз. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мутацию в хромосомной копии нуклео-тидной последовательности интродуцируют путем трансформации клетки химерным олигонуклеотидом, состоящим из смежного участка остатков РНК и ДНК, имеющего конформационные особенности дуплексной структуры с двумя кэпами в виде шпилек на концах. Дополнительной особенностью олигонук-леотида является, например, 2'-О-метилирование остатков РНК. Последовательность РНК/ДНК создают так, чтобы она была выровнена с последовательностью хромосомной копии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, и содержала требуемую нуклеотидную замену. Например, этот метод дополнительно описан в US 5501967 и у Zhu и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 96, 1999, c. 8768-8773. Рибозимы.
В другом варианте осуществления изобретения РНК, кодирующую полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, расщепляют с помощью каталитической РНК или рибозима, специфического для указанной РНК. Рибозим экспрессируется в трансгенных растениях, что приводит к снижению уровня РНК, кодирующей полипептид, в растительных клетках и в результате к снижению уровня полипептида, накапливаемого в клетках. Этот метод описан также в US 4987071.
Доминантно-негативные мутации.
В другом варианте осуществления изобретения изменяют активность полипептида, кодируемого нуклеотидными последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении. Для этой цели используют экспрессию доминантно-негативных мутантов белков в трансгенных растениях, что приводит к потере активности эндогенного белка.
Аптамеры.
В другом варианте осуществления изобретения активность полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, ингибируют путем экспрессии в трансгенных растениях лигандов нуклеиновых кислот, так называемых аптамеров, которые специфически связываются с белком. Аптамеры предпочтительно получают с помощью метода SELEX (системная эволюция лигандов экспоненциальным обогащением). При применении метода SELEX перспективную смесь (смесь-кандидат) одноцепочечных нуклеиновых кислот, содержащих области рандомизированной последовательности, приводят в контакт с белком, и нуклеиновые кислоты, обладающие повышенной аффинностью к мишени, отделяют от остальной части перспективной смеси. Отделенные нуклеиновые кислоты амплифицируют с получением обогащенной лигандами смеси. После нескольких итераций получают нуклеиновую кислоту, обладающую оптимальной аффинностью к полипептиду, и применяют для экспрессии в трансгенных растениях. Этот метод описан также в US 5270163.
Белки, содержащие домен "цинковых пальцев".
Для изменения экспрессии нуклеотидной последовательности можно применять также белок, содержащий домен "цинковых пальцев", который связывается с нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении, или с ее регуляторной областью. Предпочтительно транскрипцию нуклеотидной последовательности понижают или повышают. Белки, содержащие домен "цинковых пальцев", описаны, например, у Beerli и др., PNAS 95, 1988, c. 14628-14633 или в WO 95/19431, WO 98/54311 или WO 96/06166, все публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
dsPHK.
Для изменения экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, можно использовать также интерференцию dsPHK (PHKi). Процесс регуляции генов с помощью двухцепочечной РНК ("интерференция с помощью двухцепочечной РНК"; dsPHKi) многократно описан для животных и растительных организмов (например, Matzke М.А. и др., Plant Mol. Biol. 43, 2000, c. 401415; Fire А. и др., Nature 391, 1998, c. 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364, все публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки). Процессы и методы, описанные в представленных в настоящем описании ссылках, прежде всего касательно dsPHKi, основаны на том явлении, что одновременная интродукция комплементарной цепи и контурной цепи транскрипта гена подавляет экспрессию соответствующего гена с высокой эффективностью. Предпочтительно обусловленный этим явлением фенотип очень напоминает фенотип, соответствующий "молчащему" мутанту (Waterhouse P.M. и др., Proc Natl Acad Sci США 95, 1998, c. 13959-13964). Установлено, что использование процесса dsPHKi является наиболее эффективным и предпочтительным путем снижения экспрессии маркерного белка.
Двухцепочечная молекула РНК (dsPHK) согласно изобретению предпочтительно означает одну или несколько последовательностей рибонуклеиновых кислот, которые с помощью комплементарных последовательностей, теоретически (например, на основе правила спаривания оснований Уотосона и Крика) и/или фактически (например, благодаря экспериментам по гибридизации in vitro и/или in vivo) обладают способностью образовывать двухцепочечные структуры ДНК. Специалисту в данной области известен тот факт, что образование двухцепочечных структур РНК представляет собой равновесное состояние.
Предпочтительно соотношение двухцепочечных молекул и соответствующих диссоциированных форм составляет по меньшей мере 1:10, предпочтительно 1:1, более предпочтительно 5:1, наиболее предпочтительно 10:1.
Настоящее изобретение относится также к двухцепочечным молекулам РНК, которые при их интродукции в организм растения (или в полученную из него клетку, ткань, орган или материал для размножения) вызывают снижение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени. Двухцепочеч-ная молекула РНК, предназначенная для снижения уровня экспрессии гена-мишени, согласно настоящему описанию предпочтительно содержит:
а) " смысловую" цепь РНК, которая включает по меньшей мере одну рибонуклеотидную последова-
тельность, практически идентичную по меньшей мере части "смыслового" РНК-транскрипта гена-
мишени, и
б) " антисмысловую" цепь РНК, которая практически предпочтительно полностью комплементарна
смысловой цепи РНК, указанной в подпункте а).
" Практически идентичная" означает, что последовательность dsPHK может включать также инсер-ции, делеции, а также отдельные точечные мутации при сравнении с последовательностью гена-мишени и несмотря на это обладает способностью эффективно снижать уровень экспрессии. Гомология (что будет описано ниже) между "смысловой" цепью ингибирующей dsPHK и по меньшей мере одной частью "смыслового" РНК-транскрипта нуклеотидной последовательности гена-мишени (или между "антисмысловой" цепью комплементарной цепи нуклеотидной последовательности гена-мишени) предпочтительно составляет по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно 100%.
100%-ная идентичность последовательностей dsPHK и транскрипта гена маркерного белка не является абсолютно необходимой для эффективного снижения экспрессии гена-мишени. Таким образом, процесс предпочтительно допускает наличие отклонений в последовательности, причиной которых являются генетические манипуляции, полиморфизмы или эволюционная дивергенция. Так, можно, например, использовать dsPHK, которая создана исходя из последовательности гена-мишени первого организма для подавления экспрессии гена-мишени во втором организме. Для этой цели dsPHK предпочтительно включает области последовательности транскриптов генов-мишеней, которые соответствуют консервативным областям. Указанные консервативные области легко можно получать путем сравнений последовательностей.
В альтернативном варианте "практически идентичную" dsPHK можно определять также как нук-леотидную последовательность, которая обладает способностью к гибридизации с частью транскрипта гена-мишени.
"Практически комплементарная" означает, что "антисмысловая" цепь РНК может содержать также инсерции, делеции, а также отдельные точечные мутации по сравнению с комплементом указанной "смысловой" цепи РНК. Гомология между "антисмысловой" цепью РНК и комплементом "смысловой" цепи РНК предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%.
"Часть смыслового РНК-транскрипта" нуклеотидной последовательности гена-мишени означает фрагмент РНК или мРНК, транскрибируемый или обладающий способностью к трансляции с нуклеотид-ной последовательности гена-мишени. В этом контексте фрагмент имеет последовательность, состоящую предпочтительно по меньшей мере из 20 оснований, предпочтительно по меньшей мере из 50 оснований, более предпочтительно по меньшей мере из 100 оснований, еще более предпочтительно по меньшей мере из 200 оснований, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 500 оснований. Под это понятие подпадает также полная транскрибируемая РНК или мРНК. Под это понятие подпадают также последовательности, которые могут транскрибироваться в искусственных условиях с областей генов-мишеней, которые в ином случае в естественных условиях не транскрибируются, например промоторные области.
DsPHK может состоять из одной или нескольких цепей полирибонуклеотидов. В естественных условиях для достижения такой цели можно также интродуцировать множество индивидуальных молекул dsPHK, которые содержат в каждом случае один из указанных выше участков рибонуклеотидных последовательностей, в клетку или организм. Структура двухцепочечной dsPHK может формироваться на основе двух комплементарных разных цепей РНК или предпочтительно, на основе одной самокомплементарной цепи РНК. В этом случае "смысловая" цепь РНК и "антисмысловая" цепь РНК предпочтительно соединены друг с другом ковалентно с образованием инвертированного "повтора".
Например, как описано в WO 99/53050, dsPHK может содержать также структуру в виде "шпильки" в результате соединения "смысловой" и "антисмысловой" цепей с помощью соединяющей последовательности ("линкер", например, интрон). Предпочтительными являются самокомплементарные структуры dsPHK, поскольку для них требуется только экспрессия последовательности РНК, и они всегда содержат комплементарные цепи РНК в эквимолярном соотношении. Соединяющая последовательность может предпочтительно представлять собой интрон (например, интрон гена ST-LS1 картофеля; Vancan-neyt G.F. и др., Mol. Gen. Genet 220(2), 1990, c. 245-250).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая dsPHK, может включать дополнительные элементы, такие, например, как сигналы терминации транскрипции или сигналы полиаденилирования.
При необходимости вступление в контакт двух цепей dsPHK в клетке или растении можно обеспечивать, например, следующим образом:
а) путем трансформации клетки или растения вектором, который содержит обе кассеты экспрессии,
б) путем совместной трансформации (котрансформация) клетки или растения двумя векторами,
один из которых содержит кассеты экспрессии, несущие "смысловую" цепь, а другой содержит кассеты
экспрессии, несущие "антисмысловую" цепь. Образование дуплекса РНК можно инициировать либо из-
вне, либо внутри клетки.
DsPHK можно синтезировать либо in vivo, либо in vitro. Для этой цели последовательность ДНК, кодирующую dsPHK, можно встраивать в кассету экспрессии под контролем по меньшей мере одного генетического контролирующего элемента (такого, например, как промотор). Полиаденилирование не является необходимым и в этом случае никогда не требуется присутствие каких-либо элементов для инициации трансляции. Предпочтительной является кассета экспрессии dsPHK, оказывающая целенаправленное действие на ген-мишень, присутствующий в трансформирующей конструкции или трансформирующем векторе. Для этой цели кассеты экспрессии, кодирующие "антисмысловую" цепь и/или " смысловую" цепь dsPHK, оказывающие целенаправленное действие на ген-мишень, или кодирующие самокомплементарую цепь dsPHK, предпочтительно встраивают в трансформирующий вектор и интро-дуцируют в растительную клетку с помощью описанного ниже процесса. Стабильная инсерция в геном может являться предпочтительной для способа, предлагаемого в изобретении, но не является абсолютно необходимой. Поскольку dsPHK обусловливает продолжительное действие, во многих случаях может оказаться также достаточной кратковременная экспрессия. DsPHK может представлять собой также часть РНК, подлежащей экспрессии с использованием нуклеотидной последовательности, которая должна быть встроена путем ее слияния, например, с 3'-нетранслируемой областью указанной РНК.
DsPHK можно интродуцировать в количестве, которое делает возможным присутствие по меньшей мере одной копии в клетке. Более значительные количества копий (например, по меньшей мере 5, 10, 100, 500 или 1000 копий на клетку) может при необходимости приводить к более эффективному снижению. Для супрессии посредством PHKi BvPRR7 при создании изобретения осуществляли сборку кДНК-фрагмента, такого, например, как имеющий длину 0,6 т.п.н. фрагмент, представленный в SEQ ID NO: 1, в кассете для PHKi под контролем конститутивного промотора (см. пример 3). Приемлемыми конститутивными промоторами являются, например, промотор Ubi3 из Arabidopsis (Norris и др., 1993), промотор 35S CaMV или любой другой промотор, для которого известна его способность повышать конститутивную экспрессию в сахарной свекле. Кассета экспрессии содержит также селектируемый маркерный ген под контролем приемлемого промотора. В частности, маркерный ген кодирует маркер положительной селекции, такой как фосфоманнозоизомераза или ксилозоизомераза. Инвертированный повтор BvPRR7-фрагмента отделяют вторым интроном из гена StLS1 картофеля (Eckes и др., 1986; Vancanneyt и др., 1990) для стабилизации PHKi-кассеты, но также с целью улучшения эффективности процесса PHKi (Wang и Waterhouse, 2001; Smith и др., 2000).
Инсерция молекулы ДНК (инсерционный мутагенез).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК встраивают в хромосомную копию нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, или в ее регуляторную область. Предпочтительно такая молекула ДНК содержит транслоцируемый элемент, обладающий способностью к внутрихромосомной транслокации (траспозиции) в растительной клетке, такой, например, как, Ac/Ds, Em/Spm, мутатор. В другом варианте молекула ДНК содержит пограничную последовательность Т-ДНК из Т-ДНК Agrobacterium. Молекула ДНК может содержать также сайт, распознаваемый рекомбиназой или интегразой, который можно применять для удаления части молекулы ДНК из хромосомы растительной клетки. Под объем изобретения подпадают также методы инсерцион-ного мутагеназа, в которых используют Т-ДНК, транспозоны, олигонуклеотиды, или другие методы, известные специалистам в данной области. Методы, основанные на применении Т-ДНК и транспозона для инсерционного мутагенеза, описаны у Winkler и др., Methods Mol. Biol. 82, 1989, c. 129-136 и Martienssen, PNAS 95, 1998, c. 2021-2026, публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Другими приемлемыми методами является интродукция нонсенс-мутаций в эндогенные гены-мишени, например, путем интродукции олигонуклеотидов РНК/ДНК в растение (Zhu и др., Nat Biotechnol 18(5), 2000, c. 555-558). Можно создавать также точечные мутации с помощью гибридов ДНК-РНК, которые известны также как "химеропласт" (Cole-Strauss и др., Nucl Acids Res 27(5), 1999, c. 323-1330; Kmiec, Gene therapy American Scientist 87(3), 1999, c. 240-247).
Делеционный мутагенез.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения мутацию молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, создают в геномной копии последовательности в клетке или растении путем делеции части нуклеотидной последовательности или регуляторной последовательности. Методы делеционного мутагенеза известны специалистам в данной области (см., например, Miao и др., Plant J. 7, 1995, с. 359). Активность или уровень экспрессии гена-мишени можно снижать также
путем целенаправленной делеции в гене-мишени, например, с помощью индукции специфических для последовательности двухцепочечных разрывов в ДНК в распознающей последовательности, предназначенной для специфической индукции двухцепочечных разрывов в ДНК, или вблизи нуклеотидной последовательности гена-мишени.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения такую делецию создают произвольно в большой популяции растений путем химического мутагенеза или облучения, и растение, имеющее деле-цию в гене, предлагаемом в настоящем изобретении, выделяют путем стратегий "прямой генетики" и "обратной генетики". Известно, что облучение быстрыми нейтронами или гамма-лучами вызывает деле-ционные мутации у растений (Silverstone и др., Plant Cell, 10, 1998, c. 155-169; Bruggemann и др., Plant J., 10, 1996, c. 755-760; Redei и Koncz в: Methods in Arabidopsis Research, изд-во World Scientific Press, 1992, c. 16-82). Делеционные мутации в гене, предлагаемом в настоящем изобретении, можно восстанавливать на основе стратегии "обратной генетики" с помощью ПЦР с использованием объединенных групп геномных ДНК, как описано для С. elegans (Liu и др., Genome Research, 9, 1999, c. 859-867.). Стратегия " прямой генетики" включает мутагенез линии, для которой характерно посттранскрипционное молчание генов (PTGS), с последующим скринингом М2-потомства по признаку отсутствия PTGS. Следует ожидать, что среди этих мутантов у некоторых должен быть нарушен ген, предлагаемый в настоящем изобретении. Это можно оценивать с помощью Саузерн-блоттинга или ПЦР гена, предлагаемого в настоящем изобретении, с геномной ДНК этих мутантов.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения экспрессию нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, изменяют в каждой клетке растения. Для этой цели, например, используют гомологичную рекомбинацию или инсерцию в хромосому. Для этой цели можно применять также, например, экспрессию смысловой или антисмысловой РНК, белка, содержащего домен "цинковых пальцев", или рибозима под контролем промотора, обладающего способностью экспрессиро-вать смысловую или антисмысловую РНК, белок, содержащий домен "цинковых пальцев", или рибозим, в каждой клетке растения. Создают конструкции, предназначенные для экспрессии смысловой или антисмысловой РНК, белка, содержащего домен "цинковых пальцев", или рибозима или для сверхэкспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, и трансформируют ими растительную клетку согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, например описанным выше.
Допустимо также применение комбинаций этих методов. Другие методы известны специалистам в данной области и могут включать вмешательство в процессинг гена-мишени, транспорт белка, кодируемого геном-мишенью, или его мРНК, ингибирование присоединения рибозима, ингибирование сплайсинга РНК, индукцию ферментативного расщепления РНК гена-мишени и/или ингибирование элонгации или терминации при трансляции или остановку этих процессов.
Таким образом, изобретение относится также к смысловым и антисмысловым молекулам нуклеиновых кислот, которые соответствуют последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54 в перечне последовательностей, а также их ортологам.
Гены и открытые рамки считывания, предлагаемые в настоящем изобретении, которые практически подобны нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, представленный в SEQ ID NO: 6, включая любые соответствующие антисмысловые конструкции, можно функционально связывать с любым промотором, который обладает функциональной активностью в растении-хозяине, включая промо-торные последовательности, предлагаемые в изобретении, или их мутанты.
После создания полинуклеотидной конструкции, предлагаемой в изобретении, которая содержит экспрессионную кассету или кассету для PHKi, ее можно мобилизовать в приемлемый вектор для трансформации растений, такой, например, как бинарный вектор, который затем можно мобилизовать в растение сахарной свеклы с помощью одного из широко известных методов трансформации, такого, например, как опосредуемая Agrobacterium трансформация.
Трансгенные растения (или клетки растений, или эксплантаты растений, или ткани растений), которые несут и экспрессируют нуклеотидные последовательности или dsPHK, предлагаемые в изобретении, можно получать различными хорошо известными методами. После создания химерной конструкции, предлагаемой в изобретении, которая содержит экспрессионную кассету или кассету для PHKi, включающую нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении и описанную выше, можно использовать стандартные методики для интродукции химерной конструкции полинуклеотида в представляющие интерес растение, клетку растения, эксплантат растения или ткань растения. Необязательно клетку растения, эксплантат растения или ткань растения можно регенерировать с получением трансгенного растения. Растение может представлять собой любое высшее растение, включая голосемянные, однодольные и двудольные растения. Приемлемые протоколы известны для представителей сем. Legumino-sae (люцерна, соя, клевер и т.д.), сем. Umbelliferae (морковь, сельдерей, пастернак), сем. Cruciferae (капуста, редис, рапс, брокколи и т.д.), сем. Curcurbitaceae (дыни и огурцы), сем. Gramineae (пшеница, кукуруза, рис, ячмень, просо и т.д.), сем. Solanaceae (картофель, томаты, табак, перцы и т.д.) и различных других культур (см. протоколы, описанные в Handbook of Plant Cell Culture-Crop Specie под ред. Am-mirato и др., изд-во Macmillan Publ. Co., New York, N.Y., 1984; Shimamoto и др., Nature 338, 1989, c. 274
276; Fromm и др., Bio/Technol. 8, 1990, c. 833-839; и Vasil и др., Bio/Technol. 8, 1990, c. 429-434). Трансформация и регенерация и однодольных, и двудольных растений в настоящее время является общепринятой, и специалист в данной области может осуществлять выбор наиболее пригодного метода трансформации. Выбор метода трансформации должен варьироваться в зависимости от типа растения, подлежащего трансформации; специалисты в данной области могут определять пригодность конкретных методов для данных типов растений. Приемлемыми методами являются (но не ограничиваясь только ими): электропорация протопластов растений; опосредуемая липосомами трансформация; опосредуемая поли-этиленгликолем (ПЭГ) трансформация; трансформация с помощью вирусов; микроинъекция растительных клеток; бомбардировка микроснарядами растительных клеток; вакуумная инфильтрация и опосредуемая Agrobacterium tumefaciens трансформация.
Трансформацию растений можно осуществлять индивидуальной молекулой ДНК или несколькими молекулами ДНК (т.е. котрансформация), и оба эти метода пригодны для применения в сочетании с химерными конструкциями, предлагаемыми в настоящем изобретении. Для трансформации растений пригодны многочисленные трансформационные векторы и экспрессионные кассеты, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в сочетании с любым из таких векторов. Выбор вектора должен зависеть от предпочтительного метода трансформации и видов-мишеней для трансформации.
Специалистам в данной области доступны и известны различные методы интродукции конструкций в растительную клетку-хозяина. Эти методы, как правило, включают трансформацию с помощью ДНК с использованием A. tumefaciens или A. rhizogenes в качестве трансформирующих агентов, липосом, осаждения с помощью ПЭГ, электропорации, инъекции ДНК, непосредственного поглощения ДНК, бомбардировки микроснарядами, ускорения частиц и т.п. (см., например, EP 295959 и EP 138341) (см. ниже). Однако полинуклеотидной конструкцией, предлагаемой в изобретении, можно трансформировать не только растительные клетки. Общие сведения о растительных экспрессионных векторах и репортерных генах, и Agrobacterium и опосредуемом Agrobacterium переносе генов можно почерпнуть у Gruber и др.,
1993.
Экспрессионные векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, можно интродуцировать в протопласты, или в интактные ткани, или выделенные клетки. Предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в интактные ткани. Общие методы культивирования растительных тканей описаны, например, у Maki и др., 1993; и Phillips и др., 1988. Предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в ткани кукурузы или других растений с помощью метода прямого переноса гена, такого как опосредуемый микроснарядами перенос, инъекция ДНК, электропорация и т. п. Более предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в растительные ткани, используя введение содержащих микроснаряды сред с помощью биобаллистической пушки (см., например, Tomes и др., 1995). Векторы, предлагаемые в изобретении, можно не только применять для экспрессии структурных генов, но их можно использовать также при клонировании с использованием "экзона-ловушки" или " промотора-ловушки" для выявления экспрессии различных генов в различных тканях (Lindsey и др., 1993; Auch и Reth и др.).
Наиболее предпочтительным является применение векторов бинарного типа на основе Ti- и Ri-плазмид Agrobacterium spp. Выведенными из Ti-плазмид векторами трансформируют широкое разнообразие высших растений, включая однодольные и двудольные растения, такие как соя, хлопчатник, рапс, табак и рис (Pacciotti и др., 1985: Byrne и др., 1987; Sukhapinda и др., 1987; Lorz и др., 1985; Potrykus, 1985; Park и др., 1985: Hiei и др., 1994). Применение Т-ДНК для трансформации растительных клеток широко изучено и подробно описано (EP 120516; Hoekema, 1985; Knauf и др., 1983 и An и др., 1985). Для интродукции в растения химерные конструкции, предлагаемые в изобретении, можно встраивать в бинарные векторы, как описано в примерах.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что выбор метода может зависеть от типа растения, предназначенного для трансформации, например, от того, является ли оно однодольным или двудольным. Приемлемыми методами трансформации растительных клеток являются (но не ограничиваясь только ими) микроинъекция (Crossway и др., 1986), электропорация (Riggs и др., 1986), опосредуемая Agrobacterium трансформация (Hinchee и др., 1988), прямой перенос генов (Paszkowski и др., 1984), и баллистическое ускорение частиц с помощью устройств, поставляемых фирмой Agracetus, Inc., Мэдисон, шт. Висконсин, и фирмой BioRad, Геркулес, шт. Калифорния (см., например, Sanford и др., US 4945050; и McCabe и др., 1988) (см. также Weissinger и др., 1988; Sanford и др., 1987 (лук); Christou и др., 1988 (соя); McCabe и др., 1988 (соя); Datta и др.,1990 (рис); Klein и др., 1988 (кукуруза); Klein и др., 1988 (кукуруза); Klein и др.,1988 (кукуруза); Fromm и др., 1990 (кукуруза) и Gordon-Kamm и др., 1990 (кукуруза); Svab и др., 1990 (хлоропласты табака); Koziel и др., 1993 (кукуруза); Shimamoto и др., 1989 (рис); Christou и др., 1991 (рис); EP 0332581 (ежа сборная и другие представители сем. Pooideae); Vasil и др., 1993 (пшеница); Weeks и др., 1993 (пшеница)). В одном из вариантов осуществления изобретения применяют метод трансформации протопласта кукурузы (EP 0292435, US 5350689).
Основной целью настоящего изобретения является трансформация сахарной свеклы. Экспериментальные процедуры для трансформации сахарной свеклы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, у Chang и др., 2002, в этом исследовании применяли меристему сахарной
свеклы в качестве материала эксплантата, указанные методы описаны также у Joersbo и др., 1998.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения (см. пример 3) кассетой для PHKi можно трансформировать генотип, характерный для двулетнего типа развития сахарной свеклы генотип, такой, например, как G018. Трансгенные проростки отбирают по признаку экспрессии маркера селекции, такого, например, как PMI-активность (Joersbo и др., 1998). Дающие положительную реакцию проростки и нетрансгенные контрольные проростки укореняют и переносят в теплицу для акклиматизации в течение минимум двух недель при 18°C до их обработки с целью яровизации (яровизационная обработка). Согласно принятым методам трансгенные растения подвергают обработке с целью яровизации, которая предусматривает выдерживание в течение 14 недель при постоянной температуре 6°C и 12-часовой низкой искусственной освещенности. Перед воздействием индуцирующих стрелкование условий прошедшие яровизизацию растения медленно акклиматизируют в течение двух недель в климатических камерах путем ступенчатого повышения температуры с 10 до 18°C. Затем растения пересаживают в более крупные горшки (2 л), и осуществляют мониторинг стрелкования, выдерживая их при постоянной температуре 18°C и фотопериоде с длительным световым днем 17 ч света/7 ч темноты.
После того как трансформированные растения отобраны и выращены до созревания, идентифицируют растения, имеющие представляющий интерес признак. Признак может представлять собой любой признак, описанный выше. Кроме того, для подтверждения того, что представляющий интерес признак является результатом экспрессии интродуцированной представляющей интерес нуклеотидной последовательности под контролем регуляторного нуклеотида, предлагаемого в изобретении, уровни экспрессии или активности представляющего/представляющей интерес полипептида или нуклеотидной последовательности можно определять с помощью анализа экспрессии мРНК с использованием Нозерн-блоттинга, ОТ-ПЦР или микромассивов или экспрессии белка с использованием иммуноблотинга или Вестерн-блоттинга или анализов сдвига в гелях.
Таким образом, изобретение относится к растительным клеткам и тканям, к растениям, полученным из таких клеток и тканей соответственно, к растительному материалу, к потомству и семенам таких растений и к сельскохозяйственным продуктам, включая продукты переработки растений, которые можно получать, например, с помощью одного из методов трансформации, описанных ниже.
После того как предлагаемой в настоящем изобретении и описанной выше экспрессионной кассетой, которая содержит нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, трансформированы виды растений, ее можно размножать в этих видах или переносить в другие сорта этих же видов, включая, прежде всего, предназначенные для продажи сорта, с помощью традиционных методов селекции. Предпочтительными растениями согласно изобретению являются голосемянные, однодольные и двудольные растения, прежде всего агрономически важные культурные растения, такие как рис, пшеница, ячмень, рожь, рапс, кукуруза, картофель, морковь, сладкий картофель, сахарная свекла, фасоль, горох, цикорий, латук-салат, капуста, цветная капуста, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржа, лук, чесок, баклажан, перец, сельдерей, тыква крупноплодная, тыква обыкновенная, цуккини, огурец, яблоня, груша, айва, дыня, слива, вишня, персик, нектарин, абрикос, земляника, виноград, малина, ежевика, ананас, авокадо, папайя, манго, банан, соя, табак, томаты, сорго и сахарный тростник.
Описанные выше генетически свойства, сконструированные в трансгенных растениях, передаются при половом размножении или вегетативном росте и в результате их можно поддерживать и размножать в потомстве растений. Как правило, для поддержания и размножения используют известные сельскохозяйственные методы, разработанные для высокоспецифических целей, такие как обработка почвы, посев или сбор урожая. Можно применять также специализированные процессы, такие как гидропоника или технология возделывания в теплицах. Дающие преимущество генетические свойства трансгенных растений, предлагаемых в изобретении, можно применять также при селекции растений с целью создания растений с улучшенными характеристиками, такими как устойчивость к вредителям, гербицидам или стрессу, повышенная питательная ценность, повышенная урожайность или улучшенная структура, обусловливающая защиту от полегания или осыпания. Для осуществления различных стадий селекции требуется хорошо известное вмешательство человека, включая, например, отбор линий, подлежащих скрещиванию, прямое опыление родительских линий или отбор соответствующих потомков растений. В зависимости от требуемых характеристик выбирают различные пути селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают (но не ограничиваясь только ими) гибридизацию, инбридинг, обратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешение различных линий, неспецифическую гибридизацию, анеопладию. Методы гибридизации включают также стерилизацию растений с получением растений с мужской или женской стерильностью с помощью механических, химических или биохимических средств. Перекрестное опыление растения с мужской стерильностью пыльцой другой линии гарантирует, что геном обладающего мужской стерильность, но женской фертильностью растения, будет в равной степени включать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные растения, предлагаемые в изобретении, можно применять для отбора улучшенных линий растений, что позволяет, например, повышать эффективность общепринятых методов, таких как обработка гербицидами или пестицидами, или обходиться без указанных методов в результате модифицированных генетических особенностей растений. В другом варианте можно получать новые культуры с повышенной устой
чивостью к стрессу, благодаря их оптимизированному генетическому "аппарату", что позволяет получать продукт более высокого качества, чем продукты, которые не обладают способностью противостоять аналогичным вредным условиям, воздействующим их развитие.
Специалисту в данной области известно, что трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно интрогрессировать путем скрещивания с другими линиями растений (предпочтительно линиями сахарной свеклы), содержащими другие трансгенные или нетрансгенные генотипы. Указанный другой трансгенный или нетрансгенный генотип может представлять собой любой генотип, но предпочтительным является генотип, обусловливающий по меньшей мере один представляющий интерес признак. Например, инбредную линию сахарной свеклы, содержащую трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно скрещивать с инбредной линией сахарной свеклы, содержащей трансгенный генотип, обусловливающий устойчивость к различным вирусам, которые, как известно, заражают растения сахарной свеклы. Образовавшиеся семена и растения-потомки должны нести признак замедленного стрелкования и признаки устойчивости в объединенной форме. Например, инбредную линию сахарной свеклы с трансгенным генотипом, предлагаемым в настоящем изобретении, можно скрещивать с инбредной линией сахарной свеклы, содержащей трансгенный генотип, обусловливающий устойчивость к глифосату, такой как Н7-1 (заявка на европейский патент EP-А1-1597373, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Образовавшиеся семена и растения-потомки имеют как признак устойчивости, так и признак замедленного стрелкования. Другие признаки типа устойчивости к гербицидам, устойчивости к болезням или устойчивости к вирусам (т.е. вирусам типа, например, BNYVV (вирус некротического пожелтения жилок свеклы), полученным либо из трансгенного, либо из общепринятых источников (типа Holly или C48), или вирусам, отличным от BNYVV) можно применять для объединения с трансгенным генотипом, предлагаемым в настоящем изобретении. Кроме того, должно быть очевидно, что другие комбинации или группы можно создавать с использованием трансгенного генотипа, предлагаемого в изобретении, и поэтому указанные примеры не следует рассматривать, как ограничивающие объем изобретения.
Специалисту в данной области также должно быть очевидно, что трансгенный семенной материал сахарной свеклы, содержащий трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно обрабатывать различными химическими соединениями, предназначенными для обработки семян, включая различные пестициды и инсектициды, для дополнительного повышения устойчивости, предлагаемой в настоящем изобретении.
Трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно интрогрессировать в любую инбредную или гибридную линию сахарной свеклы с использованием известных в данной области методов скрещивания. Целью скрещивания растений является объединение в одном сорте или гибриде различных требуемых признаков. Для полевых культур эти признаки включают устойчивость к насекомым и болезням (например, полученные из общепринятых источников, включая (но не ограничиваясь только ими) Holly и C48), толерантность к гербицидам, толерантность к высоким температурам и засухе, повышенную урожайность и более высокое агрономическое качество. При механическом сборе урожая многих культур является важной однородность характеристик растений, таких как прорастание и образование главного корня, скорость роста, созревание и размер корней.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридных семян, из которых образуются растения сахарной свеклы, имеющие фенотип замедленного стрелкования. Указанные способы заключаются в том, что: а) получают линию сахарной свеклы с фенотипом замедленного стрелкования, прежде всего трансгенное растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении, в качестве первой родительской линии; б) получают вторую линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; в) дают растениям первой родительской линии, полученной на стадии а), и растениям второй родительской лини, полученной на стадии б), опылять друг друга, дают развитья семенам и собирают гибридный семенной материал, где собранные гибридные семена представляют собой семена гибридного растения сахарной свеклы, имеющего фенотип замедленного стрелкования. В одном из вариантов этого объекта первая родительская линия, полученная на стадии а), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, содержащую один или несколько или все полинук-леотиды, предлагаемые в настоящем изобретении. В другом варианте этого объекта вторую родительскую линию выбирают из группы, включающей а) инбредную линию сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к одному вирусу, поражающему сахарную свеклу, такому, например, как вирус некротического пожелтения жилок свеклы; б) инбредную линию растений сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к одному гербициду; и в) инбредную линию растений сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к одной болезни. Примеры обычных вирусов и болезнетворных агентов, поражающих сахарную свеклы, и источников устойчивости к этим вирусам или болезням известны специалисту в данной области. Кроме того, гербициды, которые используют на сахарной свекле, и источники устойчивости к этим гербицидам, также известны специалисту в данной области.
Растения, которым давали самоопыляться и отобрали в отношении типа в течение многих поколений, становились гомозиготными практически по всем генным локусам и давали однородную популяцию чистосортового потомства. Скрещивание между двумя гомозиготными линиям дают однородную попу
ляцию гибридных растений, которые могут быть гетерогенными по многим генным локусам. Скрещивание двух растений, каждое из которых является гетерозиготным по нескольким генным локусам, должно приводить к получению популяции гибридных растений, которые отличаются генетически и не могут быть однородными.
Методы скрещивания растений, которые известны в данной области и которые можно применять в программах селекции сахарной свеклы, включают (но не ограничиваясь только ими) рекуррентную (периодическую) селекцию, возвратное скрещивание, селекцию на базе родословной, селекцию повышенной эффективности на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, селекцию повышенной эффективности на основе генетических маркеров и трансформацию. Для создания гибридов сахарной свеклы в рамках программы селекции сахарной свеклы требуется, в целом, создание гомозиготных ин-бредных линий, скрещивание этих линий и оценка кроссов. Методы селекции на базе родословной и рекуррентной селекции используют для создания инбредных линий из предназначенных для разведения популяций. В программах селекции сахарной свеклы объединяют генетические фоны из двух или большего количества инбредных линий или различных других источников зародышевой плазмы в пулы для разведения, из которых создают новые инбредные линии путем самоопыления и отбора требуемых фенотипов. Новые инбредные линии скрещивают с другими инбредными линиями, и гибриды, полученные в результате этих скрещиваний, оценивают для выявления тех из них, которые потенциально можно использовать для продажи. Разведение растений и создание гибридов при воплощении на практике программы селекции растений сахарной свеклы является дорогостоящим и требующим значительных временных затрат процессом.
Селекция на базе родословной начинается со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одну или несколько требуемых характеристик, которые отсутствуют в другом или которые дополняют другой. Если два исходных родителя не обеспечивают присутствие всех требуемых характеристик, то в популяцию для разведения можно включать другие источники. При использовании метода селекции на базе родословной растения высшего качества опыляют и отбирают последовательные поколения. В последовательных поколениях гетерозиготное состояние позволяет получать гомозиготные линии в результате самоопыления и селекции. Как правило, при использовании метода селекции на базе родословной на практике для самоопыления и селекции применяют пять или большее количество поколений
F1^F2; F2^F3; F3^F4; F4^F5 и т.д.
Разведение на основе рекуррентной селекции, например возвратное скрещивание, можно использовать для улучшения инбредной линии и гибрида, созданного с использованием этих инбредных линий. Возвратное скрещивание можно применять для переноса конкретного требуемого признака из одной ин-бредной линии или из одного источника в инбредную линию, в которой отсутствует этот признак. Это можно осуществлять, например, путем первого скрещивания инбредной линии высшего качества (рекуррентный родитель) с инбредной линией-донором (нерекуррентный родитель), которая несет соответст-вующий(ие) ген(ы), обусловливающий(е) представляющий интерес признак. Затем потомство этого скрещивания подвергают возвратному скрещиванию с рекуррентным родителем высшего качества с последующей селекцией образовавшего потомства в отношении требуемого признака, который должен быть перенесен из нерекуррентного родителя. После получения 5 или большего количества поколений бэккроссов с их селекцией по требуемому признаку потомство должно быть гомозиготным по локусу, контролирующему характеристику, подлежащую переносу, но должно быть похоже на родителя высшего качества касательно всех других генов. Затем последнее поколение бэккроссов опыляют с получением чистосортового потомства в отношении гена(ов), подлежащего(их) переносу. Гибрид, созданный из ин-бредных линий, содержащих перенесенный(ые) ген(ы), является практически таким же, что и гибрид, полученный из этих инбредных линий без перенесенного(ых) гена(ов).
Элитные инбредные линии, которые представляют собой чистосортовые гомозиготные инбредные линии, можно применять также в качестве исходного материала для селекции или популяций-источников, из которых создают другие инбредные линии. Эти инбредные линии выводят из элитных инбредных линий с помощью описанных ранее методов разведения, таких как селекция на базе родословной и рекуррентная селекция. Например, когда возвратное скрещивание используют для создания этих выведенных линий при осуществлении программы селекции растений сахарной свеклы, элитные инбредные линии можно применять в качестве родительской линии или исходного материала или популяции-источника, и они могут служить либо в качестве донора, либо в качестве рекуррентного родителя.
Простой гибрид получают в результате скрещивания двух инбредных линий, каждая из которых имеет генотип, комплементарный генотипу другого. Гибридное потомство первого поколения обозначают как F1. При создании предназначенных для продажи гибридов при осуществлении программы селекции растений сахарной свеклы высаживают только гибридные F1-растения. Предпочтительные F1-гибриды являются более сильными, чем их инбредные родители. Эта гибридная сила или гетерозис может проявляться во многих полигенных признаках, включая повышенный вегетативный рост и повышенную урожайность.
Создание гибрида сахарной свеклы при осуществлении программы селекции растений сахарной
свеклы включает три стадии:1) отбор растений, полученных из различных пулов зародышевой плазмы для начальных кроссбридингов; (2) самоопыление отобранных растений, полученных в результате кроссбридинга нескольких поколений, с получением серий инбредных линий, которые хотя отличаются друг от друга, являются чистосортовыми и обладают высокой степенью однородности; и 3) скрещивание отобранных инбредных линий с различными инбредными линиями с получением гибридного потомства (F1). В процессе инбридинга сахарной свеклы сила линий снижается. Сила восстанавливается, когда две различные инбредные линии скрещивают с получением гибридного потомства (F1). Важным результатом гомозиготности и гомогенности инбредных линий является то, что гибрид двух различных пар ин-бредных линий всегда является тем же самым. После идентификации инбредных линий, которые дают гибрид высшего качества, гибридный семенной материал можно неограниченно размножать, если сохраняется гомогенность инбредных родителей.
Простой гибрид получают в том случае, когда скрещивают две инбредные линии с получением F1-потомства. Двойной гибрид получают в результате попарного скрещивания четырех инбредных линий (AxB и CxD), а затем два F1-гибрида скрещивают вновь (AxB)x(CxD). Трехлинейный гибрид получают из трех инбредных линий, при этом скрещивают две из этих инбредных линий (AxB), а затем образовавшийся F1-гибрид скрещивают с третьей инбредной линией (AxB)xC. Большая часть гибридной силы, характерной для F1-гибридов, теряется в следующем поколении (F2). Следовательно, семенной материал гибридов нельзя применять в качестве посадочного материала.
При производстве гибридных семян предпочтительно элиминируют или инактивируют производство пыльцы материнской особью. Неполное удаление или инактивация пыльцы оставляет потенциальную возможность самоопыления. Эти полученные в результате нежелательного самоопыления семена могут быть непреднамеренно собраны и упакованы вместе с гибридными семенами. После посева семян можно идентифицировать и отбирать эти полученные в результате самоопыления растения. Эти полученные в результате самоопыления растения будут генетически эквивалентны женской инбредной линии, применяемой для получения гибрида. Как правило, эти полученные в результате самоопыления растения можно идентифицировать по их пониженной силе. Женские растения, полученные в результате самоопыления, идентифицируют по снижению силы вегетативных и/или репродуктивных характеристик. Идентификацию этих полученных в результате самоопыления линий можно осуществлять также с помощью анализа с использованием молекулярных маркеров.
Однако существует простая и эффективная система контроля опыления, гарантирующая наличие гетерозиса, путем исключения самоопыления при производстве предназначенных для продажи гибридов. Если один из родителей обладает самостерильностью (SI), цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) или ядерной мужской стерильностью (ЯМС), то растение не может самоопыляться или неспособно производить пыльцу, при этом должно иметь место только перекрестное опыление. Путем элиминации пыльцы одного из применяемых для скрещивания родительских сортов растениевод-селекционер гарантирует получение гибридного семенного материала однородного качества при условии, что родители имеют однородное качество и селекционер осуществляет одно скрещивание. Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) представляет собой наследуемый по материнской линии признак, генетические детерминанты которого локализованы в геноме цитоплазматических органелл, митохондрий. У таких растений в значительной степени нарушена способность образовывать функциональные пыльцевые зерна. Гены-восстановители системы ЦМС представляют собой доминантные ядерные гены, которые подавляют эффекты мужской стерильности, свойственные цитоплазме. Проявление мужской стерильности в растениях, обладающих ЦМС, является результатом несовместимости между рецессивным ядерным геном и специфическим для мужской стерильности цитоплазматическим геномом.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения систему ЦМС применяют для получения гибридных растений сахарной свеклы, предлагаемых в настоящем изобретении. В этой системе мужскую стерильную линию, обладающую ЦМС, применяют в качестве материнской особи, которую опыляют мужской фертильной линией, применяемой в качестве отцовской особи. Признак замедленного стрелкования, рассматриваемый в настоящем изобретении, может присутствовать как в мужской стерильной линии, обладающей ЦМС, которая представляет собой (материнскую) родительскую линию, так и в мужской фертильной (отцовской) родительской линии, или даже в обеих линиях. Предпочтительно признак замедленного стрелкования поддерживают в варианте, обладающем мужской стерильностью, для того чтобы избежать ГМ (генномодифицированных) загрязнений через пыльцу, содержащую признак, переносимый отцовской особью.
Как должно быть очевидно специалисту в данной области, выше изложены лишь некоторые из возможных путей, с помощью которых можно получать инбредные линии, предлагаемые в настоящем изобретении, относящиеся к интрогрессии трансгенного генотипа, предлагаемого в изобретении, в другие линии сахарной свеклы. Специалисту в данной области известны и доступны другие средства, а приведенные выше примеры даны только с целью иллюстрации.
В целом, вторая родительская линия, применяемая для получения гибридов, может представлять собой также линию растений сахарной свеклы, имеющую фенотип замедленного стрелкования, напри
мер растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении. Предпочтительно первая родительская линия и вторая родительская линия, применяемые для получения гибридного семенного материла, отличаются различным генетическим фоном. Генетическое расстояние можно измерять с помощью молекулярных маркеров согласно методу, описанному, например, у Knaak (1996). Однако вторая родительская линия может представлять собой также инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит другой представляющий интерес признак, такой, например, как (но не ограничиваясь только им) устойчивость к глифосату (например, содержит фактор Н7-1, описанный в заявке на европейский патент EP-А1-1597373, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Образовавшееся гибридное семя должно содержать сгруппированные признаки замедленного стрелкования и устойчивости к гербициду глифосату. Другие признаки типа устойчивости к гербицидам, устойчивости к болезням или устойчивости к BNYVV, полученные из общепринятых источников (типа Holly или C48), или устойчивости к вирусам, отличным от BNYVV, может нести также вторая родительская линия для объединения с трансгенным генотипом, предлагаемым в настоящем изобретении, в гибридном семени. Очевидно также, что можно создавать другие комбинации или группы с трансгенным генотипом, предлагаемым в изобретении, и таким образом, эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих объем изобретения.
Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является гибридное семя растения сахарной свеклы, имеющее фенотип замедленного стрелкования. Согласно одному из объектов настоящего изобретения гибридное семя получают с помощью предлагаемого в настоящем изобретении способа получения гибридного семени сахарной свеклы или растений сахарной свеклы, которые имеют фенотип замедленного стрелкования. Указанные методы известны специалистам в данной области. Согласно другому объекту настоящего изобретения получают гибридное растение сахарной свеклы, имеющее фенотип замедленного стрелкования, путем выращивания гибридного семени, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно у этого гибридного растения стрелкование отсутствует полностью, т.е. для него характерно полное подавление яровизационного ответа. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является часть гибридного растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно указанную часть растения выбирают из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, клетки, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли или другие репродуктивные или вегетативные части или экстракты, или образцы.
Следующим объектом изобретения являются способы выявления присутствия нуклеотидной последовательности или химерной конструкции, предлагаемой в настоящем изобретении, в биологическом образце. Указанные способы заключаются в том, что а) приводят в контакт образец, содержащий ДНК с парой праймеров, которые при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, в которой используют геномную ДНК из сахарной свеклы, несущей нуклеотидную последовательность или химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, продуцируют ампликон, являющийся диагностическим для сахарной свеклы, предлагаемой в настоящем изобретении; б) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и в) выявляют ампликон. Выявление ампликона можно осуществлять с помощью любых средств, хорошо известных в данной области, включая (но не ограничиваясь только ими) флуоресцентные, хемилюминисцентные, радиологические, иммунологические или иные средства обнаружения. В том случае, когда для амплификации конкретной последовательности с целью получения ампликона предполагается применять гибридизацию, то подразумевается, что получение и выявление ампликона с помощью любых средств, хорошо известных в данной области, может свидетельствовать о требуемой гибридизации с последовательностью-мишенью, когда применяют один зонд или праймер, или с последовательностями-мишениями, когда используют два или большее количество зондов или праймеров.
Изобретение относится также к способам получения сахара, при которых для получения сахара осуществляют переработку растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта. Кроме того, настоящее изобретение относится к сахару, полученному с помощью способа получения сахара, предлагаемого в настоящем изобретении. Способ получения сахара может включать любой общепринятый метод получения сахара, известный специалисту в данной области.
Другим предпочтительным объектом изобретения является способ получения одного или несколько видов биотоплива, выбранных из группы, включающей этанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, путем переработки трансгенного растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта с получением одного или нескольких видов биотоплива. Биотопливо может представлять собой любое биотопливо, получаемое путем аэробной или анаэробной ферментации растительного материала. Примером биотоплива является (но не ограничиваясь только им) полученный с помощью аэробной ферментации биоэтанол. Биотоплива, которые можно получать с помощью анаэробной ферментации, представляют собой (но не ограничиваясь только ими) биогазы и/или дизельное биотопливо. Методы аэробной и/или анаэробной ферментации известны специалистам в данной области. Под объем настоящего изобретения подпадают также виды биотоплива,
выбранные из группы, включающей этанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, которые получают с помощью способа получения одного или нескольких видов биотоплива, предлагаемого в настоящем изобретении.
Другим предпочтительным объектом настоящего изобретения являются полинуклеотидные маркеры, которые картированы в локусе B или находятся в непосредственной близости к нему, в частности на расстоянии 1 сМ против хода транскрипции относительно маркеров МР0176 и GJ01, и которые обладают способностью к косегрегации с маркером GJ131 (Mohring S. и др., 2004; Gaafar RM. и др., 2005) (фиг. 5).
Изобретение относится также к полинуклеотидным маркерам, идентифицированным в геноме сахарной свеклы, включая их варианты и производные, где полинуклеотидные маркеры создают на основе нуклеотидной последовательности, которую можно получать из области геномной ДНК, для которой характерна истинная косегрегация с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (ген В), у сахарной свеклы, где маркер позволяет различать генотип, характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, которые имеют характерный для двулетнего типа развития или характерный для однолетнего типа развития фенотип. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют нуклеотидную последовательность, которую можно получать из одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше. Предпочтительные полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, несут один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на SNP, SSR, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на SNP, этот полиморфизм является диагностическим для аллеля B в локусе B.
Указанные полинуклеотидные маркеры предпочтительно обладают способностью выявлять по меньшей мере один из различных SNP, присутствующих в различных аллелях геномной последовательности, которая представлена в настоящем описании в SEQ ID NO: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12), где указанный полипептидный маркер позволяет осуществлять дифференциацию различных аллелей, прежде всего различать однолетние и двулетние линии сахарной свеклы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения по-линуклеотидный маркер, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает способностью выявлять по меньшей мере один SNP, выбранный из группы SNP в положениях №№ 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12).
Следующим объектом настоящего изобретения является набор полинуклеотидных маркеров, который содержит множество индивидуальных маркеров, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше. В этом контексте понятие "множество" относится к набору, включающему больше одного полинуклеотидного маркера, который предпочтительно состоит из двух, трех или большего количества маркеров.
Согласно одному из объектов изобретения можно разрабатывать и применять маркеры, которые не полностью соответствуют представленным в настоящем описании, или еще не идентифицированные маркеры. На основе информации, представленной в настоящем описании, специалист в данной области может идентифицировать или создавать маркеры, которые не полностью соответствуют представленным в настоящем описании, но генетически близко сцеплены или предпочтительно локализованы в гене, обусловливающем стрелкование, или гене B, или сцеплены с маркерами, представленными в настоящем описании. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что другие маркеры могут найти по меньшей мере такое же применение в скрининговых анализах и связанной с использованием маркеров селекции.
Молекулярные маркеры, предпочтительно применяемые в технологии End point TaqMan(r), можно разрабатывать, например, на основе SNP, которые характеризуют на основе секвенированных ПЦР-продуктов, амплифицированных из однолетних и двулетних растений. При этом требуется осуществлять несколько циклов ПЦР-амплификации для того, чтобы охватить полную последовательность гена. Затем новые молекулярные маркеры следует тестировать с использованием различных генетических фонов однолетних и двулетних растений для оценки робастности молекулярного теста.
В одном из вариантов осуществления изобретения молекулярный маркер представляет собой ДНК-фрагмент, амплифицированный с помощью ПЦР, например SSR-маркер или RAPD-маркер. В одном из вариантов осуществления изобретения присутствие или отсутствие амплифицированного ДНК-фрагмента является показателем присутствия или отсутствия самого признака или конкретного ассоциированного с признаком аллеля. В одном из вариантов осуществления изобретения различие в длине ам-плифицированного ДНК-фрагмента является показателем присутствия или отсутствия конкретного ассоциированного с признаком аллеля и в результате позволяет дифференцировать различные ассоциированные с признаком аллели.
В одном из вариантов осуществления изобретения (микросателлитные), основанные на простых повторяющихся последовательностях (SSR), маркеры используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений,
полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.
Специалистам в данной области известно или доступно несколько дополнительных методов или подходов, которые можно применять для идентификации и/или создания маркеров неравновесного сцепления и/или сцепленных с и/или локализованных в области гена B, а также маркеров, которые представляют собой фактически причинные мутации, ответственные за характерный для двулетнего типа развития генотип. Известные специалистам в данной области подходы включают (но не ограничиваясь только ими)
применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании гибридизации подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области; прай-мерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагмент), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять в качестве зондов (гибридизующихся) для выделения нуклеотидных последовательностей/генов, фланкирующих маркеры, и/или сцепленных и/или ассоциированных с областью гена B, и/или специфических для нее, из образца геномной нуклеиновой кислоты и/или образца РНК, или кДНК, или пула образцов (например, осуществляя скрининг геномных ресурсов типа BAC-библиотек или скрининг библиотек гДНК или кДНК);
применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании ПЦР подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области: праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности марке-ров/генов(кандидатов) (или их фрагмент), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять в качестве праймеров для (ПЦР)-амплификации нуклеотидной последовательности/гена, фланкирующего QTL (локусы количественных признаков)-область и/или сцепленного с ней, и/или ассоциированного с ней, и/или специфического в отношении нее из образца геномной нуклеиновой кислоты и/или образца РНК или кДНК, или пула образцов, либо выделенных из конкретной растительной ткани, либо не выделенных из нее, и/или после специфической обработки растения, и из растения сахарной свеклы или в принципе из любого другого организма, имеющего достаточную степень гомологии с сахарной свеклой;
применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании ПЦР подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области: нуклеотидные последовательности/гены одного или нескольких маркеров можно определять после создания внутренних праймеров для указанных маркерных последовательностей и применять для определения дополнительных фланкирующих последовательностей/генов в области гена B и/или генетически сцепленных и/или ассоциированных с признаком;
применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании картирования и/или сравнительного картирования для идентификации маркеров в одном(их) и том(тех) же облас-ти(ях) (определение местоположения (позиционирование) гена B на других картах): на основе информации о местоположении и/или информации о маркерах, представленной выше, маркеры любого типа можно идентифицировать на основе подходов с использованием генетического картирования, в конечном счете (если в этом есть необходимость) путем определения местоположения описанных маркеров (методом генетического картирования или экстраполяции на основе общих маркеров на картах) на гене-тической(их) карте(ах) (высокой плотности) и/или интегрированной(ых) генетической(их) или консен-сусной(ых) карты(карт). Маркеры, которые уже являются известными и/или новые маркеры, генетически сцепленные и/или расположенные вблизи описанных маркеров и/или области гена B, можно идентифицировать и/или получать и в конечном счете применять для картирования (точного) гена B и/или клонирования гена B, и/или применения для MAS-(связанная с маркерами селекция)-селекции;
применение описанных последовательностей/маркеров в "in-siloco''-подходах (методы молекулярного моделирования на основе набора вычислительных методов) для идентификации дополнительных последовательностей/маркеров/генов-кандидатов в области(ях) гена B: праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов-кандидатов (или их фрагмент), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, или на основе сцепленных маркеров, можно использовать в "in-silico''-методах для поиска в базах данных последовательностей или белков (например, с использованием программы BLAST) (дополнительных) фланкирующих и/или гомологичных последовательностей/генов, и/или ал-лельного разнообразия (как геномных последовательностей, так и/или последовательностей кДНК или даже белков, полученных как из представителей рода Capsicum (перец), так и/или из любого другого организма), которые генетически сцеплены и/или ассоциированы с признаками, указанными в настоящем описании, и/или локализованы в области гена B;
применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на физическом картировании подходах (определение местоположения гена B на физической карте или в геномной последовательности): праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагменты), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, или с помощью других маркеров, генетически сцеп
ленных с маркерами, представленными в настоящем описании, и/или локализованных в области гена B, можно позиционировать на физической карте и/или в (полной) геномной последовательности в принципе любого организма, имеющей достаточную степень гомологии для идентификации (перспективных) последовательностей/маркеров/генов, которые можно применять для картирования (точного) гена B и/или клонирования гена B, и/или применения для MAS-селекции;
применение описанных последовательностей/маркеров для определения местоположения гена B на других (физических) картах или геномах (других видов): праймерые последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагменты), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять для подходов, основанных на сравнительном картировании генома или синтении, для идентификации гомологичной области и последовательностей гомологов и/или ортологов/генов (кандидатов), генетически сцепленных с областью гена B и/или расположенных в ней, и которые можно применять для картирования (точного) гена B и/или клонирования гена B, и/или применения для MAS-селекции;
применение описанных последовательностей/маркеров для отбора соответствующих особей, с помощью которых можно идентифицировать маркеры в представляющей интерес области с помощью генетических подходов: праймерные последовательности и/или маркеры, представленные в настоящем описании, можно использовать для отбора особей с другими/контрастирующими аллелями гена B. Подходы, основанные на генетической ассоциации, и/или анализ объединенных сегрегантов (BSA, Michelmore и др., 1991) можно применять для идентификации маркеров/генов в конкретной представляющей интерес области (области гена B) и/или области, ассоциированной или генетически сцепленной с описанными признаками; или
применение представленной информации для поиска (позиционных) генов-кандидатов: представленную информацию можно применять для идентификации позиционных и/или функциональных генов-кандидатов, которые могут быть ассоциированы и/или генетически сцеплены с описанными признаками.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения маркер, основанный на однонуклеотид-ном полиморфизме, используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.
Большая часть производств предназначенных для продажи семян сахарной свеклы находится на юге Франции и севере Италии. В обоих регионах присутствуют однолетние сорные виды свекольных, это может приводить к загрязнению их пыльцой получаемых продуктов и, как следствие, к появлению характерного для однолетнего типа развития генотипа у предназначенных для продажи семян. Это является неприемлемым для покупателей, и поэтому все предназначенные для продажи партии семян выращивают в регионах, таких как Аргентина, в которых сорные виды свекольных не вырастают непосредственно после сбора семян. Растения являются неяровизированными и наличие стрелок используют для идентификации партий, загрязненных характерным для однолетнего типа развития генотипом.
Таким образом, полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в изобретении, можно применять для контроля качества партий поступающих в продажу семян путем скрининга поступающих в продажу семян двулетней сахарной свеклы в отношении загрязнителей, имеющих характерный для однолетнего типа развития генотип, и для идентификации однолетних/двулетних растений в программах селекции, в которых используют признак однолетнего типа развития для ускорения процесса селекции, или когда признак однолетнего типа развития интродуцируют вместе с новыми источниками генетической вариации. Различные анализы, основанные на применении генной последовательности, предлагаемой в изобретении и описанной выше, можно создавать и применять для скрининга растительного материала в отношении присутствия или отсутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности.
Ранее были разработаны методы применения молекулярных маркеров, которые можно использовать для генетического картирования, клонирования генов, размножения растений с использованием маркеров и фингерпринтинга генома и исследования генетических взаимосвязей. Генетические маркеры создают на основе полиморфизмов ДНК в нуклеотидных последовательностях геномных областей и их можно выявлять либо с помощью рестриктаз, либо с помощью двух примированных сайтов.
Известно несколько типов молекулярных маркеров, которые можно применять для основанного на использовании маркеров отбора, в том числе полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (RFLP), произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (RAPD), полиморфизмы длин амплифицирован-ных фрагментов (AFLP), простые повторяющиеся последовательности (SSR) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP).
Информационное содержание различных типов маркеров может различаться в зависимости от метода, применяемого для получения данных о маркерах, и популяции, в которой оценивали маркеры. Например, не всегда возможно отличать геномные фрагменты, которые находятся в гомозиготном состоянии, от гетерозиготных фрагментов. В гетерологичной популяции типа F2, кодоминантные маркеры, такие как полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (RFLP, Botstein и др., 1980) и характеризующиеся кодоминантностью полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (AFLP, Vos и др.,
1995), являются более информативными, чем доминантные маркеры, такие как произвольно амплифици-рованные полиморфные ДНК (RAPD, Welsh и McCleland, 1990) и характеризующиеся доминантностью AFLP. RFLP являются кодоминантными и их можно применять для идентификации уникального локуса. RFLP предусматривает применение рестриктаз для расщепления хромосомной ДНК в специфических коротких сайтах рестрикции, полиморфизмы являются результатом дупликаций сайтов или их делеций, или мутаций в сайтах рестрикции.
При использовании AFLP требуется расщепление клеточной ДНК с помощью рестриктазы перед осуществлением ПЦР и селективных нуклеотидов в праймерах для амплификации специфических фрагментов. При использовании этого метода можно оценивать вплоть до 100 полиморфных локусов, и для каждого анализа требуется лишь относительно небольшой образец ДНК.
Наиболее предпочтительным методом для амплификации нуклеотидных фрагментов, покрывающих полиморфную область растительного генома, является полимеразная цепная реакция ("ПЦР") (Mul-lis и др., 1986), для осуществления которой используют пару праймеров, включающую "обратный" прай-мер и "прямой" праймер, которые обладают способностью гибридизоваться с проксимальными последовательностями, определяющими полиморфизм, в их двухцепочечной форме.
В отличие от RFLP для осуществления методов, основанных на ПЦР, требуется лишь небольшой процент (примерно 10%) ДНК, применяемой в качестве матрицы, для получения больших количеств последовательности-мишени с помощью ПЦР-амплификации.
Одним из таких основанных на ПЦР-методов является RAPD, в котором применяют осуществляемую в расслабленных условиях амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием только праймеров произвольной последовательности для создания специфических для штамма массивов неизвестных ДНК-фрагментов. Для этого метода требуются лишь очень небольшие образцы ДНК, и он позволяет анализировать большое число полиморфных локусов. Однако непредсказуемое поведение коротких праймеров, на которые влияют различные условия реакции, их доминантный путь наследования и популяционная специфичность являются основными недостатками RAPD.
Микросателлиты или простые повторяющиеся последовательности (SSR), полиморфизмы длин простых последовательностей (SSLP), короткие тандемные повторы (STR), мотивы простых последовательностей (SSM) и микросателлиты последовательностей-мишеней (STM) представляют собой класс повторяющихся последовательностей, которые широко распространены в геноме эукариот. Вариация количества и длины повторов является источником полиморфизма даже среди близкородственных особей. Анализ SSR основан на этих (несущих короткий повтор) последовательностях, которые селективно амплифицируют для выявления вариаций в простых повторяющихся последовательностях. Такие микро-сателлитные последовательности легко можно амплифицировать с помощью ПЦР с использованием пары специфических для локуса фланкирующих олигонуклеотидов в качестве праймеров для выявления полиморфизмов длин ДНК (Litt и Luty, 1989; Weber и May, 1989).
Мутации, затрагивающие одно положение в нуклеотидной последовательности, приводящие к заменам, делециям или инсерциям, приводят к однонуклеотидным полиморфизмам или SNP, которые встречаются примерно через каждые 1,3 т.п.н. в геноме человека (Cooper и др., 1985; Kwok и др., 1996). Большинство полиморфизмов этого типа имеют только два аллеля и их называют также биаллельными локусами. Позиционное клонирование на основе SNP может облегчать идентификацию признаков болезней и ряда биологически информативных мутаций (Wang и др., 1998).
Анализы, основанные на ПЦР-удлинении, которые позволяют эффективно выявлять точковые мутации, можно применять для обнаружения SNP. Для процедуры требуется небольшое количество ДНК на образец. Тремя широко распространенными типами анализов выявления SNP с использованием метода ПЦР, являются методы, основанные на применении расщепленных амплифицированных полиморфных последовательностей (CAPS), (Konieczny и Ausubel, 1993; Thiel и др., 2004), производных CAPS (dCAPS) (Michaels и Amasino, 1998; Neff и др., 1998) и конформационного полиморфизма одной цепи (SSCP) (Orita и др., 1989).
CAPS-полиморфизмы представляют собой различия в длинах рестрикционных фрагментов, вызываемые SNP или инделами, которые создают или упраздняют распознаваемые обладающими эндонукле-азной активностью рестриктазами сайты рестрикции в ПЦР-ампликонах, продуцируемых специфическими для локуса олигонуклеотидными праймерами. Анализы CAPS осуществляют путем расщепления специфических для локуса ПЦР-ампликонов одной или несколькими рестриктазами и последующего разделения расщепленной ДНК на агарозных или полиакриламидных гелях.
dCAPS является модификацией метода CAPS, который позволяет выявлять большинство однонук-леотидных изменений путем использования ошибочно спаренных ПЦР-праймеров. С помощью этого метода распознаваемый рестриктазой сайт, который включает SNP, интродуцируют в ПЦР-продукт с помощью праймера, который содержит одно или несколько ошибочных спариваний с ДНК-матрицей. Затем модифицированный таким образом ПЦР-продукт подвергают расщеплению рестриктазой и определяют присутствие или отсутствие SNP на основе полученной рестрикционной схемы.
Метод SSCP позволяет разделять денатурированную двухцепочечную ДНК на неденатурирующем геле и в результате позволяет определять на основе подвижности в геле вторичную структуру, а также
молекулярную массу одноцепочечной ДНК.
Процедура ARMS (амплификация рефракторной мутационной системы)-ПЦР (Ye и др., 2001) предусматривает применение одной ПЦР для генотипирования SNP (Fan и др., 2003; Chiapparino и др., 2004). Состоящий из двух пар праймеров тетрапраймер используют для амплификации двух различных аллелей SNP в одной реакции ПЦР.
Для амплификации таких фрагментов можно применять альтернативные методы, такие как "лигаз-ная цепная реакция" ("ЛЦР") (Barany F., 1991)), для осуществления которой применяют две пары олиго-нуклеотидных зондов для экспоненциальной амплификации специфической мишени. Последовательности каждой пары олигонуклеотидов выбирают так, чтобы позволять паре гибридизоваться с примыкающими последовательностями этой же цепи мишени. С помощью указанной гибридизации формируют субстрат для зависящей от матрицы лигазы. Также как в случае ПЦР, образовавшиеся продукты служат в качестве матрицы в последующих циклах и таким образом осуществляют экспоненциальную амплификацию требуемой последовательности. ЛЦР можно осуществлять с олигонуклеотидами, имеющими проксимальные и дистальные последовательности одной и той же цепи полиморфного сайта. В одном из вариантов осуществления изобретения следует создавать олигонуклеотиды, включающие фактический полиморфный сайт полиморфизма. В таком варианте осуществления изобретения условия реакции выбирают так, чтобы олигонуклеотиды могли лигироваться вместе только в том случае, когда молекула-мишень либо содержит, либо лишена специфического олигонуклеотида, который является комплементарным полиморфному сайту, присутствующему в олигонуклеотиде. В другом варианте олигонуклеоти-ды можно выбирать так, что они не включают полиморфный сайт (см. Segev, заявка PCTWO 90/01069).
Еще один альтернативный метод, который можно применять, представляет собой "метод лигирова-ния олигонуклеотидов" ("OLA") (Landegren и др., 1988). В OLA-протоколе используют два олигонуклео-тида, которые создают так, чтобы они могли гибридизоваться с примыкающими последовательностями одной цепи мишени. OLA подобно ЛЦР наиболее пригоден для выявления точечных мутаций. В отличие от ЛЦР в результате OLA получают "линейную", а не экспоненциальную амплификацию последовательности мишени.
Nickerson с соавторами в 1990 г. описали анализ выявления нуклеиновой кислоты, который объединяет особенности и ПЦР, и OLA (Nickerson и др., 1990). В этом методе ПЦР используют для достижения экспоненциальной амплификации ДНК-мишени, которую затем выявляют с помощью OLA. Помимо необходимости в осуществлении нескольких и разнообразных стадий процессинга одна из проблем, возникающих при применении таких комбинированных методов, состоит в том, что они включают все проблемы, связанные как с ПЦР, так и с OLA.
Известны также схемы, основанные на лигировании двух (или большего числа) олигонуклеотидов в присутствии нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность образовавшегося "диолигонуклеоти-да", что приводит к амплификации диолигонуклеотида (Wu и Wallace, 1989), и их можно легко адаптировать для целей настоящего изобретения.
Еще в одном варианте осуществления изобретения маркер, полученный на основе делеции или ин-серции ("индел") по меньшей мере одного нуклеотида, используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений. Эти маркеры можно создавать на основе последовательности полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении и описанных выше.
В частности, маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в анализе ал-лельной дискриминации, прежде всего в анализе, который позволяет различать (дискриминировать) различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих генотип, характерный для двулетнего типа развития. Указанный анализ базируется на применении набора полинуклеотидных зондов, содержащего две различные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена BvPRR7, которую можно получать путем ПЦР-амплификации с использованием "прямого" праймера PRR7(T1)-F и "обратного" праймера PRR7(T1)-F-R, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, где молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариванием оснований и представляют собой зонды PRR7(T1)-VIC (SEQ ID NO: 15) и PRR7(T1)-FAM (SEQ ID NO: 16). Другие предпочтительные наборы включают "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и "обратный" праймер PRR7(T6)-R, представленный в SEQ ID NO: 50, в сочетании с зондами PRR7(T6)-VIC (SEQ ID NO: 51) и PRR7(T6)-FAM (SEQ ID NO: 52), а также "прямой" праймер 1r22(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 55, и "обратный" праймер 1r22(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 56, в сочетании с зондами rr22Cr1)-VIC (SEQ ID NO: 57) и 1r22(T1)-FAM (SEQ ID NO: 58).
Указанные анализы, в которых применяют набор полинуклеотидных зондов, предпочтительно содержащий по меньшей мере две отдельные молекулы-зонды, которые отличаются по меньшей мере одним ошибочным спариванием, предпочтительно двумя или большим количеством ошибочных спариваний, которые локализованы в соседних сайтах, но прежде всего одним ошибочным спариванием, в котором первая молекула-зонд, прежде всего меченая молекула-зонд, более предпочтительно молекула-зонд, меченная первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а вторая молекула-зонд, прежде всего меченая молекула-зонд, более предпочтительно молекула-зонд, меченная
вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, и гасителем, представляет собой другой аллель, и где указанный набор полинуклеотидных зондов применяют для дискриминации двух аллельных вариантов. Кроме того, можно применять две различные флуоресцентные метки, флуоресценцию которых легко можно различать. Например, первый зонд метят первым флуоресцентным красителем (типа, например FAM), а второй зонд метят вторым флуоресцентным красителем (типа, например VIC). В предпочтительном варианте указанного анализа, предлагаемого в настоящем изобретении, амплифицированный фрагмент, полученный на стадии б) описанного выше анализа аллельной дискриминации, предлагаемого в настоящем изобретении, дополнительно зондируют второй флуоресцент-номеченной молекулой-зондом, которая содержит последовательность, специфическую для аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития. В этом анализе повышение уровня флуоресценции только одного красителя, которым метят первый зонд, свидетельствует о присутствии аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития. Два красителя, которые применяют в этом анализе, предпочтительно представляют собой VIC и FAM. Как правило, в анализах, предлагаемых в настоящем изобретении, предпочтительно применяют 2 праймера (т. е. пару праймеров, предлагаемых в изобретении) и по меньшей мере один зонд для аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития. Можно применять также второй зонд, представляющий собой зонд для аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития.
Другим объектом изобретения является анализ, для которого используют маркеры, обеспечивающие специфическую дискриминацию однолетних растений и двулетних растений, который в результате можно применять, например, для контроля качества партий семян.
В частности, изобретение относится к анализу, основанному на использовании набора полинуклео-тидных зондов, содержащего две различные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена BvPRR7, которую можно получать путем ПЦР-амплификации с использованием "прямого" праймера PRR7(T1)-F и "обратного" праймера PRR7(T1)-F-R, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, где молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариванием оснований и представляют собой зонды PRR7(T1)-VIC (SEQ ID NO: 15) и PRR7(T1)-FAM (SEQ ID NO: 16). Другие предпочтительные наборы включают "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и "обратный" праймер PRR7(T6)-R, представленный в
SEQ ID NO: 50, в сочетании с зондами PRR7(T6)-VIC (SEQ ID NO: 51) и PRR7(T6)-FAM (SEQ ID NO:
52), a также "прямой" праймер 1r22(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 55, и "обратный" праймер 1r22(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 56, в сочетании с зондами rr22(T1)-VIC (SEQ ID NO: 57) и 1r22(T1)-FAM (SEQ ID NO: 58).
Следующим объектом настоящего изобретения является способ идентификации загрязнения однолетним генотипом предназначенных для продажи семян. Предпочтительно этот способ заключается в том, что применяют основанный на использовании маркеров анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в настоящем изобретении и представленный в настоящем описании.
Представленные ниже примеры даны только для иллюстрации одного или нескольких предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не направлены на ограничение объема изобретения.
Примеры
В приведенных ниже примерах проиллюстрированы варианты осуществления изобретения. В свете представленного описания и известного уровня техники специалисту в данной области должно быть очевидно, что приведенные ниже примеры даны только с целью иллюстрации и что многочленные изменения, модификации и вариации можно применять без отклонения от сущности и объема изобретения, представленного в формуле изобретения.
Пример 1. Характеризация гена PRR7 сахарной свеклы.
Пример 1.1. Картирование предполагаемого гомолога PRR7 из сахарной свеклы.
На основе подхода, включающего применение генов-кандидатов, для идентификации и характери-зации предполагаемых генов, контролирующих стрелкование у сахарной свеклы, была идентифицирована EST-последовательность, имеющая регистрационный номер CV301305, в качестве предполагаемого гомолога гена PRR7 свеклы с помощью оценки гомологии BLAST-методом. В SEQ ID NO: 1 представлена нуклеотидная последовательность EST CV301305. Частью соответствующей аминокислотной последовательности является мотив домена-приемника регулятора псевдоответа (PRR, pfam00072) или домена-приемника сигнала (REC, cd00156) (фиг. 1), отличительного признака семейства генов PRR, которые все имеют решающее значение для работы внутренних часов организма (Nakamichi и др., 2005). На фиг. 2 представлено сравнение аминокислотной последовательности CV301305 и аминокислотной последовательности PRR7, ее ближайшего гомолога из Arabidopsis, который описан как компонент чувствительной к температуре циркадной системы (внутренних часов организма) (Nakamichi и др., 2007; Salome и McClung, 2005). Известно, что внутренние часы организма контролируют ряд связанных с развитием процессов у растений, включая контроль времени цветения (Imaizumi и Kay, 2006; Zhou и др., 2007).
На основе вышеуказанных данных была выведена предполагаемая генная структура части PRR7-фрагмента с помощью сравнительного анализа геномной последовательности и мРНК гена PRR7 Arabi-dopsis (AT5G02810 и NM 120359 соответственно) и EST (CV301305) гена BvPRR7 сахарной свеклы, ко
торый подтвердил присутствие нескольких предполагаемых интронных областей (фиг. 3). Праймеры PRR7-F и PRR7-R (SEQ ID NO: 2 и 3), фланкирующие предполагаемую третью интронную область, обеспечивали получение продукта амплификации размером примерно 0,5 т.п.н. при применении геномной ДНК свеклы в качестве матрицы. Для амплификации с помощью ПЦР применяли следующие условия: начальная денатурация при 95°C в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°C, 30 с при 60°C и 30 с при 72°C и затем 5 мин при 72°C. ПЦР-эксперименты осуществляли в устройстве GeneAMP PCR System 9600 фирмы Applied Biosystems Inc., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Taq и соответствующую реакционную смесь фирмы Invitrogen Corporation, согласно рекомендациям поставщика. Анализ последовательности ПЦР-продукта позволил реконструировать геномную последовательность вокруг интрона 3 гена BvPRR7 и подтвердил присутствие фрагмента длиной 296 пар оснований (SEQ ID NO: 4). Геномный фрагмент гена BvPRR7 амплифицировали и секвенирова-ли с использованием панели родительских линий сахарной свеклы, включающей 15 двулетних и 1 однолетнюю линию. Все двулетние линии оказались мономорфными по BvPRR7, поскольку обнаружено только два различных гаплотипа: один аллель, ассоциированный с двулетним типом развития, и один аллель, ассоциированный с однолетним типом развития (табл. 1). Для картирования BvPRR7 в популяции, расщепленной по признаку однолетности, создавали анализ, обеспечивающий выявление SNP в положении №160 (SEQ ID NO: 4), используя технологию EndPoint TaqMan(r). В табл. 2 представлены нук-леотидные последовательности праймеров и зондов, созданных для PRR7(Т1)-TaqMan(r)-анализа, направленного на выявление SNP в положении №160; в реакции использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (TaqMan(r) Universal PCR Master Mix, No AmpErase(r) UNG) (2x) фирмы Applied Bio-systems Inc. согласно рекомендациям производителя. ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием следующих условий: 95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин, используя детекторное устройство для секвенирования последовательности типа ABI PRISM 7700. Оценку с использованием технологии EndPoint осуществляли с помощью программы Sequence Detection System 2.0.
В верхнем ряду таблицы показаны положения нуклеотидов в геномной последовательности фрагмента гена BvPRR7 (представлена в SEQ ID NO: 4). В ряду, озаглавленном "гаплотип № 1" и "гаплотип № 2" представлены два гаплотипа, которые были обнаружены в панели, состоящей из 16 линий.
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, применяемых в TaqMan-анализе с использованием PRR7(T1) с целью генотипирования SNP №160
Обозначения применяемых праймеров и зондов
Нуклеотидная последовательность (5'-3')
SEQ ID NO:
PRR7(T1)-F
GAGGTGTCACAGTGTAAGTGTCT
PRR7(T1)-R
AAAGACTGCTACACGAACCACTAAG
PRR7(T1)-FAM
FAM-CTGATGAAAAGCTG-MGB-NFQ
PRR7(T1)-VIC
VIC-CTGATGGAAAGCTG-MGB-NFQ
С помощью описанного выше анализа с использованием PRR7(T1) ген BvPRR7 был картирован в F2-популяции, включающей 198 растений, которые получали скрещиванием однолетней линии и двулетней линии, полиморфной по SNP в положении №160. BvPRR7 картирован на хромосоме II на расстоянии примерно 1 сМ по ходу транскрипции относительно маркера GJ131 (фиг. 4), в области, которая, как известно, содержит ген В, обусловливающий независимое от яровизации цветение (Mohring и др., 2004; Gaafar и др., 2005). Результаты анализа с использованием PRR7(T1) продемонстрировали точное соответствие между предсказанным генотипом гена B и генотипом гена BvPRR7. Генотип гена B был предсказан на основе фенотипической оценки F3-популяций, которые были получены из индивидуальных F2-растений, характеризующихся независимым от яровизации цветением. В табл. 3 дано графическое представление точной карты области гена B для 9 индивидуальных растений-потомков, включающих случаи ближайшей рекомбинации. Сочетание его положения на карте и биологической функции, связанной с чувствительным к температуре циркадным ритмом (Salome и McClung, 2005), с большой долей вероятности делает BvPRR7 наиболее перспективным кандидатом на роль гена B.
Пример 1.2. Выделение полноразмерной геномной последовательности BvPRR7.
Используя праймеры PRR7-F и PRR7-R, подвергали скринингу BAC-библиотеку сахарной свеклы с помощью ПЦР. Библиотеку создавали на основе двулетнего коммерческого культивара H20 с тем расчетом, чтобы она включала 6 геномных эквивалентов со средним размером вставки 120 т.п.н. (McGrath и др., 2004). Пулы ДНК для этой библиотеки получали от фирмы Amplicon Express, Пулман, шт. Вашингтон. Для скрининга пулов ДНК применяли следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95°C в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°C, 30 с при 60°C и 30 с при 72°C и затем в течение 5 мин при 72°C. ПЦР-эксперименты осуществляли в устройстве GeneAMP PCR System 9600 фирмы Applied Biosystems Inc., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Taq и соответствующую реакционную смесь фирмы Invitrogen Corporation согласно рекомендациям поставщика. Последующий скрининг пулов ДНК в отношении присутствия BvPRR7-фрагмента, проведенный согласно инструкциям поставщика, позволил осуществить положительную идентификацию клона BAC SBA079-L24.
Для получения полноразмерной последовательности гена клон BAC SBA079-L24 передавали на фирму MWG Biotech AG, Германия, для анализа последовательности с помощью технологии секвениро-вания, разработанной фирмой "454 Life Sciences". При необходимости бреши между полученными наборами последовательных фрагментов заполняли путем общепринятого секвенирования по Сангеру с получением моногенной последовательности гена BvPRR7 (SEQ ID NO: 8). На основе сравнительного анализа геномной последовательности с последовательностью EST CV301305 и на основе гомологии последовательностей с геном PRR7 из Arabidopsis, была предсказана предполагаемая структура гена BvPRR7 свеклы, включающая интроны и экзоны, которая представлена на фиг. 5. Соответствующая аминокислотная последовательность BvPRR7 представлена в SEQ ID NO: 11. Сравнительный анализ аминокис
лотной последовательности BvPRR7 и всех представителей семейства PRR-гена из Arabidopsis, включая ТОС1 (PRR1), PRR3, PRR5, PRR7 и PRR9, позволил проиллюстрировать выраженную консервативность мотива домена-приемника регулятора псевдоответа (PRR) (pfam00072) вблизи №Т2-конца и CCT-мотива (pfam06203) на COOH-конце (фиг. 6). Помимо семейства PRR-гена из Arabidopsis, BvPRR7 характеризуется также выраженной гомологией с PRR7 зерновых культур, что проиллюстрировано с помощью филогенетического дерева, представленного на фиг. 7. Дерево, представленное на фиг. 7, создавали, используя метод "объединения соседей" (Saitou и Nei, 1987), с применением нескольких представителей семейства гена PRR из нескольких видов растений, включая Beta vulgaris BvPRR7, Arabidopsis thaliana (TOC1, NP 200946; PRR3, NP 568919; PRR5, NP 568446; PRR7, NP 568107; и PRR9, NP 566085), Oryza sativa (PRR37, Q0D3B6), Hordeum vulgare (PPD-H1, AAY17586) и Triticum aestivum (PPD-D1, ABL09477). Дендрограммы неукорененного дерева создавали, осуществляя сравнительных анализ аминокислотных последовательностей с использованием программы ClustalW, a филогенетическое дерево строили с использованием программы MEGA4 (Tamura и др., 2007). На каждой ветви представлены значения, полученные при использовании "bootstrap''-анализа для 1000 реплик. Неожиданным является то, что гомолог PRR7 в зерновых культурах, более известный как Ppd, рассматривается в качестве основного определяющего фактора фотопериодической реакции (Turner и др., 2005; Beales и др., 2007), а не определяющего яровизационный ответ фактора, как это предполагается в настоящем описании для сахарной свеклы. Пример 1.3. Точное картирование B-локуса.
На основе предварительных результатов картирования, описанных выше в примере 1.1, начинали крупномасштабное картирование с высокой степенью разрешения для "заполнения" области вокруг молекулярных маркеров GJ131 и GJ01, применяемых для картирования и подтверждения корреляции между предсказанным генотипом гена B и генотипом гена BvPRR. Было проанализировано в целом 5157 особей Б2-поколения, полученных из нескольких популяций, для которых характерна сегрегация по признаку однолетности, с использованием двух фланкирующих маркеров GJ01(T1) и GJ131^1) (Gaafar и др., 2005). В целом идентифицировано 71 растение Б2-поколения, для которых характерна рекомбинация между двумя фланкирующими маркерами. Соответственно рассчитан интервал картирования для гена B, составляющий 0,69 сМ. Затем рекомбинантные растения генотипировали с помощью анализа с использованием PRR7(T1), описанного выше, и с помощью пригодных для данного интервала анализов 9_27(Т2) и ED031700(T1), которые описаны в заявке на европейский патент EP 1995320 А1. В табл. 4 обобщены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, созданных для GJ131(T1)-, 9_27(T2)-, ED031700(T1)-, PRR7(T1)- и GJ01(T1)-TaqMan(r)-анализов; в реакциях использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (TaqMan(r) Universal PCR Master Mix, No AmpErase(r) UNG) (2x) фирмы Applied Biosystems Inc. согласно рекомендациям производителя. ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием следующих условий: 95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин, используя устройство для осуществления ПЦР в реальном времени типа Applied Biosystems 7500.
Таблица 4
Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, применяемые в GJ131(T1)-, 9_27(Т2)-, ED031700(T1)-, PRR7(T1)- и ОЛ)1(Т1)-ТадМап(r)-анализах соответственно
СИ31(Т1)-анализ
SEQ ID NO
Последовательность
"прямой" праймер
GCCCGTACAAACAAAGACTTCTC
"обратный" праймер
ACGCAGAATGTTGATGATGATACA
зонд TaqMan VIC
TCCATCTCTCCACAGCTT
зонд TaqMan VAM
TCCATCTCCCCACAGCT
9_27(Т2)-анализ
"прямой" праймер
TGCCAAAACACACATTGTACCTATACA
"обратный" праймер
TGCCTCTGGCTCCTTGAAG
зонд TaqMan VIC
CATCTCTACAACACTACC
зонд TaqMan VAM
ATCTCTACAAGACTACC
ЕО031700(Т1)-анализ
"прямой" праймер
TAAAGGTGGTAATTTTAGAGAATTTTAGGA
"обратный" праймер
GCTCGTTTTGAAAAAATTTGGG
зонд TaqMan VIC
TTTAATTCGCATCCTTCT
зонд TaqMan VAM
TTAATTCGCAAACTTCT
Р1Ш7(Т1)-анализ
"прямой" праймер
GAGGTGTCACAGTGTAAGTGTCT
"обратный" праймер
AAAGACTGCTACACGAACCACTAAG
зонд TaqMan VIC
CTGATGGAAAGCTG
зонд TaqMan VAM
CTGATGAAAAGCTG
С101(Т1)-анализ
"прямой" праймер
GAACCCAGGATTACTCGTGAGC
"обратный" праймер
AAAAGTAGAATAAAATGTAACCTCCTCCATCTC
зонд TaqMan VIC
ACGCAAGATAACATCAC
зонд TaqMan VAM
ACGCAAGATAACGTCAC
Аллельный статус гена B выводили на основе исследований фенотипов индивидуальных растений из Р2-поколения (т.е. наличие или отсутствие стрелкования в условиях фотопериода с длинным световым днем (18 ч света/6 ч темноты), а также соответствующих популяций потомков, которые получали самоопылением растений Б2-поколения. В табл. 5 представлено графическое изображение полученной с высоким разрешением карты области гена B, на котором обобщены генотипические и фенотипические данные, полученные для различных рекомбинантных растений. Полная корреляция между генотипом гена PRR7 и фенотипом всех рекомбинантов позволяет сделать заключение о том, что гомолог PRR7 свеклы действительно представляет собой ген В. Принимая во внимание наличие одного случая рекомбинации на каждой стороне гена B, при создании настоящего изобретения интервал картирования гена B был снижен до 0,02 сМ, при этом ген PRR7 в случае признака однолетности совместно локализован наверху гена B.
Таблица 5
Графическое изображение полученной с высоким разрешением карты области гена B. Генотипы "A" и "B" каждого маркера соответствуют аллелям, ассоциированным с признаком
однолетности и двулетности соответственно. Интервалы локализации гена B обозначены двумя примыкающими выделенными черным цветом колонками и основаны на фенотипах, обнаруженных для каждого рекомбинантного растения Г2-поколения (B - аллель, ассоциированный с признаком двулетности; A - аллель, ассоциированный с признаком
1(Т1)
1330 |
Линия
Фенотип Р2-поколения
> -5
ED03
Р1-0580
Однолетний
Р1-0678
Однолетний
А ¦
Р1-0977
Однолетний
Р1-1383
Однолетний
Р2-0969
Однолетний
Р2-1178
Однолетний
РЗ-0103
Однолетний
РЗ-0176
Однолетний
Р1-0960
Однолетний
"I 1
Р2-0П6
Однолетний
ТТЛ
Р2-0991
Однолетний 1
Р2-2437
Однолетний
н "
"\Г
Р1-1026
Однолетний
Р1-1494
Однолетний
1R22(T1
PRR7(T1
1 А
А 1
Н 1
1!.
п 1 i Г 1
л I
н |н 1
Пример 1.4. Анализ генной экспрессии BvPRR7.
Для анализа генной экспрессии проростки однолетних, двулетних и двулетних яровизированных растений выращивали в камерах с контролируемыми условиями окружающей среды при постоянной температуре 18°C и фотопериоде 16 ч света/8 ч темноты (длинный световой день, ДД) или 8 ч света/16 ч темноты (короткий световой день, КД) соответственно. Каждые 2 ч в течение 24 ч отбирали образцы листьев и выделяли общую РНК с помощью набора RNAqueous(r)-4PCR, поступающего в продажу от фирмы Ambion, следуя в целом инструкциям поставщика. Образцы РНК превращали в кДНК с помощью набора RETROscript(r) (фирма Ambion), начиная процесс с 1 мкг общей РНК в качестве матрицы. Уровень экспрессии гена BvPRR7 оценивали с использованием количественной ПЦР (кПЦР) с помощью мастер-смеси для ПЦР Power SYBR(r) Green PCR Master Mix (фирма Applied Biosystems Inc.) на устройстве для осуществления ПЦР в реальном времени типа 7500 System. При осуществлении ПЦР использовали следующие параметры: начальная денатурация при 95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов амплификации по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Применяли "прямой" и "обратный" праймеры для BvPRR7, имеющие следующие нуклеотидные последовательности: 5'-TTGGAGGAGGTGTCACAGTTCTAG-3' (SEQ ID NO: 45) и 5'-TGTCATTGTCCGACTCTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 46) соответственно. Ген изоцит-ратдегидрогеназы (BvICDH) использовали в качестве гена, с которым проводят сравнение (референс-гена), для стандартизации уровня экспрессии BvPRR7. Праймерные последовательности, созданные для
этого референс-гена, представляли собой 5'-CACACCAGATGAAGGCCGT-3' (SEQ ID NO: 47) и 5'-CCCTGAAGACCGTGCCAT-3' (SEQ ID NO: 48), Уровни экспрессии рассчитывали в виде средних для
трех биологических повторностей и каждую кПЦР повторяли трижды.
Как проиллюстрировано на фиг. 8, экспрессия гена BvPRR7 во всех трех классах растений (т.е. однолетних, двулетних и двулетних яровизированных растений) характеризуется циркадным колебанием с пиком уровня экспрессии через 7 ч после рассвета как при ДД (16 ч света/8 ч темноты), так и при КД (8 ч света/16 ч темноты). Этот эксперимент подтвердил ритмичную и циркадную экспрессию BvPRR7, что описано для большинства ассоциированных с внутренними часами генов, идентифицированных к настоящему времени (McClung, 2006).
Пример 1.5. Аллельная вариабельность и связь с требованием к яровизации.
С помощью пар праймеров, представленных в табл. 6, полную кодирующую область гена BvPRR7, а также участок ±1,0 т.п.н. ее промоторной области, амплифицировали и секвенировали с использованием панели двулетних и однолетних исследуемых вариантов. Эта панель включала 3 двулетние элитные линии из пула зародышевой плазмы фирмы Syngenta, а также однолетние и двулетние дикие и сорные виды свеклы, собранные в Европе. Для ПЦР-амплификации использовали следующие условия: начальная денатурация при 95°C в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°C, 30 с при 60°C и 30 с при 72°C и затем 5 мин при 72°C. ПЦР-эксперименты осуществляли с помощью устройства GeneAMP PCR System 9700 фирмы Applied Biosystems Inc., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Taq и соответствующую реакционную смесь фирмы Invitrogen Corporation согласно рекомендациям поставщика. Графическое представление обнаруженных генотипов включало несколько различных аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития, и 2 - с двулетним типом развития (ср. табл. 7-1 и 7-2, также представленные на фиг. 11 и 12 соответственно). Для нескольких полиморфизмов обнаружено наличие выраженной корреляции между аллельными вариациями, обнаруженными для BvPRR7, и однолетним или двулетним фенотипом растения. Эти данные подтверждают причинную взаимосвязь между BvPRR7 и локусом В для независимого от яровизации цветения у сахарной свеклы. В табл. 7-1 (фиг. 11) представлены полиморфизмы, идентифицированные в промоторной области при сравнении аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития. Линии растений с гетерозиготными формами аллелей не использовали для анализа. Положения SNP, указанные в табл., пронумерованы согласно SEQ ID NO: 8. Нуклеотидые положения, обозначенные звездочкой (*), можно применять для дискриминации аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития. Как видно из табл. 7-1 (фиг. 11), SNP в положениях №№ 11592, 12316, 12490 и 12544 соответственно промоторной области можно применять для того, чтобы различать аллели, ассоциированные с однолетним и с двулетним типом развития. Полиморфизмы, идентифицированные в кодирующей области, при сравнении аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития, представлены в табл. 7-2 (фиг. 12). Линии растений с гетерозиготными формами аллелей и в этом случае не использовали для анализа. В табл. 7-2 (фиг. 12) SNP и аминокислотные положения пронумерованы согласно SEQ ID NO: 9 и 11 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные положения, обозначенные звездочкой (*), можно применять для дискриминации аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития. Среди SNP, обнаруженных в кодирующей области, SNP в положениях №№ 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915 и 2334 соответственно, можно применять для того, чтобы различать все ассоциированные с однолетним и ассоциированные с двулетним типом развития аллели. Для гарантии качества любой один или комбинации нескольких SNP, обнаруженных в кодирующей области, а также в промоторной области, можно применять для выявления присутствия ассоциированного с однолетним типом развития аллеля в предназначенных для продажи партиях
семян двулетних культиваров с помощью молекулярных маркеров, мишенью которых является один или несколько из указанных SNP.
Гаплотипы BvPRR7 в различных однолетних и двулетних исследуемых вариантах (см. также фиг. 11)
Нуклеотидные последовательности праймеров, применяемых для амплификации и секвенирования кодирующей области, а также участка±1 т.п.н. из 5' UTR-области гена BvPRR7
Таблица 7-2
Гаплотипы BvPRR7 в различных однолетних и двулетних исследуемых вариантах (см. также фиг. 12)
Нуклеотидное положение
С С
GGGGO. GGGGGGGGGGGGGGG
G G G G G С. G (J G G G О (, G
G G (, (j G G G G G (I G G G G G G G (; G
с с с с с Е-
G G G G G О G G G G G G G G G О
G G G G G
Пример 1.6. Аллельная дискриминация однолетних и двулетних растении сахарной свеклы.
Присутствие "стрелкующихся растений", т.е. растений сахарной свеклы, содержащих ассоциированный с однолетним типом развития аллель В, в лотах, предназначенных для продажи семян из-за попадания пыльцы однолетнего растения в процессе получения гибридных семян, представляет собой основной параметр качества при производстве и продаже сахарной свеклы. Поэтому для контроля качества производства семян важно иметь средство, позволяющее осуществлять дискриминацию однолетних и двулетних растений.
Для аллельной дискриминации выделяли ДНК из растений или семян, подлежащих оценке, с помощью общепринятых методов выделения ДНК. Затем ДНК тестировали с использованием TaqMan(r)-анализа, направленного на выявление SNP в положении № 2334 в кодирующей области. В этом анализе использовали следующие нуклеотидные последовательности:
PRR7fT6)-F: 5'-
GCTATCGGTATTCCTTCCTTTGTTT-3' (SEQ ID NO: 49), PRR7(T6)-R: 5'-CTCGTGTTCGTGGGCAATT-3' (SEQ ID NO: 50), PRR7(T6)-VIC: 5'-VIC-CTCGTACCTGGCGCAC-MGB-NFQ-3' (SEQ ID NO: 51) и PRR7(T6)-FAM: 5'-
FAM-CTCGCACCTGGCGCAC-MGB-NFQ-3' (SEQ ID NO: 52). Для осуществления ПЦР-реакции использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (TaqMan(r) Universal PCR Master Mix, No AmpErase(r) UNG) (2x) фирмы Applied Biosystems Inc. согласно рекомендациям производителя. ПЦР-амплификацию осуществляли в следующих условиях: 95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин, с использованием устройства для осуществления ПЦР в реальном времени типа, Applied Biosystems 7500 System. Оценку с использованием технологии EndPoint осуществляли с помощью программы Sequence Detection System 2.0. Если анализ демонстрировал существенное повышение только флуоресценции, связанной с красителем VIC, то это свидетельствует о гомозиготности аллеля X (т.е. гомозиготности аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития). Существенное повышение только флуоресценции, связанной с красителем FAM, свидетельствует о гомозиготности аллеля Y (т.е. гомозиготности аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития). Если существенно повышается уровень обоих флуоресцентных сигналов, то растение является гетерозиготным (т.е. представляет собой однолетнее растение, гетерозиготное по ло-кусу В).
На фиг. 9 представлены результаты анализа аллельной дискриминации набора однолетних и двулетних индивидуальных растений.
В этом анализе можно применять также следующие нуклеотидные последовательности с получением аналогичных результатов (т.е. позволяющие осуществлять дискриминацию однолетних и двулетних индивидуальных растений):
lr22(Tl)-F: 5'-GATAAATTCTGACCCGCАТСАСА-3' (SEQ ID NO:
55) , lr22(Tl)-R: 5'-GGACTGAGTTGATAATAATCААСТТТСС-3' (SEQ ID NO:
56) , lr22(Tl)-VIC: 5'-VIC-CTAGCGCAATTTC-MGB-NFQ-3' (SEQ ID NO: 57) и
lr22(Tl)-FAM: 5'-FAM-AGCTAGCGCCCAATT-MGB-NFQ-3' (SEQ ID NO: 58).
Пример 2. Валидация трансгенов BvPRR7 с помощью изучения комплементарности.
Однолетний фенотип растения, обусловленный геном B, проявляется в виде одиночного доминантного признака; таким образом, требование к яровизации у двулетних растений является рецессивным. Таким образом, можно предсказать, что трансформация ассоциированного с однолетним типом развития аллеля BvPRR7 в характерный для двулетнего типа развития генотип должна придавать характерный для однолетнего типа развития признак цветения характерному для двулетнего типа развития генотипу-акцептору. Таким образом, нет необходимости проводить яровизацию трансгенных растений для индукции стрелкования, поскольку трансформированный ассоциированный с признаком однолетности аллель BvPRR7, по-видимому, аннулирует необходимость в яровизации, ассоциированной с признаком однолетности. Для подтверждения этой гипотезы кодирующей последовательностью ассоциированного с однолетним типом развития аллеля BvPRR7 под контролем ассоциированного с однолетним типом развития промотора и фрагмента терминатора трансформировали характерный для двулетнего типа развития генотип G018. Плазмидная карта бинарного вектора, несущего генные кассеты как для гена селектируемого маркера PMI, так и для ассоциированного с однолетним типом развития аллеля BvPRR7, показана на фиг. 10. Экспериментальная процедура, применяемая для трансформации сахарной свеклы, соответствует в целом описанной у Chang и др., 2002, для которой используют меристему сахарной свеклы в качестве материала эксплантата и ген фосфоманнозоизомеразы (PMI) в качестве селектируемого маркера. В SEQ ID NO: 53 представлена нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля PRR7, ассоциированного с однолетним типом развития (нуклеотиды 1306-3672 SEQ ID NO: 49), расположенная по ходу транскрипции относительно ее промоторной области длиной примерно 1,3 т.п.н. (нуклеотиды 11305 SEQ ID NO: 49). Трансгенные проростки отбирали по признаку PMI-активности (Joersbo и др.) и затем укореняли, высаживали в горшки и переносили в теплицу. В качестве отрицательных контролей применяли проростки нетрансгенных как однолетних, так и двулетних растений сахарной свеклы, которые подвергали такой же процедуре регенерации in vitro, но без заражения Agrobacterium и селекции с использованием маннозы. Растения выращивали в вегетационных камерах при постоянной температуре 18°C и фотопериоде 17 ч света и 7 ч темноты.
В этих условиях (без индукции стрелкования с помощью низких температур) ни у одного из не-трансгенных двухлетних контрольных растений не проявлялись какие-либо признаки стрелкования в течение периода наблюдения, составляющего вплоть до 12 недель, в то время как однолетние контрольные растения в норме начинали выбрасывать стрелку через 6-8 недель. В отличие от нетрансгенных двулетних контрольных растений у основного большинства трансгенов стрелкование начиналось через 4-10 недель, и они обладали основным признаком, характерным для однолетних растений, несмотря на соответствующий двулетним растениям генетический фон. Трансгенные растения, у которых происходило стрелкование и цветение, подвергали перекрестному опылению двулетней поддерживающей линией с получением потомства. У растений-потомков оценивали активность PMI и затем их оценивали в отношении стрелкования и цветения без яровизации. Для растений-потомков характерны коэффициент сер-грегации 1:1 и прямая корреляция между PMI-активностью и признаком однолетности. Эти данные подтвердили причинную связь между BvPRR7 и независимым от яровизации цветением у сахарной свеклы.
Пример 3. Трансгенная супрессия BvPRR7 обусловливает устойчивость к стрелкованию.
Поскольку BvPRR7 играет решающую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, то BvPRR7 является очевидным кандидатом для создания устойчивости к стрелкованию путем подавления яровизационного ответа. Для этой цели кДНК-фрагмент BvPRR7 размером 0,6 т.п.н. (SEQ ID NO: 1) помещали в кассету для PHKi под контроль конститутивного промотора Ubi3 Arabidopsis (Norris и др., 1993). Инвертированный повтор BvPRR7-фрагмента отделяли вторым интроном от гена StLS1 картофеля (Eckes и др., 1986; Vancanneyt и др., 1990) для стабилизации PHKi-кассеты, но также для повышения эффективности процесса PHKi (Wang и Waterhouse, 2001; Smith и др., 2000). Плазмидная карта бинарного вектора, несущего генную кассету для PHKi, предназначенную для BvPRR7, и селектируемый маркерный ген PMI, представлена на фиг. 10. PHKi-кассетой трансформировали двулетний генотип G018 и осуществляли отбор позитивных по PMI проростков согласно методу, описанному в предыдущем примере. PMI-позитивные проростки и нетрансгенные контрольные проростки укореняли и переносили в теплицу для акклиматизации в течение минимум двух недель при 18°C до их обработки с целью яровизации. Согласно принятым методам трансгенные растения подвергали обработке с целью яровизации, которая предусматривает выдерживание в течение 14 дней при постоянной температуре 6°C и 12-часовой низкой искусственной освещенности. Перед воздействием индуцирующих стрелкование условий яровизированные растения медленно акклиматизировали в течение двух недель в климатических камерах путем ступенчатого повышения температуры с 10 до 18°C. Затем растения пересаживали в более крупные горшки (2 л) и осуществляли мониторинг стрелкования, выдерживая их при постоянной температуре 18°C и фотопериоде с длинным световым днем (17 ч света/7 ч темноты). У нетрансгенных контрольных растений, как правило, стрелкование начиналось в период между 4-6 неделями после яровизации. У трансгенных растений с подавленным геном BvPRR7 часто наблюдалось замедление стрелкования на период, составляющий от всего лишь двух недель и вплоть до более чем 2 месяцев. В некоторых случаях в условиях, существующих в теплице, стрелкование вообще не происходило. За исключением замедления стрелкова
ния и цветения трансгенные растения развивались нормально и не имели фенотипических аномалий. В целом, для растений с замедленным стрелкованием характерно большее количество листьев в момент стрелкования в результате пролонгированной вегетативной стадии.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Зингента Партисипейшнс АГ
<12 0> Трансгенные растения сахарной свеклы <130> 71918 PCT2
<150> PCT/EP2008/056390 <151> 2008-05-28
<160> 58
<17 0> PatentIn, версия 3.3
<210> 1
<211> 840 <212> ДНК <213> Beta vulgaris
<400> 1
gctcctgtca ttatgatgtc atctcatgat tcgatgggtt tagtcttaaa gtgcttatcc 60
aagggcgctg ttgactttct ggtgaagcct ataagaaaaa acgaacttaa aaacctttgg 120
cagcatgttt ggaggaggtg tcacagttct agtggtagtg gaagtgaaag ctgtgtaagg 180
aatggaaaat ccataggaag caagagggct gaagagtcgg acaatgacac tgacatcaat 240
gaggaagatg ataacagaag cattggttta caagctcggg atggaagtga caatggaagt 300
gggacccaga gttcatggac aaaaagggct gcagaagttg agagccccca accacagtct 360
acatgggagc aagcaactga tccacctgat agcacttgtg ctcaggtcat ttatccaatg 420
tctgaggcat ttgccagcag ctggatgcct ggatccatgc aggaacttga tggacaggat 480
catcaatatg acaatgtccc aatgggaaag gatttggaga ttggagtacc tagaatttca 540
gattcacggc taaatggacc aaacaaaacg gttaagttag caactactgc tgaggaaaac 600
caatattcac agttagacct caaccaggaa aatgatggtc gaagttttga tgaagagaac 660
ctggagatga ataatgataa acctaaaagt gagtggatta aacaggctat gaactcacca 720
ggaaaagttg aagaacatcg tagaggaaat aaagtatctg atgcaccacc cgaaatttca 780
aaataaagga caaaggcatg caacatgtcg aggatatgcc ttctcttgtg ctcagtctga 840
<210> 2
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер PRR7-F
<400> 2
atgtcatctc atgattcgat ggg 23
<210> 3
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер PRR7-R
<400> 3
tcagccctct tgcttcctat g 21
<210> 4
<211> 493
<212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 4
atgtcatctc atgattcgat gggtttagtc ttaaagtgct tatccaaggg cgctgttgac 60
tttctggtga agcctataag aaaaaatgaa cttaaaaacc tttggcagca tgtttggagg 120
aggtgtcaca gtgtaagtgt ctttacattt tccagctttt catcagctta gtggttcgtg 180
tagcagtctt tcagattttc gaactttcta gcacatatga caaattaaac ctgcatgcta 240
attcccgatt agataatgga ataagctctt tcagctggtc ttttacttct ttctcttctc 300
ctcttatgaa aaactggtat gccactatgc atcttgttcc aggtgtttgt ttagtgtttc 360
tttcctttat tcgttttttt gtttttattt ttaattttaa ttttaatttt tcctcattct 420 ttttttagtc tagtggtagt ggaagtgaaa gctgtgtaag gaatggaaaa tccataggaa 480 gcaagagggc tga 493
<210> 5 <211> 493 <212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 5
atgtcatctc atgattcgat gggtttagtc ttaaagtgct tatccaaggg cgctgttgac 60
tttctggtga agcctataag aaaaaatgaa cttaaaaacc tttggcagca tgtttggagg 120
aggtgtcaca gtgtaagtgt ctttacattt tccagctttt catcagctta gtggttcgtg 180
tagcagtctt tcaaattttc gaactttcta gcacatatga caaattaaac ctgcatgcta 240
attcccgatt agataatgga ataagctctt tcagctggtc ttttacttct ttctcttctc 300
ctcttatgaa aaactggtat gccactatgc atcttgttcc aggtgtttgt ttagtgtttc 360
tttcctttat tcgttttttt gtttttattt ttaattttaa ttttagtttt tcctcattct 420
ttttttagtc tagtggtagt ggaagtgaaa gctgtgtaag gaatggaaaa tccataggaa 480
gcaagagggc tga 493
<210> 6 <211> 493 <212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 6
atgtcatctc atgattcgat gggtttagtc ttaaagtgct tatccaaggg cgctgttgac 60
tttctggtga agcctataag aaaaaaygaa cttaaaaacc tttggcagca tgtttggagg 120
aggtgtcaca gtgtaagtgt ctttacattt tccagcttty catcagctta gtggttcgtg 180
tagcagtctt tcarattttc gaactttcta gcacatatga caaattaaac ctgcatgcta 240
attcccgatt agataatgga ataagctctt tcagctggtc ttttacttct ttctcttctc 300
ctcttatgaa aaactggtat gccactatgc atcttgttcc aggtgtttgt ttagtgtttc 360
tttcctttat tcgttttttt gtttttattt ttaattttaa ttttartttt tcctcattct 420
ttttttagtc tagtggtagt ggaagtgaaa gctgtgtaag gaatggaaaa tccataggaa 480
gcaagagggc tga 493
<210> 7 <211> 15037 <212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 7
attattgtac atayawgacy atttacgtaa ctaaattaaa aaaagtttta aaaatgcaaa 60
acagaaaata aaatcaaata tcgacatttg gaaatttata atagaaatga ataaaaataa 120
gggagaaata aatgaagaac aaaataaatg agaaagagaa ttaaaatggt tcttgaaaaa 180
taaatgagag agaaaaggag ggaatgagtg agtgatgaga gagaaagagc tggcccactt 240
tcaaaaattc tgccaaaagc ctgccaaatt ttggccctcc taaaagcatc aaaactacgt 300
agttttggcc aaggtgtagg atgctcatcc tacacctccg tgcaggatct aaattgcgct 360
tagaaatagg gtctcctaat atttctctac tagcattttt tgcacgcgat gcgtgcttga 420
atttttttca agatagaaac tcgatttttt tcgacgtatg taaaagtcaa aatttaaaca 480
ttagacatac aaagtataat tgtttttagt tacaaaattt aattggttta gtctctgtaa 540
cttgagtttc tcaccagtct tttttttttt tttttttttt tttactttca aagttaaatt 600
ctatgaacaa aatagaaatt ttattgaatt tatctatgat ttctaatatt actccctccg 660
acccaaaata tagttcccat ttcccttttt tcacggtaat ttatgcaaat agaatataag 720
agggatagta aagatttttt gtttatttaa ataaatgttg tatgggaaaa gatgatttta 780
ggagagaaag tagagaataa ttggtgaaag agtattaatt gtaacatttt ggttgaataa 840
acaaaggaaa aaacaaaatt caagaagcaa ataaatgaga attgtttcct tgaataatgc 900
aaaagtgggt tttaattccc aaaatatgcc caaaaataaa aaaattccct gtgtaccgtc 960
cacgtaagac ggcacgcgag attttttttt cctacttcaa tacaaccgct acttaaagta 1020
gcggtttact gatttttttt tttatctact taggtaaaac cttggcgctg agtgatataa 1080
ctcgctactt caagtagcga tttactgaaa tccccaactc catagtttga tatgtgcttg 1140
caacattttg cccaggtaaa ccgctactca gggtagcggt ttatgtgtat aaaccgctac 1200
ttaaagtagc ggtttatttt aatataaacc actattgtga gtagcggttt acgtgggcaa 1260
aaacaaaaaa aaaaatagtt tctcgcgtgt cgtcctacgt ggacggtacg cagggaattt 1320
tttaattttt gggcatattt tgggaactaa aacccacttt tgcattattc aaggaaaaaa 1380
ttcaaataaa tgatgggaca cggtttttct agacaaatta cgaaaaaatg tggaactaaa 1440
tatgaaaatg gaaactatat tttgggacac ccaaaatgga aatgggaatt atattttggg 1500
acggagggag tataattttt tagttgattt ttgaattaag tatactactt catatattgt 1560
taagaaactg gacacttgga tttcaagtca aatttttgtg agtatgtatt gacgttgtag 1620
tgtattggtt gtagtttgta agttaatttt tgtttttgta aagtttactc atttgagtga 1680
tttgtataat gtaaattatg caattctatg attttagttg acttgtgagt gattgttata 1740
attttatttc cattattttt atttgaatct ccctttggtt tgtatgtgaa tttgtaattt 1800
agaaaggcaa aggggtaaaa tagtctcttc attcgggaac accatagttc ccctccttcc 1860
cttatataat aaagatgatg atgatttttg ataataatga tttgtaagtg aattatgtga 1920
atgtttttgt atgtattgac gtcctagtat attagtttta gtttgtaagt taattttttt 1980
gtttttgtaa agtttcccga tcatttgagt gattttcgtg attttttgtg attttctcaa 2040
ttctatgagt gatttgtaaa gtttcttgat ataagtgatt tctgagtggt gttgaattaa 2100
tttccggtgg ctttgttaga accccatttt agtattgaca tttcttttgt aatttagaaa 2160
gggaaagggg ggtaaaatag gcatttcaaa aaaggacacc attgctcccc ccttccctta 2220
tgtaattgag atatcttaaa agaataccga gagttttttc ccataaagga gtattttttt 2280
taaaattttt tccataaagg agtatttatt agtaccaagt tgatttccca aatcattatc 2340
cttgcgcaaa ttgcataatg gagatatttg gtgttgacgt gtgaatatgg ggccataata 2400
ataggaggtc aaaaacaaaa ctacaagggt taaaatcgtc acaatattaa acaagcatct 2460
cacattctca ctggtcactt ttttttaacc tattaaaaga acaaaccttt aactctcctc 2520
acaatctgac acgtgtcgaa tattgattta ctgagatcaa tttagatcct ctcccttaga 2580
ctcttctgtc ttctcagtac agctttagat ctcaacctcc atgtcagcaa agttacctta 2640
cgtgtcatcc tacgtggcct ctccttctac ccctcactcc tccacgtcaa cattttcctc 2700
caaaattaaa aaatcatttt tttattatat ttacttgaat gtatataata atgtctactg 2760
atcttcttct ttagaactat ctccttctct cattggaacc tcaaaatcat tcttatttta 2820
tttcgagaaa aggaaaaaaa agcacatctt ttttgaagat taatttgtgg attattattg 2880
agcttcatcg tattaaaaaa catagtaaaa gttctttcct catttgtctt tttattcatc 2940
taattttttt tagtgaagaa ccctaatttt gtttgtgaat tctcaagttc aagttttgat 3000
ttgggtattt tttttgatga aatttgtgca gctgtaggat gttatcgtgc tgagaaaagg 3060
gttttagatg gtaagttttt ttttctttga tttctctctc ctactttttt ttttgttttg 3120
ctttagataa tactgtcatg atatgatata aagaattggt gatttgggta gtttatttaa 3180
cctatgatta tgtgttattt gttttgatct ttcaatttat ctggtgctgt gtgtatatat 3240
gttttgtttt tcttcaagta tttggttatt attgaagtgg gtaattagga atttgctact 3300
aatctatgga tttgggttct gttgtgatta atttactata gatttgaggt ttaatttatg 3360
ttttataggt tagaaaagga aatcaatgat ttgtttgtgg atttgagtag attgtttgtt 3420
agtgtgtgta tgatgatatt aacttccatt attcttcccc aaattagggg taattgatgg 3480
ttttttgcat accgaaggcg tattctcttt gatgatggag tgattgttga aaagacatga 3540
tgggttaaag ttgcaggatt atttcatttc aataaacata attgatcaat ttggatctgt 3600
tgaatgaggt tgattcacaa aaatgaagat gggcccggtg ttgccaagtc ggtggcagag 3660
cttaatcaac atatagttgc tgtgaaaaaa gaaggtaggg gtagggttgc aggtgaaggg 3720
caggggcttt ccgaggagga cgaactgaga attattgagg atggtgaaga tgcaaacagc 3780
aggcgttctt tgagttctgt tcagcttcca gttcatactc acaggcatca gccacaagta 3840
caaccccagg ggagagtctg ttgggagagg tttctccctg ttggatctcc taaggttttg 3900
ctcgtagaaa gtgatgactc aactcgtcat attgttagtg ctttgctacg gaaatgtagc 3960
tatgaaggtg atttgatctg ttttaatccc atatatgcaa tgtcttgtcc ttatcaccta 4020
cttcaacaaa tgattaagag aattgtactc cctcgttcca aaataatagc aacacttagc 4080
cttcccgtag actttaggga gcgtttggtt catattatgg tatgggtttg gaattaggaa 4140
tgaaaccaag gtggtatggg gttggaactt gatacttaat accttgtatt tggtttcatt 4200
taggaatgaa aaaatttctt ttatttgata cctagaggta aggtatgagc catacccacc 4260
tccccccatg ggtttctaaa ccccatacct tatgggtttg aggtatgggt ttaaaattta 4320
aaaataagtt aaacaaacac taggtatgtg ttttgttcat tccaaaccca tacctcatac 4380
ctaaaactag tgaaccaaac acccccttaa ggatcttggg acaaagggaa tccattacta 4440
gatctggtga cattaatacc taagtttaca tcagtttcac ttaaatcctt cgttttaaaa 4500
aaagtaaaaa aacctgttag tctgagtaag tttactaatt tttgttctaa aattcaacac 4560
attatctaca tgcaagcact tactagtaca atacaactca aacaatatat gcatcctatc 4620
tgttcacaat gaaccgaaaa ctaatctttt catacccttg tttgatgctt ttttcaggcc 4680
atacaaattt ctttaaccta aattgcctcc tcagtcactg ttcaaaattg cagttttaac 4740
atcctcaaga ccatgtgatg tactgttaga ttatattaag accctattgt aaataaagca 4800
tgtatagtgg aataaaatgc atgtcttcct actttttttt gggggtcatg aactcattgt 4860
ttgatatttt gcagttgtag gggtgccaaa tggcatagaa gcatggaaaa tcttagaaga 4920
tttgagcaat cagattgacc tagttttaac tgaggtagtc acatcaggac tctctggtat 4980
aggtcttctg tccaagataa tgagtcacaa aagctgccag aatactcctg tcattagtga 5040
gctttcgttc cttgttgtat tagtgtatgt tctgtatttg attttctttc tttgtgcata 5100
tcttgccttg ttttttacaa ttatttagat tttagatgaa aatgtatact cattttatgg 5160
tctttagctg caacatttga ttattttgtg tgcagtgatg tcatctcatg attcgatggg 5220
tttagtctta aagtgcttat ccaagggcgc tgttgacttt ctggtgaagc ctataagaaa 5280
aaacgaactt aaaaaccttt ggcagcatgt ttggaggagg tgtcacagtg taagtgtctt 5340
tacattttcc agctttccat cagcttagtg gttcgtgtag cagtctttca aattttcgaa 5400
ctttctagca catatgacaa attaaacctg catgctaatt cccgattaga taatggaata 5460
agctctttca gctggtcttt tacttctttc tcttctcctc ttatgaaaaa ctggtatgcc 5520
actatgcatc ttgttccagg tgtttgttta gtgtttcttt cctttattcg tttttttgtt 5580
tttattttta attttaattt taatttttcc tcattctttt tttagtctag tggtagtgga 5640
agtgaaagct gtgtaaggaa tggaaaatcc ataggaagca agagggctga agagtcggac 5700
aatgacactg acatcaatga ggaagatgat aacagaagca ttggtttaca agctcgggat 5760
ggaagtgaca atggaagtgg gacccaggta gtgctaaccc ctgtaatatt aaacttccta 5820
tagtaggtgt ggttaatgtg acgctgttaa ggccttttgg gtggttgctt ctagttcact 5880
aaggataata agaaatagct cgctattgat agttagggca cctcaatatc acctcctctt 5940
gtatgtttgt tgaactacat ttttagccag acttgagtat tttatcctga aggatagaac 6000
aggtgcattt ttggttgcgg ttgttagttg ttactgttat gcaaagacta ttgccaccat 6060
tttctcacac atatttaaca tggaagtgtc ctaaccaccc cccaacccaa aaaatgggag 612 0
ggagaaatta ctggagatgg gaaagaagtt acataaaaag ttagtcgttt gggtcatgat 6180
tgtttgttgt atttgcaaag ttagcgcgtt ctcttcctgg atgcttcaaa ataagctgat 6240
gcaccataaa gtaccactct tggcttcacc tgttggtgtg gacccaacca atgtaccctt 6300
gttgatctcg agatagacaa agaggaagtt taatttctct ttatatgtta tctctcttca 6360
atttgttagc agctatgtct ctttcgtgga catttagaac ccatgttagg ttcatattta 6420
tagttaggtg attgtatcaa aattgccatc acaataaaca gaacattaat ttctattggg 6480
aaggattcaa ggatcaaata tacaggaaag agcagtgtag gagatatcat cttgttgaac 6540
aacaaaagaa acattaacat caactggtga taatctttgc aagattggat gacaaaatga 6600
ggagtcgatc taatataaaa caaattggga actgtcagct atatcctgca tatcaagaat 6660
ggagaccttt aagaaaagta agaccatttt ttgttgggaa gtcaagccat tgtcccagtt 6720
tccttgtgaa atttagttca tcttagcttt cttctaccaa catgaattct ctttcctttc 6780
agcccttgca aacttggttt tatgctaatt atcagtgttt ccttcattta gtacgctgag 6840
agggtttatt tggttgatca aagaatactt gatgaccttg aggtagatgc tctacatgga 6900
gaagttcctc taagtgtaca aagaatctag ttcgaccaac tttgatttag gaagagataa 6960
cacgatcacc tcgtggtcta gactctggag aggtcaaagt gtgcaaaagg gtatttttga 7020
aagacaatgg cttgttgatt catgactgaa attggatggt cgtgactgag catatactat 7080
tagtggttct cttctaaggt gatataagta tgtgataacc caatcctgta tatttcttcg 7140
aggacatcaa ttgtgctact attctagggt gctggagacc catacatata gagccattga 7200
caattaacac aaacttcaac cacttatttt tatttcattt aagctatcaa tccctaagaa 7260
agagcccatc caagctcctg ctttaggtgc atcccctccc ttttcagcta gtgcacaaaa 7320
aatgaacttt cgagatagac tgctaaattt gctttgtcaa gaagacaaaa ttttgataca 7380
caactgtaat tgcattttat gacacttacg ctgatatatc tgcaagtgaa gttgatatgc 7440
aaaaactatg tagcctcctt cgtctacggt aatagatctc cgtcaatgtg atgcttgtgt 7500
gccatcataa aatgatattg ggtctttaga ctctgttact ctacagctga aggatcttag 7560
ccttggcatt tatatccttt ttatccaaaa gttaaaaaaa gcggaccgtt tgacccatgt 7620
aaggaaaaag gaaaggaatc gagaaagaca aaggagggga aagaagttaa atctcctaaa 7680
aagcttgttt tgtgcggtga gagagggagc gacttgaaat tgccattgat gatgattggt 7740
tcacaattgt aatcgaaatc aaactcactc tctctctctc tctctctctt atcacccccc 7800
tcaaactata acatcacagt cctttaaacg tgactgtttc gggggatagt gactggtagg 7860
gatgggcaag ggtcgggtct ggctggaccc tagacccgga ccctaatttt tttttgtaga 7920
cccaaacccg gaccctaagg gtctgaaaaa attggacctt gacccagacc cttagggtct 7980
gaagggtcta gagggtcagg agggtccagg cttaaatttt ttattttgcc aaatttttag 8040
cattattaat atcaataatc atttgaaatt cgcatgaaac aaacacaaaa aaaaatcgca 8100
tgaatcaaac acaaaaattc gcatgaaaca aacactaaca tataaattga aaaaaacgaa 8160
acaaacacaa acttataaac gaaaaaaatt gaaacaaaca caattccaaa catataaact 8220
gaaaaaaaaa acgaaacaaa cacaaatata caaactgaaa aaaagaagaa acaaacacaa 8280
cttacataag agttcagaat gggtgttata gtttatgttt tagtcattta gaaaatcaat 8340
ttgttttttt tttaaagtta aaatgtatat attaaataag tttagggtct aaggtgttgg 8400
aacatttata gggtaatggg tttgaaactc atatgggtat gtactagaag aggaggaggt 8460
ctagtatgca aaaggttaga gtgcatcaag tggtaacaac gcgcattgtt ataccaatgt 8520
cgcgagtcgc gacaggcgtc gcgggtcgcg accagcgcct cgcgagcttc ttcgcatgtc 8580
gcgacgcgtc ttctgccttg gaatgcgaaa aaatgcctcg gcggttttat atccgttgtg 8640
atgctttgtt gatcatttta atgactttta aggtctttta atcagtagat taaaggcctt 8700
tgatgagtga ttaagatggg ggttatgtga ttaacctctc tagtcaatga aatgttgatt 8760
atgcttatat aacctttgga ttcctatgag tgaggagtta gaagaaaatc agaattttct 8820
atactctctc aaaagtcttc ttgcttagct taagagaaac cttgcaatct tctcttgagt 8880
gttcttcaca aacacaaaac acaagttctt gttgattcac ttagaagatc atctaagtgg 8940
attgtttctc tccattgtat ctcattagtt atttcgtgtt aacccggtga tcctagaggg 9000
gcgaaattaa actaattgga aagcgtagtt tccgtgcctt ggagtgggat atccggttct 9060
ctcattgatc acaagcctaa cataagggtc gggtctgggt ccaaatttta agacccggac 9120
ccggacccta aaaaattcac ttggacccag acccggaccc ggactcttag ggtctgaaaa 9180
agttggaccc aaacccttaa attagggtcg ggtccaacag ggtccgggta gggtcttgga 9240
cccatgccca tccctagtga ttgggtagcc cattgcagaa tattgagaac gcaatataaa 9300
ggggtgttga gaaagagggt tttgagtgta ttgtttaaga aagttgggaa aggaatgaga 9360
gatgaagtac agaagaaaac gtctagaaag tgaagcatgg gagtctgttt cttttctttt 9420
tcctaaagtt tcccaccaaa tgtcccttaa gtggttcagc cacgcctttg gacaagctta 9480
ccaccaagct ccccatccca gatcatattt gaatcaaaca tctttctttt tttagaatat 9540
tctttttttg tgcatgaaag ccaattccat gagatatgta ccttatattt ctctaaaata 9600
tataaataat tgatgaagca attttcagat cattagataa gcgttctaca aaagaaccat 9660
ctttttttgc ttccttgtgt acttggaaaa tgtagttccc atatataatt ttaccatggc 9720
agtacttcta tagaccacta agttcttcgc ttgtgcaacc tatagtgcat ttaagagggt 9780
ttaggtatag acagccttca ctttcaattg gttagagtct acctccagta tcactgacag 9840
aattttcaat aggaacttct gtcataactt aattcgcaga aagcactaac taaacaaccc 9900
cttagttctt tagttaagcg cttgattggt cacatccagc ttttagtttt tagtatggag 9960
atttataaag tagtatgact tgagttgaat agtgaacgta agattagaca tatttatata 10020
gtcgtgttaa ttttggaaac tgacaggagt gactagaaac cacttttttt gtgtccaaaa 10080
tttccatata ttgtttttta aaaaaactgc taaatcacga tgataacaaa caaaccttac 10140
acaggtaccg gaatgatatt gaaacaaatt gaggttagtg ataagccata atcccttacc 10200
ttgaaattca gaggctgtct gctgcagtct ctatcatctt cttatttcac taaatcaatt 10260
attacctgct tcaacctcaa cggtccgagg cttagacatt gtgtctttga tagtatcatc 10320
acagctgaaa attaatgtgt actttcttct atttaaatac catttgagag tgcctttggt 10380
agtcattatg aatgtcgtga gatcacaatc cgtgaaatat agttttcatc acattcttac 10440
ctgcatgtgt aaggaaaagt atagcgttag tgttcaatct tttgctactt ctggtgactg 10500
gtcaatggtc aaagtatgca gcatgatttt gtgtttgtca gtttcttctt taaataagtg 10560
tgaactgctc tagtctaagt tgctcgaact cttaaaaagt gttggacttg ttagttgtta 10620
catgtataca atgttgattg ggtgggcttt tccatatatt attatatttg ttgaatcaca 10680
atgaagtacc tatttccatt tgaggagtag gtatgatgag gttagtaggg agtttgagtg 10740
ttaaaggtta tgtgaagatg taaaaattca ctgacaatga gaccttagta tccgacggtc 10800
ggaattttac caattttatt gccttgttac ctttctattt ttacttagta tttccttttc 10860
ataaattttt gtgatctaga gttcatggac aaaaagggct gcagaagttg agagccccca 10920
accacagtct acatgggagc aagcaactga tccacctgat agcacttgtg ctcaggtcat 10980
ttatccaatg tctgaggcat ttgccagcag ctggatgcct ggatccatgc aggaacttga 11040
tggacaggat catcaatatg gtatgtggta ctgtatttga tagaagttac aataatgtgt 11100
aaactgaaac cacttaatga cctagtatcc atctgtatca gacaatgtcc caatgggaaa 11160
ggatttggag attggagtac ctagaatttc agattcacgg ctaaatggac caaacaaaac 11220
ggttaagtta gcaactactg ctgaggaaaa ccaatattca cagttagacc tcaaccagga 11280
aaatgatggt cgaagttttg atgaagagaa cctggagatg aataatgata aacctaaaag 11340
tgagtggatt aaacaggcta tgaactcacc aggaaaagtt gaagaacatc gtagaggaaa 11400
taaagtatct gatgcaccac ccgaaatttc caaaataaag gacaaaggca tgcaacatgt 11460
cgaggatatg ccttctcttg tgctcagtct gaagaggttg ggtgatattg cagacacgag 11520
cactaatgtc tcagaccaga atattgttgg gcgttcagag ctttcagcct tcaccaggta 11580
tgctagagaa ggtgaaactt gaatttatat aatggacaag tggacaatat ctcattttta 11640
aattgttgca ggtacaattc aggcacaact ggtaaccagg gtcaaacagg taatgttggc 11700
agttgctctc caccaaataa tagttcagaa gcagcaaagc agtcccattt tgatgctcca 11760
catcaaattt cgaatagcag tagtaacaat aacaatatgg gctctactac taataagttc 11820
ttcaaaaagc ctgctatgga cattgataag acacctgcaa aatcaacagt caactgttct 11880
catcattcac atgtgtttga gccagtgcaa agttcccata tgtctaataa taaccttact 11940
gcatctggta agcctggtgt tggctccgta aatggtatgc tgcaagaaaa cgtaccagta 12000
aatgctgttc tgccgcaaga aaataacgtg gatcagcagc tcaagattca gcaccaccat 12060
cactaccatc attacgatgt ccatagtgta cagcagctac caaaggtttc tgttcaacat 12120
aatatgccca aaagcaagga tgtgacagca cccccacagt gtgggtcttc aaacacttgt 12180
agatcgccaa ttgaagcaaa tgttgccaat tgcagtttga atggaagtgg tagtggaagc 12240
aatcatggga gcaatttcct taatggaagt agtgctgctg tgaatgttga aggaacaaac 12300
atggtcaatg atagtgggat agctgcaaaa gatggtgctg aaaatggaag tggtagtgga 12360
agtggaagtg gtagtggtag tggtgttggt gtggatcaaa gtcgatcagc tcaacgagaa 12420
gctgccttga ataaattccg tctcaagcgt aaagaaagat gctttgacaa aaaggtaata 12480
ctccaaattc tctccagaat gtttatactt ggacatctag tatgtacatc cttgaatcta 12540
aactgtaaaa gctgaatttc agaataaaaa acacaaatta tatcaagtat gaaggcagag 12600
tattgtagta attatagttt ttctggtatg gaattagtac ttacatttac cagaagcctg 12660
ctgtcacaag ccataatttg atcatcaagc aacaataatt tggccatttc ttgcttgtat 12720
tgaaagtgag atgacttcaa acttatttgt gtatcatcac atcaggtgcg atatcaaagc 12780
agaaagaagt tagcagatca aagacctcgt gttcgtgggc aattcgtgcg ccaggtacga 12840
gaaaacaaag gaaggaatac cgatagctaa caccaattct ttccacaagt tgctgccaag 12900
atcatttatg ccactctgat gtcagctgtc ttcatatgta caaatttcga attttatgtg 12960
tgcatgaggt gctaaatact gtcaaacctc agtgattctg tttggtttag gctgtagaaa 13020
gacatctttt cctttgtgtt ttcatggttc ttattttgag ctgtgttcac tactttttat 13080
aacatggtag cccctggttg cctttggaaa taagcttttc cttaaaggtg tgatgcatat 13140
aatcttgttt ggtgttagat tatatgatca tttcttcagg cgtttacggg tcacattttc 13200
cggaatcctt tcaaacgcga ttccggaaac aatggctcat attttctttt ggtttcaagg 13260
agaaggctat ttaaaacaga aaagatttag gttacagaaa tcagtgatga agcaatgagt 13320
ttcattatag aataggtaga agtagggggt gttttttccg tactcttgag atagaaagtg 13380
gggatagatt ctttggactc gtcagaaagg aataatatag ttgtctacct ttttcatttt 13440
tagttcttgt aggagtttta ttccacttcc atttttgtaa aatttaggag ttgtaaggac 13500
gtgtaaagag aatctgccat ccagatttta accgacggta aatttgttct tttcatgttt 13560
tctcaagtaa ctataatgtt ttcatcgaat ctatagggat tttctaatgt gtacctgata 13620
gaggcacaca gtaacaataa tataagtaca tatattcttt aagaataatg acatagtaat 13680
tatattttta atacaaataa aagatgtcct tatgtaatga aacaaataac ttttccttga 13740
aggtatgcca taattaatta ctttattttg aagatatttt atatttagtt tgggtagtgg 13800
aactactaaa taaaaatatg gttatagtaa catgtactca tgtgcgaacc gaaaaaaacc 13860
ctatgctttc tctaaaagtt cccaaaccct tgagcttata gccccgacgg cccagcgcag 13920
gcttgctgga gcgccgcgtc gctcaccctg tcgccgacga gcctgcatgt cgtatcgttc 13980
ggtcttctga aggtttagtt ttccctgttc ctctttgtgt tattcatcgt tcccatcccc 14040
catgtctccc cttcccctgt cagtggttgt cggcctcccc ttcccctatt aatggttgtc 14100
ggcctcccct tccctttccc ctaatagtgg ttgttggtct ccccttcccc tttcatgttg 14160
tcaagttgtt cctttccccg ttctcccttt tcctagtcct cttttggtgt tcttgttgtt 14220
gttagtttag tggctttggt tggttagttc ggctgagtgc ttcgtcgtcg tatgcccttc 14280
cttgttcccc tatttggttt tggttatgtt ggggtttcgg ttaaccccgt tcccatgctt 14340
aaacgtggga gggcctcagg atttagatat aaaggtcatc attctcgcgc ttagacgtga 14400
gagggattaa gtgttcaggg ataagggctc cgttcctgcg cttaaacgtg ggagaactta 14460
aaggttctag gttttacagg agttttggga ttggaaagta tatgaactct gtttggcaga 14520
agatgacagt gcaatgtggg gattaatcat ttcgttttct tcctttttaa taagttagtc 14580
tcttattatg agagttttct attagttcta atccccttaa tttcttgtag gggttgtaag 14640
tctagtttgt cgttgtttag tatatctagt tcgagaagct cgaaagtttg aggttgtgga 14700
aaaatgtact tactggttgc agatcaagaa tattaagacg aatgtttgac ttcaatttac 14760
tattgcatca ggtaggaaat atggtgagtc atcgaatatc cattatggtt ggaatagtac 14820
catatcatgg aagcggtttc gaagcgtgta tattagtaaa atagatgaag atattcaaat 14880
cgatgtttta gattatcttt tatgtacgta agggtcatta ttgttgtaga tgttgtatgg 14940
ttttttaatt taatgataat ttttccttat tcccacttaa aagtaaacaa tgcattcatg 15000
tgcacatatt agtacatata tttgtatata catctcg 15037
<210> 8
<211> 24128
<212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 8
maaacgttgt gatcatctaa tattattgaa tatattatct ccataactta tcctaatatt 60
atttagttta ttacacttga tcgaggacaa aatccttcaa tctcccactt gtctaagaac 120
aagtgtgtaa ccttcaaact ccttaagtcg cttaatgtct aacttgatga catgataaca 180
tcatatgttc atcataacaa tattcaagtc gttccttgaa atctgagttt gaactgtcga 240
aacaaatgat taacttctta atccatttga gcacggccat gcattttcag ttctcactct 300
tcaagaggcc aagacaccaa tcctaactct taggaggact tatccaatct tgtatgacca 360
aagctcccac tcaattcata gcagttccaa tcgctgcttt tataacctcc ttttacggca 420
cggcgttttg cagcgtcaag aacatactaa tccttaagta agaacagttt catactcatg 480
tcaaaggaat ccactaaata tattaataag agtctcataa accttttaga gaactcccac 540
taggtctgcc cagcgtgtat caactataca agcctatgca aatgactaga catctccatg 600
tccctatagc ccatgaaact gcgctatcaa tcaacttgca atctagtcca tgaaattgaa 660
tcatttacgt tcaacttaat gattcgaact agggactaag gtatattata actcctgttc 72 0
actggataga gttccattcg tcaaatcacg tatttgacaa ttctatcaaa cgttataaaa 780
tactttgaac gttttattta atactaaacc aagattaaat aagaacaaaa cttttattga 840
taaacataaa cataacatat caaagcgagt aattataact gtgaactaat taaaagtaaa 900
tagtacacaa ttaaacccac tctcctatat gcttaagccc tatagcccta gtatgactct 960
catgcttggg ctgtggcaaa ggtttagtca aaggatcagc gacattacta tccgtatgaa 1020
ccttgcaaac tattacatcc tttctctcaa cgatttctcg aatgagatga aactttctaa 1080
gtacatgttt acatctttga tgtgatcttg gttccttaga ctgagctatg gcaccattgt 1140
tatcacaatg taaaacaata ccatctccaa cactaggcac tactcctagc tccagaatga 1200
acttcttcat ccaaacggct tcctttgctg catctgctgc agcaatatac tcagcttctg 1260
tcgtagaatc agcgacagtg ctttgctttg aacttttcca gctcactgcc cctccattta 1320
gacaaaagat gaaaccagat tgggatcgga aatcatcttt gtcagtttgg aaacttgcat 1380
ctgtgtaacc ctcaacaatt aacttacttt tacctccata cactaagaaa ttatccttag 1440
tccttctcaa gtactttagg atattcttag ctgcactcca gtgtgcgtca cctggatttg 1500
attggaatct gctacacatg ctcaaggcat atgaaacatc tgggcgagta caaatcatgg 1560
agtacataat ggagcctata gctgacgcat aaggaacatt actcattcgc ttaatctcat 1620
caggcccaga aggacactga gtcttgctaa gcgacactcc atgttgcatg ggtaggaagc 1680
ctctcttaga gttttccatg ttgaacttag tgacgatctt atctatataa gttcgttggc 1740
taagtccgat catcctctta gacctatccc tatagatctt gatccccaaa atatactcgg 1800
cgttttcgag gtctttcata gaaaaacaac tttttaacca ttccttgact gactcaagca 1860
tgggaatgtt gtttcctatg agaagtatgt catctacata caagaccaag aagactatgt 1920
tactcccact ttccttcttg taaacacaag actcttctcc atttttaaga aaaccaaact 1980
ctttgattgc ctcatcaaaa cgaagattcc aactccgtga tgcttgcttc aatccataaa 2040
tggatttttg aagcttacat accctcctag gattttctgg atccacaaaa ccctccggct 2100
gtgtcatata cacatcctct ttcaagaacc cattcaagaa agcggttttg acatccattt 2160
gccaaatctc gtaatcatag aaggcggcga tcgctaggag tatccgaacg gatttaagca 2220
tggctaccgg tgaaaaggtt tcgtcatagt ctataccatg aacttgcttg aacccttttg 2280
caaccaacct tgctttgtaa acctgaatat taccatcctt gtctgttttc actttgaaaa 2340
cccatttgca accaataggt gtgatcccat cgggcaaatc taccaagtcc catacttgat 2400
tttcagacat ggatgccatt tcggacctca tggcttcgag ccatttttcg gagtcttcac 2460
tcatcaaagc ttgcttgtaa gtagtaggtt cctcaaattc taaaatcatt atctcagaat 2520
tttcagttaa caagaaatca acaaacctct tggttggtat tcttgttcta ctagacttac 2580
gaggggctgc aacaggagaa attttcttct caacaatatg agaattttcg cacgaattag 2640
attcgagtgg gacaatagga ggttcgtgta cgggatgcac gtcctccaac acttggtcag 2700
ttatgggaga agattcctcc aaaggaggaa ctacttcaag cccaacatct ggctcttgtg 2760
tcgttgtctc taacatagga tgaactatgt ccatttgttg atcttctcga acttcttcga 2820
gaaatacatt actcccactt gcctttttgg aaataaaatc tttttccaaa aagacaccac 2880
gacgagcaac aaacactttg ccctcagtgc gattgtagaa gtaatagccc ttggtttcct 2940
ttggataacc cacaaagaaa cacttatctg atttaggggc gagtttatct gaaagtaaac 3000
gctttacata aacctcacat ccccaaatac gtagaaaaga caagtttgga acttttccac 3060
tccatatctc atatggtgtc ttatctactg cctttgatgg agttctatta agtgtgaaag 3120
tagcagtttc gagagcatat ccccagaagg atattggaag atcagcaaaa ctcatcatag 3180
accgaaccat atcaagtaga gttcgattcc tcctttccga aacaccattc aactgaggtg 3240
ttccaggcgg agtgagttgt gaaagaattc cacaactctt caagtgatca ttaaactctt 3300
ggctcaaata ttcaccacca cgatcggatc gcagtgcttt gattgttttg ccaagctggt 3360
tttggacttc attttggaat tctttgaatt tttcaaatga ttccgactta tgcttcatta 3420
aatagacata tccatatcta cttaaatcgt ccgtaaaagt aatgaagtat ccaaaccctc 3480
ccctagcttt tgtgctcatt ggtccacata catcagtatg tattaggccc aatagatcac 3540
tgaccttttc accctttcca gtaaaaggtg actttgtcat tttacccatt aaacatgatt 3600
cacacacatc aaatggctca aagtcaaaag atgttagaag tccatcttta tgcaacttct 3660
gaatgcgttt cgcgtttatg tgtcctaaac gacaatgcca taagtaagta ggattagtat 3720
cgcttgttct atgttttttg ttgtctatgt taaggacatc tttgtctaag tctaggtaat 3780
atagaccatt agacctctta gcagtggcat aaaacattga attcaaataa acagagaaac 3840
aacctttctc aattgtaaat gaaaaccctt cattatccaa aacaggaata gaaataatgt 3900
ttttggtaat agcaggaacg taataacaat tattaagctc taatattaat ccagaaggca 3960
aaggtagact ataagtccca actgcaacgg cggcaactct tgcaccattt ccaactcgca 4020
gttccacctc tcctttagcc aaggttctac tccttcttag tccctgcaca ttcgaagtaa 4080
tgtgagaaac acaaccggta tcaaataccc aagaagtaga tgttgctaaa ttaatgtcaa 4140
tgacatagat acctgaagaa gaagccccag acttcttatc cttcaagtac tttgggcagt 4200
tacgcttcca atgacctatt tgatcacaat agaagcactt ggcatttgcg gccacctttg 4260
gctttgcctt tgcctgtggc ttaatagcag tcttagtggc aacttgcttg cccttatctt 4320
gctttttctt gccagcccat tccttcttaa aacccttttc cttttgaacc ataagaactt 4380
ccttcttagg tgcaatagtg atgttttgct cggcagtcat gagcatccca tgcaactcag 4440
caagggtttt cgacacccca ttcatattga aattcaatcg aaacgtattg aaccccttat 4500
gaagtgagtg cagaatgatg tcagtagcca actcttggct ataaggaaag cccaacctct 4560
ccatggcttc aaaataacca atcatttcga agacatgagt ggcgaccggc ttgccttcaa 4620
ctaacgaaca ctcaagaata gccttgtgag tttcatacct ctctatccga gcttgttgtt 4680
gaaacatggt tttcaactgt cggataatgc tataggcatc caagcttgca aacctctttt 4740
gaaggcttgg ttccatagcc gctagcataa ggcaagtaac aattactgac ctttctgcaa 4800
cggccttatg ggcctctttc tcagcatcag tagaggtagt agttaaaact gggatcggtg 4860
tttcaagaac atcctctcga ccttcggacc taagaacaat tcttagattc ctttcccaat 4920
caaggaagtt gttcccgttc aatttatcct tctcaaggat tgaacgtaag ttaaaaggtg 4980
aattattgtt gttaccagac atgatatcta catagaagat gcaaaaagta taagtatgtt 5040
tatcataata gcttttaaca aattttaaac actttaaaat aaaagctatg cacttgacca 5100
attttaatgt gtcccttttg aatcaagtgg ttctaagatc ctatcaaaca tgatttataa 5160
gtggactttg gcctcaactt aaaaccaagt ttaaaaggta agtaaactcc tttactaatt 5220
acaacaattg taactcttag ttaatgggtg attgctaagg tgattacgct cccaggtaag 5280
gaagttaccc acaacgttgg ggagagcctt cctaatccta gacagagcat gtcacccaaa 5340
cacaaaaacc cataaacttt gctacaaaat ccaaaaccgt tttgatgatt ttgttgggcc 5400
aaaccaaact aaacttgcaa atttcggaaa tttactctac ttagcccaag attgaaagta 5460
atactctgct ttggcagaac ctattactaa cgatcaagtt ttagtaggtg tttatttgga 5520
atagcaaaaa cccaatattt tatttaaggg acctaagtaa attattatgt tgatttaatt 5580
gctagtgaac atttaaataa ttaaatcaca agcataataa acttagaaag catttaaaag 5640
caatatttaa atgcataaaa ttaaatatga tcctagtatg gcccctaaac ctaaagacta 5700
ctctttaaga ctcccttgtt gaatcaccat ggatctccat ccttgtgctt cataggataa 5760
gattgaatca ccattcttct tattaatact tgaataaata ttttttgaaa ttataaacta 5820
aaaaattaca aaaaatacca acgatgcgta gatcgtattt agattacaaa aatacattaa 5880
cgatacgcat atcgtatttt ctatccaagt tttgggccat actagtcacc gcatgcattc 5940
ataatatcat atatacaaaa acatgcattt taatcaacta ttaaaataaa ttatcatgtt 6000
ttaacaactt taaaacataa taacaccatg aagatttaat cacacattaa atcctatggt 6060
tggtacctta agacaaaatt taatcatatt agaatttcgt ctcacaaagg ctttaaaata 6120
ttaatctaac aaatttaatc atattaaact taaagaaaaa ttaaagcaat tgtaggcacc 6180
acatataatt taatcatatt aaaaacaaaa acttaacatg atgactaacc acataaaaag 6240
ggcatgaaag aattaatcaa ctattaatac taacaaccta acatgtaatt aacatcataa 6300
aaaaataata atagttacta actccttagt aacccccttt aaaattaact agtcaattat 6360
cacatataat taactaataa aattaaagct cattatttaa ttcaattatg acttaaatat 6420
aaaattaatc accattaatt aatttatttg caaattggaa tatactcaaa aacaagaaaa 6480
agaaagaaaa aaaaaaaaaa agcaggctgc caaggcagca gtgtacactg ccacctcagt 6540
gccggccacc tgcgcgacca ccagaaacga ccagaacctg ccaccgcgtc gctggccacg 6600
gcgaccagca ccggcagcac tgcagcgcag gcagcaggcc gcgccaacag cagcgcccag 6660
cgcaggaagc tcgcgccgcg cgagccacca cgacgccggc cacagtccgg cggcacgcca 6720
gccaccatgt cggtcgaatt ccggtggacc ttcccccttt ccctttcaat tatcatcaac 6780
ccttgtgcat aattgaatga aagttacaac aaattgattt ggggaaaaaa ttagggttca 6840
tatcaatttt gttttaaaaa aaamcatgaa ctaacacaaa aaatctgata ttttgtgatg 6900
tgagatttca attttgagta taatatatat ttatatatat acatwaaaat ccaattttta 6960
tgtttccaat caattaatat cataatatca attatgcaaa taaattcata tataaagccc 7020
tcccttaatt gaattaaaaa atgaaataaa acatgcatca acatgatcat attaatctat 7080
gcaataggct aactgatacc actgtaggaa cttagatgca taatgcggaa aatcaagtat 7140
caaatacttg tacatctatc ccaagatcat tgcataaatt agtatgaatc aaacaatagt 7200
atagaattat acctttgatg cgtatgttcc tcttgtcacc aaacttctag tggagatcac 7260
cttagaacgt caagcgccgt tcctctaatg ttggtccacg aacaacactt ggatcaccac 7320
gtatgctagt acggaagaga gaaaaacact ctcttacttt tgtggtgagg gccgaaaatg 7380
agtgtgaaaa gactaaggga aaaatcagat ttttcactct agaagttgta aaagtgtata 7440
tccacctttg taaccccata tcaatatata aggtggttac aaaagaggtg tttcatgagg 7500
ctttatttts cctcataatg tcatacatta tgagtctaat aaactcatga gttacaactc 7560
ttcccatcca tcatcaaacc gcgcaaccca tttcacaaat ggatttggat aaatatccaa 7620
gtgtcattac ttgtgtgacc tcataggact caatgatatt agtagttggc cctaatcata 7680
ttagtccaac aaaccacaat tagcttctag caaaacgttg tgatcatcta atattattga 7740
atatattatc tccataactt atcctaatat tatttagttt attacacttg atcgaggaca 7800
aaatccttca caaatgcata tggtttgatg tacaataata tacgagtgta catttgggta 7860
ttttcaatga tcaaagtaat gaccatcagt gtacattgtg atttatcctt atttacgttg 7920
gttgcggtac ctttttatta ttattattag ctccacctac agttgcatgt acatgcacgt 7980
acctagcatg tacactttgt tgacattcat gtacattaac cgggttaacg ttacaattat 8040
gttgttatgt gttgaccttt tgttttaata ctcgtattga gttttttttg ttttgtttgt 8100
gtctatatca caaggattgt actttggatg tctattattg ttcattgtgt gttattgacg 8160
attttatggg gggatgtcat tgtgcatttt gattttgtta atgaacaacc acgaagccaa 8220
gaatgtacaa agaaacataa tagaataaaa gtaacccaat tcctaaagct gatgtcaagt 8280
gagtaatttg caatctttgt acactggtgt gttgatgttt gttcgcttat gaaattcaat 8340
atgtacaatt atagtcatat acctcatagt gctccaggtg ccacaaaaaa aactcaatat 8400
gggtattaaa acaaaaggtc aatacataac aacatgattg caacccagtt aatgtacatg 8460
aatgtcaaca aagtgtacat gcaaggtacg tgcatgtaca tgcaactgta tgtggagcta 8520
ataataaaaa aaggtaccgc aaccaacgta aataaggata aatcacaatg tacactgatg 8580
gtcattactt tgatcactga aaataaggat acattattgt ttgattgaat gttcactgga 8640
tatgactcaa tgtacaaata ttctagcaag attgttcaat tattaagcct gaatgtacaa 8700
tgttgttatg actgaatgtt caagttattt tatagagctg actttgttct gtgtacatta 8760
aagttgcgtt aatgatcatt gtgtatgact aaatatacat tagcttcact aacatgcgtg 8820
cataacatat tctatagaca caaacaaaac aaaaaaaaac tcaatatggg tactagatta 8880
aaaggtcaac acataacaac ctgattgtaa cccagttaat gtacatgaat gtcaacaaag 8940
tgtacatgca aggtacgtgc atgtacatgc aactgtagat ggagctaata ataaaaaaaa 9000
ggttccacaa ccaacgtaaa taaggataaa tcacaatgta cactgatggt cattactttg 9060
atcactgaaa atacccaaat gtacactcgt atattattgt acatcaaacc atatgcattt 9120
gttacattaa aaaaagtttt aaaaatgcaa aacagaaaat aaaatcaaat atcgacattt 9180
ggaaatttat aatagaaatg aataaaaata agggagaaat aaatgaagaa caaaataaat 9240
gagaaagaga attaaaatgg ttcttgaaaa ataaatgaga gagaaaagga gggaatgagt 9300
gagtgatgag agagaaagag ctggcccact ttcaaaaatt ctgccaaaag cctgccaaat 9360
tttggccctc ctaaaagcat caaaactacg tagttttggc caaggtgtag gatgctcatc 9420
ctacacctcc gtgcaggatc taaattgcgc ttagaaatag ggtctcctaa tatttctcta 9480
ctagcatttt ttgcacgcga tgcgtgcttg aatttttttc aagatagaaa ctcgattttt 9540
ttcgacgtat gtaaaagtca aaatttaaac attagacata caaagtataa ttgtttttag 9600
ttacaaaatt taattggttt agtctctgta acttgagttt ctcaccagtc tttttttttt 9660
tttttttttt ttttactttc aaagttaaat tctatgaaca aaatagaaat tttattgaat 9720
ttatctatga tttctaatat tactccctcc gacccaaaat atagttccca tttccctttt 9780
ttcacggtaa tttatgcaaa tagaatataa gagggatagt aaagattttt tgtttattta 9840
aataaatgtt gtatgggaaa agatgatttt aggagagaaa gtagagaata attggtgaaa 9900
gagtattaat tgtaacattt tggttgaata aacaaaggaa aaaacaaaat tcaagaagca 9960
aataaatgag aattgtttcc ttgaataatg caaaagtggg ttttaattcc caaaatatgc 10020
ccaaaaataa aaaaattccc tgtgtaccgt ccacgtaaga cggcacgcga gatttttttt 10080
tcctacttca atacaaccgc tacttaaagt agcggtttac tgattttttt ttttatctac 10140
ttaggtaaaa ccttggcgct gagtgatata actcgctact tcaagtagcg atttactgaa 10200
atccccaact ccatagtttg atatgtgctt gcaacatttt gcccaggtaa accgctactc 10260
agggtagcgg tttatgtgta taaaccgcta cttaaagtag cggtttattt taatataaac 10320
cactattgtg agtagcggtt tacgtgggca aaaacaaaaa aaaaaatagt ttctcgcgtg 10380
tcgtcctacg tggacggtac gcagggaatt ttttaatttt tgggcatatt ttgggaacta 10440
aaacccactt ttgcattatt caaggaaaaa attcaaataa atgatgggac acggtttttc 10500
tagacaaatt acgaaaaaat gtggaactaa atatgaaaat ggaaactata ttttgggaca 10560
cccaaaatgg aaatgggaat tatattttgg gacggaggga gtataatttt ttagttgatt 10620
tttgaattaa gtatactact tcatatattg ttaagaaact ggacacttgg atttcaagtc 10680
aaatttttgt gagtatgtat tgacgttgta gtgtattggt tgtagtttgt aagttaattt 10740
ttgtttttgt aaagtttact catttgagtg atttgtataa tgtaaattat gcaattctat 10800
gattttagtt gacttgtgag tgattgttat aattttattt ccattatttt tatttgaatc 10860
tccctttggt ttgtatgtga atttgtaatt tagaaaggca aaggggtaaa atagtctctt 10920
cattcgggaa caccatagtt cccctccttc ccttatataa taaagatgat gatgattttt 10980
gataataatg atttgtaagt gaattatgtg aatgtttttg tatgtattga cgtcctagta 11040
tattagtttt agtttgtaag ttaatttttt tgtttttgta aagtttcccg atcatttgag 11100
tgattttcgt gattttttgt gattttctca attctatgag tgatttgtaa agtttcttga 11160
tataagtgat ttctgagtgg tgttgaatta atttccggtg gctttgttag aaccccattt 11220
tagtattgac atttcttttg taatttagaa agggaaaggg gggtaaaata ggcatttcaa 11280
aaaaggacac cattgctccc cccttccctt atgtaattga gatatcttaa aagaataccg 11340
agagtttttt cccataaagg agtatttttt ttaaaatttt ttccataaag gagtatttat 11400
tagtaccaag ttgatttccc aaatcattat ccttgcgcaa attgcataat ggagatattt 11460
ggtgttgacg tgtgaatatg gggccataat aataggaggt caaaaacaaa actacaaggg 11520
ttaaaatcgt cacaatatta aacaagcatc tcacattctc actggtcact tttttttaac 11580
ctattaaaag aacaaacctt taactctcct cacaatctga cacgtgtcga atattgattt 11640
actgagatca atttagatcc tctcccttag actcttctgt cttctcagta cagctttaga 11700
tctcaacctc catgtcagca aagttacctt acgtgtcatc ctacgtggcc tctccttcta 11760
cccctcactc ctccacgtca acattttcct ccaaaattaa aaaatcattt ttttattata 11820
tttacttgaa tgtatataat aatgtctact gatcttcttc tttagaacta tctccttctc 11880
tcattggaac ctcaaaatca ttcttatttt atttcgagaa aaggaaaaaa aagcacatct 11940
tttttgaaga ttaatttgtg gattattatt gagcttcatc gtattaaaaa acatagtaaa 12000
agttctttcc tcatttgtct ttttattcat ctaatttttt ttagtgaaga accctaattt 12060
tgtttgtgaa ttctcaagtt caagttttga tttgggtatt ttttttgatg aaatttgtgc 12120
agctgtagga tgttatcgtg ctgagaaaag ggttttagat ggtaagtttt tttttctttg 12180
atttctctct cctacttttt tttttgtttt gctttagata atactgtcat gatatgatat 12240
aaagaattgg tgatttgggt agtttattta acctatgatt atgtgttatt tgttttgatc 12300
tttcaattta tctggtgctg tgtgtatata tgttttgttt ttcttcaagt atttggttat 12360
tattgaagtg ggtaattagg aatttgctac taatctatgg atttgggttc tgttgtgatt 12420
aatttactat agatttgagg tttaatttat gttttatagg ttagaaaagg aaatcaatga 12480
tttgtttgtg gatttgagta gattgtttgt tagtgtgtgt atgatgatat taacttccat 12540
tattcttccc caaattaggg gtaattgatg gttttttgca taccgaaggc gtattctctt 12600
tgatgatgga gtgattgttg aaaagacatg atgggttaaa gttgcaggat tatttcattt 12660
caataaacat aattgatcaa tttggatctg ttgaatgagg ttgattcaca aaaatgaaga 12720
tgggcccggt gttgccaagt cggtggcaga gcttaatcaa catatagttg ctgtgaaaaa 12780
agaaggtagg ggtagggttg caggtgaagg gcaggggctt tccgaggagg acgaactgag 12840
aattattgag gatggtgaag atgcaaacag caggcgttct ttgagttctg ttcagcttcc 12900
agttcatact cacaggcatc agccacaagt acaaccccag gggagagtct gttgggagag 12960
gtttctccct gttggatctc ctaaggtttt gctcgtagaa agtgatgact caactcgtca 13020
tattgttagt gctttgctac ggaaatgtag ctatgaaggt gatttgatct gttttaatcc 13080
catatatgca atgtcttgtc cttatcacct acttcaacaa atgattaaga gaattgtact 13140
ccctcgttcc aaaataatag caacacttag ccttcccgta gactttaggg agcgtttggt 13200
tcatattatg gtatgggttt ggaattagga atgaaaccaa ggtggtatgg ggttggaact 13260
tgatacttaa taccttgtat ttggtttcat ttaggaatga aaaaatttct tttatttgat 13320
acctagaggt aaggtatgag ccatacccac ctccccccat gggtttctaa accccatacc 13380
ttatgggttt gaggtatggg tttaaaattt aaaaataagt taaacaaaca ctaggtatgt 13440
gttttgttca ttccaaaccc atacctcata cctaaaacta gtgaaccaaa caccccctta 13500
aggatcttgg gacaaaggga atccattact agatctggtg acattaatac ctaagtttac 13560
atcagtttca cttaaatcct tcgttttaaa aaaagtaaaa aaacctgtta gtctgagtaa 13620
gtttactaat ttttgttcta aaattcaaca cattatctac atgcaagcac ttactagtac 13680
aatacaactc aaacaatata tgcatcctat ctgttcacaa tgaaccgaaa actaatcttt 13740
tcataccctt gtttgatgct tttttcaggc catacaaatt tctttaacct aaattgcctc 13800
ctcagtcact gttcaaaatt gcagttttaa catcctcaag accatgtgat gtactgttag 13860
attatattaa gaccctattg taaataaagc atgtatagtg gaataaaatg catgtcttcc 13920
tacttttttt tgggggtcat gaactcattg tttgatattt tgcagttgta ggggtgccaa 13980
atggcataga agcatggaaa atcttagaag atttgagcaa tcagattgac ctagttttaa 14040
ctgaggtagt cacatcagga ctctctggta taggtcttct gtccaagata atgagtcaca 14100
aaagctgcca gaatactcct gtcattagtg agctttcgtt ccttgttgta ttagtgtatg 14160
ttctgtattt gattttcttt ctttgtgcat atcttgcctt gttttttaca attatttaga 14220
ttttagatga aaatgtatac tcattttatg gtctttagct gcaacatttg attattttgt 14280
gtgcagtgat gtcatctcat gattcgatgg gtttagtctt aaagtgctta tccaagggcg 14340
ctgttgactt tctggtgaag cctataagaa aaaacgaact taaaaacctt tggcagcatg 14400
tttggaggag gtgtcacagt gtaagtgtct ttacattttc cagctttcca tcagcttagt 14460
ggttcgtgta gcagtctttc aaattttcga actttctagc acatatgaca aattaaacct 14520
gcatgctaat tcccgattag ataatggaat aagctctttc agctggtctt ttacttcttt 14580
ctcttctcct cttatgaaaa actggtatgc cactatgcat cttgttccag gtgtttgttt 14640
agtgtttctt tcctttattc gtttttttgt ttttattttt aattttaatt ttaatttttc 14700
ctcattcttt ttttagtcta gtggtagtgg aagtgaaagc tgtgtaagga atggaaaatc 14760
cataggaagc aagagggctg aagagtcgga caatgacact gacatcaatg aggaagatga 14820
taacagaagc attggtttac aagctcggga tggaagtgac aatggaagtg ggacccaggt 14880
agtgctaacc cctgtaatat taaacttcct atagtaggtg tggttaatgt gacgctgtta 14940
aggccttttg ggtggttgct tctagttcac taaggataat aagaaatagc tcgctattga 15000
tagttagggc acctcaatat cacctcctct tgtatgtttg ttgaactaca tttttagcca 15060
gacttgagta ttttatcctg aaggatagaa caggtgcatt tttggttgcg gttgttagtt 15120
gttactgtta tgcaaagact attgccacca ttttctcaca catatttaac atggaagtgt 15180
cctaaccacc ccccaaccca aaaaatggga gggagaaatt actggagatg ggaaagaagt 15240
tacataaaaa gttagtcgtt tgggtcatga ttgtttgttg tatttgcaaa gttagcgcgt 15300
tctcttcctg gatgcttcaa aataagctga tgcaccataa agtaccactc ttggcttcac 15360
ctgttggtgt ggacccaacc aatgtaccct tgttgatctc gagatagaca aagaggaagt 15420
ttaatttctc tttatatgtt atctctcttc aatttgttag cagctatgtc tctttcgtgg 15480
acatttagaa cccatgttag gttcatattt atagttaggt gattgtatca aaattgccat 15540
cacaataaac agaacattaa tttctattgg gaaggattca aggatcaaat atacaggaaa 15600
gagcagtgta ggagatatca tcttgttgaa caacaaaaga aacattaaca tcaactggtg 15660
ataatctttg caagattgga tgacaaaatg aggagtcgat ctaatataaa acaaattggg 15720
aactgtcagc tatatcctgc atatcaagaa tggagacctt taagaaaagt aagaccattt 15780
tttgttggga agtcaagcca ttgtcccagt ttccttgtga aatttagttc atcttagctt 15840
tcttctacca acatgaattc tctttccttt cagcccttgc aaacttggtt ttatgctaat 15900
tatcagtgtt tccttcattt agtacgctga gagggtttat ttggttgatc aaagaatact 15960
tgatgacctt gaggtagatg ctctacatgg agaagttcct ctaagtgtac aaagaatcta 16020
gttcgaccaa ctttgattta ggaagagata acacgatcac ctcgtggtct agactctgga 16080
gaggtcaaag tgtgcaaaag ggtatttttg aaagacaatg gcttgttgat tcatgactga 16140
aattggatgg tcgtgactga gcatatacta ttagtggttc tcttctaagg tgatataagt 16200
atgtgataac ccaatcctgt atatttcttc gaggacatca attgtgctac tattctaggg 16260
tgctggagac ccatacatat agagccattg acaattaaca caaacttcaa ccacttattt 16320
ttatttcatt taagctatca atccctaaga aagagcccat ccaagctcct gctttaggtg 16380
catcccctcc cttttcagct agtgcacaaa aaatgaactt tcgagataga ctgctaaatt 16440
tgctttgtca agaagacaaa attttgatac acaactgtaa ttgcatttta tgacacttac 16500
gctgatatat ctgcaagtga agttgatatg caaaaactat gtagcctcct tcgtctacgg 16560
taatagatct ccgtcaatgt gatgcttgtg tgccatcata aaatgatatt gggtctttag 16620
actctgttac tctacagctg aaggatctta gccttggcat ttatatcctt tttatccaaa 16680
agttaaaaaa agcggaccgt ttgacccatg taaggaaaaa ggaaaggaat cgagaaagac 16740
aaaggagggg aaagaagtta aatctcctaa aaagcttgtt ttgtgcggtg agagagggag 16800
cgacttgaaa ttgccattga tgatgattgg ttcacaattg taatcgaaat caaactcact 16860
ctctctctct ctctctctct tatcaccccc ctcaaactat aacatcacag tcctttaaac 16920
gtgactgttt cgggggatag tgactggtag ggatgggcaa gggtcgggtc tggctggacc 16980
ctagacccgg accctaattt ttttttgtag acccaaaccc ggaccctaag ggtctgaaaa 17040
aattggacct tgacccagac ccttagggtc tgaagggtct agagggtcag gagggtccag 17100
gcttaaattt tttattttgc caaattttta gcattattaa tatcaataat catttgaaat 17160
tcgcatgaaa caaacacaaa aaaaaatcgc atgaatcaaa cacaaaaatt cgcatgaaac 17220
aaacactaac atataaattg aaaaaaacga aacaaacaca aacttataaa cgaaaaaaat 17280
tgaaacaaac acaattccaa acatataaac tgaaaaaaaa aacgaaacaa acacaaatat 17340
acaaactgaa aaaaagaaga aacaaacaca acttacataa gagttcagaa tgggtgttat 17400
agtttatgtt ttagtcattt agaaaatcaa tttgtttttt ttttaaagtt aaaatgtata 17460
tattaaataa gtttagggtc taaggtgttg gaacatttat agggtaatgg gtttgaaact 17520
catatgggta tgtactagaa gaggaggagg tctagtatgc aaaaggttag agtgcatcaa 17580
gtggtaacaa cgcgcattgt tataccaatg tcgcgagtcg cgacaggcgt cgcgggtcgc 17640
gaccagcgcc tcgcgagctt cttcgcatgt cgcgacgcgt cttctgcctt ggaatgcgaa 17700
aaaatgcctc ggcggtttta tatccgttgt gatgctttgt tgatcatttt aatgactttt 17760
aaggtctttt aatcagtaga ttaaaggcct ttgatgagtg attaagatgg gggttatgtg 17820
attaacctct ctagtcaatg aaatgttgat tatgcttata taacctttgg attcctatga 17880
gtgaggagtt agaagaaaat cagaattttc tatactctct caaaagtctt cttgcttagc 17940
ttaagagaaa ccttgcaatc ttctcttgag tgttcttcac aaacacaaaa cacaagttct 18000
tgttgattca cttagaagat catctaagtg gattgtttct ctccattgta tctcattagt 18060
tatttcgtgt taacccggtg atcctagagg ggcgaaatta aactaattgg aaagcgtagt 18120
ttccgtgcct tggagtggga tatccggttc tctcattgat cacaagccta acataagggt 18180
cgggtctggg tccaaatttt aagacccgga cccggaccct aaaaaattca cttggaccca 18240
gacccggacc cggactctta gggtctgaaa aagttggacc caaaccctta aattagggtc 18300
gggtccaaca gggtccgggt agggtcttgg acccatgccc atccctagtg attgggtagc 18360
ccattgcaga atattgagaa cgcaatataa aggggtgttg agaaagaggg ttttgagtgt 18420
attgtttaag aaagttggga aaggaatgag agatgaagta cagaagaaaa cgtctagaaa 18480
gtgaagcatg ggagtctgtt tcttttcttt ttcctaaagt ttcccaccaa atgtccctta 18540
agtggttcag ccacgccttt ggacaagctt accaccaagc tccccatccc agatcatatt 18600
tgaatcaaac atctttcttt ttttagaata ttcttttttt gtgcatgaaa gccaattcca 18660
tgagatatgt accttatatt tctctaaaat atataaataa ttgatgaagc aattttcaga 18720
tcattagata agcgttctac aaaagaacca tctttttttg cttccttgtg tacttggaaa 18780
atgtagttcc catatataat tttaccatgg cagtacttct atagaccact aagttcttcg 18840
cttgtgcaac ctatagtgca tttaagaggg tttaggtata gacagccttc actttcaatt 18900
ggttagagtc tacctccagt atcactgaca gaattttcaa taggaacttc tgtcataact 18960
taattcgcag aaagcactaa ctaaacaacc ccttagttct ttagttaagc gcttgattgg 19020
tcacatccag cttttagttt ttagtatgga gatttataaa gtagtatgac ttgagttgaa 19080
tagtgaacgt aagattagac atatttatat agtcgtgtta attttggaaa ctgacaggag 19140
tgactagaaa ccactttttt tgtgtccaaa atttccatat attgtttttt aaaaaaactg 19200
ctaaatcacg atgataacaa acaaacctta cacaggtacc ggaatgatat tgaaacaaat 19260
tgaggttagt gataagccat aatcccttac cttgaaattc agaggctgtc tgctgcagtc 19320
tctatcatct tcttatttca ctaaatcaat tattacctgc ttcaacctca acggtccgag 19380
gcttagacat tgtgtctttg atagtatcat cacagctgaa aattaatgtg tactttcttc 19440
tatttaaata ccatttgaga gtgcctttgg tagtcattat gaatgtcgtg agatcacaat 19500
ccgtgaaata tagttttcat cacattctta cctgcatgtg taaggaaaag tatagcgtta 19560
gtgttcaatc ttttgctact tctggtgact ggtcaatggt caaagtatgc agcatgattt 19620
tgtgtttgtc agtttcttct ttaaataagt gtgaactgct ctagtctaag ttgctcgaac 19680
tcttaaaaag tgttggactt gttagttgtt acatgtatac aatgttgatt gggtgggctt 19740
ttccatatat tattatattt gttgaatcac aatgaagtac ctatttccat ttgaggagta 19800
ggtatgatga ggttagtagg gagtttgagt gttaaaggtt atgtgaagat gtaaaaattc 19860
actgacaatg agaccttagt atccgacggt cggaatttta ccaattttat tgccttgtta 19920
cctttctatt tttacttagt atttcctttt cataaatttt tgtgatctag agttcatgga 19980
caaaaagggc tgcagaagtt gagagccccc aaccacagtc tacatgggag caagcaactg 20040
atccacctga tagcacttgt gctcaggtca tttatccaat gtctgaggca tttgccagca 20100
gctggatgcc tggatccatg caggaacttg atggacagga tcatcaatat ggtatgtggt 20160
actgtatttg atagaagtta caataatgtg taaactgaaa ccacttaatg acctagtatc 20220
catctgtatc agacaatgtc ccaatgggaa aggatttgga gattggagta cctagaattt 20280
cagattcacg gctaaatgga ccaaacaaaa cggttaagtt agcaactact gctgaggaaa 20340
accaatattc acagttagac ctcaaccagg aaaatgatgg tcgaagtttt gatgaagaga 20400
acctggagat gaataatgat aaacctaaaa gtgagtggat taaacaggct atgaactcac 20460
caggaaaagt tgaagaacat cgtagaggaa ataaagtatc tgatgcacca cccgaaattt 20520
ccaaaataaa ggacaaaggc atgcaacatg tcgaggatat gccttctctt gtgctcagtc 20580
tgaagaggtt gggtgatatt gcagacacga gcactaatgt ctcagaccag aatattgttg 20640
ggcgttcaga gctttcagcc ttcaccaggt atgctagaga aggtgaaact tgaatttata 20700
taatggacaa gtggacaata tctcattttt aaattgttgc aggtacaatt caggcacaac 20760
tggtaaccag ggtcaaacag gtaatgttgg cagttgctct ccaccaaata atagttcaga 20820
agcagcaaag cagtcccatt ttgatgctcc acatcaaatt tcgaatagca gtagtaacaa 20880
taacaatatg ggctctacta ctaataagtt cttcaaaaag cctgctatgg acattgataa 20940
gacacctgca aaatcaacag tcaactgttc tcatcattca catgtgtttg agccagtgca 21000
aagttcccat atgtctaata ataaccttac tgcatctggt aagcctggtg ttggctccgt 21060
aaatggtatg ctgcaagaaa acgtaccagt aaatgctgtt ctgccgcaag aaaataacgt 21120
ggatcagcag ctcaagattc agcaccacca tcactaccat cattacgatg tccatagtgt 21180
acagcagcta ccaaaggttt ctgttcaaca taatatgccc aaaagcaagg atgtgacagc 21240
acccccacag tgtgggtctt caaacacttg tagatcgcca attgaagcaa atgttgccaa 21300
ttgcagtttg aatggaagtg gtagtggaag caatcatggg agcaatttcc ttaatggaag 21360
tagtgctgct gtgaatgttg aaggaacaaa catggtcaat gatagtggga tagctgcaaa 21420
agatggtgct gaaaatggaa gtggtagtgg aagtggaagt ggtagtggta gtggtgttgg 21480
tgtggatcaa agtcgatcag ctcaacgaga agctgccttg aataaattcc gtctcaagcg 21540
taaagaaaga tgctttgaca aaaaggtaat actccaaatt ctctccagaa tgtttatact 21600
tggacatcta gtatgtacat ccttgaatct aaactgtaaa agctgaattt cagaataaaa 21660
aacacaaatt atatcaagta tgaaggcaga gtattgtagt aattatagtt tttctggtat 21720
ggaattagta cttacattta ccagaagcct gctgtcacaa gccataattt gatcatcaag 21780
caacaataat ttggccattt cttgcttgta ttgaaagtga gatgacttca aacttatttg 21840
tgtatcatca catcaggtgc gatatcaaag cagaaagaag ttagcagatc aaagacctcg 21900
tgttcgtggg caattcgtgc gccaggtacg agaaaacaaa ggaaggaata ccgatagcta 21960
acaccaattc tttccacaag ttgctgccaa gatcatttat gccactctga tgtcagctgt 22020
cttcatatgt acaaatttcg aattttatgt gtgcatgagg tgctaaatac tgtcaaacct 22080
cagtgattct gtttggttta ggctgtagaa agacatcttt tcctttgtgt tttcatggtt 22140
cttattttga gctgtgttca ctacttttta taacatggta gcccctggtt gcctttggaa 22200
ataagctttt ccttaaaggt gtgatgcata taatcttgtt tggtgttaga ttatatgatc 22260
atttcttcag gcgtttacgg gtcacatttt ccggaatcct ttcaaacgcg attccggaaa 22320
caatggctca tattttcttt tggtttcaag gagaaggcta tttaaaacag aaaagattta 22380
ggttacagaa atcagtgatg aagcaatgag tttcattata gaataggtag aagtaggggg 22440
tgttttttcc gtactcttga gatagaaagt ggggatagat tctttggact cgtcagaaag 22500
gaataatata gttgtctacc tttttcattt ttagttcttg taggagtttt attccacttc 22560
catttttgta aaatttagga gttgtaagga cgtgtaaaga gaatctgcca tccagatttt 22620
aaccgacggt aaatttgttc ttttcatgtt ttctcaagta actataatgt tttcatcgaa 22680
tctataggga ttttctaatg tgtacctgat agaggcacac agtaacaata atataagtac 22740
atatattctt taagaataat gacatagtaa ttatattttt aatacaaata aaagatgtcc 22800
ttatgtaatg aaacaaataa cttttccttg aaggtatgcc ataattaatt actttatttt 22860
gaagatattt tatatttagt ttgggtagtg gaactactaa ataaaaatat ggttatagta 22920
acatgtactc atgtgcgaac cgaaaaaaac cctatgcttt ctctaaaagt tcccaaaccc 22980
ttgagcttat agccccgacg gcccagcgca ggcttgctgg agcgccgcgt cgctcaccct 23040
gtcgccgacg agcctgcatg tcgtatcgtt cggtcttctg aaggtttagt tttccctgtt 23100
cctctttgtg ttattcatcg ttcccatccc ccatgtctcc ccttcccctg tcagtggttg 23160
tcggcctccc cttcccctat taatggttgt cggcctcccc ttccctttcc cctaatagtg 23220
gttgttggtc tccccttccc ctttcatgtt gtcaagttgt tcctttcccc gttctccctt 23280
ttcctagtcc tcttttggtg ttcttgttgt tgttagttta gtggctttgg ttggttagtt 23340
cggctgagtg cttcgtcgtc gtatgccctt ccttgttccc ctatttggtt ttggttatgt 23400
tggggtttcg gttaaccccg ttcccatgct taaacgtggg agggcctcag gatttagata 23460
taaaggtcat cattctcgcg cttagacgtg agagggatta agtgttcagg gataagggct 23520
ccgttcctgc gcttaaacgt gggagaactt aaaggttcta ggttttacag gagttttggg 23580
attggaaagt atatgaactc tgtttggcag aagatgacag tgcaatgtgg ggattaatca 23640
tttcgttttc ttccttttta ataagttagt ctcttattat gagagttttc tattagttct 23700
aatcccctta atttcttgta ggggttgtaa gtctagtttg tcgttgttta gtatatctag 23760
ttcgagaagc tcgaaagttt gaggttgtgg aaaaatgtac ttactggttg cagatcaaga 23820
atattaagac gaatgtttga cttcaattta ctattgcatc aggtaggaaa tatggtgagt 23880
catcgaatat ccattatggt tggaatagta ccatatcatg gaagcggttt cgaagcgtgt 23940
atattagtaa aatagatgaa gatattcaaa tcgatgtttt agattatctt ttatgtacgt 24000
aagggtcatt attgttgtag atgttgtatg gttttttaat ttaatgataa tttttcctta 24060
ttcccactta aaagtaaaca atgcattcat gtgcacatat tagtacatat atttgtatat 24120
acatctcg 24128
<210> 9
<211> 2367
<212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 9
atgaggttga ttcacaaaaa tgaagatggg cccggtgttg ccaagtcggt ggcagagctt 60
aatcaacata tagttgctgt gaaaaaagaa ggtaggggta gggttgcagg tgaagggcag 120
gggctttccg aggaggacga actgagaatt attgaggatg gtgaagatgc aaacagcagg 180
cgttctttga gttctgttca gcttccagtt catactcaca ggcatcagcc acaagtacaa 240
ccccagggga gagtctgttg ggagaggttt ctccctgttg gatctcctaa ggttttgctc 300
gtagaaagtg atgactcaac tcgtcatatt gttagtgctt tgctacggaa atgtagctat 360
gaagttgtag gggtgccaaa tggcatagaa gcatggaaaa tcttagaaga tttgagcaat 420
cagattgacc tagttttaac tgaggtagtc acatcaggac tctctggtat aggtcttctg 480
tccaagataa tgagtcacaa aagctgccag aatactcctg tcattatgat gtcatctcat 540
gattcgatgg gtttagtctt aaagtgctta tccaagggcg ctgttgactt tctggtgaag 600
cctataagaa aaaacgaact taaaaacctt tggcagcatg tttggaggag gtgtcacagt 660
tctagtggta gtggaagtga aagctgtgta aggaatggaa aatccatagg aagcaagagg 720
gctgaagagt cggacaatga cactgacatc aatgaggaag atgataacag aagcattggt 780
ttacaagctc gggatggaag tgacaatgga agtgggaccc agagttcatg gacaaaaagg 840
gctgcagaag ttgagagccc ccaaccacag tctacatggg agcaagcaac tgatccacct 900
gatagcactt gtgctcaggt catttatcca atgtctgagg catttgccag cagctggatg 960
cctggatcca tgcaggaact tgatggacag gatcatcaat atgacaatgt cccaatggga 1020
aaggatttgg agattggagt acctagaatt tcagattcac ggctaaatgg accaaacaaa 1080
acggttaagt tagcaactac tgctgaggaa aaccaatatt cacagttaga cctcaaccag 1140
gaaaatgatg gtcgaagttt tgatgaagag aacctggaga tgaataatga taaacctaaa 1200
agtgagtgga ttaaacaggc tatgaactca ccaggaaaag ttgaagaaca tcgtagagga 1260
aataaagtat ctgatgcacc acccgaaatt tccaaaataa aggacaaagg catgcaacat 1320
gtcgaggata tgccttctct tgtgctcagt ctgaagaggt tgggtgatat tgcagacacg 1380
agcactaatg tctcagacca gaatattgtt gggcgttcag agctttcagc cttcaccagg 1440
tacaattcag gcacaactgg taaccagggt caaacaggta atgttggcag ttgctctcca 1500
ccaaataata gttcagaagc agcaaagcag tcccattttg atgctccaca tcaaatttcg 1560
aatagcagta gtaacaataa caatatgggc tctactacta ataagttctt caaaaagcct 1620
gctatggaca ttgataagac acctgcaaaa tcaacagtca actgttctca tcattcacat 1680
gtgtttgagc cagtgcaaag ttcccatatg tctaataata accttactgc atctggtaag 1740
cctggtgttg gctccgtaaa tggtatgctg caagaaaacg taccagtaaa tgctgttctg 1800
ccgcaagaaa ataacgtgga tcagcagctc aagattcagc accaccatca ctaccatcat 1860
tacgatgtcc atagtgtaca gcagctacca aaggtttctg ttcaacataa tatgcccaaa 1920
agcaaggatg tgacagcacc cccacagtgt gggtcttcaa acacttgtag atcgccaatt 1980
gaagcaaatg ttgccaattg cagtttgaat ggaagtggta gtggaagcaa tcatgggagc 2040
aatttcctta atggaagtag tgctgctgtg aatgttgaag gaacaaacat ggtcaatgat 2100
agtgggatag ctgcaaaaga tggtgctgaa aatggaagtg gtagtggaag tggaagtggt 2160
agtggtagtg gtgttggtgt ggatcaaagt cgatcagctc aacgagaagc tgccttgaat
2220
aaattccgtc tcaagcgtaa agaaagatgc tttgacaaaa aggtgcgata tcaaagcaga
2280
aagaagttag cagatcaaag acctcgtgtt cgtgggcaat tcgtgcgcca ggtacgagaa
2340
aacaaaggaa ggaataccga tagctaa
2367
<210> 10
<211> 2367
<212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 10
atgaggttga ttcacaaaaa tgaagatggg cccggtgttg ccaagtcggt ggcagagctt aatcaacata tagttgctgt gaaaaaagaa ggtaggggta gggttgcagg tgaagggcag gggctttccg aggaggacga actgagaatt attgaggatg gtgaagatgc aaacagcagg cgttctttga gttctgttca gcttccagtt catactcaca ggcctcagcc acaagtacaa ccccagggga gagtctgttg ggagaggttt ctccctgttg gatctcctaa ggttttgctc gtagaaagtg atgactcaac tcgtcatatt gttagtgctt tgctacggaa ttgtagctat gaagttgtag gggtgccaaa tggcatagaa gcatggaaaa tcttagaaga tttgagcaat cagattgacc tagttttaac tgaggtagtc acatcaggac tctctggtat aggtcttctg tccaagataa tgagtcacaa aagctgccag aatactcctg tcattatgat gtcatctcat gattcgatgg gtttagtctt aaagtgctta tccaagggcg ctgttgactt tctggtgaag cctataagaa aaaatgaact taaaaacctt tggcagcatg tttggaggag gtgtcacagt tctagtggta gtggaagtga aagctgtgta aggaatggaa aatccatagg aagcaagagg gctgaagagt cggacaatga cactgacagc aatgaggaag atgataacag aagcattggt ttacaagctc gggatggaag tgacaatgga agtgggaccc agagttcatg gacaaaaagg gctgcagaag ttgagagccc ccaaccacag tctacatggg agcaagcaac tgatccgcct gatagcactt gtgctcaggt catttatcca atgtctgagg catttgccag cagctggatg
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
cctggatcca tgcaggaact tgatgtacag gatcatcaat atgacaatgt cccaatggga 1020
aaggatttgg agattggagt acctagaatt tcagattcac ggctaaatgg accaaacaaa 1080
aaggttaagt tagcaactac tgctgaggaa aaccaatatt cacagttaga cctcaaccag 1140
gaaaatgatg gtcgaagttt tgatgaagag aacctggaga tgaataatga taaacctaaa 1200
agtgagtgga ttaaacaggc tatgaactca ccaggaaaag ttgaagaaca tcatagagga 1260
aataaagtat ctgatgcacc acccgaaatt tccaaaataa aggacaaagg catgcaacat 1320
gtcgaggata tgccttctct tgtgctcagt ctgaagaggt tgggtgatat tgcagacacg 1380
agcactaatg tctcagacca gaatattgtt gggcgttcag agctttcagc cttcaccagg 1440
tacaattcag gcacaactgg taaccagggt caaacaggta atgttggcag ttgctctcca 1500
ccaaataata gttcagaagc agcaaagcag tcccattttg atgctccaca tcaaatttcg 1560
aatagcagta gtaacaataa caatatgggc tctactacta ataagttctt caaaaagcct 1620
gctatggaca ttgataagac acctgcaaaa tcaacagtca actgttctca tcattcacat 1680
gtgtttgagc cagtgcaaag ttcccatatg tctaataata accttactgc atctggtaag 1740
cctggtgttg gctccgtaaa tggtatgctg caagaaaacg taccagtaaa tgctgttctg 1800
ccgcaagaaa ataacgtgga tcagcagctc aagattcagc gccaccatca ctaccatcat 1860
tacgatgtcc ataatgtaca gcagctacca aaggtttctg ttcaacataa tatgtccaaa 1920
agcaaggatg tgacagcacc cccacagtgt gggtcttcaa acacttgtag atcgccaatt 1980
aaagcaaatg ttgccaattg cagtttgaat ggaagtggta gtggaagcaa tcatgggagc 2040
aatttcctta atggaagtag tgctgctgtg aatgttgaag gaacaaacat ggtcaatgat 2100
agtgggatag ctgcaaaaga tggtactgaa aatggaagtg gtagtggaag tggaagtggt 2160
agtggtagtg gtgttggtgt ggatcaaagt cgatcagctc aacgagaagc tgccttgaat 2220
aaattccgtc tcaagcgtaa agaaagatgc tttgacaaaa aggtgcgata tcaaagcaga 2280
aagaagttag cagatcaaag acctcgtgtt cgtgggcaat tcgtgcgcca ggtgcgagaa 2340
aacaaaggaa ggaataccga tagctaa 2367
<211> 788
<212> PRT
<213> Beta vulgaris
<400> 11
Met Arg Leu Ile His Lys Asn Glu Asp Gly Pro Gly Val Ala Lys Ser
1 5 10 15
Val Ala Glu Leu Asn Gln His Ile Val Ala Val Lys Lys Glu Gly Arg
20 25 30
Gly Arg Val Ala Gly Glu Gly Gln Gly Leu Ser Glu Glu Asp Glu Leu
35 40 45
Arg Ile Ile Glu Asp Gly Glu Asp Ala Asn Ser Arg Arg Ser Leu Ser
50 55 60
Ser Val Gln Leu Pro Val His Thr His Arg His Gln Pro Gln Val Gln
65 70 75 80
Pro Gln Gly Arg Val Cys Trp Glu Arg Phe Leu Pro Val Gly Ser Pro
85 90 95
Lys Val Leu Leu Val Glu Ser Asp Asp Ser Thr Arg His Ile Val Ser
100 105 110
Ala Leu Leu Arg Lys Cys Ser Tyr Glu Val Val Gly Val Pro Asn Gly
115 120 125
Ile Glu Ala Trp Lys Ile Leu Glu Asp Leu Ser Asn Gln Ile Asp Leu
130 135 140
Val Leu Thr Glu Val Val Thr Ser Gly Leu Ser Gly Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ser Lys Ile Met Ser His Lys Ser Cys Gln Asn Thr Pro Val Ile Met
165 170 175
Met Ser Ser His Asp Ser Met Gly Leu Val Leu Lys Cys Leu Ser Lys
180 185 190
Gly Ala Val Asp Phe Leu Val Lys Pro Ile Arg Lys Asn Glu Leu Lys
195 200 205
Asn Leu Trp Gln His Val Trp Arg Arg Cys His Ser Ser Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Glu Ser Cys Val Arg Asn Gly Lys Ser Ile Gly Ser Lys Arg
225 230 235 240
Ala Glu Glu Ser Asp Asn Asp Thr Asp Ile Asn Glu Glu Asp Asp Asn
245 250 255
Arg Ser Ile Gly Leu Gln Ala Arg Asp Gly Ser Asp Asn Gly Ser Gly
260 265 270
Thr Gln Ser Ser Trp Thr Lys Arg Ala Ala Glu Val Glu Ser Pro Gln
275 280 285
Pro Gln Ser Thr Trp Glu Gln Ala Thr Asp Pro Pro Asp Ser Thr Cys
290 295 300
Ala Gln Val Ile Tyr Pro Met Ser Glu Ala Phe Ala Ser Ser Trp Met
305 310 315 320
Pro Gly Ser Met Gln Glu Leu Asp Gly Gln Asp His Gln Tyr Asp Asn
325 330 335
Val Pro Met Gly Lys Asp Leu Glu Ile Gly Val Pro Arg Ile Ser Asp
340 345 350
Ser Arg Leu Asn Gly Pro Asn Lys Thr Val Lys Leu Ala Thr Thr Ala
355 360 365
Glu Glu Asn Gln Tyr Ser Gln Leu Asp Leu Asn Gln Glu Asn Asp Gly
370 375 380
Arg Ser Phe Asp Glu Glu Asn Leu Glu Met Asn Asn Asp Lys Pro Lys
385 390 395 400
Ser Glu Trp Ile Lys Gln Ala Met Asn Ser Pro Gly Lys Val Glu Glu
405 410 415
His Arg Arg Gly Asn Lys Val Ser Asp Ala Pro Pro Glu Ile Ser Lys
420 425 430
Ile Lys Asp Lys Gly Met Gln His Val Glu Asp Met Pro Ser Leu Val
435 440 445
Leu Ser Leu Lys Arg Leu Gly Asp Ile Ala Asp Thr Ser Thr Asn Val
450 455 460
Ser Asp Gln Asn Ile Val Gly Arg Ser Glu Leu Ser Ala Phe Thr Arg
465 470 475 480
Tyr Asn Ser Gly Thr Thr Gly Asn Gln Gly Gln Thr Gly Asn Val Gly
485 490 495
Ser Cys Ser Pro Pro Asn Asn Ser Ser Glu Ala Ala Lys Gln Ser His
500 505 510
Phe Asp Ala Pro His Gln Ile Ser Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn
515 520 525
Met Gly Ser Thr Thr Asn Lys Phe Phe Lys Lys Pro Ala Met Asp Ile
530 535 540
Asp Lys Thr Pro Ala Lys Ser Thr Val Asn Cys Ser His His Ser His
545 550 555 560
Val Phe Glu Pro Val Gln Ser Ser His Met Ser Asn Asn Asn Leu Thr
565 570 575
Ala Ser Gly Lys Pro Gly Val Gly Ser Val Asn Gly Met Leu Gln Glu
580 585 590
Asn Val Pro Val Asn Ala Val Leu Pro Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln
595 600 605
Gln Leu Lys Ile Gln His His His His Tyr His His Tyr Asp Val His
610 615 620
Ser Val Gln Gln Leu Pro Lys Val Ser Val Gln His Asn Met Pro Lys
625 630 635 640
Ser Lys Asp Val Thr Ala Pro Pro Gln Cys Gly Ser Ser Asn Thr Cys
645 650 655
Arg Ser Pro Ile Glu Ala Asn Val Ala Asn Cys Ser Leu Asn Gly Ser
660 665 670
Gly Ser Gly Ser Asn His Gly Ser Asn Phe Leu Asn Gly Ser Ser Ala
675 680 685
Ala Val Asn Val Glu Gly Thr Asn Met Val Asn Asp Ser Gly Ile Ala
690 695 700
Ala Lys Asp Gly Ala Glu Asn Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
705 710 715 720
Ser Gly Ser Gly Val Gly Val Asp Gln Ser Arg Ser Ala Gln Arg Glu
725 730 735
Ala Ala Leu Asn Lys Phe Arg Leu Lys Arg Lys Glu Arg Cys Phe Asp
740 745 750
Lys Lys Val Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Lys Leu Ala Asp Gln Arg Pro
755 760 765
Arg Val Arg Gly Gln Phe Val Arg Gln Val Arg Glu Asn Lys Gly Arg
770 775 780
Asn Thr Asp Ser 785
<210> <211> <212>
788
PRT
<213> Beta vulgaris
<400> 12
Met Arg Leu Ile His Lys Asn Glu Asp Gly Pro Gly Val Ala Lys Ser
1 5 10 15
Val Ala Glu Leu Asn Gln His Ile Val Ala Val Lys Lys Glu Gly Arg
20 25 30
Gly Arg Val Ala Gly Glu Gly Gln Gly Leu Ser Glu Glu Asp Glu Leu
35 40 45
Arg Ile Ile Glu Asp Gly Glu Asp Ala Asn Ser Arg Arg Ser Leu Ser
50 55 60
Ser Val Gln Leu Pro Val His Thr His Arg Pro Gln Pro Gln Val Gln
65 70 75 80
Pro Gln Gly Arg Val Cys Trp Glu Arg Phe Leu Pro Val Gly Ser Pro
85 90 95
Lys Val Leu Leu Val Glu Ser Asp Asp Ser Thr Arg His Ile Val Ser
100 105 110
Ala Leu Leu Arg Asn Cys Ser Tyr Glu Val Val Gly Val Pro Asn Gly
115 120 125
Ile Glu Ala Trp Lys Ile Leu Glu Asp Leu Ser Asn Gln Ile Asp Leu
130 135 140
Val Leu Thr Glu Val Val Thr Ser Gly Leu Ser Gly Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ser Lys Ile Met Ser His Lys Ser Cys Gln Asn Thr Pro Val Ile Met
165 170 175
Met Ser Ser His Asp Ser Met Gly Leu Val Leu Lys Cys Leu Ser Lys
180 185 190
Gly Ala Val Asp Phe Leu Val Lys Pro Ile Arg Lys Asn Glu Leu Lys
195 200 205
Asn Leu Trp Gln His Val Trp Arg Arg Cys His Ser Ser Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Glu Ser Cys Val Arg Asn Gly Lys Ser Ile Gly Ser Lys Arg
225 230 235 240
Ala Glu Glu Ser Asp Asn Asp Thr Asp Ser Asn Glu Glu Asp Asp Asn
245 250 255
Arg Ser Ile Gly Leu Gln Ala Arg Asp Gly Ser Asp Asn Gly Ser Gly
260 265 270
Thr Gln Ser Ser Trp Thr Lys Arg Ala Ala Glu Val Glu Ser Pro Gln
275 280 285
Pro Gln Ser Thr Trp Glu Gln Ala Thr Asp Pro Pro Asp Ser Thr Cys
290 295 300
Ala Gln Val Ile Tyr Pro Met Ser Glu Ala Phe Ala Ser Ser Trp Met
305 310 315 320
Pro Gly Ser Met Gln Glu Leu Asp Val Gln Asp His Gln Tyr Asp Asn
325 330 335
Val Pro Met Gly Lys Asp Leu Glu Ile Gly Val Pro Arg Ile Ser Asp
340 345 350
Ser Arg Leu Asn Gly Pro Asn Lys Lys Val Lys Leu Ala Thr Thr Ala
355 360 365
Glu Glu Asn Gln Tyr Ser Gln Leu Asp Leu Asn Gln Glu Asn Asp Gly
370 375 380
Arg Ser Phe Asp Glu Glu Asn Leu Glu Met Asn Asn Asp Lys Pro Lys
385 390 395 400
Ser Glu Trp Ile Lys Gln Ala Met Asn Ser Pro Gly Lys Val Glu Glu
405 410 415
His His Arg Gly Asn Lys Val Ser Asp Ala Pro Pro Glu Ile Ser Lys
420 425 430
Ile Lys Asp Lys Gly Met Gln His Val Glu Asp Met Pro Ser Leu Val
435 440 445
Leu Ser Leu Lys Arg Leu Gly Asp Ile Ala Asp Thr Ser Thr Asn Val
450 455 460
Ser Asp Gln Asn Ile Val Gly Arg Ser Glu Leu Ser Ala Phe Thr Arg
465 470 475 480
Tyr Asn Ser Gly Thr Thr Gly Asn Gln Gly Gln Thr Gly Asn Val Gly
485 490 495
Ser Cys Ser Pro Pro Asn Asn Ser Ser Glu Ala Ala Lys Gln Ser His
500 505 510
Phe Asp Ala Pro His Gln Ile Ser Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn
515 520 525
Met Gly Ser Thr Thr Asn Lys Phe Phe Lys Lys Pro Ala Met Asp Ile
530 535 540
Asp Lys Thr Pro Ala Lys Ser Thr Val Asn Cys Ser His His Ser His
545 550 555 560
Val Phe Glu Pro Val Gln Ser Ser His Met Ser Asn Asn Asn Leu Thr
565 570 575
Ala Ser Gly Lys Pro Gly Val Gly Ser Val Asn Gly Met Leu Gln Glu
580 585 590
Asn Val Pro Val Asn Ala Val Leu Pro Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln
595 600 605
Gln Leu Lys Ile Gln Arg His His His Tyr His His Tyr Asp Val His
610 615 620
Asn Val Gln Gln Leu Pro Lys Val Ser Val Gln His Asn Met Ser Lys
625 630 635 640
Ser Lys Asp Val Thr Ala Pro Pro Gln Cys Gly Ser Ser Asn Thr Cys
645 650 655
Arg Ser Pro Ile Lys Ala Asn Val Ala Asn Cys Ser Leu Asn Gly Ser
660 665 670
Gly Ser Gly Ser Asn His Gly Ser Asn Phe Leu Asn Gly Ser Ser Ala
675 680 685
Ala Val Asn Val Glu Gly Thr Asn Met Val Asn Asp Ser Gly Ile Ala
690 695 700
Ala Lys Asp Gly Thr Glu Asn Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
705 710 715 720
Ser Gly Ser Gly Val Gly Val Asp Gln Ser Arg Ser Ala Gln Arg Glu
725 730 735
Ala Ala Leu Asn Lys Phe Arg Leu Lys Arg Lys Glu Arg Cys Phe Asp
740 745 750
Lys Lys Val Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Lys Leu Ala Asp Gln Arg Pro
755 760 765
Arg Val Arg Gly Gln Phe Val Arg Gln Val Arg Glu Asn Lys Gly Arg
770 775 780
Asn Thr Asp Ser 785
<210> 13
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер PRR7(T1)-F
<400> 13
gaggtgtcac agtgtaagtg tct 23
<210> 14
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер PRR7(T1)-R
<400> 14
aaagactgct acacgaacca ctaag 25
<210> 15
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд PRR7(T1)-VIC
<400> 15
ctgatggaaa gctg 14
<210> 16
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд PRR7(T1)-FAM
<400> 16
ctgatgaaaa gctg 14
<210> 17
<211> 23
<212> ДНК
<400> 17
gcccgtacaa acaaagactt ctc 23
<210> 18
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер GJ131(T1)-R
<400> 18
acgcagaatg ttgatgatga taca 24
<210> 19
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд GJ131(T1)-VIC
<400> 19
tccatctctc cacagctt 18
<210> 20
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд GJ131(T1)-FAM
<400> 20
tccatctccc cacagct 17
<210> 21
<211> 30
<212> ДНК
<400> 21
taaaggtggt aattttagag aattttagga 30
<210> 22
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 031700(T1)-R
<400> 22
gctcgttttg aaaaaatttg gg 22
<210> 23
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд ED031700(T1)-VIC
<400> 23
tttaattcgc atccttct 18
<210> 24
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд ED031700(T1)-FAM
<400> 24
ttaattcgca aacttct 17
<210> 25
<211> 27
<212> ДНК
<400> 25
tgccaaaaca cacattgtac ctataca 27
<210> 26
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 9_27(T2)-R
<400> 26
tgcctctggc tccttgaag 19
<210> 27
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд 9_27(T2)-VIC
<400> 27
catctctaca acactacc 18
<210> 28
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - 9_27(T2)-FAM
<400> 28
atctctacaa gactacc 17
<210> 29 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер GJ01(T1)-F
<400> 29
gaacccagga ttactcgtga gc 22
<210> 30
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер GJ01(T1)-R
<400> 30
aaaagtagaa taaaatgtaa cctcctccat ctc 33
<210> 31
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд GJ01(T1)-VIC
<400> 31
acgcaagata acatcac 17
<210> 32
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд GJ01(T1)-FAM
<400> 32
acgcaagata acgtcac 17
<210> 33 <211> 27
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3977
<400> 33
cgtgtcgaat attgatttac tgagatc 27
<210> 34
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3988
<400> 34
taacccatca tgtcttttca acaatc 26
<210> 35
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA4442
<400> 35
aagaataccg agagtttttt ccc 23
<210> 36
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3809
<400> 36
tcaccaattc tttatatcat atcatgaca 29
<210> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3810
<400> 37
gagaaaaggg ttttagatgg taagtttt 2 8
<210> 38
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 3807
<400> 38
catttgttga agtaggtgat aaggacaa 28
<210> 39
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3766
<400> 39
tttgatgctt ttttcaggcc a 21
<210> 40
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3769
<400> 40
aatatgtgtg agaaaatggt ggca 24
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3857
<400> 41
tccatttgag gagtaggtat gatgag 26
<210> 42
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3860
<400> 42
tcttgagctg ctgatccacg t 21
<210> 43
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3861
<400> 43
ctgcatctgg taagcctggt g 21
<210> 44
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер SELA3864
<400> 44
aatgtgaccc gtaaacgcct 20
<210> 45
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность- "прямой" праймер для анализа экспрессии гена BvPRR7
<400> 45
ttggaggagg tgtcacagtt ctag 24
<210> 46
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность- "обратный" праймер для анализа экспрессии гена BvPRR7
<400> 46
tgtcattgtc cgactcttca gc 22
<210> 47
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность- "прямой" праймер для анализа экспрессии гена BvlCDH
<400> 47
cacaccagat gaaggccgt 19
<210> 48
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность- "обратный" праймер для анализа экс-
прессии гена BvlCDH
<400> 48
ccctgaagac cgtgccat 18
<210> 49
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер PRR7(T6)-F
<400> 49
gctatcggta ttccttcctt tgttt 25
<210> 50
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер PRR7(T6)-R
<400> 50
ctcgtgttcg tgggcaatt 19
<210> 51
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд PRR7(T6)-VIC
<400> 51
ctcgtacctg gcgcac 16
<210> 52
<211> 16
<212> ДНК
<223>
олигонуклеотидная последовательность
зонд PRR7(T6)-FAM
<400>
ctcgcacctg gcgcac
<210> 53 <211> 3672 <212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 53
aaaaaatttc cataaaggtg tatttattag gcgtagcggt tgatttccca aatcattatc 60
cttgcgcaaa ttgcataatg gagatatttg gtgttgacgt ggggccataa ccataatagg 120
gggtcaaaaa caaaactaca agggttaaaa tcgtcacaat attaaacaag catctcactg 180
gtcacttttt ttttacctat taaagaacaa acctttaact ctcctcacaa tctgccacgt 240
gtcgaataat tgatttactg agatcaattt agatcctctc ccttagactc ttctcagtac 300
agctttagat ctcaacctcc atgtcagcaa agttacctta cgtgtcatcc tacgtggcct 360
ctccttctac ccctcactcc tccacgtcaa cattttcctc caaaattaaa aaatcatttt 420
tttattatat ttacttgaat gtatataata atgtctactg atcttcttct ttagaactat 480
ctccttctct cattggaacc tcaaaatcat tcttatttta tttcgagaaa aggaaaaaaa 540
agcacatctg ttttgaagat taatttgtgg attattattg agcttcatcg tatttaaaaa 600
acatagtaaa agttctttcc tcatttgtct ttttattcat ctaatttttt tagtgaagaa 660
ccctaatttt gtttgtgaat tctcaagttc aagttttgat ttgggtattt tttttgatga 720
aatttgtgca gctgtaggat gttatcgtgc tgagaaaagg gttttagatg gtaagttttt 780
tttttctttg atttctctct cctacttttt tttttgtttt gctttagata atactgtcat 840
gatatgatat aaagaattgg tgatttgggt agtttattta acctatgatt atgtgttatt 900
tgttttgatc tttcaattta tctggtactg tgtgtatata tgttttgttt ttcttcaagt 960
atttggttat tattgaagtg ggtaattagg aatttgctac taatctatgg atttgggttc 1020
tgttgtgatt aatttactat agatttgagg tttaatttat gttttatagg ttagaaaagg 1080
aaatcaatga tttgtttgtg aatttgagta gattgtttgt tagtgtgtgt atgatgatat 1140
taacttccat tatttcttcc ccaaattagg ggtaattgat ggttttttgc ataccgaagg 1200
cgtattctct ttgatgatgg agtgattgtt gaaaagacat gatgggttaa agttgcagga 1260
ttatttcatt tcaataaaca taattgatca atttggatct gttgaatgag gttgattcac 132 0
aaaaatgaag atgggcccgg tgttgccaag tcggtggcag agcttaatca acatatagtt 1380
gctgtgaaaa aagaaggtag gggtagggtt gcaggtgaag ggcaggggct ttccgaggag 1440
gacgaactga gaattattga ggatggtgaa gatgcaaaca gcaggcgttc tttgagttct 1500
gttcagcttc cagttcatac tcacaggcct cagccacaag tacaacccca ggggagagtc 1560
tgttgggaga ggtttctccc tgttggatct cctaaggttt tgctcgtaga aagtgatgac 1620
tcaactcgtc atattgttag tgctttgcta cggaattgta gctatgaagt tgtaggggtg 1680
ccaaatggca tagaagcatg gaaaatctta gaagatttga gcaatcagat tgacctagtt 1740
ttaactgagg tagtcacatc aggactctct ggtataggtc ttctgtccaa gataatgagt 1800
cacaaaagct gccagaatac tcctgtcatt atgatgtcat ctcatgattc gatgggttta 1860
gtcttaaagt gcttatccaa gggcgctgtt gactttctgg tgaagcctat aagaaaaaat 1920
gaacttaaaa acctttggca gcatgtttgg aggaggtgtc acagttctag tggtagtgga 1980
agtgaaagct gtgtaaggaa tggaaaatcc ataggaagca agagggctga agagtcggac 2040
aatgacactg acagcaatga ggaagatgat aacagaagca ttggtttaca agctcgggat 2100
ggaagtgaca atggaagtgg gacccagagt tcatggacaa aaagggctgc agaagttgag 2160
agcccccaac cacagtctac atgggagcaa gcaactgatc cgcctgatag cacttgtgct 2220
caggtcattt atccaatgtc tgaggcattt gccagcagct ggatgcctgg atccatgcag 2280
gaacttgatg tacaggatca tcaatatgac aatgtcccaa tgggaaagga tttggagatt 2340
ggagtaccta gaatttcaga ttcacggcta aatggaccaa acaaaaaggt taagttagca 2400
actactgctg aggaaaacca atattcacag ttagacctca accaggaaaa tgatggtcga 2460
agttttgatg aagagaacct ggagatgaat aatgataaac ctaaaagtga gtggattaaa 2520
caggctatga actcaccagg aaaagttgaa gaacatcata gaggaaataa agtatctgat 2580
gcaccacccg aaatttccaa aataaaggac aaaggcatgc aacatgtcga ggatatgcct 2640
tctcttgtgc tcagtctgaa gaggttgggt gatattgcag acacgagcac taatgtctca 2700
gaccagaata ttgttgggcg ttcagagctt tcagccttca ccaggtacaa ttcaggcaca 2760
actggtaacc agggtcaaac aggtaatgtt ggcagttgct ctccaccaaa taatagttca 2820
gaagcagcaa agcagtccca ttttgatgct ccacatcaaa tttcgaatag cagtagtaac 2880
aataacaata tgggctctac tactaataag ttcttcaaaa agcctgctat ggacattgat 2940
aagacacctg caaaatcaac agtcaactgt tctcatcatt cacatgtgtt tgagccagtg 3000
caaagttccc atatgtctaa taataacctt actgcatctg gtaagcctgg tgttggctcc 3060
gtaaatggta tgctgcaaga aaacgtacca gtaaatgctg ttctgccgca agaaaataac 3120
gtggatcagc agctcaagat tcagcgccac catcactacc atcattacga tgtccataat 3180
gtacagcagc taccaaaggt ttctgttcaa cataatatgt ccaaaagcaa ggatgtgaca 3240
gcacccccac agtgtgggtc ttcaaacact tgtagatcgc caattaaagc aaatgttgcc 3300
aattgcagtt tgaatggaag tggtagtgga agcaatcatg ggagcaattt ccttaatgga 3360
agtagtgctg ctgtgaatgt tgaaggaaca aacatggtca atgatagtgg gatagctgca 3420
aaagatggta ctgaaaatgg aagtggtagt ggaagtggaa gtggtagtgg tagtggtgtt 3480
ggtgtggatc aaagtcgatc agctcaacga gaagctgcct tgaataaatt ccgtctcaag 3540
cgtaaagaaa gatgctttga caaaaaggtg cgatatcaaa gcagaaagaa gttagcagat 3600
caaagacctc gtgttcgtgg gcaattcgtg cgccaggtgc gagaaaacaa aggaaggaat 3660
accgatagct aa 3672
<210> 54 <211> 4543
<212> ДНК
<400> 54
aaaaaatttc cataaaggtg tatttattag gcgtagcggt tgatttccca aatcattatc 60
cttgcgcaaa ttgcataatg gagatatttg gtgttgacgt ggggccataa ccataatagg 120
gggtcaaaaa caaaactaca agggttaaaa tcgtcacaat attaaacaag catctcactg 180
gtcacttttt ttttacctat taaagaacaa acctttaact ctcctcacaa tctgccacgt 240
gtcgaataat tgatttactg agatcaattt agatcctctc ccttagactc ttctcagtac 300
agctttagat ctcaacctcc atgtcagcaa agttacctta cgtgtcatcc tacgtggcct 360
ctccttctac ccctcactcc tccacgtcaa cattttcctc caaaattaaa aaatcatttt 420
tttattatat ttacttgaat gtatataata atgtctactg atcttcttct ttagaactat 480
ctccttctct cattggaacc tcaaaatcat tcttatttta tttcgagaaa aggaaaaaaa 540
agcacatctg ttttgaagat taatttgtgg attattattg agcttcatcg tatttaaaaa 600
acatagtaaa agttctttcc tcatttgtct ttttattcat ctaatttttt tagtgaagaa 660
ccctaatttt gtttgtgaat tctcaagttc aagttttgat ttgggtattt tttttgatga 720
aatttgtgca gctgtaggat gttatcgtgc tgagaaaagg gttttagatg gtaagttttt 780
tttttctttg atttctctct cctacttttt tttttgtttt gctttagata atactgtcat 840
gatatgatat aaagaattgg tgatttgggt agtttattta acctatgatt atgtgttatt 900
tgttttgatc tttcaattta tctggtactg tgtgtatata tgttttgttt ttcttcaagt 960
atttggttat tattgaagtg ggtaattagg aatttgctac taatctatgg atttgggttc 1020
tgttgtgatt aatttactat agatttgagg tttaatttat gttttatagg ttagaaaagg 1080
aaatcaatga tttgtttgtg aatttgagta gattgtttgt tagtgtgtgt atgatgatat 1140
taacttccat tatttcttcc ccaaattagg ggtaattgat ggttttttgc ataccgaagg 1200
cgtattctct ttgatgatgg agtgattgtt gaaaagacat gatgggttaa agttgcagga 1260
ttatttcatt tcaataaaca taattgatca atttggatct gttgaatgag gttgattcac 1320
aaaaatgaag atgggcccgg tgttgccaag tcggtggcag agcttaatca acatatagtt 1380
gctgtgaaaa aagaaggtag gggtagggtt gcaggtgaag ggcaggggct ttccgaggag 1440
gacgaactga gaattattga ggatggtgaa gatgcaaaca gcaggcgttc tttgagttct 1500
gttcagcttc cagttcatac tcacaggcct cagccacaag tacaacccca ggggagagtc 1560
tgttgggaga ggtttctccc tgttggatct cctaaggttt tgctcgtaga aagtgatgac 1620
tcaactcgtc atattgttag tgctttgcta cggaattgta gctatgaagt tgtaggggtg 1680
ccaaatggca tagaagcatg gaaaatctta gaagatttga gcaatcagat tgacctagtt 1740
ttaactgagg tagtcacatc aggactctct ggtataggtc ttctgtccaa gataatgagt 1800
cacaaaagct gccagaatac tcctgtcatt atgatgtcat ctcatgattc gatgggttta 1860
gtcttaaagt gcttatccaa gggcgctgtt gactttctgg tgaagcctat aagaaaaaat 1920
gaacttaaaa acctttggca gcatgtttgg aggaggtgtc acagttctag tggtagtgga 1980
agtgaaagct gtgtaaggaa tggaaaatcc ataggaagca agagggctga agagtcggac 2040
aatgacactg acagcaatga ggaagatgat aacagaagca ttggtttaca agctcgggat 2100
ggaagtgaca atggaagtgg gacccagagt tcatggacaa aaagggctgc agaagttgag 2160
agcccccaac cacagtctac atgggagcaa gcaactgatc cgcctgatag cacttgtgct 2220
caggtcattt atccaatgtc tgaggcattt gccagcagct ggatgcctgg atccatgcag 2280
gaacttgatg tacaggatca tcaatatgac aatgtcccaa tgggaaagga tttggagatt 2340
ggagtaccta gaatttcaga ttcacggcta aatggaccaa acaaaaaggt taagttagca 2400
actactgctg aggaaaacca atattcacag ttagacctca accaggaaaa tgatggtcga 2460
agttttgatg aagagaacct ggagatgaat aatgataaac ctaaaagtga gtggattaaa 2520
caggctatga actcaccagg aaaagttgaa gaacatcata gaggaaataa agtatctgat 2580
gcaccacccg aaatttccaa aataaaggac aaaggcatgc aacatgtcga ggatatgcct 2640
tctcttgtgc tcagtctgaa gaggttgggt gatattgcag acacgagcac taatgtctca 2700
gaccagaata ttgttgggcg ttcagagctt tcagccttca ccaggtacaa ttcaggcaca 2760
actggtaacc agggtcaaac aggtaatgtt ggcagttgct ctccaccaaa taatagttca 2820
gaagcagcaa agcagtccca ttttgatgct ccacatcaaa tttcgaatag cagtagtaac 2880
aataacaata tgggctctac tactaataag ttcttcaaaa agcctgctat ggacattgat 2940
aagacacctg caaaatcaac agtcaactgt tctcatcatt cacatgtgtt tgagccagtg 3000
caaagttccc atatgtctaa taataacctt actgcatctg gtaagcctgg tgttggctcc 3060
gtaaatggta tgctgcaaga aaacgtacca gtaaatgctg ttctgccgca agaaaataac 3120
gtggatcagc agctcaagat tcagcgccac catcactacc atcattacga tgtccataat 3180
gtacagcagc taccaaaggt ttctgttcaa cataatatgt ccaaaagcaa ggatgtgaca 3240
gcacccccac agtgtgggtc ttcaaacact tgtagatcgc caattaaagc aaatgttgcc 3300
aattgcagtt tgaatggaag tggtagtgga agcaatcatg ggagcaattt ccttaatgga 3360
agtagtgctg ctgtgaatgt tgaaggaaca aacatggtca atgatagtgg gatagctgca 3420
aaagatggta ctgaaaatgg aagtggtagt ggaagtggaa gtggtagtgg tagtggtgtt 3480
ggtgtggatc aaagtcgatc agctcaacga gaagctgcct tgaataaatt ccgtctcaag 3540
cgtaaagaaa gatgctttga caaaaaggtg cgatatcaaa gcagaaagaa gttagcagat 3600
caaagacctc gtgttcgtgg gcaattcgtg cgccaggtgc gagaaaacaa aggaaggaat 3660
accgatagct aacaccaatt ctttccacaa gttgctgccg agatcattta tgccactctg 3720
atatcagctg tcttcatatg tacaaatttc gaattttatg tgtgcatgag gtgctaaata 3780
ctgtcaaacc tcagtgattc tgtttggttt aggctgtaga aagacatctt ttcctttgtg 3840
ttttcatggt tcttattttg agctgtgttc actacttttt ataacatggt agccccaggt 3900
tgcctttgga aataagcttt tccttaaagg tgtgatgcat ataatcttgt ttggtgttag 3960
attatatgat catttcttca ggcgtttacg ggtcacattt tccgggatcc tttcaaacgc 4020
gattccggaa acaatggctc atattttctt ttggtttcaa ggagaaggct atttaaaaca 4080
gaaaagattt aggttacaga aatcagtgat gaagcaatga gtttcattat agaataggtg 4140
gaagtagggg gtgttttttc cgtactcttg agatagaaag tggggataga ttctttggac 4200
tcgtcagaaa ggaataatat aggagttgtc tacctttttc atttttagtt cttgtaagag 4260
ttttattcca cttccatttt agtaaaattt aggagttgta aggacgtgta aagagaatct 4320
gccatccaga ttttaaccga cggtaaattt gttcttttca tgttttctca agtaactata 4380
atgttttcat cgaatctaga gggattttct aatgtgtacc tgatagaggc acacagtaac 4440
aataatataa gtacatatat tctttaagaa taatgacata gtaattatat ttttaataca 4500
aataaaagat gtccttatgt aatgaaacaa ataacttttc ctt 4543
<210> 55
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 1r22(T1)-F
<400> 55
gataaattct gacccgcatc aca 23
<210> 56
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 1r22(T1)-R
<400> 56
ggactgagtt gataataatc aactttcc 28
<210> 57
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд 1r22(T1)-VIC
<400> 57
cctagcgcaa tttc 14
<210> 58
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - зонд 1r22(T1)-FAM
<400> 58
agctagcgcc caatt 15
Ссылки
Abe J., Guan G.-P. и Shimamoto Y., A gene complex for annual habit in sugar beet (Beta vulgaris L.). Euphytica 94, 1997, cc. 129-135.
Barany F., Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, cc. 189-193.
Batzer M.A., Carlton J.E. и Deininger P.L., Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosine at the З'-terminus. Nucleic Acids Res. 19, 1991, c. 5081.
Beales J., Turner A., Griffiths S., Snape J.W. и Laurie D.A., A Pseudo-Response Regulator is misexpressed in the photoperiod insensitive Ppd-Dla mutant of wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet. 115, 2007, cc. 721-733.
Botstein D., White R.L., Skolnick M. и Davis R.W., Construction of genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32, 1980, cc. 314-331.
Brunke K.J. и Wilson S.L., Brassica hsp80 promoter. EP0559603, 1993.
Chang Y.-F., Zhou H., Dunder E.M., Rouse S.N., Gu W. and Boutreau E., Methods for stable transformation of plants. WO 02/14523, 2002.
Chiapparino E., Lee D. и Donini P., Genotyping single nucleotide polymorphisms in barley by tetra-primer ARMS-PCR. Genome 47, 2004, cc. 414-420.
Cooper D.N., Smith B.A., Cooke H.J. и др., An estimate of unique DNA sequence heterozygosity in the human genome. Hum. Genet. 69, 1985, cc. 201-205.
Eckes P., Rosahl S., Schell J. и Willmitzer L., Isolation and characterization of a light-inducible, organ-specific gene from potato and analysis of its expression after tagging and transfer into tobacco and potato shoots. Mol Gen Genet 205, 1986, cc. 1422.
English J.J., Mueller E. и Baulcombe DC, Suppression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes. Plant Cell 8, 1996, cc. 179188.
Fan J.B., Oliphant A., Shen R., Kermani B.G., Garcia F., Gunderson K.L., Hansen M. и др., Highly parallel SNP genotyping. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 68, 2003, cc. 69-78.
Felsenstein J., Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39, 1985, cc. 783-791.
Gaafar R. M., Hohmann U. и Jung C, Bacterial artificial chromosome-derived molecular markers for early bolting in sugar beet. Theor. Appl. Genet. 110, Number 6, 2005, cc. 1027-1037.
Imaizumi Т. и Kay S.A., Photoperiodic control of flowering: not only by coincidence. Trends Plant Science 11, 2006, cc. 550-557.
Joersbo ML, Donaldson I., Kreiberg K., Petersen S.G., Brunstedt J. и Okkels F.T., Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol Breeding 4, 1998, cc. 111-117.
Konieczny А. и Ausubel F.M., A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers, Plant J. 4, 1993, cc. 403410.
Kwok P.Y., Deng Q., Zakeri H., Taylor S.L. и Nickerson D.A., Increasing the information content of STS-based genome maps: Identifying polymorphisms in mapped STSs. Genomics 31, 1996, cc. 123-126.
Landegren U., Kaiser R., Sanders J. и Hood L., A ligase-mediated gene detection technique. Science 241 4869, 1988, cc. 1077-1080.
Litt M. и Luty J.A., Hypervariable microsatellite revealed by in-vitro amplification of a dinucleotide repeat in the cardiac muscle actin gene. Am J Hum Genet 44, 1989, cc. 397-401.
McClung C.R., Plant circadian rhythms. Plant Cell 18, 2006, cc. 792-803.
McGrath J.M., Shaw R.S., de los Reyes B.G. и Weiland J.J., Construction of a Sugar Beet ВАС Library from a Hybrid with diverse Traits. Plant Mol Biol Rep 22, 2004, cc. 23-28.
Michaels S.D. и Amasino R.M., A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR. The Plant Journal 14(3), 1998, cc. 381-385.
Mohring S., Salamini F. и Schneider K., Multiplexed, linkage group-specific SNP marker sets for rapid genetic mapping and fingerprinting of sugar beet (Beta vulgaris L.). Molecular Breeding, том 14, номер 4, 2005, cc. 475-488.
Mullis K.B., Faloona F.A., Scharf S., Saiki R., Horn G. и Erlich H., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51, 1986, cc. 263-273.
Nakamichi N, Kita M., Ito S., Sato E., Yamashino Т. и Mizuno Т., PSEUDO-RESPONSE REGULATORS, PRR9, PRR7 and PRR5, together play essential roles
close to the circadian clock of Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 46, 2005, cc. 686-698.
Neff M.M., Neff J.D., Chory J. и Pepper A.E., dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J 14, 1998, cc. 387-392.
Nickerson D.A., Kaiser R., Lappin S., Stewart J., Hood L. и Landegren U., Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 87(22), ноябрь 1990, cc. 8923-8927.
Norris S. R., Meyer S. E. и Callis J., The intron of Arabidopsis thaliana polyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant of chimeric gene expression. Plant Mol Biol 21, 1993, cc. 895-906.
Ohtsuka E., Matsuki S., Ikehara M., Takahashi Y. и Matsubara K.,. An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions, J. Biol. Chem. 260(5), 1985, cc. 26052608.
Okamuro J.K. и Goldberg R.B., Regulation of Plant Gene Expression: General Principles. Biochemistry of Plants, том 15, 1989, cc. 1-82.
Orita M., Suzuki Y., Sekiya Т. и Hayashi K., Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphism using he polymerase chain reaction. Genomics 5, 1989, cc. 874-879.
Pearson W.R., Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA. Methods in Enzymology 183, 1990, cc. 63-98.
Rossolini G.M., Cresti S., Ingianni A., Cattani P., Riccio M.L. и Satta G., Use of deoxyinosine-containing primers vs degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information, Mol. Cell Probes 8, 1994, cc. 91-98.
Ruiz M.T., Voinnet О. и Baulcombe D.C., Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell 10, 1998, cc. 937-946.
Salome P.A. и McClung C.R., PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7 and 9 are partially redundant genes essential for the temperature responsiveness of the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 17, 2005, cc. 791-803.
Saitou N. и Nei M., The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4, 1987, cc. 406425.
Segev D., PCT Pub. No. WO 90/01069, 1990.
Smith N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijk P.A. Green A.G. и Waterhouse P.M., Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407, 2000, cc. 319-320.
Smith T.F. и Waterman M.S., Advances in Applied Mathematics. 2, 1981, cc. 482-489.
Tamura K., Dudley J., Nei M. и Kumar S., MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24, 2007, cc. 1596-1599.
Thiel Т., Kota R., Grosse I., Stein N. и Graner A., SNP2CAPS: a SNP and INDEL analysis tool for CAPS marker development. Nucleic Acids Res 32(1), 2004, c. e5.
Tijssen P., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, часть I, глава 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", изд-во Elsevier, New York, 1993.
Turner A., Beales J., Faure S., Dunford R.P. и Laurie D.A., The Pseudo-Response Regulator Ppd-Hl provides adaptation to photoperiod in barley. Science 310, 2005, cc. 1031-1034.
Vancanneyt G., Schmidt R., O'Connor-Sanchez A., Willmitzer L. и Rocha-Sosa M., Construction of an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediatQd plant transformation. Mol. Gen. Genet. 220, 1990, cc. 245-250.
Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B, Van Roy N, De Paepe А. и Speleman F., Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3, 2002, cc. 1-11.
Vos P., Hogers R., Bleeker M. и др., AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23(21), 1995, cc. 4407-4414.
Wang D.G., Fan J.B., Siao C.J. и др., Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 15, 1998, cc. 1077-1082.
Wang M.B. и Waterhouse P.M., Application of gene silencing in plants. Curr. Opin. Plant Biol 5, 2001, cc. 124-150.
Weber J.L. и May P.E., Abundant class of human DNA polymorhisms which can be typed using the polymerare chain reaction. Am. J. Hum. Genet. 44, 1989, cc. 388396.
Welsh J. и McCleland M., Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research 18 (24), 1990, cc. 7213-7218.
Wu D.Y. и Wallace R.B., Genomics 4, 1989, cc. 560-569.
Ye S., Dhillon S., Ke X., Collins A.R. и Day I.N., An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res., 29, 2001, cc. E88-E88.
Zhou Y., Sun X.-D. и Ni M., Timing of photoperiodic flowering: light perception and circadian clock. J. Integrative Plant Biol. 49, 2007, cc. 28-34.
Zuckerkandl E. и Pauling L., Evolutionary divergence and convergence in proteins, в "Evolving Genes and Proteins", под ред. V. Bryson и H.J. Vogel., изд-во Academic Press, New York, 1965, cc. 97-166.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ген сахарной свеклы BvPRR7, которая включает
нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
53 или 54.
2. Растительный экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
3. Растительный экспрессионный вектор по п.2, который представляет собой экспрессионный вектор для РНК i.
4. Клетка растения сахарной свеклы, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3.
5. Трансгенное растение сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования и содержит растительную клетку по п.3 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
6. Часть растения сахарной свеклы, выбранная из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли, которые получают из трансгенного растения сахарной свеклы по п.5, где указанная часть растения сахарной свеклы включает клетки растения сахарной свеклы по п.4 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
7. Способ трансформации растений свеклы, отличающийся тем, что в клетки сахарной свеклы вводят молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3.
8. Полинуклеотидный маркер, представляющий собой молекулу ДНК, созданный на основе нуклео-тидных последовательностей, раскрытых в п.1, который позволяет различать генотипы, обеспечивающие проявление характерных для однолетнего и для двулетнего типа развития фенотипов растения сахарной свеклы, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, обеспечивающие проявление характерных для двулетнего или однолетнего типа развития фенотипов, причем указанный маркер дополнительно содержит один однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и способен обнаруживать один или несколько SNPs в положениях, которые выбраны из группы, включающей положения № 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8, причем указанные SNPs приведены в табл. 7-1 и 7-2.
9. Пара праймеров, состоящая из "прямого" праймера и "обратного" праймера, обладающих способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области геномной ДНК свеклы, для которой характерно полностью совместное наследование с геном, обусловливающим стрелкование (BvPRR7), причем указанная последовательность является нуклеотидной последовательностью по п.1, и к амплификации полинуклеотидного маркера по п.8, где указанный полинуклеотидный маркер содержит один или несколько SNPs, которые являются диагностическими для аллеля BvPRR7B в локусе BvPRR7, и позволяет различать растения сахарной свеклы, которые имеют характерный для однолетнего и для двулетнего типа развития генотип.
10. Пара праймеров по п.9, выбранная из группы, включающей:
а) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последователь-
ностью в 3-м интроне гена BvPPR7, представленной в SEQ ID NO: 6, и к амплификации фрагмента из
указанной области, который содержит SNP,
б) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последователь-
ностью SEQ ID NO: 8, и к амплификации фрагмента из указанной последовательности, содержащего
SNP, выбранный из SNPs, которые присутствуют в различных аллелях указанной последовательности и
представлены в табл. 7-1 и 7-2.
11. Пара праймеров по п.9 или 10, содержащая:
а) "прямой" праймер PRR7(T6)-F, представленный в SEQ ID NO: 49, и "обратный" праймер
PRR7(T6)-R, представленный в SEQ ID NO: 50, для амплификации фрагмента, содержащего SNP №
2334; или
б) "прямой" праймер PRR7(T1)-F, представленный в SEQ ID NO: 13, и "обратный" праймер
PRR7(T1)-R, представленный в SEQ ID NO: 14, для амплификации фрагмента, содержащего SNP № 160.
PVIMMSSHDSMGLVLKCLSKGAVDFLVKPIRKNELKNLWQHWRRCHSSSGSGSESCV-R 180
PVIMMSSHDSMGLV-KCLSKGAVDFLVKPIRKNELK-LWQHWRRC-SSSGSGSES +
PVIMMSSHDSMGLVFKCLSKGAVDFLVKPIRKNELKILWQHWRRCQSSSGSGSESGTHQ 214
NGKSIGSKRAEESDNDTDINEEDDNRSIGLQARDGSDNGSGTQSSWTKRAAEV-ESPQPQ 357 -KS+-SK-++SD-D+-++E++N-SIGL-A-DGS-+GSG-QSSWTK+A-+V-+SP+- TQKSVKSKSIKKSDQDSGSSDENENGSIGLNASDGSSDGSGAQSSWTKKAVDVDDSPRAV 274
STWEQATDPPDST CAQVIY PM SEAFAS SWM-PGSMQELDGQDHQYDNVPMGKDLEIGVP 5 31
S-W++ DSTCAQV++ E-F-S+-+-P-+-+E D-++++V-MG+DLEI-+-
SLWDRV DSTCAQWHSNPE-FPSNQLVAPPAEKETQEHDDKFEDVTMGRDLEISIR 329
RISDSRLNGPNKTVKLATTAEENQYSQLDLNQENDGRSFDEENLEMNNDKPKSEWIKQAM 711
R-D-L-P TT Q-+-+-+ +-L+++++-P-S+-+-+-
RNCDLALE-PKDEPLSKTTGIMRQDNSFEKSSSKWKMKVGKGPLDLSSESPSSKQMHEDG 388
NSPGK-VEEHRRGNKVSDAP 768 -S-K-+-H-+-N+-+AP GSSFKAMSSHLQDNREPEAP 4 08
Фиг. 2
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
(61 (61
(121 (121
(181 (181
(241 (241
(301 (301
(311 (361
(320 (421
(541) (1)
(473) (601) (14)
(473) (661) (14)
(721) (28)
(547) (781)
(607) (841) (148)
(607) (901) (148)
(607) (961) (148)
1 60
A7GAA7GC7AATGAGGAGGGGGAGGG77CACG77ACCCAA7CAC7GA7CGAAAGACCGGA
A7GAA7GC7AATGAGGAGGGGGAGGG7TCACG77ACCCAA7CAC7GA7CGAAAGACCGGA
61' "'"""""" "4""''120
GAGACGAAATTCGATAGGGTTGAGAGTCGGACAGAGAAGeATAGTGAAGAAGAGAAAACT
GAGACGAAA77CGATAGGGT7GAGAG7CGGACAGAGAAGCA7AGTGAAGAAGAGAAAAC7
121"""' """""""""" 180
AATGGAA77AC7A7GGA7G7GAGAAA7GGGAGT7CAGGTGGAC7GCAAAT7CCA77G7CG
AATGGAATTACTATGGATGTGAGAAATGGGAGTTCAGGTGGACTGCAAATTCCATTGTCG
181 24 0
CAACAAACAGCGGCAACTGTCTGTTGGGAAAGGTTTCTTCATGTGAGAACCATTAGAGTT CAACAAACAGCGGCAACTGTCTGTTGGGAAAGGTTTCTTCATGTGAGAACCATTAGAGTT 241 300 CTGCTTGTCGAAAATGAC &ACTGCACTCGTTATATCGTTACTGCACTTCTTCGCAATTGT C7GC77G7CGAAAA7GACGAC7GCAC7CG77A7A7CG77AC7GCACT7C77CGCAA77G7 301 360
AGC TATGAAG
AGCTATGAAGGTCAGTTTTGAAGCCTATGGCCCAACTTTAATCTATAGCGCATATATGTA 361 420
XTGTTGAGG
CCCGTTTCGGTTCTGTTTGTTGATTGATTATTATTAACTCTGTCATGGCAGTTGTTGAGG
421 480
CGTCAAA7GGGA7ACAAGCT7GGAAGG7G77A &AAGA7C7AAACAATCA7A77C^ATA77G
CG7CAAA7GGGA7ACAAGC77GGAAGG7G77AGAAGA7C7AAACAATCA7A77GA7A77G
4 81 54 0
7GC7AACAGAGG7GA7CA7GCC77AC77A7C7GG7A7CGG7C7C77G7GCAAGA7777GA 7GC7AACAGAGG7GA7CA7GCC77AC77A7C7GG7A7CGG7C7C77G7GCAAGA7777GA 541 600
ACCACAAATCTCGTCGGAACATCCCTGTCATCA
ACCACAAATCTCGTCGGAACATCCCTGTCATCAGTGAGTTCTTTTTCCTTGGTCGTTTTA
GCTCC7GTCATTA
601 660
TGATGTCATGTCAT
'GCAGTGATGTCATCTCAT
TGATGTCATCTCAT
' !^78o
'GTTGACTTTCTTGTTAAG 'GTTGACTTTGTTGTTAAG 'GTTGACTTTCTGGTGAAG 84 0
'TGGAGAAGATGCCAAAGT 'TGGAGAAGATGCCAAAGT 'TGGAGGAGGTGTCACAGT
900
CATTGAGCTCTTTCTTTTGAAGTTACACGATTTGTTGAGTCTTCTCTAGCGTATGTTGGA
AAGTAGATGCT7TTAACTACATTCCCCTGTGAGATTTGTGTT
721
GACTCAATGGGGCTGGTCTTTAAGTGCTTATCGAAAGGAGC: GAC7CAATGGGGC7GG7C777AAGTGC77A7CGAAAGGAGC:: GATTCGATGGGTTTAGTCTTAAAGTGCTTATCCAAGGGCGC: 78l"""" """ """" ''' С CAATAAGAAAAAArGAGC7TAAGA7C С777GGCAGCATGT" С CAA7AAGAAAAAA7 GAGC 7 7AAGA7C С777GGCAGCA7 G7" С С TATAAGAAAAAACGAAC 77AAAAACС777GGCAGCA7G7' 341
GTATGTCCTTGCTCATATATGATTAATCTGAAAACCTGTTGGTACAACTGGTGATAAGTA
901 960
GTAAACTAGAAATTCATGGTCTAATTGTGGATTGGTATCTTCTTTTTTTTTTTCCACATG
961 1020
TCTAGTGGT
ATTGGTATCTTACTTTTTGGTTTCTCATGGTTTTCCTTGTTTCTTGTTCAGTCTAGTGGT
TCTAGTGGT
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
(616) (1021) (157)
(676) (1081) (214)
(736) (1141) (274)
(772) (1201) (310)
(772) (1261) (310)
1021 1080
AGTGGAA3TGAGAGCGGAA03CA.TCAAAC7CA
AGTGGAAGTGAGAGCGGAA.CGC^
AGTGGAAGTGAAAGCTG..TGTAAGGAA7GGAAAA7CCA7AGGAAGC.AAGAGGGCZ'GAA
1031 114 0
AAA7C?GA7aAAGA77CAGGAAGCAG7GATGAGAA7GAA^
AAA7CTGA?GAAGAr7CAG(^AGCAGrGA7GAGAA7GAAAATGGGAGCArrGGCC7CiAA7 C^GrCGGACAA7GACACTGACATCAArGAGGAAGAr^rAAGAGAAGGArTGGrr7ACMA 1141 1200
GCTAGTGATGGAAGTAGTGAIGGGAGTGGCGCTCAG
6С7А67С^7Сй^^7АСТ6АТС6 &АС7СССесГаг\СС7АА &АС &АА7С7ССАА7АСССАТ
GC7CGGGA7GGAAG7GA.CAATGGAAG7GGGA.CCCAG
1201 1260
AATCTAAATATACACCCGAGAAGCTATCC TT TTAAAAAT TTCT TAACCACAAATGATAGG
1261 1320
GGTCGGATGATCGAACTTCGCATGTGCACTCAGATGCTTATAAATGGTGGAAGCGCTTAA
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
(772) (1321) (310)
CTAACCAATTGTAGAACTCAATGATGTTTAACTTAGATCTATTCAGTGATAAACTGGGTG
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
AtPRR7 CDS AtPRR7 ген CV301305
(772) (1381) (310)
(772) (1441) (310)
(804) (1501) (342)
AAAATTTCTAGTTCATTTTGAAGTTTTATTTTGCACATGGTTTATCTCCAAAACCTAGGT
1441 1500
AGC 7C.77GGAC GAAAAAAG.C7G7GGATG7 7GA
-AG77GA7GGACAAA^
1501 1560
¦7GAGAG7CCACGAGCGG7A7C7C7A7GGGACCGAG7 7GA7AGCAC77G
7GAGAG7CCACGAGCGGTATC7CTA7GGGACCGAG7 7GA7AGCACr7G
G. . . AGCCCCCAACCACAGTCl7ACA.7GGGAGGAAGGAACrGArcCACCTGATAGCAC77G 1561 1620
Фиг. 3
MS0499
25 П
MS0662
IMS0616 MS0205 GJ131
\9 27 PRR7
62 JO -У- MS0376
Фиг. 4
экзон 4 экзон 3 \ экзон 5
экзон 6
экзон 7
экзон
CV301305
Фиг. 5
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
AtPRR3 AtPRR5 AtPRR9 AtTOCl AtPRR7 BvPRR7
EEEKTNGIT
-QGLSEEDELRII
1Ж
EEGEGSRYPITDRKTGETKFDRVESRTEKHS
E DGPGVAKS VAE LNQHIVAVKKEGRGRVAGEG
121
DTARNTNN VQISQQQQQP-LAHVVT WERYLPVRSLKVLLVtNDDSTRHIV
WKAPEAGGGKLS RRKI RKKDAGVDGLVf WERFLPKIALRVLLV EADDSTRQII
KNRVKSSE WЈ WEKYLPKTVLRVLLV ESDYSTRQII
LNGECKGG DGFIDRSRVRILLC DNDSTSLGEV
MDVRNGSS GGLQIPLSQQTAATVC WERFLHVRTIRVLLV ENDDCTRYIV
EDGEDANSRRSLSSVQLPVHTHRHQPQVQPQGRVC WERFLPVGSPKVLLV ESDDSTRHIV
ш r
rALLKNCSYEVTAVPDVLEAWRILEDEKSCIDLVLTEVDMPVHSGTGLLSKIMSHKTLKN V\LLRKCSYRVAAVPDGLKAWEMLKGKPESVDLILTEVDLPSISGYALLTLIMEHDICKN rALLRKCCYKWAVSDGLAAWEVLKEKSHNIDLILTELDLPSISGFALLALVMEHEACKN fTLLSECSYQVTAVKSARQVIDALNAEGPDIDIILAEIDLPMAKGMKMLRYITRDKDLRR rALLRNCSYEWEASNGIQAWKVLEDLNNHIDIVLTEVIMPYLSGIGLLCKILNHKSRRN 3ALLRKCSYEWGVPNGIEAWKILEDLSNQIDLVLTEWTSGLSGIGLLSKIMSHKSCQN
м i ¦ 377T7
EPVIMMSSHDSMVLVFKCLSNGAVDFLVKPIRKNELKNLWQHVWRR2H SSSGSGSES
-MLGLAEKNM -SSSGSGSES
IPVIMMSTQDSVNTVYKCMLKGAADYLVKPLRRNELRNLWQHA/WRR3TSIAPDSFPWNES
Г PVIMMSSQDSIKMVLKCMLRGAADYLIKPMRKNELKNLWQHVWRR LT LRDDPTAHA
Г PVIMMSRQDEVPVWKCLKLGAADYLVKPLRTNELLNLWTHMWRR 4R-
IPVIMMSSHDSMGLVFKCLSKGAVDFLVKPIRKNELKILWQFIVWRR;Q-
RPVIMMSSHDSMGLVLKCLSKGAVDFLVKPIRKNELKNLWQHVWRRZH SSSGSGSES
¦зТТТ ' 360
GIHD-KKSVKPESTQGSENDASISDEHRNESGSSGGLSNQDGGSDNGSGTQSSWTKRASD VGQQKAEGASANNSNGKRDDHWSGNGGDAQSSCTRPEMEGESADVEVSARDAVQMECAK
QSLPASQHNLEDTDETCEDSRYHSDQGSG AQAINYNGHNKLMENGKSVDERDE FKE
LSYDFDLVGSDQSDPNTNSTNLFSDDTDDRSLRSTNPQRGNLSHQENEWSVATAPVHARD
GTHQTQKSVKSKSIKKSDQDSGSSDENEN GSIGLNASDG-S SDGSGAQSSWTKKAVD
CVRN-GKSIGSKRAEESDNDTDINEEDDN RSIGLQARDG-SDNGSGTQ SSWTKRAAE
361 420
TKSTSP S N Q FPDAPNKKGTYENGCAHVNRLKE
SQFNETRLLANELQSK QAEAIDFMGASFRRTGRRNREESVAQYESRIE
TFDVTMDLIG GIDKRPDS-IYKDKSRDECVGPE
GGLGADGTATSSLAVTAIEPPLDHLAGSHHEPMK RNSN PAQ F S S APKKS RLKIGE S
VDDSPR-AVS-LWDRVDSTCAQWHSNPEFPSNQLVAPPAEKETQEHDDKFEDVTMGRD VESPQPQSTWEQATDPPDSTCAQVIYPMSEAFAS-SWMPGSMQELDGQDHQYDNVPMGKD 421 480
AEDQKEQIGTGSQTG MSMSKKAEEP-GDLEKN AKYSVQALERNNDDTLN-
LDLSLRRPNASENQSSGDRPSLHPSSASAFTRYҐHRPLQTQCSASPWTDQRKNVAASQD LGLSLKRSCSVSFEN-QDESKHQKLSLSDASAFSRFEESKSAEKAWALEESTSGEPK-SAFFTYVKSTVLRTNGQDPPLVDGNGSLHLHRG31AEKFQVVASEGINNTKQARRATPKST LEISIRRNCDLALEPKDEPLSKTTGIMRQD-NSFEKSSSKWKMKVGKGPLDLSSESPSSK LEIGVPRISDSRLNGPNKTVKLATTAEENQYSQLDLNQENDGRSFDEENLEMNNDKPKSE 481 540
-RSSGNS QVESKAPSS-NREDLQSLEQTLKKT
DNIVLMNQYNTSEP PPNAPRRNDTSFYTGADSPGPPFSNQLNSWPG
TPTESHEKLRKVTSDQGSATTSSNQEN
VLRTNGQDPPLVNGN GSHHLHRGAAEKFQWASEGINNTKQAHRSRG-T
QMHEDGGSSFKAMSSHLQDNREPEAPNTHLKTLDTNEASVKISEELMHVEHSSKRHRG-T
WIKQAMNSPGKVEEHRRGN KVSDAPPEISKIKDKGMQHVEDMPSLVLSLKRLG-D
541 600
REDRDYKVGDRSVLRHSNLSAFSKYNN-G-ATS
QSSYPTPTPINNIQFRDPNTAYTSAMAPASLSPSPSSVSPHEYSSMFHPFN
- IGSSSVSFRNQVLQSTVTNQKQDS PIPVE SN RE
EQYHSQGETLQNGASYPHSLERSRTLPTSMESHGRNYQEGNMNIPQVAMNR
KDDGTLVRDDRNVLRRSE GSAFSRYNPASNANKISGGNLGS TSLQDNN
IADTSTNVSDQNIVGRSELSAFTRYNSGTTGNQGQTGNVGSCSPPNNSSEAAKQSHFDAP 601 660
AKKAPEENVESCSPHDSPIAKLLGSSSSSDNPL
SKPEGLQpRDCSMDVDERRYVSSATEHSAIG
KAAS KEVEAGSQ S TNE GIAGQ SSS ТЕ KPKE E
SKDSS QVDGSGFSAPNAY PYYMHGVMNQVMM
SQDLIKKTEAAYDCHSNMNESLPHNHRSHVGSfjNFD
HQISNS S SNNNNMGS TTNKFFKKPAMDIDKTPAKS TVNCSHHSHVFE PVQSSHMSNNNLT 661 720
NHIDQLIE
ES
QSAAMMPQYGHQIPHCQPNHPNGMTGYPYYHHPMNTSLQHSQMSLQ
MSSTTENNAFTKPGAPKVSSAGSSSVKHSSFQPLPCDHHNNHASYNLVHVAE
ASGKPGVGSVNGMLQENVPVNAVLPQENNVDQQUKIQHHHHYHHYDVHSVQQLPKVSVQH
721 780
Q_
-RKK LPPQCGS SNVYNETIEGNNNTVNY^VNGSVSGSGHGSNGPYGS SNGMNAGG
-DRWAC REAALMKFRLKRKERCFEKK
-RSC REAALMRFRLKRKIDRCEDKK ISWSPAGNPPSNEVRVNKLDI REEALLKFRRKRNQRCEDKK S? REAALTKFRQKRKERCFRKK EAALNKFRLKRKERCFDKK
NMPKSKDVTAPPQCGSSNTCRSPIEAN-VANCSJLNGSGSGSNHGSNFLNGSSAAVNVEG 781
QSSGS
KKNEDGYSLSVGKT
AKQRWS-
GSDNGAGKNG NGDjGSGSGSGSGSGNIADENKI
DDALGT
DS
TNMVNDSGIAAKDGAENGsbsGSGSGSGSGVGVDQSRSA^R:
MJ
Фиг. 6
100 I-HvPPD-H1 (Hordeurn vulgare)
^TaPPD-D1 (Triticum aestivum)
OsPRR37 (Oryza sativa)
BvPRR7 (Beta vulgaris)
AtPRR7 (Arabidopsis thaliana)
AtPRR3 (Arabidopsis thaliana)
AtPRR5 (Arabidopsis thaliana)
AtPRR9 (Arabidopsis thaliana)
Аллельная дискриминация
Аллель X (VTC MGB)
Фиг. 9
AtTOCl (Arabidopsis thaliana)
сайт инициации репликации ColEl
правая пограничная последовательность Т-ДНК
сайт инициации репликации pVSl
RepA: белок, участвующий: репликации pVSl
ген, обусловливающий устойчивость к спектиномицину (AadA)
левая пограничная последовательность Т-ДНК
BvPRR7_RNAi
11231 пара оснований
промотор Ubi3
интрон 1 Ubi3 антисмысловой фрагмент BvPPR7
i интрон 2 StLSl
инвертированный повтор BvPPR7 /¦i смысловой фрагмент BvPPR7 К терминатор Nos
терминатор 35S CamV
промотор HSP80
Фиг. 10
Источники
Испания
Греция
Syngenta однолетний
Италия
Португалия
США
Италия
Италия
Франция
Франция
Франция
Франция
Франция
Франция
Франция
Франция
Франция
Италия
Великобритания
Syngenta О-тип
Syngenta Р-1
Syngenta Р-2
Линии
BATRANI
< 5
1TALAN |
P0RTAN|
USDA-62^
О >
HD08TAI
<
<
HHOIBA|
13D10A 1
Фснопш
Нуклеотидное положение
224
.551
111111
ill
ill
(.15
"24
"44
845
S'l-
'"6
№№*
1012
IIIS2
1100
1 15" 1161
шшм г
У 1
ШШ 1
1S1 ]¦
1253
IS4I
18"4
I'M?
1481
Фт.
pew
2100
2104
А
ПОЯ
2154
ШШ А
тм \
й &1?
2155 2156
21?-
2158
2154
> ;
-1-
Аминокислотное положение
242
250
282
324
| V-: иинняии
338
36!
367
386
418
на н
614
625
63!)
661
702
704
723
724
Фиг. 12
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028355
028355
- 1 -
- 1 -
(19)
028355
028355
- 1 -
- 1 -
(19)
028355
028355
- 1 -
- 1 -
(19)
028355
028355
- 4 -
- 3 -
(19)
028355
028355
- 44 -
- 44 -
028355
028355
- 45 -
- 45 -
028355
028355
- 46 -
- 46 -
028355
028355
- 48 -
028355
028355
- 48 -
028355
028355
- 51 -
- 51 -
028355
028355
- 52 -
- 52 -
028355
028355
- 83 -
960
- 84 -
028355
<210> 11
028355
<210> 11
86 ¦
86 ¦
028355
028355
- 87 -
- 87 -
028355
028355
- 90 -
- 90 -
028355
028355
- 90 -
- 90 -
028355
028355
<213> Искусственная
- 95 -
<220>
<213> Искусственная
- 95 -
<220>
028355
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер GJ131(T1)-F
028355
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер GJ131(T1)-F
- 96 -
<213> Искусственная
- 96 -
<213> Искусственная
028355
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер ED031700(T1)-F
028355
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер ED031700(T1)-F
- 97 -
<213> Искусственная
- 97 -
<213> Искусственная
028355
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 9_27(T2)-F
028355
<220>
<223> олигонуклеотидная последовательность - праймер 9_27(T2)-F
- 98 -
- 98 -
028355
028355
- 99 -
- 99 -
028355
<212> ДНК
028355
<212> ДНК
- 100 -
- 100 -
028355
<211> 28
028355
<211> 28
- 101 -
- 101 -
028355
<210> 41
028355
<210> 41
- 102 -
- 102 -
028355
028355
- 103 -
- 103 -
028355
028355
- 104 -
<213> Искусственная
- 104 -
<213> Искусственная
<220>
028355
<220>
028355
- 105 -
- 105 -
<220>
028355
<220>
028355
- 105 -
- 105 -
<220>
028355
<220>
028355
- 105 -
- 105 -
028355
028355
- 106 -
- 106 -
028355
028355
<213> Beta vulgaris
- 107 -
- 108 -
028355
028355
- 110 -
- 110 -
028355
028355
- 113 -
- 113 -
028355
028355
- 116 -
- 116 -
028355
028355
- 118 -
- 118 -
028355
028355
- 119 -
- 119 -
028355
028355
- 119 -
- 119 -
028355
028355
- 119 -
- 119 -
028355
028355
- 119 -
- 119 -
028355
028355
- 121 -
122
028355
028355
- 121 -
122
028355
028355
- 121 -
122
028355
028355
- 121 -
122
028355
028355
- 121 -
122
028355
028355
- 123 -
122
|
